JP2014531213A - 上皮又は間葉の表現型の診断用メチル化マーカー、及び腫瘍又は腫瘍細胞におけるｅｇｆｒキナーゼ阻害薬に対する応答 - Google Patents
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Abstract
本発明は、腫瘍の上皮及び間葉の表現型を決定し、腫瘍増殖がＥＧＦＲ阻害薬での処置に対して感受性であるか、又は抵抗性であるか否かを予測する方法を提供する。特に、ＣＬＤＮ７、ＨＯＸＣ４、ＣＰ２Ｌ３、ＴＢＣＤ、ＥＳＰＲ１、ＧＲＨＬ２、ＥＲＢＢ２、及びＣ２０ｏｒｆ５５からなる群から選択される少なくとも一つの遺伝子におけるＣｐＧ部位のＤＮＡメチル化の有無は、腫瘍増殖がＥＧＦＲキナーゼ阻害薬によって阻害される感受性を決定し、かつ／又はＥＦＧＲ阻害薬での処置が有益である可能性が高い癌患者を同定するための、腫瘍細胞における間葉の表現型のマーカーとして提供される。ＰＣＤＨ８、ＰＥＸ５Ｌ、ＧＡＬＲ１、及びＺＥＢ２からなる群から選択される少なくとも一つの遺伝子におけるＣｐＧ部位のＤＮＡメチル化の有無は、腫瘍細胞の上皮表現型のマーカーとして提供される。
Description
関連出願の相互参照
本出願は、２０１１年９月３０日出願の米国仮特許出願第６１／５４２，１４１号の利益を主張するものであり、その開示は全文が出典明示によって本明細書に援用される。
本出願は、２０１１年９月３０日出願の米国仮特許出願第６１／５４２，１４１号の利益を主張するものであり、その開示は全文が出典明示によって本明細書に援用される。
本発明は、遺伝子のメチル化状態に基づく癌治療に対する応答を予測する方法を提供する。
本発明は、癌患者を診断及び処置するための方法を対象とする。特に、本発明は、どの患者が上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）キナーゼ阻害薬での処置が有益であるかを決定するための方法を対象とする。
癌は、非制御の成長、分化の欠如、及び局所の組織に浸潤し、転移する能力によって特徴付けられる、広範囲の細胞性悪性疾患に対する総称である。これら新生物性の悪性疾患は、様々な程度の有病率で、身体におけるあらゆる組織及び器官に罹患する。
様々なタイプの癌を処置するために、過去数十年にわたって多数の治療薬が開発されている。最も一般的に用いられるタイプの抗癌薬には、ＤＮＡアルキル化剤（例えば、シクロホスファミド、イフォスファミド）、代謝拮抗薬（例えば、メトトレキセート、葉酸拮抗薬、及び５−フルオロウラシル、ピリミジン拮抗薬）、微小管破壊薬（ｄｉｓｒｕｐｔｅｒｓ）（例えば、ビンクリスチン、ビンブラスチン、パクリタキセル）、ＤＮＡインターカレーター（例えば、ドキソルビシン、ダウノマイシン、シスプラチン）、及びホルモン治療（例えば、タモキシフェン、フルタミド）が含まれる。
上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）ファミリーは、分化及び増殖などの細胞応答に関与する４つの密接に関連する受容体（ＨＥＲ１／ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、及びＨＥＲ４）を含んでいる。ＥＧＦＲキナーゼ、又はそのリガンドであるＴＧＦ−アルファの過剰発現は、乳癌、肺癌、結腸直腸癌、卵巣癌、腎細胞癌、膀胱癌、頭部及び頸部の癌、神経膠芽腫、ならびに星細胞腫を含めた多くの癌に関連することが多く、これら腫瘍の悪性の成長の一因であると考えられている。ＥＧＦＲ遺伝子（ＥＧＦＲｖＩＩＩ）における特定の欠失−変異も、細胞の腫瘍形成能を増大することが見出されている。ＥＧＦＲ刺激性シグナル伝達経路の活性化は、増殖、血管新生、細胞の運動性及び浸潤、アポトーシスの低下、ならびに薬物抵抗性の誘導など、潜在的に癌促進性である複数のプロセスを促進する。ＨＥＲ１／ＥＧＦＲ発現の増大は、進行型の疾患、転移、及び劣悪な予後につながることが頻繁にある。例えば、ＮＳＣＬＣ及び胃癌では、ＨＥＲ１／ＥＧＦＲ発現が増大すると、転移率が高くなり、腫瘍の分化が劣り、腫瘍増殖が増大することに相関することが示されている。
受容体の内在タンパク質であるチロシンキナーゼ活性を活性化し、かつ／又は下流のシグナル伝達を増大する変異は、ＮＳＣＬＣ及び神経膠芽腫において観察されている。しかし、エルロチニブ（ＴＡＲＣＥＶＡ（登録商標））又はゲフィチニブ（ＩＲＥＳＳＡ（商標））などのＥＧＦ受容体阻害薬に感受性を付与する主要なメカニズムとしての変異の役割には、議論の余地があった。最近、変異型の全長のＥＧＦ受容体が、ＥＧＦ受容体チロシンキナーゼ阻害薬ゲフィチニブに対する応答性を予測することが報告されている（Ｐａｅｚ，Ｊ．Ｇ．ら、（２００４年）Ｓｃｉｅｎｃｅ、３０４巻、１４９７〜１５００頁；Ｌｙｎｃｈ，Ｔ．Ｊ．ら、（２００４年）Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．、３５０巻、２１２９〜２１３９頁）。細胞培養試験は、変異型のＥＧＦ受容体を発現する細胞株（すなわち、Ｈ３２５５）は、ＥＧＦ受容体チロシンキナーゼ阻害薬ゲフィチニブによる成長阻害に対してより感受性であり、野生型ＥＧＦ受容体を発現する腫瘍細胞株を阻害するには非常に高濃度のゲフィチニブが必要であったことを示していた。これらの知見は、特定の変異型のＥＧＦ受容体はＥＧＦ受容体阻害薬に対するより高い感受性を反映し得るが、完全に非応答性の表現型を特定するものではないことを示唆している。
ＥＧＦＲのキナーゼ活性を直接阻害する化合物を、及びＥＧＦＲ活性化を阻止することによりＥＧＦＲキナーゼ活性を低下させる抗体を抗腫瘍薬として用いるための開発は、強烈な研究努力の分野である（ｄｅ Ｂｏｎｏ Ｊ．Ｓ．及びＲｏｗｉｎｓｋｙ，Ｅ．Ｋ．（２００２年）Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｍｏｌ． Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、８巻、Ｓ１９〜Ｓ２６頁；Ｄａｎｃｅｙ，Ｊ．及びＳａｕｓｖｉｌｌｅ，Ｅ．Ａ．（２００３年）Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ、２巻、９２〜３１３頁）。いくつかの研究により、ＥＧＦＲキナーゼ阻害薬の中には、ある種の他の抗癌薬又は化学療法剤又は処置と組み合わせて用いる場合、腫瘍細胞又は新形成の死滅を改善し得るものがあることが実証され、開示され、又は示唆された（例えば、Ｈｅｒｂｓｔ，Ｒ．Ｓ．ら、（２００１年）Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｌ．Ｔｈｅｒ．、１巻、７１９〜７３２頁；Ｓｏｌｏｍｏｎ，Ｂ．ら、（２００３年）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｒａｄｉａｔ．Ｏｎｃｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｐｈｙｓ．、５５巻、７１３〜７２３；Ｋｒｉｓｈｎａｎ，Ｓ．ら、（２００３年）Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、８巻、ｅ１〜１３頁；Ｇｒｕｎｗａｌｄ，Ｖ．及びＨｉｄａｌｇｏ，Ｍ．（２００３年）Ｊ．Ｎａｔ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．、９５巻、８５１〜８６７頁；Ｓｅｙｍｏｕｒ Ｌ．（２００３年）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔｉｇ．Ｄｒｕｇｓ、４巻（６）、６５８〜６６６頁；Ｋｈａｌｉｌ，Ｍ．Ｙ．ら、（２００３年）Ｅｘｐｅｒｔ Ｒｅｖ．Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ．、３巻、３６７〜３８０頁；Ｂｕｌｇａｒｕ，Ａ．Ｍ．ら、（２００３年）Ｅｘｐｅｒｔ Ｒｅｖ．Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ．、３巻、２６９〜２７９頁；Ｄａｎｃｅｙ，Ｊ．及びＳａｕｓｖｉｌｌｅ，Ｅ．Ａ．（２００３年）Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ、２巻、９２〜３１３頁；Ｃｉａｒｄｉｅｌｌｏ，Ｆ．ら、（２０００年）Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、６巻、２０５３〜２０６３頁；ならびに米国特許出願公開第ＵＳ２００３／０１５７１０４号）。
エルロチニブ（例えば、ＴＡＲＣＥＶＡ（登録商標）又はＯＳＩ−７７４としても知られる、エルロチニブＨＣｌ）は、経口的に利用できるＥＧＦＲキナーゼの阻害薬である。エルロチニブは、インビトロで、結腸直腸癌及び乳癌を含めた数々のヒトの腫瘍細胞株においてＥＧＦＲキナーゼに対する実質的な阻害活性を実証し（Ｍｏｙｅｒ Ｊ．Ｄ．ら、（１９９７年）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、５７巻、４８３８頁）、前臨床評価により数々のＥＧＦＲ発現性ヒト腫瘍異種移植片に対する活性が実証された（Ｐｏｌｌａｃｋ，Ｖ．Ａ．ら、（１９９９年）Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．、２９１巻、７３９頁）。より最近、エルロチニブは、第Ｉ相及び第ＩＩ相臨床試験において、頭部及び頸部の癌を含めた数々の徴候における有望な活性を実証した（Ｓｏｕｌｉｅｒｅｓ，Ｄ．，ら、（２００４年）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．、２２巻、７７頁）、ＮＳＣＬＣ（Ｐｅｒｅｚ−Ｓｏｌｅｒ Ｒ，ら、（２００１年）Ｐｒｏｃ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．、２０巻、３１０ａ、アブストラクト、１２３５頁）、ＣＲＣ（Ｏｚａ，Ｍ．，ら、（２００３年）Ｐｒｏｃ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．、２２巻、１９６ａ、アブストラクト、７８５頁）、及びＭＢＣ（Ｗｉｎｅｒ，Ｅ．ら、（２００２年）Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．Ｔｒｅａｔ．、７６巻、５１１５ａ、アブストラクト、４４５頁）。第ＩＩＩ相臨床試験において、エルロチニブの単独療法により、進行型の、処置不応性のＮＳＣＬＣを有する患者において、生存が著しく延長し、疾患の進行が遅延し、かつ肺癌関連の症状の悪化が遅延した（Ｓｈｅｐｈｅｒｄ，Ｆ．ら、（２００４年）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌｏｇｙ、２２巻、１４Ｓ（７月１５日補完）、アブストラクト、７０２２頁）。エルロチニブに対する臨床試験データの多くはＮＳＣＬＳにおけるエルロチニブの使用に関連するものであるが、第Ｉ／ＩＩ相試験からの予備的な結果は、ＣＲＣ（Ｏｚａ，Ｍ．，ら、（２００３年）Ｐｒｏｃ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．、２２巻、１９６ａ、アブストラクト、７８５頁）及びＭＢＣ（Ｊｏｎｅｓ，Ｒ．Ｊ．ら、（２００３年）Ｐｒｏｃ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．、２２巻、４５ａ、アブストラクト、１８０頁）を含めた広範囲のヒト固形腫瘍型を有する患者における、エルロチニブ及びカペシタビン／エルロチニブの組合せに対する有望な活性を実証した。２００４年１１月、米国食品医薬品局（ＦＤＡ）は、局所的に進行型の、又は転移性の非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）を有する患者の、以前の化学療法レジメンを少なくとも１回失敗した後の処置にエルロチニブを認可した。エルロチニブは、第ＩＩＩ相臨床試験における進行型ＮＳＣＬＣ患者の生存の増大を実証する、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）クラスの唯一の薬物である。
抗悪性腫瘍薬は、非悪性細胞に対する毒性に対して広い治療指数で、癌細胞を選択的に死滅させるのが理想的である。抗悪性腫瘍薬は、長時間の薬物への暴露後でも、悪性細胞に対する有効性はやはり保持している。残念なことに、現在の化学療法のどれにもこのような理想的なプロファイルがない。その代り、殆どの化学療法の治療指数は非常に狭い。さらに、癌細胞をわずかに致死量以下の濃度の化学療法剤に暴露するとこのような薬剤に対する抵抗性を生じることが非常に多く、いくつかの他の抗悪性腫瘍剤に対しても交差抵抗性を発症することが極めて多い。さらに、あらゆる所与の癌のタイプに対して、ＥＧＦＲキナーゼ阻害薬などのより新しい遺伝子標的治療でも、どの患者が特定の処置に応答する可能性が高いかを予測することができないことは頻繁にあり、したがって、最も効果的な治療を見つけるために、しばしば患者にとってかなりの危険性及び不快感のある、かなりの試行錯誤が必要とされる。
このように、新形成及び他の増殖性障害に対してより効果的な処置が必要とされており、どの腫瘍がどの処置に応答するかを決定するためのより効率的な手段が必要とされている。現存する薬物の治療有効性を増強するための戦略は、これらを投与するための計画の変更を伴い、他の抗癌薬又は生化学的変調薬と組み合わせたこれらの使用も伴う。組合せ治療は、治療上適切な投与量の各薬剤を単独で用いるのに比べて、より大きな有効性及び副作用の減少をもたらし得る方法としてよく知られている。場合によっては、薬物組合せの有効性は相加的である（組合せの有効性が各薬物単独の効果の和にほぼ等しい）が、他の場合には効果は相乗的である（組合せの有効性が、各薬物を単独で投与した効果の和を超える）。
エルロチニブなど、標的特異的な治療的取組みは、一般的に、従来の細胞毒性薬剤に比べて毒性の低下を伴い、したがって組合せのレジメンにおける使用に向いている。ベバシズマブ（Ｍｉｎｉｎｂｅｒｇ，Ｅ．Ｄ．ら、（２００３年）Ｐｒｏｃ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．、２２巻、６２７ａ、アブストラクト、２５２１頁）及びゲムシタビン（Ｄｒａｇｏｖｉｃｈ，Ｔ．、（２００３年）Ｐｒｏｃ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．、２２巻、２２３ａ、アブストラクト、８９５頁）と組み合わせたエルロチニブの第Ｉ／ＩＩ相試験において、有望な結果が観察されている。ＮＳＣＬＣ第ＩＩＩ相臨床試験における最近のデータは、標準的な化学療法と組み合わせた第一線のエルロチニブ又はゲフィチニブは生存性を改善しなかったことを示している（Ｇａｔｚｅｍｅｉｅｒ，Ｕ．、（２００４年）Ｐｒｏｃ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．、２３巻、６１７巻（アブストラクト、７０１０頁）；Ｈｅｒｂｓｔ，Ｒ．Ｓ．、（２００４年）Ｐｒｏｃ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．、２３巻、６１７（アブストラクト、７０１１頁）；Ｇｉａｃｃｏｎｅ，Ｇ．，ら、（２００４年）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．２２巻、７７７頁；Ｈｅｒｂｓｔ，Ｒ．ら、（２００４年）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．、２２巻、７８５頁）。しかし、膵臓癌の第ＩＩＩ相臨床試験は、ゲムシタビンと組み合わせた第一線のエルロチニブは生存性を改善したことを示している。
いくつかのグループが、ＥＧＦＲ阻害薬に対する患者の応答を予測する潜在的なバイオマーカーを研究している（例えば、ＷＯ２００４／０６３７０９、ＷＯ２００５／０１７４９３、ＷＯ２００４／１１１２７３、ＷＯ２００４／０７１５７２；ＵＳ２００５／００１９７８５、及びＵＳ２００４／０１３２０９７を参照されたい）。このようなバイオマーカーの一つは、上皮表現型及び間葉表現型である。殆どの癌では転移の間、上皮間葉転換（ＥＭＴ）として知られている重要な変化が腫瘍細胞において起こる（Ｔｈｉｅｒｙ，Ｊ．Ｐ．、（２００２年）Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｃａｎｃｅｒ、２巻、４４２〜４５４頁；Ｓａｖａｇｎｅｒ，Ｐ．（２００１年）Ｂｉｏｅｓｓａｙｓ、２３巻、９１２〜９２３頁；Ｋａｎｇ Ｙ．及びＭａｓｓａｇｕｅ，Ｊ．、（２００４年）Ｃｅｌｌ、１１８巻、２７７〜２７９頁；Ｊｕｌｉｅｎ−Ｇｒｉｌｌｅ，Ｓ．ら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、６３巻、２１７２〜２１７８頁；Ｂａｔｅｓ，Ｒ．Ｃ．ら、（２００３年）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｂｉｏｌｏｇｙ、１３巻、１７２１〜１７２７頁；Ｌｕ Ｚ．ら、（２００３年）Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ．、４巻（６）、４９９〜５１５頁））。上皮細胞は、一緒に緊密に結合し、極性を表し、間葉細胞を生じ、間葉細胞はより緩く団結し、極性の喪失を表し、移動する能力を有する。これら間葉細胞は、最初の腫瘍を取り囲む組織中に広がり、血管及びリンパ管に浸潤し、新しい場所に移動し、そこで分裂し、さらなる腫瘍を形成することができる。ＥＭＴは、胚形成の間以外には、健常細胞では起こらない。正常な状況下、ＴＧＦ−βは成長阻害物質として働くが、癌の転移の間、ＴＧＦ−βはＥＭＴの促進を開始する。
上皮表現型及び間葉表現型は、特定の遺伝子発現パターンに関連している。例えば、上皮表現型は、ＷＯ２００６１０１９２５において、Ｅ−カドヘリン、Ｂｒｋ、γ−カテニン、α−カテニン、ケラチン８、ケラチン１８、コネキシン３１、プラコフィリン３、ストラタフィン（ｓｔｒａｔａｆｉｎ）１、ラミニンアルファ−５、及びＳＴ１４の高レベルの発現に関連することが示され、間葉表現型は、ビメンチン、フィブロネクチン、フィブリン−１、フィブリン−２、コラーゲンアルファ−２（ＩＶ）、コラーゲンアルファ−２（Ｖ）、ＬＯＸＬ１、ニドゲン、Ｃ１１ｏｒｆ９、テネイシン、Ｎ−カドヘリン、胚性ＥＤＢ＋フィブロネクチン、チューブリンアルファ−３、及びエピモルフィンの高レベルの発現に関連していた。
エピジェネティックスは、根源的なＤＮＡ配列における変化以外のメカニズムによってもたらされる、遺伝子発現又は細胞の表現型における遺伝性の変化の研究であり、それ故、エピ（ギリシャ語：超えた（ｏｖｅｒ）、上の（ａｂｏｖｅ）、外側の（ｏｕｔｅｒ））−ジェネティックスという名称である。このような変化の例には、ＤＮＡメチル化及びヒストンの修飾が含まれ、この両方とも関連の遺伝子の配列を変更せずに遺伝子の発現を変調するように働く。これらの変化は、生物体の生涯の残りの間、細胞分裂によって体細胞性に遺伝性であり得、生物体の次の世代にやはり伝えられ得る。しかし、生物体の根源的なＤＮＡ配列における変化がない代わりに、非遺伝的な要因が生物体の遺伝子に、異なる挙動又は発現をもたらす。
ＤＮＡメチル化は、高等生物において、正常な生物体の発生及び細胞の分化の決定的な部分である。ＤＮＡメチル化は、細胞が「細胞が存在していた場所を覚えている」ことができるように細胞における遺伝子発現パターンを安定に変更し、例えば、胚発生の間、膵島になるようプログラムされた細胞は、細胞に膵島のままである必要があると告げるシグナルが継続しなくても、生物体の生涯を通して膵島のままである。さらに、ＤＮＡメチル化は、ウイルス遺伝子、及び徐々にホストのゲノム中に組み入れられた他の有害なエレメントの発現を抑制する。ＤＮＡメチル化はまた、クロマチン構造の基礎を形成し、この構造により細胞は、単一の不変のＤＮＡの配列から多細胞の生命に必要な無数の特徴を形成することができるようになる。ＤＮＡメチル化はまた、ほぼ全タイプの癌の発生において決定的な役割を果たす。シトシンの５位のＤＮＡメチル化は遺伝子の発現を低下させる特定の効果があり、これは調べたあらゆる脊椎動物において見出された。成人体細胞組織において、ＤＮＡメチル化は、ＣｐＧジヌクレオチドの状況において起こるのが典型的であるが、ＣｐＧ以外のメチル化は胚性幹細胞において多く見られる。
「ＣｐＧ」は、「−Ｃ−リン酸−Ｇ−」、すなわち、シトシンとグアニンがたった１個のリン酸によって隔てられていることを簡単に表記するものであり、ＤＮＡにおいてリン酸は任意の２個のヌクレオシドを互いに連結する。「ＣｐＧ」の表記は、この直線状の配列を、シトシン及びグアニンのＣＧ塩基対と区別するのに用いられる。ＣｐＧジヌクレオチドにおけるシトシンはメチル化されて５−メチルシトシン（５−ｍＣ）を形成することができる。哺乳動物において、遺伝子内でシトシンがメチル化されると、遺伝子のスイッチを切ることができる。ＤＮＡにメチル基を付加する酵素は、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼと呼ばれる。哺乳動物では、ＣｐＧシトシンの７０％から８０％がメチル化されている。高濃度のＣｐＧ部位を有するゲノムの領域が存在し、ＣｐＧアイランドとして知られている。この「ＣｐＧアイランド」はまた、ＧＣ含量が予想より高い（すなわち、＞５０％）。哺乳動物のゲノムにおける遺伝子の多くは、遺伝子の開始に関連するＣｐＧアイランドを有する。こういう訳で、遺伝子の予測及びアノテーションを手助けするのに、ＣｐＧアイランドの存在が用いられる。ＣｐＧアイランドはメチル化に不応性であるが、メチル化はオープンクロマチン構造を維持する助けとなり得る。さらに、オープンクロマチン構造は塩基転位型突然変異に対する脆弱性の低下をもたらし得、その結果、より高い平衡密度のＣｐＧの残存をもたらし得る。遺伝子のプロモーター内でＣｐＧ部位がメチル化されると、プロモーターのサイレンシング（例えば、腫瘍抑制遺伝子のサイレンシング）がもたらされることがあり、これは数々のヒトの癌に見られる特徴である。これとは対照的に、ＣｐＧ部位の低メチル化は、癌細胞内の癌遺伝子の過剰発現に関連している。
本発明の一態様は、腫瘍細胞が上皮表現型を有するか否かを決定する方法であって、腫瘍細胞において表２又は表４において同定されるＣｐＧ部位のいずれか一つにおけるＤＮＡメチル化の有無を検出することを含み、ＣｐＧ部位のいずれかにメチル化が存在することが、腫瘍細胞が上皮表現型を有することを示す、方法を提供する。ある実施態様において、ＣｐＧ部位は、ＰＣＤＨ８、ＰＥＸ５Ｌ、ＧＡＬＲ１、又はＺＥＢ２遺伝子にある。ある実施態様において、腫瘍細胞はＮＳＣＬＣ細胞である。
本発明の別の一態様は、腫瘍細胞が上皮表現型を有するか否かを決定する方法であって、表１又は表３において同定されるＣｐＧ部位のいずれか一つにおけるＤＮＡメチル化の有無を検出することを含み、ＣｐＧ部位のいずれかにメチル化が存在しないことが、腫瘍細胞が上皮表現型を有することを示す、方法を提供する。ある実施態様において、ＣｐＧ部位は、ＣＬＤＮ７、ＨＯＸＣ４、Ｐ２Ｌ３、ＴＢＣＤ、ＥＳＰＲ１、ＧＲＨＬ２、又はＣ２０ｏｒｆ５５遺伝子にある。ある実施態様において、腫瘍細胞はＮＳＣＬＣ細胞である。
本発明の別の一態様は、ＥＧＦＲキナーゼ阻害薬による腫瘍増殖の阻害に対する感受性を決定する方法であって、試料の腫瘍細胞において表２又は表４において同定されるＣｐＧ部位のいずれか一つにおけるＤＮＡメチル化の有無を検出することを含み、ＣｐＧ部位のいずれか一つにＤＮＡメチル化が存在することが、腫瘍増殖がＥＧＦＲ阻害薬での阻害に対して感受性であることを示す、方法を提供する。一実施態様において、ＥＧＦＲ阻害薬は、エルロチニブ、セツキシマブ、又はパニツムマブである。ある実施態様において、腫瘍細胞はＮＳＣＬＣ細胞である。
本発明の別の一態様は、ＥＧＦＲ阻害薬での処置が有益である可能性が高い癌患者を同定する方法であって、患者の癌からの試料において表１又は表３において同定されるＣｐＧ部位のいずれか一つにおけるＤＮＡメチル化の有無を検出することを含み、ＣｐＧ部位のいずれか一つにＤＮＡメチル化の非存在が検出される場合、患者はＥＧＦＲ阻害薬での処置が有益である可能性が高いと同定される、方法を提供する。ある実施態様において、ＣｐＧ部位は、ＣＬＤＮ７、ＨＯＸＣ４、Ｐ２Ｌ３、ＴＢＣＤ、ＥＳＰＲ１、ＧＲＨＬ２、又はＣ２０ｏｒｆ５５遺伝子にある。ある実施態様において、ＥＧＦＲ阻害薬は、エルロチニブ、セツキシマブ、又はパニツムマブである。ある実施態様において、癌はＮＳＣＬＣである。
本発明のさらに別の一態様は、ＥＧＦＲ阻害薬での処置が有益である可能性が高い癌患者を同定する方法であって、患者の癌からの試料において表２又は表４において同定されるＣｐＧ部位のいずれか一つにおけるＤＮＡメチル化の有無を検出することを含み、ＣｐＧ部位のいずれか一つにＤＮＡメチル化の存在が検出される場合、患者はＥＧＦＲ阻害薬での処置が有益である可能性が高いと同定される、方法を提供する。ある実施態様において、患者がＥＧＦＲ阻害薬での処置が有益である可能性が高いと同定される場合、患者に治療有効量のＥＧＦＲ阻害薬を投与する。ある実施態様において、ＥＧＦＲ阻害薬は、エルロチニブ、セツキシマブ、又はパニツムマブである。ある実施態様において、癌はＮＳＣＬＣである。
本発明の別の一態様は、腫瘍細胞が間葉表現型を有するか否かを決定する方法であって、腫瘍細胞において表２又は表４において同定されるＣｐＧ部位のいずれか一つにおけるＤＮＡメチル化の有無を検出することを含み、ＣｐＧ部位のいずれかにメチル化が存在しないことが、腫瘍細胞が間葉表現型を有することを示す、方法を提供する。ある実施態様において、ＣｐＧ部位は、ＰＣＤＨ８、ＰＥＸ５Ｌ、ＧＡＬＲ１、又はＺＥＢ２遺伝子にある。ある実施態様において、腫瘍細胞はＮＳＣＬＣ細胞である。
本発明の別の一態様は、腫瘍細胞が間葉表現型を有するか否かを決定する方法であって、表１又は表３において同定されるＣｐＧ部位のいずれか一つにおけるＤＮＡメチル化の有無を検出することを含み、ＣｐＧ部位のいずれかにメチル化が存在することが、腫瘍細胞が間葉表現型を有することを示す、方法を提供する。ある実施態様において、ＣｐＧ部位は、ＣＬＤＮ７、ＨＯＸＣ４、Ｐ２Ｌ３、ＴＢＣＤ、ＥＳＰＲ１、ＧＲＨＬ２、又はＣ２０ｏｒｆ５５遺伝子にある。ある実施態様において、腫瘍細胞はＮＳＣＬＣ細胞である。
本発明のさらに別の一態様は、ＥＧＦＲキナーゼ阻害薬による阻害に対する腫瘍増殖の感受性を決定する方法であって、試料の腫瘍細胞において表２又は表４において同定されるＣｐＧ部位のいずれか一つにおけるＤＮＡメチル化の有無を検出することを含み、ＣｐＧ部位のいずれか一つにＤＮＡメチル化が存在しないことが、腫瘍増殖がＥＧＦＲ阻害薬での阻害に対して抵抗性であることを示す、方法を提供する。ある実施態様において、ＥＧＦＲ阻害薬は、エルロチニブ、セツキシマブ、又はパニツムマブである。ある実施態様において、腫瘍細胞はＮＳＣＬＣ細胞である。
本発明の別の一態様は、ＥＧＦＲキナーゼ阻害薬による阻害に対する腫瘍増殖の感受性を決定する方法であって、試料の腫瘍細胞において表１又は表３において同定されるＣｐＧ部位のいずれか一つにおけるＤＮＡメチル化の有無を検出することを含み、ＣｐＧ部位のいずれか一つにＤＮＡメチル化が存在することが、腫瘍増殖が、例えば、エルロチニブ、ゲフィチニブ、ラパチニブ、セツキシマブ、又はパニツムマブなどのＥＧＦＲ阻害薬での阻害に対して抵抗性であることを示す、方法を提供する。ある実施態様において、ＣｐＧ部位は、ＣＬＤＮ７、ＨＯＸＣ４、Ｐ２Ｌ３、ＴＢＣＤ、ＥＳＰＲ１、ＧＲＨＬ２、又はＣ２０ｏｒｆ５５遺伝子にある。ある実施態様において、ＥＧＦＲ阻害薬は、エルロチニブ、セツキシマブ、又はパニツムマブである。ある実施態様において、腫瘍細胞はＮＳＣＬＣ細胞である。
本発明の別の一態様は、患者における癌を処置する方法であって、患者に治療有効量のＥＧＦＲ阻害薬を投与することを含み、患者が、ＥＧＦＲ阻害薬の投与前、表２又は表４において同定されるＣｐＧ部位の一つにＤＮＡメチル化の存在を示す癌を有すると診断されている、方法を提供する。ある実施態様において、ＥＧＦＲ阻害薬は、エルロチニブ、セツキシマブ、又はパニツムマブである。ある実施態様において、癌はＮＳＣＬＣである。
本発明の別の一態様は、患者における癌を処置する方法であって、患者に治療有効量のＥＧＦＲ阻害薬を投与することを含み、患者が、ＥＧＦＲ阻害薬の投与前、表１又は表３において同定されるＣｐＧ部位の一つにＤＮＡメチル化の非存在を示す癌を有すると診断されている、方法を提供する。ある実施態様において、ＥＧＦＲ阻害薬は、エルロチニブ、セツキシマブ、又はパニツムマブである。ある実施態様において、癌はＮＳＣＬＣである。
