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JP2014522851A - チロシンライゲーションの方法 - Google Patents

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Abstract

ｎ個のチロシン単位を含むポリペプチド(またはタンパク質)を含む式(Ｉ−Ａ)または(Ｉ)のコンジュゲートの製造方法が提供され、ここで、ｎは１以上の整数であり、タンパク質またはポリペプチドのアミノ末端(Ａ１)および酸末端(Ａ２)(アミノ末端または酸末端のいずれかは少なくとも１個のチロシン単位であり得る)を有するアミノ酸鎖内に分散しており、１０,０００ダルトン(１０kDa)以上の重量平均分子量を有し、ここで、本コンジュゲートは式(Ｉ−Ａ)または(Ｉ)に記載するとおりｍ個のチロシンコンジュゲート(修飾チロシン残基)を有し、ここで、ｍは少なくとも１であり、ｎ以下である

〔ここで、Ｘ、Ｌｇ、ＬおよびＲはここに定義したとおりである。〕。

Description

発明の分野
本発明は、チロシン含有ポリペプチドコンジュゲートの形成に使用するためのチロシンライゲーションの方法および架橋結合剤に関する。
背景
コンジュゲーションは生物学的に活性なタンパク質、例えばタンパク質／ペプチド治療剤、抗体−薬物コンジュゲート、ワクチン、組織選択的標的化媒体、分子診断剤およびタンパク質核酸コンジュゲートの性質を最適化するために広範に使用されている。古典的コンジュゲーション法はリシンベースの共有結合ライゲーションを利用し、これは表面のリシン豊富化のために同質性(homogenicity)を達成するのが困難である。他の典型的方法はシステインコンジュゲーションに基づく。しかしながら、システインは稀なアミノ酸であり、通常ジスルフィド形態で存在し、遊離システインはおそらくジスルフィドと混ざり得る。
チロシンはより良好な代替的コンジュゲーション部位である。チロシンはリシンより稀であり、その全てが表面に露呈されているわけではない。最近、アリルアルキル化、ジアゾ−カップリングおよびマンニッヒ型カップリングのようなチロシンライゲーションのためのいくつかの方法が報告されている。例えば、J Am Chem Soc, 128, 1080-1081 (2006); J Am Chem Soc, 127, 3718-3723 (2005); およびBioconjugate Chem, 19, 153-157 (2008))参照。
チロシンライゲーションの方法は最近Ban, H., et al. in J Am Chem Soc, 132, 1523-1525 (2010)により報告された。しかしながら、発表されたプロトコル(リン酸緩衝化食塩水(ＰＢＳ)溶液)を使用して得られる主生成物は、リシン位でのウレア形成が最も可能性が高い。該論文中のＬＣ−ＭＳは提唱されているチロシンライゲーションの生成物に一致しない。
概要
出願人は、チロシンライゲーションにおいて、ＰＢＳに替えてＴｒｉｓ緩衝液を使用すると、所望のチロシンライゲーション生成物を短時間で生成することを発見した。
本発明の一つの態様において、ｎ個のチロシン単位を含むポリペプチド(またはタンパク質)を含む式(Ｉ−Ａ)
〔ここで、ｎは１以上の整数であり、タンパク質またはポリペプチドのアミノ末端(Ａ１)および酸末端(Ａ２)(アミノ末端または酸末端のいずれかは少なくとも１個のチロシン単位であり得る)を有するアミノ酸鎖
内に分散しており、１０,０００ダルトン(１０kDa)以上の重量平均分子量を有するものであり；
Ｘは末端活性結合基(Ｌｇ)を有するスペーサーである。〕
のコンジュゲートの製造方法が提供され、
ここで、該方法はｎ個のチロシン単位を含む式(Ｉａ)のタンパク質またはポリペプチドと少なくとも１個の式(Ｉ−Ｉｂ)の４−置換−３Ｈ−１,２,４−トリアゾール−３,５(４Ｈ)−ジオンを、トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン(Ｔｒｉｓ)緩衝液の存在下、約６.０〜約９.０のｐＨで反応させて、ｍ個のコンジュゲートしたチロシン単位を含む式(Ｉ−Ａ)のコンジュゲート(ここで、ｍはｎ以下の整数であり、好ましくは１以上である)を製造する工程を含む。
本発明の他の面において、上記方法により製造した式(Ｉ−Ａ)のコンジュゲートを提供する。
本発明の他の態様において、ｎ個のチロシン単位を含むタンパク質またはポリペプチドを含む式(Ｉ)
〔ここで、ｎは１以上の整数であり、タンパク質またはポリペプチドのアミノ末端(Ａ１)および酸末端(Ａ２)を有するアミノ酸鎖
内に分散しており、１０,０００ダルトン以上の重量平均分子量を有し、ここで、該式(Ｉ)のコンジュゲートはｍ個のチロシンコンジュゲートを含み、ここで、ｍはｎより小さい整数であり(またはある態様において、ｍはｎと等しい整数である)、好ましくは少なくとも１であるものであって；
ＬはスペーサーＸ’(ここに定義)を含むリンカーであり、Ｒは治療剤、放射標識治療剤、蛍光剤、細胞毒性剤、ＤＮＡ、ＲＮＡ、脂質、ハプテンまたはポリマー(例えば、ポリエチレングリコール(ＰＥＧ)(ポリエチレンオキシド(ＰＥＯ)またはポリオキシエチレン(ＰＯＥ)としても知られる)または多糖)である。〕
のコンジュゲートの製造方法が提供され、
ここで、該方法はｎ個のチロシン単位を含む式(Ｉａ)のタンパク質またはポリペプチドと少なくとも１個の式(Ｉｂ)の４−置換−３Ｈ−１,２,４−トリアゾール−３,５(４Ｈ)−ジオンを、トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン(Ｔｒｉｓ)緩衝液の存在下、約６.０〜約９.０のｐＨで反応させて、ｍ個のコンジュゲートしたチロシン単位を含む式(Ｉ)のコンジュゲート(ここで、ｍはｎ以下の整数であり、好ましくは少なくとも１である)を製造する工程を含む。
さらに別の態様において、式(Ｉ)のコンジュゲート(上記)の製造方法が提供され、これは、式(Ｉ−Ａ)のコンジュゲートとＲＬを反応させて、式(Ｉ)のコンジュゲートを形成させる工程を含む
〔ここで、Ｘ、Ｌｇ、Ａ１、Ａ２、ＬおよびＲはここで定義したとおりであり、ＲＬは結合基(Ｌｇ)と反応できる置換基で場合により置換されていてよいＲである。〕。置換基が存在しないとき、Ｒは、結合基(Ｌｇ)と反応できる結合部位を含むと理解される。
本発明の他の面は、ｎ個のチロシン単位を含むポリペプチドを含む式(Ｉ−Ａ)
〔ここで、ｎは１以上の整数であり、タンパク質またはポリペプチドのアミノ末端(Ａ１)および酸末端(Ａ２)を有するアミノ酸鎖
内に分散しており、１０,０００ダルトン以上の重量平均分子量を有するものであり；
Ｘは末端活性結合基(Ｌｇ)を有するスペーサーである。〕
のコンジュゲートを提供し、ここで、該式(Ｉ−Ａ)のコンジュゲートはｎ個のチロシン単位を含む式(Ｉａ)のタンパク質またはポリペプチドと、少なくとも１個の式(Ｉ−Ｉｂ)の４−置換−３Ｈ−１,２,４−トリアゾール−３,５(４Ｈ)−ジオンを、トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン緩衝液の存在下、約６.０〜約９.０のｐＨで反応させて、ｍ個のコンジュゲートしたチロシン単位を含む式(Ｉ−Ａ)のコンジュゲート(ここで、ｍはｎ以下の整数であり、好ましくはｍは少なくとも１である)を製造する工程を含む方法により製造される
本発明のさらに別の面は、ｎ個のチロシン単位を含むポリペプチドを含む式(Ｉ)
〔ここで、ｎは１以上の整数であり、タンパク質またはポリペプチドのアミノ末端(Ａ１)および酸末端(Ａ２)を有するアミノ酸鎖
内に分散しており、１０,０００ダルトン以上の重量平均分子量を有し、ここで、該式(Ｉ)のコンジュゲートはｍ個のチロシンコンジュゲートを含み、ここで、ｍはｎ未満の整数であり、好ましくはｍは少なくとも１であり；
ＬはスペーサーＸ’を含むリンカーであり、Ｒは治療剤、放射標識治療剤、蛍光剤、細胞毒性剤、ＤＮＡ、ＲＮＡ、脂質、ハプテンまたはポリマーである。〕
のコンジュゲートを提供し、ここで、該式(Ｉ)のコンジュゲートは、式(Ｉ−Ａ)のコンジュゲートとＲＬを反応させて、式(Ｉ)のコンジュゲートを製造する工程を含む方法により製造される
〔ここで、Ｘは末端活性結合基(Ｌｇ)を有するスペーサーであり、ＲＬは結合基(Ｌｇ)と反応できる置換基で場合により置換されていてよいＲである；
但し、該ポリペプチドがキモトリプシノーゲンＡ、ミオグロビンまたはウシ血清アルブミンであり、Ｒがローダミン色素であるときまたは該ポリペプチドがハーセプチンであり、Ｒがインテグリン結合環状アルギニン−グリシン−アスパラギン(ＲＧＤ)ペプチドであるとき、Ｘ−Ｌｇは
ではない。〕。時々、該ポリペプチドがキモトリプシノーゲンＡ、ミオグロビンまたはウシ血清アルブミンであり、Ｒがローダミン色素であるときまたは該ポリペプチドがハーセプチンであり、Ｒがインテグリン結合環状アルギニン−グリシン−アスパラギン(ＲＧＤ)ペプチドであるとき、Ｘ−Ｌｇはさらに
ではない。
本発明のさらに別の面は、ｎ個のチロシン単位を含むポリペプチドを含む式(Ｉ−Ａ)のコンジュゲートを提供し、ここで、ｎは１以上の整数であり、タンパク質またはポリペプチドのアミノ末端(Ａ１)および酸末端(Ａ２)を有するアミノ酸鎖
内に分散しており、１０,０００ダルトン以上の重量平均分子量を有するものであり、そして、ｍ個のコンジュゲートしたチロシン残基を含み、ここで、ｍはｎ以下であり、コンジュゲートしたチロシン残基は式
〔ここで、Ｘは末端活性結合基(Ｌｇ)を有するスペーサーである。〕
のものである。あるこのような態様において、ポリペプチは抗原性ポリペプチド、ワクチンにおける使用に適するキャリアペプチドまたは抗体または抗体フラグメントである。好ましい態様において、本コンジュゲートは、Ｌｇ基にコンジュゲートしたリシン残基より多くの修飾されたＬｇ基にコンジュゲートしたチロシン残基を有し、すなわち、Ｌｇ基にコンジュゲートしたリシン残基の数はｔであり、ここで、ｔはｍより小さい。
本発明のさらに別の面は、ｎ個のチロシン単位を含むポリペプチドを含む式(Ｉ)のコンジュゲートを提供し、ここで、ｎは１以上の整数であり、タンパク質またはポリペプチドのアミノ末端(Ａ１)および酸末端(Ａ２)を有するアミノ酸鎖
内に分散しており、１０,０００ダルトン以上の重量平均分子量を有し、ここで、該式(Ｉ)のコンジュゲートはｍ個のチロシンコンジュゲートを含み、ここで、ｍはｎより小さい整数である
〔ここで、ＬはスペーサーＸ’を含むリンカーであり、Ｒは治療剤、放射標識治療剤、蛍光剤、細胞毒性剤、ＤＮＡ、ＲＮＡ、脂質、ハプテンまたはポリマーである。〕。このような態様において、ポリペプチドは抗原性ポリペプチド、ワクチン使用に適するキャリアペプチドまたは抗体または抗体フラグメントである。好ましい態様において、本ポリペプチドは、Ｒ基にコンジュゲートしたリシン残基より多くの修飾されたＲ基にコンジュゲートしたチロシン残基を有する。好ましい態様において、本コンジュゲートは、Ｒ基にコンジュゲートしたリシン残基より多くの修飾されたＬｇ基にコンジュゲートしたチロシン残基を有し、すなわち、Ｒ基にコンジュゲートしたリシン残基の数はｔであり、ここで、ｔはｍより小さい。
本発明のさらに別の面は、式
〔ここで、Ｒ、Ｘ、ＬおよびＬｇはここに定義したとおりである。〕
の少なくとも１個のコンジュゲートしたチロシン残基を含む抗体または抗体フラグメントを含む式(Ｘａ)または(Ｘｂ)のコンジュゲートを提供する。好ましい態様において、本抗体または抗体フラグメントは、修飾リシン残基より多くの修飾チロシン残基を有する。
本発明のさらに他の面は、ｎ個のチロシン単位を含むポリペプチドを含む式(Ｉ)のコンジュゲートを提供し、ここで、ｎは１以上の整数であり、タンパク質またはポリペプチドのアミノ末端(Ａ１)および酸末端(Ａ２)を有するアミノ酸鎖
内に分散しており、１０,０００ダルトン以上の重量平均分子量を有し、ここで、該式(Ｉ)のコンジュゲートはｍ個のチロシンコンジュゲートを含み、ここで、ｍはｎより小さい整数であり、好ましくは１以上である
〔ここで、ＬはスペーサーＸ’を含むリンカーであり、Ｒは治療剤、放射標識治療剤、蛍光剤、細胞毒性剤、ＤＮＡ、ＲＮＡ、脂質、ハプテンまたはポリマーである。〕
ここで、該式(Ｉ)のコンジュゲートは、ｎ個のチロシン単位を含む式(Ｉａ)のタンパク質またはポリペプチドと、少なくとも１個の式(Ｉｂ)の４−置換−３Ｈ−１,２,４−トリアゾール−３,５(４Ｈ)−ジオンを、トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン緩衝液の存在下、約６.０〜約９.０のｐＨで反応させて、ｍ個のコンジュゲートしたチロシン単位を含む式(Ｉ)のコンジュゲート(ここで、ｍはｎ以下の整数である)を製造する工程を含む方法により製造される
〔但し該ポリペプチドがキモトリプシノーゲンＡ、ミオグロビン(myoblobin)またはウシ血清アルブミンであるとき、Ｒはローダミン色素ではなく、そして、該ポリペプチドがハーセプチンであるとき、Ｒはインテグリン結合環状アルギニン−グリシン−アスパラギン(ＲＧＤ)ペプチドではない。〕。
上記のいずれかの態様において、Ｔｒｉｓ緩衝液は、(ｉ)トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン、ホウ酸およびエチレンジアミンテトラ酢酸(ＥＤＴＡ)を含むＴＢＥ緩衝液；(ii)トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン、酢酸およびＥＤＴＡを含むＴＡＥ緩衝液；または(iii)トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタンおよび求核性アミン(例えば、メチルアミンまたはジエチルアミン)のいずれかである。
上記のいずれかの態様において、本ポリペプチドは抗体である。
上記の態様の各々の他の選択肢において、本ポリペプチドは抗原性ペプチドである。
ある態様において、本ペプチドは、免疫応答促進に有用なキャリアタンパク質、例えばCRM197、ＧＢＳ５９またはＧＢＳ８０である。
上記態様の各々の一つの具体的態様において、Ｘは
(ａ) 結合、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＮＨ−、−Ｎ((Ｃ１−Ｃ６)アルキル)−、−ＮＨ−Ｃ(Ｏ)−ＮＨ−、−Ｃ(Ｏ)−ＮＨ−、−ＮＨ−Ｃ(Ｏ)−；
(ｂ) (Ｃ１−Ｃ２０)アルキレン、(Ｃ２−Ｃ２０)アルケニレン、(Ｃ２−Ｃ２０)アルキニレン、−Ｚ−(Ｃ１−Ｃ２０)アルキレン−、−Ｚ−(Ｃ２−Ｃ２０)アルケニレン、−Ｚ−(Ｃ２−Ｃ２０)アルキニレン、(Ｃ１−Ｃ２０)アルキレン−Ｚ−(Ｃ１−Ｃ２０)アルキレン、(Ｃ２−Ｃ２０)アルケニレン−Ｚ−(Ｃ２−Ｃ２０)アルケニレン、(Ｃ２−Ｃ２０)アルキニレン−Ｚ−(Ｃ２−Ｃ２０)アルキニレン(ここで、Ｚは−ＮＨ−、−Ｎ((Ｃ１−Ｃ６)アルキル)−、−ＮＨ−Ｃ(Ｏ)−ＮＨ−、−Ｃ(Ｏ)−ＮＨ−、−ＮＨ−Ｃ(Ｏ)−、(Ｃ３−Ｃ７)シクロアルキレン、フェニレン、ヘテロアリーレンまたはヘテロシクレンである)であり、ここで、該(Ｃ１−Ｃ２０)アルキレン基、該(Ｃ２−Ｃ２０)アルケニレン基および該(Ｃ２−Ｃ２０)アルキニレン基は、各々、独立して、場合により、該基中に点在する１〜１０個の酸素原子を含んでよい；
(ｃ) (Ｃ３−Ｃ７)シクロアルキレン、(Ｃ３−Ｃ７)シクロアルキレン−Ｙ−(Ｃ３−Ｃ７)シクロアルキレン、−Ｙ−(Ｃ３−Ｃ７)シクロアルキレン、フェニレン、−Ｙ−フェニレン、フェニレン−Ｙ−フェニレン、ヘテロアリーレン、Ｙ−ヘテロアリーレン、ヘテロアリーレン−Ｙ−ヘテロアリーレン、ヘテロシクレン、−Ｙ−ヘテロシクレンまたはヘテロシクレン−Ｙ−ヘテロシクレン(ここで、Ｙは(Ｃ１−Ｃ２０)アルキレン、(Ｃ２−Ｃ２０)アルケニレン、(Ｃ２−Ｃ２０)アルキニレン、−Ｏ−、−Ｃ(Ｏ)−、−Ｓ−、−ＮＨ−、−Ｎ((Ｃ１−Ｃ６)アルキル)−、−ＮＨ−Ｃ(Ｏ)−ＮＨ−、−Ｃ(Ｏ)−ＮＨ−または−ＮＨ−Ｃ(Ｏ)−である)であり、ここで、該(Ｃ３−Ｃ７)シクロアルキレン、該フェニレン、該ヘテロアリーレンおよび該ヘテロシクレン基は、各々独立して、場合により、ハロ、(Ｃ１−Ｃ４)アルキルまたはハロ−置換(Ｃ１−Ｃ４)アルキルから選択される１〜３個の置換基で置換されていてよい；
(ｄ) −[ＯＣＨ２ＣＨ２]ｖ−(ここで、ｖは１〜２,０００である)；および
(ｅ) １〜３０アミノ酸を含むペプチド
からなる群から選択されるスペーサーである。
上記態様の各々の一つの具体的態様において、Ｌｇはハロゲン、−Ｃ≡ＣＨ、−Ｃ＝ＣＨ２、−ＯＨ、−ＳＨ、−ＳＯ２−ＣＨ＝ＣＨ２、−Ｏ−ＮＨ２、−Ｎ３、−Ｏ−Ｐ(Ｏ)(ＯＨ)２、−Ｃ(Ｏ)−Ｈ、−Ｃ(Ｏ)−ＣＨ３、−ＮＨ−Ｃ(Ｏ)−ＣＨ２−Ｉ、マレイミジル、３,５−ジオキソ−１,２,４−トリアゾリジン−４−イル、１Ｈ−ピロール−２,５−ジオン−１−イル、ピリジン−２−イル−ジスルファニル、テトラヒドロ−１Ｈ−チエノ[３,４−ｄ]イミダゾール−２(３Ｈ)−オン−４−イル、１−カルボニルオキシ−２,５−ジオキソピロリジン、１−カルボニルオキシ−２,５−ジオキソピロリジン−３−スルホン酸ナトリウム、−ＳＳＲ１、−Ｃ(Ｏ)−ＯＲ１、−Ｎ(Ｒ１)Ｈ、−ＮＨ−Ｎ(Ｒ１)Ｈ(ここで、Ｒ１はＨまたは(Ｃ１−Ｃ６)アルキルである)および−Ｃ(Ｏ)−Ｒ２(ここで、Ｒ２はＨ、(Ｃ１−Ｃ４)アルキル、ハロ−置換(Ｃ１−Ｃ４)アルキル、−ＣＨ＝ＣＨ２、Ｎ(Ｒ１)Ｈまたは−ＮＨ−Ｎ(Ｒ１)Ｈである)から成る群から選択される結合基である。
上記態様の各々の一つの具体的態様において、Ｌは、
(ａ) 結合、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＮＨ−、−Ｎ((Ｃ１−Ｃ６)アルキル)−、−ＮＨ−Ｃ(Ｏ)−ＮＨ−、−Ｃ(Ｏ)−ＮＨ−、−ＮＨ−Ｃ(Ｏ)−；
(ｂ) (Ｃ１−Ｃ２０)アルキレン、(Ｃ２−Ｃ２０)アルケニレン、(Ｃ２−Ｃ２０)アルキニレン、−Ｚ−(Ｃ１−Ｃ２０)アルキレン−、−Ｚ−(Ｃ２−Ｃ２０)アルケニレン、−Ｚ−(Ｃ２−Ｃ２０)アルキニレン、(Ｃ１−Ｃ２０)アルキレン−Ｚ−(Ｃ１−Ｃ２０)アルキレン、(Ｃ２−Ｃ２０)アルケニレン−Ｚ−(Ｃ２−Ｃ２０)アルケニレン、(Ｃ２−Ｃ２０)アルキニレン−Ｚ−(Ｃ２−Ｃ２０)アルキニレン（ここで、Ｚは−ＮＨ−、−Ｎ((Ｃ１−Ｃ６)アルキル)−、−ＮＨ−Ｃ(Ｏ)−ＮＨ−、−Ｃ(Ｏ)−ＮＨ−、−ＮＨ−Ｃ(Ｏ)−、(Ｃ３−Ｃ７)シクロアルキレン、フェニレン、ヘテロアリーレンまたはヘテロシクレンである)であり、ここで、該(Ｃ１−Ｃ２０)アルキレン基、該(Ｃ２−Ｃ２０)アルケニレン基および該(Ｃ２−Ｃ２０)アルキニレン基は、各々、独立して、場合により、該基中に点在する１〜１０個の酸素原子を含んでよい；
(ｃ) (Ｃ３−Ｃ７)シクロアルキレン、(Ｃ３−Ｃ７)シクロアルキレン−Ｙ−(Ｃ３−Ｃ７)シクロアルキレン、−Ｙ−(Ｃ３−Ｃ７)シクロアルキレン、フェニレン、−Ｙ−フェニレン、フェニレン−Ｙ−フェニレン、ヘテロアリーレン、Ｙ−ヘテロアリーレン、ヘテロアリーレン−Ｙ−ヘテロアリーレン、ヘテロシクレン、−Ｙ−ヘテロシクレンまたはヘテロシクレン−Ｙ−ヘテロシクレン(ここで、Ｙは(Ｃ１−Ｃ２０)アルキレン、(Ｃ２−Ｃ２０)アルケニレン、(Ｃ２−Ｃ２０)アルキニレン、−Ｏ−、−Ｃ(Ｏ)−、−Ｓ−、−ＮＨ−、−Ｎ((Ｃ１−Ｃ６)アルキル)−、−ＮＨ−Ｃ(Ｏ)−ＮＨ−、−Ｃ(Ｏ)−ＮＨ−または−ＮＨ−Ｃ(Ｏ)−である)であり、ここで、該(Ｃ３−Ｃ７)シクロアルキレン、該フェニレン、該ヘテロアリーレンおよび該ヘテロシクレン基は、各々独立して、場合により、ハロ、(Ｃ１−Ｃ４)アルキルまたはハロ−置換(Ｃ１−Ｃ４)アルキルから選択される１〜３個の置換基で置換されていてよい；
(ｄ) −[ＯＣＨ２ＣＨ２]ｖ−Ｏ−(ここで、ｖは１〜２,０００である)；および
(ｅ) １〜３０アミノ酸を含むペプチド
から成る群から選択されるスペーサーＸ’を含むリンカーである。
本発明のさらなる他の面において、式(Ｉｂ)
〔ここで、ＬはスペーサーＸ’を含むリンカーであり、Ｒは治療剤、放射標識治療剤、蛍光剤、細胞毒性剤、ＤＮＡ、ＲＮＡ、脂質、ハプテンまたはポリマーである；
但しＲはローダミン色素またはインテグリン結合環状アルギニン−グリシン−アスパラギン(ＲＧＤ)ペプチドではない。〕
のコンジュゲートが提供される。
定義
ここで使用する用語“アルキル”は、一般式ＣｎＨ２ｎ＋１の炭化水素基を言う。アルカン基は直鎖でも分枝鎖でもよい。例えば、用語“(Ｃ１−Ｃ１０)アルキル”は、１〜１０個の炭素原子を含む一価、直鎖または分枝鎖脂肪族基(例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、ｉ−プロピル、ｎ−ブチル、ｉ−ブチル、ｓ−ブチル、ｔ−ブチル、ｎ−ペンチル、１−メチルブチル、２−メチルブチル、３−メチルブチル、ネオペンチル、３,３−ジメチルプロピル、ヘキシル、２−メチルペンチル、ヘプチルなど)を言う。同様に、アルコキシのアルキル部分(すなわち、アルキル原子団)は上記と同じ定義を有する。“場合により置換されていてよい”と示されているとき、アルカン基またはアルキル基は非置換でも、１個以上の置換基で置換されていてもよい(一般的に、ペルクロロアルキルまたはペルフルオロアルキルのようなハロゲン置換基の場合を除き、１〜３個の置換基)。“ハロ−置換アルキル”は、少なくとも１個のハロゲン置換を有するアルキル基を言う。
用語“アルケニル”は、アルキル基内に少なくとも１個の不飽和を含むアルキル基を言う。アルケニル基は直鎖でも分枝鎖でもよい。例えば、ビニル、プロプ−１−エニル、プロプ−２−エニル、アレニル、２−メチルプロプ−２−エニル、３−メチルブト−２−エニル、ブタジエニルなど。
用語“アルキニル”は、少なくとも１個の三重結合を含むアルキル基を言う。アルキニル基は直鎖でも分枝鎖でもよい。例えば、ＣＨ３−Ｃ≡Ｃ−、Ｈ−Ｃ≡Ｃ−ＣＨ２−、ＣＨ３−Ｃ≡Ｃ−ＣＨ２−、Ｈ−Ｃ≡Ｃ−ＣＨ(ＣＨ３)−、Ｈ−Ｃ≡Ｃ−ＣＨ２ＣＨ２−、Ｈ−Ｃ≡Ｃ−ＣＨ(ＣＨ３)ＣＨ２−、Ｈ−Ｃ≡Ｃ−ＣＨ２−Ｃ≡Ｃ−ＣＨ２−など。
用語“アルキレン”または“アルキレニル”は、基が２個の結合部位を含むアルキル基を言う。アルキレン基は直鎖(例えば、−(ＣＨ２)−、−(ＣＨ２)２−、−(ＣＨ２)３−)でも分枝鎖(例えば、−ＣＨ(ＣＨ３)−、−Ｃ(ＣＨ３)２−、−ＣＨ２ＣＨ(ＣＨ３)−、−ＣＨ(ＣＨ３)−ＣＨ２−、−Ｃ(ＣＨ３)２−ＣＨ２−など)でもよい。適当なアルキレン基は、結合部位が１カ所のみでなく２カ所ある以外、アルキルについて上記したものと同じである。
用語“アルケニレン”または“アルケニレニル”は、２カ所の結合部位を含むアルケニル基を言う。例えば、−ＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ２−、−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ＝ＣＨ−など。適当なアルケニレン基は、結合部位が１カ所のみでなく２カ所ある以外、アルケニルについて上記したものと同じである。
用語“アルキニレン”または“アルキニレニル”は、２カ所の結合部位を含むアルキニル基を言う。例えば、−ＣＨ２−Ｃ≡Ｃ−ＣＨ２−。適当なアルキニレン基は、結合部位が１カ所のみでなく２カ所ある以外、アルキニルについて上記したものと同じである。
用語“アリール”は、単環(例えば、フェニル)または縮合環系(例えば、ナフタレン、アントラセン、フェナントレンなど)を有する芳香族基を言う。典型的アリール基は、６〜１４員芳香族炭素環式環である。縮合芳香環系はまた一部または完全に飽和したシクロアルキルに縮合したフェニルも含み得る。例えば、２,３−ジヒドロインデニル、１,２,３,４−テトラヒドロナフタレニル、１,２−ジヒドロナフタレニル、２,３−ジヒドロナフタレニル、９,１０−ジヒドロアントラセニル、フルオレニルなど。
用語“アリーレン”は、２個の結合部位を有する炭素環式芳香族基を言う。適当なアリーレンは、１個ではなく２個の結合部位がある以外、アリール基について上記した基を含む。例えば、１,２−フェニレン、１,３−フェニレン、１,４−フェニレン、１,３−ナフチレン、１,４−ナフチレン、１,５−ナフチレン、１,６−ナフチレン、１,７−ナフチレン、２,３−ナフチレン、２,４−ナフチレン、２,５−ナフチレン、２,６−ナフチレン、２,７−ナフチレン、３,４−ナフチレン、３,５−ナフチレン、３,６−ナフチレン、３,７−ナフチレンなど。縮合アリーレン系上の２個の結合部位は同じ環上でも異なる環上でもよい。
用語“一部または完全に飽和したシクロアルキル”は、完全に水素化された(例えば、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロオクチルなど)または一部水素化された(例えば、シクロプロペニル、シクロブテニル、シクロペンチル、シクロペンタ−１,３−ジエニル、シクロヘキセニル、シクロヘキサ−１,３−ジエニル、シクロヘキサ−１,４−ジエニルなど)炭素環式環を言う。炭素環式環は単環(上記のとおり)、二環式環(例えば、オクタヒドロペンタレニル、ビシクロ[１.１.１]ペンタニル、ビシクロ[２.１.１]ヘキサニル、ビシクロ[２.１.１]ヘキシ−２−エニル、ビシクロ[２.２.１]ヘプト−２−エニル、ビシクロ[２.２.１]ヘプタニル、ビシクロ[２.２.２]オクタニル、ビシクロ[２.２.２]オクト−２−エニル、ビシクロ[２.２.２]オクタ−２,５−ジエニルなど)またはスピロ環(例えば、スピロ[２.２]ペンタニルなど)などであり得る。
用語“一部または完全に飽和したシクロアルキレン”は、環に不飽和がないか(完全に水素化)または芳香族ではなく少なくとも１個の不飽和があり(一部水素化)、２個の結合部位を含む炭素環式環を言う。適当な環系は、１個ではなく２個の結合部位がある以外、一部または完全に飽和したシクロアルキルについて上記した基を含む。例えば、１,２−シクロプロピル、１,２−シクロプロプ−１−エニル、１,２−シクロブチル、１,３−シクロブチル、１,２−シクロブト−１−エニル、３,４−シクロブト−１−エニル、３,５−シクロペント−１−エニル、１,４−シクロペンタ−１,３−ジエニル、１,５−シクロペンタ−１,３−ジエニル、１,２−シクロペンタ−１,３−ジエニル、１,３−シクロペンタ−１,３−ジエニルなど。炭素環式環は単環、二環式環、縮合環(例えば、デカヒドロナフタレン)またはスピロ環であってよく、ここで、二環式環およびスピロ環上の２個の結合部位は同じ環上でも異なる環上でもよい。例えば、下図参照。
用語“一部または完全に飽和したヘテロ環”は、一部または完全に水素化され、単環、二環式環(縮合環を含む)またはスピロ環のいずれかで存在し得る非芳香環を言う。特に断らない限り、ヘテロ環式環は一般的に硫黄、酸素および／または窒素から独立して選択される１〜３個のヘテロ原子(好ましくは１個または２個のヘテロ原子)を含む３〜１４員環である。一部飽和または完全飽和ヘテロ環式環は、エポキシ、アジリジニル、アゼチジニル、テトラヒドロフラニル、ジヒドロフラニル、ジヒドロピリジニル、ピロリジニル、イミダゾリジニル、イミダゾリニル、１Ｈ−ジヒドロイミダゾリル、ヘキサヒドロピリミジニル、ピペリジニル、ピペラジニル、ピラゾリジニル、２Ｈ−ピラニル、４Ｈ−ピラニル、２Ｈ−クロメニル、オキサジニル、モルホリノ、チオモルホリノ、テトラヒドロチエニル、テトラヒドロチエニル、１,４,７−トリアゾナン、ジアゼパニル、１,１−ジオキシド、オキサゾリジニル、チアゾリジニル、オクタヒドロピロロ[３,２−ｂ]ピロリル、デカヒドロ−２,７−ナフチリジニルなどのような基を含む。一部飽和ヘテロ環式環はまた、ヘテロ環式環がアリールまたはヘテロアリール環に縮合した基(例えば、２,３−ジヒドロベンゾフラニル、インドリニル(または２,３−ジヒドロインドリル)、２,３−ジヒドロベンゾチオフェニル、２,３−ジヒドロベンゾチアゾリル、１,２,３,４−テトラヒドロキノリニル、１,２,３,４−テトラヒドロイソキノリニル、５,６,７,８−テトラヒドロピリド[３,４−ｂ]ピラジニルなど)を含む。スピロ環の例は、２,６−ジアザスピロ[３.３]ヘプタニル、２,７−ジアザスピロ[４.４]ノナニル、３−アザスピロ[５.５]ウンデカニル、３,９−ジアザスピロ[５.５]ウンデカニルなどを含む。
用語“一部または完全に飽和したヘテロシクレン”は、１個ではなく２個の結合部位がある以外、一部または完全に飽和したヘテロ環式環(上記のとおり)を言う。ヘテロシクレン環は単環、二環式環またはスピロ環であってよく、ここで、二環式環(縮合環を含む)およびスピロ環上の２個の結合部位は同じ環上でも異なる環上でもよい。例えば、例えば、下図参照。
