[go: up one dir, main page]

WO2024131846A1 - Antibody, antigen-binding fragment thereof, and pharmaceutical use thereof - Google Patents

Antibody, antigen-binding fragment thereof, and pharmaceutical use thereof Download PDF

Info

Publication number
WO2024131846A1
WO2024131846A1 PCT/CN2023/140296 CN2023140296W WO2024131846A1 WO 2024131846 A1 WO2024131846 A1 WO 2024131846A1 CN 2023140296 W CN2023140296 W CN 2023140296W WO 2024131846 A1 WO2024131846 A1 WO 2024131846A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
seq
amino acid
acid sequence
variable region
chain variable
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/CN2023/140296
Other languages
French (fr)
Inventor
Xinquan LIU
Qing Li
Larry Lo
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Shanghai Hansoh Biomedical Co Ltd
Changzhou Hansoh Pharmaceutical Co Ltd
Hansoh Bio LLC
Original Assignee
Shanghai Hansoh Biomedical Co Ltd
Changzhou Hansoh Pharmaceutical Co Ltd
Hansoh Bio LLC
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Shanghai Hansoh Biomedical Co Ltd, Changzhou Hansoh Pharmaceutical Co Ltd, Hansoh Bio LLC filed Critical Shanghai Hansoh Biomedical Co Ltd
Publication of WO2024131846A1 publication Critical patent/WO2024131846A1/en
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6849—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a receptor, a cell surface antigen or a cell surface determinant
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2863—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for growth factors, growth regulators
    • G01N33/5759—
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/77—Internalization into the cell

