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JP2013017484A - Ｆｇｆｒ融合タンパク質によって疾患を治療するための組成物および方法 - Google Patents

Ｆｇｆｒ融合タンパク質によって疾患を治療するための組成物および方法 Download PDF

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Abstract

【課題】増殖性疾患治療のために有用なＦＧＦＲ融合タンパク質を提供すること。
【解決手段】本発明は、ＦＧＦＲ融合タンパク質、その作製方法、ならびに癌および血管形成障害を含めた増殖性障害を治療するためのその使用方法を提供する。ＦＧＦＲ融合分子はＣＨＯ細胞中で作製することができ、ＦＧＦＲの細胞外ドメイン中に、その安定性を向上させる欠失突然変異を含み得る。これらの融合タンパク質は、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏで癌細胞の成長および生存度を阻害する。これらの受容体がそのリガンドＦＧＦに対して比較的高い親和性を有することと、これらの囮受容体が腫瘍成長を阻害する能力が実証されていることとの組合せは、本明細書中に提供する組成物および方法の臨床的価値の指標である。
【選択図】なし

Description

関連出願
本発明は、２００５年７月２２日に出願された出願第６０／７０１，４７９号；２００５年１０月２１日に出願された出願第６０／７２９，４０１号；２００６年１月１０日に出願された出願第６０／７５７，３９８号；および２００６年５月１５日に出願された出願第６０／８００，００５号に関連する。これらは全て、その全体が参考として援用される。
（技術分野）
本発明は、線維芽細胞成長因子受容体（ＦＧＦＲ）の細胞外ドメインを含む融合分子に関する。本発明は、ＦＧＦＲ融合タンパク質を含むポリペプチドおよびポリヌクレオチド配列、ベクター、宿主細胞、組成物、キット、ならびに動物に関する。本発明はまた、癌および血管形成障害を含めた増殖性疾患の診断、予防、その予後診断の決定、および治療を行うために、ＦＧＦＲ融合分子ならびにその改変体および断片を作製かつ使用する方法にも関する。
（背景技術）
線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）およびその受容体（ＦＧＦＲ）とは、血管形成、脈管形成、および創傷治癒、ならびに胚発生における組織パターン形成および肢形成において助けになる役割を有する、高度に保存されたタンパク質群である。ＦＧＦおよびＦＧＦＲは細胞遊走、増殖、および生存に影響を与え、健康および疾患に広範な影響を及ぼす。
ＦＧＦＲファミリーは、４つの主要な受容体型、すなわちＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３、およびＦＧＦＲ４を含む。これらの受容体は、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞質内ドメインを有する膜貫通タンパク質である。細胞外ドメインのそれぞれは２つまたは３つの免疫グロブリン（Ｉｇ）ドメインを含む。一部のＦＧＦＲは、第３のＩｇドメインのＣ末端領域が異なるＦＧＦＲ１−ＩＩＩｂおよびＦＧＦＲ１−ＩＩＩｃなど、分子の特定のセグメントが異なるアイソフォームとして存在する。膜貫通ＦＧＦＲは、ＦＧＦＲ二量体、ＦＧＦリガンド、およびヘパリングリカンまたはプロテオグリカンの複合体において細胞表面で起こる二量体化によって活性化される、単量体チロシンキナーゼ受容体である。ＦＧＦリガンドがＦＧＦＲに結合することによる細胞外ＦＧＦＲの活性化により、受容体チロシンキナーゼ活性から始まる細胞内でシグナル伝達現象のカスケードが開始される。
現在までに２３個の既知のＦＧＦが存在し、これらのそれぞれが１つまたは複数のＦＧＦＲと結合する能力を有する（非特許文献１）。いくつかのＦＧＦが１つまたは複数のＦＧＦＲのそれぞれに結合してそれを活性化することができ、多くの場合、様々なＦＧＦＲに対するその親和性において桁単位の差の大きな差異が存在する。多くのＦＧＦが、非常に高い親和性でその対応するＦＧＦＲと結合し、一部はピコモル範囲で結合する。一部の状況下では、ＦＧＦがＦＧＦＲと結合するためにヘパリンが必要である（非特許文献２）。例えば、ＦＧＦＲ１によって媒介されるＦＧＦ−２（塩基性ＦＧＦ（ｂＦＧＦ）としても知られる）に対する分裂応答は、ヘパリンの存在に依存することが示されている（非特許文献２）。
癌または他の増殖性細胞はアップレギュレーションされたレベルで複数のＦＧＦまたはＦＧＦＲを発現し得るので、ＦＧＦの機能を遮断するために特異的抗体を使用する以前に提案されている治療手法では、複数のＦＧＦＲを活性化する際におけるＦＧＦファミリー内の重複性の問題に取り組んでいない。アンチセンスオリゴヌクレオチドまたは関連するｓｉＲＮＡ治療には、特異性、血清半減期、および細胞内送達に関して潜在的な問題が存在する。アデノウイルスを用いるものを含めた遺伝子導入治療では患者の安全性の問題を提起されており、いくつかの臨床的遺伝子治療研究が患者の死亡により停止されている。小分子チロシンキナーゼ阻害剤治療には、標的特異性、毒性、および薬物耐性の徴候の問題が存在する。現在までに、どのヒトの疾患を治療するためにも、ＦＧＦＲシグナル伝達経路を標的とする薬物は認可されていない。
Ｚｈａｎｇら、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．、２８１：１５、６９４〜１５、７００頁（２００６年） Ｏｒｎｉｔｚら、Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．、１２：２４０頁（１９９２年）
本発明は、ＦＧＦＲポリペプチドの細胞外ドメインと融合パートナーとを含む第１のポリペプチドを含むＦＧＦＲ融合タンパク質を提供し、細胞外ドメインがＣ末端を含み、Ｃ末端は野生型ＦＧＦＲ細胞外ドメインのＣ末端の改変体を含み、改変体は野生型ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３、またはＦＧＦＲ４の細胞外ドメインのＣ末端中に存在する１〜２２個のアミノ酸残基の欠失を含み、ＦＧＦＲ融合タンパク質は少なくとも１つのＦＧＦリガンドまたはその生物活性のある断片に結合する。一実施形態では、欠失はＩｇＩＩＩドメインのＣ末端に位置するバリン残基よりもＣ末端側であり、一般的に野生型ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３、およびＦＧＦＲ４の細胞外ドメインのＣ末端に混ざってアラインメントされている。一実施形態では、ＦＧＦＲ融合タンパク質は切断されにくい。
本発明はまた、ＦＧＦＲポリペプチドの細胞外ドメインと融合パートナーとを含む第１のポリペプチドを含むＦＧＦＲ融合タンパク質も提供し；細胞外ドメインがＣ末端を含み、Ｃ末端は野生型ＦＧＦＲ細胞外ドメインのＣ末端の改変体を含み、改変体は、野生型ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３、またはＦＧＦＲ４の細胞外ドメインのＣ末端と比較して少なくとも１つの点突然変異を含み；点突然変異により、ＦＧＦＲ融合タンパク質は切断されにくくなる。
これらのうちの任意のＦＧＦＲ融合タンパク質がＦＧＦＲ１ポリペプチド、ＦＧＦＲ２ポリペプチド、ＦＧＦＲ３ポリペプチド、および／またはＦＧＦＲ４ポリペプチドを含み得る。これらのうちの任意のＦＧＦＲ融合タンパク質がＦｃポリペプチドを含み得る。
一実施形態では、ＦＧＦＲ融合タンパク質の細胞外ドメインは、配列番号１００、配列番号９７〜配列番号９９、配列番号１０１〜配列番号１２２、配列番号１２７〜配列番号１３２、配列番号１３７〜配列番号１４１、配列番号１４６〜配列番号１５０、配列番号１６２〜配列番号１６６、配列番号１７８〜配列番号１８２、配列番号１９９〜配列番号２０３、配列番号２０６〜配列番号２１０、配列番号２３０〜配列番号２３４、および配列番号２３８〜配列番号２４２のうちの任意のアミノ酸配列を含む。これらのＦＧＦＲ融合タンパク質は、ネイティブリーダー配列を欠いていてよい。一実施形態では、Ｆｃポリペプチドは、配列番号１７１〜配列番号１７３のうちの任意のアミノ酸配列を含む。
本発明はさらに、ＦＧＦＲポリペプチドの細胞外ドメインまたはその改変体と融合パートナーとを含む第１のポリペプチドを含む、ＣＨＯ細胞または２９３細胞中で産生させたＦＧＦＲ融合タンパク質を提供し、ＦＧＦＲ融合タンパク質は１つまたは複数のＦＧＦリガンドに結合することができる。一実施形態では、このＦＧＦＲ融合タンパク質は、配列番号１００、配列番号９５〜配列番号９９、配列番号１０２〜配列番号１２６、配列番号１５６〜配列番号１５７、配列番号１６２〜配列番号１６６、配列番号１７６〜配列番号１８２、配列番号１９８〜配列番号２０２、配列番号２０５〜配列番号２１０、配列番号２２８〜配列番号２３４、および配列番号２３６〜配列番号２４２のうちの任意のアミノ酸配列を含む。一実施形態では、このＦＧＦＲ融合タンパク質はネイティブリーダー配列を欠く。一実施形態では、これはＣＨＥＦ発現系を用いて産生させる。
本発明はさらに、任意の上述のＦＧＦＲ融合タンパク質の、医薬品としての使用を提供する。本発明は、有効量の任意の上述のＦＧＦＲ融合タンパク質および薬学的に許容される担体を含む組成物を提供する。本発明は、この組成物を容器中に含み、そのような組成物を必要としている対象へそれを投与するための指示書を含むキットを提供する。一実施形態では、キットはＦＧＦＲ融合タンパク質の単一用量または複数用量のどちらかを含む。
本発明は、任意の上述のＦＧＦＲ融合タンパク質をコードしているポリヌクレオチドを含む核酸分子を提供する。一実施形態では、ベクターがこの核酸分子および核酸分子の発現を制御するプロモーターを含む。本発明はまた、任意の上述のＦＧＦＲ融合タンパク質、この核酸分子、および／またはこのベクターを含む組換え宿主細胞も提供する。一実施形態では、この組換え宿主細胞は原核細胞である。一実施形態では、この組換え宿主細胞は真核細胞、例えばＣＨＯまたは２９３系統の細胞である。一実施形態では、本発明は、そのような組換え宿主細胞から発現させたポリペプチドを提供する。
別の態様では、本発明は、上述の組換え宿主細胞を提供すること、およびそれを培養してＦＧＦＲ融合タンパク質を発現させることを含む、ＦＧＦＲ融合タンパク質の産生方法を提供する。一実施形態では、本方法はさらに、ＦＧＦＲ融合タンパク質を細胞培養物から単離することを含む。一実施形態では、単離手順は、発現させたＦＧＦＲ融合タンパク質を、アフィニティーマトリックス、例えば、プロテインＡ、プロテインＧ、プロテインＡ／Ｇ、抗Ｆｃ抗体、および抗ＦＧＦＲ抗体と接触させることを含む。一実施形態では、単離はさらに、ＦＧＦＲ融合タンパク質を疎水性マトリックスと接触させることを含む。
さらなる態様では、本発明は、対象においてＦＧＦＲ発現のレベルを検出する方法であって、ＦＧＦＲに対するリガンドを提供すること、対象から組織試料を提供すること、特異的ＦＧＦＲ結合を可能にする条件下でリガンドと試料とを相互作用させること、特異的結合を測定すること；および特異的結合の量を対照試料での量と比較することを含み、リガンドがＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３、ＦＧＦＲ４、およびこれらの任意の断片のうちの少なくとも１つに結合する方法を提供する。組織試料は血液、血清、または血漿試料を含み得る。一実施形態では、組織試料は患部組織の試料を含む。一実施形態では、組織試料は腫瘍組織の試料を含む。一実施形態では、試験は、タンパク質−抗体の結合もしくは競合アッセイ、または核酸ハイブリダイゼーションアッセイを含む。一実施形態では、リガンドはＦＧＦリガンドまたは抗体リガンドを含む。
本発明はまた、対象においてＦＧＦ発現のレベルを検出する方法であって、ＦＧＦＲまたはその断片を提供すること；対象から組織試料を提供すること；特異的結合を可能にする条件下でリガンドと試料とを相互作用させること；特異的結合を測定すること；および特異的結合の量を対照試料での量と比較することを含み、ＦＧＦＲまたはその断片がＦＧＦに結合する方法を提供する。一実施形態では、ＦＧＦは、ＦＧＦ−１、ＦＧＦ−２、ＦＧＦ−３、ＦＧＦ−４、ＦＧＦ−５、ＦＧＦ−６、ＦＧＦ−７、ＦＧＦ−８、ＦＧＦ−９、ＦＧＦ−１０、ＦＧＦ−１６、ＦＧＦ−１７、ＦＧＦ−１８、ＦＧＦ−１９およびＦＧＦ−２０のうちの少なくとも１つである。
