JP2015142558A - 治療剤のためのｕｎａオリゴマー - Google Patents

Abstract

【課題】ＲＮＡ誘導遺伝子調節または遺伝子分析、特に、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）に対して使用するためのＲＮＡ鎖に取り込まれた１個又は複数個のヒドロキシメチル置換モノマーを有するＲＮＡ複合体の提供。【解決手段】１個以上の２’−３’−セコ−ＲＮＡモノマーを含むオリゴマーであって、該オリゴマーは第１及び第２のＲＮＡ鎖を有するＲＮＡ二本鎖部分を含み、該２’−３’−セコ−ＲＮＡモノマーが下式のモノマーＤで表され、且つ、該オリゴマーの少なくとも一部が標的配列と相補的な配列を含む、オリゴマー。［塩基は核酸塩基である］【選択図】なし

Description

ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）は、標的遺伝子の発現を抑制する手段を提供することから、近年、多大な注目を集めている。ＲＮＡｉは、遺伝的および生化学的経路、ならびに個々の遺伝子および遺伝子産物の機能を研究するための方法による基礎研究を提供する。その結果、ＲＮＡ干渉は、製薬業界において標的バリデーションのための重要なツールとなっている。また、薬剤として使用することができるＲＮＡ干渉複合体を媒介することができるＲＮＡ複合体を開発することを目的に、かなりの投資が行われている。

治療での使用に対するＲＮＡｉの魅力は、その感度および配列特異性にある。しかしながら、例えば、ＲＮＡ複合体の間違った鎖は、間違った標的核酸に対する反応を誘導する場合があるため、配列特異性に関して懸念されている。また、ある大きさのＲＮＡ複合体は、非特異的インターフェロン依存性応答を誘導するが、それも望ましくない。

特許文献１では、アンチセンス鎖およびパッセンジャー鎖を含む、ＲＮＡｉを媒介することができるＲＮＡ複合体であって、その鎖は、２１〜２３個のヌクレオチドの長さであるＲＮＡ複合体が記載されている。このＲＮＡ複合体は、治療的適応に使用されることが示唆される。

同様に、特許文献２では、アンチセンス鎖およびパッセンジャー鎖を含む、ＲＮＡｉを媒介することができるＲＮＡ複合体であって、この複合体は、３’突出末端を含む、ＲＮＡ複合体が記載されている。このＲＮＡ複合体は、治療的適応に使用されることが示唆される。

特許文献３では、アンチセンス鎖およびパッセンジャー鎖を含む、ＲＮＡｉを媒介することができる化学的改変ヌクレオチドを含有するＲＮＡｉ複合体が記載されている。その明細書に記載されるＲＮＡ複合体は、ＬＮＡ残基を含み、鎖のうちの１つの５’末端付近のＬＮＡ残基の取り込みは、その５−末端にある最も弱い塩基対を形成する鎖がＲＩＳＣ複合体に取り込まれるため、どの鎖がＲＩＳＣ複合体に取り込まれるかを制御することができると記載されている。

ＲＮＡｉは、本発明のＲＮＡ複合体を含み、オリゴヌクレオチドを使用して遺伝子発現の阻害を媒介するいくつかの方策のうち１つにすぎない。ＲＮアーゼＨ媒介ＲＮＡ開裂、立体障害ＲＮＡ結合、ＤＮＡザイムまたはリボザイム媒介ＲＮＡ開裂およびｓｉＲＮＡアプローチを含む、これらの異なる方策は、生物活性に適合する、選択された化学的改変ヌクレオチドの性質とともに、文献に記載されている［非特許文献１］。

本発明のヒドロキシメチル置換モノマーＢ〜Ｅは、ＤＮＡ鎖に取り込まれているため、自動ＤＮＡ／ＲＮＡ合成に対するそれらのホスホラミダイト基本要素の調製のための手順が報告されている［非特許文献２；非特許文献３；非特許文献４］。ＤＮＡ鎖に取り込まれているのは、独占的にチミンモノマーである。ヒドロキシメチル置換モノマーはどれも、あらかじめＲＮＡ鎖に取り込まれていない。

一報告においては、１つまたは２つの２’−セコウリジンは、ＤＮＡオリゴヌクレオチドに取り込まれ、ＲＮアーゼＨ媒介ＲＮＡ分解に対する好ましい効果がみられた（非特許文献５）。

米国特許出願公開第２００３／０１０８９２３号明細書 米国特許出願公開第２００５／０２３４００７号明細書 国際公開第２００５／０７３３７８号パンフレット

Ｊ．Ｋｕｒｒｅｃｋ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２００３，２７０，１６２８ Ｋ．Ｄ．Ｎｉｅｌｓｅｎら，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．１９９５，３，１４９３ Ｈ．Ｔｈｒａｎｅら，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ １９９５，５１，１０３８９ Ｐ．Ｎｉｅｌｓｅｎら，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．１９９５，３，１９ Ｍａｎｇｏｓ ＭＭ，Ｍｉｎ ＫＬ，Ｖｉａｚｏｖｋｉｎａ Ｅ，Ｇａｌａｒｎｅａｕ Ａ，Ｅｌｚａｇｈｅｉｄ ＭＩ，Ｐａｒｎｉａｋ ＭＡ，Ｄａｍｈａ ＭＪ．，Ｊ Ａｍ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ．２００３ Ｊａｎ ２２；１２５（３）：６５４−６１

本発明は、ＲＮＡ誘導遺伝子調節または遺伝子分析、特に、ＲＮＡ干渉に対して使用するためのＲＮＡ鎖に取り込まれた１個または複数個のヒドロキシメチル置換モノマーを有するＲＮＡ複合体を提供する。そのため、本発明の目的は、通常使用されるＲＮＡ複合体と比較して、オフターゲット効果が低いＲＮＡ複合体を提供することである。別の目的は、インターフェロン応答性の低減を誘導するＲＮＡ複合体を提供することである。さらに別の目的は、細胞培養物中で、またはｉｎ ｖｉｖｏで酵素的分解への安定性に関する特性を改善したＲＮＡ複合体を提供することである。さらに別の目的は、未改変ＲＮＡ複合体に対して、細胞培養物中で、またはｉｎ ｖｉｖｏで、遺伝子調節機能、例えば、遺伝子サイレンシング効果の強化を示すＲＮＡ複合体を提供することである。さらなる目的は、特定の器官または組織に対して標的とされるＲＮＡ複合体、および細胞膜を通過することができるＲＮＡ複合体を提供することである。本発明は、ヒドロキシメチル置換モノマーのオリゴヌクレオチドへの取り込みに適切なモノマー、およびそれらの合成のための方法も提供する。

ＲＮＡ複合体に取り込まれるヒドロキシメチル置換ヌクレオチドの異なる構造の例を示す。モノマーＡは、比較のために示し、そのリボース足場を有する天然ＲＮＡモノマーである。本発明のＲＮＡ複合体に含まれるモノマーＢ〜Ｅの特徴は、ヒドロキシメチル基（「遊離ヒドロキシメチル基」）である置換基を含有することであるため、本発明は、「ヒドロキシメチル置換ＲＮＡオリゴヌクレオチドおよびＲＮＡ複合体」と表題される。遊離ヒドロキシメチル基は、例えば、環式リボース足場のＣ４’原子または非環式リボースベースの足場のＣ１’原子に付加する。本発明のヒドロキシメチル置換ヌクレオチドは、それぞれ、リン原子に付加する他の酸素原子を含有するため、ヌクレオチド間結合の形成を行う（図１参照）。これらの他の酸素原子の１個または複数個は、本発明のＲＮＡ複合体のヒドロキシメチル置換ヌクレオチドの１個または複数個が、ＲＮＡ鎖の３’または５’末端に位置する場合に、ヒドロキシ基の一部になり得る。任意の末端に位置付けられた天然ＲＮＡモノマーの場合のように、本発明のＲＮＡ複合体のヒドロキシメチル置換ヌクレオチドの１つが、ＲＮＡ鎖の３’末端および／または５’末端に位置する場合、このモノマーのヒドロキシル基はリン酸化することができる。本発明のヒドロキシメチ ル置換ヌクレオチドには、ウラシル、チミン、シトシン、５−メチルシトシン、アデニン、グアニン、または任意の他の公知の天然もしくは合成核酸塩基もしくは核酸塩基類似体（図１の「塩基」として指定される）のような核酸塩基が付加する。 ヒドロキシメチル置換モノマーの誘導体化、官能化および結合体化された変異体を示す。例として、ヒドロキシメチルで置換された２’，３’−セコ−ＲＮＡモノマーＤの誘導体化、官能化および結合体化された変異体を示す（図１参照）。モノマーＦは、エーテル結合を介して結合するＲ基を含有する。モノマーＧは、チオエーテル結合を介して結合するＲ基を含有する。モノマーＨは、アミド結合を介して結合するＲ基を含有する。モノマーＩは、アミノ結合を介して結合するＲ基を含有する。モノマーＪは、ピペラジノ部分を介して結合するＲ基を含有する。そのようなモノマーの１つまたはいくつかの、本発明のＲＮＡ複合体への取り込みによって、ＲＮＡ複合体の特性を調節することができる。例えば、生物学的安定性の増加、ＲＮＡターゲッティング能力の増加、または特定の送達特性を導入することができ、検出のために、蛍光基を付加することができる。 オリゴヌクレオチドまたはＲＮＡ複合体のモノマーである場合があるヒドロキシメチル置換モノマー（モノマーＣおよびモノマーＤ）の２つの構造の図である。 「モノマーＸ」（すなわち、２’，３’−セコ−ＲＮＡモノマーＤ）を含有する本発明のｓｉＲＮＡ複合体に関する遺伝子サイレンシングの結果の図である。結果は、核酸塩基（Ｗ１３０センス鎖において「Ｘ」として示される）としてウラシルを有するモノマーＤを含有するＷ１３０センス鎖（ヌクレオチド配列に関しては、図４参照）で得られた。本研究で使用するアンチセンス鎖の核酸配列は、この図の下部に掲載する（アンチセンス配列におけるすべてのＸモノマーは、核酸塩基としてウラシルを有するモノマーＤである）。上付き文字「Ｌ」が付くモノマーは、固定核酸（例えば、ＴＬは、チミン固定核酸またはＬＮＡを示す）を表す。 「モノマーＸ」（すなわち、２’，３’−セコ−ＲＮＡモノマーＤ）を含有する本発明のｓｉＲＮＡ複合体に関する遺伝子サイレンシングの結果の図である。結果は、核酸塩基（Ｗ１３１センス鎖において「Ｘ」として示される）としてウラシルを有するモノマーＤを含有するＷ１３１センス鎖（ヌクレオチド配列に関しては、図５参照）で得られた。本研究で使用するアンチセンス鎖の核酸配列は、図４の下部に掲載する（アンチセンス配列におけるすべてのＸモノマーは、核酸塩基としてウラシルを有するモノマーＤである）。 「モノマーＸ」（すなわち、２’，３’−セコ−ＲＮＡモノマーＤ）を含有する本発明のｓｉＲＮＡ複合体に関する遺伝子サイレンシングの結果の図である。これらの結果は、核酸塩基として、シトシン（ｓＣ、Ｗ２８２配列の５’末端から第１のＸ）、アデニン（ｓＡ、Ｗ２８２配列の５’末端から第２のＸ）、およびシトシン（ｓＣ、Ｗ２８２配列の３’末端から最後のＸ）を有するモノマーＤを含有するＷ２８２センス鎖（ヌクレオチド配列に関しては、図６参照）で得られた。本研究で使用するアンチセンス鎖の核酸配列は、図４の下部に掲載する（アンチセンス配列におけるすべてのＸモノマーは、核酸塩基としてウラシルを有するモノマーＤである）。 「モノマーＸ」（すなわち、２’，３’−セコ−ＲＮＡモノマーＤ）を含有する本発明のｓｉＲＮＡ複合体に関する遺伝子サイレンシングの結果の図である。これらの結果は、Ｗ１９４センス鎖（ヌクレオチド配列に関しては、図７参照）で得られた。本研究で使用するアンチセンス鎖の核酸配列は、図４の下部に掲載する（アンチセンス配列におけるすべてのＸモノマーは、核酸塩基としてウラシルを有するモノマーＤである）。上付き文字「Ｌ」が付くモノマーは、固定核酸（例えば、Ｔ^Ｌは、チミン固定核酸またはＬＮＡを示す）を表す。 「モノマーＸ」（すなわち、２’，３’−セコ−ＲＮＡモノマーＤ）を含有する本発明のｓｉＲＮＡ複合体に関する遺伝子サイレンシングの結果の図である。これらの結果は、Ｗ１８１センス鎖（ヌクレオチド配列に関しては、図８参照）で得られた。本研究で使用するアンチセンス鎖の核酸配列は、図４の下部に掲載する（アンチセンス配列におけるすべてのＸモノマーは、核酸塩基としてウラシルを有するモノマーＤである）。上付き文字「Ｌ」が付くモノマーは、固定核酸（例えば、Ｔ^Ｌは、チミン固定核酸またはＬＮＡを示す）を表す。 「モノマーＸ」（すなわち、２’，３’−セコ−ＲＮＡモノマーＤ）を含有する本発明のｓｉＲＮＡ複合体に関する遺伝子サイレンシングの結果の図である。これらの結果は、核酸塩基（Ｗ１２９センス鎖において「Ｘ」として示される）としてウラシルを有するモノマーＤを含有するＷ１２９センス鎖（ヌクレオチド配列に関しては、図９参照）で得られた。本研究において含まれるアンチセンス鎖は、図４の下部に掲載する（アンチセンス配列におけるすべてのＸモノマーは、核酸塩基としてウラシルを有するモノマーＤである）。上付き文字「Ｌ」が付くモノマーは、固定核酸（例えば、Ｔ^Ｌは、チミン固定核酸またはＬＮＡを示す）を表す。

本発明の一態様に記載される特定の特色は、本発明の他の態様にも適用する。例えば、第１の態様のＲＮＡ複合体に関して記載される特色は、適切な場合は、第９の態様のオリゴヌクレオチド、および第１０の態様のＲＮＡ二本鎖にも適用する。

第１の態様、ＲＮＡ複合体
ｓｉＲＮＡ二本鎖または一本鎖ＲＮＡの形態のＲＮＡ複合体は、細胞における標的核酸の様々な改変を媒介することができる。この工程では、複合体のアンチセンス鎖は、アンチセンス鎖への配列相補性の拡張を有する標的核酸にハイブリダイズすることができるため、ガイドとして作用する。

標的核酸を標的とする前に、アンチセンス鎖は、標的核酸に作用することができる、ＲＮＡ誘導タンパク質複合体（ＲＧＰＣ）にしばしば取り込まれる。ＲＮＡ誘導タンパク質複合体の一例は、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）である。他のそのようなＲＧＰＣが存在し、本発明のＲＮＡ複合体は、これらの他のＲＧＰＣと併用される場合、または任意のＲＧＰＣと相互作用しなくても、有利であると考えられる。

本発明の一目的は、生物媒体（血清、ｉｎ ｖｉｖｏ、細胞培養中）における核酸分解に対してＲＮＡ複合体を安定化させることである。

本発明の別の目的は、二本鎖ＲＮＡ複合体の遺伝子サイレンシング効果を改善することである。この改善は、例えば、有効性の増加、オフターゲット効果の低下、免疫刺激の低減、保存に対する安定性の増加、血清等のような生物媒体における安定性の増加、作用の持続時間の増加、および薬物動態特性の改善に関し、すべて天然型未改変ＲＮＡ複合体に対するものである。

本発明のさらに別の目的は、一本鎖ＲＮＡオリゴヌクレオチドの遺伝子サイレンシング効果を改善することである。この改善は、例えば、有効性の増加、オフターゲット効果の低下、免疫刺激の低減、保存に対する安定性の増加、血清等のような生物媒体における安定性の増加、作用の持続時間の増加、および薬物動態特性の改善に関し、すべて天然型未改変ＲＮＡ複合体に対するものである。

本発明のｓｉＲＮＡ複合体のパッセンジャー鎖ではなくアンチセンス鎖のみが、標的核酸の改変を媒介することを確実にすることが本発明の目的である。この目的の達成により、オフターゲット効果が低いＲＮＡ複合体が提供される。

本発明の別の目的は、生物媒体におけるＲＮＡ複合体の十分な安定性を確実にすることである。したがって、未改変ＲＮＡ複合体に対して、細胞培養中またはｉｎ ｖｉｖｏで遺伝子調節機能、例えば、遺伝子サイレンシング効果の強化を示すＲＮＡ複合体を提供することが目的である。

本発明の根本概念は、１個または複数個のヒドロキシメチル置換モノマーを、本発明のＲＮＡ複合体に取り込むことである。ｓｉＲＮＡの場合、これにより、複合体の１つの鎖のみのＲＩＳＣへの選択的取り込みがもたらされる。１個または複数個のヒドロキシメチル置換モノマーの１つ（または複数）のＲＮＡ鎖への取り込みによって、生物媒体中で、そしてｉｎ ｖｉｖｏでＲＮＡ複合体の寿命が改善され、したがって、生物活性の改善、例えば、遺伝子調節活性の改善をもたらす。

本発明のＲＮＡ複合体のＲＮＡ鎖は、天然ＲＮＡヌクレオチド、遺伝子サイレンシング活性に適合することが公知のＲＮＡ改変［Ｎａｗｒｏｔ ａｎｄ Ｓｉｐａ，Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐｉｃｓ Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２００６，６，９１３−９２５］、およびヒドロキシメチル置換モノマー（図１）を含み得る。ホスホジエステル結合は、個々のモノマーを結合し得るが、ホスホロチオエート結合のような改変された結合および当業者に公知の他の結合［Ｎａｗｒｏｔ ａｎｄ Ｓｉｐａ，Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐｉｃｓ Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２００６，６，９１３−９２５］を代わりに使用してもよい。ＲＮＡ複合体は、アンチセンス鎖（アンチセンス鎖は、本明細書において誘導鎖とも称される）およびパッセンジャー鎖（パッセンジャー鎖は、本明細書においてセンス鎖とも称される）から構成されるｓｉＲＮＡ二本鎖をともに構成する２つの鎖を含む場合があるが、一本鎖ミクロＲＮＡ模倣分子も、例えば、ミクロＲＮＡを標的とするため有用な一本鎖アンチセンス分子であるため、本発明のＲＮＡ複合体として本明細書において考慮される。

本発明の実施形態においては、ＲＮＡ複合体は、１個または複数個のヒドロキシメチル改変ヌクレオチドモノマーを含む（図１参照）。１つのそのような例として、以下は、非環式ヌクレオチドモノマー、より好ましくはモノマーＤ〜Ｊから成る群より選択される非環式モノマーである。そのため、ヒドロキシメチル改変ヌクレオチドモノマーに関する第１の態様において記載される実施形態は、非環式ヌクレオチドモノマーに関する他の実施形態に対して適用する。

ヒドロキシメチル改変ヌクレオチドモノマーの使用は、いくつかの理由で有利である場合がある。それらは、例えば、ＲＮＡ複合体の遺伝子サイレンシング効果を増加させるために使用される場合があり、例えば、ＲＮＡ複合体の末端への１個または複数個のヒドロキシメチル改変ヌクレオチドモノマーの取り込みは、核酸分解に対する著しい安定性を誘導する。それらを使用して、ｓｉＲＮＡ複合体のパッセンジャー鎖の遺伝子サイレンシング効果を低減させて、オフターゲット効果の数を低減させることができる。

本発明の好ましい一実施形態においては、１個または複数個のヒドロキシメチル改変ヌクレオチドモノマーを含むＲＮＡ複合体は、一本鎖ＲＮＡ構築物である。本発明の好ましい一実施形態においては、１個または複数個のヒドロキシメチル改変ヌクレオチドモノマーを含むＲＮＡ複合体は、一本鎖アンチセンス分子として作用することによって遺伝子発現を阻害することができる一本鎖ＲＮＡ構築物である。

本発明の好ましい一実施形態においては、１個または複数個のヒドロキシメチル改変ヌクレオチドモノマーを含むＲＮＡ複合体は、ミクロＲＮＡを機能的に模倣する一本鎖ＲＮＡ構築物である。

本発明の好ましい一実施形態においては、１個または複数個のヒドロキシメチル改変ヌクレオチドモノマーを含むＲＮＡ複合体は、ｓｉＲＮＡ構築物である。

したがって、一実施形態においては、ｓｉＲＮＡ構築物のアンチセンス鎖は、１個または複数個のヒドロキシメチル改変ヌクレオチドモノマーを含む。

他の実施形態においては、ｓｉＲＮＡ構築物のパッセンジャー鎖は、１個または複数個のヒドロキシメチル改変ヌクレオチドモノマーを含む。

さらに他の実施形態においては、ｓｉＲＮＡ構築物の切れ目のあるパッセンジャー鎖の第１および第２のＲＮＡ分子は、それぞれ、１個または複数個のヒドロキシメチル改変ヌクレオチドモノマーを含有する。

本発明の一実施形態においては、アンチセンス鎖におけるヒドロキシメチル改変ヌクレオチドモノマーの数は、１０である。本発明の他の実施形態においては、アンチセンス鎖のヒドロキシメチル改変ヌクレオチドモノマーの数は、それぞれ９、８、７、６、５、４、３、２または１である。

他の実施形態においては、アンチセンス鎖のすべてのヌクレオチドは、ヒドロキシメチル改変ヌクレオチドモノマーである。

好ましい実施形態においては、アンチセンス鎖におけるすべてのヒドロキシメチル改変ヌクレオチドモノマーは、１〜８の位置に存在し、位置は、５’末端から数えられる。さらにより好ましくは、アンチセンス鎖におけるヒドロキシメチル改変ヌクレオチドモノマーは、ミクロＲＮＡのいわゆる種領域に対応する２〜７の位置に存在する。そのため、前述の領域におけるヒドロキシメチル改変ヌクレオチドモノマーの存在によって、アンチセンス鎖がミクロＲＮＡとして作用することを防止し、アンチセンス鎖がｓｉＲＮＡとして機能することを目的とする場合、オフターゲット効果を低下させる。

好ましい実施形態においては、少なくとも１個のヒドロキシメチル改変ヌクレオチドモノマーが、９〜１６の位置に存在し、位置は、５’末端から数えられる。さらにより好ましくは、２、３、４、５または６個のヒドロキシメチル改変ヌクレオチドモノマーの存在が、９〜１６の位置に存在し、別の実施形態においては、アンチセンス鎖におけるヒドロキシメチル改変ヌクレオチドモノマーは、９〜１６の位置のすべてに存在する。一実施形態においては、ヒドロキシメチル改変ヌクレオチドモノマーは、９〜１６の領域のみに存在し、残りのアンチセンス鎖には存在しない。

さらにより好ましくは、アンチセンス鎖におけるヒドロキシメチル改変ヌクレオチドモノマーは、９〜１１の位置に存在し、好ましくは、残りのオリゴヌクレオチドには存在しない。前述の領域におけるヒドロキシメチル改変ヌクレオチドモノマーの存在は、ミクロＲＮＡとして作用するアンチセンス鎖を誘導し、すなわち、ｓｉＲＮＡ効果が最小限になり、ミクロＲＮＡ効果がより高くなることを確実にする。この効果は、恐らく、非環式ヒドロキシメチル置換モノマー、例えば、モノマーＤの存在によって引き起こされる親和性の低減のために、完全長結合に対する頻度の低減から生じる。

同様に、本発明の別の実施形態においては、本発明のｓｉＲＮＡ複合体のパッセンジャー鎖におけるヒドロキシメチル改変ヌクレオチドモノマーの数は、１０である。本発明の他の実施形態においては、本発明のｓｉＲＮＡ複合体のパッセンジャー鎖におけるヒドロキシメチル改変ヌクレオチドモノマーの数は、それぞれ９、８、７、６、５、４、３、２または１である。

別の実施形態においては、本発明のｓｉＲＮＡ複合体のパッセンジャー鎖のヌクレオチドは、すべてヒドロキシメチル改変ヌクレオチドモノマーである。
一実施形態においては、本発明のｓｉＲＮＡ複合体のアンチセンス鎖およびパッセンジャー鎖の両方は、１個または複数個のヒドロキシメチル改変ヌクレオチドモノマーを含有する。

一態様において、本発明は、標的核酸の核酸改変を媒介することができるＲＮＡ複合体を提供する。そのようなＲＮＡ複合体は、例えば、ｓｉＲＮＡ、ミクロＲＮＡまたはミクロＲＮＡ前駆体（プレミクロＲＮＡ）であり得る。

本発明のｓｉＲＮＡ複合体のＲＮＡ複合体は、アンチセンス鎖およびアンチセンス鎖にハイブリダイズされるパッセンジャー鎖を含む中核二本鎖領域を含む。

本内容において言及される標的核酸は、複合体のアンチセンス鎖に対して有意な相補性を有する核酸である。好ましくは、相補性は、一続きのいくつかヌクレオチドに対して完全である。

したがって、一実施形態においては、相補性は、一続きの２５ヌクレオチドに対して完全である。

他の実施形態においては、相補性は、一続きの２４個のヌクレオチド、２３個のヌクレオチド、２２個のヌクレオチド、２１個のヌクレオチド、２０個のヌクレオチド、１９個のヌクレオチド、１８個のヌクレオチド、１７個のヌクレオチド、１６個のヌクレオチド、１５個のヌクレオチド、１４個のヌクレオチド、１３個のヌクレオチド、１２個のヌクレオチド、１１個のヌクレオチド、１０個のヌクレオチド、９個のヌクレオチド、８個のヌクレオチド、７個のヌクレオチドまたは６個のヌクレオチドに対してそれぞれ完全である。

一実施形態においては、一続きの相補性は、１つのミスマッチを含む。他の実施形態においては、一続きの相補性は、２つのミスマッチ、３つのミスマッチ、または４つのミスマッチをそれぞれ含む。１つのミスマッチは、一続きの相補性における領域であり、例えば、ＧがＡの反対である場合、塩基対は形成することができない。より多くのミスマッチが存在する場合、それらは互いに隣接し得るか、または一続きの相補性の異なる領域において間隔を空けて存在し得る。