Definitions

  • the present invention relates to antibodies, and in particular, to antibodies exhibiting specificity for cellular-mesenchymal epithelial transition factor or hepatocyte growth factor receptor, and to use thereof, for example in the treatment of cancer.
  • the c-Met receptor tyrosine kinase is the cell surface receptor for hepatocyte growth factor (HGF) , also known as scatter factor (SF) , encoded by the MET protooncogene.
  • HGF hepatocyte growth factor
  • SF scatter factor
  • MET is normally expressed by cells of epithelial origin, while expression of HGF is restricted to cells of mesenchymal origin.
  • HGF binds its cognate receptor cellular-mesenchymal epithelial transition factor (c-Met) , it induces its dimerization through a not yet completely understood mechanism leading to its activation of downstream signaling pathways, triggering mitogenesis and morphogenesis. It is essential for embryonic development, organogenesis and wound healing (Gao et al. 2015. Springer, Cham) .
  • c-Met is aberrantly activated and deregulated in many cancers. Inappropriate activation caused by MET gene amplification, autocrine activation, exon 14 deletion which promotes tumor progression, angiogenesis, invasiveness, metastasis, and resistance, has been described as oncogenic driver in many cancers including non-small cell lung carcinoma, esophagogastric malignancies, colorectal cancer, etc. (Duplaquet L etal. Oncogene. 2018, 37 (24) : 3200-3215) . In addition, c-Met receptor is overexpressed in non-small cell lung cancer (NSCLC; 40%) and several other solid tumor types (Salgia R. Mol Cancer Ther. 2017, 16 (4) : 555-565.
  • NSCLC non-small cell lung cancer
  • MET-selective TKIs have been developed and exhibited impressive efficacy, but MET genetic alterations are presented in a small percentage of all the patient population, e.g., only 4%–5%of NSCLC (Wang et al. J Hematol Oncol. 2019, 12 (1) : 63; Fujino et al. Lung Cancer (Auckl) . 2021, 12: 35-50) . TKIs are also likely to be limited by both inherent and acquired resistance (Fujino et al. J Thorac Oncol. 2019, 14 (10) : 1753-1765) . Alternatively, antibodies have been explored for MET driven cancers to overcone the shortcomings of small molecule TKIs.
  • the anti-cancer efficacy of emerging drug modalities containing an antibody part are thought to rely on their uptake by cancer cells expressing the surface antigen, so the insufficient internalization of c-Met-targeting monoclonal antibody is also an urgent problem to be solved.
  • the technical problem to be solved by the present invention is to overcome the defects of weak binding ability of c-Met targeting antibodies and insufficient internalization in human cancer cells.
  • the present invention encompasses the following aspects:
  • the present disclosure provides an anti-c-MET antibody or an antigen-binding fragment thereof, comprising one or more CDR region sequences selected from the following sequences: SEQ ID NO: 01-85.
  • the anti-c-MET antibody or an antigen-binding fragment thereof comprising: a heavy chain variable region comprising HCDR1, HCDR2 and HCDR3 regions and a light chain variable region comprising LCDR1, LCDR2 and LCDR3 regions, wherein: a) HCDR1 having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 01, SEQ ID NO: 02, SEQ ID NO: 03, SEQ ID NO: 04, SEQ ID NO: 05, SEQ ID NO: 06, SEQ ID NO: 07, SEQ ID NO: 08, SEQ ID NO: 09, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14 or SEQ ID NO: 15; b) HCDR2 having the amino acid
  • the heavy chain variable region comprises: HCDR1 having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 01, HCDR2 having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 16, and HCDR3 having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 32, respectively; or HCDR1 having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 02, HCDR2 having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 17, and HCDR3 having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 33 respectively; or HCDR1 having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 03, HCDR2 having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 18, and HCDR3 having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 34 respectively; or HCDR1 having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 04, HCDR2 having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 19, and HCDR3 having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 35 respectively; or HCDR1 having the amino acid sequence as
  • the light chain variable region comprises: LCDR1 having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 47, LCDR2 having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 60, and LCDR3 having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 71, respectively; or LCDR1 having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 48, LCDR2 having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 61, and LCDR3 having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 72, respectively; or LCDR1 having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 49, LCDR2 having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 62, and LCDR3 having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 73, respectively; or LCDR1 having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 50, LCDR2 having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 60, and LCDR3 having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 74, respectively; or LCDR1 having the amino acid sequence as shown
  • the anti-c-MET antibody or antigen-binding fragment comprises: a) a heavy chain variable region comprises HCDR1, HCDR2 and HCDR3 having the amino acid sequences having the amino acid sequences as shown in SEQ ID NO: 01, SEQ ID NO: 16 and SEQ ID NO: 32, respectively; and a light chain variable region comprises LCDR1, LCDR2 and LCDR3 having the amino acid sequences as shown in SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 60 and SEQ ID NO: 71, respectively; or b) a heavy chain variable region comprises HCDR1, HCDR2 and HCDR3 having the amino acid sequences as shown in SEQ ID NO: 02, SEQ ID NO: 17 and SEQ ID NO: 33, respectively; and a light chain variable region comprises LCDR1, LCDR2 and LCDR3 having the amino acid sequences as shown in SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 61 and SEQ ID NO: 72, respectively; or c) a heavy chain variable region comprises HCDR1, HCDR2
  • the antibody or antigen-binding fragment thereof is selected from murine antibody, chimeric antibody, humanized antibody, human antibody or the antigen-binding fragment thereof.
  • the antibody or antigen-binding fragment thereof comprising: a heavy chain variable region comprising an amino acid sequence selected from: SEQ ID NOs: 86-102, or sequence having at least 80%, 85%, 90%, 95%or 99%sequence identity therewith; and/or a light chain variable region comprising an amino acid sequence selected from: SEQ ID NOs: 103-118, or sequence having at least 80%, 85%, 90%, 95%or 99%sequence identity therewith.
  • the antibody or antigen-binding fragment thereof comprising: a) the heavy chain variable region having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 86, or having the amino acid sequence of at least 80%, 85%, 90%, 95%or 99%sequence identity therewith; and/or the light chain variable region having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 103, or having the amino acid sequence of at least 80%, 85%, 90%, 95%or 99%sequence identity therewith; or b) the heavy chain variable region having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 87, or having the amino acid sequence of at least 80%, 85%, 90%, 95%or 99%sequence identity therewith; and/or the light chain variable region having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 104, or having the amino acid sequence of at least 80%, 85%, 90%, 95%or 99%sequence identity therewith; or c) the heavy chain variable region having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 86
  • the antibody or antigen-binding fragment thereof comprising: a) the heavy chain variable region having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 86; and/or the light chain variable region having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 103; b) the heavy chain variable region having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 87; and/or the light chain variable region having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 104; c) the heavy chain variable region having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 88; and/or the light chain variable region having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 105; d) the heavy chain variable region having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 89; and/or the light chain variable region having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 106; e) the heavy chain variable region having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 90; and/or the light chain variable region having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 106; e
  • the antibody or antigen-binding fragment thereof comprising: a) the heavy chain variable region having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 86; and the light chain variable region having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 103; b) the heavy chain variable region having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 87; and the light chain variable region having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 104; c) the heavy chain variable region having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 88; and the light chain variable region having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 105; d) the heavy chain variable region having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 89; and the light chain variable region having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 106; e) the heavy chain variable region having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 90; and the light chain variable region having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 107; f) the heavy chain variable region having the amino acid
  • the antibody is a full-length antibody, further comprising human antibody constant regions; preferably, the heavy chain constant region of the human antibody constant regions is selected from constant regions of human IgG1, IgG2, IgG3 and IgG4 and conventional variants thereof, and the light chain constant region of the human antibody constant regions is selected from ⁇ and ⁇ chain constant regions of human antibody and conventional variants thereof; more preferably the full-length antibody comprises a human antibody heavy chain constant region of SEQ ID NO: 199 and a human light chain constant region of SEQ ID NO: 120.
  • the antibody or antigen-binding fragment thereof comprises: a) a heavy chain having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 121 and a light chain having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 138; b) a heavy chain having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 122 and a light chain having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 139; c) a heavy chain having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 123 and a light chain having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 140; d) a heavy chain having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 124 and a light chain having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 141; e) a heavy chain having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 125 and a light chain having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 142; f) a heavy chain having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 126 and
  • the antigen-binding fragment above is selected from the group consisting of Fab, Fab', F (ab') 2 , variable fragment (Fv) , Fd fragment, dAb fragment, single chain variable fragment (scFv) , dimerized domain V (diabody) , disulfide stabilized Fv (dsFv) and CDR-containing peptides.
  • the antibody or antigen-binding fragment thereof of the present disclosure can be used to form a bispecific or multispecific binding molecule.
  • the antibody or antigen-binding fragment thereof of the present disclosure may be part of a bispecific or multispecific binding molecule, the bispecific or multispecific binding molecule comprising a second functional module (e.g., a second antibody) having a different binding specificity as compared to the antibody or antigen-binding fragment thereof of the present disclosure, thereby capable of binding to at least two different binding sites and/or target molecules.
  • a second functional module e.g., a second antibody
  • the present disclosure provides a bispecific or multispecific binding molecule comprising the antibody or antigen-binding fragment thereof of the present disclosure.
  • the antibody or antigen-binding fragment thereof of the present disclosure can be linked to a therapeutic agent to form an immunoconjugate. Because the immunoconjugate has an ability to selectively deliver one or more therapeutic agents to a target tissue.
  • the immunoconjugate is an antibody-drug conjugate (ADC)
  • the therapeutic agent is a cytotoxic agent.
  • the present disclosure provides an immunoconjugate comprising the antibody or antigen-binding fragment thereof of the present invention.
  • the present disclosure provides an isolated nucleic acid molecule encoding any antibody or the antigen-binding fragment.
  • the present disclosure also provides a recombinant vector comprising the above-mentioned isolated nucleic acid molecule.
  • the present disclosure also provides a host cell transformed with the above-mentioned recombinant vector, wherein the host cell is selected from the group consisting of a prokaryotic cell and a eukaryotic cell, preferably a eukaryotic cell, more preferably a mammalian cell.
  • the present disclosure also provides a method for producing the above-mentioned antibody or the antigen-binding fragment in a medium to produce and accumulate the antibody or the antigen-binding fragment thereof, and harvesting the antibody or the antigen-binding fragment thereof from the culture.
  • the present disclosure also provides a method for immunologically detecting or measuring c-MET, wherein the method comprises detecting the c-MET by contacting with the above-mentioned antibody or the antigen-binding fragment.
  • the present disclosure also provides a method for diagnosing a disease related to a human c-MET positive cell, wherein the method comprises a detecting or measuring the c-MET or c-MET positive cell by contacting with the above-mentioned antibody or the antigen-binding fragment.
  • the present disclosure provides a pharmaceutical composition, which comprises the above-mentioned antibody or the antigen-binding fragment, and one or more pharmaceutically acceptable carriers, diluents or excipients.
  • the present disclosure also provides a method of treatment or prevention of a disease related to overexpression of c-MET, comprising a step of administering a therapeutically effective amount of the antibody or its antigen-binding fragment above, or the pharmaceutical composition above, to a subject in need of treatment or prevention of the disease.
  • the disease related to overexpression of c-MET is cancer; preferably the cancer is lung cancer, gastric cancer, colorectal cancer, head and neck cancer, kidney cancer, pancreatic cancer, breast cancer, ovarian cancer, liver cancer, bladder cancer and hypopharyngeal cancer.
  • the cancer is non-small cell lung cancer (NSCLC) , esophagogastric malignancies, or colorectal cancer.
  • NSCLC non-small cell lung cancer
  • esophagogastric malignancies esophagogastric malignancies
  • colorectal cancer esophagogastric cancer
  • the antibody or its antigen-binding fragment may (1) specifically recognize or bind to a c-Met receptor which is expressed on a cell surface derived from human, or (2) specifically recognize or bind to an extracellular domain of c-Met which is not present on a cell surface, or (3) have sufficient internalization in a human cell.
  • Figure 1 In vitro binding characterization of hybridoma clones to Hs746T (A) , HT-29 (B) , T47D (C) cells, and B cell sequencing clones to Hs746T (D) , HT-29 (E) , T47D (F) cells, using flow cytometry analysis. MFI: median fluorescence intensity.
  • a purified anti-human c-Met antibody was used as positive control (R&D Systems Cat#MAB3582) .
  • a purified mouse IgG1 antibody was used as isotype control (Biolegend, Cat#400102) in (A) , (B) , and (C) .
  • FIG. 1 Cell internalization activity of selected hybridoma clones were characterized using indirect killing assay.
  • the selected hybridoma clones were incubated with SNU-5 cells in the presence of secondary Fab-vc-MMAF conjugate.
  • the cell viabilities were measured by Cell Titer Glo 2.0 assay after 3 days of incubation.
  • a purified anti-human c-Met antibody was used as positive control (R&D Systems Cat#MAB3582) .
  • a purified mouse IgG1 antibody was used as isotype control (Biolegend, Cat#400102) .
  • the present invention is based on the development of an antibody which can specifically bind to c-MET.
  • the titles used in the present section are for convenience of specification only, and do not limit the present invention.
  • a range is used as a shorthand to describe each value and all values within the range. Any value in the range, especially the integer value, can be used as the end point of the range.
  • the range "at least 80%identity” is used to describe all values within the range, such as 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%and 100%, and includes all sub ranges, such as at least 85%, at least 90%, at least 95%, etc.
  • antibody refers to an immunoglobulin comprising at least two heavy (H) chains and two light (L) chains inter-connected by disulfide bonds, or an antigen binding portion thereof.
  • Each heavy chain is comprised of a heavy chain variable region (abbreviated herein as VH) and a heavy chain constant region (CH) .
  • Each light chain is comprised of a light chain variable region (abbreviated herein as VL) and a light chain constant region (CL) .
  • VH and VL regions can be further subdivided into regions of hyper variability, termed complementarity determining regions (CDR) , interspersed with regions that are more conserved, termed framework regions (FR) .
  • CDR complementarity determining regions
  • Both heavy chain and light chain have three complementary determination regions, which are called HCDR1, HCDR2, HCDR3 and LCDR1, LCDR2, LCDR3 respectively.
  • Each VH and VL is composed of three CDRs and four FRs, arranged from amino-terminus to carboxyl-terminus in the following order: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4.
  • the variable regions of the heavy and light chains contain a binding domain that interacts with an antigen.
  • the constant regions of the antibodies may mediate the binding of the immunoglobulin to host tissues or factors, including various cells of the immune system (e.g., effector cells) and the first component (C1q) of the classical complement system.
  • Antibodies are assigned to classes based on the amino acid sequence of the constant region of their heavy chain.
  • the five major classes or isotypes of antibodies are IgA, IgD, IgE, IgG, and IgM, and the corresponding heavy chains are ⁇ chain ⁇ Chain ⁇ Chain ⁇ Chain sum ⁇ Chain.
  • the same type of Ig can be also classified into different subclasses according to the amino acid composition of its hinge region and the number and position of heavy chain disulfide bonds, for example, IgG can be classified into IgG1, IgG2, IgG3 and IgG4.
  • the heavy chain constant region of IgG antibody includes three constant domains, namely CH 1 , CH 2 and CH 3 , and the light chain constant region includes one constant domain, namely CL.
  • the light chain according to the constant region can also be classified into ⁇ or ⁇ Chain.
  • Each of the five types of Ig can have ⁇ Chain or ⁇ Chain.
  • antigen-binding fragment of an antibody, as used herein, refers to one or more fragments of an antibody that retain the ability to specifically bind to an antigen (e.g., c-MET) . It has been shown that the antigen-binding function of an antibody can be performed by fragments of a full-length antibody.
  • binding fragments encompassed within the term "antigen-binding fragment" of an antibody include (i) a Fab fragment, a monovalent fragment consisting of the VL, VH, CL and CH 1 domains; (ii) a F (ab') 2 fragment, a bivalent fragment comprising two Fab fragments linked by a disulfide bridge at the hinge region; (iii) a Fd fragment consisting of the VH and CH 1 domains; (iv) a Fv fragment consisting of the VL and VH domains of a single arm of an antibody, (v) a dAb fragment (Ward et al., (1989) Nature 341: 544-546) , which consists of a VH domain; (vi) an isolated complementarity determining region (CDR) , and (vii) a combination of two or more isolated CDRs which may optionally be joined by a synthetic linker.
  • a Fab fragment a monovalent fragment consisting of the VL, VH, CL and
  • the two domains of the Fv fragment, VL and VH are coded for by separate genes, they can be joined, using recombinant methods, by a synthetic linker that enables them to be made as a single protein chain in which the VL and VH regions pair to form monovalent molecules (known as single chain Fv (scFv) ; see e.g., Bird et al. (1988) Science 242: 423-426; and Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. 85: 5879-5883) .
  • Such single chain antibodies are also intended to be encompassed within the term "antigen-binding portion" of an antibody.
  • antiigen-binding fragment also include dimerized domain V (diabody) and disulfide stabilized Fv (dsFv) .
  • human antibody is intended to include antibodies having variable and constant regions derived from human germline immunoglobulin sequences.
  • the human antibodies of the invention may include amino acid residues not encoded by human germline immunoglobulin sequences (e.g., mutations introduced by random or site-specific mutagenesis in vitro or by somatic mutation in vivo) .
  • “humanized antibody” include antibodies with variable and constant regions of a human immunoglobulin sequence, in which CDR sequences derived from another mammalian species (such as mice) germline have been grafted onto a human skeleton sequence.
  • chimeric antibody usually refers to an antibody molecule formed by covalent chimerism of antibody domain fragments from different sources, which may include an antibody that chimes a mouse derived variable region into a human derived constant region.
  • recombinant human antibody includes all human antibodies that are prepared, expressed, created or isolated by recombinant means, such as (a) antibodies isolated from an animal (e.g., a mouse) that is transgenic or trans chromosomal for human immunoglobulin genes or a hybridoma prepared therefrom, (b) antibodies isolated from a host cell transformed to express the antibody, e.g., from a transfectoma, (c) antibodies isolated from a recombinant, combinatorial human antibody library, and (d) antibodies prepared, expressed, created or isolated by any other means that involve splicing of human immunoglobulin gene sequences to other DNA sequences.
  • Such recombinant human antibodies have variable and constant regions derived from human germline immunoglobulin sequences.
  • such recombinant human antibodies can be subjected to in vitro mutagenesis (or, when an animal transgenic for human Ig sequences is used, in vivo somatic mutagenesis) and thus the amino acid sequences of the VH and VL regions of the recombinant antibodies are sequences that, while derived from and related to human germline VH and VL sequences, may not naturally exist within the human antibody germline repertoire in vivo.
  • CDR refers to one of the six hypervariable regions within the variable domain of an antibody that primarily contributes to antigen binding.
  • One of the most commonly used definitions for the six CDRs is provided by Kabat E. A. et al. (1991) Sequences of proteins of immunological interest. NIH Publication 91-3242.
  • the Kabat definition of CDR applies to CDR1, CDR2 and CDR3 of the light chain variable domain (LCDR1, LCDR2, LCDR3 or L1, L2, L3) , as well as CDR1, CDR2 and CDR3 of heavy chain variable domain (HCDR1, HCDR2, HCDR3 or H1, H2, H3) .
  • CDR can also be redefined according to alternative naming schemes, such as Chothia (see Chothia &Lesk, 1987, J. Mol. Biol. 196: 901-917; Chothia et al., 1989, Nature 342: 878-883 or Honegger &Pluckthun, 2001, J. Mol. Biol. 309: 657-670) .
  • alternative naming schemes include AbM, Contact, IMGT, etc.
  • the CDR of an antibody can be defined by a variety of methods.
  • the methods and techniques for identifying the CDR within the variable region of an antibody molecule and the amino acid sequence of the variable region of an antibody are also well known in the art, and can be used to identify the CDR within the amino acid sequence of the specific variable region of the antibodies disclosed herein.
  • Note 1 some of these definitions (particularly for Chothia loops) vary depending on the individual publication examined; Note 2 : any of the numbering schemes can be used for these CDR defintions, except the contact definition uses the Chothia or Martin (enhanced Chothia) definition; Note 3 : the end of the Chothia HCDR1 loop when numbered using the Kabat numbering convention varies between H32 and H34 depending on the length of the loop. This is because the Kabat numbering scheme places the insertions at H35A and H35B.
