JP2013516401A - Ｅ．ｃｏｌｉキャリアタンパク質に結合体化した多糖免疫原 - Google Patents

Abstract

Ｅ．ｃｏｌｉタンパク質と結合体化した多糖免疫原に対する応答を改善するためのキャリアタンパク質として有用なＥ．ｃｏｌｉタンパク質が同定された。特に、ＡｃｆＤ前駆体タンパク質（ｏｒｆ３５２６ポリペプチド）、Ｆｌｕ抗原４３タンパク質（ｏｒｆ１３６４ポリペプチド）およびＳｅｌ１反復含有タンパク質（ｕｐｅｃ−５２１１ポリペプチド）が、有効であることが示された。さらに、これらのＥ．ｃｏｌｉタンパク質は、グルカン、特に真菌グルカンに対する免疫応答を増進できる。

Description

本発明は、Ｅ．ｃｏｌｉキャリアポリペプチドに結合体化した多糖免疫原を用いる免疫化に関する。特に興味があるものは、細菌感染および真菌感染ならびに疾患に対するワクチンとしてのそのような組成物の使用である。

キャリアタンパク質は、多糖免疫原に対する免疫応答を改善するために用いられる。このようなキャリアタンパク質は、非常に若年のものにおける免疫応答を誘導するために特に有利であり得るので、いくつかの小児ワクチンで見出される。推奨される小児免疫化計画は、出生時Ｂ型肝炎ワクチン；生後６週で開始するジフテリア／破傷風／百日咳（ＤＴａＰ）、ロタウイルス、Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ ｂ型（Ｈｉｂ）結合体、不活化ポリオウイルスおよび肺炎球菌結合体の全て；生後６カ月で開始する不活化インフルエンザワクチン；生後１２カ月で開始する麻疹／流行性耳下腺炎／風疹（ＭＭＲ）、水痘およびＡ型肝炎；ならびに２歳以降の髄膜炎菌結合体を含むかなりの数のワクチンを含む。このリストのうち、以下のものは多糖結合体である：Ｈｉｂ結合体（例えばＨｂＯＣ−ジフテリアＣＲＭ_１９７結合体）；肺炎球菌結合体（例えばＰｒｅｖｎａｒ−ジフテリアＣＲＭ_１９７結合体およびＳｙｎｆｌｏｒｉｘ−分類不能型Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ株に由来するタンパク質キャリア）；および髄膜炎菌結合体（例えばＭｅｎａｃｔｒａ−ジフテリアＣＲＭ_１９７結合体）。

現在の小児免疫化計画に新しいワクチンを追加することは、対処しなければならない２つの潜在的な問題に遭遇する可能性がある。まず、キャリア誘導性エピトープ抑制（または一般的に公知であるように「キャリア抑制」）、特にキャリア初回免疫（ｃａｒｒｉｅｒ ｐｒｉｍｉｎｇ）から生じる抑制の問題に対処しなければならない。「キャリア抑制」は、それにより、キャリアタンパク質を用いる動物の予備免疫化が、そのキャリア上に提示された新しい抗原性エピトープに対する免疫応答を後で動物が惹起することを妨げる現象である（非特許文献１）。

非特許文献２において報告されるように、いくつかのワクチン抗原が同じタンパク質成分（結合体において免疫原および／またはキャリアタンパク質として用いられる）を含有するならば、これらの抗原間で干渉する可能性がある。Ｓｃｈｕｔｚｅらは、破傷風トキソイド（Ｔｔ）キャリアに結合体化した抗原に対する免疫応答が、Ｔｔに対して予め存在する免疫により抑制されたことを観察した。

Ｄａｇａｎらは、Ｈｉｂ結合体についてのキャリアがＤＴＰワクチンからの破傷風抗原と同じである場合に、ＤＴＰワクチンとＨｉｂ結合体ワクチンとの組み合わせが、有害な影響を受けたことを観察した（非特許文献３）。Ｄａｇａｎらは、共通のタンパク質キャリアによる干渉から生じるこの「キャリア抑制」現象を、複数の結合体を含むワクチンを導入する場合に考慮すべきであると結論付けている。

ＳｃｈｕｔｚｅらおよびＤａｇａｎらとは対照的に、Ｂａｒｉｎｇｔｏｎらは、破傷風トキソイドでの初回免疫が、後で投与されたＨｉｂ−Ｔｔ結合体に対する免疫応答に対して負の影響を有さないが、母体から獲得した抗Ｔｔ抗体を有する患者で抑制が見られたことを報告した（（１９９４年）Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ ６２巻：９〜１４頁）。しかし、Ｄｉ Ｊｏｈｎらは、破傷風ワクチン接種に起因する既存の抗Ｔｔ抗体を有する患者において、Ｔｔベースのペプチド結合体について「エピトープ抑制」効果を観察した（（１９８９年）Ｌａｎｃｅｔ ２巻（８６７７号）：１４１５〜８頁）。

Ｇｒａｎｏｆｆらは、ＣＲＭ_１９７（ジフテリア毒素の解毒化変異体）をキャリアとして有する結合体が、ワクチンの一部として（例えばＤＴＰまたはＤＴワクチンの一部として）ジフテリア毒素を以前に受けていない小児において無効であり得ることを示唆した（（１９９３年）Ｖａｃｃｉｎｅ Ｓｕｐｐｌ １巻：Ｓ４６〜５１頁）。この研究は、Ｇｒａｎｏｆｆら（１９９４年）ＪＡＭＡ ２７２巻：１１１６〜１１２１頁においてさらに発展し、ここでは、Ｄ−Ｔ免疫化によるキャリア初回免疫効果が、Ｈｉｂ結合体でのその後の免疫化に対して持続することが観察された。

Ｂａｒｉｎｇｔｏｎら（１９９３年）Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ ６１巻：４３２〜４３８頁では、著者らは、ジフテリアまたは破傷風トキソイドキャリアタンパク質での予備免疫化が、これらのキャリアに結合体化したＨｉｂ莢膜糖でのその後の免疫化の後の抗Ｈｉｂ抗体レベルの増加を低減した（ＩｇＧ１およびＩｇＧ２は等しく影響を受けた）ことを見出した。結合体のキャリア部分に対する応答も抑制された。さらに、１つの結合体を用いる予備免疫化が、４週間後に投与された第２の結合体のキャリアと糖部分との両方に対する免疫応答に影響したことが観察されたので、より全般的なエピトープ非特異的抑制が観察された。

したがって、「キャリア抑制」の影響に関する混乱を鑑みると、結合体化のために利用可能な追加のキャリアタンパク質を有することは、このような有害な相互作用を低減するために有益である。

次に、既に混み合った免疫化計画に鑑みると、免疫化計画に新しいワクチンを追加することは、潜在的な有害相互作用に起因するが、また、単に、必要とされる別々の注射の数のために、ますます困難になっている。したがって、ＤＴａＰまたはＭＭＲワクチンのように単一の注射にワクチンを組み合わせることができることが有利である。多糖免疫原に対する免疫応答を増進できるとともにそれ自体に対する免疫応答を誘導できる追加のキャリアタンパク質を有することは、異なる病原体に対するワクチンを単一の注射用組成物に組み合わせることを可能にできるので、有益である。

Ｈｅｒｚｅｎｂｅｒｇら、Ｎａｔｕｒｅ（１９８０年）２８５巻：６６４〜６６７頁 Ｓｃｈｕｔｚｅら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ（１９８５年）１３５巻：２３１９〜２３２２頁 Ｄａｇａｎら、Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ（１９９８年）６６巻：２０９３〜２０９８頁

多糖免疫原への結合体化のためのさらなるおよび／またはよりよいキャリアポリペプチドを提供することが、本発明の目的である。多糖免疫原への結合体化のためのキャリアポリペプチドであって、病原性Ｅ．ｃｏｌｉ株、より具体的には腸内病原型（例えばＥＡＥＣ株、ＥＩＥＣ株、ＥＰＥＣ株およびＥＴＥＣ株）およびＥｘＰＥＣ病原型に対する免疫化において用いることができるキャリアポリペプチドを提供することも、本発明の目的である。多糖免疫原がグルカン多糖であり、いくつかの実施形態では真菌病原体に対する免疫化において用いることができる、このようなさらなるおよび／またはよりよいキャリアポリペプチドを有する結合体を提供することも、本発明の目的である。

したがって、本発明の一態様は、Ｅ．ｃｏｌｉ ＡｃｆＤ前駆体タンパク質（ｏｒｆ３５２６ポリペプチド）、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｆｌｕ抗原４３タンパク質（ｏｒｆ１３６４ポリペプチド）およびＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ Ｓｅｌ１反復含有タンパク質（ｕｐｅｃ−５２１１ポリペプチド）からなる群より選択されるキャリアポリペプチドに結合体化したグルカン多糖を含むグルカン多糖結合体を提供する。キャリアポリペプチドがＥ．ｃｏｌｉ ＡｃｆＤ前駆体タンパク質（ｏｒｆ３５２６ポリペプチド）である場合、キャリアポリペプチドは、（ａ）配列番号５０のアミノ酸配列を有し、（ｂ）配列番号５０と比較して１から１０までの単一アミノ酸変更を有するアミノ酸配列を有し、（ｃ）配列番号５０と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有し、（ｄ）配列番号５０からの少なくとも１０、少なくとも１２、少なくとも１４、少なくとも１６、少なくとも１８、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも７５、少なくとも１００、少なくとも１２５もしくは少なくとも１５０連続するアミノ酸の断片を含み、かつ／または（ｅ）ペアワイズアラインメントアルゴリズムを用いて配列番号５０とアラインメントさせた場合に、Ｎ末端からＣ末端までのｘアミノ酸のそれぞれの移動ウィンドウが、少なくともｘ・ｙ（ここで、ｘは３０であり、ｙは０．７５である）の同一のアラインメントされたアミノ酸を有するものであり得る。キャリアポリペプチドがＥ．ｃｏｌｉ Ｆｌｕ抗原４３タンパク質（ｏｒｆ１３６４ポリペプチド）である場合、キャリアポリペプチドは、（ａ）配列番号４４のアミノ酸配列を有し、（ｂ）配列番号４４と比較して１から１０までの単一アミノ酸変更を有するアミノ酸配列を有し、（ｃ）配列番号４４と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有し、（ｄ）配列番号４４からの少なくとも１０、少なくとも１２、少なくとも１４、少なくとも１６、少なくとも１８、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも７５、少なくとも１００、少なくとも１２５もしくは少なくとも１５０連続するアミノ酸の断片を含み、かつ／または（ｅ）ペアワイズアラインメントアルゴリズムを用いて配列番号４４とアラインメントさせた場合に、Ｎ末端からＣ末端までのｘアミノ酸のそれぞれの移動ウィンドウが、少なくともｘ・ｙ（ここで、ｘは３０であり、ｙは０．７５である）の同一のアラインメントされたアミノ酸を有するものであり得る。キャリアポリペプチドがＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ Ｓｅｌ１反復含有タンパク質（ｕｐｅｃ−５２１１ポリペプチド）である場合、キャリアポリペプチドは、（ａ）配列番号４８のアミノ酸配列を有し、（ｂ）配列番号４８と比較して１から１０までの単一アミノ酸変更を有するアミノ酸配列を有し、（ｃ）配列番号４８と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有し、（ｄ）配列番号４８からの少なくとも１０、少なくとも１２、少なくとも１４、少なくとも１６、少なくとも１８、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも７５、少なくとも１００、少なくとも１２５もしくは少なくとも１５０連続するアミノ酸の断片を含み、かつ／または（ｅ）ペアワイズアラインメントアルゴリズムを用いて配列番号４８とアラインメントさせた場合に、Ｎ末端からＣ末端までのｘアミノ酸のそれぞれの移動ウィンドウが、少なくともｘ・ｙ（ここで、ｘは３０であり、ｙは０．７５である）の同一のアラインメントされたアミノ酸を有するものであり得る。任意の先行する実施形態と組み合わせ得るある実施形態では、グルカン多糖は、β−１，３連結および／またはβ−１，６連結を含有する。任意の先行する実施形態と組み合わせ得るある実施形態では、グルカン多糖は、単一分子種である。任意の先行する実施形態と組み合わせ得るある実施形態では、グルカン多糖は、キャリアタンパク質に直接結合体化しているかまたはリンカーを介して結合体化している。任意の先行する実施形態と組み合わせ得るある実施形態では、グルカン多糖は、１００ｋＤａ未満（例えば８０ｋＤａ未満、７０ｋＤａ未満、６０ｋＤａ未満、５０ｋＤａ未満、４０ｋＤａ未満、３０ｋＤａ未満、２５ｋＤａ未満、２０ｋＤａ未満または１５ｋＤａ未満）の分子量を有する。任意の先行する実施形態と組み合わせ得るある実施形態では、グルカン多糖は、６０以下（例えば５９、５８、５７、５６、５５、５４、５３、５２、５１、５０、４９、４８、４７、４６、４５、４４、４３、４２、４１、４０、３９、３８、３７、３６、３５、３４、３３、３２、３１、３０、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５または４）のグルコース単糖単位を有する。任意の先行する実施形態と組み合わせ得るある実施形態では、グルカン多糖は、いくらかのβ−１，６分岐を有するβ−１，３グルカン多糖である。多糖がいくらかのβ−１，６分岐を有するβ−１，３グルカン多糖である、ある実施形態では、グルカン多糖は、ラミナリンである。任意の先行する実施形態と組み合わせ得るある実施形態では、グルカン多糖は、β−１，３連結グルコース残基とβ−１，６連結グルコース残基の両方を、少なくとも８：１のβ−１，３連結グルコース残基対β−１，６連結残基の比で含み、かつ／またはβ−１，３連結によってのみ他の残基と連結した少なくとも５の近接非末端残基の１もしくは複数の配列が存在する。任意の先行する実施形態と組み合わせ得るある実施形態では、グルカン多糖は、β−１，３連結グルコース残基とβ−１，６連結グルコース残基の両方を、少なくとも８：１のβ−１，３連結グルコース残基対β−１，６連結残基の比で含む。β−１，６連結残基を有するものを除く任意の先行する実施形態と組み合わせ得るある実施形態では、グルカン多糖は、β−１，３連結のみを有する。任意の先行する実施形態と組み合わせ得るある実施形態では、グルカン多糖は、カードランである。任意の先行する実施形態と組み合わせ得るある実施形態では、グルカン多糖結合体は、アジュバントをさらに含む。

本発明の別の態様は、先行する態様による、任意のその実施形態におけるグルカン多糖結合体を含むワクチン成分を提供する。

本発明のまた別の態様は、先行する態様のワクチン成分を含むワクチンを提供する。ある実施形態では、ワクチンは、アジュバントをさらに含む。先行する実施形態と組み合わせ得るある実施形態では、ワクチンは、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ抗原、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ抗原、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ抗原、Ｍｏｒａｘｅｌｌａ ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ抗原、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ抗原、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ抗原、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｓ抗原、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｅｔａｎｉ抗原、Ｃｏｒｎｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｈｔｅｒｉａｅ抗原、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ Ｂ型（Ｈｉｂ）抗原、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ抗原、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ抗原、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ抗原、Ｎｅｉｓｅｒｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ抗原、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ抗原、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｐａｌｌｉｄｕｍ抗原、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｄｕｃｒｅｙｉ抗原、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ抗原、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ抗原、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ抗原、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｓａｐｒｏｐｈｙｔｉｃｕｓ抗原、Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａ抗原、追加のＥ．ｃｏｌｉ抗原、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉｓ抗原、Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｐｅｓｔｉｓ抗原、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ抗原、Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ抗原、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ抗原、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ抗原、Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ抗原、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉ抗原、Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ抗原、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ抗原、Ｓｈｉｇｅｌｌａ抗原およびＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ抗原から選択される追加のワクチン成分をさらに含む。先行する実施形態と組み合わせ得るある好ましい実施形態では、ワクチンは、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ抗原、Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ抗原、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ抗原またはＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ抗原を含み得る院内感染に関連する細菌から選択される追加のワクチン成分をさらに含む。

本発明のまたさらに別の態様は、哺乳類被験体におけるグルカン多糖に対する増進した免疫応答を誘導する方法であって、哺乳類被験体に、先行する態様による、任意のその実施形態におけるグルカン多糖結合体、先行する態様によるワクチン成分、または先行する態様による、任意のその実施形態におけるワクチンを投与することを含む方法を提供する。

本発明の別の態様は、哺乳類被験体における多糖に対する増進した免疫応答を誘導するための、先行する態様による、任意のその実施形態におけるグルカン多糖結合体、先行する態様によるワクチン成分、または先行する態様による、任意のその実施形態におけるワクチンの使用を提供する。

本発明のまた別の態様は、Ｅ．ｃｏｌｉ ＡｃｆＤ前駆体タンパク質（ｏｒｆ３５２６ポリペプチド）、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｆｌｕ抗原４３タンパク質（ｏｒｆ１３６４ポリペプチド）およびＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ Ｓｅｌ１反復含有タンパク質（ｕｐｅｃ−５２１１ポリペプチド）からなる群より選択されるキャリアポリペプチドに結合体化した多糖を含む多糖結合体を提供する。キャリアポリペプチドがＥ．ｃｏｌｉ ＡｃｆＤ前駆体タンパク質（ｏｒｆ３５２６ポリペプチド）である実施形態では、キャリアポリペプチドは、配列番号３９のＥ．ｃｏｌｉ ＡｃｆＤ前駆体タンパク質（ｏｒｆ３５２６ポリペプチド）と比較して毒性を低減する変異および／または精製を改善する欠失を含んでよい。キャリアポリペプチドが毒性を低減する変異を有するＥ．ｃｏｌｉ ＡｃｆＤ前駆体タンパク質（ｏｒｆ３５２６ポリペプチド）である先行する実施形態と組み合わせ得る別の実施形態では、変異は、ｚｉｎｃｉｎメタロプロテアーゼドメインの全部または一部の欠失、およびプロテアーゼ活性を低減するｚｉｎｃｉｎメタロプロテアーゼドメイン中の点変異から選択してよい。キャリアポリペプチドが毒性を低減する変異を有するＥ．ｃｏｌｉ ＡｃｆＤ前駆体タンパク質（ｏｒｆ３５２６ポリペプチド）である先行する実施形態と組み合わせ得る別の実施形態では、点変異は、いくつかの場合では、配列番号３９とのアラインメントに基づくアミノ酸番号１３０５であり得る、亜鉛結合残基の変異または触媒残基の変異である。キャリアポリペプチドが毒性を低減する変異を有するＥ．ｃｏｌｉ ＡｃｆＤ前駆体タンパク質（ｏｒｆ３５２６ポリペプチド）である先行する実施形態と組み合わせ得る別の実施形態では、キャリアポリペプチドは、Ｅ．ｃｏｌｉ ＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）タンパク質の少なくとも最後の１００のＣ末端アミノ酸、Ｅ．ｃｏｌｉ ＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）タンパク質の少なくとも最後の２００のＣ末端アミノ酸、Ｅ．ｃｏｌｉ ＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）タンパク質の少なくとも最後の３００のＣ末端アミノ酸、Ｅ．ｃｏｌｉ ＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）タンパク質の少なくとも最後の４００のＣ末端アミノ酸、Ｅ．ｃｏｌｉ ＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）タンパク質の少なくとも最後の５００のＣ末端アミノ酸、Ｅ．ｃｏｌｉ ＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）タンパク質の少なくとも最後の６００のＣ末端アミノ酸、Ｅ．ｃｏｌｉ ＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）タンパク質の少なくとも最後の７００のＣ末端アミノ酸、Ｅ．ｃｏｌｉ ＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）タンパク質の少なくとも最後の７５０のＣ末端アミノ酸、もしくはＥ．ｃｏｌｉ ＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）タンパク質の少なくとも最後の７５８のＣ末端アミノ酸を含まないか、またはＥ．ｃｏｌｉ ＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）タンパク質の少なくとも最初の１００のＮ末端アミノ酸、Ｅ．ｃｏｌｉ ＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）タンパク質の少なくとも最初の２００のＮ末端アミノ酸、Ｅ．ｃｏｌｉ ＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）タンパク質の少なくとも最初の３００のＮ末端アミノ酸、Ｅ．ｃｏｌｉ ＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）タンパク質の少なくとも最初の４００のＮ末端アミノ酸、Ｅ．ｃｏｌｉ ＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）タンパク質の少なくとも最初の５００のＮ末端アミノ酸、Ｅ．ｃｏｌｉ ＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）タンパク質の少なくとも最初の６００のＮ末端アミノ酸、Ｅ．ｃｏｌｉ ＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）タンパク質の少なくとも最初の７００のＮ末端アミノ酸、Ｅ．ｃｏｌｉ ＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）タンパク質の少なくとも最初の７５０のＮ末端アミノ酸、もしくはＥ．ｃｏｌｉ ＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）タンパク質の少なくとも最初の７６０のＮ末端アミノ酸を含まない。キャリアポリペプチドがＥ．ｃｏｌｉ ＡｃｆＤ前駆体タンパク質（ｏｒｆ３５２６ポリペプチド）である先行する実施形態と組み合わせ得る別の実施形態では、キャリアポリペプチドは、Ｅ．ｃｏｌｉ ＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）タンパク質の少なくとも最後の１００のＣ末端アミノ酸、Ｅ．ｃｏｌｉ ＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）タンパク質の少なくとも最後の１２５のＣ末端アミノ酸、Ｅ．ｃｏｌｉ ＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）タンパク質の少なくとも最後の１５０のＣ末端アミノ酸、Ｅ．ｃｏｌｉ ＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）タンパク質の少なくとも最後の１７５のＣ末端アミノ酸、Ｅ．ｃｏｌｉ ＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）タンパク質の少なくとも最後の２００のＣ末端アミノ酸、Ｅ．ｃｏｌｉ ＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）タンパク質の少なくとも最後の２１０のＣ末端アミノ酸、またはＥ．ｃｏｌｉ ＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）タンパク質の少なくとも最後の２１７のＣ末端アミノ酸を含まず、場合によって、Ｅ．ｃｏｌｉ ＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）タンパク質の少なくとも最初の１０のＮ末端アミノ酸、Ｅ．ｃｏｌｉ ＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）タンパク質の少なくとも最初の２０のＮ末端アミノ酸、Ｅ．ｃｏｌｉ ＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）タンパク質の少なくとも最初の３０のＮ末端アミノ酸、またはＥ．ｃｏｌｉ ＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）タンパク質の少なくとも最初の３３のＮ末端アミノ酸を含まない。キャリアポリペプチドがＥ．ｃｏｌｉ ＡｃｆＤ前駆体タンパク質（ｏｒｆ３５２６ポリペプチド）である先行する実施形態と組み合わせ得る別の実施形態では、キャリアポリペプチドは、（ａ）配列番号２６〜４０のアミノ酸配列を有し、（ｂ）配列番号２６〜４０と比較して１から１０までの単一アミノ酸変更を有するアミノ酸配列を有し、（ｃ）配列番号２６〜４０と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有し、（ｄ）配列番号２６〜４０からの少なくとも１０、少なくとも１２、少なくとも１４、少なくとも１６、少なくとも１８、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも７５、少なくとも１００、少なくとも１２５もしくは少なくとも１５０連続するアミノ酸の断片を含み、かつ／または（ｅ）ペアワイズアラインメントアルゴリズムを用いて配列番号２６〜４０のいずれかとアラインメントさせた場合に、Ｎ末端からＣ末端までのｘアミノ酸のそれぞれの移動ウィンドウが、少なくともｘ・ｙ（ここで、ｘは３０であり、ｙは０．７５である）の同一のアラインメントされたアミノ酸を有するものであり得る。キャリアポリペプチドがＥ．ｃｏｌｉ ＡｃｆＤ前駆体タンパク質（ｏｒｆ３５２６ポリペプチド）である先行する実施形態と組み合わせ得る別の実施形態では、キャリアポリペプチドは、Ｅ．ｃｏｌｉ ＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）タンパク質と比較してキャリアポリペプチドの溶解度を増加するＥ．ｃｏｌｉ ＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）タンパク質に対する欠失をさらに含有する。キャリアポリペプチドが溶解度を増加する欠失を有するＥ．ｃｏｌｉ ＡｃｆＤ前駆体タンパク質（ｏｒｆ３５２６ポリペプチド）である先行する実施形態と組み合わせ得る別の実施形態では、欠失は、ｇｌｙ−ｓｅｒ領域までの実質的に全てのＮ末端アミノ酸の除去、Ｎ末端プロリンリッチ反復の全てもしくは一部分の除去、またはその両方である。キャリアポリペプチドが溶解度を増加する欠失を有するＥ．ｃｏｌｉ ＡｃｆＤ前駆体タンパク質（ｏｒｆ３５２６ポリペプチド）である先行する実施形態と組み合わせ得る別の実施形態では、欠失は、Ｅ．ｃｏｌｉ ＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）タンパク質と比較して少なくとも最初の１０のＮ末端アミノ酸、Ｅ．ｃｏｌｉ ＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）タンパク質と比較して少なくとも最初の２０のＮ末端アミノ酸、Ｅ．ｃｏｌｉ ＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）タンパク質と比較して少なくとも最初の３０のＮ末端アミノ酸、Ｅ．ｃｏｌｉ ＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）タンパク質と比較して少なくとも最初の３３のＮ末端アミノ酸、Ｅ．ｃｏｌｉ ＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）タンパク質と比較して少なくとも最初の４０のＮ末端アミノ酸、Ｅ．ｃｏｌｉ ＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）タンパク質と比較して少なくとも最初の５０のＮ末端アミノ酸、Ｅ．ｃｏｌｉ ＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）タンパク質と比較して少なくとも最初の６０のＮ末端アミノ酸、Ｅ．ｃｏｌｉ ＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）タンパク質と比較して少なくとも最初の７０のＮ末端アミノ酸、Ｅ．ｃｏｌｉ ＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）タンパク質と比較して少なくとも最初の８０のＮ末端アミノ酸、Ｅ．ｃｏｌｉ ＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）タンパク質と比較して少なくとも最初の９０のＮ末端アミノ酸、またはＥ．ｃｏｌｉ ＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）タンパク質と比較して少なくとも最初の９４のＮ末端アミノ酸の除去である。キャリアポリペプチドがＥ．ｃｏｌｉ Ｆｌｕ抗原４３タンパク質（ｏｒｆ１３６４ポリペプチド）である実施形態では、キャリアポリペプチドは、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｆｌｕ抗原４３タンパク質（ｏｒｆ１３６４ポリペプチド）の断片であってよく、断片は、全長Ｅ．ｃｏｌｉ Ｆｌｕ抗原４３タンパク質（ｏｒｆ１３６４ポリペプチド）に対する欠失を含有し、この欠失は、全長タンパク質と比較して断片の溶解度を増加する。キャリアポリペプチドが、溶解度を増加する欠失を有するＥ．ｃｏｌｉ Ｆｌｕ抗原４３タンパク質（ｏｒｆ１３６４ポリペプチド）である、ある実施形態では、欠失は、カルボキシル末端β−バレルドメインを含むか、またはキャリアポリペプチドは、配列番号４４のアミノ酸配列に相当する。キャリアポリペプチドが、溶解度を増加する欠失を有するＥ．ｃｏｌｉ Ｆｌｕ抗原４３タンパク質（ｏｒｆ１３６４ポリペプチド）である先行する実施形態と組み合わせ得る別の実施形態では、断片は、ｆｌｕ抗原４３（ｏｒｆ１３６４）タンパク質の９５０未満のアミノ酸、９００未満のアミノ酸、８５０未満のアミノ酸、８００未満のアミノ酸、７５０未満のアミノ酸、７００未満のアミノ酸、６５０未満のアミノ酸、６００未満のアミノ酸、５５０未満のアミノ酸、５００未満のアミノ酸、４５０未満のアミノ酸、４４０未満のアミノ酸、または４３０未満のアミノ酸を含む。キャリアポリペプチドがＥ．ｃｏｌｉ Ｆｌｕ抗原４３タンパク質（ｏｒｆ１３６４ポリペプチド）である先行する実施形態と組み合わせ得る別の実施形態では、キャリアポリペプチドは、（ａ）配列番号１〜２２のアミノ酸配列を有し、（ｂ）配列番号１〜２２と比較して１から１０までの単一アミノ酸変更を有するアミノ酸配列を有し、（ｃ）配列番号１〜２２と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有し、（ｄ）配列番号１〜２２からの少なくとも１０、少なくとも１２、少なくとも１４、少なくとも１６、少なくとも１８、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも７５、少なくとも１００、少なくとも１２５もしくは少なくとも１５０連続するアミノ酸の断片を含み、かつ／または（ｅ）ペアワイズアラインメントアルゴリズムを用いて配列番号１〜２２のいずれかとアラインメントさせた場合に、Ｎ末端からＣ末端までのｘアミノ酸のそれぞれの移動ウィンドウが、少なくともｘ・ｙ（ここで、ｘは３０であり、ｙは０．７５である）の同一のアラインメントされたアミノ酸を有するものであり得る。キャリアポリペプチドがＥ．ｃｏｌｉ Ｆｌｕ抗原４３タンパク質（ｏｒｆ１３６４ポリペプチド）である先行する実施形態と組み合わせ得る別の実施形態では、断片は、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｆｌｕ抗原４３タンパク質（ｏｒｆ１３６４ポリペプチド）と比較して少なくとも最初の１０のＮ末端アミノ酸、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｆｌｕ抗原４３タンパク質（ｏｒｆ１３６４ポリペプチド）と比較して少なくとも最初の２０のＮ末端アミノ酸、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｆｌｕ抗原４３タンパク質（ｏｒｆ１３６４ポリペプチド）と比較して少なくとも最初の３０のＮ末端アミノ酸、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｆｌｕ抗原４３タンパク質（ｏｒｆ１３６４ポリペプチド）と比較して少なくとも最初の