用語“ヘテロアリール”は、５〜１０員芳香環系内に少なくとも１個のヘテロ原子(例えば、酸素、硫黄、窒素またはこれらの組み合わせ)を含む芳香族基(例えば、ピロリル、ピリジル、ピラゾリル、インドリル、インダゾリル、チエニル、フラニル、ベンゾフラニル、オキサゾリル、イミダゾリル、テトラゾリル、トリアジニル、ピリミジル、ピラジニル、チアゾリル、プリニル、ベンゾイミダゾリル、キノリニル、イソキノリニル、ベンゾチオフェニル、ベンゾオキサゾリル、１Ｈ−ベンゾ[ｄ][１,２,３]トリアゾリルなど)を言う。ヘテロ芳香族基は単環または縮合環系から成る。典型的単ヘテロアリール環は、酸素、硫黄および窒素から独立して選択される１〜３個のヘテロ原子を含む５〜６員環であり、典型的縮合ヘテロアリール環系は、酸素、硫黄および窒素から独立して選択される１〜４個のヘテロ原子を含む９〜１０員環系である。縮合ヘテロアリール環系は、互いに縮合した２個のヘテロアリール環またはアリール(例えば、フェニル)に縮合したヘテロアリール縮合から成り得る。
用語“ヘテロアリーレン”は、１個ではなく２個の結合部位があるヘテロアリールを言う。適当なヘテロアリーレン基は、１個ではなく２個の結合部位を有する、ヘテロアリールについて上に記載したものを含む。
用語“ポリペプチド”、“ペプチド”および“タンパク質”は、アミノ酸残基のポリマーを指称するために互換的に使われる。本用語は、１個以上のアミノ酸残基が対応する天然に存在するアミノ酸の人工的模倣物であるアミノ酸ポリマーならびに天然に存在するアミノ酸ポリマーおよび天然に存在しないアミノ酸ポリマーに適用される。
用語“アミノ酸”は天然および合成アミノ酸、ならびに天然に存在するアミノ酸に類似の態様で機能するアミノ酸類似体およびアミノ酸模倣体を言う。天然に存在するアミノ酸は遺伝暗号によりコードされたもの、ならびに後に修飾されたアミノ酸、例えば、ヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタメートおよびＯ−ホスホセリンである。アミノ酸類似体は、天然に存在するアミノ酸と同じ基本化学構造、すなわち、水素、カルボキシル基、アミノ基およびＲ基に結合したα−炭素を有する化合物、例えば、ホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウムを言う。このような類似体は修飾Ｒ基(例えば、ノルロイシン)または修飾ペプチド主鎖を有するが、天然に存在するアミノ酸と同じ基本化学構造を維持する。アミノ酸模倣体は、アミノ酸の一般化学構造と異なる構造を有するが、天然に存在するアミノ酸と類似の態様で機能する化合物を言う。
詳細な説明
本発明の化合物は、特にここに記載する説明に照らして、化学分野で周知のものに準じる方法を含む合成経路で合成し得る。出発物質は一般的に販売業者、例えばAldrich Chemicals(Milwaukee, Wis.)から入手可能であるかまたは当業者に周知の方法を使用して容易に合成される(例えば、一般的にLouis F. Fieser and Mary Fieser, Reagents for Organic Synthesis, v. 1-19, Wiley, New York (1967-1999 ed.)または補遺を含むBeilsteins Handbuch der organischen Chemie, 4, Aufl. ed. Springer-Verlag, Berlin(the Beilsteinオンラインデータベースを介しても入手可能)に記載の方法により製造)。
説明の目的で、下記の反応スキームは本発明の化合物ならびに重要中間体の合成のための可能な経路を示す。個々の反応工程のより詳細な記載に関しては、下記実施例を参照のこと。当業者は、他の合成経路を使用して、本発明化合物を合成できることを認識する。特定の出発物質および反応材をスキームに記し、下に記載しているが、他の出発物質および反応材を多様な誘導体および／または反応条件をもたらすために容易に置き換え得る。加えて、下記方法で製造できる多くの化合物を、当業者に周知の慣用の手法を使用して、本開示を参照してさらに修飾できる。
本発明の化合物の製造に関して、中間体の遠位官能基(例えば、１級または２級アミン)の保護が必要であり得る。このような保護の必要性は遠位官能基の性質および製造方法の条件により異なる。適当なアミノ保護基(ＮＨ−Ｐｇ)はアセチル、トリフルオロアセチル、ｔ−ブトキシカルボニル(ＢＯＣ)、ベンジルオキシカルボニル(ＣＢｚ)および９−フルオレニルメチレンオキシカルボニル(Ｆｍｏｃ)を含む。このような保護の必要性は当業者により容易に決定される。保護基およびその使用の一般的説明については、T. W. Greene, Protective Groups in Organic Synthesis, John Wiley & Sons, New York, 1991参照。
下記スキームＩは、改善されたチロシンライゲーションの方法を使用し、最終チロシンポリペプチドコンジュゲート(Ｉ)を製造するための可能な経路を示す。１個のチロシン単位のみを下記スキームの構造に記載しているが、当業者はさらなるチロシン単位が本ポリペプチド(またはタンパク質)のアミノ酸鎖中に分散されていてよく、これらのチロシン単位のいずれかまたは全てが本ライゲーションの方法でコンジュゲートし得ることを理解する。加えて、当業者は、コンジュゲーションの程度によってチロシンポリペプチドコンジュゲート(Ｉ)の分布が最終反応生成物に存在し得ることを認識する。
Ｔｒｉｓ緩衝液(約６.０〜約９.０、特に約７.０〜約８.０、より具体的には約７.０〜約７.５のｐＨ)中のチロシン含有ポリペプチド(１ａ)を４−置換−３Ｈ−１,２,４−トリアゾール−３,５(４Ｈ)−ジオン(１ｂ)で処理して、所望の式(Ｉ)のコンジュゲートを形成させる。あるいは、チロシン含有ポリペプチド(１ａ)を、活性末端結合基(Ｌｇ)を伴うスペーサー(Ｘ)を有する４−置換−３Ｈ−１,２,４−トリアゾール−３,５(４Ｈ)−ジオン(１ｃ)で処理して、中間体コンジュゲートポリペプチド(Ｉ−Ａ)を形成し、これを続いて当業者に周知の慣用法により末端活性結合基(Ｌｇ)を介して所望のＲ基(例えば、治療剤、放射標識治療剤、細胞毒性剤、ＤＮＡ、ＲＮＡ、脂質またはポリマー、例えばポリエチレングリコールまたは多糖)とコンジュゲートさせて(例えばクリック化学、オキシム形成、マレイミド−チオールカップリング、オレフィンメタセシスおよびアルキル化)、式(Ｉ)のコンジュゲートを形成させ得る。ＲＬは、一般的に結合基(Ｌｇ)と反応できる結合部位または置換基を含むＲ基である。末端結合基(Ｌｇ)は完全にまたは一部スペーサー(Ｘ)と共に未反応のまま残っても残らなくてもよく、式(Ｉ)の最終化合物における“Ｌ”(スペーサーＸ’を含む)を形成する。スペーサーＸ’はＲＬとカップリング後末端結合基(Ｌｇ)を有するスペーサーＸの残基を含む。ＲをＲＬを介して中間体コンジュゲートポリペプチド(Ｉ−Ａ)に結合させるために使用する方法のタイプは末端結合基(Ｌｇ)およびコンジュゲートする特定の基による。例えば、Tiefenbrunn and Dawson, in “Invited Review：Chemoselective Ligation Techniques：Modern Application of Time-Honored Chemistry” Peptide Science 94(1) 95-106 (2010)に記載されている種々のライゲーション反応、例えばヒュスゲン[３＋２]環付加、光誘発性テトラゾールライゲーション、シュタウディンガーライゲーション、ディールス・アルダー環付加、逆電子要求(inverse-electron demand)ディールス・アルダー、ヒドラゾンおよびオキシム形成、チロシン残基とのマンニッヒ縮合、チオール−エン反応およびアリルスルフィド交差メタセシス参照。
４−置換−３Ｈ−１,２,４−トリアゾール−３,５(４Ｈ)−ジオン反応材(１ｃ)は一般的に二官能性反応材として知られる。適当な二官能性反応材の代表例を下に示す(ここで、Ｘはスペーサーである)。
市販されているか、文献既知の製造法により容易に製造できるかまたは下記実施例に記載のとおり製造できる適当な二官能性反応材は、４−メチル−３Ｈ−１,２,４−トリアゾール−３,５(４Ｈ)−ジオン、(Ｅ)−４−(４−(１−(ベンジルオキシイミノ)エチル)−フェニル)−３Ｈ−１,２,４−トリアゾール−３,５(４Ｈ)−ジオン、(Ｅ)−４−(４−(１−(プロプ−２−イニルオキシイミノ)エチル)フェニル)−３Ｈ−１,２,４−トリアゾール−３,５(４Ｈ)−ジオン、４−(４−(２−(２−(プロプ−２−イニルオキシ)エトキシ)エトキシ)フェニル)−３Ｈ−１,２,４−トリアゾール−３,５(４Ｈ)−ジオン、４−(３,５−ジオキソ−３Ｈ−１,２,４−トリアゾール−４(５Ｈ)−イル)ブチルカルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチルおよびＮ−(４−(３,５−ジオキソ−３Ｈ−１,２,４−トリアゾール−４(５Ｈ)−イル)ブチル)−２−メトキシ(ポリエチレングリコール)−アセトアミドを含む。
適当な二官能性反応材はまたその対応する１,２,４−トリアゾリジン−３,５−ジオン誘導体から、当業者に周知の方法を使用して製造できる。市販されている３,５−ジオン誘導体の代表例は４−(４−アセチルフェニル)−１,２,４−トリアゾリジン−３,５−ジオン、４,４’−[(メチルイミノ)ジ−３,１−プロパンジイル]ビス−１,２,４−トリアゾリジン−３,５−ジオン、４−(３−アジドプロピル)−１,２,４−トリアゾリジン−３,５−ジオン、４,４’−[１,３−フェニレンビス(メチレン)]ビス−１,２,４−トリアゾリジン−３,５−ジオン、４,４’−(１,１２−ドデカンジイル)ビス−１,２,４−トリアゾリジン−３,５−ジオン、４,４’−(メチレンジ−４,１−フェニレン)ビス−１,２,４−トリアゾリジン−３,５−ジオン、４,４’−(１,４−シクロヘキサンジイル)ビス−１,２,４−トリアゾリジン−３,５−ジオン、４,４’−[１,４−ブタンジイルビス(オキシ−３,１−プロパンジイル)]ビス−１,２,４−トリアゾリジン−３,５−ジオン、４−[３−[(３,５−ジオキソ−１,２,４−トリアゾリジン−４−イル)メチル]−３,５,５−トリメチルシクロヘキシル]−１,２,４−トリアゾリジン−３,５−ジオン、Ｎ,Ｎ’−ビス[(３,５−ジオキソ−１,２,４−トリアゾリジン−４−イル)メチル]−ウレア、４,４’−(１,２−エタンジイル)ビス−１,２,４−トリアゾリジン−３,５−ジオン、４,４’−(メチレンジ−４,１−シクロヘキサンジイル)ビス−１,２,４−トリアゾリジン−３,５−ジオン、４,４’−(イミノジ−２,１−エタンジイル)ビス−１,２,４−トリアゾリジン−３,５−ジオン、４,４’−[(４,６−ジメチル−１,３−フェニレン)ビス(メチレン)]ビス−１,２,４−トリアゾリジン−３,５−ジオンおよび４,４’−(１,６−ヘキサンジイル)ビス−１,２,４−トリアゾリジン−３,５−ジオンを含む。
種々の誘導体を、B. Saville, in “Bis-(p-3,5-dioxo-1,2,4-triazolin-4-ylphenyl)methane：a highly reactive bifunctional enophile” J Chem Soc D, Chem Commun, 635-635 (1971); およびOrganic Syntheses, Coll. Vol.6, 936 (1988)に記載の方法に準じて製造できる。
スペーサー(“Ｘ”)は、２個の反応基の間の所望の長さおよび／または所望の官能性を提供する。例えば、ポリエチレングリコール(ＰＥＧ)ベースのスペーサーは、良好な水溶性を有する親水性反応材を提供する。あるいは、脂肪族(例えば、アルキレン)スペーサーを疎水性を導入するために使用し得る。スペーサーはまたより広汎な設計の多様性を取り込むために追加的反応部位を含み得る。例えば、インビボでまたは光化学的に開裂する開裂可能な基の導入。スペーサー内の特定の置換基はまた結合基の反応性に影響し得る。例えば、隣接する芳香環があるマレイミド基は、脂肪族環が隣接するマレイミドより開環に不安定であり、失活することが知られている。さらに、インビボでの使用を意図するコンジュゲートは、結合するクロスリンカー上のスペーサーのタイプによって異なる特性を有し得る。あるスペーサーは免疫原性であり、それに対する特異的抗体産生を誘導し得る。他の例において、インビボでのコンジュゲートの半減期は、特に開裂可能反応材を使用したとき、スペーサーの選択により変わり得る。
反応性末端結合基(Ｌｇ)を利用して他の官能基(Ｒ、例えば治療剤、細胞毒性剤、放射活性剤(例えば、放射活性金属とのキレート化剤)、ハプテン、脂質およびポリマー(例えば、ポリエチレングリコール類および多糖))を結合し得る。結合基は、官能基(Ｒ)のスペーサー(Ｘ)へのカップリングを可能にするあらゆる置換基であり得る。適当な結合基はハロゲン、−Ｃ≡ＣＨ、−Ｃ＝ＣＨ２、−ＯＨ、−ＳＨ、−ＳＯ２−ＣＨ＝ＣＨ２、−Ｏ−ＮＨ２、−Ｎ３、−Ｏ−Ｐ(Ｏ)(ＯＨ)２、−Ｃ(Ｏ)−Ｈ、−Ｃ(Ｏ)−ＣＨ３、−ＮＨ−Ｃ(Ｏ)−ＣＨ２−Ｉ、マレイミジル、３,５−ジオキソ−１,２,４−トリアゾリジン−４−イル、１Ｈ−ピロール−２,５−ジオン−１−イル、ピリジン−２−イル−ジスルファニル、テトラヒドロ−１Ｈ−チエノ[３,４−ｄ]イミダゾール−２(３Ｈ)−オン−４−イル、１−カルボニルオキシ−２,５−ジオキソピロリジン、１−カルボニルオキシ−２,５−ジオキソピロリジン−３−スルホン酸ナトリウム、−ＳＳＲ１、−Ｃ(Ｏ)−ＯＲ１、−Ｎ(Ｒ１)Ｈ、−ＮＨ−Ｎ(Ｒ１)Ｈ(ここで、Ｒ１はＨまたは(Ｃ１−Ｃ６)アルキルである)および−Ｃ(Ｏ)−Ｒ２(ここで、Ｒ２はＨ、(Ｃ１−Ｃ４)アルキル、ハロ−置換(Ｃ１−Ｃ４)アルキル、−ＣＨ＝ＣＨ２、Ｎ(Ｒ１)Ｈまたは−ＮＨ−Ｎ(Ｒ１)Ｈである)。ある態様において、−ＮＨ２および−ＣＨ２Ｂｒが適当な結合基であり得る。
スペーサー(“Ｘ”)が１個以上のさらなる反応部位を含む態様において、さらなる該反応部位は、１個以上のさらなる末端活性結合基を含み得る。従って、スペーサーは１個以上のさらなる末端活性結合基を含み得る。例えば、スペーサーは、結合基Ｌｇに加えて、第二の末端活性結合基(Ｌｇ２)を含み得る。あるいは、スペーサーは、第二の末端活性結合基(Ｌｇ２)および第三の末端活性結合基(Ｌｇ３)を含み得る。他の選択肢において、スペーサーは第二の末端活性結合基(Ｌｇ２)、第三の末端活性結合基(Ｌｇ３)および第四の末端活性結合基(Ｌｇ４)を含み得る。しかしながら、スペーサーは、典型的に結合基Ｌｇに加えて第二の末端活性結合基(Ｌｇ２)のみを含む。１個以上のさらなる末端活性結合基の各々は、は通常スペーサーにおける分枝の末端にある。
スペーサーが１個以上のさらなる末端活性結合基を含む態様において、これらの１個以上のさらなる末端活性結合基の各々は、官能基(Ｒ、例えば治療剤、細胞毒性剤、放射活性剤(例えば、放射活性金属とのキレート化剤)、ハプテン、脂質およびポリマー(例えば、ポリエチレングリコール類および多糖))のスペーサー(Ｘ)へのカップリングを可能にするあらゆる置換基から独立して選択され得る。適当な結合基はハロゲン、−Ｃ≡ＣＨ、−Ｃ＝ＣＨ２、−ＯＨ、−ＳＨ、−ＳＯ２−ＣＨ＝ＣＨ２、−Ｏ−ＮＨ２、−Ｎ３、−Ｏ−Ｐ(Ｏ)(ＯＨ)２、−Ｃ(Ｏ)−Ｈ、−Ｃ(Ｏ)−ＣＨ３、−ＮＨ−Ｃ(Ｏ)−ＣＨ２−Ｉ、マレイミジル、３,５−ジオキソ−１,２,４−トリアゾリジン−４−イル、１Ｈ−ピロール−２,５−ジオン−１−イル、ピリジン−２−イル−ジスルファニル、テトラヒドロ−１Ｈ−チエノ[３,４−ｄ]イミダゾール−２(３Ｈ)−オン−４−イル、１−カルボニルオキシ−２,５−ジオキソピロリジン、１−カルボニルオキシ−２,５−ジオキソピロリジン−３−スルホン酸ナトリウム、−ＳＳＲ１、−Ｃ(Ｏ)−ＯＲ１、−Ｎ(Ｒ１)Ｈ、−ＮＨ−Ｎ(Ｒ１)Ｈ(ここで、Ｒ１はＨまたは(Ｃ１−Ｃ６)アルキルである)および−Ｃ(Ｏ)−Ｒ２(ここで、Ｒ２はＨ、(Ｃ１−Ｃ４)アルキル、ハロ−置換(Ｃ１−Ｃ４)アルキル、−ＣＨ＝ＣＨ２、Ｎ(Ｒ１)Ｈおよび−ＮＨ−Ｎ(Ｒ１)Ｈである)を含む。これらの態様において、末端活性結合基(１個以上のさらなる末端活性結合基を含む)は、典型的に全て同じである。例えば、本発明者らは、末端活性結合基の全てが−Ｃ≡ＣＨであるスペーサーが特に適することを発見した。これらの態様において、官能基Ｒは典型的に多糖である。
スペーサー(“Ｘ”)が１個以上のさらなる末端活性結合基を含む具体的態様において、スペーサーＸは典型的に(Ｃ１−Ｃ２０)アルキレン、(Ｃ２−Ｃ２０)アルケニレン、(Ｃ２−Ｃ２０)アルキニレンから選択され、ここで、該(Ｃ１−Ｃ２０)アルキレン基、該(Ｃ２−Ｃ２０)アルケニレン基および該(Ｃ２−Ｃ２０)アルキニレン基は、各々、独立して、場合により、該基中に点在する１〜１０個の酸素原子を含んでよく、ここで、該(Ｃ１−Ｃ２０)アルキレン基、(Ｃ２−Ｃ２０)アルケニレン基および(Ｃ２−Ｃ２０)アルキニレン基は分枝鎖である。好ましくは、スペーサーＸは(Ｃ１−Ｃ２０)アルキレンであり、ここで、該(Ｃ１−Ｃ２０)アルキレンは該基中に点在する１〜１０個の酸素原子を含んでよく、ここで、該(Ｃ１−Ｃ２０)アルキレンは分枝鎖である。１個以上のさらなる末端活性結合基の各々は、は通常スペーサーにおける分枝の末端にある。
スペーサー(“Ｘ”)が１個のさらなる末端活性結合基を含むとき、式(Ｉ−Ａ)のコンジュゲート中の基−Ｘ−Ｌｇは
〔ここで、Ｙは、上記で定義したＸと同じ選択しから選択されるスペーサーであり、ＬｇおよびＬｇ２は各々上記で定義した結合基である。〕
により表され得る。Ｌｇ、Ｌｇ２およびＬｇ３(存在するとき)は同一または異なる結合基であってよく、スペーサーＹ上の任意の利用可能な位置に結合できる。
一つの具体的態様において、スペーサーＹは
(ａ) 結合、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＮＨ−、−Ｎ((Ｃ１−Ｃ６)アルキル)−、−ＮＨ−Ｃ(Ｏ)−ＮＨ−、−Ｃ(Ｏ)−ＮＨ−、−ＮＨ−Ｃ(Ｏ)−；
(ｂ) (Ｃ１−Ｃ２０)アルキレン、(Ｃ２−Ｃ２０)アルケニレン、(Ｃ２−Ｃ２０)アルキニレン、−Ｚ−(Ｃ１−Ｃ２０)アルキレン−、−Ｚ−(Ｃ２−Ｃ２０)アルケニレン、−Ｚ−(Ｃ２−Ｃ２０)アルキニレン、(Ｃ１−Ｃ２０)アルキレン−Ｚ−(Ｃ１−Ｃ２０)アルキレン、(Ｃ２−Ｃ２０)アルケニレン−Ｚ−(Ｃ２−Ｃ２０)アルケニレン、(Ｃ２−Ｃ２０)アルキニレン−Ｚ−(Ｃ２−Ｃ２０)アルキニレン（ここで、Ｚは−ＮＨ−、−Ｎ((Ｃ１−Ｃ６)アルキル)−、−ＮＨ−Ｃ(Ｏ)−ＮＨ−、−Ｃ(Ｏ)−ＮＨ−、−ＮＨ−Ｃ(Ｏ)−、(Ｃ３−Ｃ７)シクロアルキレン、フェニレン、ヘテロアリーレンまたはヘテロシクレンである)であり、ここで、該(Ｃ１−Ｃ２０)アルキレン基、該(Ｃ２−Ｃ２０)アルケニレン基および該(Ｃ２−Ｃ２０)アルキニレン基は、各々、独立して、場合により、該基中に点在する１〜１０個の酸素原子を含んでよい；
(ｃ) (Ｃ３−Ｃ７)シクロアルキレン、(Ｃ３−Ｃ７)シクロアルキレン−Ｙ−(Ｃ３−Ｃ７)シクロアルキレン、−Ｙ−(Ｃ３−Ｃ７)シクロアルキレン、フェニレン、−Ｙ−フェニレン、フェニレン−Ｙ−フェニレン、ヘテロアリーレン、Ｙ−ヘテロアリーレン、ヘテロアリーレン−Ｙ−ヘテロアリーレン、ヘテロシクレン、−Ｙ−ヘテロシクレンまたはヘテロシクレン−Ｙ−ヘテロシクレン(ここで、Ｙは(Ｃ１−Ｃ２０)アルキレン、(Ｃ２−Ｃ２０)アルケニレン、(Ｃ２−Ｃ２０)アルキニレン、−Ｏ−、−Ｃ(Ｏ)−、−Ｓ−、−ＮＨ−、−Ｎ((Ｃ１−Ｃ６)アルキル)−、−ＮＨ−Ｃ(Ｏ)−ＮＨ−、−Ｃ(Ｏ)−ＮＨ−または−ＮＨ−Ｃ(Ｏ)−である)であり、ここで、該(Ｃ３−Ｃ７)シクロアルキレン、該フェニレン、該ヘテロアリーレンおよび該ヘテロシクレン基は、各々独立して、場合により、ハロ、(Ｃ１−Ｃ４)アルキルまたはハロ−置換(Ｃ１−Ｃ４)アルキルから選択される１〜３個の置換基で置換されていてよい；
(ｄ) −[ＯＣＨ２ＣＨ２]ｖ−Ｏ−(ここで、ｖは１〜２,０００である)；および
(ｅ) １〜３０アミノ酸を含むペプチド
から成る群から選択される。
典型的に、スペーサーＹは(Ｃ１−Ｃ２０)アルキレン、(Ｃ２−Ｃ２０)アルケニレンおよび(Ｃ２−Ｃ２０)アルキニレンから成る群から選択され、ここで、該(Ｃ１−Ｃ２０)アルキレン基、該(Ｃ２−Ｃ２０)アルケニレン基および該(Ｃ２−Ｃ２０)アルキニレン基は、各々、独立して、場合により、該基中に点在する１〜１０個の酸素原子を含んでよく、ここで、該(Ｃ１−Ｃ２０)アルキレン基、(Ｃ２−Ｃ２０)アルケニレン基および(Ｃ２−Ｃ２０)アルキニレン基は分枝鎖である。好ましくは、スペーサーＹは(Ｃ１−Ｃ２０)アルキレンであり、ここで、該(Ｃ１−Ｃ２０)アルキレンは該基中に点在する１〜１０個の酸素原子を含み、ここで、該(Ｃ１−Ｃ２０)アルキレンは分枝鎖である。これらの態様において、ＬｇおよびＬｇ２の各々は通常スペーサーにおける分枝の末端にある。
同様に、スペーサー(“Ｘ”)が１個のさらなる末端活性結合基を含むとき、式(Ｉ−Ｉｂ)の４−置換−３Ｈ−１,２,４−トリアゾール−３,５(４Ｈ)−ジオンにおける基−Ｘ−Ｌｇは
〔ここで、Ｙは上に定義したスペーサーであり、ＬｇおよびＬｇ２は上に定義したとおりである。〕
として表され得る。ＬｇおよびＬｇ２の各々は通常スペーサーにおける分枝の末端にある。
スペーサー(“Ｘ”)が１個のさらなる末端活性結合基を含むとき、式(Ｉ)のコンジュゲートにおける基−Ｌ−Ｒは
〔ここで、ＲＡおよびＲＢは独立して上記Ｒと同じ選択肢から選択され、ＭはスペーサーＹ’含有リンカーでありここで、Ｙ’は上に定義したＸ’と同じ選択肢から選択される。〕
として表し得る。
典型的に、ＲＡおよびＲＢの両者は同一である。例えば、ＲＡおよびＲＢはいずれも多糖である。ＲＡおよびＲＢの各々は通常スペーサーにおける分枝の末端にある。
一つの具体的態様において、Ｍは
(ａ) 結合、−Ｏ−、−Ｓ−、−ＮＨ−、−Ｎ((Ｃ１−Ｃ６)アルキル)−、−ＮＨ−Ｃ(Ｏ)−ＮＨ−、−Ｃ(Ｏ)−ＮＨ−、−ＮＨ−Ｃ(Ｏ)−；
(ｂ) (Ｃ１−Ｃ２０)アルキレン、(Ｃ２−Ｃ２０)アルケニレン、(Ｃ２−Ｃ２０)アルキニレン、−Ｚ−(Ｃ１−Ｃ２０)アルキレン−、−Ｚ−(Ｃ２−Ｃ２０)アルケニレン、−Ｚ−(Ｃ２−Ｃ２０)アルキニレン、(Ｃ１−Ｃ２０)アルキレン−Ｚ−(Ｃ１−Ｃ２０)アルキレン、(Ｃ２−Ｃ２０)アルケニレン−Ｚ−(Ｃ２−Ｃ２０)アルケニレン、(Ｃ２−Ｃ２０)アルキニレン−Ｚ−(Ｃ２−Ｃ２０)アルキニレン(ここで、Ｚは−ＮＨ−、−Ｎ(Ｃ１−Ｃ６)アルキル)−、−ＮＨ−Ｃ(Ｏ)−ＮＨ−、−Ｃ(Ｏ)−ＮＨ−、−ＮＨ−Ｃ(Ｏ)−、(Ｃ３−Ｃ７)シクロアルキレン、フェニレン、ヘテロアリーレンまたはヘテロシクレンである)であり、ここで、該(Ｃ１−Ｃ２０)アルキレン基、該(Ｃ２−Ｃ２０)アルケニレン基および該(Ｃ２−Ｃ２０)アルキニレン基は、各々、独立して、場合により、該基中に点在する１〜１０個の酸素原子を含んでよい；
(ｃ) (Ｃ３−Ｃ７)シクロアルキレン、(Ｃ３−Ｃ７)シクロアルキレン−Ｙ−(Ｃ３−Ｃ７)シクロアルキレン、−Ｙ−(Ｃ３−Ｃ７)シクロアルキレン、フェニレン、−Ｙ−フェニレン、フェニレン−Ｙ−フェニレン、ヘテロアリーレン、Ｙ−ヘテロアリーレン、ヘテロアリーレン−Ｙ−ヘテロアリーレン、ヘテロシクレン、−Ｙ−ヘテロシクレンまたはヘテロシクレン−Ｙ−ヘテロシクレン(ここで、Ｙは(Ｃ１−Ｃ２０)アルキレン、(Ｃ２−Ｃ２０)アルケニレン、(Ｃ２−Ｃ２０)アルキニレン、−Ｏ−、−Ｃ(Ｏ)−、−Ｓ−、−ＮＨ−、−Ｎ((Ｃ１−Ｃ６)アルキル)−、−ＮＨ−Ｃ(Ｏ)−ＮＨ−、−Ｃ(Ｏ)−ＮＨ−または−ＮＨ−Ｃ(Ｏ)−である)であり、ここで、該(Ｃ３−Ｃ７)シクロアルキレン、該フェニレン、該ヘテロアリーレンおよび該ヘテロシクレン基は、各々独立して、場合により、ハロ、(Ｃ１−Ｃ４)アルキルまたはハロ−置換(Ｃ１−Ｃ４)アルキルから選択される１〜３個の置換基で置換されていてよい；
(ｄ) −[ＯＣＨ２ＣＨ２]ｖ−Ｏ−(ここで、ｖは１〜２,０００である)；および
(ｅ) １〜３０アミノ酸を含むペプチド
から成る群から選択されるスペーサーＹ’含有リンカーである。
一つの態様において、Ｍは(Ｃ１−Ｃ２０)アルキレン、(Ｃ２−Ｃ２０)アルケニレンおよび(Ｃ２−Ｃ２０)アルキニレンから成る群から選択されるスペーサーＹ’含有リンカーであり、ここで、該(Ｃ１−Ｃ２０)アルキレン基、該(Ｃ２−Ｃ２０)アルケニレン基および該(Ｃ２−Ｃ２０)アルキニレン基は、各々、独立して、場合により、該基中に点在する１〜１０個の酸素原子を含んでよく、ここで、該(Ｃ１−Ｃ２０)アルキレン基、(Ｃ２−Ｃ２０)アルケニレン基および(Ｃ２−Ｃ２０)アルキニレン基は分枝鎖である。好ましくは、スペーサーＹ’は(Ｃ１−Ｃ２０)アルキレンであり、ここで、該(Ｃ１−Ｃ２０)アルキレンは該基中に点在する１〜１０個の酸素原子を含み、ここで、該(Ｃ１−Ｃ２０)アルキレンは分枝鎖である。これらの態様において、ＲＡおよびＲＢの各々は通常スペーサーにおける分枝の末端にある。
同様に、スペーサー(“Ｘ”)が１個のさらなる末端活性結合基を含むとき、式(Ｉｂ)の４−置換−３Ｈ−１,２,４−トリアゾール−３,５(４Ｈ)−ジオンにおける基−Ｌ−Ｒは
〔ここで、ＲＡおよびＲＢは上に定義したとおりであり、Ｍは上に定義したスペーサーＹ’含有リンカーである。〕
として表し得る。
典型的に、ＲＡおよびＲＢの両者は同一である。好ましくは、ＲＡおよびＲＢはいずれも多糖である。ＲＡおよびＲＢの各々は通常スペーサーにおける分枝の末端にある。
スペーサーが１個のさらなる末端活性結合基を含む態様において、４−置換−３Ｈ−１,２,４−トリアゾール−３,５(４Ｈ)−ジオン反応材(１ｃ)はまた三官能性反応材でもあり得る。適当な三官能性反応材の代表例を下に示す。
一つの好ましい態様において、式(Ｉ)のコンジュゲートは次の式を有する。
他の好ましい態様において、式(Ｉ)のコンジュゲートは次の式を有する。
ある態様において、CRM197は、CRM197以外の抗体またはワクチンキャリアタンパク質でもあり得る。
治療剤：“治療剤”は、ヒト疾患の検出、診断または処置に使用するあらゆる化合物を言う。このような化合物は天然に存在するものでも、修飾したものでも合成したものでもよい。治療剤は、治療有効量で投与したとき、ヒト疾患経路に関係する何らかの生物学的過程を促進または阻害し得る。“治療有効量”は、(ｉ)特定の疾患、状態または障害を処置または予防する、(ii)特定の疾患、状態または障害の１個以上の症状を減衰、寛解または除去するまたは(iii)ここに記載する特定の疾患、状態または障害の１個以上の症状の発症を予防または遅延する化合物の量を意味する。用語“動物”は、ヒト(男性または女性)、コンパニオンアニマル(例えば、イヌ、ネコおよびウマ)、動物園の動物、海洋動物、鳥類および他の同様の動物種を言う。
細胞毒性剤：“細胞毒性剤”は、腫瘍細胞に対して毒性であるあらゆる天然に存在する、修飾されたまたは合成された化合物を言う。このような薬剤は、新生物、ならびに炎症性疾患、自己免疫性障害の処置におよび細胞増殖または過活性細胞集団により特徴付けられる他の症状または疾患の処置に有用である。細胞毒性剤はアルキル化剤、抗生物質、代謝拮抗剤、チューブリン阻害剤、トポイソメラーゼＩおよびII阻害剤、ホルモンアゴニストまたはアンタゴニストまたは免疫調節剤を含み、細胞毒性剤は、光または赤外線により活性化されたとき細胞毒性であってよく、他の作用経路を介して機能してもよくまたは補助的増強剤であってよい。適当な細胞毒性剤は、例えば、マイタンシノイド類、ドキソルビシン、カリチアマイシン、アドゼレシン、Ｃ−１０メチルジスルファニルプロパノイルタキソイド、カンプトテシン、ホモカンプトテシン、コルヒチン、コンブレタスタチン、ドリスタチン、メトトレキサート、ポドフィロトキシン、リゾキシン、リゾキシンＤ、タキソールおよびパクリタキセルを含む。
脂質：適当な脂質は、例えば、天然脂質、スフィンゴ脂質、リン脂質、ステロール類(例えば、コレステロール)、生理活性脂質、コエンザイムＡ(およびその誘導体)、脂肪酸修飾脂質、頭部修飾脂質、放射標識脂質、蛍光脂質(例えばＮ−(７−ニトロ−２−オキサ−１,３−ジアゾール−４−イル)ジオレオイルホスファチジルエタノールアミンおよびＮ−(リサミンローダミンＢスルホニル)−ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン)、カチオン性脂質(例えばPal, et al., in J Med Chem 54, 2378-2390 (2011)に記載のもの)および重合体脂質を含む。適当な脂質はまたAvanti Polar Lipids(Birmingham, Alabama)またはNorthern Lipids(Vancouver, BC, Canada)から購入できる。
