BRPI0811170B1

BRPI0811170B1 - oligonucleotídeos de rna e complexos de rna substituídos por hidroximetila

Info

Publication number: BRPI0811170B1
Application number: BRPI0811170-7A
Authority: BR
Inventors: Jesper Wengel
Original assignee: Arcturus Therapeutics, Inc
Priority date: 2007-05-22
Filing date: 2008-05-21
Publication date: 2020-12-01
Also published as: HK1138322A1; MY153691A; DK2162538T3; AU2008256871A1; US9303260B2; EP3045535B1; US8314227B2; US20100056768A1; US20150232849A1; JP5726520B2; EP2162538A2; IL202040A; US10457945B2; CN104480112A; JP2015142558A; BRPI0811170A2; EP2162538B1; AU2008256871B2; MX2009012568A; KR101750640B1

Abstract

OLIGONUCLEOTÍDEOS DE RNA E COMPLECOS DE RNA SUBSTITUÍDOS POR HIDROXIMETILA A presente invenção é dirigida a oligonucleotídeos de RNA ou complexos de oligonucleotídeos de RNA, conjuntamente denominados no presente como complexos de RNA, contando pelo menos um, porém opcionalmente mais que um, monômeros(s) de nucleotídeo substituídos por hidroximetila. Por um monômero de nucleotídeo substituído por hidroximetila, entende-se um monômero de nucleotídeo, contendo uma grupo hidroximetila (que pode ser não substituído, O-substituído, por exemplo, por um grupo de conjugação, ou convertido em um grupo aminometila opcionalmente substituído ou conjugado). Este grupo hidroximetila não participa na formação de uma ligação internucleotídica e não é o grupo hidroximetila (contendo o grupo 5'-hidroxila) de um monômero natural do RNA. Os complexos de RNA da invenção podem ser úteis para aplicações terapêuticas, aplicação diagnósticas ou aplicações de pesquisa. Os complexos incluem complexos curtos de RNA interferente (siRna duplos) compreendendo um filamento antissenso e um filamento passageiro contínuo ou interrompido ("filamento senso") capaz de regular a expressão dos genes. Pelo menos um desses filamentos, possivelmente mais que um desses filamentos, são modificadas por um ou mais monômero(s) de nucleotídeo substituído por hidroximetila desta invenção, que podem ser posicionados na extremidade 3', na extremidade (...).

Description

O presente pedido de patente inclui uma listagem de sequências submetida via EFS-Web, um arquivo ASCI criado em 02 de novembro de 2009 e nomeado MD0807PC.txt, cujo tamanho é 30.642 bytes e que está incluído neste documento em sua integralidade.

Fundamentos

O RNA interferente (RNAi) atraiu grande atenção nos últimos anos, já que ele propicia um meio de silenciar a expressão de um gene alvo. Ele oferece à pesquisa básica um método para estudo dos caminhos genéticos e bioquímicos e da função dos genes individuais e dos produtos de genes. Consequentemente, o RNA interferente tornou-se uma ferramenta crítica para a validação do alvo na indústria farmacêutica. Além disso, investimentos substanciais foram feitos com o objetivo de desenvolver complexos de RNA capazes de mediar os complexos de RNA interferente que podem ser usados como drogas.

A atratividade do RNAi para uso em terapia reside na sua sensibilidade e especificidade de sequências. Entretanto, questões foram levantadas a respeito da especificidade das sequências, por exemplo, em razão do filamento incorreto do complexo de RNA poder direcionar a resposta para os ácidos nucleicos de alvos incorretos. Além disso, os complexos de RNA de certo tamanho induzem uma resposta dependente de interferon não específica, o que também é indesejável.

O pedido de patente US2003/0108923 descreve os complexos de RNA capazes de mediar o RNAi, compreendendo um filamento antissenso e um filamento passageiro, onde os filamentos têm 21 a 23 nucleotídeos de comprimento. É sugerido que os complexos de RNA sejam usados para aplicações terapêuticas. Similarmente, o pedido de patente US2005/0234007 descreve os complexos de RNA capazes de mediar o RNAi, compreendendo um filamento antissenso e um filamento passageiro, onde o complexo compreende saliências 3’-.É sugerido que os complexos de RNA sejam usados para aplicações terapêuticas. W02005/073378 descreve os complexos do RNAi contendo nucleotídeos modificados quimicamente capazes de mediar o RNAi, compreendendo um filamento antissenso e um filamento passageiro. Os complexos de RNA descritos na especificação compreendem os resíduos de LNA e é declarado que a incorporação dos resíduos de LNA próximo à extremidade 5’ de um filamento pode controlar qual filamento é incorporado no complexo RISC, em razão do filamento que forma o par de bases mais fraco em sua extremidade 5- ser incorporado no complexo de silenciamento induzido por RNA (RISC, do inglês RNA induced silencing complex). O RNAi é somente uma das várias estratégias para mediar a inibição da expressão de genes usando oligonucleotídeos, incluindo os complexos de RNA desta invenção. Estas diferentes estratégias que incluem abordagens de clivagem de RNA mediada por RNAase H, aglutinação de RNA em bloco estérico, clivagem de RNA mediada por DNAzima ou Ribo- zima e cadeia curta de RNA interferente (siRNA, sigla em inglês) foram descritas na literatura em conjunto com a natureza de nucleotídeos selecionados, modificados quimicamente, que são compatíveis com a atividade biológica [J. Kurreck, Eur. J. Biochem. 2003, 270, 1628],

Os monômeros B-E substituídos por hidroximetila da invenção foram incorporados nos filamentos de DNA e, portanto, foram informados procedimentos para preparação de seus blocos construtores de fosforamidita para síntese automatizada de DNA/RNA [K. D. Nielsen et al., Bioorg. Med. Chem. 1995, 3, 1493; H. Thrane et al., Tetrahedron 1995, 51, 10389; P. Nielsen et al., Bioorg. Med. Chem. 1995, 3, 19].Apenas monômeros de timina foram incorporados nos filamentos de DNA.Nenhum monômero substituído por hidroximetila havia sido anteriormente incorporado nos filamentos de RNA.

Em um relatório, uma ou duas 2’-seco-uridinas foram incorporadas em um oligonu- cleotídeo de DNA e foi observado um efeito positivo na degradação do RNA mediada por RNase H (Mangos MM, Min KL, Viazovkina E, Galarneau A, Elzagheid Ml, Parniak MA, Da- mha MJ., J Am Chem Soc. 2003 Jan. 22;125(3):654-61).

Sumário

A presente invenção propicia complexos de RNA com um ou mais monômeros substituídos por hidroximetila incorporados em um filamento de RNA, para serem usados em relação à regulação genética guiada por RNA na regulação genética guiada por RNA ou na análise de genes, em particular o RNA interferente. Assim, é um objeto de presente invenção propiciar complexos de RNA, que têm efeitos fora do alvo reduzidos quando comparados com os complexos de RNA tipicamente usados. Outro aspecto é propiciar complexos de RNA que induzem uma resposta reduzida do interferon. Ainda outro objeto é o de propiciar complexos de RNA com propriedades aperfeiçoadas em relação à estabilidade da degradação enzimática nas culturas de células ou in vivo. Ainda outro objeto é o de propiciar complexos de RNA que exibem melhor função reguladora de genes, por exemplo, o efeito silenciador de genes, em culturas de células ou in vivo, com relação aos complexos de RNA não modificados. Ainda outros objetos são o de propiciar complexos de RNA que sejam direcionados para órgãos ou tecidos específicos, e que sejam capazes de penetrar na membrana celular. A presente invenção também propicia monômeros adequados para incorporação dos monômeros substituídos por hidroximetila em oligonucleotídeos e métodos para sua síntese.

Breve descrição dos desenhos Figura 1

São mostrados exemplos de diferentes arquiteturas dos nucleotídeos substituídos por hidroximetila que são incorporados nos complexos de RNA. O monômero A é mostrado para comparação e é um monômero de RNA natural com sua estrutura de ribose. A caracte-rística dos monômeros B-E que são compreendidos nos complexos de RNA da invenção é que eles contêm um substituinte que é um grupo hidroximetila (“o grupo de hidroximetila livre”) e, portanto, a invenção é intitulada “Oligonucleotídeos de RNA substituídos por hidro-ximetila e complexos de RNA”. O grupo hidroximetila livre é, por exemplo, ligado ao átomo C4’ de uma estrutura de ribose cíclica ou ao átomo CT de uma estrutura baseada em ribose acíclica. Os nucleotídeos substituídos por hidroximetila da invenção contêm outros átomos de oxigênio, onde cada um deles é ligado a um átomo de fósforo e, assim, participam na formação das ligações entre nucleotídeos (vide Figura 1). Um ou mais destes átomos de oxigênio podem ser parte de um grupo hidroxila, que é o caso quando um ou mais nucleotí-deos substituídos por hidroximetila dos complexos de RNA da invenção são posicionados na extremidade 3’- ou 5’- de um filamento de RNA. Quando um dos nucleotídeos substituídos por hidroximetila dos complexos de RNA da invenção é posicionado na extremidade 3’- e/ou 5’- dos filamentos de RNA, um grupo hidroxila deste monômetro pode ser fosforilado, conforme pode ser o caso de qualquer monômero de RNA natural posicionado terminalmente. Uma base de nucleotídeos como uracila, timina, citosina, 5-metilcitosina, adenina, guanina ou qualquer outra base de nucleotídeos natural ou sintética conhecida ou base de nucleotídeos análoga (designada como “Base” na Figura 1) é afixada aos nucleotídeos substituídos por hidroximetila da invenção.

Figura 2

Variantes derivadas, funcionalizadas e conjugadas dos monômeros substituídos por hidroximetila são mostradas. Como exemplos são mostradas variantes derivadas, funcionalizadas e conjugadas do monômero D de 2’,3’-seco-RNA substituído por hidroximetila (vide Figura 1). O monômetro F contém um grupo R ligado via uma ligação éter. O monômero G contém um grupo R ligado via uma ligação tioéter. O monômero H contém um grupo R ligado via uma ligação amida. O monômero I contém um grupo R ligado via uma ligação amino. O monômero J contém um grupo R ligado via uma unidade de piperazino. Pela incorporação de um ou vários desses monômeros nos complexos de RNA da invenção, as propriedades dos complexos de RNA podem ser moduladas. Por exemplo, pode-se introduzir propriedades de bioestabilidade aumentada, de capacidade aumentada de direcionamento do RNA ou propriedades de entrega específicas e grupos fluorescentes podem ser afixados para fins de detecção.

Figura 3

As estruturas de dois dos monômeros substituídos por hidroximetila (Monômero C e Monômero D) que podem ser um monômero de um complexo de oligonucleotídeo ou de RNA.

Figura 4

Resultados de silenciamento de genes para os complexos de siRNA da invenção contendo o “monômero X” (isto é, o Monômero D do2’,3’-seco-RNA). Os resultados foram obtidos com o filamento senso W130 (vide Figura 4 para sequência de nucleotídeos) contendo o Monômero D contendo uracila como a base de nucleotídeo (mostrado como ‘X’ no o filamento senso W130). A sequência de ácidos nucleicos usada neste estudo está listada na parte inferior desta figura (todos os monômeros X nas sequências antissenso são o Monômero D contendo a uracila como base de nucleotídeos). Os monômeros com um sobrescrito “L” representam um ácido nucleico fechado (por exemplo, TL indica um ácido nucleico fechado de timina ou LNA, sigla em inglês).A Figura 4 apresenta as SEQ ID de números 44 a 52, respectivamente, em ordem de apresentação.

Figura 5

Resultados do silenciamento de genes para os complexos de siRNA da invenção contendo o “monômero X” (isto é, o Monômero D do 2’,3’-seco-RNA). Os resultados foram obtidos com o filamento senso W131 (vide Figura 5 para a sequência de nucleotídeos) contendo o Monômero D, com contendo a uracila como base de nucleotídeo (mostrado como ‘X’ no filamento senso W131). A sequência de ácidos nucleicos dos filamentos antissenso usada neste estudo está listada na parte inferior da Figura 4 (todos os monômeros X nas sequências antissenso são o Monômero D contendo uracila como base de nucleotídeo). A Figura 5 apresenta a SEQ ID No. 53.

Figura 6

Resultados de silenciamento de genes para os complexos de siRNA da invenção contendo o “monômero X” (isto é, o Monômero D do 2’,3’-seco-RNA). Estes resultados foram obtidos com o filamento senso W282 (vide a Figura 6 para a sequência de nucleotídeos) contendo o Monômero D contendo como base de nucleotídeo a citosina (sC, primeiro X a partir da extremidade 5’- da sequência W282), adenina (sA, segundo X a partir da extremidade 5’- da sequência W282) e citosina (sC, último X a partir da extremidade 3’- da sequência W282). A sequência de ácidos nucleicos dos filamentos antissenso usados neste estudo está listada na parte inferior da Figura 4 (todos os monômeros X nas sequências antissenso são o Monômero D contendo uracila como base de nucleotídeo). A Figura 6 a- presenta a SEQ ID No. 54.

Figura 7

Resultados de silenciamento de genes para complexos de siRNA da invenção contendo o “monômero X” (isto é, o Monômero D do 2’,3’-seco-RNA). Estes resultados foram obtidos com o filamento senso W194 (vide a Figura 7 para a sequência de nucleotídeos). A sequência de ácidos nucleicos dos filamentos antissenso usados neste estudo está listada na parte inferior da Figura 4 (todos os monômeros X nas sequências antissenso são o Mo- nômero D contendo a uracila como base de nucleotídeo). Os monômeros com um sobrescrito “L” representam um ácido nucleico fechado (por exemplo, TL indica um ácido nucleico fechado de timina ou LNA).A Figura 7 apresenta a SEQ ID No. 55.

Figura 8

Resultados de silenciamento de genes para complexos de siRNA da invenção contendo o “monômero X” (isto é, o Monômero D do 2’,3’-seco-RNA). Estes resultados foram obtidos com o filamento senso W181 (vide a Figura 8 para a sequência de nucleotídeos). A sequência de ácidos nucleicos dos filamentos antissenso usados neste estudo está listada na parte inferior da Figura 4 (todos os monômeros X nas sequências antissenso são o Monômero D contendo uracila como base de nucleotídeo). Os monômeros com um sobrescrito “L” representam um ácido nucleico fechado (por exemplo, TL indicia um ácido nucleico fechado de timina ou LNA).A Figura 8 apresenta a SEQ ID No. 56.

Figura 9

Resultados de silenciamento de genes para complexos de siRNA da invenção contendo o “monômero X” (isto é, o Monômero D do 2’,3’-seco-RNA). Estes resultados foram obtidos com o filamento senso W129 (vide a Figura 9 para a sequência de nucleotídeos) contendo o Monômero D contendo uracila como base de nucleotídeo (mostrado como ‘X’ no filamento senso W129). Os filamentos antissenso incluídos neste estudo estão listados na parte inferior da Figura 4 (todos os monômeros X nas sequências antissenso são o Monômero D contendo uracila como base de nucleotídeo). Os monômeros com um sobrescrito “L” representam um ácido nucleico fechado (por exemplo, TL indica um ácido nucleico fechado de timina ou LNA).A Figura 9 apresenta a SEQ ID No. 57.

Descrição Detalhada

As características específicas descritas em um aspecto da invenção também se a- plicam a outros aspectos da invenção. Por exemplo, características descritas com relação aos complexos de RNA do primeiro aspecto também se aplicam aos oligonucleotídeos do nono aspecto e aos RNAs duplos do décimo aspecto, conforme apropriado.

Primeiro aspecto, complexos de RNA

Os complexos de RNA na forma de siRNA duplos ou RNA de filamento único podem mediar várias modificações de ácidos nucleicos alvos na célula. Neste processo, o filamento antissenso do complexo age como um guia, uma vez que o filamento antissenso pode hibridizar de modo a se direcionar aos ácidos nucleicos que possuem alongamentos de complementaridade de sequências para o filamento antissenso.

Antes de se direcionar a um ácido nucleico alvo, o filamento antissenso é frequentemente incorporado em um complexo de proteínas guiado por RNA (RGPC, sigla em inglês), que pode atuar sobre o ácido nucleico alvo. Um exemplo de um complexo de proteínas guiado por RNA é o Complexo de Silenciamento Induzido por RNA (RISC, sigla em in-

glês). Acredita-se que outros tais RGPCs existam e que os complexos de RNA da presente invenção serão também vantajosos, quando usados com estes outros RGPCs ou mesmo sem interagir com qualquer RGPCs.

Um objeto da presente invenção é o de estabilizar os complexos de RNA na direção da degradação nucleolítica em meios biológicos (soro, in vivo, em culturas de células).

Outro objeto da presente invenção é o de melhorar o efeito silenciador de genes de um complexo de RNA de filamento duplo. Este aperfeiçoamento pode, por exemplo, se relacionar com o aumento da potência, com a redução dos efeitos fora do alvo, com a redução da estimulação imune, com o aumento da estabilidade para armazenagem, com o aumento da estabilidade em meios biológicos como soro, etc., com o aumento da duração da ação e com o aperfeiçoamento das propriedades farmacocinéticas, todos relacionados com o complexo de RNA nativo não modificado.

Ainda outro objeto da presente invenção é o de aperfeiçoar o efeito silenciador de genes de um oligonucleotídeo de RNA de filamento único. Este aperfeiçoamento pode, por exemplo, se relacionar com o aumento da potência, com a redução dos efeitos fora do alvo, com a redução da estimulação imune, com o aumento da estabilidade para armazenagem, com o aumento da estabilidade em meios biológicos como soro, etc., com o aumento da duração da ação e com o aperfeiçoamento das propriedades farmacocinéticas, todos relacionados com o complexo de RNA nativo não modificado.

Um objeto da invenção é o de assegurar que apenas o filamento antissenso, e não o filamento passageiro, de um complexo de siRNA da invenção mediará as modificações dos ácidos nucleicos alvos. O cumprimento deste objeto propiciará complexos de RNA com menos efeitos fora do alvo.

Outro objeto da invenção é o de assegurar estabilidade suficiente de um complexo de RNA em meios biológicos. Assim, um objeto é o de propiciar complexos de RNA que exibam função reguladora de genes aperfeiçoada, por exemplo, o efeito silenciador de genes, em culturas de células ou in vivo, em relação aos complexos de RNA não modificados.

A ideia básica da invenção é incorporar um ou mais monômeros substituídos por hidroximetila em um complexo de RNA da invenção. No caso do siRNA, isto poderia levar à incorporação preferencial de somente um filamento do complexo no RISC. A incorporação de um ou mais monômeros substituídos por hidroximetila em um (ou mais) filamento(s) de RNA de um complexo de RNA aperfeiçoará o tempo de vida do complexo de RNA em meios biológicos e in vivo, e assim levará ao aperfeiçoamento da atividade biológica, por exemplo, atividade de regulação de genes aperfeiçoada.

Um filamento de RNA de um complexo de RNA da invenção poderá compreender nucleotídeos de RNA naturais, modificações de RNA conhecidas como sendo compatíveis com a atividade de silenciamento de genes [Nawrot e Sipa, Curr. Topics Med. Chem. 2006, 6, 913-925] e os monômeros substituídos por hidroximetila (Figura 1). As ligações de fosfo- diéster podem ligar os monômeros individuais, mas as ligações modificadas, como as ligações de fosforotioato e outras ligações conhecidas por uma pessoa habilitada no campo [Nawrot e Sipa, Curr. Topics Med. Chem. 2006, 6, 913-925] podem ser usados em seu lugar. Os complexos de RNA podem compreender dois filamentos que juntos constituem um siRNA duplo composto de dois filamentos que em conjunto constituem um siRNA duplo composto de um filamento antissenso (o filamento antissenso é também aqui referido como filamento guia) e um filamento passageiro (o filamento passageiro é também aqui referido como um filamento senso), mas uma molécula simuladora de microRNA de filamento único é também considerada aqui como um complexo de RNA da invenção, como o é uma molécula antissenso de filamento único que, por exemplo, é útil para alvejar os microRNAs.

Nas modalidades da invenção, o complexo de RNA compreende um ou mais monômeros de nucleotídeos modificados por hidroximetila (vide Figura 1). Abaixo, como exemplo para tanto, está um monômero de nucleotídeo acíclico, mais preferivelmente um monômero acíclico selecionado do grupo consistindo dos monômeros D a J. Assim, as modalidades descritas no primeiro aspecto com relação aos monômeros de nucleotídeos modificados por hidroximetila aplicar-se-ão a outras modalidades relacionadas com os monômeros nucleotídeos acíclicos.

O uso de monômeros de nucleotídeos substituídos por hidroximetila modificados por hidroximetila pode ser favorecido por várias razões. Eles podem, por exemplo, ser usados para aumentar o efeito silenciador de genes dos complexos de RNA e a incorporação de um ou mais monômero(s) de nucleotídeo modificado por hidroximetila, por exemplo, na direção das extremidades dos complexos de RNA induz à significativa estabilidade na direção da degradação nucleolítica. Eles podem também ser usados para diminuir o efeito silenciador de genes do filamento passageiro de um complexo de siRNA, reduzindo assim o número de efeitos fora-alvo.

Em uma modalidade preferida da invenção, o complexo de RNA compreendo um ou mais monômero(s) de nucleotídeo modificado por hidroximetila é uma estrutura de RNA de filamento único.

Em uma modalidade preferida da invenção, o complexo de RNA compreendendo um ou mais monômero(s) de nucleotídeo modificado por hidroximetila é uma estrutura de RNA de filamento único que é capaz de inibir a expressão genética ao agir como uma molécula antissenso de filamento único.

Numa modalidade preferida da invenção, o complexo de RNA compreendendo um ou mais monômero(s) de nucleotídeo modificado por hidroximetila é uma estrutura de RNA de filamento único que funcionalmente imita um microRNA.

Numa modalidade preferida da invenção, o complexo de RNA compreendendo um ou mais monômero(s) de nucleotídeo modificado por hidroximetila é uma estrutura de siR-NA.

Consequentemente, numa modalidade, o filamento antissenso de uma estrutura de siRNA compreende um ou mais monômero(s) de nucleotídeo modificado de hidroximetila.

Em outra modalidade, o filamento passageiro de uma estrutura de siRNA compreende um ou mais monômero(s) de nucleotídeo modificado por hidroximetila.Em ainda outra modalidade, cada uma das primeira e segunda moléculas de RNA de um filamento passageiro entalhado de uma estrutura de siRNA contêm um ou mais monômero(s) de nucleotídeo modificado por hidroximetila.