本発明はさらに、有効量の上述のＦＧＦＲ融合タンパク質および薬学的に許容される担体を含む組成物を提供すること、ならびに増殖性細胞を、増殖性細胞の生存度または増殖を阻害するために有効な量の組成物と接触させることを含む、増殖性細胞の生存度または増殖をｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｉｎ ｖｉｖｏ、またはｅｘ ｖｉｖｏで阻害する方法を提供する。一実施形態では、対象内に増殖性細胞が存在し、対象は、正常よりも高いレベルで１つまたは複数のＦＧＦリガンドを発現する。一実施形態では、この対象の組織は、正常よりも高いレベルでＦＧＦリガンドを発現する。一実施形態では、ＦＧＦリガンドはＦＧＦＲ１−Ｆｃ、ＦＧＦＲ２−Ｆｃ、ＦＧＦＲ３−Ｆｃ、もしくはＦＧＦＲ４−Ｆｃ、またはこれらの任意の改変体のうちの少なくとも１つに結合し、これは結合相互作用を実時間で測定することによって決定する。例えば、このＦＧＦは、ＦＧＦ−１、ＦＧＦ−２、ＦＧＦ−３、ＦＧＦ−４、ＦＧＦ−５、ＦＧＦ−６、ＦＧＦ−８、ＦＧＦ−９、ＦＧＦ−１６、ＦＧＦ−１７、ＦＧＦ−１８、ＦＧＦ−１９およびＦＧＦ−２０から選択し得る。一実施形態では、本方法を行い、対象内に増殖性細胞が存在し、対象は、正常よりも高いレベルでＦＧＦＲポリペプチドを発現する。一実施形態では、対象内の組織も、正常よりも高いレベルでＦＧＦＲポリペプチド、例えば、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３、またはＦＧＦＲ４を発現する。一実施形態では、本方法は、増殖性癌細胞、増殖性異形成細胞、または増殖性内皮細胞の生存度および／または増殖を阻害する。一実施形態では、増殖性細胞は、乳房細胞、膵臓細胞、前立腺細胞、肺細胞、卵巣細胞、腎細胞、脳細胞、結腸直腸細胞、網膜細胞、または表７〜表１３のうちの任意の表から選択された別の細胞を含む。一実施形態では、対象は、正常よりも高いレベルでＦＧＦＲポリペプチドおよび正常よりも高いレベルのＦＧＦリガンドを発現する。
さらなる態様では、本発明は、対象において癌を治療する方法であって、任意の上述のＦＧＦＲ融合タンパク質を提供すること、および有効量のＦＧＦＲ融合タンパク質を対象に投与することを含む方法を提供する。一実施形態では、癌は、ＦＧＦリガンドによる成長刺激に依存するまたはそれに応答性である細胞の少なくとも１つの部分集団を含む。一実施形態では、癌は、成長のための血管の生成について、血管新生因子に依存するまたはそれに応答性である細胞の少なくとも１つの部分集団を含む。一実施形態では、癌は、ＶＥＧＦシグナル伝達経路の阻害に対する耐性を有する。一実施形態では、癌は、転移性の癌、例えば骨転移を含む。一実施形態では、癌は、血液癌、例えば、慢性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、または有毛細胞白血病を含む。一実施形態では、癌は固形腫瘍を含む。一実施形態では、癌は、乳癌、膵臓癌、下垂体癌、前立腺癌、肺癌、卵巣癌、腎細胞癌、口内扁平細胞癌、結腸直腸癌、膀胱癌、網膜癌、脳癌、または表７〜表１３に記載の別の癌を含む。
一実施形態では、本方法はさらに、第２の抗癌治療剤、例えば、細胞分裂抑制剤、細胞毒性剤、抗血管形成剤、第２のＦＧＦＲ融合タンパク質、ＰＤＧＦシグナル伝達の阻害剤、ＶＥＧＦシグナル伝達の阻害剤、またはＥＧＦシグナル伝達の阻害剤を含む抗癌治療剤を、対象に投与することを含む。第２の抗癌治療剤は、ＦＧＦＲ融合タンパク質を投与する前、後、またはそれと同時に投与し得る。
本発明はまた、対象において血管形成を阻害する方法であって、任意の上述のＦＧＦＲ融合タンパク質を提供すること、および血管形成を阻害するために有効な量のＦＧＦＲ融合タンパク質を対象に投与することを含む方法を提供する。一実施形態では、本方法はさらに、第２の治療剤、例えば、細胞分裂抑制剤、細胞毒性剤、第２の抗血管形成剤、または第２の抗血管形成剤を、対象に投与することを含む。
本方法の一実施形態では、対象を黄斑変性症について治療する。一実施形態では、対象を癌について治療する。一実施形態では、第２の治療剤は、抗癌治療剤、例えば、第２のＦＧＦＲ融合タンパク質、ＰＤＧＦシグナル伝達の阻害剤、ＶＥＧＦシグナル伝達の阻害剤、ＥＧＦシグナル伝達の阻害剤、抗体、またはｓｉＲＮＡを含む。一実施形態では、本発明は、Ａｖａｓｔｉｎ（登録商標）で治療したまたは治療中である対象において血管形成を治療する方法を提供する。
本発明は、有効量の任意の上述のＦＧＦＲ融合タンパク質を含む組成物を、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、局所投与、経口投与、腹腔内投与、眼窩内投与、移植による投与、吸入による投与、くも膜下腔内投与、脳室内投与、および／または鼻腔内投与することによる、増殖性細胞の生存度または増殖をｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｉｎ ｖｉｖｏ、またはｅｘ ｖｉｖｏで阻害する方法；癌を治療する方法、ならびに血管形成を治療する方法を提供する。一実施形態では、本方法はさらに、第２の抗癌治療剤を対象に投与することを含み、第２の薬剤は、手術、化学療法、放射線療法、および／または別の生物剤の投与を含む。
本発明はまた、増殖性疾患、例えば、癌または黄斑変性症を治療するための医薬品を製造するための、任意の上述のＦＧＦＲ融合タンパク質の使用を提供する。一実施形態では、癌は血液癌または固形癌を含む。一実施形態では、癌は、乳癌、膵臓癌、下垂体癌、前立腺癌、肺癌、卵巣癌、腎臓癌、口腔癌、結腸直腸癌、膀胱癌、網膜癌、脳癌、または表７〜表１３に同定した別の癌を含む。
本発明は、癌を治療するために同時、別々、または逐次的に使用する、上述のＦＧＦＲ融合タンパク質および少なくとも１つの抗癌治療剤を合わせた調製物を含む製品を提供する。
上記に加えて、本発明は以下を提供する：
（項目１） ＦＧＦＲポリペプチドの細胞外ドメインと融合パートナーとを含む第１のポリペプチドを含むＦＧＦＲ融合タンパク質であって、該細胞外ドメインがＣ末端を含み、該Ｃ末端が野生型ＦＧＦＲ細胞外ドメインのＣ末端の改変体を含み、該改変体が野生型ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３、またはＦＧＦＲ４の細胞外ドメインのＣ末端中に存在する１〜２２個のアミノ酸残基の欠失を含み、該ＦＧＦＲ融合タンパク質が少なくとも１つのＦＧＦリガンドまたはその生物活性のある断片に結合する、ＦＧＦＲ融合タンパク質。
（項目２） 上記欠失がＩｇＩＩＩドメインのＣ末端に位置するバリン残基よりもＣ末端側であり、一般的に野生型ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３、およびＦＧＦＲ４の細胞外ドメインのＣ末端に混ざってアラインメントされている、項目１に記載のＦＧＦＲ融合タンパク質。
（項目３） ＦＧＦＲポリペプチドの細胞外ドメインと融合パートナーとを含む第１のポリペプチドを含むＦＧＦＲ融合タンパク質であって、該細胞外ドメインがＣ末端を含み、該Ｃ末端が野生型ＦＧＦＲ細胞外ドメインのＣ末端の改変体を含み、該改変体が、野生型ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３、またはＦＧＦＲ４の細胞外ドメインのＣ末端と比較して少なくとも１つの点突然変異を含み、該点突然変異により、該ＦＧＦＲ融合タンパク質が切断されにくくなる、ＦＧＦＲ融合タンパク質。
（項目４） 上記ＦＧＦＲポリペプチドがＦＧＦＲ１ポリペプチドを含む、項目１から３のいずれかに記載のＦＧＦＲ融合タンパク質。
（項目５） 上記ＦＧＦＲポリペプチドがＦＧＦＲ２ポリペプチドを含む、項目１から３のいずれかに記載のＦＧＦＲ融合タンパク質。
（項目６） 上記ＦＧＦＲポリペプチドがＦＧＦＲ３ポリペプチドを含む、項目１から３のいずれかに記載のＦＧＦＲ融合タンパク質。
（項目７） 上記ＦＧＦＲポリペプチドがＦＧＦＲ４ポリペプチドを含む、項目１から３のいずれかに記載のＦＧＦＲ融合タンパク質。
（項目８） 上記融合パートナーがＦｃポリペプチドを含む、項目１から３のいずれかに記載のＦＧＦＲ融合タンパク質。
（項目９） 上記融合タンパク質が切断されにくい、項目１から３のいずれかに記載のＦＧＦＲ融合タンパク質。
（項目１０） 上記細胞外ドメインが、配列番号１００、配列番号９７〜配列番号９９、配列番号１０１〜配列番号１２２、配列番号１２７〜配列番号１３２、配列番号１３７〜配列番号１４１、配列番号１４６〜配列番号１５０、配列番号１６２〜配列番号１６６、配列番号１７８〜配列番号１８２、配列番号１９９〜配列番号２０３、配列番号２０６〜配列番号２１０、配列番号２３０〜配列番号２３４、および配列番号２３８〜配列番号２４２のうちの任意のアミノ酸配列を含む、項目１に記載のＦＧＦＲ融合タンパク質。
（項目１１） 上記融合タンパク質がネイティブリーダー配列を欠く、項目１０に記載のＦＧＦＲ融合タンパク質。
（項目１２） 上記Ｆｃポリペプチドが配列番号１７１〜配列番号１７３のうちの任意のアミノ酸配列を含む、項目１０に記載のＦＧＦＲ融合タンパク質。
（項目１３） ＣＨＯ細胞または２９３細胞中で産生されたＦＧＦＲ融合タンパク質であって、該ＦＧＦＲ融合タンパク質は、ＦＧＦＲポリペプチドの細胞外ドメインまたはその改変体と融合パートナーとを含む第１のポリペプチドを含み、該ＦＧＦＲ融合タンパク質は１つまたは複数のＦＧＦリガンドに結合することができる、ＦＧＦＲ融合タンパク質。（項目１４） 上記ＦＧＦＲ融合タンパク質が、配列番号１００、配列番号９５〜配列番号９９、配列番号１０２〜配列番号１２６、配列番号１５６〜配列番号１５７、配列番号１６２〜配列番号１６６、配列番号１７６〜配列番号１８２、配列番号１９８〜配列番号２０２、配列番号２０５〜配列番号２１０、配列番号２２８〜配列番号２３４、および配列番号２３６〜配列番号２４２のうちの任意のアミノ酸配列を含む、項目１３に記載のＦＧＦＲ融合タンパク質。
（項目１５） 上記融合タンパク質がネイティブリーダー配列を欠く、項目１３に記載のＦＧＦＲ融合タンパク質。
（項目１６） 上記融合タンパク質はＣＨＥＦ発現系を用いて産生させる、項目１３に記載のＦＧＦＲ融合タンパク質。
（項目１７） 医薬品として使用するための、項目１から１６のいずれか一項に記載のＦＧＦＲ融合タンパク質。
（項目１８） 有効量の項目１から１７のいずれかに記載のＦＧＦＲ融合タンパク質および薬学的に許容される担体を含む組成物。
（項目１９） 項目１８の組成物を容器中に含み、そして該組成物を必要としている対象へ投与するための指示書を含む、キット。
（項目２０） 上記組成物が単一または複数用量のＦＧＦＲ融合タンパク質を含む、項目１９に記載のキット。
（項目２１） 項目１から１７のいずれかに記載のＦＧＦＲ融合タンパク質をコードしているポリヌクレオチドを含む、核酸分子。
（項目２２） 項目２１に記載の核酸分子と、該核酸分子の発現を制御するプロモーターとを含む、ベクター。
（項目２３） 宿主細胞と、項目１から１６のいずれかに記載のＦＧＦＲ融合タンパク質、項目２１に記載の核酸分子、または項目２２に記載のベクターとを含む、組換え宿主細胞。
（項目２４） 上記宿主細胞が真核細胞である、項目２３に記載の組換え宿主細胞。
（項目２５） 上記真核細胞がＣＨＯまたは２９３系統のものである、項目２４に記載の組換え宿主細胞。
（項目２６） 項目２４に記載の組換え宿主細胞から発現された、ポリペプチド。
（項目２７） （ａ）項目２３から２５のいずれかに記載の組換え宿主細胞を提供すること；および
（ｂ）ＦＧＦＲ融合タンパク質を発現させるための組換え宿主細胞を培養すること を含む、ＦＧＦＲ融合タンパク質の産生方法。
（項目２８） 上記ＦＧＦＲ融合タンパク質を上記細胞培養物から単離することをさらに含む、項目２７に記載の方法。
（項目２９） 上記ＦＧＦＲ融合タンパク質の単離が、発現させたＦＧＦＲ融合タンパク質をアフィニティーマトリックスと接触させることを含む、項目２８に記載の方法。
（項目３０） 上記アフィニティーマトリックスが、プロテインＡ、プロテインＧ、プロテインＡ／Ｇ、抗Ｆｃ抗体、および抗ＦＧＦＲ抗体の少なくとも１つを含む、項目２９に記載の方法。
（項目３１） 上記ＦＧＦＲ融合タンパク質の単離が、該ＦＧＦＲ融合タンパク質を疎水性マトリックスと接触させることをさらに含む、項目２８から３０のいずれかに記載の方法。
（項目３２） 対象においてＦＧＦＲ発現のレベルを検出する方法であって、
（ａ）ＦＧＦＲに対するリガンドを提供すること；
（ｂ）該対象から組織試料を提供すること；
（ｃ）特異的ＦＧＦＲ結合を可能にする条件下で該リガンドと該試料とを相互作用させること；
（ｄ）該特異的結合を測定すること；および
（ｅ）特異的結合の量を対照試料での量と比較すること
を含み、該リガンドがＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３、ＦＧＦＲ４、およびこれらの任意の断片のうちの少なくとも１つと結合する、方法。
（項目３３） 上記組織試料が血液、血清、または血漿試料を含む、項目３２に記載の方法。
（項目３４） 上記組織試料が患部組織の試料を含む、項目３２に記載の方法。
（項目３５） 上記組織試料が腫瘍組織を含む、項目３２に記載の方法。
（項目３６） 上記試験がタンパク質−抗体の結合もしくは競合アッセイ、または核酸ハイブリダイゼーションアッセイを含む、項目３２に記載の方法。