ポリマー：適当なポリマーは、約４０kDaまでの重量平均分子量を有するポリエチレングリコール類(ＰＥＧｓ)を含む。ＰＥＧは直鎖でも分枝鎖でもよい。精製ＰＥＧは、広くまたは狭く規定された分子量(ＭＷ)範囲の種々のオリゴマーサイズの混合物として極く一般的に販売されている。例えば、“ＰＥＧ６００”は、典型的に６００ｇ／mol(または６００Da)の平均分子量を有するオリゴマーの混合物を含む調製物を意味する。同様に、“ＰＥＧ１００００”は、１０,０００ｇ／mol(または１０kDa)の平均分子量を有するＰＥＧ分子(Ｈ−[Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２]ｖ−ＯＨであって、ここで、ｖ＝１９５〜２６５である)の混合物である。２０kDa ＰＥＧについて、ｖ＝４２０〜５１０。多数のＰＥＧおよびＰＥＧ誘導体がThermo Fisher Scientific(Rockford, Illinois)およびJenkem Technology(Allen, Texas)から入手可能である。他の適当なポリマーは、多糖、ポリアルキレングリコール類、ポリビニルピロリドン類、ポリアクリレート類、ポリメタクリレート類、ポリオキサゾリン類、ポリビニルアルコール類、ポリアクリルアミド類、ポリメタクリルアミド類、ＨＰＭＡコポリマー、ポリエステル類、ポリアセタール類、ポリ(オルトエステル)類、ポリカーボネート類、ポリ(イミノカーボネート)類、ジビニルエーテル−マレイン無水物またはスチレン−マレイン無水物のコポリマーまたはポリグルタミン酸類を含む。
多糖はあらゆる多糖、特に病原性生物由来の多糖であり得る。これらの多糖のコンジュゲートは、該病原性生物が原因である感染症に対してその対象を免疫化し得る。本発明において使用するための多糖類の例を下に記載する。特に、多糖は細菌多糖、例えば細菌莢膜多糖であり得る。代表的細菌多糖を表１に記載する。
当該多糖類はオリゴ糖の形態で使用し得る。後者は、好都合には精製した多糖の断片化(例えば加水分解)により製造し、通常その後所望のサイズの断片を精製する。多糖類は天然源から精製し得る。精製に替えて、多糖類を全合成または部分合成により製造して良い。
髄膜炎菌莢膜多糖：当該多糖は細菌莢膜多糖であり得る。細菌莢膜多糖の例には髄膜炎菌由来のものが含まれる。本菌の莢膜多糖を起源に、種々の髄膜炎菌の血清型が同定されており、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、２９Ｅ、Ｗ１３５、Ｘ、ＹおよびＺを含む。本発明における多糖はこれらの血清型の何れであってもよい。典型的に、該多糖は、Ａ、Ｃ、Ｗ１３５およびＹの髄膜炎菌血清型の何れかである。
当該莢膜多糖は一般的にオリゴ糖の形態で使用される。これらは好都合には精製莢膜多糖の分解(例えば加水分解)により製造し、通常その後所望のサイズの断片を精製する。
多糖類の断片化は、典型的にオリゴ糖における最終平均重合度(ＤＰ)が３０未満(例えば血清型Ａについて１０〜２０、好ましくは約１０；血清型Ｗ１３５およびＹについて１５〜２５、好ましくは約１５〜２０；血清型Ｃについて１２〜２２など)となるように行う。ＤＰは、好都合にはイオン交換クロマトグラフィーまたは比色分析により測定できる(Ravenscroft et al. Vaccine 17, 2802-2816 (1999))。
加水分解を行ったとき、加水分解生成物を一般的に短い長さのオリゴ糖を除くように並べる(Costantino et al. Vaccine 17, 1251-1263 (1999))。これは種々の方法で、例えば限外濾過とそれに続くイオン交換クロマトグラフィーで達成できる。約６以下の重合度のオリゴ糖を、好ましくは血清型Ａについて除き、約４以下のものを、好ましくは血清型Ｗ１３５およびＹについて除く。
糖の化学的加水分解は、一般的に当分野で標準的な条件下の酸または塩基での処理を含む。莢膜多糖をその構成単糖類へ脱重合する条件は当分野で知られている。脱重合化法のひとつは過酸化水素の使用を含む(ＷＯ０２／０５８７３７)。過酸化水素を糖に添加し(例えば最終Ｈ２Ｏ２濃度１％とする)、混合物を次いで所望の鎖長減少が達成されるまで加温(例えば約５５℃で)する。経時的減少の進行は、混合物からサンプルを取り、サンプル中の糖の(平均)分子サイズを測定することにより追跡できる。脱重合化は、所望の鎖長に到達したら、急速冷却により停止できる。
血清型Ｃ、Ｗ１３５およびＹ：髄膜炎菌からの莢膜多糖の製造技術は長年知られており、典型的に多糖類の沈殿(例えばカチオン性界面活性剤使用)、エタノール分画、冷フェノール抽出(タンパク質除去のため)および超遠心分離(ＬＰＳ除去のため)の工程を含む方法に関する(例えば、Frash, Advances in Biotechnological Processes 13, 123-145 (1990)(eds. Mizrahi & Van Wezel)参照)。
より好ましい方法(ＷＯ０３／００７９８５)は、多糖類の沈殿と、続く低級アルコールを使用する沈殿多糖類の可溶化を含む。カチオン性界面活性剤、例えばテトラブチルアンモニウムおよびセチルトリメチルアンモニウム塩類(例えばブロマイド塩類)またはヘキサジメトリン(dimethrine)ブロマイドおよびミリスチルトリメチルアンモニウム塩類を使用して、沈殿を達成できる。セチルトリメチルアンモニウムブロマイド(‘ＣＴＡＢ’)が特に好ましい(Inzana, Infect. Immun. 55, 1573-1579 (1987)。沈殿物質の可溶化は、低級アルコール、例えばメタノール、プロパン−１−オール、プロパン−２−オール、ブタン−１−オール、ブタン−２−オール、２−メチル−プロパン−１−オール、２−メチル−プロパン−２−オール、ジオール類などを使用して達成できるが、エタノールがＣＴＡＢ−多糖類複合体の可溶化に特に適当である。エタノールを沈殿多糖類に添加して、５０％〜９５％の最終エタノール濃度(エタノールおよび水の総含量に基づく)とし得る。
再可溶化後、多糖類は、さらに処理して夾雑物を除去し得る。これは、わずかな夾雑も許されない状況(例えばヒトワクチン産生)で特に重要である。これは、典型的に１工程以上の濾過、例えば深層濾過、活性炭を通過させる濾過を経て実施し得る、サイズ濾過および／または限外濾過を含む。
夾雑物を除去する濾過の後、多糖類をさらなる処理および／または加工のために沈殿させ得る。これは、好都合にはカチオン交換により達成できる(例えばカルシウム塩またはナトリウム塩添加)。
精製に替えて、本発明の莢膜多糖類は、全合成または部分合成により製造され得る、例えばＨｉｂ合成がKandil et al. Glycoconj J 14, 13-17. (1997)に記載され、ＭｅｎＡ合成がBerkin et al. Chemistry 8, 4424-4433 (2002)に記載されている。
多糖は化学修飾してよく、例えばＯ−アセチル化またはデ−Ｏ−アセチル化してよい。あらゆるこのようなデ−Ｏ−アセチル化または過アセチル化は、多糖の特定位置で実施し得る。例えば、ほとんどの血清型Ｃ株はシアル酸残基のＣ−７および／またはＣ−８位にＯ−アセチル基を含むが、約１５％の臨床分離株はこれらのＯ−アセチル基を欠く(Glode et al. J Infect Dis 139, 52-56 (1979)；ＷＯ９４／０５３２５；米国特許５,４２５,９４６)。アセチル化は保護効果に影響するとは考えられない(例えばMenjugateＴＭ製品と異なって、NeisVac-CＴＭ製品はデ−Ｏ−アセチル化多糖を使用するが、いずれのワクチンも有効である)。血清型Ｗ１３５多糖はシアル酸−ガラクトース二糖単位のポリマーである。血清型Ｙ多糖は、二糖反復単位がガラクトースではなくグルコースを含む以外、血清型Ｗ１３５多糖に類似する。血清型Ｃ多糖と同様、ＭｅｎＷ１３５およびＭｅｎＹ多糖は多様なＯ−アセチル化を有するが、シアル酸７位および９位である(ＷＯ２００５／０３３１４８)。あらゆるこのような化学修飾は、好ましくはコンジュゲーション前に行うが、それに替えてにまたはそれに加えて、コンジュゲーション中に実施してもよい。
異なる血清型の多糖類は、好ましくは別に精製し、コンジュゲーション前またはコンジュゲーション後に結合させてよい。
血清型Ａ：多糖は血清型Ａ由来であり得る。多糖を血清型Ｃ、Ｗ１３５およびＹと同じ方法で精製できるが(上記参照)、構造的に異なる − 血清型Ｃ、Ｗ１３５およびＹの莢膜はシアル酸(Ｎ−アセチル−ノイラミン酸、ＮｅｕＡｃ)に基づくが、血清型Ａの莢膜はＮ−アセチル−マンノサミンに基づき、これはシアル酸の天然前駆体である。血清型Ａ多糖は、特に加水分解に感受性であり、水性媒体中の不安定性は、(ａ)血清型Ａに対する液体ワクチンの免疫原性が時間と共に低下することおよび(ｂ)ワクチンへの糖加水分解生成物の混入により品質管理がより困難となることを意味する。
天然ＭｅｎＡ莢膜多糖は(α１→６)−結合Ｎ−アセチル−Ｄ−マンノサミン−１−ホスフェートのホモポリマーであり、一部Ｃ３およびＣ４でＯ−アセチル化されている。主グリコシド結合は、Ｄ−マンノサミンのＣ１のヘミアセタール基およびＣ６のアルコール基を含む１−６ホスホジエステル結合である。平均鎖長は９３単量体である。それは次の式を有する。
天然血清型Ａ多糖の免疫原性活性を保持するが、水中ではるかに安定である修飾多糖が製造されている。単糖単位の炭素３および４に結合したヒドロキシル基が封鎖基で置換されている(ＷＯ０３／０８０６７８およびＷＯ２００８／０８４４１１)。
ヒドロキシルの代わりに封鎖基を有する単糖単位の数は変わり得る。例えば、全てまたは実質的に全ての単糖単位は封鎖基を有し得る。あるいは、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％または９０％の単糖単位は封鎖基を有し得る。少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０単糖単位は封鎖基を有し得る。
同様に、単糖単位上の封鎖基の数は変わり得る。例えば、あらゆる特定の単糖単位上の封鎖基の数は１または２であり得る。
末端単糖単位は、その天然ヒドロキシルの代わりに封鎖基を有しても有していなくてもよい。さらなる反応(例えばコンジュゲーション)の手がかりを提供するために、末端単糖単位上に遊離アノマーヒドロキシル基を維持するのが好ましい。アノマーヒドロキシル基は、還元的アミノ化(例えば、ＮａＢＨ３ＣＮ／ＮＨ４Ｃｌを使用)によりアミノ基(−ＮＨ２または−ＮＨ−Ｅであって、ここで、Ｅは窒素保護基である)に変換でき、次いで、他のヒドロキシル基を封鎖基に変換後に再生できる。
ヒドロキシル基を置き換えるための封鎖基は、直接、ヒドロキシル基上の反応を誘導化することにより、すなわちヒドロキシル基の水素原子を他の基で置き換えることにより利用可能である。封鎖基として作用するヒドロキシル基の適当な誘導体は、例えば、カルバメート類、スルホネート類、カーボネート類、エステル類、エーテル類(例えばシリルエーテル類またはアルキルエーテル類)およびアセタール類である。このような封鎖基のいくつかの具体例はアリル、Ａｌｏｃ、ベンジル、ＢＯＭ、ｔ−ブチル、トリチル、ＴＢＳ、ＴＢＤＰＳ、ＴＥＳ、ＴＭＳ、ＴＩＰＳ、ＰＭＢ、ＭＥＭ、ＭＯＭ、ＭＴＭ、ＴＨＰなどである。直接利用できず、ヒドロキシル基を完全に置き換える他の封鎖基は、Ｃ１−１２アルキル、Ｃ３−１２アルキル、Ｃ５−１２アリール、Ｃ５−１２アリール−Ｃ１−６アルキル、ＮＲ１Ｒ２(Ｒ１およびＲ２は次段落に定義)、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＯ２Ｈ、ＣＯ２(Ｃ１−６アルキル)、ＣＮ、ＣＦ３、ＣＣｌ３などを含む。
典型的封鎖基は式−Ｏ−Ｘ’−Ｙ’および−ＯＲ３であり、ここで、Ｘ’はＣ(Ｏ)、Ｓ(Ｏ)またはＳＯ２であり；ＹはＣ１−１２アルキル、Ｃ１−１２アルコキシ、Ｃ３−１２シクロアルキル、Ｃ５−１２アリールまたはＣ５−１２アリール−Ｃ１−６アルキルであり、この各々は、場合によりＦ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＯ２Ｈ、ＣＯ２(Ｃ１−６アルキル)、ＣＮ、ＣＦ３またはＣＣｌ３から独立して選択される１個、２個または３個の基で置換されていてよく；またはＹ’はＮＲ１Ｒ２であり；Ｒ１およびＲ２は独立してＨ、Ｃ１−１２アルキル、Ｃ３−１２シクロアルキル、Ｃ５−１２アリール、Ｃ５−１２アリール−Ｃ１−６アルキルから選択され；またはＲ１およびＲ２は一体となってＣ３−１２飽和ヘテロ環基を形成してよく；Ｒ３はＣ１−１２アルキルまたはＣ３−１２シクロアルキルであり、この各々は、場合によりＦ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＯ２(Ｃ１−６アルキル)、ＣＮ、ＣＦ３またはＣＣｌ３から独立して選択される１個、２個または３個の基で置換されていてよく；またはＲ３はＣ５−１２アリールまたはＣ５−１２アリール−Ｃ１−６アルキルであり、この各々は、場合によりＦ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＯ２Ｈ、ＣＯ２(Ｃ１−６アルキル)、ＣＮ、ＣＦ３またはＣＣｌ３から独立して選択される１個、２個、３個、４個または５個の基で置換されていてよい。Ｒ３がＣ１−１２アルキルまたはＣ３−１２シクロアルキルであるとき、それは典型的に錠気温とおり１個、２個または３個の基で置換されている。Ｒ１およびＲ２が一体となってＣ３−１２飽和ヘテロ環基を形成するとき、これは、Ｒ１およびＲ２が窒素原子と一体となって、３〜１２個(例えばＣ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ９、Ｃ１０、Ｃ１１、Ｃ１２)の間の任意の数の炭素原子を含む飽和ヘテロ環基を形成することを意味する。ヘテロ環基は、窒素原子意外に１個または２個のヘテロ原子(例えばＮ、ＯまたはＳ)を含み得る。Ｃ３−１２飽和ヘテロ環基の例はピロリジニル、ピペリジニル、モルホリニル、ピペラジニル、イミダゾリジニル、アゼチジニルおよびアジリジニルである。
封鎖基−Ｏ−Ｘ−Ｙおよび−ＯＲ３は、−ＯＨ基から標準誘導体化方法により、例えばヒドロキシル基とアシルハライド、アルキルハライド、スルホニルハライドなどの反応により製造できる。故に、−Ｏ−Ｘ−Ｙ中の酸素原子は通常ヒドロキシル基の酸素原子であり、−Ｏ−Ｘ−Ｙ中の−Ｘ−Ｙ基は通常ヒドロキシル基の水素原子を置き換える。
あるいは、封鎖基は置換反応、例えば光延型置換を介して利用可能である。ヒドロキシル基から封鎖基を製造するためのこれらおよび他の方法は周知である。
本発明において使用する特異的封鎖基は−ＯＣ(Ｏ)ＣＦ３(Nilsson & Svensson Carbohydrate Research 69, 292-296 (1979))およびカルバメート基ＯＣ(Ｏ)ＮＲ１Ｒ２(ここで、Ｒ１およびＲ２は独立してＣ１−６アルキルから選択される)である。典型的に、Ｒ１およびＲ２は両者ともメチルであり、すなわち封鎖基は−ＯＣ(Ｏ)ＮＭｅである２。カルバメート封鎖基はグリコシド結合に対する安定化効果を有し、穏やかな条件下で製造し得る。
特に好ましい封鎖基は−ＯＣ(Ｏ)ＣＨ３である(ＷＯ２００８／０８４４１１)。修飾髄膜炎菌血清型Ａ多糖におけるこの封鎖基を有する４位および／または３位の比率は変わり得る。例えば、封鎖基を有し得る４位の比率は約０％、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または約１００％であり得て、少なくとも８０％および約１００％が好ましい。同様に、封鎖基を有する３位の比率は約０％、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または約１００％であり得て、少なくとも８０％および約１００％が好ましい。典型的に、封鎖基を有する４位および３位の比率は、各位置でほぼ等しい。還元すると、封鎖基を有する４位対封鎖基を有する３位の比は約１：１である。しかしながら、ある態様において、封鎖基を有する４位の比率は、封鎖基を有する３位の比率に対して変わり得る。例えば、封鎖基を有する４位対封鎖基を有する３位の比は１：２０、１：１９、１：１８、１：１７、１：１６、１：１５、１：１４、１：１３、１：１２、１：１１、１：１０、１：９、１：８、１：７、１：６、１：５、１：４、１：３または１：２であり得る。同様に、封鎖基を有する３位対封鎖基を有する４位の比は１：２０、１：１９、１：１８、１：１７、１：１６、１：１５、１：１４、１：１３、１：１２、１：１１、１：１０、１：９、１：８、１：７、１：６、１：５、１：４、１：３または１：２であり得る。
典型的修飾ＭｅｎＡ多糖は、３位および４位のいずれでも少なくともｈ％の単糖単位が−ＯＨ基を有しない、ｎ個の単糖単位を含む。ｈの値は２４以上であり得る(例えば２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９８、９９または１００)、通常５０以上。不存在−ＯＨ基は、上に定義した封鎖基である。
他の典型的修飾ＭｅｎＡ多糖は、少なくともｓ個の単糖単位が３位で−ＯＨを有さず、４位で−ＯＨを有さない、単糖単位を含む。ｓの値は少なくとも１である(例えば２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０)。不存在−ＯＨ基は上に定義した封鎖基である。
本発明で使用するための適当な修飾ＭｅｎＡ多糖類は式
〔ここで、ｐは１〜１００の整数(特に５〜２５、通常１５〜２５の整数)であり；
Ｔは式(Ａ)または(Ｂ)
であり、
各Ｚ基は独立してＯＨまたは上に定義した封鎖基から選択され；
各Ｑ基は独立してＯＨまたは上に定義した封鎖基から選択され；
ＹはＯＨまたは上に定義した封鎖基から選択され；
ＥはＨまたは窒素保護基であり；
ここで、約７％を超える(例えば８％、９％、１０％以上)Ｑ基が封鎖基である。〕
を有する。ある態様において、式(Ａ)の炭素１に結合したヒドロキシル基が上に定義した封鎖基で置換されている。ある態様において、式(Ｂ)におけるＥは下に記載するリンカーまたは担体分子である。Ｅがリンカーであるとき、リンカーは担体分子と共有結合してよい。
ｐ＋２ Ｚ基の各々は互いに同一でも異なってもよい。同様に、ｎ＋２ Ｑ基は互いに同一でも異なってもよい。全てのＺ基はＯＨであり得る。あるいは、少なくとも１０％、２０、３０％、４０％、５０％または６０％のＺ基はＯＡｃであり得る。典型的に、約７０％のＺ基がＯＡｃであり、Ｚ基の残りがＯＨまたは上に定義した封鎖基である。少なくとも約７％のＱ基が封鎖基である。典型的に、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％またはさらに１００％のＱ基が封鎖基である。
グルカン：多糖はグルカンであり得る。グルカンは、とりわけ真菌細胞壁に見られるグルコース含有多糖類である。α−グルカンは、グルコースサブユニット間に１個以上のα−結合を含み、β−グルカンはグルコースサブユニット間に１個以上のβ−結合を含む。本発明に従い使用するグルカンは、β結合を含み、β結合のみを含み得る(すなわちα結合を含まない)。
グルカンは１個以上のβ−１,３−結合および／または１個以上のβ−１,６−結合を含み得る。また１個以上のβ−１,２−結合および／またはβ−１,４−結合を含み得るが、通常その唯一のβ結合はβ−１,３−結合および／またはβ−１,６−結合である。
グルカンは分枝鎖でも直鎖でもよい。
完全長天然β−グルカンは不溶性であり、メガダルトン規模の重量平均分子量を有する。本発明のコンジュゲートにおいて可溶性グルカンを使用するのが好ましい。可溶化は、長不溶性グルカンの断片化により達成し得る。これは、加水分解または、より好都合には、グルカナーゼ(例えばβ−１,３−グルカナーゼまたはβ−１,６−グルカナーゼ)での消化により達成し得る。代替法として、短鎖グルカンを、単糖構成ブロックの結合により化学的に合成し得る。
低分子量グルカン、特に重量平均分子量１００kDa未満(例えば８０、７０、６０、５０、４０、３０、２５、２０または１５kDa未満)のものが好ましい。また、例えば６０以下(例えば５９、５８、５７、５６、５５、５４、５３、５２、５１、５０、４９、４８、４７、４６、４５、４４、４３、４２、４１、４０、３９、３８、３７、３６、３５、３４、３３、３２、３１、３０、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４)のグルコース単糖単位を含むオリゴ糖の使用も可能である。この規模で、１０〜５０または２０〜４０単糖単位のオリゴ糖が好ましい。
グルカンは真菌グルカンであり得る。‘真菌グルカン’は、一般的に真菌から得られるが、特定のグルカン構造が真菌および非真菌(例えば細菌、下等植物または藻類)に見られるとき、非真菌生物を代替供給源として使用し得る。故に、グルカンはカンジダ、例えばカンジダ・アルビカンスまたはコクシジオイデス・イミチス、トリコフィトン・ベルコーズム、ブラストミセス・デルマチチジス、クリプトコッカス・ネオフォルマンス、ヒストプラズマ・カプスラーツム、サッカロマイセス・セレビシエ、南アメリカ分芽菌またはピシウム・インシディオスムの細胞壁由来であり得る。
真菌β−グルカンには種々の供給源がある。例えば、純粋β−グルカンは市販されており、例えばpustulan(Calbiochem)はUmbilicaria papullosaから精製されたβ−１,６−グルカンである。β−グルカンは、真菌細胞壁から種々の方法で精製できる。Tokunaka et al. Carbohydr Res 316, 161-172. (1999)は、ＮａＣｌＯ酸化およびＤＭＳＯ抽出を含む、例えば、細胞壁マンナンを含まない、カンジダからの水可溶性β−グルカン抽出物の製造のための２工程法を開示する。得られた生成物(‘カンジダ可溶性β−Ｄ−グルカン’または‘ＣＳＢＧ’)は主に、直鎖状β−１,６−グルカン部分を伴う直鎖状β−１,３−グルカンから成る。同様に、ＷＯ０３／０９７０９１は、CalbicansからのＧＧ−ｚｙｍの産生を開示する。カンジダ・アルビカンス由来のこのようなグルカンは、(ａ)β−１,３−グルカン側鎖を有し、平均重合度約３０のβ−１,６−グルカンおよび(ｂ)β−１,６−グルカン側鎖を有し、平均重合度約４のβ−１,３−グルカンを含む。
本発明のある態様において、グルカンは、例えばラミナリン類に見られるような幾分かのβ−１,６分枝を伴うβ−１,３−グルカンである。ラミナリン類は褐色藻類および海藻に見られる。ラミナリン類のβ(１−３)：β(１−６)比はそれぞれの起源によって変わり、例えば荒布ラミナリンでは３：２程度で低いが、マコンブラミナリンにおいては７：１程度に高い(Pang et al. Biosci Biotechnol Biochem 69, 553-8 (2005))。故に、本発明で使用するグルカンは、１.５：１〜７.５：１、例えば約２：１、３：１、４：１、５：１、６：１または７：１のβ(１−３)：β(１−６)比を有し得る。所望により、グルカンは末端マンニトールサブユニット、例えば１,１−α−結合マンニトール残基を有し得る(Read et al. Carbohydr Res. 281, 187-201 (1996))。グルカンはまたマンノースサブユニットを含み得る。
他の態様において、グルカンはカードランで見られるとおり、専らまたは主としてβ−１,３結合を含む。これらのグルカンは、他の結合を含むグルカン、特にβ−１,３結合および高い比率のβ−１,６結合を含むグルカンと比較して、良好な保護を誘導し得る。故に、グルカンはβ−１,３−結合グルコース残基のみからなってよい(例えば排他的１,３結合の直鎖状β−Ｄ−グルコピラノース)。しかし、グルカンは、所望により、β−１,３−結合グルコース残基ではない単糖残基を含んでよく、例えばそれはβ−１,６−結合グルコース残基を含んでよい。β−１,３−結合グルコース残基対これらの他の残基の比率は少なくとも８：１(例えば＞９：１、＞１０：１、＞１１：１、＞１２：１、＞１３：１、＞１４：１、＞１５：１、＞１６：１、＞１７：１、＞１８：１、＞１９：１、＞２０：１、＞２５：１、＞３０：１、＞３５：１、＞４０：１、＞４５：１、＞５０：１、＞７５：１、＞１００：１など)でなければならずおよび／またはβ−１,３結合によってのみ他の残基に結合した少なくとも５個(例えば＞５、＞６、＞７、＞８、＞９、＞１０、＞１１、＞１２、＞１３、＞１４、＞１５、＞１６、＞１７、＞１８、＞１９、＞２０、＞３０、＞４０、＞５０、＞６０など)隣接非末端残基の配列が１個以上(例えば＞１、＞２、＞３、＞４、＞５、＞６、＞７、＞８、＞９、＞１０、＞１１、＞１２など)をなければならない。“非末端”により、該残基がグルカンの遊離末端にないことを意味する。ある態様において、隣接非末端残基は、担体分子またはリンカーに結合した残基を含まない。β−１,３結合によってのみ他の残基に結合した５隣接非末端残基の存在は、例えばカンジダ・アルビカンスに対する、保護的抗体応答を提供し得る。
さらなる態様において、コンジュゲートは２個の異なるグルカンを含み、例えば最初のグルカンは１.５：１〜７.５：１のβ(１−３)：β(１−６)比を有し、第二のグルカは排他的にまたは主にβ−１,３結合を含む。例えばコンジュゲートはラミナリングルカンおよびカードラングルカンの両者を含み得る。
β−グルカンがβ−１,３およびβ−１,６結合の両者を所望の比でおよび／または配列で含むとき、このグルカンは天然で見られるかもしれず(例えばラミナリン)または人工的に製造し得る。例えば、全部または一部化学合成により製造し得る。β−１,３／β−１,６グルカンの化学合成方法は、例えばTakeo and Tei Carbohydr Res. 145, 293-306 (1986), Tanaka et al. Tetrahedron Letters 44, 3053-3057 (2003), Ning et al. Tetrahedron Letters 43, 5545-5549 (2002), Geurtsen et al. Journal of Organic Chemistry 64 (21): 7828-7835 (1999), Wu et al. Carbohydr Res. 338, 2203-12 (2003), Nicolaou et al. J. Am. Chem. Soc. 119, 449-450 (1997), Yamada et al. Tetrahedron Letters 40, 4581-4584 (1999), Yamago et al. Org. Lett. 24, 3867-3870 (2001), Yuguo et al. Tetrahedron 60, 6345-6351 (2004), Amaya et al. Tetrahedron Letters 42: 9191-9194 (2001), Mei et al. Carbohydr Res. 340, 2345-2351 (2005)から既知である。所望の比でβ−１,３およびβ−１,６結合の両者を含むβ−グルカンはまた利用可能なグルカンから出発し、β−１,６−グルカナーゼ(グルカンｅｎｄｏ−１,６−β−グルコシダーゼ、１,６−β−Ｄ−グルカングルカノヒドロラーゼなどとしても既知；EC 3.2.1.75)またはβ−１,３−グルカナーゼ(例えばｅｘｏ−１,３−グルカナーゼ(EC 3.2.1.58)またはｅｎｄｏ−１,３−グルカナーゼ(EC 3.2.1.39)で所望の比および／または配列に到達するまで処理して製造し得る。