本発明のｓｉＲＮＡ複合体のＲＮＡ複合体は、好ましい実施形態において、実質的に二本鎖の領域である中核を含む。ＲＮＡ複合体における一本鎖領域は、主に、複合体の突出に関連する。

そのため、一実施形態においては、本発明のｓｉＲＮＡ複合体の二本鎖領域は、１つのミスマッチを含む。他の実施形態においては、二本鎖領域は、２つのミスマッチ、３つのミスマッチ、および４つのミスマッチをそれぞれ含む。

本明細書において使用されるように、「標的核酸」という用語は、標的開裂または立体障害等のアンチセンス鎖によって誘導される改変を受ける任意のＲＮＡ／ＤＮＡを包含する。標的ＲＮＡ／ＤＮＡは、例えば、ゲノムＤＮＡ、ゲノムウイルスＲＮＡ、ｍＲＮＡ、プレｍＲＮＡ、または非コードＲＮＡであり得る。

本明細書において使用されるように、「標的核酸改変」という用語は、標的核酸の構造に影響を与えずに標的核酸の活性に影響を与える改変を含む、標的核酸に対する任意の改変を意味する。

本発明の好ましい標的核酸は、ｍＲＮＡである。したがって、一実施形態においては、ＲＮＡ複合体によって媒介される核酸改変は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）である。好ましい実施形態においては、ＲＮＡｉは、ｍＲＮＡの分解を媒介する。別の好ましい実施形態においては、ＲＮＡｉは、ｍＲＮＡの翻訳阻害を媒介する。別の実施形態においては、ＲＮＡｉは、ｍＲＮＡの翻訳阻害および分解の両方を媒介する。

他の好ましい実施形態においては、標的核酸は、非コードＲＮＡ、例えば、ｔＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、ｓｎｏＲＮＡ、またはｒＲＮＡである。

さらに別の実施形態においては、標的核酸は、ゲノムＤＮＡである。そのような実施形態においては、好ましい核酸改変は、ＤＮＡメチル化およびＤＮＡ欠損を含む。

本発明のＲＮＡ複合体の大きさは、本発明の１つまたは複数の目的を果たしながらも、異なり得る。これは、例えば、特定の目的がオフターゲット効果の低下である場合に適用する。

そのため、本発明のｓｉＲＮＡ複合体の中核二本鎖領域は、１０個の塩基対、１１個の塩基対、１２個の塩基対、１３個の塩基対、１４個の塩基対、１５個の塩基対、１６個の塩基対、１７個の塩基対、１８個の塩基対、１９個の塩基対、２０個の塩基対、２１個の塩基対、２２個の塩基対、２３個の塩基対、２４個の塩基対、２５個の塩基対、２６個の塩基対、２７個の塩基対、２８個の塩基対、２９個の塩基対、３０個の塩基対、３５個の塩基対、４０個の塩基対、４２個の塩基対、４５個の塩基対、５０個の塩基対、５５個の塩基対、６０個の塩基対、または６２個の塩基対の群から選択される多数の塩基対を含む場合がある。

一実施形態においては、本発明のｓｉＲＮＡ複合体の中核二本鎖領域は、１５〜４０個の塩基対を含む。

別の好ましい実施形態においては、本発明のｓｉＲＮＡ複合体の中核二本鎖領域は、１８〜２２個の塩基対を含む。

一実施形態においては、本発明のｓｉＲＮＡ複合体の中核二本鎖領域は、４０の塩基対よりも長いが、一部の細胞では、より長い二本鎖ＲＮＡ複合体の導入は、インターフェロン依存性非特異応答を誘導することが知られている。そのような一実施形態においては、複合体は、ＲＧＰＣと結合する前に、より短い二本鎖ＲＮＡ複合体へと処理されると考えられる。ＤＩＣＥＲ等の酵素のようなＲＮアーゼＩＩＩは、処理を行うことができる。Ｄｉｃｅｒも４０個の塩基対より短い二本鎖ＲＮＡを処理し、そのようなＲＮＡ複合体（Ｄｉｃｅｒ基質と称される）は、処理なしにＲＩＳＣへ進入するｓｉＲＮＡと比較して、様々な利点を有する。したがって、一実施形態においては、本発明のＲＮＡ複合体は、Ｄｉｃｅｒ基質である。

別の実施形態においては、ＲＮＡ複合体は一本鎖であり、二本鎖領域を有さない。

さらに別の実施形態においては、ＲＮＡ複合体は一本鎖であるが、１つまたは複数の二本鎖領域を含有するように折り重なる。そのような実施形態は、例えば、ミクロＲＮＡおよびそれらの機能を模倣するために有用である。

さらに別の実施形態においては、本発明のｓｉＲＮＡ複合体の中核二本鎖領域は、１０の塩基対より短いため、１〜９個の塩基対を含む。

本発明の一実施形態においては、ＲＮＡ複合体の中核二本鎖領域は、２つより多いＲＮＡ鎖から成る。

本発明の一実施形態においては、ＲＮＡ複合体の中核二本鎖領域は、３つのＲＮＡ鎖から成る。

本発明の別の実施形態においては、ＲＮＡ複合体の中核二本鎖領域は、４つ以上のＲＮＡ鎖から成る。

本発明の好ましい実施形態においては、本発明のｓｉＲＮＡ複合体は、突出を含む。本内容において使用される突出は、二本鎖領域に続く短い一本鎖領域を指す。

一実施形態においては、本発明のｓｉＲＮＡ複合体のアンチセンス鎖は、３’突出を含む。

別の実施形態においては、本発明のｓｉＲＮＡ複合体のパッセンジャー鎖は、３’突出を含む。

さらに別の実施形態においては、本発明のｓｉＲＮＡ複合体のアンチセンス鎖は、５’突出を含む。

さらに別の実施形態においては、本発明のｓｉＲＮＡ複合体のパッセンジャー鎖は、５’突出を含む。

好ましい実施形態においては、本発明のｓｉＲＮＡ複合体のアンチセンス鎖およびパッセンジャー鎖は、両方とも３’突出を含む。

本発明のｓｉＲＮＡ複合体の突出は、複合体の基本機能を干渉しない様々な長さであり得る。そのため、一実施形態においては、突出は、１個のヌクレオチド、２個のヌクレオチド、３個のヌクレオチド、４個のヌクレオチド、５個のヌクレオチド、６個のヌクレオチド、７個のヌクレオチド、および８個のヌクレオチドの長さを有する突出の群より選択される。

本発明のｓｉＲＮＡ複合体の最も好ましい突出は、それぞれ、１、２、および３個のヌクレオチドの長さを有する突出である。

一実施形態においては、本発明のｓｉＲＮＡ複合体のアンチセンス鎖の突出は、パッセンジャー鎖の突出と同じ長さを有する。

別の実施形態においては、本発明のｓｉＲＮＡ複合体のアンチセンス鎖の突出は、パッセンジャー鎖の突出と同じ長さを有さない。

本発明のｓｉＲＮＡ複合体のさらに別の実施形態においては、ＲＮＡ複合体は、少なくとも１つの平滑末端を含む。「平滑末端」は、いかなる突出ヌクレオチドを有さない二本鎖核酸の末端を指し、すなわち、二本鎖核酸末端の両鎖は同じ位置にある。

別の実施形態においては、本発明のｓｉＲＮＡ複合体は、両末端が平滑末端である。

本発明の好ましいＲＮＡ複合体は、全体構造においては、より長い二本鎖ＲＮＡ複合体のＤｉｃｅｒ処理の生成物と同様である。別の実施形態においては、本発明のＲＮＡ複合体は、上記のＤｉｃｅｒ基質である。

本発明の他の好ましいＲＮＡ複合体は、中核二本鎖領域が１８〜２２個の塩基対を含む複合体、およびアンチセンス鎖およびパッセンジャー鎖がそれぞれ１〜３個のヌクレオチドの３’突出を含む複合体である。

本発明のＲＮＡ複合体のアンチセンス鎖は、複合体の機能を干渉しない様々な長さを有することができる。そのため、好ましい実施形態においては、アンチセンス鎖は、それぞれ、８−ｍｅｒ、９−ｍｅｒ、１０−ｍｅｒ、１１−ｍｅｒ、１２−ｍｅｒ、１３−ｍｅｒ、１４−ｍｅｒ、１５−ｍｅｒ、１６−ｍｅｒ、１７−ｍｅｒ、１８−ｍｅｒ、１９−ｍｅｒ、２０−ｍｅｒ、２１−ｍｅｒ、２２−ｍｅｒ、２３−ｍｅｒ、２４−ｍｅｒ、２５−ｍｅｒ、２６−ｍｅｒ、２７−ｍｅｒ、２８−ｍｅｒ、２９−ｍｅｒ、３０−ｍｅｒ、３１−ｍｅｒ、３２−ｍｅｒ、３３−ｍｅｒ、３４−ｍｅｒ、３５−ｍｅｒ、３６−ｍｅｒ、３７−ｍｅｒ、３８−ｍｅｒ、３９−ｍｅｒ、４０−ｍｅｒ、４１−ｍｅｒ、４２−ｍｅｒ、４３−ｍｅｒ、４４−ｍｅｒ、４５−ｍｅｒ、４６−ｍｅｒ、４７−ｍｅｒ、４８−ｍｅｒ、４９−ｍｅｒ、５０−ｍｅｒ、５１−ｍｅｒ、５２−ｍｅｒ、５３−ｍｅｒ、５４−ｍｅｒ、５５−ｍｅｒ、５６−ｍｅｒ、５７−ｍｅｒ、５８−ｍｅｒ、５９−ｍｅｒ、６０−ｍｅｒ、６１−ｍｅｒ、または６２−ｍｅｒである。当然のことながら、例えば、１９−ｍｅｒは、１９個のモノマー、すなわち、１９個のヌクレオチドのアンチセンス鎖である。

別の好ましい実施形態としては、ＲＮＡ複合体のアンチセンス鎖は、アンチセンス鎖の以下の群より選択される：１５−ｍｅｒ、１６−ｍｅｒ、１７−ｍｅｒ、１８−ｍｅｒ、１９−ｍｅｒ、２０−ｍｅｒ、２１−ｍｅｒ、２２−ｍｅｒ、および２３−ｍｅｒ。

一実施形態においては、本発明のｓｉＲＮＡ複合体のパッセンジャー鎖は、不連続である。本発明のｓｉＲＮＡ複合体の一実施形態においては、パッセンジャー鎖は、いくつかの別々のＲＮＡ分子を含む。ＲＮＡ分子の数は、１、２、３、４、５、または６であり得る。

一実施形態においては、本発明のｓｉＲＮＡ複合体のパッセンジャー鎖の個々のＲＮＡ分子の長さは、４個のモノマー以上である。他の実施形態においては、パッセンジャー鎖の個々のＲＮＡ分子の長さは、それぞれ、５個のモノマー、６個のモノマー、７個のモノマー、８個のモノマー、９個のモノマー、１０個のモノマー、１１個のモノマー、および１２個のモノマーより長い。

他の実施形態においては、本発明のｓｉＲＮＡ複合体のパッセンジャー鎖の個々のＲＮＡ分子の長さは、それぞれ、５個のモノマー、６個のモノマー、７個のモノマー、８個のモノマー、９個のモノマー、１０個のモノマー、１１個のモノマー、および１２個のモノマー未満である。

本発明の一実施形態においては、本発明のｓｉＲＮＡ複合体の不連続のパッセンジャー鎖は、不連続のパッセンジャー鎖を共に形成する第１および第２のＲＮＡ分子を含み、第１のＲＮＡ分子は、アンチセンス鎖の下流部にハイブリダイズし、第２のＲＮＡ分子は、アンチセンス鎖の上流部にハイブリダイズする。

一実施形態においては、本発明のｓｉＲＮＡ複合体のアンチセンス鎖は、不連続である。アンチセンス鎖の好ましい不連続性は、パッセンジャー鎖の好ましい不連続性と同じである。

本発明のｓｉＲＮＡ複合体の鎖のうちの１つの不連続性は、切れ目であり得る。切れ目は、欠損リン酸ジエステル結合によって生じる二本鎖核酸の１つの鎖における不連続性として理解されるが、二本鎖核酸は、ヌクレオチドを欠損していない。そのため、切れ目の反対側の塩基は、切れ目のある鎖上の塩基にハイブリダイズする。

本発明のｓｉＲＮＡ複合体の鎖のうちの１つの別の不連続性は、リン酸ジエステル結合以外の、糖−リン酸エステル骨格における１つの欠損結合、または２つ以上の欠損結合によって生じる二本鎖核酸の１つの鎖における不連続性として理解される選択的切れ目であるが、二本鎖核酸は、核酸塩基を欠損していない。そのため、切れ目の反対側の塩基は、切れ目のある鎖上の塩基にハイブリダイズできる。

本発明のＲＮＡ複合体のＲＮＡ鎖の場合、指名として使用されるギャップは、少なくとも１ヌクレオチド、ヌクレオシド、または核酸塩基が、二本鎖核酸において欠損している場合の不連続性を有すると説明することができる。

好ましくは、ＲＮＡ複合体の５’末端は、リン酸化されるか、またはリン酸化に使用可能である。リン酸化に使用可能とは、例えば、５’−ヒドロキシ基が、５’−ヒドロキシ基付近における他の基との直接結合または他の結合（これは、この５’−ヒドロキシ基のリン酸化を妨害する）によって阻害されていないことを意味する。

したがって、本発明の好ましい実施形態においては、ＲＮＡ複合体のＲＮＡ分子は、５’末端リン酸エステルおよび３’−ヒドロキシ基を含む。

別の実施形態においては、本発明のｓｉＲＮＡ複合体の第２のＲＮＡ分子は、５’末端リン酸エステルおよび３’−ヒドロキシ基を含む。

さらに別の実施形態においては、アンチセンス鎖は、５’末端リン酸エステルおよび３’−ヒドロキシ基を含む。

本発明の一部の実施形態においては、ＲＮＡ複合体が、ヒドロキシメチル改変ヌクレオチド以外のヌクレオチド類似体を含むことが好ましい。ヒドロキシメチル改変ヌクレオチド以外のそのようなヌクレオチド類似体は、以下において、「選択的に改変されたヌクレオチド」と称される。

選択的に改変されたヌクレオチドの使用は、いくつかの理由で有利である場合がある。例えば、本発明のｓｉＲＮＡ複合体の中核二本鎖領域の融解温度を上昇させるために使用することができる。

選択的に改変されたヌクレオチドの使用は、アンチセンス鎖と標的核酸との間に形成される二本鎖構造の融解温度を上昇させるために有利である場合がある。

したがって、一実施形態においては、アンチセンス鎖は、選択的に改変されたヌクレオチドを含む。

別の実施形態においては、本発明のｓｉＲＮＡ複合体のパッセンジャー鎖は、選択的に改変されたヌクレオチドを含む。

さらに別の実施形態においては、本発明のｓｉＲＮＡ複合体のパッセンジャー鎖の第１および第２のＲＮＡ分子は、それぞれ、選択的に改変されたヌクレオチドを含有する。

本発明の一実施形態においては、ＲＮＡ複合体における選択的に改変されたヌクレオチドの数は、１０である。本発明の他の実施形態においては、ＲＮＡ複合体におけるヌクレオチド類似体の数は、それぞれ、９、８、７、６、５、４、３、２、または１である。

本発明の一実施形態においては、アンチセンス鎖における選択的に改変されたヌクレオチドの数は、１０である。本発明の他の実施形態においては、アンチセンス鎖におけるヌクレオチド類似体の数は、それぞれ、９、８、７、６、５、４、３、２、または１である。

別の実施形態においては、アンチセンス鎖のすべてのヌクレオチドは、選択的に改変されたヌクレオチド、または選択的に改変されたヌクレオチドおよびヒドロキシメチル置換ヌクレオチドの組み合わせである。

同様に、本発明の別の実施形態においては、本発明のｓｉＲＮＡ複合体のパッセンジャー鎖におけるヌクレオチド類似体の数は、１０である。本発明の他の実施形態においては、パッセンジャー鎖のヌクレオチド類似体の数は、それぞれ、９、８、７、６、５、４、３、２、または１つある。

別の実施形態においては、本発明のｓｉＲＮＡ複合体のパッセンジャー鎖のすべてのヌクレオチドは、ヌクレオチド類似体、または選択的に改変されたヌクレオチドおよびヒドロキシメチル置換ヌクレオチドの組み合わせである。

一実施形態においては、本発明のｓｉＲＮＡ複合体のアンチセンス鎖およびパッセンジャー鎖は、両方とも選択的に改変されたヌクレオチドを含有する。

一実施形態においては、ＲＮＡ複合体の選択的に改変されたヌクレオチドは、同一、すなわち、例えば、それらは、すべてＬＮＡまたは、すべて２’−Ｏ−Ｍｅ−ＲＮＡである。別の実施形態においては、様々な異なる選択的に改変されたヌクレオチドは、同じＲＮＡ複合体において使用される。

一実施形態においては、ＲＮＡ複合体は、ホスホロチオエート結合を含む。

別の実施形態においては、ＲＮＡ複合体は、天然リン酸ジエステルおよびホスホロチオエート結合の混合物を含む。

本発明の好ましいヌクレオチド類似体は、２’−Ｏ−アルキル−ＲＮＡモノマー、２’−アミノ−ＤＮＡモノマー、２’−フルオロ−ＤＮＡモノマー、ＬＮＡモノマー、ＨＮＡモノマー、ＡＮＡモノマー、ＦＡＮＡモノマー、ＤＮＡモノマー、ＰＮＡモノマー、およびＩＮＡモノマーの群から選択されるヌクレオチド類似体であるが、他のモノマーも使用することができる［Ｎａｗｒｏｔ ａｎｄ Ｓｉｐａ，Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐｉｃｓ Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２００６，６，９１３−９２５］。

一実施形態においては、本発明のヒドロキシメチル置換モノマーのヒドロキシメチル置換基は、共役基（ｃｏｎｊｕｇａｔｉｎｇ ｇｒｏｕｐ）によって官能化される。共役基は、本発明のＲＮＡ複合体の特性を変化、拡大、または改善する、当業者に公知の基である。そのような基は、細胞分布、臓器分布、組織分布、二本鎖融解温度、標的親和性、生物学的安定性、ハイブリダイゼーションのシグナル伝達等を調節するために有用であり得る。

一実施形態においては、本発明のヒドロキシメチル置換モノマーのヒドロキシメチル置換基は、結合した基と、ヒドロキシメチル置換基のメチレン基との間にあるエーテル結合によって官能化される。図２参照（モノマーＦ）。

一実施形態においては、本発明のヒドロキシメチル置換モノマーのヒドロキシメチル置換基は、当業者に公知の方法を使用して、本発明のＲＮＡ複合体への取り込みの前に、チオエーテル官能基に変換される。図２参照（モノマーＧ）。

別の実施形態においては、本発明のヒドロキシメチル置換モノマーのヒドロキシメチル置換基は、当業者に公知の方法を使用して、本発明のＲＮＡ複合体への取り込みの前に、メルカプトメチル官能基に変換される。図２参照（モノマーＧ、Ｒ＝Ｈ）。このメルカプト官能基は、当業者に公知の方法を使用して、ＲＮＡ合成の間、例えば、そのアセチル誘導体として適切に保護される。

一実施形態においては、本発明のヒドロキシメチル置換モノマーのヒドロキシメチル置換基は、当業者に公知の方法を使用して、本発明のＲＮＡ複合体への取り込みの前に、アミン官能基に変換される。図２参照（モノマーＩ、Ｒ＝Ｈ）。このアミン官能基は、当業者に公知の方法を使用して、ＲＮＡ合成の間、例えば、そのトリフルオロアセチルまたはＦｍｏｃ誘導体として適切に保護される。

一実施形態においては、本発明のヒドロキシメチル置換モノマーのヒドロキシメチル置換基は、アミド結合共役基の付加のためのハンドルとして作用している。これは、例えば、上記のような、ヒドロキシメチル置換基のヒドロキシル部分のアミン部分への変換、および、例えば、当業者に公知の方法を使用するアミド結合形成による、共役基でのこのアミノ基のさらなる誘導体化を伴う。これは、当業者に公知の方法を使用するＲＮＡ合成の前後に行われてもよい（図２、モノマーＨ）。

一実施形態においては、本発明のヒドロキシメチル置換モノマーのヒドロキシメチル置換基は、アミノ結合共役基の付加のためのハンドルとして作用している。これは、例えば、上記のような、ヒドロキシメチル置換基のヒドロキシル部分のアミン部分への変換、および、例えば、当業者に公知の方法を使用するアミン結合形成による、共役基でのこのアミノ基のさらなる誘導体化を伴う。これは、当業者に公知の方法を使用するＲＮＡ合成の前後に行われてもよい（図２、モノマーＩ）。

さらなる一実施形態においては、結合のために使用されるアミン基は、アミノ基、ピペラジノ基、またはジアミノアルキル基である。そのようなモノマーは、アミン誘導体化モノマーと称される。これらの基のそれぞれは、さらに誘導体化または結合体化される場合がある（図２、モノマーＪ）。

一実施形態においては、本発明のＲＮＡ複合体は、天然型ＲＮＡ複合体と比較して、オフターゲット効果の低下がある。

一好ましい実施形態においては、ＲＮＡ複合体は、アンチセンス鎖において、本発明の少なくとも１個のヒドロキシメチル置換モノマーを有する。

別の好ましい実施形態においては、ＲＮＡ複合体は、アンチセンス鎖のいわゆる種領域、またはその周辺、すなわち、アンチセンス鎖の５’末端から位置番号１〜１２の少なくとも１つに取り込まれる、本発明の少なくとも１つのヒドロキシメチル置換モノマーを有する。

別の好ましい実施形態においては、ＲＮＡ複合体は、アンチセンス鎖の５’末端から位置番号２〜１０の少なくとも１つに取り込まれる、本発明の少なくとも１個のヒドロキシメチル置換モノマーを有する。さらに別の好ましい実施形態においては、ＲＮＡ複合体は、アンチセンス鎖の５’末端から位置番号３〜８の１つに取り込まれる、本発明の１個のヒドロキシメチル置換モノマーを有する。

さらに別の好ましい実施形態においては、ＲＮＡ複合体は、アンチセンス鎖の５’末端から位置番号７〜８の１つに取り込まれる、本発明の１個のヒドロキシメチル置換モノマーを有する。

さらに別の好ましい実施形態においては、ＲＮＡ複合体は、アンチセンス鎖の５’末端から位置番号７に取り込まれる、本発明の１個のヒドロキシメチル置換モノマーを有する。

さらに別の好ましい実施形態においては、ＲＮＡ複合体は、アンチセンス鎖の５’末端から位置番号９〜１６に取り込まれる、本発明の１個のヒドロキシメチル置換モノマーを有する。

さらに別の好ましい実施形態においては、ＲＮＡ複合体は、アンチセンス鎖の５’末端から位置番号９〜１１に取り込まれる、本発明の１つの個ヒドロキシメチル置換モノマーを有する。

さらに別の好ましい実施形態においては、ＲＮＡ複合体は、アンチセンス鎖の５’末端から位置番号９〜１０に取り込まれる、本発明の１個のヒドロキシメチル置換モノマーを有する。

別の実施形態においては、本発明のＲＮＡ複合体は、天然型ＲＮＡ複合体と比較して、免疫応答の低減をもたらす。

さらに別の実施形態においては、本発明のＲＮＡ複合体は、天然型ＲＮＡ複合体と比較して持続効果を有する。

さらに別の実施形態においては、本発明のＲＮＡ複合体は、天然型ＲＮＡ複合体と比較して増大した効果を有する。したがって、好ましい実施形態においては、ＲＮＡ複合体は、例えば、標的ｍＲＮＡのより効率的な分解、または標的ｍＲＮＡのより効率的な翻訳阻害によって、天然型ＲＮＡ複合体より効率的にＲＮＡｉを媒介する。

さらに別の実施形態においては、本発明のＲＮＡ複合体は、ヒトまたは動物の特定の器官または組織に効率的に送達される。

さらに別の実施形態においては、本発明のＲＮＡ複合体は、効率的に細胞膜に浸透することができる。

さらに別の実施形態においては、本発明のＲＮＡ複合体は、天然ＲＮＡ複合体より効率的に細胞膜に浸透することができる。

一実施形態においては、本発明のＲＮＡ複合体は、人体におけるＲＮＡ複合体の保持を増加させるプラズマタンパク質に結合することができる。

第２の態様、ＲＮＡ複合体の調製
本発明の別の態様は、中核二本鎖領域を含むＲＮＡ複合体が形成される条件下で、アンチセンス鎖をパッセンジャー鎖とともに培養することを含む、本発明の二本鎖ＲＮＡ複合体を調製する方法であって、このＲＮＡ複合体は、対応する細胞ＲＮＡのＲＮＡ干渉を媒介することが可能である。

本態様の代替の実施形態においては、ＲＮＡ複合体は、本発明のＲＮＡ二本鎖によって置換される（第１０の態様）。

第３の態様、核酸改変を媒介する方法
本発明のさらに別の態様は、以下のステップを含む、細胞または生物における標的核酸の核酸改変を媒介する方法である。
ａ．標的核酸の改変を生じることができる条件下で、細胞または生物を本発明のＲＮＡ複合体に接触させるステップ、
ｂ．それにより、標的核酸の改変を媒介するステップ。

好ましい実施形態においては、標的核酸の核酸改変を媒介する方法は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで行われる。