Numa modalidade da invenção, o número de monômeros de nucleotídeos modificados por hidroximetila no filamento antissenso é 10.Em outras modalidades da invenção, o número de monômeros de nucleotídeos modificados por hidroximetila no filamento antissenso é 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 ou 1, respectivamente.

Numa outra modalidade, todos os nucleotídeos do filamento antissenso são monômeros de nucleotídeos modificados por hidroximetila.

Numa modalidade preferida, todos os monômeros de nucleotídeos substituídos por hidroximetila no filamento antissenso estão presentes nas posições 1 a 8, onde as posições são contadas a partir da extremidade 5’-. Mais preferivelmente, os monômeros de nucleotídeos modificados por hidroximetila no filamento antissenso estão presentes nas posições 2 a 7, correspondendo à assim chamada região de semente de um microRNA. Assim, a presença dos monômeros de nucleotídeos modificados por hidroximetila nas regiões acima mencionadas impedirão que o filamento antissenso atue como um microRNA, o qual reduz os efeitos fora do alvo quando o filamento antissenso é destinado a funcionar como um siRNA.

Numa modalidade preferida, pelo menos um monômero de nucleotídeo modificado por hidroximetila está presente numa das posições 9 a 16, onde as posições são contadas a partir da extremidade 5’-.Mais preferida é a presença de 2, 3, 4, 5 ou 6 monômeros de nucleotídeos modificados por hidroximetila nas posições 9 a 16 e em outra modalidade, os monômeros de nucleotídeos modificados por hidroximetila no filamento antissenso estão presentes em todas as posições 9 a 16. Numa modalidade, os monômeros de nucleotídeo modificados por hidroximetila estão somente presentes nas regiões 9 a 16 e não no restante do filamento antissenso.

Ainda mais preferivelmente, os monômeros de nucleotídeos modificados por hidroximetila no filamento antissenso estão presentes na posição 9 a 11 e preferivelmente, não no restante do oligonucleotídeo. A presença dos monômeros de nucleotídeos modificados de hidroximetila nas regiões acima mencionadas induzirá o filamento antissenso para atuar como um microRNA, isto é, assegurar que o efeito siRNA será mínimo e o efeito microRNA

muito maior. Este efeito provavelmente surge a partir da diminuição da tendência de realizar aglutinação de comprimento total, devido à afinidade reduzida causada pela presença de um monômero substituído por hidroximetila acíclico, por exemplo, o monômero D.

Similarmente, numa outra modalidade da invenção, o número de monômeros de nucleotídeos modificados por hidroximetila no filamento passageiro de um complexo de siRNA da invenção é 10.Em outras modalidades da invenção, o número dos monômeros de nucleotídeos modificados por hidroximetila no filamento passageiro de um complexo de siRNA da invenção é 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 ou 1, respectivamente.

Numa outra modalidade, todos os nucleotídeos do filamento passageiro de um complexo de siRNA da invenção são monômeros de nucleotídeos modificados por hidroximetila.

Numa modalidade, tanto o filamento antissenso como o filamento passageiro de um complexo de siRNA da invenção contêm um ou mais monômero(s) de nucleotídeo modificado por hidroximetila.

Num aspecto, a presente invenção propicia um complexo de RNA capaz de mediar modificações de ácido nucleico de um ácido nucleico alvo.Tal complexo de RNA pode, por exemplo, ser um siRNA, microRNA ou precursor de microRNA (pré-microRNA).

O complexo de RNA de um complexo de siRNA da invenção compreende uma região central de filamentos duplos compreendendo um filamento antissenso e um filamento passageiro que é hibridizado para o filamento antissenso.

Um ácido nucleico alvo conforme referido no presente contexto é um ácido nucleico que possui significativa complementaridade para com o filamento antissenso do complexo. Preferivelmente, a complementaridade é perfeita e abrange vários nucleotídeos.

Assim, numa modalidade, a complementaridade é perfeita quando abrange 25 nucleotídeos.

Em outras modalidades, a complementaridade é perfeita quando abrange 24 nucleotídeos, 23 nucleotídeos, 22 nucleotídeos, 21 nucleotídeos, 20 nucleotídeos, 19 nucleotídeos, 18 nucleotídeos, 17 nucleotídeos, 16 nucleotídeos, 15 nucleotídeos, 14 nucleotídeos, 13 nucleotídeos, 12 nucleotídeos, 11 nucleotídeos, 10 nucleotídeos, 9 nucleotídeos, 8 nucleotídeos, 7 nucleotídeos ou 6 nucleotídeos, respectivamente.

Em uma modalidade, a abrangência da complementaridade compreende 1 divergência. Em outras modalidades, a abrangência da complementaridade compreende 2 divergências, 3 divergências ou 4 divergências, respectivamente. Uma divergência de 1 é uma região na abrangência da complementaridade onde um par de bases não pode ser formado, por exemplo, quando G é oposta a A. Quando mais divergências estiverem presentes, elas poderão estar adjacentes uma à outra ou podem ser espaçadas em diferentes regiões da abrangência da complementaridade.

Em uma modalidade preferida, o complexo de RNA de um complexo de siRNA da invenção compreende uma região de filamentos duplos central, que é uma região substancialmente de filamentos duplos. As regiões de filamentos únicos no complexo de RNA são primariamente relacionadas às terminações do complexo.

Assim, em uma modalidade, a região de filamentos duplos de um complexo de siRNA da invenção compreende 1 divergência.Em outras modalidades, a região de filamentos duplos compreende 2 divergências, 3 divergências e 4 divergências, respectivamente.

Como usado aqui, o termo “ácido nucleico alvo” compreende qualquer RNA/DNA que estaria sujeito à modulação guiada pelo filamento antissenso, tal como divagem direcionada ou bloqueio estérico. O RNA/DNA alvo poderia, por exemplo, ser DNA genômico, RNA virai genômico, mRNA, um pré-mRNA, ou RNA não-codificador.

Conforme usado aqui, o termo “modificação de ácido nucleico alvo” significa qualquer modificação a um ácido nucleico alvo, incluindo aquelas que afetam a atividade do ácido nucleico alvo, sem afetar a estrutura do ácido nucleico alvo.

Um ácido nucleico alvo preferido da invenção é o mRNA. Consequentemente, numa modalidade, a modificação do ácido nucleico mediada pelo complexo de RNA é o RNA interferente (RNAi). Numa modalidade preferida, o RNAi media a degradação do mRNA. Em outra modalidade, o RNAi media tanto a inibição e como a degradação translacional do mRNA.

Em outras modalidades preferidas, o ácido nucleico alvo é um RNA não-codificador, por exemplo, um tRNA, miRNA, snRNA, snoRNA ou um rRNA.

Em ainda outra modalidade, o ácido nucleico alvo é o DNA genômico. Em tais mo-dalidades, as modificações de ácido nucleico preferidas incluem a metilação do DNA e a exclusão do DNA.

O tamanho do complexo de RNA da invenção pode variar ainda que esteja cumprindo um ou mais objetos da invenção. Isto se aplica, por exemplo, onde o objeto em particular é a redução do efeito fora do alvo.

Assim, a região central de filamentos duplos de um complexo de siRNA da invenção pode compreender um número de pares de bases selecionados do grupo de 10 pares de bases, 11 pares de bases, 12 pares de bases, 13 pares de bases, 14 pares de bases, 15 pares de bases, 16 pares de bases, 17 pares de bases, 18 pares de bases, 19 pares de bases, 20 pares de bases, 21 pares de bases, 22 pares de bases, 23 pares de bases, 24 pares de bases e 25 pares de bases, 26 pares de bases, 27 pares de bases, 28 pares de bases, 29 pares de bases, 30 pares de bases, 35 pares de bases, 40 pares de bases, 42 pares de bases, 45 pares de bases, 50 pares de bases, 55 pares de bases, 60 pares de bases ou 62 pares de bases.

Numa modalidade, a região central de filamentos duplos ou um complexo de siRNA da invenção compreende de 15 a 40 pares de bases.

Em outra modalidade preferida, a região central de filamentos duplos de um complexo de siRNA da invenção compreende 18 a 22 pares de bases.

Numa modalidade, a região central de filamentos duplos de um complexo de siRNA da invenção é ainda mais longa do que 40 pares de bases, embora seja sabido que em algumas células, a introdução do complexo de RNA de filamentos duplos mais longos pode induzir a uma resposta não-específica dependente de interferon. Em tal modalidade, con- templa-se que o complexo é processado em complexos de RNA de filamentos duplos mais curtos antes de se ligar a um RGPC. Uma enzima similar à RNase III tal como DICER pode realizar o processamento. A enzima Dicer também processa o RNA de filamentos duplos mais curtos do que os 40 pares de bases e tais complexos de RNA (referidos como substratos Dicer) apresentam várias vantagens em comparação a um siRNA que entra no RISC sem processamento. Portanto, numa modalidade, os complexos de RNA da invenção são os substratos da enzima Dicer.

Numa outra modalidade, o complexo de RNA tem filamentos únicos e não possui nenhuma região de filamentos duplos.

Em ainda outra modalidade, o complexo de RNA tem filamentos únicos porém des-dobramentos de tal modo que contém uma ou mais regiões de filamentos duplos. Tais modalidades são úteis, por exemplo, para imitação de microRNAs e suas funções.

Ainda numa outra modalidade, a região central de filamentos duplos de um complexo de siRNA da invenção é mais curto do que 10 pares de bases e assim compreende de um a nove pares de bases.

Numa modalidade da invenção, a região central de filamentos duplos do complexo de RNA compreende mais do que dois filamentos de RNA.

Numa modalidade da invenção, a região central de filamentos duplos do complexo de RNA compreende três filamentos de RNA.

Numa outra modalidade da invenção, a região central de filamentos duplos do complexo de RNA compreende quatro ou mais filamentos de RNA.

Numa modalidade preferida da invenção, o complexo de siRNA da invenção compreende saliências. Uma saliência, conforme usado no presente contexto refere-se a uma região de filamentos únicos curtos após uma região de filamentos duplos.

Numa modalidade, o filamento antissenso de um complexo de siRNA da invenção compreende uma saliência 3’-.

Numa outra modalidade, o filamento passageiro de um complexo de siRNA da invenção compreende uma saliência 3’-.

Em ainda outra modalidade, o filamento antissenso de um complexo de siRNA da invenção compreende uma saliência 5’-.

Em ainda outra modalidade, o filamento passageiro de um complexo de siRNA da invenção compreende uma saliência 5’-.

Em uma modalidade preferida, o filamento antissenso e o filamento passageiro de um complexo de siRNA da invenção compreendem uma saliência 3’-.

As saliências de um complexo de siRNA da invenção podem ser diferentes comprimentos, sem interferir com a função básica do complexo. Assim, em uma modalidade, as saliências são selecionadas do grupo de saliências com um comprimento de 1 nucleotídeo, 2 nucleotídeos, 3 nucleotídeos, 4 nucleotídeos, 5 nucleotídeos, 6 nucleotídeos, 7 nucleotídeos e 8 nucleotídeos.

As saliências mais preferidas de um complexo de siRNA da invenção são as saliências com um comprimento de 1, 2 e 3 nucleotídeos, respectivamente.

Numa modalidade, a saliência do filamento antissenso de um complexo siRNA da invenção possui o mesmo comprimento que a saliência do filamento passageiro.

Numa outra modalidade, a saliência do filamento antissenso de um complexo de siRNA da invenção não possui o mesmo comprimento da saliência do filamento passageiro.

Em ainda outra modalidade de um complexo de siRNA da invenção, o complexo de RNA compreende pelo menos uma extremidade cega. Uma “extremidade cega” refere-se à extremidade de um ácido nucleico de filamentos duplos que não possui qualquer nucleotídeo saliente, isto é, com ambos os filamentos das extremidades do ácido nucleico de filamentos duplos na mesma posição.

Numa outra modalidade, o complexo de siRNA da invenção tem a extremidade cega em ambas as extremidades.

Os complexos de RNA preferidos da invenção são similares na estrutura geral aos produtos de processamento da enzima DICER de complexos de RNA de filamentos duplos mais longos. Numa outra modalidade, os complexos de RNA da invenção são os substratos da enzima Dicer conforme mencionado acima.

Outros complexos de RNA preferidos da invenção são complexos onde a região central de filamentos duplos compreende 18 a 22 pares de bases, e onde tanto o filamento antissenso como o filamento passageiro compreendem uma saliência 3’- de 1 a 3 nucleotídeos.

O filamento antissenso do complexo de RNA da invenção pode ter comprimentos variáveis, sem interferir com a função do complexo. Assim, em modalidades preferidas, o filamento antissenso é um 8-mer, 9-mer, 10-mer, 11-mer, 12-mer, 13-mer, 14-mer, 15-mer, 16-mer, 17-mer, 18-mer, 19-mer, 20-mer, 21-mer, 22-mer, 23-mer, a 24-mer, a 25-mer, a 26- mer, a 27-mer, a 28-mer, 29-mer, 30-mer, 31-mer, 32-mer, 33-mer, 34-mer, 35-mer, 36-mer, 37-mer, 38-mer, 39-mer, 40-mer, 41-mer, 42-mer, 43-mer, 44-mer, 45-mer, 46-mer, 47-mer, 48-mer, 49-mer, 50-mer, 51-mer, 52-mer, 53-mer, 54-mer, 55-mer, 56-mer, 57-mer, 58-mer, 59-mer, 60-mer, 61-mer ou um 62-mer, respectivamente.Deve ser entendido que, por e- xemplo, um 19-mer é um filamento antissenso de 19 monômeros, isto é, 19 nucleotídeos.

Em outra modalidade preferida, o filamento antissenso do complexo de RNA é selecionado do seguinte grupo de filamentos antissenso: um 15-mer, 16-mer, 17-mer, 18-mer, 19-mer, 20-mer, 21-mer, 22-mere um 23-mer.

Numa modalidade, o filamento passageiro de um complexo de siRNA da invenção é descontínuo.Numa modalidade de um complexo de siRNA da invenção, o filamento passageiro compreende moléculas de RNA separadas. O número de moléculas de RNA pode ser 1, 2, 3, 4, 5 ou 6.

Numa modalidade, o comprimento das moléculas de RNA individuais do filamento passageiro de um complexo de siRNA da invenção é de mais de 4 monômeros. Em outras modalidades, o comprimento das moléculas de RNA individuais do filamento passageiro é de mais de 5 monômeros, 6 monômeros, 7 monômeros, 8 monômeros, 9 monômeros, 10 monômeros, 11 monômeros e 12 monômeros, respectivamente.

Em outras modalidades, o comprimento das moléculas de RNA individuais do filamento passageiro de um complexo de siRNA da invenção é de menos de 5 monômeros, 6 monômeros, 7 monômeros, 8 monômeros, 9 monômeros, 10 monômeros, 11 monômeros e 12 monômeros, respectivamente.

Numa modalidade da invenção, um filamento passageiro descontínuo de um complexo de siRNA da invenção compreende uma primeira e segunda molécula de RNA que em conjunto formam o filamento passageiro descontínuo, onde a primeira molécula de RNA é hibridizada para a parte a jusante do filamento antissenso e a segunda molécula de RNA é hibridizada para a parte a montante do filamento antissenso.

Numa modalidade, o filamento antissenso de um complexo de siRNA da invenção é descontínuo. As descontinuidades preferidas dos filamentos antissenso são as mesmas das descontinuidades preferidas do filamento passageiro.

Uma descontinuidade de um dos filamentos de um complexo de siRNA da invenção pode ser um entalhe. Um entalhe deve ser entendido como uma descontinuidade de um filamento de um ácido nucleico de filamentos duplos causada pela ausência de uma ligação de fosfodiéster, entretanto, sem a ausência de um nucleotídeo no ácido nucleico de filamentos duplos. Assim, as bases opostas ao entalhe ainda serão hibridizadas para as bases no filamento entalhado.

Outra descontinuidade de um dos filamentos de um complexo de siRNA da invenção é um entalhe alternativo, que é entendido como uma descontinuidade em um filamento de um ácido nucleico de filamentos duplos, causada pela ausência de uma ligação, ou mais de uma ligação na estrutura de açúcar-fosfato, ao invés de uma ligação de fosfodiéster, entretanto, sem a ausência de uma base de nucleotídeo no ácido nucleico de filamentos du- pios. Assim, as bases opostas ao entalhe podem ainda ser hibridizadas às bases no filamento entalhado.

Um espaço vazio usado como uma nominação quando um filamento de RNA de um complexo de RNA da invenção pode ser descrita como tendo uma descontinuidade onde pelo menos um nucleotídeo ou nucleosídeo ou uma base de nucleotídeo estiver faltando no ácido nucleico de filamentos duplos.

Preferivelmente, as extremidades 5’- do complexo de RNA são fosforiladas ou estão disponíveis para fosforilação. “Disponíveis para fosforilação” significa que o grupo 5’- hidroxila não foi bloqueado, por exemplo, pela conjugação direta ou por outra conjugação a outros grupos nas regiões circunvizinhas do grupo 5’-hidroxila, o que impedirá que o grupo 5’-hidroxila seja fosforilado.

Portanto, numa modalidade preferida da invenção, as moléculas de RNA do complexo de RNA compreendem um grupo fosfato com extremidade 5’- e um grupo 3’-hidroxila.

Numa outra modalidade, a segunda molécula de RNA de um complexo de siRNA da invenção compreende um grupo fosfato com extremidade 5’- e um grupo 3’-hidroxila.

Em ainda outra modalidade, o filamento antissenso compreende um grupo fosfato com extremidade 5’- e um grupo 3’-hidroxila.

Em algumas modalidades da invenção, prefere-se que o complexo de RNA compreenda análogos de nucleotídeos em vez de nucleotídeos modificados por hidroximetila. Tais análogos de nucleotídeos que não os nucleotídeos modificados por hidroximetila são denominados abaixo como sendo “nucleotídeos alternativamente modificados”.

O uso de nucleotídeos alternativamente modificados pode ser favorecido por várias razões. Eles podem, por exemplo, ser usados para aumentar a temperatura de fusão da região de filamentos duplos central de um complexo siRNA da invenção.

O uso de nucleotídeos alternativamente modificados pode ser favorecido para aumentar a temperatura de fusão da estrutura de filamentos duplos formada entre o filamento antissenso e o ácido nucleico alvo.

Consequentemente, em uma modalidade, o filamento antissenso compreende nucleotídeos alternativamente modificados.

Numa outra modalidade, o filamento passageiro de um complexo de siRNA da invenção compreende nucleotídeos alternativamente modificados.

Em ainda outra modalidade, uma primeira e segunda molécula de RNA do filamento passageiro de um complexo de siRNA da invenção contêm, cada uma, nucleotídeos alternativamente modificados.

Numa modalidade da invenção, o número de nucleotídeos alternativamente modificados no complexo de RNA é 10.Em outras modalidades da invenção, o número de análogos de nucleotídeos no complexo de RNA é 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 ou 1, respectivamente.

Numa modalidade da invenção, o número de nucleotídeos alternativamente modificados no filamento antissenso é 10.Em outras modalidades da invenção, o número de análogos de nucleotídeos no filamento antissenso é 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 ou 1, respectivamente.

Numa outra modalidade, todos os nucleotídeos do filamento antissenso são nucleotídeos alternativamente modificados ou uma combinação de nucleotídeos alternativamente modificados e nucleotídeos substituídos por hidroximetila.

Similarmente, numa outra modalidade da invenção, o número de análogos de nucleotídeos no filamento passageiro de um complexo de siRNA da invenção é 10.Em outras modalidades da invenção, o número de análogos de nucleotídeos no filamento passageiro é 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 ou 1, respectivamente.

Numa outra modalidade, todos os nucleotídeos do filamento passageiro de um complexo de siRNA da invenção são análogos de nucleotídeos ou uma combinação de nucleotídeos alternativamente modificados e nucleotídeos substituídos por hidroximetila.

Numa modalidade, tanto o filamento antissenso como o filamento passageiro de um complexo siRNA da invenção contêm nucleotídeos alternativamente modificados.

Numa modalidade, os nucleotídeos alternativamente modificados do complexo de RNA são idênticos, isto é, eles são, por exemplo, todos LNA ou todos 2’-O-Me-RNA. Numa outra modalidade, vários nucleotídeos alternativamente modificados diferentes são usados no mesmo complexo de RNA.

Numa modalidade, o complexo de RNA compreende ligações de fosforotioato.

Numa outra modalidade, o complexo de RNA compreende uma mistura de ligações de fosfodiéster e fosforotioato.

Análogos de nucleotídeos preferidos da invenção são os análogos de nucleotídeos selecionados do grupo de monômeros do 2’-O-alquil-RNA, monômeros do 2’-amino-DNA, monômeros do 2’-fluoro-DNA, monômeros do LNA, monômeros do HNA, monômeros do ANA, monômeros do FANA, monômeros do DNA, monômeros do PNA e monômeros do INA, mas outros monômeros podem também ser usados [Nawrot e Sipa, Curr. Topics Med. Chem. 2006, 6, 913-925],

Numa modalidade, o substituinte hidroximetila dos monômeros substituídos por hi-droximetila da invenção é funcionalizado por um grupo de conjugação. Um grupo de conjugação é um grupo conhecido por uma pessoa habilitada na técnica e que muda, amplia ou aperfeiçoa as propriedades de um complexo de RNA da invenção. Tais grupos podem ser úteis para modular a distribuição celular, a distribuição de órgãos, a distribuição de tecidos, as temperaturas de fusão do duplo, a afinidade alvo, a bioestabilidade, a sinalização da hi- bridização, etc.

Numa modalidade, o substituinte hidroximetila dos monômeros substituídos por hi-droximetila da invenção é funcionalizado por uma ligação éter entre um grupo conjugado e o grupo metileno do substituinte hidroximetila. Vide a Figura 2 (Monômero F).

Numa modalidade, o substituinte hidroximetila dos monômeros substituídos por hi-droximetila da invenção é convertido em uma funcionalidade de tioéter antes da incorporação no complexo de RNA da invenção, usando métodos conhecidos por uma pessoa habilitada na técnica. Vide a Figura 2 (Monômero G).

Numa outra modalidade, o substituinte hidroximetila dos monômeros substituídos por hidroximetila da invenção é convertido em uma funcionalidade de mercaptometila antes da incorporação no complexo de RNA da invenção, usando métodos conhecidos por uma pessoa habilitada na técnica. Vide a Figura 2 (Monômero G, R = H). Esta funcionalidade de mercapto é apropriadamente protegida como, por exemplo, seu derivado de acetila durante a síntese do RNA, usando métodos conhecidos por uma pessoa habilitada na técnica.