  • nucleic acid molecule refers to a DNA molecule and a RNA molecule.
  • the nucleic acid molecule may be single stranded or double stranded but is preferably a double stranded DNA.
  • a nucleic acid is “effectively linked” when it is placed into functional relationship with another nucleic acid sequence. For example, if a promoter or enhancer affects transcription of a coding sequence, the promoter or enhancer is effectively linked to the coding sequence.
  • the preparation method of the nucleic acid is a conventional preparation method in the art. Preferably, it comprises the following steps: obtaining the nucleic acid molecule encoding the interest protein by gene cloning technology, or obtaining the nucleic acid molecule encoding the interest protein by the method of artificial full-length sequence synthesis.
  • the base sequence encoding the amino acid sequence of the protein can be replaced, deleted, changed, inserted or added appropriately to provide a polynucleotide homolog.
  • the homolog of the polynucleotide of the present invention can be prepared by replacing, deleting or adding one or more bases of the gene encoding the protein sequence within the scope of maintaining the activity of the antibody.
  • vector refers to a nucleic acid molecule capable of transporting another nucleic acid to that it has been linked.
  • the vector is a “plasmid” that refers to a circular double stranded DNA loop into which additional DNA segment can be ligated.
  • the vector is a viral vector, wherein an additional DNA segment can be ligated into viral genome.
  • the vectors disclosed herein are capable of self-replicating in a host cell into which they have been introduced (for example, a bacterial vector having a bacterial replication origin and an episomal mammalian vector) or can be integrated into the genome of a host cell upon introduction into host cell, thereby is replicated along with the host genome (e.g., a non-episomal mammalian vector) .
  • the recombinant expression vector can be obtained by conventional methods in the art, that is, by connecting the nucleic acid molecule of the present invention to various expression vectors, thus being constructed.
  • the expression vector is one of a variety of conventional vectors in the art, as long as it can carry the above-mentioned nucleic acid molecule.
  • the vector preferably includes: various plasmids, cosmids, phage or virus vectors and the like.
  • transfectoma includes recombinant eukaryotic host cell expressing the antibody, such as CHO cells, NS/0 cells, HEK293 cells, plant cells, or fungi, including yeast cells.
  • sequence of the DNA molecule for the antibody or a fragment thereof according to the present invention can be obtained by conventional techniques, for example, methods such as PCR amplification or genomic library screening.
  • sequences encoding light chain and heavy chain can be fused together, to form a single-chain antibody.
  • the relevant sequence can be obtained in bulk using a recombination method. This is usually carried out by cloning the sequence into a vector, transforming a cell with the vector, and then separating the relevant sequence from the proliferated host cell by conventional methods.
  • a relevant sequence can be synthesized artificially, especially when the fragment is short in length.
  • several small fragments are synthesized first, and then are linked together to obtain a fragment with a long sequence.
  • DNA sequence encoding the antibody of the present invention (or fragments thereof, or derivatives thereof) completely by chemical synthesis.
  • the DNA sequence can then be introduced into a variety of existing DNA molecules (or, for example, vectors) and cells known in the art.
  • mutations can also be introduced into the protein sequences of the present invention by chemical synthesis.
  • the host cell obtained is cultured.
  • the antibody of the present invention is purified by using conventional immunoglobulin purification steps, for example, the conventional separation and purification means well known to those skilled in the art, such as protein A-Sepharose, hydroxyapatite chromatography, gel electrophoresis, dialysis, ion exchange chromatography, hydrophobic chromatography, molecular sieve chromatography or affinity chromatography.
  • the monoclonal antibody obtained can be identified by conventional means.
  • the binding specificity of a monoclonal antibody can be determined by immunoprecipitation or an in vitro binding assay (such as radioimmunoassay (RIA) or enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) ) .
  • the binding affinity of a monoclonal antibody can be determined by, for example, the Scatchard analysis (Munson et al., Anal. Biochem., 107: 220 (1980) ) .
  • the antibody according to the present invention can be expressed in a cell or on the cell membrane, or is secreted extracellularly. If necessary, the recombinant protein can be separated and purified by various separation methods according to its physical, chemical, and other properties. These methods are well known to those skilled in the art. The examples of these methods comprise, but are not limited to, conventional renaturation treatment, treatment by protein precipitant (such as salt precipitation) , centrifugation, cell lysis by osmosis, ultrasonic treatment, super centrifugation, molecular sieve chromatography (gel chromatography) , adsorption chromatography, ion exchange chromatography, high performance liquid chromatography (HPLC) , and any other liquid chromatography, and the combination thereof.
  • protein precipitant such as salt precipitation
  • identity refers to the relationship between the sequences of two or more polypeptide molecules or two or more nucleic acid molecules, as determined by aligning and aligning sequences. Generally, identity refers to the number or percentage of identical positions shared by two amino acid or nucleic acid sequences, taking into account the number of gaps, and the length of each gap, which need to be introduced for optimal alignment of the two sequences. Generally, before calculating the percentage of identity between two amino acid or nucleotide sequences, sequence alignment is performed, and gap (if any) is introduced.
  • the two sequences are considered to be consistent or matched at that position; If the amino acid residues or bases in the two sequences are different, it is considered that they are inconsistent or mismatched at this position.
  • the number of matching positions is divided by the total number of positions in the alignment window to obtain sequence consistency. In other algorithms, the number of notches and/or the length of notches are also taken into account.
  • the public alignment software BLAST (which can be found on the web page ncbi. nlm. nih.
  • variants of a polypeptide such as for example, an antigen-binding fragment, a protein or an antibody is a polypeptide in which one or more amino acid residues are inserted, deleted, added and/or substituted, as compared to another polypeptide sequence, and includes a fusion polypeptide.
  • a protein variant includes one modified by protein enzyme cutting, phosphorylation or other posttranslational modification, but maintaining biological activity of the antibody disclosed herein, for example, binding to c-MET and specificity.
  • the variant may be about 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91%, 90%, 89%, 88%, 87%, 86%, 85%, 84%, 83%, 82%, 81%, or 80%identical to the sequence of the antibody or its antigen-binding fragment disclosed herein.
  • the percent identity (%) or homology may be calculated with reference to the following description.
  • the percent homology or identity may be calculated as 100 x [ (identical position) /min (TGA, TGB) ] , and in the formula, TGA, TGB are the sum of the number of residues of sequences A and B compared and the internal gap position (Russell et al., J. Mol Biol., 244: 332-350 (1994) .
  • the antibody of the present invention also includes a conservative variant (or conventional variant) thereof, which means that, compared to the amino acid sequence of the antibody of the present invention, there are up to 10, preferably up to 8 and more preferably up to 5, most preferably up to 3 amino acids are replaced by amino acids with similar or similar properties to form a polypeptide.
  • conservative variant polypeptides are preferably produced by conservative substitutions according to Table A.
  • K D (M)
  • M molar concentration
  • K D values for antibodies can be determined using methods in the art in view of the present disclosure.
  • the K D of an antibody can be determined by using surface plasmon resonance, such as by using a biosensor system, e.g., a system, or by using bio-layer interferometry technology, such as an Octet RED96 system.
  • affinity is the strength of interaction between an antibody or its antigen-binding fragment and an antigen, and it is determined by properties of the antigen such as size, shape and/or charge of antigen, and CDR sequences of the antibody or antigen-binding fragment.
  • properties of the antigen such as size, shape and/or charge of antigen, and CDR sequences of the antibody or antigen-binding fragment.
  • the antibody or its antigen-binding fragment is called “specifically binding" to its target such as an antigen, when a dissociation constant (K D ) is ⁇ l0 -6 M.
  • the antibody specifically binds to a target with "high affinity” , when K D is ⁇ l0 -9 M.
  • “Pharmaceutical composition" is intended to refer to a mixture containing one or more of the compounds or a physiological/pharmaceutically acceptable salt or prodrug thereof described herein with other chemical components, such as physiological /pharmaceutically acceptable carriers and excipients.
  • the purpose of the pharmaceutical composition is to promote the administration to the organism, which is beneficial to the absorption of the active ingredient and exerts the biological activity.
  • administering when applied to an animal, human, experimental subject, cell, tissue, organ, or biological fluid, refer to contact with an exogenous pharmaceutical, therapeutic, diagnostic reagent, or composition with the animal, human, subject, cell, tissue, organ, or biological fluid.
  • administering can refer, e.g., to therapeutic, pharmacokinetic, diagnostic, research, and experimental methods.
  • Treatment of a cell encompasses contacting the cell with a reagent, as well as contacting a fluid with a reagent, wherein the fluid is in contact with the cell.
  • administering and “treatment” also mean in vitro and ex vivo treatments, e.g., of a cell, by a reagent, diagnostic, binding composition or by another cell.
  • Treatment when applied to a human, veterinary, or research subject, refers to therapeutic treatment, prophylactic or preventative measures, research and diagnostic applications.
  • the present disclosure includes a medicament for treating a disease associated with c-MET, comprising an antibody, an antigen-binding fragment or an antibody-drug conjugate thereof of the present disclosure as an active ingredient.
  • the molecules of the present disclosure are very useful for those who suffer a tumor, cancer or infectious disease when in preparations and formulations suitable for therapeutic applications.
  • the present disclosure relates to a method for immunologically detecting or measuring c-MET, a reagent for immunologically detecting or measuring c-MET, a method for immunologically detecting or measuring cells expressing c-MET, and a diagnostic reagent for diagnosis of disease related to c-MET positive cells, comprising the antibody or antigen-binding fragment of the present disclosure that specifically recognizes human c-MET, as an active ingredient.
  • the method for detecting or determining the amount of c-MET may be any known method.
  • it includes immunodetection or assay.
  • the immunodetection or assay is a method of detecting or determining the amount of antibody or antigen by using labeled antigen or antibody.
  • immunodetection or assay include a radioactive substance labeled immunological antibody method (RIA) , an enzyme immunoassay (EIA or ELISA) , a fluorescent immunoassay (FIA) , a luminescent immunoassay, a western blotting method, physicochemical methods, etc.
  • the above-mentioned diseases related to c-MET positive cells can be diagnosed by detecting or measuring cells expressing c-MET by using the antibodies or antibody fragments thereof of the present invention.
  • a known immunodetection can be used, and preferably immunoprecipitation, fluorescent cell staining or immunohistochemically staining etc. can be used. Furthermore, a fluorescent antibody staining method etc. using FMAT8100HTS system (Applied Bio system) can be used.
  • the room temperature described in the examples is a conventional room temperature in the art, and is generally 10-30°C.
  • a combination of recombinant protein antigen human c-Met His Tag (Acro Biosystems, catalog number MET-H5227) , human c-Met-Fc (R&D systems, catalog number 8614-MT) , cynomolgus c-Met His Tag (Sino Biological, catalog number 90304-C08H) , cynomolgus c-Met-Fc (Sino Biological, catalog number 90304-C02H) , were used to immunize the mice.
  • Example 1-2 Immunization and screening of the antibody
  • Anti-c-MET antibodies were obtained by immunizing genetically modified mouse encoding human immunoglobulin heavy and kappa light chain variable regions with recombinant protein antigen human c-Met His Tag (Acro Biosystems, catalog number MET-H5227) and human c-Met-Fc (R&D systems, catalog number 8614-MT) , and boosted with cynomolgus c-Met His Tag (Sino Biological, catalog number 90304-C08H) , cynomolgus c-Met-Fc (Sino Biological, catalog number 90304-C02H) , respectively.
  • the antibody immune response was monitored by a c-Met specific immunoassay. When a desired immune response was achieved, splenocytes were harvested from each mouse and fused with mouse myeloma cells to preserve their viability and form hybridoma cells and screened for c-MET specificity.
  • the spleen lymphocytes and myeloma cells Sp2/0 were fused to obtain hybridoma cells by electrofusion or PEG fusion.
  • PEG fusion was performed using Clonacell TM HY technology (STEMCELL technologies) , following manufacturer’s instructions.
  • the primary cell: mouse myeloma cell line ratio was 1: 1 for electrofusion, and 10: 1 for PEG fusion.
  • B cells were isolated by RoboSep Mouse Pan-B cell isolation kit (StemCell) .
  • the isolated B cells were incubated with human c-Met his tag protein (Acro Biosystems, catalog number MET-H5227) and iFluor-488 anti-His antibody (Genscript, catalog number A01800) , and then stained with PE anti-mouse CD19 antibody (BioLegend, catalog number 115508) , F (ab') 2-Goat anti-Mouse IgG (H+L) secondary Antibody, (APC, Invitrogen, catalog number 17-4010-82) , and Zombie Violet Fixable viability dye.
  • Viable cells with CD19 positive, mouse IgG positive, and c-Met binding positive signals were sorted and collected for single B cell sequencing.
  • Barcoded cDNA library was prepared using Chromium next GEM single cell V (D) J reagent kits v1.1 (10X Genomics) , and then subjected for next-generation sequencing.
  • VH and VL region of selected sequences were cloned into pFUSE-CHIg_hG1 vector (InvivoGen #pfuse-hchg1) , which in-frame with constant region of hIgG1 heavy chain in the vector, and pFUSE2-CLIg_hk vector (InvivoGen, #pfuse2-hclk) , which in-frame with constant region of hIg kappa light chain in the vector, respectively.
  • the heavy and light chain expression plasmid and were co-transfected into into ExpiCHO-Scells (Thermo Fisher #A29127) using ExpiFectamine CHO Transfection Kit (Thermo Fisher, A29129) .
  • the culture supernatant of each clone was collected for further characterization.
  • the recombinant IgG form of antibodies NGS28, NGS57, NGS75, NGS91, NGS95, NGS111 were obtained.
  • ELISA was performed using the DuoSet ELISA Ancillary Kit (R&D System, DY008) . ELISA plates were coated with 1 ⁇ g/ml of human c-Met His Tag (Acro Biosystems, catalog number MET-H5227) , human MSPR/Ron protein His Tag (1947-MS-050) or BSA overnight. Excess unbound proteins were washed off by washing the plates three times with the wash buffer before blocking for 1 hour at room temperature. 50 ⁇ l c-Met hybridoma supernatant was added in each well and incubated for 1 hour.
  • Hybridoma supernatants and recombinant expression culture supernatants was subjected to binding tests on c-Met positive cell line Hs746T (ATCC-HTB-135) , HT29 (ATCC, HTB-38) , and c-Met negative cell line T47D (ATCC, HTB-133) using flow cytometry analysis. Briefly, 50 ⁇ L of cells in cell staining buffer (2 ⁇ 10 6 cells/mL) was mixed with 50 ⁇ L undiluted supernatants. The mixture was incubated on ice for 20 min and then washed with ice cold staining buffer twice.
  • the cells were subsequently stained with 50 ⁇ L of PE labelled secondary antibody (1: 400 dilution, BioLegend, Cat#405307) for 20 min. After washing by staining buffer and fixing by 4%PFA, cells were analyzed by flow cytometry.
  • a purified anti-human c-Met antibody was used as positive control (R&D Systems Cat#MAB3582) .
  • a purified mouse IgG1 antibody was used as isotype control (Biolegend, Cat#400102) .
  • Figure 1 shows examples of selected cell binding signals measured by flow cytometry.
  • hybridoma clones 2H12, 5A8, 7B12, 9D10, 14B6, 14C4, 15A8, 15F7, 17C2, 19E1, 27E10, and B cell sequencing clones NGS28, NGS57, NGS75, NGS91, NGS95, NGS111 were identified with enhanced binding profile to Hs746T cells and HT-29 cells compared to T47D cells.
  • hybridoma supernatants were measured using an indirect killing assay in SNU-5 cells.
  • the SNU-5 cells were seeded in 96 well plate at 1, 500 cells/well and incubated overnight.
  • the hybridoma supernatants from each hybridoma clone were diluted with hybridoma culture medium and mixed with Fab anti-mouse IgG Fc-MMAF conjugates with cleavable linker (Moradec, AM-202AF) , then added to each well.
  • the final concentrations of mouse IgG were roughly 10 nM, 2 nM, and 0.4 nM.
  • the final concentration of the Fab anti-mouse IgG Fc-MMAF conjugates in each well was 50 nM.
  • the internalized antibody/Fac-vc-MMAF conjugates complex will release the cytotoxic payload and kill the cells. After 3 days incubation, the viable cells in each well were detected by Cell Titer Glo 2.0 assay (Promega, G9243) .
  • a purified anti-human c-Met antibody was used as positive control (R&D Systems Cat#MAB3582) .
  • a purified mouse IgG1 antibody was used as isotype control (Biolegend, Cat#400102) . Cells treated with selected hybridoma supernatants showed reduced viability, as shown in Figure 2, indicating the internalization of the antibodies.
  • the clones 2H12, 5A8, 7B12, 9D10, 14B6, 14C4, 15A8, 15F7, 17C2, 19E1, 27E10 were identified to be capable of internalizing into c-Met positive cell line using the indirect killing assay.
  • Example 1-3 Sequencing of positive hybridoma clones
  • the process of cloning sequences from positive hybridomas are as follows.
  • the logarithmic growth phase hybridoma cells were collected, RNA was extracted, and reverse transcription was performed then followed by VDJ region amplification.
  • Amplified cDNA library from each clone were subjected to next-generation sequencing.
  • the amino acid sequences of the heavy and light chain variable region DNA sequences corresponding to the antibodies 2H12, 5A8, 7B12, 9D10, 14B6, 14C4, 15A8, 15F7, 17C2, 19E1, 27E10 were obtained.
  • the cDNA sequences that encode VH and VL regions of the selected 17 clones were directly synthesized as DNA fragments with 5’ -end in-frame leader sequence (MGWSCIILFLVATATGVHS) . These DNA fragments were cloned into selected vectors using NEBuilder DNA Assembly Cloning Kit (New England Biolabs) . VH region was cloned into pFUSE-CHIg_hG1 vector (InvivoGen #pfuse-hchg1) , which in-frame with constant region of hIgG1 heavy chain in the vector.
  • VL region was cloned into pFUSE2-CLIg_hk vector (InvivoGen, #pfuse2-hclk) , which in-frame with constant region of hIg kappa light chain in the vector.
  • the amino acid sequences of the constant region of hIgG1 heavy chain and the constant region of hIg kappa light chain are as follow:
  • Example 2-2 Expression and purification of recombinant antibodies
  • the heavy chain expression plasmid and light chain plasmids were co-transfected into Expi293F cells (ThermoFisher, #A14527) using ExpiFectamine 293 Transfection Kit (ThermoFisher, A14524) , or into ExpiCHO-Scells (ThermoFisher #A29127) using ExpiFectamine CHO Transfection Kit (ThermoFisher, A29129) . Based on the manufacturer’s instructions, plasmid DNA concentration reached 1.0 ug per ml of suspended cells, with LC: HC vector ratio 1: 1.
  • the transfected cells were cultured 5 to 7 days on an orbital shaker at 37 °C, 8%CO 2 .
  • Conditioned medium was collected and antibodies were purified using HiTrap MabSelect SuRe column (Cytiva, #17549112) on AKTA Pure 25 machine (Cytiva) .
  • Eluted antibodies were neutralized with Tris Buffer (pH 9.0) and subjected to PBS buffer exchange. Product concentration was measured by UV absorption, and quality was determined by SDS-PAGE and HPLC.
  • Example 3 Binding characterization of anti-c-Met recombinant antibody to c-Met positive and c-Met negative cell lines by flow cytometry
  • Binding of the hIgGl mAbs of Example 2 to the cell surface c-MET was determined by FACS analysis using cancer cell lines including c-Met positive cancer cell Hs746T cells and c-Met negative cancer cell SNU-1 cells.
  • Hs746T cells were maintained in DMEM medium supplemented with 10%FBS and 1%penicillin and streptomycin.
  • SNU-1 cells were maintained in RPMI-1640 medium supplemented with 10%FBS and 1%penicillin and streptomycin. Both cell lines were cultured at 37°C with 5%CO 2 in humidified atmosphere.
  • hIgG1 mAbs To determine the binding of hIgG1 mAbs to cell surface c-Met receptors, cells were first harvested and resuspended in cell staining buffer (BioLegend) at 2 ⁇ 10 6 cells/mL. Then, the cells were treated with human Fc receptor blocking reagent (BioLegend) on the ice for 10 min. The resulting cell suspension was aliquoted into 50 ⁇ L aliquots. 50 ⁇ L of hIgG1 mAbs at various concentrations were mixed with the cell aliquots, the final concentration of hIgG1 mAbs in the mixture ranged from 1.1 pM to 200 nM.
  • the cells were incubated on the ice for 1 hour and then washed with cell staining buffer twice. 50 ⁇ L of secondary antibody (PE conjugated goat anti-human Fc, eBioscience TM , 1: 200 dilution) was added to each sample to resuspend the cells. The cells were incubated on the ice for another 30 min. Cells were subsequently washed twice with cell staining buffer and resuspended in 4%PFA to fix the cells. The samples were analyzed using iQue3 to measure the median fluorescence intensity using corresponding channels. The result was disclosed in Figure 3 and Table 6. As a result, it was confirmed that the anti-c-Met antibody of the present invention specifically binds to the human c-Met as originally expressed in cells in a concentration-dependent pattern.
  • secondary antibody PE conjugated goat anti-human Fc, eBioscience TM , 1: 200 dilution
  • Example 4 Characterization of anti-c-Met recombinant antibody cell internalization in c-Met expression cells by indirect killing assay
  • Fab anti-human IgG Fc-MMAF conjugates with cleavable linker (Moradec, AH-202AF) was incubated and complexed with the recombinant anti-c-Met antibodies. The formed complexes were then incubated with c-Met expressing cells. Upon binding to the cell surface c-Met receptors, the complexes were internalized and release the conjugated MMAF after lysosomal cleavage of the linker. The released MMAF subsequently inhibited the cell division by blocking the polymerization of tubulin.
  • a c-Met expressing cell line SNU-5 cells were seeded in 96-well plate at 1, 500 cells/well and incubated overnight.
  • the recombinant anti-c-Met antibodies were mixed with the Fab anti-human IgG Fc-MMAF conjugates with cleavable linker at 1: 6 ratio (mol/mol) and incubated for 10 min to form the complex.
  • a series dilution of the complexes, 1.5 pM to 10 nM were added to each well and incubate for 72 hours.
  • the cell viability was measured by Cell Titer Glo 2.0 assay (Promega, G9243) .
  • the dose-response curves were plotted and fitted by GraphPad Prism 9.
  • all the anti-c-Met antibodies of the present invention have a potent cytotoxicity, indicating MMAF was delivered into the cells efficiently. the anti-c-Met antibodies have sufficient internalization.
  • Example 5 Characterization of anti-c-Met recombinant antibody cell internalization in c-Met expression cells
  • EBC-1 cells were collected and suspended in ice cold staining buffer (PBS with 0.5%FBS) at 2 ⁇ 10 6 cells/mL, followed by treating with human Fc receptor blocking reagent (BioLegend, 422302) . The cells were then pre-incubated with Alexa Fluor 488 labelled antibodies on ice for 1 hour. After incubation, cells were transfer to 37°Cincubator.
  • ice cold staining buffer PBS with 0.5%FBS
  • human Fc receptor blocking reagent BioLegend, 422302
  • MFI t is the MFI of samples collected at time t; MFI t0 is the MFI of samples collected at time 0 minute. MFI total is the MFI of the additional sample collected and served as control for 100%cell surface binding signal.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