好ましい実施形態においては、標的核酸の核酸改変を媒介する方法は、ｉｎ ｖｉｖｏ、すなわち、動物、ヒト、または非ヒト動物において行われる。

好ましい実施形態においては、標的核酸の核酸改変を媒介する方法は、細胞培養物中で行われる。

さらに別の実施形態においては、上記方法は、単離細胞上で行われる。

好ましい実施形態においては、上記方法の核酸改変は、ＲＮＡ干渉、好ましくは、標的ｍＲＮＡの分解、または標的ｍＲＮＡの翻訳阻害、または他の種類のＲＮＡ、例えば、非コードＲＮＡの阻害である。

別の実施形態においては、核酸改変は、ＤＮＡメチル化である。

本態様の代替の実施形態においては、ＲＮＡ複合体は、本発明のオリゴヌクレオチド（第９の態様）または本発明のＲＮＡ二本鎖（第１０の態様）のいずれかによって置換される。

第４の態様、遺伝子機能を検査する方法
本発明の別の態様は、以下のステップを含む、細胞または生物における遺伝子の機能を検査する方法である。
ａ．この遺伝子に対応する本発明のＲＮＡ複合体を細胞または生物に導入することによって、被検細胞または被検生物を産生するステップ、
ｂ．標的核酸の改変を生じることができる条件下で、被検細胞または被検生物を維持するステップ、
ｃ．ステップｂにおいて産生された被検細胞または被検生物の表現型を観察し、任意で、観察した表現型を適切な対照細胞または対照生物の表現型と比較することによって、遺伝子の機能に関する情報を提供するステップ。

本発明のＲＮＡ複合体は、例えば、添付の実施例において概説されるトランスフェクションを使用して、細胞に導入することができる。

生物または細胞の表現型は、例えば、タンパク質レベルを評価するためのプロテオミクス、またはＲＮＡレベルを評価するためのマイクロアレイを使用して観察することができる。また、より明確な表現型、例えば、１つの特定の遺伝子の発現を使用することができる。

遺伝子の機能に関して得られた情報は、特定の疾患に対して、遺伝子産物が、治療的介入に適切な標的であるかを判断するために使用することができる。そのため、ある遺伝子産物が、例えば、癌の特定の亜型において影響を受けることが公知のある生化学経路において作用することが証明される場合、遺伝子産物は、癌の前述の亜型の治療に対する治療的介入に適切な標的であり得る。

細胞または生物における遺伝子の機能を検査する方法の好ましい実施形態においては、方法の核酸改変は、ＲＮＡ干渉、好ましくは、標的ｍＲＮＡの分解、または標的ｍＲＮＡの翻訳阻害である。

別の実施形態においては、核酸改変は、ＤＮＡメチル化である。

細胞または生物における遺伝子の機能を検査する方法の好ましい実施形態においては、上記方法は、細胞培養物中で、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、またはｉｎ ｖｉｖｏで行われる。

さらに別の実施形態においては、上記方法は、単離細胞上で行われる。

本態様の代替の実施形態においては、ＲＮＡ複合体は、本発明のオリゴヌクレオチド（第９の態様）または本発明のＲＮＡ二本鎖（第１０の態様）のいずれかによって置換される。

第５の態様、薬剤を評価する方法
本発明の別の態様は、以下のステップを含む、薬剤が遺伝子産物に作用するかを評価する方法である。
ａ．この遺伝子に対応する本発明のＲＮＡ複合体を細胞または生物に導入することによって、被検細胞または被検生物を産生するステップ、
ｂ．標的核酸の改変を生じる条件下で、被検細胞または被検生物を維持するステップ、
ｃ．この薬剤を被検細胞または被検生物に導入するステップ、
ｄ．ステップｃにおいて産生された被検細胞または生物の表現型を観察し、任意で、観察した表現型を適切な対照細胞または対照生物の表現型と比較することによって、この薬剤が遺伝子産物に作用するかどうかに関する情報を提供するステップ。

ステップｄにおける好ましい対照は、導入されたステップａのＲＮＡ複合体を有していない被検細胞または被検生物である。

上記薬剤が遺伝子または遺伝子産物に作用するかを評価する方法の好ましい実施形態においては、この方法の核酸改変は、ＲＮＡ干渉、標的ＲＮＡの好ましい分解または標的ＲＮＡの標的の翻訳阻害である。別の実施形態においては、核酸改変の改変は、ＤＮＡメチル化である。

薬剤が遺伝子産物上に作用するかを評価する方法の好ましい実施形態においては、方法は、細胞培養、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、またはｉｎ ｖｉｖｏで行われる。

さらに別の実施形態においては、方法は、単離細胞上で行われる。

本態様の代替の実施形態においては、ＲＮＡ複合体は、本発明のオリゴヌクレオチド（第９の態様）または本発明のＲＮＡ二本鎖（第１０の態様）のいずれかによって置換される。

第６の態様、医薬組成物
本発明のさらに別の態様は、ＲＮＡ複合体および医薬的に許容可能な希釈剤、担体、またはアジュバントである。本発明のＲＮＡ複合体が特定の遺伝子または遺伝子産物を標的とするように設計することができることは、当業者にとって明らかである。ＲＮＡ複合体は、タンパク質ではなく、ＤＮＡ配列またはＲＮＡ配列を標的とすることが理解されよう。しかしながら、タンパク質等の遺伝子産物のレベルは、そのｍＲＮＡまたは非コードＲＮＡが、例えば、ＲＮＡ分解または翻訳阻害によって改変される場合、間接的に影響を受ける場合がある。また、タンパク質をコードする遺伝子の発現は、例えば、ＤＮＡメチル化のために影響を受ける場合がある。

本態様の代替の実施形態においては、ＲＮＡ複合体は、本発明のオリゴヌクレオチド（第９の態様）または本発明のＲＮＡ二本鎖（第１０の態様）のいずれかによって置換される。

第７の態様、薬物の使用
したがって、別の態様は、薬物としての使用のための本発明のＲＮＡ複合体である。ＲＮＡ複合体の特異性は、アンチセンス鎖の配列内のみにあるため、治療標的が確認されると、当業者は、標的のレベルおよび活性に影響を与えるＲＮＡ複合体を設計することができる。連続的パッセンジャー鎖を有する天然型ＲＮＡ複合体に対しては、ガイド配列として作用するパッセンジャー鎖のため、オフターゲット効果に関連する問題が残る。

本態様の代替の実施形態においては、ＲＮＡ複合体は、本発明のオリゴヌクレオチド（第９の態様）または本発明のＲＮＡ二本鎖（第１０の態様）のいずれかによって置換される。

第８の態様、モノマー
本発明の態様は、本発明のヒドロキシメチル置換モノマーの取り込みに適切なモノマー、および容易に入手可能な出発物質からのそれらの調製のための方法である。本発明のヒドロキシメチル置換モノマーのチミン−１−イル誘導体は、ＤＮＡ鎖へ取り込まれ、自動ＤＮＡ／ＲＮＡ合成に対するそれらのホスホラミダイト基本要素の調製のための手順が報告されている［Ｋ．Ｄ．Ｎｉｅｌｓｅｎら，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．１９９５，３，１４９３；Ｈ．Ｔｈｒａｎｅら，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ １９９５，５１，１０３８９；Ｐ．Ｎｉｅｌｓｅｎら，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．１９９５，３，１９］。

ほとんどの場合、本発明のＲＮＡ複合体は、当業者に公知の自動オリゴヌクレオチド合成によって調製される。本発明のヒドロキシメチル置換モノマーの本発明のＲＮＡ複合体への取り込みは、ａ）自動ＲＮＡ合成器でのＲＮＡ合成、ｂ）ＲＮＡ精密検査、ｃ）ＲＮＡ精製、およびｄ）ＲＮＡ単離のための標準方法に従う［Ｆ．Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ａｎａｌｏｇｕｅｓ，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，１９９１］。ヒドロキシメチル置換ＲＮＡオリゴヌクレオチド（＝ＲＮＡ鎖）およびＲＮＡ複合体は、ＲＮＡ合成のための標準技術を使用して、ホスホラミダイト誘導体を使用して合成することができる。

好ましい実施形態においては、本発明のヒドロキシメチル置換モノマーのホスホラミダイト誘導体の調製の方法は、アデニン、グアニン、シトシン、および５−メチルシトシンの塩基に対して、例えば、ベンゾイル、イソブチリル、アセチル、フェノキシアセチル、
ｔｅｒｔ−ブチルフェノキシアセチル、または当業者に公知の他の標準塩基保護基のような塩基保護基を含有するリボヌクレオシド、例えば、リボヌクレオシドのＯ５’−ＤＭＴ保護誘導体から開始する。

好ましい実施形態においては、本発明は、２’，３’−開裂炭素−炭素結合（リボヌクレオシド命名法）を有するモノマーＤおよびＥの取り込みに適切なモノマー基本要素を調製するための方法を含む。

他の好ましい実施形態においては、本発明は、２’，３’−開裂炭素−炭素結合を有し、加えて、例えば、ヒドロキシ基以外の、例えば、その２’−炭素原子（リボヌクレオシド命名法）に官能基または基を持つＦ〜Ｊのようなモノマーの取り込みに適切なモノマー基本要素を調製する方法を含む。

本発明の好ましい実施形態においては、モノマーＤのホスホラミダイト誘導体の調製の方法は、主要なステップの中でもとりわけ、２’，３’−グリコール開裂、得られた中間体の還元、選択的Ｏ２’−保護、およびＯ３’−ホスフィチル化を含む。

好ましい実施形態においては、２’，３’−グリコール開裂は、例えば、試薬としての過ヨウ素酸ナトリウムでの酸化開裂を使用して行われる。

別の好ましい実施形態においては、過ヨウ素酸ナトリウム開裂後の中間体の還元は、例えば、水素化ホウ素ナトリウムに影響を受ける対応するジオールへと還元される。

モノマーＤの本発明のＲＮＡ複合体への取り込みに対して、２’−ヒドロキシ基（リボヌクレオシド命名法）を保護することが必要である。本発明の好ましい実施形態においては、これはベンゾイル化によって行われる。保護の選択性、すなわち、Ｏ３’−ベンゾイル化に対するＯ２’−ベンゾイル化の量を最適化するため、１当量よりわずかに多いベンゾイル化試薬（塩化ベンゾイル、または例えば、無水ベンゾイル）を使用することは有益な場合がある。好ましい一実施形態においては、ベンゾイル化は、室温以下で行われる。別の有用な実施形態においては、ベンゾイル化は、０℃以下または−５０℃以下でも行われる。

別の好ましい実施形態においては、Ｏ２’−保護は、アセチル化、または有機合成分野の当業者に公知のアシル化試薬を使用するアシル化を行うことによって行われる。

別の好ましい実施形態においては、Ｏ２’−保護は、シリル化試薬を使用するシリル化、および有機合成分野の当業者に公知の方法によって行われる。好ましいシリル化保護基は、ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルである。

次のホスフィチル化反応は、好ましい実施形態においては、いわゆる「ＰＣｌ」試薬［ＰＣｌ（ＯＣＨ_２ＣＨ_２ＣＮ）（Ｎ（ｉＰｒ）_２）］、またはいわゆる「ビス−アミダイト」試薬［Ｐ（ＯＣＨ_２ＣＨ_２ＣＮ）（Ｎ（ｉＰｒ）_２）_２］のいずれかを使用して行われる。

モノマーＤのホスホラミダイト誘導体の調製の方法の好ましい実施形態においては、出発物質は、アデニン、グアニン、シトシン、および５−メチルシトシンの塩基に対して、例えば、ベンゾイル、イソブチリル、アセチル、フェノキシアセチル、ｔｅｒｔ−ブチルフェノキシアセチル、または当業者に公知の他の標準塩基保護基のような塩基保護基を含有するリボヌクレオシド、例えば、リボヌクレオシドのＯ５’−ＤＭＴ保護誘導体である。

別の好ましい実施形態においては、本発明は、モノマーＥのホスホラミダイト誘導体の調製の方法を提供する。

本発明の好ましい実施形態においては、モノマーＥのホスホラミダイト誘導体の調製の方法は、主要なステップの中でもとりわけ、２’，３’−グリコール開裂、得られた中間体の還元、選択的Ｏ３’−保護、およびＯ２’−ホスフィチル化を含む。Ｏ３’−保護は、例えば、シリル化またはアシル化、もしくは、まず、Ｏ２’−ベンゾイル化、その後Ｏ３’−シリル化、およびその後Ｏ２’−脱ベンゾイル化のような組み合わせによって行うことができる。他の保護基も、当業者にとって明らかなように、適応することができる。

別の好ましい実施形態においては、２’，３’−開裂炭素−炭素結合を有し、加えて、ヒドロキシ基以外の、その２’−炭素原子（リボヌクレオシド命名法）に官能基を持つＦ〜Ｊのようなモノマーの取り込みに適切なモノマー基本要素を調製する方法は、主要なステップの中でもとりわけ、リボヌクレオシド（例えば、Ｏ５’−ＤＭＴ保護リボヌクレオシド）２’，３’−グリコール開裂、得られた中間体の還元、選択的Ｏ３’−保護、２’−ヒドロキシ基の変換、Ｏ３’−脱保護、およびＯ３’−ホスフィチル化から開始するステップを含む。Ｏ３’−保護は、例えば、シリル化またはアシル化、もしくは、まず、Ｏ２’−ベンゾイル化、その後Ｏ３’−シリル化、およびその後Ｏ２’−脱ベンゾイル化のような組み合わせによって行うことができる。他の保護基も、当業者にとって明らかなように、適用することができる。２’−ヒドロキシ基の、アミノ、アシル化アミノ、アルキル化アミノ、ジアルキル化アミノ、カルバモイル化アミノ、ピペラジノ、アシル化ピペラジノ、アルキル化ピペラジノ、カルバモイル化ピペラジノ、メルカプト、アシル化メルカプト、アルキル化メルカプト、ジスルフィド、アシル化ヒドロキシ、アルキル化ヒドロキシ、カルバモイル化ヒドロキシ等のような別の基への変換、またはこれらの基の置換および／または保護誘導体による変換は、有機合成分野の当業者に公知の方法および手順を使用して行うことができる。そのような方法および手順は、２’−ヒドロキシ基またはアシル化の活性誘導体に対する置換反応、またはカルバモイル化反応を含む。そのような方法および手順は、アミノまたはメルカプトのような他のＣ２’付加基の包含後のＯ２’−アルキル化反応およびアルキル化反応も含む。さらに別の可能性は、例えば、求核試薬との反応によってさらに改変される場合があるアルデヒド官能基、または、例えば、活性エステルのような活性誘導体へのカルボキシ官能基の変換後の求核試薬との反応によってさらに改変される場合があるカルボキシ官能基を得るための２’−ヒドロキシ基の酸化である。

本発明の別の実施形態においては、Ｆ〜Ｊのようであるが、Ｏ２’原子がホスフィチル化され、Ｃ３’原子がヒドロキシ基以外の官能基と結合するように、３’−ヒドロキシ基が別の基に変換されるように「逆」（同様にモノマーＤおよびＥは、「逆」と考えられる）であるモノマーの取り込みに適切なモノマー基本要素を調製する方法は、主要なステップの中でもとりわけ、リボヌクレオシド（例えば、Ｏ５’−ＤＭＴ保護リボヌクレオシド）２’，３’−グリコール開裂、得られた中間体の還元、選択的Ｏ２’−保護、３’−ヒドロキシ基の変換、Ｏ２’−脱保護、およびＯ２’−ホスフィチル化から開始するステップを含む。Ｏ２’−保護は、例えば、シリル化またはアシル化、もしくは、それらの組み合わせによって行うことができる。他の保護基も、当業者にとって明らかなように、適応することができる。３’−ヒドロキシ基の、アミノ、アシル化アミノ、アルキル化アミノ、ジアルキル化アミノ、カルバモイル化アミノ、ピペラジノ、アシル化ピペラジノ、アルキル化ピペラジノ、カルバモイル化ピペラジノ、メルカプト、アシル化メルカプト、アルキル化メルカプト、ジスルフィド、アシル化ヒドロキシ、アルキル化ヒドロキシ、カルバモイル化ヒドロキシ等のような別の基への変換、またはこれらの基の置換および／または保護誘導体による変換は、有機合成分野の当業者に公知の方法および手順を使用して行うことができる。そのような方法および手順は、３’−ヒドロキシ基またはアシル化の活性誘導体に対する置換反応、またはカルバモイル化反応を含む。そのような方法および手順は、アミノまたはメルカプトのような他のＣ３’付加基の包含後のＯ３’−アルキル化反応およびアルキル化反応も含む。さらに別の可能性は、例えば、求核試薬との反応によってさらに改変される場合があるアルデヒド官能基、または、例えば、活性エステルのような活性誘導体へのカルボキシ官能基の変換後の求核試薬との反応によってさらに改変される場合があるカルボキシ官能基を得るための３’−ヒドロキシ基の酸化である。

一実施形態においては、２’−Ｃ−ピペラジノ誘導体は、２’−ヒドロキシ基を脱離基（例えば、メシラート誘導体）に変換し、その後、大過剰のピペラジンと反応させることによって調製される。これは、例えば、構造アミダイトＪのホスホラミダイトの合成に対するステップとして行うことができる（下図参照）。

さらに別の実施形態においては、本発明は、天然核酸塩基とは異なる基または官能基をＣ１’原子（リボヌクレオシド命名法）に持つ、本発明のヒドロキシメチル置換モノマーの取り込みに適切なモノマー基本要素を調製する方法を含む。保護基を含む場合があるそのような基または官能基は、天然核酸塩基以外の、例えば、ピレン、ペリレン、フルオロフォア、水素、アルキル、反応基、および複素環を含む。

さらに別の実施形態においては、本発明は、ホスホラミダイト誘導体の代わりにＨ−ホスホン酸誘導体として構成される、本発明のヒドロキシメチル置換モノマーの取り込みに適切なモノマー基本要素を調製する方法を含む。

以下に、ホスホラミダイト（＝アミダイト）基本要素（ＤＭＴ＝４，４’−ジメトキシトリチル；塩基＝天然核酸塩基；ＣＥｔＯ＝シアノエトキシ）に対する、本発明の一部の好ましい実施形態の構造の例を示す。

第９の態様、非環式オリゴヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド
本発明の第９の態様は、非環式ヌクレオチドモノマーを含むオリゴヌクレオチドである。詳細な説明および実施例のセクションから明らかであるように、そのようなオリゴヌクレオチドは、様々な用途および利点を有する。

好ましい実施形態においては、非環式ヌクレオチドモノマーは、２’−３’−セコ−ヌクレオチドモノマーである。非環式ヌクレオチドモノマーを含む本発明のオリゴヌクレオチドは、驚くことに、ＲＮＡｉ機構の基質細胞酵素であることが分かり、場合によっては、これらのオリゴヌクレオチドは、非環式ヌクレオチドモノマーを有さない同一のオリゴヌクレオチドよりも優れている。

好ましくは、非環式ヌクレオチドモノマーは、モノマーＥ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、またはＪ（図１参照）から成る群より選択される。当業者にとって明らかとなるように、Ｇ，Ｆ、Ｈ、Ｉ、またはＪは、すべて、モノマーＤの合成前駆体から作成することができる。図２に示されるように、非環式モノマーは、コレステリル誘導体、アルキル、フルオロフォア、ポリアミン、アミノ酸、単糖類、ポリペプチド等の共役基を持つ誘導体に転換することができる。そのような共役基は、例えば、オリゴヌクレオチドが、細胞、器官、または生物における標的ｍＲＮＡの活性を調節するために使用される場合、より優れた生物学的安定性および／または生体内分布のために有用である場合がある。

オリゴヌクレオチドの長さは、好ましくは１０〜４０個のヌクレオチドモノマーである。さらにより好ましくは、１８〜３０個のヌクレオチドモノマーの長さである。

好ましい実施形態においては、本発明のオリゴヌクレオチドは、５個未満の非環式ヌクレオチドモノマーを含む。別の好ましい実施形態においては、オリゴヌクレオチドは、非環式ヌクレオチドモノマー以外の５個のヌクレオチドモノマーあたり１個以下の非環式ヌクレオチドモノマーを含む。さらにより好ましくは、非環式ヌクレオチドモノマー以外の８個のヌクレオチドモノマーあたり１個以下の非環式ヌクレオチドモノマーを含む。非環式ヌクレオチドモノマーの数が多くなる場合、相補核酸との本発明のオリゴヌクレオチドの結合親和性は、低下を示す。

そのため、別の実施形態においては、オリゴヌクレオチドは、１〜５個の非環式ヌクレオチドモノマーを含む。

好ましい実施形態においては、非環式ヌクレオチドモノマーは、オリゴヌクレオチドの位置１〜８、より好ましくは位置２〜７の１つまたは複数のみに存在する。位置は、オリゴヌクレオチドの５’末端から数えられる。これらの領域の非環式ヌクレオチドモノマーは、これらの位置がミクロＲＮＡのいわゆる種領域と対応するため、オリゴヌクレオチドがミクロＲＮＡとして作用することを低減または妨害する。これは、例えば、オリゴヌクレオチドが、ｓｉＲＮＡのガイド鎖として機能することを目的とする場合、該当する。

好ましい実施形態においては、アンチセンス鎖におけるすべてのヒドロキシメチル改変ヌクレオチドモノマーは、位置９〜１６に存在し、位置は、５’末端から数えられる。さらにより好ましくは、アンチセンス鎖におけるヒドロキシメチル改変ヌクレオチドモノマーは、位置９〜１１に存在する。そのため、前述の領域におけるヒドロキシメチル改変ヌクレオチドモノマーの存在は、ミクロＲＮＡとして作用するようにアンチセンス鎖を誘導し、すなわち、確実にｓｉＲＮＡ効果を最小限にし、ミクロＲＮＡ効果をより高くする。この効果は、恐らく、非環式ヒドロキシメチル置換モノマー、例えば、モノマーＤの存在によって生じる親和性の低下のため、完全長結合に対する傾向の低下によって引き起こされる。

好ましい実施形態においては、オリゴヌクレオチドは、８個より多い連続的ＤＮＡモノマーのＤＮＡ配列を含まない。さらにより好ましくは、６個以下の連続的ＤＮＡモノマー、およびより好ましくは、４個以下の連続的ＤＮＡモノマーである。連続的ＤＮＡモノマーは、通常、ＲＮＡの分解をもたらす、相補ＲＮＡと結合する場合、オリゴヌクレオチドがＲＮアーゼＨを活性化することを可能にする。本発明の一部の実施形態においては、これは望ましくない。そのため、さらなる実施形態においては、オリゴヌクレオチドは、いかなるＤＮＡモノマーも全く含有しない。

他の実施形態においては、ＲＮアーゼＨ活性は望ましく、オリゴヌクレオチドが４個より多い連続的ＤＮＡモノマー、より好ましくは６個より多いＤＮＡモノマー、および、より好ましくは８個より多いＤＮＡモノマーを含むことが好ましい。

さらに別の実施形態においては、オリゴヌクレオチドは、５０％を上回るＲＮＡモノマーを含む。高い割合のＲＮＡモノマーは、例えば、ＲＩＳＣ等の細胞酵素に対する基質またはガイド（または共因子）として機能することにより、ＲＮＡと相互作用するタンパク質との相互作用を促進する。

そのため、別の実施形態においては、オリゴヌクレオチドのモノマーの８０％より多くが、ＲＮＡモノマーであることが好ましい。さらに別の実施形態においては、オリゴヌクレオチドのモノマーの９０％より多くが、ＲＮＡモノマーであることが好ましい。

明らかとなるように、オリゴヌクレオチドは、ヌクレオチドモノマー類似体も含む場合がある。そのような一実施形態においては、非環式ヌクレオチドモノマーおよびＲＮＡモノマーは、すべてのヌクレオチドモノマーの８０％より多く以上を占める。別の実施形態においては、非環式モノマーおよびＲＮＡモノマーは、すべてのヌクレオチドモノマーの９０％より多くを占める。

オリゴヌクレオチドがヌクレオチドモノマー類似体を含む場合、それらが、２’−Ｏ−アルキル−ＲＮＡモノマー、２’−アミノ−ＤＮＡモノマー、２’−フルオロ−ＤＮＡモノマー、ＬＮＡモノマー、ＰＮＡモノマー、ＨＮＡモノマー、ＡＮＡモノマー、ＦＡＮＡモノマー、ＣｅＮＡモノマー、ＥＮＡモノマー、ＤＮＡモノマー、およびＩＮＡモノマーから成る群より選択されることが好ましい。ヌクレオチド類似体は、通常、結合親和性を調節し、生物学的安定性を増加させ、概して、オリゴヌクレオチドにより薬物のような特性を与えるために使用される。

一実施形態においては、オリゴヌクレオチドは、少なくとも２つのＬＮＡヌクレオチド類似体を含む。非環式ヌクレオチドモノマーは、通常、相補核酸へ塩基対合した本発明のオリゴヌクレオチドの融解温度（すなわち、結合親和性）を低下させ、ＬＮＡヌクレオチドモノマーは、この融解温度の低下を妨げるために使用される場合がある。すなわち、一実施形態においては、非環式ヌクレオチドモノマーの数は、ＬＮＡヌクレオチドモノマーの数と同一である。

好ましい実施形態においては、オリゴヌクレオチドは、非環式モノマーおよびＲＮＡモノマーのみを含む。

別の好ましい実施形態においては、オリゴヌクレオチドは、非環式ヌクレオチドモノマー、ＲＮＡモノマー、およびＬＮＡヌクレオチド類似体のみを含む。

好ましい実施形態においては、本発明のオリゴヌクレオチドは、ホスホロチオエート結合、ボラノホスフェート結合、エチルホスホン酸結合、ホスホロアミダート結合、およびホスホトリエステル結合から成る群より選択される１つまたは複数の結合を含む。ホスホロチオエート結合および／またはボラノホスフェート結合が最も好ましい。これらの結合は、オリゴヌクレオチドの生物学的安定性を改善し、オリゴヌクレオチドの生体内分布に対して好ましい効果を有することも示されている。好ましい実施形態においては、オリゴヌクレオチドは、前述のヌクレオチド間結合の５０％より多く、さらにより好ましくは７５％より多くを含む。一実施形態においては、全てのヌクレオチド間結合は、前述の型である。