本発明の別の一態様は、癌患者に治療を選択する方法であって、患者の癌からの試料において表２又は表４において同定されるＣｐＧ部位の一つにおけるＤＮＡメチル化の有無を検出するステップと、表２又は表４において同定されるＣｐＧ部位の一つの一つにメチル化の存在が検出される場合、治療用にＥＧＦＲ阻害薬を選択するステップとを含む方法を提供する。一実施態様において、ＥＧＦＲ治療が選択される場合、患者に、治療有効量の、エルロチニブ、セツキシマブ、又はパニツムマブなどのＥＧＦＲ阻害薬を投与する。ある実施態様において、患者はＮＳＣＬＣに罹患している。
本発明の別の一態様は、癌患者に治療を選択する方法であって、患者の癌からの試料において表１又は表３において同定されるＣｐＧ部位の一つにおけるＤＮＡメチル化の有無を検出するステップと、表１又は表３において同定されるＣｐＧ部位の一つにメチル化の非存在が検出される場合、ＥＧＦＲ阻害薬を治療に選択するステップを含む方法を提供する。一実施態様において、ＥＧＦＲ治療が選択される場合、患者に、治療有効量の、エルロチニブ、セツキシマブ、又はパニツムマブなどのＥＧＦＲ阻害薬を投与する。ある実施態様において、患者はＮＳＣＬＣに罹患している。
上記の態様のある実施態様において、メチル化の有無はパイロシークエンシングによって検出される。上記の態様のある実施態様において、ＤＮＡは、ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織から、又は新鮮凍結組織から単離される。一実施態様において、組織試料から単離されたＤＮＡは、パイロシークエンシング前に予備増幅される。
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表のリスト
表１。間葉表現型に関連するメチル化シトシンヌクレオチド（ＣｐＧ）。
表２。上皮表現型に関連するメチル化シトシンヌクレオチド（ＣｐＧ）。
表３。染色体番号、ヌクレオチド位置、及び遺伝子のアントレ（Ｅｎｔｒｅｚ）ＩＤによって同定される、間葉の表現型に関連するメチル化シトシンヌクレオチド（ＣｐＧ）。
表４。染色体番号、ヌクレオチド位置、及び遺伝子のアントレＩＤによって同定される、上皮の表現型に関連するメチル化シトシンヌクレオチド（ＣｐＧ）。
表１。間葉表現型に関連するメチル化シトシンヌクレオチド（ＣｐＧ）。
表２。上皮表現型に関連するメチル化シトシンヌクレオチド（ＣｐＧ）。
表３。染色体番号、ヌクレオチド位置、及び遺伝子のアントレ（Ｅｎｔｒｅｚ）ＩＤによって同定される、間葉の表現型に関連するメチル化シトシンヌクレオチド（ＣｐＧ）。
表４。染色体番号、ヌクレオチド位置、及び遺伝子のアントレＩＤによって同定される、上皮の表現型に関連するメチル化シトシンヌクレオチド（ＣｐＧ）。
動物における「癌」の語は、非制御の増殖、不死、転移の可能性、迅速な成長及び増殖の速度、ならびにある種の特徴的な形態学的特徴など、発癌性の細胞に典型的な特徴を有する細胞の存在を意味する。しばしば、癌細胞は腫瘍の形態であるが、このような細胞は、動物内で単独に存在することもあり、又は白血病細胞など、独立の細胞として血流中を循環することもある。
本明細書で用いられる「異常な細胞の増殖」は、別段の指摘がなければ、正常な調節メカニズムとは無関係である（例えば、接触阻害の喪失）細胞の増殖を意味する。これには、（１）変異型チロシンキナーゼの発現又は受容体チロシンキナーゼの過剰発現により増殖する腫瘍細胞（腫瘍）、（２）異常なチロシンキナーゼ活性化が生じる他の増殖性疾患の良性細胞及び悪性細胞、（４）受容体チロシンキナーゼにより増殖するあらゆる腫瘍、（５）異常なセリン／スレオニンキナーゼ活性化により増殖するあらゆる腫瘍、ならびに（６）異常なセリン／スレオニンキナーゼ活性化が生じる他の増殖性疾患の良性細胞及び悪性細胞の異常な成長が含まれる。
本明細書で用いられる「処置する」の語は、別段の指摘がなければ、患者における、腫瘍の成長、腫瘍の転移、又は他の発癌性もしくは新生物形成性の細胞を、部分的又は完全にのいずれかで、逆転し、軽減し、その進行を阻害し、又は防止することを意味する。本明細書で用いられる「処置」の語は、別段の指摘がなければ、処置の行為を意味する。
「処置する方法」の句又はその同等語は、癌などに適用される場合、動物における癌細胞の数を低減又は排除するようにデザインされ、又は癌の症状を軽減するようにデザインされる行為の手順又は経過を意味する。癌又は別の増殖性障害を「処置する方法」は、癌細胞もしくは他の障害が実際に排除されること、細胞の数もしくは障害が実際に低減されること、又は癌もしくは他の障害の症状が実際に軽減されることを必ずしも意味するものではない。
「治療上有効な薬剤」の語は、研究者、獣医師、医師、又は他の臨床家によって探求されている、組織、システム、動物、又はヒトの生物学的応答又は医学的応答を誘発する組成物を意味する。
「治療有効量」又は「有効量」の語は、研究者、獣医師、医師、又は他の臨床家によって探求されている、組織、システム、動物、又はヒトの生物学的応答又は医学的応答を誘発する対象の化合物又は組合せの量を意味する。
「ＥｒｂＢ１」、「ＨＥＲ１」、「上皮増殖因子受容体」及び「ＥＧＦＲ」、ならびに「ＥＧＦＲキナーゼ」の語は本明細書において交換可能に用いられ、天然に存在するその変異型を含めた（例えば、Ｈｕｍｐｈｒｅｙら、ＰＮＡＳ（ＵＳＡ）、８７巻、４２０７〜４２１１頁（１９９０年）における欠失変異体ＥＧＦＲ）、Ｃａｒｐｅｎｔｅｒら、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、５６巻、８８１〜９１４頁（１９８７年）などにおいて公開されているＥＧＦＲを意味する。ｅｒｂＢ１は、ＥＧＦＲタンパク質生成物をコードする遺伝子を意味する。
本明細書で用いられる「ＥＧＦＲキナーゼ阻害薬」及び「ＥＧＦＲ阻害薬」の語は、当技術分野において現在知られており、又は将来同定されるあらゆるＥＧＦＲキナーゼ阻害薬を意味し、他の点ではその天然のリガンドのＥＧＦＲに対する結合に起因する、あらゆる下流の生物学的効果を含めた、患者に投与すると患者におけるＥＧＦ受容体の活性化に関連する生物学的活性の阻害をもたらす、あらゆる化学的実体を含む。このようなＥＧＦＲキナーゼ阻害薬には、ＥＧＦＲ活性化を阻止し、又は患者における癌の処置に関連するＥＧＦＲ活性化のあらゆる下流の生物学的効果を阻止することができるあらゆる薬剤が含まれる。このような阻害薬は、受容体の細胞内ドメインに直接結合し、そのキナーゼ活性を阻害することによって作用することができる。あるいは、このような阻害薬は、ＥＧＦ受容体のリガンド結合部位又はそのポーションを占有することによって作用することができ、それにより受容体は、その天然のリガンドに対してアクセス不能になり、その結果リガンドの正常の生物学的活性が妨げられ、又は低下する。あるいは、このような阻害薬は、ＥＧＦＲポリペプチドの二量体化、もしくはＥＧＦＲポリペプチドの他のタンパク質との相互作用を変調することによって作用することができ、又はＥＧＦＲのユビキチン化及びエンドサイトーシスの分解を増強することができる。ＥＧＦＲキナーゼ阻害薬には、それだけには限定されないが、低分子量阻害薬、抗体又は抗体フラグメント、アンチセンス構築物、低分子阻害性ＲＮＡ（すなわち、ｄｓＲＮＡによるＲＮＡ干渉；ＲＮＡｉ）、及びリボザイムが含まれる。好ましい一実施態様において、ＥＧＦＲキナーゼ阻害薬は、小型有機分子、又はヒトＥＧＦＲに特異的に結合する抗体である。
ＥＧＦ受容体機能の阻害薬は臨床的有用性を示し、治療が有益である可能性が最も高い患者のサブセットを示す主要なＥＧＦ受容体シグナル伝達経路を規定することは重要な研究領域になっている。受容体の固有のタンパク質チロシンキナーゼ活性を活性化し、かつ／又は下流のシグナル伝達を増大する変異が、ＮＳＣＬＣ及び神経膠芽腫において観察された。インビトロ及び臨床試験により、ｗｔＥＧＦ受容体細胞株と腫瘍との間に、ＥＧＦ受容体阻害に対するこれらの細胞応答においてかなりの変動があることが示され、この変動は部分的に、ホスファチジルイノシトール３キナーゼ経路のＥＧＦ受容体非依存的活性化に由来し、抗アポトーシス性セリン−スレオニンキナーゼＡｋｔの連続性のリン酸化をもたらすことが示された。ＰＩ３キナーゼ活性化の代替の経路に対する分子決定要因、及び結果として起こるＥＧＦ受容体阻害薬の非感受性は、活発な研究領域である。例えば、インスリン様増殖因子１受容体（ＩＧＦ−１受容体）は、ＰＩ３キナーゼ経路を強力に活性化し、ＥＧＦ阻害薬に対する細胞の抵抗性に結び付けられている。細胞−細胞及び細胞−接着ネットワークの役割は、選択的ＥＧＦ受容体阻害に対する非感受性を媒介する上でＰＩ３−キナーゼ経路によって生存シグナルを発揮することもできるが、あまり明瞭ではなく、ＥＧＦ受容体阻止に対する細胞の感受性に影響を及ぼすことが仮定される。腫瘍細胞が、細胞外マトリックスに対する接着又は細胞間の接触の非存在下で成長及び生存のシグナルを維持する能力は、細胞の遊走及び転移の状況におけるだけではなく、細胞外マトリックスが再構築され、細胞接触阻害が低減する創傷様の腫瘍環境において細胞の増殖及び生存を維持する上でも重要である。
ＮＳＣＬＣ細胞株のエルロチニブに対するインビトロの感受性に相関するＥＭＴ遺伝子発現シグネチャーは、以前に開発されたものである（Ｙａｕｃｈら、２００５年、Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ、１１巻、８６８６〜８６９８頁）。上皮表現型及び間葉表現型に関連するｆｌｕｉｄｉｇｍベースのＥＭＴ発現シグネチャーがこの研究に基づき開発された（図１）。
本発明は、一部には、遺伝子発現分析を全ゲノムメチル化プロファイリングと組み合わせて、メチル化のバイオマーカーは癌（例えば、ＮＳＣＬＣ）における上皮表現型及び間葉表現型を分類することができることを示し、ＤＮＡメチル化パターンにおけるゲノムワイドの違いがその癌の個々の生物学的及び臨床的に関連のあるサブセットに関連することを実証する、一体化されたゲノミクスの取組みの使用に基づく。本明細書に記載する方法を用いて癌の表現型のサブセットを分類するためにメチル化パターンを使用することは、ＤＮＡベース及びＲＮＡベースの分析のより伝統的な方法に比べて試験組織の量をあまり必要としないので有利である。この特徴は、組織が限定される場合に臨床試料を分析するときには、特に有用である。
予測的なバイオマーカーの開発における主な課題は、予期される評価に対して頑強な「カットポイント」を確立する必要性があることである。これは、免疫組織化学などのタンパク質ベースのアッセイでは特に問題が多い。免疫組織化学は広く用いられる一方で、予測的なバイオマーカーの開発の状況でその使用を制限する数々の技術的難題にさらされている。これらの制限には、抗体の特異性及び感受性、エピトープの利用可能性及び安定性、ならびに様々な病理学者によるデータ解釈の固有の主観性が含まれる（２４、２５）。ＰＣＲのダイナミックレンジ及び特異性に影響を及ぼすことができる分子アッセイが、さらにより望ましい。しかし、ＰＣＲベースのアッセイにも、ＲＮＡが非常に不安定であり、カットオフ点を将来的に規定する必要があるという制限がある。変異検出アッセイは、潜在的に二要素からなり、高度に普及している変異ホットスポット及び標的配列の利用度によって制限される。実施例において示す通り、ＰＣＲベースのメチル化アッセイは、変異アッセイと感度が同様である、広いダイナミックレンジ及び本質的に二要素の読みを含めた変異アッセイの性質の多くを有するため、これら問題点の多くに潜在的に対処するが、ＣｐＧメチル化状態の挙動に局所的に相関するため、アッセイデザインのための標的領域は極めて大型であり得る。最も重要なことは、ＤＮＡメチル化を用いて、過去に遺伝子発現を用いたのと殆ど同じ方法で、腫瘍の生物学的状態を推測することができることである。
本明細書の実施例に提示するデータは、野生型ＥＧＦＲを含んでいる、ＮＳＣＬＣ又は膵臓癌細胞などの腫瘍細胞は、細胞培養物中又はｉｎ ｖｉｖｏのいずれかで成長し、これらが上皮間葉転換（ＥＭＴ）を経験したか否かに応じて、ＥＧＦＲキナーゼ阻害薬による阻害に対してある範囲の感受性を示すことを実証するものである。ＥＭＴの前、腫瘍細胞はエルロチニブＨＣｌ（Ｔａｒｃｅｖａ（登録商標））などのＥＧＦＲキナーゼ阻害薬による阻害に対して非常に感受性であるが、ＥＭＴを経験した腫瘍細胞は、このような化合物による阻害に対する感受性が本質的に低い。データは、ＥＭＴがＥＧＦＲキナーゼ阻害薬に対する腫瘍の感受性のレベルを決定する一般的な生物学的スイッチであり得ることを指摘している。本明細書において、ＥＧＦＲキナーゼ阻害薬に対する腫瘍の感受性のレベルは、ＥＭＴイベントの前又は後のいずれかに細胞に特徴的である、腫瘍細胞によって発現されるバイオマーカーのレベルを決定することにより評価できることが実証される。例えば、腫瘍細胞がＥ−カドヘリンなどの上皮バイオマーカーを高レベルに発現すれば、細胞がＥＭＴを未だ経験していないことを示し、ＥＧＦＲキナーゼ阻害薬に対する高感受性と相関する。これとは反対に、腫瘍細胞がビメンチン又はフィブロネクチンなどの間葉バイオマーカーを高レベルに発現すれば、細胞がＥＭＴを経験したことを示し、ＥＧＦＲキナーゼ阻害薬に対する低感受性と相関する。このように、これらの知見により、腫瘍の成長に対するＥＧＦＲキナーゼ阻害薬の効果を予測するための診断方法の基本を形作ることができ、腫瘍学者に、自分たちの患者に最も好適な処置を選ぶ助けとなるツールをもたらしてくれる。
実施例に記載する通り、癌は、ＤＮＡメチル化パターンに基づいて、上皮様（ＥＬ）腫瘍及び間葉様（ＭＬ）腫瘍に区別することができる。間葉表現型（又はＥＭＴを経験した腫瘍細胞）は、表１及び表３に示す特定の遺伝子のメチル化に関連する。したがって、本発明は、腫瘍細胞が間葉表現型を有するか否かを決定する方法であって、腫瘍細胞において表１又は表３において同定されるＣｐＧ部位のいずれか一つにおけるＤＮＡメチル化の有無を検出することを含み、ＣｐＧ部位のいずれかのメチル化は、腫瘍細胞が間葉表現型を有することを示す、方法を提供する。これとは反対に、表１又は表３において同定されるＣｐＧ部位のいずれか一つにＤＮＡメチル化が存在しないことが、腫瘍が上皮の表現型を有することを示す。
特定の一実施態様において、腫瘍細胞が間葉表現型を有するか否かを決定する方法は、ＣＬＤＮ７（クローディン−７）、ＨＯＸＣ４（ホメオボックスＣ４）、ＣＰ２Ｌ３（グレイニーヘッド様３（（ｇｒａｉｎｙｈｅａｄ ｌｉｋｅ−３））、ＳＴＸ２（シンタキシン２）、ＲＯＮ（マクロファージ刺激１受容体）、ＴＢＣＤ（チューブリン特異的シャペロンＤ）、ＥＳＲＰ１（上皮スプライシング調節タンパク質１）、ＧＲＨＬ２（グレイニーヘッド様２）、ＥＲＢＢ２、及びＣ２０ｏｒｆ５５（染色体２０オープンリーディングフレーム５５）遺伝子の一又は複数におけるＣｐＧ部位にメチル化の有無を検出することを含み、ＣｐＧ部位のいずれか一つにＤＮＡメチル化が存在することが、腫瘍が間葉の表現型を有することを示す。これとは反対に、ＣｐＧ部位のいずれか一つにＤＮＡメチル化が存在しないことが、腫瘍が上皮の表現型を有することを示す。特定の一実施態様において、この方法は、ＣＬＤＮ７、ＨＯＸＣ４、ＣＰ２Ｌ３、ＳＴＸ２、ＲＯＮ、ＴＢＣＤ、ＥＳＲＰ１、ＧＲＨＬ２、ＥＲＢＢ２、及びＣ２０ｏｒｆ５５の一又は複数におけるＣｐＧ部位にメチル化を検出することを含み、ＣｐＧ部位のいずれか一つにＤＮＡメチル化が存在することが、腫瘍が間葉表現型を有することを示す。特定の一実施態様において、表１又は表３における遺伝子の２つにおけるＣｐＧ部位にメチル化の存在を検出することは、腫瘍が間葉表現型を有することを示す。特定の一実施態様において、表１又は表３における遺伝子の３つにおけるＣｐＧ部位にメチル化の存在を検出することは、腫瘍が間葉表現型を有することを示す。特定の一実施態様において、表１又は表３における遺伝子の４つにおけるＣｐＧ部位にメチル化の存在を検出することは、腫瘍が間葉表現型を有することを示す。特定の一実施態様において、表１又は表３における遺伝子の５つにおけるＣｐＧ部位にメチル化の存在を検出することは、腫瘍が間葉表現型を有することを示す。特定の一実施態様において、ＣＬＤＮ７、ＨＯＸＣ４、ＣＰ２Ｌ３、ＳＴＸ２、ＲＯＮ、ＴＢＣＤ、ＥＳＲＰ１、ＧＲＨＬ２、及びＣ２０ｏｒｆ５５遺伝子の２つ、３つ、又は４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、又は９つ全てにおけるＣｐＧ部位にメチル化の存在を検出することは、腫瘍が間葉表現型を有することを示す。別の一実施態様において、ＣＬＤＮ７、ＲＯＮ、ＥＳＲＰ１、及びＧＲＨＬ２の２つ、３つ、又は４つにおけるＣｐＧ部位にメチル化の存在を検出することは、腫瘍が間葉表現型を有することを示す。別の一実施態様において、ＣＬＤＮ７、ＲＯＮ、ＥＳＲＰ１、及びＧＲＨＬ２の４つ全てにおけるＣｐＧ部位にメチル化の存在を検出することは、腫瘍が間葉表現型を有することを示す。
さらに、本発明は、ＥＧＦＲ阻害薬による阻害に対する腫瘍増殖の感受性を予測する方法であって、腫瘍から採取した試料細胞において表１又は表３において同定されるＣｐＧ部位のいずれか一つにＤＮＡのメチル化の有無を検出することを含み、ＣｐＧ部位のいずれか一つにＤＮＡメチル化が存在することは、腫瘍増殖はＥＧＦＲ阻害薬での阻害に対して抵抗性であることを示す、方法を提供する。これとは反対に、ＣｐＧ部位のいずれか一つにＤＮＡメチル化が存在しないことが、腫瘍増殖は、ＥＧＦＲ阻害薬による阻害に対して感受性である（すなわち、応答性である）ことを示す。特定の一実施態様において、表１又は表３における２つの遺伝子においてＣｐＧ部位にメチル化の存在を検出することが、腫瘍増殖はＥＧＦＲ阻害薬での阻害に対して抵抗性であることを示す。特定の一実施態様において、表１又は表３における３つの遺伝子においてＣｐＧ部位にメチル化の存在を検出することが、腫瘍増殖はＥＧＦＲ阻害薬での阻害に対して抵抗性であることを示す。特定の一実施態様において、表１又は表３における４つの遺伝子においてＣｐＧ部位にメチル化の存在を検出することが、腫瘍増殖はＥＧＦＲ阻害薬での阻害に対して抵抗性であることを示す。特定の一実施態様において、表１又は表３における５つの遺伝子においてＣｐＧ部位にメチル化の存在を検出することが、腫瘍増殖はＥＧＦＲ阻害薬での阻害に対して抵抗性であることを示す。特定の一実施態様において、ＣＬＤＮ７、ＨＯＸＣ４、ＣＰ２Ｌ３、ＳＴＸ２、ＲＯＮ、ＴＢＣＤ、ＥＳＲＰ１、ＧＲＨＬ２、ＥＲＢＢ２、及びＣ２０ｏｒｆ５５遺伝子の２つ、３つ、又は４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、又は９つ全てにおけるＣｐＧ部位にメチル化の存在を検出することが、腫瘍増殖はＥＧＦＲ阻害薬での阻害に対して抵抗性であることを示す。別の一実施態様において、ＣＬＤＮ７、ＲＯＮ、ＥＳＲＰ１、及びＧＲＨＬ２の２つ、３つ、又は４つにおけるＣｐＧ部位にメチル化の存在を検出することが、腫瘍増殖はＥＧＦＲ阻害薬での阻害に対して抵抗性であることを示す。別の一実施態様において、ＣＬＤＮ７、ＲＯＮ、ＥＳＲＰ１、及びＧＲＨＬ２の４つ全てにおけるＣｐＧ部位にメチル化の存在を検出することが、腫瘍増殖がＥＧＦＲ阻害薬での阻害に対して抵抗性であることを示す。
本発明の別の一態様は、ＥＧＦＲ阻害薬での処置が有益である可能性が高い癌患者を同定する方法であって、患者の癌からの試料において表１又は表３において同定されるＣｐＧ部位のいずれか一つにおけるＤＮＡメチル化の有無を検出することを含み、ＣｐＧ部位のいずれか一つにＤＮＡメチル化の非存在が検出される場合、患者はＥＧＦＲ阻害薬での処置が有益である可能性が高いと同定される、方法を提供する。これとは反対に、ＣｐＧ部位のいずれか一つにＤＮＡメチル化が存在することが、患者はＥＧＦＲ阻害薬での処置が有益である可能性が低いことを示す。特定の一実施態様において、表１又は表３における２つの遺伝子においてＣｐＧ部位にメチル化の非存在を検出することが、患者はＥＧＦＲ阻害薬での処置が有益である可能性が高いことを示す。特定の一実施態様において、表１又は表３における３つの遺伝子においてＣｐＧ部位にメチル化の非存在を検出することが、患者はＥＧＦＲ阻害薬での処置が有益である可能性が高いことを示す。特定の一実施態様において、表１又は表３における４つの遺伝子においてＣｐＧ部位にメチル化の非存在を検出することが、患者はＥＧＦＲ阻害薬での処置が有益である可能性が高いことを示す。特定の一実施態様において、表１又は表３における５つの遺伝子においてＣｐＧ部位にメチル化の非存在を検出することが、患者はＥＧＦＲ阻害薬での処置が有益である可能性が高いことを示す。特定の一実施態様において、ＣＬＤＮ７、ＨＯＸＣ４、ＣＰ２Ｌ３、ＳＴＸ２、ＲＯＮ、ＴＢＣＤ、ＥＳＲＰ１、ＧＲＨＬ２、ＥＲＢＢ２、及びＣ２０ｏｒｆ５５遺伝子の２つ、３つ、又は４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、又は９つ全てにおけるＣｐＧ部位にメチル化の非存在を検出することが、患者はＥＧＦＲ阻害薬での処置が有益である可能性が高いことを示す。別の一実施態様において、ＣＬＤＮ７、ＲＯＮ、ＥＳＲＰ１、及びＧＲＨＬ２の２つ、３つ、又は４つにおけるＣｐＧ部位にメチル化の非存在を検出することが、患者はＥＧＦＲ阻害薬での処置が有益である可能性が高いことを示す。別の一実施態様において、ＣＬＤＮ７、ＲＯＮ、ＥＳＲＰ１、及びＧＲＨＬ２の４つ全てにおけるＣｐＧ部位にメチル化の非存在を検出することが、患者はＥＧＦＲ阻害薬での処置が有益である可能性が高いことを示す。ある実施態様において、ＥＧＦＲ阻害薬での処置が有益である可能性が高いとみなされている患者に、治療有効量のＥＧＦＲ阻害薬を投与する。
実施例において記載する通り、腫瘍細胞における上皮の表現型は、表２及び表４において示す特定の遺伝子のメチル化に関連する。したがって、本発明は、腫瘍細胞が上皮の表現型を有するか否かを決定する方法であって、腫瘍細胞において表２又は表４において同定されるシトシンヌクレオチド（ＣｐＧ部位）のいずれか一つにおけるＤＮＡメチル化の有無を検出することを含み、シトシンヌクレオチド（ＣｐＧ部位）のいずれかにメチル化が存在することが、腫瘍細胞は上皮の表現型を有することを示す、方法を提供する。これとは反対に、本発明は、腫瘍細胞が上皮の表現型を有するか否かを決定する方法であって、腫瘍細胞において表２又は表４において同定されるＣｐＧ部位のいずれか一つにおけるＤＮＡメチル化の有無を検出することを含み、ＣｐＧ部位にメチル化が存在しないことが、腫瘍は間葉の表現型を有することを示す、方法をさらに提供する。
特定の一実施態様において、方法は、ＰＣＤＨ８（プロトカドヘリン８）、ＰＥＸ５Ｌ（ペルオキシソーム生合成因子５様（（ｐｅｒｏｘｉｓｏｍａｌ ｂｉｏｇｅｎｅｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ ５−ｌｉｋｅ））、ＧＡＬＲ１（ガラニン受容体１）、ＺＥＢ２（亜鉛フィンガーＥボックス結合ホメオボックス２（ｚｉｎｃ ｆｉｎｇｅｒ Ｅ−ｂｏｘ ｂｉｎｄｉｎｇ ｈｏｍｅｏｂｏｘ ２））、及びＭＥ３（リンゴ酸酵素３）遺伝子の一又は複数のＣｐＧ部位にメチル化の有無を検出することを含み、ＣｐＧ部位にメチル化が存在することが、腫瘍は上皮の表現型を有することを示す。特定の一実施態様において、方法は、ＺＥＢ２遺伝子中のＣｐＧ部位におけるメチル化の有無を検出することを含み、ＣｐＧ部位にメチル化が存在することが、腫瘍は上皮の表現型を有することを示す。特定の一実施態様において、表２又は表４における２つの遺伝子のＣｐＧ部位にメチル化の存在を検出することが、腫瘍は上皮の表現型を有することを示す。特定の一実施態様において、表２又は表４における３つの遺伝子のＣｐＧ部位にメチル化の存在を検出することが、腫瘍は上皮の表現型を有することを示す。特定の一実施態様において、表２又は表４における４つの遺伝子のＣｐＧ部位にメチル化の存在を検出することが、腫瘍は上皮の表現型を有することを示す。特定の一実施態様において、表２又は表４における５つの遺伝子のＣｐＧ部位にメチル化の存在を検出することが、腫瘍が上皮の表現型を有することを示す。特定の一実施態様において、ＰＣＤＨ８、ＰＥＸ５Ｌ、ＧＡＬＲ１、又はＺＥＢ２遺伝子各々におけるＣｐＧ部位にＤＮＡメチル化の存在を検出することが、腫瘍が上皮の表現型を有することを示す。
さらに、本発明は、ＥＧＦＲ阻害薬による阻害に対する腫瘍増殖の感受性を予測する方法であって、腫瘍から採取した試料細胞において表２又は表４において同定されるＣｐＧ部位のいずれか一つにおけるＤＮＡメチル化の有無を検出することを含み、ＣｐＧ部位のいずれか一つにＤＮＡメチル化が存在することが、腫瘍増殖はＥＧＦＲ阻害薬での阻害に対して感受性であることを示す、方法を提供する。これとは反対に、ＣｐＧ部位のいずれか一つにＤＮＡメチル化が存在しないことが、腫瘍増殖はＥＧＦＲ阻害薬での阻害に対して抵抗性であることを示す。特定の一実施態様において、方法は、ＰＣＤＨ８、ＰＥＸ５Ｌ、ＧＡＬＲ１、又はＺＥＢ２遺伝子の一又は複数のＣｐＧ部位のメチル化を検出することを含み、ＣｐＧ部位のいずれか一つにメチル化が存在することが、腫瘍増殖はＥＧＦＲ阻害薬での阻害に対して感受性であることを示す。特定の一実施態様において、この方法は、ＺＥＢ２遺伝子におけるＣｐＧ部位のメチル化を検出することを含み、ＺＥＢ２遺伝子中のＣｐＧ部位にメチル化が存在することが、腫瘍増殖はＥＧＦＲ阻害薬での阻害に対して感受性であることを示す。特定の一実施態様において、表２又は表４における２つの遺伝子においてＣｐＧ部位にメチル化の存在を検出することが、腫瘍増殖はＥＧＦＲ阻害薬での阻害に対して感受性であることを示す。特定の一実施態様において、表４における３つの遺伝子においてＣｐＧ部位にメチル化の存在を検出することが、腫瘍増殖はＥＧＦＲ阻害薬での阻害に対して感受性であることを示す。特定の一実施態様において、表４における４つの遺伝子においてＣｐＧ部位にメチル化の存在を検出することが、腫瘍増殖はＥＧＦＲ阻害薬での阻害に対して感受性であることを示す。特定の一実施態様において、表４における５つの遺伝子においてＣｐＧ部位にメチル化の存在を検出することが、腫瘍増殖はＥＧＦＲ阻害薬での阻害に対して感受性であることを示す。特定の一実施態様において、ＰＣＤＨ８、ＰＥＸ５Ｌ、ＧＡＬＲ１、又はＺＥＢ２遺伝子の各々におけるＣｐＧ部位にメチル化の存在を検出することが、腫瘍増殖はＥＧＦＲ阻害薬での阻害に対して感受性であることを示す。
本発明の別の一態様は、ＥＧＦＲ阻害薬での処置が有益である可能性が高い癌患者を同定する方法であって、患者の癌からの試料において表２又は表４において同定されるＣｐＧ部位のいずれか一つにおけるＤＮＡメチル化の有無を検出することを含み、ＣｐＧ部位のいずれか一つにＤＮＡメチル化の存在が検出されれば、患者はＥＧＦＲ阻害薬での処置が有益である可能性が高いと同定される、方法を提供する。これとは反対に、ＣｐＧ部位のいずれか一つにＤＮＡメチル化が存在しないことが、患者はＥＧＦＲ阻害薬での処置が有益である可能性が低いことを示す。特定の一実施態様において、表２又は表４における２つの遺伝子中のＣｐＧ部位にメチル化の存在を検出することが、患者はＥＧＦＲ阻害薬での処置が有益である可能性が高いことを示す。特定の一実施態様において、表２又は表４における３つの遺伝子中のＣｐＧ部位におけるメチル化の存在を検出することが、患者はＥＧＦＲ阻害薬での処置が有益である可能性が高いことを示す。特定の一実施態様において、表２又は表４における４つの遺伝子中のＣｐＧ部位におけるメチル化の存在を検出することが、患者はＥＧＦＲ阻害薬での処置が有益である可能性が高いことを示す。特定の一実施態様において、表２又は表４における５つの遺伝子中のＣｐＧ部位におけるメチル化の存在を検出することが、患者はＥＧＦＲ阻害薬での処置が有益である可能性が高いことを示す。特定の一実施態様において、ＰＣＤＨ８、ＰＥＸ５Ｌ、ＧＡＬＲ１、又はＺＥＢ２の２つ、３つ、又は４つのＣｐＧ部位にメチル化の存在を検出することが、患者はＥＧＦＲ阻害薬での処置が有益である可能性が高いことを示す。別の一実施態様において、ＺＥＢ２におけるＣｐＧ部位にメチル化の存在を検出することが、患者はＥＧＦＲ阻害薬での処置が有益である可能性が高いことを示す。ある実施態様において、ＥＧＦＲ阻害薬での処置が有益である可能性が高いとみなされている患者に、治療有効量のＥＧＦＲ阻害薬を投与する。
本発明の別の一態様は、本明細書に記載するＤＮＡメチル化プロファイリングを用いてＥＧＦＲ阻害薬での処置が有益である可能性が高いと予め同定された癌患者を処置する方法であって、患者に治療有効量のＥＧＦＲ阻害薬を投与することを含む方法を提供する。