The present application provides antibodies or antigen-binding fragments that specifically recognize human cellular mesenchymal epithelial transition factor or hepatocyte growth factor receptor, and their pharmaceutical use. In particular, a monoclonal antibody according to the present application suppresses tumors, and can thus be useful as a cancer therapeutic agent and in targeted cancer treatments including the detection of various cancers expressing cellular mesenchymal epithelial transition factor through specific binding, and the delivery of drugs to specific cancers, etc.

Description

ANTIBODY, ANTIGEN-BINDING FRAGMENT THEREOF, AND PHARMACEUTICAL USE THEREOF FIELD OF THE INVENTION
The present invention relates to antibodies, and in particular, to antibodies exhibiting specificity for cellular-mesenchymal epithelial transition factor or hepatocyte growth factor receptor, and to use thereof, for example in the treatment of cancer.
BACKGROUND
The c-Met receptor tyrosine kinase is the cell surface receptor for hepatocyte growth factor (HGF) , also known as scatter factor (SF) , encoded by the MET protooncogene. MET is normally expressed by cells of epithelial origin, while expression of HGF is restricted to cells of mesenchymal origin. When HGF binds its cognate receptor cellular-mesenchymal epithelial transition factor (c-Met) , it induces its dimerization through a not yet completely understood mechanism leading to its activation of downstream signaling pathways, triggering mitogenesis and morphogenesis. It is essential for embryonic development, organogenesis and wound healing (Gao et al. 2015. Springer, Cham) .
However, c-Met is aberrantly activated and deregulated in many cancers. Inappropriate activation caused by MET gene amplification, autocrine activation, exon 14 deletion which promotes tumor progression, angiogenesis, invasiveness, metastasis, and resistance, has been described as oncogenic driver in many cancers including non-small cell lung carcinoma, esophagogastric malignancies, colorectal cancer, etc. (Duplaquet L etal. Oncogene. 2018, 37 (24) : 3200-3215) . In addition, c-Met receptor is overexpressed in non-small cell lung cancer (NSCLC; 40%) and several other solid tumor types (Salgia R. Mol Cancer Ther. 2017, 16 (4) : 555-565.
MET-selective TKIs have been developed and exhibited impressive efficacy, but MET genetic alterations are presented in a small percentage of all the patient population, e.g., only 4%–5%of NSCLC (Wang et al. J Hematol Oncol. 2019, 12 (1) : 63; Fujino et al. Lung Cancer (Auckl) . 2021, 12: 35-50) . TKIs are also likely to be limited by both inherent and acquired resistance (Fujino et al. J Thorac Oncol. 2019, 14 (10) : 1753-1765) . Alternatively, antibodies have been explored for MET driven cancers to overcone the shortcomings of small molecule TKIs. Antibodies like Met-Mab (onartuzumab) , ABT-700 (telisotuzumab) , emibetuzumab, etc., have been described in the literature in an attempt to block c-Met mediated signaling activation (Merchant et al. Proc Natl Acad Sci USA. 2013, 110 (32) : E2987-E2996; US8329173B2; US8398974B2) . These molecules are in clinical development for many years, while with onartuzumab failed in its phase 3 trail (NCT01472016; Spigel et al. J Clin Oncol. 2017, 35 (4) : 412-420) .
With the success of emerging new technologies that use antibodies as part of the modality, such as antibody-drug conjugates, the previous research focused on blocking the c-Met signaling pathway may limit the scope of c-Met targeted antibody discovery, and often requires additional antibody engineering to achieve the blocking function. There is an unmet need in the art for better anti-c-Met antibodies that have more critical characteristics, such as efficient internalization or other functional properties not possessed by the known antibody. The instant invention is directed to addressing these and other needs.
SUMMARY OF THE INVENTION
The anti-cancer efficacy of emerging drug modalities containing an antibody part, more specifically, antibody-drug conjugates, are thought to rely on their uptake by cancer cells expressing the surface antigen, so the insufficient internalization of c-Met-targeting monoclonal antibody is also an urgent problem to be solved.
The technical problem to be solved by the present invention is to overcome the defects of weak binding ability of c-Met targeting antibodies and insufficient internalization in human cancer cells.
Specifically, the present invention encompasses the following aspects: The present disclosure provides an anti-c-MET antibody or an antigen-binding fragment thereof, comprising one or more CDR region sequences selected from the following sequences: SEQ ID NO: 01-85. In some embodiments, the anti-c-MET antibody or an antigen-binding fragment thereof comprising: a heavy chain variable region comprising HCDR1, HCDR2 and HCDR3 regions and a light chain variable region comprising LCDR1, LCDR2 and LCDR3 regions, wherein: a) HCDR1 having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 01, SEQ ID NO: 02, SEQ ID NO: 03, SEQ ID NO: 04, SEQ ID NO: 05, SEQ ID NO: 06, SEQ ID NO: 07, SEQ ID NO: 08, SEQ ID NO: 09, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14 or SEQ ID NO: 15; b) HCDR2 having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30 or SEQ ID NO: 31; c) HCDR3 having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45 or SEQ ID NO: 46; d) LCDR1 having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 58 or SEQ ID NO: 59; e) LCDR2 having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 69 or SEQ ID NO: 70; f) LCDR3 having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 84 or SEQ ID NO: 85.
In some embodiments, the heavy chain variable region comprises: HCDR1 having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 01, HCDR2 having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 16, and HCDR3 having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 32, respectively; or HCDR1 having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 02, HCDR2 having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 17, and HCDR3 having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 33 respectively; or HCDR1 having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 03, HCDR2 having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 18, and HCDR3 having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 34 respectively; or HCDR1 having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 04, HCDR2 having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 19, and HCDR3 having the amino acid sequence as  shown in SEQ ID NO: 35 respectively; or HCDR1 having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 05, HCDR2 having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 20, and HCDR3 having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 36 respectively; or HCDR1 having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 01, HCDR2 having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 21, and HCDR3 having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 37 respectively; or HCDR1 having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 06, HCDR2 having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 22, and HCDR3 having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 38 respectively; or HCDR1 having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 07, HCDR2 having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 23, and HCDR3 having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 39 respectively; or HCDR1 having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 08, HCDR2 having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 24, and HCDR3 having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 40 respectively; or HCDR1 having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 09, HCDR2 having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 25, and HCDR3 having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 41 respectively; or HCDR1 having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 10, HCDR2 having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 26, and HCDR3 having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 42 respectively; or HCDR1 having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 06, HCDR2 having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 27, and HCDR3 having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 43 respectively; or HCDR1 having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 11, HCDR2 having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 28, and HCDR3 having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 44 respectively; or HCDR1 having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 12, HCDR2 having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 16, and HCDR3 having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 32 respectively; or HCDR1 having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 13, HCDR2 having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 29, and HCDR3 having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 45 respectively; or HCDR1 having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 14, HCDR2 having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 30, and HCDR3 having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 46 respectively; or HCDR1 having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 15, HCDR2 having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 31, and HCDR3 having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 39 respectively.
In some embodiments, the light chain variable region comprises: LCDR1 having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 47, LCDR2 having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 60, and LCDR3 having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 71, respectively; or LCDR1 having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 48, LCDR2 having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 61, and LCDR3 having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 72, respectively; or LCDR1 having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 49, LCDR2 having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 62, and LCDR3 having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 73, respectively; or LCDR1 having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 50, LCDR2 having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 60, and LCDR3 having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 74, respectively; or LCDR1 having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 51, LCDR2 having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 60, and LCDR3  having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 75, respectively; or LCDR1 having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 50, LCDR2 having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 60, and LCDR3 having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 71, respectively; or LCDR1 having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 52, LCDR2 having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 63, and LCDR3 having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 76, respectively; or LCDR1 having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 53, LCDR2 having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 64, and LCDR3 having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 77, respectively; or LCDR1 having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 48, LCDR2 having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 65, and LCDR3 having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 78, respectively; or LCDR1 having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 54, LCDR2 having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 66, and LCDR3 having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 79, respectively; or LCDR1 having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 55, LCDR2 having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 67, and LCDR3 having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 80, respectively; or LCDR1 having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 51, LCDR2 having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 60, and LCDR3 having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 81, respectively; or LCDR1 having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 56, LCDR2 having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 68, and LCDR3 having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 82, respectively; or LCDR1 having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 57, LCDR2 having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 69, and LCDR3 having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 83, respectively; or LCDR1 having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 58, LCDR2 having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 70, and LCDR3 having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 84, respectively; or LCDR1 having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 59, LCDR2 having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 64, and LCDR3 having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 85, respectively.
In a preferable embodiment, the anti-c-MET antibody or antigen-binding fragment comprises: a) a heavy chain variable region comprises HCDR1, HCDR2 and HCDR3 having the amino acid sequences having the amino acid sequences as shown in SEQ ID NO: 01, SEQ ID NO: 16 and SEQ ID NO: 32, respectively; and a light chain variable region comprises LCDR1, LCDR2 and LCDR3 having the amino acid sequences as shown in SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 60 and SEQ ID NO: 71, respectively; or b) a heavy chain variable region comprises HCDR1, HCDR2 and HCDR3 having the amino acid sequences as shown in SEQ ID NO: 02, SEQ ID NO: 17 and SEQ ID NO: 33, respectively; and a light chain variable region comprises LCDR1, LCDR2 and LCDR3 having the amino acid sequences as shown in SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 61 and SEQ ID NO: 72, respectively; or c) a heavy chain variable region comprises HCDR1, HCDR2 and HCDR3 having the amino acid sequences as shown in SEQ ID NO: 03, SEQ ID NO: 18 and SEQ ID NO: 34, respectively; and a light chain variable region comprises LCDR1, LCDR2 and LCDR3 having the amino acid sequences as shown in SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 62 and SEQ ID NO: 73, respectively; or d) a heavy chain variable region comprises HCDR1, HCDR2 and HCDR3 having the amino acid sequences as shown in SEQ ID NO: 04, SEQ ID NO: 19 and SEQ ID NO: 35, respectively; and a light chain variable region comprises LCDR1, LCDR2 and LCDR3 having the  amino acid sequences as shown in SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 60 and SEQ ID NO: 74, respectively; or e) a heavy chain variable region comprises HCDR1, HCDR2 and HCDR3 having the amino acid sequences as shown in SEQ ID NO: 05, SEQ ID NO: 20 and SEQ ID NO: 36, respectively; and a light chain variable region comprises LCDR1, LCDR2 and LCDR3 having the amino acid sequences as shown in SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 60 and SEQ ID NO: 75, respectively; or f) a heavy chain variable region comprises HCDR1, HCDR2 and HCDR3 having the amino acid sequences as shown in SEQ ID NO: 01, SEQ ID NO: 21 and SEQ ID NO: 37, respectively; and a light chain variable region comprises LCDR1, LCDR2 and LCDR3 having the amino acid sequences as shown in SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 60 and SEQ ID NO: 71, respectively; or g) a heavy chain variable region comprises HCDR1, HCDR2 and HCDR3 having the amino acid sequences as shown in SEQ ID NO: 06, SEQ ID NO: 22 and SEQ ID NO: 38, respectively; and a light chain variable region comprises LCDR1, LCDR2 and LCDR3 having the amino acid sequences as shown in SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 63and SEQ ID NO: 76, respectively; or h) a heavy chain variable region comprises HCDR1, HCDR2 and HCDR3 having the amino acid sequences as shown in SEQ ID NO: 07, SEQ ID NO: 23 and SEQ ID NO: 39, respectively; and a light chain variable region comprises LCDR1, LCDR2 and LCDR3 having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 64and SEQ ID NO: 77, respectively; or i) a heavy chain variable region comprises HCDR1, HCDR2 and HCDR3 having the amino acid sequences as shown in SEQ ID NO: 08, SEQ ID NO: 24 and SEQ ID NO: 40, respectively; and a light chain variable region comprises LCDR1, LCDR2 and LCDR3 having the amino acid sequences as shown in SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 65 and SEQ ID NO: 78, respectively; or j) a heavy chain variable region comprises HCDR1, HCDR2 and HCDR3 having the amino acid sequences as shown in SEQ ID NO: 09, SEQ ID NO: 25 and SEQ ID NO: 41, respectively; and a light chain variable region comprises LCDR1, LCDR2 and LCDR3 having the amino acid sequences as shown in SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 66 and SEQ ID NO: 79, respectively; or k) a heavy chain variable region comprises HCDR1, HCDR2 and HCDR3 having the amino acid sequences as shown in SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 26 and SEQ ID NO: 42, respectively; and a light chain variable region comprises LCDR1, LCDR2 and LCDR3 having the amino acid sequences as shown in SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 67 and SEQ ID NO: 80, respectively; or l) a heavy chain variable region comprises HCDR1, HCDR2 and HCDR3 having the amino acid sequences as shown in SEQ ID NO: 06, SEQ ID NO: 27 and SEQ ID NO: 43, respectively; and a light chain variable region comprises LCDR1, LCDR2 and LCDR3 having the amino acid sequences as shown in SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 60 and SEQ ID NO: 81, respectively; or m) a heavy chain variable region comprises HCDR1, HCDR2 and HCDR3 having the amino acid sequences as shown in SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 28 and SEQ ID NO: 44, respectively; and a light chain variable region comprises LCDR1, LCDR2 and LCDR3 having the amino acid sequences as shown in SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 68 and SEQ ID NO: 82, respectively; or n) a heavy chain variable region comprises HCDR1, HCDR2 and HCDR3 having the amino acid sequences as shown in SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 16 and SEQ ID NO: 32, respectively; and a light chain variable region comprises LCDR1, LCDR2 and LCDR3 having the amino acid sequences as shown in SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 60 and SEQ ID NO: 71, respectively; or o) a heavy chain variable region comprises HCDR1, HCDR2 and HCDR3 having the amino acid sequences as shown in SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 29 and SEQ ID NO: 45, respectively; and a light chain variable region comprises LCDR1, LCDR2 and LCDR3 having the  amino acid sequences as shown in SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 69 and SEQ ID NO: 83, respectively; or p) a heavy chain variable region comprises HCDR1, HCDR2 and HCDR3 having the amino acid sequences as shown in SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 30 and SEQ ID NO: 46, respectively; and a light chain variable region comprises LCDR1, LCDR2 and LCDR3 having the amino acid sequences as shown in SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 70 and SEQ ID NO: 84, respectively; or q) a heavy chain variable region comprises HCDR1, HCDR2 and HCDR3 having the amino acid sequences as shown in SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 31 and SEQ ID NO: 39, respectively; and a light chain variable region comprises LCDR1, LCDR2 and LCDR3 having the amino acid sequences as shown in SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 64 and SEQ ID NO: 85, respectively.
In a preferable embodiment, the antibody or antigen-binding fragment thereof is selected from murine antibody, chimeric antibody, humanized antibody, human antibody or the antigen-binding fragment thereof.
In some embodiments, the antibody or antigen-binding fragment thereof comprising: a heavy chain variable region comprising an amino acid sequence selected from: SEQ ID NOs: 86-102, or sequence having at least 80%, 85%, 90%, 95%or 99%sequence identity therewith; and/or a light chain variable region comprising an amino acid sequence selected from: SEQ ID NOs: 103-118, or sequence having at least 80%, 85%, 90%, 95%or 99%sequence identity therewith.
In some embodiments, the antibody or antigen-binding fragment thereof comprising: a) the heavy chain variable region having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 86, or having the amino acid sequence of at least 80%, 85%, 90%, 95%or 99%sequence identity therewith; and/or the light chain variable region having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 103, or having the amino acid sequence of at least 80%, 85%, 90%, 95%or 99%sequence identity therewith; or b) the heavy chain variable region having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 87, or having the amino acid sequence of at least 80%, 85%, 90%, 95%or 99%sequence identity therewith; and/or the light chain variable region having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 104, or having the amino acid sequence of at least 80%, 85%, 90%, 95%or 99%sequence identity therewith; or c) the heavy chain variable region having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 88, or having the amino acid sequence of at least 80%, 85%, 90%, 95%or 99%sequence identity therewith; and/or the light chain variable region having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 105, or having the amino acid sequence of at least 80%, 85%, 90%, 95%or 99%sequence identity therewith; or d) the heavy chain variable region having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 89, or having the amino acid sequence of at least 80%, 85%, 90%, 95%or 99%sequence identity therewith; and/or the light chain variable region having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 106, or having the amino acid sequence of at least 80%, 85%, 90%, 95%or 99%sequence identity therewith; or e) the heavy chain variable region having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 90, or having the amino acid sequence of at least 80%, 85%, 90%, 95%or 99%sequence identity therewith; and/or the light chain variable region having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 107, or having the amino acid sequence of at least 80%, 85%, 90%, 95%or 99%sequence identity therewith; or f) the heavy chain variable region having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 91, or having the amino acid sequence of at least 80%, 85%, 90%, 95%or 99%sequence identity therewith; and/or the light chain variable region having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 108, or having the amino acid sequence of at least 80%, 85%, 90%, 95% or 99%sequence identity therewith; or g) the heavy chain variable region having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 92, or having the amino acid sequence of at least 80%, 85%, 90%, 95%or 99%sequence identity therewith; and/or the light chain variable region having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 109, or having the amino acid sequence of at least 80%, 85%, 90%, 95%or 99%sequence identity therewith; or h) the heavy chain variable region having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 93, or having the amino acid sequence of at least 80%, 85%, 90%, 95%or 99%sequence identity therewith; and/or the light chain variable region having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 110, or having the amino acid sequence of at least 80%, 85%, 90%, 95%or 99%sequence identity therewith; or i) the heavy chain variable region having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 94, or having the amino acid sequence of at least 80%, 85%, 90%, 95%or 99%sequence identity therewith; and/or the light chain variable region having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 111, or having the amino acid sequence of at least 80%, 85%, 90%, 95%or 99%sequence identity therewith; or j) the heavy chain variable region having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 95, or having the amino acid sequence of at least 80%, 85%, 90%, 95%or 99%sequence identity therewith; and/or the light chain variable region having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 112, or having the amino acid sequence of at least 80%, 85%, 90%, 95%or 99%sequence identity therewith; or k) the heavy chain variable region having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 96, or having the amino acid sequence of at least 80%, 85%, 90%, 95%or 99%sequence identity therewith; and/or the light chain variable region having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 113, or having the amino acid sequence of at least 80%, 85%, 90%, 95%or 99%sequence identity therewith; or l) the heavy chain variable region having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 97, or having the amino acid sequence of at least 80%, 85%, 90%, 95%or 99%sequence identity therewith; and/or the light chain variable region having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 114, or having the amino acid sequence of at least 80%, 85%, 90%, 95%or 99%sequence identity therewith; or m) the having the amino acid sequence of chain variable region having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 98, or having the amino acid sequence of at least 80%, 85%, 90%, 95%or 99%sequence identity therewith; and/or the light chain variable region having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 115, or having the amino acid sequence of at least 80%, 85%, 90%, 95%or 99%sequence identity therewith; or n) the heavy chain variable region having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 99, or having the amino acid sequence of at least 80%, 85%, 90%, 95%or 99%sequence identity therewith; and/or the light chain variable region having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 108, or having the amino acid sequence of at least 80%, 85%, 90%, 95%or 99%sequence identity therewith; or o) the heavy chain variable region having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 100, or having the amino acid sequence of at least 80%, 85%, 90%, 95%or 99%sequence identity therewith; and/or the light chain variable region having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 116, or having the amino acid sequence of at least 80%, 85%, 90%, 95%or 99%sequence identity therewith; or p) the heavy chain variable region having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 101, or having the amino acid sequence of at least 80%, 85%, 90%, 95%or 99%sequence identity therewith; and/or the light chain variable region having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 117, or having the amino acid sequence of at least 80%, 85%, 90%, 95%or 99%sequence identity therewith; or q) the heavy chain variable region having the amino acid sequence  as shown in SEQ ID NO: 102, or having the amino acid sequence of at least 80%, 85%, 90%, 95%or 99%sequence identity therewith; and/or the light chain variable region having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 118, or having the amino acid sequence of at least 80%, 85%, 90%, 95%or 99%sequence identity therewith.
In some embodiments, the antibody or antigen-binding fragment thereof comprising: a) the heavy chain variable region having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 86; and/or the light chain variable region having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 103; b) the heavy chain variable region having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 87; and/or the light chain variable region having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 104; c) the heavy chain variable region having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 88; and/or the light chain variable region having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 105; d) the heavy chain variable region having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 89; and/or the light chain variable region having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 106; e) the heavy chain variable region having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 90; and/or the light chain variable region having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 107; f) the heavy chain variable region having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 91; and/or the light chain variable region having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 108; g) the heavy chain variable region having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 92; and/or the light chain variable region having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 109; h) the heavy chain variable region having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 93; and/or the light chain variable region having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 110; i) the heavy chain variable region having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 94; and/or the light chain variable region having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 111; j) the heavy chain variable region having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 95; and/or the light chain variable region having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 112; k) the heavy chain variable region having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 96; and/or the light chain variable region having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 113; l) the heavy chain variable region having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 97; and/or the light chain variable region having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 114; m) the heavy chain variable region having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 98; and/or the light chain variable region having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 115; n) the heavy chain variable region having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 99; and/or the light chain variable region having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 108; o) the heavy chain variable region having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 100; and/or the light chain variable region having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 116; p) the heavy chain variable region having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 101; and/or the light chain variable region having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 117; or q) the heavy chain variable region having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 102; and/or the light chain variable region having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 118.
In a preferable embodiment, the antibody or antigen-binding fragment thereof comprising: a) the heavy chain variable region having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 86; and the light chain variable region having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 103; b) the heavy chain variable region having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 87; and  the light chain variable region having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 104; c) the heavy chain variable region having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 88; and the light chain variable region having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 105; d) the heavy chain variable region having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 89; and the light chain variable region having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 106; e) the heavy chain variable region having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 90; and the light chain variable region having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 107; f) the heavy chain variable region having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 91; and the light chain variable region having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 108; g) the heavy chain variable region having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 92; and the light chain variable region having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 109; h) the heavy chain variable region having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 93; and the light chain variable region having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 110; i) the heavy chain variable region having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 94; and the light chain variable region having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 111; j) the heavy chain variable region having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 95; and the light chain variable region having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 112; k) the heavy chain variable region having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 96; and/or the light chain variable region having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 113; l) the heavy chain variable region having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 97; and the light chain variable region having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 114; m) the heavy chain variable region having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 98; and the light chain variable region having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 115; n) the heavy chain variable region having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 99; and the light chain variable region having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 108; o) the heavy chain variable region having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 100; and the light chain variable region having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 116; p) the heavy chain variable region having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 101; and the light chain variable region having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 117; or q) the heavy chain variable region having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 102; and the light chain variable region having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 118.
In some embodiments, the antibody is a full-length antibody, further comprising human antibody constant regions; preferably, the heavy chain constant region of the human antibody constant regions is selected from constant regions of human IgG1, IgG2, IgG3 and IgG4 and conventional variants thereof, and the light chain constant region of the human antibody constant regions is selected from κ and λ chain constant regions of human antibody and conventional variants thereof; more preferably the full-length antibody comprises a human antibody heavy chain constant region of SEQ ID NO: 199 and a human light chain constant region of SEQ ID NO: 120.
In some embodiments, the antibody or antigen-binding fragment thereof comprises: a) a heavy chain having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 121 and a light chain having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 138; b) a heavy chain having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 122 and a light chain having the amino acid sequence as  shown in SEQ ID NO: 139; c) a heavy chain having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 123 and a light chain having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 140; d) a heavy chain having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 124 and a light chain having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 141; e) a heavy chain having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 125 and a light chain having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 142; f) a heavy chain having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 126 and a light chain having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 143; g) a heavy chain having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 127 and a light chain having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 144; h) a heavy chain having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 128 and a light chain having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 145; i) a heavy chain having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 129 and a light chain having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 146; j) a heavy chain having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 130 and a light chain having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 147; k) a heavy chain having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 131 and a light chain having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 148; l) a heavy chain having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 132 and a light chain having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 149; m) a heavy chain having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 133 and a light chain having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 150; n) a heavy chain having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 134 and a light chain having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 151; o) a heavy chain having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 135 and a light chain having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 152; p) a heavy chain having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 136 and a light chain having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 153; or q) a heavy chain having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 137 and a light chain having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 154.
In some embodiments, the antigen-binding fragment above is selected from the group consisting of Fab, Fab', F (ab') 2, variable fragment (Fv) , Fd fragment, dAb fragment, single chain variable fragment (scFv) , dimerized domain V (diabody) , disulfide stabilized Fv (dsFv) and CDR-containing peptides.
The antibody or antigen-binding fragment thereof of the present disclosure can be used to form a bispecific or multispecific binding molecule. The antibody or antigen-binding fragment thereof of the present disclosure may be part of a bispecific or multispecific binding molecule, the bispecific or multispecific binding molecule comprising a second functional module (e.g., a second antibody) having a different binding specificity as compared to the antibody or antigen-binding fragment thereof of the present disclosure, thereby capable of binding to at least two different binding sites and/or target molecules.
In some embodiments, the present disclosure provides a bispecific or multispecific binding molecule comprising the antibody or antigen-binding fragment thereof of the present disclosure.
The antibody or antigen-binding fragment thereof of the present disclosure can be linked to a therapeutic agent to form an immunoconjugate. Because the immunoconjugate has an ability to selectively deliver one or more therapeutic agents to a target tissue. In certain embodiments, the immunoconjugate is an antibody-drug conjugate (ADC) , the therapeutic agent is a cytotoxic agent.
In some embodiments, the present disclosure provides an immunoconjugate comprising the antibody or antigen-binding fragment thereof of the present invention.
In some embodiments, the present disclosure provides an isolated nucleic acid molecule encoding any antibody or the antigen-binding fragment.
In one aspect, the present disclosure also provides a recombinant vector comprising the above-mentioned isolated nucleic acid molecule.
In another aspect, the present disclosure also provides a host cell transformed with the above-mentioned recombinant vector, wherein the host cell is selected from the group consisting of a prokaryotic cell and a eukaryotic cell, preferably a eukaryotic cell, more preferably a mammalian cell.
In one aspect, the present disclosure also provides a method for producing the above-mentioned antibody or the antigen-binding fragment in a medium to produce and accumulate the antibody or the antigen-binding fragment thereof, and harvesting the antibody or the antigen-binding fragment thereof from the culture.
In one aspect, the present disclosure also provides a method for immunologically detecting or measuring c-MET, wherein the method comprises detecting the c-MET by contacting with the above-mentioned antibody or the antigen-binding fragment.
In one aspect, the present disclosure also provides a method for diagnosing a disease related to a human c-MET positive cell, wherein the method comprises a detecting or measuring the c-MET or c-MET positive cell by contacting with the above-mentioned antibody or the antigen-binding fragment.
In some embodiments, the present disclosure provides a pharmaceutical composition, which comprises the above-mentioned antibody or the antigen-binding fragment, and one or more pharmaceutically acceptable carriers, diluents or excipients.
In some embodiments, the present disclosure also provides a method of treatment or prevention of a disease related to overexpression of c-MET, comprising a step of administering a therapeutically effective amount of the antibody or its antigen-binding fragment above, or the pharmaceutical composition above, to a subject in need of treatment or prevention of the disease.
In some embodiments, the disease related to overexpression of c-MET is cancer; preferably the cancer is lung cancer, gastric cancer, colorectal cancer, head and neck cancer, kidney cancer, pancreatic cancer, breast cancer, ovarian cancer, liver cancer, bladder cancer and hypopharyngeal cancer.
In some embodiments, the cancer is non-small cell lung cancer (NSCLC) , esophagogastric malignancies, or colorectal cancer.
The antibody or its antigen-binding fragment may (1) specifically recognize or bind to a c-Met receptor which is expressed on a cell surface derived from human, or (2) specifically recognize or bind to an extracellular domain of c-Met which is not present on a cell surface, or (3) have sufficient internalization in a human cell.
BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS
Figure 1. In vitro binding characterization of hybridoma clones to Hs746T (A) , HT-29 (B) , T47D (C) cells, and B cell sequencing clones to Hs746T (D) , HT-29 (E) , T47D (F) cells, using flow cytometry analysis. MFI: median fluorescence intensity. A purified anti-human c-Met antibody was used as positive control (R&D Systems Cat#MAB3582) . A purified mouse IgG1 antibody was  used as isotype control (Biolegend, Cat#400102) in (A) , (B) , and (C) . In-house version of ABT-700 (patent US8, 545, 839B2) , and B12 (Zwick, et al. J Virol., 2003, 77 (10) : 5863-5876) were used as positive control and negative control, respectively, in (D) , (E) , and (F) .
Figure 2. Cell internalization activity of selected hybridoma clones were characterized using indirect killing assay. The selected hybridoma clones were incubated with SNU-5 cells in the presence of secondary Fab-vc-MMAF conjugate. The cell viabilities were measured by Cell Titer Glo 2.0 assay after 3 days of incubation. A purified anti-human c-Met antibody was used as positive control (R&D Systems Cat#MAB3582) . A purified mouse IgG1 antibody was used as isotype control (Biolegend, Cat#400102) .
Figure 3. In vitro binding characterization of recombinant anti-c-Met antibodies to Hs746T (A) cells and SNU-1 (B) cells was determined by flow cytometry analysis.
Figure 4. Dose-response curves of recombinant anti-c-Met antibody internalization by indirect-killing assay.
Figure 5. The recombinant anti-c-Met antibody internalization in EBC-1 cells.
DETAILED DESCRIPTION
The present invention is based on the development of an antibody which can specifically bind to c-MET. The titles used in the present section are for convenience of specification only, and do not limit the present invention.
Unless otherwise defined herein, the scientific and technical terms used herein have the same meaning as commonly understood by those skilled in the art. Further, unless the context specifically requires, the singular includes the plural, and the plural includes the singular.
DEFINITIONS
Before the present invention is detailed below, it is to be understood that the present invention is not limited to the particular methodologies, protocols and reagents described herein, as those may vary. It is also to be understood that the terminology used herein is for the purpose of describing the particular embodiments only, and is not intended to limit the scope of the invention, which will be limited only by the appended claims. Unless defined otherwise, all technical and scientific terms used herein have the same meaning as commonly understood by one of ordinary skill in the art to which the invention pertains.
For interpretation of the specification, the following definitions will be applied and wherever appropriate, terms used in the singular may also include the plural and vice versa. It is to be understood that the terminology used herein is for the purpose of describing specific embodiments only and is not intended to be limiting.
The terms used herein are for the purpose of describing specific embodiments only and are not intended to limit the present invention. Unless the context clearly indicates otherwise, the open-ended expressions "include" and "including" are interpreted as including structural components or method steps that are not mentioned, but it should be noted that the open-ended expression also covers the situation that only the components and method steps are mentioned (that is, it covers the situation that the closed-ended expression "consists of... ) .
As used throughout, a range is used as a shorthand to describe each value and all values within the range. Any value in the range, especially the integer value, can be used as the end point of the range. For example, the range "at least 80%identity" is used to describe all values within  the range, such as 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%and 100%, and includes all sub ranges, such as at least 85%, at least 90%, at least 95%, etc.
The term "antibody" refers to an immunoglobulin comprising at least two heavy (H) chains and two light (L) chains inter-connected by disulfide bonds, or an antigen binding portion thereof. Each heavy chain is comprised of a heavy chain variable region (abbreviated herein as VH) and a heavy chain constant region (CH) . Each light chain is comprised of a light chain variable region (abbreviated herein as VL) and a light chain constant region (CL) . The VH and VL regions can be further subdivided into regions of hyper variability, termed complementarity determining regions (CDR) , interspersed with regions that are more conserved, termed framework regions (FR) . Both heavy chain and light chain have three complementary determination regions, which are called HCDR1, HCDR2, HCDR3 and LCDR1, LCDR2, LCDR3 respectively. Each VH and VL is composed of three CDRs and four FRs, arranged from amino-terminus to carboxyl-terminus in the following order: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. The variable regions of the heavy and light chains contain a binding domain that interacts with an antigen. The constant regions of the antibodies may mediate the binding of the immunoglobulin to host tissues or factors, including various cells of the immune system (e.g., effector cells) and the first component (C1q) of the classical complement system. Antibodies are assigned to classes based on the amino acid sequence of the constant region of their heavy chain. The five major classes or isotypes of antibodies are IgA, IgD, IgE, IgG, and IgM, and the corresponding heavy chains are μ chain δ Chain γ Chain αChain sum ε Chain. The same type of Ig can be also classified into different subclasses according to the amino acid composition of its hinge region and the number and position of heavy chain disulfide bonds, for example, IgG can be classified into IgG1, IgG2, IgG3 and IgG4. Generally, the heavy chain constant region of IgG antibody includes three constant domains, namely CH1, CH2 and CH3, and the light chain constant region includes one constant domain, namely CL. The light chain according to the constant region can also be classified into κ or λ Chain. Each of the five types of Ig can have κ Chain or λ Chain.
The term "antigen-binding fragment" of an antibody, as used herein, refers to one or more fragments of an antibody that retain the ability to specifically bind to an antigen (e.g., c-MET) . It has been shown that the antigen-binding function of an antibody can be performed by fragments of a full-length antibody. Examples of binding fragments encompassed within the term "antigen-binding fragment " of an antibody include (i) a Fab fragment, a monovalent fragment consisting of the VL, VH, CL and CH1 domains; (ii) a F (ab') 2 fragment, a bivalent fragment comprising two Fab fragments linked by a disulfide bridge at the hinge region; (iii) a Fd fragment consisting of the VH and CH1domains; (iv) a Fv fragment consisting of the VL and VH domains of a single arm of an antibody, (v) a dAb fragment (Ward et al., (1989) Nature 341: 544-546) , which consists of a VH domain; (vi) an isolated complementarity determining region (CDR) , and (vii) a combination of two or more isolated CDRs which may optionally be joined by a synthetic linker. Furthermore, although the two domains of the Fv fragment, VL and VH, are coded for by separate genes, they can be joined, using recombinant methods, by a synthetic linker that enables them to be made as a single protein chain in which the VL and VH regions pair to form monovalent molecules (known as single chain Fv (scFv) ; see e.g., Bird et al. (1988) Science 242: 423-426; and Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. 85: 5879-5883) . Such single chain antibodies are also intended to be encompassed within the term "antigen-binding portion" of an antibody. In some the term  "antigen-binding fragment" also include dimerized domain V (diabody) and disulfide stabilized Fv (dsFv) .
The term "human antibody" , as used herein, is intended to include antibodies having variable and constant regions derived from human germline immunoglobulin sequences. The human antibodies of the invention may include amino acid residues not encoded by human germline immunoglobulin sequences (e.g., mutations introduced by random or site-specific mutagenesis in vitro or by somatic mutation in vivo) . "humanized antibody" include antibodies with variable and constant regions of a human immunoglobulin sequence, in which CDR sequences derived from another mammalian species (such as mice) germline have been grafted onto a human skeleton sequence. "chimeric antibody" usually refers to an antibody molecule formed by covalent chimerism of antibody domain fragments from different sources, which may include an antibody that chimes a mouse derived variable region into a human derived constant region.
The term "recombinant human antibody" , as used herein, includes all human antibodies that are prepared, expressed, created or isolated by recombinant means, such as (a) antibodies isolated from an animal (e.g., a mouse) that is transgenic or trans chromosomal for human immunoglobulin genes or a hybridoma prepared therefrom, (b) antibodies isolated from a host cell transformed to express the antibody, e.g., from a transfectoma, (c) antibodies isolated from a recombinant, combinatorial human antibody library, and (d) antibodies prepared, expressed, created or isolated by any other means that involve splicing of human immunoglobulin gene sequences to other DNA sequences. Such recombinant human antibodies have variable and constant regions derived from human germline immunoglobulin sequences. In certain embodiments, however, such recombinant human antibodies can be subjected to in vitro mutagenesis (or, when an animal transgenic for human Ig sequences is used, in vivo somatic mutagenesis) and thus the amino acid sequences of the VH and VL regions of the recombinant antibodies are sequences that, while derived from and related to human germline VH and VL sequences, may not naturally exist within the human antibody germline repertoire in vivo.
The term "CDR" refers to one of the six hypervariable regions within the variable domain of an antibody that primarily contributes to antigen binding. One of the most commonly used definitions for the six CDRs is provided by Kabat E. A. et al. (1991) Sequences of proteins of immunological interest. NIH Publication 91-3242. As used herein, the Kabat definition of CDR applies to CDR1, CDR2 and CDR3 of the light chain variable domain (LCDR1, LCDR2, LCDR3 or L1, L2, L3) , as well as CDR1, CDR2 and CDR3 of heavy chain variable domain (HCDR1, HCDR2, HCDR3 or H1, H2, H3) . CDR can also be redefined according to alternative naming schemes, such as Chothia (see Chothia &Lesk, 1987, J. Mol. Biol. 196: 901-917; Chothia et al., 1989, Nature 342: 878-883 or Honegger &Pluckthun, 2001, J. Mol. Biol. 309: 657-670) . Other alternative naming schemes include AbM, Contact, IMGT, etc. In the art, the CDR of an antibody can be defined by a variety of methods. The methods and techniques for identifying the CDR within the variable region of an antibody molecule and the amino acid sequence of the variable region of an antibody are also well known in the art, and can be used to identify the CDR within the amino acid sequence of the specific variable region of the antibodies disclosed herein.
A useful comparison of CDR numbering is as below:

Note 1: some of these definitions (particularly for Chothia loops) vary depending on the individual publication examined; Note2: any of the numbering schemes can be used for these CDR defintions, except the contact definition uses the Chothia or Martin (enhanced Chothia) definition; Note3: the end of the Chothia HCDR1 loop when numbered using the Kabat numbering convention varies between H32 and H34 depending on the length of the loop. This is because the Kabat numbering scheme places the insertions at H35A and H35B.
The term "nucleic acid molecule" as used herein refers to a DNA molecule and a RNA molecule. The nucleic acid molecule may be single stranded or double stranded but is preferably a double stranded DNA. A nucleic acid is “effectively linked” when it is placed into functional relationship with another nucleic acid sequence. For example, if a promoter or enhancer affects transcription of a coding sequence, the promoter or enhancer is effectively linked to the coding sequence.
The preparation method of the nucleic acid is a conventional preparation method in the art. Preferably, it comprises the following steps: obtaining the nucleic acid molecule encoding the interest protein by gene cloning technology, or obtaining the nucleic acid molecule encoding the interest protein by the method of artificial full-length sequence synthesis.
Those skilled in the art know that the base sequence encoding the amino acid sequence of the protein can be replaced, deleted, changed, inserted or added appropriately to provide a polynucleotide homolog. The homolog of the polynucleotide of the present invention can be prepared by replacing, deleting or adding one or more bases of the gene encoding the protein sequence within the scope of maintaining the activity of the antibody.
The term "vector" refers to a nucleic acid molecule capable of transporting another nucleic acid to that it has been linked. In one embodiment, the vector is a “plasmid” that refers to a circular double stranded DNA loop into which additional DNA segment can be ligated. In another embodiment, the vector is a viral vector, wherein an additional DNA segment can be ligated into viral genome. The vectors disclosed herein are capable of self-replicating in a host cell into which they have been introduced (for example, a bacterial vector having a bacterial replication origin and an episomal mammalian vector) or can be integrated into the genome of a host cell upon introduction into host cell, thereby is replicated along with the host genome (e.g., a non-episomal mammalian vector) .
The recombinant expression vector can be obtained by conventional methods in the art, that is, by connecting the nucleic acid molecule of the present invention to various expression vectors, thus being constructed. The expression vector is one of a variety of conventional vectors in the art, as long as it can carry the above-mentioned nucleic acid molecule. The vector preferably includes: various plasmids, cosmids, phage or virus vectors and the like.
The term "transfectoma" , as used herein, includes recombinant eukaryotic host cell expressing the antibody, such as CHO cells, NS/0 cells, HEK293 cells, plant cells, or fungi,  including yeast cells.
The sequence of the DNA molecule for the antibody or a fragment thereof according to the present invention can be obtained by conventional techniques, for example, methods such as PCR amplification or genomic library screening. In addition, the sequences encoding light chain and heavy chain can be fused together, to form a single-chain antibody.
Once a relevant sequence is obtained, the relevant sequence can be obtained in bulk using a recombination method. This is usually carried out by cloning the sequence into a vector, transforming a cell with the vector, and then separating the relevant sequence from the proliferated host cell by conventional methods.
In addition, a relevant sequence can be synthesized artificially, especially when the fragment is short in length. Usually, several small fragments are synthesized first, and then are linked together to obtain a fragment with a long sequence.
At present, it is possible to obtain a DNA sequence encoding the antibody of the present invention (or fragments thereof, or derivatives thereof) completely by chemical synthesis. The DNA sequence can then be introduced into a variety of existing DNA molecules (or, for example, vectors) and cells known in the art. In addition, mutations can also be introduced into the protein sequences of the present invention by chemical synthesis.
In general, under conditions suitable for expression of the antibody according to the present invention, the host cell obtained is cultured. Then, the antibody of the present invention is purified by using conventional immunoglobulin purification steps, for example, the conventional separation and purification means well known to those skilled in the art, such as protein A-Sepharose, hydroxyapatite chromatography, gel electrophoresis, dialysis, ion exchange chromatography, hydrophobic chromatography, molecular sieve chromatography or affinity chromatography.
The monoclonal antibody obtained can be identified by conventional means. For example, the binding specificity of a monoclonal antibody can be determined by immunoprecipitation or an in vitro binding assay (such as radioimmunoassay (RIA) or enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) ) . The binding affinity of a monoclonal antibody can be determined by, for example, the Scatchard analysis (Munson et al., Anal. Biochem., 107: 220 (1980) ) .
The antibody according to the present invention can be expressed in a cell or on the cell membrane, or is secreted extracellularly. If necessary, the recombinant protein can be separated and purified by various separation methods according to its physical, chemical, and other properties. These methods are well known to those skilled in the art. The examples of these methods comprise, but are not limited to, conventional renaturation treatment, treatment by protein precipitant (such as salt precipitation) , centrifugation, cell lysis by osmosis, ultrasonic treatment, super centrifugation, molecular sieve chromatography (gel chromatography) , adsorption chromatography, ion exchange chromatography, high performance liquid chromatography (HPLC) , and any other liquid chromatography, and the combination thereof.
The term "identity" or "consistency" of sequences refers to the relationship between the sequences of two or more polypeptide molecules or two or more nucleic acid molecules, as determined by aligning and aligning sequences. Generally, identity refers to the number or percentage of identical positions shared by two amino acid or nucleic acid sequences, taking into account the number of gaps, and the length of each gap, which need to be introduced for optimal alignment of the two sequences. Generally, before calculating the percentage of identity between  two amino acid or nucleotide sequences, sequence alignment is performed, and gap (if any) is introduced. If the amino acid residues or bases in the two sequences are the same at a certain alignment position, the two sequences are considered to be consistent or matched at that position; If the amino acid residues or bases in the two sequences are different, it is considered that they are inconsistent or mismatched at this position. In some algorithms, the number of matching positions is divided by the total number of positions in the alignment window to obtain sequence consistency. In other algorithms, the number of notches and/or the length of notches are also taken into account. For the purpose of this disclosure, the public alignment software BLAST (which can be found on the web page ncbi. nlm. nih. gov) can be used to obtain the best sequence alignment and calculate the sequence consistency between the two amino acid or nucleotide sequences by using the default settings. When an amino acid sequence is described as being at least 85%or at least 90%or at least 95%identical with another amino acid sequence, the difference in the amino acid sequence may lie in conservative substitution (including all substitutions therein are conservative substitutions) .
The term "variant" of a polypeptide such as for example, an antigen-binding fragment, a protein or an antibody is a polypeptide in which one or more amino acid residues are inserted, deleted, added and/or substituted, as compared to another polypeptide sequence, and includes a fusion polypeptide. In addition, a protein variant includes one modified by protein enzyme cutting, phosphorylation or other posttranslational modification, but maintaining biological activity of the antibody disclosed herein, for example, binding to c-MET and specificity. The variant may be about 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91%, 90%, 89%, 88%, 87%, 86%, 85%, 84%, 83%, 82%, 81%, or 80%identical to the sequence of the antibody or its antigen-binding fragment disclosed herein. The percent identity (%) or homology may be calculated with reference to the following description.
In one embodiment, the percent homology or identity may be calculated as 100 x [ (identical position) /min (TGA, TGB) ] , and in the formula, TGA, TGB are the sum of the number of residues of sequences A and B compared and the internal gap position (Russell et al., J. Mol Biol., 244: 332-350 (1994) .
In the present invention, the antibody of the present invention also includes a conservative variant (or conventional variant) thereof, which means that, compared to the amino acid sequence of the antibody of the present invention, there are up to 10, preferably up to 8 and more preferably up to 5, most preferably up to 3 amino acids are replaced by amino acids with similar or similar properties to form a polypeptide. These conservative variant polypeptides are preferably produced by conservative substitutions according to Table A.
Table A