Numa modalidade, o substituinte hidroximetila dos monômeros substituídos por hi-droximetila da invenção é convertido em uma funcionalidade amina antes da incorporação no complexo de RNA da invenção, usando métodos conhecidos por uma pessoa habilitada na técnica. Vide a Figura 2 (Monômero I, R = H). Esta funcionalidade amina é apropriadamente protegida como, por exemplo, seu derivado de trifluoroacetila ou Fmoc durante a síntese do RNA, usando métodos conhecidos por uma pessoa habilitada na técnica.

Numa modalidade, o substituinte hidroximetila dos monômeros substituídos por hi-droximetila da invenção está atuando como uma alça para fixação dos grupos de conjugação ligados por amida. Isto envolve a conversão da unidade hidroxila do substituinte hidroximetila em uma unidade amina, por exemplo, conforme descrito acima, e ainda a derivação deste grupo amino por um grupo de conjugação, por exemplo, através da formação de ligação de amidas usando métodos conhecidos por uma pessoa habilitada na técnica. Isto pode ocorrer antes da síntese do RNA ou após a síntese do RNA, usando métodos conhecidos por uma pessoa habilitada na técnica (Figura 2, Monômero H).

Numa modalidade, o substituinte hidroximetila dos monômeros substituídos por hi-droximetila da invenção está atuando como uma alça para fixação dos grupos de conjugação ligados por amina. Isto envolve a conversão da unidade hidroxila do substituinte hidroximetila em uma unidade amina, por exemplo, conforme descrito acima, e ainda a derivação deste grupo de amino por um grupo de conjugação, por exemplo, através da formação de ligação de aminas usando métodos conhecidos por uma pessoa habilitada na técnica. Isto pode ocorrer antes da síntese do RNA ou após a síntese do RNA, usando métodos conhecidos por uma pessoa habilitada na técnica (Figura 2, Monômero I).

Ainda numa modalidade, o grupo amina usado para conjugação é um grupo amino, um grupo piperazino ou um grupo diamino-alquila.Tais monômeros são chamados monômeros derivados de amina.Cada um desses grupos pode ser ainda derivado ou conjugado (Figura 2, Monômero J).

Numa modalidade, o complexo de RNA da invenção reduziu os efeitos fora do alvo quando comparado com os complexos de RNA nativos.

Numa modalidade preferida, o complexo de RNA possui pelo menos um monômero substituído por hidroximetila da invenção no filamento antissenso.

Numa outra modalidade preferida, o complexo de RNA possui pelo menos um monômero substituído por hidroximetila da invenção incorporado em ou em torno da chamada região de semente do filamento antissenso, isto é, pelo menos numa das posições n°. 1 a 12 da extremidade 5’- do filamento antissenso.

Ainda numa outra modalidade preferida, o complexo de RNA possui pelo menos um monômero substituído por hidroximetila da invenção incorporado em pelo menos uma das posições n°. 2 a 10 da extremidade 5’- do filamento antissenso.

Ainda numa outra modalidade preferida, o complexo de RNA possui pelo menos um monômero substituído por hidroximetila da invenção incorporado em pelo menos uma das posições n°. 3 a 8 da extremidade 5’- do filamento antissenso.

Ainda numa outra modalidade preferida, o complexo de RNA possui pelo menos um monômero substituído por hidroximetila da invenção incorporado em pelo menos uma das posições n°. 7 ou 8 da extremidade 5’- do filamento antissenso.

Ainda numa outra modalidade preferida, o complexo de RNA possui pelo menos um monômero substituído por hidroximetila da invenção incorporado na posição n°. 7 da extremidade 5’- do filamento antissenso.

Ainda numa outra modalidade preferida, o complexo de RNA possui pelo menos um monômero substituído por hidroximetila da invenção incorporado nas posições n°. 9 a 16 da extremidade 5’- do filamento antissenso.

Ainda numa outra modalidade preferida, o complexo de RNA possui pelo menos um monômero substituído por hidroximetila da invenção incorporado nas posições n°. 9 a 11 da extremidade 5’- do filamento antissenso.

Ainda numa outra modalidade preferida, o complexo de RNA possui pelo menos um monômero substituído por hidroximetila da invenção incorporado nas posições n°. 9 a 10 da extremidade [s/c] ’ do filamento antissenso.

Numa outra modalidade, o complexo de RNA da invenção produz uma resposta i- mune reduzida quando comparado com os complexos de RNA nativos.

Ainda numa outra modalidade, os complexos de RNA da invenção possuem um e- feito prolongado quando comparado com os complexos de RNA nativos.

Ainda numa outra modalidade, os complexos de RNA da invenção possuem um e- feito aumentado quando comparado com os complexos de RNA nativos. Consequentemente, numa modalidade preferida, o complexo de RNA media o RNAi mais eficientemente do que o complexo de RNA nativo, por exemplo, através da degradação mais eficiente do mR-

NA alvo ou através da inibição translacional mais eficiente do mRNA alvo.

Ainda numa outra modalidade, os complexos de RNA da invenção são entregues eficientemente a órgãos ou tecidos específicos de um ser humano ou de um animal.

Ainda numa outra modalidade, os complexos de RNA da invenção são capazes de penetrar na membrana celular eficientemente.

Ainda numa outra modalidade, os complexos de RNA da invenção são capazes de penetrar a membrana celular mais eficientemente do que os complexos de RNA naturais.

Numa modalidade, os complexos de RNA da invenção são capazes de se aglutinarem às proteínas do plasma, o que aumenta a retenção dos complexos de RNA no corpo humano.

Segundo aspecto preparação do complexo de RNA

Outro aspecto da invenção é um método para preparar um complexo de RNA de dois filamentos da invenção, compreendendo a incubação do filamento antissenso com o filamento passageiro sob condições onde um complexo de RNA compreendendo uma região de filamentos duplos central é formada, o dito complexo de RNA sendo capaz de mediar o RNA interferente de um RNA celular correspondente.

Em modalidades alternativas deste aspecto, o complexo de RNA é substituído por um RNA duplo da invenção (décimo aspecto).

Terceiro aspecto, método de mediação da modificação do ácido nucleico

Ainda outro aspecto da invenção é um método de mediar a modificação do ácido nucleico de um ácido nucleico alvo numa célula ou num organismo compreendendo as etapas de: a.Contatar uma célula ou organismo com um complexo de RNA da invenção sob condições onde a modificação de um ácido nucleico alvo pode ocorrer; b.Mediar, deste modo, a modificação de um ácido nucleico alvo.

Em modalidades preferidas, o método de mediar a modificação do ácido nucleico de um ácido nucleico alvo é realizado in vitro.

Em modalidades preferidas, o método de mediação da modificação do ácido nucleico de um ácido nucleico alvo é realizado in vivo, isto é, em animais, em humanos ou em animais não-humanos.

Em modalidades preferidas, o método de mediar a modificação do ácido nucleico de um ácido nucleico alvo é realizado em culturas de células.

Numa outra modalidade, o método é realizado numa célula isolada.

Numa modalidade preferida, a modificação do ácido nucleico do método é o RNA interferente, a degradação preferível do mRNA alvo ou a inibição translacional do mRNA alvo ou a inibição de outros tipos de RNA, por exemplo, o RNA não-codificador.

Numa outra modalidade, a modificação do ácido nucleico é a metilação do DNA.

Em modalidades alternativas deste aspecto, o complexo de RNA é substituído por um oligonucleotídeo da invenção (nono aspecto) ou por um RNA duplo da invenção (décimo aspecto).

Quarto aspecto, método para examinar a função genética

Outro aspecto da invenção é um método para examinar a função de um gene em uma célula ou organismo compreendendo:

A introdução de um complexo de RNA da invenção correspondente ao dito gene na célula ou organismo, deste modo produzindo uma célula de teste ou um organismo de teste; a. A manutenção da célula deteste ou do organismo de teste sob condições sob as quais a modificação de um ácido nucleico alvo pode ocorrer; c. A observação do fenótipo da célula ou organismo de teste produzido na etapa b, e opcionalmente comparando o fenótipo observado com o fenótipo de uma célula de controle ou organismo de controle apropriado, deste modo fornecendo informações sobre a função genética.

O complexo de RNA da invenção pode ser introduzido em células, por exemplo, usando a transfecção, conforme descrito nos exemplos anexos.

O fenótipo do organismo ou célula pode ser observado, por exemplo, usando a pro- teômica para avaliar os níveis de proteína ou utilizando microsséries para avaliar os níveis de RNA. Também um fenótipo mais definido pode ser usado, por exemplo, a expressão de um gene em particular.

As informações obtidas sobre a função de um gene podem ser usadas para determinar se um produto genético é um alvo adequado para intervenção terapêutica em relação a uma doença em particular. Assim, se for demonstrado que certo produto genético atua em certo caminho bioquímico que se sabe pode ser afetado em, por exemplo, um subtipo específico de câncer, o produto genético poderia ser um alvo adequado para a intervenção terapêutica para o tratamento do subtipo de câncer acima mencionado.

Numa modalidade preferida do método de exame da função de um gene em ma célula ou organismo, as modificações do ácido nucleico do método são o RNA interferente, a degradação preferível do mRNA alvo ou a inibição translacional do RNA alvo.

Em modalidades preferidas do método de exame da função de um gene em uma célula ou organismo, o método é realizado em culturas de células, in vitro ou in vivo.

Ainda numa outra modalidade, o método é realizado em uma célula isolada.

Em modalidades alternativas deste aspecto, o complexo de RNA é substituído quer por um oligonucleotídeo da invenção (nono aspecto) ou por um RNA duplo da invenção (décimo aspecto).

Quinto aspecto, método de avaliação do agente

Outro aspecto da invenção é um método para avaliar se um agente atua sobre um produto genético compreendendo as etapas de: a.Introduzir o complexo de RNA da invenção correspondendo ao dito gene numa célula ou organismo, deste modo produzindo uma célula de teste ou organismo de teste; b.Manter a célula de teste ou organismo de teste sob condições sob as quais ocorre a modificação de um ácido nucleico alvo; c.Introduzir o agente na célula de teste ou organismo de teste; d.Observar o fenótipo da célula de teste ou organismo de teste produzido na etapa c, fornecendo deste modo informações sobre se o agente atua ou não no produto genético.

Um controle preferido na etapa d é uma célula de teste ou organismo de teste que não tenha tido o complexo de RNA da etapa a introduzido.

Numa modalidade preferida do método de avaliação se um agente atua ou não sobre um gene ou produto genético, as modificações do ácido nucleico do método são o RNA interferente, a degradação do RNA alvo ou a inibição translacional do RNA alvo. Em outra modalidade, a modificação das modificações do ácido nucleico é a metilação do DNA.

Em modalidades preferidas do método de avaliação se um agente atua ou não sobre um produto genético, o método é realizado em culturas de células, in vitro ou in vivo.

Ainda numa outra modalidade, o método é realizado numa célula isolada.

Em modalidades alternativas deste aspecto, o complexo de RNA é substituído por um oligonucleotídeo da invenção (nono aspecto) ou um RNA duplo da invenção (décimo aspecto).

Sexto aspecto, composição farmacêutica

Ainda outro aspecto da invenção é o complexo de RNA e um diluente, condutor ou adjuvante farmaceuticamente aceitáveis. Será evidente para aquele habilitado na técnica que os complexos de RNA da invenção podem ser projetados para atingir genes e produtos genéticos específicos. Deve ser entendido que os complexos de RNA visarão uma sequência de DNA ou uma sequência de RNA, e não uma proteína. Entretanto, o nível do produto genético tal como uma proteína pode ser afetado indiretamente, se seu mRNA ou um RNA não-codificador for modificado, por exemplo, pela degradação do RNA ou a inibição translacional. Também, a expressão do gene codificando a proteína pode ser afetada, por exemplo, devido à metilação do DNA.

Em modalidades alternativas deste aspecto, o complexo de RNA é substituído quer por um oligonucleotídeo da invenção (nono aspecto) ou um RNA duplo da invenção (décimo aspecto).

Sétimo aspecto, uso como medicamento

Assim, outro aspecto do complexo de RNA da invenção para ser usado como um medicamento. Uma vez que um alvo terapêutico tenha sido validado, aquele habilitado na técnica poderá projetar complexos de RNA que afetem o nível e a atividade do alvo, uma vez que a especificidade dos complexos de RNA reside exclusivamente dentro da sequência do filamento antissenso. Para os complexos de RNA nativos com um filamento passageiro contínuo, o problema com os efeitos fora do alvo ainda permanece, devido ao filamento passageiro atuar como uma sequência guia.

Oitavo aspecto, monômeros

Um aspecto da invenção são os monômeros adequados para incorporação dos monômeros substituídos por hidroximetila da invenção e métodos para seu preparo a partir de materiais de partida prontamente disponíveis. Os derivados de timin-1-il de monômeros substituídos por hidroximetila da invenção foram incorporados nos filamentos de DNA, e foram relatados procedimentos para o preparo de seus blocos de construção de fosforamidi- ta para a síntese automatizada do DNA/RNA [K. D. Nielsen et al., Bioorg. Med. Chem. 1995, 3, 1493; H. Thrane et al., Tetrahedron 1995, 51, 10389; P. Nielsen et al., Bioorg. Med. Chem. 1995, 3,19],

Na maioria das vezes, os complexos de RNA da invenção serão preparados pela síntese de oligonucleotídeos automatizada conforme conhecido por uma pessoa habilitada na técnica. A incorporação dos monômeros substituídos por hidroximetila da invenção em complexos de RNA da implantação desta modalidade segue os métodos padrão para a) a síntese do RNA em um sintetizador de RNA automatizado; b) exames complementares de RNA; c) purificação do RNA e d) isolamento do RNA [F. Eckstein, Oligonucleotides and Analogues, IRL Press, Oxford University Press, 1991]. Os oligonucleotídeos de RNA substituídos por hidroximetila ( = filamentos de RNA) e os complexos de RNA podem ser sintetizados usando derivados de fosforamidita usando técnicas padrão para a síntese do RNA.

Numa modalidade preferida, os métodos de preparação dos derivados de fosforamidita dos monômeros substituídos por hidroximetila da invenção têm início a partir de um ribonucleosídeo, por exemplo, um derivado de DMT com proteção de 05’- de um ribonucle- osídeo que contém, para as bases adenina, guanina, citosina e 5-metilcitosina, grupos de proteção de base como, por exemplo, benzoila, isobutirila, acetila, fenoxiacetila, tert- butilfenoxiacetila ou outros grupos de proteção de base padrão conhecidos por uma pessoa habilitada na técnica.

Numa modalidade preferida, a invenção compreende métodos para preparar blocos construtores monoméricos adequados para a incorporação dos Monômeros D e E, contendo uma ligação 2’,3’-carbono clivado-carbono (nomenclatura de ribonucleosídeo).

Em outras modalidades preferidas, a invenção compreende métodos para preparar blocos construtores monoméricos adequados para a incorporação de Monômeros tais como F a J contendo uma ligação 2’,3’-carbono clivado-carbono e, além disso, portando uma fun-cionalidade ou grupo em, por exemplo, seu átomo de carbono 2’- (nomenclatura de ribonu- cleosídeos) em vez de um grupo hidroxila.

Numa modalidade preferida da invenção, o método de preparo dos derivados de fosforamidita do Monômero D compreende, dentre as etapas principais, a clivagem de 2’,3’- glicol, a redução do intermediário resultante, a proteção seletiva de 02’-, e a fosfitilação de 03’-.

Numa modalidade preferida, a clivagem de 2’,3’-glicol é realizada usando a clivagem oxidativa com, por exemplo, periodato de sódio como reagente.

Numa outra modalidade preferida, a redução do intermediário após a clivagem com periodato de sódio é reduzida ao diol correspondente afetado pelo, por exemplo, borohidreto de sódio.

Para a incorporação do Monômero D nos complexos de RNA da invenção, é necessário proteger o grupo 2’-hidroxila (nomenclatura de ribonucleosídeos). Numa modalidade preferida da invenção, isto é feito pela benzoilação. Pode ser benéfico usar somente ligeiramente mais do que um equivalente do reagente da benzoilação (cloreto de benzoila ou, por exemplo, anidreto de benzoila) para otimizar a seletividade da proteção, isto é, a quantidade de benzoilação de 02’- em relação à benzoilação de 03’-. Numa modalidade preferida, a benzoilação é realizada abaixo da temperatura ambiente.Em outra modalidade útil, a benzoilação é realizada abaixo de 0 °C ou mesmo abaixo de -50 °C.

Em outra modalidade preferida, a proteção de 02’- é feita pela acetilação ou pela realização da acilação usando um reagente de acilação conhecido por uma pessoa habilitada na técnica de síntese orgânica.

Em outra modalidade preferida, a proteção de 02’- é feita pela sililação usando um reagente de sililação e método conhecido por uma pessoa habilitada na técnica da síntese orgânica. Um grupo de proteção de sililação preferido é a tert-butildimetilsilila.

A reação de fosfitilação subsequente encontra-se numa modalidade preferida realizada usando o reagente chamado “PCI” [PCI(OCH2CH2CN)(N(iPr)2)] ou o reagente chamado “bis-amidita” [P(OCH2CH2CN)(N(iPr)2)2J.

Numa modalidade preferida dos métodos de preparo dos derivados de fosforamidita do Monômero D, o material de partida é um ribonucleosídeo, por exemplo, um derivado de DMT com proteção de 05’ de um ribonucleosídeo que, para as bases adenina, guanina, citosina e 5-metilcitosina contém grupos de proteção de base como, por exemplo, benzoila, isobutirila, acetila, fenoxiacetila, tert-butilfenoxiacetila ou outros grupos de proteção de base padrão conhecidos por uma pessoa habilitada na técnica.

Em outra modalidade preferida, a invenção propicia um método de preparo de um derivado de fosforamidita do Monômero E.

Numa modalidade preferida da invenção, o método de preparo dos derivados de fosforamidita do Monômero E compreende, dentre as etapas principais, a clivagem de 2’,3’- glicol, a redução do intermediário resultante, a proteção seletiva de 03’-, e a fosfitilação de 02’-. A proteção de 03’ pode, por exemplo, ser realizada pela sililação ou acilação ou por uma combinação como primeiro a benzoilação de 02’-, então a sililação de 03’- e então a desbenzoilação de 02’-. Outros grupos protetores podem também ser aplicados como poderá ser evidente para uma pessoa habilitada na técnica.

Em outras modalidades preferidas, o método para preparar blocos construtores monoméricos adequados para incorporação dos monômeros como F a J, contendo uma ligação 2’,3’-carbono clivado-carbono e, além disso, portando uma funcionalidade em seu átomo de 2’-carbono (nomenclatura de ribonucleosídeos) que não um grupo hidroxila, compreende, dentre as etapas principais, iniciando a partir de uma clivagem de 2’,3’-glicol de ribonucleosídeo (por exemplo, um ribonucleosídeo de DMT protegido por 05’-), a redução do intermediário resultante, a proteção seletiva de 03’-, a conversão do grupo 2’-hidroxila, a desproteção de 03’- e a fosfitilação de 03’-. A proteção de 03’- pode, por exemplo, ser realizada por sililação ou acilação, ou uma combinação de ambas como primeiro a benzoilação de 02’-, então a sililação de 03’-, e então desbenzoilação de 02’-. Outros grupos de proteção podem também ser aplicados como seria evidente para uma pessoa habilitada na técnica. A conversão do grupo 2’-hidroxila em outro grupo como amino, amino acilado, amino alquilado, amino dialquilado, amino carbamoilado, piperazino, piperazino acilado, piperazino alquilado, piperazino carbamoilado, mercapto, mercapto acilado, mercapto alquilado, dissul- feto, hidroxila acilada, hidroxila alquilada, hidroxila carbamoilada, etc., ou por derivados substituídos e/ou protegidos destes grupos, pode ser realizada usando métodos e procedimentos conhecidos por aquela pessoa habilitada na técnica de síntese orgânica. Tais métodos e procedimentos incluem as reações de substituição em um derivado ativado do grupo 2’-hidroxila ou reações de acilação ou carbamoilação. Tais métodos e procedimentos também incluem reações de alquilação de 02’- e reações de alquilação após a inclusão de outros grupos C2’ anexados, como amino ou mercapto. Ainda outra possibilidade é a oxidação do grupo 2’-hidroxila para propiciar uma funcionalidade de aldeído, que poderá ser ainda modificada pela, por exemplo, reação com nucleófilos, ou para propiciar uma funcionalidade carboxila, que pode ser ainda modificada pela, por exemplo, reação com nucleófilos após a conversão da funcionalidade carboxila em um derivado ativado, tal como um éster ativo.

Numa outra modalidade da invenção, o método para preparar blocos construtores monoméricos adequados para incorporação de Monômeros como F a J, porém “inversos” (como os Monômeros D e E que podem ser considerados “inversos”), de modo que o átomo 02’ seja fosfitilatado e é o grupo 3’-hidroxila que é convertido em outro grupo, de modo que o átomo C3’ seja ligado a uma funcionalidade que não um grupo hidroxila, compreende, dentre as etapas principiais, iniciando a partir de uma clivagem de 2’,3’-glicol de ribonucleosídeo (por exemplo, um ribonucleosídeo de DMT com proteção de 05’-), a redução do intermediário resultante, a proteção seletiva de 02’-, a conversão do grupo 3’-hidroxila, a desproteção de 02’- e a fosfitilação de 02’-. A proteção de 02’- pode, por exemplo, ser realizada por sililação ou acilação, ou uma combinação de ambas. Outros grupos de proteção podem também ser aplicados como seria evidente para uma pessoa habilitada na técnica. A conversão do grupo 3’-hidroxila em outro grupo como amino, amino acilado, amino alquilado, amino dialquilado, amino carbamoilado, piperazino, piperazino acilado, piperazino alquilado, piperazino carbamoilado, mercapto, mercapto acilado, mercapto alquilado, dissulfeto, hidroxila acilada, hidroxila alquilada, hidroxila carbamoilada, etc., ou por derivados substituídos e/ou protegidos destes grupos, pode ser realizada usando métodos e procedimentos conhecidos por aquela pessoa habilitada na técnica de síntese orgânica. Tais métodos e procedimentos incluem as reações de substituição em um derivado ativado do grupo 3’- hidroxila ou reações de acilação ou carbamoilação. Tais métodos e procedimentos também incluem reações de alquilação de 03’- e reações de alquilação após a inclusão de outros grupos C3’ anexados, como amino ou mercapto. Ainda outra possibilidade é a oxidação do grupo 3’-hidroxila para propiciar uma funcionalidade de aldeído, que poderá ser ainda modificada pela, por exemplo, reação com nucleófilos, ou para propiciar uma funcionalidade car- boxila, que pode ser ainda modificada pela, por exemplo, reação com nucleófilos após a conversão da funcionalidade carboxila em um derivado ativado, tal como um éster ativo.