本発明の別の一態様は、本明細書に記載するＤＮＡメチル化プロファイリング方法に基づき、癌患者に治療を選択する方法を提供する。一実施態様において、方法は、表２又は表４において同定されるＣｐＧ部位の一つにメチル化の存在が検出される場合、患者の癌からの試料において表２又は表４において同定されるＣｐＧ部位の一つにＤＮＡの有無を検出し、治療に対してＥＧＦＲ阻害薬を選択することを含む。別の一実施態様において、方法は、表１又は表３において同定されるＣｐＧ部位の一つにメチル化の非存在が検出される場合、患者の癌からの試料において表１又は表３において同定されるＣｐＧ部位の一つにおけるＤＮＡメチル化の有無を検出し、治療に対してＥＧＦＲ阻害薬を選択することを含む。ある実施態様において、ＥＧＦＲ阻害薬の治療が選択された場合、患者に、治療有効量の、エルロチニブ、セツキシマブ、又はパニツムマブなどのＥＧＦＲ阻害薬を投与する。
医薬の技術分野における技術者、特に診断検査及び治療法での処置の適用に関与する技術者であれば、生物系は可変性を示すことがあり、完全に予測可能ではあるとは限らないことがあり、したがって多くの優れた診断検査又は治療法がときには無効であることを認識される。したがって、試験結果、患者の状態及び病歴、ならびに患者自身の経験に基づいて、個々の患者を処置するのに最も好適な過程を決定するのは、最終的に担当医の判断次第である。例えば、特に他の明白な処置の選択肢の全てもしくは殆どが失敗した場合に、又は別の処置を与えた場合にいくつかの相乗作用が予測される場合に、診断検査からの、又は他の診断基準からのデータに基づき、腫瘍がＥＧＦＲキナーゼ阻害薬に対して特に感受性ではないと予測される場合でも、医師がＥＧＦＲ阻害薬で患者を処置することを選択する場合もあり得る。癌の処置において用いられるより伝統的な化学療法剤又は細胞毒性薬剤などの他の抗癌薬の多くに比べて、あるクラスの薬物としてＥＧＦＲ阻害薬が比較的良好に認容されるという事実により、これがより実行可能な選択肢となる。
したがって、本発明は、ＥＧＦＲキナーゼ阻害薬による阻害に対する腫瘍細胞成長の感受性を予測する方法であって、腫瘍細胞において一つもしくは複数の（又は１パネルの）上皮バイオマーカーのＤＮＡメチル化レベルを評価すること、及びＥＧＦＲ阻害薬による阻害に対する腫瘍細胞成長の感受性を予測することを含み、全ての腫瘍細胞上皮バイオマーカーのＤＮＡメチル化レベルが同時に高いことが、ＥＧＦＲ阻害薬による阻害に対する高い感受性に相関する、方法を提供する。本方法の特定の一実施態様において、上皮バイオマーカーは、ＰＣＤＨ８、ＰＥＸ５Ｌ、ＧＡＬＲ１、ＺＥＢ２、及びＭＥ３遺伝子を含み、２つの腫瘍細胞上皮バイオマーカーの発現レベルが同時に高いことが、ＥＧＦＲキナーゼ阻害薬による阻害に対する高感受性に相関する。
本発明は、ＥＧＦＲキナーゼ阻害薬による阻害に対する腫瘍細胞成長の感受性を予測する方法であって、腫瘍細胞における一つもしくは複数の（又は１パネルの）間葉バイオマーカーのレベルを評価すること、及びＥＧＦＲ阻害薬による阻害に対する腫瘍細胞成長の感受性を予測することを含み、全ての腫瘍細胞間葉バイオマーカーが同時に高レベルであることが、ＥＧＦＲ阻害薬による阻害に対する抵抗性に相関する、方法も提供する。この方法の特定の一実施態様において、間葉バイオマーカーは、ＣＬＤＮ７、ＨＯＸＣ４、ＣＰ２Ｌ３、ＴＢＣＤ、ＥＳＲＰ１、ＧＲＨＬ２、及びＣ２０ｏｒｆ５５遺伝子を含み、少なくとも２つ腫瘍細胞間葉バイオマーカーのＤＮＡメチル化レベルが同時に高いことが、ＥＧＦＲ阻害薬による阻害に対する抵抗性に相関する。
本発明は、癌患者が、ＥＧＦＲキナーゼ阻害薬での処置に効果的に応答する腫瘍に罹っているか否かを予測する方法であって、腫瘍細胞における一つもしくは複数の（又は１パネルの）上皮バイオマーカーであるＰＣＤＨ８、ＰＥＸ５Ｌ、ＧＡＬＲ１、ＺＥＢ２、及びＭＥ３のＤＮＡメチル化レベルを評価すること、ならびに腫瘍がＥＧＦＲ阻害薬での処置に対して効果的に応答するか否かを予測することを含み、腫瘍細胞上皮バイオマーカーの全ての発現レベルが同時に高いことが、腫瘍がＥＧＦＲ阻害薬での処置に対して効果的に応答することに相関する、方法も提供する。
本発明は、癌患者が、ＥＧＦＲキナーゼ阻害薬での処置に効果的に応答する腫瘍に罹っているか否かを予測する方法であって、腫瘍細胞における一つもしくは複数の（又は１パネルの）間葉バイオマーカーであるＣＬＤＮ７、ＨＯＸＣ４、ＣＰ２Ｌ３、ＴＢＣＤ、ＥＳＲＰ１、ＧＲＨＬ２、及びＣ２０ｏｒｆ５５のレベルを評価すること、ならびに腫瘍がＥＧＦＲ阻害薬での処置に対して効果的に応答するか否かを予測することを含み、このような腫瘍細胞間葉バイオマーカーの全てのＤＮＡメチル化レベルが高いことが、ＥＧＦＲ阻害薬での処置に対して抵抗性である腫瘍に相関する、方法も提供する。
本明細書に記載する方法において、腫瘍細胞は、癌、前癌性の状態、又は別の形態の異常な細胞成長と診断された患者、及び処置を必要とする患者からのものであるのが典型的である。癌は肺癌（例えば、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ））、膵臓癌、頭部及び頸部の癌、胃癌、乳癌、結腸癌、卵巣癌、又は本明細書以下に記載するあらゆる様々な他の癌であり得る。癌は、ＥＧＦＲ阻害薬で潜在的に処置できることが知られているものである。腫瘍細胞は、患者の、痰、唾液、血液、尿、糞便、脳脊髄液から、又は穿刺吸引などにより腫瘍から直接得ることができる。
試料中の様々なバイオマーカーの存在及び／又はレベル／量は、数々の方法によって分析することができ、その多くは当技術分野において知られており、当業者によって理解されるものであり、それだけには限定されないが、免疫組織化学（「ＩＨＣ」）、ウエスタンブロット分析、免疫沈降、分子結合アッセイ、ＥＬＩＳＡ、ＥＬＩＦＡ、蛍光標示式細胞分取（「ＦＡＣＳ」）、ＭａｓｓＡＲＲＡＹ、プロテオミクス、血液ベースの定量アッセイ（例えば、血清ＥＬＩＳＡ）、生化学的酵素活性アッセイ、インサイチューハイブリダイゼーション、サザン分析、ノーザン分析、全ゲノムシークエンシング、定量的リアルタイムＰＣＲ（「ｑＲＴ−ＰＣＲ」）を含むポリメラーゼ連鎖反応（「ＰＣＲ」）及び他の増幅型の検出方法（例えば、分枝ＤＮＡ、ＳＩＳＢＡ、ＴＭＡなど）、ＲＮＡ−Ｓｅｑ、ＦＩＳＨ、マイクロアレイ分析、遺伝子発現プロファイリング、及び／又は遺伝子発現連鎖解析（「ＳＡＧＥ」）、ならびにタンパク質、遺伝子、及び／又は組織のアレイ分析によって行うことができる広範囲のアッセイのいずれか一つを含む。遺伝子の状態及び遺伝子生成物を評価するための典型的なプロトコールは、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら編、１９９５年、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ Ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、ユニット２（ノーザンブロッティング）、４（サザンブロッティング）、１５（免疫ブロット法）、及び１８（ＰＣＲ分析）において見出される。Ｒｕｌｅｓ Ｂａｓｅｄ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ社又はＭｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（「ＭＳＤ」）社から入手できるものなどの複合的な免疫アッセイも用いることができる。
ＤＮＡメチル化を評価するための方法はよく知られている。例えば、Ｌａｉｒｄ、（２０１０年）Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、１１巻、１９１〜２０３頁は、ＤＮＡメチル化分析の概説を提供するものである。いくつかの実施態様において、メチル化を評価するための方法は、ゲノムＤＮＡをランダムにせん断し、又はランダムに断片化し、ＤＮＡをメチル化依存的な、又はメチル化感受性の制限酵素で切断し、引き続き切断されたＤＮＡ又は非切断のＤＮＡを選択的に同定及び／又は分析することを含む。選択的な同定は、例えば、切断されたＤＮＡと非切断のＤＮＡとを分離し（例えば、サイズによって）、切断された、又は代替的に切断されなかった対象の配列を定量することを含むことができる。例えば、米国特許第７，１８６，５１２号を参照されたい。いくつかの実施態様において、方法は、制限酵素で消化した後にインタクトのＤＮＡを増幅し、それによって増幅された領域において制限酵素によって切断されなかったＤＮＡだけを増幅することを包含することができる。例えば、米国特許出願第１０／９７１，９８６号、第１１／０７１，０１３号、及び第１０／９７１，３３９号を参照されたい。いくつかの実施態様において、増幅は、遺伝子特異的であるプライマーを用いて行うことができる。あるいは、ランダムに断片化されたＤＮＡの末端にアダプターを加えることができ、ＤＮＡをメチル化依存的な、又はメチル化感受性の制限酵素で消化することができ、インタクトなＤＮＡをアダプター配列にハイブリダイズするプライマーを用いて増幅することができる。いくつかの実施態様において、第２のステップを行って、増幅されたＤＮＡのプールにおける特定の遺伝子の存在、非存在、又は量を決定することができる。いくつかの実施態様において、ＤＮＡをリアルタイムの、定量的ＰＣＲを用いて増幅する。
いくつかの実施態様において、方法は、ゲノムＤＮＡの集団内の標的の配列における平均メチル化密度を定量することを含む。いくつかの実施態様において、方法は、遺伝子座における潜在的な制限酵素切断部位の少なくともいくつかのコピーを非切断のままにする条件下で、ゲノムＤＮＡをメチル化依存的制限酵素又はメチル化感受性制限酵素と接触させ、遺伝子座のインタクトなコピーを定量し、増幅した生成物の量を、対照のＤＮＡのメチル化の量を表す対照値と比較し、それによって遺伝子座における平均メチル化密度を、対照のＤＮＡのメチル化密度と比べて定量することを含む。
一遺伝子座のＤＮＡのメチル化の定量は、遺伝子座を含むゲノムＤＮＡの試料を提供し、メチル化感受性又はメチル化依存的いずれかである制限酵素でＤＮＡを切断し、次いでインタクトなＤＮＡの量を定量し、又は対象のＤＮＡ遺伝子座で切断されたＤＮＡの量を定量することにより決定することができる。インタクトなＤＮＡ又は切断されたＤＮＡの量は、遺伝子座を含むゲノムＤＮＡの初期の量、遺伝子座におけるメチル化の量、及びゲノムＤＮＡにおいてメチル化されている遺伝子座におけるヌクレオチドの数（すなわち、分数）に依存する。ＤＮＡ遺伝子座におけるメチル化の量は、インタクトなＤＮＡ又は切断されたＤＮＡの量を、同様に処理したＤＮＡ試料中のインタクトなＤＮＡ又は切断されたＤＮＡの量を表す対照値と比較することによって決定することができる。対照値は、メチル化されたヌクレオチドの既知数又は予測数を表すことができる。あるいは、対照値は、別の（例えば、正常な、罹患していない）細胞における同じ遺伝子座又は第２の遺伝子座からのインタクトなＤＮＡ又は切断されたＤＮＡの量を表すことができる。
遺伝子座における潜在的な制限酵素切断部位の少なくともいくつかのコピーを非切断のままにする条件下、メチル化感受性又はメチル化依存的な制限酵素を用い、引き続き残りのインタクトなコピーを定量し、その量を対照と比べることによって、遺伝子座の平均メチル化密度を決定することができる。メチル化感受性の制限酵素が、遺伝子座における潜在的な制限酵素切断部位の少なくともいくつかのコピーを非切断のままにする条件下、ＤＮＡ遺伝子座のコピーと接触する場合、残りのインタクトなＤＮＡはメチル化密度に正比例し、したがって対照に比べて、試料中の遺伝子座の相対的なメチル化密度を決定することができる。同様に、メチル化依存的な制限酵素が、遺伝子座における潜在的な制限酵素切断部位の少なくともいくつかのコピーを非切断のままにする条件下、ＤＮＡ遺伝子座のコピーと接触する場合、残りのインタクトなＤＮＡはメチル化密度に反比例し、したがって対照に比べて、試料中の遺伝子座の相対的なメチル化密度を決定することができる。このようなアッセイは、例えば、米国特許出願第１０／９７１，９８６号に開示されている。
いくつかの実施態様において、定量的増幅方法（例えば、定量的ＰＣＲ、又は定量的線形増幅）を用いて、制限消化後、増幅プライマーに隣接する遺伝子座内のインタクトなＤＮＡの量を定量することができる。定量的増幅方法は、例えば、米国特許第６，１８０，３４９号、第６，０３３，８５４号、及び第５，９７２，６０２号、ならびに、例えば、Ｇｉｂｓｏｎら、Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、６巻、９９５〜１００１頁（１９９６年）；ＤｅＧｒａｖｅｓら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、３４巻（１）、１０６〜１０頁、１１２〜５頁（２００３年）；Ｄｅｉｍａｎ Ｂら、Ｍｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、２０巻（２）、１６３〜７９頁（２００２年）に開示されている。
ＤＮＡメチル化を検出するためのさらなる方法は、バイサルファイトでＤＮＡを処理する前及び後にゲノムのシークエンシングをすることを伴い得る。例えば、Ｆｒｏｍｍｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８９巻、１８２７〜１８３１頁（１９９２年）を参照されたい。亜硫酸水素ナトリウムをＤＮＡと接触させると、非メチル化のシトシンはウラシルに変換されるが、メチル化シトシンは修飾されない。
いくつかの実施態様において、バイサルファイト変換したＤＮＡから増幅したＰＣＲ生成物の制限酵素消化を用いて、ＤＮＡメチル化を検出する。例えば、Ｓａｄｒｉ及びＨｏｒｎｓｂｙ、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、２４巻、５０５８〜５０５９頁（１９９６年）；Ｘｉｏｎｇ及びＬａｉｒｄ、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、２５巻、２５３２〜２５３４頁（１９９７年）を参照されたい。
いくつかの実施態様において、ＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔアッセイを単独で、又は他の方法と組み合わせて用いて、ＤＮＡメチル化を検出する（Ｅａｄｓら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、５９巻、２３０２〜２３０６頁（１９９９年）を参照されたい）。簡潔に述べると、ＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔプロセスにおいて、ゲノムＤＮＡを亜硫酸水素ナトリウム反応において変換する（バイサルファイトのプロセスにより非メチル化のシトシン残基をウラシルに変換する）。次いで、ＣｐＧジヌクレオチドにハイブリダイズするＰＣＲプライマーを用いて、対象のＤＮＡ配列の増幅を行う。非メチル化のＤＮＡのバイサルファイト変換によって生じる配列だけに（又は代替的に、変換されていないメチル化配列に）ハイブリダイズするプライマーを用いることにより、増幅は、プライマーがハイブリダイズする配列のメチル化状態を示すことができる。同様に、増幅生成物は、非メチル化の（又はメチル化の）ＤＮＡのバイサルファイト処理によって生じる配列に特異的に結合するプローブで検出することができる。所望により、プライマー及びプローブの両方を用いて、メチル化状態を検出することができる。このように、ＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔと一緒に用いるためのキットは、亜硫酸水素ナトリウム、及びバイサルファイトで処理されたメチル化ＤＮＡと非メチル化ＤＮＡとの間を区別するプライマー又は検出可能に標識されたプローブ（それだけには限定されないがＴａｑｍａｎもしくは分子ビーコンプローブを含む）を含むことができる。他のキットの構成成分は、例えば、それだけには限定されないが、ＰＣＲバッファー、デオキシヌクレオチド、及び熱安定性のポリメラーゼを含めたＤＮＡの増幅に必要な試薬を含むことができる。
いくつかの実施態様において、Ｍｓ−ＳＮｕＰＥ（メチル化感受性単一ヌクレオチドプライマー伸長（Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ−ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ Ｓｉｎｇｌｅ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｐｒｉｍｅｒ Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ））反応を単独で、又は他の方法と組み合わせて用いて、ＤＮＡメチル化を検出する。（Ｇｏｎｚａｌｇｏ及びＪｏｎｅｓ、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、２５巻、２５２９〜２５３１頁（１９９７年）を参照されたい）。Ｍｓ−ＳＮｕＰＥ法は、ＤＮＡをバイサルファイトで処理し、引き続き単一ヌクレオチドプライマー伸長することに基づく、特定のＣｐＧ部位のメチル化の違いを評価するための定量方法である。簡潔に述べると、ゲノムＤＮＡを亜硫酸水素ナトリウムと反応させて、非メチル化のシトシンはウラシルに変換し、５−メチルシトシンは不変のままにする。次いで、バイサルファイト変換したＤＮＡに特異的なＰＣＲプライマーを用いて、所望の標的配列の増幅を行い、得られた生成物を単離し、対象のＣｐＧ部位（複数可）でメチル化分析をするためのテンプレートとして用いる。
いくつかの実施態様において、メチル化特異的ＰＣＲ（「ＭＳＰ」）反応を単独で、又は他の方法と組み合わせて用いて、ＤＮＡメチル化を検出する。ＭＳＰアッセイは、亜硫酸水素ナトリウムによってＤＮＡを最初に修飾し、メチル化ではなく、非メチル化のシトシンを全てウラシルに変換し、メチル化対非メチル化のＤＮＡに特異的なプライマーで引き続き増幅することを伴う。Ｈｅｒｍａｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９３巻、９８２１〜９８２６頁（１９９６年）；米国特許第５，７８６，１４６号を参照されたい。いくつかの実施態様において、ＤＮＡメチル化を、予めデザインされたパイロシークエンシングＤＮＡメチル化アッセイであるＱＩＡＧＥＮ ＰｙｒｏＭａｒｋ ＣｐＧ Ａｓｓａｙによって検出する。
いくつかの実施態様において、細胞のメチル化状態を、ＥＧＦＲ阻害薬に対する感受性を決定するためのハイスループットのＤＮＡメチル化分析を用いて決定する。簡潔に述べると、ゲノムＤＮＡを細胞又は組織の試料（例えば、腫瘍試料もしくは血液試料）から単離し、当技術分野における標準的なアッセイを用いて、亜硫酸水素ナトリウム反応において変換する（バイサルファイトのプロセスにより非メチル化のシトシン残基がウラシルに変換される）。バイサルファイト変換したＤＮＡ生成物を増幅し、断片化し、当技術分野における標準的なアッセイを用いて、ゲノムの端から端までからのＣｐＧ部位を含むアレイにハイブリダイズさせる。ハイブリダイゼーション後、当技術分野における標準的なアッセイを用いて、アレイを画像化し、ＤＮＡメチル化状態を分析するために処理加工する。いくつかの実施態様において、組織試料はホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織である。いくつかの実施態様において、組織試料は、新鮮凍結組織である。いくつかの実施態様において、組織試料から単離したＤＮＡを、バイサルファイト変換前に予備増幅する。いくつかの実施態様において、組織試料から単離したＤＮＡを、Ｐｌａｔｉｎｕｍ Ｔａｑと一緒にＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩＩ Ｏｎｅ−Ｓｔｅｐ ＲＴ−ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍを用いることによって、バイサルファイト変換前に予備増幅する。いくつかの実施態様において、組織試料から単離したＤＮＡを、Ｔａｑｍａｎベースのアッセイを用いて、バイサルファイト変換前に予備増幅する。いくつかの実施態様において、Ｚｙｍｏ ＥＺ ＤＮＡ Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔを用いて亜硫酸水素ナトリウム反応を行う。いくつかの実施態様において、バイサルファイト変換したＤＮＡを、Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｉｎｆｉｎｉｕｍ ＨｕｍａｎＭｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ４５０ Ｂｅａｄｃｈｉｐ Ｋｉｔを用いて、アレイに対して増幅及びハイブリダイズする。いくつかの実施態様において、アレイをＩｌｌｕｍｉｎａ ｉＳｃａｎ Ｒｅａｄｅｒ上で画像化する。いくつかの実施態様において、画像を、ＧｅｎｏｍｅＳｔｕｄｉｏソフトウエアメチル化モジュールで処理加工する。いくつかの実施態様において、メチル化のデータを、Ｂｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒ ｌｕｍｉソフトウエアパッケージを用いて分析する。Ｄｕら、Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ、２４巻（１３）、１５４７〜１５４８頁（２００８年）を参照されたい。
いくつかの実施態様において、ＤＮＡメチル化部位を、バイサルファイトシークエンシングＰＣＲ（ＢＳＰ）を用いて同定して、ＥＧＦＲ阻害薬に対する感受性を決定する。簡潔に述べると、ゲノムＤＮＡを細胞又は組織の試料（例えば、腫瘍試料もしくは血液試料）から単離し、当技術分野における標準的なアッセイを用いて、亜硫酸水素ナトリウム反応において変換する（バイサルファイトのプロセスにより非メチル化のシトシン残基がウラシルに変換される）。バイサルファイト変換したＤＮＡ生成物を、バイサルファイト変換したＤＮＡに特異的であるようにデザインされたプライマー（例えば、バイサルファイト特異的プライマー）を用いて増幅し、当技術分野における標準的なアッセイを用いて、宿主細胞に形質転換するためにベクター中にライゲートする。対象のバイサルファイト変換したＤＮＡ生成物をＰＣＲ増幅したものを含んでいる宿主細胞を選択した後、ＤＮＡ生成物を単離し、シークエンシングして、当技術分野における標準的なアッセイを用いてメチル化の部位を決定する。いくつかの実施態様において、組織試料はホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織である。いくつかの実施態様において、組織試料は、遺伝子発現用など、ＩＨＣ分析用に処理加工されたＦＦＰＥ組織である。いくつかの実施態様において、組織試料は、ＩＨＣによる遺伝子発現を殆ど又は全く示さないＦＦＰＥ組織である。いくつかの実施態様において、組織試料は新鮮凍結組織である。いくつかの実施態様において、組織試料から単離したＤＮＡを、バイサルファイト変換前に予備増幅する。いくつかの実施態様において、組織試料から単離したＤＮＡを、Ｐｌａｔｉｎｕｍ Ｔａｑと一緒にＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩＩ Ｏｎｅ−Ｓｔｅｐ ＲＴ−ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍを用いて、バイサルファイト変換前に予備増幅する。いくつかの実施態様において、組織試料から単離したＤＮＡを、Ｔａｑｍａｎベースのアッセイを用いて、バイサルファイト変換前に予備増幅する。いくつかの実施態様において、Ｚｙｍｏ ＥＺ ＤＮＡ Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ−Ｇｏｌｄ Ｋｉｔを用いて亜硫酸水素ナトリウム反応を行う。いくつかの実施態様において、バイサルファイト変換したＤＮＡに特異的であるようにデザインされるプライマーを、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｍｅｔｈｙｌ Ｐｒｉｍｅｒ Ｅｘｐｒｅｓｓソフトウエアを用いてデザインする。いくつかの実施態様において、バイサルファイト変換したＤＮＡ生成物を、Ｐｌａｔｉｎｕｍ Ｔａｑと一緒にＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩＩ Ｏｎｅ−Ｓｔｅｐ ＲＴ−ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍを用いてＰＣＲ増幅する。さらなる実施態様において、バイサルファイト変換したＤＮＡ生成物をＰＣＲ増幅したものを、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ ＴＯＰＯ ＴＡクローニングキットを用いてベクター中にライゲートする。いくつかの実施態様において、宿主細胞は細菌である。いくつかの実施態様において、対象のＰＣＲ増幅したバイサルファイト変換したＤＮＡ生成物を単離したものを、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ３７３０ｘ１ＤＮＡアナライザーを用いてシークエンシングする。いくつかの実施態様において、バイサルファイト変換したＤＮＡに特異的であるようにデザインされるプライマーを、Ｑｉａｇｅｎ ＰｙｒｏＭａｒｋ Ａｓｓａｙ Ｄｅｓｉｇｎソフトウエアを用いてデザインする。いくつかの実施態様において、バイサルファイト変換したＤＮＡ生成物を、Ｐｌａｔｉｎｕｍ Ｔａｑと一緒にＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩＩ Ｏｎｅ−Ｓｔｅｐ ＲＴ−ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍを用いてＰＣＲ増幅する。さらなる実施態様において、ＰＣＲ増幅したバイサルファイト変換したＤＮＡを、Ｑｉａｇｅｎ Ｐｙｒｏｍａｒｋ Ｑ２４を用いてシークエンシングし、ＰｙｒｏＭａｒｋソフトウエアと一緒にＱｉａｇｅｎ分析する。
いくつかの実施態様において、ＤＮＡメチル化部位を、定量的メチル化特異的ＰＣＲ（ＱＭＳＰ）を用いて同定して、ＥＧＦＲ阻害薬に対する感受性を決定する。簡潔に述べると、ゲノムＤＮＡを細胞又は組織の試料から単離し、当技術分野における標準的なアッセイを用いて、亜硫酸水素ナトリウム反応において変換する（バイサルファイトのプロセスにより非メチル化のシトシン残基がウラシルに変換される）。いくつかの実施態様において、組織試料はホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織である。いくつかの実施態様において、組織試料は、ＩＨＣ分析用に処理加工されたＦＦＰＥ組織である。いくつかの実施態様において、組織試料は、ＩＨＣによる遺伝子発現を殆ど又は全く示さないＦＦＰＥ組織である。いくつかの実施態様において、組織試料は新鮮凍結組織である。バイサルファイト変換したＤＮＡ生成物を、バイサルファイト変換したＤＮＡに特異的であるようにデザインされるプライマーを用いて増幅する（例えば、定量的メチル化特異的ＰＣＲプライマー）。バイサルファイト変換したＤＮＡ生成物を、定量的メチル化特異的ＰＣＲプライマーで増幅し、当技術分野における標準的なアッセイを用いてメチル化に対して分析する。いくつかの実施態様において、組織試料はホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織である。いくつかの実施態様において、組織試料は新鮮凍結組織である。いくつかの実施態様において、組織試料から単離したＤＮＡを、バイサルファイト変換前に予備増幅する。いくつかの実施態様において、組織試料から単離したＤＮＡを、Pｌａｔｉｎｕｍ Ｔａｑと一緒にＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩＩ Ｏｎｅ−Ｓｔｅｐ ＲＴ−ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍを用いることによって、バイサルファイト変換前に予備増幅する。いくつかの実施態様において、組織試料から単離したＤＮＡを、バイサルファイト変換前に予備増幅する。いくつかの実施態様において、組織試料から単離したＤＮＡを、Ｔａｑｍａｎベースのアッセイを用いて、バイサルファイト変換前に予備増幅する。いくつかの実施態様において、亜硫酸水素ナトリウム反応を市販のキットを用いて行う。いくつかの実施態様において、Ｚｙｍｏ ＥＺ ＤＮＡ Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ−Ｇｏｌｄ Ｋｉｔを用いて亜硫酸水素ナトリウム反応を行う。いくつかの実施態様において、バイサルファイト変換したＤＮＡに特異的であるようにデザインされるプライマーを、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｍｅｔｈｙｌ Ｐｒｉｍｅｒ Ｅｘｐｒｅｓｓソフトウエアを用いてデザインする。いくつかの実施態様において、バイサルファイト変換したＤＮＡを、Ｔａｑｍａｎベースのアッセイを用いて増幅する。いくつかの実施態様において、バイサルファイト変換したＤＮＡをＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ７９００ＨＴ上で増幅し、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ＳＤＳソフトウエアを用いて分析する。