好ましい実施形態においては、本発明のオリゴヌクレオチドは、相補オリゴヌクレオチドへ塩基対合せず、すなわち、本発明のオリゴヌクレオチドは、一本鎖である。

さらに別の実施形態においては、オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドに相補的な標的ｍＲＮＡのＲＩＳＣ依存性翻訳抑制または分解を媒介することが可能である。当業者は、ＲＩＳＣをＲＮＡ誘導サイレンシング複合体として認識し、本実施形態においては、オリゴヌクレオチドは、ＲＩＳＣに対してガイド配列として作用するため、ＲＩＳＣをＲＮＡオリゴヌクレオチド、通常、本発明のオリゴヌクレオチドへの部分的または完全相補性を有するｍＲＮＡへ誘導することを理解する。オリゴヌクレオチドがＲＩＳＣを部分的相補性のｍＲＮＡ標的へ誘導する場合、オリゴヌクレオチドは、ミクロＲＮＡ模倣体として見られる場合があり、オリゴヌクレオチドがＲＩＳＣを完全相補性のｍＲＮＡ標的へ誘導する場合、一本または二本鎖ｓｉＲＮＡとして見られる場合がある。

ＲＩＳＣ依存性は、ＲＩＳＣ成分をコードするｍＲＮＡに対するｓｉＲＮＡを使用して、ＲＩＳＣの成分をノックアウトすることによって、細胞株において評価され、ノックアウト細胞株におけるオリゴヌクレオチドの活性を評価することができる。そのような実験は、当業者に周知である。

第１０の態様、本発明のオリゴヌクレオチドを含むＲＮＡ二本鎖
本発明の第１０の態様は、本発明による第１のオリゴヌクレオチド、および第２のオリゴヌクレオチドを含むＲＮＡ二本鎖である。

好ましい実施形態においては、ＲＮＡ二本鎖の第２のオリゴヌクレオチドも、本発明のオリゴヌクレオチドである。

明らかとなるように、第１の態様における本発明のＲＮＡ複合体に関して説明された特色の多くは、第１０の態様のＲＮＡ二本鎖にも適用できる。

好ましくは、本発明のＲＮＡ二本鎖は、１５〜４０個の塩基対の数を含み、好ましい実施形態においては、１８個の塩基対、１９個の塩基対、２０個の塩基対、２１個の塩基対、２２個の塩基対、および２３個の塩基対の群から選択される多くの塩基対を含む。

さらに別の実施形態においては、ＲＮＡ二本鎖は、２５〜３０個の塩基対、より好ましくは２６〜２８個、より好ましくは２７個の塩基対の数を含む。そのようなＲＮＡ二本鎖は、ｄｉｃｅｒ基質ＲＮＡと称される場合がある。

好ましい実施形態においては、本発明のＲＮＡ二本鎖は、突出を含む。

別の実施形態においては、ＲＮＡ二本鎖は、２つの突出を含む。

さらに別の実施形態においては、第１のオリゴヌクレオチドは、３’−突出を含む。

さらに別の実施形態においては、第２のオリゴヌクレオチドは、３’−突出を含む。

好ましくは、突出の長さは、１〜８個のヌクレオチドであり、さらにより好ましくは、突出の長さは、１個のヌクレオチド、２個のヌクレオチド、および３個のヌクレオチドの長さを有する突出から成る群より選択される。

別の実施形態においては、ＲＮＡ二本鎖は、少なくとも１つの平滑末端を含む。

別の実施形態においては、ＲＮＡ二本鎖は、両端が平滑末端化される。

好ましい実施形態においては、ＲＮＡ二本鎖は、１８〜２２個の塩基対の二本鎖領域を含み、第１のオリゴヌクレオチドおよび第２のオリゴヌクレオチドは、それぞれ、１〜３個のヌクレオチドの３’突出を含む。そのようなＲＮＡ二本鎖は、正準ｓｉＲＮＡ（短干渉ＲＮＡ）として認識される。

一実施形態においては、ＲＮＡ二本鎖の１つの鎖は、第１の態様において詳述されるように不連続である。

一実施形態においては、ＲＮＡ二本鎖は、ＲＮＡ二本鎖の第１または第２のオリゴヌクレオチドに相補的な標的ｍＲＮＡの翻訳抑制または分解を媒介することが可能である。すなわち、ＲＮＡ二本鎖は、例えば、ｓｉＲＮＡ、ミクロＲＮＡ、またはプレミクロＲＮＡとして機能する。

一実施形態においては、ＲＮＡ二本鎖は、非環式モノマーの代わりにＲＮＡモノマーを有する同一のＲＮＡ二本鎖と比較して、オフターゲット効果の低下を誘導しながら、標的ｍＲＮＡの翻訳抑制または分解を媒介することが可能である。結合親和性の低下のため、そして第１または第２のオリゴヌクレオチドのいずれかが、ＲＩＳＣに対するガイド鎖として機能できないように改変される場合があるため、オフターゲットの低下が達成さ入れ得る。すなわち、ＲＮＡ二本鎖のどのオリゴヌクレオチドが、パッセンジャー鎖（センス鎖）として機能し、どちらがガイド鎖（アンチセンス鎖）として機能するかを制御することができる。

別の実施形態においては、ＲＮＡ二本鎖は、特に、非環式モノマーが、ｓｉＲＮＡ二本鎖のガイド（アンチセンス）鎖において、オリゴヌクレオチドの５’末端から数えられる位置５〜１０に位置する場合、オフターゲット効果の低下を誘導しながら、標的ｍＲＮＡの翻訳抑制または分解を媒介することが可能である。

別の実施形態においては、ＲＮＡ二本鎖は、特に、非環式モノマーが、ｓｉＲＮＡ二本鎖のガイド（アンチセンス）鎖における位置６〜８に位置する場合、オフターゲット効果の低下を誘導しながら、標的ｍＲＮＡの翻訳抑制または分解を媒介することが可能である。理論に制約されるわけではないが、これらの位置にある非環式モノマーの存在によって誘導される結合親和性の低下は、ミクロＲＮＡ系の効果を誘導するガイド鎖の能力の低下をもたらすと考えられる。すなわち、正確に位置する場合、非環式モノマーは、ｓｉＲＮＡ活性よりもミクロＲＮＡ活性に対して重要であると考えられる、いわゆる種領域結合を低下させる。

一実施形態においては、ＲＮＡ二本鎖は、非環式モノマーの代わりにＲＮＡモノマーを有する同一のＲＮＡ二本鎖と比較した増加した有効性により、ＲＮＡ標的（例えば、遺伝子サイレンシングまたはＲＮＡ干渉）を媒介することが可能である。有効性の増加は、ＲＩＳＣ反応の開裂生成物のオフ率の増加によって達成される。オフ率は、結合親和性の低下によって増加する場合がある。また、基質の柔軟性の増加は、加水分解率を増加させる場合がある。さらに、柔軟性の増加は、ガイド鎖のＲＩＳＣへの取り込み前に、ＲＮＡ二本鎖の巻き戻しを緩和する場合がある。

一実施形態においては、ＲＮＡ二本鎖は、非環式モノマーの代わりにＲＮＡモノマーを有する同一のＲＮＡ二本鎖と比較して、持続した有効性によって、標的ｍＲＮＡの翻訳抑制または分解を媒介することが可能である。例えば、ＲＮＡ二本鎖のオリゴヌクレオチドおよび二本鎖自体が、エクソヌクレアーゼおよびエンドヌクレアーゼに対してより劣る基質であり、それによりオリゴヌクレオチドおよび二本鎖の安定性が増加するため、有効性の持続が達成される。

一実施形態においては、ＲＮＡ二本鎖は、非環式モノマーの代わりにＲＮＡモノマーを有する同一のＲＮＡ二本鎖と比較して、標的ｍＲＮＡの翻訳抑制または分解を媒介することが可能であり、ＲＮＡ二本鎖は、生物学的安定性の改善を有する。

さらに別の実施形態においては、ＲＮＡ二本鎖は、非環式モノマーの代わりにＲＮＡモノマーを有する同一のＲＮＡ二本鎖と比較して、標的ｍＲＮＡの翻訳抑制または分解を媒介することが可能であり、ＲＮＡ二本鎖は、低い免疫刺激を有する。免疫刺激の一理由は、異質オリゴヌクレオチドを認識するトール様受容体との相互作用である。本発明のＲＮＡ二本鎖は、非天然であるため、それらは、トール様受容体による検出がより困難である。
参考文献

実験手順および実施例
（実施例１）
本発明のＲＮＡ複合体の合成
本発明のＲＮＡ複合体のヒドロキシメチル置換モノマーの自動ＤＮＡ／ＲＮＡ合成のためのホスホラミダイト基本要素の調製のための手順が報告されている［チミン誘導体；Ｋ．Ｄ．Ｎｉｅｌｓｅｎら，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．１９９５，３，１４９３；Ｈ．Ｔｈｒａｎｅら，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ １９９５，５１，１０３８９；Ｐ．Ｎｉｅｌｓｅｎら，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．１９９５，３，１９］。アデニン、グアニン、シトシン、およびウラシルの例となるホスホラミダイト誘導体の調製のための手順の開示に関しては、実施例１１を参照されたい。

本発明のＲＮＡ複合体へのこれらのヒドロキシメチル置換モノマーの取り込みは、ａ）自動ＲＮＡ合成器でのＲＮＡ合成、ｂ）ＲＮＡの完成、ｃ）ＲＮＡ精製、およびｄ）ＲＮＡ単離のための標準方法に従う［Ｆ．Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ａｎａｌｏｇｕｅｓ，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，１９９１］。これは、ヒドロキシメチル置換ＲＮＡオリゴヌクレオチド（＝ＲＮＡ鎖）およびＲＮＡ複合体が、ＲＮＡ合成のための標準技術を使用して、公知のホスホラミダイト誘導体を使用して合成することができることを証明する。

ＬＮＡは、１つまたは複数の２’−Ｏ，４’−Ｃ−メチレン結合リボヌクレオチド（ＬＮＡヌクレオチド）を含有するオリゴヌクレオチドである［Ｍ．Ｐｅｔｅｒｓｅｎ ａｎｄ Ｊ．Ｗｅｎｇｅｌ，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００３，２１，７４−８１］。ＬＮＡ改変ｓｉＲＮＡは、１個または複数個のＬＮＡモノマーを含有するｓｉＲＮＡ構築物である。公知の方法は、市販のＬＮＡホスホラミダイトの使用により、本発明のＲＮＡ複合体へＬＮＡヌクレオチドを取り込むために使用されている［Ｐｆｕｎｄｈｅｌｌｅｒ，Ｓoｒｅｎｓｅｎ，Ｌｏｍｈｏｌｔ，Ｊｏｈａｎｓｅｎ，Ｋｏｃｈ ａｎｄ Ｗｅｎｇｅｌ，Ｊ．“Ｌｏｃｋｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｓｙｎｔｅｓｉｓ”，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２００４，ｖｏｌ．２８８（Ｏｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ），１２７−１４５．，Ｐ．Ｈｅｒｄｅｗｉｊｎ，Ｅｄ．，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．］。

ヒドロキシメチル置換ｓｉＲＮＡ（「ヒドロキシメチル置換小干渉ＲＮＡ）は、１個または複数個のヒドロキシメチル置換ヌクレオチドモノマーを含有するｓｉＲＮＡ構築物である（ヒドロキシメチル置換ヌクレオチドモノマーの構造に関しては、図１参照）。例示されるモノマーは、以下に示される。

オリゴヌクレオチド−ｓｉＲＮＡ構築物における選択したアンチセンス鎖：

オリゴヌクレオチド−ｓｉＲＮＡ構築物における選択したセンス鎖：

合成されている他のヒドロキシメチル置換ＲＮＡ鎖：

−上付き文字の「Ｌ」は、残基がＬＮＡヌクレオチドであることを示す。
−上付き文字の「ＭｅＬ」は、残基が５−メチルシトシン塩基を有するＬＮＡヌクレオチドであることを示す。
−太字、下線付きのＴは、ヒドロキシメチル置換ヌクレオチドモノマーである。本実施例においては、それは、Ｃ４’−分枝ＲＮＡモノマーＣのチミン−１−イル誘導体である（図１参照）。
−太字、下線付きのＣは、ヒドロキシメチル置換ヌクレオチドモノマーである。本実施例においては、それは、Ｃ４’−分枝ＲＮＡモノマーＣの５−メチルシトシン（５−ｍｅｔｈｙｌｃｙｔｏｓｉｎ）−１−イル誘導体である（図１参照）。
−太字、下線付きのＸは、ヒドロキシメチル置換非環式ヌクレオチドモノマーである。上記の配列においては、それは、２’，３’−セコ−ＲＮＡモノマーＤのウラシル−１−イル誘導体である（図１参照）。他の実施例および図においては、ウラシル以外の他の塩基改変体が含まれる。

研究されたさらなる配列に関しては、実施例９および１０参照。

細胞研究（ＥＧＦＰを発現する肺癌細胞株）が行われている。本発明を示すための例として、２つまたは３つのヌクレオチド突出（ｏｖｅｒｈａｎｇ）を含有するｓｉＲＮＡ二本鎖を使用する。本実施例の設計は、例示するためだけのものであり、多くの他の構築物は、本発明に含まれ、同様に作用する。したがって、例えば、平滑末端ｓｉＲＮＡ二本鎖、例示されるものより短いか、または長いｓｉＲＮＡ二本鎖、および一本鎖アンチセンス鎖が含まれる。同様に、アンチセンス鎖および不連続的なパッセンジャー鎖（「パッセンジャー鎖」は、「センス鎖」とも称される）を含むＲＮＡ複合体が含まれる。

（実施例２）
本発明のｓｉＲＮＡ複合体のためのアニーリングおよびトランスフェクションの手順
細胞は、６ウェルプレートにプレーティングさせ（ｐｌａｔｅｄ）、４０〜６０％コンフルエンスになるまで増殖させた。トランスフェクションの直前に、細胞は、１ウェルあたり１ｍＬの完全増殖培地を再度プレーティングさせた。センスおよびアンチセンス鎖は、各２０μＭの濃度でアニーリング緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．３、５０ｍＭ ＮａＣｌ）に混合し、９５℃で１分間、および３７℃で１時間インキュベートした。６−ウェルプレートの１ウェルあたり、次の溶液を調製した：１５０μＬの無血清ＲＰＭＩ培地中の４μＬのＴｒａｎｓＩＴ−ＴＫＯ。アニールされたｓｉＲＮＡ複合体を添加し、注意して混合し、室温で２０分間インキュベートし、細胞上に注入した。最終ＲＮＡ複合体濃度は、５０ｎＭであった。３７℃で２４時間のインキュベーション後、培地を交換し、細胞を３７℃でさらに２４時間インキュベートした。細胞をトリプシン処理で除去し、次のＲＮＡおよびフロー分析のために半分に分割した。

遺伝子サイレンシングが達成されると（以下参照）、ヒドロキシメチル置換モノマーを含有する本発明のＲＮＡ複合体は、標準的なトランスフェクション条件下で細胞膜を浸透することができることが証明される。

（実施例３）
遺伝子サイレンシング
ｍＲＮＡおよびタンパク質定量化のための手順。ｅＧＦＰタンパク質の発現を、フローサイトメトリー分析によって分析した。ウエスタンブロット法を以下のように行った。細胞を、ＰＢＳで２回洗浄し、同量の細胞を９０℃で１０分間を２回、２×ＳＤＳ試料緩衝液［４％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、２０％グリセロール、１２５ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ６．８、０．０１ｍｇ／ｍＬのブロモフェノールブルー、１０％２−メルカプトエタノール］中で溶解し（ｌｙｓｅｄ）、ゆっくりとしたピペット操作によって分離した。タンパク質を、８％ＳＤＳ−アクリルアミドゲル中で分離し、ＰＶＤＦ膜（Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ）上で一晩エレクトロブロットした。フィルタは、１０％ｗ／ｖのミルクを含有するＰＢＳで１時間ブロックした。ＥＧＦＰタンパク質は、ウサギポリクローナルＥＧＦＰ抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）の１：１０００希釈を使用して検出された。マウスｈｎＲＮＰ Ｃ１抗体は、Ｓｅｒａｐｈｉｎ Ｐｉｎｏｌ−Ｒｏｍａから寄贈された。西洋ワサビペルオキシダーゼ（ｈｒｐ）結合した二次抗体（ＤＡＫＯ）を、可視化のためのＥＣＬ試薬（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）と共に使用した。ｅＧＦＰｍＲＮＡを、標準手順に従い、ノーザンブロット法によって分析した。

以下は、５０ｍＭのｓｉＲＮＡ複合体濃度で行った遺伝子サイレンシング実験の結果の一覧である。結果は、ミスマッチの対照ｓｉＲＮＡ二本鎖で得られた遺伝子発現レベルに対して（１００％で設定）、パーセンテージで示す。

エントリー１は、未改変ｓｉＲＮＡ複合体が効率的にＧＦＰ遺伝子をサイレンシングしていることを示す。

エントリー２は、ＬＮＡ改変ｓｉＲＮＡ複合体が効率的にＧＦＰ遺伝子をサイレンシングしていることを示す。この構築物は、２つのＲＮＡ鎖の３’末端に対する２つのＬＮＡ改変を有する。

エントリー３〜８の実施例遺伝子サイレンシング実験においては、構造Ｔ／ＣのＣ４’−分枝ＲＮＡヒドロキシメチル置換モノマーを含有するｓｉＲＮＡ複合体が研究される（図３）。

エントリー３は、センス鎖の３’末端から位置２および３にヒドロキシメチル置換モノマーを有する本発明のｓｉＲＮＡ複合体が、ＧＦＰ遺伝子をサイレンシングする際、高度に機能的であることを示す。

エントリー３の実施例、およびエントリー４、５、６、１３および１４の実施例において、例としてのアンチセンス鎖は、ＬＮＡ改変ＲＮＡ鎖であるが、未改変ＲＮＡアンチセンス鎖、または完全もしくは部分的に改変されたＲＮＡアンチセンス鎖も機能的である。得られた結果は、ＬＮＡモノマーのような選択的に改変されたモノマーは、本発明のヒドロキシメチル置換モノマーと完全に適合することを示す。

エントリー４は、センス鎖においてヒドロキシメチル置換モノマーＴ／Ｃを有する本発明のｓｉＲＮＡ複合体が、遺伝子サイレンシングを媒介する際、高度に効率的であることを確認する。

エントリー５および６は、センス鎖においてヒドロキシメチル置換モノマーＴ／Ｃを有する本発明のｓｉＲＮＡ複合体が、遺伝子サイレンシングを媒介する際、高度に効率的であることを確認する。

結果は、非常に効率的な遺伝子サイレンシングが、センス鎖に取り込まれたヒドロキシメチル置換モノマーを有する本発明のｓｉＲＮＡ複合体によって達成されることを示す。データは、概して、未改変ｓｉＲＮＡまたはＬＮＡ改変ｓｉＲＮＡによって達成される遺伝子サイレンシングと比較して、さらに改善された遺伝子サイレンシングが本発明のこれらのＲＮＡ複合体によって達成されるという驚くべき発見を示す。さらに、サイレンシングは、中核領域（ｃｏｒｅ ｒｅｇｉｏｎ）を形成する中央の二本鎖においていくつかのヒドロキシメチル置換モノマーを有するセンスＲＮＡ鎖を含むＲＮＡ複合体でも効率的である（例として、エントリー、Ｗ０４４）。

エントリー７および８は、本発明のｓｉＲＮＡ複合体のアンチセンス鎖においてヒドロキシメチル置換モノマーＴ／Ｃを有する該複合体が、遺伝子サイレンシングを媒介することができることを明らかにする。アンチセンス鎖に取り込まれるヒドロキシメチル置換モノマーＴ／Ｃが多いほど、遺伝子サイレンシング活性がより低いと考えられる。

エントリー７、８、１５、１６、１７および１８の実施例において、例として、ＬＮＡ改変センス鎖が使用されるが、未改変ＲＮＡセンス鎖または完全もしくは部分的に改変されたＲＮＡセンス鎖も機能的である。得られた結果は、ＬＮＡモノマーのような選択的に改変されたモノマーが、本発明のヒドロキシメチル置換モノマーと完全に適合することを示す。

エントリー９〜１８の実施例遺伝子サイレンシング実験においては、上記の図３に示される構造Ｘの２’，３’−セコ−ＲＮＡヒドロキシメチル置換モノマーを含有する本発明のｓｉＲＮＡ複合体が研究される。

エントリー９は、２つのＲＮＡ鎖（２つの鎖の３’末端に対する）のそれぞれにおいて１個のヒドロキシメチル置換モノマーＸを有する本発明のｓｉＲＮＡ複合体が、未改変ｓｉＲＮＡのレベルに相当するレベルまで非常に効率的な遺伝子サイレンシングを媒介することを証明する。これは、驚くことに、ヒドロキシメチル置換モノマーＸのリボース部分の非環式性質を考慮に入れている。

ＲＮＡ複合体の２つの鎖のそれぞれにおける付加的Ｘモノマーでは、遺伝子サイレンシング効率は非効率的である（エントリー１０）。

エントリー１１は、エントリー１０と合わせて、アンチセンス鎖の５’末端付近のヒドロキシメチル置換モノマーＸの取り込みにより、ｓｉＲＮＡ複合体の遺伝子サイレンシング効率が低下することを明らかにする。

エントリー１２は、センス鎖の５’末端付近のヒドロキシメチル置換モノマーＸの取り込みにより、別のモノマーＸがセンス鎖の３’末端に取り込まれる場合、ｓｉＲＮＡ複合体の遺伝子サイレンシング効率が低下することを明らかにする。

エントリー１３および１４は、センス鎖の５’末端付近のヒドロキシメチル置換モノマーＸの取り込みにより、ｓｉＲＮＡ複合体の遺伝子サイレンシング効率が低下することを確認する。結果は、ｓｉＲＮＡ構築物のセンス鎖の中心部におけるヒドロキシメチル置換モノマーＸの取り込みにより、遺伝子サイレンシング活性が改善されることも、低下することもないことを示す。

エントリー１５〜１８は、ＬＮＡ改変ＲＮＡセンス鎖、および１個のヒドロキシメチル置換モノマーＸを有するアンチセンス鎖を含有する本発明のｓｉＲＮＡ複合体による遺伝子サイレンシング実験の結果を示す。

結果は、アンチセンス鎖の中央の領域、例えば、Ｗ１２６およびＷ１２３においてヒドロキシメチル置換モノマーＸを含有する本発明のｓｉＲＮＡ複合体が、非常に効率的な遺伝子サイレンシングを媒介することを示す。驚くべきことに、Ｗ１３１と合わせて非常に効率的な遺伝子サイレンシングを媒介するＷ１２７は、ＬＮＡ改変ＲＮＡセンス鎖ＪＷ１１０６では中度の遺伝子サイレンシングしか誘導しない。このことにより、２つのＲＮＡ鎖（２つの鎖の３’末端に対する）のそれぞれにおいて１個のヒドロキシメチル置換モノマーＸを有する本発明のｓｉＲＮＡ複合体が、未改変ｓｉＲＮＡのレベルに相当するレベルまで非常に効率的な遺伝子サイレンシングを媒介するという観察（エントリー９）の驚くべき態様が強調される。

上記と同様の結果を、ウラシル、チミン、または５−メチルシトシン以外の他の核酸塩基を有するヒドロキシメチル置換モノマーを含有する本発明のＲＮＡ複合体によって得ることができる。例えば、同様のプロトコル（ｐｒｏｔｅｃｏｌ）を使用した同程度の遺伝子サイレンシング活性を、核酸塩基としてアデニン、シトシン、またはグアニンを有するヒドロキシメチル置換モノマーを含有する本発明のＲＮＡ複合体に対して得ることができる。

（実施例４）
免疫刺激
ヒドロキシメチル置換モノマーを含有する本発明のＲＮＡ複合体は、対応する未改変ＲＮＡ複合体に対して化学的改変がなされるため、対応する未改変ＲＮＡ複合体より低い免疫刺激活性を示す。

（実施例５）
オフターゲット効果
ヒドロキシメチル置換モノマーを含有する本発明のＲＮＡ複合体は、アンチセンス鎖改変ｓｉＲＮＡ複合体が不活性であるように、調節することができるため、オフターゲット効果がより低い遺伝子サイレンシングの構築が、本発明により可能になる。要所は、センス鎖がアンチセンス鎖として機能できないように、センス鎖をヒドロキシメチル置換モノマーで改変することである。これは、例えば、ヒドロキシメチル置換モノマーをセンス鎖の５’末端に対して取り込むことによって達成することができる。

非環式モノマーＸでは、オフターゲット効果の低下は、モノマーＸを、アンチセンス鎖、最も好ましくは、アンチセンス鎖の５’末端から位置６〜８の辺り、例えば、アンチセンス鎖の５’末端から位置７に取り込むことによって達成することができる。

（実施例６）
官能化したおよび結合したヒドロキシメチルモノマーを含有する本発明のＲＮＡ複合体の合成
本発明のヒドロキシメチル置換モノマーのヒドロキシメチル置換基は、共役基によって官能化される。共役基は、本明細書において、本発明のＲＮＡ複合体の化学的、生物物理学的、または生物学的特性を調節、拡大、または改善する基として定義される。そのような基は、細胞分布、臓器分布、組織分布、融解温度、標的親和性、生物学的安定性、ハイブリダイゼーションのシグナル伝達等を調節するために有用であり得る。