β−１,３−結合グルコースのみを含むグルカンが所望の場合、β−１,６−グルカナーゼが最終的に純粋β−１,３−グルカンを生じるため、β−１,６−グルカナーゼ処理を完了まで行い得る。より好都合には、しかしながら、純粋β−１,３−グルカンを使用し得る。これらは、化学および／または酵素合成により、例えば、数種が多くの生物(細菌、酵母、植物および真菌を含む)で知られている(１→３)−β−Ｄ−グルカンシンターゼを使用して、合成し得る。β−１,３−グルカンの化学合成法は、例えばTakeo et al. Carbohydr Res. 245, 81-96 (1993), Jamois et al. Glycobiology 15(4), 393-407 (2005), Lefeber et al. Chem. Eur. J. 7(20): 4411-4421 (2001) and Huang et al. Carbohydr Res. 340, 603-608 (2005)から既知である。有用な別合成法として、天然β−１,３−グルカン、例えば、カードラン(以前はアルガリゲネス・フェカリス・バリエンティス・ミクソゲネス(Alcaligenes faecalis var. myxogenes)として知られていたアグロバクテリウム由来の直鎖状β−１,３−グルカン；例えばSigma-Aldrich catalog C7821から入手可能)またはパラミロン(ミドリムシ由来のβ−１,３−グルカン)を使用得る。高レベルのβ−１,３−グルカンを産生する生物は当分野で既知であり、例えば米国特許５５０８１９１またはMiKyoung et al. Biochemical Engineering Journal, 16, 163-8 (2003), or the Euglena gracilis of Barsanti et al. J Appl Phycol 13, 59-65 (2001)のアグロバクテリウム。
ラミナリンおよびカードランは、典型的に自然で例えば重量平均分子量少なくとも１００kDaの高分子量ポリマーとして見られる。それらはしばしば水性媒体に不溶である。その天然形態では、それ故に、免疫化に十分適さない。故に、本発明は短いグルカン、例えば６０以下のグルコース単糖単位(例えば５９、５８、５７、５６、５５、５４、５３、５２、５１、５０、４９、４８、４７、４６、４５、４４、４３、４２、４１、４０ ３９、３８、３７、３６、３５、３４、３３、３２、３１、３０、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４)を有するものを使用する。２〜６０の範囲のグルコース残基数、例えば１０〜５０また２０〜４０グルコース単位を有するグルカンを使用し得る。２５〜３０グルコース残基のグルカンが特に有用である。適当なグルカンは、例えば天然グルカンの酸加水分解によりまたは例えばグルカナーゼ、例えばβ−１,３−グルカナーゼでの酵素消化により形成され得る。１１〜１９、例えば１３〜１９および特に１５または１７グルコース単糖単位のグルカンも有用である。特に、次の構造(Ａ)または(Ｂ)を有するグルカンが本発明の使用に特に想起される。
(Ａ)
〔ここで、ｓ＋２は２〜６０、例えば１０〜５０または２〜４０の範囲である。好ましくは、ｓ＋２は２５〜３０または１１〜１９、例えば１３〜１７の範囲である。特に、ｓ＋２＝１５が好適である。さらに、ｓ＋２＝６が好適である。〕。
(Ｂ)
〔ここで、ｔは０〜９、例えば１〜７または２〜６の範囲である。好ましくは、ｔは３〜４または１〜３の範囲である。特に、ｔ＝２が好適である。＊および＊＊は、多糖単位の各結合点を示す。〕。
ある好ましい態様において、グルカンは５〜７グルコース単糖単位(すなわち５、６または７)を含む。特に、６グルコース単糖単位を有するグルカンが好ましいことがある。例えば、グルカンは、６グルコース単糖単位を有するカードランであり得る。
ある種の態様において、グルカンは単一分子種である。当該の態様において、全てのグルカン分子が配列の点で同一である。従って、全てのグルカン分子が、分子量などを含むその構造特性の点で同一である。典型的に、この形態のグルカンは、例えば上記方法を使用する、化学合成により得られる。あるいは、他の態様において、グルカンは、上記のとおり、例えばグルカンマコンブ、アグロバクテリウムまたはミドリムシ由来の天然グルカンであり、グルカンは必要な単一分子種が得られるまで精製している。この方法で精製された天然グルカンは市販されている。単一分子種であるグルカンは、グルカンサンプルの多分散性(Ｍｗ／Ｍｎ)で測定して同定し得る。このパラメータは好都合には、例えばBardotti et al. Vaccine 26, 2284-96 (2008)に記載のとおりＳＥＣ−ＭＡＬＬＳで測定できる。本発明のこの態様において使用するための適当なグルカンは、約１、例えば１.０１以下の多分散性を有する。
天然グルカン、例えばカードランの溶解度は、イオン性基導入(例えば、特にカードランにおけるＯ−６における硫酸化)により増大させ得る。このような修飾を本発明で使用してよいが、理想的にはグルカンの抗原性を変え得るため避ける。
多糖がグルカンであるとき、それは典型的にラミナリンである。
肺炎球菌莢膜多糖類：上記のとおり、多糖類はまた細菌莢膜多糖類であり得る。さらなる細菌莢膜多糖類の例は肺炎球菌由来のものを含む。
多糖類が肺炎球菌由来の莢膜多糖類であるとき、それは、典型的に１、２、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｎ、９Ｖ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ｂ、１７Ｆ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２０、２２Ｆ、２３Ｆおよび３３Ｆ、好ましくは１、５、６Ｂ、１４、１９Ｆおよび２３Ｆの肺炎球菌血清型の一つである。肺炎球菌由来莢膜多糖類は、８個までの糖残基を含み得る反復オリゴ糖単位を含む。主肺炎球菌血清型についてのオリゴ糖単位は上記表、Jones An. Acad. Bras. Cienc, 77(2), 293-324 (2005)およびJones, J Pharm Biomed Anal 38, 840-850 (2005)に記載されている。
ストレプトコッカス・アガラクチア莢膜多糖類：さらなる細菌莢膜多糖類の例にはストレプトコッカス・アガラクチア(“ＧＢＳ”)由来のものが含まれる。本莢膜多糖類は、ペプチドグリカン主鎖に結合している他の多糖であるＢ群抗原と異なり、ＧＢＳのペプチドグリカン主鎖に共有結合的に結合している。
ＧＢＳ莢膜多糖類は化学的には類似しているが、抗原的に極めて多様である。全てのＧＢＳ莢膜多糖類は次の三糖コアを共有する。
β−Ｄ−ＧｌｃｐＮＡｃ(１→３)β−Ｄ−Ｇａｌｐ(１→４)β−Ｄ−Ｇｌｃｐ
種々のＧＢＳ血清型は、このコアが修飾されている態様により区別される。血清型ＩａとIIIの差は、例えば、連続三糖コアを結合するためのこのコアにおいてＧｌｃＮＡｃ(Ｉａ)またはＧａｌ(III)のいずれを使用するかによって生じる。血清型ＩａおよびＩｂはいずれもコアにおけるＧｌｃＮＡｃに結合した[α−Ｄ−ＮｅｕｐＮＡｃ(２→３)β−Ｄ−Ｇａｌｐ−(１→]二糖を有するが、結合が１→４(Ｉａ)または１→３(Ｉｂ)である。
ＧＢＳ関連疾患は主に血清型Ｉａ、Ｉｂ、II、III、IV、Ｖ、VI、VIIおよびVIIIに起因し、８５％以上が４種の血清型Ｉａ、Ｉｂ、IIIおよびＶが原因である。本発明は、これらの４種の血清型の一つ由来の多糖を使用し得る。これらの４種の血清型の各々由来の莢膜多糖は、(ａ)全例でガラクトース残基に２→３で結合している末端Ｎ−アセチル−ノイラミン酸(ＮｅｕＮＡｃ)残基(一般的にシアル酸と言われる)；および(ｂ)三糖コア内のＮ−アセチル−グルコサミン残基(ＧｌｃＮＡｃ)を含む。
全４種の多糖は、三糖コア内にガラクトース残基を含むが、血清型Ｉａ、Ｉｂ、IIおよびIIIはまた各反復単位に付加的ガラクトース残基を含む。
本発明に従い使用する多糖類はその天然形態でも修飾されていてもよい。例えば、多糖類は天然莢膜多糖類より短くてよくまたは化学的に修飾されていてよい。特に、本発明で使用する血清型Ｖ莢膜多糖類は、ＷＯ２００６／０５０３４１およびGuttormsen et al. Proc Natl Acad Sci U S A. 105(15), 5903-8 (2008) Epub 2008 Mar 31に記載のとおり修飾されていてよい。例えば、実質的に脱シアル化されている血清型Ｖ莢膜多糖類。脱シアル化ＧＢＳ血清型Ｖ莢膜多糖類は、精製ＧＢＳ血清型Ｖ莢膜多糖類を、穏やかな酸性条件で処理することにより(例えば０.１Ｍ 硫酸で８０℃で６０分間)またはノイラミニダーゼで処理することにより製造し得る。故に、本発明に従い使用する多糖類は実質的に天然で見られる完全長莢膜多糖類でも、天然長より短くてもよい。完全長多糖類を脱重合して、例えば弱酸加水分解、加熱、サイジングクロマトグラフィーなどを使用して、本発明で使用する短いフラグメントとし得る。特に、本発明で使用する血清型IIおよび／またはIII莢膜多糖類は、ＷＯ９６／４０７９５およびMichon et al. Clin Vaccine Immunol. (2006) 13(8), 936-43に記載のとおり脱重合し得る。
多糖は、天然で見られる莢膜多糖に対して化学的に修飾し得る。例えば、多糖はデ−Ｏ−アセチル化(一部または完全)、デ−Ｎ−アセチル化(一部または完全)、Ｎ−プロピオン化(一部または完全)などされていてよい。デ−アセチル化はコンジュゲーションの前、途中または後で行ってよいが、好ましくはコンジュゲーションの前に行う。特定の多糖によっては、デ−アセチル化は免疫原性に影響を及ぼし、もしくは及ぼさないかもしれない。種々の血清型におけるＧＢＳ多糖に対するＯ−アセチル化の関連性はLewis et al. PNAS USA 101, 11123-8 (2004)に記載させ、ある態様においてシアル酸残基の７位、８位および／または９位のＯ−アセチル化を、コンジュゲーションの前、途中または後に、例えば保護／脱保護により、再アセチル化などにより維持する。しかしながら、典型的に本発明で使用するＧＢＳ多糖は実質的にシアル酸残基の７位、８位および／または９位にＯ−アセチル化を含まない。特に、ＧＢＳ多糖が下記のとおり塩基抽出により精製されているとき、Ｏ−アセチル化は典型的に消失する。デ−アセチル化などの効果は慣用的アッセイにより評価できる。
莢膜多糖類は、Wessels et al. Infect Immun 57, 1089-94 (1989)に記載のとおり、既知技術により精製できる。典型的方法は塩基抽出、遠心分離、濾過、ＲＮａｓｅ／ＤＮａｓｅ処理、プロテアーゼ処理、濃縮、サイズ排除クロマトグラフィー、限外濾過、アニオン交換クロマトグラフィーおよびさらなる限外濾過を含む。細菌細胞壁を分解して細胞壁成分をなくす酵素ムタノリシンでのＧＢＳ細胞の処理も有用である。
代替法として、ＷＯ２００６／０８２５２７に記載の精製方法を使用できる。これは塩基抽出、エタノール／ＣａＣｌ２処理、ＣＴＡＢ沈殿および再可溶化を含む。さらなる代替法がＷＯ２００９／０８１２７６に記載されている。
黄色ブドウ球菌莢膜多糖類：さらなる細菌莢膜多糖類の例は黄色ブドウ球菌由来のもの、特に黄色ブドウ球菌５型および８型の莢膜多糖類を含む。５型および８型莢膜多糖類の構造はMoreau et al. Carbohydrate Res. 339(5), 285-91 (1990) and Fournier et al. Infect. Immun. 45(1), 87-93 (1984)に
５型
→４)−β−Ｄ−ＭａｎＮＡｃＡ(３ＯＡｃ)−(１→４)−α−Ｌ−ＦｕｃＮＡｃ(１→３)−β−Ｄ−ＦｕｃＮＡｃ−(１→
８型
→３)−β−Ｄ−ＭａｎＮＡｃＡ(４ＯＡｃ)−(１→３)−α−Ｌ−ＦｕｃＮＡｃ(１→３)−β−Ｄ−ＦｕｃＮＡｃ−(１→
として記載されている。
最近のＮＭＲスペクトロスコピーデータ(Jones Carbohydrate Res. 340(6), 1097-106 (2005))はこれらの構造を
５型
→４)−β−Ｄ−ＭａｎＮＡｃＡ−(１→４)−α−Ｌ−ＦｕｃＮＡｃ(３ＯＡｃ)−(１→３)−β−Ｄ−ＦｕｃＮＡｃ−(１→
８型
→３)−β−Ｄ−ＭａｎＮＡｃＡ(４ＯＡｃ)−(１→３)−α−Ｌ−ＦｕｃＮＡｃ(１→３)−α−Ｄ−ＦｕｃＮＡｃ(１→
に訂正している。
多糖を、天然に見られる莢膜多糖に関して化学的に修飾し得る。
例えば、多糖はデ−Ｏ−アセチル化(一部または完全)、デ−Ｎ−アセチル化(一部または完全)、Ｎ−プロピオン化(一部または完全)などされていてよい。デ−アセチル化はコンジュゲーションの前に、途中でまたは後で行ってよいが、典型的にコンジュゲーションの前に行う。デ−アセチル化などの効果は慣用的アッセイにより評価できる。例えば、黄色ブドウ球菌５型または８型莢膜多糖類に対するＯ−アセチル化の妥当性はFattom et al. Infect Immun. 66(10): 4588-92 (1998)で検討されている。天然多糖類は、この文献で７５％Ｏ−アセチル化を有すると言われている。これらの多糖類は、多糖類主鎖およびＯ−アセチル基の両者に対する抗体を誘導した。０％Ｏ−アセチル化の多糖もまだ多糖類主鎖に対する抗体を誘導した。両タイプの抗体とも、Ｏ−アセチル含量が異なる黄色ブドウ球菌株に対してオプソニックであった。従って、本発明において使用する５型または８型莢膜多糖類は０〜１００％Ｏ−アセチル化を有し得る。
多糖類のＯ−アセチル化の程度は、当分野で知られるあらゆる方法、例えば、プロトンＮＭＲ(例えばLemercinier and Jones Carbohydrate Res. 296, 83-96 (1996), JonesおよびLemercinier, J Pharm Biomed Anal. 30(4), 1233-47 (2002)、ＷＯ０５／０３３１４８またはＷＯ００／５６３５７に記載)により決定できる。さらなる方法がHestrin J. Biol. Chem. 180, 249-261 (1949)に記載されている。類似の方法を使用して、多糖類のＮ−アセチル化の程度を決定し得る。Ｏ−アセチル基は加水分解により、例えば塩基、例えば無水ヒドラジン(Konadu et al. Infect. Immun. 62, 5048-5054 (1994))またはＮａＯＨ(Fattom et al. Infect Immun. 66(10): 4588-92 (1998))での処理により除去し得る。類似の方法をＮ−アセチル基の除去に使用し得る。５型および／または８莢膜多糖類上の高レベルのＯ−アセチル化を維持するために、Ｏ−アセチル基の加水分解に至る処理、例えば極端なｐＨでの処理を最小化する。
莢膜多糖類は、ここに記載する文献に記載された技術により精製できる。典型的方法は、黄色ブドウ球菌細胞のフェノール−エタノール不活化、遠心分離、リゾスタフィン処理、ＲＮａｓｅ／ＤＮａｓｅ処理、遠心分離、透析、プロテアーゼ処理、さらなる透析、濾過、エタノール／ＣａＣｌ２での沈殿、透析、凍結乾燥、アニオン交換クロマトグラフィー、透析、凍結乾燥、サイズ排除クロマトグラフィー、透析および凍結乾燥を含む(Fattom et al. Infect Immun. 58(7), 2367-74 (1990))。他の方法は、黄色ブドウ球菌細胞のオートクレーブ処理、多糖含有上清の限外濾過、濃縮、凍結乾燥、タイコ酸除去のためのメタ過ヨウ素酸ナトリウムでの処理、さらなる限外濾過、透析濾過、高速サイズ排除液体クロマトグラフィー、透析および凍結乾燥を含む(Gilbert et al. J. Microb. Meth. 20, 39-46 (1994))。
しかしながら本発明は天然源から精製された多糖類に限定されず、多糖類は他の方法、例えば全合成または部分合成により得てよい。
他の細菌莢膜多糖類：細菌莢膜多糖類のさらなる例は、ヘモフィルスインフルエンザｂ菌、サルモネラ・エンテリカ ティフィ Viおよびクロストリジウム・ディフィシル由来のものを含む。
ストレプトコッカス・アガラクチア炭水化物：本発明はまた非莢膜細菌多糖類も使用し得る。非莢膜細菌多糖類の例は、ストレプトコッカス・ピオゲネスＧＡＳ炭水化物(ＧＡＳ細胞壁多糖またはＧＡＳＰとしても知られる)。この多糖は、交互のアルファ−(１→２)およびアルファ−(１→３)連鎖および交互のラムノース環に結合したＤ−Ｎ−アセチルグルコサミン(ＧｌｃｐＮＡｃ)残基ベータ−(１→３)から成るＬ−ラムノピラノース(Ｒｈａｐ)主鎖を有する分枝鎖構造を特徴とする(Kreis et al. Int J Biol Macromol. 17(3-4), 117-30 (1995))。
ＧＡＳ炭水化物は一般にその天然形態であるが、修飾されていてよい。例えば、多糖は天然ＧＡＳ炭水化物より短くてよくまたは化学的に修飾されていてよい。
故に、本発明に従い使用する多糖類は、実質的に天然で見られる完全長ＧＡＳ炭水化物であってよくまたは天然長より短くてよい。完全長多糖類は、例えば弱酸加水分解、加熱、サイジングクロマトグラフィーなどにより脱重合して、本発明で使用するために短いフラグメントを提供し得る。ＧＡＳ炭水化物上の末端単位に対応すると考えられる短フラグメントがワクチンへの使用について提案されている(Hoeoeg et al., Carbohydr Res. 337(21-23), 2023-36 (2002))。従って、短フラグメントは本発明で使用されてもよい。しかしながら、実質的に完全長の多糖を使用するのが好ましい。ＧＡＳ炭水化物は、典型的に約１０kDa、特に約７.５〜８.５kDaの重量平均分子量を有する。分子量はＨＰＬＣで、例えばＳＥＣ−ＨＰＬＣで、TSK Gel G3000SWカラム(Sigma)を使用して、プルラン標準、例えばPolymer Standard Service (www.Polymer.de)から利用可能なものを対照として測定できる。
多糖類は、天然に存在するＧＡＳ炭水化物を化学的に修飾しものでもよい。例えば、多糖はデ−Ｎ−アセチル化(部分的または完全)、Ｎ−プロピオン化(部分的または完全)されていてよい。例えば免疫原性に対するデ−アセチル化などの影響は、日常的アッセイにより評価できる。
ポリペプチド：ここに記載するコンジュゲーションの方法は、少なくとも１個のチロシン単位を含むあらゆるポリペプチドを使用して実施できる。一般的に、ポリペプチドは１０kDa以上の重量平均分子量を有する。一つの態様において、分子量は約１０kDa〜約２,０００kDaである。他の態様において、分子量は約１０kDa〜約１００kDaである。さらに別の態様において、分子量は約２０kDa〜約７５kDaである。
ある態様において、目的のポリペプチドは、その配列内に既に１個以上のチロシン残基を含む。ある態様において、目的のポリペプチドは天然にはチロシン残基を含まないが、当該残基は配列に導入され得る。チロシン残基は、ポリペプチド配列に、例えば、遺伝子工学的手法により、例えば、置換、変異または挿入により容易に挿入できる。ポリペプチド中のチロシン残基は、当分野で知られるあらゆる技法、例えば、配列決定法により同定できる。
ある態様において、目的のポリペプチドは抗体またはその抗原結合フラグメントである。“抗体”は、非共有結合的、可逆的、そして特異的方法で、対応する抗原と結合できる免疫グロブリンファミリーのポリペプチドを意味する。典型的な抗体構造単位は四量体を含む。各四量体は、２個の同一のポリペプチド鎖ペアから成り、各ペアはジスルフィド結合を介して結合した１個の“軽”鎖(約２５kDa)および１個の“重”鎖(約５０〜７０kDa)を有する。認識される免疫グロブリン遺伝子は、κ、λ、α、γ、δ、εおよびμ定常領域遺伝子、ならびに無数の免疫グロブリン可変領域遺伝子を含む。軽鎖はκまたはλとして分類される。重鎖はγ、μ、α、δまたはεとして分類され、これは次いでそれぞれＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＥである免疫グロブリンクラスを規定する。各鎖のＮ末端は、抗原認識を主に担う約１００〜１１０以上のアミノ酸の可変領域を規定する。用語可変軽鎖(ＶＬ)および可変重鎖(ＶＨ)は、それぞれ軽鎖および重鎖のこれらの領域を意味する。本明細書で使用する“抗体”は、特定の結合特異性を有する抗体の全ての変異体を包含する。故に、この概念の範囲内に入るのは、例えば、同じ結合特異性の完全長抗体、キメラ抗体およびヒト化またはヒト抗体およびこれらの抗体フラグメントの多量体バージョン(例えば、二重特異性抗体を含む多特異性抗体、多価抗体)である。
抗体は無傷の免疫グロブリンとしてまたは種々のペプチダーゼ群での消化により産生された多くのよく特徴付けられたフラグメントとして存在できる。故に、例えば、ペプシンは、抗体をヒンジ領域におけるジスルフィド結合の下位で消化し、ジスルフィド結合によりＶＨ−ＣＨ１に結合した軽鎖であるＦａｂ’の二量体であるＦ(ａｂ)’２を生じる。Ｆ(ａｂ)’２はヒンジ領域におけるジスルフィド結合を開裂するために緩和な条件下で還元でき、それによりＦ(ａｂ)’２二量体をＦａｂ’単量体に変換する。Ｆａｂ’単量体は、本質的にヒンジ領域部分を伴うＦａｂである。Paul, Fundamental Immunology 3d ed. (1993)。種々の抗体フラグメントが無傷の抗体の消化条件で定義されているが、当業者は、このようなフラグメントを化学的にまたは組み換えＤＮＡの方法を使用してデノボ合成できることを理解している。本明細書で使用する“抗体フラグメント”は、特定の結合特異性有する抗体フラグメントの全ての変異体を包含する。故に、この概念の範囲内に入るのは、例えば、一本鎖抗体(ＳｃＦｖ)、Ｆａｂ、Ｆａｂ’およびこれらのフラグメントの多量体バージョン(例えば、Ｆ(ａｂ’)２)である。
モノクローナルまたはポリクローナル抗体の製造のために、当分野で知られるあらゆる技術を使用できる(例えば、Kohler & Milstein, Nature 256: 495-497 (1975); Kozbor et al., Immunology Today 4: 72 (1983); Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, pp. 77-96. Alan R. Liss, Inc. 1985参照)。一本鎖抗体産生のための技術(米国特許４,９４６,７７８)を本抗体の産生に応用できる。また、トランスジェニックマウスまたは他の生物、例えば他の哺乳動物をヒト化抗体の発現に使用し得る。あるいは、ファージディスプレイ技術を、選択した抗原に特異的に結合する抗体およびヘテロマーＦａｂフラグメントの同定に使用できる(例えば、McCafferty et al., supra; Marks et al., Biotechnology, 10: 779-783, (1992)参照)。
一つの態様において、ここに記載するコンジュゲーションの方法は１個以上のチロシン残基をそのＦｃ領域に含む抗体を使用する。他の態様において、ここに記載するコンジュゲーションの方法は、Ｆｃ領域の一カ所以上の特定の位置に１個以上のチロシン残基が挿入された抗体を使用する。
ある態様において、本ポリペプチドは抗原性ペプチドである。
ある態様において、特にＲが多糖であるとき、本ポリペプチドは担体分子である。一般に、多糖類の担体への共有結合的コンジュゲーションは、多糖類をＴ非依存性抗原からＴ依存性抗原に変換して多糖類の免疫原性を高め、免疫記憶のプライミングを可能にする。コンジュゲーションは、特に小児科ワクチンに有用であり(例えばRamsay et al. Lancet 357(9251): 195-196 (2001)参照)、周知の技術である(Lindberg Vaccine 17 Suppl 2: S28-36 (1999), Buttery & Moxon, J R Coll Physicians Lond 34, 163-168 (2000), Ahmad & Chapnick, Infect Dis Clin North Am 13: 113-33, vii (1999), Goldblatt J. Med. Microbiol. 47, 563-567 (1998)、欧州特許０４７７５０８、米国特許５,３０６,４９２、ＷＯ９８／４２７２１、Dick et al. Conjugate Vaccines (eds. Cruse et al.) Karger, Basel, 10, 48-114 (1989) and Hermanson Bioconjugate Techniques, Academic Press, San Diego (1996) ISBN: 0123423368におけるレビュー参照)。
好ましいキャリアタンパク質は細菌毒素、例えばジフテリアまたは破傷風毒素またはそのトキソイドまたは変異体、例えばCRM197ジフテリア毒素変異体である(Research Disclosure, 453077 (Jan 2002))。緑膿菌外毒素Ａ(ＥＴＡ)およびその非毒性変異体組み換えエキソプロテインＡ(ｒＥＰＡ)が黄色ブドウ球菌５型または８型莢膜多糖類のキャリアタンパク質として使用されている(Fattom et al. Infect Immun. 58(7), 2367-74 (1990 and Fattom et al. Infect Immun. 60(2), 584-9 (1992))。黄色ブドウ球菌α−ヘモリシン(α−トキシン)(Reynaud-Rondier et al. FEMS Microbiology Immunology 76, 193-200 (1991) and Herbelin et al. J Dairy Sci. 80(9): 2025-34 (1997))、卵白アルブミン(Gilbert et al. Vaccine 12(4), 369-74)およびヒト血清アルブミン(Tollersrud et al. Vaccine 19(28-29), 3896-903 (2001))も使用されている。これらの担体を本発明において使用してよい。
他の適当なキャリアタンパク質は、髄膜炎菌外膜タンパク質複合体(ＥＰ−Ａ−０３７２５０１)、合成ペプチド(ＥＰ−Ａ−０３７８８８１、ＥＰ−Ａ−０４２７３４７)、熱ショックタンパク質(ＷＯ９３／１７７１２、ＷＯ９４／０３２０８)、百日咳タンパク質(ＷＯ９８／５８６６８、ＥＰ−Ａ−０４７１１７７)、サイトカイン(ＷＯ９１／０１１４６)、リンホカイン類(ＷＯ９１／０１１４６)、ホルモン(ＷＯ９１／０１１４６)、増殖因子(ＷＯ９１／０１１４６)、ヒト血清アルブミン(典型的に組み換え)、種々の病原体由来抗原からの複数ヒトＣＤ４＋ Ｔ細胞エピトープを含む人工タンパク質(Falugi et al. Eur J Immunol 31, 3816-3824 (2001))、例えばＮ１９(Baraldo et al. Infect Immun 72(8), 4884-7 (2004))、インフルエンザ菌由来のタンパク質Ｄ(ＥＰ−Ａ−０５９４６１０、Ruan et al. J Immunol 145, 3379-3384 (1990)およびＷＯ００／５６３６０)、肺炎球菌表面タンパク質ＰｓｐＡ(ＷＯ０２／０９１９９８)、ニューモリシン(Kuo et al. Infect Immun 63, 2706-13 (1995))またはその非毒性誘導体(Michon et al. Vaccine. 16, 1732-41 (1998))、鉄取り込みタンパク質(ＷＯ０１／７２３３７)、クロストリジウム・ディフィシルのトキシンＡまたはＢ(ＷＯ００／６１７６１)、ＧＢＳタンパク質(ＷＯ２００４／０４１１５７)、ＧＡＳタンパク質(ＷＯ０２／３４７７１)などを含む。
他の適当なキャリアタンパク質は黄色ブドウ球菌タンパク質抗原を含む。
例えば担体抑制の危険性を減らすために、１個を超えるキャリアタンパク質を使用することが可能である。特定の多糖抗原に対して１個を超えるキャリアタンパク質を使用することも可能である。典型的に、しかしながら、全多糖に対して同じキャリアタンパク質を使用する。
単一キャリアタンパク質は１個を超える多糖類抗原を運搬するはずである(ＷＯ９９／４２１３０およびＷＯ２００４／０１１０２７)。この目標を達成するために、種々の多糖をコンジュゲーションの方法の前に混合する。典型的に、しかしながら、各多糖に対して別のコンジュゲートが存在し、種々の多糖をコンジュゲーション後に混合する。種々のコンジュゲートが同じ担体に基づき得る。
一つの具体的態様において、本ポリペプチドはCRM197またはキモトリプシノーゲンＡである。
コンジュゲート含有医薬組成物
本発明は、(ａ)式(Ｉ)のコンジュゲートおよび(ｂ)薬学的に許容される担体を含む医薬組成物を提供する。かかる担体の包括的な解説はGennaro (2000) Remington: The Science and Practice of Pharmacy. 20th edition, ISBN: 0683306472で見ることができる。