いくつかの実施態様において、本発明は、１）腫瘍試料のＩＨＣ分析、引き続き２）ステップ１のＩＨＣ分析において用いた腫瘍組織から抽出したＤＮＡの定量的メチル化特異的ＰＣＲによって、メチル化を決定するための方法を提供する。簡潔に述べると、ＩＨＣスライドからのカバーガラスを以下の２つの方法のうち一つによって除去する：スライドをフリーザー中に少なくとも１５分間配置し、次いでカミソリの刃を用いてカバーガラスを顕微鏡のスライドからこじ開ける。次いで、スライドを室温のキシレン中でインキュベートして搭載した媒体を溶解させる。あるいは、カバーガラスが落ちるまで、スライドをキシレン中に浸漬する。これには最高数日かかることがある。スライドを全て、キシレン５分（×３）、及び１００％エタノール５分（×２）の脱パラフィン手順を通す。組織をカミソリの刃でスライドから落とし、プロテイナーゼＫを含む組織溶解バッファー中に配置し、５６℃で一夜インキュベートする。インキュベート後も組織が依然として存在する場合は、追加のプロテイナーゼＫ１０μｌを加えてもよく、組織をさらに３０分間インキュベートする。ＱＩＡａｍｐ ＤＮＡ ＦＦＰＥ Ｔｉｓｓｕｅキットなどを用いて、ＤＮＡ抽出を続けた。ＩＨＣスライドから直接抽出したＤＮＡを、上記に記載した通り、ＱＭＳＰ３プライマー及びプローブを用いてＱＭＳＰ分析にかけた。
いくつかの実施態様において、バイサルファイト変換したＤＮＡを、大規模シークエンシングによってシークエンシングする。大規模シークエンシングは、直接パイロシークエンシングなど、配列を複数回読み取るプロセスである。大規模シークエンシングを用いて、稀な変異などの稀なイベントを検出することができる。ＰＣＲ生成物の直接パイロシークエンシングにより、及び１回の作動で１００を超えるＰＣＲ生成物をシークエンシングすることにより、限定された数の遺伝子座の超大規模シークエンシング（Ｕｌｔｒａ−ｄｅｅｐ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）を実現してもよい。バイサルファイト変換したＤＮＡをシークエンシングする上での課題は、シトシン残基のチミン（ウラシル）残基へのバイサルファイト変換後、配列の複雑さが低いことに起因する。低提示バイサルファイトシークエンシング（Ｒｅｄｕｃｅｄ ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ ｂｉｓｕｌｐｈｉｔｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）（ＲＲＢＳ）は、ＤＮＡフラグメントのサイズ分画によってシークエンシングするためにゲノムのいくつかの領域だけを選択することにより、配列の冗長性（ｒｅｄｕｎｄａｎｃｙ）を低減するように導入することができる（Ｌａｉｒｄ，ＰＷ、Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ、１１巻、１９５〜２０３頁（２０１０年））。標的化は、シークエンシング前に、アレイキャプチャー（ａｒｒａｙ ｃａｐｔｕｒｅ）又はパドロックキャプチャー（ｐａｄｌｏｃｋ ｃａｐｔｕｒｅ）によって達成することができる。例えば、固定されたアレイ上の、又は溶液ハイブリッド選択による標的化キャプチャー（ｔａｒｇｅｔｅｄ ｃａｐｔｕｒｅ）により、ＤＮＡ又はＲＮＡのオリゴヌクレオチドのライブラリーにより標的化された配列に対して濃縮することができ、バイサルファイト変換の前又は後に行うことができる。あるいは、パドロックキャプチャーにより、２つの繋留されているプローブのアニーリング特異性の増大を組み合わせることにより、濃縮効率の改善がもたらされ、普遍的なプライマーで引き続き増幅することで、遺伝子座に特異的なプライマーで増幅するよりも均一な提示が可能になる。
さらなるメチル化検出方法には、それだけには限定されないが、メチル化ＣｐＧアイランド増幅（Ｔｏｙｏｔａら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、５９巻、２３０７〜１２頁（１９９９年）を参照されたい）、ならびに、例えば、米国特許公開第２００５／００６９８７９号；Ｒｅｉｎら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、２６巻（１０）、２２５５〜６４頁（１９９８年）；Ｏｌｅｋら、Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ．、１７巻（３）、２７５〜６頁（１９９７年）；Ｌａｉｒｄ，ＰＷ、Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ、１１巻、１９５〜２０３頁（２０１０年）；及びＰＣＴ公開第ＷＯ００／７００９０号に記載されているものが含まれる。
ＤＮＡメチル化のレベルは、メチル化ＤＮＡのコピー数（サイクル回数）対基準の遺伝子のサイクル回数の比としてメチル化指数によって表すことができるが、このサイクル回数によりメチル化及び非メチル化の標的が両方とも等しく増幅される。高レベルのＤＮＡメチル化は、特に、末梢血単核細胞からの同じ組織型の、非腫瘍性細胞の試料中のＤＮＡメチル化のレベルを比較することによって決定することができる。特定の一実施態様において、特定の遺伝子の高レベルのＤＮＡメチル化は、正常細胞中のＤＮＡメチル化に比べて高レベルで検出できる。別の特定の一実施態様において、高レベルのＤＮＡメチル化は、正常細胞中のＤＮＡメチル化に比べて約２×又はそれを超える。別の特定の一実施態様において、高レベルのＤＮＡメチル化は、正常細胞中のＤＮＡメチル化に比べて約２×又はそれを超える。特定の一実施態様において、高レベルのＤＮＡメチル化は、正常細胞中のＤＮＡメチル化に比べて約３×又はそれを超える。特定の一実施態様において、高レベルのＤＮＡメチル化は、正常細胞中のＤＮＡメチル化に比べて約４×又はそれを超える。特定の一実施態様において、高レベルのＤＮＡメチル化は、正常細胞中のＤＮＡメチル化に比べて約５×又はそれを超える。特定の一実施態様において、高レベルのＤＮＡメチル化は、正常細胞中のＤＮＡメチル化に比べて約６×又はそれを超える。別の特定の一実施態様において、高レベルのＤＮＡメチル化は、正常細胞中のＤＮＡメチル化に比べて約７×又はそれを超える。特定の一実施態様において、高レベルのＤＮＡメチル化は、正常細胞中のＤＮＡメチル化に比べて約８×又はそれを超える。特定の一実施態様において、高レベルのＤＮＡメチル化は、正常細胞中のＤＮＡメチル化に比べて約９×又はそれを超える。特定の一実施態様において、高レベルのＤＮＡメチル化は、正常細胞中のＤＮＡメチル化に比べて約１０×又はそれを超える。
「低メチル化」は、メチル化される可能性があるＣｐＧ部位の大多数が非メチル化であることを意味する。ある実施態様において、低メチル化は、一部の遺伝子における可能なメチル化部位の、５０％未満、４５％未満、４０％未満、３５％未満、３０％未満、２５％未満、２０％未満、１５％未満、１０％未満、５％未満、又は１％未満がメチル化されていることを意味する。さらに別の一実施態様において、低メチル化は、非腫瘍細胞などにおいて、正常レベルで発現される遺伝子に比べて、より少ない可能なメチル化部位がメチル化されていることを意味する。別の一実施態様において、低メチル化は、どのＣｐＧ部位もメチル化されていないことを意味する。
「高メチル化」は、メチル化される可能性があるＣｐＧ部位の大多数がメチル化されていることを意味する。ある実施態様において、高メチル化は、一部の遺伝子における可能なメチル化部位の、５０％を超えて、５５％を超えて、６０％を超えて、６５％を超えて、７０％を超えて、７５％を超えて、８０％を超えて、８５％を超えて、９０％を超えて、９５％を超えて、又は９９％を超えてメチル化されていることを意味する。さらに別の一実施態様において、高メチル化は、非腫瘍細胞などにおいて、正常レベルで発現される遺伝子に比べて、より多くの可能なメチル化部位がメチル化されていることを意味する。別の一実施態様において、高メチル化は、ＣｐＧ部位の全てがメチル化されていることを意味する。
いくつかの実施態様において、細胞中のバイオマーカーの発現を、細胞中のｍＲＮＡを評価することによって決定する。細胞中のｍＲＮＡを評価するための方法はよく知られており、例えば、相補的なＤＮＡプローブを用いたハイブリダイゼーションアッセイ（例えば、一又は複数の遺伝子に特異的な標識されたリボプローブを用いたインサイチューハイブリダイゼーション、ノーザンブロット、及び関連の技術）、ならびに様々な核酸増幅アッセイ（例えば、一又は複数の遺伝子に特異的な相補的なプライマーを用いたＲＴ−ＰＣＲ、ならびに、分枝ＤＮＡ、ＳＩＳＢＡ、ＴＭＡなどの、他の増幅型の検出方法）が含まれる。いくつかの実施態様において、試験試料中のバイオマーカーの発現を、基準の試料と比較する。例えば、試験試料は腫瘍組織試料であってよく、基準の試料は、正常組織、又はＰＢＭＣなどの細胞からであってよい。
哺乳動物からの試料を、ノーザン分析、ドットブロット分析、又はＰＣＲ分析を用いてｍＲＮＡに対して好都合にアッセイすることができる。さらに、このような方法は、生物学的試料中の標的ｍＲＮＡのレベルを決定できるようにする一又は複数のステップを含むことができる。（例えば、アクチンファミリーメンバーなどの「ハウスキーピング」遺伝子の比較対照のｍＲＮＡ配列のレベルを同時に調べることによって）。任意選択により、増幅された標的ｃＤＮＡの配列を決定することができる。
本発明の最適な方法には、マイクロアレイ技術により組織試料又は細胞試料中の、標的ｍＲＮＡなどのｍＲＮＡを検査し、又は検出するプロトコールが含まれる。核酸マイクロアレイを用いて、試験組織試料及び対照組織試料からの試験試料及び対照のｍＲＮＡ試料を逆転写し、標識してｃＤＮＡプローブを産生する。次いで、プローブを、固体支持体上に固定化した多くの核酸にハイブリダイズさせる。このアレイを、アレイの各メンバーの配列及び位置が分かるように配置する。例えば、その発現が抗血管新生治療の臨床上の利点の増大又は低減に相関する選り抜きの遺伝子を、固体支持体上に整列させてもよい。標識したプローブを特定のアレイメンバーとハイブリダイゼーションさせることで、プローブが由来する試料がその遺伝子を発現することが示される。
いくつかの実施態様によると、前述の遺伝子のタンパク質発現レベルを観察することによって、存在及び／又はレベル／量を測定する。ある実施態様において、方法は、生物学的試料を、本明細書に記載するバイオマーカーに対する抗体と、バイオマーカーの結合を許す条件下で接触させ、抗体とバイオマーカーとの間に複合体が形成されているか否かを検出することを含む。このような方法は、インビトロ法でも、又はｉｎ ｖｉｖｏ法でもよい。
ある実施態様において、試料中のバイオマーカータンパク質の存在及び／又はレベル／量を、ＩＨＣ及び染色のプロトコールを用いて調べる。組織切片のＩＨＣ染色は、試料中のタンパク質の存在を決定又は検出する信頼できる方法であることが示されている。一態様において、バイオマーカーのレベルを、（ａ）抗体で試料（対象の癌の試料など）のＩＨＣ分析を行うこと、及び（ｂ）試料中のバイオマーカーのレベルを決定することを含めた方法を用いて決定する。いくつかの実施態様において、ＩＨＣ染色の強度を基準値に対して決定する。
ＩＨＣは、形態学的染色及び／又は蛍光インサイチューハイブリダイゼーションなどのさらなる技術と組み合わせて行うことができる。直接的アッセイ及び間接的アッセイの、２つの一般的なＩＨＣ方法が利用できる。第１のアッセイによると、抗体の、標的の抗原に対する結合を直接決定する。この直接的アッセイは、さらなる抗体の相互作用なしで可視化することができる、蛍光タグ又は酵素標的した１次抗体など、標識されている試薬を用いる。典型的な一つの間接的アッセイでは、非コンジュゲートの１次抗体が抗原に結合し、次いで標識されている２次抗体が１次抗体に結合する。２次抗体が酵素標識にコンジュゲートする場合、色素生産性の、又は蛍光発生的な基質を加えて抗原の可視化をもたらす。いくつかの２次抗体が１次抗体上の異なるエピトープと反応し得るため、シグナルの増幅が起こる。
ＩＨＣに用いられる１次抗体及び／又は２次抗体は、検出可能なモイエティで標識するのが典型的である。多数の標識が利用でき、これらは概ね以下のカテゴリーにグループ分けすることができる：（ａ）３５Ｓ、１４Ｃ、１２５Ｉ、３Ｈ、及び１３１Ｉなどの放射性同位元素；（ｂ）金コロイド粒子；（ｃ）それだけには限定されないが、希土類錯体（ユーロピウム錯体）、テキサスレッド、ローダミン、フルオレセイン、ダンシル、リサミン、ウンベリフェロン、フィコクリセリン（ｐｈｙｃｏｃｒｙｔｈｅｒｉｎ）、フィコシアニン、もしくは市販のフルオロフォア（ＳＰＥＣＴＲＵＭ ＯＲＡＮＧＥ７及びＳＰＥＣＴＲＵＭ ＧＲＥＥＮ７）を含めた蛍光標識、ならびに／又は上記のいずれか一つもしくは複数の誘導体；（ｄ）様々な酵素−基質標識が入手可能であり、米国特許第４，２７５，１４９号がこれらのいくつかの概略を提供する。酵素標識の例には、ルシフェラーゼ（例えば、ホタルのルシフェラーゼ及び細菌のルシフェラーゼ；米国特許第４，７３７，４５６号）、ルシフェリン、２，３−ジヒドロフタラジンジオン、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、ウレアーゼ、ペルオキシダーゼ、例えば、セイヨウワサビのペルオキシダーゼ（ＨＲＰＯ）、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、リゾチーム、糖類オキシダーゼ（例えば、グルコースオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼ、及びグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ）、複素環オキシダーゼ（例えば、ウリカーゼ及びキサンチンオキシダーゼ）、ラクトペルオキシダーゼ、ミクロペルオキシダーゼなどが含まれる。
酵素−基質の組合せの例には、例えば、セイヨウワサビのペルオキシダーゼ（ＨＲＰＯ）及び基質として水素ペルオキシダーゼ；アルカリホスファターゼ（ＡＰ）及び色素産生性基質としてパラ−ニトロフェニルリン酸；ならびにβ−Ｄ−ガラクトシダーゼ（β−Ｄ−Ｇａｌ）及び色素産生性基質（例えば、ｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトシダーゼ）又は蛍光発生的基質（例えば、４−メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−ガラクトシダーゼ）が含まれる。これらの一般的な概説には、米国特許第４，２７５，１４９号及び第４，３１８，９８０号を参照されたい。
このようにして調製した標本を搭載し、カバーガラスをかけてもよい。次いで、顕微鏡などを用いてスライドの評価を決定し、当技術分野において日常的に用いられる染色強度の判定基準を用いてもよい。いくつかの実施態様において、スコアの染色パターンが約１＋以上であれば、診断的及び／又は予後判定的である。ある実施態様において、ＩＨＣアッセイにおけるスコアの染色パターンが約２＋以上であれば、診断的及び／又は予後判定的である。他の実施態様において、スコアの染色パターンが約３以上であれば、診断的及び／又は予後判定的である。一実施態様において、腫瘍又は結腸腺腫からの細胞及び／又は組織をＩＨＣを用いて検査する場合、染色は、一般に、腫瘍細胞及び／又は組織において（試料中に存在し得る間質又は周囲組織に対するものとして）決定又は評価されることが理解される。
代替の方法において、試料を、抗体−バイオマーカー複合体が形成するのに十分な条件下、バイオマーカーに特異的な抗体と接触させ、次いで複合体を検出してもよい。バイオマーカーの存在は、血漿又は血清を含めた多種多様な組織及び試料をアッセイするためのウエスタンブロッティング及びＥＬＩＳＡ手順によるなど、数々の方法において検出することができる。このようなアッセイフォーマットを用いた広範囲の免疫アッセイ技術が利用でき、例えば、米国特許第４，０１６，０４３号、第４，４２４，２７９号、及び第４，０１８，６５３号を参照されたい。これらには、伝統的な競合結合アッセイにおけるのと同様、単一部位及び２部位の両方、又は非競合型の「サンドイッチ」アッセイが含まれる。これらのアッセイには、標識した抗体の、標的のバイオマーカーに対する直接的な結合も含まれる。
選択されたバイオマーカーの、組織試料又は細胞試料中の存在及び／又はレベル／量もまた、機能的アッセイ又は活性ベースのアッセイによって試験することができる。例えば、バイオマーカーが酵素である場合、当技術分野において知られているアッセイを行って、組織試料又は細胞試料中の所与の酵素活性の存在を決定又は検出してもよい。
ある実施態様において、試料を、アッセイするバイオマーカーの量における違い及び用いる試料の質における変動性の両方、ならびにアッセイ作動間の変動性に対して標準化する。このような標準化は、ＡＣＴＢなど、よく知られているハウスキーピング遺伝子を含めたある種の標準化のバイオマーカーのレベルを検出し、組み入れることにより、達成することができる。あるいは、標準化は、アッセイする遺伝子全て、又は大型のそのサブセットの、シグナルの平均値又は中央値に基づいてもよい（グローバルな標準化の取組み）。遺伝子ごとに、対象の腫瘍ｍＲＮＡ又はタンパク質を測定し標準化した量を、基準のセット中に見出される量と比較する。対象１人あたり試験した腫瘍あたりの各ｍＲＮＡ又は各タンパク質に対して標準化した発現レベルを、基準のセット中で測定した発現レベルのパーセント値として表すことができる。分析すべき特定の対象の試料中で測定した存在及び／又は発現レベル／量は、この範囲内のいくつかの百分位数に入り、これを当技術分野においてよく知られている方法によって決定することができる。
ある実施態様において、遺伝子の相対的な発現レベルを以下の通り決定する：
相対的な発現遺伝子１ 試料１＝２ｅｘｐ（ハウスキーピング遺伝子のＣｔ−遺伝子１のＣｔ）
［Ｃｔは試料中で決定］
相対的な発現遺伝子１ 基準のＲＮＡ＝２ｅｘｐ（ハウスキーピング遺伝子のＣｔ−遺伝子１のＣｔ）
［Ｃｔは基準の試料中で決定］
標準化した相対的発現遺伝子１ 試料１＝（相対的な発現遺伝子１ 試料１／相対的な発現遺伝子１ 基準のＲＮＡ）×１００
相対的な発現遺伝子１ 試料１＝２ｅｘｐ（ハウスキーピング遺伝子のＣｔ−遺伝子１のＣｔ）
［Ｃｔは試料中で決定］
相対的な発現遺伝子１ 基準のＲＮＡ＝２ｅｘｐ（ハウスキーピング遺伝子のＣｔ−遺伝子１のＣｔ）
［Ｃｔは基準の試料中で決定］
標準化した相対的発現遺伝子１ 試料１＝（相対的な発現遺伝子１ 試料１／相対的な発現遺伝子１ 基準のＲＮＡ）×１００
Ｃｔは閾値のサイクルである。Ｃｔは、反応内で産生された蛍光が閾値ラインを超えるサイクル数である。
実験は全て、基準のＲＮＡに対して標準化したものであり、基準のＲＮＡは様々な組織源からのＲＮＡの包括的な混合物である（例えば、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ、ＣＡからの基準のＲＮＡ＃６３６５３８）。同一の基準のＲＮＡがｑＲＴ−ＰＣＲの各作動に含まれており、これにより異なる実験作動間の結果を比較することができる。
一実施態様において、試料は臨床試料である。別の一実施態様において、試料は診断アッセイにおいて用いられる。いくつかの実施態様において、試料は原発又は転移の腫瘍から得られる。代表的な腫瘍組織片を得るために、しばしば組織生検が用いられる。あるいは、腫瘍細胞は、対象の腫瘍細胞を含んでいることが分かっており、又は含んでいると考えられる組織又は液体の形態において、間接的に得ることができる。例えば、肺癌病変の試料は、切除、気管支鏡検査法、細針吸引、気管支擦過ブラシ（ｂｒｏｎｃｈｉａｌ ｂｒｕｓｈｉｎｇ）によって、又は痰、胸水、もしくは血液から得ることができる。いくつかの実施態様において、試料は、循環性の腫瘍細胞、例えば、血液、尿、又は痰中の循環性の癌細胞を含む。遺伝子又は遺伝子生成物を、癌又は腫瘍組織から、又は尿、痰、血清、もしくは血漿などの他の身体試料から検出することができる。癌性の試料中の標的の遺伝子又は遺伝子生成物を検出するために上記で論じた同じ技術を、他の身体試料に応用することができる。癌細胞は、癌病変から脱落し、このような身体試料中に出現することがある。このような身体試料をスクリーニングすることにより、これらの癌に対して単純で早期の診断を実現することができる。さらに、標的の遺伝子又は遺伝子生成物に対してこのような身体試料を試験することにより、治療の進行を、より簡単にモニタリングすることができる。
ある実施態様において、基準の試料、基準の細胞、基準の組織、対照の試料、対照の細胞、又は対照の組織は、単一の試料であり、又は試験試料を得るのと異なる一又は複数の時間点に得る同じ対象又は個体からの複数の試料を組み合わせたものである。例えば、基準の試料、基準の細胞、基準の組織、対照の試料、対照の細胞、又は対照の組織は、試験試料を得るよりも早い時間点に同じ対象又は個体から得られる。このような基準の試料、基準の細胞、基準の組織、対照の試料、対照の細胞、又は対照の組織は、基準の試料を最初の癌の診断の間に得、かつ試験試料を後に、癌が転移性になったときに得る場合に有用であり得る。
ある実施態様において、基準の試料、基準の細胞、基準の組織、対照の試料、対照の細胞、又は対照の組織は、対象又は個体ではない、１人又は複数の健康個体からの複数の試料を合わせたものである。ある実施態様において、基準の試料、基準の細胞、基準の組織、対照の試料、対照の細胞、又は対照の組織は、対象又は個体ではない、疾患又は障害（例えば、癌）を有する１人又は複数の個体からの複数の試料を合わせたものである。ある実施態様において、基準の試料、基準の細胞、基準の組織、対照の試料、対照の細胞、又は対照の組織は、対象又は個体ではない１人もしくは複数の個体からの、正常組織からＲＮＡ試料をプールしたもの、又は血漿もしくは血清試料をプールしたものである。ある実施態様において、基準の試料、基準の細胞、基準の組織、対照の試料、対照の細胞、又は対照の組織は、対象又は個体ではない、疾患又は障害（例えば、癌）を有する１人もしくは複数の個体からの腫瘍組織からＲＮＡ試料をプールしたもの、又は血漿もしくは血清試料をプールしたものである。
本発明の方法において、組織試料は、血液、尿、唾液、糞便、胸水、リンパ液、痰、腹水、前立腺液、脳脊髄液（ＣＳＦ）などの体液もしくは排泄物、又はあらゆる他の身体分泌物もしくはその派生物であってよい。血液は、全血、血漿、血清、又は血液のあらゆる派生物を含むことを意味する。このような体液又は排泄物中の腫瘍上皮又は間葉バイオマーカーの評価は、侵襲性の試料採取方法が、不適合又は不都合である状況において好ましいことが度々あり得る。
本発明の方法において、腫瘍細胞は、肺癌腫瘍細胞（例えば、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ））、膵臓癌腫瘍細胞、乳癌腫瘍細胞、頭部及び頸部の癌の腫瘍細胞、胃癌腫瘍細胞、結腸癌腫瘍細胞、卵巣癌腫瘍細胞、又は本明細書以下に記載するあらゆる様々な他の癌からの腫瘍細胞であってよい。腫瘍細胞は、固形腫瘍からの全ての腫瘍細胞同様、ＥＧＦＲを発現することが知られており、又は予期される型であるのが好ましい。ＥＧＦＲキナーゼは、野生型でも、又は変異型であってもよい。
本発明の方法において、腫瘍は、肺癌腫瘍（例えば、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ））膵臓癌腫瘍、乳癌腫瘍、頭部及び頸部の癌の腫瘍、胃癌腫瘍、結腸癌腫瘍、卵巣癌腫瘍、又は本明細書以下に記載するあらゆる様々な他の癌からの腫瘍であってよい。腫瘍は、全ての固形腫瘍同様、その細胞がＥＧＦＲを発現することが知られており、又は予期される型のものであるのが好ましい。ＥＧＦＲは、野生型でも、又は変異型であってもよい。
阻害薬及び医薬組成物
本発明において用いるのに適する例示のＥＧＦＲキナーゼ阻害薬には、例えば、キナゾリンＥＧＦＲキナーゼ阻害薬、ピリド−ピリミジンＥＧＦＲキナーゼ阻害薬、ピリミド−ピリミジンＥＧＦＲキナーゼ阻害薬、ピロロ−ピリミジンＥＧＦＲキナーゼ阻害薬、ピラゾロ−ピリミジンＥＧＦＲキナーゼ阻害薬、フェニルアミノ−ピリミジンＥＧＦＲキナーゼ阻害薬、オキシインドールＥＧＦＲキナーゼ阻害薬、インドロカルバゾールＥＧＦＲキナーゼ阻害薬、フタラジンＥＧＦＲキナーゼ阻害薬、イソフラボンＥＧＦＲキナーゼ阻害薬、キナロンＥＧＦＲキナーゼ阻害薬、及びチロホスチンＥＧＦＲキナーゼ阻害薬、例えば、以下の特許出版物に記載されているもの、及びＥＧＦＲキナーゼ阻害薬の薬学的に許容される塩及び溶媒和物全てが含まれる：国際特許公開第ＷＯ９６／３３９８０号、第ＷＯ９６／３０３４７号、第ＷＯ９７／３００３４号、第ＷＯ９７／３００４４号、第ＷＯ９７／３８９９４号、第ＷＯ９７／４９６８８号、第ＷＯ９８／０２４３４号、第ＷＯ９７／３８９８３号、第ＷＯ９５／１９７７４号、第ＷＯ９５／１９９７０号、第ＷＯ９７／１３７７１号、第ＷＯ９８／０２４３７号、第ＷＯ９８／０２４３８号、第ＷＯ９７／３２８８１号、第ＷＯ９８／３３７９８号、第ＷＯ９７／３２８８０号、第ＷＯ９７／３２８８号、第ＷＯ９７／０２２６６号、第ＷＯ９７／２７１９９号、第ＷＯ９８／０７７２６号、第ＷＯ９７／３４８９５号、第ＷＯ９６／３１５１０号、第ＷＯ９８／１４４４９号、第ＷＯ９８／１４４５０号、第ＷＯ９８／１４４５１号、第ＷＯ９５／０９８４７号、第ＷＯ９７／１９０６５号、第ＷＯ９８／１７６６２号、第ＷＯ９９／３５１４６号、第ＷＯ９９／３５１３２号、第ＷＯ９９／０７７０１号、及び第ＷＯ９２／２０６４２号；欧州特許出願第ＥＰ５２０７２２号、第ＥＰ５６６２２６号、第ＥＰ７８７７７２号、第ＥＰ８３７０６３号、及び第ＥＰ６８２０２７号；米国特許第５，７４７，４９８号号、第５，７８９，４２７号、第５，６５０，４１５号、及び第５，６５６，６４３号；ならびにドイツ特許出願第ＤＥ１９６２９６５２号。低分子量ＥＧＦＲキナーゼ阻害薬のさらなる非限定的な例には、Ｔｒａｘｌｅｒ，Ｐ．、１９９８年、Ｅｘｐ．Ｏｐｉｎ．Ｔｈｅｒ．Ｐａｔｅｎｔｓ、８巻（１２）、１５９９〜１６２５頁に記載されているあらゆるＥＧＦＲキナーゼ阻害薬が含まれる。
本発明において用いるのに適する例示のＥＧＦＲキナーゼ阻害薬には、例えば、キナゾリンＥＧＦＲキナーゼ阻害薬、ピリド−ピリミジンＥＧＦＲキナーゼ阻害薬、ピリミド−ピリミジンＥＧＦＲキナーゼ阻害薬、ピロロ−ピリミジンＥＧＦＲキナーゼ阻害薬、ピラゾロ−ピリミジンＥＧＦＲキナーゼ阻害薬、フェニルアミノ−ピリミジンＥＧＦＲキナーゼ阻害薬、オキシインドールＥＧＦＲキナーゼ阻害薬、インドロカルバゾールＥＧＦＲキナーゼ阻害薬、フタラジンＥＧＦＲキナーゼ阻害薬、イソフラボンＥＧＦＲキナーゼ阻害薬、キナロンＥＧＦＲキナーゼ阻害薬、及びチロホスチンＥＧＦＲキナーゼ阻害薬、例えば、以下の特許出版物に記載されているもの、及びＥＧＦＲキナーゼ阻害薬の薬学的に許容される塩及び溶媒和物全てが含まれる：国際特許公開第ＷＯ９６／３３９８０号、第ＷＯ９６／３０３４７号、第ＷＯ９７／３００３４号、第ＷＯ９７／３００４４号、第ＷＯ９７／３８９９４号、第ＷＯ９７／４９６８８号、第ＷＯ９８／０２４３４号、第ＷＯ９７／３８９８３号、第ＷＯ９５／１９７７４号、第ＷＯ９５／１９９７０号、第ＷＯ９７／１３７７１号、第ＷＯ９８／０２４３７号、第ＷＯ９８／０２４３８号、第ＷＯ９７／３２８８１号、第ＷＯ９８／３３７９８号、第ＷＯ９７／３２８８０号、第ＷＯ９７／３２８８号、第ＷＯ９７／０２２６６号、第ＷＯ９７／２７１９９号、第ＷＯ９８／０７７２６号、第ＷＯ９７／３４８９５号、第ＷＯ９６／３１５１０号、第ＷＯ９８／１４４４９号、第ＷＯ９８／１４４５０号、第ＷＯ９８／１４４５１号、第ＷＯ９５／０９８４７号、第ＷＯ９７／１９０６５号、第ＷＯ９８／１７６６２号、第ＷＯ９９／３５１４６号、第ＷＯ９９／３５１３２号、第ＷＯ９９／０７７０１号、及び第ＷＯ９２／２０６４２号；欧州特許出願第ＥＰ５２０７２２号、第ＥＰ５６６２２６号、第ＥＰ７８７７７２号、第ＥＰ８３７０６３号、及び第ＥＰ６８２０２７号；米国特許第５，７４７，４９８号号、第５，７８９，４２７号、第５，６５０，４１５号、及び第５，６５６，６４３号；ならびにドイツ特許出願第ＤＥ１９６２９６５２号。低分子量ＥＧＦＲキナーゼ阻害薬のさらなる非限定的な例には、Ｔｒａｘｌｅｒ，Ｐ．、１９９８年、Ｅｘｐ．Ｏｐｉｎ．Ｔｈｅｒ．Ｐａｔｅｎｔｓ、８巻（１２）、１５９９〜１６２５頁に記載されているあらゆるＥＧＦＲキナーゼ阻害薬が含まれる。