４０のＮ末端アミノ酸、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｆｌｕ抗原４３タンパク質（ｏｒｆ１３６４ポリペプチド）と比較して少なくとも最初の５０のＮ末端アミノ酸、もしくはＥ．ｃｏｌｉ ＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）タンパク質と比較して少なくとも最初の５２のＮ末端アミノ酸を含まず、かつ／または断片は、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｆｌｕ抗原４３タンパク質（ｏｒｆ１３６４ポリペプチド）と比較して少なくとも最後の５０のＣ末端アミノ酸、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｆｌｕ抗原４３タンパク質（ｏｒｆ１３６４ポリペプチド）と比較して少なくとも最後の１００のＣ末端アミノ酸、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｆｌｕ抗原４３タンパク質（ｏｒｆ１３６４ポリペプチド）と比較して少なくとも最後の１５０のＣ末端アミノ酸、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｆｌｕ抗原４３タンパク質（ｏｒｆ１３６４ポリペプチド）と比較して少なくとも最後の２００のＣ末端アミノ酸、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｆｌｕ抗原４３タンパク質（ｏｒｆ１３６４ポリペプチド）と比較して少なくとも最後の２５０のＣ末端アミノ酸、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｆｌｕ抗原４３タンパク質（ｏｒｆ１３６４ポリペプチド）と比較して少なくとも最後の３００のＣ末端アミノ酸、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｆｌｕ抗原４３タンパク質（ｏｒｆ１３６４ポリペプチド）と比較して少なくとも最後の３２５のＣ末端アミノ酸、もしくはＥ．ｃｏｌｉ Ｆｌｕ抗原４３タンパク質（ｏｒｆ１３６４ポリペプチド）と比較して少なくとも最後の３２８のＣ末端アミノ酸を含まない。キャリアポリペプチドがＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ Ｓｅｌ１反復含有タンパク質（ｕｐｅｃ−５２１１ポリペプチド）である実施形態では、キャリアポリペプチドは、（ａ）配列番号２３〜２５のアミノ酸配列を有し、（ｂ）配列番号２３〜２５と比較して１から１０までの単一アミノ酸変更を有するアミノ酸配列を有し、（ｃ）配列番号２３〜２５と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有し、（ｄ）配列番号２３〜２５からの少なくとも１０、少なくとも１２、少なくとも１４、少なくとも１６、少なくとも１８、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも７５、少なくとも１００、少なくとも１２５もしくは少なくとも１５０連続するアミノ酸の断片を含み、かつ／またはペアワイズアラインメントアルゴリズムを用いて配列番号２３〜２５のいずれかとアラインメントさせた場合に、Ｎ末端からＣ末端までのｘアミノ酸のそれぞれの移動ウィンドウが、少なくともｘ・ｙ（ここで、ｘは３０であり、ｙは０．７５である）の同一のアラインメントされたアミノ酸を有するものであり得る。任意の先行する実施形態と組み合わせ得るある実施形態では、多糖は、（ａ）グルカン、（ｂ）Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの血清群Ａ、Ｃ、Ｗ１３５およびＹのうちの少なくとも１つに由来する莢膜糖、（ｃ）Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅからの糖抗原、（ｄ）Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓからの莢膜多糖、（ｅ）Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ Ｂ多糖、（ｆ）Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇｌａｃｔｉａｅからの糖抗原、（ｇ）Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅからのリポ多糖または（ｈ）Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉからの莢膜多糖であってよい。任意の先行する実施形態と組み合わせ得るある実施形態では、多糖は、１００ｋＤａ未満（例えば８０ｋＤａ未満、７０ｋＤａ未満、６０ｋＤａ未満、５０ｋＤａ未満、４０ｋＤａ未満、３０ｋＤａ未満、２５ｋＤａ未満、２０ｋＤａ未満または１５ｋＤａ未満）の分子量を有する。任意の先行する実施形態と組み合わせ得るある実施形態では、多糖は、６０以下（例えば５９、５８、５７、５６、５５、５４、５３、５２、５１、５０、４９、４８、４７、４６、４５、４４、４３、４２、４１、４０、３９、３８、３７、３６、３５、３４、３３、３２、３１、３０、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５または４）の単糖単位を有する。任意の先行する実施形態と組み合わせ得るある実施形態では、多糖は、キャリアタンパク質に直接または間接的に結合体化してよい。任意の先行する実施形態と組み合わせ得るある実施形態では、多糖結合体は、アジュバントをさらに含む。

本発明の別の態様は、先行する態様による、任意のその実施形態における多糖結合体を含むワクチン成分を提供する。

本発明のまた別の態様は、先行する態様のワクチン成分を含むワクチンを提供する。ある実施形態では、ワクチンは、アジュバントをさらに含む。先行する実施形態と組み合わせ得るある実施形態では、ワクチンは、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ抗原、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ抗原、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ抗原、Ｍｏｒａｘｅｌｌａ ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ抗原、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ抗原、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ抗原、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｓ抗原、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｅｔａｎｉ抗原、Ｃｏｒｎｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｈｔｅｒｉａｅ抗原、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ Ｂ型（Ｈｉｂ）抗原、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ抗原、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ抗原、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ抗原、Ｎｅｉｓｅｒｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ抗原、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ抗原、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｐａｌｌｉｄｕｍ抗原、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｄｕｃｒｅｙｉ抗原、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ抗原、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ抗原、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ抗原、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｓａｐｒｏｐｈｙｔｉｃｕｓ抗原、Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａ抗原、追加のＥ．ｃｏｌｉ抗原、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉｓ抗原、Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｐｅｓｔｉｓ抗原、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ抗原、Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ抗原、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ抗原、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ抗原、Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ抗原、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉ抗原、Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ抗原、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ抗原、Ｓｈｉｇｅｌｌａ抗原およびＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ抗原から選択される追加のワクチン成分をさらに含む。先行する実施形態と組み合わせ得るある好ましい実施形態では、ワクチンは、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ抗原、Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ抗原、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ抗原またはＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ抗原を含み得る院内感染に関連する細菌から選択される追加のワクチン成分をさらに含む。

本発明のまたさらに別の態様は、哺乳類被験体における多糖に対する増進した免疫応答を誘導する方法であって、哺乳類被験体に、先行する態様による、任意のその実施形態における多糖結合体、先行する態様によるワクチン成分、または先行する態様による、任意のその実施形態におけるワクチンを投与することを含む方法を提供する。

本発明の別の態様は、、哺乳類被験体における多糖に対する増進した免疫応答を誘導するための、先行する態様による、任意のその実施形態における多糖結合体、先行する態様によるワクチン成分、または先行する態様による、任意のその実施形態におけるワクチンの使用を提供する。

詳細な説明
純粋な多糖は、しばしば不十分な免疫原であり、よって、キャリアポリペプチドに結合体化する必要がある。多糖が十分な免疫原性を有する場合でさえ、キャリアタンパク質への結合体化は免疫原性を増進できるので、送達される必要がある多糖がより少ない。さらに、非常に若年のものにおける防御効力のために、キャリアポリペプチドへの結合体化が頻繁に要求される。炭水化物抗原の免疫原性を増進するための、キャリアタンパク質への結合体化の使用は、周知であり（例えばＬｉｎｄｂｅｒｇ（１９９９年）Ｖａｃｃｉｎｅ １７巻増刊２号：Ｓ２８〜３６頁、ＢｕｔｔｅｒｙおよびＭｏｘｏｎ（２０００年）Ｊ Ｒ Ｃｏｌｌ Ｐｈｙｓｉｃｉａｎｓ Ｌｏｎｄ ３４巻：１６３〜８頁、ＡｈｍａｄおよびＣｈａｐｎｉｃｋ（１９９９年）Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ Ｃｌｉｎ Ｎｏｒｔｈ Ａｍ １３巻：１１３〜３３頁、ｖｉｉ、Ｇｏｌｄｂｌａｔｔ（１９９８年）Ｊ． Ｍｅｄ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４７巻：５６３〜５６７頁、ＥＰ−Ｂ−０４７７５０８、米国特許第５，３０６，４９２号、ＷＯ９８／４２７２１、Ｄｉｃｋら、Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｖａｃｃｉｎｅｓ（Ｃｒｕｓｅら編）Ｋａｒｇｅｒ、Ｂａｓｅｌ、１９８９年、１０巻、４８〜１１４頁、Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ ＣＡ（１９９６年）などを参照されたい）、特に小児ワクチンに用いられている（Ｒａｍｓａｙら（２００１年）Ｌａｎｃｅｔ ３５７巻（９２５１号）：１９５〜６頁）。本発明者らは、３つのＥ．ｃｏｌｉ抗原：アクセサリーコロニー形成因子Ｄ（ＡｃｆＤ）前駆体タンパク質（ｏｒｆ３５２６ポリペプチド）、Ｆｌｕ抗原４３タンパク質（ｏｒｆ１３６４ポリペプチド）およびＳｅｌ１反復含有タンパク質（ｕｐｅｃ−５２１１ポリペプチド）が、キャリアポリペプチドとして作用できることを、驚くべきことに見出した。

本発明の態様は、よって、キャリアタンパク質に結合体化した多糖と、場合によってアジュバント（以下で規定されるように）とを含む多糖結合体を提供する。

キャリアポリペプチドは、多糖に、直接またはリンカーを介して共有結合的に結合体化し得る。任意の適切な結合体化反応を、必要である場合に任意の適切なリンカーとともに用いることができる。

多糖とキャリアポリペプチドとの付着は、好ましくは−ＮＨ_２基を介して、例えばキャリアポリペプチド中のリシン残基（複数可）またはアルギニン残基（複数可）の側鎖（複数可）による。多糖が遊離のアルデヒド基を有する場合、この基は、キャリアポリペプチド中のアミンと反応して、還元的アミノ化により結合体を形成できる。キャリアへの付着は、−ＳＨ基を介して、例えばキャリアポリペプチド中のシステイン残基（複数可）の側鎖（複数可）によってもよい。代わりに、多糖は、キャリアタンパク質に、リンカー分子を介して付着してよい。

多糖は、典型的には、結合体化の前に活性化または機能化（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｚｅｄ）される。活性化には、例えば、ＣＤＡＰ（１−シアノ−４−ジメチルアミノピリジニウムテトラフルオロボレート）のようなシアニル化試薬が関与してよい。その他の適切な技術は、カルボジイミド、ヒドラジド、活性エステル、ノルボラン、ｐ−ニトロ安息香酸、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、Ｓ−ＮＨＳ、ＥＤＣ、ＴＳＴＵを用いる（例えばＷＯ９８／４２７２１についての導入を参照されたい）。

キャリアポリペプチドとの直接の連結は、米国特許第４，７６１，２８３号および米国特許第４，３５６，１７０号に記載されるように、多糖の酸化と、その後のキャリアポリペプチドとの還元的アミノ化とを含み得る。

リンカー基を介する連結は、任意の公知の手順、例えば米国特許第４，８８２，３１７号および米国特許第４，６９５，６２４号に記載される手順を用いて作製してよい。典型的には、リンカーは、多糖のアノマー炭素を介して付着する。好ましい型の連結は、遊離の−ＮＨ２基（例えばアミノ化により多糖に導入される）とアジピン酸とのカップリングと（例えばジイミド活性化を用いて）、次いで得られた糖−アジピン酸中間体へのタンパク質のカップリングにより形成し得る、アジピン酸リンカーである（例えばＥＰ−Ｂ−０４７７５０８、Ｍｏｌ． Ｉｍｍｕｎｏｌ、（１９８５年）２２巻、９０７〜９１９頁およびＥＰ−Ａ−０２０８３７５を参照されたい）。同様の好ましい型の連結は、遊離の−ＮＨ基をグルタル酸と同様の方法でカップリングすることにより形成し得る、グルタル酸リンカーである。アジピン酸およびグルタル酸リンカーは、多糖への直接カップリング（すなわち遊離の基、例えば遊離の−ＮＨ基を多糖に予め導入することなく）と、その後の得られた糖−アジピン酸／グルタル酸中間体へのタンパク質のカップリングにより形成してもよい。別の好ましい型の連結は、改変多糖の遊離のヒドロキシル基とＣＤＩとの反応（Ｂｅｔｈｅｌｌ Ｇ．Ｓ．ら（１９７９年）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２５４巻、２５７２〜４頁およびＨｅａｒｎ Ｍ．Ｔ．Ｗ．（１９８１年）Ｊ． Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ ２１８巻、５０９〜１８頁）と、その後のタンパク質との反応によりカルバメート連結を形成することにより形成し得る、カルボニルリンカーである。その他のリンカーは、β−プロピオンアミド（ＷＯ００／１０５９９）、ニトロフェニル−エチルアミン（Ｇｅｖｅｒら（１９７９年）Ｍｅｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ １６５巻、１７１〜２８８頁）、ハロアシルハロゲン化物（米国特許第４，０５７，６８５号）、グリコシドの連結（米国特許第４，６７３，５７４号、第４，７６１，２８３号および第４，８０８，７００号）、６−アミノカプロン酸（米国特許第４，４５９，２８６号）、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）−プロピオネート（ＳＰＤＰ）（米国特許第５，２０４，０９８号）、アジピン酸ジヒドラジド（ＡＤＨ）（米国特許第４，９６５，３３８号）、Ｃ４〜Ｃ１２部分（米国特許第４，６６３，１６０号）などを含む。カルボジイミド縮合も用いることができる（ＷＯ２００７／０００３４３）。

二機能性リンカーを用いて、多糖中のアミン基（例えばアミノ化により多糖に導入される）とカップリングするための第１の基と、キャリアとカップリングするため（典型的には、キャリア中のアミンとカップリングするため）の第２の基とを提供してよい。代わりに、第１の基は、多糖と直接、すなわち、基、例えばアミン基を多糖に予め導入することなくカップリングできる。

いくつかの実施形態では、二機能性リンカー中の第１の基は、よって、多糖上のアミン基（−ＮＨ２）と反応できる。この反応は、典型的には、アミンの水素の求電子置換を伴う。その他の実施形態では、二機能性リンカー中の第１の基は、多糖と直接反応できる。これら実施形態の両方のセットでは、二機能性リンカー中の第２の基は、典型的には、キャリアポリペプチド上のアミン基と反応できる。この反応もまた、典型的には、アミンの求電子置換を伴う。

多糖およびキャリアタンパク質の両方との反応がアミンを伴うならば、二機能性リンカーを用いることが好ましい。例えば、式Ｘ−Ｌ−Ｘのホモ二機能性リンカー（ここで、２つのＸ基は、互いに同じであり、アミンと反応でき、Ｌは、リンカー中の連結部分である）を用いてよい。同様に、式Ｘ−Ｌ−Ｘのヘテロ二機能性リンカー（ここで、２つのＸ基は、異なり、アミンと反応でき、Ｌは、リンカー中の連結部分である）を用いてよい。好ましいＸ基は、Ｎ−オキシスクシンイミドである。Ｌは、好ましくは、式Ｌ’−Ｌ^２−Ｌ’（ここで、Ｌ’は、カルボニルである）を有する。好ましいＬ^２基は、１〜１０炭素原子（例えばＣ_１、Ｃ_２、Ｃ_３、Ｃ_４、Ｃ_５、Ｃ_６、Ｃ_７、Ｃ_８、Ｃ_９、Ｃ_１０）を有する直鎖状アルキル、例えば−（ＣＨ_２）_４−または−（ＣＨ_２）_３−である。

先行する段落に記載する二機能性リンカーにおいて用いるためのその他のＸ基は、ノルボラン、ｐ−ニトロ安息香酸およびスルホ−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドのようなＨＯ−Ｌ−ＯＨと組み合わせた場合にエステルを形成するものである。

本発明で用いるためのさらなる二機能性リンカーは、アクリロイルハロゲン化物（例えば塩化物）およびハロアシルハロゲン化物を含む。

リンカーは、一般的に、多糖とのカップリング中に、多糖に対してモル過剰で加えられる。

結合体は、過剰のキャリア（ｗ／ｗ）または過剰の多糖（ｗ／ｗ）を、例えば１：５〜５：１の比の範囲で有し得る。過剰のキャリアタンパク質を有する結合体は、例えば０．２：１〜０．９：１の範囲、または等重量が典型的である。結合体は、少量の遊離の（すなわち結合体化していない）キャリアを含んでよい。所定のキャリアタンパク質が、本発明の組成物中に遊離形態および結合体化した形態の両方で存在する場合、結合体化していない形態は、組成物全体中のキャリアタンパク質の合計量の５％以下であることが好ましく、より好ましくは２％（重量）未満で存在する。

組成物は、遊離のキャリアタンパク質を免疫原として含んでもよい（ＷＯ９６／４０２４２）。

結合体化の後に、遊離の多糖および結合体化した多糖を分離できる。多くの適切な方法、例えば疎水性クロマトグラフィー、タンジェンシャル限外ろ過（ｔａｎｇｅｎｔｉａｌ ｕｌｔｒａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）、ダイアフィルトレーション（ｄｉａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）などが存在する（Ｌｅｉら（２０００年）Ｄｅｖ Ｂｉｏｌ（Ｂａｓｅｌ）１０３巻：２５９〜２６４頁およびＷＯ００／３８７１１も参照されたい）。タンジェンシャルフロー限外ろ過が好ましい。

結合体中の多糖部分は、好ましくは、以下に規定されるように（グルカンの項を参照されたい）、低分子量多糖である。オリゴ糖は、結合体化の前に典型的に分類（ｓｉｚｅ）される。

タンパク質−多糖結合体は、好ましくは、水および／または生理的緩衝液中に可溶性である。

いくつかの多糖について、多糖とキャリアタンパク質との間にスペーサが存在するならば、免疫原性が改善されることがある。この関係において、「スペーサ」は、単一の共有結合よりも長い部分である。このスペーサは、上記のようなリンカーであってよい。代わりに、これは、多糖とリンカーとの間に共有結合した部分であってよい。典型的には、部分は、リンカーまたはキャリアとのカップリングの前に、多糖と共有結合する。例えば、スペーサは、部分Ｙ（ここで、Ｙは、１〜１０炭素原子（例えばＣ_１、Ｃ_２、Ｃ_３、Ｃ_４、Ｃ_５、Ｃ_６、Ｃ_７、Ｃ_８、Ｃ_９、Ｃ_１０）、典型的には１〜６炭素原子（例えばＣ_１、Ｃ_２、Ｃ_３、Ｃ_４、Ｃ_５、Ｃ_６）を有する直鎖状アルキルを含む）であってよい。本発明者らは、６炭素原子を有する直鎖状アルキル（すなわち−（ＣＨ_２）_６）が特に適切であり、より短い鎖（例えば−（ＣＨ_２）_２）よりも大きい免疫原性を提供し得ることを見出している。典型的には、Ｙは、多糖のアノマー炭素に、通常、−Ｏ−連結を介して付着する。しかし、Ｙは、多糖のその他の部分とかつ／またはその他の連結を介して連結してよい。Ｙの他端は、任意の適切な連結によりリンカーと結合する。典型的には、Ｙは、アミン基を末端に有して、上記のような二機能性リンカーとの連結を容易にする。これらの実施形態では、Ｙは、よって、リンカーと、−ＮＨ−連結により結合する。よって、以下の構造を有する結合体は、本発明で用いるために具体的に構想される：ｎ＋２は、２〜６０の範囲、例えば１０〜５０の間または２〜４０の間である。好ましくは、ｎ＋２は、２５〜３０または１１〜１９、例えば１３〜１７の範囲である。本発明者らは、ｎ＋２＝１５が適切であることを見出している。Ｙは、上記のとおりである。

一態様では、本発明は、キャリアタンパク質に結合体化した多糖を作製するための方法であって、結合体化のステップが、＞１０ｍＭリン酸塩のリン酸緩衝液中で行われる方法、およびこの方法により得られる結合体を提供する。本発明者らは、リン酸ナトリウムが、緩衝液のためのリン酸塩の適切な形態であることを見出している。緩衝液のｐＨは、７．０〜７．５の間、特に７．２に調整してよい。結合体化のステップは、典型的には、２０〜２００ｍＭの間のリン酸塩、例えば５０〜１５０ｍＭのリン酸緩衝液中で行う。特に、本発明者らは、９０〜１１０ｍＭ、例えば約１００ｍＭのリン酸塩のリン酸緩衝液が適切であることを見出している。結合体化のステップは、通常、室温にて行う。同様に、結合体化のステップは、通常、室内の圧力で行う。典型的には、多糖は、結合体化のステップの前に、リンカーに上記のように付着する。特に、多糖は、上記のような二機能性リンカーに付着してよい。リンカーの遊離端は、キャリアタンパク質への結合体化を容易にする基を含んでよい。例えば、本発明者らは、リンカーの遊離端が、エステル基、例えばＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル基を含んでよいことを見出している。

本明細書で開示する多糖結合体は、薬学的に許容されるキャリアをさらに含むことができる。

本明細書で開示する多糖結合体は、アジュバントをさらに含むことができる。アジュバントは、以下に記載するアジュバントの１または複数を含むことができる。

多糖結合体は、哺乳動物（または鳥類）における免疫応答を高めるための方法で用いてよく、この方法は、哺乳動物（または鳥類）に本発明の組成物を投与することを含む。

多糖免疫原
哺乳動物または鳥類において免疫応答を誘導できる任意の多糖（単独またはキャリアタンパク質に結合体化しているかのいずれか）を、本明細書で開示する多糖結合体（すなわち多糖免疫原）に用いてよい。好ましくは、多糖は、目的の病原体に対する免疫応答を誘導できる。多糖は、分岐状または直鎖状であってよい。

低分子量多糖、特に１００ｋＤａ未満（例えば８０ｋＤａ未満、７０ｋＤａ未満、６０ｋＤａ未満、５０ｋＤａ未満、４０ｋＤａ未満、３０ｋＤａ未満、２５ｋＤａ未満、２０ｋＤａ未満または１５ｋＤａ未満）の分子量を有するものを用いてよい。例えば６０以下（例えば５９、５８、５７、５６、５５、５４、５３、５２、５１、５０、４９、４８、４７、４６、４５、４４、４３、４２、４１、４０、３９、３８、３７、３６、３５、３４、３３、３２、３１、３０、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５または４）の単糖単位を含有するオリゴ糖を用いることもできる。この範囲内で、１０から５０の間または２０から４０の間の単糖単位を有するオリゴ糖が好ましい。

例示的な多糖免疫原を以下に詳述する。

グルカン多糖：グルカンは、他の病原体のなかでも、真菌細胞壁で見出されるグルコース含有多糖である。β−グルカンは、グルコースサブユニット間の１または複数のα連結を含むが、β−グルカンは、グルコースサブユニット間の１または複数のβ連結を含む。本発明により用いるグルカンは、β連結を含み、β連結だけを含有してよい（すなわちα連結なし）。

グルカンは、１もしくは複数のβ−１，３連結および／または１もしくは複数のβ−１，６連結を含んでよい。これは、１もしくは複数のβ−１，２連結および／またはβ−１，４連結も含んでよいが、通常、そのβ連結は、β−１，３連結および／またはβ−１，６連結だけである。

グルカンは、分岐状または直鎖状であってよい。

全長天然β−グルカンは、不溶性であり、メガダルトン範囲の分子量を有する。本発明の免疫原性組成物において、可溶性グルカンを用いることが好ましい。可溶化は、長い不溶性のグルカンを断片化することにより達成してよい。このことは、加水分解により、またはより簡便には、グルカナーゼを用いる（例えばβ−１，３−グルカナーゼまたはβ−１，６−グルカナーゼを用いる）消化により達成してよい。代替として、短いグルカンを、単糖基本単位（ｍｏｎｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅ ｂｕｉｌｄｉｎｇ ｂｌｏｃｋ）を接合することにより合成できる。