（項目３７） 対象においてＦＧＦ発現のレベルを検出する方法であって、
（ａ）ＦＧＦＲまたはその断片を提供すること；
（ｂ）該対象から組織試料を提供すること；
（ｃ）特異的ＦＧＦ結合を許容する条件下で該リガンドと該試料とを相互作用させること；
（ｄ）特異的結合を測定すること；および
（ｅ）特異的結合の量を対照試料での量と比較すること
を含み、該ＦＧＦＲまたはその断片がＦＧＦに結合する、方法。
（項目３８） 上記ＦＧＦが、ＦＧＦ−１、ＦＧＦ−２、ＦＧＦ−３、ＦＧＦ−４、ＦＧＦ−５、ＦＧＦ−６、ＦＧＦ−７、ＦＧＦ−８、ＦＧＦ−９、ＦＧＦ−１０、ＦＧＦ−１６、ＦＧＦ−１７、ＦＧＦ−１８、ＦＧＦ−１９、またはＦＧＦ−２０のうちの少なくとも１つである、項目３７に記載の方法。
（項目３９） 増殖性細胞の生存度または増殖をｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｉｎ ｖｉｖｏ、またはｅｘ ｖｉｖｏで阻害する方法であって、
（ａ）項目１８に記載の組成物を提供すること；および
（ｂ）該増殖性細胞を、該増殖性細胞の生存度または増殖を阻害するために有効な量の該組成物と接触させること
を含む、方法。
（項目４０） 対象内に増殖性細胞が存在し、該対象は正常よりも高いレベルで１つまたは複数のＦＧＦリガンドを発現している、項目３９に記載の方法。
（項目４１） 上記対象の組織が正常よりも高いレベルでＦＧＦリガンドを発現する、項目４０に記載の方法。
（項目４２） 結合相互作用を実時間で測定することによって決定した場合に、上記ＦＧＦリガンドがＦＧＦＲ１−Ｆｃ、ＦＧＦＲ２−Ｆｃ、ＦＧＦＲ３−Ｆｃ、もしくはＦＧＦＲ４−Ｆｃ、またはこれらの任意の改変体のうちの少なくとも１つに結合する、項目４１に記載の方法。
（項目４３） 上記ＦＧＦリガンドはＦＧＦ−１、ＦＧＦ−２、ＦＧＦ−３、ＦＧＦ−４、ＦＧＦ−５、ＦＧＦ−６、ＦＧＦ−８、ＦＧＦ−９、ＦＧＦ−１６、ＦＧＦ−１７、ＦＧＦ−１８、ＦＧＦ−１９およびＦＧＦ−２０から選択される、項目４２に記載の方法。（項目４４） 対象内に増殖性細胞が存在し、該対象は正常よりも高いレベルでＦＧＦＲポリペプチドを発現する、項目３９に記載の方法。
（項目４５） 上記対象内の組織が正常よりも高いレベルのＦＧＦＲポリペプチドを発現する、項目４４に記載の方法。
（項目４６） 上記ＦＧＦＲポリペプチドがＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３、またはＦＧＦＲ４を含む、項目４４に記載の方法。
（項目４７） 上記増殖性細胞が癌細胞、異形成細胞、および／または内皮細胞である、項目３９から４６のいずれかに記載の方法。
（項目４８） 上記増殖性細胞が、乳房細胞、膵臓細胞、前立腺細胞、肺細胞、卵巣細胞、腎細胞、脳細胞、結腸直腸細胞、網膜細胞、または表５〜表１１から選択されるものを含む、項目４７に記載の方法。
（項目４９） 上記対象が正常よりも高いレベルのＦＧＦリガンドを発現する、項目４４に記載の方法。
（項目５０） 対象において癌を治療する方法であって、
（ａ）項目１から１７のいずれかに記載のＦＧＦＲ融合タンパク質を提供すること；および
（ｂ）癌を治療するために有効量の該ＦＧＦＲ融合タンパク質を該対象に投与することを含む、方法。
（項目５１） 上記癌が、ＦＧＦリガンドによる増殖刺激に依存するかまたはそれに応答性である細胞の少なくとも１つの部分集団を含む、項目５０に記載の方法。
（項目５２） 上記癌が、成長のための血管の生成のために血管新生因子に依存するかまたはそれに応答性である細胞の少なくとも１つの部分集団を含む、項目５０に記載の方法。
（項目５３） 上記癌が、ＶＥＧＦシグナル伝達経路の阻害に対して耐性である、項目５０に記載の方法。
（項目５４） 上記癌が転移性の癌を含む、項目５０に記載の方法。
（項目５５） 上記癌が血液癌を含む、項目５０に記載の方法。
（項目５６） 上記血液癌が慢性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、または有毛細胞白血病を含む、項目５５に記載の方法。
（項目５７） 上記癌が固形腫瘍を含む、項目５５に記載の方法。
（項目５８） 上記癌が乳癌、膵臓癌、下垂体癌、前立腺癌、肺癌、卵巣癌、腎細胞癌、口内扁平細胞癌、結腸直腸癌、膀胱癌、網膜癌、脳癌、または表５〜表１１に記載の癌を含む、項目５７に記載の方法。
（項目５９） 上記癌が骨転移を含む、項目５４に記載の方法。
（項目６０） 第２の抗癌治療剤を上記対象に投与することをさらに含む、項目５０に記載の方法。
（項目６１） 上記第２の抗癌治療剤が細胞分裂抑制剤、細胞毒性剤、または抗血管形成性剤を含む、項目６０に記載の方法。
（項目６２） 上記第２の抗癌治療剤が第２のＦＧＦＲ融合タンパク質、ＰＤＧＦシグナル伝達の阻害剤、ＶＥＧＦシグナル伝達の阻害剤、またはＥＧＦシグナル伝達の阻害剤を含む、項目６０に記載の方法。
（項目６３） 上記第２の抗癌治療剤を、上記ＦＧＦＲ融合タンパク質を投与する前、後、またはそれと同時に投与する、項目６０に記載の方法。
（項目６４） 対象において血管形成を阻害する方法であって、
（ａ）項目１から１７のいずれかに記載のＦＧＦＲ融合タンパク質を提供すること；および
（ｂ）血管形成を阻害するために有効な量の該ＦＧＦＲ融合タンパク質を対象に投与すること
を含む、方法。
（項目６５） 第２の治療剤を上記対象に投与することをさらに含む、項目６４に記載の方法。
（項目６６） 上記第２の治療剤が細胞分裂抑制剤、細胞毒性剤、または第２の抗血管形成剤を含む、項目６５に記載の方法。
（項目６７） 上記対象を黄斑変性症について治療する、項目６４または６５に記載の方法。
（項目６８） 上記対象を癌について治療する、項目６４または６５に記載の方法。
（項目６９） 上記第２の治療剤が抗癌剤を含む、項目６５に記載の方法。
（項目７０） 上記抗癌治療剤が第２のＦＧＦＲ融合タンパク質、ＰＤＧＦシグナル伝達の阻害剤、ＶＥＧＦシグナル伝達の阻害剤、ＥＧＦシグナル伝達の阻害剤、抗体、またはｓｉＲＮＡを含む、項目６９に記載の方法。
（項目７１） 上記対象は、Ａｖａｓｔｉｎ（登録商標）で治療されたかまたは治療中である、項目６４に記載の方法。
（項目７２） 上記組成物は静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、局所投与、経口投与、腹腔内投与、眼窩内投与、移植による投与、吸入による投与、くも膜下腔内投与、脳室内投与、および／または鼻腔内投与される、項目３９、５０、または６４のいずれかに記載の方法。
（項目７３） 上記抗癌治療剤が手術、化学療法、放射線療法、および／または別の生物剤の投与を含む、項目６９に記載の方法。
（項目７４） 増殖性疾患を治療する医薬品を製造するための、項目１から１７のいずれか一項に記載のＦＧＦＲ融合タンパク質の使用。
（項目７５） 上記疾患が癌または黄斑変性症を含む、項目７４に記載のＦＧＦＲ融合タンパク質の使用。
（項目７６） 上記癌が血液癌または固形癌を含む、項目７５に記載のＦＧＦＲ融合タンパク質の使用。
（項目７７） 上記癌が、乳癌、膵臓癌、下垂体癌、前立腺癌、肺癌、卵巣癌、腎臓癌、口腔癌、結腸直腸癌、膀胱癌、網膜癌、脳癌または表５〜表１１で同定した癌を含む、項目７５に記載のＦＧＦＲ融合タンパク質の使用。
（項目７８） 癌を治療するために同時に、別々に、または逐次的に使用する合わせた調製物として、項目１から１７のいずれか一項に記載のＦＧＦＲ融合タンパク質および少なくとも１つの抗癌治療剤を含む製品。
本明細書に組み込まれており、その一部を構成する添付の図面は、本発明に一致したいくつかの実施形態を例示する。これらは、記述と一緒に本発明の原理を説明する役割を果たすが、本発明を限定しない。
図１Ａは、７個のＦＧＦＲアイソフォーム、すなわちＦＧＦＲ３−ＩＩＩｂ、ＦＧＦＲ３−ＩＩＩｃ、ＦＧＦＲ１−ＩＩＩｂ、ＦＧＦＲ１−ＩＩＩｃ、ＦＧＦＲ２−ＩＩＩｂ、ＦＧＦＲ２−ＩＩＩｃ、およびＦＧＦＲ４の細胞外および膜貫通ドメインの一部分のアミノ酸配列のアラインメントを示す図であり、免疫グロブリン（Ｉｇ）ＩＩＩドメイン、ＦＧＦＲ１突然変異体Ｒ１Ｍｕｔ１、Ｒ１Ｍｕｔ２、Ｒ１Ｍｕｔ３、Ｒ１Ｍｕｔ４、およびＲ１Ｍｕｔ５改変体の切断位置、ならびに融合タンパク質のＦｃ部分の位置を示す。 図１Ｂは、図１Ａと同じアミノ酸配列のアラインメントを示す図であり、ＦＧＦＲ１突然変異体Ｒ１Ｍｕｔ６、Ｒ１Ｍｕｔ７、Ｒ１Ｍｕｔ８、Ｒ１Ｍｕｔ９およびＲ１Ｍｕｔ１０の位置を示す。 図２は、図１と同じアミノ酸配列のアラインメントを示し、ＦＧＦＲ４突然変異体Ｒ４Ｍｕｔ１、Ｒ４Ｍｕｔ２、Ｒ４Ｍｕｔ３、Ｒ４Ｍｕｔ４、Ｒ４Ｍｕｔ５、およびＲ４Ｍｕｔ６の切断位置を示す。 図３Ａは、Ｒ１Ｍｕｔ１、Ｒ１Ｍｕｔ２、Ｒ１Ｍｕｔ３、Ｒ１Ｍｕｔ４、およびＲ１Ｍｕｔ５が、親ＦＧＦＲ１−ＩＩＩｃ−ＦｃよりもＭＭＰ−２によるタンパク質分解的切断に対する耐性を有することを実証するウェスタンブロットを示す図である。 図３Ｂは、Ｒ１Ｍｕｔ４が、親ＦＧＦＲ１−ＩＩＩｃ−Ｆｃと比較して、ＭＭＰ−２による切断に対してより高い耐性を有することを実証する定量的ウェスタンブロットを示す図である。ＦＧＦＲ１−ＩＩＩｃ−Ｆｃの定量的標準物質を左側に示し、ＦＧＦＲ１−ＩＩＩｃ−ＦｃおよびＲ１Ｍｕｔ４からの細胞培地を右側に示す。 図４は、Ｒ４Ｍｕｔ１、Ｒ４Ｍｕｔ２、Ｒ４Ｍｕｔ３、Ｒ４Ｍｕｔ４、およびＲ４Ｍｕｔ５が、完全長の親ＦＧＦＲ４−ＦｃよりもＭＭＰ−２によるタンパク質分解的切断に対する耐性を有していたことを実証するウェスタンブロットを示す図である。 図５Ａは、ＯＤ４５０における変化を測定することによって漸増濃度（ｕｇ／ｍｌ）のＦＧＦＲ４突然変異体とＦＧＦ−１との結合を測定する、競合ＥＬＩＳＡアッセイを示す図である。Ｒ４Ｍｕｔ１、Ｒ４Ｍｕｔ２、Ｒ４Ｍｕｔ３、Ｒ４Ｍｕｔ４、Ｒ４Ｍｕｔ５、およびＲ４Ｍｕｔ６はそれぞれ、ＦＧＦ−１に対して親ＦＧＦＲ４−Ｆｃよりも高い親和性を有するが、ヒトＩｇＧはＦＧＦ−１と結合しなかった。 図５Ｂは、ＯＤ４５０における変化を測定することによって漸増濃度（ｕｇ／ｍｌ）のＦＧＦＲ４突然変異体とＦＧＦ−２との結合を測定する、競合ＥＬＩＳＡアッセイを示す図である。Ｒ４Ｍｕｔ１、Ｒ４Ｍｕｔ２、Ｒ４Ｍｕｔ３、Ｒ４Ｍｕｔ４、およびＲ４Ｍｕｔ５はそれぞれ、ＦＧＦ−２に対して親ＦＧＦＲ４−Ｆｃよりも高い親和性を有するが、ヒトＩｇＧはＦＧＦ−２と結合しなかった。 図５Ｃは、ＯＤ４５０における変化を測定することによって漸増濃度（ｕｇ／ｍｌ）のＦＧＦＲ４突然変異体とＦＧＦ−８ｂとの結合を測定する、競合ＥＬＩＳＡアッセイを示す図である。Ｒ４Ｍｕｔ１、Ｒ４Ｍｕｔ２、Ｒ４Ｍｕｔ３、Ｒ４Ｍｕｔ４、Ｒ４Ｍｕｔ５、およびＲ４Ｍｕｔ６はそれぞれ、ＦＧＦ−８ｂに対して親ＦＧＦＲ４−Ｆｃよりも高い親和性を有するが、ヒトＩｇＧはＦＧＦ−１と結合しなかった。 図６は、ＯＤ４５０における変化を測定することによって漸増濃度（ｕｇ／ｍｌ）のＦＧＦＲ４突然変異体とＦＧＦ−２との結合を測定する、直接ＥＬＩＳＡアッセイを示す図である。Ｒ１Ｍｕｔ１、Ｒ１Ｍｕｔ２、Ｒ１Ｍｕｔ３、およびＲ１Ｍｕｔ４は親ＦＧＦＲ１−ＩＩＩｃ−Ｆｃと同等またはそれ以上にＦＧＦ−２と結合することができたが、Ｒ１Ｍｕｔ５はそうではなかった。 図７は、２９３−６Ｅ細胞またはＣＨＯ細胞のどちらか内で産生させた漸増濃度（ｕｇ／ｍｌ）のＦＧＦＲ４融合タンパク質とＦＧＦ−２との結合を測定する、競合ＥＬＩＳＡアッセイを示す図である。２９３−６ＥまたはＣＨＯ宿主細胞のどちらかによって産生させたＦＧＦＲ−ＩＩＩｃ−Ｆｃは、ＦＧＦ−２をほぼ同程度に結合および捕捉することができたが、ヒトＩｇＧはＦＧＦ−２に結合することができなかった。 図８Ａは、どちらもＤＧ４４宿主細胞によって産生させた漸増濃度（ｕｇ／ｍｌ）の親ＦＧＦＲ−ＩＩＩｃ−ＦｃとＲ１Ｍｕｔ４との結合を測定する、競合ＥＬＩＳＡアッセイで、ＦＧＦ−１をほぼ同程度に結合および捕捉することができたことを示す図である。ヒトＩｇＧはＦＧＦ−１に結合することができなかった。 図８Ｂは、どちらもＤＧ４４宿主細胞によって産生させた漸増濃度（ｕｇ／ｍｌ）の親ＦＧＦＲ−ＩＩＩｃ−ＦｃとＲ１Ｍｕｔ４との結合を測定する、競合ＥＬＩＳＡアッセイで、ＦＧＦ−２をほぼ同程度に結合および捕捉することができたことを示す図である。ヒトＩｇＧはＦＧＦ−２に結合することができなかった。 図９は、どちらもＤＧ４４宿主細胞によって産生させた漸増濃度（ｕｇ／ｍｌ）の親ＦＧＦＲ−ＩＩＩｃ−ＦｃとＲ１Ｍｕｔ４との結合を測定する、競合ＥＬＩＳＡアッセイで、ＦＧＦ−８ｂをほぼ同程度に結合および捕捉することができたことを示す図である。ヒトＩｇＧはＦＧＦ−８ｂに結合することができなかった。 図１０は、漸増濃度（ｕｇ／ｍｌ）の親ＦＧＦＲ１−ＩＩＩｃ−Ｆｃ、ＦＧＦＲ３−ＩＩＩｃ−Ｆｃ、およびＦＧＦＲ４−Ｆｃが、ＦＧＦ−１とＦＧＦＲ１−ＩＩＩｃ−Ｆｃとの結合を阻害する能力を測定する、競合ＥＬＩＳＡアッセイを示す図である。 図１１は、親ＦＧＦＲ１−ＩＩＩｃ−Ｆｃ、ＦＧＦＲ３−ＩＩＩｃ−Ｆｃ、およびＦＧＦＲ４−Ｆｃが、ＦＧＦ−２とＦＧＦＲ１−ＩＩＩｃ−Ｆｃとの結合を阻害する能力を測定する、図１０に記載の競合ＥＬＩＳＡアッセイを示す図である。 