Numa modalidade, um derivado de 2’-C-piperazino é preparado pela conversão do grupo 2’-hidroxila em um grupo de saída (por exemplo, derivado de mesilato) seguido pela reação com um grande excesso de piperazina. Isto pode ser realizado, por exemplo, como uma etapa na direção da síntese de um fosforamidita da estrutura de Amidita J (vide a figura abaixo).

Ainda numa outra modalidade, a invenção compreende métodos para preparar blocos construtores monoméricos adequados para incorporação dos monômeros substituídos por hidroximetila da invenção portando grupos ou funcionalidades no átomo C1’ (nomenclatura de ribonucleosídeos), que é diferente de uma base de nucleotídeo natural. Tais grupos ou funcionalidades, que podem conter grupos de proteção, incluem, por exemplo, pireno, perileno, fluoróforos, hidrogênio, alquila, grupos reativos e heterociclos que não as bases de nucleotídeos naturais.

Em ainda outra modalidade, a invenção compreende métodos para preparar blocos construtores monoméricos adequados para incorporação dos monômeros substituídos por hidroximetila da invenção que são constituídos como derivados de H-fosfonato, ao invés de vez de derivados de fosforamidita.

Abaixo estão ilustrados exemplos de estruturas de algumas modalidades preferidas da invenção com relação aos blocos construtores de fosforamidita (=amidita) (DMT = 4,4’- dimetoxitritil; Base = base de nucleotídeo natural; CEtO = cianoetóxi):

R= alquila, derivado de colesterila, fluoróforo, poliaminas, ácidos graxos, aminoácidos, sacarídeos ou peptídeos, etc.

Nono aspecto, oligonucleotídeo compreendo oligonucleotídeos acíclicos

Um nono aspecto da invenção é um oligonucleotídeo compreendendo um monômero de nucleotídeo acíclico. Como ficará evidente a partir da descrição e da seção de exemplos, tal oligonucleotídeo possui vários usos e vantagens.

Numa modalidade preferida, o monômero de nucleotídeo acíclico é um monômero 2’-3’-seco-nucleotídeo. Surpreendentemente, descobriu-se que os oligonucleotídeos da invenção compreendendo monômeros de nucleotídeos acíclicos são substratos de enzimas celulares do maquinário do RNAi e, em alguns casos, esses oligonucleotídeos são substratos ainda melhores do que um oligonucleotídeo idêntico sem monômeros de nucleotídeos acíclicos.

Preferivelmente, o monômero de nucleotídeo acíclico é selecionado do grupo consistindo do monômero E, F, G, H, I ou J (vide a Figura 1). Como ficará evidente para a pessoa habilitada na técnica, G, F, H, I e J podem ser todos fabricados a partir de precursores sintéticos do monômero D. Conforme indicado na figura 2, os monômeros acíclicos pode ser transformados em derivados transportando grupos tais como derivados de colestorila, alquila, fluoróforos, poliaminas, aminoácidos, sacarídeos, polipeptídeos, etc. Tais grupos de conjugação podem, por exemplo, ser úteis para melhor bioestabilidade e/ou biodistribuição quando o oligonucleotídeo for usado para a modulação da atividade dos mRNAs alvos em células, órgãos ou organismos.

O oligonucleotídeo tem preferivelmente o comprimento de 10 a 40 monômeros de nucleotídeos. Ainda mais preferível é um comprimento de 18 a 30 monômeros de nucleotídeos.

Numa modalidade preferida, o oligonucleotídeo da invenção compreende menos de 5 monômeros de nucleotídeos acíclicos. Em outra modalidade preferida, o oligonucleotídeo compreende não mais do que 1 monômero de nucleotídeo acíclico por 5 monômeros de nucleotídeos que não monômeros de nucleotídeos acíclicos. Mais ainda preferido é não mais do que 1 monômero acíclico por 8 monômeros de nucleotídeos que não monômeros de nucleotídeos acíclicos. Se o número de monômeros de nucleotídeos acíclicos for muito alto, a afinidade de aglutinação dos oligonucleotídeos da invenção a um ácido nucleico complementar fica comprometida.

Assim, numa outra modalidade, o oligonucleotídeo compreende desde 1 a 5 monômeros de nucleotídeos acíclicos.

Numa modalidade preferida, os monômeros de nucleotídeos acíclicos estão somente presentes em uma ou mais posições de 1 a 8 e mais preferivelmente nas posições 2 a 7 do oligonucleotídeo. As posições são contadas a partir da extremidade 5’- do oligonucleotídeo. Os monômeros de nucleotídeos acíclicos nestas regiões reduzirão ou impedirão que o oligonucleotídeo atue como um microRNA, já que essas posições correspondem à chamada região de semente de um microRNA. Isto é relevante, por exemplo, quando o oligonucleotídeo se destina a funcionar como um filamento guia de um siRNA.

Numa modalidade preferida, todos os monômeros de nucleotídeos modificados por hidroximetila no filamento antissenso estão presentes nas posições 9 a 16, onde as posições são contadas a partir da extremidade 5’-. Ainda mais preferivelmente, os monômeros de nucleotídeos modificados por hidroximetila no filamento antissenso estão presentes na posição 9 a 11. Assim, a presença dos monômeros de nucleotídeos modificados por hidroximetila nas regiões acima mencionadas induzirão o filamento antissenso a atuar como um microRNA, isto é, assegurará que o efeito do siRNA seja mínimo e o efeito do microRNA muito maior. Este efeito provavelmente tem origem da tendência reduzida de aglutinação de comprimento total devido à afinidade reduzida causada pela presença de um monômero substituído por hidroximetila acíclico, por exemplo, o monômero D.

Numa modalidade preferida, o oligonucleotídeo não compreende sequências de

DNA de mais de 8 monômeros de DNA consecutivos.Mais ainda preferido, não mais de 6 monômeros de DNA consecutivos e mais preferivelmente não mais de 4 monômeros de DNA consecutivos. Os monômeros de DNA consecutivos tipicamente permitirão que o oli- gonucleotídeo ative a RNase H quando ligados a um RNA complementar, o que leva à degradação do RNA. Em algumas modalidades da invenção, isto não é desejável.Assim, em outra modalidade, o oligonucleotídeo não contém nenhum monômero de DNA.

Em outras modalidades, a ativação da RNase H é recomendável e prefere-se que o oligonucleotídeo compreenda mais de 4 monômeros de DNA consecutivos, mais preferivelmente mais de 6 monômeros de DNA e mais preferivelmente mais de 8 monômeros de DNA.

Ainda numa outra modalidade, o oligonucleotídeo compreende mais de 50% de monômeros de RNA. Um alto grau de monômeros de RNA facilitará a interação com as proteínas de interação com o RNA, por exemplo, pelo funcionamento de um substrato ou guia (ou cofator) para uma enzima celular tal como o RISC.

Assim, numa outra modalidade, é preferido que mais de 80% dos monômeros do o- ligonucleotídeo sejam monômeros de RNA. Ainda numa outra modalidade, é preferido que mais de 90% dos monômeros do oligonucleotídeo sejam monômeros de RNA.

Como será evidente, o oligonucleotídeo pode também compreender análogos de monômeros de nucleotídeos. Numa modalidade como esta, os monômeros de nucleotídeos acíclicos e os monômeros de RNA perfazem mais de 80% de todos os monômeros de nucleotídeos. Numa outra modalidade, os monômeros acíclicos e os monômeros de RNA perfazem mais de 90% de todos monômeros de nucleotídeos.

Quando o oligonucleotídeo compreende análogos de monômeros de nucleotídeos, é preferido que eles sejam selecionados do grupo consistindo em monômeros de 2’-O- alquila-RNA, monômeros de 2’-amino-DNA, monômeros de 2’-fluoro-DNA, monômeros de LNA, monômeros de PNA, monômeros de HNA, monômeros de ANA, monômeros de FANA, monômeros de CeNA, monômeros de ENA, monômeros de DNA e monômeros de INA. Análogos de nucleotídeos são tipicamente usados para modular a afinidade de aglutinação, aumentar a bioestabilidade e em geral e propiciar ao oligonucleotídeo mais propriedades simi-lares à droga.

Numa modalidade, o oligonucleotídeo compreende pelo menos 2 análogos de nucleotídeo de LNA. Os monômeros de nucleotídeos acíclicos tipicamente diminuem a temperatura de fusão (isto é, a afinidade de aglutinação) do oligonucleotídeo da base da invenção emparelhada a um ácido nucleico complementar e monômeros de nucleotídeos de LNA podem ser usados para neutralizar esta diminuição na temperatura de fusão, isto é, numa modalidade, o número de monômeros de nucleotídeos acíclicos é idêntico ao número de monômeros de nucleotídeos de LNA.

Numa modalidade preferida, o oligonucleotídeo compreende somente monômeros acíclicos e monômeros de RNA.

Numa outra modalidade preferida, o oligonucleotídeo compreende somente monômeros de nucleotídeo acíclicos, monômeros de RNA e análogos de nucleotídeos de LNA.

Numa modalidade preferida, o oligonucleotídeo da invenção compreende uma ou mais ligações selecionadas do grupo consistindo de ligação de fosforotioato, ligação de bo- ranofosfato, ligação de etilfosfonato, ligação de fosforamidato e ligação de fosfotriéster. Mais preferidas é uma ligação de fosforotioato e/ou uma ligação de boranofosfato. Estas ligações aperfeiçoam a bioestabilidade do oligonucleotídeo e também comprovaram ter um efeito positivo na biodistribuição do oligonucleotídeo. Numa modalidade preferida, o oligonucleotídeo compreende mais de 50% das ligações internucleotídeos acima mencionados e ainda mais preferivelmente mais de 75%.Numa modalidade, todas as ligações internucleotídeos são dos tipos acima mencionados.

Numa modalidade preferida, o oligonucleotídeo da invenção não tem a base emparelhada a um oligonucleotídeo complementar, isto é, o oligonucleotídeo da invenção tem filamento único.

Ainda numa outra modalidade, o oligonucleotídeo é capaz de mediar a repressão ou degradação translacional dependente de RISC dos mRNAs alvos complementares ao oligonucleotídeo. A pessoa habilitada na técnica reconhecerá o RISC como sendo o Complexo de Silenciamento Induzido pelo RNA e entenderá que nesta modalidade, o oligonucleotídeo atuará como uma sequência guia para o RISC e, deste modo, guiará o RISC para os oligonucleotídeos do RNA, tipicamente os mRNAs que portam complementaridade parcial ou total ao oligonucleotídeo da invenção. Quando o oligonucleotídeo guia o RISC para os alvos mRNA da complementaridade parcial, o oligonucleotídeo pode ser visto como uma imitação do microRNA e quando o oligonucleotídeo guia o RISC para os alvos do mRNA de complementaridade total, isto pode ser visto como um siRNA de filamentos únicos ou duplos.

A dependência do RISC pode ser avaliada nas linhas celulares através de silenciar os componentes do RISC usando o siRNA contra os mRNAs codificando os componentes do RISC e avaliando a atividade do oligonucleotídeo da linha celular de silenciamento. Tais experimentos são bem conhecidos daqueles habilitados na técnica.

Décimo aspecto, RNA duplo compreendendo o oligonucleotídeo da invenção

Um décimo aspecto da invenção é um RNA duplo compreendendo um primeiro oligonucleotídeo de acordo com a invenção e um segundo oligonucleotídeo.

Numa modalidade preferida, o segundo oligonucleotídeo do RNA duplo é também um oligonucleotídeo da invenção.

Como será evidente, muitas das características descritas com relação aos complexos de RNA da invenção no primeiro aspecto, são também aplicáveis aos RNAs duplos do décimo aspecto. Preferivelmente, o RNA duplo da invenção compreende um número de bases de pares de 15 a 40 e numa modalidade preferida, compreende um número de bases de pares selecionados do grupo de 18 bases de pares, 19 bases de pares, 20 bases de pares, 21 bases de pares, 22 bases de pares e 23 bases de pares.

Ainda numa outra modalidade, o RNA duplo compreende um número de bases de pares de 25 a 30, mais preferivelmente de 26 a 28 e mais preferivelmente 27 bases de pares. Tais RNAs duplos podem ser referidos como RNAs substratos da enzima dicer.

Numa modalidade preferida, o RNA duplo da invenção compreende uma saliência.

Numa outra modalidade, o RNA duplo compreende duas saliências.

Ainda numa outra modalidade, o primeiro oligonucleotídeo compreende uma saliência 3’-.

Em ainda outra modalidade, o segundo oligonucleotídeo compreende uma saliência 3’-.

Preferivelmente, o comprimento de uma saliência se inclui desde 1 a 8 nucleotídeos e ainda mais preferivelmente, o comprimento da saliência é selecionado do grupo consistindo em saliências com um comprimento de 1 nucleotídeo, 2 nucleotídeos e 3 nucleotídeos.

Numa outra modalidade, o RNA duplo compreende pelo menos uma extremidade cega.

Numa outra modalidade, o RNA duplo tem extremidade cega em ambas as extremidades.

Numa modalidade preferida, o RNA duplo compreende uma região de filamentos duplos de 18 a 22 bases de pares, onde tanto o primeiro oligonucleotídeo como o segundo oligonucleotídeo compreendem uma saliência 3’- de 1 a 3 nucleotídeos. Tal RNA duplo será reconhecido como um siRNA canônico (RNA interferente curto).

Numa modalidade, um filamento do RNA duplo é descontínuo conforme descrito detalhadamente no primeiro aspecto.

Numa modalidade, o RNA duplo é capaz de mediar a repressão ou degradação translacional do mRNA alvo complementar ao primeiro ou segundo oligonucleotídeo do RNA duplo, isto é, o RNA duplo funcionará como, por exemplo, um siRNA, microRNA ou pré- microRNA.

Numa modalidade, o RNA duplo é capaz de mediar a repressão ou degradação translacional do mRNA alvo enquanto induz à redução dos efeitos fora do alvo quando comparado com um RNA duplo idêntico com monômeros de RNA ao invés de monômeros acíclicos. A redução dos efeitos fora do alvo pode ser atingida devido à diminuição da afinidade de aglutinação e também devido ao primeiro ou segundo oligonucleotídeo poder ser modifi- cado de tal modo que não seja capaz de funcionar como um filamento guia para o RISC, isto é, é possível controlar qual oligonucleotídeo do RNA duplo funciona como filamento passageiro (filamento senso) e qual funcionará como filamento guia (filamento antissenso).

Numa outra modalidade, o RNA duplo é capaz de mediar a repressão ou degradação translacional do mRNA alvo enquanto induz à redução dos efeitos fora do alvo quando especificamente um monômero acíclico é posicionado na posição 5 a 10 no filamento guia (antissenso) de um siRNA duplo, onde a posição é contada a partir da extremidade 5’- do oligonucleotídeo.

Numa outra modalidade, o RNA duplo é capaz de mediar a repressão ou degradação translacional do mRNA alvo enquanto induz à redução dos efeitos fora do alvo quando especificamente um monômero acíclico é posicionado na posição 6 a 8 no filamento guia (antissenso) de um siRNA duplo. Sem a intenção de se prender à teoria, acredita-se que a redução da afinidade de aglutinação induzida pela presença do monômero acíclico nestas posições é o que leva à redução da capacidade do filamento guia de induzir os efeitos do tipo microRNA, isto é, o monômero acíclico, quando posicionado corretamente, reduz a chamada aglutinação da região de semente, o que se presume ser mais importante para a atividade do microRNA do que para a atividade do siRNA.

Numa modalidade, o RNA duplo é capaz de mediar o direcionamento do RNA, por exemplo, o silenciamento do gene ou o RNA interferente, com aumento da potência quando comparado com um RNA duplo idêntico com monômeros de RNA ao invés de monômeros acíclicos. O aumento na potência pode ser atingido devido ao aumento na dissociação dos produtos de clivagem da reação do RISC. A dissociação pode ser aumentada devido à diminuição na afinidade de aglutinação. Também a flexibilidade aumentada do substrato pode aumentar a taxa da hidrólise. Além disso, a flexibilidade aumentada pode facilitar o desenro- lamento do RNA duplo antes do carregamento do filamento guia para o RISC.

Numa modalidade, o RNA duplo é capaz de mediar a repressão ou degradação translacional do mRNA alvo com potência prolongada quando comparado com um RNA duplo idêntico com monômeros de RNA ao invés de monômeros acíclicos. A potência prolongada pode, por exemplo, ser obtida devido aos oligonucleotídeos do RNA duplo e o próprio duplo serem um substrato mais fraco para as exo- e endonucleases e, deste modo, a estabilidade dos oligonucleotídeos e do duplo é aumentada.

Numa modalidade, o RNA duplo é capaz de mediar a repressão ou degradação translacional do mRNA alvo, onde o RNA duplo tem bioestabilidade aperfeiçoada quando comparado com um RNA duplo idêntico com monômeros de RNA ao invés de monômeros acíclicos.

Ainda numa outra modalidade, o RNA duplo é capaz de mediar a repressão ou degradação translacional do mRNA alvo, onde o RNA duplo te redução da estimulação imune quando comparado com um RNA duplo idêntico com monômeros de RNA ao invés de monômeros acíclicos. Uma razão para a estimulação imune é a interação com os receptores semelhantes ao do tipo “Toll” que reconhecem os oligonucleotídeos estranhos. Visto que os RNAs duplos da invenção não são naturais, eles serão mais difíceis de serem detectados pelos receptores semelhantes ao do tipo “Toll”. Referências US2003/0108923 US2005/0234007 W02005/073378 J.Kurreck, Eur. J. Biochem. 2003, 270,1628 K.D. Nielsen etal., Bioorg. Med. Chem. 1995, 3,1493 H. Thrane etal., Tetrahedron 1995, 51, 10389 P. Nielsen et al., Bioorg. Med. Chem. 1995, 3, 19 Nawrot e Sipa, Curr. Topics Med. Chem. 2006, 6, 913-925 F. Eckstein, Oligonucleotídeos and Analogues, IRL Press, Oxford University Press, 1991 M. Petersen e J. Wengel, Trends Biotechnol. 2003, 21, 74-81 Pfundheller, Sorensen, Lomholt, Johansen, Koch and Wengel, J. "Locked Nucleic Acid Synthesis", Methods Mol. Biol. 2004, vol. 288 (OligonucleotideoSynthesis), 127-145., P. Herdewijn, Ed., Humana Press Inc. Furniss, Hannaford, Smith e Tatchell, Vogel’s Textbook of Organic Chemistry, 1989, John Wiley & Sons Bryld, Hojland e Wengel, Chem. Commun. 2004,1064 Mokhir, Tetzlaff, Herzberger, Mosbachere Richart, J. Comb. Chem. 2001, 3, 374 Mangos MM, Min KL, Viazovkina E, Galarneau A, Elzagheid Ml, Parniak MA, Da- mha MJ., J Am Chem Soc. 2003 Jan 22;125(3):654-61

Procedimentos experimentais e exemplos Exemplo 1. Síntese dos complexos de RNA da invenção.

Foram informados procedimentos para preparação dos blocos construtores de fos-foramidita para síntese automatizada do DNA/RNA dos complexos de RNA da invenção [derivados de timina; K. D. Nielsen et al., Bioorg. Med. Chem. 1995, 3, 1493; H. Thrane et al., Tetrahedron 1995, 51, 10389; P. Nielsen et al., Bioorg. Med. Chem. 1995, 3, 19]. Vide o E- xemplo 11 para uma divulgação dos procedimentos para preparação dos derivados de fosfo-ramidita exemplares de adenina, guanina, citosina e uracila.