The term "KD " (M) , as used herein, is intended to refer to the dissociation equilibrium constant of a particular antibody-antigen interaction. “KD” refers to the dissociation constant, which is obtained from the ratio of Kd to Ka (i.e., Kd/Ka) and is expressed as a molar concentration (M) . KD values for antibodies can be determined using methods in the art in view of the present disclosure. For example, the KD of an antibody can be determined by using surface plasmon resonance, such as by using a biosensor system, e.g., a system, or by using bio-layer interferometry technology, such as an Octet RED96 system.
The term "affinity" is the strength of interaction between an antibody or its antigen-binding fragment and an antigen, and it is determined by properties of the antigen such as size, shape and/or charge of antigen, and CDR sequences of the antibody or antigen-binding fragment. The methods for determining the affinity are known in the art, and the followings can be referred.
The antibody or its antigen-binding fragment is called "specifically binding " to its target such as an antigen, when a dissociation constant (KD) is < l0-6 M. The antibody specifically binds to a target with "high affinity" , when KD is < l0-9 M.
The term"Pharmaceutical composition " , as used herein, is intended to refer to a mixture containing one or more of the compounds or a physiological/pharmaceutically acceptable salt or prodrug thereof described herein with other chemical components, such as physiological /pharmaceutically acceptable carriers and excipients. The purpose of the pharmaceutical composition is to promote the administration to the organism, which is beneficial to the absorption of the active ingredient and exerts the biological activity.
"Administration" and "treatment" , when applied to an animal, human, experimental subject, cell, tissue, organ, or biological fluid, refer to contact with an exogenous pharmaceutical, therapeutic, diagnostic reagent, or composition with the animal, human, subject, cell, tissue, organ, or biological fluid. “Administration” and “treatment” can refer, e.g., to therapeutic, pharmacokinetic, diagnostic, research, and experimental methods. Treatment of a cell encompasses contacting the cell with a reagent, as well as contacting a fluid with a reagent, wherein the fluid is in contact with the cell. “Administration” and “treatment” also mean in vitro and ex vivo treatments, e.g., of a cell, by a reagent, diagnostic, binding composition or by another cell. “Treatment, ” when applied to a human, veterinary, or research subject, refers to therapeutic treatment, prophylactic or preventative measures, research and diagnostic applications.
In addition, the present disclosure includes a medicament for treating a disease associated with c-MET, comprising an antibody, an antigen-binding fragment or an antibody-drug conjugate thereof of the present disclosure as an active ingredient.
There is no limitation on the diseases related to c-MET, as long as it is a disease associated with c-MET, for example, the therapeutic response induced by the molecules disclosed in the present disclosure can be reduced by binding human c-MET. Therefore, the molecules of the present disclosure are very useful for those who suffer a tumor, cancer or infectious disease when in preparations and formulations suitable for therapeutic applications.
In addition, the present disclosure relates to a method for immunologically detecting or measuring c-MET, a reagent for immunologically detecting or measuring c-MET, a method for immunologically detecting or measuring cells expressing c-MET, and a diagnostic reagent for diagnosis of disease related to c-MET positive cells, comprising the antibody or antigen-binding fragment of the present disclosure that specifically recognizes human c-MET, as an active ingredient.
In the present disclosure, the method for detecting or determining the amount of c-MET may be any known method. For example, it includes immunodetection or assay.
The immunodetection or assay is a method of detecting or determining the amount of antibody or antigen by using labeled antigen or antibody. Examples of immunodetection or assay include a radioactive substance labeled immunological antibody method (RIA) , an enzyme immunoassay (EIA or ELISA) , a fluorescent immunoassay (FIA) , a luminescent immunoassay, a western blotting method, physicochemical methods, etc.
The above-mentioned diseases related to c-MET positive cells can be diagnosed by detecting or measuring cells expressing c-MET by using the antibodies or antibody fragments thereof of the present invention.
In order to detect cells expressing the polypeptide, a known immunodetection can be used, and preferably immunoprecipitation, fluorescent cell staining or immunohistochemically staining etc. can be used. Furthermore, a fluorescent antibody staining method etc. using FMAT8100HTS system (Applied Bio system) can be used.
EXAMPLE
The invention is further illustrated by the following specific examples. It is to be understood that these examples are for illustrative purposes only and are not intended to limit the scope of the invention. The experimental methods without detailed conditions in the following examples are generally in accordance with the conditions described in the conventional conditions such as Sambrook. J et al. "Guide to Molecular Cloning Laboratory" (translated by Huang Peitang et al., Beijing: Science Press, 2002) , or in accordance with the conditions recommended by the manufacturer (for example, product manuals) . Percentages and parts are by weight unless otherwise stated. The experimental materials and reagents used in the following examples are commercially available unless otherwise specified.
The room temperature described in the examples is a conventional room temperature in the art, and is generally 10-30℃.
Example 1: Preparation of anti-c-MET antibody
Example 1-1: Antigen
A combination of recombinant protein antigen human c-Met His Tag (Acro Biosystems, catalog number MET-H5227) , human c-Met-Fc (R&D systems, catalog number 8614-MT) , cynomolgus c-Met His Tag (Sino Biological, catalog number 90304-C08H) , cynomolgus c-Met-Fc (Sino Biological, catalog number 90304-C02H) , were used to immunize the mice.
Example 1-2: Immunization and screening of the antibody
Immune protocol:
Anti-c-MET antibodies were obtained by immunizing genetically modified mouse encoding human immunoglobulin heavy and kappa light chain variable regions with recombinant protein antigen human c-Met His Tag (Acro Biosystems, catalog number MET-H5227) and human c-Met-Fc (R&D systems, catalog number 8614-MT) , and boosted with cynomolgus c-Met His Tag (Sino Biological, catalog number 90304-C08H) , cynomolgus c-Met-Fc (Sino Biological, catalog number 90304-C02H) , respectively. The antibody immune response was monitored by a c-Met specific immunoassay. When a desired immune response was achieved, splenocytes were harvested from each mouse and fused with mouse myeloma cells to preserve their viability and form hybridoma cells and screened for c-MET specificity.
Spleen cell fusion
The spleen lymphocytes and myeloma cells Sp2/0 (CRL-158) were fused to obtain hybridoma cells by electrofusion or PEG fusion. PEG fusion was performed using ClonacellTM HY technology (STEMCELL technologies) , following manufacturer’s instructions. The primary cell: mouse myeloma cell line ratio was 1: 1 for electrofusion, and 10: 1 for PEG fusion. c-Met specific B cell sorting, sequencing, and recombinant expression
The remaining lymphocytes from the fusion were collected. B cells were isolated by RoboSep Mouse Pan-B cell isolation kit (StemCell) . The isolated B cells were incubated with human c-Met his tag protein (Acro Biosystems, catalog number MET-H5227) and iFluor-488 anti-His antibody (Genscript, catalog number A01800) , and then stained with PE anti-mouse CD19 antibody (BioLegend, catalog number 115508) , F (ab') 2-Goat anti-Mouse IgG (H+L) secondary Antibody, (APC, Invitrogen, catalog number 17-4010-82) , and Zombie Violet Fixable viability dye. Viable cells with CD19 positive, mouse IgG positive, and c-Met binding positive signals were sorted and collected for single B cell sequencing. Barcoded cDNA library was prepared using Chromium next GEM single cell V (D) J reagent kits v1.1 (10X Genomics) , and then subjected for next-generation sequencing.
VH and VL region of selected sequences were cloned into pFUSE-CHIg_hG1 vector (InvivoGen #pfuse-hchg1) , which in-frame with constant region of hIgG1 heavy chain in the vector, and pFUSE2-CLIg_hk vector (InvivoGen, #pfuse2-hclk) , which in-frame with constant region of hIg kappa light chain in the vector, respectively. The heavy and light chain expression plasmid and were co-transfected into into ExpiCHO-Scells (Thermo Fisher #A29127) using ExpiFectamine CHO Transfection Kit (Thermo Fisher, A29129) . The culture supernatant of each clone was collected for further characterization. The recombinant IgG form of antibodies NGS28, NGS57, NGS75, NGS91, NGS95, NGS111 were obtained.
Screening of hybridoma clones specifically binding to human c-Met protein by ELISA
ELISA was performed using the DuoSet ELISA Ancillary Kit (R&D System, DY008) . ELISA plates were coated with 1 μg/ml of human c-Met His Tag (Acro Biosystems, catalog number MET-H5227) , human MSPR/Ron protein His Tag (1947-MS-050) or BSA overnight. Excess unbound proteins were washed off by washing the plates three times with the wash buffer before blocking for 1 hour at room temperature. 50 μl c-Met hybridoma supernatant was added in each well and incubated for 1 hour. Excess unbound antibodies were washed off and 50 μl of 1:30000 diluted secondary antibody Goat anti-mouse IgG Fc-HRP (ab5870) was added to each well for another 1 hour. Plates were washed before the addition 50 μL of chemiluminescence agents (color A and color B) according to manufacturer's protocol. The reactions were stopped using 25 μL of 2 N sulfuric acid. Optical density at 450nm of samples was measured by a microplate reader (PerkinElmer) . Eleven hybridoma clones with binding selectivity to human c-Met but not to human MSRP/Ron nor BSA, demonstrating c-Met specificity were selected (Table 1) .
Table 1. Binding characterization of hybridoma clones to human c-Met protein by ELISA assay (OD450)
Screening of hybridoma clones and B cell sequencing clones specifically binding to c-Met expressing cancer cells by flow cytometry
Hybridoma supernatants and recombinant expression culture supernatants was subjected to binding tests on c-Met positive cell line Hs746T (ATCC-HTB-135) , HT29 (ATCC, HTB-38) , and c-Met negative cell line T47D (ATCC, HTB-133) using flow cytometry analysis. Briefly, 50 μL of cells in cell staining buffer (2×106 cells/mL) was mixed with 50 μL undiluted supernatants. The mixture was incubated on ice for 20 min and then washed with ice cold staining buffer twice. The cells were subsequently stained with 50 μL of PE labelled secondary antibody (1: 400 dilution, BioLegend, Cat#405307) for 20 min. After washing by staining buffer and fixing by 4%PFA, cells were analyzed by flow cytometry. A purified anti-human c-Met antibody was used as positive control (R&D Systems Cat#MAB3582) . A purified mouse IgG1 antibody was used as isotype control (Biolegend, Cat#400102) . Figure 1 shows examples of selected cell binding signals measured by flow cytometry. The hybridoma clones 2H12, 5A8, 7B12, 9D10, 14B6, 14C4, 15A8, 15F7, 17C2, 19E1, 27E10, and B cell sequencing clones NGS28, NGS57, NGS75, NGS91, NGS95, NGS111 were identified with enhanced binding profile to Hs746T cells and HT-29 cells  compared to T47D cells.
Screening of hybridoma clones with cell internalization activity by indirect killing assay
Cell internalization activity of hybridoma supernatants were measured using an indirect killing assay in SNU-5 cells. The SNU-5 cells were seeded in 96 well plate at 1, 500 cells/well and incubated overnight. The hybridoma supernatants from each hybridoma clone were diluted with hybridoma culture medium and mixed with Fab anti-mouse IgG Fc-MMAF conjugates with cleavable linker (Moradec, AM-202AF) , then added to each well. The final concentrations of mouse IgG were roughly 10 nM, 2 nM, and 0.4 nM. The final concentration of the Fab anti-mouse IgG Fc-MMAF conjugates in each well was 50 nM. With the presence of secondary Fab-vc-MMAF, the internalized antibody/Fac-vc-MMAF conjugates complex will release the cytotoxic payload and kill the cells. After 3 days incubation, the viable cells in each well were detected by Cell Titer Glo 2.0 assay (Promega, G9243) . A purified anti-human c-Met antibody was used as positive control (R&D Systems Cat#MAB3582) . A purified mouse IgG1 antibody was used as isotype control (Biolegend, Cat#400102) . Cells treated with selected hybridoma supernatants showed reduced viability, as shown in Figure 2, indicating the internalization of the antibodies. The clones 2H12, 5A8, 7B12, 9D10, 14B6, 14C4, 15A8, 15F7, 17C2, 19E1, 27E10 were identified to be capable of internalizing into c-Met positive cell line using the indirect killing assay.
Example 1-3: Sequencing of positive hybridoma clones
The process of cloning sequences from positive hybridomas are as follows. The logarithmic growth phase hybridoma cells were collected, RNA was extracted, and reverse transcription was performed then followed by VDJ region amplification. Amplified cDNA library from each clone were subjected to next-generation sequencing. The amino acid sequences of the heavy and light chain variable region DNA sequences corresponding to the antibodies 2H12, 5A8, 7B12, 9D10, 14B6, 14C4, 15A8, 15F7, 17C2, 19E1, 27E10 were obtained.
From above, 17 antibody clones screened from hybridomas and B cells binding to the recombinant human c-MET protein and c-MET expressing cell line were sorted. The amino acid sequence of heavy chain variable and light chain variable regions and CDR sequence of each antibody are as the following tables (Table 2 to Table 4) . The amino acid residues of the CDRs in VH/VL are numbered and annotated according to the Kabat numbering system.
Table 2. CDR sequence of heavy chain variable domain for c-Met hybridoma clones and clones from single B cell sequencing.

Table 3. CDR sequence of light chain variable domain for c-Met hybridoma clones and clones from single B cell sequencing.

Table 4. Sequences of heavy chain and light chain variable domains for c-Met hybridoma clones and clones from single B cell sequencing.


Example 2: Construction and Expression of anti-c-Met Recombinant Antibody
Example 2-1: Molecular cloning of recombinant antibodies
The cDNA sequences that encode VH and VL regions of the selected 17 clones were directly synthesized as DNA fragments with 5’ -end in-frame leader sequence (MGWSCIILFLVATATGVHS) . These DNA fragments were cloned into selected vectors using NEBuilder DNA Assembly Cloning Kit (New England Biolabs) . VH region was cloned into pFUSE-CHIg_hG1 vector (InvivoGen #pfuse-hchg1) , which in-frame with constant region of hIgG1 heavy chain in the vector. VL region was cloned into pFUSE2-CLIg_hk vector (InvivoGen, #pfuse2-hclk) , which in-frame with constant region of hIg kappa light chain in the vector. The amino acid sequences of the constant region of hIgG1 heavy chain and the constant region of hIg kappa light chain are as follow:
>Heavy chain constant region (SEQ ID NO: 119) :
>Light chain constant region (SEQ ID NO: 120) :
Table 5. Sequences of heavy chain and light chain for c-Met hybridoma clones and clones from single B cell sequencing.