図１２は、ＦＧＦＲ１−ＩＩＩｃ−Ｆｃ、ＦＧＦＲ３−ＩＩＩｃ−Ｆｃ、およびＦＧＦＲ４−Ｆｃが、ＦＧＦ−８とＦＧＦＲ１−ＩＩＩｃ−Ｆｃとの結合を阻害する能力を測定する、図１１に記載の競合ＥＬＩＳＡアッセイを示す図である。 図１３は、２９３細胞またはＣＨＯ細胞によって産生させた漸増濃度（ｕｇ／ｍｌ）の親ＦＧＦＲ１−ＩＩＩｃ−Ｆｃによって誘導されたＯＤ４５０の変化を測定する、競合ｐｈｏｓｐｈｏ−Ｅｒｋ ＥＬＩＳＡアッセイを示す図である。どちらの親構築体もＦＧＦ−２に活性化されたＥｒｋリン酸化を阻害したが、ヒトＩｇＧは阻害することができなかった。 図１４は、漸増濃度（ｕｇ／ｍｌ）の親ＦＧＦＲ１−ＩＩＩｃ−Ｆｃ、Ｒ１Ｍｕｔ４、およびＲ１Ｍｕｔ５によって誘導されたＯＤ４５０の変化を測定する、競合ｐｈｏｓｐｈｏ−Ｅｒｋ ＥＬＩＳＡアッセイを示す図である。親ＦＧＦＲ１−ＩＩＩｃ−ＦｃおよびＲ１Ｍｕｔ４はＦＧＦ−２に活性化されたＥｒｋリン酸化を阻害したが、Ｒ１Ｍｕｔ５またはヒトＩｇＧは阻害しなかった。 図１５は、１０％のＦＣＳ中に１０００個の細胞／ウェルの濃度で植えたＵ２５１悪性膠芽細胞腫細胞の生存度および増殖に対する、２０ｕｇ／ｍｌ、４．０ｕｇ／ｍｌ、および０．８ｕｇ／ｍｌの濃度のＦＧＦＲ１−ＩＩＩｃ−Ｆｃの用量依存性の阻害効果を実証する、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒＧｌｏ（商標）生存度アッセイを示す図である。ヒトＩｇＧは効果がなかった。陽性対照であるＴＲＡＩＬが最大の阻害を誘導した。 図１６は、１．０％のＦＣＳ中に５０００個の細胞／ウェルの濃度で植えたＵ２５１悪性膠芽細胞腫細胞の生存度および増殖に対する、２０ｕｇ／ｍｌ、４．０ｕｇ／ｍｌ、および０．８ｕｇ／ｍｌの濃度のＦＧＦＲ１−ＩＩＩｃ−Ｆｃの用量依存性の阻害効果を実証する、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒＧｌｏ（商標）生存度アッセイを示す図である。ヒトＩｇＧは効果がなかった。陽性対照であるＴＲＡＩＬが最大の阻害を誘導した。 図１７は、０．１％のＦＣＳ中に１０，０００個の細胞／ウェルの濃度で植えたＵ２５１悪性膠芽細胞腫細胞の生存度および増殖に対する、２０ｕｇ／ｍｌ、４．０ｕｇ／ｍｌ、および０．８ｕｇ／ｍｌの濃度のＦＧＦＲ１−ＩＩＩｃ−Ｆｃの用量依存性の阻害効果を実証する、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒＧｌｏ（商標）生存度アッセイを示す図である。ヒトＩｇＧは効果がなかった。陽性対照であるＴＲＡＩＬが最大の阻害を誘導した。 図１８は、ＦＧＦＲ１−ＩＩＩｃ−Ｆｃによるその生存度および増殖の阻害に対するその感度について試験した癌細胞系を示す図である。その悪性疾患の起源およびＦＧＦＲ１−ＩＩＩｃ−Ｆｃに対するその感度を示す。 図１９は、Ａ５４９肺癌細胞の生存度および増殖に対するＦＧＦＲ１−ＩＩＩｃ−ＦｃおよびＦＧＦＲ４−Ｆｃの両方の用量依存性の阻害効果を実証する、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒＧｌｏ（商標）生存度アッセイを示す図である。 図２０は、腫瘍細胞系由来の腫瘍細胞の生存度および増殖に対するＦＧＦＲ１−ＩＩＩｂ−Ｆｃ、ＦＧＦＲ１−ＩＩＩｃ−Ｆｃ、ＦＧＦＲ２−ＩＩＩｂ−Ｆｃ、ＦＧＦＲ２−ＩＩＩｃ−Ｆｃ、ＦＧＦＲ３−ＩＩＩｂ−Ｆｃ、ＦＧＦＲ３−ＩＩＩｃ−Ｆｃ、およびＦＧＦＲ４−Ｆｃの阻害効果を比較しており、融合タンパク質（治療タンパク質（ｕｇ／ｍｌ））の濃度の増加に伴う阻害（％阻害）の増加を示す図である。データは、Ａ５４９細胞（図２０Ａ）、Ｕ１１８細胞（図２０Ｂ）、Ｕ２５１細胞（図２０Ｃ）、ＳＦ２６８細胞（図２０Ｄ）、Ｔ４７Ｄ細胞（図２０Ｅ）、およびＣａｋｉ−１細胞（図２０Ｆ）について示した。図２０Ｇでは、Ａ５４９細胞およびＵ２５１細胞の生存度および増殖に対する親ＦＧＦＲ１−ＩＩＩｃおよびＲ１Ｍｕｔ４の濃度依存性の阻害効果が示されているが、Ｒ１Ｍｕｔ５では示されていない。 図２０は、腫瘍細胞系由来の腫瘍細胞の生存度および増殖に対するＦＧＦＲ１−ＩＩＩｂ−Ｆｃ、ＦＧＦＲ１−ＩＩＩｃ−Ｆｃ、ＦＧＦＲ２−ＩＩＩｂ−Ｆｃ、ＦＧＦＲ２−ＩＩＩｃ−Ｆｃ、ＦＧＦＲ３−ＩＩＩｂ−Ｆｃ、ＦＧＦＲ３−ＩＩＩｃ−Ｆｃ、およびＦＧＦＲ４−Ｆｃの阻害効果を比較しており、融合タンパク質（治療タンパク質（ｕｇ／ｍｌ））の濃度の増加に伴う阻害（％阻害）の増加を示す図である。データは、Ａ５４９細胞（図２０Ａ）、Ｕ１１８細胞（図２０Ｂ）、Ｕ２５１細胞（図２０Ｃ）、ＳＦ２６８細胞（図２０Ｄ）、Ｔ４７Ｄ細胞（図２０Ｅ）、およびＣａｋｉ−１細胞（図２０Ｆ）について示した。図２０Ｇでは、Ａ５４９細胞およびＵ２５１細胞の生存度および増殖に対する親ＦＧＦＲ１−ＩＩＩｃおよびＲ１Ｍｕｔ４の濃度依存性の阻害効果が示されているが、Ｒ１Ｍｕｔ５では示されていない。 図２０は、腫瘍細胞系由来の腫瘍細胞の生存度および増殖に対するＦＧＦＲ１−ＩＩＩｂ−Ｆｃ、ＦＧＦＲ１−ＩＩＩｃ−Ｆｃ、ＦＧＦＲ２−ＩＩＩｂ−Ｆｃ、ＦＧＦＲ２−ＩＩＩｃ−Ｆｃ、ＦＧＦＲ３−ＩＩＩｂ−Ｆｃ、ＦＧＦＲ３−ＩＩＩｃ−Ｆｃ、およびＦＧＦＲ４−Ｆｃの阻害効果を比較しており、融合タンパク質（治療タンパク質（ｕｇ／ｍｌ））の濃度の増加に伴う阻害（％阻害）の増加を示す図である。データは、Ａ５４９細胞（図２０Ａ）、Ｕ１１８細胞（図２０Ｂ）、Ｕ２５１細胞（図２０Ｃ）、ＳＦ２６８細胞（図２０Ｄ）、Ｔ４７Ｄ細胞（図２０Ｅ）、およびＣａｋｉ−１細胞（図２０Ｆ）について示した。図２０Ｇでは、Ａ５４９細胞およびＵ２５１細胞の生存度および増殖に対する親ＦＧＦＲ１−ＩＩＩｃおよびＲ１Ｍｕｔ４の濃度依存性の阻害効果が示されているが、Ｒ１Ｍｕｔ５では示されていない。 図２０は、腫瘍細胞系由来の腫瘍細胞の生存度および増殖に対するＦＧＦＲ１−ＩＩＩｂ−Ｆｃ、ＦＧＦＲ１−ＩＩＩｃ−Ｆｃ、ＦＧＦＲ２−ＩＩＩｂ−Ｆｃ、ＦＧＦＲ２−ＩＩＩｃ−Ｆｃ、ＦＧＦＲ３−ＩＩＩｂ−Ｆｃ、ＦＧＦＲ３−ＩＩＩｃ−Ｆｃ、およびＦＧＦＲ４−Ｆｃの阻害効果を比較しており、融合タンパク質（治療タンパク質（ｕｇ／ｍｌ））の濃度の増加に伴う阻害（％阻害）の増加を示す図である。データは、Ａ５４９細胞（図２０Ａ）、Ｕ１１８細胞（図２０Ｂ）、Ｕ２５１細胞（図２０Ｃ）、ＳＦ２６８細胞（図２０Ｄ）、Ｔ４７Ｄ細胞（図２０Ｅ）、およびＣａｋｉ−１細胞（図２０Ｆ）について示した。図２０Ｇでは、Ａ５４９細胞およびＵ２５１細胞の生存度および増殖に対する親ＦＧＦＲ１−ＩＩＩｃおよびＲ１Ｍｕｔ４の濃度依存性の阻害効果が示されているが、Ｒ１Ｍｕｔ５では示されていない。 図２０は、腫瘍細胞系由来の腫瘍細胞の生存度および増殖に対するＦＧＦＲ１−ＩＩＩｂ−Ｆｃ、ＦＧＦＲ１−ＩＩＩｃ−Ｆｃ、ＦＧＦＲ２−ＩＩＩｂ−Ｆｃ、ＦＧＦＲ２−ＩＩＩｃ−Ｆｃ、ＦＧＦＲ３−ＩＩＩｂ−Ｆｃ、ＦＧＦＲ３−ＩＩＩｃ−Ｆｃ、およびＦＧＦＲ４−Ｆｃの阻害効果を比較しており、融合タンパク質（治療タンパク質（ｕｇ／ｍｌ））の濃度の増加に伴う阻害（％阻害）の増加を示す図である。データは、Ａ５４９細胞（図２０Ａ）、Ｕ１１８細胞（図２０Ｂ）、Ｕ２５１細胞（図２０Ｃ）、ＳＦ２６８細胞（図２０Ｄ）、Ｔ４７Ｄ細胞（図２０Ｅ）、およびＣａｋｉ−１細胞（図２０Ｆ）について示した。図２０Ｇでは、Ａ５４９細胞およびＵ２５１細胞の生存度および増殖に対する親ＦＧＦＲ１−ＩＩＩｃおよびＲ１Ｍｕｔ４の濃度依存性の阻害効果が示されているが、Ｒ１Ｍｕｔ５では示されていない。 図２０は、腫瘍細胞系由来の腫瘍細胞の生存度および増殖に対するＦＧＦＲ１−ＩＩＩｂ−Ｆｃ、ＦＧＦＲ１−ＩＩＩｃ−Ｆｃ、ＦＧＦＲ２−ＩＩＩｂ−Ｆｃ、ＦＧＦＲ２−ＩＩＩｃ−Ｆｃ、ＦＧＦＲ３−ＩＩＩｂ−Ｆｃ、ＦＧＦＲ３−ＩＩＩｃ−Ｆｃ、およびＦＧＦＲ４−Ｆｃの阻害効果を比較しており、融合タンパク質（治療タンパク質（ｕｇ／ｍｌ））の濃度の増加に伴う阻害（％阻害）の増加を示す図である。データは、Ａ５４９細胞（図２０Ａ）、Ｕ１１８細胞（図２０Ｂ）、Ｕ２５１細胞（図２０Ｃ）、ＳＦ２６８細胞（図２０Ｄ）、Ｔ４７Ｄ細胞（図２０Ｅ）、およびＣａｋｉ−１細胞（図２０Ｆ）について示した。図２０Ｇでは、Ａ５４９細胞およびＵ２５１細胞の生存度および増殖に対する親ＦＧＦＲ１−ＩＩＩｃおよびＲ１Ｍｕｔ４の濃度依存性の阻害効果が示されているが、Ｒ１Ｍｕｔ５では示されていない。 図２０は、腫瘍細胞系由来の腫瘍細胞の生存度および増殖に対するＦＧＦＲ１−ＩＩＩｂ−Ｆｃ、ＦＧＦＲ１−ＩＩＩｃ−Ｆｃ、ＦＧＦＲ２−ＩＩＩｂ−Ｆｃ、ＦＧＦＲ２−ＩＩＩｃ−Ｆｃ、ＦＧＦＲ３−ＩＩＩｂ−Ｆｃ、ＦＧＦＲ３−ＩＩＩｃ−Ｆｃ、およびＦＧＦＲ４−Ｆｃの阻害効果を比較しており、融合タンパク質（治療タンパク質（ｕｇ／ｍｌ））の濃度の増加に伴う阻害（％阻害）の増加を示す図である。データは、Ａ５４９細胞（図２０Ａ）、Ｕ１１８細胞（図２０Ｂ）、Ｕ２５１細胞（図２０Ｃ）、ＳＦ２６８細胞（図２０Ｄ）、Ｔ４７Ｄ細胞（図２０Ｅ）、およびＣａｋｉ−１細胞（図２０Ｆ）について示した。図２０Ｇでは、Ａ５４９細胞およびＵ２５１細胞の生存度および増殖に対する親ＦＧＦＲ１−ＩＩＩｃおよびＲ１Ｍｕｔ４の濃度依存性の阻害効果が示されているが、Ｒ１Ｍｕｔ５では示されていない。 図２１は、それぞれＦＧＦＲ１−ＩＩＩｂ−Ｆｃ、ＦＧＦＲ１−ＩＩＩｃ−Ｆｃ、ＦＧＦＲ２−ＩＩＩｂ−Ｆｃ、ＦＧＦＲ２−ＩＩＩｃ−Ｆｃ、ＦＧＦＲ３−ＩＩＩｂ−Ｆｃ、ＦＧＦＲ３−ＩＩＩｃ−Ｆｃ、およびＦＧＦＲ４−Ｆｃによって誘導されたＡ５４９、Ｕ１１８、Ｕ２５１、ＳＦ２６８、Ｔ４７Ｄ、およびＣａｋｉ−１腫瘍細胞の生存度および増殖の％阻害を示すことによって、図２０に示された結果の概要を示す図である。 図２２は、直接ＥＬＩＳＡアッセイによって測定し、注射後約４５日間監視した、水力学的尾静脈注射法を用いてＦＧＦＲ１−ＩＩＩｃ−Ｆｃをコードしている「ミニサークル」ベクターｃＤＮＡを注射した３匹のマウスの血清中のＦＧＦＲ１−ＩＩＩｃ−Ｆｃ（ｕｇ／ｍｌ）の濃度を示す図である。 図２３は、定量的競合ＥＬＩＳＡアッセイによって測定した、対照マウス由来の血清と比較した、水力学的尾静脈注射法を用いてＦＧＦＲ１−ＩＩＩｃ−Ｆｃをコードしている「ミニサークル」ベクターｃＤＮＡを注射したマウスの血清中の、機能的な循環ＦＧＦＲ１−ＩＩＩｃ−Ｆｃの存在を示す図である。 図２４は、注射後２日目および７日目の定量的競合ＥＬＩＳＡアッセイによって測定した、水力学的尾静脈注射法を用いてＲ１Ｍｕｔ４をコードしている「ミニサークル」ベクターｃＤＮＡを注射したマウスによる、４匹のマウスのそれぞれの血清中の機能的な循環Ｒ１Ｍｕｔ４の血清濃度を示す図である。 図２５は、マウスに水力学的尾静脈注射法を用いてＦＧＦＲ１−ＩＩＩｃ−Ｆｃをコードしている「ミニサークル」ベクターｃＤＮＡを注射した腫瘍成長のｉｎ ｖｉｖｏ異種移植マウスモデルにおける、Ｃａｋｉ−１腫瘍成長に対するＦＧＦＲ１−ＩＩＩｃ−Ｆｃの阻害効果を示す図である。腫瘍体積は、生理食塩水よりもＦＧＦＲ１−ＩＩＩｃ−Ｆｃで治療した動物で、よりゆっくりと増加した。 図２６は、対照マウスの血清と比較して、２９３細胞またはＣＨＯ細胞から産生させた精製ＦＧＦＲ１−ＩＩＩｃ−Ｆｃを注射した５分間、３０分間、２４時間、４８時間、および７２時間後にマウスから採取した血清のウェスタンブロットを示す図である。ブロットは抗ヒトＦｃ抗体に対して免疫反応性を示し、ＣＨＯ細胞由来のＦＧＦＲ１−ＩＩＩｃ−Ｆｃはより長く循環中に持続し（注射後７２時間を超える）、したがって、ｉｎ ｖｉｖｏで、２４時間後に検出不可能であった２９３−６Ｅ細胞由来のＦＧＦＲ１−ＩＩＩｃ−Ｆｃよりも安定であったことを実証している。 図２７は、２９３−６Ｅ細胞（上部パネル）およびＣＨＯ細胞（下部パネル）から発現させたＦＧＦＲ１−ＩＩＩｃ−ＦｃのＮ標識したグリカンのクロマトグラフィー分析を示す図である。 図２８は、定量的直接ＥＬＩＳＡによって検出した、ＦＧＦＲ１−ＩＩＩｃ−Ｆｃタンパク質の注射後２５日間測定した、マウス血清中のＦＧＦＲ１−ＩＩＩｃ−Ｆｃの量を示す図である。 図２９は、定量的ＦＧＦ−２競合ＥＬＩＳＡアッセイによって測定した、ＦＧＦＲ１−ＩＩＩｃ−Ｆｃタンパク質を注射した３０分、５時間、１日、２日、３日、４日、５日、７日、１４日、および２５日後にマウス血清中に存在する機能的ＦＧＦＲ１−ＩＩＩｃ−Ｆｃの量を示す図である。機能的ＦＧＦＲ１−ＩＩＩｃ−Ｆｃの減少は、血清体積（ｕｌ）の増加の結果生じるＯＤ４５０の低下として測定される。機能的ＦＧＦＲ１−ＩＩＩｃ−Ｆｃは、ＦＧＦＲ１−ＩＩＩｃ−Ｆｃの注射後１４日間を超えてマウス血清中に残存する。 図３０Ａは、ＦＧＦＲ１−ＩＩＩｃ−Ｆｃ融合タンパク質を静脈内注射した腫瘍成長のｉｎ ｖｉｖｏ異種移植マウスモデルにおける、Ｃａｋｉ−１腫瘍成長に対する３つの濃度のＦＧＦＲ１−ＩＩＩｃ−Ｆｃの阻害効果を示す図である。 図３０Ｂは、図３０Ａに記載のように、Ｃａｋｉ−１腫瘍成長に対するＦＧＦＲ１−ＩＩＩｃ−Ｆｃの濃度依存性の阻害効果およびＲ１Ｍｕｔ４の阻害効果を示す図である。 図３１は、ＦＧＦＲ１−ＩＩＩｃ−ＦｃまたはＲ１Ｍｕｔ４タンパク質のどちらかを注射した、注射後４時間、３日、および７日後のマウス由来の血清の、抗ヒトＦｃ抗体を用いてブロットを行い、ＦＧＦＲ１−ＩＩＩｃ−Ｆｃ標準物質の組と比較した、定量的ウェスタンブロットを示す図である。ＦＧＦＲ１−ＩＩＩｃ−ＦｃおよびＲ１Ｍｕｔ４はどちらも、ＦＧＦＲ１−ＩＩＩｃ−ＦｃまたはＲ１Ｍｕｔ４をコードしている「ミニサークル」ベクターｃＤＮＡを水力学的尾静脈注射によって注射した後少なくとも約７日日間まで、マウス中にｉｎ ｖｉｖｏで安定であった。 図３２は、表面プラズモン共鳴によって測定した、ＦＧＦＲ１−ＩＩＩｃ−ＦｃおよびＲ１Ｍｕｔ４とＦＧＦ−１、ＦＧＦ−２、ＦＧＦ−４、およびＦＧＦ−５との実時間のリガンド結合プロフィールを示す図である。