低分子量グルカン、特に１００ｋＤａ未満（例えば８０ｋＤａ未満、７０ｋＤａ未満、６０ｋＤａ未満、５０ｋＤａ未満、４０ｋＤａ未満、３０ｋＤａ未満、２５ｋＤａ未満、２０ｋＤａ未満または１５ｋＤａ未満）の分子量を有するものが好ましい。例えば６０以下（例えば５９、５８、５７、５６、５５、５４、５３、５２、５１、５０、４９、４８、４７、４６、４５、４４、４３、４２、４１、４０、３９、３８、３７、３６、３５、３４、３３、３２、３１、３０、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５または４）のグルコース単糖単位を含有するオリゴ糖を用いることもできる。この範囲内で、１０から５０の間または２０から４０の間の単糖単位を有するオリゴ糖が好ましい。

グルカンは、真菌グルカンであってよい。「真菌グルカン」は、一般的に真菌から得られるが、特定のグルカン構造は、真菌および非真菌（例えば細菌、下等植物または藻類）の両方で見出され、よって、非真菌生物は、代替の供給源として用い得る。したがって、グルカンは、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓのようなＣａｎｄｉｄａの細胞壁、またはＣｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ ｉｍｍｉｔｉｓ、Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ ｖｅｒｒｕｃｏｓｕｍ、Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｓ ｄｅｒｍａｔｉｄｉｓ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ、Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ ｃａｐｓｕｌａｔｕｍ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｐａｒａｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓまたはＰｙｔｈｉｕｍｎ ｉｎｓｉｄｉｏｓｕｍに由来し得る。真菌β−グルカンの例示的な供給源は、ＷＯ２００９／０７７８５４で見出すことができる。

いくつかの実施形態では、グルカンは、例えばラミナリンで見られるように、いくらかのβ−１，６分岐を有するβ−１，３グルカンである。ラミナリンは、褐藻および海藻で見出される。ラミナリンのβ（１−３）：β（１−６）の比は異なる供給源の間で変動し、例えば、この比は、Ｅｉｓｅｎｉａ ｂｉｃｙｃｌｉｓラミナリンでは３：２と低いが、Ｌａｍｉｎａｒｉａ ｄｉｇｉｔｉｔａｔａラミナリンでは７：１と高い（Ｐａｎｇら（２００５年）Ｂｉｏｓｃｉ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ ６９巻：５５３〜８頁）。よって、本発明で用いるグルカンは、１．５：１から７．５：１の間（例えば約２：１、３：１、４：１、５：１、６：１または７：１）のβ（１−３）：β（１−６）の比を有してよい。場合によって、グルカンは、末端マンニトールサブユニット、例えば１，１−α連結マンニトール残基を有してよい（Ｒｅａｄら（１９９６年）Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ Ｒｅｓ．２８１巻：１８７〜２０１頁）。グルカンは、マンノースサブユニットを含んでもよい。

他の実施形態では、グルカンは、カードランで見られるように、β−１，３連結のみまたはそれを主に有する。本発明者らは、これらのグルカンが、その他の連結を含むグルカン、特にβ−１，３連結とより大きい割合のβ−１，６連結とを含むグルカンよりも免疫原性が高いことがあることを見出している。よって、グルカンは、β−１，３連結グルコース残基のみで作られてよい（例えば１，３連結のみを有する直鎖状β−Ｄ−グルコピラノース）。場合によって、しかし、グルカンは、β−１，３連結グルコース残基でない単糖残基を含んでよく、例えば、これは、β−１，６連結グルコース残基を含んでよい。β−１，３連結グルコース残基対これらのその他の残基の比は、少なくとも８：１（例えば＞９：１、＞１０：１、＞１１：１、＞１２：１、＞１３：１、＞１４：１、＞１５：１、＞１６：１、＞１７：１、＞１８：１、＞１９：１、＞２０：１、＞２５：１、＞３０：１、＞３５：１、＞４０：１、＞４５：１、＞５０：１、＞７５：１、＞１００：１など）であり、かつ／またはβ−１，３連結によってのみ他の残基と連結した少なくとも５（例えば＞５、＞６、＞７、＞８、＞９、＞１０、＞１１、＞１２、＞１３、＞１４、＞１５、＞１６、＞１７、＞１８、＞１９、＞２０、＞３０、＞４０、＞５０、＞６０など）の近接非末端残基の１もしくは複数の（例えば＞１、＞２、＞３、＞４、＞５、＞６、＞７、＞８、＞９、＞１０、＞１１、＞１２など）配列が存在する。「非末端」により、その残基が、グルカンの遊離端に存在しないことを意味する。いくつかの実施形態では、近接非末端残基は、以下に記載するように、キャリア分子、リンカーまたはその他のスペーサに結合体化したいずれの残基も含まないものであり得る。本発明者らは、β−１，３連結によってのみ他の残基と連結した５の近接非末端残基の存在が、例えばＣ．ａｌｂｉｃａｎｓに対する防御抗体応答を提供し得ることを見出している。

さらなる実施形態では、組成物は、２つの異なるグルカン、例えば１．５：１から７．５：１の間のβ（１−３）：β（１−６）の比を有する第１グルカンと、β−１，３連結のみまたはそれを主に有する第２グルカンとを含んでよい。例えば、組成物は、ラミナリングルカンとカードラングルカンとの両方を含んでよい。

β−グルカンを調製する例示的な方法は、ＷＯ２００９／０７７８５４で見出すことができる。

ラミナリンおよびカードランは、例えば少なくとも１００ｋＤａの分子量を有する高分子量ポリマーとして天然で典型的に見出される。これらは、水性媒体中でしばしば不溶性である。それらの天然の形態では、よって、これらは、免疫化にあまり適切でない。よって、本発明は、より短いグルカン、例えば６０以下のグルコース単糖単位（例えば５９、５８、５７、５６、５５、５４、５３、５２、５１、５０、４９、４８、４７、４６、４５、４４、４３、４２、４１、４０、３９、３８、３７、３６、３５、３４、３３、３２、３１、３０、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４）を含有するものを用いてよい。２〜６０の範囲の多数のグルコース残基、例えば１０〜５０の間または２０〜４０の間のグルコース単位を有するグルカンを用いてよい。２５〜３０グルコース残基を有するグルカンが、特に有用である。適切なグルカンは、例えば、天然グルカンの酸加水分解により、または例えばβ−１，３−グルカナーゼのようなグルカナーゼを用いる酵素による消化により形成してよい。１１〜１９、例えば１３〜１９および特に１５または１７のグルコース単糖単位を有するグルカンも有用である。特に、以下の構造（Ａ）または（Ｂ）を有するグルカンが、本発明で用いるために具体的に構想される。

式中、ｎ＋２は、２〜６０の範囲、例えば１０〜５０の間または２〜４０の間である。好ましくは、ｎ＋２は、２５〜３０または１１〜１９、例えば１３〜１７の範囲である。本発明者らは、ｎ＋２＝１５が適切であることを見出している。

式中、ｎは、０〜９の範囲、例えば１〜７の間または２〜６の間である。好ましくは、ｎは、３〜４または１〜３の範囲である。本発明者らは、ｎ＝２が適切であることを見出している。

グルカン（上記で規定されるような）は、好ましくは、単一分子種である。この実施形態では、全てのグルカン分子は、配列の点で同一である。したがって、全てのグルカン分子は、分子量などを含むそれらの構造特性の点で同一である。典型的には、この形態のグルカンは、例えば上記の方法を用いる化学合成により得られる。例えば、Ｊａｍｏｉｓら（２００５年）Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ １５巻（４号）：３９３〜４０７頁は、単一β−１，３連結種の合成について記載している。代わりに、その他の実施形態では、グルカンは、天然グルカン、例えば上記のようにＬ．ｄｉｇｉｔａｔａ、ＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍまたはＥｕｇｌｅｎａからのグルカンから得ることができる（グルカンは、要求される単一分子種が得られるまで精製される）。この方法で精製された天然グルカンは、商業的に入手可能である。単一分子種であるグルカンは、グルカン試料の多分散性（Ｍｗ／Ｍｎ）を測定することにより同定できる。このパラメータは、例えばＢａｒｄｏｔｔｉら（２００８年）Ｖａｃｃｉｎｅ ２６巻：２２８４〜９６頁に記載されるようにＳＥＣ−ＭＡＬＬＳにより簡便に測定できる。本発明のこの実施形態で用いるために適切なグルカンは、約１、例えば１．０１以下の多分散性を有する。

カードランのような天然グルカンの溶解度は、イオン性の基を導入することにより増加できる（例えば特にカードラン中のＯ−６での硫酸化により）。このような改変を本発明で用いてよいが、これらはグルカンの抗原性を変更し得るので、回避するのが理想的である。

グルカンを天然供給源から単離する場合、これらは、混入物と組み合わせて単離してよい。例えば、本発明者らは、グルカンに、紫外−可視（ＵＶ／ＶＩＳ）分光法により同定できるフロロタンニンが混入してよいことを見出している。この問題は、グルカンを褐藻または海藻から単離する場合に特に一般的である。例えば、Ｌａｍｉｎａｒｉａ ｄｉｇｉｔａｔａから抽出された商業的に入手可能なラミナリンのＵＶスペクトルは、フロロタンニン混入の存在に起因する吸収ピークを含む。同様に、Ａｒｔｉｅ ｌａｍｉｎａｒｉａｌｉｓ、Ｓａｃｃｏｒｈｉｚａ ｄｅｒｍａｔｏｄｅａおよびＡｌａｒｉａ ｅｓｃｕｌｅｎｔａから抽出したグルカンは、フロロタンニン混入に起因する吸収ピークを含むＵＶスペクトルを有する。

グルカンの試料中のフロロタンニンの存在は、グルカンの生物学的特性に影響し得る。したがって、グルカンが本発明の多数の態様において、医療用途のためである場合は特に、試料からフロロタンニンを除去することが望ましいことがある。β−グルカンからフロロタンニンを除去する例示的な方法は、ＷＯ２００９／０７７８５４で見出すことができる。

Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ：ある実施形態では、結合体組成物は、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの血清群Ａ、Ｃ、Ｗ１３５およびＹの少なくとも２つからの莢膜糖を含んでよい。その他の実施形態では、このような組成物は、以下の１または複数からの抗原をさらに含む：（ａ）Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ；（ｂ）Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ Ｂ型；Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ、ＡおよびＢ群ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、病原性Ｅ．ｃｏｌｉならびに／または（ｃ）Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ。

ある実施形態では、結合体組成物は、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの血清群Ｃ、Ｗ１３５およびＹからの莢膜多糖を含む。ある実施形態では、結合体組成物は、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの血清群Ａ、Ｃ、Ｗ１３５およびＹからの莢膜多糖を含む。ある実施形態では、結合体組成物は、Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ Ｂ型ならびにＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの血清群Ｃ、Ｗ１３５およびＹからの莢膜多糖を含む。ある実施形態では、結合体組成物は、Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ Ｂ型ならびにＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの血清群Ａ、Ｃ、Ｗ１３５およびＹからの莢膜多糖を含む。ある実施形態では、結合体組成物は、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅならびにＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの血清群Ｃ、Ｗ１３５およびＹからの莢膜多糖を含む。ある実施形態では、結合体組成物は、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅならびにＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの血清群Ａ、Ｃ、Ｗ１３５およびＹからの莢膜多糖を含む。ある実施形態では、結合体組成物は、Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ Ｂ型、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅならびにＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの血清群Ｃ、Ｗ１３５およびＹからの莢膜多糖を含む。ある実施形態では、結合体組成物は、Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ Ｂ型、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅならびにＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの血清群Ａ、Ｃ、Ｗ１３５およびＹからの莢膜多糖を含む。

Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ：Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ多糖結合体は、糖（多糖またはオリゴ糖を含む）と、場合によって、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅからの１または複数のタンパク質とを含んでよい。糖抗原は、血清型１、２、３、４、５、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｎ、９Ｖ、１０Ａ、ＨＡ、１２Ｆ、１４、１５Ｂ、１７Ｆ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２０、２２Ｆ、２３Ｆおよび３３Ｆから選択してよい。任意選択のタンパク質抗原は、ＷＯ９８／１８９３１、ＷＯ９８／１８９３０、米国特許第６，６９９，７０３号、米国特許第６，８００，７４４号、ＷＯ９７／４３３０３およびＷＯ９７／３７０２６で同定されたタンパク質から選択してよい。Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質は、ポリヒスチジントリアドファミリー（Ｐｏｌｙ Ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ Ｔｒｉａｄ ｆａｍｉｌｙ）（ＰｈｔＸ）、コリン結合タンパク質ファミリー（ＣｂｐＸ）、ＣｂｐＸ切断型、ＬｙｔＸファミリー、ＬｙｔＸ切断型、ＣｂｐＸ切断型−ＬｙｔＸ切断型キメラタンパク質、ニューモリシン（Ｐｌｙ）、ＰｓｐＡ、ＰｓａＡ、Ｓｐｌ２８、ＳｐＩＯｌ、Ｓｐｌ３０、Ｓｐｌ２５またはＳｐｌ３３から選択してよい。

Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ：Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ多糖結合体は、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ ５、８および３３６型莢膜多糖およびその断片と、場合によって、表面タンパク質、インベイシン（ロイコチジン、キナーゼ、ヒアルロニダーゼ）、食作用性貪食を阻害する表面因子（莢膜、プロテインＡ）、カロテノイド、カタラーゼ生成、プロテインＡ、コアグラーゼ、凝固因子および／または真核生物細胞膜を溶解する膜損傷性毒素（場合によって解毒化されている）（溶血素、ロイコトキシン、ロイコチジン）に由来するタンパク質抗原とを含んでよい。Ｓ．ａｕｒｅｕｓ莢膜多糖の断片を作製する例示的な解重合方法は、２００９年９月３０日に出願された「Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ Ａｕｒｅｕｓ Ｔｙｐｅ ５ ａｎｄ Ｔｙｐｅ ８ Ｃａｐｓｕｌａｒ Ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ」との表題の米国特許出願第６１／２４７，５１８号の５頁６行目から６頁２３行目までで見出すことができる（これは、このような解重合技術の教示について、本明細書に参照により組み込まれる）。

Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ Ｂ（Ｈｉｂ）：Ｈｉｂ多糖結合体は、Ｈｉｂ糖抗原を含んでよい。

Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ（Ｂ群Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）：Ｂ群Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ多糖結合体は、ＷＯ０４／０４１１５７で同定されるような血清型Ｉａ、Ｉｂ、Ｉａ／ｃ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩ、ＶＩＩおよびＶＩＩＩに由来する糖抗原と、場合によって、限定することなくＷＯ０２／３４７７１、ＷＯ０３／０９３３０６、ＷＯ０４／０４１１５７またはＷＯ０５／００２６１９で同定されるものを含む１または複数のタンパク質抗原（例えば、タンパク質ＧＢＳ８０、ＧＢＳ１０４、ＧＢＳ２７６およびＧＢＳ３２２を含む）とを含んでよい。

Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ：Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａｅ多糖結合体は、ＬＰＳ、特にＶｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ ＩＩ、Ｏ１ Ｉｎａｂａ Ｏ−特異的多糖のリポ多糖を含んでよい。

Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉ（腸チフス）：多糖結合体は、Ｖｉのような莢膜多糖を含んでよい。

キャリアポリペプチド
Ｅ．ｃｏｌｉからのいくつかの見込みのある抗原を、キャリアポリペプチドとしてのそれらの効力について試験した。あるこのような抗原は、細菌Ｉｇ様ドメイン（群１）タンパク質（「ｏｒｆ４０５」としても、参考文献１の配列番号８０９および８１０）として注釈されており、これは、Ｅ．ｃｏｌｉ ＮＭＥＣ株ＩＨＥ３０３４からの「ｏｒｆ２８４」、Ｅ．ｃｏｌｉ ＣＦＴ０７３株からの「ｃ０４１５」およびＥ．ｃｏｌｉ ５３６株からのｅｃｐ＿０３６７としても公知である。またさらに別のそのような抗原は、Ｆｌｕ抗原４３タンパク質（「ｏｒｆ１３６４」としても、参考文献１の配列番号２７２７および２７２８）として注釈されており、これは、Ｅ．ｃｏｌｉ ＮＭＥＣ株ＩＨＥ３０３４からの「ｏｒｆ１１０９」、Ｅ．ｃｏｌｉ ＣＦＴ０７３株からの「ｃ１２７３」およびＥ．ｃｏｌｉ ５３６株からのｅｃｐ＿３００９としても公知である。またさらに別のこのような抗原は、アクセサリーコロニー形成因子Ｄ（ＡｃｆＤ）前駆体タンパク質（「ｏｒｆ３５２６」としても、参考文献１の配列番号７０５１および７０５２）として注釈されており、これは、Ｅ．ｃｏｌｉ ＵＰＥＣ株５３６からの「ＥＣＰ＿３０５０」、Ｅ．ｃｏｌｉ共生株Ｗ３１１０からの「ｙｇｈＪ」、Ｅ．ｃｏｌｉ ＥＴＥＣ株Ｅ２４３７７Ａからの「ＥｃＥ２４３７７Ａ＿３４３２」およびＥ．ｃｏｌｉ共生株ＨＳからの「ＥｃＨＳ＿Ａ３１４２」としても公知である。またさらに別のそのような抗原は、線毛タンパク質（「ｏｒｆ３６１３」としても、参考文献１の配列番号７２２５および７２２６）として注釈されており、これは、Ｅ．ｃｏｌｉ ＮＭＥＣ株ＩＨＥ３０３４からの「ｏｒｆ３４３１」およびＥ．ｃｏｌｉ ＣＦＴ０７３株からの「ｃ３７９１」としても公知である。また別のそのような抗原は、Ｓｅｌ１反復含有タンパク質（「ｕｐｅｃ−５２１１」としても、参考文献２に配列番号５７７で開示される）として注釈されており、ＣＦＴ０７３からの「ｃ５３２１」、ＥＤ１ａからの「ＥＣＥＤ１＿５０８１」およびＥ．ｆｅｒｇｕｓｏｎｉｉ ＡＴＣＣ３５４６９からの「ＥＦＥＲ＿４３０３」としても公知である。特に、ＡｃｆＤ前駆体（ｏｒｆ３５２６）、Ｆｌｕ抗原４３タンパク質（ｏｒｆ１３６４）およびＳｅｌ１反復含有タンパク質（ｕｐｅｃ−５２１１）は全て、結合体化でき、結合体として可溶性であり、結合体化多糖に対する免疫応答の増進において有効であることが証明された。

本発明で用いるキャリアポリペプチドは、様々な形態をとることができる（例えば、天然、融合、グリコシル化、非グリコシル化、脂質化、非脂質化、リン酸化、非リン酸化、ミリストイル化（ｍｙｒｉｓｔｏｙｌａｔｅｄ）、非ミリストイル化、モノマー状、マルチマー状、粒子状、変性など）。例えば、本発明のポリペプチドは、脂質化Ｎ末端システインを有してよい。

本発明で用いるキャリアポリペプチドは、様々な手段により調製できる（例えば組換え発現、細胞培養物からの精製、化学合成など）。組換え発現されたタンパク質が好ましい。

本発明で用いるキャリアポリペプチドは、精製または実質的に精製された形態、すなわち他のポリペプチドを実質的に含まない（例えば天然に存在するポリペプチドを含まない）形態、特にその他のＥ．ｃｏｌｉまたは宿主細胞ポリペプチドを含まない形態で提供されることが好ましく、一般的に、少なくとも約５０％純粋（重量）、通常少なくとも約９０％純粋であり、すなわち組成物の約５０％未満、より好ましくは約１０％未満（例えば５％）が、その他の発現されたポリペプチドから構成される。よって、組成物中の抗原は、分子が発現される生物全体から分離される。疑念を回避するために、多糖に結合体化した精製されたまたは実質的なキャリアタンパク質が、ワクチンの成分として用いられる場合、キャリアタンパク質は、その他のタンパク質抗原および細胞成分（例えばその他の多糖、外膜小胞（ｏｕｔｅｒ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｖｅｓｉｃｌｅ）など）の存在にかかわらず、依然として「精製されて」いるかまたは「実質的に精製され」ている。

本発明で用いるキャリアポリペプチドは、好ましくは、Ｅ．ｃｏｌｉポリペプチドである。このようなポリペプチドは、ＮＭＥＣ、ＡＰＥＣ、ＵＰＥＣ、ＥＡＥＣ、ＥＩＥＣ、ＥＰＥＣおよびＥＴＥＣ Ｅ．ｃｏｌｉポリペプチドからさらに選択してよい。

「ポリペプチド」との用語は、任意の長さのアミノ酸ポリマーのことをいう。ポリマーは、直鎖状または分岐状であってよく、これは、改変アミノ酸を含んでよく、これは、非アミノ酸により中断されてよい。この用語は、天然で改変されたか、または介在、例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質付加、アセチル化、リン酸化または標識成分との結合体化のような任意のその他の操作もしくは改変により改変されたアミノ酸ポリマーも包含する。例えば、アミノ酸の１または複数の類似体（例えば非天然アミノ酸などを含む）および当該技術分野において公知のその他の改変を含有するポリペプチドも含まれる。ポリペプチドは、単一鎖または会合した鎖として生じることができる。

本発明は、配列Ｐ−Ｑ−または−Ｑ−Ｐ−（ここで、−Ｐ−は、上記で規定されるアミノ酸配列であり、−Ｑ−は、上記で規定される配列でない）を含むキャリアポリペプチドも含み、すなわち本発明は、融合タンパク質を提供する。−Ｐ−のＮ末端コドンがＡＴＧでなく、このコドンがポリペプチドのＮ末端に存在しない場合、これは、Ｍｅｔとしてではなくそのコドンについての標準的なアミノ酸として翻訳される。このコドンがポリペプチドのＮ末端にある場合、しかし、これは、Ｍｅｔとして翻訳される。−Ｑ−部分の例は、それらに限定されないが、ヒスチジンタグ（すなわちＨｉｓ_ｎ（ここで、ｎ＝３、４、５、６、７、８、９、１０以上））、マルトース結合タンパク質、またはグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）を含む。

本発明は、本発明のキャリアポリペプチドを含むオリゴマータンパク質も含む。オリゴマーは、ダイマー、トリマー、テトラマーなどであってよい。オリゴマーは、ホモオリゴマーまたはヘテロオリゴマーであってよい。オリゴマー中のポリペプチドは、共有結合的または非共有結合的に会合してよい。

キャリアポリペプチドにより被験体において生じる免疫応答と、全長タンパク質により生じる免疫応答との比較は、当業者が利用可能な任意の手段により行ってよい。以下の実施例で用いる１つの単純な方法は、マウスのようなモデル被験体を免疫化する工程と、次いで、致死量のＥ．ｃｏｌｉで抗原投与する（ｃｈａｌｌｅｎｇｅ）工程とを含む。妥当な比較のために、当業者は、フロイントの完全アジュバントのような同じアジュバントを本質的に選択する。このような試験では、本発明のキャリアポリペプチド断片は、例えば、ポリペプチドが全長タンパク質により提供される防御の少なくとも７０％、全長タンパク質により提供される防御の少なくとも８０％、全長タンパク質により提供される防御の少なくとも８５％、全長タンパク質により提供される防御の少なくとも９０％、全長タンパク質により提供される防御の少なくとも９５％、全長タンパク質により提供される防御の少なくとも９７％、全長タンパク質により提供される防御の少なくとも９８％または全長タンパク質により提供される防御の少なくとも９９％を提供するならば、被験体において実質的に同様の免疫応答を生じる（すなわち、致死抗原投与に対して実質的に同じ防御を提供する）。

本発明は、本発明のポリペプチドを生成するためのプロセスであって、本発明の核酸で形質転換された宿主細胞を、ポリペプチド発現を誘導する条件下で培養するステップを含むプロセスも提供する。ポリペプチドは、次いで、例えば培養上清から精製してよい。

本発明は、本発明のキャリアポリペプチドをコードするプラスミドを含有するＥ．ｃｏｌｉ細胞を提供する。Ｅ．ｃｏｌｉ細胞の染色体は、キャリアポリペプチドの相同体を含んでよいか、またはそのような相同体は存在しなくてよいが、両方の場合において、本発明のポリペプチドはプラスミドから発現できる。プラスミドは、マーカーなどをコードする遺伝子を含んでよい。適切なプラスミドについてのこれらおよびその他の詳細は以下に示す。

本発明のキャリアポリペプチドの発現は、Ｅ．ｃｏｌｉ株で生じ得るが、本発明は、発現のための異種宿主を通常用いる。異種宿主は、原核生物（例えば細菌）または真核生物であり得る。適切な宿主は、それらに限定されないが、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｌａｃｔａｍｉｃａ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｃｉｎｅｒｅａ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ（例えばＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、酵母などを含む。

本発明は、ポリペプチドの少なくとも一部分を化学的手段により合成するステップを含む、本発明のキャリアポリペプチドを生成するためのプロセスを提供する。

上記のタンパク質、ポリペプチド、ハイブリッドポリペプチド、エピトープおよび免疫原性断片のいずれもそして全ては、限定することなく、組換え、単離または実質的に精製された（このようなタンパク質、ポリペプチド、ハイブリッドポリペプチド、エピトープおよび免疫原性断片とそれらの天然の状態で共存する物質から）形態を含むいくつかの形態のいずれか１つであり得る。

Ｏｒｆ１３６４ポリペプチド
Ｆｌｕ抗原４３タンパク質は、本明細書で「ｏｒｆ１３６４」という。Ｅ．ｃｏｌｉ ＮＭＥＣからの「ｏｒｆ１３６４」ポリペプチドは、参考文献１に開示され（配列番号２７２７および２７２８）、Ｅ．ｃｏｌｉ ＮＭＥＣ株ＩＨＥ３０３４からの「ｏｒｆ１１０９」、ＣＦＴ０７３からの「ｃ１２７３」および５３６からのｅｃｐ＿３００９としても公知である。