本発明にしたがって用いることができる低分子量ＥＧＦＲキナーゼ阻害薬の、特定の好ましい例には、［６，７−ビス（２−メトキシエトキシ）−４−キナゾリン−４−イル］−（３−エチニルフェニル）アミン（ＯＳＩ−７７４、エルロチニブ、又はＴＡＲＣＥＶＡ（商標）（エルロチニブＨＣｌ）；ＯＳＩ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ／Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ／Ｒｏｃｈｅとしても知られている）（米国特許第５，７４７，４９８号、国際特許公開第ＷＯ０１／３４５７４号、及びＭｏｙｅｒ、Ｊ．Ｄ．ら、（１９９７）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、５７巻、４８３８〜４８４８頁）；ＣＩ−１０３３（以前はＰＤ１８３８０５；Ｐｆｉｚｅｒとして知られていた）（Ｓｈｅｒｗｏｏｄら、１９９９年、Ｐｒｏｃ．Ａｍ．Ａｓｓｏｃ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、４０巻、７２３頁）；ＰＤ−１５８７８０（Ｐｆｉｚｅｒ）；ＡＧ−１４７８（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）；ＣＧＰ−５９３２６（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）；ＰＫＩ−１６６（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）；ＥＫＢ−５６９（Ｗｙｅｔｈ）；ＧＷ−２０１６（ＧＷ−５７２０１６又はラパチニブジトシレート；ＧＳＫとしても知られている）；ならびにゲフィチニブ（ＺＤ１８３９又はＩＲＥＳＳＡ（商標）；Ａｓｔｒａｚｅｎｅｃａとしても知られている）（Ｗｏｏｄｂｕｒｎら、１９９７年、Ｐｒｏｃ．Ａｍ．Ａｓｓｏｃ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、３８巻、６３３頁）が含まれる。本発明にしたがって用いることができる特に好ましい低分子量ＥＧＦＲキナーゼ阻害薬は、［６，７−ビス（２−メトキシエトキシ）−４−キナゾリン−４−イル］−（３−エチニルフェニル）アミン（すなわち、エルロチニブ）、その塩酸塩（すなわち、エルロチニブＨＣｌ、ＴＡＲＣＥＶＡ（商標））、又は他の塩の形態（例えば、エルロチニブメシレート）である。
抗体ベースのＥＧＦＲキナーゼ阻害薬には、その天然のリガンドによってＥＧＦＲ活性化を部分的又は完全に阻止することができる、あらゆる抗ＥＧＦＲ抗体又は抗体フラグメントが含まれる。抗体ベースのＥＧＦＲキナーゼ阻害薬の非限定的な例には、Ｍｏｄｊｔａｈｅｄｉ，Ｈ．ら、１９９３年、Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ、６７巻、２４７〜２５３頁；Ｔｅｒａｍｏｔｏ，Ｔ．ら、１９９６年、Ｃａｎｃｅｒ、７７巻、６３９〜６４５頁；Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎら、１９９５年、Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、１巻、１３１１〜１３１８頁；Ｈｕａｎｇ，Ｓ．Ｍ．ら、１９９９年、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、１５巻、５９巻（８）、１９３５〜４０頁；及びＹａｎｇ，Ｘ．ら、１９９９年、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、５９巻、１２３６〜１２４３頁に記載されているものが含まれる。このように、ＥＧＦＲキナーゼ阻害薬は、モノクローナル抗体であるＭａｂ Ｅ７．６．３（Ｙａｎｇ，Ｘ．Ｄ．ら、（１９９９年）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、５９巻、１２３６〜４３頁）、もしくはＭａｂＣ２２５（ＡＴＣＣ受諾番号ＨＢ−８５０８）、又はその結合特異性を有する抗体もしくは抗体フラグメントであってよい。適切なモノクローナル抗体のＥＧＦＲキナーゼ阻害薬には、それだけには限定されないが、ＩＭＣ−Ｃ２２５（セツキシマブ又はＥＲＢＩＴＵＸ（商標）；Ｉｍｃｌｏｎｅ Ｓｙｓｔｅｍｓとしても知られている）、ＡＢＸ−ＥＧＦ（Ａｂｇｅｎｉｘ）、ＥＭＤ ７２０００（Ｍｅｒｃｋ ＫｇａＡ、Ｄａｒｍｓｔａｄｔ）、ＲＨ３（Ｙｏｒｋ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｉｎｃ．）、及びＭＤＸ−４４７（Ｍｅｄａｒｅｘ／ Ｍｅｒｃｋ ＫｇａＡ）が含まれる。
本発明の方法は、ＥＧＦＲ及びさらなる標的を阻害する化合物に拡張することができる。これらの化合物を、本明細書において「二重特異性阻害物質（ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）」と呼ぶ。一実施態様において、二重特異性阻害物質は、二重阻害性ＨＥＲ３／ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲ／ＨＥＲ２、ＥＧＦＲ／ＨＥＲ４、又はＥＧＦＲ ｃ−Ｍｅｔ阻害物質である。一実施態様において、二重特異性阻害物質は、二重特異性抗体である。一実施態様において、二重特異性阻害物質は、ＥＧＦＲ及び第二の標的に特異的に結合する抗原結合性ドメインを含んでいる二重特異性抗体である。一実施態様において、二重特異性阻害物質は、ＨＥＲ３及びＥＧＦＲに特異的に結合する抗原結合性ドメインを含んでいる二重特異性抗体である。一実施態様において、二重特異性ＨＥＲ３／ＥＧＦＲ阻害物質は、同一の抗原結合性ドメインを２つ含んでいる二重特異性抗体である。このような抗体は、米国特許第８，１９３，３２１号、第２００８００６９８２０号、第ＷＯ２０１０１０８１２７号、第ＵＳ２０１００２５５０１０号、及びＳｃｈａｅｆｅｒら、Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ、２０巻、４７２〜４８６頁（２０１１年）に記載されている。一実施態様において、二重特異性ＨＥＲ２／ＥＧＦＲは、ラパチニブ／ＧＷ５７２０１６である。
さらなる抗体ベースの阻害薬を、知られている方法にしたがって、好適な抗原又はエピトープを、数ある中でもブタ、ウシ、ウマ、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、マウスなどから選択される宿主動物に投与することにより、産生することができる。当技術分野において知られている様々なアジュバントを用いて抗体生成を増強することができる。
本発明を実践するのに有用な抗体はポリクローナルであり得るが、モノクローナル抗体が好ましい。モノクローナル抗体は、培養物中の連続的な細胞株によって抗体分子の生成をもたらすあらゆる技術を用いて調製し、単離することができる。生成及び単離のための技術には、それだけには限定されないが、Ｋｏｈｌｅｒ及びＭｉｌｓｔｅｉｎ（Ｎａｔｕｒｅ、１９７５年、２５６巻、４９５〜４９７頁）によって最初に記載されたハイブリドーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Ｋｏｓｂｏｒら、１９８３年、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ、４巻、７２頁；Ｃｏｔｅら、１９８３年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｉ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８０巻、２０２６〜２０３０頁）；ならびにＥＢＶ−ハイブリドーマ技術（Ｃｏｌｅら、１９８５年、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ、Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．、７７〜９６頁）が含まれる。
あるいは、単鎖抗体を生成するために記載されている技術（例えば、米国特許第４，９４６，７７８号を参照されたい）を適用して、所望の特異性を有する単鎖抗体を生成することができる。本発明を実践するのに有用な抗体ベースの阻害物質には、それだけには限定されないが、インタクトな抗体分子のペプシン消化によって産生することができるＦ（ａｂ’）２フラグメント、及びＦ（ａｂ’）２フラグメントのジスルフィド架橋を低減することにより産生することができるＦａｂフラグメントを含めた抗体フラグメントも含まれる。あるいは、Ｆａｂ及び／又はｓｃＦｖ発現ライブラリーを構築して（例えば、Ｈｕｓｅら、１９８９年、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４６巻、１２７５〜１２８１頁を参照されたい）、所望の特異性を有するフラグメントの速やかな同定ができるようになる。
モノクローナル抗体及び抗体フラグメントを生成及び単離するための技術は当技術分野においてよく知られており、Ｈａｒｌｏｗ及びＬａｎｅ、１９８８年、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、ならびにＪ．Ｗ．Ｇｏｄｉｎｇ、１９８６年、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、ロンドンに記載されている。ヒト化抗ＥＧＦＲ抗体及び抗体フラグメントは、Ｖａｕｇｈｎ，Ｔ．Ｊ．ら、１９９８年、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．、１６巻、５３５〜５３９頁及びそこに引用されている参考文献などにおいて記載されている、知られている技術にしたがって調製することもでき、このような抗体又はそのフラグメントも、本発明を実践するのに有用である。
本発明において用いるための阻害薬は、代替的に、アンチセンスオリゴヌクレオチド構築物をベースとしていてよい。アンチセンスＲＮＡ分子及びアンチセンスＤＮＡ分子を含めたアンチセンスオリゴヌクレオチドは、標的のｍＲＮＡに結合することにより標的のｍＲＮＡの翻訳を直接阻止するように作用し、したがってタンパク質翻訳を妨げ、又はｍＲＮＡの分解を増大し、したがって標的タンパク質のレベルを低減し、したがって細胞における活性を低減する。例えば、少なくとも約１５個の塩基の、ＥＧＦＲ又はＨＥＲ２をコードするｍＲＮＡ転写配列の独特な領域に相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドを、慣例的なホスホジエステル技術などによって合成し、静脈内の注射又は注入などによって投与することができる。その配列が知られている遺伝子の遺伝子発現を特異的に阻害するためのアンチセンス技術を用いるための方法は、当技術分野においてよく知られている（例えば、米国特許第６，５６６，１３５号、第６，５６６，１３１号、第６，３６５，３５４号、第６，４１０，３２３号、第６，１０７，０９１号、第６，０４６，３２１号、及び第５，９８１，７３２号を参照されたい）。
低分子阻害性（Ｓｍａｌｌ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ）ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）もまた、本発明において用いるための阻害物質として機能することができる。標的遺伝子の発現は、標的遺伝子の発現を特異的に阻害するように、腫瘍、対象、又は細胞を、小型二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）と、又は小型２本鎖ＲＮＡの生成を引き起こすベクターもしくは構築物と接触させることによって低減することができる（すなわち、ＲＮＡ干渉又はＲＮＡｉ）。好適なｄｓＲＮＡ又はｄｓＲＮＡをコードするベクターを選択するための方法は、配列が分かっている遺伝子に対して当技術分野ではよく知られている（例えば、Ｔｕｓｃｈｉ，Ｔ．ら、（１９９９年）Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．、１３巻（２４）、３１９１〜３１９７頁；Ｅｌｂａｓｈｉｒ，Ｓ．Ｍ．ら、（２００１年）Ｎａｔｕｒｅ、４１１巻、４９４〜４９８頁；Ｈａｎｎｏｎ，Ｇ．Ｊ．、（２００２年）Ｎａｔｕｒｅ、４１８巻、２４４〜２５１頁；ＭｃＭａｎｕｓ，Ｍ．Ｔ．及びＳｈａｒｐ，Ｐ．Ａ．、（２００２年）Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、３巻、７３７〜７４７頁；Ｂｒｅｍｍｅｌｋａｍｐ，Ｔ．Ｒ．ら、（２００２年）Ｓｃｉｅｎｃｅ、２９６巻、５５０〜５５３頁；米国特許第６，５７３，０９９号及び第６，５０６，５５９号、ならびに国際特許公開第ＷＯ０１／３６６４６号、第ＷＯ９９／３２６１９号、及び第ＷＯ０１／６８８３６号を参照されたい）。
リボザイムもまた、本発明において用いるための阻害物質として機能することができる。リボザイムは、ＲＮＡの特異的な切断を触媒することができる酵素的なＲＮＡ分子である。リボザイムの作用のメカニズムは、リボザイム分子の相補的な標的ＲＮＡに対する配列特異的なハイブリダイゼーション、及びその後のヌクレオチド鎖切断性の切断を伴う。ｍＲＮＡ配列のヌクレオチド鎖切断性の切断を特異的かつ効率的に触媒する、操作されたヘアピン型又はハンマーヘッド型モチーフのリボザイム分子は、したがって、本発明の範囲内で有用である。あらゆる潜在的なＲＮＡ標的内の特異的なリボザイム切断部位は、リボザイム切断部位に対する標的分子をスキャンすることによって最初に同定され、リボザイム切断部位はＧＵＡ、ＧＵＵ、及びＧＵＣの配列を含むのが典型的である。同定後は、切断部位を含んでいる標的遺伝子の領域に対応するリボヌクレオチド約１５個から２０個の間の短いＲＮＡ配列を、オリゴヌクレオチド配列を不適切にし得る、２次構造などの予測される構造上の特徴に対して評価することができる。候補の標的の適合性は、リボヌクレアーゼプロテクションアッセイなどを用いて、相補的なヌクレオチドとのハイブリダイゼーションに対するこれらの利便性を試験することによって、やはり評価することができる。
阻害物質として有用であるアンチセンスオリゴヌクレオチド及びリボザイムの両方とも、知られている方法によって調製することができる。これらには、ホスホロアミダイト固相化学合成などによる、化学合成のための技術が含まれる。あるいは、アンチセンスＲＮＡ分子を、ＲＮＡ分子をコードするＤＮＡ配列のインビトロ又はｉｎ ｖｉｖｏの転写によって産生することができる。このようなＤＮＡ配列を、Ｔ７又はＳＰ６ポリメラーゼプロモーターなどの適切なＲＮＡポリメラーゼプロモーターを組み入れる多種多様なベクター中に組み入れることができる。細胞内安定性及び半減期を増大する手段として、本発明のオリゴヌクレオチドに様々な修飾を導入することができる。可能な修飾には、それだけには限定されないが、リボヌクレオチド又はデオキシリボヌクレオチドのフランキング配列を分子の５’及び／又は３’末端に付加すること、又はオリゴヌクレオチドバックボーン内のホスホジエステラーゼ連結よりもむしろホスホロチオエートもしくは２’−Ｏ−メチルを使用することが含まれる。
本発明の処置方法の状況において、阻害薬（例えば、ＥＧＦＲ阻害薬）は、薬学的に許容される担体及び非毒性の治療有効量のＥＧＦＲキナーゼ阻害化合物（薬学的に許容されるその塩を含む）からなる組成物として用いられる。
「薬学的に許容される塩」の語は、薬学的に許容される非毒性の塩基又は酸から調製される塩を意味する。本発明の化合物が酸性である場合、対応するその塩は、無機塩基及び有機塩基を含めた、薬学的に許容される非毒性の塩基から好都合に調製することができる。このような無機塩基に由来する塩には、アルミニウム、アンモニウム、カルシウム、銅（第二銅及び第一銅）、第二鉄、第一鉄、リチウム、マグネシウム、マンガン（第二マンガン及び第一マンガン）、カリウム、ナトリウム、亜鉛などの塩が含まれる。アンモニウム、カルシウム、マグネシウム、カリウム、及びナトリウム塩が特に好ましい。薬学的に許容される非毒性の有機塩基に由来する塩には、一級、二級、及び三級アミン、ならびに環状アミン及び置換されているアミン、例えば、天然に存在する、及び合成された、置換されているアミンの塩が含まれる。それから塩を形成することができる、他の薬学的に許容される非毒性の有機塩基には、例えば、アルギニン、ベタイン、カフェイン、コリン、Ｎ’，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン、ジエチルアミン、２−ジエチルアミノエタノール、２−ジメチルアミノエタノール、エタノールアミン、エチレンジアミン、Ｎ−エチルモルホリン、Ｎ−エチルピペリジン、グルカミン、グルコースアミン、ヒスチジン、ヒドラバミン（ｈｙｄｒａｂａｍｉｎｅ）、イソプロピルアミン、リジン、メチルグルカミン、モルホリン、ピペラジン、ピペリジン、ポリアミン樹脂、プロカイン、プリン、テオブロミン、トリエチルアミン、トリメチルアミン、トリプロピルアミン、トロメタミンなどのイオン交換樹脂が含まれる。
本発明において用いられる化合物が塩基性である場合、その対応する塩は、無機酸及び有機酸を含めた薬学的に許容される非毒性の酸から好都合に調製することができる。このような酸には、例えば、酢酸、ベンゼンスルホン酸、安息香酸、カンファースルホン酸、クエン酸、エタンスルホン酸、フマル酸、グルコン酸、グルタミン酸、臭化水素酸、塩酸、イセチオン酸、乳酸、マレイン酸、リンゴ酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、粘液酸、硝酸、パモン酸、パントテン酸、リン酸、コハク酸、硫酸、酒石酸、ｐ−トルエンスルホン酸などが含まれる。クエン酸、臭化水素酸、塩酸、マレイン酸、リン酸、硫酸、及び酒石酸が特に好ましい。
有効成分として阻害化合物（薬学的に許容されるその塩を含む）を含んでいる、本発明において用いられる医薬組成物は、薬学的に許容される担体、及び任意選択によって他の治療用成分又は補助剤を含むことができる。他の治療用薬剤は、上記に列挙した通り、細胞毒性薬剤、化学療法剤、もしくは抗癌剤、又はこのような薬剤の効果を増強する薬剤を含むことができる。組成物には、経口の、直腸の、局所の、ならびに非経口の（皮下、筋肉内、及び静脈内を含む）投与に適する組成物が含まれるが、あらゆる所与の場合における最も適切な経路は、特定のホスト、ならびに有効成分が投与される状態の性質及び重症度に依存する。医薬組成物は、単位剤形において好都合に提示することができ、薬学の技術分野においてよく知られているあらゆる方法によって調製することができる。
実際に、本発明の阻害化合物（薬学的に許容されるその塩を含む）は、慣例的な製薬上の配合技術にしたがって、製薬上の担体との念入りな混合物中の有効成分として合わせることができる。担体は、経口又は非経口（静脈内を含む）など、投与に望ましい調製物の形態に応じて、多種多様な形態をとることができる。このように、本発明の医薬組成物は、各々が予め決定された量の有効成分を含んでいる、カプセル剤、カシェ剤、又は錠剤など、経口投与に適する別個の単位として提示することができる。さらに、組成物は、散剤として、顆粒剤として、溶液剤として、水溶液中の懸濁剤として、非水性の液剤として、水中油型エマルジョンとして、又は油中水型液体エマルジョンとして提示することができる。上記で述べた通常の剤形に加えて、阻害化合物（その各成分の薬学的に許容される塩を含む）はまた、徐放の手段及び／又は送達装置によって投与することができる。組合せの組成物は、薬学のあらゆる方法によって調製することができる。一般的に、このような方法には、有効成分を、一又は複数の必要な成分を構成する担体と会合させるステップが含まれる。一般的に、組成物は、有効成分を液体の担体、もしくは微粉状の固体の担体、又はその両方と、均一かつ念入りに混合することによって調製される。次いで、この生成物を、所望の提示に好都合に形作ることができる。
本発明において用いられる阻害化合物（薬学的に許容されるその塩を含む）は、一又は複数の他の治療有効化合物と組み合わせて医薬組成物中に含まれていてもよい。他の治療有効化合物は、上記に列挙した通り、細胞毒性薬剤、化学療法剤、もしくは抗癌剤、又はこのような薬剤の効果を増強する薬剤を含むことができる。
このように、本発明の一実施態様において、医薬組成物は、抗癌剤と組み合わせて阻害化合物を含むことができ、抗癌剤は、アルキル化薬、代謝拮抗薬、微小管阻害薬、ポドフィロトキシン、抗生物質、ニトロソウレア、ホルモン療法、キナーゼ阻害薬、腫瘍細胞アポトーシス活性化物質、及び血管新生阻害剤からなる群から選択されるメンバーである。
使用される製薬上の担体は、固体、液体、又は気体などであってよい。固体の担体の例には、ラクトース、石膏、ショ糖、タルク、ゼラチン、寒天、ペクチン、アラビアゴム、ステアリン酸マグネシウム、及びステアリン酸が含まれる。液体の担体の例には、液糖、ラッカセイ油、オリーブ油、及び水がある。気体の担体の例には、二酸化炭素及び窒素が含まれる。
経口剤形用の組成物の調製において、あらゆる便利な製薬上の媒体を使用することができる。例えば、水、グリコール、油、アルコール、香味剤、保存剤、着色剤などを用いて、懸濁剤、エリキシル剤、及び溶液剤などの経口用の液体調製物を形成してもよく、デンプン、糖、微結晶性セルロース、希釈剤、造粒剤、滑沢剤、結合剤、崩壊剤などの担体を用いて、散剤、カプセル剤、及び錠剤などの経口用の固体調製物を形成してもよい。錠剤及びカプセル剤は投与が容易であるため、これらは好ましい経口用剤形であり、それによって固体の製薬上の担体が用いられる。任意選択により、錠剤は、標準の水性又は非水性の技術によってコーティングすることができる。
本発明に用いられる組成物を含んでいる錠剤は、任意選択により一又は複数の付属の成分又は補助剤と一緒に、圧縮又は成形により調製することができる。圧縮錠剤は、適切な機械において、任意選択により結合剤、滑沢剤、不活性な希釈剤、表面活性剤、又は分散剤と混合した、粉末又は顆粒などの易流動型の有効成分を、圧縮することにより調製することができる。成形錠剤は、適切な機械において、不活性な液体の希釈剤で湿らせた粉末化した化合物の混合物を成形することによって作成することができる。各々の錠剤が有効成分を約０．０５ｍｇから約５ｇまで含んでいるのが好ましく、各カシェ剤又はカプセル剤が有効成分を約０．０５ｍｇから約５ｇまで含んでいるのが好ましい。
例えば、ヒトに経口投与することを意図した製剤は、組成物全体の約５％から約９５％まで変動し得る好適かつ便利な量の担体材料を配合した、有効成分を約０．５ｍｇから約５ｇまで含むことができる。単位剤形は、一般に、有効成分を約１ｍｇから約２ｇまでの間、典型的には２５ｍｇ、５０ｍｇ、１００ｍｇ、２００ｍｇ、３００ｍｇ、４００ｍｇ、５００ｍｇ、６００ｍｇ、８００ｍｇ、又は１０００ｍｇ含んでいる。
非経口投与に適する本発明において用いられる医薬組成物は、有効成分の水中の溶液剤又は懸濁剤として調製することができる。例えば、ヒドロキシプロピルセルロースなどの適切な界面活性剤を含むことができる。油中の、グリセロール、液体ポリエチレングリコール、及びこれらの混合物の分散剤を調製することもできる。さらに、微生物の有害な成長を防ぐために保存剤が含まれていてよい。
注射使用に適する本発明において用いられる医薬組成物には、無菌の水溶液剤又は分散剤が含まれる。さらに、組成物は、このような無菌の注射溶液又は分散液を即時に調製するための無菌の粉末の形態であってもよい。全ての場合において、最終の注射用形態は無菌でなければならず、シリンジ使用性（ｓｙｒｉｎｇａｂｉｌｉｔｙ）を容易にするために効率的に液体でなければならない。医薬組成物は、製造及び貯蔵の条件下で安定でなければならず、したがって、好ましくは細菌及び真菌などの微生物の汚染作用に対抗して保存しなければならない。担体は、水、エタノール、多価アルコール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、及び液体ポリエチレングリコール）、植物油、ならびにこれらの適切な混合物などを含む、溶媒又は分散媒体であってよい。
本発明のための医薬組成物は、例えば、エアロゾル剤、クリーム剤、軟膏剤、ローション剤、散布剤などの局所使用に適する形態であってよい。さらに、組成物は、経皮装置における使用に適する形態であってよい。これらの製剤は、慣例的な処理加工方法によって、阻害化合物（薬学的に許容されるその塩を含む）を利用して調製することができる。一例として、クリーム剤又は軟膏剤は、所望の粘度を有するクリーム剤又は軟膏剤を生成するために、約５重量％から約１０重量％の化合物と一緒に、親水性の材料及び水を混合することによって調製される。
本発明のための医薬組成物は、直腸投与に適する形態であってよく、この場合、担体は固体である。混合物が単位投与量の坐剤を形成するのが好ましい。適切な担体には、カカオ脂、及び当技術分野において一般的に用いられる他の材料が含まれる。坐剤は、組成物を軟化又は融解した担体（複数可）と最初に混合し、その後冷却し、型中で成形することによって好都合に形成することができる。
前述の担体成分の他に、上記に記載した医薬製剤は、適宜、一又は複数のさらなる担体成分、例えば、希釈剤、バッファー、香味剤、結合剤、表面活性剤、増粘剤、滑沢剤、保存剤（抗酸化剤を含む）などを含むことができる。さらに、意図する受容者の血液と製剤を等張にするために、他の補助剤も含まれていてよい。阻害化合物（薬学的に許容されるその塩を含む）を含む組成物は、粉末又は液体の濃縮形態において調製することもできる。
本発明を実践するために用いられる化合物の投与量レベルは、およそ本明細書に記載する通りであり、又はこれらの化合物に対して当技術分野において記載されている通りである。しかし、あらゆる特定の患者に特異的な投与量レベルは、年齢、体重、全体的な健康状態、性別、食事、投与時間、投与経路、排泄速度、薬物の組合せ、及び治療を受ける特定の疾患の重症度を含めた、様々な因子に依存することが理解される。