（定義）
本明細書中で用いた用語はその通常の意味をもち、より具体的には以下に記載の意味、また本明細書の文脈においてさらに理解することができる意味をもつ。
用語「核酸分子」および「ポリヌクレオチド」とは、ゲノムやｃＤＮＡであれ、ｃＲＮＡやアンチセンスＲＮＡであれ、ＤＮＡ；ＲＮＡ；ＲＮＡｉ；ｓｉＲＮＡなどのヌクレオチドのポリマーをいうために互換性があるように使用してよく、天然または非天然の核酸もしくはポリヌクレオチドまたはその活性断片を含み得る。
用語「ポリペプチド」および「タンパク質」は、天然または非天然のアミノ酸残基を含むアミノ酸残基のポリマーをいうために互換性があるように使用し、最小の長さには限定されない。したがって、ペプチド、オリゴペプチド、二量体、多量体などが本定義内に含まれる。完全長のタンパク質およびその断片はどちらも本定義に包含される。これらの用語には、例えば、グリコシル化、シアリル化、アセチル化、およびリン酸化を含めたポリペプチドの翻訳後修飾も含まれる。さらに、本明細書における「ポリペプチド」とは、タンパク質が所望の活性を保つ限り、ネイティブ配列の単一または複数のアミノ酸残基の欠失、付加、および置換などの修飾タンパク質もいう。例えば、単一の反応性システインを排除するためもしくはジスルフィド結合を除去するために１個のセリン残基を置換してもよく、または切断部位を排除するために保存的アミノ酸置換を行ってもよい。これらの修飾は、部位特異的突然変異誘発によるものなどの意図的な修飾、またはタンパク質を産生させる宿主の突然変異もしくはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅が原因の誤りによるものなどの偶然の修飾であり得る。
「細胞外ドメイン」（「ＥＣＤ」）とは、膜貫通ドメインを越えて細胞外空間内へと伸びる、ポリペプチドの一部分である。本明細書中で使用する用語「細胞外ドメイン」は、完全な細胞外ドメインを含むか、または１つもしくは複数のアミノ酸を欠く切断された細胞外ドメインを含み得る。ＦＧＦＲの細胞外ドメイン（以下に定義）は１つまたは複数のＦＧＦに結合する。細胞外ドメインの組成は、どのアミノ酸が膜中に存在するのかを決定するために用いるアルゴリズムに依存し得る。所定のＦＧＦＲについて、異なるアルゴリズムは異なる細胞外ドメインを予測する場合があり、また、異なる系は異なる細胞外ドメインを発現する場合がある。例えば、チロシン（Ｙ）残基は、細胞外ドメインの決定に用いた方法次第で膜貫通ドメイン中の最初のアミノ酸残基または細胞外ドメインの最後のアミノ酸残基と見なされ得る。
本明細書中で使用する「線維芽細胞成長因子受容体」（ＦＧＦＲ）ポリペプチドとは、すべてのその天然に存在するアイソフォームもしくは対立遺伝子改変体を含めたＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３、またはＦＧＦＲ４の、全体または一部分を含むポリペプチドである。例えば、「ＦＧＦＲ１ポリペプチド」とは、ＦＧＦＲ１−ＩＩＩｂおよびＦＧＦＲ１−ＩＩＩｃなどの既知のＦＧＦＲ１ポリペプチドのうち任意のもののアミノ酸配列を有するポリペプチド、ならびに任意のその断片をいい、米国特許第６，６５６，７２８号；第６，３８４，１９１号；第５，２２９，５０１号；第６，２５５，４５４号；第６，３４４，５４６号；第５，４７４，９１４号；および第５，２８８，８５５号に記載のものが含まれる。ＦＧＦＲ１−ＩＩＩｂおよびＦＧＦＲ１−ＩＩＩｃは、そのＩｇＩＩＩドメイン（以下に定義）が互いに異なる。ＦＧＦＲ２ポリペプチドとは、例えば、既知のＦＧＦＲ２ポリペプチドのうち任意のもの、例えばＦＧＦＲ２−ＩＩＩｂおよびＦＧＦＲ２−ＩＩＩｃのアミノ酸配列を有するポリペプチド、ならびに任意のその断片をいう。ＦＧＦＲ２−ＩＩＩｂおよびＦＧＦＲ２−ＩＩＩｃも、ＩｇＩＩＩドメインが互いに異なる。「ＦＧＦＲ３ポリペプチド」とは、例えば、既知のＦＧＦＲ３ポリペプチドのうち任意のもの、例えばＦＧＦＲ３−ＩＩＩｂおよびＦＧＦＲ３−ＩＩＩｃのアミノ酸配列を有するポリペプチド、ならびに任意のその断片をいう。ＦＧＦＲ３−ＩＩＩｂおよびＦＧＦＲ３−ＩＩＩｃも、ＩｇＩＩＩドメインが互いに異なる。「ＦＧＦＲ４ポリペプチド」とは、例えば、既知のＦＧＦＲ４ポリペプチドのうち任意のもののアミノ酸配列を有するポリペプチド、および任意のその断片をいう。
「ＦＧＦＲ融合タンパク質」とは、表および配列表中に定義したタンパク質であり、典型的には、ＦＧＦＲポリペプチドの細胞外ドメインまたはその生物活性のある断片に対応するアミノ酸配列と、融合パートナーとを含む。融合パートナーはＦＧＦＲポリペプチドのＮ末端またはＣ末端のどちらかに結合してよく、ＦＧＦＲは融合パートナーのＮ末端またはＣ末端のどちらかに結合してよい。ＦＧＦＲ融合タンパク質は、組換えＤＮＡ鎖のスプライシングの結果生じた産物であることができ、ハイブリッド遺伝子を発現する。これは、遺伝子操作によって、例えば、ＤＮＡ配列が単一のタンパク質として発現されるように、第１のタンパク質のＤＮＡ配列からストップコドンを除去し、次いで第２のタンパク質のＤＮＡ配列をインフレームで付加することによって、作製することができる。これは典型的には、ｃＤＮＡを発現ベクター内に、既存の遺伝子とインフレームでクローニングすることによって達成する。ＦＧＦＲ融合タンパク質は、複数の遺伝子の全体または複数の断片を表すアミノ酸残基を含む融合パートナーを含み得る。また、ＦＧＦＲ融合タンパク質は、ポリペプチドではなく、化学結合している融合パートナーを含み得る。
「ＩｇＩＩＩドメインのＣ末端に位置し、一般的に野生型ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３、およびＦＧＦＲ４のＥＣＤのＣ末端の間でアラインメントされているバリン残基」とは、以下に太字で示すバリン（Ｖ）残基である。
Figure 2013017484
「融合パートナー」とは、ＦＧＦＲの細胞外ドメインまたはその断片に加えた融合分子の任意の構成成分である。融合パートナーは、免疫グロブリン分子の断片などのポリペプチド、または非ポリペプチド部分、例えばポリエチレングリコールを含み得る。融合パートナーは、重鎖免疫グロブリンのＦｃドメインなどのオリゴマー化ドメインを含み得る。
「ＦＧＦリガンド」とは、ＦＧＦＲに結合する線維芽細胞成長因子、またはその改変体もしくは断片である。現在、既知のＦＧＦリガンドにはＦＧＦ−１、ＦＧＦ−２、ＦＧＦ−３、ＦＧＦ−４、ＦＧＦ−５、ＦＧＦ−６、ＦＧＦ−７、ＦＧＦ−８、ＦＧＦ−９、ＦＧＦ−１０、ＦＧＦ−１１、ＦＧＦ−１２、ＦＧＦ−１３、ＦＧＦ−１４、ＦＧＦ−１５、ＦＧＦ−１６、ＦＧＦ−１７、ＦＧＦ−１８、ＦＧＦ−１９、ＦＧＦ−２０、ＦＧＦ−２１、ＦＧＦ−２２、およびＦＧＦ−２３が含まれる。それぞれのＦＧＦは１つまたは複数のＦＧＦＲに結合し得る。ＦＧＦリガンドは、リガンドを発現している細胞、組織、または生物において正常よりも高いレベルで発現された場合、「過剰発現」されている。
「断片結晶性（Ｆｃ）ポリペプチド」とは、エフェクター分子および細胞と相互作用する抗体分子の部分をいう。これは、免疫グロブリン重鎖のＣ末端部分を含む。本明細書中で使用するＦｃポリペプチドとは、完全なＦｃポリペプチドの１つまたは複数の生物活性を有するＦｃドメインの断片を含む。Ｆｃポリペプチドの「エフェクター機能」とは、刺激に応答して完全にまたは部分的に抗体によって行われる作用または活性であり、補体の固定またはＡＤＣＣ（抗体依存性細胞性細胞傷害）の誘導が含まれ得る。
「野生型」とは、遺伝子、対立遺伝子、遺伝子型、ポリペプチド、もしくは表現型の突然変異していない型、またはこれらの任意の断片をいう。これは、天然に存在するか、または組換えによって産生させ得る。「野生型ＦＧＦＲのＥＣＤ」とは、ＦＧＦＲの野生型細胞外ドメインと同一のアミノ酸配列または核酸配列を完全にもしくは部分的に含むタンパク質または核酸分子をいい、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３、およびＦＧＦＲ４のすべてのアイソフォームが含まれる。
「改変体」とは、参照核酸分子またはポリペプチドと単一もしくは複数のアミノ酸の置換、欠失、および／または付加によって異なり、参照核酸分子またはポリペプチドの少なくとも１つの生物活性を実質的に保持している、核酸分子あるいはポリペプチドである。
「点突然変異」とは、単一のヌクレオチドまたはアミノ酸残基に関与する突然変異である。突然変異は、ヌクレオチドもしくはアミノ酸の喪失、１つのヌクレオチドもしくはアミノ酸残基の別のものとの置換、追加のヌクレオチドもしくはアミノ酸残基の挿入であり得る。
「リーダー配列」とは、目的ポリペプチドの分泌を促進し、典型的にはポリペプチドが細胞表面膜の外に輸出された際に切断される、アミノ酸残基またはそれをコードしているポリヌクレオチドの配列をいう。
「ベクター」とは、１つの生物から別の生物へとＤＮＡ配列を移すため、または目的遺伝子を発現させるために使用することができるプラスミドである。ベクターには、典型的には複製起点および目的遺伝子の発現を制御する調節配列が含まれ、抗生物質耐性遺伝子などの選択マーカー遺伝子を保有していても、していなくてもよい。ベクターは、それを発現させる宿主細胞に適している。ベクターは、目的遺伝子がベクター中に存在する場合には「組換えベクター」と呼び得る。
「宿主細胞」とは、任意の組換えベクターもしくは単離ポリヌクレオチドのレシピエントとなることができるまたはなったことがある、個々の細胞または細胞培養物である。宿主細胞には、天然、偶然、または意図的な突然変異および／または変更により、例えば形態学的にまたは完全ＤＮＡ補体において、必ずしも元々の親細胞と完全に同一でなくてもよい単一の宿主細胞の子孫が含まれる。宿主細胞には、本発明の組換えベクターまたはポリヌクレオチドを用いて、ｉｎ ｖｉｖｏもしくはｉｎ ｖｉｔｒｏで形質移入または感染を行った細胞が含まれる。組換え分子を含む宿主細胞は、「組換え宿主細胞」と呼び得る。宿主細胞は原核細胞または真核細胞であり得る。宿主細胞としての使用に適した真核細胞には、霊長類または非霊長類の動物細胞などの哺乳動物細胞；真菌細胞；植物細胞；および昆虫細胞が含まれる。例えば、宿主細胞は、２９３またはＣＨＯ細胞に由来し得る。
「プロモーター」とは、細胞中のＲＮＡポリメラーゼに結合して、作動可能にそれに連結している下流（５’から３’の方向）のコード配列の転写を開始することができる、ＤＮＡ制御領域である。プロモーターには、天然で核酸分子に連続しているもの、および天然で核酸分子に連続していないものが含まれる。さらに、用語「プロモーター」には、誘導性プロモーター、ならびにｃｒｅ−ｌｏｘプロモーター、ｔｅｔ誘導性プロモーター、構成的プロモーター、および組織特異的プロモーターなどの条件的に活性となるプロモーターが含まれる。「外来性プロモーター」とは、天然に存在する状態で目的遺伝子に作動可能に連結していないものである。
「ＣＨＥＦ発現系」とは、調節配列として米国特許第５，８８８，８０９号に記載のハムスター伸長因子−１（ＥＦ−１）α遺伝子由来の制御ＤＮＡ配列を利用する発現系をいう。ＣＨＥＦ発現系では、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞を宿主細胞として用い得る。
ＣＨＥＦ発現系は、チャイニーズハムスター卵巣ＥＦ−１α遺伝子の翻訳された領域の５’側の制御ＤＮＡ配列を含み、Ｓｐｅ１制限部位からＥＦ−１αタンパク質の開始メチオニン（ＡＴＧ）コドンまで伸びる約３．７ｋｂのＤＮＡが含まれる。３．７ｋｂ未満のポリヌクレオチドは、作動可能に連結した遺伝子の転写を増加させる能力を有する限り小さな断片のポリヌクレオチドも含まれる。この制御系を含むプラスミドの例には、ｐＤＥＦ２およびｐＤＥＦ１０が含まれる。大腸菌株ＸＬ−１ Ｂｌｕｅ中のプラスミドｐＤＥＦ２は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、１０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ、バージニア州Ｍａｎａｓｓａｓ、２０１１０から寄託し、寄託番号９８３４３が割り当てられた。