本発明の組成物は種々の形態に製造し得る。例えば、本組成物は注射可能な、溶液または懸濁液として製造し得る。注射前に、液体媒体に溶解または懸濁するために適切な固体形態も製造し得る。本組成物は、また局所投与のために、例えば軟膏、クリームまたは粉末として製造し得る。本組成物は経口投与のために、例えば錠剤またはカプセル剤としてまたはシロップ剤(所望により風味づけされていてよい)として製造される。本組成物は、肺投与のために、例えば吸入器による、微粉末またはスプレーとして製造し得る。本組成物は坐薬または腟坐薬として製造し得る。本組成物は経鼻、耳内または眼内投与のために、例えば滴剤、スプレーまたは粉末として製造できる[例えばAlmeida & Alpar (1996) J. Drug Targeting 3: 455-467]。本組成物は口腔洗浄薬に包含されていてよい。組成物は凍結乾燥してよい。
医薬組成物は、好ましくは無菌である。好ましくは無発熱物質である。好ましくは例えばｐＨ６〜ｐＨ８、一般的に約ｐＨ７に緩衝化されている。
本発明はまた医薬本発明の組成物を含む送達デバイスも提供する。本デバイスは、例えば、シリンジまたは吸入器であり得る。
式(Ｉ)のコンジュゲートを含む医薬組成物は、特に抗原性ペプチドまたは病原性生物由来の多糖類を含むとき、免疫学的有効量の抗原を含む点で、好ましくは免疫原性組成物である。‘免疫学的有効量’により、その量の個体への１回量または連続投与の一部としての投与が、処置または予防に有効であることを意味する。この量は、処置する個体の健康および身体状態、年齢、分類学的群(例えば非ヒト霊長類、霊長類など)、抗体を産生する個体免疫系の能力、所望の保護の程度、ワクチンの製剤、医学的状況の処置医の評価および他の関連因子により変わる。本量は、慣用の治験を介して決定できる比較的広い範囲内に入ることが予測される。投与量処置は単回投与スケジュールまたは複数投与スケジュール(例えばブースター投与量を含む)であり得る。本組成物は他の免疫調節剤と投与し得る。
製剤したら、本発明の組成物を対象に直接投与できる。処置する対象は動物であってよく、特に、ヒト対象を処置できる。
本発明の免疫原性組成物は治療的に(すなわち既にある感染を処置するために)または予防的に(すなわち将来の感染を予防するために)使用し得る。治療的免疫化は、免疫不全対象におけるカンジダ感染処置に特に有用である。
免疫原性組成物は、本組成物を投与された患者で誘発される免疫応答(液性および／または細胞性)を亢進するために機能するさらなるアジュバントを含み得る。本発明で使用できるアジュバントは次のものを含むが、これらに限定されない。
・ カルシウム塩類およびアルミニウム塩類(またはその混合物)を含む、鉱物含有組成物。カルシウム塩類はリン酸カルシウムを含む(例えば米国特許６３５５２７１に開示された“ＣＡＰ”粒子)。アルミニウム塩類は、水酸化物、リン酸塩類、硫酸塩類などを含み、塩類はあらゆる適当な形態を取り得る(例えばゲル、結晶、非晶質など)。これらの塩類への吸着が好ましい。鉱物含有組成物は金属塩の粒子としても製剤し得る[ＷＯ００／２３１０５]。水酸化アルミニウムおよびリン酸アルミニウムとして知られるアジュバントを使用し得る。これらの名称は慣習的であるが、存在する実際の化合物の正確な名称でなくても、単に便宜上使用される(例えば Vaccine Design: The Subunit and Adjuvant Approach (eds. Powell & Newman) Plenum Press 1995 (ISBN 0-306-44867-X)の７章参照)。本発明は、一般にアジュバントとして使用されるあらゆる“ヒドロキシド”または“ホスフェート”アジュバントを使用できる。“アルミニウムヒドロキシド”として知られるアジュバントは、典型的にアルミニウムオキシヒドロキシド塩類であり、これは通常少なくとも部分的に結晶である。“アルミニウムホスフェイト”として知られるアジュバントは典型的にアルミニウムオキシヒドロキシド類であり、しばしば少量の硫酸を含む(すなわちアルミニウムオキシヒドロキシドスルフェイト)。それらは沈殿により得られ、沈殿中の反応条件および濃縮が、塩におけるホスフェートのヒドロキシルへの置換度に影響する。本発明は、アルミニウムヒドロキシドおよびアルミニウムホスフェイトの両者の混合物を使用できる。この場合、ヒドロキシドよりも多いアルミニウムホスフェイトが存在でき、例えば少なくとも２：１、例えば≧５：１、≧６：１、≧７：１、≧８：１、≧９：１などの重量比である。患者に投与するための組成物におけるＡｌ＋＋＋濃度は、好ましくは１０mg／ml未満、例えば≦５mg／ml、≦４mg／ml、≦３mg／ml、≦２mg／ml、≦１mg／mlなどである。好ましい範囲は０.３〜１mg／mlである。最大０.８５mg／投与量が好ましい。
・ 広範囲の植物の樹皮、葉、幹、根および花にさえ見られるステロール配糖体およびトリテルペノイド配糖体の異種構造群であるサポニン類[Vaccine Design: The Subunit and Adjuvant Approach (eds. Powell & Newman) Plenum Press 1995 (ISBN 0-306-44867-X)のチャプター２２。]。シャボンノキの樹皮由来のサポニンがアジュバントとして広く試験されている。サポニンはまたSmilax ornata(sarsaprilla)、Gypsophilla paniculata(brides veil)およびSaponaria officianalis(soap root)から生産することもできる。サポニンアジュバント製剤は精製製剤、例えばＱＳ２１、ならびに脂質製剤、例えばＩＳＣＯＭｓを含む。ＱＳ２１はStimulonＴＭとして市販されている。サポニン組成物は、ＨＰＬＣおよびＲＰ−ＨＰＬＣを使用して精製されている。これらの方法を使用した特異的精製フラクションは同定されており、ＱＳ７、ＱＳ１７、ＱＳ１８、ＱＳ２１、ＱＨ−Ａ、ＱＨ−ＢおよびＱＨ−Ｃを含む。好ましくは、サポニンはＱＳ２１である。ＱＳ２１の製造方法はＵＳ５,０５７,５４０に開示されている。サポニン製剤はまたステロール、例えばコレステロールを含み得る[ＷＯ９６／３３７３９]。サポニン類とコレステロール類の組み合わせを使用して、免疫賦活性複合体(ＩＳＣＯＭｓ)と呼ばれる独特な粒子を形成し得る[Vaccine Design: The Subunit and Adjuvant Approach (eds. Powell & Newman) Plenum Press 1995 (ISBN 0-306-44867-X)の２３章]。ＩＳＣＯＭは、典型的にまたリン脂質、例えばホスファチジルエタノールアミンまたはホスファチジルコリンを含む。あらゆる既知のサポニンをＩＳＣＯＭに使用できる。好ましくは、ＩＳＣＯＭはＱｕｉｌＡ、ＱＨＡおよびＱＨＣの１種以上を含む。ＩＳＣＯＭｓは、さらにＷＯ９６／３３７３９およびＥＰ−Ａ−０１０９９４２に開示されている。所望により、ＩＳＣＯＭＳは、付加的界面活性剤が欠けている[ＷＯ００／０７６２１]。サポニンベースのアジュバントの開発についてのレビューは、Barr et al. (1998) Advanced Drug Delivery Reviews 32: 247-271 and Sjolanderet et al. (1998) Advanced Drug Delivery Reviews 32: 321-338に見ることができる。
・ 細菌ＡＤＰリボシル化毒素(例えば大腸菌熱不安定性エンテロトキシン“ＬＴ”、コレラトキシン“ＣＴ”または百日咳トキシン“ＰＴ”)およびその解毒誘導体、例えばＬＴ−Ｋ６３およびＬＴ−Ｒ７２として知られる変異体毒素[Pizza et al. (2000) Int J Med Microbiol 290: 455-461]。解毒ＡＤＰリボシル化毒素の粘膜アジュバントとしての使用はＷＯ９５／１７２１１におよび非経腸アジュバントは記載されている。
・ 生体接着材および粘膜付着材、例えばエステル化ヒアルロン酸マイクロスフェア[Singh et al](2001) J Cont Release 70: 267-276]またはキトサンおよびその誘導体[ＷＯ９９／２７９６０]。
・ 生分解性および非毒性(例えばポリ(α−ヒドロキシ酸)、ポリヒドロキシ酪酸、ポリオルトエステル、ポリ無水物、ポリカプロラクトンなど)の物質から形成された微小粒子(すなわち直径〜１００nmから〜１５０μm、より好ましくは直径〜２００nmから〜３０μmまたは直径〜５００nmから〜１０μmの有し)であって、ポリ(ラクチド−コ−グリコリト)が好ましく、所望により負に荷電した表面(例えばＳＤＳで)または正に荷電した表面(例えばカチオン性界面活性剤、例えばＣＴＡＢで)を有するように処理されている。
・ リポソーム類(Vaccine Design: The Subunit and Adjuvant Approach (eds. Powell & Newman) Plenum Press 1995 (ISBN 0-306-44867-X)の１３章および１４章)。アジュバントとして使用するのに適当なリポソーム製剤の例はＵＳ６,０９０,４０６、ＵＳ５,９１６,５８８およびＥＰ−Ａ−０６２６１６９に記載されている。
・ ムラミルペプチド、例えばＮ−アセチルムラミル−Ｌ−スレオニル−Ｄ−イソグルタミン(“ｔｈｒ−ＭＤＰ”)、Ｎ−アセチル−ノルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン(ｎｏｒ−ＭＤＰ)、Ｎ−アセチルグルコサミニル−Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−Ａｌ−Ｄ−ｉｓｏｇｌｕ−Ｌ−Ａｌａ−ジパルミトオキシプロピルアミド(“ＤＴＰ−ＤＰＰ”または“TheramideＴＭ)、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニル−Ｌ−アラニン−２−(１’−２’ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ)−エチルアミン(“ＭＴＰ−ＰＥ”)。
・ ポリオキシドニウム(polyoxidonium)ポリマー[Dyakonova et al. (2004) Int Immunopharmacol 4(13): 1615-23]または他のＮ−酸化ポリエチレン−ピペラジン誘導体。
・ メチルイノシン５’−モノホスフェート(“ＭＩＭＰ”)[Signorelli & Hadden (2003) Int Immunopharmacol 3(8): 1177-86]。
・ 多ヒドロキシル化ピロリジジン化合物[ＷＯ２００４／０６４７１５]、例えば式
〔ここで、Ｒは水素、直鎖または分枝鎖、非置換または置換、飽和または不飽和アシル、アルキル(例えばシクロアルキル)、アルケニル、アルキニルおよびアリール基から選択される。〕
を有するものまたはその薬学的に許容される塩または誘導体。例はカスアリン、カスアリン−６−α−Ｄ−グルコピラノース、３−エピ−カスアリン、７−エピ−カスアリン、３,７−ジエピ−カスアリンなどを含むが、これらに限定されない。
・ ＣＤ１ｄリガンド、例えばα−グリコシルセラミド(De Libero et al, Nature Reviews Immunology, 2005, 5: 485-496、米国特許５,９３６,０７６、Oki et al, J. Clin. Investig., 113: 1631-1640およびＵＳ２００５／０１９２２４８(例えばα−ガラクトシルセラミド))、フィトスフィンゴシン含有α−グリコシルセラミド類、ＯＣＨ、ＫＲＮ７０００[(２Ｓ,３Ｓ,４Ｒ)−１−Ｏ−(α−Ｄ−ガラクトピラノシル)−２−(Ｎ−ヘキサコサノイルアミノ)−１,３,４−オクタデカントリオール]、ＣＲＯＮＹ−１０１、３’’−Ｏ−スルホ−ガラクトシルセラミドなど。
・ ガンマイヌリン[Cooper (1995) Pharm Biotechnol 6: 559-80]またはその誘導体、例えばアルガムリン(algammulin)。
・ 水中油型エマルジョン。種々のこのようなエマルジョンは知られており、典型的に少なくとも１個の油および少なくとも１個の界面活性剤を含み、油および界面活性剤は生分解性(代謝可能)および生体適合性である。エマルジョン中の油滴は一般的に直径５μm未満であり、直径サブミクロンでさえあってよく、これらの小サイズは、安定なエマルジョンを提供するためのマイクロフルイダイザーにより達成される。２２０nm未満の液滴サイズが、濾過滅菌に付すことができるために、好ましい。
・ 免疫刺激性オリゴヌクレオチド、例えばＣｐＧモチーフ(グアノシン残基にリン酸結合により結合した非メチル化シトシン残基を含むジヌクレオチド配列)またはＣｐＩモチーフ(イノシンに結合したシトシンを含むジヌクレオチド配列)を含むものまたはパリンドローム配列を含む二本鎖ＲＮＡまたはオリゴヌクレオチドまたはポリ(ｄＧ)配列を含むオリゴヌクレオチド。免疫刺激性オリゴヌクレオチドはヌクレオチド修飾／類似体、例えばホスホロチオエート修飾を含んでよく、二本鎖または(ＲＮＡ以外)一本鎖であってよい。ＷＯ９９／６２９２３、ＷＯ０２／２６７５７およびKandimalla et al. (2003) Nucleic Acids Research 31: 2393-2400は、可能なアナログ置換、例えばグアノシンの２’−デオキシ−７−デアザグアノシンでの置換を記載する。ＣｐＧオリゴヌクレオチドのアジュバント効果はさらにKrieg (2003) Nature Medicine 9: 831-835, McCluskie et al. (2002) FEMS Immunology and Medical Microbiology 32: 179-185、ＷＯ９８／４０１００および米国特許６,２０７,６４６に記載されている。ＣｐＧ配列はＴＬＲ９、例えばモチーフＧＴＣＧＴＴまたはＴＴＣＧＴＴを指向してよい[Kandimalla et al. (2003) Biochemical Society Transactions 31 (part 3): 654-658]。ＣｐＧ配列は、Ｔｈ１免疫応答の誘導に特異的であってよく、例えばＣｐＧ−Ａ ＯＤＮ(オリゴデオキシヌクレオチド)であるかまたはＢ細胞応答の誘発により特異的であってよく、例えばＣｐＧ−Ｂ ＯＤＮである。ＣｐＧ−ＡおよびＣｐＧ−Ｂ ＯＤＮｓはBlackwell et al. (2003) J Immunol 170: 4061-4068, Krieg (2002) Trends Immunol 23: 64-65およびＷＯ０１／９５９３５に議論されている。
・ 好ましくは、ＣｐＧはＣｐＧ−Ａ ＯＤＮである。好ましくは、ＣｐＧオリゴヌクレオチドは、５’末端が受容体認識のためにアクセス可能であるように構築する。所望により、２個のＣｐＧオリゴヌクレオチド配列をその３’末端で結合して、“イムノマー”を形成してよい。例えば、Kandimalla et al. (2003) Biochemical Society Transactions 31 (part 3): 654-658 and Bhagat et al. (2003) BBRC 300: 853-861参照。有用なＣｐＧアジュバントはＣｐＧ７９０９であり、ProMuneＴＭとしても知られる(Coley Pharmaceutical Group, Inc．)。他はＣｐＧ１８２６である。ＣｐＧ配列使用の代替としてまたは加えて、ＴｐＧ配列を使用でき[ＷＯ０１／２２９７２]、これらのオリゴヌクレオチドは非メチル化ＣｐＧモチーフを含まなくてよい。免疫刺激性オリゴヌクレオチドはピリミジン・リッチであり得る。例えば、１個を超える連続チミジンヌクレオチド(例えばＷＯ０１／２２９７２に開示のＴＴＴＴ)を含んでよくおよび／または＞２５％チミジン(例えば＞３５％、＞４０％、＞５０％、＞６０％、＞８０％など)のヌクレオチド組成を含んでよい。例えば、１個を超える連続的シトシンヌクレオチド(例えばＷＯ０１／２２９７２に開示のＣＣＣＣ)を含んでよくおよび／または＞２５％シトシン(例えば＞３５％、＞４０％、＞５０％、＞６０％、＞８０％など)のヌクレオチド組成を有してよい。これらのオリゴヌクレオチドは非メチル化ＣｐＧモチーフを含まなくてよい。免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、典型的に少なくとも２０ヌクレオチドを含む。それらは１００個より少ないヌクレオチドを含み得る。
免疫刺激性オリゴヌクレオチド類に基づく特に有用なアジュバントはＩＣ３１ＴＭとして知られる[Schellack et al. (2006) Vaccine 24: 5461-72]。故に、本発明と共に使用するアジュバントは、(ｉ)少なくとも１個の(そして好ましくは複数の)ＣｐＩモチーフを含むオリゴヌクレオチド(例えば１５〜４０ヌクレオチド)および(ii)少なくとも１個の(そして好ましくは複数の)Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ三ペプチド配列を含むポリカチオン性ポリマー、例えばオリゴペプチド(例えば５〜２０アミノ酸)の混合物を含み得る。オリゴヌクレオチドは、２６量体配列５’−(ＩＣ)１３−３’(配列番号１)を含むデオキシヌクレオチドであってよい。ポリカチオン性ポリマーは、１１量体アミノ酸配列ＫＬＫＬＬＬＬＬＫＬＫ(配列番号２)を含むペプチドであってよい。
・ ３−Ｏ−デアシル化モノホスホリル脂質Ａ(‘３ｄＭＰＬ’、‘ＭＰＬＴＭ’としても既知)(Myers et al. (1990) pages 145-156 of Cellular and molecular aspects of endotoxin reactions, Johnson et al. (1999) J Med Chem 42: 4640-9 and Baldrick et al. (2002) Regulatory Toxicol Pharmacol 35: 398-413)。水性条件で、３ｄＭＰＬは、種々のサイズ、例えば直径＜１５０nmまたは＞５００nmのミセル凝集体または粒子を形成できる。これらのいずれかまたは両者を本発明と共に使用でき、良好な粒子を日常的アッセイにより選択できる。小さい粒子(例えば３ｄＭＰＬの透明水性懸濁液を提供するのに十分小さい)が、その優れた活性のために本発明において使用するのに好ましい[ＷＯ９４／２１２９２]。好ましい粒子は、平均直径２２０nm未満、より好ましくは２００nm未満、１５０nm未満、１２０nm未満を有し、１００nm未満の平均直径でさえ有し得る。ほとんどの場合、しかしながら、平均直径は５０nmより小さくない。
・ イミダゾキノリン化合物、例えばイミキモド(“Ｒ−８３７”)[ＵＳ４,６８０,３３８、ＵＳ４,９８８,８１５]、レシキモド(“Ｒ−８４８”)[ＷＯ９２／１５５８２]およびそれらの類似体；およびそれらの塩類(例えば塩酸塩類)。免疫刺激性イミダゾキノリン類についてのさらなる詳細は、Stanley (2002) Clin Exp Dermatol 27: 571-577, Vasilakos et al. (2000) Cell Immunol. 204(1): 64-74 and Jones (2003) Curr Opin Investig Drugs 4: 214-218に見ることができる。
・ チオセミカルバゾン化合物、例えばＷＯ２００４／０６０３０８に開示のもの。活性化合物の製剤、製造およびスクリーニングのための方法はＷＯ２００４／０６０３０８に開示されている。チオセミカルバゾン類は、サイトカイン、例えばＴＮＦ−αの産生のためにヒト末梢血単核細胞を刺激するのに特に有効である。
・ トリプタントリン化合物、例えばＷＯ２００４／０６４７５９に開示のもの。活性化合物の製剤、製造およびスクリーニングのための方法はまたＷＯ２００４／０６４７５９に開示されている。チオセミカルバゾン類は、サイトカイン、例えばＴＮＦ−αの産生のためにヒト末梢血単核細胞を刺激するのに特に有効である。
・ ヌクレオシド類似体、例えば(ａ)イサトラビン(ANA-245；７−チア−８−オキソグアノシン)
およびそのプロドラッグ；(ｂ)ＡＮＡ９７５；(ｃ)ＡＮＡ−０２５−１；(ｄ)ＡＮＡ３８０；(ｅ)ＵＳ６,９２４,２７１およびＵＳ２００５／００７０５５６に開示の化合物、ロキソリビン(７−アリル−８−オキソグアノシン)[米国特許５,０１１,８２８]。
・ アシルピペラジン化合物、インドールジオン化合物、テトラヒドライソキノリン(ＴＨＩＱ)化合物、ベンゾシクロジオン化合物、アミノアザビニル化合物、アミノベンゾイミダゾールキノリノン(ＡＢＩＱ)化合物[ＷＯ２００４／８７１５３、ＷＯ０２／１８３８３]、ヒドラフタルアミド化合物、ベンゾフェノン化合物、イソキサゾール化合物、ステロール化合物、キナゾリノン化合物、ピロール化合物[ＷＯ２００４／０１８４５５]、アントラキノン化合物、キノキサリン化合物、トリアジン化合物、ピラゾロピリミジン化合物およびベンズアゾール化合物[ＷＯ０３／０８２２７２]を含むＷＯ２００４／８７１５３に開示の化合物。
・ アミノアルキルグルコサミニドホスフェート誘導体、例えばＲＣ−５２９[Johnson et al. (1999) Bioorg Med Chem Lett 9: 2273-2278 and Evans et al. (2003) Expert Rev Vaccines 2: 219-229]。
・ ホスファゼン、例えば、Andrianov et al. (1998) Biomaterials 19: 109-115 and Payne et al. (1998) Adv Drug Delivery Review 31: 185-196に開示の、例えばポリ[ジ(カルボキシラトフェノキシ)ホスファゼン](“ＰＣＰＰ”)。
・ ＷＯ０３／０１１２２３に定義された置換ウレアまたは式Ｉ、IIまたはIIIの化合物またはその塩
例えば‘ER 803058’、‘ER 803732’、‘ER 804053’、‘ER 804058’、‘ER 804059’、‘ER 804442’、‘ER 804680’、‘ER 804764’、‘ER 803022または‘ER 804057’、例えば
・ 大腸菌由来の脂質Ａの誘導体、例えばＯＭ−１７４(Meraldi et al. (2003) Vaccine 21: 2485-2491 & Pajak et al. (2003) Vaccine 21: 836-842に記載)。
・ ホスフェート含有非環式主鎖に結合した脂質を含む化合物、例えばＴＬＲ４アンタゴニストＥ５５６４[Wong et al. (2003) J Clin Pharmacol 43(7): 735-42]。
これらおよび他のアジュバント活性物質はVaccine Design: The Subunit and Adjuvant Approach (eds. Powell & Newman) Plenum Press 1995 (ISBN 0-306-44867-X)により詳細に記載されている。
組成物における抗原およびアジュバントは典型的に混合されている。
本組成物は２種以上の該アジュバントを含み得る。例えば、有利に水中油型エマルジョンおよび３ｄＭＰＬの両者などを含み得る。
本発明で用いるのに有用な特異的水中油型エマルジョンアジュバントは、次のものを含むが、これらに限定されない。
・ スクアレン、Tween 80およびSpan 85のサブミクロンエマルジョン。エマルジョンの体積による組成は、約５％スクアレン、約０.５％ポリソルベート８０および約０.５％Span 85であり得る。重量の観点で、これらの比は４.３％スクアレン、０.５％ポリソルベート８０および０.４８％Span 85となる。このアジュバントは‘ＭＦ５９’として知られ[ＷＯ９０／１４８３７およびPodda & Del Giudice (2003) Expert Rev Vaccines 2: 197-203]、Vaccine Design: The Subunit and Adjuvant Approach (eds. Powell & Newman) Plenum Press 1995 (ISBN 0-306-44867-X)のチャプター１０およびVaccine Adjuvants: Preparation Methods and Research Protocols (Volume 42 of Methods in Molecular Medicine series). ISBN: 1-59259-083-7. Ed. O’Haganのチャプター１２により詳細に記載されている。ＭＦ５９エマルジョンは、有利にシトレートイオン、例えば１０mMクエン酸ナトリウム緩衝液を含む。
・ スクアレン、トコフェロールおよびTween 80のエマルジョン。エマルジョンはリン酸緩衝化食塩水を含み得る。またSpan 85(例えば１％)および／またはレシチンを含み得る。これらのエマルジョンは２〜１０％スクアレン、２〜１０％トコフェロールおよび０.３〜３％Tween 80を含んでよく、およびスクアレン：トコフェロールの重量比は、好ましくは、より安定なエマルジョンを提供するために≦１である。スクアレンおよびTween 80は約５：２の体積比で存在し得る。一つのこのようなエマルジョンは、ＰＢＳ中にTween 80を溶解して２％溶液とし、次いで９０mlのこの溶液と５ｇのＤＬ−α−トコフェロールおよび５mlスクアレンの混合物を混合し、次いで混合物を微少流動化することにより製造できる。得られたエマルジョンは、例えば平均直径１００〜２５０nm、好ましくは約１８０nmのサブミクロン油滴を有し得る。
・ スクアレン、トコフェロールおよびトリトン界面活性剤(例えばトリトンＸ−１００)のエマルジョン。エマルジョンは３ｄ−ＭＰＬを含み得る(下記参照)。エマルジョンはリン酸緩衝液を含み得る。
・ ポリソルベート(例えばポリソルベート８０)、トリトン界面活性剤(例えばトリトンＸ−１００)およびトコフェロール(例えばα−トコフェロールスクシネート)を含むエマルジョン。エマルジョンは、これらの三成分を約７５：１１：１０(例えば７５０μg／ml ポリソルベート８０、１１０μg／ml トリトンＸ−１００および１００μg／ml α−トコフェロールスクシネート)の質量比で含み、これらの集積物は、抗原からのこれらの成分のすべての寄与を有する。エマルジョンはまたスクアレンを含み得る。エマルジョンはまた３ｄ−ＭＰＬを含み得る(下記参照)。水性相はリン酸緩衝液を含み得る。
・ スクアラン、ポリソルベート８０およびポロクサマー４０１(“プルロニックTM L121”)のエマルジョン。エマルジョンは、リン酸緩衝化食塩水、ｐＨ７.４中で製剤できる。このエマルジョンは、ムラミルジペプチドのための有用な送達媒体であり、“ＳＡＦ−１”アジュバントにおいてスレオニル−ＭＤＰと使用されている[Allison & Byars (1992) Res Immunol 143: 519-25](０.０５−１％Ｔｈｒ−ＭＤＰ、５％スクアラン、２.５％プルロニックＬ１２１および０.２％ポリソルベート８０)。“ＡＦ”アジュバントにおけるように、Ｔｈｒ−ＭＤＰなしでも使用されている[Hariharan et al. (1995) Cancer Res 55: 3486-9](５％スクアラン、１.２５％プルロニックＬ１２１および０.２％ポリソルベート８０)。微少流動化が好ましい。
・ ０.５〜５０％の油、０.１〜１０％のリン脂質および０.０５〜５％の非イオン性界面活性剤を有するエマルジョン。ＷＯ９５／１１７００に記載のとおり、好ましいリン脂質成分はホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジン酸、スフィンゴミエリンおよびカルジオリピンである。サブミクロン液滴サイズが有利である。
・ 非代謝可能油(例えば軽鉱油)および少なくとも１種の界面活性剤(例えばレシチン、Tween 80またはＳｐａｎ ８０)のサブミクロン水中油型エマルジョン。例えばＱｕｉｌＡサポニン、コレステロール、サポニン−脂溶性コンジュゲート(例えばグルクロン酸のカルボキシル基を介したデスアシルサポニンの脂肪族アミンへの付加により製造し、米国特許６,０８０,７２５に記載のＧＰＩ−０１００)、ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロマイドおよび／またはＮ,Ｎ−ジオクタデシル−Ｎ,Ｎ−ビス(２−ヒドロキシエチル)プロパンジアミンのような添加物を含んでよい。
・ サポニン(例えばＱｕｉｌＡまたはＱＳ２１)およびステロール(例えばコレステロール)がらせん状ミセルとして結合しているエマルジョン[ＷＯ２００５／０９７１８１]。
医学的処置および使用
本発明はまた、医薬において、そして治療に使用するためのここに記載する式(Ｉ)のコンジュゲートまたはそのあらゆる下位群を提供する。例えば、本発明は、特に式(Ｉ)のコンジュゲートが抗原性ペプチドまたは病原性生物由来の多糖を含むとき、哺乳動物における抗体応答誘導に使用するための式(Ｉ)のコンジュゲートを提供する。さらに、ここに記載する式(Ｉ)のコンジュゲートまたはそのあらゆる下位群を含む医薬の製造方法を提供する。