本発明に従って用いる場合、ｏｒｆ１３６４ポリペプチドは、様々な形態をとり得る。好ましいｏｒｆ１３６４配列は、配列番号１〜２２と５０％以上の同一性（例えば６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、８７．５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％またはそれより高い）を有する。これは、改変体（例えば、対立遺伝子改変体、相同体、オルソログ、パラログ、変異体など）を含む。代わりに、ｏｒｆ１３６４配列は、ペアワイズアラインメントアルゴリズムを用いて配列番号１〜２２のいずれかとアラインメントさせた場合に、Ｎ末端からＣ末端までのｘ個のアミノ酸のそれぞれの移動ウィンドウ（ｐ個のアミノ酸まで伸長するアラインメントについて、ｐ＞ｘの場合、ｐ−ｘ＋１のこのようなウィンドウが存在するように）が、少なくともｘ・ｙの同一のアラインメントされたアミノ酸（ここで、ｘは、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００から選択され、ｙは、０．５０、０．６０、０．７０、０．７５、０．８０、０．８５、０．９０、０．９１、０．９２、０．９３、０．９４、０．９５、０．９６、０．９７、０．９８、０．９９から選択され、ｘ・ｙが整数でない場合、最も近い整数まで切り上げる）を有する。

好ましいペアワイズアラインメントアルゴリズムは、デフォルトパラメータ（例えばＥＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックスを用いてギャップ開始ペナルティ＝１０．０およびギャップ伸長ペナルティ＝０．５）を用いるＮｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈグローバルアラインメントアルゴリズム（３）である。このアルゴリズムは、ＥＭＢＯＳＳパッケージのｎｅｅｄｌｅツールに簡便に実装されている（４）。

Ｏｒｆ１３６４ポリペプチド配列は、配列番号１〜２２と比較して、離れた位置にあり得るかまたは連続的であり得る１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０（またはそれより多く）の単一アミノ酸変更（欠失、挿入、置換）を有してよい。

Ｏｒｆ１３６４ポリペプチド配列は、配列番号１〜２２のいずれか１つと比較して、保存置換（すなわちあるアミノ酸の、関連する側鎖を有する別のアミノ酸での置換）のような１または複数（例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０など）のアミノ酸置換を含んでよい。遺伝子によりコードされるアミノ酸は、一般的に４つのファミリーに分けられる：（１）酸性、すなわちアスパラギン酸、グルタミン酸；（２）塩基性、すなわちリシン、アルギニン、ヒスチジン；（３）非極性、すなわちアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン；および（４）非荷電極性、すなわちグリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、スレオニン、チロシン。フェニルアラニン、トリプトファンおよびチロシンは、時折、一緒に芳香族アミノ酸として分類される。一般的に、これらのファミリー内での単一アミノ酸の置換は、生物学的な活性に対して大きな影響を有さない。

Ｏｒｆ１３６４ポリペプチド配列は、配列番号１〜２２のいずれか１つに対して１または複数（例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９など）の単一アミノ酸欠失を含んでよい。同様に、ポリペプチドは、配列番号１〜２２のいずれか１つに対して１または複数（例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０など）の挿入（例えば、それぞれ１アミノ酸、２アミノ酸、３アミノ酸、４アミノ酸または５アミノ酸）を含んでよい。

その他の好ましいｏｒｆ１３６４配列は、配列番号１〜２２からの少なくともｎ連続するアミノ酸（ここで、ｎは、７以上（例えば８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０またはそれより多い）である）を含む。好ましい断片は、ｏｒｆ１３６４からのエピトープまたは免疫原性断片を含む。その他の好ましい断片は、配列番号１〜２２のＣ末端および／またはＮ末端から１または複数のアミノ酸（例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５２以上）を喪失している。例示的な断片は、以下のアラインメントの下に＃により示す。例示的な断片は、ｆｌｕ抗原４３（ｏｒｆ１３６４）タンパク質の９５０未満のアミノ酸、９００未満のアミノ酸、８５０未満のアミノ酸、８００未満のアミノ酸、７５０未満のアミノ酸、７００未満のアミノ酸、６５０未満のアミノ酸、６００未満のアミノ酸、５５０未満のアミノ酸、５００未満のアミノ酸、４５０未満のアミノ酸、４４０未満のアミノ酸または４３０未満のアミノ酸を含んでよい。さらに、例示的な断片は、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｆｌｕ抗原４３タンパク質（ｏｒｆ１３６４ポリペプチド）と比較して少なくとも最初の１０のＮ末端アミノ酸、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｆｌｕ抗原４３タンパク質（ｏｒｆ１３６４ポリペプチド）と比較して少なくとも最初の２０のＮ末端アミノ酸、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｆｌｕ抗原４３タンパク質（ｏｒｆ１３６４ポリペプチド）と比較して少なくとも最初の３０のＮ末端アミノ酸、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｆｌｕ抗原４３タンパク質（ｏｒｆ１３６４ポリペプチド）と比較して少なくとも最初の４０のＮ末端アミノ酸、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｆｌｕ抗原４３タンパク質（ｏｒｆ１３６４ポリペプチド）と比較して少なくとも最初の５０のＮ末端アミノ酸、またはＥ．ｃｏｌｉ ＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）タンパク質と比較して少なくとも最初の５２のＮ末端アミノ酸を含まないものであり得る。最後に、例示的な断片は、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｆｌｕ抗原４３タンパク質（ｏｒｆ１３６４ポリペプチド）と比較して少なくとも最後の５０のＣ末端アミノ酸、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｆｌｕ抗原４３タンパク質（ｏｒｆ１３６４ポリペプチド）と比較して少なくとも最後の１００のＣ末端アミノ酸、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｆｌｕ抗原４３タンパク質（ｏｒｆ１３６４ポリペプチド）と比較して少なくとも最後の１５０のＣ末端アミノ酸、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｆｌｕ抗原４３タンパク質（ｏｒｆ１３６４ポリペプチド）と比較して少なくとも最後の２００のＣ末端アミノ酸、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｆｌｕ抗原４３タンパク質（ｏｒｆ１３６４ポリペプチド）と比較して少なくとも最後の２５０のＣ末端アミノ酸、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｆｌｕ抗原４３タンパク質（ｏｒｆ１３６４ポリペプチド）と比較して少なくとも最後の３００のＣ末端アミノ酸、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｆｌｕ抗原４３タンパク質（ｏｒｆ１３６４ポリペプチド）と比較して少なくとも最後の３２５のＣ末端アミノ酸、またはＥ．ｃｏｌｉ Ｆｌｕ抗原４３タンパク質（ｏｒｆ１３６４ポリペプチド）と比較して少なくとも最後の３２８のＣ末端アミノ酸を含まないものであり得る。

株Ｅ１１００１９（配列番号１）
群Ａ：株Ｓａｋａｉ、ＥＤＬ９３３、ＥＣ５０８、ＥＣ８６９、ＥＣ４０２４、ＥＣ４０４２、ＥＣ４０４５、ＥＣ４０７６、ＥＣ４１１３、ＥＣ４１１５、ＥＣ４１９６、ＥＣ４２０６、ＥＣ４４０１、ＥＣ４４８６、ＥＣ４５０１およびＴＷ１４５８８（配列番号２）
株Ｂ１７１（配列番号３）
株Ｅ２２（配列番号４）
株Ｂ１７１（配列番号５）
株Ｂ１７１（配列番号６）
株Ｅ２４３７７ＡおよびＯ４２（配列番号７）
株Ｅ２４３７７Ａ（配列番号８）
群Ｂ：株ＵＴＩ８９、ＲＳ２１８およびＩＨＥ３０３４（配列番号９）
株Ｅ１１００１９（配列番号１０）
株Ｅ２２（配列番号１１）
株Ｈ１０４０７（配列番号１２）
株Ｆ１１および５３６（配列番号１３）
株ＳＥＣＥＣ（配列番号１４）
株Ｈ１０４０７（配列番号１５）
株Ｗ３１１０およびＤＨ１０Ｂ（配列番号１６）
株ＭＧ１６５５（配列番号１７）
株Ｏ４２（配列番号１８）
株Ｂ７Ａ（配列番号１９）
株ＣＦＴ０７３（配列番号２０）
株Ｏ４２（配列番号２１）
株ＣＦＴ０７３（配列番号２２）

Ｕｐｅｃ−５２１１ポリペプチド
Ｓｅｌ１反復含有タンパク質は、本明細書において、「ｕｐｅｃ−５２１１」という。Ｅ．ｃｏｌｉからの「ｕｐｅｃ−５２１１」ポリペプチドは、ＣＦＴ０７３からの「ｃ５３２１」、ＥＤ１ａからの「ＥＣＥＤ１＿５０８１」およびＥ．ｆｅｒｇｕｓｏｎｉｉ ＡＴＣＣ３５４６９からの「ＥＦＥＲ＿４３０３」としても公知である。

本発明に従って用いる場合、ｕｐｅｃ−５２１１ポリペプチドは、様々な形態をとり得る。好ましいｕｐｅｃ−５２１１配列は、配列番号２３〜２５と５０％以上の同一性（例えば６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、８７．５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％またはそれより高い）を有する。これは、改変体（例えば、対立遺伝子改変体、相同体、オルソログ、パラログ、変異体など）を含む。

代わりに、ｕｐｅｃ−５２１１配列は、ペアワイズアラインメントアルゴリズムを用いて配列番号２３〜２５のいずれかとアラインメントさせた場合に、Ｎ末端からＣ末端までのｘ個のアミノ酸のそれぞれの移動ウィンドウ（ｐ個のアミノ酸まで伸長するアラインメントについて、ｐ＞ｘの場合、ｐ−ｘ＋１のこのようなウィンドウが存在するように）が、少なくともｘ・ｙの同一のアラインメントされたアミノ酸（ここで、ｘは、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００から選択され、ｙは、０．５０、０．６０、０．７０、０．７５、０．８０、０．８５、０．９０、０．９１、０．９２、０．９３、０．９４、０．９５、０．９６、０．９７、０．９８、０．９９から選択され、ｘ・ｙが整数でない場合、最も近い整数まで切り上げる）を有する。

好ましいペアワイズアラインメントアルゴリズムは、デフォルトパラメータ（例えばＥＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックスを用いてギャップ開始ペナルティ＝１０．０およびギャップ伸長ペナルティ＝０．５）を用いるＮｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈグローバルアラインメントアルゴリズム（３）である。このアルゴリズムは、ＥＭＢＯＳＳパッケージのｎｅｅｄｌｅツールに簡便に実装されている（４）。

Ｕｐｅｃ−５２１１ポリペプチド配列は、配列番号２３〜２５と比較して、離れた位置にあり得るかまたは連続的であり得る１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０（またはそれより多く）の単一アミノ酸変更（欠失、挿入、置換）を有してよい。

Ｕｐｅｃ−５２１１ポリペプチド配列は、配列番号２３〜２５のいずれか１つと比較して、保存置換（すなわちあるアミノ酸の、関連する側鎖を有する別のアミノ酸での置換）のような１または複数（例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０など）のアミノ酸置換を含んでよい。遺伝子によりコードされるアミノ酸は、一般的に４つのファミリーに分けられる：（１）酸性、すなわちアスパラギン酸、グルタミン酸；（２）塩基性、すなわちリシン、アルギニン、ヒスチジン；（３）非極性、すなわちアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン；および（４）非荷電極性、すなわちグリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、スレオニン、チロシン。フェニルアラニン、トリプトファンおよびチロシンは、時折、一緒に芳香族アミノ酸として分類される。一般的に、これらのファミリー内での単一アミノ酸の置換は、生物学的な活性に対して大きな影響を有さない。

Ｕｐｅｃ−５２１１ポリペプチド配列は、配列番号２３〜２５のいずれか１つに対して１または複数（例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９など）の単一アミノ酸欠失を含んでよい。同様に、ポリペプチドは、配列番号２３〜２５のいずれか１つに対して１または複数（例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０など）の挿入（例えば、それぞれ１アミノ酸、２アミノ酸、３アミノ酸、４アミノ酸または５アミノ酸）を含んでよい。

その他の好ましいｕｐｅｃ−５２１１配列は、配列番号２３〜２５からの少なくともｎ連続するアミノ酸（ここで、ｎは、７以上（例えば８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０またはそれより多い）である）を含む。好ましい断片は、ｕｐｅｃ−５２１１からのエピトープまたは免疫原性断片を含む。その他の好ましい断片は、配列番号２３〜２５のＣ末端および／またはＮ末端から１または複数のアミノ酸（例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５以上）を喪失している。

株ＣＦＴ０７３および８３９７２（配列番号２３）
株ＥＤ１ａ（配列番号２４）
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｆｅｒｇｕｓｏｎｉｉ ＡＴＣＣ３５４６９（配列番号２５）

Ｏｒｆ３５２６ポリペプチド
アクセサリーコロニー形成因子Ｄ（ＡｃｆＤ）前駆体タンパク質は、本明細書において、「ｏｒｆ３５２６」という。Ｅ．ｃｏｌｉ ＮＭＥＣからの「ｏｒｆ３５２６」ポリペプチドは、参考文献１に開示され（配列番号７０５１および７０５２）、Ｅ．ｃｏｌｉ ＵＰＥＣ株５３６からの「ＥＣＰ＿３０５０」、Ｅ．ｃｏｌｉ共生株Ｗ３１１０からの「ｙｇｈＪ」、Ｅ．ｃｏｌｉ ＥＴＥＣ株Ｅ２４３７７Ａからの「ＥｃＥ２４３７７Ａ＿３４３２」およびＥ．ｃｏｌｉ共生株ＨＳからの「ＥｃＨＳ＿Ａ３１４２」としても公知である。

本発明に従って用いる場合、ｏｒｆ３５２６ポリペプチドは、様々な形態をとり得る。好ましいｏｒｆ３５２６配列は、配列番号２６〜４０と５０％以上の同一性（例えば６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、８７．５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％またはそれより高い）を有する。これは、改変体（例えば、対立遺伝子改変体、相同体、オルソログ、パラログ、変異体など）を含む。

代わりに、ｏｒｆ３５２６配列は、ペアワイズアラインメントアルゴリズムを用いて配列番号２６〜４０のいずれかとアラインメントさせた場合に、Ｎ末端からＣ末端までのｘ個のアミノ酸のそれぞれの移動ウィンドウ（ｐ個のアミノ酸まで伸長するアラインメントについて、ｐ＞ｘの場合、ｐ−ｘ＋１のこのようなウィンドウが存在するように）が、少なくともｘ・ｙの同一のアラインメントされたアミノ酸（ここで、ｘは、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００から選択され、ｙは、０．５０、０．６０、０．７０、０．７５、０．８０、０．８５、０．９０、０．９１、０．９２、０．９３、０．９４、０．９５、０．９６、０．９７、０．９８、０．９９から選択され、ｘ・ｙが整数でない場合、最も近い整数まで切り上げる）を有する。

好ましいペアワイズアラインメントアルゴリズムは、デフォルトパラメータ（例えばＥＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックスを用いてギャップ開始ペナルティ＝１０．０およびギャップ伸長ペナルティ＝０．５）を用いるＮｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈグローバルアラインメントアルゴリズム（３）である。このアルゴリズムは、ＥＭＢＯＳＳパッケージのｎｅｅｄｌｅツールに簡便に実装されている（４）。

Ｏｒｆ３５２６ポリペプチド配列は、配列番号２６〜４０と比較して、離れた位置にあり得るかまたは連続的であり得る１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０（またはそれより多く）の単一アミノ酸変更（欠失、挿入、置換）を有してよい。

Ｏｒｆ３５２６ポリペプチド配列は、配列番号２６〜４０のいずれか１つと比較して、保存置換（すなわちあるアミノ酸の、関連する側鎖を有する別のアミノ酸での置換）のような１または複数（例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０など）のアミノ酸置換を含んでよい。遺伝子によりコードされるアミノ酸は、一般的に４つのファミリーに分けられる：（１）酸性、すなわちアスパラギン酸、グルタミン酸；（２）塩基性、すなわちリシン、アルギニン、ヒスチジン；（３）非極性、すなわちアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン；および（４）非荷電極性、すなわちグリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、スレオニン、チロシン。フェニルアラニン、トリプトファンおよびチロシンは、時折、一緒に芳香族アミノ酸として分類される。一般的に、これらのファミリー内での単一アミノ酸の置換は、生物学的な活性に対して大きな影響を有さない。

Ｏｒ３５２６ポリペプチド配列は、配列番号２６〜４０のいずれか１つに対して１または複数（例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９など）の単一アミノ酸欠失を含んでよい。同様に、ポリペプチドは、配列番号２６〜４０のいずれか１つに対して１または複数（例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０など）の挿入（例えば、それぞれ１アミノ酸、２アミノ酸、３アミノ酸、４アミノ酸または５アミノ酸）を含んでよい。

その他の好ましいｏｒｆ３５２６配列は、配列番号２６〜４０からの少なくともｎ連続するアミノ酸（ここで、ｎは、７以上（例えば８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０またはそれより多い）である）を含む。好ましい断片は、ｏｒｆ３５２６からのエピトープまたは免疫原性断片を含む。その他の好ましい断片は、配列番号２６〜４０のＣ末端および／またはＮ末端から１または複数のアミノ酸（例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５以上）を喪失している。ｇｌｙ−ｓｅｒ領域の程度は、以下のアラインメントの下に「Ｇ」により示す。Ｎ末端プロリンリッチ反復の程度は、以下のアラインメントの下に「Ｐ」により示す。ｏｒｆ３５２６Ａ、ｏｒｆ３５２６Ｂおよびｏｒｆ３５２６Ｃと称する３つの好ましい断片は、アラインメントの下にそれぞれ「Ａ」、「Ｂ」または「Ｃ」により示す。

ＥＡＥＣ株１０１−１（ＧＩ：８３５８７５８７）（配列番号２６）
ＵＰＥＣ株５３６（ＧＩ：１１０６４３２０４）（配列番号２７）
ＥＡＥＣ株Ｏ４２（配列番号２８）
ＥＰＥＣ株Ｅ２３４８／６９（配列番号２９）
ＥＩＥＣ株５３６３８（ＧＩ：７５５１５２３７）（配列番号３０）
共生株Ｗ３１１０（ＧＩ：８９１０９７４８）（配列番号３１）
ＥＴＥＣ株Ｂ７Ａ（ＧＩ：７５２２７６１８）（配列番号３２）
ＥＰＥＣ株Ｅ２２（ＧＩ：７５２５９９１２）（配列番号３３）
ＥＴＥＣ株Ｅ２４３７７Ａ（ＧＩ：１５７１５６７４７）（配列番号３４）
ＥＴＥＣ株Ｈ１０４０７（配列番号３５）
ＥＰＥＣ株Ｅ１１００１９（ＧＩ：７５２３９４５０）（配列番号３６）
共生株ＨＳ（ＧＩ：１５７１６２４４２）（配列番号３７）
抗生物質耐性株ＳＥＣＥＣ（配列番号３８）
ＮＭＥＣ株ＩＨＥ３０３４（配列番号３９）
ＵＰＥＣ株Ｆ１１（ＧＩ：７５２４１１７９）（配列番号４０）

ある実施形態では、Ｅ．ｃｏｌｉ ＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）ポリペプチドを含むキャリアポリペプチドは、Ｅ．ｃｏｌｉ ＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）タンパク質と比較してキャリアポリペプチドの毒性を減少するＥ．ｃｏｌｉ ＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）タンパク質に対する変異を有する。

毒性を減少する例示的な変異は、ｚｉｎｃｉｎメタロプロテアーゼドメインの全部もしくは一部の欠失、およびプロテアーゼ活性を低減するｚｉｎｃｉｎメタロプロテアーゼドメイン中の点変異を含む。ある場合では、点変異は、亜鉛結合残基の変異または触媒残基の変異である。好ましい点変異は、配列番号３９とのアラインメントに基づくアミノ酸番号１３０５の置換である。

例えばｏｒｆ３５２６Ａについての例示的な欠失は、Ｅ．ｃｏｌｉ ＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）タンパク質の少なくとも最後の１００のＣ末端アミノ酸、Ｅ．ｃｏｌｉ ＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）タンパク質の少なくとも最後の２００のＣ末端アミノ酸、Ｅ．ｃｏｌｉ ＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）タンパク質の少なくとも最後の３００のＣ末端アミノ酸、Ｅ．ｃｏｌｉ ＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）タンパク質の少なくとも最後の４００のＣ末端アミノ酸、Ｅ．ｃｏｌｉ ＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）タンパク質の少なくとも最後の５００のＣ末端アミノ酸、Ｅ．ｃｏｌｉ ＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）タンパク質の少なくとも最後の６００のＣ末端アミノ酸、Ｅ．ｃｏｌｉ ＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）タンパク質の少なくとも最後の７００のＣ末端アミノ酸、Ｅ．ｃｏｌｉ ＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）タンパク質の少なくとも最後の７５０のＣ末端アミノ酸、もしくはＥ．ｃｏｌｉ ＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）タンパク質の少なくとも最後の７５８のＣ末端アミノ酸の除去を含むか、またはｏｒｆ３５２６Ｂについて、Ｅ．ｃｏｌｉ ＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）タンパク質の少なくとも最初の１００のＮ末端アミノ酸、Ｅ．ｃｏｌｉ ＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）タンパク質の少なくとも最初の２００のＮ末端アミノ酸、Ｅ．ｃｏｌｉ ＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）タンパク質の少なくとも最初の３００のＮ末端アミノ酸、Ｅ．ｃｏｌｉ ＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）タンパク質の少なくとも最初の４００のＮ末端アミノ酸、Ｅ．ｃｏｌｉ ＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）タンパク質の少なくとも最初の５００のＮ末端アミノ酸、Ｅ．ｃｏｌｉ ＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）タンパク質の少なくとも最初の６００のＮ末端アミノ酸、Ｅ．ｃｏｌｉ ＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）タンパク質の少なくとも最初の７００のＮ末端アミノ酸、Ｅ．ｃｏｌｉ ＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）タンパク質の少なくとも最初の７５０のＮ末端アミノ酸、もしくはＥ．ｃｏｌｉ ＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）タンパク質の少なくとも最初の７６０のＮ末端アミノ酸を含まない。

ｏｒｆ３５２６Ｃのような例示的な断片は、Ｅ．ｃｏｌｉ ＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）タンパク質の少なくとも最後の１００のＣ末端アミノ酸、Ｅ．ｃｏｌｉ ＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）タンパク質の少なくとも最後の１２５のＣ末端アミノ酸、Ｅ．ｃｏｌｉ ＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）タンパク質の少なくとも最後の１５０のＣ末端アミノ酸、Ｅ．ｃｏｌｉ ＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）タンパク質の少なくとも最後の１７５のＣ末端アミノ酸、Ｅ．ｃｏｌｉ ＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）タンパク質の少なくとも最後の２００のＣ末端アミノ酸、Ｅ．ｃｏｌｉ ＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）タンパク質の少なくとも最後の２１０のＣ末端アミノ酸、またはＥ．ｃｏｌｉ ＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）タンパク質の少なくとも最後の２１７のＣ末端アミノ酸を含まず、場合によって、Ｅ．ｃｏｌｉ ＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）タンパク質の少なくとも最初の１０のＮ末端アミノ酸、Ｅ．ｃｏｌｉ ＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）タンパク質の少なくとも最初の２０のＮ末端アミノ酸、Ｅ．ｃｏｌｉ ＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）タンパク質の少なくとも最初の３０のＮ末端アミノ酸、またはＥ．ｃｏｌｉ ＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）タンパク質の少なくとも最初の３３のＮ末端アミノ酸を含まない。

上記のキャリアポリペプチドは、全長Ｅ．ｃｏｌｉ ＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）タンパク質と比較してキャリアポリペプチドの溶解度を増加するＥ．ｃｏｌｉ ＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）タンパク質に対する欠失をさらに含有してよいが、一方で、キャリアポリペプチドは、被験体において、結合体化多糖に対して全長Ｅ．ｃｏｌｉ ＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）タンパク質と実質的に同様の免疫応答を依然として生じる。

溶解度を増加する例示的な欠失は、ｇｌｙ−ｓｅｒ領域までの実質的に全てのＮ末端アミノ酸の除去、Ｎ末端プロリンリッチ反復の全てもしくは一部分の除去、またはその両方を含む。さらに、欠失は、Ｅ．ｃｏｌｉ ＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）タンパク質と比較して少なくとも最初の２０のＮ末端アミノ酸の除去、Ｅ．ｃｏｌｉ ＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）タンパク質と比較して少なくとも最初の２０のＮ末端アミノ酸の除去、Ｅ．ｃｏｌｉ ＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）タンパク質と比較して少なくとも最初の３０のＮ末端アミノ酸、Ｅ．ｃｏｌｉ ＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）タンパク質と比較して少なくとも最初の３３のＮ末端アミノ酸、Ｅ．ｃｏｌｉ ＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）タンパク質と比較して少なくとも最初の４０のＮ末端アミノ酸、Ｅ．ｃｏｌｉ ＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）タンパク質と比較して少なくとも最初の５０のＮ末端アミノ酸、Ｅ．ｃｏｌｉ ＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）タンパク質と比較して少なくとも最初の６０のＮ末端アミノ酸、Ｅ．ｃｏｌｉ ＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）タンパク質と比較して少なくとも最初の７０のＮ末端アミノ酸、Ｅ．ｃｏｌｉ ＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）タンパク質と比較して少なくとも最初の８０のＮ末端アミノ酸、Ｅ．ｃｏｌｉ ＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）タンパク質と比較して少なくとも最初の９０のＮ末端アミノ酸、またはＥ．ｃｏｌｉ ＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）タンパク質と比較して少なくとも最初の９４のＮ末端アミノ酸を含んでよい。

溶解度を改善し、毒性を低下することに加えて、欠失は、内因性ＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）タンパク質を有する共生Ｅ．ｃｏｌｉ株における発現の後の精製がより容易である。

免疫原性組成物および医薬品
本発明の多糖結合体は、免疫原性組成物中の活性成分（免疫原）として有用であり、そのような組成物は、ワクチンとして有用であり得る。本発明によるワクチンは、予防的（すなわち感染を防ぐ）または治療的（すなわち感染を処置する）のいずれかであってよいが、典型的には予防的である。

免疫原性組成物は、よって、薬学的に許容される。これらは、通常、抗原に加えて成分を含み、例えば、これらは、典型的には、１または複数の薬学的キャリア、賦形剤および／またはアジュバントを含む。キャリアおよび賦形剤の詳細な考察は、参考文献１００で入手可能である。ワクチンアジュバントの詳細な考察は、参考文献５および６で入手可能である。

組成物は、一般的に、哺乳動物に水性形態で投与される。しかし、投与の前に、組成物は非水性形態であってよい。例えば、いくつかのワクチンは水性形態で製造され、次いで充填および配布され、同じく水性形態で投与されるが、その他のワクチンは製造中に凍結乾燥され、使用時に水性形態に再構成される。よって、本発明の組成物は、凍結乾燥処方物のように乾燥され得る。