公知の方法を使用して、ヒドロキシメチル置換基を多様な化学誘導体に変換することができる［Ｆｕｒｎｉｓｓ，Ｈａｎｎａｆｏｒｄ，Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｔａｔｃｈｅｌｌ，Ｖｏｇｅｌ’ｓ Ｔｅｘｔｂｏｏｋ ｏｆ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９８９，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ］。これは、ヌクレオシドレベル、すなわち、自動ＤＮＡ合成器上での自動ＲＮＡ合成に有用なホスホラミダイト誘導体への変換前に達成することができる。有用な誘導体へのヒドロキシメチル基の変換後、自動ＲＮＡ合成に必要なホスホラミダイト誘導体は、標準方法を使用して合成され、ＲＮＡオリゴヌクレオチド（鎖）への誘導体または結合モノマーの取り込みは、その後、標準方法を使用して、達成される（実施例１参照）。

エーテル結合を介する結合 本発明のヒドロキシメチル置換モノマーのヒドロキシメチル置換基は、求核置換反応による、共役基（ｃｏｎｊｕｇａｔｉｎｇ ｇｒｏｕｐ）とヒドロキシメチル置換基のメチレン基との間のエーテル結合によって官能化される。この反応は、例えば、メシル化、またはハロゲン化物への変換、その後のアルコールまたはアルコキシド誘導体による求核付加による、良好な脱離基へヒドロキシメチル置換基のヒドロキシ基の変換を伴う。

チオエーテル結合を介する結合 本発明のヒドロキシメチル置換モノマーのヒドロキシメチル置換基は、求核置換反応による、共役基とヒドロキシメチル置換基のメチレン基との間のチオエーテル結合によって官能化される。この反応は、例えば、メシル化、またはハロゲン化物への変換、その後のアルキルチオールまたはチオアルコキシド誘導体による求核付加を伴う、良好な脱離基へヒドロキシメチル置換基のヒドロキシ基の変換を伴う。求核剤が、選択的にＳＨ⁻である場合、例えば、アセチル化による保護は、本発明のＲＮＡ複合体へのメルカプト（ＳＨ）基の導入に有用なホスホラミダイト誘導体をもたらす。ＲＮＡ複合体へメルカプト官能基を導入するための選択的手順として、ジスルフィド含有部分を有する結合を使用することができる。ジスルフィド含有ＲＮＡ複合体の還元後、メルカプト基官能化ＲＮＡ複合体が得られる。

アミノメチル基への誘導体化 本発明のヒドロキシメチル置換モノマーのヒドロキシメチル置換基は、アミノメチル基へ変換することができる。この反応は、例えば、メシル化、またはハロゲン化物への変換、その後のアンモニア、または所望のアミノ誘導体を得るために脱保護される（例えば、ＲＮＡ合成後）保護アミン誘導体（例えば、フタルイミドのような）による求核付加による、良好な脱離基へヒドロキシメチル置換基のヒドロキシ基の変換を伴う。トリフルオロアセチルまたはＦｍｏｃ保護基は、自動ＲＮＡ合成の間のアミノ保護に対する他の選択肢であり、標準的なオリゴヌクレオチド脱保護の後の遊離アミノ基の遊離を伴う。

アミド結合を介する結合 本発明のヒドロキシメチル置換モノマーのヒドロキシメチル置換基は、アミド結合共役基の付加のハンドル（ｈａｎｄｌｅ）として作用する。これは、例えば、上記のようなアミン構造単位（ｕｎｉｔ）へのヒドロキシメチル置換基のヒドロキシ構造単位の変換、および、例えば、公知の方法を使用してアミド結合形成を介する共役基による、このアミノ基のさらなる誘導体化を伴う。これは、当業者に公知の方法を使用して、ＲＮＡ合成の前またはその後に行ってもよい［Ｂｒｙｌｄ，Ｈoｊｌａｎｄ
ａｎｄ Ｗｅｎｇｅｌ，Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．２００４，１０６４；Ｍｏｋｈｉｒ，Ｔｅｔｚｌａｆｆ，Ｈｅｒｚｂｅｒｇｅｒ，Ｍｏｓｂａｃｈｅｒ ａｎｄ Ｒｉｃｈａｒｔ，Ｊ．Ｃｏｍｂ．Ｃｈｅｍ．２００１，３，３７４］。

アミノ結合を介する結合 本発明のヒドロキシメチル置換モノマーのヒドロキシメチル置換基は、アミノ結合共役基の付加のハンドルとして作用する。これは、例えば、上記のようなアミン部分へのヒドロキシメチル置換基のヒドロキシ部分の変換、および、公知の反応である還元的アミノ化反応による、例えば、アルデヒド官能基を含有する共役基による、このアミノ基のさらなる誘導体化を伴う［Ｆｕｒｎｉｓｓ，Ｈａｎｎａｆｏｒｄ，Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｔａｔｃｈｅｌｌ，Ｖｏｇｅｌ’ｓ Ｔｅｘｔｂｏｏｋ ｏｆ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９８９，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ］。これは、ＲＮＡ合成の前またはその後に行ってもよい。

ピペラジノ基または直鎖ジアミノアルキル基を介する結合 ピペラジノ基または直鎖ジアミノアルキル基も、記載される反応を行うことによる誘導体化に使用される［Ｂｒｙｌｄ，Ｈooｊｌａｎｄ ａｎｄ Ｗｅｎｇｅｌ，Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．２００４，１０６４−５］。例えば、ＲＮＡオリゴヌクレオチド合成の前またはその後のいずれかに、アミド結合形成または還元的アミノ化反応により、例えば、ピペラジノ基の遠位窒素原子（図２、モノマーＪ参照）に他の共役基が付加することができるため、これらの基は、有用である［Ｂｒｙｌｄ，Ｈｏｊｌａｎｄ ａｎｄ Ｗｅｎｇｅｌ，Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．２００４，１０６４；Ｍｏｋｈｉｒ，Ｔｅｔｚｌａｆｆ，Ｈｅｒｚｂｅｒｇｅｒ，Ｍｏｓｂａｃｈｅｒ ａｎｄ Ｒｉｃｈａｒｄ，Ｊ．Ｃｏｍｂ．Ｃｈｅｍ．２００１，３，３７４］。この方法で、例えば、コレステリルまたは脂肪酸構造単位は、ピペラジノ−メチル置換基を介して本発明のＲＮＡ複合体と結合することができる。

これらの手順を使用して、例えば、コレステリル構造単位、アルキル構造単位、脂肪酸構造単位、ポリアミン誘導体、チオ誘導体、アミノ酸、ポリペプチド、単糖類誘導体、多糖類誘導体、またはフルオロフォア（そのすべてが、ヒドロキシメチル置換基のメチレン基を介して本発明のＲＮＡ複合体に結合することができる）を含有する本発明のＲＮＡ複合体を調製することができる。本明細書に掲載される基は、上記で例示される手順を使用して付加することができる基の例でしかない。結合モノマーの構造的な例に関しては、図２を参照されたい。

（実施例７）
官能化および結合ヒドロキシメチルモノマーを含有する本発明のＲＮＡ複合体による遺伝子サイレンシング
遺伝子サイレンシングは、官能化および結合ヒドロキシメチルモノマー（例えば、図２または実施例６参照）を含有する本発明のＲＮＡ複合体により効率的である。

効率的な遺伝子サイレンシングは、これらの官能化および結合ヒドロキシメチルモノマーが、ｓｉＲＮＡ複合体の２つの鎖の３’末端に位置するか、またはその付近に位置する場合に達成される。

さらに、効率的な遺伝子サイレンシングは、これらの官能化および結合ヒドロキシメチルモノマーが、ｓｉＲＮＡ複合体のセンス鎖の３’末端および５’末端に位置するか、またはその付近に位置する場合に達成される。

特に、効率的な遺伝子サイレンシングは、これらの官能化および結合ヒドロキシメチルモノマーが、ｓｉＲＮＡ複合体のセンス鎖の３’末端に位置するか、またはその付近に位置する場合に達成される。

さらに、効率的な遺伝子サイレンシングは、これらの官能化および結合ヒドロキシメチルモノマーが、一本鎖アンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチド内に位置する場合に達成される。

薬物動態特性の調節は、本発明のＲＮＡ複合体の基（図２のＲ）が、コレステリル誘導体である場合、効率的な遺伝子サイレンシングと共に達成される。これは、例えば、組織分布および細胞取り込みの改善、ならびに生物学的安定性の増加にもつながる。

薬物動態特性の調節は、本発明のＲＮＡ複合体の基（図２のＲ）が、チオ誘導体である場合、効率的な遺伝子サイレンシングと共に達成される。これは、人体における循環時間の改善、すなわち、腎臓を介するクリアランスの低減をもたらす。

薬物動態特性の調節は、本発明のＲＮＡ複合体の基（図２のＲ）が、アミノ基を含有する場合、効率的な遺伝子サイレンシングと共に達成される。これは、組織分布の改善をもたらす。

（実施例８）
ヒドロキシメチル置換ＲＮＡ複合体の生物学的安定性
安定性試験のための実験手順 ヒドロキシメチル置換ＲＮＡ複合体は、Ｄ−ＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）で希釈した１０％ウシ胎仔血清（Ｇｉｂｃｏ）において３７℃でインキュベートした。５μＬのサンプルを指示された時点で収集し、ドライアイス上で、直ちに１５μＬの１．３３×ＴＢＥ／１０％グリセロール充填緩衝液中に凍結させ、１５％ゲル上で非変性ＰＡＧＥを行った。ＲＮＡは、ＳＹＢＲゴールド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で可視化した。

そのような実験は、ヒドロキシメチル置換ＲＮＡ複合体の安定性が、天然型（すなわち、「未改変」）対照ＲＮＡ複合体に関して、生物学的媒体における安定性の改善を示すことを示す。したがって、ヒドロキシメチル置換ｓｉＲＮＡは、通常のｓｉＲＮＡより、１０％血清において有意に安定する。したがって、１時間を超える長いインキュベーション期間にわたって、ヒドロキシメチル置換ｓｉＲＮＡの大きさのごくわずかな減少がみられることを想定することができる。本発明者らは、ヒドロキシメチル置換モノマーを含有する本発明のＲＮＡ複合体は、細胞、動物、およびヒトにおいて非常に安定し、この特性は、それらの非常に効率的な遺伝子サイレンシング特性に貢献していると結論付ける。この顕著な生物学的安定性のため、ヒドロキシメチル置換モノマーを含有する本発明のＲＮＡ複合体は、それらの未改変対応物より長い期間、遺伝子サイレンシングを示す。

（実施例９）
遺伝子サイレンシングに対する構造Ｄのモノマーの強力な能力を証明する一連の遺伝子サイレンシング実験
前の実験に記載される手順を使用して、遺伝子サイレンシング研究を、より初期に記載の配列のｓｉＲＮＡ二本鎖、およびさらなる配列のｓｉＲＮＡ二本鎖を使用して行った（本実施例の研究に含まれる配列に関しては、図４〜９を参照）。これらの実験は、モノマーＸ（モノマーＸの記載に関しては、実施例１を参照）の１個または複数個の取り込みを含有する配列を含んだ。モノマーＸは、本明細書において、構造の例としてのみ使用され、例えば、モノマーＥ、モノマーＦ、モノマーＧ、モノマーＩ、およびモノマーＪ（図１および図２参照）のような誘導体に対して、同様の結果が予測される。上付き文字のＬが付いた、太字、下線付きのモノマーは、ＬＮＡモノマーである。本実施例においては、図４〜９は、Ｃ^Ｌ＝Ｃ^ＭｅＬ＝５−メチルシトシン（５−ｍｅｔｈｙｌｃｙｔｏｓｉｎ）−１−イルＬＮＡモノマーを含んでいる。

結果が図４に示される実験は、すべて、モノマーＸの２つの取り込みを有するセンス鎖（Ｗ１３０）を伴う。以下のことが示される。
−遺伝子サイレンシング官能基を示すヒドロキシメチル置換およびＬＮＡモノマーの両方を含有する鎖から成るｓｉＲＮＡ二本鎖を設計することは可能である。
−遺伝子サイレンシング官能基を示す、センス鎖におけるミスマッチモノマーＸを有する鎖から成るｓｉＲＮＡ二本鎖を設計することは可能である。
−完全ＲＮＡアンチセンス鎖（３’末端に対する２個のＬＮＡモノマーを除く）は、耐容性良好である。
−単一Ｘモノマーは、アンチセンス鎖において耐容性良好である（Ｗ１２３、Ｗ１２５、またはＷ１２６）。
−いくつかのＸモノマーは、耐容性であるが、アンチセンス鎖としてＷ１２３、Ｗ１２５、またはＷ１２６によるよりか、Ｗ１８６およびＷ１８７による方が、効率性がより低い遺伝子サイレンシングが見られる。
−Ｗ１８８では、有意な遺伝子サイレンシング活性が見られるが、このアンチセンス鎖は、６個のＬＮＡモノマーを含有し、アンチセンス鎖の中央に位置するモノマーＸは、モノマーＸが、対応するＲＮＡモノマーで置換される状況と比較して、遺伝子サイレンシングを改善することができることを示す。

結果が図５に示される実験は、すべて、鎖（Ｗ１３１）の３’末端に対して位置する１個のモノマーＸを有するセンス鎖を伴う。以下のことが示される。
−完全ＲＮＡアンチセンス鎖（３’末端に対する２個のＬＮＡモノマーを除く）は、耐容性良好である。
−単一Ｘモノマーは、アンチセンス鎖において耐容性良好であり得る（Ｗ１２３）。
−単一Ｘモノマーは、未改変対照（ｓｉＲＮＡ−ＥＧＦＰ）と比較して、同様に良好なまたはさらに改善された遺伝子サイレンシングにつながり得る（Ｗ１２５またはＷ１２６）。
−いくつかのＸモノマーは、むしろ耐容性良好である（アンチセンス鎖として、Ｗ１８６、Ｗ１８７、またはＷ２８１）。
−Ｗ１８８では、有意な遺伝子サイレンシング活性が見られるが、このアンチセンス鎖は、６個のＬＮＡモノマーを含有し、アンチセンス鎖の中央に位置するモノマーＸは、モノマーＸが、対応するＲＮＡモノマーで置換される状況と比較して、遺伝子サイレンシングを改善することができることを示す。
−ＬＮＡモノマーの共存がない状況において、アンチセンス鎖におけるモノマーＸのいくつかの置換により、有意な遺伝子サイレンシングが見られる（Ｗ２８１）。

結果が図６に示される実験は、すべて、センス鎖（Ｗ２８２）と共に分散する３個のＸモノマーを有するセンス鎖を伴う。以下のことが示される。
−完全ＲＮＡアンチセンス鎖（３’末端に対する２個のＬＮＡモノマーを除く）は、耐容性良好である。
−単一Ｘモノマーは、アンチセンス鎖において耐容性良好であり得、未改変対照（ｓｉＲＮＡ−ＥＧＦＰ）と比較して、同様に良好なまたはさらに改善された遺伝子サイレンシングが観察される３’末端に対して、最もそのように明白であり得る（Ｗ１２３、Ｗ１２５、Ｗ１２６）。
−いくつかのＸモノマーは、むしろ耐容性良好である。（アンチセンス鎖として、Ｗ１８６、Ｗ１８７、またはＷ２８１）
−Ｗ１８８では、有意な遺伝子サイレンシング活性が見られるが、このアンチセンス鎖は、６個のＬＮＡモノマーを含有し、アンチセンス鎖の中央に位置するモノマーＸは、モノマーＸが、対応するＲＮＡモノマーで置換される状況と比較して、遺伝子サイレンシングを改善することができ、センス鎖が、いくつかのＸモノマーを含有する場合も遺伝子サイレンシングを改善することができることを示す。
−ＬＮＡモノマーの共存がない状況においても、アンチセンス鎖におけるモノマーＸのいくつかの置換により、遺伝子サイレンシングが見られる（Ｗ２８１）。

結果が図７に示される実験は、すべて、モノマーＸがないセンス鎖を伴う（Ｗ１９４）。以下のことが示される。
−単一Ｘモノマーは、アンチセンス鎖において耐容性良好であり得る（Ｗ１２３）。
−単一Ｘモノマーは、未改変対照（ｓｉＲＮＡ−ＥＧＦＰ）と比較して、同様に良好なまたはさらに改善された遺伝子サイレンシングにつながり得る（Ｗ１２５またはＷ１２６）。
−いくつかのＸモノマーは、むしろ耐容性良好である（アンチセンス鎖として、Ｗ１８６、Ｗ１８７、またはＷ２８１）。
−Ｗ１８８では、有意な遺伝子サイレンシング活性が見られるが、このアンチセンス鎖は、６個のＬＮＡモノマーを含有し、アンチセンス鎖の中央に位置するモノマーＸは、モノマーＸが、対応するＲＮＡモノマーで置換される状況と比較して、遺伝子サイレンシングを改善することができることを示す。
−ＬＮＡモノマーの共存がない状況においても、アンチセンス鎖におけるモノマーＸのいくつかの置換により、有意な遺伝子サイレンシングが見られる（Ｗ２８１）。

結果が図８に示される実験は、すべて、モノマーＸはないが（Ｗ１８１）、二本鎖形成セグメント（３’末端における２個のＬＮＡモノマーを加えて）に取り込まれる４個のＬＮＡモノマーを有するセンス鎖を伴う。以下のことが示される。
−単一Ｘモノマーは、アンチセンス鎖において耐容性良好である（Ｗ１２３、Ｗ１２５、またはＷ１２６）。
−いくつかのＸモノマーは、むしろ耐容性良好である（アンチセンス鎖として、Ｗ１８６、Ｗ１８７、またはＷ２８１）。
−Ｗ１８８では、有意な遺伝子サイレンシング活性が見られるが、このアンチセンス鎖は、６個のＬＮＡモノマーを含有し、アンチセンス鎖の中央に位置するモノマーＸは、モノマーＸが、対応するＲＮＡモノマーで置換される状況と比較して、遺伝子サイレンシングを改善することができることを示す。
−ＬＮＡモノマーの共存がない状況においても、アンチセンス鎖におけるモノマーＸのいくつかの置換により、有意な遺伝子サイレンシングが見られる（Ｗ２８１）。

結果が図９に示される実験は、すべて、鎖の５’末端に対して位置する１個のモノマーＸを有するセンス鎖を伴う（Ｗ１２９）。以下のことが示される。
−完全ＲＮＡアンチセンス鎖（３’末端に対する２個のＬＮＡモノマーを除く）は、耐容性良好である。
−単一Ｘモノマーは、アンチセンス鎖において耐容性良好であり得、未改変対照（ｓｉＲＮＡ−ＥＧＦＰ）と比較して、改善された遺伝子サイレンシングにつながり得る（Ｗ１２３、Ｗ１２５、またはＷ１２６）。
−いくつかのＸモノマーは、むしろ耐容性良好である（アンチセンス鎖として、Ｗ１８６、Ｗ１８７、またはＷ２８１）。
−Ｗ１８８では、有意な遺伝子サイレンシング活性が見られるが、このアンチセンス鎖は、６個のＬＮＡモノマーを含有し、アンチセンス鎖の中央に位置するモノマーＸは、モノマーＸが、対応するＲＮＡモノマーで置換される状況と比較して、遺伝子サイレンシングを改善することができることを示す。
−ＬＮＡモノマーの共存がない状況において、アンチセンス鎖におけるモノマーＸのいくつかの置換により、有意な遺伝子サイレンシングが見られる（Ｗ２８１）。

以下に示されるデータは、ヒドロキシメチル置換モノマーが、ｓｉｓｉＲＮＡ法に適合することを示す。例として、Ｗ１２３アンチセンス鎖＋（Ｗ００４＋Ｗ００５）センス鎖の３分子の組み合わせの使用は、効率的な遺伝子サイレンシング（すなわち、ｓｉＲＮＡ効果が、０．２４である場合、「ｓｉＲＮＡ効果」は、低い値を有する）につながり、モノマーＸが、ｓｉｓｉＲＮＡ複合体のアンチセンス鎖において位置し得ることを示す（対照と比較して；読み出し１．０）。未改変ｓｉＲＮＡに関するデータも示す。アンチセンス鎖の設計は、Ｗ１８６アンチセンス鎖＋（Ｗ００４＋Ｗ００５）センス鎖の組み合わせが、遺伝子サイレンシング効果を誘導することができないため、重要である。これは、ヒドロキシメチル置換モノマー（例えば、モノマーＤ）の数は低く、最も好ましくは、１個のモノマーに制約されるべきであることを示す（アンチセンス鎖の突出における任意のヒドロキシメチル置換モノマーに加えて）。図９に示される研究に含まれる他のＲＮＡ複合体は、遺伝子サイレンシングに関して、同等に効率的である。

（実施例１０）
種（ｓｅｅｄ）改変は、オフターゲット効果を削減する
５０ｎＭ濃度のｓｉＲＮＡ二本鎖におけるセンス鎖として、アンチセンス鎖Ｗ１２４およびＷ２０７（５’−ＧＡＣ ＧＵＡ ＡＡＣ ＧＧＣ ＣＡＣ ＡＡＧ ＵＴ^ＬＣ^ＭｅＬ）（配列番号）を使用して、本発明者らは、モノマーＸが、アンチセンス鎖のいわゆる種領域に存在する場合、より低いオフターゲット効果をもたらす選択性増強効果を有することを示した。したがって、実験の設定により、ｓｉＲＮＡ効果（鎖開裂を伴う遺伝子サイレンシング）とｍｉＲＮＡ効果（翻訳抑制；種領域の一致のみから成る４つの標的領域を有する、プラスミドに基づくオフターゲットセンサ）との識別を可能にした。上記の組み合わせを使用すると、ｓｉＲＮＡ効果は、未改変ｓｉＲＮＡ対照と同様であったが、一方、ｍｉＲＮＡ効果は、有意に低下した。同様の効果は、ｓｉＤｈａｒｍａ（アンチセンス鎖の５’末端からの位置番号２に取り込まれる２’−Ｏ−Ｍｅ−ＲＮＡモノマーを有する市販品）に対して得られた。以上のように、これは、アンチセンス鎖のいわゆる種領域に存在するヒドロキシメチル置換モノマー（例えば、モノマーＤ）が、好ましい効果（すなわち、オフターゲット効果の低下または排除）をもたらすことを示す。そのため、ＲＮＡ複合体のオフターゲット効果を低下または排除するための方法は、ＲＮＡ複合体に１個または複数個のヒドロキシメチル置換モノマー（例えば、モノマーＤ）を取り込む工程、または１個または複数個のヒドロキシメチル置換モノマー（例えば、モノマーＤ）を含有するＲＮＡ複合体を調製する工程を含む。遺伝子サイレンシング（すなわち、「ｓｉＲＮＡ効果」）およびオフターゲット効果（すなわち、「ｍｉＲＮＡ効果）の結果に関しては、以下の表を参照されたい。これらのデータは、１個または複数個のヒドロキシメチル置換モノマー（例えば、モノマーＤ）を含有するＲＮＡ複合体が、オフターゲット効果を最小限にしながら、標的の発現を削減することを示す。

さらなる種の分野の研究に対して、本発明者らは、ＲＮＡモノマー（ｒＡ、ｒＣ、ｒＧ、およびｒＵ）および、ヒドロキシメチル改変モノマー（モノマーＤ；アデニン（ａｄｅｎｉｎ）−９−イル、シトシン（ｃｙｔｏｓｉｎ）−１−イル、グアニン（ｇｕａｎｉｎ）−９−イル、およびウラシル−１−イル誘導体に対して、それぞれ、標識されたｓＡ、ｓＣ、ｓＧ、およびｓＵ）から成る以下の配列を調製した。モノマーＸは、核酸塩基を有するモノマーＤを表す。

以下に示される最初の９オリゴヌクレオチドの番号付けは、以下の通りである（上から、１番から９番）。

遺伝子サイレンシング実験において、オリゴマーＷ３１３、Ｗ３１４、Ｗ３１５、Ｗ３１６、Ｗ３１７、Ｗ１２３、Ｗ３１８、Ｗ３１９、およびＷ３２０をアンチセンス鎖として、そしてオリゴマーＪＷ１１０４をセンス鎖として有する上記実施例に記載されるのと同様の実験技法を使用することにより、ヒドロキシメチル置換モノマーＤを含有するｓｉＲＮＡ構築物の有効性は、未改変ｓｉＲＮＡ、またはアンチセンス鎖の５’末端からの位置番号２に２’−Ｏ−Ｍｅ−ＲＮＡモノマーを有する市販の化学的改変ｓｉＲＮＡ生成物（Ｄｈａｒｍａ）と比較して改善することができる。さらに、２’，３’−セコ−ＲＮＡモノマーＤを含有するｓｉＲＮＡ複合体は、オフターゲット効果（ｍｉＲＮＡ効果）が参照未改変ｓｉＲＮＡ（ＳｉＲＮＡ）と比較して低減されるように、このモノマーをｓｉＲＮＡ構築物に取り込むことができることを示す。

１ｎＭ、１０ｎＭ、および１００ｎＭのＲＮＡ複合体に対する結果を、以下に表の形式で示す（対照；１．０に調節したデータ）。ｓｉＲＮＡ効果およびｍｉＲＮＡ（ミクロＲＮＡ）効果による遺伝子サイレンシングを、指示される通り、異なるｓｉＲＮＡ二本鎖の様々な濃度で研究した。同様の結果が、ＲＮＡおよび非環式２’，３’−セコ−ＲＮＡモノマーを独占的に含有する、上記の９つの鎖のような鎖から予期される。アンチセンス鎖改変としてのヒドロキシメチル改変モノマーＤは、オフターゲット効果を低下させ、遺伝子サイレンシングの有効性を増加させる。