本発明はまた、哺乳動物に本発明のコンジュゲートまたは医薬組成物を投与することを含む、哺乳動物における免疫応答を誘導する方法を提供する。
本発明はまた哺乳動物における微生物感染の予防または処置用医薬の製造における、本発明のコンジュゲートの使用も提供する。
これらの方法および使用により誘導された免疫応答は、一般的に抗体応答、好ましくは保護的抗体応答を含む。抗原免疫化後の抗体応答を評価する方法は当分野で周知である。本抗体応答は、好ましくはＩｇＡまたはＩｇＧ応答である。免疫応答は予防的および／または治療的であり得る。哺乳動物は好ましくはヒトである。
治療的処置の効果は、本発明の組成物投与後の微生物感染のモニタリングにより試験できる。予防的処置の効果は、組成物投与後の抗原に対する免疫応答(例えば抗抗原抗体)のモニタリングにより試験できる。
本発明の組成物は、一般的に患者に直接投与される。直接送達は、非経腸注射(例えば皮下、腹腔内、静脈内、筋肉内または組織間質性空間へ)または直腸、経口、膣、局所、経皮、皮内、眼、経鼻、耳または肺投与により達成し得る。注射または鼻腔内投与が好ましい。
本発明は、全身性および／または粘膜免疫の誘導に使用し得る。
本発明に従い製造したワクチンは、小児および成人の両者の処置に使用し得る。故に、対象は１歳未満、１〜５歳、５〜１５歳、１５〜５５歳または少なくとも５５歳であり得る。ワクチンを受ける好ましい対象は高齢者(例えば≧５０歳、≧６０歳および好ましくは≧６５歳)または小児(例えば≦５歳)である。しかしながら、ワクチンは、これらの群のためだけに適当ではなく、より一般的に集団において使用し得る。
処置は単一投与スケジュールまたは複数投与スケジュールであり得る。複数投与量を一次免疫化スケジュールおよび／またはブースター免疫化スケジュールに使用し得る。複数投与スケジュールにおいて、種々の投与量を同一のまたは種々の経路で、例えば非経腸刺激および粘膜ブースト、粘膜刺激および非経腸ブーストなどで与えてよい。１投与量を超える投与(典型的に２投与量)は、免疫学的に未処置の患者において特に有用である。複数投与量を、典型的に少なくとも１週間離れて(例えば約２週間、約３週間、約４週間、約６週間、約８週間、約１０週間、約１２週間、約１６週間など)。
本発明の使用および方法は、抗原が由来する生物が原因の感染に対する処置／保護に特に有用である。使用／方法の例を、Ｒが下に示す多糖であるときの態様について示す。
髄膜炎菌莢膜糖
使用および方法は、髄膜炎菌が原因の疾患、例えば髄膜炎、敗血症などの予防および／または処置である。
グルカン
グルカン(および特にβ−グルカン)は、ほとんど全ての病原性真菌、特に免疫無防備状態対象における感染に関与するものおよびまた細菌病原体および原虫の必須かつ主要な多糖構成物であるため、抗グルカン免疫は、広範囲の病原体および疾患に対する効果を有し得る。例えば、出芽酵母で免疫化後に誘導した抗グルカン血清は、カンジダ・アルビカンスと交差反応性である。広スペクトル免疫は、これらのヒト感染性真菌について、化学療法が不十分であり、抗真菌剤耐性が生じ、予防的および治療的ワクチンの必要性の認識が増しているため、特に有用である。
本発明の使用および方法は、カンジダ属、例えばカンジダ・アルビカンス；クリプトコッカス属、例えばクリプトコッカス・ネオフォルマンス；腸球菌属、例えばフェカリス菌；ストレプトコッカス属、例えば肺炎球菌、ミュータンス菌、ストレプトコッカス・アガラクチアおよび化膿性連鎖球菌；リーシュマニア属、例えば森林型熱帯リーシュマニア；アカントアメーバ属、例えばカステラーニアメーバ；アスペルギルス属、例えばアスペルギルス・フミガーツスおよびアスペルギルス・フラバス；ニューモシスチス属、例えばニューモシスチス・カリニ；マイコバクテリウム属、例えば結核菌；シュードモナス属、例えばシュードモナス・エルジノーサ；ブドウ球菌属、例えば黄色ブドウ球菌；サルモネラ属、例えばサルモネラ・チフィリウム；コクシジオイデス属、例えばコクシジオイデス・イミチス；白癬菌属、例えばトリコフィトン・ベルコーズム；ブラストミセス属、例えばブラストミセス・デルマチチジス；ヒストプラズマ属、例えばヒストプラズマ・カプスラーツム；パラコクシジオイデス属、例えば南アメリカ分芽菌；フィチウム属、例えばフィチウム・インシディオサム；およびエシェリキア属、例えば大腸菌の感染に対する処置／保護に特に有用である。
本使用および方法は、カンジダ症(肝脾カンジダ症、侵襲性カンジダ症、慢性粘膜皮膚カンジダ症および播種性カンジダ症を含む)；カンジダ血症；アスペルギルス症、クリプトコッカス症、皮膚真菌症、スポロトリクム症および他の皮下真菌症、ブラストミセス症、ヒストプラスマ症、コクシジオイデス症、パラコクシジオイデス症、ニューモシスチス症、鵞口瘡、結核、ミコバクテリア症、呼吸器感染、猩紅熱、肺炎、膿痂疹、リウマチ熱、敗血症、敗血症、皮膚および内臓リーシュマニア症、角膜アカントアメーバ症、嚢胞性線維症、腸チフス、胃腸炎および溶血性尿毒症症候群を含む胃が、これらに限定されない疾患の予防／処置に特に有用である。抗カンジダ・アルビカンス活性は、ＡＩＤＳ患者における感染の処置に特に有用である。
本発明のコンジュゲートを、複数病原体に対する同時免疫化のための一組成物中に、非グルカン抗原と組み合わせてよい。組み合わせワクチンを製造する代わりに、コンジュゲートを患者に他のワクチンと実質的に同じ時間に(例えば同じ診察中または医療専門家またはワクチン接種センター来訪時に)投与し得る。これらの組み合わせワクチンにおいて使用するためのまたは同時投与のための抗原は、例えば、ストレプトコッカス・アガラクチア、黄色ブドウ球菌および／またはシュードモナス・エルジノーサ、Ａ型肝炎ウィルス、Ｂ型肝炎ウィルス、ナイセリア・メニンギティディス(例えば、血清型Ａ、Ｃ、Ｗ１３５および／またはＹについて糖またはコンジュゲートした糖)、肺炎球菌(例えば糖またはコンジュゲートした糖)など由来の免疫原を含む。
本発明のコンジュゲートを、特に患者が既に感染しているとき、抗真菌剤と組み合わせて使用し得る。抗真菌剤は即時の治療的効果を提供し、本コンジュゲートは、長時間続く効果を提供する。適当な抗真菌は、アゾール類(例えばフルコナゾール、イトラコナゾール)、ポリエン類(例えばアンホテリシンＢ)、フルシトシンおよびスクアレンエポキシダーゼ阻害剤(例えばテルビナフィンを含むが、これらに限定されない)[またWills et al. (2000) Emerging Therapeutic Targets 4: 1-32参照]。抗真菌剤および本コンジュゲートを別々に、または組み合わせで投与し得る。別々に投与するとき、典型的に互いに７日以内に投与する。コンジュゲートの最初の投与後、抗真菌剤を１回を超えて投与してよい。
肺炎球菌莢膜糖類
本使用および方法は、肺炎球菌が原因の疾患、例えば髄膜炎、敗血症、肺炎などの予防および／または処置に使用し得る。
本発明の態様を次の実施例により説明する。しかしながら、本発明の態様は、当業者には他の変形が知られておりまたは本開示に照らして明らかであるため、これらの実施例の具体的な詳述に限定されないと解釈すべきである。
コンジュゲート７Ａとアジド修飾糖のコンジュゲーションを行うための反応を示す。 コンジュゲート７Ａとアジド修飾糖のコンジュゲーションにより得られた複合多糖のＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動法分析およびMALDI-TOFスペクトロメトリーの結果を示す。 コンジュゲート１３Ａとアジド修飾糖のコンジュゲーションを行うための反応を示す。 コンジュゲート１３Ａとアジド修飾糖のコンジュゲーションにより得られた複合多糖のＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動法分析およびMALDI-TOFスペクトロメトリーの結果を示す。 コンジュゲート１３Ａとアジド修飾糖および陽性対照のコンジュゲーションにより得られた複合多糖のＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動法分析およびMALDI-TOFスペクトロメトリーの結果を示す。 ラミナリンとアジュバントとしてのＭＦ５９でコーティングしたプレート上のマウス血清を使用した３投与量後の種々のコンジュゲートに対するＩｇＧ応答を比較する。
特に断らない限り、出発物質は一般的にAldrich Chemicals Co.(Milwaukee, Wis.)、Lancaster Synthesis, Inc.(Windham, N.H.)、Acros Organics(Fairlawn, N.J.)、Maybridge Chemical Company, Ltd.(Cornwall, England)およびTyger Scientific(Princeton, N.J.)のような業者から入手可能である。下の実施例において使用する次の略語は対応する意味を有する。
３−(２−(２−ヨードエトキシ)エトキシ)プロプ−１−インは、Flavia Piron, et al., in “Synthesis of Podands with Cyanurate or Isocyanurate Cores and Terminal Triple Bonds” Synthesis, 10, 1639-1644 (2010)に記載の方法を使用して製造した。
CRM197(CAS Number 92092-36-9)およびキモトリプシノーゲンＡ(CAS Number 9035-75-0)はいずれもAldrich Chemicals Co.(Milwaukee, Wisconsin)から入手可能である。
実施例１(コンパレータ)
CRM197とＰＴＡＤのコンジュゲーション(１Ａ)
CRM197(０.１１６mg、０.００２μmol)のＰＢＳ(ｐＨ７.２)(６６μL)溶液に、新たに調製したＰＴＡＤ(０.２μL、０.０２０μmol)のＣＨ３ＣＮ溶液を添加した。混合物を室温で１６時間撹拌した。ＬＣＭＳは約１５％変換を示した：58402 (+0), 58519 (+1)。さらにＰＴＡＤ(０.４μL、０.０４０μmol)のＣＨ３ＣＮ溶液を添加し、混合物をさらに２０時間、室温で撹拌した。混合物を7K MWCO Zeba spinカラムを使用して脱塩した。LCMS ESI: 58406 (+0), 58524 (+1), 58645 (+2)
実施例２
CRM197と４−フェニル−３Ｈ−１,２,４−トリアゾール−３,５(４Ｈ)−ジオン(２Ａ)のコンジュゲーション
CRM197(０.０３mg、０.０００５μmol)のＴｒｉｓ ＨＣｌ(１００mM、ｐＨ７.４)(１５μL)溶液に、新たに調製したＰＴＡＤ(０.５００μL、０.００５０μmol)のＣＨ３ＣＮ溶液を添加した。混合物を室温で１時間撹拌した。混合物を7K MWCO Zeba spinカラムを使用して脱塩した(Thermo Scientificから入手可能)。LCMS ESI: 58420 (+0), 58596 (+1), 58769 (+2), 58945 (+3)
実施例３
CRM197と４−メチル−３Ｈ−１,２,４−トリアゾール−３,５(４Ｈ)−ジオン(３Ａ)のコンジュゲーション
中間体４−メチル−３Ｈ−１,２,４−トリアゾール−３,５(４Ｈ)−ジオン(Ｉ−３ａ)の製造
ジオン(Ｉ−３ａ)を、Arash Ghorbani-Choghamarani, et al., in “Supported Nitric Acid on Silica Gel and Polyvinyl Pyrrolidone (PVP) as an Efficient Oxidizing Agent for the Oxidation of Urazoles and Bis-urazoles” Synthetic Communications, 39(23), 4264-4270 (2009)に記載の方法に準じる方法を使用して製造した。
４−メチルウラゾール(１１５mg、０.９９９mmol)のＣＨ２Ｃｌ２(４.９９６mL)溶液に、ＳｉＯ２−ＨＮＯ３(２５０mg)を添加した。混合物を室温で１５分間撹拌し、濾過し、真空で濃縮し、乾燥させて、４−メチル−３Ｈ−１,２,４−トリアゾール−３,５(４Ｈ)−ジオンを桃色固体として得た(Ｉ−２ａ：２５mg、２２％)。1H NMR (400 MHz, CD3CN) δ ppm 3.08 (s, 3 H)
コンジュゲート(３Ａ)を形成させるためのCRM197へのコンジュゲーション：
CRM197(０.０３mg、０.０００５μmol)のＴｒｉｓ ＨＣｌ(１００mM、ｐＨ７.４)(２０μL)溶液に、新たに調製した４−メチル−３Ｈ−１,２,４−トリアゾール−３,５(４Ｈ)−ジオン(Ｉ−３ａ：各０.１００μL、各０.００２５μmol、計０.００７５μmol)のＣＨ３ＣＮ溶液を３回添加した。混合物を室温で３０分間撹拌した。混合物を7K MWCO Zeba spinカラムを使用して脱塩した。LCMS ESI: 58647 (+2), 58759 (+3), 58874 (+4), 58984 (+5)
実施例４
CRM197と４−(４−アセチルフェニル)−１,２,４−トリアゾリジン−３,５−ジオン(４Ａ)とのコンジュゲーション
中間体２−(４−アセチルフェニルカルバモイル)ヒドラジンカルボン酸エチル(Ｉ−４ａ)の製造
４−アミノアセトフェノン(６７６mg、５mmol)のＴＨＦ(２５.０００mL)溶液に、０℃でトリエチルアミン(１.３８６mL、１０.００mmol)およびクロロギ酸４−ニトロフェニル(１５１２mg、７.５０mmol)を添加した。混合物を室温で２時間撹拌した。カルバジン酸エチル(１５６２mg、１５.００mmol)を添加し、続いてさらにトリエチルアミン(２.０７９mL、１５.００mmol)を添加した。混合物を５５℃で２時間撹拌した。水を添加し、ＣＨ２Ｃｌ２で２回抽出し、飽和重炭酸ナトリウムで洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥させ、濾過し、真空で濃縮させた。残渣を酢酸エチルで摩砕し、濾過し、真空で濃縮させた。残渣をシリカゲルクロマトグラフィー(１０〜８０％酢酸エチル／ヘプタン)で精製して、２−(４−アセチルフェニルカルバモイル)−ヒドラジンカルボン酸エチル(３５４mg、２７％)を淡黄色固体として得た。LC-MS (M+1) 266.1, t = 0.79 min
中間体４−(４−アセチルフェニル)−１,２,４−トリアゾリジン−３,５−ジオン(Ｉ−４ｂ)の製造
２−(４−アセチルフェニルカルバモイル)ヒドラジンカルボン酸エチル(Ｉ−４ａ：３５４mg、１.３３５mmol)のＭｅＯＨ(１０mL)溶液にＫ２ＣＯ３(５５３mg、４.００mmol)を添加した。混合物を５５℃で２時間撹拌し、室温に冷却し、４Ｎ ＨＣｌのジオキサン溶液(１.６６８mL、６.６７mmol)を添加した。沈殿を濾過し、濾液を真空で濃縮させた。得られた固体をＣＨ２Ｃｌ２で摩砕し、濾過し、乾燥させて、４−(４−アセチルフェニル)−１,２,４−トリアゾリジン−３,５−ジオン(Ｉ−４ｂ：１２５mg、４３％)を淡黄色固体として得た。LC-MS (M+1) 220.2, t = 0.78 min. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ ppm 2.60 (s, 3 H) 7.68 (d, J = 8.84 Hz, 2 H) 8.05 (d, J = 8.59 Hz, 2 H) 10.65 (s, 2 H)
中間体４−(４−アセチルフェニル)−３Ｈ−１,２,４−トリアゾール−３,５(４Ｈ)−ジオン(Ｉ−４ｃ)の製造
４−(４−アセチルフェニル)−１,２,４−トリアゾリジン−３,５−ジオン(１１５mg、０.９９９mmol)のＣＨ２Ｃｌ２(３.５mL)溶液に、ＳｉＯ２−ＨＮＯ３(３００mg)を添加した。混合物を室温で１５分間撹拌し、濾過し、真空で濃縮し、乾燥させて、４−(４−アセチルフェニル)−３Ｈ−１,２,４−トリアゾール−３,５(４Ｈ)−ジオンを赤色固体として得た(７８mg、７４％)。
コンジュゲート(４Ａ)を形成させるためのCRM197へのコンジュゲーション：
CRM197(０.０００５μmol)のＴｒｉｓ ＨＣｌ(１００mM、ｐＨ７.４)(２５.００μL)溶液に、４−(４−アセチルフェニル)−３Ｈ−１,２,４−トリアゾール−３,５(４Ｈ)−ジオン(Ｉ−４ｃ：０.２００μL、０.００１００μmol)のＣＨ３ＣＮ溶液を毎分２回添加した(計４当量添加)。混合物を１５分間撹拌し、続いてさらに反応材(１０当量)を添加した。混合物をさらに１５分間撹拌した。さらに反応材(１０当量)を添加し、混合物をさらに１５分間撹拌した。混合物をZeba 7K MWCOカラムを使用して脱塩した。LCMS ESI: 58644 (+1), 58865 (+2), 59072 (+3)
実施例５
CRM197と(Ｅ)−４−(４−(１−(ベンジルオキシイミノ)エチル)フェニル)−３Ｈ−１,２,４−トリアゾール−３,５(４Ｈ)−ジオン(５Ａ)のコンジュゲーション
中間体(Ｅ)−４−(４−(１−(ベンジルオキシイミノ)エチル)フェニル)−１,２,４−トリアゾリジン−３,５−ジオン(Ｉ−５ａ)の製造
４−(４−アセチルフェニル)−１,２,４−トリアゾリジン−３,５−ジオン(５００mg、２.２８１mmol)のエタノール(６.９１mL)溶液に、Ｏ−ベンジルヒドロキシルアミンヒドロクロライド(７２８mg、４.５６mmol)および４Ｎ ＨＣｌのジオキサン溶液(０.２７７mL、９.１２mmol)を添加した。混合物を６５℃で１時間撹拌し、濾過し、真空で濃縮させた。飽和重炭酸ナトリウムを残渣に添加し、酢酸エチルで２回抽出し、ＭｇＳＯ４で乾燥させ、濾過し、真空で濃縮させた。メタノール／ＣＨ２Ｃｌ２(〜５０／５０)を添加し、沈殿を濾過し、乾燥させて、(Ｅ)−４−(４−(１−(ベンジルオキシイミノ)エチル)−フェニル)−１,２,４−トリアゾリジン−３,５−ジオン(Ｉ−５ａ：１６７mg、２３％)を白色固体として得た。LC-MS (M+1) 325.1, t = 1.77 min. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ ppm 2.60 (s, 3 H) 7.68 (d, J = 8.84 Hz, 2 H) 8.05 (d, J = 8.59 Hz, 2 H) 10.65 (s, 2 H). 1H NMR (400 MHz, CD3CN) δ ppm 2.29 (s, 3 H) 5.26 (s, 2 H) 7.37 (d, J = 7.07 Hz, 1 H) 7.42 (t, J = 7.33 Hz, 2 H) 7.45 - 7.50 (m, 2 H) 7.53 (d, J = 8.59 Hz, 2 H) 7.75 - 7.93 (m, 4 H)
中間体(Ｅ)−４−(４−(１−(ベンジルオキシイミノ)エチル)フェニル)−３Ｈ−１,２,４−トリアゾール−３,５(４Ｈ)−ジオン(Ｉ−５ｂ)の製造
(Ｅ)−４−(４−(１−(ベンジルオキシイミノ)エチル)フェニル)−１,２,４−トリアゾリジン−３,５−ジオン(Ｉ−５ａ：５６mg、０.１７３mmol)のＣＨ２Ｃｌ２(１.７２７mL)溶液に、ＳｉＯ２−ＨＮＯ３(１１２mg)を添加した。混合物を室温で３０分間撹拌し、濾過し、真空で濃縮し、乾燥させて、(Ｅ)−４−(４−(１−(ベンジルオキシイミノ)エチル)フェニル)−３Ｈ−１,２,４−トリアゾール−３,５(４Ｈ)−ジオン(Ｉ−４ｂ：２９mg、５２％)を赤色固体として得た。1H NMR (400 MHz, CD3CN) δ ppm 2.31 (s, 3 H) 5.28 (s, 2 H) 7.38 (d, J = 7.07 Hz, 1 H) 7.43 (t, J = 7.20 Hz, 2 H) 7.46 - 7.54 (m, 4 H) 7.86 - 7.94 (m, 2 H)。
コンジュゲート(５Ａ)を形成させるためのCRM197へのコンジュゲーション；
CRM197(０.０００５μmol)のＴｒｉｓ ＨＣｌ(１００mM、ｐＨ７.４)(１６.７μL)に、(Ｅ)−４−(４−(１−(ベンジルオキシイミノ)エチル)フェニル)−３Ｈ−１,２,４−トリアゾール−３,５(４Ｈ)−ジオン(Ｉ−５ｂ：０.１００μL、０.００１００μmol)のＣＨ３ＣＮを毎分２回添加した(計４当量添加)。混合物を１５分間撹拌し、続いてさらに反応材(１０当量)を添加した。混合物をさらに１５分間撹拌し、Zeba 7K MWCOカラムを使用して脱塩した。LCMS ESI: 58413 (+0), 58736 (+1), 59061 (+2)
実施例６
CRM197と(Ｅ)−４−(４−(１−(プロプ−２−イニルオキシイミノ)エチル)フェニル)−３Ｈ−１,２,４−トリアゾール−３,５(４Ｈ)−ジオン(６Ａ)のコンジュゲーション
中間体(Ｅ)−４−(４−(１−(プロプ−２−イニルオキシイミノ)エチル)フェニル)−１,２,４−トリアゾリジン−３,５−ジオン(Ｉ−６ａ)の製造
４−(４−アセチルフェニル)−１,２,４−トリアゾリジン−３,５−ジオン(５００mg、２.２８１mmol)のエタノール(６.９１２mL)溶液に、Ｏ−(プロプ−２−イニル)ヒドロキシルアミンヒドロクロライド(３６８mg、３.４２mmol)および４Ｎ ＨＣｌのジオキサン溶液(１.７１１mL、６.８４mmol)を添加した。混合物を５０℃で２時間撹拌し、真空で濃縮させた。飽和重炭酸ナトリウムを添加し、酢酸エチルで２回抽出し、ＭｇＳＯ４で乾燥させ、濾過し、真空で濃縮させた。残渣をシリカゲルクロマトグラフィー(６０〜１００％酢酸エチル／ヘプタンおよび５％ＭｅＯＨ／酢酸エチル)で精製して、(Ｅ)−４−(４−(１−(プロプ−２−イニルオキシイミノ)エチル)フェニル)−１,２,４−トリアゾリジン−３,５−ジオン(Ｉ−６ａ：４６mg、７％)を白色固体として得た。LC-MS (M+1) 273.1, t = 0.81 min. 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ ppm 2.23 (s, 3 H) 3.48 (t, J = 2.40 Hz, 1 H) 4.80 (d, J = 2.27 Hz, 2 H) 7.53 (d, J = 8.59 Hz, 2 H) 7.76 (d, J = 8.59 Hz, 2 H) 10.52 (s, 2 H)
中間体(Ｅ)−４−(４−(１−(プロプ−２−イニルオキシイミノ)エチル)フェニル)−３Ｈ−１,２,４−トリアゾール−３,５(４Ｈ)−ジオン(Ｉ−６ｂ)の製造
(Ｅ)−４−(４−(１−(プロプ−２−イニルオキシイミノ)エチル)フェニル)−１,２,４−トリアゾリジン−３,５−ジオン(Ｉ−６ａ：４６mg、０.１６９mmol)のＣＨ２Ｃｌ２(１.６９mL)溶液に、ＳｉＯ２−ＨＮＯ３(１００mg)を添加した。混合物を室温で３０分間撹拌し、濾過し、真空で濃縮し、乾燥させて、(Ｅ)−４−(４−(１−(プロプ−２−イニルオキシイミノ)エチル)フェニル)−３Ｈ−１,２,４−トリアゾール−３,５(４Ｈ)−ジオン(２４mg、５３％)を赤色固体として得た。1H NMR (400 MHz, CD3CN) δ ppm 2.31 (s, 3 H) 5.28 (s, 2 H) 7.38 (d, J = 7.07 Hz, 1 H) 7.43 (t, J = 7.20 Hz, 2 H) 7.46 - 7.54 (m, 4 H) 7.86 - 7.94 (m, 2 H). 1H NMR (400 MHz, CD3CN) δ ppm 2.31 (s, 3 H) 2.81 (t, J = 2.40 Hz, 1 H) 4.84 (d, J = 2.27 Hz, 2 H) 7.53 (d, J = 8.84 Hz, 2 H) 7.93 (d, J = 8.84 Hz, 2 H)
CRM197へのコンジュゲーション(６Ａ)：
CRM197(０.００１μmol)のＴｒｉｓ ＨＣｌ(１００mM、ｐＨ７.４)(５０.０μL)に、(Ｅ)−４−(４−(１−(プロプ−２−イニルオキシイミノ)エチル)フェニル)−３Ｈ−１,２,４−トリアゾール−３,５(４Ｈ)−ジオン(Ｉ−６ｂ：０.４００μL、０.００２０μmol)のＣＨ３ＣＮを毎分６回添加した(計１２当量添加)。混合物をさらに１時間撹拌し、7K MWCO Zeba Spinカラムを使用して脱塩した。LCMS ESI: 58418 (+0), 58688 (+1), 58960 (+2)
実施例７
４−(４−(２−(２−(プロプ−２−イニルオキシ)エトキシ)エトキシ)フェニル)−３Ｈ−１,２,４−トリアゾール−３,５(４Ｈ)−ジオンとコンジュゲートしたCRM197(７Ａ)
中間体４−(２−(２−(プロプ−２−イニルオキシ)エトキシ)エトキシ)フェニルカルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチル(Ｉ−７ａ)の製造
４−ヒドロキシフェニルカルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチル(１.６７５ｇ、８.０１mmol)のＤＭＦ(５３.４mL)溶液に、３−(２−(２−ヨードエトキシ)エトキシ)プロプ−１−イン(２.０３４ｇ、８.０１mmol)およびＫ２ＣＯ３(３.３２ｇ、２４.０２mmol)を添加した。混合物を６０℃で４時間撹拌し、続いて飽和重炭酸ナトリウムを添加した。混合物を酢酸エチルで２回抽出し、ＭｇＳＯ４で乾燥させ、濾過し、真空で濃縮させた。残渣をシリカゲルクロマトグラフィー(０〜４０％酢酸エチル／ヘプタン)で精製して、４−(２−(２−(プロプ−２−イニルオキシ)エトキシ)エトキシ)−フェニルカルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチル(Ｉ−７ａ：１.９１ｇ、７１％)を無色油状物として得た。LC-MS (M-tBu+1) 280.1, t = 1.31 min
中間体４−(２−(２−(プロプ−２−イニルオキシ)エトキシ)エトキシ)アニリン(Ｉ−７ｂ)の製造
４−(２−(２−(プロプ−２−イニルオキシ)エトキシ)エトキシ)フェニルカルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチル(Ｉ−７ａ：１.９１ｇ、５.６９mmol)のＣＨ２Ｃｌ２(１４.２４mL)溶液に、４Ｎ ＨＣｌのジオキサン溶液(１４.２４mL、５６.９mmol)を添加した。混合物を室温で２時間撹拌し、真空で濃縮させ、続いて飽和重炭酸ナトリウム水溶液を添加した。混合物を酢酸エチルで２回抽出し、ＭｇＳＯ４で乾燥させ、濾過し、真空で濃縮させた。４−(２−(２−(プロプ−２−イニルオキシ)エトキシ)エトキシ)アニリン(Ｉ−７ｂ)をそのまま次工程で使用した。LC-MS (M+1) 236.1, t = 0.87 min
中間体２−(４−(２−(２−(プロプ−２−イニルオキシ)エトキシ)エトキシ)−フェニルカルバモイル)ヒドラジンカルボン酸エチル(Ｉ−７ｃ)の製造
４−(２−(２−(プロプ−２−イニルオキシ)エトキシ)エトキシ)アニリン(Ｉ−７ｂ：１.３３９ｇ、５.６９mmol)のＴＨＦ(３７.９mL)溶液に、０℃でクロロギ酸４−ニトロフェニル(２.０６４ｇ、１０.２４mmol)およびトリエチルアミン(１.４２０mL、１０.２４mmol)を添加した。混合物を室温で１時間撹拌した。カルバジン酸エチル(１.５４０ｇ、１４.７９mmol)およびさらにトリエチルアミン(１.４２０mL、１０.２４mmol)を添加した。混合物を室温で１６時間撹拌し、続いて飽和重炭酸ナトリウム水溶液を添加した。混合物を酢酸エチルで２回抽出し、ＭｇＳＯ４で乾燥させ、濾過し、真空で濃縮させた。粗製の生成物をシリカゲルクロマトグラフィー(４０〜１００％酢酸エチル／ヘプタン)で精製して、２−(４−(２−(２−(プロプ−２−イニルオキシ)エトキシ)エトキシ)フェニルカルバモイル)−ヒドラジンカルボン酸エチル(Ｉ−７ｃ：１.３１ｇ、６３％)を泡状無色油状物として得た。LC-MS (M+1) 366.1, t = 0.95 min
中間体４−(４−(２−(２−(プロプ−２−イニルオキシ)エトキシ)エトキシ)フェニル)−１,２,４−トリアゾリジン−３,５−ジオン(Ｉ−７ｄ)の製造