A incorporação desses monômeros substituídos por hidroximetila nos complexos de RNA da invenção segue os métodos padrão para a) síntese do RNA em um sintetizador de RNA automatizado; b) exames complementares de RNA; c) purificação do RNA; e d) isola mento do RNA [F. Eckstein, Oligonucleotides and Analogues, IRL Press, Oxford University Press, 1991]. Isto demonstra que os oligonucleotídeos de RNA substituídos por hidroximetila (= filamentos de RNA) e os complexos de RNA podem ser sintetizados usando derivados de fosforamidita conhecidos, usando técnicas padrão para a síntese do RNA. 5O LNA é um oligonucleotídeo contendo um ou mais ribonucleotídeos ligados ao 2’- O,4’-C-metileno (nucleotídeos LNA) [M. Petersen e J. Wengel, Trends Biotechnol. 2003, 21, 74-81]. O siRNA modificado pelo LNA é uma estrutura de siRNA contendo um ou mais monômeros LNA. Métodos conhecidos foram usados para incorporar os nucleotídeos LNA nos complexo de RNA para a invenção, através do uso de fosforamiditas LNA disponíveis co- 10 mercialmente [Pfundheller, Sorensen, Lomholt, Johansen, Koch e Wengel, J. "Locked Nucleic Acid Synthesis", Methods Mol. Biol. 2004, vol. 288 (OligonucleotideoSynthesis), 127-145., P. Herdewijn, Ed., Humana Press Inc.]. O siRNA substituído pela hidroximetila (“RNA interferente pequeno substituído por hidroximetila) é uma estrutura de siRNA contendo um ou mais monômeros de nucleotídeos 15 substituídos por hidroximetila (vide a Figura 1 para estruturas do monômero de nucleotídeo substituído por hidroximetila). Os monômeros exemplificados estão mostrados abaixo:

30Monômero C (Ç, T)Monômero D (X) Oligonucleotídeos - Filamentos antissenso nas estruturas de siRNA: RNA nativo5’-ACU UGU GGC CGU UUA CGU CGC U (SEQ ID No.: 1) JW11O35’-ACU UGU GGC CGU UUA CGU CGLCMeL U (SEQ ID No.: 2) 35JW11865’-ACU UGT GGC CGU UUA CGU CGLCMeL U (SEQ ID No.: 3) JW11875’-ACI UGT GGC CGU UTA CGT CGLCMeL U (SEQ ID No.: 4) W1235-ACU UGX GGC CGU UUA CGU CGLCMeL U (SEQ ID No.: 5) W1245-ACX UGU GGC CGU UUA CGU CGLCMeL U (SEQ ID No.: 6) W1255’-ACU UGU GGC CGU UUA CGX CGLCMeL U=(SEQ ID No.: 7) 40W1265’-ACU UGU GGC CGX UUA CGU CGLCMeL U=(SEQ ID No.: 8) W1275’-ACU UGU GGC CGU UUA CGT CGX U=(SEQ ID No.: 9) W1285’-ACX UGU GGC CGU UUA CGT CGX U=(SEQ ID No.: 10) Oligonucleotídeos - Filamentos senso selecionados nas estruturas de siRNA: RNA nativo5’-GAC GUA AAC GGC CAO AAG UUC U=(SEQ ID No.: 11) JW11O45’-GAC GUA AAC GGC CAC AAG UTLCMeL U=(SEQ ID No.: 12) JW11O65’-GACMeL GUA AACMeL GGC CACMeL AAG UTLCMeL U=(SEQ ID No.: 13) JW11885’-GAC GUA AAC GGC CAC AAG TTC (SEQ ID No.:14) W0435’-GAC GUA AAC GGC CAC AAG UJÇ U=(SEQ ID No.: 15) W0445’-GAÇ GJA AAC GGC ÇAÇ AAG UTÇ U (SEQ ID No.: 16) JW11895-GAC GTA AAC GGC CAC AAG TTC=(SEQ ID No.: 17) W1295’-GAC GXA AAC GGC CAC AAG UTLCMeL U (SEQ ID No.: 18) W1305’-GAC GXA AACXGGC CAC AAG UTLCMeL U (SEQ ID No.: 19) W1315-GAC GUA AAC GGC CAC AAG UUX U=(SEQ ID No.: 20) W1325’-GAC GXA AAC GGC CAC AAG UUX U (SEQ ID No.: 21) Outros filamentos de RNA substituídos por hidroximetila que foram sintetizados: 5’-ACU UGU GGC CGU UUA CGU ÇGÇ U (SEQ ID No.: 22) 5’-GAÇ GIA AAÇ G (SEQ ID No.: 23) 5’-GC ÇAÇ AAG UTÇ U (SEQ ID No.: 24) -“L” em sobrescrito indica que o resíduo é um nucleotídeo LNA. -“MeL” em sobrescrito indica que o resíduo é um nucleotídeo LNA com uma base 5- metilcitosina. -T em negrito sublinhado é um monômero de nucleotídeo substituído por hidroximetila. Neste exemplo é o derivado timin-1-il do Monômero C do C4’-ramificado-RNA (vide Figura 1). -Ç em negrito sublinhado é um monômero(s) de nucleotídeo substituído por hidroximetila. Neste exemplo é o derivado 5-metilcitosin-1-il do Monômero C do C4’-ramificado- RNA (vide Figura 1). -X em negrito sublinhado é um monômero de nucleotídeo acíclico substituído por hidroximetila. Nas sequências acima é o derivado uracil-1-il do Monômero D do 2’,3’-seco- RNA (vide Figura 1). Em outros exemplos e figuras são outras variantes de bases que não incluem o uracil. Vide os Exemplos 9 e 10 para outras sequências estudadas.

Estudos celulares (linha celular de câncer de pulmão expressando EGFP) foram realizados. Como exemplos para ilustrar a invenção são usados duplos contendo duas ou três saliências de nucleotídeos. Este desenho de exemplo é somente uma ilustração e muitas outras estruturas são incluídas na invenção e operam similarmente. Assim são, por exemplo, os siRNA duplos com extremidade cega, siRNA duplos mais curtos ou mais longos do que aqueles exemplificados e os filamentos antissenso de filamento único incluídos. Similarmente estão incluídos os complexos de RNA compreendendo um filamento antissenso e um filamento passageiro interrompido (o “filamento passageiro” também pode ser chamadode “filamento senso”).

Exemplo 2. Procedimento de recozimento e transfecção para os complexos de siRNA da invenção.

Células foram colocadas em placas de seis poços e cultivadas à confluência de 40 a 60%. Imediatamente antes da transfecção, as células foram recolocadas em 1 mL de meio de cultura completo por poço. Os filamentos de senso e antissenso foram misturados em uma solução tampão de recozimento (10 mM Tris-HCI, pH 7,3, 50 mM de NaCI) em concentração de 20 μM para cada e foram incubadas a 95 °C por 1 min. e por 1 h a 37 °C. A solução seguinte foi preparada por poço em uma placa de seis poços: 4 μl de TransIT-TKO em 150 μl de meio RPMI sem soro. O complexo de siRNA recozido foi adicionado, misturado cuidadosamente, incubado por 20 min. em temperatura ambiente, e vertido sobre as células. A concentração do complexo de RNA final foi de 50 nM. Após incubação por 24 h a 37 °C, o meio foi mudado e as células foram incubadas por mais 24 horas a 37 °C. As células foram removidas por tripsinação e divididas pela metade para análise subsequente de RNA e fluxo.

Conforme o silenciamento dos genes é atingido (vide abaixo), demonstra-se que os complexos de RNA da invenção contendo os monômeros substituídos por hidroximetila podem penetrar numa membrana celular sob condições padrão de transfecção.

Exemplo 3. Silenciamento de Genes

Procedimento para quantificação de mRNA e de proteínas.A expressão da proteína eGFP foi analisada pela análise citométrica de fluxo. O método “Western Blotting” foi aplicado conforme segue: as células foram lavadas duas vezes em PBS e uma quantidade igual de células foi lisada em 2 x solução tampão de amostra SDS [Sódio Dodecil-Sulfato (SDS) a 4%, glicerol a 20%, 125 mM Tris/HCI pH 6,8, 0,01 mg/ml Bromfenol Azul, 10% 2- mercaptoetanol] a 90 °C por 2 x 10 min. E separada por pipetação suave. As proteínas foram separadas em 8% de gel SDS-acrilamida e submetidas ao teste de “Western blotting” elétrico durante o período noturno sobre uma membrana de PVDF (Immobilon). O filtro foi bloqueado por 1 h com PBS a 10% p/v de leite. A proteína EGFP foi detectada usando uma diluição de 1:1000 de um anticorpo EGFP policlonal de coelho (Santa Cruz Biotechnology). O anticorpo hnRNP C1 de rato foi uma doação da Seraphin Pinol-Roma. Um anticorpo secundário conjugado (DAKO) de peroxidase de rabanete (hrp) foi usado com o reagente ECL (Amersham Biosciences) para visualização. O mRNA do eGFP foi analisado pelo método “Northen Blotting” de acordo com procedimentos padrão.

A seguir, uma lista com os resultados dos experimentos de silenciamento de genes conduzidos em concentração de 50 mM de complexo de siRNA. Os resultados são apresentados em percentagens relativas ao nível de expressão dos genes obtidos com um siRNA duplo de controle divergente (estabelecido em 100%): Entrada Senso/ Antissenso GFP MédiomRNA do EGFP 1RNA/RNA13%16% 2JW1104 / JW110313%28% 3JW1188 / JW11037% 13% 4JW1189 / JW11036%15% 5W043 / JW1103~13% 6W044Z JW1103~19% 7JW1104 / JW118622%31 % 8JW1104 / JW118762%90% 9W131 ZW12727% 10W132/W12886% 11W131 ZW12868% 12W132 / W12747% 13W129/JW110336% 14W130 / JW110339% 15JW1106/W12324% 16JW1106 / W12751% 17JW1106 / W12534% 18JW1106 / W12622%

A entrada 1 mostra que o complexo siRNA não modificado está silenciando eficientemente o gene GFP.

A entrada 2 mostra que um complexo siRNA modificado por LNA está eficientemente silenciando o gene GFP. Esta estrutura possui duas modificações LNA na direção das extremidades 3’- dos dois filamentos de RNA.

Nos experimentos exemplares de silenciamento de genes das entradas 3 a 8, um complexo de siRNA contendo monômeros de C4’-ramificado-RNA substituídos por hidroximetila da estrutura T/C é estudado (Figura 3).

A entrada 3 mostra que um complexo de siRNA da invenção contendo um monômero substituído por hidroximetila nas posições 2 e 3 da extremidade 3’ do filamento senso é altamente funcional no silenciamento do gene GFP.

No exemplo da entrada 3 e nos exemplos das entradas 4, 5, 6, 13 e 14 temos o filamento antissenso como um exemplo de um filamento RNA modificado por LNA, mas um filamento antissenso de RNA não modificado ou um filamento antissenso de RNA total ou parcialmente modificado seriam também funcionais. Os resultados obtidos mostram que monômeros alternativamente modificados como os monômeros LNA são totalmente compatíveis com os monômeros substituídos por hidroximetila da invenção.

A entrada 4 confirma que um complexo de siRNA da invenção contendo monômeros substituídos por hidroximetila T/C no filamento senso é altamente eficiente na mediação do silenciamento dos genes.

As entradas 5 e 6 confirmam que um complexo de siRNA da invenção contendo monômeros substituídos por hidroximetila T/C no filamento senso é altamente eficiente na mediação do silenciamento dos genes.

Os resultados mostram que um silenciamento dos genes bastante eficiente é atingido com os complexos de siRNA da invenção contendo monômeros substituídos por hidroximetila incorporados no filamento senso.Os dados mostram a surpreendente descoberta que em geral mesmo o silenciamento de genes aperfeiçoado é atingido com esses complexos de RNA da invenção quando comparado com o silenciamento de genes atingido com siRNA não modificado ou siRNA modificado por LNA. Além disso, o silenciamento é eficiente mesmo com um complexo de RNA compreendendo um filamento senso de RNA com vários monômeros substituídos por hidroximetila na região central formadora do duplo (entrada, W044 como exemplo).

As entradas 7 e 8 revelam que um complexo de siRNA da invenção contendo monômeros substituídos por hidroximetila T/C no filamento antissenso do complexo é capaz de mediar o silenciamento dos genes. Parece que quanto mais monômeros substituídos por hidroximetila T/C são incorporados no filamento senso, menor é a atividade de silenciamento dos genes.

Um filamento senso modificado por LNA é usado como um exemplo nos exemplos das entradas 7, 8, 15, 16, 17 e 18, mas um filamento senso de RNA não modificado ou um filamento senso de RNA total ou parcialmente modificado seriam também funcionais. Os resultados obtidos mostram que os monômeros modificados alternativamente como os monômeros de LNA são totalmente compatíveis com os monômeros substituídos por hidroximetila da invenção.

Nos experimentos de silenciamento de genes exemplares das entradas 9 a 18, é estudado um complexo de siRNA da invenção contendo monômero substituídos por hidroximetila 2’,3’-seco-RNA da estrutura X mostrada acima na Figura 3.

A entrada 9 demonstra que um complexo de siRNA da invenção contendo um monômero X substituído por hidroximetila em cada dos dois filamentos de RNA (na direção da extremidade 3’- dos dois filamentos) media o silenciamento bastante eficiente dos genes a um nível comparável àquele do siRNA não modificado. Toe é surpreendente quando se leva em consideração a natureza não-cíclica da unidade de ribose do monômero X substituído por hidroximetila.

Com um monômero X adicional em cada dos dois filamentos do complexo de RNA, a eficiência do silenciamento dos genes é ineficaz (entrada 10).

A entrada 11 em conjunto com a entrada 10 revela que a incorporação de um mo- nômero X substituído por hidroximetila próximo à extremidade 5’- do filamento senso reduz a eficiência do silenciamento dos genes de um complexo de siRNA.

A entrada 12 revela que a incorporação de um monômero X substituído por hidroximetila próximo à extremidade 5’- do filamento senso reduz a eficiência do silenciamento dos genes de um complexo de siRNA quando outro monômero X substituído por hidroximetila é incorporado na extremidade 3’- do filamento senso.

As entradas 13 e 14 confirmam que a incorporação de um monômero substituído X por hidroximetila próximo à extremidade 5’- do filamento senso reduz a eficiência do silenciamento dos genes de um complexo de siRNA. Os resultados indicam que a incorporação de um monômero X substituído por hidroximetila na parte central de um filamento senso de uma estrutura de siRNA não melhora nem reduz a atividade de silenciamento dos genes.

As entradas 15 a 18 exibem resultados a partir de experimentos de silenciamento dos genes com os complexos de siRNA da invenção compreendendo um filamento senso de RNA modificado por LNA e filamentos antissenso contendo um monômero X substituído por hidroximetila.

Os resultados mostram que os complexos de siRNA da invenção que contêm monômeros X substituídos por hidroximetila na região central do filamento antissenso, por e- xemplo, W126 e W123, mediam o silenciamento bastante eficiente dos genes. É surpreendente que W127, que em conjunto com W131 media o silenciamento bastante eficiente dos genes, somente induza o silenciamento moderado dos genes com o filamento senso do RNA modificado por LNA JW1106. Isto chama a atenção para o aspecto surpreendente da observação (entrada 9) que um complexo de siRNA da invenção contendo um monômero X substituído por hidroximetila em cada um dos dois filamentos de RNA (na direção das extremidades 3’- dos dois filamentos) mediam o silenciamento bastante eficiente dos genes até um nível comparável com aquele do siRNA não modificado.

Resultados similares àqueles descritos acima podem ser obtidos com os complexos de RNA da invenção contendo monômeros substituídos por hidroximetila contendo outras bases de nucleotídeos em lugar da uracila, timina ou 5-metilcitosina. Por exemplo, atividades de silenciamento comparável de genes usando protocolos similares podem ser obtidas para os complexos de RNA da invenção contendo monômeros substituídos por hidroximetila contendo adenina, citosina ou guanina como bases de nucleotídeos.

Exemplo 4. Estimulação imune.

Uma vez que os complexos de RNA da invenção que contêm os monômeros substituídos por hidroximetila são quimicamente modificados em relação aos complexos de RNA não modificados correspondentes, eles exibirão menos atividade de estimulação imune do que os complexos de RNA não modificados correspondentes.

Exemplo 5. Efeitos fora do alvo.

Uma vez que os complexos de RNA da invenção que contêm os monômeros substituídos por hidroximetila podem ser modulados de tal modo que os complexos de siRNA modificados por filamento antissenso se mostrem inativas, esta invenção torna possível o silen- ciamento dos genes com menos efeitos fora do alvo. A chave é modificar os filamentos senso com monômeros substituídos por hidroximetila de tal modo que o filamento senso não pode funcionar como um filamento antissenso. Isto pode ser atingido, por exemplo, pela incorporação de um monômero substituído por hidroximetila na direção da extremidade 5’- do filamento senso.

Com o monômero acíclico X, a redução dos efeitos fora do alvo pode ser obtida pela incorporação do monômero X no filamento antissenso, mais preferivelmente em torno das posições 6 a 8 a partir da extremidade 5’- do filamento senso, por exemplo, na posição 7 da extremidade 5’- do filamento antissenso.

Exemplo 6. Síntese dos complexos de RNA da invenção contendo monômeros de hidroximetila funcionalizados e conjugados.

O substituinte hidroximetila dos monômeros substituídos por hidroximetila da invenção é funcionalizado por um grupo de conjugação. Um grupo de conjugação é aqui definido como um grupo que modula, amplia ou aperfeiçoa as propriedades químicas, biofísicas ou biológicas de um complexo de RNA da invenção. Tais grupos podem ser úteis para modular a distribuição celular, a distribuição dos órgãos, a distribuição dos tecidos, as temperaturas de fusão, as afinidades dos alvos, a bioestabilidade, a sinalização de hibridização, etc.

Métodos conhecidos podem ser usados para converter um substituinte hidroximetila em vários derivados químicos [Furniss, Hannaford, Smith e Tatchell, Vogel’s Textbook of Organic Chemistry, 1989, John Wiley & Sons]. Isto pode ser obtido no nível de nucleosi- deos, isto é, antes da conversão em um derivado de fosforamidita útil para a síntese automatizada do RNA em urn sintetizador DNA automatizado. Após a conversão do grupo hidroximetila em um derivado útil, o derivado de fosforamidita necessário para a síntese automatizada do RNA é sintetizado usando métodos padrão, e a incorporação dos monômeros derivados ou conjugados em oligonucleotídeos de RNA (filamentos) é subsequentemente obtida usando métodos padrão (vide Exemplo 1).

Conjugação via uma ligação de éteres. O substituinte hidroximetila dos monômeros substituídos por hidroximetila da invenção é funcionalizado por uma ligação de éteres entre um grupo de conjugação e o grupo metileno do substituinte hidroximetila através de uma reação de substituição nucleofílica. Esta reação envolve a conversão do grupo hidroxila do substituinte hidroximetila em um bom grupo de saída através de, por exemplo, mesilação ou transformação em um haleto, e a posterior fixação nucleofílica por um álcool ou um derivado de alcóxido.

Conjugação via ligação de tioéteres. O substituinte hidroximetila dos monômeros substituídos por hidroximetila da invenção é funcionalizado por uma ligação de tioéteres e entre um grupo de conjugação e o grupo metileno do substituinte hidroximetila através de uma reação de substituição nucleofílica. Esta reação envolve a conversão do grupo hidroxila do substituinte hidroximetila em um bom grupo de saída através de, por exemplo, mesilação ou transformação em um haleto, e a posterior fixação nucleofílica por um derivado de alquil- tiol ou tioalcóxido. Se o nucleófilo alternativamente for SH, a proteção, por exemplo, pela acetilação leva a um derivado de fosforamidita que é útil para a introdução dos grupos mer-capto (SH) nos complexos de RNA da invenção. Como procedimento alternativo para intro-duzir uma funcionalidade mercapto nos complexos de RNA, a conjugação com um dissulfeto contendo um componente pode ser usada. Após a redução do dissulfeto contendo o com-plexo de RNA, obtém-se o complexo de RNA funcionalizado do grupo mercapto.

Derivação em um grupo aminometila. O substituinte hidroximetila dos monômeros substituídos por hidroximetila da invenção pode ser convertido em um grupo aminometila. Esta reação envolve a conversão do grupo hidroxila do substituinte hidroximetila em um bom grupo de saída através de, por exemplo, mesilação ou transformação em um haleto, e a posterior fixação nucleofílica pela amónia ou um derivado de amina protegido (como, por exemplo, ftalimida) que posteriormente é desprotegido (por exemplo, após a síntese do RNA) para fornecer o derivado amino desejado. Um grupo protetor trifluoroacetila ou Fmoc são outras opções para proteção do amino durante a síntese do RNA, com liberação de um grupo sem amino após a desproteção padrão de oligonucleotídeos

Conjugação via uma ligação amida. O substituinte hidroximetila dos monômeros substituídos por hidroximetila da invenção está atuando como uma alça para fixação dos grupos de conjugação ligados por amida. Isto envolve a conversão da unidade hidroxila do substituinte hidroximetila em uma unidade amina conforme descrito acima, por exemplo, e ainda a derivação deste grupo amino através de, por exemplo, um grupo de conjugação via formação de ligação de amida usando métodos conhecidos. Isto pode ocorrer antes da síntese do RNA ou após a síntese do RNA usando métodos conhecidos por uma pessoa habilitada na técnica. [Bryld, Hojland e Wengel, Chem. Commun. 2004, 1064; Mokhir, Tetzlaff, Herzberger, Mosbachere Richart, J. Comb.Chem. 2001, 3, 374].

Conjugação via uma ligação amino. O substituinte hidroximetila dos monômeros substituídos por hidroximetila da invenção está também atuando como uma alça para fixação dos grupos de conjugação ligados ao amino. Isto envolve a conversão da unidade hidroxila do substituinte hidroximetila em uma unidade amina, por exemplo, conforme descrito acima, e ainda a derivação deste grupo amino por um grupo de conjugação, por exemplo, uma funcionalidade aldeído por uma reação de aminação redutora, que é uma reação conhecida [Furniss, Hannaford, Smith e Tatchell, Vogel’s Textbook of Organic Chemistry, 1989, John Wiley & Sons]. Isto pode ocorrer antes da sintese do RNA ou após a sintese doRNA.

Conjugação via um grupo piperazino ou um grupo diamino alquila.Um grupo piperazino ou um grupo diamino alquila linear é também usado para derivação pela realização de reações conforme descrito [Bryld, Hojland e Wengel, Chem. Commun. 2004, 1064-5]. Estes grupos serão úteis, uma vez que outros grupos de conjugação podem ser afixados, por exemplo, ao átomo de nitrogênio distal de um grupo piperazino (vide Figura 2, Monômero J) através, por exemplo, da formação de ligação amida ou através de uma reação de a- minação redutora, quer antes ou após a síntese de oligonucleotídeos de RNA [Bryld, Hojland e Wengel, Chem. Commun. 2004, 1064; Mokhir, Tetzlaff, Herzberger, Mosbacher e Richart, J. Comb. Chem. 2001, 3, 374]. Deste modo, por exemplo, as unidades de colesterila ou ácidos graxos, podem ser ligadas aos complexos de RNA da invenção via um substituin- te piperazino-metila.

Utilizando estes procedimentos, os complexos de RNA da invenção podem ser preparados contendo, por exemplo, unidades de colesterila, unidades alquila, unidades de ácidos graxos, derivados de poliamina, derivados tio, aminoácidos, polipeptídeos, derivados de monossacarideos, derivados de polissacarídeos ou fluoróforos, todos conectados aos complexos de RNA da invenção via o grupo metileno do substituinte hidroximetila. Os grupos listados aqui são somente exemplos dos grupos que podem ser anexados usando os procedimentos exemplificados acima. Vide figura 2 para exemplos estruturais dos monômeros conjugados.

Exemplo 7. Silenciamento de genes pelos complexos de RNA da invenção contendo monômeros de hidroximetila funcionalizados e conjugados.

O silenciamento eficiente dos genes é obtido com os complexos de RNA da invenção contendo monômeros de hidroximetila funcionalizados e conjugados (vide, por exemplo, a Figura 2 ou o Exemplo 6).

O silenciamento eficiente dos genes é obtido quando estes monômeros de hidroximetila funcionalizados e conjugados são posicionados nas extremidades 3’- dos dois filamentos de um complexo siRNA, ou próximos a elas.

Ademais, o silenciamento eficiente dos genes é obtido quando estes monômeros de hidroximetila funcionalizados e conjugados são posicionados na extremidade 3’- ou na extremidade 5’ do filamento senso de um complexo de siRNA, ou próximos a elas.

O silenciamento eficiente dos genes é particularmente obtido quando estes monômeros de hidroximetila funcionalizados e conjugados são posicionados na extremidade 3’- do filamento senso de um complexo siRNA, ou próximos a ela.