タンパク質を細胞培養物から「単離すること」とは、タンパク質を、細胞培養物中の残りの物質から分離することを意味する。「単離すること」とは、培養物からタンパク質の部分的または完全な分離を達成することを意味することができる。「単離すること」および「精製すること」は互換性があるように使用し、「単離した」および「精製した」も同様である。
「アフィニティーマトリックス」とは、目的のポリペプチドまたはポリヌクレオチドに対して優先的な親和性を示す組成物をいい、その環境、例えば細胞培養物中に天然で存在する他の物質からそれらを精製または単離するために用いる。アフィニティーマトリックスとしての使用に適した物質には、それだけには限定されないが、プロテインＡ、プロテインＧ、プロテインＡおよびＧの組合せ、ならびに、固体基質に付着した抗体が含まれる。
「生物活性のある」実体、または「生物活性」を有する実体とは、代謝的もしくは生理的プロセスに関連もしくは関与する任意の機能を有し、かつ／または天然に存在する分子の構造的、制御的、もしくは生化学的機能を有する実体である。生物活性のあるポリヌクレオチド断片とは、本発明のポリヌクレオチド活性に類似しているが、必ずしも同一である必要はない活性を示している断片である。生物活性のあるポリペプチドまたはその断片には、それだけには限定されないが、リガンド−受容体の相互作用または抗原−抗体結合を含めた生物学的反応に参加することができるものが含まれる。生物活性には、所望の活性の向上または望ましくない活性の低下が含まれることができる。実体は、別の分子との分子相互作用、例えばハイブリダイゼーションに参加する場合、病状の緩和において治療的価値を有する場合、免疫応答の誘発において予防的価値を有する場合、例えばポリヌクレオチド分子に対して独特に検出され得るポリヌクレオチドの生物活性のある断片のような分子の存在の決定において診断的および／または予後的価値を有する場合、ならびにポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）においてプライマーとして用いることができる場合に、生物活性を実証し得る。
「対象」、「個体」、「宿主」、「動物」、および「患者」は、それだけには限定されないが、げっ歯類、サル、ヒト、ネコ科動物、イヌ科動物、ウマ科動物、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、哺乳類の実験動物、哺乳類の家畜、哺乳類のスポーツ用動物、および哺乳類のペットを含めた哺乳動物をいうために、本明細書中で互換性があるように使用する。
「組織試料」とは、患者に由来する任意の生物学的検体である。この用語には、それだけには限定されないが、血液、血清、血漿、尿、脳脊髄液、涙、唾液、リンパ液、透析液、洗浄液、精液、および他の液体試料などの生物学的液体、ならびに生物学的起源の細胞および組織が含まれる。また、この用語には、培養中の細胞、細胞上清、および細胞溶解液を含めた、それに由来する細胞または細胞ならびにその子孫も含まれる。これにはさらに、器官または組織培養物由来の液体、組織生検試料、腫瘍生検試料、糞便試料、および生理的組織から抽出した液体、ならびに固体組織、組織切片、および細胞溶解液から解離した細胞が含まれる。この定義には、試薬を用いた処理、可溶化、またはポリヌクレオチドもしくはポリペプチドなどの特定の構成成分の富化など、入手した後に任意の方法で操作した試料が包含される。また、この用語には、患者試料の誘導体および画分も含まれる。患者試料は、診断的アッセイ、予後的アッセイ、または他の監視アッセイに用い得る。
「成長因子受容体シグナル伝達阻害剤」、例えば「ＰＤＧＦシグナル伝達阻害剤」、「ＶＥＧＦシグナル伝達阻害剤」、または「ＥＧＦシグナル伝達阻害剤」とは、成長因子とその受容体の結合から始まり、増殖応答などの生物学的応答で終わる、シグナル伝達経路におけるような一連の現象の１つまたは複数の効果を減少させる薬剤である。成長因子受容体シグナル伝達阻害剤は、シグナル伝達、キナーゼ活性化、遺伝子活性化、および細胞周期の調節を含めた、連続的にまたは平行的のどちらでも起こる多くの現象の１つまたは複数を減少させ得る。
用語「抗体」および「免疫グロブリン」とは、特定の抗原を認識してそれに結合することができる、免疫系によって産生された、合成によって作製した、または組換えによって作製したタンパク質をいう。抗体は、一般的に当分野で知られている。これらは、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、単鎖抗体またはその抗原結合断片であることができる。
「血管形成」とは、毛細血管を含めた新しい血管の発生である。これは、健康または癌を含めた疾患の際に起こる。この用語には、新血管形成、血管再生、血管新生、および脈管形成が含まれる。新しい血管の成長は、典型的には、癌または黄斑変性症における場合などの増殖性条件下で活性であり得る、血管新生因子による内皮細胞の刺激の結果として起こる。「血管新生因子」とは、血管形成を促進するものである。
「癌」および「腫瘍」とは、動物における任意の異常な細胞または組織の成長または増殖をいう、互換性のある用語である。本明細書中で使用する用語「癌」および「腫瘍」には、固形癌および血液癌／リンパ癌が包含され、悪性成長、前悪性成長、および異形成などの良性成長も包含される。
「転移」とは、疾患プロセス、例えば癌の、身体の一部分から別の部分への伝播または播種である。これには、疾患の最初のまたは原発性の部位から別の部位への伝播または播種が含まれる。また、「転移」は、このような伝播または播種が起こるプロセスもいう。この用語は、伝播または播種の機構に限定されない。「転移」には、リンパ管または血管による、あるいは漿膜腔またはくも膜下空間もしくは他の空間を介した直接伸長による、癌細胞の伝播または播種が含まれる。
「黄斑変性症」とは、黄斑の細胞が変性する任意の状態であり、かすみ目および場合によっては盲目をもたらす現象である。
本明細書中で使用する「治療」とは、ヒトを含めた哺乳動物において疾患を治療するための任意の投与または施用を網羅し、例えば、喪失、欠失、もしくは欠損した機能の回帰、回復もしくは修復を引き起こすことによって、または非効率的なプロセスを刺激することによって、疾患を阻害すること、その発生を停止させること、または疾患を軽減させることが含まれる。治療は、手術、放射線照射、化学療法、および／または生物剤を用いて達成し得る。
「薬学的に許容される担体」とは、対象に投与するための治療剤と共に用いる、無毒性の固体、半固体、もしくは液体の充填剤、希釈剤、カプセル封入剤、配合補助剤、または当分野で慣用の担体をいう。薬学的に許容される担体は、用いる用量および濃度でレシピエントに無毒性であり、配合物の他の成分と適合性がある。薬学的に許容される担体は、用いる配合物に適切である。例えば、治療剤を経口投与する場合は、担体はゲルカプセルであり得る。治療剤を皮下投与する場合は、担体は、理想的には皮膚刺激性ではなく、注射部位の反応を引き起こさない。
「生物剤」とは、修飾されているまたは修飾されていない、完全またはその断片である、生きた生物によって何らかの形態で自然に産生される産物である。生物剤は、動物組織などの生きた起源から調製し得る。この用語には、それだけには限定されないが、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、抗体、細胞、ウイルス、毒素、ワクチン、血液の構成成分または誘導体、および融合タンパク質が含まれる。「生物剤」は、ヒトを含めた動物を治療するために用い得る。
「表面プラズモン共鳴」とは、光が薄い金属フィルムから反射され、入射光のエネルギーの一部が金属フィルム中の非局在化電子（プラズモン）と相互作用することができる場合に起こる、反射光強度の減少である。
（ＦＧＦＲ細胞外ドメイン融合分子）
本発明のＦＧＦＲ融合分子は、ＦＧＦＲポリペプチドの細胞外ドメイン（ＥＣＤ）と融合パートナーとを含む第１のポリペプチドを含む。ＦＧＦＲポリペプチドは、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３、およびＦＧＦＲ４のうちの任意のものであることができ、すべてのその改変体およびアイソフォームが含まれる。したがって、本発明での使用に適したＦＧＦＲポリペプチドのファミリーには、例えば、ＦＧＦＲ１−ＩＩＩｂ、ＦＧＦＲ１−ＩＩＩｃ、ＦＧＦＲ２−ＩＩＩｂ、ＦＧＦＲ２−ＩＩＩｃ、ＦＧＦＲ３−ＩＩＩｂ、ＦＧＦＲ３−ＩＩＩｃ、およびＦＧＦＲ４が含まれる。ＦＧＦＲの細胞外ドメインは、ＥＣＤ全体またはその一部分であることができる。ＦＧＦＲのＥＣＤは、野生型ＦＧＦＲのＥＣＤと比較して修飾されており、リガンド結合活性を保有する。修飾は、単一または複数のアミノ酸の欠失、付加、または置換であり得る。ＦＧＦＲ細胞外ドメインは、所望の薬物動態学特性をもたらす、例えばその半減期をｉｎ ｖｉｖｏで増加させる融合パートナーに付着させることができる。本発明のＦＧＦＲ融合分子の融合パートナーは、例えば二量体化ドメイン（例えばＦｃ断片）のオリゴマー化ドメインを有するもの含めた、当分野で慣用の任意の融合パートナーであることができる。本発明の融合パートナーには、ペグ化などの化学修飾によって作製したものも含まれる。
ＦＧＦＲは、その細胞外ドメインを介してその同族ＦＧＦに結合することによって、細胞外ドメインがリガンド結合の特異性を決定する。ＦＧＦＲ細胞外ドメインは、３つまでの免疫グロブリン様（Ｉｇ様）ドメイン、すなわちＩｇＩ、ＩｇＩＩ、およびＩｇＩＩＩドメインを含むことができる。選択的ｍＲＮＡスプライシングにより、数種類の形態の細胞外ドメインが産生される。１つのスプライシング現象により、アミノ末端Ｉｇ様ドメイン（ドメインＩ）が排除され、その結果、２つのみのＩｇ様ドメインを有する短い形態の受容体が生じる。別のｍＲＮＡスプライシング現象はＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、およびＦＧＦＲ３中で起こり、その結果、Ｉｇ様ドメインＩＩＩの３つの代替形態、すなわち、ＩＩＩａ、ＩＩＩｂ、およびＩＩＩｃが生じる。これまで、ＦＧＦＲ４はこの領域中で選択的スプライシングされることが報告されていない。第３の免疫グロブリン様ドメインは、異なるリガンド結合特性を有する受容体スプライシング改変体を生じることができる。
本発明は、このようなＦＧＦＲ融合分子を含む組成物およびそれを用いる方法を提供する。本発明のＦＧＦＲ融合分子には、ＦＧＦＲ１のＥＣＤ、例えば、国立バイオインフォマティクス情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）（ＮＣＢＩ）によって記載された、ＮＰ＿０７５５９４、ＮＰ＿０５６９３４、またはＮＰ＿０００５９５として注記されたものを含めて、米国特許第６，３８４，１９１号；第６，６５６，７２８号；第５，２２９，５０１号；第６，３４４，５４６号；および第５，４７４，９１４号に記載のものが含まれることができる。また、本発明のＦＧＦＲ融合分子には、ＦＧＦＲ２のＥＣＤ、例えば、１５２８１４１５およびＮＰ＿０００１３２として注記されたものも含まれることができる。本発明のＦＧＦＲ融合分子にはさらに、ＦＧＦＲ３のＥＣＤ、例えば、ＮＰ＿０５６９３４、１７９３９６５８、Ｐ２２６０７、ＮＰ＿０００１３３、またはＮＰ＿０７５２５４として注記されたものが含まれることができる。本発明のＦＧＦＲ融合分子はさらに、ＦＧＦＲ４のＥＣＤ、例えば、ＮＰ＿００２００２、１３９９１６１８、２８３２３５０、３１３７２、および１８２５７１として注記されたものが含まれることができる。
本発明の融合タンパク質は、野生型または改変体ＦＧＦＲのＥＣＤ全体またはＥＣＤの一部分を含むことができる。例えば、本発明の融合タンパク質は、野生型ＦＧＦＲ１−ＩＩＩｂまたは野生型ＦＧＦＲ１−ＩＩＩｃのＥＣＤ全体を含めた、ＦＧＦＲ１のＥＣＤ全体を含むことができる。また、本発明は、改変体のＥＣＤがそのＦＧＦリガンド結合活性の少なくとも１つを保持している限りは、野生型ＦＧＦＲ１のＥＣＤのＣ末端から数えて１つまたは複数かつ２２個までのアミノ酸残基の欠失を有する改変体などの、野生型ＦＧＦＲ１のＥＣＤの改変体を含むこともできる。一実施形態では、ＦＧＦＲ１のＥＣＤは、Ｃ末端の２２個のアミノ酸が欠失している。一実施形態では、欠失は、野生型の完全長ＦＧＦＲ１−ＩＩＩｂもしくはＦＧＦＲ１−ＩＩＩｃのアミノ酸残基３５６のバリン残基にまで至らず、すなわち欠失にはそれが含まれない。そのような改変体の例には、アミノ酸残基ＬＹＬＥが欠失したもの（配列番号２４３）、アミノ酸残基ＰＬＹＬＥ（配列番号２４４）が欠失したもの、アミノ酸残基ＭＴＳＰＬＹＬＥが欠失したもの（配列番号２４５）、アミノ酸残基ＡＶＭＴＳＰＬＹＬＥが欠失したもの（配列番号２４６）、アミノ酸残基ＶＭＴＳＰＬＹＬＥ（配列番号２４７）が欠失したもの、アミノ酸残基ＥＥＲＰＡＶＭＴＳＰＬＹＬＥが欠失したもの（配列番号２４８）、アミノ酸残基ＬＥＥＲＰＡＶＭＴＳＰＬＹＬＥが欠失したもの（配列番号２４９）、アミノ酸残基ＫＡＬＥＥＲＰＡＶＭＴＳＰＬＹＬＥが欠失したもの（配列番号２５０）、アミノ酸残基ＥＡＬＥＥＲＰＡＶＭＴＳＰＬＹＬＥが欠失したもの（配列番号２５１）、およびアミノ酸残基ＲＰＶＡＫＡＬＥＥＲＰＡＶＭＴＳＰＬＹＬＥが欠失したもの（配列番号２５２）が含まれ、これらはすべて野生型ＦＧＦＲ１−ＩＩＩｂまたはＦＧＦＲ１−ＩＩＩｃと比較したものである。