設計は重要であり、ｓｉＲＮＡ効果に対する上記の一連のオリゴマーのうち最も強力なものは、アンチセンス鎖の５’末端からの位置番号７にヒドロキシメチル置換モノマーＤを有するＷ３１８である。Ｗ３１８は、また未改変ｓｉＲＮＡまたは市販品（Ｄｈａｒｍａ）と比較して、好ましい低いオフターゲット（ｍｉＲＮＡ）効果をもたらす。概して、取り込まれたヒドロキシメチル置換モノマーＤを有する上記に掲載されるアンチセンス鎖の使用は、好ましい低いオフターゲット（ｍｉＲＮＡ）効果をもたらす。重要かつ驚くことに、高い有効性および低いオフターゲット効果が、ヒドロキシメチル置換モノマーＤを含有するアンチセンス鎖を有する構築物を使用して同時に実現することができる（上表参照）。特に、Ｗ３１８の設計は、好ましくは、ヒドロキシメチル置換モノマーＤが、アンチセンス鎖のいわゆる種領域の境界付近、最も好ましくは、例えば、アンチセンス鎖の５’末端からの位置番号７のような、アンチセンス鎖の５’末端からの位置番号５〜１０付近に、好ましくは、取り込むことができることを示す。１個または複数個のヒドロキシメチル置換モノマーＤの付加的な取り込みを２つの鎖において実現することができる。

さらに、効果は、モノマーＸが、５’末端から数えて、位置９〜１６付近のアンチセンス鎖に位置する場合、逆転し得ることに注目してよい。例えば、アンチセンス鎖におけるモノマーＸが、アンチセンス鎖の５’末端からの位置番号９に存在する場合、アンチセンス鎖および二本鎖は、ミクロＲＮＡとして作用する（ｓｉＲＮＡ効果は最小となり、ミクロＲＮＡ効果は、より高くなる）。この効果は、潜在的に非環式ヒドロキシメチル置換モノマーＸ（＝モノマーＤ）の存在によって生じる親和性の低下のため、完全長結合に対する低下傾向によって引き起こされる。

（実施例１１）
ホスホラミダイトモノマー基本要素の合成
以下のスキームは、モノマーアミダイト（＝ホスホラミダイト）基本要素の合成を例示するために行われた手順を示す。

化合物１００は、リボヌクレオシド出発物質である。化合物１０２は、酸化開裂反応、その後の還元によって調製されるジオールである。化合物１０３は、化合物１０２のＯ２’−ヒドロキシ基の選択的ベンゾイル化によって調製されるＯ２’−ベンゾイル化誘導体である。化合物１０４は、化合物１０３のＯ３’−ヒドロキシ基のＯ３’−リン酸化によって調製されるアミダイト（＝ホスホラミダイト）である。以下は、詳細な手順、および手順の例として含まれる特性データである。

５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’，３’−セコウリジン（１０２−Ｕ）

ヌクレオシド１００−Ｕ（５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）ウリジン；１０．３５ｇ，１８．９４ｍｍｏｌ）を、ジオキサン（２５０ｍＬ）および水（５０ｍＬ）に溶解した。ＮａＩＯ_４（４．４７ｇ，２０．９０ｍｍｏｌ）を水（５０ｍＬ）に溶解し、溶解したヌクレオシドに添加した。混合物を１時間攪拌し、その間に白色沈殿物が形成された。さらにジオキサン（２００ｍＬ）を添加し、懸濁液を１５分間攪拌し、それから、懸濁液をガラスフィルタでろ過し、ろ過ケーキをジオキサン（１００ｍＬ）で洗浄した。ろ液を合わせ、ＮａＢＨ_４（７９７ｍｇ，２１．１ｍｍｏｌ）を添加し、反応混合物を３０分間攪拌した。反応混合物を緩衝液（ピリジン：ＡｃＯＨ １：１，ｖ／ｖ，約１０ｍＬ）で中和した。混合物を約１５０ｍＬまで蒸発させた後、ＣＨ_２Ｃｌ_２（１００ｍＬ）を添加し、混合物を飽和ＮａＨＣＯ_３水溶液（２×１００ｍＬ）で洗浄した。有機相を分離し、Ｎａ_２ＳＯ_４で乾燥させ、乾燥するまで蒸発させ、得られた残渣をカラムクロマトグラフィー（石油エーテル中の４０％アセトン）で精製し、溶媒の蒸発後、白色発泡体として所望のヌクレオシド１０２−Ｕを得た。
収率：８．５３ｇ（８２％）
Ｒ_ｆ：０．２（ＣＨ_２Ｃｌ_２中の１０％ＭｅＯＨ）
^１Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ_６）：δ１１．３４（ｂｒ ｓ，ＮＨ），７．６２（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．０５Ｈｚ，Ｈ６），７．４５−７．１５（ｍ，９Ｈ，ａｒ），６．８５（ｄ，４Ｈ，ａｒ），５．８０（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝６．２Ｈｚ，Ｈ１’），５．５２（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．０５Ｈｚ，Ｈ５），５．１２（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝５．８６Ｈｚ，２’ＯＨ），４．７４（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝５．４９Ｈｚ，３’ＯＨ），３．７２（ｓ，６Ｈ，ＯＣＨ_３），３．５５−３．４７（ｍ，３Ｈ，Ｈ２’／Ｈ４’），３．４０（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝５．１３Ｈｚ，Ｈ３’），３．０１−２．９０（ｍ，２Ｈ，Ｈ５’）
^１３Ｃ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ_６）：δ１６３．２，１５７．９，１５１．４，１４４．８，１４１．１（Ｃ５），１３５．４，１２９．５（ａｒ），１２７．７，１２７．５（ａｒ），１２６．５（ａｒ），１１３．０，１０１．６（Ｃ６），８５．３，８３．６（Ｃ１’），７９．３（Ｃ２’／Ｃ４’），６３．５（Ｃ５’），６１．１，６０．５（Ｃ２’／Ｃ４’），５４．９（−ＯＣＨ_３）
ＥＳＩ−ＨｉＲｅｓ（ｍＮａ^＋）：ｍ／ｚ：５７１．１７４３ ｃａｌｃ．：５７１．２０５１。

２’−Ｏ−ベンゾイル−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’，３’−セコウリジン（１０３−Ｕ）

ヌクレオシド１０２−Ｕ（３．０１ｇ，５．５０ｍｍｏｌ）を無水トルエン（１５ｍＬ）で同時蒸発させた。得られた残渣を、無水ピリジン（４．４ｍＬ）と共に、無水ＤＣＭ（１５０ｍＬ）に溶解し、混合物を−７０℃まで冷却した。塩化ベンゾイル（７００μＬ，６ｍｍｏｌ）をゆっくりと反応混合物に添加し、−７０℃で１時間攪拌した。ＥｔＯＨ（５ｍＬ）を溶液に添加し、その後、室温になるまで放置した。反応混合物を飽和ＮａＨＣＯ_３水溶液（３×１００ｍＬ）およびブライン（１００ｍＬ）で洗浄した。合わせた水相をＣＨ_２Ｃｌ_２（１００ｍＬ）で逆抽出した。有機相を合わせ、蒸発させた。得られた残渣をカラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ中の３．５％ＭｅＯＨ）で精製し、溶媒の蒸発後、白色発泡体として生成物１０３−Ｕを得た。
収率：３．４４ｇ（７９％）
Ｒ_ｆ：０．３（ＣＨ_２Ｃｌ_２中の５％ＭｅＯＨ）
^１Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ_６）：δ１１．４３（ｓ，１Ｈ，ＮＨ，ｅｘ），７．９３−７．８７（ｍ，２Ｈ，ａｒ），７．８０（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．０５Ｈｚ，Ｈ６），７．７０−７．６３（ｍ，１Ｈ），７．５６−７．４８（ｍ，２Ｈ，ａｒ），７．３５−７．１７（ｍ，１０Ｈ，ａｒ），６．８９−６．８１（ｍ，４Ｈ，ａｒ），６．２０（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝５．４９Ｈｚ，Ｈ１’），５．５６（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝８．０５Ｈｚ，Ｈ５），４．８３（ｔ，１Ｈ，０Ｈ−３’，ｅｘ），４．５８（ｄｑ，２Ｈ，Ｈ２’），３．７３（ｓ，７Ｈ−ＯＣＨ_３），３．７０−３．６２（ｍ，１Ｈ，Ｈ４’），３．４５（ｔ，２Ｈ，Ｈ３’），３．１１−２．９６（ｍ，２Ｈ，Ｈ５’）
^１３Ｃ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ_６）：δ１６４．９２，１６２．９８，１５７．８９，１５１．００，１４４．６７，１４０．５１，１３５．４５，１３５．３５，１３３．５４，１２９．４９，１２９．４５，１２９．１３，１２９．０２，１２８．９２，１２８．７４，１２８．６１，１２７．６５，１２７．５１，１２６．４９，１１３．１６，１１３．０１，１０２．０６，８５．３５，８０．８４，７９．５７，７１．８，７１．８，６３．４，６０．５，５４．９，５４．８
ＥＳＩ−ＨｉＲｅｓ（ｍＮａ^＋）：ｍ／ｚ：６７５．１９４９ ｃａｌｃ．：６７５．２３１３
２’−Ｏ−ベンゾイル−３’−Ｏ−（２−シアノエトキシ（ジイソプロピルアミノ）ホスフィノ）−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’，３’−セコウリジン（１０４−Ｕ）

ヌクレオシド１０３−Ｕ（６７９ｍｇ，１．０４ｍｍｏｌ）をＤＣＥ（３×６ｍＬ）で同時蒸発させ、真空で１２時間乾燥させた。残渣をＭｅＣＮ中の２０％ＤＩＰＥＡ（６．５ｍＬ）に溶解し、混合物を攪拌した。２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルクロロホスホラミダイト［Ｐ（Ｃｌ）（ＯＣＨ_２ＣＨ_２ＣＮ）（Ｎ（ｉＰｒ）_２）：０．６６ｍＬ，３．０２ｍｍｏｌ］を反応混合物に添加し、４０分間攪拌し続けた。反応混合物をＤＣＥ（１０ｍＬ）に注入し、飽和ＮａＨＣＯ_３水溶液（１０ｍＬ）で洗浄し、水相をＤＣＥ（１０ｍＬ）で逆抽出した。有機相をプールし、蒸発させ、白色発泡体を得た。粗生成物をカラムクロマトグラフィー（トルエン中の０〜２０％ＥｔＯＡｃ）で精製し、溶媒の蒸発後、白色固形物としてヌクレオシド１０４−Ｕを得た。
収率：６００ｍｇ（６８％）
Ｒ_ｆ：０．６（トルエン中の５０％ＥｔＯＡｃ）
^３１Ｐ ＮＭＲ（ＭｅＣＮ）：δ１４７．８
ＥＳＩ−ＨｉＲｅｓ（ｍＮａ^＋）：ｍ／ｚ：８７５．２９４６ ｃａｌｃ．：８７５．３３９１
６−Ｎ−ベンゾイル−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’，３’−セコアデノシン（１０２−Ａ）

６−Ｎ−ベンゾイル−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）アデノシン（１００−Ａ；７．０２ｇ，１０．４２ｍｍｏｌ）をジオキサン（１５０ｍＬ）および水（２５ｍＬ）に溶解した。ＮａＩＯ_４（２．７３ｇ，１１．７７ｍｍｏｌ）を水（２５ｍＬ）に溶解し、溶解したヌクレオシドに添加した。混合物を１時間攪拌し、その間、白色沈殿物が形成された。さらにジオキサン（１００ｍＬ）を添加し、懸濁液を１５分間攪拌し、それから、懸濁液をガラスフィルタでろ過し、ろ過ケーキをジオキサン（５０ｍＬ）で洗浄した。ろ液を合わせ、ＮａＢＨ_４（４３５ｍｇ，１１．５ｍｍｏｌ）を添加し、反応混合物を３０分間攪拌した。その後、アセトンを添加し、残留ＮａＢＨ_４をクエンチングした。反応混合物を緩衝液（ピリジン：ＡｃＯＨ １：１，ｖ／ｖ，約１０ｍＬ）で中和した。反応混合物を約１００ｍＬまで減らし、ＣＨ_２Ｃｌ_２（１００ｍＬ）を添加し、混合物を飽和ＮａＨＣＯ_３水溶液（２×１００ｍＬ）で洗浄した。有機相を分離し、Ｎａ_２ＳＯ_４で乾燥させ、乾燥するまで蒸発させ、得られた残渣をＤＣＭおよびｉ−ＰｒＯＨを使用してカラムクロマトグラフィーで精製し、溶媒の蒸発後、白色固形物として生成物を得た。
収率：６．０７ｇ（８６％）
Ｒ_ｆ：０．２２（ＤＣＭ中の５％ｉ−ＰｒＯＨ）
^１Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ_６）：δ１１．２３（ｂｒ ｓ，１Ｈ，Ｎ６Ｈ），８．７６（ｓ，１Ｈ，アデニン（ａｄｅｎｉｎ）Ｃ８／Ｃ２），８．６８（ｓ，１Ｈ，アデニン（ａｄｅｎｉｎ）Ｃ８／Ｃ２），８．０７（ｄ，２Ｈ，Ｊ＝６．９６Ｈｚ，Ａｒ），７．６９−７．５０（ｍ，３Ｈ，Ａｒ），７．２５−６．９１（ｍ，９Ｈ，Ａｒ），６．７９（ｄｄ，４Ｈ，Ａｒ），６．０６（ｔ，１Ｈ，Ｈ１’），５．２９（ｔ，１Ｈ，２’ＯＨ），４．８４（ｔ，１Ｈ，３’ＯＨ），４．１９−４．０２（ｍ，２Ｈ，Ｈ２’），３．９０−３．８０（ｍ，１Ｈ，Ｈ４’），３．６９（ｓ，６Ｈ，２×−ＯＣＨ_３），３．４９（ｔ，２Ｈ，Ｈ３’），２．９３−２．７４（ｍ，２Ｈ，Ｈ５’）
^１３Ｃ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ_６）：δδ１６５．６，１５７．９，１５２．８，１５１．６（アデニン（ａｄｅｎｉｎ）ＣＨ），１５０．２，１４４．６，１４３．１（アデニン（ａｄｅｎｉｎ）ＣＨ），１３５．７，１３５．４，１３２．４（Ａｒ），１２９．４（Ａｒ），１２８．５（Ａｒ），１２８．４（Ａｒ），１２７．７（Ａｒ），１２７．５（Ａｒ），１２６．４（Ａｒ），１２５．２，１１３．０（Ａｒ），８５．０，８４．５（１’Ｃ），７９．６（４’Ｃ），６３．６（５’Ｃ），６１．４（２’Ｃ），６０．９（３’Ｃ），５４．９（−ＯＣＨ_３）
６−Ｎ−ベンゾイル−２’−Ｏ−ベンゾイル−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’，３’−セコアデノシン（１０３−Ａ）

ヌクレオシド１０２−Ａ（２．０１ｇ，２．９８ｍｍｏｌ）を無水ＭｅＣＮ（２×３０ｍＬ）で同時蒸着させ、一晩乾燥させた。得られた残渣を、無水ＤＢＵ（９００ｍｇ，５．９６ｍｍｏｌ）と共に、無水ＤＣＭ（１５０ｍＬ）に溶解し、混合物を−７０℃まで冷却した。０．５Ｍ塩化ベンゾイル溶液（６．５６ｍＬ，３．２８ｍｍｏｌ）をゆっくりと反応混合物に添加した。反応混合物を−７０℃で１時間攪拌し、その後、室温になるまで放置し、それから、ＥｔＯＨ（５ｍＬを添加した）。反応混合物を飽和ＮａＨＣＯ_３水溶液（３×１５０ｍＬ）およびブライン（１５０ｍＬ）で洗浄した。合わせた水相をＣＨ_２Ｃｌ_２（１００ｍＬ）で逆抽出した。有機相を合わせ、蒸発させた。得られた残渣をカラムクロマトグラフィー（石油エーテル中の０〜１００％ＥｔＯＡｃ）で精製し、溶媒の蒸発後、白色発泡体として生成物ヌクレオシド１０３−Ａを得た。
収率：１．６９ｇ（７３％）
Ｒ_ｆ：０．４９（ＥｔＯＡｃ）
^１Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ_６）：δ１１．２８（ｓ，１Ｈ，ＮＨ），８．８２（ｓ，１Ｈ，アデニン ＣＨ），８．７６（ｓ，１Ｈ，アデニン ＣＨ），８．０６（ｄ，２Ｈ，Ａｒ），７．７９（ｄ，２Ｈ，Ａｒ），７．５５−７．４０（ｍ，６Ｈ，Ａｒ），７．２５−６．８９（ｍ，１０，Ａｒ），６．７７（ｄｄ，４Ｈ，Ａｒ），６．５１（ｔ，１Ｈ，Ｈ１’），４．９９（ｍ，２Ｈ，Ｈ２’），４．９１（ｔ，１Ｈ，３’ＯＨ），３．８９（ａｐ．ｓ，１Ｈ，Ｈ４’），３．７２（ｓ，６Ｈ，２×−ＯＣＨ_３），３．５４（ｍ，２Ｈ，Ｈ３’），２．８１（ｍ，２Ｈ，Ｈ５’）
^１３Ｃ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ_６）：δ１６５．０，１５７．９，１５２．４，１５０．５，１４４．６，１４２．９（アデニンＣＨ），１３５．６，１３３．６（Ａｒ），１３２．４（Ａｒ），１２９．０（Ａｒ），１２８．８（Ａｒ），１２８．４（Ａｒ），１２７．５（Ａｒ），１２５．２（Ａｒ），１１３．０（Ａｒ），８５．１，８１．５（Ｃ１’），７９．９（Ｃ４’），６３．８（Ｃ２’），６３．５，５４．９（−ＯＣＨ_３）
ＥＳＩ−ＨｉＲｅｓ（ｍＮａ^＋）：ｍ／ｚ：８０２．２８４８ ｃａｌｃ．：８０２．２８４７
６−Ｎ−ベンゾイル−２’−Ｏ−ベンゾイル−３’−Ｏ−（２−シアノエトキシ（ジイソプロピルアミノ）ホスフィノ）−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’，３’−セコアデノシン（１０４−Ａ）

ヌクレオシド１０３−Ａ（１．６９ｇ，２．１７ｍｍｏｌ）を無水ＭｅＣＮ（２×２０ｍＬ）で同時蒸発させ、真空で１２時間乾燥させた。残渣をＭｅＣＮ中（４０ｍＬ）の２０％ＤＩＰＥＡに溶解し、得られた混合物を攪拌した。２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルクロロホスホラミダイト［Ｐ（Ｃｌ）（ＯＣＨ_２ＣＨ_２ＣＮ）（Ｎ（ｉＰｒ）_２）；１．０ｍＬ］を反応混合物に添加し、４０分間攪拌した。さらに２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルクロロホスホラミダイト（０．２ｍＬ）を添加し、得られた混合物を３時間攪拌した。ＥｔＯＨ（５ｍＬ）を添加し、混合物を飽和ＮａＨＣＯ_３水溶液（３×５０ｍＬ）で洗浄し、水相をＤＣＭ（５０ｍＬ）で逆抽出した。有機相をプールし、蒸発させた。粗生成物をカラムクロマトグラフィー（石油エーテル中の０〜１００％ＥｔＯＡｃ）で精製し、溶媒の蒸発後、白色発泡体を得た。
収率：１．５２ｇ（７１％）
Ｒ_ｆ：０．７５（ＤＣＭ中の５％ＭｅＯＨ）
^３１Ｐ ＮＭＲ（ＭｅＣＮ）：δ１４８．９
ＥＳＩ−ＨｉＲｅｓ（ｍＮａ^＋）：ｍ／ｚ：１００２．３８８５ ｃａｌｃ．：１００２．３９２６
４−Ｎ−アセチル−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’，３’−セコシチジン（１０２−Ｃ）

４−Ｎ−アセチルシチジン（１１．７５ｇ，４１．１８ｍｍｏｌ）を無水ピリジン（５０ｍＬ）で同時蒸発させた。得られた残渣を無水ピリジン（１６０ｍＬ）に溶解した。ＤＭＴ−Ｃｌ（４，４’−ジメトキシトリチルクロリド；１６．７６ｇ，４９．４２ｍｍｏｌ）を固形物として添加し、得られた混合物を室温で２時間攪拌した。反応混合物を飽和ＮａＨＣＯ_３水溶液（３×５０ｍＬ）で洗浄し、有機相を蒸発させ、白色発泡体を得、乾燥させた。この残渣をジオキサン（５００ｍＬ）および水（１００ｍＬ）に溶解した。ＮａＩＯ_４（１０．６２ｇ，４９．５ｍｍｏｌ）を水（１００ｍＬ）に溶解し、溶解したヌクレオシドに添加した。混合物を１時間攪拌し、その間に、白色沈殿物が得られた。さらに４００ｍＬのジオキサンを添加し、１５分間攪拌し続けた。沈殿物をろ過し、ジオキサン（２００ｍＬ）で洗浄した。ろ液を合わせ、ＮａＢＨ_４（１７２０ｍｇ，４５．５ｍｍｏｌ）を添加し、３０分間攪拌し続けた。反応混合物を中和するために、緩衝液（１０ｍＬ，１：１−ＡｃＯＨ：ピリジン）を、ｐＨ７になるまで添加した。反応混合物を３００ｍＬまで蒸発させ、ＥｔＯＡｃ（１５０ｍＬ）で抽出した。有機相を飽和ＮａＨＣＯ_３水溶液（３×２００ｍＬ）で洗浄し、蒸発させた。残渣を、ＥｔＯＡ中のＭｅＯＨの勾配によりカラムクロマトグラフィーで精製し、溶媒の蒸発後、白色固形物として生成物を得た。
収率：１７．２４ｇ（７１％）
Ｒ_ｆ：０．１９（ＣＨＣｌ_３中の５％ＭｅＯＨ）
^１Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ_６）：δ１０．９４（ｓ，１Ｈ，ＮＨ），８．０８（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．３２Ｈｚ，シチジンＣＨ），７．３１−７．１２（ｍ，１２Ｈ，Ａｒ／シチジンＣＨ），６．８５（ｄ，４Ｈ，Ａｒ），５．９６（ｔ，１Ｈ，Ｈ１’），５．１３（ｔ，１Ｈ，２’ＯＨ），４．７４（ｔ，１Ｈ，３’ＯＨ），３．７３（ｓ，６Ｈ，２×−ＯＣＨ_３），３．６３（ｍ，３Ｈ，Ｈ２’／Ｈ４’），３．４３（ｍ，２，Ｈ３’），３．００（ｍ，２Ｈ，Ｈ５’），２．１３（ｓ，３Ｈ−ＣＨ_３）
^１３Ｃ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ_６）：δ１７０．９，１６２．３，１５８．０，１５５．４，１４６．１（シチジンＣ５／Ｃ６），１４４．６，１３５．６，１２９．６（ａｒ）
，１２７．７（ａｒ），１２６．６（ａｒ），１１３．１（ａｒ），９５．４（シチジンＣ５／Ｃ６），８５．５，８４．７（Ｃ１’），７９．４（Ｃ２’／Ｃ４’），６３．８（Ｃ５’），６１．７（Ｃ２’／Ｃ４’），６０．５（Ｃ３’），５５．０（−ＯＣＨ_３），２４．３（−ＣＨ_３）
ＥＳＩ−ＨｉＲｅｓ（ｍＮａ^＋）：ｍ／ｚ：６１２．２２９８ ｃａｌｃ．：６１２．２３１６
４−Ｎ−アセチル−２’−Ｏ−ベンゾイル−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’，３’−セコシチジン（１０３−Ｃ）

ヌクレオシド１０２−Ｃ（３．０３ｇ，５．１４ｍｍｏｌ）を無水トルエン（２×３０ｍＬ）で同時蒸発させ、真空で１２時間乾燥させた。得られた残渣を、無水ＤＢＵ（１．５ｍＬ，１０．３ｍｍｏｌ）と共に、無水ＤＣＭ（１５０ｍＬ）に溶解し、得られた混合物を−７０℃まで冷却した。塩化ベンゾイル（６．５６ｍＬ，５．６５ｍｍｏｌ）をゆっくりと反応混合物に添加した。反応混合物を−７０℃で1時間攪拌し、その後、室温になるまで放置し、それから、ＥｔＯＨ（４ｍＬ）を添加した。反応混合物を飽和ＮａＨＣＯ_３水溶液（２×１５０ｍＬ）で洗浄した。有機相を合わせ、蒸発させた。得られた残渣をカラムクロマトグラフィー（ＣＨＣｌ_３中の０〜５％ＭｅＯＨ）で精製し、溶媒の蒸発後、白色発泡体として生成物ヌクレオシド１０３−Ｃを得た。
収率：２．０８ｇ（６４％）
Ｒ_ｆ：０．２４（ＣＨＣｌ_３中の５％ＭｅＯＨ）
^１Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ_６）：δ１０．９７（ｓ，１Ｈ，ＮＨ），８．２５（ｄ，１Ｈ，シチジンＣＨ），７．９１（ｄ，２Ｈ，Ａｒ），７．６５（ａｐ．ｔ，１Ｈ，Ａｒ）７．３２−７．１２（ｍ，１２Ｈ，Ａｒ／シチジンＣＨ），６．８３（ｄ，４Ｈ，Ａｒ），６．３４（ｔ，１Ｈ，Ｈ１’），４．８４（ｔ，１Ｈ，３’ＯＨ），４．５８（ｄｑ，２Ｈ，Ｈ２’），３．７４（ｓ，６Ｈ，２×−ＯＣＨ_３），３．７０−３．６４（ｍ，１Ｈ，Ｈ４’），３．４８（ｍ，２Ｈ，Ｈ３’），３．０７（ｍ，２Ｈ，Ｈ５’），２．１４（ｓ，３Ｈ−ＣＨ_３）
^１３Ｃ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ_６）：δ１７１．０，１６５．０，１６２．５，１５７．１，１４５．５（シチジンＣ５／Ｃ６），１４４．６，１３５．４８，１３３．６，１２９．６（Ａｒ），１２８．８（Ａｒ），１２７．７（Ａｒ），１２７．６（Ａｒ），１２６．６（Ａｒ），１１３．１（Ａｒ），９５．８（シチジンＣ５／Ｃ６），８５．６，８２．０（Ｃ１’），７９．６（Ｃ４’），７９．２ ６３．９（Ｃ２’），６３．７，６０．５（Ｃ３’），５４．９（−ＯＣＨ_３），２４．３（−ＣＨ_３）
ＥＳＩ−ＨｉＲｅｓ（ｍＮａ^＋）：ｍ／ｚ：７１６．２５８９ ｃａｌｃ．：７１６．２７５９
４−Ｎ−アセチル−２’−Ｏ−ベンゾイル−３’−Ｏ−（２−シアノエトキシ（ジイソプロピルアミノ）ホスフィノ）−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’，３’−セコシチジン（１０４−Ｃ）