O silenciamento eficiente de genes é ainda mais obtido quando estes monômeros de hidroximetila funcionalizados e conjugados são posicionados em um oligonucleotídeo de RNA antissenso de filamento único.

A modulação das propriedades farmacocinéticas é obtida em conjunto com o silen- ciamento eficiente dos genes quando o grupo (R na Figura 2) de um complexo de RNA da invenção é um derivado de colesterila. Isto leva, por exemplo, à distribuição de tecidos e captação celular e também ao aumento da bioestabilidade.

A modulação das propriedades farmacocinéticas é obtida em conjunto com o silen- ciamento eficiente dos genes quando o grupo (R na Figura 2) de um complexo de RNA da invenção é um derivado tio. Isto leva à melhoria do tempo de circulação em um corpo humano, isto é, na redução da depuração pelos rins.

A modulação das propriedades farmacocinéticas é obtida em conjunto com o silen- ciamento eficiente dos genes quando o grupo (R na Figura 2) de um complexo de RNA da invenção contiver um grupo amino. Isto leva à melhor distribuição nos tecidos.

Exemplo 8. Bioestabilidade dos complexos de RNA substituídos por hidroximetila.

Procedimento experimental para ensaio de estabilidade.Os complexos de RNA substituídos por hidroximetila são incubados a 37 °C em soro fetal bovino a 10% (Gibco) diluído em D-MEM (Gibco). Amostras de 5 μl foram coletadas nos pontos de tempo indicados e imediatamente congeladas em gelo seco em 15 μl 1,33 x TBE/10% de solução tampão de carregamento de glicerol e submetidas a PAGE não-desnaturante em 15% de gel. RNAs foram visualizados com o SYBR gold (Invitrogen).

Tais experimentos mostram que a estabilidade dos complexos de RNA substituídos por hidroximetila exibem melhor estabilidade em meios biológicos em relação aos complexos de RNA de controle nativos (ou “não modificados”). Assim os siRNAs substituídos por hidroximetila são significativamente mais estáveis em soro a 10% do que em siRNA comum. É possível então visualizar que somente um declínio muito pequeno no tamanho do siRNA substituído por hidroximetila é observado durante mais de uma hora de período de incubação. Concluímos que os complexos de RNA da invenção contendo monômeros substituídos por hidroximetila são bastante estáveis em células, em animais e em seres humanos, e que esta característica está contribuindo para sua propriedade bastante eficiente de silenciamen- to de genes. Em razão desta bioestabilidade acentuada, os complexos de RNA da invenção contendo monômeros substituídos por hidroximetila exibem silenciamento de genes por um período mais longo de tempo do que suas contrapartidas não modificadas.

Exemplo 9. Uma série de experimentos de silenciamento de genes demonstrando o forte potencial dos monômeros da estrutura D para silenciar genes.

Utilizando os procedimentos descritos nos experimentos anteriores, os estudos de silenciamento de genes foram conduzidos utilizando os siRNA duplos das sequências descritas anteriormente como também de sequências adicionais (vide as Figuras 4 a 9 para as sequências incluídas nos estudos deste exemplo). Estes experimentos incluíram sequências contendo uma ou mais incorporações do monômero X (vide o Exemplo 1 para a descrição do monômero X). O monômero X é usado aqui somente como estrutura de exemplo e resultados similares são previstos para derivados como, por exemplo, o monômero E, o monômero F, o monômero G, o monômero I e o monômero J (vide a Figura 1 e a Figura 2). Os monômeros em negrito e sublinhados com um L sobrescrito são monômeros do LNA. Neste exemplo, incluindo as Figuras 4 a 9, estão CL = CMeL = monômero de 5-metilcitosin-1-il LNA.

Todos os experimentos cujos resultados estão ilustrados Figura 4, envolvem um filamento senso que possui duas incorporações do monômero X (W130). É mostrado que: -é possível projetar um siRNA duplo composto de filamentos contendo tanto os monômeros substituídos por hidroximetila como os monômeros do LNA que exibem funcionalidade de silenciamento de genes; -é possível projetar um siRNA duplo composto de filamento contendo um monômero X divergente no filamento senso que exibe funcionalidade de silenciamento de genes; -todo o filamento antissenso do RNA (exceto para os dois monômeros do LNA na direção da extremidade 3’-) é bem tolerado; -um único monômero X é bem tolerado no filamento antissenso (W123, W125 ou W126); -vários monômeros X são tolerados, porém o silenciamento menos eficiente de genes é observado com W186 e W187, do que com W123, W125 ou W126 como o filamento antissenso; -a atividade significativa de silenciamento de genes é vista com W188 embora este filamento antissenso contenha seis monômeros do LNA, o que mostra que um monômero X posicionado centralmente em um filamento antissenso é capaz de aperfeiçoar o silenciamento de genes em relação à situação na qual o monômero X é substituído pelo monômero do RNA correspondente.

Todos os experimentos cujos resultados estão ilustrados na Figura 5 envolvem um filamento senso que possui um monômero X posicionado na direção da extremidade 3’- do filamento (W131). É mostrado que: -todo o filamento antissenso do RNA (exceto pelos dois monômeros do LNA na direção da extremidade 3’-) é bem tolerado; -um único monômero X pode ser bem tolerado no filamento antissenso (W123); -um único monômero X pode levar a um silenciamento de genes bom ou mesmo melhorado em relação ao controle não modificado (siRNA-EGFP) (W125 ou W126); -vários monômeros X são mais bem tolerados (W186, W187 ou W281 como filamento antissenso); -uma atividade de silenciamento de genes significativa é vista com W188 embora este filamento antissenso contenha seis monômeros do LNA, o que mostra que um monômero X posicionado centralmente num filamento antissenso é capaz de melhorar o silencia- mento de genes em relação à situação na qual o monômero X é substituído pelo monômero do RNA correspondente; -um silenciamento de genes significativo é observado com várias substituições do monômero X no filamento antissenso, numa situação sem a co-presença de monômeros do LNA(W281).

Todos os experimentos cujos resultados estão ilustrados na Figura 6 envolvem um filamento senso que possui três monômeros X dispersos ao longo do filamento senso (W282). É mostrado que: -todo o filamento antissenso do RNA (exceto pelos dois monômeros do LNA na direção da extremidade 3’-) é bem tolerado; -um único monômero X pode ser bem tolerado no filamento antissenso, mais evidentemente na direção da extremidade 3’-, para o que foi observado um silenciamento de genes bom ou mesmo aperfeiçoado em relação ao controle não modificado (siRNA-EGFP) (W123, W125, W126); -vários monômeros X são bastante bem tolerados (W186, W187 ou W281 como filamento antissenso); -uma atividade de silenciamento de genes significativa é observada com W188, embora este filamento antissenso contenha seis monômeros do LNA, o que mostra que um monômero X posicionado centralmente num filamento antissenso é capaz de melhorar o silenciamento de genes em relação à situação na qual o monômero X é substituído pelo monômero do RNA correspondente, e também quando o filamento senso contém vários monômeros X; -um silenciamento de genes é observado com várias substituições do monômero X no filamento antissenso também em uma situação sem a co-presença dos monômeros do LNA (W281).

Todos os experimentos cujos resultados são ilustrados na Figura 7 envolvem um filamento senso sem o monômero X (W194). É mostrado que: -um único monômero X pode ser bem tolerado no filamento antissenso (W123); -um único monômero X poderia levar a um silenciamento de genes bom ou até mesmo aperfeiçoado em relação ao controle não modificado (siRNA-EGFP) (W125 ou W126); -vários monômeros X são bastante bem tolerados (W186, W187 ou W281 como filamento antissenso); -uma atividade de silenciamento de genes significativa é vista com W188, embora este filamento antissenso contenha seis monômeros do LNA, o que mostra que um monômero X posicionado centralmente num filamento antissenso é capaz de aperfeiçoar o silenciamento de genes em relação com a situação na qual o monômero X é substituído pelo monômero do RNA correspondente; -um silenciamento de genes significativo é observado com várias substituições do monômero X no filamento antissenso também numa situação sem a co-presença dos monômeros LNA (W281).

Todos os experimentos cujos resultados estão ilustrados na Figura 8 envolvem um filamento senso sem o monômero X (W181) mas com quatro monômeros do LNA incorporados no segmento formador duplo (mais dois monômeros do LNA na extremidade 3’-). É mostrado que: -um único monômero X é bem tolerado no filamento antissenso (W123, W125 ou W126); -vários monômeros X são bastante bem tolerados (W186, W187 ou W281 como filamento antissenso); -uma atividade de silenciamento de genes significativa é vista com W188, embora este filamento antissenso contenha seis monômeros LNA, o que mostra que um monômero X posicionado centralmente num filamento antissenso é capaz de aperfeiçoar o silenciamento dos genes em relação à situação na qual o monômero X é substituído pelo monômero do RNA correspondente; -um silenciamento de genes significativo é observado com várias substituições do monômero X no filamento antissenso também numa situação sem a co-presença dos monômeros do LNA (W281).

Todos os experimentos cujos resultados estão ilustrados na Figura 9 envolvem um filamento senso que possui um monômero X posicionado na direção da extremidade 5’- do filamento (W129). É mostrado que: -todo o filamento antissenso do RNA (exceto para dois monômeros do LNA na direção da extremidade 3’-) é bem tolerado; -um único monômero X pode ser bem tolerado no filamento antissenso e pode levar ao aperfeiçoamento do silenciamento de genes em relação ao controle não modificado (siRNA-EGFP) (W123, W125 ou W126); -vários monômeros X são bastante bem tolerados (W186, W187 ou W281 como filamento antissenso); -uma atividade de silenciamento de genes significativa é vista com W188 embora este filamento antissenso contenha seis monômeros do LNA, o que mostra que um monômero X posicionado centralmente num filamento antissenso é capaz de aperfeiçoar o silenciamento dos genes em relação à situação na qual o monômero X é substituído pelo monômero do RNA correspondente; -um silenciamento de genes significativo é observado com várias substituições do monômero X no filamento antissenso numa situação sem a co-presença dos monômeros do LNA(W281). Os dados abaixo mostrados abaixo indicam que os monômeros substituídos por hi-droximetila são compatíveis com a abordagem [s/c] sisiRNA. Como exemplo, o uso da combinação trimolecular do filamento antissenso W123 + filamentos senso (W004+W005) leva ao silenciamento eficiente dos genes (isto é, o “efeito siRNA” possui um valor baixo, no caso do efeito siRNA ser 0,24) o que mostra que o monômero X pode ser posicionado no filamento antissenso dos complexos [s/c] sisiRNA (compare com o controle; indicador 1,0). Os dados para siRNA não modificado são também mostrados. O desenho do filamento antissenso é importante, já que a combinação do filamento antissenso W186 + os filamentos senso (W004+W005) é incapaz de induzir a um efeito de silenciamento de genes. Isto mostra que o número de monômeros substituídos por hidroximetila (por exemplo, o Monômero D) deve ser baixo, e mais favoravelmente restrito a um monômero (além dos monômeros substituídos por hidroximetila opcionais na saliência do filamento antissenso). Outros complexos de RNA incluídos no estudo ilustrados na Figura 9 são igualmente eficientes em relação ao silenciamento dos genes.Filamento antissenso Efeito siRNA W1230,24 W1250,26 W1260.23 W1861,12 SiRNA0,11 Controlei,0

Exemplo 10. Modificações da semente reduzem os efeitos fora do alvo.

Utilizando o filamento antissenso W124 e W207 (5’-GAC GUA AAC GGC CAC AAG UTLCMeL) (SEQ ID N°. 25 ) como filamento senso num siRNA duplo a uma concentração de 50 nM, mostramos que o monômero X quando presente na chamada região de semente do filamento antissenso possui uma efeito de aperfeiçoamento da seletividade que levará à redução dos efeitos fora do alvo. A configuração experimental assim permitiu a discriminação entre o efeito siRNA (silenciamento dos genes com divagem de filamentos) e o efeito Mirna (repressão translacional; sensor de fora do alvo com base em plasm ideo contendo quatro regiões alvo compostas de somente a combinação da região da semente). Usando a combinação acima, o efeito siRNA foi como para o controle siRNA não modificado enquanto que o efeito Mirna foi significativamente reduzido. Um efeito similar foi obtido para o siDhar- ma (um produto comercial contendo um monômero do 2’-O-Me-RNA incorporado na posição n°. 2 a partir da extremidade 5’- do filamento antissenso). Conforme declarado acima, isto mostra que o monômero substituído por hidroximetila (por exemplo, o Monômero D) presente na chamada região de semente do filamento antissenso leva a um efeito favorável (isto é, redução ou eliminação do efeito fora do alvo). Assim o método para redução ou eliminação do efeito fora do alvo de um complexo de RNA, o método compreendendo a incorporação de um ou mais monômeros substituídos por hidroximetila (por exemplo, o Monômero D) num complexo ou a preparação de um complexo de RNA contendo um ou mais monômeros substituídos por hidroximetila (por exemplo, o Monômero D). Vide a tabela abaixo para os resultados para silenciamento de genes (isto é, o “efeito siRNA”) e efeito fora do alvo (isto é, o “efeito Mirna”). Estes dados indicam que um complexo de RNA contendo um ou mais monômeros substituídos por hidroximetila (por exemplo, o Monômero D) reduz a expressão do alvo enquanto minimiza o efeito fora do alvo.Filamento antissenso Efeito siRNAEfeito Mirna W1240,120,38 W1250,040,19 SiRNA0,060,15 siDharma0,080,37 Controlei,01,0

Para outros estudos da caminhada da semente, preparamos as seguintes sequências compostas de monômeros do RNA (rA, rC, rG e rll) e monômeros modificados por hidroximetila (Monômero D; rotulado sA, sC, sG e sU para derivados de adenin-9-il, citosin-1- il, guanin-9-il e uracil-1-il, respectivamente). O monômero X representa o Monômero D com uma base de nucleotídeo:

A numeração dos primeiros nove oligonucleotídeos mostrados abaixo é a seguinte (a partir do n°. 1 a partir do alto - n°. 9): W313; W314; W315; W316; W317; W123; W318; W319 e W320

Utilizando técnicas experimentais similares, conforme descrito nos exemplos anteri ores com os oligômeros W313; W314; W315; W316; W317; W123; W318; W319 e W320 como filamento antissenso e o oligômero JW1104 como filamento senso nos experimentos de silenciamento de genes, foi mostrado que a potência das estruturas siRNA contendo o monômero D substituído por hidroximetila podem ser aperfeiçoadas em relação ao siRNA não modificado ou a um produto do siRNA quimicamente modificado comercial (Dharma) tendo um monômero do 2’-O-Me-RNA na posição n°. 2 a partir da extremidade 5’ do filamento antissenso. Ainda, os complexos siRNA contendo o Monômero D do 2’,3’-seco-RNA mostrando que este monômero pode ser incorporado nas estruturas siRNA de modo que os efeitos fora do alvo (efeitos miRNA) sejam reduzidos em relação ao siRNA não modificado de referência (siRNA).

Os resultados para os complexos de RNA de 1 nM, 10 nM e 100 nM são ilustrados na forma de uma tabela abaixo (Controle; dados ajustados em 1,0). Os efeitos dos silencia- mento dos genes via siRNA e miRNA (microRNA) foram estudados em várias concentrações dos diferentes siRNA duplos, conforme indicado. Resultados similares são esperados a partir das filamentos como os nove filamentos mostrados acima, contendo exclusivamente monômeros do e RNA e monômeros acíclicos do 2’,3’-seco-RNA.

Monômero D modificado de Hidroximetila como filamento antissenso reduz efeitos de desvio e aumenta a potência de silenciamento de gene.

O desenho é importante e a mais potente das séries de oligômeros mencionadas acima para o efeito siRNA é o W318, que possui um monômero D substituído por hidroximetila na posição n°. 7 a partir da extremidade 5’- do filamento antissenso. O W318 também leva a efeitos fora do alvo (miRNA) favoravelmente reduzidos em relação ao siRNA não modificado ou a um produto comercial (Dharma). Em geral, o uso dos filamentos antissenso listados acima contendo um monômero D substituído por hidroximetila incorporado leva a efeitos fora do alvo favoravelmente baixos (miRNA). Importante e surpreendente, a alta potência e os efeitos baixos fora do alvo podem simultaneamente ser realizados utilizando uma estrutura com um filamento antissenso contendo um monômero D substituído por hidroximetila (vide tabela acima). Em particular o desenho do W318 é favorável, mostrando que um monômero D substituído por hidroximetila pode ser favoravelmente incorporado em torno da borda da chamada região de semente do filamento antissenso, mais favoravelmente em torno das posições n°. 5 a 10 a partir da extremidade 5’- do filamento antissenso, como, por exemplo, a posição n°. 7 da extremidade 5’- do filamento antissenso. Outras configurações de um ou mais monômeros D substituídos por hidroximetila podem ser realizadas nos dois filamentos.

Pode ainda ser observado que o efeito pode ser revertido se o monômero X estiver posicionado no filamento antissenso em torno das posições 9 a 16, onde as posições são contadas a partir da extremidade 5’- . Se, por exemplo, o monômero X no filamento antissenso estiver presente na posição n°. 9 a partir da extremidade 5’- do filamento antissenso, o filamento antissenso e o duplo atuam como um microRNA (o efeito siRNA será mínimo e o efeito microRNA muito mais alto). Este efeito possivelmente se origina da tendência reduzida na direção da aglutinação do comprimento total em razão da afinidade reduzida causada pela presença de um monômero X substituído por hidroximetila (= o monômero D).

Exemplo 11. Síntese dos blocos construtores monoméricos de fosforamidita

O esquema abaixo exibe os procedimentos que foram conduzidos para exemplifica a síntese dos blocos construtores monoméricos de amidita (= fosforamidita):

O esquema abaixo exibe os procedimentos que foram conduzidos para exemplifica a sintese dos blocos construtores monomericos de amidita (= fosforamidita):

* O estagio abertura de aneis que produz SecoG e SecoC foi efetuado sem purificagao apos a protegao DMT. Os rendimentos registrados sao portantorendimentos globais relatives aos dois estagios.

Os compostos 100 sao materials de partida de ribonucleosideos.Os compostos 102 sao dois preparados por reagbes de clivagem oxidativa seguida de redugao. Os compostos 103 sao derivados de O2’-benzoilatado preparados pela benzoilagao seletiva do grupo O2’-hidroxila dos compostos 102. Os compostos 104 sao amiditas (=fosforamiditas) preparados por O3’-fosforilagao do grupo O3’-hidroxila dos compostos 103. Abaixo estao os procedimentos detalhados e os dados de caracterizagao incluidos como procedimentos e- xemplares.5’-O-(4,4’-Dimetoxitritil)-2’,3’-secouridina (102-U) o

O nucleosídeo 100-U (5’-O-(4,4’-dimetoxitritil)uridina; 10,35 g, 18,94 mmol) foi dissolvido em dioxano (250 mL) e água (50 mL). NalO4 (4,47 g, 20,90 mmol) foi dissolvido em água (50 mL) e adicionado ao nucleosídeo dissolvido. A mistura foi agitada por 1 h, e durante esse período um precipitado branco foi formado. Dioxano adicional (200 mL) foi adiciona- 10 do e a suspensão foi agitada por 15 min., depois do que a suspensão foi filtrada através de um filtro de vidro e o bolo do filtro foi lavado com dioxano (100 mL). Os filtrados foram combinados, NaBH4 (797 mg, 21,1 mmol) foi adicionado e a mistura da reação agitada por 30 min. A mistura da reação foi neutralizada com um solução tampão (piridina:AcOH 1:1, v/v, ~10 mL). Após a evaporação da mistura até aproximadamente 150 mL, adicionou-se CH2CI2 15(100 mL) e a mistura foi lavada com solução aquosa saturada de NaHCO3 (2 x 1OO mL). A fase orgânica foi separada, seca com Na2SO4, evaporada até secar, e o resíduo resultante foi purificado por cromatografia de coluna (40% acetona em éter de petróleo), produzindo o nucleosídeo desejado 102-U como uma espuma branca após a evaporação dos solventes. Rendimento: 8,53 g (82%). 20Rf: 0,2 (MeOH em CH2CI2 a 10% ). 1H NMR (DMSO-cfe): δ 11,34 (br s, NH), 7,62 (d, 1H, J=8,05 Hz, H6), 7,45-7,15 (m, 9H, ar), 6,85 (d, 4H, ar), 5,80 (t, 1H, J=6,2 Hz, HV), 5,52 (d, 1H, J=8,05 Hz, H5), 5,12 (t, 1H, J=5,86 Hz, 2’OH), 4,74 (t, 1H, J=5,49 Hz, 3’OH), 3,72 (s, 6H, OCH3), 3,55-3,47 (m, 3H, H27H4’), 3,40 (t, 2H, J=5,13 Hz, H3’), 3,01-2,90 (m, 2H, H5’). 2513C NMR (DMSO-cfe): δ 163,2, 157,9, 151,4, 144,8, 141,1 (C5), 135,4, 129,5 (ar), 127,7, 127,5 (ar), 126,5 (ar), 113,0, 101,6 (C6), 85,3, 83,6 (C1’), 79,3 (C27C4’), 63,5 (C5’), 61,1, 60,5 (C27C4’), 54,9 (-OCH3). ESl-HiRes (mNa+): m/z: 571,1743 calc.: 571,2051. 2’-O-Benzoil-5’-O-(4,4’-dimetoxitril)-2’,3’-secouridina (103-U)