当技術分野において知られている多くの代替の実験方法が、例えば本発明に関連のある技術の領域において入手できる優れたマニュアル及び教科書の多くに記載されている通り（例えば、Ｕｓｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｈａｒｌｏｗ，Ｅ．及びＬａｎｅ，Ｄ．編、１９９９年、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、（例えば、ＩＳＢＮ ０−８７９６９−５４４〜７）； Ｒｏｅ Ｂ．Ａ．ら、１９９６年、ＤＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ（Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ Ｓｅｒｉｅｓ）、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ．（例えば、ＩＳＢＮ ０−４７１−９７３２４−０）；Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ：Ｃｈｉｍｅｒｉｃ Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ、２０００年、Ｊ．Ａｂｅｌｓｏｎ， Ｍ．Ｓｉｍｏｎ， Ｓ．Ｅｍｒ， Ｊ．Ｔｈｏｒｎｅｒ．編、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、２００１年、第３版、Ｊｏｓｅｐｈ Ｓａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｐｅｔｅｒ ＭａｃＣａｌｌｕｍ、（以前の、Ｍａｎｉａｔｉｓ Ｃｌｏｎｉｎｇ ｍａｎｕａｌ）（例えば、ＩＳＢＮ ０−８７９６９−５７７−３）；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｆｒｅｄ Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ（例えば、ＩＳＢＮ ０−４７１−５０３３８−Ｘ）；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｊｏｈｎ Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ編、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ（例えば、ＩＳＢＮ ０−４７１−１１１８４−８）；ならびにＭｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ：Ｇｕｉｄｅ ｔｏ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ、１９９０年、１８２巻、Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ，Ｍ．Ｐ．編、Ａｃｅｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．（例えば、ＩＳＢＮ ０−１２−２１３５８５−７））、又は分子生物学における実験方法の記載に捧げられた多くの大学の、及び商業的なウエブサイトに記載されている通り、本発明の実践において本明細書に特に記載するものに、上首尾に代わることができる。
医薬の技術分野における技術者であれば、本明細書に記載する治療有効量の阻害薬（例えば、ＥＧＦＲキナーゼ阻害薬、二重特異的ＥＧＦＲキナーゼ阻害薬、又はＨＥＲ２阻害薬）を、患者が阻害薬に応答性である可能性が高いという診断にしたがって患者に投与する正確な様式は、担当の医師の判断であることを理解される。投与量、他の抗癌剤との組合せ、投与のタイミング及び頻度などを含めた投与様式は、患者が阻害薬に応答性である可能性が高いという診断、ならびに患者の状態及び病歴により影響を受けることがある。したがって、阻害薬のタイプに比較的非感受性であることが予測される腫瘍と診断された患者でさえ、特に他の抗がん剤、又は阻害薬に対する腫瘍の感受性を変更し得る薬剤と組み合わせて、このような阻害薬での処置の恩恵を依然として受けることがある。
本発明の目的で、阻害薬をさらなる抗癌剤（両成分を本明細書以下において「２つの有効薬剤」と言及する）と一緒に「同時投与」又は「同時投与すること」は、組合せ治療の恩恵を得るようにデザインされた好適な投与量レジメンの一部として２つの有効薬剤を投与する場合、別々又は一緒のいずれかでの、２つの有効薬剤のあらゆる投与を意味する。このように２つの有効薬剤は、同じ医薬組成物の一部として、又は別々の医薬組成物においてのいずれかで投与することができる。さらなる薬剤は、阻害薬の投与の前に、投与と同時に、もしくは投与に引き続いて、又はこれらのいくつかの組合せにおいて、投与することができる。処置の標準的な経過の間などに、阻害薬を患者に、反復した間隔で投与する場合、さらなる薬剤を、阻害薬の各投与の前に、投与と同時に、もしくは投与に引き続いて、又はこれらのいくつかの組合せで、又は阻害薬の処置に関して異なる間隔で、又は阻害薬での処置の経過の前に、その間のあらゆる時間に、もしくはそれに引き続いて単一投与量において投与することができる。
阻害薬は、当技術分野において知られている通り、かつ国際特許公開第ＷＯ０１／３４５７４号において開示されている通り、それに対して患者を処置している癌の最も効果的な処置（有効性及び安全性両方の見込みから）を提供する投与量レジメンにおいて患者に投与するのが典型的である。本発明の処置方法を実施する上で、阻害薬を、経口、局所、静脈内、服腔内、筋肉内、関節内、皮下、鼻腔内、眼内、膣内、直腸、又は皮内の経路などによって、処置する癌のタイプ、用いる阻害薬のタイプ（例えば、小分子、抗体、ＲＮＡｉ、リボザイム、又はアンチセンス構築物）、及び公開されている臨床試験の結果などに基づいて処方する医師の医学的判断に応じて、当技術分野において知られているあらゆる効果的な様式において投与することができる。
投与する阻害薬の量、及び阻害薬を投与するタイミングは、処置する患者のタイプ（人種、性別、年齢、体重など）及び状態、処置する疾患又は状態の重症度、ならびに投与経路に依存する。例えば、小分子阻害薬は、１日あたり、又は１週間あたり０．００１から１００ｍｇ／ｋｇ体重の範囲の投与量において、単一の、もしくは分割された投与量において、又は持続的な注入によって患者に投与することができる（例えば、国際特許公開第ＷＯ０１／３４５７４号を参照されたい）。特に、エルロチニブＨＣｌは、１日あたり５〜２００ｍｇ、又は１週間あたり１００〜１６００ｍｇの範囲の投与量において、単一の、もしくは分割された投与量において、又は持続的な注入によって患者に投与することができる。好ましい投与量は１５０ｍｇ／日である。抗体ベースの阻害薬、又はアンチセンス、ＲＮＡｉ、もしくはリボザイム構築物は、１日あたりもしくは１週間あたり、単一の、もしくは分割された投与量において、又は持続的な注入によって、０．１ｍｇ／ｋｇ体重から１００ｍｇ／ｋｇ体重までの範囲の投与量において患者に投与することができる。ある場合には、前述の（ａｆｏｒｅｔｈｅ）範囲の下限未満である投与量レベルが十分を超えることがあり、他の場合には、このような高投与量を、１日を通して投与するために最初にいくつかの低投与量に分割するのであれば、いかなる有害な副作用を引き起こさずに、いっそう高投与量を使用することができる。
阻害薬及び他のさらなる薬剤は、別々に、又は一緒にのいずれかで、同じ又は異なる経路によって、多種多様な異なる剤形において投与することができる。例えば、阻害薬を経口又は非経口的に投与するのが好ましい。阻害薬がエルロチニブＨＣｌ（ＴＡＲＣＥＶＡ（商標））である場合は、経口投与が好ましい。阻害薬及び他のさらなる薬剤の両方とも、単一の、又は複数の投与量において投与することができる。
阻害薬は、錠剤、カプセル剤、菓子錠剤、トローチ剤、ハードキャンデー剤、散剤、噴霧剤、クリーム剤、膏薬（ｓａｌｖｅ）、坐剤、ゼリー剤、ゲル剤、パスタ剤、ローション剤、軟膏剤、エリキシル剤、シロップ剤などの形態において、様々な薬学的に許容される不活性の担体と一緒に投与することができる。このような剤形の投与は、単一の、又は複数の投与量において行うことができる。担体には、固体の希釈剤又は充填剤、無菌の水性媒体、及び様々な非毒性の有機溶媒などが含まれる。経口用の医薬組成物には、適切に、甘み付けされ、かつ／又は風味付けされていてよい。
阻害薬は、噴霧剤、クリーム剤、膏薬、坐剤、ゼリー剤、ゲル剤、パスタ剤、ローション剤、軟膏剤などの形態において、様々な薬学的に許容される不活性な担体と一緒に組み合わせることができる。このような剤形の投与は、単一の、又は複数の投与量において行うことができる。担体には、固体の希釈剤又は充填剤、無菌の水性媒体、及び様々な非毒性の有機溶媒などが含まれる。
タンパク質性の阻害薬を含む製剤は全て、変性及び／又は分解、ならびに阻害薬の生物学的活性の喪失を避けるように選択しなければならない。
阻害薬を含む医薬組成物を調製する方法は当技術分野において知られており、国際特許公開第ＷＯ０１／３４５７４号などに記載されている。本発明の教示の観点では、阻害薬を含む医薬組成物を調製する方法は、上記に引用した出版物、及びＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｅａｓｔｏｎ、Ｐａ．、第１８版（１９９０年）などの、他の知られている参考文献から明らかである。
阻害薬を経口投与するには、有効薬剤の一方又は両方を含んでいる錠剤を、例えば、デンプン（好ましくは、トウモロコシ、バレイショ、又はタピオカのデンプン）、アルギン酸、及びある種の複合ケイ酸塩などの様々な崩壊剤に加えて、ポリビニルピロリドン、ショ糖、ゼラチン、及びアラビアゴムなどの造粒結合剤と一緒に、微結晶性セルロース、クエン酸ナトリウム、炭酸カルシウム、リン酸二カルシウム、及びグリシンなどのあらゆる様々な賦形剤と組み合わせる。さらに、ステアリン酸マグネシウム、ラウリル硫酸ナトリウム、及びタルクなどの滑沢化剤が、しばしば打錠目的に非常に有用である。同様のタイプの固体組成物も、ゼラチンカプセル剤における充填剤として使用することができ、この関係において好ましい材料には、ラクトース又は乳糖、及び高分子量のポリエチレングリコールがやはり含まれる。水性懸濁剤及び／又はエリキシル剤を経口投与用にデザインする場合、阻害薬を様々な甘味剤又は香味剤、着色材料又は色素と組み合わせることができ、所望により、水、エタノール、プロピレングリコール、グリセリンなどの希釈剤、及びこれらの様々な同様の組合せと一緒に、乳化剤及び／又は懸濁化剤とも組み合わせることができる。
有効薬剤のいずれか又は両方を非経口投与するには、ゴマ油中もしくはラッカセイ油中いずれかの、又はプロピレングリコール水溶液中の溶液を使用することができ、有効薬剤又は対応するその水溶性の塩を含む無菌の水溶液を使用することができる。このような無菌の水溶液は適切に緩衝化されているのが好ましく、また十分な食塩水又はグルコースなどで等張にされているのが好ましい。これらの特定の水溶液剤は、静脈内、筋肉内、皮下、及び腹腔内注射の目的に特に適する。油性液剤は、関節内、筋肉内、及び皮下注射の目的に適する。無菌条件下のこれら全ての溶液の調製物は、当業者にはよく知られている標準的な製薬技術によって容易に実現される。タンパク質性の阻害薬を投与するのに選択されるあらゆる非経口製剤は、阻害薬の生物学的活性の変性及び喪失を避けるように選択しなければならない。
さらに、有効薬剤のいずれか又は両方を、標準的な製薬操作にしたがって、例えば、クリーム剤、ローション剤、ゼリー剤、ゲル剤、パスタ剤、軟膏剤、膏薬などによって局所投与することが可能である。例えば、約０．１％（ｗ／ｖ）から約５％（ｗ／ｖ）の濃度の阻害薬を含む局所製剤を調製することができる。
獣医学目的では、有効薬剤を、別々に又は一緒に、上記に記載したあらゆる形態を用いて、及びあらゆる経路によって動物に投与することができる。好ましい一実施態様において、阻害薬を、カプセル剤、ボーラス、錠剤、水薬の形態において、注射により、又は埋込みとして投与する。一代替として、阻害薬を動物の餌と一緒に投与することができ、この目的では、通常の動物餌用に、濃縮された餌の添加剤又はプレミックスを調製することができる。このような製剤は、標準的な獣医学的操作にしたがって、慣例的な様式において調製される。
特に診断検査及び処置を治療に適用することに関係する、医薬の技術分野の技術者であれば、生物系は変動性を示すことがあり、完全に予測できるとは限らないことがあり、したがって多くの優れた診断検査又は治療がときとして無効であることを理解される。したがって、試験結果、患者の状態及び病歴、ならびに患者自身の経験に基づいて、個々の患者に最も好適な処置の経過を決定するのは、最終的に担当の医師の判断次第である。例えば、腫瘍がＥＧＦＲキナーゼ阻害薬に対して特に感受性であると予測されない場合でも、特に他の明らかな処置の選択肢の全てもしくは殆どが失敗した場合、又は別の処置と一緒に投与した場合にいくらかの相乗効果が予測される場合、診断検査からの、又は他の診断基準からのデータに基づいて、医師がＥＧＦＲ阻害薬で患者を処置することを選択する場合さえもあり得る。あるクラスの薬物としてＥＧＦＲ阻害薬が、癌の処置において用いられるより伝統的な化学療法又は細胞毒性薬剤など、多くの他の抗癌薬に比べて、比較的良好に認容されるという事実により、これがより実行可能な選択肢となる。
宣伝方法
本明細書における本発明は、標的の観衆に対して、上皮様腫瘍を示すメチル化パターンによって特徴付けられるあるタイプの癌を有する患者集団を処置するための阻害薬もしくはその医薬組成物の使用を促進し、又は標的の観衆に対して、間葉様腫瘍を示すメチル化パターンによって特徴付けられるあるタイプの癌を有する患者集団を処置するための阻害薬もしくはその医薬組成物の不使用を促進することを含めた、ＥＧＦＲ又は薬学的に許容されるその組成物を宣伝するための方法も包含する。
本明細書における本発明は、標的の観衆に対して、上皮様腫瘍を示すメチル化パターンによって特徴付けられるあるタイプの癌を有する患者集団を処置するための阻害薬もしくはその医薬組成物の使用を促進し、又は標的の観衆に対して、間葉様腫瘍を示すメチル化パターンによって特徴付けられるあるタイプの癌を有する患者集団を処置するための阻害薬もしくはその医薬組成物の不使用を促進することを含めた、ＥＧＦＲ又は薬学的に許容されるその組成物を宣伝するための方法も包含する。
宣伝は、一般的に、スポンサーが特定され、メッセージが制御されている、非個人的な媒体による有償の情報伝達である。本明細書の目的での宣伝には、広告、広報活動、プロダクトプレースメント、資金提供、引受業務、及び販売促進が含まれる。この語には、本明細書における本発明の好ましいパターンの購入、支持、又は賛同に向けて説得し、通知し、促進し、動機づけ、又は別の方法で行動を修飾するように、多くの観衆に訴えるようデザインされている、あらゆる印刷コミュニケーション媒体において出現するスポンサー付き情報公示（ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ ｐｕｂｌｉｃ ｎｏｔｉｃｅ）も含まれる。
本明細書の診断方法の宣伝及び促進は、あらゆる手段によって遂行することができる。これらのメッセージを配信するのに用いられる宣伝媒体の例には、放送媒体に現れるメッセージであるコマーシャルを含めた、テレビ、ラジオ、映画、雑誌、新聞、インターネット、及び広告板が含まれる。広告にはまた、食料品カートのシート上、空港の歩道の壁上、及びバスの側面上のもの、又は電話の保留メッセージもしくは店舗内のＰＡシステムで聞かれるものも含まれ、又は視覚的もしくは聴覚的な情報伝達を配置することができるあらゆる場所が含まれる。
促進又は宣伝手段のより具体的な例には、テレビ、ラジオ、映画、ウエブ放送及びウエビナーなどのインターネット、ユーザーに同時に到達することを意図した双方向コンピュータネットワーク、固定又は電子上の広告板及び他の公共サイン、ポスター、伝統的な、又は電子上の印刷物（例えば、雑誌及び新聞）、他の媒体アウトレット、プレゼンテーション又は個人的接触（例えば、電子メール、電話、インスタントメッセージ、郵便、宅配業者、大衆、又はキャリアメール（ｃａｒｒｉｅｒ ｍａｉｌ）による）、本人直々の訪問などが含まれる。
用いられる宣伝のタイプは、病院、保険会社、診療所、医師、看護師、及び患者など、到達する標的の観衆の性質、ならびに費用の考慮、ならびに薬物及び診断の宣伝を統治する関連の管轄の法律及び規則などの多くの要因に依存する。宣伝は、サービスのインターアクションならびに／又は使用者の人口統計及び地理的位置などの他のデータによって規定されるユーザーの特徴付けに基づいて、個別化されてもよく、又はカスタマイズされてもよい。
表
表
本発明は、以下の実施例からさらに理解される。しかし、当業者であれば、論じられる特定の方法及び結果は、本明細書の後に続く特許請求の範囲においてより完全に記載する通り、本発明を単に説明するものであり、本明細書に決して限定されないとみなされることが容易に理解される。
材料と方法
Ｆｌｕｉｄｉｇｍ発現分析
ＢｉｏＭａｒｋ ９６×９６遺伝子発現プラットホーム（Ｆｌｕｉｄｉｇｍ）及び２０遺伝子ＥＭＴ発現パネル（補完表１ Ｓ１及び方法）を用いて、８２のＮＳＣＬＣ細胞株に対してＥＭＴ遺伝子発現分析を行った。ΔＣｔ値を用いて、Ｃｌｕｓｔｅｒ ｖ．３．０及びＴｒｅｅｖｉｅｗ ｖ．１．６０ソフトウエアを用いてＥＭＴ遺伝子発現レベルにしたがって、細胞株をクラスタ化した。
Ｆｌｕｉｄｉｇｍ発現分析
ＢｉｏＭａｒｋ ９６×９６遺伝子発現プラットホーム（Ｆｌｕｉｄｉｇｍ）及び２０遺伝子ＥＭＴ発現パネル（補完表１ Ｓ１及び方法）を用いて、８２のＮＳＣＬＣ細胞株に対してＥＭＴ遺伝子発現分析を行った。ΔＣｔ値を用いて、Ｃｌｕｓｔｅｒ ｖ．３．０及びＴｒｅｅｖｉｅｗ ｖ．１．６０ソフトウエアを用いてＥＭＴ遺伝子発現レベルにしたがって、細胞株をクラスタ化した。
Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｉｎｆｉｎｉｕｍ分析
以下に記載する通りＩｌｌｕｍｉｎａ Ｈｕｍａｎ Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ４５０ ＢｅａｄＣｈｉｐ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を用いて、Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｉｎｃ．（Ｄｕｒｈａｍ、Ｎ．Ｃ．）でマイクロアレイデータを収集した。「一個抜き（ｌｅａｖｅ−ｏｎｅ−ｏｕｔ）」交差検証の戦略（以下及び参考文献２５、２６に記載）を用いてアレイデータを分析し、メチル化分類指標を確立した。アレイデータは、Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｏｍｎｉｂｕｓデータベース（受諾番号ＧＳＥ３６２１６）に提出されたものである。
以下に記載する通りＩｌｌｕｍｉｎａ Ｈｕｍａｎ Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ４５０ ＢｅａｄＣｈｉｐ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を用いて、Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｉｎｃ．（Ｄｕｒｈａｍ、Ｎ．Ｃ．）でマイクロアレイデータを収集した。「一個抜き（ｌｅａｖｅ−ｏｎｅ−ｏｕｔ）」交差検証の戦略（以下及び参考文献２５、２６に記載）を用いてアレイデータを分析し、メチル化分類指標を確立した。アレイデータは、Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｏｍｎｉｂｕｓデータベース（受諾番号ＧＳＥ３６２１６）に提出されたものである。
細胞株
ＮＳＣＬＣ細胞株は全て、アメリカ培養細胞株統保存機関（ＡＴＣＣ）から購入したもの、又はＵＴ ＳｏｕｔｈｗｅｓｔｅｒｎのＡｄｉ Ｇａｚｄａｒ及びＪｏｈｎ Ｍｉｎｎａによって提供されたものであった。固定化されている気管支上皮細胞株（ｇＢＥＣ）及び小気道細胞株（ｇＳＡＣ）は、選択マーカーとしてｃｄｋ４、ｈＴＥＲＴ、及びＧ４１８を含むトリシストロニックベクター（ｔｒｉｃｉｓｔｒｏｎｉｃ ｖｅｃｔｏｒ）を用いてＧｅｎｅｎｔｅｃｈで作成されたものであった。トリシストロニックベクターは、ｈＴＥＲＴを含むｐＱＣＸＩＮバックボーンから構築した。固定化のプロセスは、予め公開されているプロトコールをいくつか修正したものに基づくものであった（Ｒａｍｉｒｅｚ、Ｓｈｅｒｉｄａｎら、２００４年；Ｓａｔｏ、Ｖａｕｇｈａｎら、２００６年）。ｇＢＥＣ及びｇＳＡＣは、二倍体の核型を有し、非腫瘍形成性である。５−アザｄＣ、エルロチニブ、又はＴＧＦβ１での細胞株の処理を、記載されている通りに行った。
ＮＳＣＬＣ細胞株は全て、アメリカ培養細胞株統保存機関（ＡＴＣＣ）から購入したもの、又はＵＴ ＳｏｕｔｈｗｅｓｔｅｒｎのＡｄｉ Ｇａｚｄａｒ及びＪｏｈｎ Ｍｉｎｎａによって提供されたものであった。固定化されている気管支上皮細胞株（ｇＢＥＣ）及び小気道細胞株（ｇＳＡＣ）は、選択マーカーとしてｃｄｋ４、ｈＴＥＲＴ、及びＧ４１８を含むトリシストロニックベクター（ｔｒｉｃｉｓｔｒｏｎｉｃ ｖｅｃｔｏｒ）を用いてＧｅｎｅｎｔｅｃｈで作成されたものであった。トリシストロニックベクターは、ｈＴＥＲＴを含むｐＱＣＸＩＮバックボーンから構築した。固定化のプロセスは、予め公開されているプロトコールをいくつか修正したものに基づくものであった（Ｒａｍｉｒｅｚ、Ｓｈｅｒｉｄａｎら、２００４年；Ｓａｔｏ、Ｖａｕｇｈａｎら、２００６年）。ｇＢＥＣ及びｇＳＡＣは、二倍体の核型を有し、非腫瘍形成性である。５−アザｄＣ、エルロチニブ、又はＴＧＦβ１での細胞株の処理を、記載されている通りに行った。
ＮＳＣＬＣ正常肺組織、原発腫瘍、及び生検組織
初期を代表し、外科的に切除可能な腫瘍である、新鮮凍結ＮＳＣＬＳ原発腫瘍組織３１検体（腺癌Ｎ＝２８、扁平上皮癌３）、及び最先端の化学療法を継続できなかった患者からのホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）ＮＳＣＬＣ生検６０検体。新鮮凍結正常肺組織３５検体（原発腫瘍組織にマッチした３１検体もこの収集物の一部であった）。試料は全て、ＩＲＢ認可のプロトコールの下、インフォームドコンセントとともに入手した。全ての試料を、病理学者により、組織の質及び腫瘍のステージ、グレード、ならびに腫瘍含有量に対して評価した。末梢血単核細胞（Ｎ＝２０）は、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈクリニックで健常志願者から入手した。
初期を代表し、外科的に切除可能な腫瘍である、新鮮凍結ＮＳＣＬＳ原発腫瘍組織３１検体（腺癌Ｎ＝２８、扁平上皮癌３）、及び最先端の化学療法を継続できなかった患者からのホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）ＮＳＣＬＣ生検６０検体。新鮮凍結正常肺組織３５検体（原発腫瘍組織にマッチした３１検体もこの収集物の一部であった）。試料は全て、ＩＲＢ認可のプロトコールの下、インフォームドコンセントとともに入手した。全ての試料を、病理学者により、組織の質及び腫瘍のステージ、グレード、ならびに腫瘍含有量に対して評価した。末梢血単核細胞（Ｎ＝２０）は、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈクリニックで健常志願者から入手した。
５−アザｄＣ処置及びＴＧＦβ１処置
細胞を、１０％ウシ胎児血清及び２ｍＭ Ｌ−グルタミンを補ったＲＰＭＩ１６４０中で増殖させた。０日目に細胞４０００〜９０００個／ｃｍ２を接種し、１日目、３日目、及び５日目に、１μＭ５−アザ−２’−デオキシシチジン（５−アザ−ｄＣ）（ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨカタログ番号Ａ３６５６）又はＤＭＳＯ対照（カタログ番号Ｄ２６５０）を投与した。６日目、細胞を冷ＰＢＳ中で１回洗浄し、Ｔｒｉｚｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号１５５９６０１８）中で掻取ることによって収集し、ＲＮＡに対して抽出し、又は後にＲＮＡ抽出するために急速冷凍した。ＥＭＴを誘導するために、細胞を完全培地中２００００〜５００００細胞／１０ｃｍ２接種し、ヒトトランスフォーミング増殖因子β１（ＴＧＦβ１）（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号１００−Ｂ／ＣＦ）２ｎｇ／ｍｌ又はＰＢＳ対照を補った。培地及びＴＧＦβ１を３日毎に置き換え、ＴＧＦβ１によりＥＭＴを誘導し４〜５週後にＲＮＡを抽出した。遺伝子発現の変化を、２０遺伝子ＥＭＴパネルに対してＴａｑｍａｎアッセイを用いて評価した（図１）。
細胞を、１０％ウシ胎児血清及び２ｍＭ Ｌ−グルタミンを補ったＲＰＭＩ１６４０中で増殖させた。０日目に細胞４０００〜９０００個／ｃｍ２を接種し、１日目、３日目、及び５日目に、１μＭ５−アザ−２’−デオキシシチジン（５−アザ−ｄＣ）（ＳＩＧＭＡ−ＡＬＤＲＩＣＨカタログ番号Ａ３６５６）又はＤＭＳＯ対照（カタログ番号Ｄ２６５０）を投与した。６日目、細胞を冷ＰＢＳ中で１回洗浄し、Ｔｒｉｚｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号１５５９６０１８）中で掻取ることによって収集し、ＲＮＡに対して抽出し、又は後にＲＮＡ抽出するために急速冷凍した。ＥＭＴを誘導するために、細胞を完全培地中２００００〜５００００細胞／１０ｃｍ２接種し、ヒトトランスフォーミング増殖因子β１（ＴＧＦβ１）（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号１００−Ｂ／ＣＦ）２ｎｇ／ｍｌ又はＰＢＳ対照を補った。培地及びＴＧＦβ１を３日毎に置き換え、ＴＧＦβ１によりＥＭＴを誘導し４〜５週後にＲＮＡを抽出した。遺伝子発現の変化を、２０遺伝子ＥＭＴパネルに対してＴａｑｍａｎアッセイを用いて評価した（図１）。
エルロチニブ処理
エルロチニブのＩＣ５０を決定するために、細胞を、０．５％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ（アッセイ培地）中３８４ウエルプレート中に１ウエルあたり３×１０２細胞を４回接種し、一夜インキュベートした。２４時間後、細胞を、ＴＧＦα３ｎＭ及び最終濃度１０μＭ〜１ｐＭの投与量範囲のエルロチニブを含むアッセイ培地で処理した。７２時間後、細胞の生存能を、Ｃｅｌｌｔｉｔｅｒ−Ｇｌｏ Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて測定した。細胞の生存能の５０％阻害をもたらすエルロチニブの濃度を、４−パラメータ曲線分析から算出し、２つの実験の最小値から決定した。エルロチニブＩＣ５０≦２．０μＭを示す細胞株を感受性、２．０〜８．０μＭを中間、及び≧８．０μＭを抵抗性と規定した。
エルロチニブのＩＣ５０を決定するために、細胞を、０．５％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ（アッセイ培地）中３８４ウエルプレート中に１ウエルあたり３×１０２細胞を４回接種し、一夜インキュベートした。２４時間後、細胞を、ＴＧＦα３ｎＭ及び最終濃度１０μＭ〜１ｐＭの投与量範囲のエルロチニブを含むアッセイ培地で処理した。７２時間後、細胞の生存能を、Ｃｅｌｌｔｉｔｅｒ−Ｇｌｏ Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて測定した。細胞の生存能の５０％阻害をもたらすエルロチニブの濃度を、４−パラメータ曲線分析から算出し、２つの実験の最小値から決定した。エルロチニブＩＣ５０≦２．０μＭを示す細胞株を感受性、２．０〜８．０μＭを中間、及び≧８．０μＭを抵抗性と規定した。
Ｆｌｕｉｄｉｇｍ遺伝子発現分析
全ＲＮＡ２μｌをｃＤＮＡに逆転写し、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩＩ／Ｐｌａｔｉｎｕｍ Ｔａｑ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及び予備増幅反応混合物（Ｐｒｅ−ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｍｉｘ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて１回の反応で予備増幅した。ＥＭＴ発現パネルに対して選択した２０個のＴａｑｍａｎプライマー／プローブセット（図１）を、０．０５×オリジナルのＴａｑｍａｎアッセイ濃度（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）の最終希釈で予備増幅反応に含めた。熱サイクル条件は以下の通りであった：５０℃、１５分間を１サイクル、７０℃、２分間を１サイクル、次いで９５℃、１５秒間及び６０℃、４分間を１４サイクル。
全ＲＮＡ２μｌをｃＤＮＡに逆転写し、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩＩ／Ｐｌａｔｉｎｕｍ Ｔａｑ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及び予備増幅反応混合物（Ｐｒｅ−ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｍｉｘ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて１回の反応で予備増幅した。ＥＭＴ発現パネルに対して選択した２０個のＴａｑｍａｎプライマー／プローブセット（図１）を、０．０５×オリジナルのＴａｑｍａｎアッセイ濃度（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）の最終希釈で予備増幅反応に含めた。熱サイクル条件は以下の通りであった：５０℃、１５分間を１サイクル、７０℃、２分間を１サイクル、次いで９５℃、１５秒間及び６０℃、４分間を１４サイクル。