ヌクレオシド１０３−Ｃ（１．４９ｇ，２．１５ｍｍｏｌ）を無水ＭｅＣＮ（２×２０ｍＬ）で同時蒸発させた。残渣をＭｅＣＮ中（２０ｍＬ）の２０％ＤＩＰＥＡに溶解し、混合物を攪拌した。２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルクロロホスホラミダイト［Ｐ（Ｃｌ）（ＯＣＨ_２ＣＨ_２ＣＮ）（Ｎ（ｉＰｒ）_２）；０．８ｍＬ］を混合物に添加し、４０分間攪拌し続けた。さらに２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルクロロホスホラミダイト（０．４ｍＬ）を添加し、３時間攪拌し続けた。ＥｔＯＨ（５ｍＬ）を添加し、得られた混合物を飽和ＮａＨＣＯ_３水溶液（３×５０ｍＬ）で洗浄し、水相をＤＣＭ（５０ｍＬ）で逆抽出した。有機相をプールし、蒸発させた。残渣をカラムクロマトグラフィー（石油エーテル中の０〜１００％ＥｔＯＡｃ）で精製し、溶媒の蒸発後、白色固形物としてヌクレオシド１０４−Ｃを得た。
収率：９４０ｍｇ（４４％）
Ｒ_ｆ：０．４２（ＤＣＭ中の５％ＭｅＯＨ）
^３１Ｐ ＮＭＲ（ＭｅＣＮ）：δ１４８．８
ＥＳＩ−ＨｉＲｅｓ（ｍＮａ^＋）：ｍ／ｚ：９１６．３６２２ ｃａｌｃ．：９１６．３６５７
５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２−Ｎ−イソブチリル−２’，３’−セコグアノシン（１０２−Ｇ）

２−Ｎ−イソブチリルグアノシン（１１．６８ｇ，１７．８ｍｍｏｌ）を無水ピリジン（５０ｍＬ）で同時蒸発させた。得られた残渣を無水ピリジン（１００ｍＬ）に溶解した。ＤＭＴ−Ｃｌ（４，４’−ジメトキシトリチルクロリド；７．２６ｇ，２１．４６ｍｍｏｌ）を固形物として添加し、反応混合物を室温で１時間攪拌した。ＤＭＡＰ（５０ｍｇ，０．４０ｍｍｏｌ）を添加し、得られた混合物をさらに１２時間攪拌した。その後、反応混合物を飽和ＮａＨＣＯ_３水溶液（３×５０ｍＬ）で洗浄し、有機相を蒸発させ、白色発泡体を得た。この残渣をジオキサン（２５０ｍＬ）および水（５０ｍＬ）に溶解した。ＮａＩＯ_４（４．５７ｇ，２１．３ｍｍｏｌ）を水（５０ｍＬ）に溶解し、溶解したヌクレオシドに添加した。混合物を１時間攪拌し、その間に、白色沈殿物が形成された。さらに２００ｍＬのジオキサンを添加し、１５分間攪拌し続けた。沈殿物をろ過し、ジオキサン（１００ｍＬ）で洗浄した。ろ液を収集し、ＮａＢＨ_４（７４８ｍｇ，１９．７７ｍｍｏｌ）を添加し、得られた混合物を室温で３０分攪拌した。中和するために、緩衝液（１０ｍＬ，１：１−ＡｃＯＨ：ピリジン）を、ｐＨ７になるまで添加した。得られた混合物の量を１５０ｍＬまで減らし、ＥｔＯＡｃ（１５０ｍＬ）を使用して抽出を行った。有機相を飽和ＮａＨＣＯ_３水溶液（３×１００ｍＬ）で洗浄し、蒸発させ、残渣を、ＤＣＭ中の０−１０％（１：１ ＭｅＯＨ：ｉ−ＰｒＯＨ）の勾配を使用してカラムクロマトグラフィーで精製し、溶媒の蒸発後、白色固形物として生成物を得た。
収率：８．０２ｇ（６８％）
Ｒ_ｆ：０．２４（ＣＨ_２Ｃｌ_２中の７％ＭｅＯＨ）
^１３Ｃ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ_６）：δ１８０．２，１５７．９，１５４．９，１４７．８，１４４．７，１３５．４，１２９．３（Ａｒ），１２７．５（Ａｒ），１２７．４（Ａｒ），１２６．４（Ａｒ），１２０．４，１１３．０（Ａｒ），８５．２，８５．１（Ｃ１’），７９．９（Ｃ４’），６３．５（Ｃ５’），６１．７（Ｃ２’），６１．１（Ｃ３’），５４．９（−ＯＣＨ_３），３４．７（第四級ｉ−Ｐｒ），１８．９（ｉ−Ｐｒ），１８．８（ｉ−Ｐｒ）
ＭＡＬＤＩ−ＨｉＲｅｓ（ｍＮａ^＋）：ｍ／ｚ：６８０．２６７９ ｃａｌｃ．：６８０．２６９１
２’−Ｏ−ベンゾイル−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２−Ｎ−イソブチリル−２’，３’−セコグアノシン（１０３−Ｇ）

ヌクレオシド１０２−Ｇを無水トルエン（２×３０ｍＬ）に懸濁し、蒸発させた。得られた残渣を真空で１２時間乾燥させた。残渣を、無水ＤＢＵ（０．９ｍＬ，６．１ｍｍｏｌ）と共に、無水ＤＣＭ（１００ｍＬ）に溶解し、得られた混合物を−７０℃まで冷却した。塩化ベンゾイル（３９０μＬ，３．３６ｍｍｏｌ）を反応混合物にゆっくりと添加した。反応混合物を−７０℃で１時間攪拌し、その後、室温になるまで放置し、それから、ＥｔＯＨ（４ｍＬ）を添加した。得られた混合物を飽和ＮａＨＣＯ_３水溶液（２×１００ｍＬ）で洗浄し、有機相を合わせ、蒸発させた。得られた残渣をカラムクロマトグラフィー（ＣＨＣｌ_３中の０〜５％ＭｅＯＨ）で精製し、溶媒の蒸発後、白色発泡体としてヌクレオシド１０３−Ｇを得た。
収率：１．４９ｇ（６３％）
Ｒ_ｆ：０．４７（ＣＨ_２Ｃｌ_２中の７％ＭｅＯＨ）
^１Ｈ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ_６）：δ１２．１０（ｓ，１Ｈ，ＮＨ），１１．７２（ｓ，１Ｈ，ＮＨ），８．３２（ｓ，１Ｈ，グアニジンＨ８），７．８５−７．７９（ｍ，２Ｈ，Ａｒ），７．６５−７．６３（ｍ，１Ｈ，Ａｒ），７．５１−７．４５（ｍ，２Ｈ，Ａｒ），７．２６−６．９７（ｍ，１１Ｈ，Ａｒ），６．７９（ｍ，４Ｈ，Ａｒ），６．１８（ｔ，１Ｈ，Ｈ１’），５．０４−４．８２（ｍ，３Ｈ，Ｈ２’／３’ＯＨ），３．８２（ｍ，１Ｈ，Ｈ４’），３．７２（ｓ，６Ｈ，２×−ＯＣＨ_３），３．４９（ｔ，２Ｈ，Ｈ３’），３．０３−２．７４（ｍ，３Ｈ，Ｈ５’／第四級ｉ−Ｐｒ），１．１１（ａｐ．ｔ，６Ｈ，２×−ＣＨ_３）
^１３Ｃ ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ_６）：δ１８０．１，１６４．９，１５７．８，１５４．８，１４８．６，１４７．９，１４４．６，１３８．４，１３５．５，１３５．３，１３３．６，１２９．３（Ａｒ），１２９．０（ａｒ），１２８．８（ａｒ），１２８．７（ａｒ），１２７．６（ａｒ），１２７．４（ａｒ），１２６．３（ａｒ），１２０．６，１１２．９（ａｒ），８５．１，８２．０（Ｃ１’），８０．１（Ｃ４’），６３．７， ６３．３（Ｃ５’），６１．０（Ｃ３’），５４．８（−ＯＣＨ_３），３４．６（第四級ｉ−Ｐｒ），１８．８（−ＣＨ_３），１８．６（−ＣＨ_３）
ＥＳＩ−ＨｉＲｅｓ（ｍＮａ^＋）：ｍ／ｚ：７８４．２９４３ ｃａｌｃ．：７８４．２９５３
２’−Ｏ−ベンゾイル−３’−Ｏ−（２−シアノエトキシ（ジイソプロピルアミノ）ホスフィノ）−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２−Ｎ−イソブチリル−２’，３’−セコグアノシン（１０４−Ｇ）

ヌクレオシド１０３−Ｇ（１．４５ｇ，１．９ｍｍｏｌ）を無水ＭｅＣＮ（２×２０ｍＬ）で同時蒸発させた。残渣をＭｅＣＮ（２０ｍＬ）中の２０％ＤＩＰＥＡに溶解し、得られた混合物を攪拌した。２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルクロロホスホラミダイト［Ｐ（Ｃｌ）（ＯＣＨ_２ＣＨ_２ＣＮ）（Ｎ（ｉＰｒ）_２）；０．６５ｍＬ］を反応混合物に添加し、４０分間攪拌し続けた。ＥｔＯＨ（５ｍＬ）を添加し、得られた混合物を飽和ＮａＨＣＯ_３水溶液（３×５０ｍＬ）で洗浄し、水相をＤＣＭ（５０ｍＬ）で逆抽出した。有機相をプールし、蒸発させた。残渣を、ＥｔＯＡｃ中の溶液からの石油エーテルから沈殿させ、乾燥後、白色固形物としてアミダイト１０４−Ｇを得た。
収率：６０７ｍｇ（３３％）
Ｒ_ｆ：０．３（１：３ アセトン：トルエン）
^３１Ｐ ＮＭＲ（ＭｅＣＮ）：δ１４８．６
ＥＳＩ−ＨｉＲｅｓ（ｍＮａ^＋）：ｍ／ｚ：９８４．４０２８ ｃａｌｃ．：９８４．４０３１。

（実施例１２）
ピペラジノ−官能化モノマー基本要素の合成
実施例は、モノマーのＣ２’位置に付加するアミノ官能基を有するモノマーアミダイト基本要素の合成、すなわち、化合物１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、および１１０を介してヌクレオシド１０３−Ｕから開始するＣ２’−ピペラジノ−官能化モノマー基本要素１１１（アミダイトＪ；塩基＝ウラシル）の合成を例示するために行われた手順を説明する。

２’−Ｏ−ベンゾイル−３’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’，３’−セコウリジン（１０５）
ヌクレオシド１０３−Ｕ（３２８ｍｇ，０．５０ｍｍｏｌ）を無水ピリジン（２ｍＬ）に溶解し、室温で攪拌した。ＴＢＤＭＳＣｌ（１１３ｍｇ，０．７５ｍｍｏｌ）を反応混合物に添加し、１９時間攪拌した。その後、水（１ｍＬ）を添加し、さらに１５分攪拌し続け、それから、反応混合物をＤＣＭ（５０ｍＬ）で希釈し、飽和ＮａＨＣＯ_３水溶液（２×２５ｍＬ）およびブライン（２５ｍＬ）で洗浄した。有機相をＮａ_２ＳＯ_４で乾燥させ、ろ過し、減圧下で乾燥するまで蒸発させた。残渣を、溶離液としてＤＣＭ中のＭｅＯＨ（０〜８％）を使用してシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し、白色固形物としてヌクレオシド１０５を得た。収率２９４ｍｇ（７８％）．^１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ_６）δ１１．４６（ｓ，１Ｈ，ＮＨ），７．９５−７．７９（ｍ，３Ｈ），７．７１−７．６３（ｍ，１Ｈ），７．５７−７．４８（ｍ，２Ｈ），７．３７−７．１３（ｍ，９Ｈ），６．８４（ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，４Ｈ），６．２２（ｔ，J＝５．７Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ１’），５．５８（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ５），４．６９−４．４５（ｍ，２Ｈ，Ｈ２’），３．８０−３．６４（ｍ，８Ｈ，２×ＯＭｅおよびＨ４’），３．５４（ｔ，J＝４．７Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ３’），３．０９−２．９７（ｍ，２Ｈ，Ｈ５’），０．７３（ｓ，９Ｈ，３×Ｍｅ），−０，０７および−０，０９（２×ｓ，６Ｈ，２×Ｍｅ）．^１３Ｃ ＮＭＲ（７５．５ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ_６）：δ１６５．０，１６３．１，１５８．０，１５１．１，１４４．７，１４０．６，１３５．５，１３５．４，１３３．７，１２９．６，１２９．１，１２９．０，１２８．８，１２７．８，１２７．６，１２６．６，１１３．１，１０２．３，８５．５，８１．１，７９．２，６３．４，６３．１，６２．１，５５．０，２５．６，１７．７，２×−５．７．ＥＳＩ−ＨＲＭＳ：ｍ／ｚ７８９．３１４７（［Ｍ＋Ｎａ］^＋，Ｃ_４３Ｈ_５０Ｎ_２Ｏ_９Ｓｉ・Ｎａ ｃａｌｃ．７８９．３１７８）

３’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’，３’−セコウリジン（１０６）

ＮａＯＨ（８４５ｍｇ，２１．１ｍｍｏｌ）を無水ＭｅＯＨ（２００ｍＬ）と混合し、得られた混合物を０℃まで冷却した。ヌクレオシド１０５（３．１０ｇ，４．０５ｍｍｏｌ）を無水ＭｅＯＨ（４０ｍＬ）に溶解し、得られた混合物を上記の混合物に添加し、得られた反応混合物を２．５時間攪拌した。飽和ＮＨ_４Ｃｌ水溶液（１０ｍＬ）を添加し、さらに１０分間攪拌し続けた。それから、水（１００ｍＬ）を添加し、ＤＣＭ（４×２００ｍＬ）を使用して抽出を行った。有機相を減圧下で乾燥するまで蒸発させ、その後、残渣を無水ピリジン（１０ｍＬ）で同時蒸発させた。残渣を、溶離液としてＤＣＭ中のＭｅＯＨ（５〜１０％）を使用してシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し、白色固形物としてヌクレオシド１０６を得た。収率２．５４ｇ（９５％）．^１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ_６）：δ１１．３５（ｓ，１Ｈ，ＮＨ），７．６６（ｄ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ６），７．３３−７．１４（ｍ，９Ｈ），６．８８−６．８２（ｍ，４Ｈ），５．８２（ｔ，J＝６．０Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ１’），５．５３（ｄ，Ｊ＝８Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ５），５．１１（ｔ，J＝５．８Ｈｚ，１Ｈ，２’−ＯＨ），３．７３（ｓ，６Ｈ，２×ＯＭｅ），３．６９−３．４５（ｍ，５Ｈ，Ｈ２’，Ｈ４’およびＨ３’），３．０１−２．９３（ｍ，２Ｈ，Ｈ５’），０．７６（ｓ，９Ｈ，３×Ｍｅ），−０．０３および−０．０５（２×ｓ，６Ｈ，２×Ｍｅ）．^１３Ｃ ＮＭＲ（７５．５ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ_６）：δ１６３．２，１５８．０，１５１．６，１４４．８，１３５．６，１３５．４，１２９．６，１２７．７，１２７．６，１２６．６，１１３．１，１０１．８，８５．４，８３．５，７８．５，６３．３，６１．８，６１．０，５５．０，２５．６，１７．７，２×−５．６．ＥＳＩ−ＨＲＭＳ：ｍ／ｚ６８５．２８８５（［Ｍ＋Ｎａ］^＋，Ｃ_３６Ｈ_４６Ｎ_２Ｏ_８Ｓｉ・Ｎａ ｃａｌｃ．６８５．２９１６）

３’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−Ｏ−メタンスルホニル−２’，３’−セコウリジン（１０７）
ヌクレオシド１０６（９２７ｍｇ，１．４０ｍｍｏｌ）を無水ピリジン（２０ｍＬ）に溶解し、得られた混合物を０℃で攪拌した、ＭｓＣl（２２０μＬ，２．８３ｍｍｏｌ）を滴下し、得られた混合物を室温で３時間攪拌した。ＥｔＯＨ（２ｍＬ）を添加し、さらに１０分間攪拌し続けた。その後、混合物を乾燥するまで蒸発させ、残渣を、溶離液としてＤＣＭ中のＭｅＯＨ（０〜７％）を使用してシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し、白色発泡体としてヌクレオシド１０７を得た。収率８３４ｍｇ（８１％）．^１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ_６）：δ１１．４９（ｓ，１Ｈ，ＮＨ），７．７７（ｄ，Ｊ＝８．２Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ６），７．３５−７．１４（ｍ，９Ｈ），６．８６（ｄ，Ｊ＝８．５Ｈｚ，４Ｈ），６．１１（ｔ，J＝５．７Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ１’），５．６０（ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ５），４．４９（ｄ，Ｊ＝５．５Ｈｚ，２Ｈ，Ｈ２’），３．７７−３．４８（ｍ，９Ｈ，２×ＯＭｅ，Ｈ４’およびＨ３’），３．２２（ｓ，３Ｈ，Ｍｅ），３．１０−２．８９（ｍ，２Ｈ，Ｈ５’），０．７７（ｓ，９Ｈ，３×Ｍｅ），−０．０２および−０．０４（２×ｓ，６Ｈ，２×Ｍｅ）．^１３Ｃ ＮＭＲ（７５．５ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ_６）：δ１６３．１，１５８．０，１５１．７，１４４．７，１４０．５，１３５．５，１３５．３，１２９．６，１２７．８，１２７．６，１２６．６，１１３，１，１０２．４，８５．５，８０．６，７９．１，６７．８，６３．１，６１．８，５５．０，３６．８，２５．６，１７．７，−５．６，−５．７．ＥＳＩ−ＨＲＭＳ：ｍ／ｚ７６３．２６６２（［Ｍ＋Ｎａ］^＋，Ｃ_３７Ｈ_４８Ｎ_２Ｏ_１０ＳＳｉ・Ｎａ ｃａｌｃ．７６３．２６９２）

３’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル−２’−デオキシ−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−ピペラジノ−２’，３’−セコウリジン（１０８）
ヌクレオシド１０７（２７６ｍｇ，０．３７３ｍｍｏｌ）を無水ピリジン（３ｍＬ）に溶解し、ピペラジン（３．２１ｇ，３７．３ｍｍｏｌ）を室温で攪拌下しながら添加した。その後、反応混合物を１５０℃まで加熱し、１時間攪拌し、その後、室温まで冷却した。反応混合物を飽和ＮａＨＣＯ_３水溶液（２００ｍＬ）で希釈し、それから、クロロホルム（７×１００ｍＬ）を使用して抽出を行った。有機相をＮａ_２ＳＯ_４で乾燥させ、ろ過し、乾燥するまで蒸発させた。残渣を、溶離系として、まずＤＣＭ中のＭｅＯＨ（０〜５％）、その後、ＤＣＭ中の半飽和メタノールアンモニア（５％）を使用して、シリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し、白色固形物としてヌクレオシド１０８を得た。収率１８２ｍｇ（６７％）．^１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ_６）：δ７．６４（ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ６），７．３４−７．１３（ｍ，９Ｈ），６．８５（ｄ，Ｊ＝７．８Ｈｚ，４Ｈ），５．９８（ｔ，J＝６．０Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ１’），５．５３（ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ５），３．７２（ｓ，６Ｈ，２×ＯＭｅ），３．６８−３．５１（ｍ，３Ｈ，Ｈ４’およびＨ３’），３．０４−２．９０（ｍ，２Ｈ，Ｈ５’），２．７７−２．５４（ｍ，６Ｈ，Ｈ２’，ピペラジノ），２．４８−２．２７（ｍ，４Ｈ，ピペラジノ），０．７７，（ｓ，９Ｈ，３×Ｍｅ），−０．０２および−０．０４（２×ｓ，６Ｈ，２×Ｍｅ）．^１３Ｃ ＮＭＲ（７５．５ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ_６）：δ１６３．２，１５８．０，１５１，３，１４４．８，１４１．１（Ｃ６），１３５．６，１３５．４，１２９．５，１２７．７，１２７．６，１２６．６，１１３．１，１１３．１，１０１．８（Ｃ５），８５．４，８１．３（Ｃ１’），７８．３，６３．１，６２．１，６０．１，５５．０（ＯＭｅ），５５．０（ＯＭｅ），５３．８，４５．３，２５．７（Ｍｅ），１７．８，−５．５（Ｍｅ），−５．６（Ｍｅ）．ＥＳＩ−ＨＲＭＳ：ｍ／ｚ７３１．３８５９（［Ｍ＋Ｈ］^＋，Ｃ_４０Ｈ_５４Ｎ_４Ｏ_７Ｓｉ・Ｈ ｃａｌｃ．７３１．３８３４）

３’−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル−２’−デオキシ−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−（４−Ｎ−トリフルオロアセチル）ピペラジノ−２’，３’−セコウリジン（１０９）
ヌクレオシド１０８（１０２ｍｇ，０．１４ｍｍｏｌ）を無水ＭｅＯＨ（２ｍＬ）に溶解し、得られた混合物を室温で攪拌した。ＤＭＡＰ（１０ｍｇ，０．０８ｍｍｏｌ）およびトリフルオロ酢酸エチル（２２μＬ，０．１８４ｍｍｏｌ）を添加し、１６時間攪拌し続けた。その後、混合を減圧下で乾燥するまで蒸発させ、残渣を、溶離液としてＤＣＭ中のＭｅＯＨ（０〜２％）を使用してシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し、白色固形体としてヌクレオシド１０９を得た。収率１００ｍｇ（８６％）．^１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ_６）：δ１１．３７（ｓ，１Ｈ，ＮＨ），７．６６（ｄ，Ｊ＝７．８Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ６），７．３８−７．１２（ｍ，９Ｈ），６．９３−６．８０（ｍ，４Ｈ），６．００（ｔ，J＝５．９Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ１’），５．５４（ｄ，Ｊ＝７．８Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ５），３．７３（ｓ，６Ｈ，２×ＯＭｅ），３．７０−３．４０（ｍ，７Ｈ，Ｈ３’，Ｈ４’およびピペラジノ），３．０８−２．９２（ｍ，２Ｈ，Ｈ５’），２．９０−２．５２（ｍ，６Ｈ，Ｈ２’およびピペラジノ），０．７７（ｓ，９Ｈ，３×Ｍｅ），０．００および−０．０４（２×ｓ，６Ｈ，２×Ｍｅ）．^１３Ｃ ＮＭＲ（７５．５ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ_６）：δ１６３．２，１５８．０，１５１．３，１４４．８，１４０．８，１３５．６，１３５．４，１２９．５，１２７．７，１２７．６，１２６．６，１１３．１，１０２．０，８５．５，８１．０，７８．２，６３．１，６２．０，５８．９，５５．０，５２．６，５２．０，４５．４，４３．０，２５．６，１７．８，−５．６，−５．６．ＥＳＩ−ＨＲＭＳ：ｍ／ｚ８４９．３４５２（［Ｍ＋Ｎａ］^＋，Ｃ４_２Ｈ_５３Ｆ_３Ｎ_４Ｏ_８Ｓｉ・Ｎａ ｃａｌｃ．８４９．３４７７）

２’−デオキシ−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−（Ｎ−トリフルオロアセチル）ピペラジノ−２’，３’−セコウリジン（１１０）
ヌクレオシド１０９（２５１ｍｇ，０．３０４ｍｍｏｌ）を無水ＴＨＦ（２×５ｍＬ）で同時蒸発させ、その後、無水ＴＨＦ（１０ｍＬ）に溶解した。ＴＨＦ中の１Ｍ ＴＢＡＦ（６０６μｌ，０．６０６ｍｍｏｌ）を、攪拌しながら室温で１時間の間、この混合物に滴下し、その後、室温で２１時間攪拌し続けた。反応混合物を減圧下で乾燥するまで蒸発させ、その後、残渣をＥｔＯＡｃ（４０ｍＬ）に溶解した。得られた混合物を飽和ＮａＨＣＯ_３水溶液（３×１０ｍＬ）および水（３×１０ｍＬ）で洗浄し、分離した有機相をＮａ_２ＳＯ_４で乾燥させ、ろ過し、減圧下で乾燥するまで蒸発させた。残渣を、溶離液として石油エーテル中のＥｔＯＡｃ（６０〜１００％）を使用してシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し、白色固形体としてヌクレオシド１１０を得た。収率１１１ｍｇ（５１％）．^１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ_６）：δ１１．３６（ｓ，１Ｈ，ＮＨ），７．６６（ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ６），７．３４−７．２７（ｍ，４Ｈ），７．２４−７．１４（ｍ，５Ｈ），６．９２−６．８２（ｍ，４Ｈ），５．９８（ｔ，J＝６．１Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ１’），５．５３（ｄ，Ｊ＝７．３Ｈｚ，１Ｈ，Ｈ５），４．８０（ｔ，J＝５．３Ｈｚ，１Ｈ，３’−ＯＨ），３．７３（ｓ，６Ｈ，２×ＯＭｅ），３．６３−３．３８（ｍ，８Ｈ，Ｈ４’，Ｈ３’およびピペラジノ），３．０７−２．８９（ｍ，２Ｈ，Ｈ５’），２．７７（ｔ，J＝５．８Ｈｚ，２Ｈ，Ｈ２’），２．６６−２．５４（ｍ，３Ｈ，ピペラジノ）．^１３Ｃ ＮＭＲ（７５．５ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ_６）：δ１６３．２，１５８．０，１５１．２，１４４．８，１４０．９，１３５．６，１３５．５，１２９．６，１２９．６，１２７．８，１２７．６，１２６．６，１１３．１，１０１．９，８５．４，８１．３，７９．２，６３．５，６０．７，５９．１，５５．０，５２．７，５２．１，４５．４，４２．９．ＥＳＩ−ＨＲＭＳ：ｍ／ｚ７３５．２５８５（［Ｍ＋Ｎａ］^＋，Ｃ_３６Ｈ_３９Ｆ_３Ｎ_４Ｏ_８・Ｎａ ｃａｌｃ．７３５．２６１２）