Example 2-2: Expression and purification of recombinant antibodies
The heavy chain expression plasmid and light chain plasmids were co-transfected into Expi293F cells (ThermoFisher, #A14527) using ExpiFectamine 293 Transfection Kit (ThermoFisher, A14524) , or into ExpiCHO-Scells (ThermoFisher #A29127) using ExpiFectamine CHO Transfection Kit (ThermoFisher, A29129) . Based on the manufacturer’s instructions, plasmid DNA concentration reached 1.0 ug per ml of suspended cells, with LC: HC vector ratio 1: 1. The transfected cells were cultured 5 to 7 days on an orbital shaker at 37 ℃, 8%CO2. Conditioned medium was collected and antibodies were purified using HiTrap MabSelect SuRe column (Cytiva, #17549112) on AKTA Pure 25 machine (Cytiva) . Eluted antibodies were neutralized with Tris Buffer (pH 9.0) and subjected to PBS buffer exchange. Product concentration was measured by UV absorption, and quality was determined by SDS-PAGE and HPLC.
Example 3: Binding characterization of anti-c-Met recombinant antibody to c-Met positive and c-Met negative cell lines by flow cytometry
Binding of the hIgGl mAbs of Example 2 to the cell surface c-MET was determined by FACS analysis using cancer cell lines including c-Met positive cancer cell Hs746T cells and c-Met negative cancer cell SNU-1 cells.
Hs746T cells were maintained in DMEM medium supplemented with 10%FBS and 1%penicillin and streptomycin. SNU-1 cells were maintained in RPMI-1640 medium supplemented with 10%FBS and 1%penicillin and streptomycin. Both cell lines were cultured at 37℃ with 5%CO2 in humidified atmosphere.
To determine the binding of hIgG1 mAbs to cell surface c-Met receptors, cells were first harvested and resuspended in cell staining buffer (BioLegend) at 2×106 cells/mL. Then, the cells were treated with human Fc receptor blocking reagent (BioLegend) on the ice for 10 min. The resulting cell suspension was aliquoted into 50 μL aliquots. 50 μL of hIgG1 mAbs at various concentrations were mixed with the cell aliquots, the final concentration of hIgG1 mAbs in the mixture ranged from 1.1 pM to 200 nM. The cells were incubated on the ice for 1 hour and then washed with cell staining buffer twice. 50 μL of secondary antibody (PE conjugated goat anti-human Fc, eBioscienceTM, 1: 200 dilution) was added to each sample to resuspend the cells. The cells were incubated on the ice for another 30 min. Cells were subsequently washed twice with cell staining buffer and resuspended in 4%PFA to fix the cells. The samples were analyzed using iQue3 to measure the median fluorescence intensity using corresponding channels. The  result was disclosed in Figure 3 and Table 6. As a result, it was confirmed that the anti-c-Met antibody of the present invention specifically binds to the human c-Met as originally expressed in cells in a concentration-dependent pattern.
Table 6. KD values of anti-c-Met recombinant antibodies binding to c-Met positive Hs746T cells
Example 4: Characterization of anti-c-Met recombinant antibody cell internalization in c-Met expression cells by indirect killing assay
To evaluate the endocytosis of the antibodies induced by anti-c-Met antibodies binding, an indirect killing assay was used to characterize the antibody internalization. Fab anti-human IgG Fc-MMAF conjugates with cleavable linker (Moradec, AH-202AF) was incubated and complexed with the recombinant anti-c-Met antibodies. The formed complexes were then incubated with c-Met expressing cells. Upon binding to the cell surface c-Met receptors, the complexes were internalized and release the conjugated MMAF after lysosomal cleavage of the linker. The released MMAF subsequently inhibited the cell division by blocking the polymerization of tubulin. Briefly, a c-Met expressing cell line SNU-5 cells were seeded in 96-well plate at 1, 500 cells/well and incubated overnight. The recombinant anti-c-Met antibodies were mixed with the Fab anti-human IgG Fc-MMAF conjugates with cleavable linker at 1: 6 ratio (mol/mol) and incubated for 10 min to form the complex. Then, a series dilution of the complexes, 1.5 pM to 10 nM, were added to each well and incubate for 72 hours. The cell viability was measured by Cell Titer Glo 2.0 assay (Promega, G9243) . The dose-response curves were plotted and fitted by GraphPad Prism 9. As shown in the Figure 4 and Table 7, all the anti-c-Met antibodies of the present invention have a potent cytotoxicity, indicating MMAF was delivered into the cells efficiently. the anti-c-Met antibodies have sufficient internalization.
Table 7. IC50 of indirect killing assay to evaluate the internalization of recombinant anti-c-Met antibodies in SNU-5 cells.

Example 5: Characterization of anti-c-Met recombinant antibody cell internalization in c-Met expression cells
To explore the possibility of developing ADC strategy with the c-Met antibodies of the invention, the inventors evaluated endocytosis of the antibodies induced by c-Met-antibody binding. In the assay, EBC-1 cells were collected and suspended in ice cold staining buffer (PBS with 0.5%FBS) at 2×106 cells/mL, followed by treating with human Fc receptor blocking reagent (BioLegend, 422302) . The cells were then pre-incubated with Alexa Fluor 488 labelled antibodies on ice for 1 hour. After incubation, cells were transfer to 37℃incubator. At predetermined time point (0 min, 15 min, 30 min, 45 min, 1 hour, 2 hour, 4 hour, 6 hour) , 50 μL of the cell suspension were aliquoted and transferred to incubate on ice till end of the incubation for internalization. Then, all aliquoted samples were washed twice with ice cold staining buffer. Cell surface bound Alexa Fluor 488 signal was quenched by anti-Alexa Fluor antibody (Invitrogen, A-11094) . The remaining signals inside the cells, resulting from internalization, were then analyzed by flow cytometry. An additional 50 μL aliquot of the cells at 0 min was collected kept on ice and analyzed by flow cytometry without quenching. The sample was served as control for 100%cell surface binding signal. The amount of internalized antibodies were calculated and normalized to 100%cell surface binding signal of each antibody, as calculated by the following equation:
Normalized Internalization (%) = (MFIt-MFIt0) / (MFItotal-MFIt0) ×100%
Internalization results based on median fluorescence intensity (MFI) . MFIt is the MFI of samples collected at time t; MFIt0 is the MFI of samples collected at time 0 minute. MFItotal is the MFI of the additional sample collected and served as control for 100%cell surface binding signal.
Table 8. Internalization kinetics of anti-c-Met recombinant antibodies in c-Met+ EBC-1 cells.
As shown in Figure 5 and Table 8, strong internalization signals in EBC-1 cells were observed for anti-c-Met antibodies NGS75, 9D10, 14C4.

Claims (21)