２−(４−(２−(２−(プロプ−２−イニルオキシ)エトキシ)エトキシ)フェニルカルバモイル)−ヒドラジンカルボン酸エチル(１.３１ｇ、３.５９mmol)のメタノール(１７.９３mL)溶液に、Ｋ２ＣＯ３(１.２３９ｇ、８.９６mmol)を添加した。混合物を５５℃で３０分間撹拌した。室温に冷却後、４Ｎ ＨＣｌのジオキサン溶液(３.５９mL、１４.３４mmol)を添加した。沈殿を濾過し、濾液を真空で濃縮させた。残渣をシリカゲルクロマトグラフィー(４０〜１００％酢酸エチル／ヘプタン)で精製して、４−(４−(２−(２−(プロプ−２−イニルオキシ)エトキシ)エトキシ)フェニル)−１,２,４−トリアゾリジン−３,５−ジオン(Ｉ−７ｄ：３１８mg、２８％)を白色油性固体として得た。LC-MS (M+1) 320.0, t = 0.73 min. 1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ ppm 2.48 (t, J = 2.15 Hz, 1 H) 3.68 - 3.83 (m, 4 H) 3.83 - 3.97 (m, 2 H) 4.11 - 4.32 (m, 4 H) 7.04 (d, J = 8.84 Hz, 2 H) 7.36 (d, J = 8.84 Hz, 2 H)
中間体４−(４−(２−(２−(プロプ−２−イニルオキシ)エトキシ)エトキシ)フェニル)−３Ｈ−１,２,４−トリアゾール−３,５(４Ｈ)−ジオン(Ｉ−７ｅ)の製造
４−(４−(２−(２−(プロプ−２−イニルオキシ)エトキシ)エトキシ)フェニル)−１,２,４−トリアゾリジン−３,５−ジオン(Ｉ−７ｄ：１５３mg、０.４７９mmol)のＣＨ２Ｃｌ２(４.７９２mL)溶液に、ＳｉＯ２−ＨＮＯ３(３００mg)を添加した。混合物を室温で１５分間撹拌し、濾過し、真空で濃縮し、乾燥させて、４−(４−(２−(２−(プロプ−２−イニルオキシ)エトキシ)エトキシ)フェニル)−３Ｈ−１,２,４−トリアゾール−３,５(４Ｈ)−ジオン(１１２mg、７４％)を赤色油状物として得た。1H NMR (400 MHz, CD3CN) δ ppm 2.60 (t, J = 2.40 Hz, 1 H) 3.44 - 3.62 (m, 4 H) 3.68 - 3.75 (m, 2 H) 4.02 - 4.12 (m, 4 H) 7.02 (d, J = 9.09 Hz, 2 H) 7.23 (d, J = 8.84 Hz, 2 H)
コンジュゲート(７Ａ)を形成させるためのCRM197へのコンジュゲーション：
CRM197(０.０３４μmol)のＴｒｉｓ ＨＣｌ(１００mM、ｐＨ７.４)(１.３６９mL)に、４−(４−(２−(２−(プロプ−２−イニルオキシ)エトキシ)エトキシ)フェニル)−３Ｈ−１,２,４−トリアゾール−３,５(４Ｈ)−ジオン(Ｉ−６ｅ：１.７１２μL、０.１７１μmol)のＣＨ３ＣＮを毎分８回添加し(計４０当量添加)、１時間撹拌し、Zeba spinカラム7K MWCOを使用して脱塩した。LCMS ESI: 58740 (+1), 59061 (+2), 59381 (+3), 59699 (+4)
実施例８
CRM197と４−(３,５−ジオキソ−１,２,４−トリアゾリジン−４−イル)ブチルカルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチルのコンジュゲーション(８Ａ)
中間体１３,１３−ジメチル−４,１１−ジオキソ−１２−オキサ−２,３,５,１０−テトラアザテトラデカン−１−オン酸エチル(Ｉ−８ａ)の製造
クロロギ酸４−ニトロフェニル(１.００８ｇ、５.００mmol)のＴＨＦ(２５.００mL)溶液に、０℃でカルバジン酸エチル(０.５２１ｇ、５mmol)およびトリエチルアミン(１.５２５mL、１１.００mmol)を添加した。混合物を０℃で１時間撹拌した。Ｎ−Ｂｏｃ−１,４−ブタンジアミン(１.１４８mL、６.００mmol)を添加した。混合物を室温で１時間撹拌した。水を添加し、酢酸エチルで２回抽出し、ＭｇＳＯ４で乾燥させ、濾過し、真空で濃縮させた。粗製の生成物をシリカゲルクロマトグラフィー(０〜１０％ＭｅＯＨ／ＣＨ２Ｃｌ２)で精製して、１３,１３−ジメチル−４,１１−ジオキソ−１２−オキサ−２,３,５,１０−テトラアザテトラデカン−１−オン酸エチル(Ｉ−８ａ：１.０４５ｇ、６６％)を白色固体として得た。LC-MS (M+1) 319.1, t = 0.92 min
中間体４−(３,５−ジオキソ−１,２,４−トリアゾリジン−４−イル)ブチルカルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチル(Ｉ−８ｂ)の製造
１３,１３−ジメチル−４,１１−ジオキソ−１２−オキサ−２,３,５,１０−テトラアザテトラデカン−１−オン酸エチル(Ｉ−８ａ：１.０４５ｇ、３.２８mmol)のＥｔＯＨ(１３.１３mL)溶液に、Ｋ２ＣＯ３(１.８１５ｇ、１３.１３mmol)を添加した。混合物を６５℃で１６時間撹拌した。室温に冷却し、濾過し、４Ｎ ＨＣｌのジオキサン溶液をｐＨ約４まで添加した。白色固体を濾過し、幾分かのメタノールで濯ぎ、濾液を真空で濃縮させた。残渣をシリカフラッシュクロマトグラフィー(０〜１０％ＭｅＯＨ／ＣＨ２Ｃｌ２)で精製して、４−(３,５−ジオキソ−１,２,４−トリアゾリジン−４−イル)ブチルカルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチル(３８８mg、４３％)を油性白色固体として得た。LC-MS (M-1) 271.1, t = 0.73 min. 1H NMR (400 MHz, CD3CN) δ ppm 1.39 (s, 9 H) 1.42 - 1.49 (m, 2 H) 1.52 - 1.65 (m, 2 H) 3.03 (q, J = 6.40 Hz, 2 H) 3.42 (t, J = 6.95 Hz, 2 H)
中間体４−(３,５−ジオキソ−３Ｈ−１,２,４−トリアゾール−４(５Ｈ)−イル)ブチルカルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチル(Ｉ−８ｃ)の製造
４−(３,５−ジオキソ−１,２,４−トリアゾリジン−４−イル)ブチルカルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチル(１５mg、０.０５５mmol)のＣＨ２Ｃｌ２(０.５５１mL)に、ＳｉＯ２−ＨＮＯ３(３５mg)を添加した。混合物を室温で１５分間撹拌し、濾過し、真空で濃縮し、乾燥させて、４−(３,５−ジオキソ−３Ｈ−１,２,４−トリアゾール−４(５Ｈ)−イル)ブチルカルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチル(Ｉ−８ｃ：１５mg、定量的収率)を赤色油状物として得た。
コンジュゲート(８Ａ)を形成させるためのCRM197へのコンジュゲーション：
CRM197(０.０００５μmol)のＴｒｉｓ ＨＣｌ(１００mM、ｐＨ７.４)(２０.０μL)に、４−(３,５−ジオキソ−３Ｈ−１,２,４−トリアゾール−４(５Ｈ)−イル)ブチルカルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチル(Ｉ−８ｃ：０.１００μL、０.００２５μmol)のＣＨ３ＣＮを毎分３回添加した(計１５当量)。混合物を室温で３０分間撹拌した。LCMS ESI: 58687 (+1), 58964 (+2), 59228 (+3)
実施例９
CRM197とＮ−(４−(３,５−ジオキソ−３Ｈ−１,２,４−トリアゾール−４(５Ｈ)−イル)ブチル)−２−メトキシ(ポリエチレングリコール)−アセトアミドのコンジュゲーション(９Ａ)
中間体４,１１−ジオキソ−１３−フェニル−１２−オキサ−２,３,５,１０−テトラアザトリデカン−１−オン酸エチル(Ｉ−９ａ)の製造
クロロギ酸４−ニトロフェニル(１.００８ｇ、５.００mmol)のＴＨＦ(２５.０００mL)溶液に、０℃でカルバジン酸エチル(０.５２１ｇ、５mmol)およびトリエチルアミン(２.２１８mL、１６.００mmol)を添加した。混合物を０℃で１時間撹拌した。４−アミノブチルカルバミン酸ベンジル塩酸塩(１.５５２ｇ、６.００mmol)を添加した。混合物を室温で１時間撹拌し、水を添加し、酢酸エチルで２回抽出し、ＭｇＳＯ４で乾燥させ、濾過し、真空で濃縮させた。粗製の生成物をシリカゲルクロマトグラフィー(４０〜１００％酢酸エチル／ヘプタン)で精製して、４,１１−ジオキソ−１３−フェニル−１２−オキサ−２,３,５,１０−テトラアザトリデカン−１−オン酸エチル(Ｉ−９ａ：９６５mg、５５％)を白色固体として得た。LC-MS (M+1) 353.2, t = 0.94 min
中間体４−(３,５−ジオキソ−１,２,４−トリアゾリジン−４−イル)ブチルカルバミン酸ベンジル(Ｉ−９ｂ)の製造
４,１１−ジオキソ−１３−フェニル−１２−オキサ−２,３,５,１０−テトラアザトリデカン−１−オン酸エチル(Ｉ−９ａ：９６５mg、２.７４mmol)のエタノール(１１.０００mL)溶液に、Ｋ２ＣＯ３(１５１４mg、１０.９５mmol)を添加した。混合物を６５℃で１６時間撹拌し、室温に冷却し、濾過し、４Ｎ ＨＣｌのジオキサン溶液をｐＨ約４となるまで添加した。得られた白色固体を濾過し、幾分かのメタノールで濯ぎ、真空で濃縮させた。残渣をシリカゲルクロマトグラフィー(４０〜１００％酢酸エチル／ヘプタン)で精製して、４−(３,５−ジオキソ−１,２,４−トリアゾリジン−４−イル)ブチルカルバミン酸ベンジル(Ｉ−９ｂ：３６９mg、４４％)を白色固体として得た。LC-MS (M+1) 307.1, t = 0.78 min. 1H NMR (400 MHz, MeOD) δ ppm 1.40 - 1.58 (m, 2 H) 1.58 - 1.74 (m, 2 H) 3.15 (t, J = 6.82 Hz, 2 H) 3.51 (t, J = 6.95 Hz, 2 H) 5.06 (s, 2 H) 7.21 - 7.42 (m, 5 H)
中間体４−(４−アミノブチル)−１,２,４−トリアゾリジン−３,５−ジオン(Ｉ−９ｃ)の製造
４−(３,５−ジオキソ−１,２,４−トリアゾリジン−４−イル)ブチルカルバミン酸ベンジル(Ｉ−９ｂ：３６９mg、１.２０５mmol)のメタノール(４.８１９mL)溶液に、１０％Ｐｄ／Ｃ(５１.３mg、０.０４８mmol)を添加した。混合物を室温で１時間１気圧のＨ２下に撹拌し、セライトで濾過し、さらにメタノールで濯ぎ、真空で濃縮し、乾燥させて、４−(４−アミノブチル)−１,２,４−トリアゾリジン−３,５−ジオン(Ｉ−９ｃ：１０５mg、５１％)を白色固体として得た。1H NMR (400 MHz, MeOD) δ ppm 1.51 - 1.79 (m, 4 H) 2.94 (t, J = 7.20 Hz, 2 H) 3.50 (t, J = 6.57 Hz, 2 H)
中間体Ｎ−(４−(３,５−ジオキソ−１,２,４−トリアゾリジン−４−イル)ブチル)−２−メトキシＰＥＧ−アセトアミド(Ｉ−９ｄ)の製造
４−(４−アミノブチル)−１,２,４−トリアゾリジン−３,５−ジオン(Ｉ−９ｃ：１３.２８mg、０.０７７mmol)のメタノール(１.５４２mL)溶液に、５０００分子量ｍＰＥＧＮＨＳエステル(４０mg、７.７１μmol)およびトリエチルアミン(５.３４μL、０.０３９mmol)を添加した。混合物を室温で１時間撹拌した。過剰のアミンを、メタノールを溶離剤として使用するＳｉ−カルボン酸カートリッジ(１ｇ、６mL)を使用して除去した。残渣を真空で濃縮し、乾燥させて、Ｎ−(４−(３,５−ジオキソ−１,２,４−トリアゾリジン−４−イル)ブチル)−２−メトキシ(ポリエチレングリコール)−アセトアミド(Ｉ−９ｄ：３３.５mg、８２％)を白色固体として得た。
中間体Ｎ−(４−(３,５−ジオキソ−３Ｈ−１,２,４−トリアゾール−４(５Ｈ)−イル)ブチル)−２−メトキシＰＥＧ−アセトアミド(Ｉ−９ｅ)の製造
Ｎ−(４−(３,５−ジオキソ−１,２,４−トリアゾリジン−４−イル)ブチル)−２−メトキシ(ポリエチレングリコール)−アセトアミド(Ｉ−９ｄ：１６mg、２.９９μmol)のＣＨ３ＣＮ(５９.７μL)溶液に、ピリジン(０.２３９μL、２.９６μmol)および０.５Ｍ Ｎ−ブロモスクシンイミド(ＮＢＳ)のＤＭＦ溶液(５.９１μL、２.９６μmol)を添加した。混合物を室温で１５分間撹拌し(色が赤色−桃色に変化)、次のコンジュゲーション工程でそのまま使用した。
コンジュゲート(９Ａ)を形成させるためのCRM197へのコンジュゲーション：
CRM197(３.００μL、０.００１５μmol)のＴｒｉｓ ＨＣｌ(ｐＨ７.４、０.１Ｍ)(５０.０μL)溶液に、Ｎ−(４−(３,５−ジオキソ−３Ｈ−１,２,４−トリアゾール−４(５Ｈ)−イル)ブチル)−２−メトキシ(ポリエチレングリコール)−アセトアミド(０.３３３μL、０.０１５μmol)を添加した。混合物を室温で３０分間撹拌し、さらにＮ−(４−(３,５−ジオキソ−３Ｈ−１,２,４−トリアゾール−４(５Ｈ)−イル)ブチル)−２−メトキシ(ポリエチレングリコール)−アセトアミド(２μL、０.０９μmol)を添加した。混合物をさらに１５分間撹拌した。ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動(ＳＤＳ−ＰＡＧＥ)は、もはや非修飾CRM197がほとんど存在せず、複数コンジュゲーションの複数高ＭＷバンドを示した。
実施例１０、１１および１２は、キモトリプシノーゲンＡとのコンジュゲーションを記載する。
実施例１０(コンパレータ)
キモトリプシノーゲンＡとＰＴＡＤのコンジュゲーション(１０Ａ)
キモトリプシノーゲンＡ(０.０７７mg、０.００３μmol)のＰＢＳ(ｐＨ７.２)(１００μL)溶液に、新たに調製したＰＴＡＤ(１.００μL、０.１００μmol)のＣＨ３ＣＮ溶液を添加した。混合物を室温で３０分間撹拌した。混合物を7K MWCO Zeba spinカラムを使用して脱塩した。LCMS ESI: 25657 (+0), 25777 (+1)
実施例１１
キモトリプシノーゲンＡとＰＴＡＤのコンジュゲーション(１１Ａ)
キモトリプシノーゲンＡ(０.０７７mg、０.００３μmol)のＴｒｉｓ ＨＣｌ(１００mM、ｐＨ７.４)(１００μL)溶液に、新たに調製したＰＴＡＤ(１.００μL、０.１００μmol)のＣＨ３ＣＮ溶液を添加した。混合物を室温で３０分間撹拌した。混合物を7K MWCO Zeba spinカラムを使用して脱塩した。LCMS ESI: 25658 (+0), 25832 (+1)
実施例１２
キモトリプシノーゲンＡと４−メチル−３Ｈ−１,２,４−トリアゾール−３,５(４Ｈ)−ジオンのコンジュゲーション(１２Ａ)
キモトリプシノーゲンＡ(０.０５０mg、０.００２μmol)のＴｒｉｓ ＨＣｌ(１００mM、ｐＨ７.４)(８０μL)溶液に、４−メチル−３Ｈ−１,２,４−トリアゾール−３,５(４Ｈ)−ジオン(０.２００μL、０.０１０μmol)のＣＨ３ＣＮを毎分３回添加した(計１５当量添加)。混合物を室温で３０分間撹拌した。混合物を7K MWCO Zeba spinカラムを使用して脱塩した。LCMS ESI: 25662 (+0), 25774 (+1)
実施例１３
CRM197と４−(２,３−ビス(プロプ−２−イニルオキシ)プロピル)−３Ｈ−１,２,４−トリアゾール−３,５(４Ｈ)−ジオンのコンジュゲーション(１３Ａ)
中間体２,３−ビス(プロプ−２−イニルオキシ)プロピルカルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチル(Ｉ−１３ａ)の製造
２,３−ジヒドロキシプロピルカルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチル(１.９１２ｇ、１０mmol)のＤＭＦ(３３.３mL)溶液に、０℃で臭化プロパルギル(３.４５mL、４０.０mmol)および水酸化カリウム(２.２４４ｇ、４０.０mmol)をゆっくり添加した。混合物を室温で１６時間撹拌した。水を混合物に添加し、ＡｃＯＥｔで２回抽出し、塩水で洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥させ、濾過し、濃縮した。粗製の生成物をシリカゲルクロマトグラフィー(０〜２０％ＡｃＯＥｔ／ヘプタン)で精製して、２,３−ビス(プロプ−２−イニルオキシ)プロピルカルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチル(Ｉ−１３ａ：１.５８３ｇ、５９％)を無色油状物として得た。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ ppm 1.38 - 1.53 (m, 9 H) 2.47 (s, 2 H) 3.12 - 3.33 (m, 1 H) 3.46 (m, 1 H) 3.58 - 3.74 (m, 2 H) 3.76 - 3.91 (m, 1 H) 4.21 (t, J = 1.77 Hz, 2 H) 4.26 - 4.42 (m, 2 H) 4.93 (br. s., 1 H)。
中間体２,３−ビス(プロプ−２−イニルオキシ)プロパン−１−アミン(Ｉ−１３ｂ)の製造
２,３−ビス(プロプ−２−イニルオキシ)プロピルカルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチル(Ｉ−１３ａ：１.５８３ｇ、５.９２mmol)のＣＨ２Ｃｌ２(２３.６９mL)溶液に、０℃でＴＦＡ(４.５６mL、５９.２mmol)を添加した。混合物を室温で２時間撹拌した。濃縮し、１６時間ポンプで吸引して、２,３−ビス(プロプ−２−イニルオキシ)プロパン−１−アミンを黄色油状物として得て、そのまま次工程で使用した。LC-MS (M+1) 168.1, t = 0.44 min
中間体２−(２,３−ビス(プロプ−２−イニルオキシ)プロピルカルバモイル)ヒドラジンカルボン酸エチル(Ｉ−１３ｃ)の製造
クロロギ酸４−ニトロフェニル(１０８４mg、５.３８mmol)のＴＨＦ(１８mL)溶液に、０℃でカルバジン酸エチル(５６０mg、５.３８mmol)およびＥｔ３Ｎ(２.９８mL、２１.５２mmol)を添加した。混合物を０℃で１時間撹拌した。さらにＥｔ３Ｎ(２.９８mL、２１.５２mmol)を添加し、続いて２,３−ビス(プロプ−２−イニルオキシ)プロパン−１−アミン(Ｉ−１３ｂ：５.９２mmol)の５mL ＴＨＦ溶液を添加し、混合物を室温で３０分間撹拌した。水を添加し、ＡｃＯＥｔで２回抽出し、ＭｇＳＯ４で乾燥させ、濾過し、濃縮した。粗製の生成物をシリカゲルクロマトグラフィー(４０〜１００％ＡｃＯＥｔ／ヘプタン)で精製して、２−(２,３−ビス(プロプ−２−イニルオキシ)プロピルカルバモイル)ヒドラジンカルボン酸エチル(Ｉ−１３ｃ：８５５mg、５４％)を淡黄色油状物として得た。LC-MS (M+1) 298.2, t = 0.75 min
中間体４−(２,３−ビス(プロプ−２−イニルオキシ)プロピル)−１,２,４−トリアゾリジン−３,５−ジオン(Ｉ−１３ｄ)の製造
２−(２,３−ビス(プロプ−２−イニルオキシ)プロピルカルバモイル)ヒドラジンカルボン酸エチル(Ｉ−１３ｃ：８５５mg、２.８８mmol)のＥｔＯＨ(１４.４００mL)溶液に炭酸カリウム(１５９０mg、１１.５０mmol)を添加した。混合物を６５℃で１６時間撹拌した。室温に冷却後、混合物を濃縮した。１Ｎ ＨＣｌをｐＨ〜３まで添加し、ＡｃＯＥｔで２回抽出し、塩水で洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥させ、濾過し、濃縮した。残渣をシリカゲルクロマトグラフィー(３０〜１００％ＡｃＯＥｔ／ヘプタン)で精製し、シリカゲルクロマトグラフィー(０〜２０％ＭｅＯＨ／ＣＨ２Ｃｌ２)で歳精製して、４−(２,３−ビス(プロプ−２−イニルオキシ)プロピル)−１,２,４−トリアゾリジン−３,５−ジオン(Ｉ−１３ｄ：２３８mg、３３％)を無色油状物として得た。LC-MS (M+1) 252.1, t = 0.72 min. 1H NMR (400 MHz, CD3CN) δ ppm 2.69 (t, J = 2.27 Hz, 1 H) 2.76 (t, J = 2.27 Hz, 1 H) 3.47 - 3.69 (m, 4 H) 3.93 - 4.04 (m, 1 H) 4.20 (d, J = 2.27 Hz, 2 H) 4.22 - 4.28 (m, 2 H)
中間体４−(２,３−ビス(プロプ−２−イニルオキシ)プロピル)−３Ｈ−１,２,４−トリアゾール−３,５(４Ｈ)−ジオン(Ｉ−１３ｅ)の製造
４−(２,３−ビス(プロプ−２−イニルオキシ)プロピル)−１,２,４−トリアゾリジン−３,５−ジオン(Ｉ−１３ｄ：５０mg、０.１９９mmol)のＣＨ２Ｃｌ２(１.９９mL)溶液に、ＳｉＯ２−ＨＮＯ３(１５０mg)を添加した。混合物を室温で１５分間撹拌し、濾過し、真空で濃縮し、乾燥させて、４−(２,３−ビス(プロプ−２−イニルオキシ)プロピル)−３Ｈ−１,２,４−トリアゾール−３,５(４Ｈ)−ジオン(Ｉ−１３ｅ：５０mg、定量的)を赤色油状物として得た。
コンジュゲート(１３Ａ)を形成させるためのCRM197へのコンジュゲーション：
CRM197(０.００１μmol)のＴｒｉｓ ＨＣｌ(１００mM、ｐＨ７.４)(４０.０μL)に、４−(２,３−ビス(プロプ−２−イニルオキシ)プロピル)−３Ｈ−１,２,４−トリアゾール−３,５(４Ｈ)−ジオン(Ｉ−１３ｅ：０.２００μL、０.００５μmol)のＣＨ３ＣＮを毎分７回添加した(計３５当量)。混合物を室温で３０分間撹拌した。LCMS ESI: 58661.0 (+1), 58911.5 (+2), 59161.5 (+3), 59409.5 (+4), 59660.5 (+5)
実施例１４
CRM197と４−(４−(２,５−ジオキソ−２,５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル)ブチル)−３Ｈ−１,２,４−トリアゾール−３,５(４Ｈ)−ジオン(１４Ａ)とのコンジュゲーション
中間体４−(４−アミノブチル)−１,２,４−トリアゾリジン−３,５−ジオンヒドロクロライド(Ｉ−１４ａ)の製造
４−(３,５−ジオキソ−１,２,４−トリアゾリジン−４−イル)ブチルカルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチル(Ｉ−８ｂ：５９０mg、２.１６７mmol)のＣＨ２Ｃｌ２(１０.８００mL)溶液に、ＨＣｌのジオキサン溶液(５.４２mL、２１.６７mmol)を滴下した。混合物を室温で４時間撹拌し、濃縮し、ポンプで乾燥させて、４−(４−アミノブチル)−１,２,４−トリアゾリジン−３,５−ジオンヒドロクロライド(Ｉ−１４ａ：４６１mg、定量的)をベージュ色固体として得た。1H NMR (400 MHz, dmso-d6) δ ppm 1.41 - 1.71 (m, 4 H) 2.68 - 2.87 (m, 2 H) 3.37 (t, J = 6.44 Hz, 2 H) 7.86 (br. s., 2 H) 10.13 (s, 2 H)
中間体４−(４−(２,５−ジオキソ−２,５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル)ブチル)−１,２,４−トリアゾリジン−３,５−ジオン(Ｉ−１４ｂ)の製造
４−(４−アミノブチル)−１,２,４−トリアゾリジン−３,５−ジオンヒドロクロライド(Ｉ−１４ａ：４２mg、０.２０１mmolのＮａＨＣＯ３飽和水溶液(１.００６mL)に、０℃でＮ−メトキシカルボニルマレイミド(３１.２mg、０.２０１mmol)を添加した。混合物を０℃で１時間および室温で２時間撹拌した。混合物を分取ＨＰＬＣ(０〜６０％ＣＨ３ＣＮ／(０.１％ＴＦＡのＨ２Ｏ溶液))で精製し、凍結乾燥して、４−(４−(２,５−ジオキソ−２,５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル)ブチル)−１,２,４−トリアゾリジン−３,５−ジオン(Ｉ−１４ｂ：１０mg、２０％)を白色固体として得た。LC-MS (M+1) 253.3, t = 0.89 min. 1H NMR (400 MHz, CD3CN) δ ppm 1.51 - 1.62 (m, 4 H) 3.45 (t, J = 6.44 Hz, 2 H) 3.49 (t, J = 6.44 Hz, 2 H) 6.76 (s, 2 H) 7.52 (br. s., 2 H)
中間体４−(４−(２,５−ジオキソ−２,５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル)ブチル)−３Ｈ−１,２,４−トリアゾール−３,５(４Ｈ)−ジオン(Ｉ−１４ｃ)の製造
４−(４−(２,５−ジオキソ−２,５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル)ブチル)−１,２,４−トリアゾリジン−３,５−ジオン(Ｉ−１４ｂ：６mg、０.０２４mmol)のＣＨ２Ｃｌ２(０.９５mL)溶液に、ＳｉＯ２−ＨＮＯ３(５０mg)を添加した。混合物を室温で１５分間撹拌し、濾過し、真空で濃縮し、乾燥させて、４−(４−(２,５−ジオキソ−２,５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル)ブチル)−３Ｈ−１,２,４−トリアゾール−３,５(４Ｈ)−ジオン(Ｉ−１４ｃ：６mg、定量的)を桃色固体として得た。1H NMR (400 MHz, CD3CN) δ ppm 1.52 - 1.71 (m, 4 H) 3.49 (t, J = 6.44 Hz, 2 H) 3.59 (t, J = 6.69 Hz, 2 H) 6.77 (s, 2 H)
コンジュゲート(１４Ａ)を形成させるためのCRM197へのコンジュゲーション：
CRM197(０.０００５μmol)のＴｒｉｓ ＨＣｌ(１Ｍ、ｐＨ７.４)(２０.０μL)溶液に、４℃で４−(４−(２,５−ジオキソ−２,５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル)ブチル)−３Ｈ−１,２,４−トリアゾール−３,５(４Ｈ)−ジオン(Ｉ−１４ｃ：０.１００μL、０.００２５μmol)のアセトニトリル溶液を毎分４回添加した(計２０当量)。混合物を４℃で３０分間撹拌した。LCMS ESI: 58661 (+1), 58912 (+2), 59162 (+3), 59413 (+4), 59663 (+5)
実施例１５
GBS80と４−(４−(２,５−ジオキソ−２,５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル)ブチル)−３Ｈ−１,２,４−トリアゾール−３,５(４Ｈ)−ジオンのコンジュゲーション(１５Ａ)
GBS80(ＭＷ＝５２８３６、０.０００４μmol)のＴｒｉｓ(０.５Ｍ、ｐＨ７.４)(４０μL)溶液に、４℃で４−(４−(２,５−ジオキソ−２,５−ジヒドロ−１Ｈ−ピロール−１−イル)ブチル)−３Ｈ−１,２,４−トリアゾール−３,５(４Ｈ)−ジオン(Ｉ−１４ｃ：０.２μL、０.００４μmol)のアセトニトリル溶液を毎分８回添加した(計８０当量)。混合物を４℃で１５分間撹拌した。混合物をZeba 7K MWCO spinカラムを使用して２回脱塩し、炭酸アンモニウムｐＨ８.０に緩衝液を交換した。LCMS ESI: 53338 (+2), 53588 (+3), 53838 (+4), 54088 (+5)
実施例１６
GBS59と４−(４−(２−(２−(プロプ−２−イニルオキシ)エトキシ)エトキシ)フェニル)−３Ｈ−１,２,４−トリアゾール−３,５(４Ｈ)−ジオンのコンジュゲーション(１６Ａ)
GBS59(ＭＷ＝７７５４９、０.０４μmol)のＴｒｉｓ(０.２５Ｍ、ｐＨ７.４)(４０μL)に、４℃で４−(４−(２−(２−(プロプ−２−イニルオキシ)エトキシ)エトキシ)フェニル)−３Ｈ−１,２,４−トリアゾール−３,５(４Ｈ)−ジオン(Ｉ−６ｅ：８.０５μL、０.２０μmol)のアセトニトリル溶液を毎分６回添加した(計３０当量)。混合物を４℃で３０分間撹拌した。混合物をZeba 7K MWCO spinカラムを使用して３回脱塩し、ＰＢＳ ｐＨ７.４に緩衝液を交換した。LCMS ESI: 77879 (+1), 78202 (+2)
実施例１７
CRM197とＰＴＡＤおよびペントイン−１−アミンのコンジュゲーション(１７Ａ)
CRM197(０.０１７μmol)のＴｒｉｓ ＨＣｌ(１００mM、ｐＨ７.４)(６８０μL)溶液に、ペントイン−１−アミン(６.７μL、６８μmol)を添加し、ＰＴＡＤ(３.４μL、０.１７μmol)のＣＨ３ＣＮを毎分１２回添加した(計１２０当量)。混合物を室温で３０分間撹拌した。LCMS ESI: 58575 (+1), 58741 (+2), 58906 (+3), 59071 (+4)