O nucleosídeo 102-U (3,01 g, 5,50 mmol) foi coevaporado com tolueno anidro (15 mL). O resíduo resultante foi dissolvido em DCM anidro (150 ml_) em conjunto com piridina anidra (4,4 mL) e a mistura foi resfriada a -70°C. Cloreto de benzoila (700 μL, 6 mmol) foi lentamente adicionado à mistura da reação e agitado por 1 ha -70°C, EtOH (5 mL) foi adicionado à solução e subsequentemente deixado atingir a temperatura ambiente.A mistura da reação foi lavada com solução aquosa saturada de NaHCO3 (3 x 100 mL) e salmoura (100 mL). A fase aquosa combinada foi extraída de volta com CH2CI2 (100 mL). As fases orgânicas foram combinadas e evaporadas, O resíduo resultante foi purificado por cromato- grafia de coluna (MeOH em DCM a 3,5%), produzindo o produto 103-U como uma espuma branca após a evaporação dos solventes, Rendimento: 3,44 g (79%). Rf: 0,3 (MeOH em CH2CI2 a 5%). 1H NMR (DMSO-d6): δ11,43 (s, 1H, NH, ex), 7,93-7,87 (m, 2H, ar), 7,80 (d, 1H, J = 8,05 Hz, H6), 7,70-7,63 (m, 1H), 7,56-7,48 (m, 2H, ar), 7,35-7,17 (m, 10H, ar), 6,89-6,81 (m, 4H, ar), 6,20 (t, 1H, J = 5,49 Hz, H1’), 5,56 (d, 1H, J = 8,05 Hz, H5), 4,83 (t, 1H, OH-3’, ex), 4,58 (dq, 2H, H2’), 3,73 (s, 7H, -OCH3), 3,70-3,62 (m, 1H, H4’), 3,45 (t, 2H, H3’), 3,11-2,96 (m, 2H, H5’). 13C NMR (DMSO-dβ): δ 164,92, 162,98, 157,89, 151,00, 144,67, 140,51, 135,45, 135,35, 133,54, 129,49, 129,45, 129,13, 129,02, 128,92, 128,74, 128,61, 127,65, 127,51, 126,49, 113,16, 113,01, 102,06, 85,35, 80,84, 79,57, 71,8, 71,8, 63,4, 60,5, 54,9, 54,8. ESl-HiRes (mNa+): m/z: 675,1949 calc.: 675.2313. 2’-0-Benzoil-3’-0-(2-cianoetoxi(diisopropilamino)fosfino)-5’-0-(4,4’-dimetoxitritil)- 2’,3’-secouridina (104-U)

O nucleosideo 103-U (679 mg, 1,04 mmol) foi coevaporado com DCE (3x6 ml_) e seco por 12 h no vácuo. O resíduo foi dissolvido em DIPEA em MeCN a 20%(6,5 mL) e a misturafoiagitada.2-Cianoetil-/V,A/-diisopropilclorofosforamidita [R(CI)(OCH2CH2CN)(N(iPr)2): 0,66 mL, 3,02 mmol] foi adicionado à mistura da reação e a agitação continuou por 40 min. A mistura da reação foi vertida em DCE (10 mL) e lavada com solução aquosa saturada de NaHCO3 (10 mL) e a fase aquosa foi extraída de volta com DCE (10 mL). As fases orgânicas foram reunidas e evaporadas para produzir uma espuma branca. O produto bruto foi purificado por cromatografia de coluna (EtOAc em tolueno de 0 a 20%) para produzir o nucleosídeo 104-U como um material sólido branco após a evaporação dos solventes. Rendimento: 600 mg (68%). Rf: 0,6 (EtOAc em tolueno a 50%). 31P NMR (MeCN): δ 147,8. ESl-HiRes (mNa+): m/z: 875,2946 calc.: 875,3391. 6-/V-Benzoil-5’-O-(4,4’-dimetoxitritil)-2’,3’-secoadenosina (102-A)

6-A/-Benzoil-5’-0-(4,4’-dimetoxitritil)adenosina (100-A; 7,02 g, 10,42 mmol) foi dissolvido em dioxano (150 mL) e água (25 mL). NalO4 (2,73 g, 11,77 mmol) foi dissolvido em água (25 mL) e adicionado ao nucleosídeo dissolvido. A mistura foi agitada por 1 h, e durante esse período um precipitado branco foi formado. Dioxano adicional (100 mL) foi adicionado e a suspensão foi agitada por 15 min., depois do que a suspensão foi filtrada através de um filtro de vidro e o bolo do filtro foi lavado com dioxano (50 mL). Os filtrados foram combinados, adicionou-se NaBH4 (435 mg, 11,5 mmol) e a mistura da reação foi agitada por 30 min. Acetona foi então adicionada para extinguir o NaBH4 residual. A mistura da reação foi neutralizada com uma solução tampão (piridina:AcOH 1:1, v/v, ~10 mL). A mistura da reação foi reduzida a aproximadamente 100 mL e foi adicionado CH2CI2 (100 mL), e a mistura lavada com solução aquosa saturada de NaHCO3 (2 x 100 mL). A fase orgânica foi separada, seca com Na2SO4, evaporada até secar, e o resíduo resultante foi purificado por cromatografia de coluna usando DCM e i-PrOH para resultar no produto como um material sólido branco após a evaporação dos solventes. Rendimento: 6,07 g (86%). Rf: 0,22 (i-PrOH em DCM a 5%). 1H NMR (DMSO-dβ): δ 11,23 (br s, 1H, N6H), 8,76 (s, 1H, adenina C8/C2), 8,68 (s, 1H, adenina C8/C2), 8,07 (d, 2H, J = 6,96 Hz, Ar), 7,69-7,50 (m, 3H, Ar), 7,25-6,91 (m, 9H, Ar), 6,79 (dd, 4H, Ar), 6,06 (t, 1H, HT), 5,29 (t, 1H, 2’OH), 4,84 (t, 1H, 3’OH), 4,19-4,02 (m, 2H, H2’), 3,90-3,80 (m, 1H, H4’), 3,69 (s, 6H, 2 x -OCH3), 3,49 (t, 2H, H3’), 2,93-2,74 (m, 2H, H5’). 13C NMR (DMSO-C/6): δ [sic] δ 165,6, 157,9, 152,8, 151,6 (adenina CH), 150,2, 144,6, 143,1 (adenina CH), 135,7, 135,4, 132,4 (Ar), 129,4 (Ar), 128,5 (Ar), 128,4 (Ar), 127,7 (Ar), 127,5 (Ar), 126,4 (Ar), 125,2, 113,0 (Ar), 85,0, 84,5 (TC), 79,6 (4’C), 63,6 (5’C), 61,4 (2’C), 60,9 (3’C), 54,9 (-OCH3). 6-A/-Benzoil-2’-0-benzoil-5’-0-(4,4’-dimetoxitritil)-2’,3’-secoadenosina (103-A)

O nucleosídeo 102-A (2,01 g, 2,98 mmol) foi coevaporado com MeCN anidro (2 x 30 mL) e seco durante a noite. O resíduo resultante foi dissolvido em DCM anidro (150 mL) em conjunto com DBU anidro (900 mg, 5,96 mmol) e a mistura foi resfriada a -70°C. 0,5 M de solução de cloreto de benzoila (6,56 mL, 3,28 mmol) foi lentamente adicionado à mistura. A mistura da reação foi agitada por 1 h a -70°C e subsequentemente deixada atingir a temperatura ambiente, depois do que EtOH (5 mL) foi adicionado. A mistura da reação foi lavada com solução aquosa saturada de NaHCO3 (3 x 150 mL) e salmoura (150 mL). A fase aquosa combinada foi extraída de volta com CH2CI2 (100 mL). As fases orgânicas foram combinadas e evaporadas. O resíduo resultante foi purificado por cromatografia de coluna (EtOAc em éter de petróleo de 0 a 100%), produzindo 0 nucleosídeo do produto 103-A como uma espuma branca após a evaporação dos solventes. Rendimento: 1,69 g (73%). Rf: 0,49 (EtOAc). 1H NMR (DMSO-cfe): δ 11,28 (s, 1H, NH), 8,82 (s, 1H, adenina CH), 8,76 (s, 1H, a- denina CH), 8,06 (d, 2H, Ar), 7,79 (d, 2H, Ar), 7,55-7,40 (m, 6H, Ar), 7,25-6,89 (m, 10, Ar), 6,77 (dd, 4H, Ar), 6,51 (t, 1H, H1’), 4,99 (m, 2H, H2’), 4,91 (t, 1H, 3’OH), 3,89 (ap, s, 1H, H4’), 3,72 (s, 6H, 2 x -OCH3), 3,54 (m, 2H, H3’), 2,81 (m, 2H, H5’). 13C NMR (DMSO-d6): δ 165,0, 157,9, 152,4, 150,5, 144,6, 142,9 (adenina CH), 135,6, 133,6 (Ar), 132,4 (Ar), 129,0 (Ar), 128,8 (Ar), 128,4 (Ar), 127,5 (Ar), 125,2 (Ar), 113,0 (Ar), 85,1, 81,5 (CT), 79,9 (C4’), 63,8 (C2’), 63,5, 54,9 (-OCH3). ESI-HiRes (mNa+): m/z: 802,2848 calc.: 802,2847. 6-A/-Benzoil-2’-0-benzoil-3’-0-(2-cianoetoxi(diisoDroDilamino)fosfino)-5’-0-(4,4’- dimetoxitritil)-2’,3’-secoadenosina (104-A)

O nucleosídeo 103-A (1,69 g, 2,17 mmol) foi coevaporado com MeCN (2 x 20 mL) e seco por 12 h no vácuo. O resíduo foi dissolvido em DIPEA em MeCN a 20% (40 mL) e a mistura resultante foi agitada. Adicionou-se 2-Cianoetil-/V,/V-diisopropilclorofosforamidita [P(CI)(OCH2CH2CN)(N(iPr)2); 1,0 mL] à mistura da reação, que foi agitada por 40 min. Adicionou-se 2-cianoetil-A/,A/-diisopropilclorofosforamidita (0,2 mL) e a mistura resultante foi agitada por 3 horas. EtOH (5 mL) foi adicionado e a mistura foi lavada com solução aquosa saturada de NaHCO3 (3 x 50 mL) e a fase aquosa foi extraída de volta com DCM (50 mL). As fases orgânicas foram reunidas e evaporadas. O produto bruto foi purificado por croma- tografia de coluna (EtOAc em éter de petróleo de 0 a 100%), para produzir uma espuma branca após a evaporação dos solventes. Rendimento: 1,52 g (71%). Rf: 0,75 (MeOH em DCM a 5%). 31P NMR (MeCN): δ 148,9. ESI-HiRes (mNa+): m/z: 1002,3885 calc.: 1002,3926. 4-A/-Acetil-5’-O-(4,4’-dimetoxitritil)-2’,3’-secocitidina (102-C)

4-AZ-Acetilcitidina (11,75 g, 41,18 mmol) foi coevaporada com piridina anidra (50 mL). O resíduo resultante foi dissolvido em piridina anidra (160 mL). DMT-CI (4,4’- dimetoxitritilcloreto; 16,76 g, 49,42 mmol) foi adicionado como um material sólido e a mistura resultante foi agitada por 2 horas sob temperatura ambiente. A mistura da reação foi lavada com solução aquosa saturada de NaHCO3 (3 x 50 mL), e a fase orgânica foi evaporada para produzir um espuma branca que foi seca.Este resíduo foi dissolvido em dioxano (500 mL) e água (100 mL). NalO4 (10,62 g, 49,5 mmol) foi dissolvido em água (100 mL) e adicionado ao nucleosídeo dissolvido. A mistura foi agitada por 1 he durante esse período um precipitado branco foi formado. Mais 400 mL de dioxano foram adicionados e a agitação continuou por 15 min. O precipitado foi filtrado e lavado com dioxano (200 mL). Os filtrados foram combinados e NaBH4 (1720 mg, 45,5 mmol) foi adicionando, e a agitação foi mantida por 30 min. Para neutralizar a mistura da reação, uma solução tampão (10 mL, 1:1 - AcOH:piridina) foi adicionada até que o pH 7 foi atingido. A reação da mistura foi evaporada até 300 mL e extraída com EtOAc (150 mL). A fase orgânica foi lavada com solução aquosa saturada de NaHCO3 (3 x 200 mL) e evaporada. O resíduo foi purificado por cromatografia de coluna com um gradiente de MeOH em EtOAc para propiciar um produto como material sólido branco após a evaporação dos solventes. Rendimento: 17,24g (71%). Rf: 0,19 (MeOH em CHCI3 a 5%). 1H NMR (DMSO-cfe): δ 10,94 (s, 1H, NH), 8,08 (d, 1H, J=7,32 Hz, Citidina CH), 7,31- 7,12 (m, 12H, Ar/Citidina CH), 6,85 (d, 4H, Ar), 5,96 (t, 1H, HT), 5,13 (t, 1H, 2’OH), 4,74 (t, 1H, 3’OH), 3,73 (s, 6H, 2 x -OCH3), 3,63 (m, 3H, H27H4’), 3,43 (m, 2, H3’), 3,00 (m, 2H, H5’), 2,13 (s, 3H, -CH3). 13C NMR (DMSO-d6): δ 170,9, 162,3, 158,0, 155,4, 146,1 (Citidina C5/C6), 144,6, 135,6, 129,6 (ar), 127,7 (ar), 126,6 (ar), 113,1 (ar), 95,4 (Citidina C5/C6), 85,5, 84,7 (CT), 79,4 (C27C4’), 63,8 (C5’), 61,7 (C27C4’), 60,5 (C3’), 55,0 (-OCH3), 24,3 (-CH3). ESl-HiRes (mNa+): m/z: 612,2298 calc.: 612,2316. 4-A/-Acetil-2’-0-benzoil-5’-0-(4.4’-dimetoxitritil)-2’,3’-secocitidina (103-C)

O nucleosídeo 102-C (3,03 g, 5,14 mmol) foi coevaporado com tolueno anidro (2 x 30 mL) e seco por12 h no vácuo. O resíduo resultante foi dissolvido em DCM anidro (150 mL) em conjunto com DBU anidro (1,5 mL, 10,3 mmol) e a mistura resultante foi resfriada a - 70°C. Cloreto de benzoila (6,56 mL, 5,65 mmol) foi lentamente adicionado à mistura da reação. A mistura da reação foi agitada por 1 h a -70°C e subsequentemente deixada atingir a temperatura ambiente depois do que EtOH (4 mL) foi adicionado. A mistura da reação foi lavada com solução aquosa saturada de NaHCO3 (2 x 150 mL). As fases orgânicas foram combinadas e evaporadas. O resíduo resultante foi purificado por cromatografia de coluna (MeOH em CHCI3 de 0 a 5%), produzindo o produto nucleosídeo 103-C como uma espuma branca após a evaporação dos solventes. Rendimento: 2,08 g (64%). Rf: 0,24 (MeOH em CHCI3a 5%). 1H NMR (DMSO-cfe): δ 10,97 (s, 1H, NH), 8,25 (d, 1H, Citidinas CH), 7,91 (d, 2H, Ar), 7,65 (ap, t, 1H, Ar) 7,32-7,12 (m, 12H, Ar/Citidinas CH), 6,83 (d, 4H, Ar), 6,34 (t, 1H, H1’)> 4,84 (t, 1H, 3’OH), 4,58 (dq, 2H, H2’), 3,74 (s, 6H, 2 x -OCH3), 3,70-3,64 (m, 1H, H4’), 3,48 (m, 2H, H3’), 3,07 (m, 2H, H5’), 2,14 (s, 3H, -CH3). 13C NMR (DMSO-cfe): δ 171,0, 165,0, 162,5, 157,1, 145,5 (Citidina C5/C6), 144,6, 135,48,133,6, 129,6 (Ar), 128,8 (Ar), 127,7 (Ar), 127,6 (Ar), 126,6 (Ar), 113,1 (Ar), 95,8 (Citidina C5/C6), 85,6, 82,0 (CT), 79,6 (C4’), 79,2 63,9 (C2’), 63,7, 60,5 (C3’), 54,9 (-OCH3), 24,3 (-CH3). ESl-HiRes (mNa+): m/z: 716,2589 calc.: 716,2759. 4-/V-Acetil-2’-0-benzoil-3’-0-(2-cianoetoxi(diisopropilamino)fosfino)-5’-Q-(4,4’- dimetoxitriti0-2’,3’-secocitidina (104-C)

O nucleosídeo 103-C (1,49 g, 2,15 mmol) foi coevaporado com MeCN anidro (2 x 20 mL). O resíduo foi dissolvido em DIPEA em MeCN a 20%( 20 mL) e a mistura foi agitada. 2-Cianoetil-A/,A/-diisopropiclorofosforamidita [P(CI)(OCH2CH2CN)(N(iPr)2); 0,8 mL] foi adicionado à mistura e a agitação foi mantida por 40 min. Adicionou-se mais 2-cianoetil-A/,/V- diisopropilclorofosforamidita (0,4 mL) e a agitação prosseguiu por 3 h. EtOH (5 mL) foi adicionado e a mistura resultante foi lavada com solução aquosa saturada de NaHCO3 (3 x 50 mL) e a fase aquosa foi extraída de volta com DCM (50 mL). As fases orgânicas foram combinadas e evaporadas. O resíduo resultante foi purificado por cromatografia de coluna (EtOAc em éter de petróleo de 0 a 100%) para produzir o nucleosídeo 104-C como uma espuma branca após a evaporação dos solventes. Rendimento: 940 mg (44%). Rf: 0,42 (MeOH em DCM a 5%). 31P NMR (MeCN): δ 148,8. ESl-HiRes (mNa+): m/z: 916,3622 calc.: 916,3657. 5’-0-(4,4’-Dimetoxitritil)-2-/V-isobutiril-2’,3,-secoquanosina (102-G)

2-A/-lsobutirilguanosina (11,68 g, 17,8 mmol) foi coevaporada com piridina anidra (50 mL). O resíduo resultante foi dissolvido em piridina anidra (100 mL). DMT-CI (4,4- dimetoxitritilcloreto; 7,26 g, 21,46 mmol) foi adicionado como um material sólido e a mistura da reação foi agitada por 1 h sob temperatura ambiente. DMAP (50 mg, 0,40 mmol) foi adicionado e a mistura resultante foi agitada por mais 12 h. A mistura da reação foi então lavada com solução aquosa saturada de NaHCO3 (3 x 50 mL) e a fase orgânica evaporada para produzir uma espuma branca.Este resíduo foi dissolvido em dioxano (250 mL) e água (50 mL). NalO4 (4,57 g, 21,3 mmol) foi dissolvido em água (50 mL) e foi adicionado ao nucleosídeo dissolvido. A mistura foi agitada por 1 he durante esse período um precipitado branco se formou. Foram adicionados mais 200 mL de dioxano e a agitação foi mantida por 15 min. O precipitado foi filtrado e lavado com dioxano (100 mL). Os filtrados foram coletados e Na- BH4 (748 mg, 19,77 mmol) foi adicionado e a mistura resultante foi agitada por 30 min. sob temperatura ambiente. Uma solução tampão (10 mL, 1:1 - AcOH:piridina) foi adicionada para neutralizar, até atingir o pH 7. O volume da mistura resultante foi reduzido para 150 mL e a extração foi realizada usando EtOAc (150 mL). A fase orgânica foi lavada com solução aquosa saturada de NaHCO3 (3 x 100 mL) e evaporada, e o resíduo foi purificado por cro- matografia de coluna usando um gradiente de 0 a 10% (1:1 MeOH:i-PrOH) em DCM para produzir o produto como um material sólido branco após a evaporação dos solventes. Rendimento: 8,02g (68%). Rf: 0,24 (MeOH em CH2CI2 a 7%). 13C NMR (DMSO-d6): δ 180,2, 157,9, 154,9, 147,8, 144,7, 135,4, 129,3 (Ar), 127,5 (Ar), 127,4 (Ar), 126,4 (Ar), 120,4, 113,0 (Ar), 85,2, 85,1 (C1’), 79,9 (C4’), 63,5 (C5’), 61,7 (C2’), 61,1 (C3’)> 54,9 (-OCH3), 34,7 (i-Pr quaternário), 18,9 (i-Pr), 18,8 (i-Pr). MALDI-HiRes (mNa+): m/z: 680,2679 calc.: 680,2691. 2’-O-Benzoil-5’-O-(4,4’-dimetoxitritil)-2-A/-isobutiril-2’,3’-secoguanosina (103-G)

O nucleosídeo 102-G foi suspenso em tolueno anidro (2 * 30 mL) e evaporado. O resíduo resultante foi seco por 12 h no vácuo. O resíduo foi dissolvido em DCM anidro (100 mL) em conjunto com DBU anidro (0,9 mL, 6,1 mmol) e a mistura resultante foi resfriada a - 70°C. Cloreto de benzoila (390 μL, 3,36 mmol) foi lentamente adicionado à mistura da reação. A mistura da reação foi agitada por 1 h a -70°C e subsequentemente deixada atingir a temperatura ambiente depois do que EtOH (4 mL) foi adicionado. A mistura resultante foi lavada com solução aquosa saturada de NaHCO3 (2 x 1OO mL) e as fases orgânicas foram combinadas e evaporadas. O resíduo resultante foi purificado por cromatografia de coluna (MeOH em CHCI3 de 0 a 5%), produzindo o nucleosídeo 103-G como uma espuma branca após a evaporação dos solventes. Rendimento: 1,49 g (63%). Rf: 0,47 ( MeOH em CH2CI2 a 7%). 1H NMR (DMSO-d6): δ 12,10 (s, 1H, NH), 11,72 (s, 1H, NH), 8,32 (s, 1H, guanidina H8), 7,85-7,79 (m, 2H, Ar), 7,65-7,63 (m, 1H, Ar), 7,51-7,45 (m, 2H, Ar), 7,26-6,97 (m, 11H, Ar), 6,79 (m, 4H, Ar), 6,18 (t, 1H, HT), 5,04-4,82 (m, 3H, H273’OH), 3,82 (m, 1H, H4’), 3,72 (s, 6H, 2 x -OCH3), 3,49 (t, 2H, H3’), 3,03-2,74 (m, 3H, H57 i-Pr quaternário), 1,11 (ap, t, 6H, 2 x -CH3). 13C NMR (DMSO-d6): δ 180,1, 164,9, 157,8, 154,8, 148,6, 147,9, 144,6, 138,4, 135,5, 135,3, 133,6, 129,3 (Ar), 129,0 (ar), 128,8 (ar), 128,7 (ar), 127,6 (ar), 127,4 (ar), 126,3 (ar), 120,6, 112,9 (ar), 85,1, 82,0 (CT), 80,1 (C4’), 63,7, 63,3 (C5’), 61,0 (C3’), 54,8 (-OCH3), 34,6 (i-Pr quaternário), 18,8 (-CH3), 18,6 (-CH3). ESl-HiRes (mNa+): m/z: 784,2943 calc.: 784,2953. 2’-0-Benzoil-3’-0-(2-cianoetoxi(diisoDropilamino)fosfíno)-5’-0-(4,4’-dimetoxitritil)-2- A/-isobutiril-2’.3’-secoguanosina (104-G)

O nucleosídeo 103-G (1,45 g, 1,9 mmol) foi coevaporado com MeCN anidro (2 x 20 mL). O resíduo foi dissolvido em DIPEA em MeCN a 20%(20 mL) e a mistura resultante foi agitada. 2-Cianoetil-A/,A/-diisopropilclorofosforamidita [P(CI)(OCH2CH2CN)(N(iPr)2); 0,65 mL] foi adicionado à mistura da reação e a agitação foi mantida por 40 min. EtOH (5 mL) foi adicionado e a mistura resultante foi lavada com solução aquosa saturada de NaHCO3 (3 x 50 mL) e a fase aquosa foi extraída de volta com DCM (50 mL). As fases orgânicas foram reunidas e evaporadas. O resíduo foi precipitado a partir do éter de petróleo a partir de uma solução em EtOAc para fornecer amidita 104-G como um material sólido branco após a secagem. Rendimento: 607 mg (33%). Rf: 0,3 (1:3 Acetona:tolueno). 31P NMR (MeCN): δ 148,6. ESI-HiRes (mNa+): m/z: 984,4028 calc.: 984,4031.