予備増幅したｃＤＮＡを１．９４倍希釈し、次いで、ＢｉｏＭａｒｋ ＢＭＫ−Ｍ−９６．９６プラットホーム（Ｆｌｕｉｄｉｇｍ）上、Ｔａｑｍａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＰＣＲ ＭａｓｔｅｒＭｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、製造元の指示にしたがって増幅した。試料は全て、３回ずつアッセイした。複数の細胞株にまたがって発現安定性に対して予め評価した特注の基準遺伝子２つ、新鮮凍結した組織試料、及びＦＦＰＥ組織試料であるＡＬ−１３７７２７１及びＶＰＳ−３３Ｂが発現パネルに含まれた。２つの基準遺伝子に対するＣｔ値の平均を各試料に対して算出し、ＥＭＴ標的遺伝子の発現レベルを、デルタＣｔ（ｄＣｔ）法を用いて以下の通り決定した：平均Ｃｔ（標的遺伝子）−平均Ｃｔ（基準遺伝子）。
Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｉｎｆｉｎｉｕｍ分析
マイクロアレイのデータは、ＩｌｌｕｍｉｎａＨｕｍａｎＭｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ４５０ ＢｅａｄＣｈｉｐ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を用いて、Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｉｎｃ．（Ｄｕｒｈａｍ、ＮＣ；ｗｗｗ．ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎａｎａｌｙｓｉｓ．ｃｏｍ）で収集されたものであった。これらのアレイは、ＣｐＧ遺伝子座のおよそ４５００００部位に対するプローブを含んでいる。標的を調製し、「Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｉｎｆｉｎｉｕｍ ＨＤメチル化アッセイ、マニュアルプロトコール」（Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｐａｒｔ ＃１５０１９５２２ Ｒｅｖ．Ａ）にしたがってハイブリダイズした。
マイクロアレイのデータは、ＩｌｌｕｍｉｎａＨｕｍａｎＭｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ４５０ ＢｅａｄＣｈｉｐ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を用いて、Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｉｎｃ．（Ｄｕｒｈａｍ、ＮＣ；ｗｗｗ．ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎａｎａｌｙｓｉｓ．ｃｏｍ）で収集されたものであった。これらのアレイは、ＣｐＧ遺伝子座のおよそ４５００００部位に対するプローブを含んでいる。標的を調製し、「Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｉｎｆｉｎｉｕｍ ＨＤメチル化アッセイ、マニュアルプロトコール」（Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｐａｒｔ ＃１５０１９５２２ Ｒｅｖ．Ａ）にしたがってハイブリダイズした。
バイサルファイト変換
バイサルファイト変換反応を、ゲノムＤＮＡ５００ｎｇを用い、Ｚｙｍｏ ＥＺ ＤＮＡメチル化キット（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）に対する製造元のプロトコールにしたがって使用した。ＤＮＡをＺｙｍｏ Ｍ−希釈バッファーに加え、３７℃で１５分間インキュベートした。次いで、ＣＴ変換試薬を加え、混合物を９５℃で３０秒間加熱することにより変性させ、引き続き５０℃で１時間インキュベートした。この変性／インキュベートサイクルを、合計１６時間繰り返した。バイサルファイト変換後、ＤＮＡをＺｙｍｏスピンカラムに結合させ、脱スルホン試薬を用い、製造元のプロトコールにしたがって、カラム上で脱スルホンした。バイサルファイト変換したＤＮＡを、溶出カラム１０μｌ中、カラムから溶出した。
バイサルファイト変換反応を、ゲノムＤＮＡ５００ｎｇを用い、Ｚｙｍｏ ＥＺ ＤＮＡメチル化キット（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）に対する製造元のプロトコールにしたがって使用した。ＤＮＡをＺｙｍｏ Ｍ−希釈バッファーに加え、３７℃で１５分間インキュベートした。次いで、ＣＴ変換試薬を加え、混合物を９５℃で３０秒間加熱することにより変性させ、引き続き５０℃で１時間インキュベートした。この変性／インキュベートサイクルを、合計１６時間繰り返した。バイサルファイト変換後、ＤＮＡをＺｙｍｏスピンカラムに結合させ、脱スルホン試薬を用い、製造元のプロトコールにしたがって、カラム上で脱スルホンした。バイサルファイト変換したＤＮＡを、溶出カラム１０μｌ中、カラムから溶出した。
Ｉｎｆｉｎｉｕｍメチル化アッセイ
バイサルファイト変換した生成物４μｌを、等量の０．１Ｎ ＮａＯＨ及びＭＡ１試薬２０μｌ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）と一緒に新たなプレートに移し、次いで、ＲＴで１０分間インキュベートした。インキュベート直後、ＭＡ２試薬６８μｌ及びＭＳＭ試薬７５μｌ（両方ともＩｌｌｕｍｉｎａ）を加え、プレートを一夜、３７℃でインキュベートして増幅させた。増幅後、ＤＮＡを酵素でフラグメント化し、沈澱させ、ＲＡ１ハイブリダイゼーションバッファー中に再懸濁した。ハイブリダイゼーション及びスキャニング：フラグメント化したＤＮＡをマルチチャネルＨｕｍａｎＭｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ＢｅａｄＣｈｉｐｓ上に分配し、Ｉｌｌｕｍｉｎａハイブリダイゼーションオーブン中で２０時間、ハイブリダイゼーションを行った。ＢｅａｄＣｈｉｐｓを洗浄し、プライマー伸長し、製造元のプロトコールにしたがって染色した。ＢｅａｄＣｈｉｐｓをコーティングし、次いで、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ｉＳｃａｎ Ｒｅａｄｅｒ上で画像化し、画像をＧｅｎｏｍｅＳｔｕｄｉｏソフトウエアメチル化モジュール（バージョン１．８以降）で処理加工した。
バイサルファイト変換した生成物４μｌを、等量の０．１Ｎ ＮａＯＨ及びＭＡ１試薬２０μｌ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）と一緒に新たなプレートに移し、次いで、ＲＴで１０分間インキュベートした。インキュベート直後、ＭＡ２試薬６８μｌ及びＭＳＭ試薬７５μｌ（両方ともＩｌｌｕｍｉｎａ）を加え、プレートを一夜、３７℃でインキュベートして増幅させた。増幅後、ＤＮＡを酵素でフラグメント化し、沈澱させ、ＲＡ１ハイブリダイゼーションバッファー中に再懸濁した。ハイブリダイゼーション及びスキャニング：フラグメント化したＤＮＡをマルチチャネルＨｕｍａｎＭｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ＢｅａｄＣｈｉｐｓ上に分配し、Ｉｌｌｕｍｉｎａハイブリダイゼーションオーブン中で２０時間、ハイブリダイゼーションを行った。ＢｅａｄＣｈｉｐｓを洗浄し、プライマー伸長し、製造元のプロトコールにしたがって染色した。ＢｅａｄＣｈｉｐｓをコーティングし、次いで、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ｉＳｃａｎ Ｒｅａｄｅｒ上で画像化し、画像をＧｅｎｏｍｅＳｔｕｄｉｏソフトウエアメチル化モジュール（バージョン１．８以降）で処理加工した。
Ｉｎｆｉｎｉｕｍ分析
メチル化データをＢｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒ ｌｕｍｉソフトウエアパッケージを用いて処理加工した（Ｄｕ、Ｋｉｂｂｅら、２００８年）。Ｉｎｆｉｎｉｕｍ ４５０Ｋプラットホームには、同じアレイ上Ｉｎｆｉｎｉｕｍ Ｉ及びＩＩアッセイが含まれていた。Ｉｎｆｉｎｉｕｍ Ｉアッセイは、ＣｐＧ遺伝子座一つあたり２つのビーズタイプを使用し、メチル化の状態は場合により赤色色素によって報告され、場合により緑色色素によって報告される（以前のＩｎｆｉｎｉｕｍ ２７Ｋプラットホームと同一）。Ｉｎｆｉｎｉｕｍ ＩＩアッセイは一つのビーズタイプを用い、常にメチル化状態は同じ色素で報告され、そのため色素の偏りが問題となる。２段階の標準化手順をアレイに適用した：第１に、各アレイに対して、色−偏り補正曲線を、Ｉｎｆｉｎｉｕｍ Ｉデータから、平滑変位値標準化法（ｓｍｏｏｔｈ ｑｕａｎｔｉｌｅ ｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ）を用いて推定し、この補正曲線を、次いで、そのアレイからのデータ全てに適用した。第２に、全ての色−補正シグナルに対して標準的な変位値の標準化を適用することにより、アレイを相互に対して標準化した。予備処理後、メチル化のＭ値（メチル化対非メチル化のプローブのｌｏｇ２の比）及び値（ロジスティック変換によりＭ値を０及び１の範囲に再基準化したもの）の両方を各試料に対して計算した（Ｄｕ、Ｚｈａｎｇら、２０１０年）。視覚化するために、完全な連結及びユークリッド距離を用いて、−値の集塊性階層的クラスタ化（ａｇｇｌｏｍｅｒａｔｉｖｅ ｈｉｅｒａｒｃｈｉｃａｌ ｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇ）を行った。
メチル化データをＢｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒ ｌｕｍｉソフトウエアパッケージを用いて処理加工した（Ｄｕ、Ｋｉｂｂｅら、２００８年）。Ｉｎｆｉｎｉｕｍ ４５０Ｋプラットホームには、同じアレイ上Ｉｎｆｉｎｉｕｍ Ｉ及びＩＩアッセイが含まれていた。Ｉｎｆｉｎｉｕｍ Ｉアッセイは、ＣｐＧ遺伝子座一つあたり２つのビーズタイプを使用し、メチル化の状態は場合により赤色色素によって報告され、場合により緑色色素によって報告される（以前のＩｎｆｉｎｉｕｍ ２７Ｋプラットホームと同一）。Ｉｎｆｉｎｉｕｍ ＩＩアッセイは一つのビーズタイプを用い、常にメチル化状態は同じ色素で報告され、そのため色素の偏りが問題となる。２段階の標準化手順をアレイに適用した：第１に、各アレイに対して、色−偏り補正曲線を、Ｉｎｆｉｎｉｕｍ Ｉデータから、平滑変位値標準化法（ｓｍｏｏｔｈ ｑｕａｎｔｉｌｅ ｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ）を用いて推定し、この補正曲線を、次いで、そのアレイからのデータ全てに適用した。第２に、全ての色−補正シグナルに対して標準的な変位値の標準化を適用することにより、アレイを相互に対して標準化した。予備処理後、メチル化のＭ値（メチル化対非メチル化のプローブのｌｏｇ２の比）及び値（ロジスティック変換によりＭ値を０及び１の範囲に再基準化したもの）の両方を各試料に対して計算した（Ｄｕ、Ｚｈａｎｇら、２０１０年）。視覚化するために、完全な連結及びユークリッド距離を用いて、−値の集塊性階層的クラスタ化（ａｇｇｌｏｍｅｒａｔｉｖｅ ｈｉｅｒａｒｃｈｉｃａｌ ｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇ）を行った。
メチル化分類指標
１０×１０倍の交差検証戦略を用いて、１セットの差示的メチル化ＣｐＧ部位（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ ｍｅｔｈｙｌａｔｅｄ ＣｐＧ ｓｉｔｅ）（ＤＭＲ）を選択し、メチル化ベースのＥＬ対ＭＬ分類指標の正確さを同時に評価した。細胞株を、１０個の均等にサイズ分けしたグループに分割した。１０分の９の系統を用いて（トレーニングセット）、最初に、各細胞株のＭ値に対して移動平均を算出することにより（インターロゲーションされる（ｉｎｔｅｒｒｏｇａｔｅｄ）ＣｐＧ部位を中心とする５００ｂｐのウインドウ）、候補のＤＭＲを同定し、次いでｔ検定を用いて、上皮様対間葉様のトレーニング系統に関連するウインドウスコアを対比させた。ＤＭＲのｐ値を調節して、誤り発見率（Ｆａｌｓｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ｒａｔｅ）を制御し（Ｂｅｎｊａｍｉｎｉ及びＨｏｃｈｂｅｒｇ、１９９５年）、０．０１のカットオフと比較した。より生物学的に関連のある現象に対して濃縮するために、候補は（ｉ）上皮と間葉との系統の間で少なくとも１単位異なり、（ｉｉ）２セットの細胞株において反対の符号を有する、ウインドウスコアの平均を有することが必要とされた。このプロセスにより、間葉に関連する（正のシグナル）及び上皮に関連する（負のシグナル）両方の候補のＤＭＲを得た。性能を評価するために、試験に提供された系統の１０分の１を、正のＤＭＲに対してこれらのシグナルを合計し、負のＤＭＲに対してシグナルを差し引き、次いでＤＭＲの合計数によって除すことにより、スコア付けした。試験系統に対して既知の上皮対間葉の標識を、結果の符号と比較した。最後に、各１０番目を試験セットの役割に取り上げて、交差検証プロセスを繰り返した。最後に交差検証プロセス自体をさらに９回繰り返し、全体の正確さの評価は１００の異なる試験セットの正解率（ａｃｃｕｒａｃｙ ｒａｔｅ）の平均であった。最終セットのＤＭＲを構築するために、本発明者らは、交差検証の分割に１００％関連があると同定された候補だけを保持した。この判断基準を満たす近接したＤＭＲが２ｋｂ未満分かれていた場合、これらＤＭＲを単一のＤＭＲに併合した。
１０×１０倍の交差検証戦略を用いて、１セットの差示的メチル化ＣｐＧ部位（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ ｍｅｔｈｙｌａｔｅｄ ＣｐＧ ｓｉｔｅ）（ＤＭＲ）を選択し、メチル化ベースのＥＬ対ＭＬ分類指標の正確さを同時に評価した。細胞株を、１０個の均等にサイズ分けしたグループに分割した。１０分の９の系統を用いて（トレーニングセット）、最初に、各細胞株のＭ値に対して移動平均を算出することにより（インターロゲーションされる（ｉｎｔｅｒｒｏｇａｔｅｄ）ＣｐＧ部位を中心とする５００ｂｐのウインドウ）、候補のＤＭＲを同定し、次いでｔ検定を用いて、上皮様対間葉様のトレーニング系統に関連するウインドウスコアを対比させた。ＤＭＲのｐ値を調節して、誤り発見率（Ｆａｌｓｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ｒａｔｅ）を制御し（Ｂｅｎｊａｍｉｎｉ及びＨｏｃｈｂｅｒｇ、１９９５年）、０．０１のカットオフと比較した。より生物学的に関連のある現象に対して濃縮するために、候補は（ｉ）上皮と間葉との系統の間で少なくとも１単位異なり、（ｉｉ）２セットの細胞株において反対の符号を有する、ウインドウスコアの平均を有することが必要とされた。このプロセスにより、間葉に関連する（正のシグナル）及び上皮に関連する（負のシグナル）両方の候補のＤＭＲを得た。性能を評価するために、試験に提供された系統の１０分の１を、正のＤＭＲに対してこれらのシグナルを合計し、負のＤＭＲに対してシグナルを差し引き、次いでＤＭＲの合計数によって除すことにより、スコア付けした。試験系統に対して既知の上皮対間葉の標識を、結果の符号と比較した。最後に、各１０番目を試験セットの役割に取り上げて、交差検証プロセスを繰り返した。最後に交差検証プロセス自体をさらに９回繰り返し、全体の正確さの評価は１００の異なる試験セットの正解率（ａｃｃｕｒａｃｙ ｒａｔｅ）の平均であった。最終セットのＤＭＲを構築するために、本発明者らは、交差検証の分割に１００％関連があると同定された候補だけを保持した。この判断基準を満たす近接したＤＭＲが２ｋｂ未満分かれていた場合、これらＤＭＲを単一のＤＭＲに併合した。
発現ベースのＥＭＴスコア
本発明者らの、２０遺伝子のＦｌｕｉｄｉｇｍ発現パネルにおけるいくつかの遺伝子の挙動は、細胞株と腫瘍試料との間で異なることが見て取れた。ＥＬ対ＭＬを分類する目的でこのパネルのより頑強なサブセットを同定するために、本発明者らはＣＤＨ１発現をＥＭＴのアンカー（ａｎｃｈｏｒ）として捕らえ、次いでＣＤＨ１との相関が細胞株と腫瘍試料両方における符号が同じことを示す遺伝子（合計１３）を選択した。ＥＭＴ発現スコアを腫瘍試料に割り当てるために、各１３遺伝子に対する−ｄＣＴ値を、最初に平均値が０となるように中央におき、標準偏差が１になるようにスケール付けした。次の符号を、ＣＤＨ１と負の相関を示す遺伝子に対して反転させた。最後に、標準化し、符号を調節した結果を平均することによって、個々の腫瘍試料のスコアを算出した。
本発明者らの、２０遺伝子のＦｌｕｉｄｉｇｍ発現パネルにおけるいくつかの遺伝子の挙動は、細胞株と腫瘍試料との間で異なることが見て取れた。ＥＬ対ＭＬを分類する目的でこのパネルのより頑強なサブセットを同定するために、本発明者らはＣＤＨ１発現をＥＭＴのアンカー（ａｎｃｈｏｒ）として捕らえ、次いでＣＤＨ１との相関が細胞株と腫瘍試料両方における符号が同じことを示す遺伝子（合計１３）を選択した。ＥＭＴ発現スコアを腫瘍試料に割り当てるために、各１３遺伝子に対する−ｄＣＴ値を、最初に平均値が０となるように中央におき、標準偏差が１になるようにスケール付けした。次の符号を、ＣＤＨ１と負の相関を示す遺伝子に対して反転させた。最後に、標準化し、符号を調節した結果を平均することによって、個々の腫瘍試料のスコアを算出した。
バイサルファイトシークエンシング及び分析
ゲノムＤＮＡを、ＥＺ ＤＮＡ Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ−Ｇｏｌｄキット（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を用いて、バイサルファイト変換した。変換したＤＮＡに特異的なプライマーを、Ｍｅｔｈｙｌ Ｐｒｉｍｅｒ Ｅｘｐｒｅｓｓソフトウエアｖ１．０（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いてデザインした（配列は要請があれば入手可能）。Ｐｌａｔｉｎｕｍ ＰＣＲ ｓｕｐｅｒｍｉｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、反応物２５μｌ中バイサルファイト変換したＤＮＡ１μｌでＰＣＲ増幅を行った。ＰＣＲの熱サイクル条件は以下の通りであった：９５℃１０分間の最初の変性サイクル１回、引き続き９４℃３０秒間、６５℃１分間、及びサイクルごとに１℃低下させるのを１０サイクル、ならびに７２℃１分間、引き続き９４℃３０秒間、５５℃１．５分間、及び７２℃１分間を３０サイクル、引き続き７２℃１５分間の最終の伸長。ＰＣＲ生成物を、エチジウムブロマイド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含む２％アガロースＥゲルを用いた電気泳動によって分解し、ＦｌｕｏｒＣｈｅｍ ８９００カメラ（Ａｌｐｈａ Ｉｎｎｏｔｅｃｈ）を用いて可視化した。
ゲノムＤＮＡを、ＥＺ ＤＮＡ Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ−Ｇｏｌｄキット（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を用いて、バイサルファイト変換した。変換したＤＮＡに特異的なプライマーを、Ｍｅｔｈｙｌ Ｐｒｉｍｅｒ Ｅｘｐｒｅｓｓソフトウエアｖ１．０（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いてデザインした（配列は要請があれば入手可能）。Ｐｌａｔｉｎｕｍ ＰＣＲ ｓｕｐｅｒｍｉｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、反応物２５μｌ中バイサルファイト変換したＤＮＡ１μｌでＰＣＲ増幅を行った。ＰＣＲの熱サイクル条件は以下の通りであった：９５℃１０分間の最初の変性サイクル１回、引き続き９４℃３０秒間、６５℃１分間、及びサイクルごとに１℃低下させるのを１０サイクル、ならびに７２℃１分間、引き続き９４℃３０秒間、５５℃１．５分間、及び７２℃１分間を３０サイクル、引き続き７２℃１５分間の最終の伸長。ＰＣＲ生成物を、エチジウムブロマイド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含む２％アガロースＥゲルを用いた電気泳動によって分解し、ＦｌｕｏｒＣｈｅｍ ８９００カメラ（Ａｌｐｈａ Ｉｎｎｏｔｅｃｈ）を用いて可視化した。
ＰＣＲ生成物を、ＴＯＰＯ ＴＡ Ｃｌｏｎｉｎｇキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用い、製造元の指示にしたがって、ｐＣＲ４−ＴＯＰＯベクター中にライゲートした。ライゲートしたプラスミドＤＮＡ２μｌを、ＴＯＰ１０コンピテント細菌（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に形質転換させ、形質転換させた細菌１００μｌを、５０μｇ／ｍｌカルベニシリン（Ｔｅｋｎｏｖａ）を含むＬＢ寒天平板上に塗抹し、３７℃で一夜インキュベートした。各候補の遺伝子座に対して１細胞株あたりコロニー１２個を、５０μｌ／ｍｇカルベニシリンを含むＬＢ１ｍｌ中に接種し、振盪培養器中３７℃で一夜増殖させた。プラスミドＤＮＡを９６ウエルフォーマットのＱｉａｐｒｅｐ ｍｉｎｉｐｒｅｐキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて単離し、３７３０ｘ１ ＤＮＡ Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）上でシークエンシングした。
バイサルファイトシークエンシング分析
シークエンシングデータを、Ｓｅｑｕｅｎｃｈｅｒ ｖ ４．５ソフトウエア及びＢｉＱ Ａｎａｌｙｚｅｒソフトウエアを用いて分析した（Ｂｏｃｋ、Ｒｅｉｔｈｅｒら、２００５年）。
シークエンシングデータを、Ｓｅｑｕｅｎｃｈｅｒ ｖ ４．５ソフトウエア及びＢｉＱ Ａｎａｌｙｚｅｒソフトウエアを用いて分析した（Ｂｏｃｋ、Ｒｅｉｔｈｅｒら、２００５年）。
パイロシークエンシング
バイサルファイト特異的ＰＣＲ（ＢＳＰ）プライマーを、Ｍｅｔｈｙｌ Ｐｒｉｍｅｒ Ｅｘｐｒｅｓｓソフトウエアｖ １．０（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）又はＰｙｒｏＭａｒｋ Ａｓｓａｙ Ｄｅｓｉｇｎソフトウエアｖ ２．０（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてデザインした。ＰＣＲ生成物のストレプトアビジンセファロースビーズに対する結合を促進するために、フォワード又はリバースいずれかのプライマー上に５’ビオチン標識を有するＰＣＲプライマーを合成した。ＰｙｒｏＭａｒｋ Ａｓｓａｙ Ｄｅｓｉｇｎソフトウエアｖ ２．０（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、５’−ビオチン標識したＰＣＲプライマーのリバース方向の、シークエンシングプライマーをデザインした。プライマー配列は要請に応じて入手できる。バイサルファイト修飾したＤＮＡ１μｌを、２５μ反応液中、Ｐｌａｔｉｎｕｍ ＰＣＲ Ｓｕｐｅｒｍｉｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて増幅し、ＰＣＲ生成物２０μｌを、Ｐｙｒｏｍａｒｋ Ｑ２４（Ｑｉａｇｅｎ）上でシークエンシングするのに用いた。ＰＣＲ生成物をストレプトアビジンセファロースビーズと１０分間インキュベートし、引き続き７０％エタノール、Ｐｙｒｏｍａｒｋ変性溶液、及びＰｙｒｏｍａｒｋ洗浄バッファーで洗浄した。変性させたＰＣＲ生成物を、次いで、０．３μＭシークエンシングプライマーを用いてシークエンシングした。パイログラムを可視化し、配列の質に対して評価し、個々のＣｐＧ部位のメチル化パーセントを、ＰｙｒｏＭａｒｋソフトウエアバージョン２．０．４（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて決定した。
バイサルファイト特異的ＰＣＲ（ＢＳＰ）プライマーを、Ｍｅｔｈｙｌ Ｐｒｉｍｅｒ Ｅｘｐｒｅｓｓソフトウエアｖ １．０（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）又はＰｙｒｏＭａｒｋ Ａｓｓａｙ Ｄｅｓｉｇｎソフトウエアｖ ２．０（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてデザインした。ＰＣＲ生成物のストレプトアビジンセファロースビーズに対する結合を促進するために、フォワード又はリバースいずれかのプライマー上に５’ビオチン標識を有するＰＣＲプライマーを合成した。ＰｙｒｏＭａｒｋ Ａｓｓａｙ Ｄｅｓｉｇｎソフトウエアｖ ２．０（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、５’−ビオチン標識したＰＣＲプライマーのリバース方向の、シークエンシングプライマーをデザインした。プライマー配列は要請に応じて入手できる。バイサルファイト修飾したＤＮＡ１μｌを、２５μ反応液中、Ｐｌａｔｉｎｕｍ ＰＣＲ Ｓｕｐｅｒｍｉｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて増幅し、ＰＣＲ生成物２０μｌを、Ｐｙｒｏｍａｒｋ Ｑ２４（Ｑｉａｇｅｎ）上でシークエンシングするのに用いた。ＰＣＲ生成物をストレプトアビジンセファロースビーズと１０分間インキュベートし、引き続き７０％エタノール、Ｐｙｒｏｍａｒｋ変性溶液、及びＰｙｒｏｍａｒｋ洗浄バッファーで洗浄した。変性させたＰＣＲ生成物を、次いで、０．３μＭシークエンシングプライマーを用いてシークエンシングした。パイログラムを可視化し、配列の質に対して評価し、個々のＣｐＧ部位のメチル化パーセントを、ＰｙｒｏＭａｒｋソフトウエアバージョン２．０．４（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて決定した。
定量的メチル化特異的ＰＣＲ
Ｉｎｆｉｎｉｕｍプロファイリングによって同定されるＤＭＲを標的とする、定量的メチル化特異的ＰＣＲ（ｑＭＳＰ）アッセイをデザインした。亜硫酸水素ナトリウム変換したＤＮＡを、ＴａｑＭａｎ（登録商標）Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ，Ｎｏ ＡｍｐＥｒａｓｅ（登録商標）ＵＮＧ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、９５℃１０分間、次いで９５℃１５秒間及び６０℃１分間を５０サイクルのサイクル条件で、様々な２０×Ｃｕｓｔｏｍ Ｔａｑｍａｎ Ａｓｓａｙｓで増幅した。７９００ＨＴ上で増幅を行い、ＳＤＳソフトウエア（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて分析した。ＤＮＡ含量を、ｍｅＲＮａｓｅＰ Ｔａｑｍａｎアッセイを用いて標準化した。ＦＦＰＥ材料のｑＭＳＰを、予備増幅手順を用いて行った。
Ｉｎｆｉｎｉｕｍプロファイリングによって同定されるＤＭＲを標的とする、定量的メチル化特異的ＰＣＲ（ｑＭＳＰ）アッセイをデザインした。亜硫酸水素ナトリウム変換したＤＮＡを、ＴａｑＭａｎ（登録商標）Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ，Ｎｏ ＡｍｐＥｒａｓｅ（登録商標）ＵＮＧ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、９５℃１０分間、次いで９５℃１５秒間及び６０℃１分間を５０サイクルのサイクル条件で、様々な２０×Ｃｕｓｔｏｍ Ｔａｑｍａｎ Ａｓｓａｙｓで増幅した。７９００ＨＴ上で増幅を行い、ＳＤＳソフトウエア（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて分析した。ＤＮＡ含量を、ｍｅＲＮａｓｅＰ Ｔａｑｍａｎアッセイを用いて標準化した。ＦＦＰＥ材料のｑＭＳＰを、予備増幅手順を用いて行った。