組成物は、チオメルサールまたは２−フェノキシエタノールのような防腐剤を含んでよい。しかし、好ましくは、ワクチンは、水銀性物質を実質的に含まない（すなわち５μｇ／ｍｌ未満）、例えばチオメルサールを含まないようにすべきである。水銀を含まないワクチンがより好ましい。防腐剤を含まないワクチンが特に好ましい。

熱安定性を改善するために、組成物は、温度保護剤を含んでよい。

張度を制御するために、ナトリウム塩のような生理的な塩を含むことが好ましい。塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）が好ましく、これは、１〜２０ｍｇ／ｍｌ、例えば約１０±２ｍｇ／ｍｌ ＮａＣｌで存在してよい。存在し得るその他の塩は、塩化カリウム、リン酸二水素カリウム、リン酸二ナトリウム無水物（ｄｉｓｏｄｉｕｍ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｄｅｈｙｄｒａｔｅ）、塩化マグネシウム、塩化カルシウムなどを含む。

組成物は、一般的に、２００ｍＯｓｍ／ｋｇ〜４００ｍＯｓｍ／ｋｇ、好ましくは２４０〜３６０ｍＯｓｍ／ｋｇの重量オスモル濃度を有し、より好ましくは、２９０〜３１０ｍＯｓｍ／ｋｇの範囲内にある。

組成物は、１または複数の緩衝剤を含んでよい。典型的な緩衝剤は、リン酸塩緩衝剤、Ｔｒｉｓ緩衝剤、ホウ酸塩緩衝剤、コハク酸塩緩衝剤、ヒスチジン緩衝剤（特に水酸化アルミニウムアジュバントとともに）またはクエン酸塩緩衝剤を含む。緩衝剤は、典型的には、５〜２０ｍＭの範囲で含まれる。

組成物のｐＨは、一般的に、５．０〜８．１であり、より典型的には６．０〜８．０、例えば６．５および７．５、または７．０〜７．８である。

組成物は、好ましくは滅菌されている。組成物は、好ましくは非発熱性であり、例えば用量あたり＜１ＥＵ（内毒素単位、標準的な尺度）、好ましくは用量あたり＜０．１ＥＵを含有する。組成物は、好ましくは、グルテンを含まない。

組成物は、単回の免疫化のための物質を含んでも、複数回の免疫化（すなわち「複数回用量（ｍｕｌｔｉｄｏｓｅ）」キット）のための物質を含んでもよい。複数回用量の構成（ａｒｒａｎｇｅｍｅｎｔ）において、防腐剤を含むことが好ましい。複数回用量組成物に防腐剤を含める代わり（またはそれに加えて）に、組成物を、物質を取り出すための無菌アダプタを有する容器中に入れてよい。

ヒトワクチンは、典型的には、約０．５ｍｌの投与容積で投与されるが、小児には半分の用量（すなわち約０．２５ｍｌ）を投与してよい。

本発明の免疫原性組成物は、１または複数の免疫調節剤も含んでよい。好ましくは、免疫調節剤の１または複数は、１または複数のアジュバントを含む。アジュバントは、以下でさらに論じるＴＨ１アジュバントおよび／またはＴＨ２アジュバントを含んでよい。

本発明の組成物で使用され得るアジュバントとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：
（Ａ．無機質含有組成物）
本発明においてアジュバントとして用いるために適切な無機質含有組成物は、アルミニウム塩およびカルシウム塩（またはそれらの混合物）のような無機塩を含む。カルシウム塩は、リン酸カルシウム（例えば参考文献７に開示されている「ＣＡＰ」粒子）を含む。アルミニウム塩は、水酸化物、リン酸塩、硫酸塩などを含み、これらの塩は任意の適切な形態（例えばゲル、結晶、非晶質など）をとる。これらの塩への吸着が好ましい。無機質含有組成物はまた、金属塩の粒子として処方されてもよい（８）。

水酸化アルミニウムおよびリン酸アルミニウムとして公知のアジュバントを用いてよい。これらの名称は、一般的であるが、簡便さのためにのみ用いられる。なぜなら、これらはいずれも、存在する実際の化合物を正確に記載していないからである（例えば参考文献５の第９章を参照されたい）。本発明は、アジュバントとして一般的に用いられる「水酸化物」または「リン酸塩」アジュバントのいずれも用いることができる。「水酸化アルミニウム」として公知のアジュバントは、典型的にはオキシ水酸化アルミニウム塩（ａｌｕｍｉｎｕｍ ｏｘｙｈｙｄｒｏｘｉｄｅ ｓａｌｔ）であり、これは、通常、少なくとも部分的に結晶性である。「リン酸アルミニウム」として公知のアジュバントは、典型的には、少量の硫酸塩も頻繁に含有しているヒドロキシリン酸アルミニウム（ａｌｕｍｉｎｕｍ ｈｙｄｒｏｘｙｐｈｏｓｐｈａｔｅ）である（すなわち、アルミニウムヒドロキシホスフェートサルフェート（ａｌｕｍｉｎｉｕｍ ｈｙｄｒｏｘｙｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｓｕｌｆａｔｅ））。これらは、沈殿により得ることができ、沈殿中の反応条件および濃度は、塩中のヒドロキシルに対するホスフェートの置換の程度に影響する。

水酸化アルミニウムアジュバントについて、繊維状の形態（例えば透過型電子顕微鏡写真で観察されるような）が典型的である。水酸化アルミニウムアジュバントのｐＩは、典型的には約１１であり、すなわちアジュバント自体が生理的ｐＨにおいて正の表面電荷を有する。ｐＨ７．４にてＡｌ^＋＋＋１ｍｇあたり１．８〜２．６ｍｇのタンパク質吸着能が、水酸化アルミニウムアジュバントについて報告されている。

リン酸アルミニウムアジュバントは、一般的に、０．３〜１．２、好ましくは０．８〜１．２、より好ましくは０．９５±０．１のＰＯ_４／Ａｌモル比を有する。リン酸アルミニウムは、ヒドロキシリン酸塩については特に、一般的に非晶質である。典型的なアジュバントは、０．８４〜０．９２のＰＯ_４／Ａｌモル比を有する非晶質ヒドロキシリン酸アルミニウムであり、０．６ｍｇ Ａｌ^３＋／ｍｌで含まれる。リン酸アルミニウムは、一般的に粒子状である（例えば透過型電子顕微鏡写真で観察されるようなプレート様の形態）。粒子の典型的な直径は、任意の抗原吸着後に、０．５〜２０μｍの範囲（例えば約５〜１０μｍ）である。ｐＨ７．４にてＡｌ^＋＋＋１ｍｇあたり０．７〜１．５ｍｇのタンパク質吸着能が、リン酸アルミニウムアジュバントについて報告されている。

リン酸アルミニウムのゼロ電荷点（ＰＺＣ）は、ヒドロキシルに対するホスフェートの置換の程度と反比例し、この置換の程度は、沈殿により塩を調製するために用いる反応条件および反応物の濃度に依存して変動できる。ＰＺＣは、溶液中の遊離リン酸イオンの濃度を変化させること（より多いホスフェート＝より酸性側のＰＺＣ）、またはヒスチジン緩衝剤のような緩衝剤を加えること（ＰＺＣをより塩基性にする）によっても変更される。本発明に従って用いられるリン酸アルミニウムは、一般的に、４．０〜７．０、より好ましくは５．０〜６．５、例えば約５．７のＰＺＣを有する。

本発明の組成物を調製するために用いられるアルミニウム塩の懸濁物は、緩衝剤（例えばリン酸塩緩衝剤またはヒスチジン緩衝剤またはＴｒｉｓ緩衝剤）を含有してよいが、このことは常に必要というわけではない。懸濁物は、好ましくは、滅菌されており、発熱物質を含まない。懸濁物は、例えば１．０〜２０ｍＭ、好ましくは５〜１５ｍＭ、より好ましくは約１０ｍＭの濃度で存在する遊離の水性リン酸イオンを含んでよい。懸濁物は、塩化ナトリウムも含んでよい。

本発明は、水酸化アルミニウムとリン酸アルミニウムの両方の混合物を使用することができる。この場合、水酸化アルミニウムよりも多くのリン酸アルミニウムが存在し得、例えば、少なくとも２：１、例えば≧５：１、≧６：１、≧７：１、≧８：１、≧９：１などの重量比であってよい。

患者に投与するための組成物中のＡｌ^＋＋＋の濃度は、好ましくは１０ｍｇ／ｍｌ未満、例えば≦５ｍｇ／ｍｌ、≦４ｍｇ／ｍｌ、≦３ｍｇ／ｍｌ、≦２ｍｇ／ｍｌ、≦１ｍｇ／ｍｌなどである。好ましい範囲は、０．３〜１ｍｇ／ｍｌである。最大０．８５ｍｇ／用量が好ましい。

（Ｂ．油性エマルジョン（ｏｉｌ ｅｍｕｌｓｉｏｎ））
本発明においてアジュバントとして用いるために適切な油性エマルジョン組成物は、ＭＦ５９（ＴＭ）［参考文献５の第１０章；参考文献９も参照されたい］（マイクロフルイダイザーを用いてサブミクロンの粒子に処方された５％スクアレン、０．５％ＴＷＥＥＮ８０（ＴＭ）および０．５％ＳＰＡＮ８５（ＴＭ））のようなスクアレン−水エマルジョンを含む。完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）および不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）も用いてよい。

種々の水中油型エマルジョンアジュバントが公知であり、これらは、典型的には、少なくとも１種の油と少なくとも１種の界面活性剤とを含み、油（複数可）および界面活性剤（複数可）は、生分解性（代謝可能）であり、生体適合性である。エマルジョン中の油滴は、一般的に直径５μｍ未満であり、理想的にはサブミクロンの直径を有し、これらの小さいサイズは、マイクロフルイダイザーを用いて達成され、安定なエマルジョンを提供する。２２０ｎｍ未満のサイズの液滴は、フィルタ滅菌に供することができるので好ましい。

エマルジョンは、動物（例えば魚類）の供給源または植物の供給源からのもののような油を含むことができる。植物油の供給源は、堅果、種子および穀粒を含む。ピーナツ油、大豆油、ヤシ油およびオリーブ油が、最も一般的に入手可能な堅果油の例である。例えばホホバ豆から得られるホホバ油を用いることができる。種子油は、紅花油、綿実油、ひまわり種子油、ごま油などを含む。穀粒の群において、コーン油が最も容易に入手可能であるが、コムギ、オート麦、ライムギ、コメ、テフ、ライコムギなどのようなその他の穀類の穀粒の油も用いてよい。グリセロールおよび１，２−プロパンジオールの６〜１０炭素脂肪酸エステルは、種子油中に天然には存在しないが、堅果油および種子油から出発する適切な材料の加水分解、分離およびエステル化により調製し得る。哺乳動物の乳からの脂肪および油は代謝可能であり、よって、本発明の実施において用いてよい。動物供給源から純粋な油を得るために必要な分離、精製、けん化およびその他の手段の手順は、当該技術分野において周知である。ほとんどの魚類は、容易に収集し得る代謝可能な油を含有する。例えば、タラ肝油、サメ肝油および鯨ろうのような鯨油は、本明細書において用い得る魚油のいくつかの例である。いくつかの分岐鎖油が、５炭素イソプレン単位で生化学的に合成され、通常、テルペノイドと呼ばれる。サメ肝油は、スクアレン、２，６，１０，１５，１９，２３−ヘキサメチル−２，６，１０，１４，１８，２２−テトラコサヘキサエンとして公知の分岐不飽和テルペノイドを含有し、これは、本明細書において特に好ましい。スクアレンの飽和類似体であるスクアランも好ましい油である。スクアレンおよびスクアランを含む魚油は、商業的な供給源から容易に入手可能であるか、または当該技術分野において公知の方法により得ることができる。その他の好ましい油は、トコフェロールである（下記参照）。油の混合物を用いることができる。

界面活性剤は、それらの「ＨＬＢ」（親水性／親油性バランス）により分類できる。本発明の好ましい界面活性剤は、少なくとも１０、好ましくは少なくとも１５、より好ましくは少なくとも１６のＨＬＢを有する。本発明は、それらに限定されないが、ポリオキシエチレンソルビタンエステル界面活性剤（一般的にＴｗｅｅｎと呼ばれる）、特にポリソルベート２０およびポリソルベート８０；直鎖状ＥＯ／ＰＯブロックコポリマーのようなＤＯＷＦＡＸ^ＴＭの商品名の下で販売されるエチレンオキシド（ＥＯ）、プロピレンオキシド（ＰＯ）および／またはブチレンオキシド（ＢＯ）のコポリマー；反復エトキシ（オキシ−１，２−エタンジイル）基の数が変動し得るオクトキシノール、特にオクトキシノール−９（ＴｒｉｔｏｎＸ−１００またはｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール）が興味深い；（オクチルフェノキシ）ポリエトキシエタノール（ＩＧＥＰＡＬ ＣＡ−６３０／ＮＰ−４０）；ホスファチジルコリン（レシチン）のようなリン脂質；Ｔｅｒｇｉｔｏｌ^ＴＭＮＰシリーズのようなノニルフェノールエトキシレート；トリエチレングリコールモノラウリルエーテル（Ｂｒｉｊ３０）のようなラウリル、セチル、ステアリルおよびオレイルアルコールに由来するポリオキシエチレン脂肪エーテル（Ｂｒｉｊ界面活性剤として公知である）；ならびにソルビタントリオレエート（ＳＰＡＮ８５（ＴＭ））およびソルビタンモノラウレートのようなソルビタンエステル（一般的にＳＰＡＮとして公知である）を含む界面活性剤とともに用いることができる。非イオン界面活性剤が好ましい。エマルジョンに含めるために好ましい界面活性剤は、ＴＷＥＥＮ８０（ＴＭ）（ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート）、ＳＰＡＮ８５（ＴＭ）（ソルビタントリオレエート）、レシチンおよびＴｒｉｔｏｎＸ−１００である。

界面活性剤の混合物、例えばＴＷＥＥＮ８０（ＴＭ）／ＳＰＡＮ８５（ＴＭ）混合物を用いることができる。ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート（ＴＷＥＥＮ８０（ＴＭ））のようなポリオキシエチレンソルビタンエステルと、ｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール（ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）のようなオクトキシノールとの組み合わせも適切である。別の有用な組み合わせは、ラウレス−９とポリオキシエチレンソルビタンエステルおよび／またはオクトキシノールとを含む。

界面活性剤の好ましい量（重量％）は、ポリオキシエチレンソルビタンエステル（例えばＴＷＥＥＮ８０（ＴＭ））０．０１〜１％、特に約０．１％；オクチル−またはノニルフェノキシポリオキシエタノール（例えばＴｒｉｔｏｎＸ−１００またはＴｒｉｔｏｎシリーズのその他の洗浄剤）０．００１〜０．１％、特に０．００５〜０．０２％；ポリオキシエチレンエーテル（例えばラウレス９）０．１〜２０％、好ましくは０．１〜１０％、特に０．１〜１％または約０．５％である。

好ましいエマルジョンアジュバントは、＜１μｍ、例えば≦７５０ｎｍ、≦５００ｎｍ、≦４００ｎｍ、≦３００ｎｍ、≦２５０ｎｍ、≦２２０ｎｍ、≦２００ｎｍまたはそれより小さい平均液滴サイズを有する。これらの液滴サイズは、マイクロフルイダイゼーションのような技術により簡便に達成できる。

本発明で有用な具体的な水中油型エマルジョンアジュバントは、それらに限定されないが、以下のものを含む。

・スクアレン、ＴＷＥＥＮ８０（ＴＭ）およびＳＰＡＮ８５（ＴＭ）のサブミクロンのエマルジョン。エマルジョンの容積での組成は、約５％スクアレン、約０．５％ポリソルベート８０および約０．５％ＳＰＡＮ８５（ＴＭ）であり得る。重量の点において、これらの比率は、４．３％スクアレン、０．５％ポリソルベート８０および０．４８％ＳＰＡＮ８５（ＴＭ）になる。このアジュバントは、参考文献１２の第１０章および参考文献１３の第１２章により詳細に記載されるように、「ＭＦ５９（ＴＭ）」（１０〜１１）として公知である。有利には、ＭＦ５９（ＴＭ）エマルジョンは、クエン酸イオン、例えば１０ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝剤を含む。

・スクアレン、トコフェロールおよびＴＷＥＥＮ８０（ＴＭ））のエマルジョン。エマルジョンは、リン酸緩衝食塩水を含んでよい。これは、ＳＰＡＮ８５（ＴＭ）（例えば１％で）および／またはレシチンも含んでよい。これらのエマルジョンは、２〜１０％スクアレン、２〜１０％トコフェロールおよび０．３〜３％ＴＷＥＥＮ８０（ＴＭ）を有してよく、スクアレン：トコフェロールの重量比は、より安定なエマルジョンが得られるので、好ましくは≦１である。スクアレンとＴＷＥＥＮ８０（ＴＭ）とは、約５：２の容積比で存在してよい。あるこのようなエマルジョンは、ＴＷＥＥＮ８０（ＴＭ）をＰＢＳ中に溶解して２％溶液を得て、次いで９０ｍｌのこの溶液を、（５ｇのＤＬ−α−トコフェロールおよび５ｍｌスクアレン）の混合物と混合し、次いで混合物をマイクロフルイダイズすることにより作製できる。得られるエマルジョンは、例えば、１００〜２５０ｎｍ、好ましくは約１８０ｎｍの平均直径のサブミクロンの油滴を有し得る。

・スクアレン、トコフェロールおよびＴｒｉｔｏｎ洗浄剤（例えばＴｒｉｔｏｎＸ−１００）のエマルジョン。エマルジョンは、３ｄ−ＭＰＬも含んでよい（下記参照）。エマルジョンは、リン酸塩緩衝剤を含有してよい。

・ポリソルベート（例えばポリソルベート８０）、Ｔｒｉｔｏｎ洗浄剤（例えばＴｒｉｔｏｎＸ−１００）およびトコフェロール（例えばα−コハク酸トコフェロール）を含むエマルジョン。エマルジョンは、これらの３成分を、約７５：１１：１０の質量比で含んでよく（例えば７５０μｇ／ｍｌポリソルベート８０、１１０μｇ／ｍｌ ＴｒｉｔｏｎＸ−１００および１００μｇ／ｍｌ α−コハク酸トコフェロール）、これらの濃度は、抗原からのこれらの成分のいずれの寄与も含むべきである。エマルジョンは、スクアレンも含んでよい。エマルジョンは、３ｄ−ＭＰＬも含んでよい（下記参照）。水相は、リン酸塩緩衝剤を含有してよい。

・スクアラン、ポリソルベート８０およびポロキサマー４０１（「ＰＬＵＲＯＮＩＣ（ＴＭ）Ｌ１２１」）のエマルジョン。エマルジョンは、リン酸緩衝食塩水、ｐＨ７．４中で処方できる。このエマルジョンは、ムラミルジペプチドについての有用な送達ビヒクルであり、スレオニル−ＭＤＰとともに「ＳＡＦ−１」アジュバント中で用いられている（１４）（０．０５〜１％Ｔｈｒ−ＭＤＰ、５％スクアラン、２．５％ＰＬＵＲＯＮＩＣ（ＴＭ）Ｌ１２１および０．２％ポリソルベート８０）。これは、「ＡＦ」アジュバントでのようにＴｈｒ−ＭＤＰなしで用いることもできる（１５）（５％スクアラン、１．２５％ＰＬＵＲＯＮＩＣ（ＴＭ）Ｌ１２１および０．２％ポリソルベート８０）。マイクロフルイダイゼーションが好ましい。

・スクアレン、水性溶媒、ポリオキシエチレンアルキルエーテル親水性非イオン界面活性剤（例えばポリオキシエチレン（１２）セトステアリルエーテル）および疎水性非イオン界面活性剤（例えばソルビタンモノオレエートまたは「ＳＰＡＮ８０（ＴＭ）」のようなソルビタンエステルまたはマンニドエステル）を含むエマルジョン。エマルジョンは、好ましくは、熱可逆性であり、かつ／または少なくとも９０％の油滴（容積による）が２００ｎｍ未満のサイズである（１６）。エマルジョンは、アルジトール、凍結保護剤（例えばドデシルマルトシドおよび／またはスクロースのような糖）、および／またはアルキルポリグリコシドの１または複数も含んでよい。このようなエマルジョンは、凍結乾燥してよい。

・スクアレン、ポロキサマー１０５およびＡｂｉｌ−Ｃａｒｅのエマルジョン（１７）。アジュバント添加された（ａｄｊｕｖａｎｔｅｄ）ワクチンにおけるこれらの成分の最終濃度（重量）は、５％スクアレン、４％ポロキサマー１０５（プルロニックポリオール）および２％Ａｂｉｌ−Ｃａｒｅ８５（ビス−ＰＥＧ／ＰＰＧ−１６／１６ ＰＥＧ／ＰＰＧ−１６／１６ジメチコン；カプリル酸／カプリン酸トリグリセリド）である。

・０．５〜５０％の油、０．１〜１０％のリン脂質および０．０５〜５％の非イオン界面活性剤を含むエマルジョン。参考文献１８に記載されるように、好ましいリン脂質成分は、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジン酸、スフィンゴミエリンおよびカルジオリピンである。サブミクロンの液滴サイズが有利である。

・代謝不能な油（例えば軽油（ｌｉｇｈｔ ｍｉｎｅｒａｌ ｏｉｌ））および少なくとも１種の界面活性剤（例えばレシチン、ＴＷＥＥＮ８０（ＴＭ）またはＳＰＡＮ８０（ＴＭ））のサブミクロンの水中油型エマルジョン。ＱｕｉｌＡサポニン、コレステロール、サポニン親油性結合体（例えば脂肪族アミンをデスアシルサポニンに、グルクロン酸のカルボキシル基を介して付加することにより生成される、参考文献１９に記載されるＧＰＩ−０１００）、ジメチルジオクタデシルアンモニウム（ｄｉｍｅｔｈｙｉｄｉｏｃｔａｄｅｃｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ）ブロミドおよび／またはＮ，Ｎ−ジオクタデシル−Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）プロパンジアミンのような添加物を含んでよい。

・サポニン（例えばＱｕｉｌＡまたはＱＳ２１）およびステロール（例えばコレステロール）が、らせん状ミセルとして会合しているエマルジョン（２０）。

・鉱油、非イオン親油性エトキシ化脂肪アルコールおよび非イオン親水性界面活性剤（例えばエトキシ化脂肪アルコールおよび／またはポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンブロックコポリマー）を含むエマルジョン（２１）。

・鉱油、非イオン親水性エトキシ化脂肪アルコールおよび非イオン親油性界面活性剤（例えばエトキシ化脂肪アルコールおよび／またはポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンブロックコポリマー）を含むエマルジョン（２１）。

いくつかの実施形態において、エマルジョンは、送達時に抗原と即席に混合してよく、よって、アジュバントおよび抗原は、使用時の最終的な処方のために準備された、パッケージまたは分配されたワクチンにおいて別々に保持され得る。その他の実施形態において、エマルジョンは、製造中に抗原と混合され、よって、組成物は、液体アジュバント添加形態でパッケージされる。抗原は、一般的に、ワクチンが２つの液体を混合することにより最終的に調製されるように水性の形態にある。混合するための２つの液体の容積比は変動し得る（例えば５：１〜１：５）が、一般的には約１：１である。成分の濃度が具体的なエマルジョンの上記の記載において示されている場合、これらの濃度は、典型的に、希釈されていない組成物についてのものであり、抗原溶液と混合した後の濃度は、よって、減少する。

組成物がトコフェロールを含む場合、α、β、γ、δ、εまたはξトコフェロールのいずれを用いることもできるが、α−トコフェロールが好ましい。トコフェロールは、いくつかの形態、例えば異なる塩および／または異性体をとることができる。塩は、コハク酸塩、酢酸塩、ニコチン酸塩などのような有機塩を含む。Ｄ−α−トコフェロールおよびＤＬ−α−トコフェロールの両方を用いることができる。トコフェロールは、有利には、高齢患者（例えば６０歳以上の年齢）用のワクチンに有利に含まれる。なぜなら、ビタミンＥは、この患者群における免疫応答に対して正の効果を有することが報告されているからである（２２）。これらは、エマルジョンを安定化する助けになり得る抗酸化特性も有する（２３）。好ましいα−トコフェロールは、ＤＬ−α−トコフェロールであり、このトコフェロールの好ましい塩は、コハク酸塩である。コハク酸塩は、インビボにおいてＴＮＦ関連リガンドと一緒に働くことが見出されている。

（Ｃ．サポニン処方物（参考文献５の第２２章））
サポニン処方物を、本発明においてアジュバントとして用いてもよい。サポニンは、広範囲の種の植物の樹皮、葉、茎、根および花でさえも見出されるステロールグリコシドおよびトリテルペノイドグリコシドの不均質な群である。Ｑｕｉｌｌａｉａ ｓａｐｏｎａｒｉａ Ｍｏｌｉｎａの木の樹皮からのサポニンは、アジュバントとして広く研究されている。サポニンは、Ｓｍｉｌａｘ ｏｒｎａｔａ（サルサパリラ（ｓａｒｓａｐｒｉｌｌａ））、Ｇｙｐｓｏｐｈｉｌｌａ ｐａｎｉｃｕｌａｔａ（ブライズヴェイル（ｂｒｉｄｅｓ ｖｅｉｌ））およびＳａｐｏｎａｒｉａ ｏｆｆｉｃｉａｎａｌｉｓ（ソープルート）から商業的に得ることもできる。サポニンアジュバント処方物は、ＱＳ２１のような精製処方物およびＩＳＣＯＭのような脂質処方物を含む。ＱＳ２１は、Ｓｔｉｍｕｌｏｎ^ＴＭとして市販されている。

サポニン組成物は、ＨＰＬＣおよびＲＰ−ＨＰＬＣを用いて精製されている。ＱＳ７、ＱＳ１７、ＱＳ１８、ＱＳ２１、ＱＨ−Ａ、ＱＨ−ＢおよびＱＨ−Ｃを含む、これらの技術を用いた具体的な精製画分が同定されている。好ましくは、サポニンはＱＳ２１である。ＱＳ２１の生成方法は、参考文献２４に開示されている。サポニン処方物は、コレステロールのようなステロールも含んでよい（２５）。