３’−（２−シアノエトキシ（ジイソプロピルアミノ）ホスフィノ）−２’−デオキシ−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−（Ｎ−トリフルオロアセチル）ピペラジノ−２’，３’−セコウリジン（１１１）
ヌクレオシド１１０（９１ｍｇ，０．１２８ｍｍｏｌ）を無水ＤＣＭ（２×５ｍＬ）で同時蒸発させ、その後、無水ＤＣＭ（２．５ｍＬ）で溶解した。ＤＩＰＥＡ（１１１μＬ，０．６４ｍｏｌ）を、攪拌しながら室温で混合物に添加し、それから、２−シアノエチルＮ，Ｎ−ジイソプロピルホスホラミドクロリダイト（５７μＬ，０．２５６ｍｍｏｌ）を滴下した。室温で１時間攪拌し続け、それから、ＥｔＯＨ（０．５ｍＬ）を添加し、その後、さらに１０分間攪拌した。ＤＣＭ（４０ｍＬ）を添加し、その後、飽和ＮａＨＣＯ_３水溶液（２０ｍＬ）で洗浄した。分離した有機相をＮａ_２ＳＯ_４で乾燥させ、ろ過し、減圧下で乾燥するまで蒸発させた。残渣を、溶離液として石油エーテル中のＥｔＯＡｃ（６０〜８０％）を使用してシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し、白色固形体としてアミダイト１１１を得た。収率１０６ｍｇ（９１％）。^３１Ｐ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３）δ１５０．０および１４９．５。ＥＳＩ−ＨＲＭＳ：ｍ／ｚ９１３．３８４１（［Ｍ＋Ｈ］^＋，Ｃ_４５Ｈ_５６Ｆ_３Ｎ_６Ｏ_９Ｐ・Ｈ ｃａｌｃ．９１３．３８７１）
（実施例１３）
ピペラジノ官能化モノマー基本要素を含有するオリゴヌクレオチドの合成
実施例１に記載される方法を使用することによって、ピペラジノ部分における遊離末端ＮＨを有するモノマーＪの効率的な取り込みが、ＲＮＡアミダイト類およびアミダイト１１１を使用して遂行される。このアミダイトの収率を合わせると、９５％を上回る。

（配列表）
本出願は、２００９年１１月２日に作成された、ＭＤ０８０７ＰＣ．ｔｘｔという名前を付けられたＡＳＣＩＩファイルとして、ＥＦＳ−Ｗｅｂにより、本明細書とともに提出された配列表を含む。この配列表は、大きさが３０，８９４バイトであり、その全体が参照により本明細書に援用される。
ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）は、標的遺伝子の発現を抑制する手段を提供することから、近年、多大な注目を集めている。ＲＮＡｉは、遺伝的および生化学的経路、ならびに個々の遺伝子および遺伝子産物の機能を研究するための方法による基礎研究を提供する。その結果、ＲＮＡ干渉は、製薬業界において標的バリデーションのための重要なツールとなっている。また、薬剤として使用することができるＲＮＡ干渉複合体を媒介することができるＲＮＡ複合体を開発することを目的に、かなりの投資が行われている。

ＲＮＡ複合体に取り込まれるヒドロキシメチル置換ヌクレオチドの異なる構造の例を示す。モノマーＡは、比較のために示し、そのリボース足場を有する天然ＲＮＡモノマーである。本発明のＲＮＡ複合体に含まれるモノマーＢ〜Ｅの特徴は、ヒドロキシメチル基（「遊離ヒドロキシメチル基」）である置換基を含有することであるため、本発明は、「ヒドロキシメチル置換ＲＮＡオリゴヌクレオチドおよびＲＮＡ複合体」と表題される。遊離ヒドロキシメチル基は、例えば、環式リボース足場のＣ４’原子または非環式リボースベースの足場のＣ１’原子に付加する。本発明のヒドロキシメチル置換ヌクレオチドは、それぞれ、リン原子に付加する他の酸素原子を含有するため、ヌクレオチド間結合の形成を行う（図１参照）。これらの他の酸素原子の１個または複数個は、本発明のＲＮＡ複合体のヒドロキシメチル置換ヌクレオチドの１個または複数個が、ＲＮＡ鎖の３’または５’末端に位置する場合に、ヒドロキシ基の一部になり得る。任意の末端に位置付けられた天然ＲＮＡモノマーの場合のように、本発明のＲＮＡ複合体のヒドロキシメチル置換ヌクレオチドの１つが、ＲＮＡ鎖の３’末端および／または５’末端に位置する場合、このモノマーのヒドロキシル基はリン酸化することができる。本発明のヒドロキシメチル置換ヌクレオチドには、ウラシル、チミン、シトシン、５−メチルシトシン、アデニン、グアニン、または任意の他の公知の天然もしくは合成核酸塩基もしくは核酸塩基類似体（図１の「塩基」として指定される）のような核酸塩基が付加する。 ヒドロキシメチル置換モノマーの誘導体化、官能化および結合体化された変異体を示す。例として、ヒドロキシメチルで置換された２’，３’−セコ−ＲＮＡモノマーＤの誘導体化、官能化および結合体化された変異体を示す（図１参照）。モノマーＦは、エーテル結合を介して結合するＲ基を含有する。モノマーＧは、チオエーテル結合を介して結合するＲ基を含有する。モノマーＨは、アミド結合を介して結合するＲ基を含有する。モノマーＩは、アミノ結合を介して結合するＲ基を含有する。モノマーＪは、ピペラジノ部分を介して結合するＲ基を含有する。そのようなモノマーの１つまたはいくつかの、本発明のＲＮＡ複合体への取り込みによって、ＲＮＡ複合体の特性を調節することができる。例えば、生物学的安定性の増加、ＲＮＡターゲッティング能力の増加、または特定の送達特性を導入することができ、検出のために、蛍光基を付加することができる。 オリゴヌクレオチドまたはＲＮＡ複合体のモノマーである場合があるヒドロキシメチル置換モノマー（モノマーＣおよびモノマーＤ）の２つの構造の図である。 「モノマーＸ」（すなわち、２’，３’−セコ−ＲＮＡモノマーＤ）を含有する本発明のｓｉＲＮＡ複合体に関する遺伝子サイレンシングの結果の図である。結果は、核酸塩基（Ｗ１３０センス鎖において「Ｘ」として示される）としてウラシルを有するモノマーＤを含有するＷ１３０センス鎖（ヌクレオチド配列に関しては、図４参照）で得られた。本研究で使用するアンチセンス鎖の核酸配列は、この図の下部に掲載する（アンチセンス配列におけるすべてのＸモノマーは、核酸塩基としてウラシルを有するモノマーＤである）。上付き文字「Ｌ」が付くモノマーは、固定核酸（例えば、ＴＬは、チミン固定核酸またはＬＮＡを示す）を表す。図４は、出現の順に、それぞれ、配列番号４４〜５２を開示する。 「モノマーＸ」（すなわち、２’，３’−セコ−ＲＮＡモノマーＤ）を含有する本発明のｓｉＲＮＡ複合体に関する遺伝子サイレンシングの結果の図である。結果は、核酸塩基（Ｗ１３１センス鎖において「Ｘ」として示される）としてウラシルを有するモノマーＤを含有するＷ１３１センス鎖（ヌクレオチド配列に関しては、図５参照）で得られた。本研究で使用するアンチセンス鎖の核酸配列は、図４の下部に掲載する（アンチセンス配列におけるすべてのＸモノマーは、核酸塩基としてウラシルを有するモノマーＤである）。図５は配列番号５３を開示する。 「モノマーＸ」（すなわち、２’，３’−セコ−ＲＮＡモノマーＤ）を含有する本発明のｓｉＲＮＡ複合体に関する遺伝子サイレンシングの結果の図である。これらの結果は、核酸塩基として、シトシン（ｓＣ、Ｗ２８２配列の５’末端から第１のＸ）、アデニン（ｓＡ、Ｗ２８２配列の５’末端から第２のＸ）、およびシトシン（ｓＣ、Ｗ２８２配列の３’末端から最後のＸ）を有するモノマーＤを含有するＷ２８２センス鎖（ヌクレオチド配列に関しては、図６参照）で得られた。本研究で使用するアンチセンス鎖の核酸配列は、図４の下部に掲載する（アンチセンス配列におけるすべてのＸモノマーは、核酸塩基としてウラシルを有するモノマーＤである）。図６は配列番号５４を開示する。 「モノマーＸ」（すなわち、２’，３’−セコ−ＲＮＡモノマーＤ）を含有する本発明のｓｉＲＮＡ複合体に関する遺伝子サイレンシングの結果の図である。これらの結果は、Ｗ１９４センス鎖（ヌクレオチド配列に関しては、図７参照）で得られた。本研究で使用するアンチセンス鎖の核酸配列は、図４の下部に掲載する（アンチセンス配列におけるすべてのＸモノマーは、核酸塩基としてウラシルを有するモノマーＤである）。上付き文字「Ｌ」が付くモノマーは、固定核酸（例えば、Ｔ^Ｌは、チミン固定核酸またはＬＮＡを示す）を表す。図７は配列番号５５を開示する。 「モノマーＸ」（すなわち、２’，３’−セコ−ＲＮＡモノマーＤ）を含有する本発明のｓｉＲＮＡ複合体に関する遺伝子サイレンシングの結果の図である。これらの結果は、Ｗ１８１センス鎖（ヌクレオチド配列に関しては、図８参照）で得られた。本研究で使用するアンチセンス鎖の核酸配列は、図４の下部に掲載する（アンチセンス配列におけるすべてのＸモノマーは、核酸塩基としてウラシルを有するモノマーＤである）。上付き文字「Ｌ」が付くモノマーは、固定核酸（例えば、Ｔ^Ｌは、チミン固定核酸またはＬＮＡを示す）を表す。図８は配列番号５６を開示する。 「モノマーＸ」（すなわち、２’，３’−セコ−ＲＮＡモノマーＤ）を含有する本発明のｓｉＲＮＡ複合体に関する遺伝子サイレンシングの結果の図である。これらの結果は、核酸塩基（Ｗ１２９センス鎖において「Ｘ」として示される）としてウラシルを有するモノマーＤを含有するＷ１２９センス鎖（ヌクレオチド配列に関しては、図９参照）で得られた。本研究において含まれるアンチセンス鎖は、図４の下部に掲載する（アンチセンス配列におけるすべてのＸモノマーは、核酸塩基としてウラシルを有するモノマーＤである）。上付き文字「Ｌ」が付くモノマーは、固定核酸（例えば、Ｔ^Ｌは、チミン固定核酸またはＬＮＡを示す）を表す。図９は配列番号５７を開示する。

オリゴヌクレオチド−ｓｉＲＮＡ構築物における選択したセンス鎖：

合成されている他のヒドロキシメチル置換ＲＮＡ鎖：

−上付き文字の「Ｌ」は、残基がＬＮＡヌクレオチドであることを示す。
−上付き文字の「ＭｅＬ」は、残基が５−メチルシトシン塩基を有するＬＮＡヌクレオチドであることを示す。
−太字、下線付きのＴは、ヒドロキシメチル置換ヌクレオチドモノマーである。本実施例においては、それは、Ｃ４’−分枝ＲＮＡモノマーＣのチミン−１−イル誘導体である（図１参照）。
−太字、下線付きのＣは、ヒドロキシメチル置換ヌクレオチドモノマーである。本実施例においては、それは、Ｃ４’−分枝ＲＮＡモノマーＣの５−メチルシトシン（５−ｍｅｔｈｙｌｃｙｔｏｓｉｎ）−１−イル誘導体である（図１参照）。
−太字、下線付きのＸは、ヒドロキシメチル置換非環式ヌクレオチドモノマーである。上記の配列においては、それは、２’，３’−セコ−ＲＮＡモノマーＤのウラシル−１−イル誘導体である（図１参照）。他の実施例および図においては、ウラシル以外の他の塩基改変体が含まれる。

（実施例１０）
種（ｓｅｅｄ）改変は、オフターゲット効果を削減する
５０ｎＭ濃度のｓｉＲＮＡ二本鎖におけるセンス鎖として、アンチセンス鎖Ｗ１２４およびＷ２０７（５’−ＧＡＣ ＧＵＡ ＡＡＣ ＧＧＣ ＣＡＣ ＡＡＧ ＵＴ^ＬＣ^ＭｅＬ）（配列番号２５）を使用して、本発明者らは、モノマーＸが、アンチセンス鎖のいわゆる種領域に存在する場合、より低いオフターゲット効果をもたらす選択性増強効果を有することを示した。したがって、実験の設定により、ｓｉＲＮＡ効果（鎖開裂を伴う遺伝子サイレンシング）とｍｉＲＮＡ効果（翻訳抑制；種領域の一致のみから成る４つの標的領域を有する、プラスミドに基づくオフターゲットセンサ）との識別を可能にした。上記の組み合わせを使用すると、ｓｉＲＮＡ効果は、未改変ｓｉＲＮＡ対照と同様であったが、一方、ｍｉＲＮＡ効果は、有意に低下した。同様の効果は、ｓｉＤｈａｒｍａ（アンチセンス鎖の５’末端からの位置番号２に取り込まれる２’−Ｏ−Ｍｅ−ＲＮＡモノマーを有する市販品）に対して得られた。以上のように、これは、アンチセンス鎖のいわゆる種領域に存在するヒドロキシメチル置換モノマー（例えば、モノマーＤ）が、好ましい効果（すなわち、オフターゲット効果の低下または排除）をもたらすことを示す。そのため、ＲＮＡ複合体のオフターゲット効果を低下または排除するための方法は、ＲＮＡ複合体に１個または複数個のヒドロキシメチル置換モノマー（例えば、モノマーＤ）を取り込む工程、または１個または複数個のヒドロキシメチル置換モノマー（例えば、モノマーＤ）を含有するＲＮＡ複合体を調製する工程を含む。遺伝子サイレンシング（すなわち、「ｓｉＲＮＡ効果」）およびオフターゲット効果（すなわち、「ｍｉＲＮＡ効果）の結果に関しては、以下の表を参照されたい。これらのデータは、１個または複数個のヒドロキシメチル置換モノマー（例えば、モノマーＤ）を含有するＲＮＡ複合体が、オフターゲット効果を最小限にしながら、標的の発現を削減することを示す。

遺伝子サイレンシング実験において、オリゴマーＷ３１３、Ｗ３１４、Ｗ３１５、Ｗ３１６、Ｗ３１７、Ｗ１２３、Ｗ３１８、Ｗ３１９、およびＷ３２０をアンチセンス鎖として、そしてオリゴマーＪＷ１１０４をセンス鎖として有する上記実施例に記載されるのと同様の実験技法を使用することにより、ヒドロキシメチル置換モノマーＤを含有するｓｉＲＮＡ構築物の有効性は、未改変ｓｉＲＮＡ、またはアンチセンス鎖の５’末端からの位置番号２に２’−Ｏ−Ｍｅ−ＲＮＡモノマーを有する市販の化学的改変ｓｉＲＮＡ生成物（Ｄｈａｒｍａ）と比較して改善することができる。さらに、２’，３’−セコ−ＲＮＡモノマーＤを含有するｓｉＲＮＡ複合体は、オフターゲット効果（ｍｉＲＮＡ効果）が参照未改変ｓｉＲＮＡ（ＳｉＲＮＡ）と比較して低減されるように、このモノマーをｓｉＲＮＡ構築物に取り込むことができることを示す。

本発明は、ＲＮＡ誘導遺伝子調節または遺伝子分析、特に、ＲＮＡ干渉に対して使用するためのＲＮＡ鎖に取り込まれた１個または複数個のヒドロキシメチル置換モノマーを有するＲＮＡ複合体を提供する。そのため、本発明の目的は、通常使用されるＲＮＡ複合体と比較して、オフターゲット効果が低いＲＮＡ複合体を提供することである。別の目的は、インターフェロン応答性の低減を誘導するＲＮＡ複合体を提供することである。さらに別の目的は、細胞培養物中で、またはｉｎ ｖｉｖｏで酵素的分解への安定性に関する特性を改善したＲＮＡ複合体を提供することである。さらに別の目的は、未改変ＲＮＡ複合体に対して、細胞培養物中で、またはｉｎ ｖｉｖｏで、遺伝子調節機能、例えば、遺伝子サイレンシング効果の強化を示すＲＮＡ複合体を提供することである。さらなる目的は、特定の器官または組織に対して標的とされるＲＮＡ複合体、および細胞膜を通過することができるＲＮＡ複合体を提供することである。本発明は、ヒドロキシメチル置換モノマーのオリゴヌクレオチドへの取り込みに適切なモノマー、およびそれらの合成のための方法も提供する。
本発明は、例えば以下の項目を提供する。
（項目１）
非環式ヌクレオチドモノマーを含むオリゴヌクレオチド。
（項目２）
前記非環式ヌクレオチドモノマーは、２’−３’−セコ−ヌクレオチドモノマーである、項目２に記載のオリゴヌクレオチド。
（項目３）
前記非環式ヌクレオチドモノマーは、以下のモノマーＤ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、およびＪから成る群より選択され、

式中、Ｒは、Ｈ、アルキル、コレステロール誘導体、フルオロフォア、ポリアミン、脂肪酸、アミノ酸、単糖類、およびポリペプチドから成る群より選択される、項目１〜２のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド。
（項目４）
１５〜４０個のヌクレオチドモノマーを含む、項目１〜３のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド。
（項目５）
１〜５個の非環式ヌクレオチドモノマーを含む、項目１〜５のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド。
（項目６）
４個未満の連続的ＤＮＡモノマーを含む、項目１〜５のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド。
（項目７）
５０％を上回るＲＮＡモノマーを含む、項目１〜６のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド。
（項目８）
２’−Ｏ−アルキル−ＲＮＡモノマー、２’−アミノ−ＤＮＡモノマー、２’−フルオロ−ＤＮＡモノマー、ＬＮＡモノマー、ＰＮＡモノマー、ＨＮＡモノマー、ＡＮＡモノマー、ＦＡＮＡモノマー、ＣｅＮＡモノマー、ＥＮＡモノマー、ＤＮＡモノマー、およびＩＮＡモノマーから成る群より選択されるヌクレオチド類似体をさらに含む、項目１〜７のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド。
（項目９）
少なくとも２つのＬＮＡヌクレオチド類似体を含む、項目１〜８のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド。
（項目１０）
ホスホロチオエート結合またはボラノホスフェート結合を含む、項目１〜９のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド。
（項目１１）
前記オリゴヌクレオチドは、該オリゴヌクレオチドに相補的な標的ｍＲＮＡのＲＩＳＣ依存性翻訳抑制または分解を媒介することが可能である、項目１〜１０のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド。
（項目１２）
項目１〜１１のいずれかに記載の少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを含む、ＲＮＡ二本鎖。
（項目１３）
１５〜４０個の多数の塩基対を含む、項目１２に記載のＲＮＡ二本鎖。
（項目１４）
１４〜２６個の多数の塩基対を含む、項目１２に記載のＲＮＡ二本鎖。
（項目１５）
少なくとも１つの突出を含む、項目１２〜１４のいずれかに記載のＲＮＡ二本鎖。
（項目１６）
前記突出の長さは、１〜１４個のヌクレオチドである、項目１５に記載のＲＮＡ二本鎖。
（項目１７）
少なくとも１つの３’突出を含む、項目１２〜１５のいずれかに記載のＲＮＡ二本鎖。（項目１８）
前記少なくとも１つの３’突出の長さは、１〜１４個のヌクレオチドである、項目１７に記載のＲＮＡ二本鎖。
（項目１９）
少なくとも１つの平滑末端を含む、項目１２に記載のＲＮＡ二本鎖。
（項目２０）
前記ＲＮＡ二本鎖は、標的ｍＲＮＡに相補的なヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドを含み、ここで、該ＲＮＡ二本鎖は、該標的ｍＲＮＡの発現を低減させる、項目１２〜１９のいずれかに記載のＲＮＡ二本鎖。
（項目２１）
前記ＲＮＡ二本鎖は、非環式モノマーの代わりに天然ＲＮＡモノマーを有する同一のＲＮＡ二本鎖と比較して、オフターゲット効果を低下させる、項目１２〜２０のいずれかに記載のＲＮＡ二本鎖。
（項目２２）
前記ＲＮＡ二本鎖は、非環式モノマーの代わりに天然ＲＮＡモノマーを有する同一のＲＮＡ二本鎖と比較して、有効性を増大または持続させる、項目１２〜２１のいずれかに記載のＲＮＡ二本鎖。
（項目２３）
前記ＲＮＡ二本鎖は、非環式モノマーの代わりに天然ＲＮＡモノマーを有する同一のＲＮＡ二本鎖と比較して、安定性を改善させる、項目１２〜２２のいずれかに記載のＲＮＡ二本鎖。
（項目２４）
前記ＲＮＡ二本鎖は、非環式モノマーの代わりに天然ＲＮＡモノマーを有する同一のＲＮＡ二本鎖と比較して、免疫刺激を低減させる、項目１２〜２３のいずれかに記載のＲＮＡ二本鎖。

Claims (24)

1. 非環式ヌクレオチドモノマーを含むオリゴヌクレオチド。
2. 前記非環式ヌクレオチドモノマーは、２’−３’−セコ−ヌクレオチドモノマーである、請求項２に記載のオリゴヌクレオチド。
3. 前記非環式ヌクレオチドモノマーは、以下のモノマーＤ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、およびＪから成る群より選択され、
   

   

   
   式中、Ｒは、Ｈ、アルキル、コレステロール誘導体、フルオロフォア、ポリアミン、脂肪酸、アミノ酸、単糖類、およびポリペプチドから成る群より選択される、請求項１〜２のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド。
4. １５〜４０個のヌクレオチドモノマーを含む、請求項１〜３のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド。
5. １〜５個の非環式ヌクレオチドモノマーを含む、請求項１〜５のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド。
6. ４個未満の連続的ＤＮＡモノマーを含む、請求項１〜５のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド。
7. ５０％を上回るＲＮＡモノマーを含む、請求項１〜６のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド。
8. ２’−Ｏ−アルキル−ＲＮＡモノマー、２’−アミノ−ＤＮＡモノマー、２’−フルオロ−ＤＮＡモノマー、ＬＮＡモノマー、ＰＮＡモノマー、ＨＮＡモノマー、ＡＮＡモノマー、ＦＡＮＡモノマー、ＣｅＮＡモノマー、ＥＮＡモノマー、ＤＮＡモノマー、およびＩＮＡモノマーから成る群より選択されるヌクレオチド類似体をさらに含む、請求項１〜７のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド。
9. 少なくとも２つのＬＮＡヌクレオチド類似体を含む、請求項１〜８のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド。
10. ホスホロチオエート結合またはボラノホスフェート結合を含む、請求項１〜９のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド。
11. 前記オリゴヌクレオチドは、該オリゴヌクレオチドに相補的な標的ｍＲＮＡのＲＩＳＣ依存性翻訳抑制または分解を媒介することが可能である、請求項１〜１０のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド。
12. 請求項１〜１１のいずれかに記載の少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを含む、ＲＮＡ二本鎖。
13. １５〜４０個の多数の塩基対を含む、請求項１２に記載のＲＮＡ二本鎖。
14. １４〜２６個の多数の塩基対を含む、請求項１２に記載のＲＮＡ二本鎖。
15. 少なくとも１つの突出を含む、請求項１２〜１４のいずれかに記載のＲＮＡ二本鎖。
16. 前記突出の長さは、１〜１４個のヌクレオチドである、請求項１５に記載のＲＮＡ二本鎖。
17. 少なくとも１つの３’突出を含む、請求項１２〜１５のいずれかに記載のＲＮＡ二本鎖。
18. 前記少なくとも１つの３’突出の長さは、１〜１４個のヌクレオチドである、請求項１７に記載のＲＮＡ二本鎖。
19. 少なくとも１つの平滑末端を含む、請求項１２に記載のＲＮＡ二本鎖。
20. 前記ＲＮＡ二本鎖は、標的ｍＲＮＡに相補的なヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドを含み、ここで、該ＲＮＡ二本鎖は、該標的ｍＲＮＡの発現を低減させる、請求項１２〜１９のいずれかに記載のＲＮＡ二本鎖。
21. 前記ＲＮＡ二本鎖は、非環式モノマーの代わりに天然ＲＮＡモノマーを有する同一のＲＮＡ二本鎖と比較して、オフターゲット効果を低下させる、請求項１２〜２０のいずれかに記載のＲＮＡ二本鎖。
22. 前記ＲＮＡ二本鎖は、非環式モノマーの代わりに天然ＲＮＡモノマーを有する同一のＲＮＡ二本鎖と比較して、有効性を増大または持続させる、請求項１２〜２１のいずれかに記載のＲＮＡ二本鎖。
23. 前記ＲＮＡ二本鎖は、非環式モノマーの代わりに天然ＲＮＡモノマーを有する同一のＲＮＡ二本鎖と比較して、安定性を改善させる、請求項１２〜２２のいずれかに記載のＲＮＡ二本鎖。
24. 前記ＲＮＡ二本鎖は、非環式モノマーの代わりに天然ＲＮＡモノマーを有する同一のＲＮＡ二本鎖と比較して、免疫刺激を低減させる、請求項１２〜２３のいずれかに記載のＲＮＡ二本鎖。

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