一実施形態では、本発明の融合タンパク質は、野生型ＦＧＦＲ２−ＩＩＩｂまたは野生型ＦＧＦＲ２−ＩＩＩｃのＥＣＤ全体を含めた、ＦＧＦＲ２のＥＣＤ全体を含むことができる。また、本発明は、改変体のＥＣＤがそのＦＧＦリガンド結合活性の少なくとも１つを保持している限りは、野生型ＦＧＦＲ２のＥＣＤのＣ末端から数えて１つまたは複数かつ２２個までのアミノ酸残基の欠失を有する改変体などの、野生型ＦＧＦＲ２のＥＣＤの改変体を含むこともできる。一実施形態では、ＦＧＦＲ２のＥＣＤは、Ｃ末端の２２個のアミノ酸が欠失している。一実施形態では、欠失は、野生型の完全長ＦＧＦＲ２−ＩＩＩｂのアミノ酸残基３５７もしくは野生型の完全長ＦＧＦＲ２−ＩＩＩｃのアミノ酸残基３５９のバリン残基にまで至らず、すなわち欠失にはそれが含まれない。そのような改変体の例には、アミノ酸残基ＤＹＬＥが欠失したもの（配列番号２５３）、アミノ酸残基ＰＤＹＬＥが欠失したもの（配列番号２５４）、アミノ酸残基ＴＡＳＰＤＹＬＥが欠失したもの（配列番号２５５）、アミノ酸残基ＩＴＡＳＰＤＹＬＥが欠失したもの（配列番号２５６）、アミノ酸残基ＥＩＴＡＳＰＤＹＬＥが欠失したもの（配列番号２５７）、アミノ酸残基ＧＲＥＫＥＩＴＡＳＰＤＹＬＥが欠失したもの（配列番号２５８）、アミノ酸残基ＰＧＲＥＫＥＩＴＡＳＰＤＹＬＥが欠失したもの（配列番号２５９）、アミノ酸残基ＡＰＧＲＥＫＥＩＴＡＳＰＤＹＬＥが欠失したもの（配列番号２６０）、アミノ酸残基ＰＡＰＧＲＥＫＥＩＴＡＳＰＤＹＬＥが欠失したもの（配列番号２６１）、アミノ酸残基ＱＡＰＧＲＥＫＥＩＴＡＳＰＤＹＬＥが欠失したもの（配列番号２６２）、およびアミノ酸残基ＰＫＱＱＡＰＧＲＥＫＥＩＴＡＳＰＤＹＬＥが欠失したもの（配列番号２６３）が含まれ、これらはすべて野生型ＦＧＦＲ２−ＩＩＩｂまたはＦＧＦＲ２−ＩＩＩｃと比較したものである。
一実施形態では、本発明の融合タンパク質は、野生型ＦＧＦＲ３−ＩＩＩｂまたは野生型ＦＧＦＲ３−ＩＩＩｃのＥＣＤ全体を含めた、ＦＧＦＲ３のＥＣＤ全体を含むことができる。また、本発明は、改変体のＥＣＤがそのＦＧＦリガンド結合活性の少なくとも１つを保持している限りは、野生型ＦＧＦＲ３のＥＣＤのＣ末端から数えて１つまたは複数かつ２２個までのアミノ酸残基の欠失を有する改変体などの、野生型ＦＧＦＲ３のＥＣＤの改変体を含むこともできる。一実施形態では、ＦＧＦＲ３のＥＣＤは、Ｃ末端の２２個のアミノ酸が欠失している。一実施形態では、欠失は、野生型の完全長ＦＧＦＲ３−ＩＩＩｂのアミノ酸残基３５５もしくは野生型の完全長ＦＧＦＲ３−ＩＩＩｃのアミノ酸残基３５６のバリン残基にまで至らず、すなわち欠失にはそれが含まれない。そのような改変体の例には、アミノ酸残基ＶＹＡＧが欠失したもの（配列番号２６４）、アミノ酸残基ＳＶＹＡＧが欠失したもの（配列番号２６５）、アミノ酸残基ＥＡＧＳＶＹＡＧが欠失したもの（配列番号２６６）、アミノ酸残基ＤＥＡＧＳＶＹＡＧが欠失したもの（配列番号２６７）、アミノ酸残基ＡＤＥＡＧＳＶＹＡＧが欠失したもの（配列番号２６８）、アミノ酸残基ＥＬＶＥＡＤＥＡＧＳＶＹＡＧが欠失したもの（配列番号２６９）、アミノ酸残基ＥＥＬＶＥＡＤＥＡＧＳＶＹＡＧが欠失したもの（配列番号２７０）、アミノ酸残基ＡＥＥＥＬＶＥＡＤＥＡＧＳＶＹＡＧが欠失したもの（配列番号２７１）、アミノ酸残基ＰＡＥＥＥＬＶＥＡＤＥＡＧＳＶＹＡＧが欠失したもの（配列番号２７２）、およびアミノ酸残基ＧＰＲＡＡＥＥＥＬＶＥＡＤＥＡＧＳＶＹＡＧが欠失したもの（配列番号２７３）が含まれ、これらはすべて野生型ＦＧＦＲ３−ＩＩＩｂまたはＦＧＦＲ３−ＩＩＩｃと比較したものである。
一実施形態では、本発明の融合タンパク質は、野生型ＦＧＦＲ４のＥＣＤ全体を含めた、ＦＧＦＲ３のＥＣＤ全体を含むことができる。また、本発明は、改変体のＥＣＤがそのＦＧＦリガンド結合活性の少なくとも１つを保持している限りは、野生型ＦＧＦＲ４のＥＣＤのＣ末端から数えて１つまたは複数かつ２２個までのアミノ酸残基の欠失を有する改変体などの、野生型ＦＧＦＲ４のＥＣＤの改変体を含むこともできる。一実施形態では、ＦＧＦＲ４のＥＣＤは、Ｃ末端の２２個のアミノ酸が欠失している。一実施形態では、欠失は、野生型の完全長ＦＧＦＲ４のアミノ酸残基３５１のバリン残基にまで至らず、すなわち欠失にはそれが含まれない。そのような改変体の例には、アミノ酸残基ＲＹＴＤが欠失したもの（配列番号２７４）、アミノ酸残基ＡＲＹＴＤが欠失したもの（配列番号２７５）、アミノ酸残基ＡＰＥＡＲＹＴＤが欠失したもの（配列番号２７６）、アミノ酸残基ＡＡＰＥＡＲＹＴＤが欠失したもの（配列番号２７７）、アミノ酸残基ＡＡＡＰＥＡＲＹＴＤが欠失したもの（配列番号２７８）、アミノ酸残基ＰＴＷＴＡＡＡＰＥＡＲＹＴＤが欠失したもの（配列番号２７９）、アミノ酸残基ＤＰＴＷＴＡＡＡＰＥＡＲＹＴＤが欠失したもの（配列番号２８０）、アミノ酸残基ＥＥＤＰＴＷＴＡＡＡＰＥＡＲＹＴＤが欠失したもの（配列番号２８１）、およびアミノ酸残基ＰＥＥＤＰＴＷＴＡＡＡＰＥＡＲＹＴＤが欠失したもの（配列番号２８２）が含まれ、これらはすべて野生型ＦＧＦＲ４と比較したものである。
一実施形態では、本発明の融合タンパク質は、それらが少なくとも１つのＦＧＦリガンド結合活性を保持している限りは、点突然変異体である改変体を含むことができる。点突然変異体には、アミノ酸残基の付加、欠失、または置換の任意の１つまたは複数が、既に言及した領域と同じＣ末端の領域中に、すなわち、ＦＧＦＲ１−ＩＩＩｂまたはＦＧＦＲ１−ＩＩＩｃの位置３５６；ＦＧＦＲ２−ＩＩＩｂの位置３５７；ＦＧＦＲ２−ＩＩＩｃの位置３５９；ＦＧＦＲ３−ＩＩＩｂの位置３５５；ＦＧＦＲ３−ＩＩＩｃの位置３５６；およびＦＧＦＲ４の位置３５０のバリン残基までに含まれることができる。例えば、完全長ＦＧＦＲ１−ＩＩＩｂまたはＦＧＦＲ１−ＩＩＩｃの位置３６４〜３６７のアミノ酸残基ＰＡＶＭの任意の１つまたは複数が、付加、欠失、または置換されていてよい。
ＦＧＦＲポリペプチドの細胞外および膜貫通ドメインのＣ末端は、細胞外ドメインの同定に用いた方法に応じて異なり得る。異なるアルゴリズムにより膜貫通ドメインについて異なる開始残基が予測され、したがって、細胞外ドメインについて異なる終端残基が予測される。例えば、ＦＧＦＲ１−ＩＩＩｃの細胞外ドメインは、配列表（配列番号９２）中にアミノ酸配列「ＹＬＥ」で終わると示されている。表２は、ＦＧＦＲ１−ＩＩＩｃの膜貫通領域であるＮＰ＿０５６９３４、ＮＰ＿０７５５９４、およびＮＰ＿０００５９５がアミノ酸残基３７３で始まることを示しており、これは「ＹＬＥ」配列中の「Ｌ」に対応する。したがって、「ＬＥ」残基は、予測に用いたアルゴリズム次第でＦＧＦＲ１−ＩＩＩｃの細胞外ドメインまたは膜貫通ドメインのどちらかに属すると見なされ得る。この概念は、本明細書中に記載のすべてのＦＧＦＲに当てはまる。したがって、図１に関して、ＦＧＦＲ３−ＩＩＩｂの細胞外ドメインは「ＶＹＡＧ」または「ＶＹ」で終わる可能性があり、ＦＧＦＲ３−ＩＩＩｃのＥＣＤは「ＶＹＡＧ」または「ＶＹ」で終わる可能性があり、ＦＧＦＲ１−ＩＩＩｂのＥＣＤは「ＬＹＬＥ」または「ＬＥ」で終わる可能性があり、ＦＧＦＲ１−ＩＩＩｃのＥＣＤは「ＬＹＬＥ」または「ＬＹ」で終わる可能性があり、ＦＧＦＲ２−ＩＩＩｂのＥＣＤは「ＤＹＬＥ」または「ＤＹ」で終わる可能性があり、ＦＧＦＲ２−ＩＩＩｃのＥＣＤは「ＤＹＬＥ」または「ＤＹ」で終わる可能性があり、ＦＧＦＲ４のＥＣＤは「ＲＹＴＤ」または「ＲＹ」で終わる可能性がある。
本発明は、融合パートナーを含むＦＧＦＲ融合タンパク質を提供する。融合パートナーは、免疫グロブリン重鎖のＦｃ断片などの二量体化ドメインを有する分子であることができる。Ｆｃ断片は、天然に存在する抗体中に見つかる野生型Ｆｃ、その改変体、またはその断片であり得る。一実施形態では、Ｆｃ断片はＩｇＧ１、ＩｇＧ２、またはＩｇＧ４クラスに属する。一実施形態では、本発明は、それだけには限定されないが、ＩｇＧ１クラスに属するおよび／またはＣ２３７Ｓ突然変異を有するＦｃ免疫グロブリン分子の断片を含めた融合分子を提供する。
本発明は、第１のポリペプチドと融合パートナーとを連結するリンカーを含むＦＧＦＲ融合タンパク質を提供する。本発明の融合タンパク質は、そのようなリンカーを用いてまたは用いずに、互換性があるように使用し得る。一実施形態では、リンカーは、アミノ酸ＧＳまたはＧＳをコードしている任意のヌクレオチド配列を含む。リンカーは、融合タンパク質をコードしている核酸を、ＦＧＦＲのＥＣＤをコードしている核酸に付着させることにおいて、少なくとも第１のＤＮＡ構築体の構築に好都合であり得る。融合タンパク質の所望の特性を減少させない限りは、当分野で慣用の任意のリンカーをこの目的のために用い得る。
本発明はまた、複数のＦＧＦＲ細胞外ドメインを含む多量体ＦＧＦＲ融合タンパク質を提供する。例えば、本発明は、ＦＧＦＲ融合タンパク質であって、融合パートナーが、第１のポリペプチドと同じである第２のＦＧＦＲ細胞外ドメインを含み、ホモ二量体が形成される；もしくは第１のポリペプチドとは異なる第２のＦＧＦＲ細胞外ドメインを含み、ヘテロ二量体が形成される、またはこれらのどちらかの生物活性のある断片を含む、ＦＧＦＲ融合タンパク質を提供する。そのような融合タンパク質は、融合タンパク質のＦＧＦリガンド結合への親和性を増加させるか、または融合タンパク質に結合することができるＦＧＦリガンドの範囲を拡大させ得る。その構成成分には、２つのＦＧＦＲ１細胞外ドメイン、２つのＦＧＦＲ２細胞外ドメイン、２つのＦＧＦＲ３細胞外ドメイン、２つのＦＧＦＲ４細胞外ドメイン、またはこれらの任意のドメインの生物活性のある断片が含まれ得る。また、これには、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３、およびＦＧＦＲ４の細胞外ドメイン、またはこれらの任意のドメインの生物活性のある断片の異種の組合せも含まれ得る。
本発明のＦＧＦＲ融合分子の配列を配列表中に提供し、表中にさらに記載する。それらの配列の指定には、公開されている配列および本発明の新規融合タンパク質がどちらも含まれる。配列の種類には、細胞外ドメイン、リンカー、融合パートナー、欠失突然変異体、および他の突然変異体が含まれる。
表１は、配列表のＦＧＦＲ配列を示す表である。第１列は、内部で指定したＩＤ番号を示す（特許ＩＤ）。第２列は、第３列に記載のポリペプチドの一部のオープンリーディングフレームをコードしている核酸のヌクレオチド配列ＩＤ番号を示す（配列番号（Ｎ１））。第３列は、ポリペプチド配列のアミノ酸配列ＩＤ番号を示す（配列番号（Ｐ１））。第４列は、当てはまる場合はＮＣＢＩ寄託番号を含めた、ポリペプチドの説明を提供する
（タンパク質ＩＤ）。第５列は、ＦＧＦＲファミリーを指定する、コードされたタンパク質の簡単な説明を提供する（タンパク質）。第６列は、当てはまる場合は改変体ＦＧＦＲの説明を含めた、タンパク質の注記を提供する（注記）。第７列は、当てはまる場合は欠失または変更されたアミノ酸残基を含めた、改変体または親構築体の説明を提供する（説明）。
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表２は、完全長のＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ３、およびＦＧＦＲ４タンパク質に関連する配列を特徴づける情報を示す表である。第１列は、ＮＣＢＩ寄託番号を示す（タンパク質ＩＤ）。第２列は、配列がＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ３、またはＦＧＦＲ４に関連するかどうかを指定する。第３列は、それぞれのタンパク質によってコードされているポリペプチドの予測される長さを示す（タンパク質の長さ）。第４列は、予測されたアミノ酸配列が分泌されるかどうかを予測するアルゴリズムの結果を示す（Ｔｒｅｅｖｏｔｅ）。０に近いＴｒｅｅｖｏｔｅは、タンパク質が分泌される確率が低いことを示し、一方で１．００に近いＴｒｅｅｖｏｔｅはタンパク質が分泌される確率が高いことを示す。第５列は、予測されたシグナルペプチドの座標を示す（シグナルペプチドの座標）。第６列は、分泌リーダー配列またはシグナルペプチド配列の切断後の成熟ポリペプチドのアミノ酸残基の座標を参照する、成熟タンパク質の座標を示す（成熟タンパク質の座標）。第７列は、シグナルペプチドの座標の代替予測を示す（代替シグナルペプチド座標）。第８列は、成熟タンパク質の代替形態の座標を指定する（代替成熟タンパク質座標）。代替の座標は、シグナルペプチド切断部位の代替予測から生じ、その存在は、例えば、ポリペプチドの発現に用いた宿主に依存し得る。第９列は、膜貫通ドメインの数を指定する（ＴＭ）。第１０列および第１１列は、ポリペプチドの膜貫通および非膜貫通配列の座標を提供する。膜貫通の座標（ＴＭ座標）は、分子の膜貫通ドメインを指定する。非膜貫通の座標（非ＴＭ座標）は、膜中に位置しないタンパク質セグメントを参照し、これらには、細胞外、細胞質、および管腔の配列が含まれることができる。座標は、完全長ポリペプチドのＮ末端の最初のアミノ酸残基を「１」として始めたアミノ酸残基の観点から記載する。