サポニンとコレステロールとの組み合わせを用いて、免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭ）と呼ばれる独特の粒子を形成できる［参考文献５の第２３章］。ＩＳＣＯＭは、典型的には、ホスファチジルエタノールアミンまたはホスファチジルコリンのようなリン脂質も含む。任意の公知のサポニンを、ＩＳＣＯＭで用いることができる。好ましくは、ＩＳＣＯＭは、ＱｕｉｌＡ、ＱＨＡおよびＱＨＣの１または複数を含む。ＩＳＣＯＭは、参考文献２５〜２６にさらに記載されている。所望により、ＩＳＣＯＭＳは、さらなる洗浄剤を欠いていてよい（２７）。

サポニンに基づくアジュバントの開発の概説は、参考文献２８および２７で見出すことができる。

（Ｄ．ビロソームおよびウイルス様粒子）
ビロソームおよびウイルス様粒子（ＶＬＰ）を、本発明においてアジュバントとして用いることもできる。これらの構造は、一般的に、所望によりリン脂質と組み合わされたかもしくはそれとともに処方されたウイルスからの１または複数のタンパク質を含有する。これらは、一般的に、非病原性で、非複製性であり、一般的に、いずれの天然ウイルスゲノムも含有しない。ウイルスタンパク質は、組換え生成されても、またはウイルス全体から単離されてもよい。ビロソームまたはＶＬＰで用いるために適切なこれらのウイルスタンパク質は、インフルエンザウイルス（例えばＨＡまたはＮＡ）、Ｂ型肝炎ウイルス（例えばコアまたはカプシドタンパク質）、Ｅ型肝炎ウイルス、麻疹ウイルス、シンドビスウイルス、ロタウイルス、口蹄疫ウイルス、レトロウイルス、ノーウォークウイルス、ヒトパピローマウイルス、ＨＩＶ、ＲＮＡファージ、Ｑβファージ（例えばコートタンパク質）、ＧＡファージ、ｆｒファージ、ＡＰ２０５ファージおよびＴｙ（例えばレトロトランスポゾンＴｙタンパク質ｐ１）に由来するタンパク質を含む。ＶＬＰは、参考文献３０〜３１においてさらに論じられている。ビロソームは、例えば参考文献３２においてさらに論じられている。

（Ｅ．細菌誘導体または微生物誘導体）
本発明で用いるために適切なアジュバントは、腸内細菌リポ多糖（ＬＰＳ）の非毒性誘導体、リピドＡ誘導体、免疫刺激オリゴヌクレオチドならびにＡＤＰ−リボシル化毒素およびその解毒化誘導体のような細菌誘導体または微生物誘導体を含む。

ＬＰＳの非毒性誘導体は、モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）および３−Ｏ−脱アシル化ＭＰＬ（３ｄＭＰＬ）を含む。３ｄＭＰＬは、４、５または６のアシル化された鎖を有する３脱−Ｏ−アシル化モノホスホリルリピドＡの混合物である。３脱−Ｏ−アシル化モノホスホリルリピドＡの好ましい「小粒子」の形態は、参考文献３３に開示されている。３ｄＭＰＬのこのような「小粒子」は、０．２２μｍの膜を通して滅菌ろ過されるために十分小さい（３３）。その他の非毒性ＬＰＳ誘導体は、アミノアルキルグルコサミニドホスフェート誘導体、例えばＲＣ−５２９のようなモノホスホリルリピドＡ模倣物を含む（３４、３５）。

リピドＡ誘導体は、ＯＭ−１７４のようなＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉからのリピドＡの誘導体を含む。ＯＭ−１７４は、例えば参考文献３６および３７に記載されている。

本発明においてアジュバントとして用いるために適切な免疫刺激オリゴヌクレオチドは、ＣｐＧモチーフ（リン酸結合（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｏｎｄ）によりグアノシンと連結された非メチル化シトシンを含有するジヌクレオチド配列）を含有するヌクレオチド配列を含む。２本鎖ＲＮＡおよびパリンドロームまたはポリ（ｄＧ）配列を含有するオリゴヌクレオチドも、免疫刺激性であることが示されている。

ＣｐＧは、ホスホロチオエート改変のようなヌクレオチド改変／類似体を含むことができ、２本鎖または１本鎖であり得る。参考文献３８、３９および４０は、可能性のある類似体置換、例えば２’−デオキシ−７−デアザグアノシンでのグアノシンの置き換えを開示している。ＣｐＧオリゴヌクレオチドのアジュバント効果は、参考文献４１〜４２においてさらに論じられている。

ＣｐＧ配列は、モチーフＧＴＣＧＴＴまたはＴＴＣＧＴＴ（４３）のようにＴＬＲ９に向けられることがある。ＣｐＧ配列は、ＣｐＧ−Ａ ＯＤＮのようにＴｈ１免疫応答を誘導するために特異的であり得るか、またはＣｐＧ−Ｂ ＯＤＮのようにＢ細胞応答を誘導するためにより特異的であり得る。ＣｐＧ−ＡおよびＣｐＧ−Ｂ ＯＤＮは、参考文献４４〜４５において論じられている。好ましくは、ＣｐＧは、ＣｐＧ−Ａ ＯＤＮである。

好ましくは、ＣｐＧオリゴヌクレオチドは、受容体認識のために５’端が近付くことができるように構築されている。所望により、２つのＣｐＧオリゴヌクレオチド配列をそれらの３’端で付着させて、「イムノマー（ｉｍｍｕｎｏｍｅｒ）」を形成してよい。例えば、参考文献４３および４６〜４７を参照されたい。

有用なＣｐＧアジュバントは、ＰｒｏＭｕｎｅ^ＴＭ（Ｃｏｌｅｙ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｇｒｏｕｐ，Ｉｎｃ．）としても公知のＣｐＧ７９０９である。別のものは、ＣｐＧ１８２６である。ＣｐＧ配列を用いる代わりにまたはそれに加えて、ＴｐＧ配列を用いることができ（４８）、これらのオリゴヌクレオチドは、非メチル化ＣｐＧモチーフを含まないことがある。免疫刺激オリゴヌクレオチドは、ピリミジンリッチであってよい。例えば、これは、１より多い連続チミジンヌクレオチド（例えば参考文献４８に開示されるようなＴＴＴＴ）を含んでよく、かつ／またはこれは、＞２５％チミジン（例えば＞３５％、＞４０％、＞５０％、＞６０％、＞８０％など）を有するヌクレオチド組成を有してよい。例えば、これは、１より多い連続シトシンヌクレオチド（例えば参考文献４８に開示されるようなＣＣＣＣ）を含んでよく、かつ／またはこれは、＞２５％シトシン（例えば＞３５％、＞４０％、＞５０％、＞６０％、＞８０％など）を有するヌクレオチド組成を有してよい。これらのオリゴヌクレオチドは、非メチル化ＣｐＧモチーフを含まないことがある。免疫刺激オリゴヌクレオチドは、典型的には、少なくとも２０ヌクレオチドを含む。これらは、１００未満のヌクレオチドを含んでよい。

免疫刺激オリゴヌクレオチドに基づく特に有用なアジュバントは、ＩＣ−３１^ＴＭとして公知である（４９）。よって、本発明で用いられるアジュバントは、（ｉ）少なくとも１つ（好ましくは複数）のＣｐＩモチーフ（すなわち、イノシンと連結されてジヌクレオチドを形成するシトシン）を含むオリゴヌクレオチド（例えば１５〜４０のヌクレオチド）と、（ｉｉ）少なくとも１つ（好ましくは複数）のＬｙｓ−Ａｒｇ−Ｌｙｓトリペプチド配列を含むオリゴペプチド（例えば５〜２０のアミノ酸）のようなポリカチオンポリマーとの混合物を含んでよい。オリゴヌクレオチドは、２６マーの配列５’−（ＩＣ）_１３−３’（配列番号５１）を含むデオキシヌクレオチドであってよい。ポリカチオンポリマーは、１１マーのアミノ酸配列ＫＬＫＬＬＬＬＬＫＬＫ（配列番号５２）を含むペプチドであってよい。

細菌ＡＤＰリボシル化毒素およびその解毒化誘導体は、本発明においてアジュバントとして用いてよい。好ましくは、タンパク質は、Ｅ．ｃｏｌｉ（Ｅ．ｃｏｌｉ熱不安定性エンテロトキシン「ＬＴ」）、コレラ（「ＣＴ」）または百日咳（「ＰＴ」）に由来する。解毒化ＡＤＰリボシル化毒素を粘膜アジュバントとして用いることは、参考文献５０に記載され、非経口アジュバントとして用いることは、参考文献５１に記載されている。毒素またはトキソイドは、好ましくは、ＡおよびＢのサブユニットをともに含むホロ毒素の形態にある。好ましくは、Ａサブユニットは解毒化変異を含有し、好ましくは、Ｂサブユニットは変異されていない。好ましくは、アジュバントは、ＬＴ−Ｋ６３、ＬＴ−Ｒ７２およびＬＴ−Ｇ１９２のような解毒化ＬＴ変異体である。アジュバントとしてＡＤＰリボシル化毒素およびその解毒化誘導体、特にＬＴ−Ｋ６３およびＬＴ−Ｒ７２を用いることは、参考文献５２〜５３で見出すことができる。有用なＣＴ変異体は、ＣＴ−Ｅ２９Ｈである（５４）。アミノ酸置換についての数字の参照は、好ましくは、参考文献５５（単に、そこでのアラインメントおよびアミノ酸のナンバリングの目的のために、その全体が参照により本明細書に具体的に組み込まれている）に示されるＡＤＰリボシル化毒素のＡおよびＢサブユニットのアラインメントに基づく。

（Ｆ．ヒト免疫調節物質）
本発明においてアジュバントとして用いるために適切なヒト免疫調節物質は、インターロイキン（例えばＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１２（５６）など）（５７）、インターフェロン（例えばインターフェロン−γ）、マクロファージコロニー刺激因子、および腫瘍壊死因子のようなサイトカインを含む。好ましい免疫調節物質は、ＩＬ−１２である。

（Ｇ．生体付着性物質（ｂｉｏａｄｈｅｓｉｖｅ）および粘膜付着性物質（ｍｕｃｏａｄｈｅｓｉｖｅ））
生体付着性物質および粘膜付着性物質も、本発明においてアジュバントとして用いてよい。適切な生体付着性物質は、エステル化ヒアルロン酸マイクロスフェア（５８）、またはポリ（アクリル酸）、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、多糖類およびカルボキシメチルセルロースの架橋誘導体のような粘膜付着性物質を含む。キトサンおよびその誘導体も、本発明においてアジュバントとして用いてよい（５９）。

（Ｈ．微小粒子）
微小粒子も、本発明においてアジュバントとして用いてよい。ポリ（ラクチド−ｃｏ−グリコリド）に加えて、生分解性で非毒性の物質（例えばポリ（α−ヒドロキシ酸）、ポリヒドロキシ酪酸、ポリオルトエステル、ポリ無水物、ポリカプロラクトンなど）から形成された微小粒子（すなわち直径約１００ｎｍ〜約１５０μｍ、より好ましくは直径約２００ｎｍ〜約３０μｍ、最も好ましくは直径約５００ｎｍ〜約１０μｍの粒子）が好ましく、これらは、所望により、負に荷電された表面（例えばＳＤＳで）または正に荷電された表面（例えばＣＴＡＢのようなカチオン洗浄剤で）を有するように処理される。

（Ｉ．リポソーム（参考文献５の第１３および１４章））
アジュバントとして用いるために適切なリポソーム処方物の例は、参考文献６０〜６１に記載されている。

（Ｊ．ポリオキシエチレンエーテル処方物およびポリオキシエチレンエステル処方物）
本発明で用いるために適切なアジュバントは、ポリオキシエチレンエーテルおよびポリオキシエチレンエステルを含む（６２）。このような処方物は、さらに、オクトキシノールと組み合わせたポリオキシエチレンソルビタンエステル界面活性剤（６３）、およびオクトキシノールのような少なくとも１つの追加の非イオン界面活性剤と組み合わせたポリオキシエチレンアルキルエーテルまたはエステル界面活性剤（６４）を含む。好ましいポリオキシエチレンエーテルは、以下の群から選択される：ポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテル（ラウレス９）、ポリオキシエチレン−９−ステアリル（ｓｔｅｏｒｙｌ）エーテル、ポリオキシエチレン（ｐｏｌｙｏｘｙｔｈｅｙｌｅｎｅ）−８−ステアリルエーテル、ポリオキシエチレン−４−ラウリルエーテル、ポリオキシエチレン−３５−ラウリルエーテル、およびポリオキシエチレン−２３−ラウリルエーテル。

（Ｋ．ホスファゼン）
例えば参考文献６５および６６に記載されるようなポリ［ジ（カルボキシラトフェノキシ）ホスファゼン］（「ＰＣＰＰ」）のようなホスファゼンを用いてよい。

（Ｌ．ムラミルペプチド）
本発明においてアジュバントとして用いるために適切なムラミルペプチドの例は、Ｎ−アセチル−ムラミル−Ｌ−スレオニル−Ｄ−イソグルタミン（ｔｈｒ−ＭＤＰ）、Ｎ−アセチル−ノルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミン（ｎｏｒ−ＭＤＰ）、およびＮ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニル−Ｌ−アラニン−２−（１’−２’−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ）−エチルアミン（ＭＴＰ−ＰＥ）を含む。

（Ｍ．イミダゾキノロン化合物）
本発明においてアジュバントとして用いるために適切なイミダゾキノロン化合物の例は、イミキモッド（「Ｒ−８３７」）（６７、６８）、レシキモド（Ｒｅｓｉｑｕｉｍｏｄ）（「Ｒ−８４８」）（６９）およびそれらの類似体、ならびにそれらの塩（例えば塩酸塩）を含む。免疫刺激イミダゾキノリンについてのさらなる詳細は、参考文献７０〜７１で見出すことができる。

（Ｎ．置換尿素）
アジュバントとして有用な置換尿素は、参考文献１７２に定義されるような式Ｉ、ＩＩもしくはＩＩＩの化合物、またはそれらの塩：

例えば「ＥＲ８０３０５８」、「ＥＲ８０３７３２」、「ＥＲ８０４０５３」、「ＥＲ８０４０５８」、「ＥＲ８０４０５９」、「ＥＲ８０４４４２」、「ＥＲ８０４６８０」、「ＥＲ８０４７６４」、「ＥＲ８０３０２２」または「ＥＲ８０４０５７」、例えば：

を含む。

（Ｏ．さらなるアジュバント）
本発明で用い得るさらなるアジュバントは、以下のものを含む。

・ＲＣ−５２９のようなアミノアルキルグルコサミニドリン酸塩誘導体（７３、７４）。

参考文献７５に開示されているもののようなチオセミカルバゾン化合物。活性化合物についての処方、製造およびスクリーニングの方法も、参考文献７５に記載される。チオセミカルバゾンは、ＴＮＦ−αのようなサイトカインの生成のためのヒト末梢血単核細胞の刺激において特に有効である。

参考文献７６に開示されているもののようなトリプタントリン化合物。活性化合物についての処方、製造およびスクリーニングの方法も、参考文献７６に記載される。チオセミカルバゾンは、ＴＮＦ−αのようなサイトカインの生成のためのヒト末梢血単核細胞の刺激において特に有効である。

・（ａ）イサトラビン（Ｉｓａｔｏｒａｂｉｎｅ）（ＡＮＡ−２４５；７−チア−８−オキソグアノシン）：

およびそのプロドラッグ；（ｂ）ＡＮＡ９７５；（ｃ）ＡＮＡ−０２５−１；（ｄ）ＡＮＡ３８０；（ｅ）参考文献７７〜７８に開示されている化合物ロキソリビン（Ｌｏｘｏｒｉｂｉｎｅ）（７−アリル−８−オキソグアノシン）（７９）のようなヌクレオシド類似体。

・アシルピペラジン化合物、インドールジオン化合物、テトラヒドロイソキノリン（Ｔｅｔｒａｈｙｄｒａｉｓｏｑｕｉｎｏｌｉｎｅ）（ＴＨＩＱ）化合物、ベンゾシクロジオン化合物、アミノアザビニル化合物、アミノベンズイミダゾールキノリノン（ＡＢＩＱ）化合物（８１、８２）、ヒドラフタラミド（Ｈｙｄｒａｐｔｈａｌａｍｉｄｅ）化合物、ベンゾフェノン化合物、イソキサゾール化合物、ステロール化合物、キナジリノン（Ｑｕｉｎａｚｉｌｉｎｏｎｅ）化合物、ピロール化合物（８３）、アントラキノン化合物、キノキサリン化合物、トリアジン化合物、ピラザロピリミジン（Ｐｙｒａｚａｌｏｐｙｒｉｍｉｄｉｎｅ）化合物およびベンザゾール化合物（８４）を含む、参考文献８０に開示されている化合物。

・ＴＬＲ４アンタゴニストＥ５５６４（８５、８６）のようなリン酸含有非環式骨格に連結された脂質を含有する化合物。

・ポリオキシドニウムポリマー（８７、８８）またはその他のＮ酸化ポリエチレン−ピペラジン誘導体。

・メチルイノシン５’−１リン酸（「ＭＩＭＰ」）（８９）。

・式：

（式中、Ｒは、水素、直鎖もしくは分岐鎖の、非置換もしくは置換の、飽和もしくは不飽和のアシル、アルキル（例えばシクロアルキル）、アルケニル、アルキニルおよびアリール基を含む群から選択される）を有するもののようなポリヒドロキシル化ピロリジジン化合物（９０）、またはその薬学的に許容される塩もしくは誘導体。その例は、それらに限定されないが、カスアリン、カスアリン−６−α−Ｄ−グルコピラノース、３−ｅｐｉ−カスアリン、７−ｅｐｉ−カスアリン、３，７−ジｅｐｉ−カスアリンなどを含む。

・α−グリコシルセラミド（９１〜９２）（例えばα−ガラクトシルセラミド）、フィトスフィンゴシン含有α−グリコシルセラミド、ＯＣＨ、ＫＲＮ７０００（（２Ｓ，３Ｓ，４Ｒ）−１−Ｏ−（α−Ｄ−ガラクトピラノシル）−２−（Ｎ−ヘキサコサノイルアミノ）−１，３，４−オクタデカントリオール）、ＣＲＯＮＹ−１０１、３’’−Ｏ−スルホ−ガラクトシルセラミドなどのようなＣＤ１ｄリガンド。

・アルガムリンのようなガンマイヌリン（９３）またはその誘導体。

（アジュバントの組み合わせ）
本発明は、上記で同定されるアジュバントの１または複数の態様の組み合わせも含んでよい。例えば、以下のアジュバント組成物を、本発明において用いてよい：（１）サポニンと水中油型エマルジョン（９４）；（２）サポニン（例えばＱＳ２１）＋非毒性ＬＰＳ誘導体（例えば３ｄＭＰＬ）（９５）；（３）サポニン（例えばＱＳ２１）＋非毒性ＬＰＳ誘導体（例えば３ｄＭＰＬ）＋コレステロール；（４）サポニン（例えばＱＳ２１）＋３ｄＭＰＬ＋ＩＬ−１２（所望により＋ステロール）（９６）；（５）３ｄＭＰＬと、例えばＱＳ２１および／または水中油型エマルジョンとの組み合わせ（９７）；（６）サブミクロンのエマルジョンになるようにマイクロフルイダイズされたかまたはより大きい粒子サイズのエマルジョンを生じるようにボルテックスされた１０％スクアレン、０．４％ＴＷＥＥＮ８０^ＴＭ、５％ＰＬＵＲＯＮＩＣ（ＴＭ）−ブロックポリマーＬ１２１およびｔｈｒ−ＭＤＰを含有するＳＡＦ、（７）２％スクアレン、０．２％ＴＷＥＥＮ８０（ＴＭ）ならびにモノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）、トレハロースジミコレート（ｔｒｅｈａｌｏｓｅ ｄｉｍｙｃｏｌａｔｅ）（ＴＤＭ）および細胞壁骨格（ＣＷＳ）からなる群由来の１または複数の細菌細胞壁成分、好ましくはＭＰＬ＋ＣＷＳ（Ｄｅｔｏｘ^ＴＭ）を含有するＲｉｂｉ^ＴＭアジュバント系（ＲＡＳ）（Ｒｉｂｉ Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍ）；ならびに（８）１または複数の無機塩（例えばアルミニウム塩）＋ＬＰＳの非毒性誘導体（例えば３ｄＭＰＬ）。

免疫刺激剤として作用するその他の物質は、参考文献５の第７章に開示される。

水酸化アルミニウムおよび／またはリン酸アルミニウムアジュバントの使用は、特に好ましく、抗原は、一般的に、これらの塩に吸着される。リン酸カルシウムは、別の好ましいアジュバントである。その他の好ましいアジュバントの組み合わせは、ＣｐＧおよびミョウバン（ａｌｕｍ）、またはレシキモドおよびミョウバンのようなＴｈ１アジュバントおよびＴｈ２アジュバントの組み合わせを含む。リン酸アルミニウムと３ｄＭＰＬとの組み合わせを用いてよい。

本発明の組成物は、細胞媒介性免疫応答と体液性免疫応答をともに惹起し得る。この免疫応答は、好ましくは、長期持続性（例えば中和）抗体と、免疫化された病原体への曝露に際して迅速に応答できる細胞媒介性免疫とを誘導する。

２つの型のＴ細胞、すなわちＣＤ４およびＣＤ８細胞は、一般的に、細胞媒介性免疫および体液性免疫を開始および／または増進するために必要であると考えられている。ＣＤ８ Ｔ細胞は、ＣＤ８共受容体を発現でき、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）と一般に呼ばれる。ＣＤ８ Ｔ細胞は、ＭＨＣクラスＩ分子上に提示される抗原を認識でき、またはそれと相互作用できる。

ＣＤ４ Ｔ細胞は、ＣＤ４共受容体を発現でき、Ｔヘルパー細胞と一般に呼ばれる。ＣＤ４ Ｔ細胞は、ＭＨＣクラスＩＩ分子と結合した抗原性ペプチドを認識できる。ＭＨＣクラスＩＩ分子との相互作用の際に、ＣＤ４細胞は、サイトカインのような因子を分泌できる。これらの分泌されたサイトカインは、Ｂ細胞、細胞傷害性Ｔ細胞、マクロファージおよび免疫応答に参加するその他の細胞を活性化できる。ヘルパーＴ細胞またはＣＤ４＋細胞は、２つの機能的に異なるサブセット、すなわちそれらのサイトカインおよびエフェクター機能が異なるＴＨ１表現型およびＴＨ２表現型にさらに分けることができる。

活性化ＴＨ１細胞は、細胞性免疫を増進し（抗原特異的ＣＴＬの生成の増加を含む）、よって、細胞内感染に対する応答において特に価値がある。活性化ＴＨ１細胞は、ＩＬ−２、ＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−βの１または複数を分泌し得る。ＴＨ１免疫応答は、マクロファージ、ＮＫ（ナチュラルキラー）細胞およびＣＤ８細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）を活性化することにより局所的炎症反応をもたらし得る。ＴＨ１免疫応答は、ＢおよびＴ細胞の増殖を、ＩＬ−１２を用いて刺激することにより免疫応答を拡大するように作用することもある。ＴＨ１刺激Ｂ細胞は、ＩｇＧ２ａを分泌し得る。

活性化ＴＨ２細胞は、抗体生成を増進し、よって、細胞外感染に対する応答において価値がある。活性化ＴＨ２細胞は、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６およびＩＬ−１０の１または複数を分泌し得る。ＴＨ２免疫応答は、ＩｇＧ１、ＩｇＥ、ＩｇＡおよび将来の防御のためのメモリーＢ細胞の生成をもたらし得る。

免疫応答の増進は、ＴＨ１免疫応答の増進およびＴＨ２免疫応答の増進の１または複数を含み得る。

ＴＨ１免疫応答は、ＣＴＬの増加、ＴＨ１免疫応答と関連するサイトカインの１もしくは複数（例えばＩＬ−２、ＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−β）の増加、活性化マクロファージの増加、ＮＫ活性の増加、またはＩｇＧ２ａの生成の増加の１または複数を含み得る。好ましくは、ＴＨ１免疫応答の増進は、ＩｇＧ２ａ生成の増加を含む。

ＴＨ１免疫応答は、ＴＨ１アジュバントを用いて惹起し得る。ＴＨ１アジュバントは、一般的に、アジュバントなしの抗原での免疫化と比べて、増加したレベルのＩｇＧ２ａ生成を惹起する。本発明で用いるために適切なＴＨ１アジュバントは、例えばサポニン処方物、ビロソームおよびウイルス様粒子、腸内細菌リポ多糖（ＬＰＳ）の非毒性誘導体、免疫刺激オリゴヌクレオチドを含んでよい。ＣｐＧモチーフを含有するオリゴヌクレオチドのような免疫刺激オリゴヌクレオチドは、本発明で用いるために好ましいＴＨ１アジュバントである。

ＴＨ２免疫応答は、ＴＨ２免疫応答と関連するサイトカインの１もしくは複数（例えばＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６およびＩＬ−１０）の増加、またはＩｇＧ１、ＩｇＥ、ＩｇＡおよびメモリーＢ細胞の生成の増加の１または複数を含み得る。好ましくは、ＴＨ２免疫応答の増進は、ＩｇＧ１生成の増加を含む。

ＴＨ２免疫応答は、ＴＨ２アジュバントを用いて惹起し得る。ＴＨ２アジュバントは、一般的に、アジュバントなしの抗原での免疫化と比べて、増加したレベルのＩｇＧ１生成を惹起する。本発明で用いるために適切なＴＨ２アジュバントは、例えば無機質含有組成物、油性エマルジョンならびにＡＤＰリボシル化毒素およびその解毒化誘導体を含む。アルミニウム塩のような無機質含有組成物は、本発明で用いるために好ましいＴＨ２アジュバントである。

好ましくは、本発明は、ＴＨ１アジュバントとＴＨ２アジュバントとの組み合わせを含む組成物を含む。好ましくは、このような組成物は、増進されたＴＨ１応答および増進されたＴＨ２応答を惹起し、すなわちアジュバントなしでの免疫化と比べて、ＩｇＧ１生成およびＩｇＧ２ａ生成の両方の生成の増加を惹起する。さらにより好ましくは、ＴＨ１アジュバントとＴＨ２アジュバントとの組み合わせを含む組成物は、単一アジュバントを用いる免疫化と比べて（すなわち、ＴＨ１アジュバントのみでの免疫化またはＴＨ２アジュバントのみでの免疫化と比べて）、ＴＨ１免疫応答の増加および／またはＴＨ２免疫応答の増加を惹起する。