ＦＦＰＥ腫瘍材料の予備増幅
ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織から抽出した、ピコグラム量のＤＮＡをメチル化分析するための予備増幅法を、以下の通り開発した。バイサルファイト変換したＤＮＡ２μｌ（１００ｐｇ〜１ｎｇに等しい）を最初に、０．１×ｑＭＳＰプライマー−プローブ濃度の反応液２０μｌ中、ＴａｑＭａｎ（登録商標）Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ，Ｎｏ ＡｍｐＥｒａｓｅ（登録商標）ＵＮＧ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号４３２４０１８）を用いて、９５℃１０分間、次いで９５℃１５秒間及び６０℃１分間を１４サイクルのサイクル条件で増幅した。予備増幅した材料１μｌを、次いで、９５℃１０分間、次いで９５℃１５秒間及び６０℃１分間を５０サイクルのサイクル条件で第２のＰＣＲ反応において増幅した。ＤＮＡ含量を、基準のｍｅＲＮａｓｅＰ Ｔａｑｍａｎアッセイでの予備増幅を用いて確認し、ｍｅＲＮａｓｅＰに対してポジティブであった試料のみを、ｑＭＳＰ反応のさらなる分析に含めた。反応は全て２回ずつ行った。
ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織から抽出した、ピコグラム量のＤＮＡをメチル化分析するための予備増幅法を、以下の通り開発した。バイサルファイト変換したＤＮＡ２μｌ（１００ｐｇ〜１ｎｇに等しい）を最初に、０．１×ｑＭＳＰプライマー−プローブ濃度の反応液２０μｌ中、ＴａｑＭａｎ（登録商標）Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ，Ｎｏ ＡｍｐＥｒａｓｅ（登録商標）ＵＮＧ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号４３２４０１８）を用いて、９５℃１０分間、次いで９５℃１５秒間及び６０℃１分間を１４サイクルのサイクル条件で増幅した。予備増幅した材料１μｌを、次いで、９５℃１０分間、次いで９５℃１５秒間及び６０℃１分間を５０サイクルのサイクル条件で第２のＰＣＲ反応において増幅した。ＤＮＡ含量を、基準のｍｅＲＮａｓｅＰ Ｔａｑｍａｎアッセイでの予備増幅を用いて確認し、ｍｅＲＮａｓｅＰに対してポジティブであった試料のみを、ｑＭＳＰ反応のさらなる分析に含めた。反応は全て２回ずつ行った。
上皮様及び間葉様の発現シグネチャーはインビトロのエルロチニブの感受性に相関する
ＮＳＣＬＣ細胞株のエルロチニブに対するインビトロの感受性に相関する遺伝子発現シグネチャーは、以前に規定された（１１）。この遺伝子セットは、ＥＭＴに関与する遺伝子に対して高度に濃縮されたものである。Ｆｌｕｉｄｉｇｍナノ流体プラットホーム（ｎａｎｏｆｌｕｉｄｉｃ ｐｌａｔｆｏｒｍ）上、定量的逆転写酵素ＰＣＲベースのＥＭＴ発現パネル（図１）を開発した。Ｙａｕｃｈら（１１）の試験からの１００プローブのセットと、Ｙａｕｃｈらの試験においてプロファイリングされた４２の系統に対する２０遺伝子のＥＭＴ Ｆｌｕｉｄｉｇｍパネルとを比較することで、この２０遺伝子の発現パネルはＥＭＴの代表的な分類指標であることが示された（参考文献１１）。
ＮＳＣＬＣ細胞株のエルロチニブに対するインビトロの感受性に相関する遺伝子発現シグネチャーは、以前に規定された（１１）。この遺伝子セットは、ＥＭＴに関与する遺伝子に対して高度に濃縮されたものである。Ｆｌｕｉｄｉｇｍナノ流体プラットホーム（ｎａｎｏｆｌｕｉｄｉｃ ｐｌａｔｆｏｒｍ）上、定量的逆転写酵素ＰＣＲベースのＥＭＴ発現パネル（図１）を開発した。Ｙａｕｃｈら（１１）の試験からの１００プローブのセットと、Ｙａｕｃｈらの試験においてプロファイリングされた４２の系統に対する２０遺伝子のＥＭＴ Ｆｌｕｉｄｉｇｍパネルとを比較することで、この２０遺伝子の発現パネルはＥＭＴの代表的な分類指標であることが示された（参考文献１１）。
２０遺伝子のパネルが、ＥＭＴに関連する表現型の変化を代表するか否かをさらに評価するために、２つの細胞株をＴＧＦβ１で処理した。この試験の結果は、ＴＧＢβ１はＥＭＴに関連する形態学的な変化を誘導することを示していた。これらの細胞株において、上皮表現型に関連する遺伝子は下方制御され、間葉表現型に関連する遺伝子は上方制御された。
ＤＮＡメチル化プロファイリングを用いてＮＳＣＬＣ細胞株を上皮様及び間葉様のグループに分類することができるか否かを決定するために、２０遺伝子の発現パネルを用いて、上皮様対間葉様の状態を８２の細胞株に割り当てた。この試験で用いたＮＳＣＬＣ細胞株には、Ｙａｕｃｈら（１１）の試験においてプロファイリングされた殆どの系統、及びＥＧＦＲ変異を有する６系統を含むさらなる５２系統が含まれていた。８２の細胞株のうち、これらマーカーの発現に基づき、３６が上皮様と分類され、３４が間葉様と分類された（図２）。発現データを標準化し、中央値を真ん中に配置した（試料及び遺伝子）。緑色は、指摘した遺伝子に対するｍＲＮＡ発現が低レベルであるか、又はないことを示し、赤色は高発現を示す。１２系統（図２の下部のクラスタにおいて示す）を上皮様と分類したが、上皮及び間葉のマーカーの組合せを発現しており、これらの系統は中間と呼ぶ別個の生物学を表すことが指摘される。このように、８２のＮＳＣＬＣ系統のうち、８９％を、上皮又は間葉と明白に分類することができた。概ね、別個のＤＮＡメチル化プロファイルにつながり得る、おそらく別個の根源的な生物学を反映して、この上皮様対間葉様の発現の表現型は相互に排他的である。組織学を含めた細胞株の記載のまとめを、図８Ａ〜Ｂに示す。
ゲノムワイドのメチル化プロファイルは、ＮＳＣＬＣ細胞株におけるＦｌｕｉｄｉｇｍベースのＥＭＴシグネチャーに相関する
Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｉｎｆｉｎｉｕｍ ４５０Ｋアレイを、５２のプローブに対するβ値、及びサブセットの細胞株に対する（Ｎ＝１２）亜硫酸水素ナトリウムシークエンシングデータを比較することにより、ハイスループットのメチル化プロファイリングに対するプラットホームとして分析した。Ｉｎｆｉｎｉｕｍアレイ及びバイサルファイトの直接シークエンシングにより、高度に有意で、強力にポジティブな、メチル化細胞間の相関が観察された（ｒ＝０．９２６）。
Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｉｎｆｉｎｉｕｍ ４５０Ｋアレイを、５２のプローブに対するβ値、及びサブセットの細胞株に対する（Ｎ＝１２）亜硫酸水素ナトリウムシークエンシングデータを比較することにより、ハイスループットのメチル化プロファイリングに対するプラットホームとして分析した。Ｉｎｆｉｎｉｕｍアレイ及びバイサルファイトの直接シークエンシングにより、高度に有意で、強力にポジティブな、メチル化細胞間の相関が観察された（ｒ＝０．９２６）。
上皮様と間葉様との細胞株の間を区別するＤＭＲを同定するために、メチル化ベースの分類指標を同時に構築した交差検証の戦略を用い、実施例１に記載した通り、その予測正確性を評価した。６９の細胞株のトレーニングセットに適用した場合、この分析により、上皮様対間葉様のＮＳＣＬＣ細胞株を規定するとして選択された個々の９１５のＣｐＧ部位を代表する５４９のＤＭＲがもたらされ、誤り発見率により調節されたＰ値は交差検証相互作用１００％中０．０１未満であった。交差検証から推定されるメチル化ベースの分類指標の正確さは８８．０％であった（±２．４％、９５％信頼区間）。
次に、本発明者らのメチル化ベースのＥＭＴ分類指標に含まれるＣｐＧ部位を用いて、ＮＳＣＬＣ細胞株（ＥＧＦＲ変異体、エルロチニブ感受性６系統を含む）６９、及び初期の正常な肺細胞２系統、ならびにこれらを固定化した対応物をクラスタ化した。この分析により、上皮様、間葉様、及び正常な系統の顕著な隔たりが明らかになった（図３）。このアッセイにおいて、７２のＮＳＣＬＣ細胞株及び正常肺上皮細胞を、Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｉｎｆｉｎｉｕｍ ４５０Ｋメチル化アレイプラットホームを用いてプロファイリングした。監視下の階層的クラスタ分析（Ｓｕｐｅｒｖｉｓｅｄ ｈｉｅｒａｒｃｈｉｃａｌ ｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇ）を、上皮様と間葉様との細胞株の間で著しく差示的にメチル化された９１５のプローブを用いて行った（誤り発見率＝０．０１、実施例１）。クラスタ分析に用いた、アノテーションを付けたプローブのセットを列挙する。各横列はＩｎｆｉｎｉｕｍ ４５０Ｋアレイ上の個々のプローブを表し、各コラムは細胞株を表す。ヒートマップ中影付き青色の領域は非メチル化領域を表し、影付き赤色の領域はメチル化領域を表す。上部の色つきバーは、Ｆｌｕｉｄｉｇｍ ＥＭＴ遺伝子発現分析によって決定した各細胞株の、上皮様又は間葉様の状態を表すコラムを示す。緑色は上皮様細胞株を示し、黒色は間葉様細胞株を示す。下部の色つきバーは、エルロチニブが各細胞株の表現型に応答することを示す。赤色はエルロチニブ感受性系統を示し、黒色はエルロチニブ抵抗性系統を示し、灰色はエルロチニブに対して中間の感受性を有する系統を示す。センタリングをせずにクラスタ化するためにＥｕｃｌｉｄｉａｎ距離測定を用い、色のスキームは絶対的なメチル化の違いを表す。
注目すべきことに、これらＣｐＧ部位からのメチル化シグナルにより、上皮様及び間葉様の細胞株は各自それぞれ上皮様及び間葉様のグループにクラスタ化され、例外は６個だけであり、間葉様系統Ｈ１４３５、ＨＣＣ４０１７、Ｈ６４７、Ｈ２２２８、Ｈ１７５５、及びＨＣＣ１５は上皮様のグループとともにクラスタ化された。興味深いことに、ＥＭＴ遺伝子発現分析により、これら６系統のうち５系統が密接に一緒にクラスタ化されて間葉様系統の別個のサブセットとなり、この遺伝子発現の表現型は幾分別個の根源的なメチル化シグネチャーに関連することが示唆された。重要なのは、間葉様表現型は、上皮様表現型よりも高い比率の過剰メチル化部位を抱え持つことである。これは、メチル化における変化は、ＮＳＣＬＣにおけるＥＭＴの間に獲得された表現型の変更を安定化するのに必要とされ得ることを示唆している。
ＥＧＦＲ変異ＮＳＣＬＣは、末梢の肺において高分化型の腺癌として存在するのが典型的である。これらの上皮様発現の表現型及びこれらの特徴的な組織学に基づき、ＥＧＦＲ変異細胞株は、間葉様系統よりも上皮様系統に類似の挙動を示す。エルロチニブに対するインビトロの感受性に基づいた細胞株の隔たりのパターンが注目された（図３、中央、感受性によって示される）。ほぼ全てのエルロチニブ感受性の系統は上皮様表現型に関連し、ほぼ全ての間葉様系統はエルロチニブに対して抵抗性であった。しかし、全ての上皮様系統がエルロチニブに対して感受性だったわけではない。エルロチニブ抵抗性の１０系統が上皮様系統とともにクラスタ化され、Ｈ８３８、Ｈ２０３０、ＲＥＲＦ−ＬＣ−ＭＳ、及びＳＫ−ＭＥＳ−１の４つのエルロチニブ感受性系統が、間葉様系統とともにクラスタ化された。顕著なことに、本発明者らが以前に規定したＥＭＴ発現シグネチャー（１１）を用いた遺伝子発現によってクラスタ化した場合、Ｈ８３８及びＳＫ−ＭＥＳ−１が、エルロチニブ感受性の点で、外れ値としての挙動を示した。エルロチニブ感受性に関して他の外れ値の中には、これらの見かけの抵抗性を説明する変異を有するものもあった。例えば、上皮様系統であるＨ１９７５はＥＧＦＲにおけるＴ７９０Ｍ変異を抱え持ち、Ｈ１９９３はＭＥＴ増幅を抱え持つ。これらの遺伝子変化は、エルロチニブに対して特異的に抵抗性を与え、観察されるエピジェネティックなシグネチャーは、エルロチニブ感受性そのものよりもむしろ細胞株の生物学的状態を代行することを示唆している。
選択されたＤＭＲの亜硫酸水素ナトリウムシークエンシングによりＩｎｆｉｎｉｕｍメチル化プロファイリングが確証される
Ｉｎｆｉｎｉｕｍにより遺伝子と空間的に関連すると同定された１７のＤＭＲ（５’ＣｐＧアイランド又は遺伝子内）を（図４）、亜硫酸水素ナトリウム変換したＤＮＡのクローニングしたフラグメントを直接シークエンシングすることによって、これらのメチル化状態に対して検討した。上皮様５系統、間葉様４系統、及び中間１系統を、シークエンシングの確証に選択した。１０遺伝子座に対して１細胞株あたりおよそ１０のクローンをバイサルファイトシークエンシングすることで、ほぼ全てのこれらのマーカーが、間葉様細胞少なくとも４系統、及び中間系統Ｈ５２２において、殆ど完全にメチル化されていたことが明らかになった。これとは対照的に、これらの遺伝子座は、上皮様５系統全てにおいて、完全に非メチル化であった。間葉様系統においてメチル化されていた１０のマーカーのうち、ＥＳＲＰ１及びＣＰ２Ｌ３／ＧＲＨＬ２、ｍｉＲ２００Ｃ、及びＭＳＴ１Ｒ／ＲＯＮの４つが上皮の分化に関与する（２、２７、２８）。ＥＳＲＰ１は、間葉細胞において下方制御されている代替的スプライシングの上皮特異的な調節因子であり、ＣＰ２Ｌ３／ＧＲＨＬ２は、頂端接合部（ａｐｉｃａｌ ｊｕｎｃｔｉｏｎａｌ）複合体の転写調節因子であり（２７、２８）、ｍｉＲ２００ＣはＥＭＴ誘導因子ＺＥＢ１の負の調節因子である（２９）。ＥＳＲＰ１及びＧＲＨＬ２の発現は、全上皮様系統に比べてより大きなパネルの間葉様系統において下方制御され、間葉細胞におけるＥＳＲＰタンパク質の知られている非存在、及びこれらのタンパク質がＥＭＴの間にスプライシングを切り換える上皮の転写物を制御する能力と一致していた。パイロシークエンシング分析により、ＧＲＨＬ２は、上皮様系統に比べて間葉様系統の幅広いパネルにおいてやはり過剰メチル化されていたことも指摘された。
Ｉｎｆｉｎｉｕｍにより遺伝子と空間的に関連すると同定された１７のＤＭＲ（５’ＣｐＧアイランド又は遺伝子内）を（図４）、亜硫酸水素ナトリウム変換したＤＮＡのクローニングしたフラグメントを直接シークエンシングすることによって、これらのメチル化状態に対して検討した。上皮様５系統、間葉様４系統、及び中間１系統を、シークエンシングの確証に選択した。１０遺伝子座に対して１細胞株あたりおよそ１０のクローンをバイサルファイトシークエンシングすることで、ほぼ全てのこれらのマーカーが、間葉様細胞少なくとも４系統、及び中間系統Ｈ５２２において、殆ど完全にメチル化されていたことが明らかになった。これとは対照的に、これらの遺伝子座は、上皮様５系統全てにおいて、完全に非メチル化であった。間葉様系統においてメチル化されていた１０のマーカーのうち、ＥＳＲＰ１及びＣＰ２Ｌ３／ＧＲＨＬ２、ｍｉＲ２００Ｃ、及びＭＳＴ１Ｒ／ＲＯＮの４つが上皮の分化に関与する（２、２７、２８）。ＥＳＲＰ１は、間葉細胞において下方制御されている代替的スプライシングの上皮特異的な調節因子であり、ＣＰ２Ｌ３／ＧＲＨＬ２は、頂端接合部（ａｐｉｃａｌ ｊｕｎｃｔｉｏｎａｌ）複合体の転写調節因子であり（２７、２８）、ｍｉＲ２００ＣはＥＭＴ誘導因子ＺＥＢ１の負の調節因子である（２９）。ＥＳＲＰ１及びＧＲＨＬ２の発現は、全上皮様系統に比べてより大きなパネルの間葉様系統において下方制御され、間葉細胞におけるＥＳＲＰタンパク質の知られている非存在、及びこれらのタンパク質がＥＭＴの間にスプライシングを切り換える上皮の転写物を制御する能力と一致していた。パイロシークエンシング分析により、ＧＲＨＬ２は、上皮様系統に比べて間葉様系統の幅広いパネルにおいてやはり過剰メチル化されていたことも指摘された。
ＤＭＲの生物学的妥当性
選択されたＤＭＲに関連する遺伝子の発現を調節する上でのメチル化の役割を評価するために、定量的ＰＣＲを、１パネルの３４の、５−アザ−２’−デオキシシチジン（５−アザ−ｄＣ）及びジメチルスルホキシド処理したＮＳＣＬＣ細胞株において行った。全てのＤＭＲが、５−アザ−ｄＣ処理後の明らかな遺伝子発現の変化に関連していたわけではなかったが、間葉様対上皮様の系統においてＧＲＨＬ２、ＥＳＲＰ１、及びＣＬＤＮ７転写物の著しい誘導が注目された。このグループの遺伝子からＣＬＤＮ７をＥＭＴの代表的なマーカーとして選択し、そのメチル化状態を、拡張されたパネルの４２細胞株においてパイロシークエンシングによって定量した。ほぼ全ての間葉様系統のＣＬＤＮ７プロモーター領域がメチル化され、５−アザ−ｄＣ処理に応答して、ＣＬＤＮ７発現の劇的な誘導（＞１０倍）を表した（図５Ａ及びＢ）。これとは対照的に、ＣＬＤＮ７は、上皮様細胞株の大多数において発現され、５−アザ−ｄＣ処理によってさらに誘導されなかった。これらのデータは、ＮＳＣＬＣ細胞株における上皮様及び間葉様の状態と関連する遺伝子のサブセットにおける、遺伝子座特異的なＤＮＡの過剰メチル化と転写サイレンシングとの間の直接的な連結を示している。
選択されたＤＭＲに関連する遺伝子の発現を調節する上でのメチル化の役割を評価するために、定量的ＰＣＲを、１パネルの３４の、５−アザ−２’−デオキシシチジン（５−アザ−ｄＣ）及びジメチルスルホキシド処理したＮＳＣＬＣ細胞株において行った。全てのＤＭＲが、５−アザ−ｄＣ処理後の明らかな遺伝子発現の変化に関連していたわけではなかったが、間葉様対上皮様の系統においてＧＲＨＬ２、ＥＳＲＰ１、及びＣＬＤＮ７転写物の著しい誘導が注目された。このグループの遺伝子からＣＬＤＮ７をＥＭＴの代表的なマーカーとして選択し、そのメチル化状態を、拡張されたパネルの４２細胞株においてパイロシークエンシングによって定量した。ほぼ全ての間葉様系統のＣＬＤＮ７プロモーター領域がメチル化され、５−アザ−ｄＣ処理に応答して、ＣＬＤＮ７発現の劇的な誘導（＞１０倍）を表した（図５Ａ及びＢ）。これとは対照的に、ＣＬＤＮ７は、上皮様細胞株の大多数において発現され、５−アザ−ｄＣ処理によってさらに誘導されなかった。これらのデータは、ＮＳＣＬＣ細胞株における上皮様及び間葉様の状態と関連する遺伝子のサブセットにおける、遺伝子座特異的なＤＮＡの過剰メチル化と転写サイレンシングとの間の直接的な連結を示している。
図５Ａにおいて、定量的メチル化を、７個のＣｐＧ部位でＰｙｒｏＭａｒｋ分析ソフトウエアによって、等式：メチル化％＝（Ｃピーク高さ×１００／Ｃピーク高さ＋Ｔピーク高さ）を用いて決定した。データを、７つのＣｐＧ部位のメチル化パーセント値の平均値±ＳＤとして表す。図５Ｂにおいて、ＣＬＤＮ７ ｍＲＮＡの相対的発現を、４２の（上皮様ｎ＝２０、間葉様１９、中間３）ＤＭＳＯ処理し、５−アザ−ｄＣ処理したＮＳＣＬＣ細胞株において、標準のΔＣｔ法を用いて決定した。発現値を、ＤＭＳＯ処理した対照細胞に比べた５−アザ−ｄＣ処理における変化の倍数（ｆｏｌｄ ｃｈａｎｇｅ）として計算した。データは、ハウスキーピング遺伝子ＧＡＰＤＨに対して標準化し、繰返し２回の平均値として表したものである。ＤＭＳＯ、ジメチルスルホキシド；ＧＡＰＤＨ、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ。
定量的ＭＳＰによりＮＳＣＬＣ細胞株は上皮及び間葉のサブタイプに分類され、エルロチニブの感受性が予測される
直接シークエンシング分析により１７のマーカーのメチル化状態を独立に検証した後、７０のＮＳＣＬＣ細胞株を分析して、これらのマーカーが上皮様表現型及び間葉様表現型を正確に分類することができるか否かを決定した。亜硫酸水素ナトリウムシークエンシング分析に基づいて、上皮様系統を間葉様系統と最もよく区別するメチル化領域を選択し、定量的メチル化特異的ＰＣＲ（ｑＭＳＰ）アッセイをＴａｑＭａｎ技術に基づいてデザインした。ｑＭＳＰは、癌を有する患者から得た検体における腫瘍特異的プロモーターの過剰メチル化の検出における使用があることが示されていたため、ｑＭＳＰをアッセイプラットホームとして用いた。この方法は、高度に感受性であり、メチル化されたアレルの定量に特異的であり、ハイスループットのフォーマットに容易に適用でき、そのため臨床応用に適している（３０〜３３）。ＴａｑＭａｎ技術は、プライマーとして働かない蛍光プローブによって授けられるアッセイの特異性が増大するため、ＭＳＰ用のＳＹＢＲベースのデザインより優れている。試料をＤＮＡの入力に対して標準化するために、そのメチル化状態とは無関係の入力ＤＮＡを増幅するように、バイサルファイト修飾したＲＮａｓｅＰ基準アッセイをデザインした。対照のメチル化ＤＮＡ、末梢血単球に由来するＤＮＡ（Ｎ＝２０）、及び各ＤＭＲに対してメチル化状態が既知である細胞株からのＤＮＡを用いて、滴定曲線を行った。注目すべきことに、開発したほぼ全てのアッセイが、メチル化の有無に対して本質的に二要素の出力をもたらし、このためカットオフ点を規定する必要性が不要になる。
直接シークエンシング分析により１７のマーカーのメチル化状態を独立に検証した後、７０のＮＳＣＬＣ細胞株を分析して、これらのマーカーが上皮様表現型及び間葉様表現型を正確に分類することができるか否かを決定した。亜硫酸水素ナトリウムシークエンシング分析に基づいて、上皮様系統を間葉様系統と最もよく区別するメチル化領域を選択し、定量的メチル化特異的ＰＣＲ（ｑＭＳＰ）アッセイをＴａｑＭａｎ技術に基づいてデザインした。ｑＭＳＰは、癌を有する患者から得た検体における腫瘍特異的プロモーターの過剰メチル化の検出における使用があることが示されていたため、ｑＭＳＰをアッセイプラットホームとして用いた。この方法は、高度に感受性であり、メチル化されたアレルの定量に特異的であり、ハイスループットのフォーマットに容易に適用でき、そのため臨床応用に適している（３０〜３３）。ＴａｑＭａｎ技術は、プライマーとして働かない蛍光プローブによって授けられるアッセイの特異性が増大するため、ＭＳＰ用のＳＹＢＲベースのデザインより優れている。試料をＤＮＡの入力に対して標準化するために、そのメチル化状態とは無関係の入力ＤＮＡを増幅するように、バイサルファイト修飾したＲＮａｓｅＰ基準アッセイをデザインした。対照のメチル化ＤＮＡ、末梢血単球に由来するＤＮＡ（Ｎ＝２０）、及び各ＤＭＲに対してメチル化状態が既知である細胞株からのＤＮＡを用いて、滴定曲線を行った。注目すべきことに、開発したほぼ全てのアッセイが、メチル化の有無に対して本質的に二要素の出力をもたらし、このためカットオフ点を規定する必要性が不要になる。
ＲＯＮ／ＭＳＴ１Ｒ（Ｍ）、ＳＴＸ２（Ｍ）、ＨＯＸＣ５（Ｍ）、ＰＥＸ５Ｌ（Ｅ）、ＦＡＭ１１０Ａ（Ｍ）、ＺＥＢ２（Ｅ）、ＥＳＲＰ１（Ｍ）、ＢＣＡＲ３（Ｅ）、ＣＬＤＮ７（Ｍ）、ＰＣＤＨ８（Ｅ）、ＮＫＸ６．２（Ｍ）、ＭＥ３（Ｅ）、及びＧＲＨＬ２（Ｍ）を含めた上皮（Ｅ）又は間葉（Ｍ）の状態の候補のマーカー１３個を試験して、これらがＥＭＴ遺伝子発現の分類に基づいて、上皮様の細胞株を間葉様の細胞株と区別したか否かを決定した。１３のマーカーのうち１０が、Ｐ＜０．０５のカットオフ値を用いて、上皮様又は間葉様の状態と有意に関連していた（図６）。このアッセイにおいて、ｑＭＳＰアッセイを用いて、上皮様（ｎ＝３６）及び間葉様（ｎ＝３４）のＮＳＣＬＣ細胞株におけるメチル化を決定した。入力ＤＮＡ全体を、バイサルファイト特異的ＲＮａｓｅ Ｐ ＴａｑＭａｎプローブを用いて標準化した。図６において、メチル化レベルを、ｙ軸上、各試料に対して−ΔＣｔとしてプロットする（示した標的遺伝子−ＲＮａｓｅＰ）。−ΔＣｔ値が増大すればメチル化が増大することを示す。細胞株を、ｘ軸上、上皮様／間葉様の状態によってグループ分けした。両側の対応のないスチューデントのｔ検定を用いてＰ値を決定した。（Ｂ）ＲＯＮ、（Ｄ）ＦＡＭ１１０Ａ、（Ｆ）ＧＲＨＬ２、及び（Ｈ）ＥＳＲＰ１に対する受信者動作特性（ＲＯＣ）プロットを示す。Ｐ値を、ウィルコクソン順位和検定を用いて決定した。
これら同じマーカーを試験して、これらがインビトロでエルロチニブ感受性を予測するか否かを決定した。ＤＭＲ１３個のうち７個が、エルロチニブ抵抗性を強力に予測し（個々のＰ＜０．００５；図７）、ＤＭＲ１３個のうちＰＥＸ５Ｌ、ＭＥ３、及びＺＥＢ２の３個が、上皮表現型と有意に関連したが、エルロチニブ感受性を統計的に予測するものではなかった。このアッセイにおいて、示したｑＭＳＰアッセイを用いて、５８のＮＳＣＬＣ細胞株のＤＮＡ試料のｑＭＳＰ増幅を行った。Ｒ統計的ソフトウエアを用いて、エルロチニブ感受性対エルロチニブ抵抗性の細胞株に対してＲＯＣ曲線を生成した。Ｐ値を、スチューデントのｔ検定を用いて決定した。図７Ａ〜Ｍ及び図８Ａ〜Ｂ。
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出典明示による援用
全ての特許、公開された特許出願、及び本明細書に開示する他の参考文献は、これにより、出典明示によって本明細書に特に援用される。
全ての特許、公開された特許出願、及び本明細書に開示する他の参考文献は、これにより、出典明示によって本明細書に特に援用される。
均等物
当業者であれば、ルーチンの実験を用いる程度で、本明細書に特に記載する本発明の特定の実施態様の多くの均等物を認識し、又は確認することができる。このような均等物は、以下の特許請求の範囲の範囲に包含されるものとされる。本明細書で用いられる「含む」との語は非限定的であり、さらなる要素を含むことを限定せずに特定の要素を含むものである。
当業者であれば、ルーチンの実験を用いる程度で、本明細書に特に記載する本発明の特定の実施態様の多くの均等物を認識し、又は確認することができる。このような均等物は、以下の特許請求の範囲の範囲に包含されるものとされる。本明細書で用いられる「含む」との語は非限定的であり、さらなる要素を含むことを限定せずに特定の要素を含むものである。
Claims (12)
- 腫瘍細胞が間葉表現型を有するか否かを決定する方法であって、ＣＬＤＮ７、ＨＯＸＣ４、Ｐ２Ｌ３、ＴＢＣＤ、ＥＳＰＲ１、ＧＲＨＬ２、ＥＲＢＢ２、及びＣ２０ｏｒｆ５５からなる群から選択される少なくとも一つの遺伝子中のＣｐＧ部位におけるＤＮＡメチル化の有無を検出することを含み、ＣｐＧ部位にメチル化が存在することが、腫瘍細胞が間葉表現型を有することを示す、方法。
- ＥＧＦＲキナーゼ阻害薬による阻害に対する腫瘍増殖の感受性を決定する方法であって、試料の腫瘍細胞におけるＣＬＤＮ７、ＨＯＸＣ４、Ｐ２Ｌ３、ＴＢＣＤ、ＥＳＰＲ１、ＧＲＨＬ２、ＥＲＢＢ２、及びＣ２０ｏｒｆ５５からなる群から選択される少なくとも一つの遺伝子中のＣｐＧ部位におけるＤＮＡメチル化の有無を検出することを含み、ＣｐＧ部位にメチル化が存在することが、腫瘍増殖がＥＧＦＲ阻害薬での阻害に対して抵抗性であることを示す、方法。
- ＥＧＦＲ阻害薬での処置が有益である可能性が高い癌患者を同定する方法であって、患者の癌からの試料におけるＣＬＤＮ７、ＨＯＸＣ４、Ｐ２Ｌ３、ＴＢＣＤ、ＥＳＰＲ１、ＧＲＨＬ２、ＥＲＢＢ２、及びＣ２０ｏｒｆ５５からなる群から選択される少なくとも一つの遺伝子中のＣｐＧ部位におけるＤＮＡメチル化の有無を検出することを含み、ＣｐＧ部位にＤＮＡメチル化の非存在が検出される場合、患者はＥＧＦＲ阻害薬での処置が有益である可能性が高いと同定される、方法。
- 患者がＥＧＦＲ阻害薬での処置が有益である可能性が高いと同定される場合、患者に治療有効量のＥＧＦＲ阻害薬を投与することをさらに含む、請求項３に記載の方法。
- 患者における癌を処置する方法であって、患者に治療有効量のＥＧＦＲ阻害薬を投与することを含み、患者が、ＥＧＦＲ阻害薬の投与前、ＣＬＤＮ７、ＨＯＸＣ４、Ｐ２Ｌ３、ＴＢＣＤ、ＥＳＰＲ１、ＧＲＨＬ２、ＥＲＢＢ２、及びＣ２０ｏｒｆ５５からなる群から選択される少なくとも一つの遺伝子中のＣｐＧ部位におけるＤＮＡメチル化の非存在を表す癌と診断されている、方法。
- ＥＧＦＲ阻害薬が、エルロチニブ、セツキシマブ、又はパニツムマブである、請求項２ないし５のいずれか一項に記載の方法。
- 腫瘍細胞が上皮の細胞型を有するか否かを決定する方法であって、ＰＣＤＨ８、ＰＥＸ５Ｌ、ＧＡＬＲ１、及びＺＥＢ２からなる群から選択される少なくとも一つの遺伝子中のＣｐＧ部位におけるＤＮＡメチル化の有無を検出することを含み、ＣｐＧ部位にＤＮＡメチル化が存在することが、腫瘍細胞が上皮表現型を有することを示す、方法。
- メチル化の有無がパイロシークエンシングによって検出される、請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。
- ＤＮＡが、ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織から、又は新鮮凍結組織から単離される、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
- 組織試料から単離されたＤＮＡがパイロシークエンシング前に予備増幅される、請求項９に記載の方法。
- 腫瘍細胞がＮＳＣＬＣ細胞である、請求項１又は２に記載の方法。
- 癌がＮＳＣＬＣである、請求項３から５のいずれか一項に記載の方法。
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