Exemplo 12. Síntese de blocos construtores monoméricos funcionalizados por piperazino O exemplo descreve os procedimentos que foram conduzidos para exemplificar a síntese dos blocos construtores de amidita monoméricos contendo uma funcionalidade amino afixada na posição C2’- de um monômero, isto é, a síntese do bloco construtor monomé- rico 111 funcionalizado por C2’-piperazino (amidita J; base = uracila), iniciando a partir do nucleosídeo 103-U via compostos 105, 106, 107, 108, 109 e 110. DMTrO-]n2’-0-Benzoil-3’-0-tert-butildimetelsilil-5’-Q-(4.4’-dimetoxitritil)-2’,3’-secouridina (105)

O nucleosídeo 103-U (328 mg, 0,50 mmol) foi dissolvido em piridina anidra (2 mL) e agitado sob temperatura ambiente. TBDMS- Cl (113 mg, 0,75 mmol) foi adicionado à mistura da reação que foi agitada por 19 h. Água (1 mL) foi então adicionada e a agitação foi mantida por mais 15 min., depois do que a mistura da reação foi diluída com DCM (50 mL) e lavada com solução aquosa saturada de NaHCO3 (2 x 25 mL) e salmoura (25 mL). A fase orgânica foi seca sobre Na2SO4, filtrada e evaporada até secar, sob pressão reduzida. O resíduo foi purificado por cromatografia de coluna com gel de sílica usando MeOH (0 a 8%) em DCM como eluen- te, assim produzindo o nucleosídeo 105 como um material sólido branco. Rendimento: 294 mg (78%). 1H NMR (300 MHz, DMSO-d6) δ 11,46 (s, 1H, NH), 7,95-7,79 (m, 3H), 7,71-7,63 (m, 1H), 7,57-7,48 (m, 2H), 7,37-7,13 (m, 9H), 6,84 (d, J = 8,8 Hz, 4H), 6,22 (t, J = 5,7 Hz, 1H, H1’), 5,58 (d, J = 8,0 Hz, 1H, H5), 4,69-4,45 (m, 2H, H2’), 3,80-3,64 (m, 8H, 2*OMe e H4’), 3,54 (t, J = 4,7 Hz, 1H, H3’), 3,09-2,97 (m, 2H, H5’), 0,73 (s, 9H, 3xMe), -0,07 e -0,09 (2xs, 6H, 2xMe), 13C NMR (75,5 MHz, DMSO-d6): δ 165,0, 163,1, 158,0, 151,1, 144,7, 140,6, 135,5, 135,4, 133,7, 129,6, 129,1, 129,0, 128,8, 127,8, 127,6, 126,6, 113,1, 102,3, 85,5, 81,1, 79,2, 63,4, 63,1, 62,1, 55,0, 25,6, 17,7, 2x-5,7, ESI-HRMS: m/z 789,3147 ([M+Na]+, C43H5oN209Si-Na calc. 789,3178).

D M TrO —| 635?3’-O-tert-Butildimetilsilil-5’-O-(4.4’-dimetoxitritil)-2’,3’-secouridina NaOH (845 mg, 21,1 mmol) foi misturado com MeOH anidro (200 mL) e a mistura resultante foi resfriada a 0 °C. O nucleosídeo 105 (3,10 g, 4,05 mmol) foi dissolvido em MeOH anidro (40 mL) e a mistura resultante foi adicionada à mistura acima e a mistura da reação resultante foi agitada por 2,5 h. Solução aquosa saturada de NH4CI (10 mL) foi adicionada e a agitação foi mantida por mais 10 min. depois do que água (100 mL) foi adicionada e a extração foi realizada utilizando DCM (4 x 200 mL). A fase orgânica foi evaporada até secar, sob pressão reduzida e o resíduo então foi coevaporado com piridi- na anidra (10 mL). O resíduo foi purificado por cromatografia de coluna com gel de sílica utilizando MeOH (5 a 10%) em DCM como eluente, produzindo assim o nucleosídeo 106 como um material sólido branco. Rendimento: 2,54 g (95%). 1H NMR (300 MHz, DMSO-d6): δ 11,35 (s, 1H, NH), 7,66 (d, J = 7,6 Hz, 1H, H6), 7,33-7,14 (m, 9H), 6,88-6,82 (m, 4H), 5,82 (t, J = 6,0 Hz, 1H, HT), 5,53 (d, J = 8 Hz, 1H, H5), 5,11 (t, J = 5,8 Hz, 1H, 2’-OH), 3,73 (s, 6H, 2xQMe), 3,69-3,45 (m, 5H, H2’, H4’ e H3’), 3,01-2,93 (m, 2H, H5’), 0,76 (s, 9H, 3xMe), - 0,03 e -0,05 (2xS, 6H, 2xMe), 13C NMR (75,5 MHz, DMSO-d6): δ 163,2, 158,0, 151,6, 144,8, 135,6, 135,4, 129,6, 127,7, 127,6, 126,6, 113,1, 101,8, 85,4, 83,5, 78,5, 63,3, 61,8, 61,0, 55,0, 25,6, 17,7, 2x-5,6, ESI-HRMS: m/z 685,2885 ([M+Na]+, C36H46N2O8Si-Na calc. 685,2916).

DMTrO-1Q V3’-O-tert-Butildimetilsilil-5’-O-(4.4’-dimetoxitritil)-2’-O- 'sxθO-2gO nucleosídeo 106 (927 mg, 1,40 mmol) foi dissolvido em pi- \ O ridina anidra (20 mL) e a mistura resultante foi agitada a 0 °C. MsCI (220 μL, 2,83 mmol) foi adicionado em gotas e a mistura resultante foi agitada por 3 h sob temperatura ambiente. EtOH (2 mL) foi adicionado e a agitação foi mantida por mais 10 min. A mistura foi então evaporada para até secar e o resíduo foi purificado por cromatografia de coluna de gel de sílica usando MeOH (0 a 7%) em DCM como eluente, produzindo assim o nucleosídeo 107 como uma espuma branca. Rendimento: 834 mg (81%). 1H NMR (300 MHz, DMSO-cfe): δ 11,49 (s, 1H, NH), 7,77 (d, J = 8,2 Hz, 1H, H6), 7,35-7,14 (m, 9H), 6,86 (d, J=8,5 Hz, 4H), 6,11 (t, J = 5,7Hz, 1H, HT), 5,60 (d, J = 8,1 Hz, 1H, H5), 4,49 (d, J=5,5 Hz, 2H, H2’), 3,77-3,48 (m, 9H, 2xOMe, H4’ e H3’), 3,22 (s, 3H, Me), 3,10-2,89 (m, 2H, H5’), 0,77 (s, 9H, 3xMe), -0,02 e -0,04 (2xs, 6H, 2xMe), 13C NMR (75,5 MHz, DMSO-cfe): δ 163,1, 158,0, 151,7, 144,7, 140,5, 135,5, 135,3, 129,6, 127,8, 127,6, 126,6, 113,1, 102,4, 85,5, 80,6, 79,1, 67,8, 63,1, 61,8, 55,0, 36,8, 25,6, 17,7, -5,6, -5,7, ESI-HRMS: m/z 763,2662 ([M+Na]+, C37H48N2OioSSi Na calc. 763,2692). 3’-O-tert-Butildimetilsilil-2’-desoxi-5’-O-(4,4’-dimetoxitritil)-2’- DÍDerazino-2’,3’-secouridina (108)

O nucleosídeo 107 (276 mg, 0,373 mmol) foi dissolvido em pi- ridina anidra (3 mL) e adicionou-se piperazina (3,21 g, 37,3 mmol) sob agitação, sob temperatura ambiente. A mistura da reação foi então aquecida a 150 °C e agitada por 1 h, seguido de resfriamento até a temperatura ambiente. A mistura da reação foi diluída com solução aquosa de NaHCO3 (200 mL) depois do que a extração foi realizada com clorofórmio (7 x 100 mL). A fase orgânica foi seca sobre Na2SO4, filtrada e evaporada até secar. O resíduo foi purificado por cromatografia de coluna de gel de sílica, usando primeiro MeOH (0 a 5%) em DCM e então metade de solução saturada de amónia metanólica (a 5%) em DCM como sistemas eluentes, produzindo assim o nucleosídeo 108 como um material sólido branco. Rendimento: 182 mg (67%). 1H NMR (300 MHz, DMSO-cfe): δ 7,64 (d, J = 8,1 Hz, 1H, H6), 7,34-7,13 (m, 9H), 6,85 (d, J= 7,8 Hz, 4H), 5,98 (t, J = 6,0 Hz, 1H, H1’), 5,53 (d, J = 8,1 Hz, 1H, H5), 3,72 (s, 6H, 2xOMe), 3,68-3,51 (m, 3H, H4’ e H3’), 3,04-2,90 (m, 2H, H5’), 2,77- 2,54 (m, 6H, H2’, piperazino), 2,48-2,27 (m, 4H, piperazino), 0,77, (s, 9H, 3xMe), -0,02 e - 0,04 (2xs, 6H, 2xMe), 13C NMR (75,5 MHz, DMSO-cfe): δ 163,2, 158,0, 151,3, 144,8, 141,1(C6), 135,6, 135,4, 129,5, 127,7, 127,6, 126,6, 113,1, 113,1, 101,8 (C5), 85,4, 81,3 (CV), 78,3, 63,1, 62,1, 60,1, 55,0 (OMe), 55,0(OMe), 53,8, 45,3, 25,7 (Me), 17,8, -5,5 (Me), - 5,6 (Me), ESI-HRMS: m/z 731,3859 ([M+H]+, C4oH54N407Si-H calc. 731,3834). DMTrO—iQ Y3’-O-tert-Butildimetilsilil-2’-desoxi-5’-O-(4,4’-dimetoxitritil)-2’- V / (4-/V-trifluoroacetil)Diperazino-2’,3’-secouridina (109)

θ nucleosídeo 108 (102 mg, 0,14 mmol) foi dissolvido em L J MeOH anidro (2 mL) e a mistura resultante foi agitada sob tempera- N J tura ambiente. DMAP (10 mg, 0,08 mmol) e trifluoroacetato de etila O^^CF 3 (22 μL, 0,184 mmol) foram adicionados e a agitação foi mantida por 16 h. A mistura foi então evaporada até secar, sob pressão reduzida e o resíduo foi purificado por cromatografia de coluna de gel de sílica usando MeOH (0 a 2%) em DCM como elu- ente, produzindo assim o nucleosídeo 109 como um material sólido branco. Rendimento: 100 mg (86%). 1H NMR (300 MHz, DMSO-d6): δ 11,37 (s, 1H, NH), 7,66 (d, J = 7,8 Hz, 1H, H6), 7,38-7,12 (m, 9H), 6,93-6,80 (m, 4H), 6,00 (t, J = 5,9 Hz, 1H, HT), 5,54 (d, J = 7,8 Hz, 1H, H5), 3,73 (s, 6H, 2x OMe), 3,70-3,40 (m, 7H, H3’, H4’ e piperazino), 3,08-2,92 (m, 2H, H5’), 2,90-2,52 (m, 6H, H2’ e piperazino), 0,77 (s, 9H, 3xMe), 0,00 e -0,04 (2xS, 6H, 2xMe), 13C NMR (75,5 MHz, DMSO-cfe): <5 163,2, 158,0, 151,3, 144,8, 140,8, 135,6, 135,4, 129,5, 127,7, 127,6, 126,6, 113,1, 102,0, 85,5, 81,0, 78,2, 63,1, 62,0, 58,9, 55,0, 52,6, 52,0, 45,4, 43,0, 25,6, 17,8, -5,6, -5,6, ESI-HRMS: m/z 849,3452 ([M+Na]+, C42H53F3N4O8SiNa calc. 849,3477). DMTrO-i 0 Y \/352’-Desoxi-5’-O-(4.4’-dimetoxitritil)-2’-(/V-OH^N^ trifluoroacetil)DÍDerazino-2’.3’-secouridina (110)

< JO nucleosídeo 109 (251 mg, 0,304 mmol) foi coevaporadocom THF anidro (2 *5 mL) e então dissolvido em THF anidro (10 mL). TBAF a 1M em THF (606 μL, 0,606 mmol) foi adicionado em gotas sob agitação à esta mistura sob temperatura ambiente durante 1 h e sob agitação e sob temperatura ambiente que foi então mantida por 21 h. A mistura da reação foi evaporada até secar, sob pressão reduzida e o resíduo então dissolvido em EtOAc (40 mL). A mistura resultante foi lavada com solução aquosa saturada de NaHCO3 (3 x 10 mL) e água (3 x 10 mL), e a fase orgânica separada foi seca sobre Na2SO4, filtrada e evaporada até secar, sob pressão reduzida. O resíduo foi purificado por cromatografia de coluna de gel de sílica usando EtOAc (60 a 100%) em éter de petróleo como eluente, produzindo assim o nucleosídeo 110 como um material sólido branco. Rendimento: 111 mg (51%). 1H NMR (300 MHz, DMSO-cfe): δ11,36 (s, 1H, NH), 7,66 (d, J = 8,1 Hz, 1H, H6), 7,34-7,27 (m, 4H), 7,24-7,14 (m, 5H), 6,92-6,82 (m, 4H), 5,98 (t, J= 6,1 Hz, 1H, H1’), 5,53 (d, J = 7,3 Hz, 1H, H5), 4,80 (t, J= 5,3 Hz, 1H, 3’-OH), 3,73 (s, 6H, 2xQMe), 3,63- 3,38 (m, 8H, H4’, H3’ e piperazino), 3,07-2,89 (m, 2H, H5’), 2,77 (t, J = 5,8 Hz, 2H, H2’), 2,66-2,54 (m, 3H, piperazino), 13C NMR (75,5 MHz, DMSO-d6): δ 163,2, 158,0, 151,2, 144,8, 140,9, 135,6, 135,5, 129,6, 129,6, 127,8, 127,6, 126,6, 113,1, 101,9, 85,4, 81,3, 79,2, 63,5, 60,7, 59,1, 55,0, 52,7, 52,1, 45,4, 42,9, ESI-HRMS: m/z 735,2585 ([M+Na]+, C36H39F3N4O8Na calc. 735,2612). 3’-(2-Cianoetoxi(diisoDroDilamino)fosfino)-2’-desoxi-5’-O- (4,4’-dimetoxitritil)-2,-(/\/-trifluoroacetil)Diperazino-2’,3’-secouridina(111)

JO nucleosídeo 110 (91 mg, 0,128 mmol) foi coevaporado N com DCM anidro (2*5 mL) e então dissolvido em DCM anidro 0 Cl=3 (2,5 mL). DIPEA (111 μL, 0,64 mol) foi adicionado sob agitação a esta mistura sob temperatura ambiente depois do que 2-cianoetil N,N- diisopropilfosfamidocloridita (57 μL, 0,256 mmol) foi adicionado em gotas. A agitação sob temperatura ambiente foi mantida por 1 h, depois do que EtOH (0,5 mL) foi adicionado seguido por agitação por mais 10 min. Foi adicionado DCM (40 mL) seguido de lavagem com solução aquosa saturada de NaHCO3 (20 mL). A fase orgânica separada sobre Na2SO4, filtrada e evaporada até secar, sob pressão reduzida. O resíduo foi purificado por cromatografia de coluna com gel de sílica usando EtOAc (60 a 80%) em éter de petróleo como eluente, produzindo assim amidita 111 como um material sólido branco. Rendimento: 106 mg (91%). 31P NMR (CDCI3) δ 150,0 e 149,5. ESI-HRMS: m/z 913,3841 ([M+H]+, C45H56F3N6O9P H calc. 913,3871).

Exemplo 13. Síntese dos oligonucleotídeos contendo blocos construtores monoméricos funcionalizados por piperazino.

Pelo uso dos métodos descritos no Exemplo 1, a incorporação eficiente do monô- mero J com urn NH de terminal livre no componente piperazino foi conseguida usando ami- ditas do RNA e amidita 111. Os rendimentos conjugados deste amidita foram acima de 95%.

Claims

1.RNA duplo CARACTERIZADO pelo fato de que compreende pelo menos um oli- gonucleotídeo compreendendo uma sequência de nucleotídeos que é complementar ao mRNA alvo, em que o oligonucleotídeo compreende um monômero 2’-3’-seco-nucleotídeo acíclico, em que o RNA duplo diminui a expressão de um mRNA alvo.

2.RNA duplo, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que o monômero acíclico é um monômero 2’-3’-seco-nucleotídeo tendo o grupo 2’-hidroxila substituído em um grupo amino, amino acilado, amino alquilado, amino dialquilado, amino carbamoilado, piperazino, piperazino acilado, piperazino alquilado, piperazino carbamoilado, mercapto, mercapto acilado, mercapto alquilado, dissulfeto, hidroxila acilada, hidroxila alquilada ou hidroxila carbamoilada.

3.RNA duplo, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, CARACTERIZADO pelo fato de que o nucleotídeo monomérico acíclico é selecionado do grupo de monômeros D, F, G, H, I e J:

em que R é selecionado do grupo que consiste em H, alquila, um derivado de colesterol, um fluoróforo, uma poliamina, um ácido graxo, um aminoácido, um sacarídeo ou um polipetídeo.

4.RNA duplo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, CARACTERIZADO pelo fato de que o monômero acíclico está localizado na região de semente do filamento antissenso.

5.RNA duplo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, CARACTERIZADO pelo fato de que adicionalmente compreende de 15 a 40 monômeros nucleotídeos e um monômero nucleotídeo acíclico.

6.RNA duplo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, CARACTERIZADO pelo fato de adicionalmente compreender de um a cinco monômeros acíclicos.

7.RNA duplo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, CARACTERIZADO pelo fato de que adicionalmente compreende menos que quatro monô- meros de DNA consecutivos e um monômero nucleotídeo acíclico.

8.RNA duplo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, CARACTERIZADO pelo fato de que adicionalmente compreende mais que 50% de monô- meros de RNA e um monômero nucleotídeo acíclico.

9.RNA duplo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende pelo menos um oligonucleotideo que compreende um monômero nucleotídeo acíclico e um análogo nucleotídeo selecionado de monômeros do 2'-O-alquil-RNA, monômeros do 2'-amino-DNA, monômeros do 2'-fluoro- DNA, monômeros do LNA, monômeros do PNA, monômeros do HNA, monômeros do ANA, monômeros do FANA, monômeros do CeNA, monômeros do ENA, monômeros do DNA e monômeros do INA.

10.RNA duplo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende pelo menos um oligonucleotídeo compreendendo um monômero nucleotídeo de acíclico e pelo menos dois análogos de nucleotídeos do LNA.

11.RNA duplo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, CARACTERIZADO pelo fato de adicionalmente compreender uma ligação de fosforotioato ou uma ligação de boranofosfato.

12.RNA duplo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, CARACTERIZADO pelo fato de que o RNA duplo é capaz de mediar repressão ou degradação translacional dependente de RISC dos mRNAs alvos complementares ao oligonucleotí- deo.

13.RNA duplo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende um número de pares de bases de 15 a 40; ou compreendendo um número de pares de bases de 14 a 26 pares de bases.

14.RNA duplo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13, CARACTERIZADO pelo fato de adicionalmente compreender pelo menos uma terminação, pelo menos uma terminação 3’.

15.RNA duplo, de acordo com a reivindicação 14, CARACTERIZADO pelo fato de que o comprimento da terminação é de 1 a 14 nucleotídeos.

16.RNA duplo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 15, CARACTERIZADO pelo fato de que adicionalmente compreende pelo menos uma terminação do filamento antissenso compreende pelo menos um monômero acíclico.

17.RNAduplo,deacordocomqualquerumadasreivindicações1a16, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende pelo menos uma extremidade cega.

18.RNAduplo,deacordocomqualquerumadasreivindicações1a17, CARACTERIZADO pelo fato de que adicionalmente compreende um oligonucleotídeo compreendendo uma sequência de nucleotídeos que é complementar a um mRNA alvo em que o RNA duplo diminui a expressão do mRNA alvo.

19.RNA duplo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 18, CARACTERIZADO pelo fato de que é para diminuição do nível de expressão de um mRNA alvo em uma célula.

20.RNAduplo,deacordocomqualquerumadasreivindicações1a18, CARACTERIZADO pelo fato de que é para o uso no tratamento de doença.

21.RNAduplo,deacordocomqualquerumadasreivindicações1a18, CARACTERIZADO pelo fato de que é para uso em regulação de gene guiada por RNA ou análise de gene; preferencialmente para uso na interferência de RNA.

22.Oligonucleotídeo CARACTERIZADO pelo fato de que compreende um monô- mero acíclico, em que o monômero acíclico diminui a expressão de um mRNA alvo e em que o monômero acíclico é um monômero 2’-3’-seco-nucleotídeo tendo o grupo 2’-hidroxila substituído em um grupo amino, amino acilado, amino alquilado, amino dialquilado, amino carbamoilado, piperazino, piperazino acilado, piperazino alquilado, piperazino carbamoilado, mercapto, mercapto acilado, mercapto alquilado, dissulfeto, hidroxila acilada, hidroxila alquilada ou hidroxila carbamoilada.

23.Oligonucleotídeo CARACTERIZADO pelo fato de que compreende um monô- mero acíclico selecionado do grupo de monômeros F, G, H, I e J:

em que o oligonucleotideo diminui a expressão de um mRNA alvo e R é alquila, um derivado de colesterol, um fluoróforo, uma poliamina, um ácido graxo, um aminoácido, um sacarídeo ou um polipetídeo.

24. Composição farmacêutica CARACTERIZADA pelo fato de que compreende um RNA duplo, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 18, e um diluente, veículo ou adjuvante farmaceuticalmente aceitável.