実施例１８
GBS80と４−(２−(２−(２−(２−アジドエトキシ)エトキシ)エトキシ)エチル)−３Ｈ−１,２,４−トリアゾール−３,５(４Ｈ)−ジオンのコンジュゲーション(１８Ａ)
中間体１６−アジド−４−オキソ−８,１１,１４−トリオキサ−２,３,５−トリアザヘキサデカン−１−オン酸エチル(Ｉ−１８ａ)の製造
クロロギ酸４−ニトロフェニル(１００８mg、５.００mmol)のＴＨＦ(１７mL)溶液に、０℃でカルバジン酸エチル(０.５２１ｇ、５mmol)およびＥｔ３Ｎ(２.０８mL、１５.００mmol)を添加した。混合物を０℃で３０分間撹拌した。１１−アジド−３,６,９−トリオキサウンデカン−１−アミン(１.０９ml、５.５０mmol)の２mL ＴＨＦ溶液を添加し、混合物を室温で１６時間撹拌した。水を添加し、ＡｃＯＥｔで２回抽出し、ＭｇＳＯ４で乾燥させ、濾過し、濃縮した。粗製の生成物をシリカゲルクロマトグラフィー(４０〜１００％ＡｃＯＥｔ／ヘプタン、５％ＭｅＯＨ／ＡｃＯＥｔ)で精製して、１６−アジド−４−オキソ−８,１１,１４−トリオキサ−２,３,５−トリアザヘキサデカン−１−オン酸エチル(Ｉ−１８ａ：１.２３ｇ、７１％)を無色油状物として得た。LC-MS (M+1) 349.4, t = 1.63 min
中間体４−(２−(２−(２−(２−アジドエトキシ)エトキシ)エトキシ)エチル)−１,２,４−トリアゾリジン−３,５−ジオン(Ｉ−１８ｂ)の製造
エチル１６−アジド−４−オキソ−８,１１,１４−トリオキサ−２,３,５−トリアザヘキサデカン−１−オン酸エチル(Ｉ−１８ａ：１.１５ｇ、３.３０mmol)のＥｔＯＨ(１６.５mL)溶液に、炭酸カリウム(１８２５mg、１３.２mmol)を添加した。混合物を６５℃で１６時間撹拌した。室温に冷却後、混合物を濃縮した。１Ｎ ＨＣｌをｐＨ〜３まで添加し、ＡｃＯＥｔで２回抽出し、塩水で洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥させ、濾過し、濃縮した。残渣をシリカゲル(２５〜１００％ＡｃＯＥｔ／ヘプタン、５％ＭｅＯＨ／ＡｃＯＥｔ)で精製して、４−(２−(２−(２−(２−アジドエトキシ)エトキシ)エトキシ)エチル)−１,２,４−トリアゾリジン−３,５−ジオン(Ｉ−１８ｂ：１８３mg、１８％)を無色油状物として得た。LC-MS (M+1) 303.3, t = 0.71 min. 1H NMR (400 MHz, CD3CN) δ ppm 3.30 (s, 2 H) 3.40 (t, J = 4.80 Hz, 2 H) 3.50 - 3.71 (m, 12 H)
中間体４−(２−(２−(２−(２−アジドエトキシ)エトキシ)エトキシ)エチル)−３Ｈ−１,２,４−トリアゾール−３,５(４Ｈ)−ジオン(Ｉ−１８ｃ)の製造
４−(２−(２−(２−(２−アジドエトキシ)エトキシ)エトキシ)エチル)−１,２,４−トリアゾリジン−３,５−ジオン(Ｉ−１８ｃ：３mg、９.９２μmol)のＣＨ２Ｃｌ２(１mL)溶液に、ＳｉＯ２−ＨＮＯ３(２５mg)を添加した。混合物を室温で１５分間撹拌し、濾過し、真空で濃縮し、乾燥させて、４−(２−(２−(２−(２−アジドエトキシ)エトキシ)エトキシ)エチル)−３Ｈ−１,２,４−トリアゾール−３,５(４Ｈ)−ジオン(Ｉ−１８ｃ：３mg、定量的)を桃色油状物として得た。
コンジュゲート(１８Ａ)を形成するためのGBS80へのコンジュゲーション：
GBS80(ＭＷ＝５２８３６、０.００１μmol)のＴｒｉｓ(０.５Ｍ、ｐＨ７.４)(６７μL)に、４℃で４−(２−(２−(２−(２−アジドエトキシ)エトキシ)エトキシ)エチル)−３Ｈ−１,２,４−トリアゾール−３,５(４Ｈ)−ジオン(Ｉ−１８ｃ：０.２５μL、０.００５μmol)のアセトニトリル溶液を毎分４回添加した(計２０当量)。混合物を４℃で３０分間撹拌した。混合物をZeba 7K MWCO spinカラムを使用して２回脱塩し、ＰＢＳ ｐＨ７.４に緩衝液を交換した。LCMS ESI: 53137 (+1), 53438 (+2), 53738 (+3)
実施例１９
トリクロロアセトイミデート(acedimidate)ドナーを用いるグリコシル化の一般法
撹拌中の活性化４ÅＭＳ(０.７５ｇ)を含むアクセプター(１mmol)およびドナー(１.２mmol)の無水ＣＨ２Ｃｌ２(１５ml)溶液に、ＴＭＳＯＴｆ(０.２〜０.４mmol)を０℃で添加した。混合物は、ＴＬＣ(２：１シクロヘキサン−ＥｔＯＡｃ)が反応の完了を示したとき、３０分間撹拌した。混合物をトリエチルアミンで中和し、セライトパッドで濾過し、濾液を濃縮した。残渣のクロマトグラフィー(シクロヘキサン−ＥｔＯＡｃ)により、所望の生成物を得た。この方法を、実施例２１〜２２(下記)に略記した合成に応用した。
脱レブリノイル化(delevulinoylation)の一般法
３−Ｏ−Ｌｅｖオリゴ糖(１mmol)のＣＨ２Ｃｌ２(２５ml)溶液に、エチレンジアミン(０.２６ml、４mmol)およびＡｃＯＨ(０.２９ml、５mmol)を０℃で添加した。白色固体が形成され、脱保護が完了したとき(ＴＬＣ、シクロヘキサン−ＥｔＯＡｃ ２：１)、懸濁液を５〜６時間、５０℃で撹拌した。混合物を濃縮し、残渣のクロマトグラフィー(シクロヘキサン−ＥｔＯＡｃ)により、脱レブリノイル化生成物を得た。この方法を、実施例１５〜１６(下記)に略記した合成に応用した。
実施例２０
ラムノシド４の合成
実施例２１
四糖１２の合成
実施例２２
六糖１５の合成
実施例２３
コンジュゲート７Ａとアジド修飾糖４および１５のコンジュゲーション：
予め混合した５mM ＣｕＳＯ４.５Ｈ２Ｏ(５μl)および２５mM ＴＨＰＴＡ(５μl)の溶液を、窒素雰囲気下、コンジュゲート７Ａ(３００μg、０.００５μmol)の１００mM ＮａＰｉ ｐＨ７(７０μl)およびアジド４(０.１μmol)または１５(０.１５μmol)溶液に添加し、続いて５mM塩酸アミノグアニジン(５μl)および１０mMアスコルビン酸ナトリウム(５μl)を添加した。混合物を環境温度で１.５時間撹拌し、糖タンパク質を30 KDa Amicon遠心濾過機で１０mM ＥＤＴＡ／１０mM ＮａＰｉ ｐＨ７(２×１００μl)および１０mM ＮａＰｉ ｐＨ７(８×１００μl)を用いて洗浄し、続いて１０mM ＮａＰｉ ｐＨ７で再構成した。アジド４とのコンジュゲーションについて、回収した糖タンパク質の収率は９５％であった。アジド１５とのコンジュゲーションについて、回収した糖タンパク質(コンジュゲートＡ)の収率は８５％であった。アジド１５とのコンジュゲーションを図１に略記する。
本発明者らはまた異なる濃度の反応材、すなわち１０mM ＣｕＳＯ４.５Ｈ２Ｏ、２５mM塩酸アミノグアニジンおよびＴＨＰＴＡを５：１の比で０.２５μmol／ml Ｃｕ(Ｉ)と共に使用してコンジュゲーションを行っている。この変法において、混合物を１時間撹拌し、その後４０当量のアジドを添加し、続いて撹拌をさらに２時間続けた。複合多糖の負荷をマトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型マススペクトロメトリー(MALDI-TOF MS; UltraFlex III MALDI-TOF/TOF instrument, Bruker Daltonics)でリニアモードおよび陽イオン検出により決定した。分析サンプルを、２.５μlの生成物および２.５μlのSuper DHBマトリックスの混合により調製した。２.５μlの各混合物をサンプルプレートに付着させ、ｒｔで１０分間乾燥させ、スペクトロメーターに付した。結果を図２Ａ(アジド４のコンジュゲート)および２Ｂ(アジド１５のコンジュゲート、すなわちコンジュゲートＡ)に示す。
ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動法分析について、サンプル(５μg)を７％TrisAcetateゲルまたは４〜１２％Bis-Trisゲル(NuPage, Invitrogen)で電気泳動し、クーマシーブルーで染色した。結果を図２Ａ(アジド４のコンジュゲート、７％TrisAcetateゲル使用)および２Ｂ(アジド１５のコンジュゲート、すなわちコンジュゲートＡ、４〜１２％Bis-Trisゲル使用)に示す。
実施例２４
コンジュゲートＢを製造するためのコンジュゲート１３Ａとアジド修飾糖１５のコンジュゲーション：
コンジュゲーションを図３に記載のとおり行った。
実施例２５
コンジュゲートＣを製造するためのアジピン酸リンカーを介するCRM197の六糖へのコンジュゲーション(比較実施例)
アジド−結合糖１５および得られた六糖複合多糖の種々のバッチの特徴を表２に示す。
複合多糖の負荷をマトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型マススペクトロメトリー(MALDI-TOF MS; UltraFlex III MALDI-TOF/TOF instrument, Bruker Daltonics)でリニアモードおよび陽イオン検出により決定した。分析サンプルを、２.５μlの生成物および２.５μlのSuper DHBマトリックスの混合により調製した。２.５μlの各混合物をサンプルプレートに付着させ、ｒｔで１０分間乾燥させ、スペクトロメーターに付した。結果を図４および５に示す。
ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動法分析について、サンプル(５μg)を４〜１２％Bis-Trisゲル(NuPage, Invitrogen)で電気泳動し、クーマシーブルーで染色した。結果を図４および５に示す。
実施例２６
実施例２３〜２５のコンジュゲートでのマウス免疫化：
８匹のＣＤ１マウスの群を、１日目、１４日目および２８日目にコンジュゲート(２μg糖抗原／投与量)または陰性対照(ＰＢＳ)で免疫化し、いずれもＭＦ５９と製剤し、１５０μlの体積を皮下注射により送達した。０日目(免疫前血清)、２８日目(ポスト２血清)および４２日目(ポスト３血清)に採血した。
血清のＥＬＩＳＡ分析：
９６ウェルMaxisorbプレート(Nunc, Thermo Fisher Scientific)を、一夜、＋４℃で、０.０５Ｍ Ｎａ２ＣＯ３−ＮａＨＣＯ３緩衝液、ｐＨ９.６中、ラミナリン５μg／ウェルでコーティングした。コーティング後、プレートを３００μl／ウェルのリン酸化食塩水緩衝液(ＰＢＳ)と０.０５％Ｔｗｅｅｎ ２０(ＴＰＢＳ)、ｐＨ７.４で３回洗浄した。１００μlのウシ血清アルブミン(Fraction V, Sigma-Aldrich)を、ＴＰＢＳ中３％で添加し、プレートを１時間、３７℃でインキュベートすることによりブロッキング工程を行った。ブロッキング溶液をウェルあたりＴＰＢＳで３回洗浄することによりプレートから除去した。
２００μlの予希釈血清(免疫前１：２５、参照血清１：１００、試験血清１：５０)をプレートの各縦列の最初のウェルに添加し、他のウェルに１００μlのＴＰＢＳを分配した。各縦列に添った８個の２倍希釈を、ウェルからウェルに１００μlの血清溶液を写すことにより行った。一次Ａｂｓ希釈後、プレートを２時間、３７℃でインキュベートした。ＴＰＢＳで３回洗浄後、二次抗体アルキレンホスフェートコンジュゲート(抗マウスＩｇＧ １：１００００)の１００μl ＴＰＢＳ溶液を添加し、プレートを１時間、３７℃でインキュベートした。さらにＴＰＢＳで３回洗浄後、１００μl／ウェルの１Ｍ ジエタノールアミン緩衝液(ｐＨ９.８)中１mg／mlのｐ−ニトロフェニルリン酸二ナトリウム(Sigma-Aldrich)を添加した。プレートを、３０分間、室温でインキュベートし、その時点で４０５nmでBioradプレートリーダで読んだ。生データをMicroplate Manager Software(Biorad)で得た。血清力価を、カットオフ(光学密度)ＯＤ＝０.２に対応する血清希釈の逆数として示した。各免疫化群は、一マウス力価の幾何平均(ＧＭＴ)として示している。統計学的分析およびグラフ分析をGraphPad 5.0 softwareで行った。免疫化スケジュールの詳細を表３に略記する(下記)。アジュバントとしてのＭＦ５９と共にラミナリンでコートしたプレート上のマウス血清を使用した３回投与後の種々のコンジュゲートに対するＩｇＧ応答を図６に示す。
Ｌａｍ−ＣＲＭ＝CRM197にコンジュゲートしたラミナリン(ＷＯ０３／０９７０９１およびTorosantucci et al. (2005) J Exp Med 202: 597-606)

Claims (69)

  1. ｎ個のチロシン単位を含むポリペプチドを含む式(Ｉ−Ａ)
    〔ここで、ｎは１以上の整数であり、ポリペプチドのアミノ末端(Ａ１)および酸末端(Ａ２)を有するアミノ酸鎖
    内に分散しており、１０,０００ダルトン以上の重量平均分子量を有するものであり；
    Ｘは末端活性結合基(Ｌｇ)を有するスペーサーである。〕
    のコンジュゲートの製造方法であって、
    ｎ個のチロシン単位を含む式(Ｉａ)のタンパク質またはポリペプチドと、少なくとも１個の式(Ｉ−Ｉｂ)の４−置換−３Ｈ−１,２,４−トリアゾール−３,５(４Ｈ)−ジオンを、トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン緩衝液の存在下、約６.０〜約９.０のｐＨで反応させて、ｍ個のコンジュゲートしたチロシン単位を含む式(Ｉ−Ａ)のコンジュゲート(ここで、ｍはｎ以下の整数である)を製造する工程を含む、方法。
  2. ｎ個のチロシン単位を含むポリペプチドを含む式(Ｉ)
    〔ここで、ｎは１以上の整数であり、タンパク質またはポリペプチドのアミノ末端(Ａ１)および酸末端(Ａ２)を有するアミノ酸鎖
    内に分散しており、１０,０００ダルトン以上の重量平均分子量を有し、ここで、該式(Ｉ)のコンジュゲートはｍ個のチロシンコンジュゲートを含み、ここで、ｍはｎ未満の整数であり；
    ＬはスペーサーＸ’を含むリンカーであり、
    Ｒは治療剤、放射標識治療剤、蛍光剤、細胞毒性剤、ＤＮＡ、ＲＮＡ、脂質、ハプテンまたはポリマーである。〕
    のコンジュゲートの製造方法であって、
    ｎ個のチロシン単位を含む式(Ｉａ)のタンパク質またはポリペプチドと、少なくとも１個の式(Ｉｂ)の４−置換−３Ｈ−１,２,４−トリアゾール−３,５(４Ｈ)−ジオンを、トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン緩衝液の存在下、約６.０〜約９.０のｐＨで反応させて、ｍ個のコンジュゲートしたチロシン単位を含む式(Ｉ)のコンジュゲート(ここで、ｍはｎ以下の整数である)を製造する工程を含む、方法。
  3. ｎ個のチロシン単位を含むポリペプチドを含む式(Ｉ)
    〔ここで、ｎは１以上の整数であり、タンパク質またはポリペプチドのアミノ末端(Ａ１)および酸末端(Ａ２)を有するアミノ酸鎖
    内に分散しており、１０,０００ダルトン以上の重量平均分子量を有し、ここで、該式(Ｉ)のコンジュゲートはｍ個のチロシンコンジュゲートを含み、ここで、ｍはｎ未満の整数であり；
    ＬはスペーサーＸ’を含むリンカーであり、Ｒは治療剤、放射標識治療剤、蛍光剤、細胞毒性剤、ＤＮＡ、ＲＮＡ、脂質、ハプテンまたはポリマーである。〕
    のコンジュゲートの製造方法であって、式(Ｉ−Ａ)のコンジュゲートとＲＬを反応させて、式(Ｉ)のコンジュゲートを形成させる工程を含む、方法
    〔ここで、Ｘは末端活性結合基(Ｌｇ)を有するスペーサーであり、
    ＲＬは結合基(Ｌｇ)と反応できる置換基で場合により置換されていてよいＲである。〕。
  4. 該Ｔｒｉｓ緩衝液がトリス(ヒドロキシメチル)−アミノメタン、ホウ酸およびエチレンジアミンテトラ酢酸を含むＴＢＥ緩衝液である、請求項１、２または３に記載の方法。
  5. 該Ｔｒｉｓ緩衝液がトリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン、酢酸およびエチレンジアミンテトラ酢酸を含むＴＡＥ緩衝液である、請求項１、２または３に記載の方法。
  6. 該Ｔｒｉｓ緩衝液が求核性アミンを含む、請求項１、２または３に記載の方法。
  7. 該求核性アミンがメチルアミンまたはジエチルアミンである、請求項６に記載の方法。
  8. 該ポリペプチドが抗体である、請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
  9. 該ポリペプチドが抗原性ペプチドである、請求項１、２、３、４、５、６または７のいずれかに記載の方法。
  10. 該ポリペプチドがキャリアタンパク質である、請求項１、２、３、４、５、６または７のいずれかに記載の方法。
  11. 該キャリアタンパク質がジフテリアまたは破傷風トキシンまたはトキソイドまたはその変異体である、請求項１０に記載の方法。
  12. 該キャリアタンパク質がCRM197ジフテリアトキシン変異体である、請求項１１に記載の方法。
  13. Ｒが多糖である、請求項２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１または１２のいずれかに記載の方法。
  14. 多糖が５〜７グルコース単糖単位を含むグルカンである、請求項１３に記載の方法。
  15. グルカンが６グルコース単糖単位を有するカードランである、請求項１４に記載の方法。
  16. ｎ個のチロシン単位を含むポリペプチドを含む式(Ｉ−Ａ)
    〔ここで、ｎは１以上の整数であり、タンパク質またはポリペプチドのアミノ末端(Ａ１)および酸末端(Ａ２)を有するアミノ酸鎖
    内に分散しており、１０,０００ダルトン以上の重量平均分子量を有するものであり；
    Ｘは末端活性結合基(Ｌｇ)を有するスペーサーである。〕
    のコンジュゲートであって、ｎ個のチロシン単位を含む式(Ｉａ)のタンパク質またはポリペプチドと、少なくとも１個の式(Ｉ−Ｉｂ)の４−置換−３Ｈ−１,２,４−トリアゾール−３,５(４Ｈ)−ジオンを、トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン緩衝液の存在下、約６.０〜約９.０のｐＨで反応させて、ｍ個のコンジュゲートしたチロシン単位を含む式(Ｉ−Ａ)のコンジュゲート(ここで、ｍはｎ以下の整数である)を得る工程を含む方法により製造される、式(Ｉ−Ａ)のコンジュゲート
  17. 該ポリペプチドが抗体である、請求項１６に記載のコンジュゲート。
  18. 該ポリペプチドが抗原性ペプチドである、請求項１６に記載のコンジュゲート。
  19. 該ポリペプチドがキャリアタンパク質である、請求項１６に記載のコンジュゲート。
  20. 該キャリアタンパク質がジフテリアまたは破傷風トキシンまたはトキソイドまたはその変異体である、請求項１９に記載のコンジュゲート。
  21. 該キャリアタンパク質がCRM197ジフテリア毒素変異体である、請求項２０に記載のコンジュゲート。
  22. ｎ個のチロシン単位を含むポリペプチドを含む式(Ｉ)
    〔ここで、ｎは１以上の整数であり、タンパク質またはポリペプチドのアミノ末端(Ａ１)および酸末端(Ａ２)を有するアミノ酸鎖
    内に分散しており、１０,０００ダルトン以上の重量平均分子量を有し、ここで、該式(Ｉ)のコンジュゲートがｍ個のチロシンコンジュゲートを含み、ここで、ｍはｎ未満の整数であり；
    ＬはスペーサーＸ’を含むリンカーであり、Ｒは治療剤、放射標識治療剤、蛍光剤、細胞毒性剤、ＤＮＡ、ＲＮＡ、脂質、ハプテンまたはポリマーである。〕
    のコンジュゲートであって、式(Ｉ−Ａ)のコンジュゲーとＲＬを反応させて、式(Ｉ)のコンジュゲートを製造する工程を含む方法により製造される、式(Ｉ)のコンジュゲート
    〔ここで、Ｘは末端活性結合基(Ｌｇ)を有するスペーサーであり、ＲＬは結合基(Ｌｇ)と反応できる置換基で場合により置換されていてよいＲである；
    但し、該ポリペプチドがキモトリプシノーゲンＡ、ミオグロビン(myoblobin)またはウシ血清アルブミンであり、Ｒがローダミン色素であるときまたは該ポリペプチドがハーセプチンであり、Ｒがインテグリン結合環状アルギニン−グリシン−アスパラギン(ＲＧＤ)ペプチドであるとき、Ｘ−Ｌｇは
    ではない。〕。
  23. 該ポリペプチドが抗体である、請求項２２に記載のコンジュゲート。
  24. 該ポリペプチドが抗原性ペプチドである、請求項２２に記載のコンジュゲート。
  25. 該ポリペプチドがキャリアタンパク質である、請求項２２に記載のコンジュゲート。
  26. 該キャリアタンパク質がジフテリアまたは破傷風トキシンまたはトキソイドまたはその変異体である、請求項２５に記載のコンジュゲート。
  27. 該キャリアタンパク質がCRM197ジフテリア毒素変異体である、請求項２６に記載のコンジュゲート。
  28. Ｒが多糖である、請求項２２、２３、２４、２５、２６または２７のいずれかに記載のコンジュゲート。
  29. 多糖が５〜７グルコース単糖単位を含むグルカンである、請求項２８に記載のコンジュゲート。
  30. グルカンが６グルコース単糖単位を有するカードランである、請求項２９に記載のコンジュゲート。
  31. 次の式
    を有する、請求項２２に記載のコンジュゲート。
  32. 次の式
    を有する、請求項２２に記載のコンジュゲート。
  33. ｎ個のチロシン単位を含むポリペプチドを含む式(Ｉ)
    〔ここで、ｎは１以上の整数であり、タンパク質またはポリペプチドのアミノ末端(Ａ１)および酸末端(Ａ２)を有するアミノ酸鎖
    内に分散しており、１０,０００ダルトン以上の重量平均分子量を有し、ここで、該式(Ｉ)のコンジュゲートはｍ個のチロシンコンジュゲートを含み、ここで、ｍはｎ未満の整数であり；
    ＬはスペーサーＸ’を含むリンカーであり、Ｒは治療剤、放射標識治療剤、蛍光剤、細胞毒性剤、ＤＮＡ、ＲＮＡ、脂質、ハプテンまたはポリマーである。〕
    のコンジュゲートであって、ｎ個のチロシン単位を含む式(Ｉａ)のタンパク質またはポリペプチドと、少なくとも１個の式(Ｉｂ)の４−置換−３Ｈ−１,２,４−トリアゾール−３,５(４Ｈ)−ジオンを、トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン緩衝液の存在下、約６.０〜約９.０のｐＨで反応させて、ｍ個のコンジュゲートしたチロシン単位を含む式(Ｉ)のコンジュゲート(ここで、ｍがｎ以下の整数である)を製造する工程を含む方法により製造されている、式(Ｉ)のコンジュゲート
    〔但し、該ポリペプチドがキモトリプシノーゲンＡ、ミオグロビン(myoblobin)またはウシ血清アルブミンであるとき、Ｒがローダミン色素ではなく、そして、該ポリペプチドがハーセプチンであるとき、Ｒがインテグリン結合環状アルギニン−グリシン−アスパラギン(ＲＧＤ)ペプチドではない。〕。
  34. 該ポリペプチドが抗体である、請求項３３に記載のコンジュゲート。
  35. 該ポリペプチドが抗原性ペプチドである、請求項３３に記載のコンジュゲート。
  36. 該ポリペプチドがキャリアタンパク質である請求項３３に記載のコンジュゲート。
  37. 該キャリアタンパク質がジフテリアまたは破傷風トキシンまたはトキソイドまたはその変異体である、請求項３６に記載のコンジュゲート。
  38. 該キャリアタンパク質がCRM197ジフテリア毒素変異体である、請求項３７に記載のコンジュゲート。
  39. Ｒが多糖である、請求項３３、３４、３５、３６、３７または３８のいずれかに記載のコンジュゲート。
  40. 多糖が５〜７グルコース単糖単位を含むグルカンである、請求項３９に記載のコンジュゲート。
  41. グルカンが６グルコース単糖単位を有するカードランである、請求項４０に記載のコンジュゲート。
  42. 次の式
    を有する、請求項３３に記載のコンジュゲート。
  43. 次の式
    を有する、請求項３３に記載のコンジュゲート。
  44. 式(Ｉｂ)
    〔ここで、ＬがスペーサーＸ’を含むリンカーであり、Ｒが治療剤、放射標識治療剤、蛍光剤、細胞毒性剤、ＤＮＡ、ＲＮＡ、脂質、ハプテンまたはポリマーである；
    但しＲがローダミン色素またはインテグリン結合環状アルギニン−グリシン−アスパラギン(ＲＧＤ)ペプチドではない。〕
    のコンジュゲート。
  45. Ｒが多糖である、請求項４４に記載のコンジュゲート。
  46. 多糖が５〜７グルコース単糖単位を含むグルカンである、請求項４５に記載のコンジュゲート。
  47. グルカンが６グルコース単糖単位を有するカードランである、請求項４６に記載のコンジュゲート。
  48. ｎ個のチロシン単位を含むポリペプチドを含む式(Ｉ−Ａ)
    〔ここで、ｎが１以上の整数であり、タンパク質またはポリペプチドのアミノ末端(Ａ１)および酸末端(Ａ２)を有するアミノ酸鎖
    内に分散しており、１０,０００ダルトン以上の重量平均分子量を有するものであり；
    Ｘが末端活性結合基(Ｌｇ)を有するスペーサーである。〕
    のコンジュゲート。
  49. 該ポリペプチドが抗体である、請求項４８に記載のコンジュゲート。
  50. 該ポリペプチドが抗原性ペプチドである、請求項４８に記載のコンジュゲート。
  51. 該ポリペプチドがキャリアタンパク質である、請求項４８に記載のコンジュゲート。
  52. 該キャリアタンパク質がジフテリアまたは破傷風トキシンまたはトキソイドまたはその変異体である、請求項５１に記載のコンジュゲート。
  53. 該キャリアタンパク質がCRM197ジフテリア毒素変異体である、請求項５２に記載のコンジュゲート。
  54. 式
    〔ここで、Ｘが末端活性結合基(Ｌｇ)を有するスペーサーである。〕
    を有する、少なくとも１個のコンジュゲートしたチロシン残基を含む抗体または抗体フラグメントを含む、式(Ｘａ)のコンジュゲート。
  55. ｎ個のチロシン単位を含むポリペプチドを含む式(Ｉ)
    〔ここで、ｎが１以上の整数であり、タンパク質またはポリペプチドのアミノ末端(Ａ１)および酸末端(Ａ２)を有するアミノ酸鎖
    内に分散しており、１０,０００ダルトン以上の重量平均分子量を有し、ここで、該式(Ｉ)のコンジュゲートがｍ個のチロシンコンジュゲートを含み、ここで、ｍがｎ未満の整数であり；
    ＬがスペーサーＸ’を含むリンカーであり、Ｒが治療剤、放射標識治療剤、蛍光剤、細胞毒性剤、ＤＮＡ、ＲＮＡ、脂質、ハプテンまたはポリマーである。〕
    のコンジュゲート。
  56. 該ポリペプチドが抗体である、請求項５５に記載のコンジュゲート。
  57. 該ポリペプチドが抗原性ペプチドである、請求項５５に記載のコンジュゲート。
  58. 該ポリペプチドがキャリアタンパク質である、請求項５５に記載のコンジュゲート。
  59. 該キャリアタンパク質がジフテリアまたは破傷風トキシンまたはトキソイドまたはその変異体である、請求項５８に記載のコンジュゲート。
  60. 該キャリアタンパク質がCRM197ジフテリア毒素変異体である、請求項５９に記載のコンジュゲート。
  61. Ｒが多糖である、請求項５５、５６、５７、５８、５９または６０のいずれかに記載のコンジュゲート。
  62. 多糖が５〜７グルコース単糖単位を含むグルカンである、請求項６１に記載のコンジュゲート。
  63. グルカンが６グルコース単糖単位を有するカードランである、請求項６２に記載のコンジュゲート。
  64. 次の式
    を有する、請求項５５に記載のコンジュゲート。
  65. 次の式
    を有する、請求項５５に記載のコンジュゲート。
  66. 式
    〔ここで、ＬがスペーサーＸ’を含むリンカーであり、Ｒが治療剤、放射標識治療剤、蛍光剤、細胞毒性剤、ＤＮＡ、ＲＮＡ、脂質、ハプテンまたはポリマーである。〕
    の少なくとも１個のコンジュゲートしたチロシン残基を含む抗体または抗体フラグメントを含む、式(Ｘｂ)のコンジュゲート。
  67. 医薬として使用するための、請求項２２〜４３または請求項５５〜６６のいずれかに記載のコンジュゲート。
  68. 請求項２２〜４３または請求項５５〜６６のいずれかに記載のコンジュゲートを薬学的に許容される担体と組み合わせて含む、医薬組成物。
  69. 哺乳動物における免疫応答を誘導する方法であって、請求項２２〜４３または請求項５５〜６６のいずれかに記載のコンジュゲートまたは請求項６８に記載の医薬組成物を哺乳動物に投与することを含む、方法。
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