免疫応答は、ＴＨ１免疫応答およびＴＨ２応答の一方または両方であってよい。好ましくは、免疫応答は、ＴＨ１応答の増進およびＴＨ２応答の増進の一方または両方をもたらす。

免疫応答の増進は、全身免疫応答および粘膜免疫応答の一方または両方であり得る。好ましくは、免疫応答は、全身免疫応答の増進および粘膜免疫応答の増進の一方または両方をもたらす。好ましくは、粘膜免疫応答は、ＴＨ２免疫応答である。好ましくは、粘膜免疫応答は、ＩｇＡの生成の増加を含む。

医薬組成物
本発明の一態様は、（ａ）本明細書で開示する多糖結合体と、（ｂ）薬学的に許容されるキャリアと、場合によって（ｃ）先行する項で記載するようなアジュバントとを含む医薬組成物を含む。

本発明の組成物は、種々の形態で調製してよい。例えば、組成物は、液体溶液または懸濁物のいずれかとしての注射剤（ｉｎｊｅｃｔａｂｌｅ）として調製してよい。注射前に液体ビヒクルに溶解または懸濁するために適切な固体の形態も調製できる（例えば凍結乾燥組成物または噴霧凍結乾燥組成物）。組成物は、表面投与（ｔｏｐｉｃａｌ ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）用に、例えば軟膏剤、クリームまたは散剤として調製してよい。組成物は、経口投与用に、例えば錠剤もしくはカプセル剤として、噴霧剤として、またはシロップ剤（所望により矯味矯臭して）として調製してよい。組成物は、肺投与用に、例えば微細粉末または噴霧剤を用いる吸入器として調製してよい。組成物は、坐剤または膣坐剤として調製してよい。組成物は、鼻、耳または眼の投与用に、例えば滴剤として調製してよい。組成物は、組み合わせ組成物が、患者への投与の直前に再構成されるように設計されたキットの形態であってよい。このようなキットは、液体の形態の１または複数の抗原と、凍結乾燥された１または複数の抗原とを含んでよい。

組成物が使用前に即席で調製され（例えば成分が凍結乾燥された形態である場合）、かつキットとして提示される場合、キットは２つのバイアルを含んでも、１つの充填済み（ｒｅａｄｙ−ｆｉｌｌｅｄ）シリンジと１つのバイアルとを含んでもよく、シリンジの内容物は、注射前にバイアルの内容物を再活性化するために用いられる。

ワクチンとして用いられる免疫原性組成物は、免疫学的有効量の抗原（複数可）（例えば、多糖および／またはキャリアタンパク質）と、必要に応じて任意のその他の成分とを含む。「免疫学的有効量」により、単回用量または一連のものの一部のいずれかとしてその量を個体に投与することが、処置または予防のために有効であることを意味する。この量は、処置される個体の健康および身体の状態、年齢、処置される個体の分類群（例えば非ヒト霊長類、霊長類など）、抗体を合成する個体の免疫系の能力、所望される防御の程度、ワクチンの処方、医学的状態についての処置医師の評価、およびその他の関連する要因に依存して変動する。この量は、日常的な試験により決定できる比較的広い範囲内にあると予測される。

（処置方法およびワクチンの投与）
本発明は、本発明の組成物の有効量を投与するステップを含む、哺乳動物における免疫応答を高めるための方法も提供する。免疫応答は、好ましくは防御的であり、好ましくは、抗体および／または細胞媒介性免疫を伴う。方法は、追加免疫応答（ｂｏｏｓｔｅｒ ｒｅｓｐｏｎｓｅ）を高め得る。

本発明は、例えば哺乳動物における免疫応答を高めることにおいて用いるための医薬品として使用するための本発明のポリペプチドも提供する。

本発明は、哺乳動物における免疫応答を高めるための医薬品の製造における、本発明のポリペプチドの使用も提供する。

本発明は、本発明の免疫原性組成物が予め充填された送達デバイスも提供する。

グルカン（および特にβ−グルカン）は、ほぼ全ての病原性真菌、特に免疫無防備状態の被験体での感染に関与するもの、ならびに細菌病原体および原生生物の必須のおよび主な多糖構成成分であるので、抗グルカン免疫は、広い範囲の病原体および疾患に対して効力を有し得る。例えば、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅでの免疫化の後に産生される抗グルカン血清は、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓと交差反応性である。広いスペクトルの免疫は、特に有用である。なぜなら、これらのヒト感染性の真菌病原因子（ｆｕｎｇａｌ ａｇｅｎｔ）について、化学療法は不十分であり、抗真菌薬耐性が出現し、予防的ワクチンおよび治療的ワクチンに対する必要性が、ますます認識されているからである。

よって、本明細書で開示する多糖結合体の多糖免疫原がグルカンである場合、本明細書で開示するグルカン多糖結合体の使用および方法は、特に、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓのようなＣａｎｄｉｄａの種；Ｃ．ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓのようなＣｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓの種；Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓのようなＥｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓの種；Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｓ．ｍｕｔａｎｓ、Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅおよびＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓのようなＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓの種；Ｌ．ｍａｊｏｒのようなＬｅｉｓｈｍａｎｉａの種；Ａ．ｃａｓｔｅｌｌａｎｉのようなＡｃａｎｔｈａｍｏｅｂａの種；Ａ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓおよびＡ．ｆｌａｖｕｓのようなＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓの種；Ｐ．ｃａｒｉｎｉｉのようなＰｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓの種；Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓのようなＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍの種；Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａのようなＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓの種；Ｓ．ａｕｒｅｕｓのようなＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓの種；Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍのようなＳａｌｍｏｎｅｌｌａの種；Ｃ．ｉｍｍｉｔｉｓのようなＣｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓの種；Ｔ．ｖｅｒｒｕｃｏｓｕｍのようなＴｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎの種；Ｂ．ｄｅｒｍａｔｉｄｉｓのようなＢｌａｓｔｏｍｙｃｅｓの種；Ｈ．ｃａｐｓｕｌａｔｕｍのようなＨｉｓｔｏｐｌａｓｍａの種；Ｐ．ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓのようなＰａｒａｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓの種；Ｐ．ｉｎｓｉｄｉｏｓｕｍのようなＰｙｔｈｉｕｍの種；ならびにＥ．ｃｏｌｉのようなＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａの種の感染に対する処置／防御のために有用である。

使用および方法は、特に、それらに限定されないが、カンジダ症（肝脾カンジダ症（ｈｅｐａｔｏｓｐｌｅｎｉｃ ｃａｎｄｉｄｉａｓｉｓ）、侵襲性カンジダ症、慢性粘膜皮膚カンジダ症および播種性カンジダ症（ｄｉｓｓｅｍｉｎａｔｅｄ ｃａｎｄｉｄｉａｓｉｓ）を含む）；カンジダ血症；アスペルギルス症、クリプトコッカス症、皮膚真菌症、スポロトリコーシス（ｓｐｏｒｏｔｈｒｙｃｈｏｓｉｓ）およびその他の皮下真菌症、ブラストミセス症、ヒストプラスマ症、コクシジウム症、パラコクシジウム症、ニューモシスティス症、鵞口瘡、結核、ミコバクテリア症、呼吸器感染症、猩紅熱、肺炎、膿痂疹、リウマチ熱、敗血症（ｓｅｐｓｉｓ）、敗血症（ｓｅｐｔｉｃａｅｍｉａ）、皮膚および内臓リーシュマニア症、角膜アカントアメーバ症、嚢胞性線維症、腸チフス、胃腸炎ならびに溶血性尿毒症症候群を含む疾患の予防／処置のために有用である。抗Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ活性は、ＡＩＤＳ患者での感染を処置するために特に有用である。

免疫化の効力は、組成物の投与後のβ−グルカンに対する免疫応答（例えば抗β−グルカン抗体）をモニタリングすることにより試験できる。治療的処置の効力は、本発明の組成物の投与後の微生物感染をモニタリングすることにより試験できる。

これらの使用および方法により哺乳動物において免疫応答を産生させることにより、哺乳動物を、多糖免疫原が由来する（または模倣する）病原体による感染に対して、ならびにＥｘＰＥＣおよび非ＥｘＰＥＣ株を含むＥ．ｃｏｌｉキャリアタンパク質によるＥ．ｃｏｌｉ感染から防御できる。本発明は、ＥＰＥＣ、ＥＡＥＣ、ＥＩＥＣ、ＥＴＥＣおよびＤＡＥＣ病原型のような腸内病原型を含む病原性Ｅ．ｃｏｌｉに対する広い防御を提供するために特に有用である。よって、哺乳動物を、それらに限定されないが、腹膜炎、腎盂腎炎、膀胱炎、心内膜炎、前立腺炎、尿路感染症（ＵＴＩ）、髄膜炎（特に新生児髄膜炎）、敗血症（またはＳＩＲＳ）、脱水症、肺炎、下痢（乳児、旅行者、急性、持続性など）、細菌性赤痢、溶血性尿毒素症症候群（ＨＵＳ）、心膜炎、細菌尿などを含む疾患に対して防御できる。

哺乳動物は、好ましくはヒトであるが、例えばウシ、ブタ、ネコまたはイヌであってよい。なぜなら、Ｅ．ｃｏｌｉ疾患は、これらの種でも問題であるからである。本明細書は哺乳動物および哺乳類被験体に言及するが、本明細書で開示する多糖結合体は、ニワトリおよびアヒルのような鳥類の種についても有用であり、よって、本明細書において哺乳動物または哺乳類と記載する場合は必ず、鳥類も含むことができる。ワクチンが予防用である場合、ヒトは、好ましくは小児（例えば、よちよち歩きの幼児（ｔｏｄｄｌｅｒ）または乳児）または１０代の若者である。ワクチンが治療用である場合、ヒトは、好ましくは１０代の若者または成人である。小児用を意図するワクチンは、例えば安全性、投与量、免疫原性などを評価するために成人に投与してもよい。

治療的処置の効力を確認するある方法は、本発明の組成物の投与後のＥ．ｃｏｌｉ感染をモニタリングすることを含む。予防処置の効力を確認するある方法は、本発明の組成物中の抗原に対する全身（例えばＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａ生成のレベルをモニタリングする）および／または粘膜（例えばＩｇＡ生成のレベルをモニタリングする）の免疫応答を、組成物の投与後にモニタリングすることを含む。典型的には、抗原特異的血清抗体応答は、免疫化後であるが抗原投与前に決定され、一方、抗原特異的粘膜抗体応答は、免疫化後であり、かつ抗原投与後に決定される。

本発明の組成物の免疫原性を評価する別の方法は、患者血清もしくは粘膜分泌物をイムノブロットおよび／またはマイクロアレイによりスクリーニングするためにタンパク質を組換え発現させることである。タンパク質と患者試料との間の陽性の反応は、患者が問題のタンパク質に対する免疫応答を確立した（ｍｏｕｎｔ）ことを示す。この方法は、免疫優性抗原および／または抗原内のエピトープを同定するために用いてもよい。

ワクチン組成物の効力は、Ｅ．ｃｏｌｉ感染の動物モデル、例えばモルモットまたはマウスを、ワクチン組成物を用いて抗原投与することによりｉｎ ｖｉｖｏで決定することもできる。ＥｘＰＥＣおよび致死的敗血症のマウスモデルは、参考文献９８に記載されている。コットンラットモデルは、参考文献９９に開示されている。

本発明の組成物は、一般的に、患者に直接投与される。直接送達は、非経口注射（例えば皮下、腹腔内、静脈内、筋肉内または組織の間質腔へ）、または直腸、経口（例えば錠剤、噴霧剤）、膣、表面、経皮（ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌ）もしくは経皮（ｔｒａｎｓｃｕｔａｎｅｏｕｓ）、鼻内、眼、耳、肺もしくはその他の粘膜投与のような粘膜投与により達成してよい。新規な直接送達形態は、本明細書で開示するポリペプチドを食物においてトランスジェニック発現させること、例えばジャガイモにおいてトランスジェニック発現させることも含むことができる。

本発明は、全身および／または粘膜免疫を惹起するため、好ましくは増進された全身および／または粘膜免疫を惹起するために用いてよい。

好ましくは、全身および／または粘膜免疫の増進は、ＴＨ１および／またはＴＨ２免疫応答の増進に反映される。好ましくは、免疫応答の増進は、ＩｇＧ１および／またはＩｇＧ２ａおよび／またはＩｇＡの生成の増加を含む。

投薬は、単回用量計画または複数回用量計画によるものであり得る。複数回用量は、一次免疫化計画および／または追加免疫化計画で用い得る。複数回用量計画において、種々の用量を、同じまたは異なる経路により与えてよく、例えば非経口による一次免疫（ｐｒｉｍｅ）と粘膜による追加免疫（ｂｏｏｓｔ）、粘膜による一次免疫と非経口による追加免疫などである。複数回用量は、典型的には、少なくとも１週間隔てて投与される（例えば約２週間、約３週間、約４週間、約６週間、約８週間、約１０週間、約１２週間、約１６週間など）。

本発明のワクチンは、小児および成人の両方を処置するために用いてよい。よって、ヒト患者は、１歳未満、１〜５歳、５〜１５歳、１５〜５５歳または少なくとも５５歳であってよい。ワクチンを受ける好ましい患者は、高齢者（例えば≧５０歳、≧６０歳、好ましくは≧６５歳）、年少者（例えば≦５歳）、入院患者、医療従事者、軍隊および軍の職員（ｍｉｌｉｔａｒｙ ｐｅｒｓｏｎｎｅｌ）、妊娠している女性、慢性の病人または免疫不全患者である。しかし、ワクチンは、これらの群にのみ適するのではなく、集団においてより一般的に用いられることがある。

本発明のワクチンは、外科手術が予定されている患者、またはその他の入院患者のために特に有用である。これらは、カテーテル処置される患者においても有用である。これらは、青年期の女性（例えば１１歳〜１８歳）および慢性尿路感染症の患者においても有用である。

本発明のワクチンは、その他のワクチン（例えば、麻疹ワクチン、流行性耳下腺炎ワクチン、風疹ワクチン、ＭＭＲワクチン、水痘ワクチン、ＭＭＲＶワクチン、ジフテリアワクチン、破傷風ワクチン、百日咳ワクチン、ＤＴＰワクチン、結合体型Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ ｂ型ワクチン、不活化ポリオウイルスワクチン、Ｂ型肝炎ウイルスワクチン、髄膜炎菌結合体ワクチン（例えば４価Ａ−Ｃ−Ｗ１３５−Ｙワクチン）、ＲＳウイルスワクチンなどと実質的に同時に）と実質的に同時に（例えば医療専門家またはワクチン接種センターへの同じ医療相談または訪問中に）患者に投与してよい。

（全般）
本発明の実施は、そうでないと記載しない限り、当該分野の技術の範囲内である化学、生化学、分子生物学、免疫学および薬理学の従来の方法を用いる。このような技術は、文献に詳細に説明されている。例えば参考文献１００〜１０１などを参照されたい。

用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」および「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ）」を包含し、例えばＸを「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」組成物は、Ｘのみからなり得るか、または何か追加のもの、例えばＸ＋Ｙを含み得る。

数値ｘに関する「約」との用語は、例えばｘ±１０％を意味する。

「ＧＩ」ナンバリングを本明細書で用いている。ＧＩ番号または「ＧｅｎＩｎｆｏ識別子」は、そのデータベースに配列が加えられた場合に、ＮＣＢＩにより処理されるそれぞれの記録された配列に連続的に割り当てられる一連の数字である。ＧＩ番号は、配列の記録のアクセッション番号に対して類似性はない。配列がアップデートされたとき（例えば修正のため、またはさらなる注釈もしくは情報を加えるため）に、新しいＧＩ番号が与えられる。よって、与えられたＧＩ番号に付随する配列は、決して変更されない。

２つのアミノ酸配列間のパーセンテージ配列同一性についての言及は、アラインメントさせたときに、そのパーセンテージのアミノ酸が、２つの配列の比較において同じであることを意味する。このアラインメントおよびパーセント相同性または配列同一性は、当該技術分野において公知のソフトウェアプログラム、例えば参考文献１０２の７．７．１８節に記載されるものを用いて決定できる。好ましいアラインメントは、１２のギャップ開始ペナルティおよび２のギャップ伸長ペナルティ、６２のＢＬＯＳＵＭマトリックスでのアフィンギャップ検索を用いるＳｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ相同性検索アルゴリズムにより決定される。Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ相同性検索アルゴリズムは、参考文献１０３に開示されている。

当業者は、「単離された」が、その天然の状態から「人の手により」変更された、すなわち、それが天然に存在する場合、それは、その元来の環境から変化されたかもしくは取り出されたかまたはその両方であることを意味することを理解する。この用語を本開示で用いる場合、例えば、生存する生物中に天然に存在するポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、そのような生存する生物中にある場合に「単離」されていないが、その天然の状態の共存する物質から分離された同じポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、「単離」されている。さらに、生物に形質転換、遺伝子操作または任意のその他の組換え方法により導入されたポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、そのような形質転換、遺伝子操作またはその他の組換え方法が、それ以外は天然に存在する生物と区別できない生物を生成する場合を除いて、それが上記の生物（生存していても生存していなくてもよい）内にまだ存在していても、「単離された」と理解される。

図１（Ａ）は、以下のもののＳＤＳ−Ｐａｇｅ（４〜１２％勾配）を示し（左から右に）：（１）結合体化前のｏｒｆ４０５Ｂ、（２）結合体化後のｏｒｆ４０５Ｂ、（３）結合体化前のｕｐｅｃ−５２１１および（４）結合体化後のｕｐｅｃ−５２１１、（Ｂ）は、以下のもののＳＤＳ−Ｐａｇｅ（４〜１２％勾配）を示す（左から右に）：分子量マーカー、（１）結合体化前のｕｐｅｃ−５２１１、（２）結合体化後のｕｐｅｃ−５２１１、（３）結合体化前のｏｒｆ３５２６、（４）結合体化後のｏｒｆ３５２６、（５）結合体化前のｏｒｆ１３６４および（６）結合体化後のｏｒｆ１３６４。 図２は、１回目のキャリアタンパク質免疫化研究の結果を示す。ｙ軸は、ＥＬＳＡにより測定した、免疫化後の抗ラミナリンＩｇＧ誘導を示す。ｘ軸は、以下の結合体についてのＥＬＩＳＡの結果を示す（左から右に）：ＣＲＭ_１９７に結合体化したラミナリン、ｏｒｆ４０５Ｂに結合体化したラミナリン、およびｕｐｅｃ−５２１１に結合体化したラミナリン。 図３は、２回目のキャリアタンパク質免疫化研究の結果を示す。ｙ軸は、ＥＬＳＡにより測定した、免疫化後の抗ラミナリンＩｇＧ誘導を示す。ｘ軸は、以下の結合体についてのＥＬＩＳＡの結果を示す（左から右に）：ＣＲＭ_１９７に結合体化したラミナリン、ｏｒｆ３５２６に結合体化したラミナリン、およびｏｒｆ１３６４に結合体化したラミナリン。

配列表の簡単な説明

実施例
結合体化プロセス
腸外病原性Ｅ．ｃｏｌｉの異なる株からの５つの異なる組換えタンパク質を、多糖免疫原（ラミナリンを例示的多糖免疫原として用いる）のためのキャリアタンパク質として作用するそれらの能力について比較した：ｏｒｆ３６１３（配列番号４６）、ｕｐｅｃ−５２１１（配列番号４８）、ｏｒｆ３５２６（配列番号５０）、ｏｒｆ１３６４（配列番号４４）およびｏｒｆ４０５Ｂ（配列番号４２）。ｏｒｆ３６１３の結合体は不溶性であることが明らかになったので、これはさらに試験しなかった。ラミナリンとの結合体化の後に、４つの残りの結合体のそれぞれを、ＣＲＭ_１９７が多糖免疫原のためのキャリアタンパク質としてのその使用においてよく特徴決定されていることに鑑みて、ラミナリン−ＣＲＭ_１９７結合体と比較した。

これらの結合体を、それぞれのタンパク質および活性化ラミナリンの適切な溶液から出発して調製し、Ｔｏｒｏｓａｎｔｕｃｃｉら（２００５年）Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ．２０２巻（５号）：５９７〜６０６頁に開示される方法により調製した。簡単に言うと、結合体化の前に、糖を、アジピン酸のＮ−ヒドロキシスクシンイミドジエステルを用いて活性化した。次いで、ｕｐｅｃ−５２１１およびｏｒｆ４０５Ｂについての結合体化反応を、５０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、６ＭグアニジンＨＣｌ中でｐＨ７．６にて、３０のタンパク質に対する多糖エステル基のモル比および１．２〜１．４ｍｇ／ｍｌのタンパク質濃度を用いて行った。これらの結合体化反応の結果を、図１（Ａ）に示すように、勾配ＳＤＳ−Ｐａｇｅ（４〜１２％）上で泳動した（ｒｕｎ）。

結合体化反応の別のセットでは、ｕｐｅｃ−５２１１（再度）、ｏｒｆ３５２６およびｏｒｆ１３６４についての結合体化反応を、ＰＢＳ中で、３０のタンパク質に対する多糖エステル基のモル比および５ｍｇ／ｍｌのタンパク質濃度を用いて行った。

５つの反応のそれぞれにおける反応混合物を室温にて混合し、１晩放置した。

得られた結合体は、タンパク質精製のための周知の分離方法である（例えば参考文献１および２を参照されたい）固定化金属イオン親和性クロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）により精製した。精製は、減圧供給源（ｖａｃｕｕｍ ｓｏｕｒｃｅ）を用いながら、ヒスチジンタグ付加タンパク質の小規模精製のためのプレパック９６ウェルフィルタプレートであるＨＩＳ ＭＵＬＴＩＴＲＡＰ ＨＰ（商標）プレート（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて行った。

プレートは、イミノ二酢酸基が共有結合的に結合体化する高度に架橋されたアガロースの３４μｍビーズからなるＩＭＡＣマトリックスＮＩ ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ ＨＩＧＨ ＰＥＲＦＯＲＭＡＮＣＥ（商標）（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で事前に充填されていた（ｐｒｅ−ｐａｃｋｅｄ）。イミノ二酢酸基にＮｉ^２＋を負荷し、露出したヒスチジン基を有するキャリアタンパク質に対する親和性を有する基を結合体中に提供した。上記のように溶液中で調製した結合体は、ＩＭＡＣマトリックスと結合した。ＩＭＡＣマトリックスを、次いで、洗浄して、遊離の糖を除去した。洗浄の後に、精製結合体を最終的に溶出した。

精製：
１．ＨＩＳ ＭＵＬＴＩＴＲＡＰ ＨＰ（商標）プレートのマトリックスを、０．５ｍｌの蒸留水で洗浄し、次いで、６ＭグアニジンＨＣｌ、２０ｍＭ ＮａＰＯ_４、ｐＨ７．６からなる０．５ｍｌの結合緩衝液で２回平衡化した。

２．結合体（２５０μｇ／ウェルのタンパク質のために約２００μｌ／ウェル）をプレート上に載せ、プレートを揺動プラットフォーム上に１時間、室温にて放置して、ｈｉｓタグ付加タンパク質をＩＭＡＣマトリックスに結合させた。プレートを、次いで、０．５ｍｌの結合緩衝液で２回洗浄して、遊離の糖を結合した結合体から除去した。

３．結合体を、マトリックスに０．２ｍｌの溶出緩衝液６ＭグアニジンＨＣｌ、２０ｍＭ ＮａＰＯ_４、５００ｍＭ ＮａＣｌ、５００ｍＭイミダゾール、ｐＨ７．６を加えることにより回収した。プレートを１０分間インキュベートし、結合体を含有する溶出液を集めた。この溶出手順を１回反復した。２つの溶出画分を併せ、１０ｍＭ ＮａＰＯ_４ ｐＨ７．２または１０ｍＭ ＮａＰＯ_４、１００ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ７．２またはＰＢＳに対して、ｓｐｅｃｔｒａ Ｐｏｒメンブレン、６〜８ｋＤａカットオフを用いて透析した。

本発明の精製結合体を、ＳＤＳ−Ｐａｇｅ ４〜１２％により特徴決定し（図１（Ａ）および１（Ｂ）を参照されたい）、ＭｉｃｒｏＢＣＡによりタンパク質の量を定量し、ＨＰＡＥＣ−ＰＡＤにより糖の量を定量した。表１に、ＭｉｃｒｏＢＣＡおよびＨＰＡＥＣ−ＰＡＤにより決定された結合体化効率をまとめる。

キャリアタンパク質免疫化研究−ラミナリン結合体中のキャリアとして試験したＥ．ｃｏｌｉタンパク質
４〜６週齢のＢａｌｂ／ｃマウスを、第０日、第１４日および第２８日に、５μｇ用量の多糖免疫原を１５０μｌの注射容積で皮下注射することにより免疫した。マウスを、第０日、第２７日および第４２日に放血させた。

免疫化は、１回目の免疫化研究について６匹のマウスの群で、および２回目の免疫化研究について８匹のマウスの群で行った。

１回目の免疫化研究では、マウスに、ｕｐｅｃ−５２１１（上記の最初のプロトコールにより調製）、ｏｒｆ４０５Ｂおよび（強力な陽性対照として）ＣＲＭ_１９７に結合体化したラミナリンを注射した。

結果は、キャリアタンパク質としてのｕｐｅｃ−５２１１が、多糖部分に対して適当な抗体応答を誘導した（ＣＲＭ_１９７により誘導される応答のおよそ３分の２）が、一方で、キャリアタンパク質としてのｏｒｆ４０５Ｂは、多糖部分に対して抗体応答を誘導しなかったことを示す（図２を参照されたい）。

２回目の免疫化研究では、マウスに、ｏｒｆ３５２６、ｏｒｆ１３６４および（強力な陽性対照として）ＣＲＭ_１９７に結合体化したラミナリンを注射した。

結果は、キャリアタンパク質としてのｏｒｆ３５２６が、多糖部分に対して強い抗体応答を誘導した（ＣＲＭ_１９７のものと同等またはわずかにそれより大きい）が、一方で、ｏｒｆ１３６４は、より低いが依然として適当な応答を誘導した（ＣＲＭ_１９７により誘導される応答のおよそ３分の１）ことを示す（図３を参照されたい）。