  1. An anti-c-MET antibody or an antigen-binding fragment thereof comprising: a heavy chain variable region and a light chain variable region, wherein:
    the heavy chain variable region comprises:
    HCDR1 having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 05,
    HCDR2 having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 20, and
    HCDR3 having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 36 respectively;
    or
    HCDR1 having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 03,
    HCDR2 having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 18, and
    HCDR3 having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 34 respectively;
    or
    HCDR1 having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 01,
    HCDR2 having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 16, and
    HCDR3 having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 32, respectively;
    or
    HCDR1 having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 02,
    HCDR2 having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 17, and
    HCDR3 having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 33 respectively;
    or
    HCDR1 having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 04,
    HCDR2 having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 19, and
    HCDR3 having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 35 respectively;
    or
    HCDR1 having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 01,
    HCDR2 having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 21, and
    HCDR3 having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 37 respectively;
    or
    HCDR1 having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 06,
    HCDR2 having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 22, and
    HCDR3 having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 38 respectively;
    or
    HCDR1 having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 07,
    HCDR2 having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 23, and
    HCDR3 having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 39 respectively;
    or
    HCDR1 having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 08,
    HCDR2 having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 24, and
    HCDR3 having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 40 respectively;
    or
    HCDR1 having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 09,
    HCDR2 having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 25, and
    HCDR3 having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 41 respectively;
    or
    HCDR1 having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 10,
    HCDR2 having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 26, and
    HCDR3 having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 42 respectively;
    or
    HCDR1 having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 06,
    HCDR2 having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 27, and
    HCDR3 having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 43 respectively;
    or
    HCDR1 having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 11,
    HCDR2 having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 28, and
    HCDR3 having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 44 respectively;
    or
    HCDR1 having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 12,
    HCDR2 having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 16, and
    HCDR3 having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 32 respectively;
    or
    HCDR1 having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 13,
    HCDR2 having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 29, and
    HCDR3 having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 45 respectively;
    or
    HCDR1 having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 14,
    HCDR2 having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 30, and
    HCDR3 having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 46 respectively;
    or
    HCDR1 having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 15,
    HCDR2 having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 31, and
    HCDR3 having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 39 respectively;
    and/or
    the light chain variable region comprises:
    LCDR1 having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 51,
    LCDR2 having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 60, and
    LCDR3 having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 75, respectively;
    or
    LCDR1 having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 49,
    LCDR2 having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 62, and
    LCDR3 having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 73, respectively;
    or
    LCDR1 having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 47,
    LCDR2 having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 60, and
    LCDR3 having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 71, respectively;
    or
    LCDR1 having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 48,
    LCDR2 having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 61, and
    LCDR3 having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 72, respectively;
    or
    LCDR1 having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 50,
    LCDR2 having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 60, and
    LCDR3 having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 74, respectively;
    or
    LCDR1 having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 50,
    LCDR2 having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 60, and
    LCDR3 having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 71, respectively;
    or
    LCDR1 having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 52,
    LCDR2 having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 63, and
    LCDR3 having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 76, respectively;
    or
    LCDR1 having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 53,
    LCDR2 having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 64, and
    LCDR3 having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 77, respectively;
    or
    LCDR1 having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 48,
    LCDR2 having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 65, and
    LCDR3 having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 78, respectively;
    or
    LCDR1 having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 54,
    LCDR2 having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 66, and
    LCDR3 having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 79, respectively;
    or
    LCDR1 having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 55,
    LCDR2 having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 67, and
    LCDR3 having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 80, respectively;
    or
    LCDR1 having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 51,
    LCDR2 having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 60, and
    LCDR3 having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 81, respectively;
    or
    LCDR1 having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 56,
    LCDR2 having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 68, and
    LCDR3 having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 82, respectively;
    or
    LCDR1 having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 57,
    LCDR2 having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 69, and
    LCDR3 having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 83, respectively;
    or
    LCDR1 having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 58,
    LCDR2 having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 70, and
    LCDR3 having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 84, respectively;
    or
    LCDR1 having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 59,
    LCDR2 having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 64, and
    LCDR3 having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 85, respectively.
  2. The anti-c-MET antibody or antigen-binding fragment thereof according to claim 1, wherein:
    a) a heavy chain variable region comprises HCDR1, HCDR2 and HCDR3 having the amino acid sequences as shown in SEQ ID NO: 05, SEQ ID NO: 20 and SEQ ID NO: 36, respectively; and a light chain variable region comprises LCDR1, LCDR2 and LCDR3 having the amino acid sequences as shown in SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 60 and SEQ ID NO: 75, respectively;
    or
    b) a heavy chain variable region comprises HCDR1, HCDR2 and HCDR3 having the amino acid sequences as shown in SEQ ID NO: 03, SEQ ID NO: 18 and SEQ ID NO: 34, respectively; and a light chain variable region comprises LCDR1, LCDR2 and LCDR3 having the amino acid sequences as shown in SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 62 and SEQ ID NO: 73, respectively;
    or
    c) a heavy chain variable region comprises HCDR1, HCDR2 and HCDR3 having the amino acid sequences as shown in SEQ ID NO: 01, SEQ ID NO: 16 and SEQ ID NO: 32, respectively; and a light chain variable region comprises LCDR1, LCDR2 and LCDR3 having the amino acid sequences as shown in SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 60 and SEQ ID NO: 71, respectively;
    or
    d) a heavy chain variable region comprises HCDR1, HCDR2 and HCDR3 having the amino acid sequences as shown in SEQ ID NO: 02, SEQ ID NO: 17 and SEQ ID NO: 33, respectively; and a light chain variable region sequence comprises LCDR1, LCDR2 and LCDR3 having the amino acid sequences as shown in SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 61 and SEQ ID NO: 72, respectively;
    or
    e) a heavy chain variable region comprises HCDR1, HCDR2 and HCDR3 having the amino acid sequences as shown in SEQ ID NO: 04, SEQ ID NO: 19 and SEQ ID NO: 35, respectively; and a light chain variable region comprises LCDR1, LCDR2 and LCDR3 having the amino acid sequences as shown in SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 60 and SEQ ID NO: 74, respectively;
    or
    f) a heavy chain variable region comprises HCDR1, HCDR2 and HCDR3 having the amino acid sequences as shown in SEQ ID NO: 01, SEQ ID NO: 21 and SEQ ID NO: 37, respectively; and a light chain variable region comprises LCDR1, LCDR2 and LCDR3 having the amino acid sequences as shown in SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 60 and SEQ ID NO: 71, respectively;
    or
    g) a heavy chain variable region comprises HCDR1, HCDR2 and HCDR3 having the amino acid sequences as shown in SEQ ID NO: 06, SEQ ID NO: 22 and SEQ ID NO: 38, respectively; and a light chain variable region comprises LCDR1, LCDR2 and LCDR3 having the amino acid sequences as shown in SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 63and SEQ ID NO: 76, respectively;
    or
    h) a heavy chain variable region comprises HCDR1, HCDR2 and HCDR3 having the amino acid sequences as shown in SEQ ID NO: 07, SEQ ID NO: 23 and SEQ ID NO: 39, respectively; and a  light chain variable region comprises LCDR1, LCDR2 and LCDR3 having the amino acid sequences as shown in SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 64and SEQ ID NO: 77, respectively;
    or
    i) a heavy chain variable region comprises HCDR1, HCDR2 and HCDR3 having the amino acid sequences as shown in SEQ ID NO: 08, SEQ ID NO: 24 and SEQ ID NO: 40, respectively; and a light chain variable region comprises LCDR1, LCDR2 and LCDR3 having the amino acid sequences as shown in SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 65 and SEQ ID NO: 78, respectively;
    or
    j) a heavy chain variable region comprises HCDR1, HCDR2 and HCDR3 having the amino acid sequences as shown in SEQ ID NO: 09, SEQ ID NO: 25 and SEQ ID NO: 41, respectively; and a light chain variable region comprises LCDR1, LCDR2 and LCDR3 having the amino acid sequences as shown in SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 66 and SEQ ID NO: 79, respectively;
    or
    k) a heavy chain variable region comprises HCDR1, HCDR2 and HCDR3 having the amino acid sequences as shown in SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 26 and SEQ ID NO: 42, respectively; and a light chain variable region comprises LCDR1, LCDR2 and LCDR3 having the amino acid sequences as shown in SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 67 and SEQ ID NO: 80, respectively;
    or
    l) a heavy chain variable region comprises HCDR1, HCDR2 and HCDR3 having the amino acid sequences as shown in SEQ ID NO: 06, SEQ ID NO: 27 and SEQ ID NO: 43, respectively; and a light chain variable region comprises LCDR1, LCDR2 and LCDR3 having the amino acid sequences as shown in SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 60 and SEQ ID NO: 81, respectively;
    or
    m) a heavy chain variable region comprises HCDR1, HCDR2 and HCDR3 having the amino acid sequences as shown in SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 28 and SEQ ID NO: 44, respectively; and a light chain variable region comprises LCDR1, LCDR2 and LCDR3 having the amino acid sequences as shown in SEQ ID NO: 56, SEQ ID NO: 68 and SEQ ID NO: 82, respectively;
    or
    n) a heavy chain variable region comprises HCDR1, HCDR2 and HCDR3 having the amino acid sequences as shown in SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 16 and SEQ ID NO: 32, respectively; and a light chain variable region comprises LCDR1, LCDR2 and LCDR3 having the amino acid sequences as shown in SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 60 and SEQ ID NO: 71, respectively;
    or
    o) a heavy chain variable region comprises HCDR1, HCDR2 and HCDR3 having the amino acid sequences as shown in SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 29 and SEQ ID NO: 45, respectively; and a light chain variable region comprises LCDR1, LCDR2 and LCDR3 having the amino acid sequences as shown in SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 69 and SEQ ID NO: 83, respectively;
    or
    p) a heavy chain variable region comprises HCDR1, HCDR2 and HCDR3 having the amino acid sequences as shown in SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 30 and SEQ ID NO: 46, respectively; and a light chain variable region comprises LCDR1, LCDR2 and LCDR3 having the amino acid sequences as shown in SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 70 and SEQ ID NO: 84, respectively;
    or
    q) a heavy chain variable region comprises HCDR1, HCDR2 and HCDR3 having the amino acid sequences as shown in SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 31 and SEQ ID NO: 39, respectively; and a light chain variable region comprises LCDR1, LCDR2 and LCDR3 having the amino acid sequences as shown in SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 64 and SEQ ID NO: 85, respectively.
  3. The anti-c-MET antibody or antigen-binding fragment thereof according to claim 1 or 2, wherein the antibody or antigen-binding fragment thereof is selected from murine antibody, chimeric antibody, humanized antibody, human antibody or the antigen-binding fragment thereof.
  4. The anti-c-MET antibody or antigen-binding fragment thereof according to any one of claims 1-3, wherein the antibody or antigen-binding fragment thereof comprises: a heavy chain variable region comprising an amino acid sequence selected from: SEQ ID NOs: 86-102, or sequence having at least 80%, 85%, 90%, 95%or 99%sequence identity therewith; and/or a light chain variable region comprising an amino acid sequence selected from: SEQ ID NOs: 103-118, or sequence having at least 80%, 85%, 90%, 95%or 99%sequence identity therewith.
  5. The anti-c-MET antibody or antigen-binding fragment thereof according to claim 4, wherein the antibody or antigen-binding fragment thereof comprising:
    a) the heavy chain variable region having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 90, or having the amino acid sequence of at least 80%, 85%, 90%, 95%or 99%sequence identity therewith; and/or the light chain variable region having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 107, or having the amino acid sequence of at least 80%, 85%, 90%, 95%or 99%sequence identity therewith;
    or
    b) the heavy chain variable region having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 88, or having the amino acid sequence of at least 80%, 85%, 90%, 95%or 99%sequence identity therewith; and/or the light chain variable region having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 105, or having the amino acid sequence of at least 80%, 85%, 90%, 95%or 99%sequence identity therewith;
    or
    c) the heavy chain variable region having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 86, or having the amino acid sequence of at least 80%, 85%, 90%, 95%or 99%sequence identity therewith; and/or the light chain variable region having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 103, or having the amino acid sequence of at least 80%, 85%, 90%, 95%or 99%sequence identity therewith;
    or
    d) the heavy chain variable region having the amino acid sequence as shown SEQ ID NO: 87, or having the amino acid sequence of at least 80%, 85%, 90%, 95%or 99%sequence identity therewith; and/or the light chain variable region having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 104, or having the amino acid sequence of at least 80%, 85%, 90%, 95%or 99%sequence identity therewith;
    or
    e) the heavy chain variable region having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 89, or having the amino acid sequence of at least 80%, 85%, 90%, 95%or 99%sequence identity  therewith; and/or the light chain variable region having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 106, or having the amino acid sequence of at least 80%, 85%, 90%, 95%or 99%sequence identity therewith;
    or
    f) the heavy chain variable region having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 91, or having the amino acid sequence of at least 80%, 85%, 90%, 95%or 99%sequence identity therewith; and/or the light chain variable region having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 108, or having the amino acid sequence of at least 80%, 85%, 90%, 95%or 99%sequence identity therewith;
    or
    g) the heavy chain variable region having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 92, or having the amino acid sequence of at least 80%, 85%, 90%, 95%or 99%sequence identity therewith; and/or the light chain variable region having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 109, or having the amino acid sequence of at least 80%, 85%, 90%, 95%or 99%sequence identity therewith;
    or
    h) the heavy chain variable region having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 93, or having the amino acid sequence of at least 80%, 85%, 90%, 95%or 99%sequence identity therewith; and/or the light chain variable region having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 110, or having the amino acid sequence of at least 80%, 85%, 90%, 95%or 99%sequence identity therewith;
    or
    i) the heavy chain variable region having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 94, or having the amino acid sequence of at least 80%, 85%, 90%, 95%or 99%sequence identity therewith; and/or the light chain variable region having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 111, or having the amino acid sequence of at least 80%, 85%, 90%, 95%or 99%sequence identity therewith;
    or
    j) the heavy chain variable region having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 95, or having the amino acid sequence of at least 80%, 85%, 90%, 95%or 99%sequence identity therewith; and/or the light chain variable region having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 112, or having the amino acid sequence of at least 80%, 85%, 90%, 95%or 99%sequence identity therewith;
    or
    k) the heavy chain variable region having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 96, or having the amino acid sequence of at least 80%, 85%, 90%, 95%or 99%sequence identity therewith; and/or the light chain variable region having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 113, or having the amino acid sequence of at least 80%, 85%, 90%, 95%or 99%sequence identity therewith;
    or
    l) the heavy chain variable region having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 97, or having the amino acid sequence of at least 80%, 85%, 90%, 95%or 99%sequence identity therewith; and/or the light chain variable region having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 114, or having the amino acid sequence of at least 80%, 85%, 90%, 95%or 99%sequence  identity therewith;
    or
    m) the heavy chain variable region having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 98, or having the amino acid sequence of at least 80%, 85%, 90%, 95%or 99%sequence identity therewith; and/or the light chain variable region having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 115, or having the amino acid sequence of at least 80%, 85%, 90%, 95%or 99%sequence identity therewith;
    or
    n) the heavy chain variable region having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 99, or having the amino acid sequence of at least 80%, 85%, 90%, 95%or 99%sequence identity therewith; and/or the light chain variable region having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 108, or having the amino acid sequence of at least 80%, 85%, 90%, 95%or 99%sequence identity therewith;
    or
    o) the heavy chain variable region having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 100, or having the amino acid sequence of at least 80%, 85%, 90%, 95%or 99%sequence identity therewith; and/or the light chain variable region having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 116, or having the amino acid sequence of at least 80%, 85%, 90%, 95%or 99%sequence identity therewith;
    or
    p) the heavy chain variable region having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 101, or having the amino acid sequence of at least 80%, 85%, 90%, 95%or 99%sequence identity therewith; and/or the light chain variable region having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 117, or having the amino acid sequence of at least 80%, 85%, 90%, 95%or 99%sequence identity therewith;
    or
    q) the heavy chain variable region having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 102, or having the amino acid sequence of at least 80%, 85%, 90%, 95%or 99%sequence identity therewith; and/or the light chain variable region having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 118, or having the amino acid sequence of at least 80%, 85%, 90%, 95%or 99%sequence identity therewith.
  6. The anti-c-MET antibody or antigen-binding fragment thereof according to claim 5, wherein the antibody or antigen-binding fragment thereof comprising:
    a) the heavy chain variable region having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 90; and/or the light chain variable region having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 107;
    b) the heavy chain variable region having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 88; and/or the light chain variable region having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 105;
    c) the heavy chain variable region having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 86; and/or the light chain variable region having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 103;
    d) the heavy chain variable region having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 87;  and/or the light chain variable region having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 104;
    e) the heavy chain variable region having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 89; and/or the light chain variable region having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 106;
    f) the heavy chain variable region having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 91; and/or the light chain variable region having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 108;
    g) the heavy chain variable region having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 92; and/or the light chain variable region having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 109;
    h) the heavy chain variable region having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 93; and/or the light chain variable region having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 110;
    i) the heavy chain variable region having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 94; and/or the light chain variable region having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 111;
    j) the heavy chain variable region having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 95; and/or the light chain variable region having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 112;
    k) the heavy chain variable region having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 96; and/or the light chain variable region having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 113;
    l) the heavy chain variable region having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 97; and/or the light chain variable region having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 114;
    m) the heavy chain variable region having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 98; and/or the light chain variable region having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 115;
    n) the heavy chain variable region having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 99; and/or the light chain variable region having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 108;
    o) the heavy chain variable region having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 100; and/or the light chain variable region having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 116;
    p) the heavy chain variable region having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 101; and/or the light chain variable region having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 117; or
    q) the heavy chain variable region having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 102; and/or the light chain variable region having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 118.
  7. The anti-c-MET antibody or antigen-binding fragment thereof according to claim 6, wherein the antibody or antigen-binding fragment thereof comprising:
    a) the heavy chain variable region having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 90; and the light chain variable region having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 107;
    b) the heavy chain variable region having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 88; and the light chain variable region having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 105;
    c) the heavy chain variable region having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 86; and the light chain variable region having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 103;
    d) the heavy chain variable region having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 87; and the light chain variable region having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 104;
    e) the heavy chain variable region having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 89; and the light chain variable region having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 106;
    f) the heavy chain variable region having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 91; and the light chain variable region having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 108;
    g) the heavy chain variable region having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 92; and the light chain variable region having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 109;
    h) the heavy chain variable region having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 93; and the light chain variable region having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 110;
    i) the heavy chain variable region having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 94; and the light chain variable region having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 111;
    j) the heavy chain variable region having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 95; and the light chain variable region having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 112;
    k) the heavy chain variable region having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 96; and/or the light chain variable region having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 113;
    l) the heavy chain variable region having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 97; and the light chain variable region having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 114;
    m) the heavy chain variable region having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 98; and the light chain variable region having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 115;
    n) the heavy chain variable region having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 99; and the light chain variable region having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 108;
    o) the heavy chain variable region having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 100; and the light chain variable region having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 116;
    p) the heavy chain variable region having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 101; and the light chain variable region having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 117; or
    q) the heavy chain variable region having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 102; and the light chain variable region having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 118.
  8. The anti-c-MET antibody or antigen-binding fragment thereof according to any one of claim 1-7, wherein the antibody is a full-length antibody, further comprising human antibody constant regions;
    preferably, the heavy chain constant region of the human antibody constant regions is selected from constant regions of human IgG1, IgG2, IgG3 and IgG4 and conventional variants thereof, and the light chain constant region of the human antibody constant regions is selected from κ and λ chain constant regions of human antibody and conventional variants thereof;
    more preferably the full-length antibody comprises a human antibody heavy chain constant region of SEQ ID NO: 119 and a human light chain constant region of SEQ ID NO: 120.
  9. The anti-c-MET antibody or antigen-binding fragment thereof according to any one of claim 1-8, wherein the antibody or antigen-binding fragment thereof comprising:
    a) a heavy chain having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 125 and a light chain having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 142;
    b) a heavy chain having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 123 and a light chain having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 140;
    c) a heavy chain having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 121 and a light chain having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 138;
    d) a heavy chain having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 122 and a light chain having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 139;
    e) a heavy chain having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 124 and a light chain having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 141;
    f) a heavy chain having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 126 and a light chain having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 143;
    g) a heavy chain having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 127 and a light chain having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 144;
    h) a heavy chain having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 128 and a light chain having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 145;
    i) a heavy chain having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 129 and a light chain having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 146;
    j) a heavy chain having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 130 and a light chain having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 147;
    k) a heavy chain having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 131 and a light chain having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 148;
    l) a heavy chain having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 132 and a light chain having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 149;
    m) a heavy chain having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 133 and a light chain having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 150;
    n) a heavy chain having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 134 and a light chain having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 151;
    o) a heavy chain having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 135 and a light chain having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 152;
    p) a heavy chain having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 136 and a light chain having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 153; or
    q) a heavy chain having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 137 and a light chain having the amino acid sequence as shown in SEQ ID NO: 154.
  10. The anti-c-MET antibody or antigen-binding fragment thereof according to claim 1-9, wherein the antigen-binding fragment is selected from the group consisting of Fab, Fab', F (ab') 2, variable fragment (Fv) , Fd fragment, dAb fragment, single chain variable fragment (scFv) , dimerized domain V (diabody) , disulfide stabilized Fv (dsFv) and CDR-containing peptides.
  11. A bispecific or multispecific binding molecule, which comprises the antibody or antigen-binding fragment thereof according to any one of claims 1-10.
  12. An immunoconjugate, which comprises the antibody or antigen-binding fragment thereof according to any one of claims 1-10.
  13. An isolated nucleic acid molecule encoding the antibody or the antigen-binding fragment thereof according to any one of claims 1-10.
  14. A recombinant vector comprising the isolated nucleic acid molecule according to claim 13.
  15. A host cell comprising the recombinant vector according to claim 14, wherein the host cell is selected from the group consisting of a prokaryotic cell and a eukaryotic cell, preferably a eukaryotic cell, more preferably a mammalian cell.
  16. A method for producing the antibody or the antigen-binding fragment thereof according to any one of claims 1-10, wherein the method comprises culturing the host cell according to claim 15 in a medium to produce and accumulate the antibody or the antigen-binding fragment thereof according to any one of claims 1-10, and harvesting the antibody or the antigen-binding fragment thereof from the culture.
  17. A method for immunologically detecting or measuring c-MET, wherein the method comprises detecting the c-MET by contacting with the anti-c-MET antibody or antigen-binding fragment thereof of any one of claims 1-10.
  18. A method for diagnosing a disease related to a human c-MET positive cell, wherein the method comprises a detecting or measuring the c-MET or c-MET positive cell by contacting with the anti-c-MET antibody or antigen-binding fragment thereof of any one of claims 1-10.
  19. A pharmaceutical composition, which comprises the anti-c-MET antibody or the antigen-binding fragment thereof according to any one of claims 1-10, and one or more pharmaceutically acceptable carriers, diluents, or excipients.
  20. A method of treatment or prevention of a disease related to overexpression of c-MET, comprising
    a step of administering a therapeutically effective amount of the antibody or its antigen-binding fragment according to any one of claims 1-10, or the pharmaceutical composition of claim 19, to a subject in need thereof.
  21. The method of treatment or prevention of a disease related to overexpression of c-MET according to claim 20, wherein the disease related to overexpression of c-MET is cancer; preferably the cancer is lung cancer, gastric cancer, colorectal cancer, head and neck cancer, kidney cancer, pancreatic cancer, breast cancer, ovarian cancer, liver cancer, bladder cancer and  hypopharyngeal cancer.
PCT/CN2023/140296 2022-12-20 2023-12-20 Antibody, antigen-binding fragment thereof, and pharmaceutical use thereof Ceased WO2024131846A1 (en)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US202263476185P 2022-12-20 2022-12-20
US63/476185 2022-12-20

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2024131846A1 true WO2024131846A1 (en) 2024-06-27

Family

ID=91587673

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/CN2023/140296 Ceased WO2024131846A1 (en) 2022-12-20 2023-12-20 Antibody, antigen-binding fragment thereof, and pharmaceutical use thereof

Country Status (2)

Country Link
TW (1) TW202434637A (en)
WO (1) WO2024131846A1 (en)

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101981054A (en) * 2007-07-12 2011-02-23 皮埃尔法布雷医药公司 Novel antibody inhibiting c-MET dimerization and use thereof
AU2012202209A1 (en) * 2004-08-05 2012-05-10 Genentech, Inc. Humanized anti-cmet antagonists
CN110770254A (en) * 2017-05-30 2020-02-07 株式会社钟根堂 Novel anti-c-MET antibodies and their uses
CN111196853A (en) * 2015-04-17 2020-05-26 苏州盛迪亚生物医药有限公司 anti-c-Met antibody, anti-c-Met antibody-cytotoxic drug conjugate and medical application thereof
CN111848797A (en) * 2020-07-20 2020-10-30 北京鼎成肽源生物技术有限公司 A single chain antibody targeting c-Met, chimeric antigen receptor, recombinant vector, CAR-T cell and application

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2012202209A1 (en) * 2004-08-05 2012-05-10 Genentech, Inc. Humanized anti-cmet antagonists
CN101981054A (en) * 2007-07-12 2011-02-23 皮埃尔法布雷医药公司 Novel antibody inhibiting c-MET dimerization and use thereof
CN111196853A (en) * 2015-04-17 2020-05-26 苏州盛迪亚生物医药有限公司 anti-c-Met antibody, anti-c-Met antibody-cytotoxic drug conjugate and medical application thereof
CN110770254A (en) * 2017-05-30 2020-02-07 株式会社钟根堂 Novel anti-c-MET antibodies and their uses
CN111848797A (en) * 2020-07-20 2020-10-30 北京鼎成肽源生物技术有限公司 A single chain antibody targeting c-Met, chimeric antigen receptor, recombinant vector, CAR-T cell and application

Also Published As

Publication number Publication date
TW202434637A (en) 2024-09-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
TWI845767B (en) Anti-human Claudin18.2 antibody and its application
CN113015749B (en) Antibodies targeting CD3, bispecific antibodies, and uses thereof
TWI708788B (en) Bispecific antibody
CN112867507B (en) Novel anti-SIRPA antibodies
WO2017071625A1 (en) Anti-pd-1 monoclonal antibody, and pharmaceutical composition and use thereof
JP7457822B2 (en) Anti-CD3 and anti-CD123 bispecific antibodies and uses thereof
WO2020168555A1 (en) Cd3 antigen binding fragment and application thereof
JP7533897B2 (en) Fusion proteins and uses thereof
JP2023540526A (en) Nectin-4 antibody and its use
US20250257130A1 (en) Anti-ror1 antibodies
KR20220167331A (en) Anti-FLT3 Antibodies and Compositions
CN112830969A (en) Monoclonal antibody specifically binding to human Claudin18.2, and medicine and kit containing monoclonal antibody
IL323270A (en) Anti-ptk7 antibody and uses thereof
US20240270839A1 (en) Novel anti-claudin18 antibodies
WO2024175093A1 (en) Antibodies, antigen-binding fragments and methods of use
CN115991784A (en) anti-CD 47-CLDN18.2 bispecific antibody and uses thereof
WO2024131846A1 (en) Antibody, antigen-binding fragment thereof, and pharmaceutical use thereof
KR20250042908A (en) Anti-mesothelin antibody and the use thereof
WO2024131835A1 (en) Ligand-cytotoxicity drug conjugates and pharmaceutical uses thereof
WO2024012434A1 (en) Antibody, antigen-binding fragment thereof, and pharmaceutical use thereof
WO2024088386A1 (en) Antibody, antigen-binding fragment thereof, and pharmaceutical use thereof
WO2025146161A1 (en) Antibody, antigen-binding fragment and medical use thereof
EP4663661A1 (en) Anti-cdh6 antibody and use thereof
WO2024012513A1 (en) Antibody, antigen-binding fragment thereof, and pharmaceutical use thereof
CN119285769A (en) Multispecific antibodies and their medical uses

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 23906007

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 23906007

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1