キャリアタンパク質がそれ自体に対する防御免疫を誘導する能力と、多糖結合体に対する抗体応答を誘導する能力が関連しないことは、特に注目に値する。表２は、マウスに接種するために同じタンパク質の同様の断片（またはｕｐｅｃ−５２１１、ｏｒｆ１３６４およびｏｒｆ４０５Ｂの場合は、全く同じ配列）を用いた以前の実験が、敗血症モデルにおいて非常に異なる応答を示したことをまとめる。ｕｐｅｃ−５２１１、ｏｒｆ１３６４およびｏｒｆ４０５Ｂはそれぞれ、比較的同様の免疫応答を提供したが、それぞれは、結合体化多糖に対する免疫応答の誘導の程度がかなり異なる。

免疫原性−ｏｒｆ３５２６Ａ、ｏｒｆ３５２６Ｂおよびｏｒｆ３５２６Ｃ
上記のアラインメントにおいて記載した３つの好ましい断片が、全長ＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）と実質的に同じ免疫原性を有することを確認するために、配列番号３９の全長配列に基づく断片を精製した。精製断片をマウスの免疫化実験において用い、フロイント完全アジュバント（ｏｒｆ３５２６Ａおよびｏｒｆ３５２６Ｂ）またはミョウバン（ｏｒｆ３５２６Ｃ）を用いてアジュバント添加した。免疫化したマウスを、次いで、致死量のＥ．ｃｏｌｉを用いて抗原投与した。抗原投与の結果を、以下の表３に示す。

よって、断片は、マウスにおいて実質的に同様の免疫応答を生じ、よって、全長ｏｒｆ３５２６と実質的に同様の結合体化多糖に対する免疫応答の増進を提供することが期待される。

本発明は、例としてのみ記載され、本発明の範囲および精神内に留まったまま改変を行うことができることが理解される。

参考文献（これらの内容は、完全に本明細書に援用される）

Claims (53)

1. グルカン多糖結合体であって、Ｅ．ｃｏｌｉ ＡｃｆＤ前駆体タンパク質（ｏｒｆ３５２６ポリペプチド）、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｆｌｕ抗原４３タンパク質（ｏｒｆ１３６４ポリペプチド）およびＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ Ｓｅｌ１反復含有タンパク質（ｕｐｅｃ−５２１１ポリペプチド）からなる群より選択されるキャリアポリペプチドに結合体化したグルカン多糖を含む、グルカン多糖結合体。
2. 前記キャリアポリペプチドが、
   （ａ）配列番号５０のアミノ酸配列；
   （ｂ）配列番号５０と比較しての１から１０までの単一アミノ酸変更；
   （ｃ）配列番号５０との少なくとも８５％の配列同一性；
   （ｄ）配列番号５０からの少なくとも１０連続するアミノ酸の断片；
   および／または
   （ｅ）ペアワイズアラインメントアルゴリズムを用いて配列番号５０とアラインメントさせた場合に、Ｎ末端からＣ末端までのｘアミノ酸のそれぞれの移動ウィンドウが、少なくともｘ・ｙの同一のアラインメントされたアミノ酸を有し、ここで、ｘは３０であり、ｙは０．７５である、
   を含む前記Ｅ．ｃｏｌｉ ＡｃｆＤ前駆体タンパク質（ｏｒｆ３５２６ポリペプチド）である、請求項１に記載のグルカン多糖結合体。
3. 前記キャリアポリペプチドが、
   （ａ）配列番号４４のアミノ酸配列；
   （ｂ）配列番号４４と比較しての１から１０までの単一アミノ酸変更；
   （ｃ）配列番号４４のいずれか１つとの少なくとも８５％の配列同一性；
   （ｄ）配列番号４４からの少なくとも１０連続するアミノ酸の断片；
   および／または
   （ｅ）ペアワイズアラインメントアルゴリズムを用いて配列番号４４とアラインメントさせた場合に、Ｎ末端からＣ末端までのｘアミノ酸のそれぞれの移動ウィンドウが、少なくともｘ・ｙの同一のアラインメントされたアミノ酸を有し、ここで、ｘは３０であり、ｙは０．７５である、
   を含む前記Ｅ．ｃｏｌｉ Ｆｌｕ抗原４３タンパク質（ｏｒｆ１３６４ポリペプチド）である、請求項１に記載のグルカン多糖結合体。
4. 前記キャリアポリペプチドが、
   （ａ）配列番号４８のアミノ酸配列；
   （ｂ）配列番号４８と比較しての１から１０までの単一アミノ酸変更；
   （ｃ）配列番号４８との少なくとも８５％の配列同一性；
   （ｄ）配列番号４８からの少なくとも１０連続するアミノ酸の断片；
   および／または
   （ｅ）ペアワイズアラインメントアルゴリズムを用いて配列番号４８とアラインメントさせた場合に、Ｎ末端からＣ末端までのｘアミノ酸のそれぞれの移動ウィンドウが、少なくともｘ・ｙの同一のアラインメントされたアミノ酸を有し、ここで、ｘは３０であり、ｙは０．７５である、
   を含む前記Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ Ｓｅｌ１反復含有タンパク質（ｕｐｅｃ−５２１１ポリペプチド）である、請求項１に記載のグルカン多糖結合体。
5. 前記グルカン多糖が、β−１，３連結および／またはβ−１，６連結を含有する、請求項１〜４のいずれか１項に記載のグルカン多糖結合体。
6. 前記グルカン多糖が、単一分子種である、請求項１〜５のいずれか１項に記載のグルカン多糖結合体。
7. 前記グルカン多糖が、キャリアタンパク質に直接結合体化している、請求項１〜６のいずれか１項に記載のグルカン多糖結合体。
8. 前記グルカン多糖が、キャリアタンパク質にリンカーを介して結合体化している、請求項１〜６のいずれか１項に記載のグルカン多糖結合体。
9. 前記グルカン多糖が、１００ｋＤａ未満（例えば、８０ｋＤａ未満、７０ｋＤａ未満、６０ｋＤａ未満、５０ｋＤａ未満、４０ｋＤａ未満、３０ｋＤａ未満、２５ｋＤａ未満、２０ｋＤａ未満または１５ｋＤａ未満）の分子量を有する、請求項１〜８のいずれか１項に記載のグルカン多糖結合体。
10. 前記グルカン多糖が、６０以下のグルコース単糖単位を有する、請求項１〜８のいずれか１項に記載のグルカン多糖結合体。
11. 前記グルカン多糖が、いくらかのβ−１，６分岐を有するβ−１，３グルカン多糖である、請求項１〜１０のいずれか１項に記載のグルカン多糖結合体。
12. 前記グルカン多糖が、ラミナリンである、請求項１１に記載のグルカン多糖結合体。
13. 前記グルカン多糖が、β−１，３連結グルコース残基とβ−１，６連結グルコース残基の両方を、少なくとも８：１のβ−１，３連結グルコース残基対β−１，６連結残基の比で含み、かつ／またはβ−１，３連結によってのみ他の残基と連結した少なくとも５の近接非末端残基の１もしくは複数の配列が存在する、請求項１〜１１のいずれか１項に記載のグルカン多糖結合体。
14. 前記グルカン多糖が、β−１，３連結グルコース残基とβ−１，６連結グルコース残基の両方を、少なくとも８：１のβ−１，３連結グルコース残基対β−１，６連結残基の比で含む、請求項１〜１１のいずれか１項に記載のグルカン多糖結合体。
15. 前記グルカン多糖が、β−１，３連結のみを有する、請求項１〜１０のいずれか１項に記載のグルカン多糖結合体。
16. 前記グルカン多糖が、カードランである、請求項１３〜１５のいずれか１項に記載のグルカン多糖結合体。
17. アジュバントをさらに含む、請求項１〜１６のいずれか１項に記載のグルカン多糖結合体。
18. 請求項１〜１６に記載のグルカン多糖結合体を含むワクチン成分。
19. 請求項１８に記載のワクチン成分を含むワクチン。
20. アジュバントをさらに含む、請求項１９に記載のワクチン。
21. Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ抗原、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ抗原、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ抗原、Ｍｏｒａｘｅｌｌａ ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ抗原、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ抗原、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ抗原、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｓ抗原、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｅｔａｎｉ抗原、Ｃｏｒｎｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｈｔｅｒｉａｅ抗原、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ Ｂ型（Ｈｉｂ）抗原、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ抗原、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ抗原、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ抗原、Ｎｅｉｓｅｒｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ抗原、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ抗原、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｐａｌｌｉｄｕｍ抗原、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｄｕｃｒｅｙｉ抗原、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ抗原、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ抗原、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ抗原、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｓａｐｒｏｐｈｙｔｉｃｕｓ抗原、Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａ抗原、追加のＥ．ｃｏｌｉ抗原、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉｓ抗原、Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｐｅｓｔｉｓ抗原、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ抗原、Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ抗原、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ抗原、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ抗原、Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ抗原、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉ抗原、Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ抗原、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ抗原、Ｓｈｉｇｅｌｌａ抗原およびＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ抗原から選択される追加のワクチン成分をさらに含む、請求項１９または請求項２０に記載のワクチン。
22. 哺乳類被験体における多糖に対する増進した免疫応答を誘導する方法であって、
    前記哺乳類被験体に、請求項１〜１６に記載のグルカン多糖結合体、請求項１８に記載のワクチン成分または請求項１９〜２１に記載のワクチンを投与する工程、
    を包含する、方法。
23. 哺乳類被験体における多糖に対する増進した免疫応答を誘導するための、請求項１〜１６に記載のグルカン多糖結合体、請求項１８に記載のワクチン成分または請求項１９〜２１に記載のワクチンの使用。
24. 多糖結合体であって、Ｅ．ｃｏｌｉ ＡｃｆＤ前駆体タンパク質（ｏｒｆ３５２６ポリペプチド）、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｆｌｕ抗原４３タンパク質（ｏｒｆ１３６４ポリペプチド）およびＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ Ｓｅｌ１反復含有タンパク質（ｕｐｅｃ−５２１１ポリペプチド）からなる群より選択されるキャリアポリペプチドに結合体化した多糖を含む、多糖結合体。
25. 前記キャリアポリペプチドが、前記Ｅ．ｃｏｌｉ ＡｃｆＤ前駆体タンパク質（ｏｒｆ３５２６ポリペプチド）である、請求項２４に記載の多糖結合体。
26. キャリアポリペプチドが、配列番号３９のＥ．ｃｏｌｉ ＡｃｆＤ前駆体タンパク質（ｏｒｆ３５２６ポリペプチド）と比較して毒性を低減する変異および／または精製を改善する欠失を含む、請求項２５に記載の多糖結合体。
27. 前記変異が、ｚｉｎｃｉｎメタロプロテアーゼドメインの全部または一部の欠失、およびプロテアーゼ活性を低減するｚｉｎｃｉｎメタロプロテアーゼドメイン中の点変異から選択される、請求項２６に記載の多糖結合体。
28. 前記点変異が、亜鉛結合残基の変異または触媒残基の変異である、請求項２６〜２７のいずれか１項に記載の多糖結合体。
29. 前記亜鉛結合残基が、配列番号３９とのアラインメントに基づくアミノ酸番号１３０５である、請求項２６〜２８のいずれか１項に記載の多糖結合体。
30. 前記キャリアポリペプチドが、前記Ｅ．ｃｏｌｉ ＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）タンパク質の少なくとも最後の１００のＣ末端アミノ酸、前記Ｅ．ｃｏｌｉ ＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）タンパク質の少なくとも最後の２００のＣ末端アミノ酸、前記Ｅ．ｃｏｌｉ ＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）タンパク質の少なくとも最後の３００のＣ末端アミノ酸、前記Ｅ．ｃｏｌｉ ＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）タンパク質の少なくとも最後の４００のＣ末端アミノ酸、前記Ｅ．ｃｏｌｉ ＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）タンパク質の少なくとも最後の５００のＣ末端アミノ酸、前記Ｅ．ｃｏｌｉ ＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）タンパク質の少なくとも最後の６００のＣ末端アミノ酸、前記Ｅ．ｃｏｌｉ ＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）タンパク質の少なくとも最後の７００のＣ末端アミノ酸、前記Ｅ．ｃｏｌｉ ＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）タンパク質の少なくとも最後の７５０のＣ末端アミノ酸、もしくは前記Ｅ．ｃｏｌｉ ＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）タンパク質の少なくとも最後の７５８のＣ末端アミノ酸を含まないか、または前記Ｅ．ｃｏｌｉ ＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）タンパク質の少なくとも最初の１００のＮ末端アミノ酸、前記Ｅ．ｃｏｌｉ ＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）タンパク質の少なくとも最初の２００のＮ末端アミノ酸、前記Ｅ．ｃｏｌｉ ＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）タンパク質の少なくとも最初の３００のＮ末端アミノ酸、前記Ｅ．ｃｏｌｉ ＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）タンパク質の少なくとも最初の４００のＮ末端アミノ酸、前記Ｅ．ｃｏｌｉ ＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）タンパク質の少なくとも最初の５００のＮ末端アミノ酸、前記Ｅ．ｃｏｌｉ ＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）タンパク質の少なくとも最初の６００のＮ末端アミノ酸、前記Ｅ．ｃｏｌｉ ＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）タンパク質の少なくとも最初の７００のＮ末端アミノ酸、前記Ｅ．ｃｏｌｉ ＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）タンパク質の少なくとも最初の７５０のＮ末端アミノ酸、もしくは前記Ｅ．ｃｏｌｉ ＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）タンパク質の少なくとも最初の７６０のＮ末端アミノ酸を含まない、請求項２６〜２９のいずれか１項に記載の多糖結合体。
31. 前記キャリアポリペプチドが、前記Ｅ．ｃｏｌｉ ＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）タンパク質の少なくとも最後の１００のＣ末端アミノ酸、前記Ｅ．ｃｏｌｉ ＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）タンパク質の少なくとも最後の１２５のＣ末端アミノ酸、前記Ｅ．ｃｏｌｉ ＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）タンパク質の少なくとも最後の１５０のＣ末端アミノ酸、前記Ｅ．ｃｏｌｉ ＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）タンパク質の少なくとも最後の１７５のＣ末端アミノ酸、前記Ｅ．ｃｏｌｉ ＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）タンパク質の少なくとも最後の２００のＣ末端アミノ酸、前記Ｅ．ｃｏｌｉ ＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）タンパク質の少なくとも最後の２１０のＣ末端アミノ酸、または前記Ｅ．ｃｏｌｉ ＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）タンパク質の少なくとも最後の２１７のＣ末端アミノ酸を含まず、場合によって、前記Ｅ．ｃｏｌｉ ＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）タンパク質の少なくとも最初の１０のＮ末端アミノ酸、前記Ｅ．ｃｏｌｉ ＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）タンパク質の少なくとも最初の２０のＮ末端アミノ酸、前記Ｅ．ｃｏｌｉ ＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）タンパク質の少なくとも最初の３０のＮ末端アミノ酸、または前記Ｅ．ｃｏｌｉ ＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）タンパク質の少なくとも最初の３３のＮ末端アミノ酸を含まない、請求項２６〜２９のいずれか１項に記載の多糖結合体。
32. 前記キャリアポリペプチドが、
    （ａ）配列番号２６〜４０からなる群より選択されるアミノ酸配列；
    （ｂ）配列番頭２６〜４０と比較しての１から１０までの単一アミノ酸変更；
    （ｃ）配列番号２６〜４０のいずれか１つとの少なくとも８５％の配列同一性；
    （ｄ）配列番号２６〜４０のいずれか１つからの少なくとも１０連続するアミノ酸の断片；
    および／または
    （ｅ）ペアワイズアラインメントアルゴリズムを用いて配列番号２６〜４０のいずれかとアラインメントさせた場合に、Ｎ末端からＣ末端までのｘアミノ酸のそれぞれの移動ウィンドウが、少なくともｘ・ｙの同一のアラインメントされたアミノ酸を有し、ここで、ｘは３０であり、ｙは０．７５である
    を含む、請求項２５〜３１のいずれか１項に記載の多糖結合体。
33. 前記キャリアポリペプチドが、前記Ｅ．ｃｏｌｉ ＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）タンパク質と比較して前記キャリアポリペプチドの溶解度を増加する前記Ｅ．ｃｏｌｉ ＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）タンパク質に対する欠失をさらに含有する、請求項２５〜３２に記載の多糖結合体。
34. 前記欠失が、ｇｌｙ−ｓｅｒ領域までの実質的に全てのＮ末端アミノ酸の除去、Ｎ末端プロリンリッチ反復の全てもしくは一部分の除去、またはその両方である、請求項３３に記載の多糖結合体。
35. 前記欠失が、前記Ｅ．ｃｏｌｉ ＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）タンパク質と比較して少なくとも最初の１０のＮ末端アミノ酸、前記Ｅ．ｃｏｌｉ ＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）タンパク質と比較して少なくとも最初の２０のＮ末端アミノ酸、前記Ｅ．ｃｏｌｉ ＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）タンパク質と比較して少なくとも最初の３０のＮ末端アミノ酸、前記Ｅ．ｃｏｌｉ ＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）タンパク質と比較して少なくとも最初の３３のＮ末端アミノ酸、前記Ｅ．ｃｏｌｉ ＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）タンパク質と比較して少なくとも最初の４０のＮ末端アミノ酸、前記Ｅ．ｃｏｌｉ ＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）タンパク質と比較して少なくとも最初の５０のＮ末端アミノ酸、前記Ｅ．ｃｏｌｉ ＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）タンパク質と比較して少なくとも最初の６０のＮ末端アミノ酸、前記Ｅ．ｃｏｌｉ ＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）タンパク質と比較して少なくとも最初の７０のＮ末端アミノ酸、前記Ｅ．ｃｏｌｉ ＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）タンパク質と比較して少なくとも最初の８０のＮ末端アミノ酸、前記Ｅ．ｃｏｌｉ ＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）タンパク質と比較して少なくとも最初の９０のＮ末端アミノ酸、または前記Ｅ．ｃｏｌｉ ＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）タンパク質と比較して少なくとも最初の９４のＮ末端アミノ酸の除去である、請求項３３に記載の多糖結合体。
36. 前記キャリアポリペプチドが、前記Ｅ．ｃｏｌｉ Ｆｌｕ抗原４３タンパク質（ｏｒｆ１３６４ポリペプチド）である、請求項２４に記載の多糖結合体。
37. 前記キャリアポリペプチドが、前記Ｅ．ｃｏｌｉ Ｆｌｕ抗原４３タンパク質（ｏｒｆ１３６４ポリペプチド）の断片であり、前記断片が、全長Ｅ．ｃｏｌｉ Ｆｌｕ抗原４３タンパク質（ｏｒｆ１３６４ポリペプチド）に対する欠失を含有し、前記欠失が、前記全長タンパク質と比較して前記断片の溶解度を増加する、請求項３６に記載の多糖結合体。
38. 前記欠失が、カルボキシル末端β−バレルドメインを含む、請求項３７に記載の多糖結合体。
39. 前記キャリアポリペプチドが、配列番号４４のアミノ酸配列に相当する、請求項３８に記載の多糖結合体。
40. 前記断片が、前記ｆｌｕ抗原４３（ｏｒｆ１３６４）タンパク質の９５０未満のアミノ酸、９００未満のアミノ酸、８５０未満のアミノ酸、８００未満のアミノ酸、７５０未満のアミノ酸、７００未満のアミノ酸、６５０未満のアミノ酸、６００未満のアミノ酸、５５０未満のアミノ酸、５００未満のアミノ酸、４５０未満のアミノ酸、４４０未満のアミノ酸、または４３０未満のアミノ酸を含む、請求項３７〜３９のいずれかに記載の多糖結合体。
41. 前記キャリアポリペプチドが、
    （ａ）配列番号１〜２２からなる群より選択されるアミノ酸配列；
    （ｂ）配列番頭１〜２２と比較しての１から１０までの単一アミノ酸変更；
    （ｃ）配列番号１〜２２のいずれか１つとの少なくとも８５％の配列同一性；
    （ｄ）配列番号１〜２２のいずれか１つからの少なくとも１０連続するアミノ酸の断片；
    および／または
    （ｅ）ペアワイズアラインメントアルゴリズムを用いて配列番号１〜２２のいずれかとアラインメントさせた場合に、Ｎ末端からＣ末端までのｘアミノ酸のそれぞれの移動ウィンドウが、少なくともｘ・ｙの同一のアラインメントされたアミノ酸を有し、ここで、ｘは３０であり、ｙは０．７５である
    を含む、請求項３６〜４０のいずれか１項に記載の多糖結合体。
42. 前記断片が、前記Ｅ．ｃｏｌｉ Ｆｌｕ抗原４３タンパク質（ｏｒｆ１３６４ポリペプチド）と比較して少なくとも最初の１０のＮ末端アミノ酸、前記Ｅ．ｃｏｌｉ Ｆｌｕ抗原４３タンパク質（ｏｒｆ１３６４ポリペプチド）と比較して少なくとも最初の２０のＮ末端アミノ酸、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｆｌｕ抗原４３タンパク質（ｏｒｆ１３６４ポリペプチド）と比較して少なくとも最初の３０のＮ末端アミノ酸、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｆｌｕ抗原４３タンパク質（ｏｒｆ１３６４ポリペプチド）と比較して少なくとも最初の４０のＮ末端アミノ酸、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｆｌｕ抗原４３タンパク質（ｏｒｆ１３６４ポリペプチド）と比較して少なくとも最初の５０のＮ末端アミノ酸、または前記Ｅ．ｃｏｌｉ ＡｃｆＤ（ｏｒｆ３５２６）タンパク質と比較して少なくとも最初の５２のＮ末端アミノ酸を含まない、請求項４１に記載の多糖結合体。
43. 前記断片が、前記Ｅ．ｃｏｌｉ Ｆｌｕ抗原４３タンパク質（ｏｒｆ１３６４ポリペプチド）と比較して少なくとも最後の５０のＣ末端アミノ酸、前記Ｅ．ｃｏｌｉ Ｆｌｕ抗原４３タンパク質（ｏｒｆ１３６４ポリペプチド）と比較して少なくとも最後の１００のＣ末端アミノ酸、前記Ｅ．ｃｏｌｉ Ｆｌｕ抗原４３タンパク質（ｏｒｆ１３６４ポリペプチド）と比較して少なくとも最後の１５０のＣ末端アミノ酸、前記Ｅ．ｃｏｌｉ Ｆｌｕ抗原４３タンパク質（ｏｒｆ１３６４ポリペプチド）と比較して少なくとも最後の２００のＣ末端アミノ酸、前記Ｅ．ｃｏｌｉ Ｆｌｕ抗原４３タンパク質（ｏｒｆ１３６４ポリペプチド）と比較して少なくとも最後の２５０のＣ末端アミノ酸、前記Ｅ．ｃｏｌｉ Ｆｌｕ抗原４３タンパク質（ｏｒｆ１３６４ポリペプチド）と比較して少なくとも最後の３００のＣ末端アミノ酸、前記Ｅ．ｃｏｌｉ Ｆｌｕ抗原４３タンパク質（ｏｒｆ１３６４ポリペプチド）と比較して少なくとも最後の３２５のＣ末端アミノ酸、または前記Ｅ．ｃｏｌｉ Ｆｌｕ抗原４３タンパク質（ｏｒｆ１３６４ポリペプチド）と比較して少なくとも最後の３２８のＣ末端アミノ酸を含まない、請求項４１または請求項４２に記載の多糖結合体。
44. 前記キャリアポリペプチドが、前記Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ Ｓｅｌ１反復含有タンパク質（ｕｐｅｃ−５２１１ポリペプチド）である、請求項２４に記載の多糖結合体。
45. 前記キャリアポリペプチドが、
    （ａ）配列番号２３〜２５からなる群より選択されるアミノ酸配列；
    （ｂ）配列番頭２３〜２５と比較しての１から１０までの単一アミノ酸変更；
    （ｃ）配列番号２３〜２５のいずれか１つとの少なくとも８５％の配列同一性；
    （ｄ）配列番号２３〜２５のいずれか１つからの少なくとも１０連続するアミノ酸の断片；
    および／または
    （ｅ）ペアワイズアラインメントアルゴリズムを用いて配列番号２３〜２５のいずれかとアラインメントさせた場合に、Ｎ末端からＣ末端までのｘアミノ酸のそれぞれの移動ウィンドウが、少なくともｘ・ｙの同一のアラインメントされたアミノ酸を有し、ここで、ｘは３０であり、ｙは０．７５である
    を含む、請求項４４に記載の多糖結合体。
46. 前記多糖が、
    （ａ）グルカン、
    （ｂ）Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓの血清群Ａ、Ｃ、Ｗ１３５およびＹのうちの少なくとも１つに由来する莢膜糖、
    （ｃ）Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅからの糖抗原、
    （ｄ）Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓからの莢膜多糖、
    （ｅ）Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ Ｂ多糖、
    （ｆ）Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇｌａｃｔｉａｅからの糖抗原、
    （ｇ）Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅからのリポ多糖、または
    （ｈ）Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉからの莢膜多糖
    を含むリストから選択される、請求項２４〜４５のいずれかに記載の多糖結合体。
47. アジュバントをさらに含む、請求項２４〜４６のいずれかに記載の多糖結合体。
48. 請求項２４〜４６に記載の多糖結合体を含むワクチン成分。
49. 請求項４８に記載のワクチン成分を含むワクチン。
50. アジュバントをさらに含む、請求項４９に記載のワクチン。
51. Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ抗原、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ抗原、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ抗原、Ｍｏｒａｘｅｌｌａ ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ抗原、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ抗原、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ抗原、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｓ抗原、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｅｔａｎｉ抗原、Ｃｏｒｎｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｈｔｅｒｉａｅ抗原、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ Ｂ型（Ｈｉｂ）抗原、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ抗原、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ抗原、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ抗原、Ｎｅｉｓｅｒｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ抗原、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ抗原、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｐａｌｌｉｄｕｍ抗原、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｄｕｃｒｅｙｉ抗原、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ抗原、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ抗原、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ抗原、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｓａｐｒｏｐｈｙｔｉｃｕｓ抗原、Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａ抗原、追加のＥ．ｃｏｌｉ抗原、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ａｎｔｈｒａｃｉｓ抗原、Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｐｅｓｔｉｓ抗原、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ抗原、Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ抗原、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ抗原、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ抗原、Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ抗原、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉ抗原、Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ抗原、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ抗原、Ｓｈｉｇｅｌｌａ抗原およびＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ抗原から選択される追加のワクチン成分をさらに含む、請求項４９または請求項５０に記載のワクチン。
52. 哺乳類被験体における多糖に対する増進した免疫応答を誘導する方法であって、
    前記哺乳類被験体に、請求項２４〜４６に記載の多糖結合体、請求項４８に記載のワクチン成分または請求項４９〜５１に記載のワクチンを投与する工程
    を含む方法。
53. 哺乳類被験体における前記多糖に対する増進した免疫応答を誘導するための、請求項２４〜４６に記載の多糖結合体、請求項４８に記載のワクチン成分または請求項４９〜５１に記載のワクチンの使用。