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（ＦＧＦＲ融合分子をコードしている核酸分子）
本発明は、本発明のＦＧＦＲ融合タンパク質をコードしているポリヌクレオチド配列を含む核酸分子を提供する。これらの核酸分子は、当分野で慣用の組換えＤＮＡ技術を用いて構築することができる。核酸分子には、配列番号１８３〜１８９で提供するものなどの、ＦＧＦＲ１−ＩＩＩｂのＥＣＤに関連する分子；配列番号１〜６３で提供するものなどの、ＦＧＦＲ１−ＩＩＩｃのＥＣＤに関連する分子；配列番号２１１〜２１８で提供するものなどの、ＦＧＦＲ２−ＩＩＩｂのＥＣＤに関連する分子；配列番号２１９〜２２６で提供するものなどの、ＦＧＦＲ２−ＩＩＩｃのＥＣＤに関連する分子；配列番号１９０〜１９６で提供するものなどの、ＦＧＦＲ３−ＩＩＩｂのＥＣＤに関連する分子；配列番号８３〜９１で提供するものなどの、ＦＧＦＲ３−ＩＩＩｃのＥＣＤに関連する分子；および配列番号６４〜７８で提供するものなどの、ＦＧＦＲ４のＥＣＤに関連する分子が含まれる。
本発明の核酸分子には、そのネイティブの相同的な分泌リーダー配列を有するまたは有さない、ＦＧＦＲポリペプチドのＥＣＤの全体または一部分をコードしているポリヌクレオチド配列が含まれることができる。相同的な分泌リーダー配列を核酸分子の構築に用いない場合は、別の分泌リーダー配列、例えば、ＰＣＴ ＵＳ０６／０２９５１号に記載のリーダー配列の任意の１つを用い得る。
典型的には、核酸分子が転写および翻訳された際にインフレームであるように、目的遺伝子であるＦＧＦＲのＥＣＤをコードしている核酸分子を、選択した宿主細胞中での発現に適した発現ベクター内のリンカー部位に挿入し、融合パートナーをコードしている核酸分子を、ＦＧＦＲのＥＣＤに続く部位に挿入する。
（ＦＧＦＲ融合分子の発現および産生）
（ベクター）
本発明は、本発明の融合タンパク質をコードしている核酸分子を含む遺伝子操作した組換えベクター、組換えベクターを含む組換え宿主細胞、本発明の融合タンパク質をコードしている核酸分子、ならびにＦＧＦＲ融合タンパク質およびその断片の産生を提供する。本発明のベクターには、原核であれ真核であれ選択した宿主中での発現に適したもの、例えば、ファージ、プラスミド、およびウイルスのベクターが、含まれる。ウイルスベクターは、複製可能または複製欠損のどちらかのレトロウイルスベクターであり得る。ウイルスの増殖は、一般に、複製欠損のベクターを含む相補宿主細胞においてのみ起こる。本発明のベクターはコザック配列（Ｌｏｄｉｓｈら、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ」、第４版、１９９９年）を含んでいてよく、また、ＦＧＦＲ細胞外ドメインのＡＴＧ開始コドンも含んでいてよい。本発明のベクターには、以下にさらに詳細に記載する「ミニサークル」ベクターが含まれる。
コピー数および位置的効果が、一過的および安定して発現されるベクターの設計において考慮される。コピー数は、例えばジヒドロ葉酸還元酵素の増幅によって増加することができる。位置的効果は、例えば、チャイニーズハムスター伸長因子−１ベクターｐＤＥＦ３８（ＣＨＥＦ１）、遍在性クロマチンオープニングエレメント（ＵＣＯＥ）、ヒトの骨格／マトリックス結合領域（Ｓ／ＭＡＲ）、および人工染色体発現（ＡＣＥ）ベクターによって、ならびに当分野で知られている部位特異的な組込み方法を用いることによって、最適化することができる。ベクターおよび目的遺伝子を含む発現構築体はさらに、転写開始部位、転写停止部位、および転写領域中に翻訳のためのリボソーム結合部位を含む。構築体によって発現される転写物のコード部分には、先頭に翻訳開始コドンおよび翻訳するポリペプチドの最後に適切に配置された停止コドン（ＵＡＡ、ＵＧＡ、またはＵＡＧ）が含まれることができる。
上述の要素を考慮すると、細菌中でＦＧＦＲ融合分子を発現させるために適したベクターには、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（カナダＭｏｎｔｒｅａｌ）から入手可能なｐＴＴベクター；Ｑｉａｇｅｎ（カナダ、オンタリオ州Ｍｉｓｓｉｓｓａｕｇａ）から入手可能なｐＱＥ７０、ｐＱＥ６０、およびｐＱＥ−９；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（カリフォルニア州Ｃａｒｌｓｂａｄ）から入手可能なｐｃＤＮＡ３由来のベクター；Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（カリフォルニア州Ｌａ Ｊｏｌｌａ）から入手可能なｐＢＳベクター、Ｐｈａｒｇｅｓｃｒｉｐｔベクター、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクター、ｐＮＨ８Ａ、ｐＮＨ６ａ、ｐＮＨ１８Ａ、ｐＮＨ４６Ａ；ならびにＰｈａｒｍａｃｉａ（ニュージャージー州Ｐｅａｐａｃｋ）から入手可能なｐｔｒｃ９９ａ、ｐＫＫ２２３−３、ｐＫＫ２３３−３、ｐＤＲ５４０、ｐＲＩＴ５が含まれる。適切な真核ベクターには、とりわけ、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（カリフォルニア州Ｌａ Ｊｏｌｌａ）から入手可能なｐＷＬＮＥＯ、ｐＳＶ２ＣＡＴ、ｐＯＧ４４、ｐＸＴＩ、およびｐＳＧ；ならびにＰｈａｒｍａｃｉａ（ニュージャージー州Ｐｅａｐａｃｋ）から入手可能なｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧおよびｐＳＶＬがある。
ＦＧＦＲ融合分子を発現させるためのベクターには、ｐＴＴベクターの主鎖を含むものが含まれる（Ｄｕｒｏｃｈｅｒら、Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、３０：Ｅ９（２００２年））。手短に述べると、ｐＴＴベクターの主鎖は、ｐＩＲＥＳｐｕｒｏ／ＥＧＦＰ（ｐＥＧＦＰ）およびｐＳＥＡＰ基本ベクター（または複数のベクター）を、例えばＣｌｏｎｔｅｃｈ（カリフォルニア州Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ）から得ることによって調製してもよく、ｐｃＤＮＡ３．１、ｐＣＤＮＡ３．１／Ｍｙｃ−（Ｈｉｓ）６およびｐＣＥＰ４ベクターは、例えばＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（カリフォルニア州Ｃａｒｌｓｂａｄ）から得ることができる。本明細書中で使用するｐＴＴ５主鎖ベクターは、ｐＴＴ５−Ｇａｔｅｗａｙベクターを生じることができ、哺乳動物細胞中でタンパク質を一過的に発現させるために用いる。ｐＴＴ５ベクターは、例えば、ｐＴＴ５−Ａ、ｐＴＴ５−Ｂ、ｐＴＴ５−Ｄ、ｐＴＴ５−Ｅ、ｐＴＴ５−Ｈ、およびｐＴＴ５−Ｉに誘導体化することができる。本明細書中で使用するｐＴＴ２ベクターは、哺乳動物細胞系中で安定して発現するための構築体を生じることができる。
ｐＴＴベクターは、ハイグロマイシン（ＢｓｍＩおよびＳａｌＩの切除、次いで補充およびライゲーション）ならびにＥＢＮＡＩ（ＣｌａＩおよびＮｓｉＩの切除、次いで補充およびライゲーション）の発現カセットを欠失させることによって調製することができる。ＣｏｌＥＩ起源（β−ラクタマーゼのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の３’末端を含めたＦｓｐＩ−ＳａｌＩ断片）を、ｐＭＢＩ起源（およびβ−ラクタマーゼＯＲＦの同じ３’末端）を含むｐｃＤＮＡ３．１由来のＦｓｐＩ−ＳａｌＩ断片で置き換えることができる。Ｍｙｃ−（Ｈｉｓ）６のＣ末端融合タグは、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＶで消化したｐｃＤＮＡ３．１／Ｍｙｃ−Ｈｉｓ中のインフレームのライゲーションに次いで、ＳＥＡＰ（ｐＳＥＡＰ−基本由来のＨｉｎｄＩＩＩ−ＨｐａＩ断片）に付加することができる。その後、プラスミドを、ＬＢ培地中で増殖させた大腸菌（ＤＨ５α）中で増幅し、ＭＡＸＩ ｐｒｅｐカラム（Ｑｉａｇｅｎ、カナダ、オンタリオ州Ｍｉｓｓｉｓｓａｕｇａ）を用いて精製することができる。定量するためには、次いでプラスミドを、例えば、５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．４に希釈し、２６０ｎｍおよび２８０ｎｍで吸光度を測定することができる。約１．７５〜約２．００のＡ２６０／Ａ２８０比を有するプラスミド調製物が、ＦＧＦＲ構築体の産生に適している。
発現ベクターｐＴＴ５は、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターによって駆動されるｃＤＮＡの染色体外複製を可能にする。プラスミドベクターｐＣＤＮＡ−ｐＤＥＳＴ４０は、高レベルの発現のためにＣＭＶプロモーターを利用することができる、Ｇａｔｅｗａｙに適合したベクターである。ＳｕｐｅｒＧｌｏ ＧＦＰ改変体（ｓｇＧＦＰ）は、Ｑ−Ｂｉｏｇｅｎｅ（カリフォルニア州Ｃａｒｌｓｂａｄ）から得ることができる。ｐＣＥＰ５ベクターの調製は、ＳａｌＩおよびＸｂａＩ酵素を用いた逐次的な消化および自己ライゲーションによってｐＣＥＰ４のＣＭＶプロモーターおよびポリアデニル化シグナルを除去し、プラスミドｐＣＥＰ４Δを生じることによって達成することができる。ＢｇｌＩＩを直鎖状にしたｐＣＥＰ４Δ中にライゲーションしたＣＭＶ５−ポリ（Ａ）発現カセットをコードしている、ｐＡｄＣＭＶ５由来のＧｂｌＩＩ断片（Ｍａｓｓｉｅら、Ｊ．
Ｖｉｒｏｌ．、７２：２２８９〜２２９６頁（１９９８年））により、ｐＣＥＰ５ベクターが生じた。
ＦＧＦＲ融合分子を発現させるためのベクターには、ｐＤＥＦ３８（ＣＨＥＦ１）および類似のベクターなど、ＣＨＯ−ＳまたはＣＨＯ−Ｓ由来細胞での使用に最適化されたベクターを含むものが含まれる（Ｒｕｎｎｉｎｇ Ｄｅｅｒら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ｐｒｏｇ．、２０：８８０〜８８９頁（２００４年）。ＣＨＥＦベクターは、ＣＨＯ細胞およびその誘導体中で高くかつ持続した発現をもたらすＤＮＡ要素を含む。これらには、それだけには限定されないが、導入遺伝子の転写サイレンシングを阻止する要素が含まれる。
宿主中での増殖のためにＦＧＦＲポリヌクレオチドベクターを選択マーカーと結合し得る。一般に、選択マーカーは、必須の細胞機能を阻害する化学剤または他の薬剤が存在する場合または存在しない場合に成長するその能力に基づいた、形質転換細胞の選択を可能にする。選択マーカーは、適切な条件下で細胞を同定できるように、マーカーを発現する細胞に表現型を与える。したがって、適切なマーカーには、細胞を適切な選択培地中で増殖させた際に、薬物耐性すなわち感受性を付与するか、色を与えるか、または選択マーカーをコードしている分子で形質移入した細胞の抗原性特徴を変更するタンパク質をコードしている遺伝子が含まれる。
適切な選択マーカーには、真核細胞培養物中ではジヒドロ葉酸還元酵素またはＧ４１８（ネオマイシン耐性のため）；ならびに大腸菌および他の細菌中の培養ではテトラサイクリン、カナマイシン、またはアンピシリン耐性遺伝子が含まれる。また、適切な選択マーカーには、細胞毒素または薬物の１つまたは複数を含む培地上で成長するその能力について細胞を選択する、細胞毒性マーカーおよび薬物耐性マーカー；チミジンおよびヒポキサンチンなどの特定の栄養素またはサプリメントを有するまたは有さない特定培地上で成長するその能力について細胞を選択する、栄養要求性マーカー；例えば、特定の物質、例えば唯一の炭素源としての適切な糖を含む特定培地上で成長する能力について細胞を選択する、代謝マーカー；ならびに細胞に色素基質上で有色コロニーを形成する能力、または細胞の蛍光発光を引き起こす能力を与えるマーカーも含まれる。
上述のように、ＦＧＦＲ融合タンパク質を発現させるためのベクターは、タンパク質レトロウイルスベクター中に構築することもできる。このようなベクターの１つである、マウス染色体６にマッピングするＲＯＳＡβｇｅｏレトロウイルスベクターは、レポーター遺伝子をレトロウイルスの転写に関し逆方向で、スプライスアクセプター配列の下流に用いて構築した（米国特許第６，４６１，８６４号；Ｚａｍｂｒｏｗｉｃｚら、Ｐｒｏｃ．
Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．、９４：３７８９〜３７９４頁（１９９７年））。胚性幹（ＥＳ）細胞をＲＯＳＡβｇｅｏレトロウイルスベクターで感染させることにより、ＥＳ細胞中にランダムレトロウイルス遺伝子トラッピングを行うことによってＲＯＳＡβｇｅｏ２６（ＲＯＳＡ２６）マウス株が生じた。
ＦＧＦＲ融合分子を含むＤＮＡ挿入物を、ファージλＰＬプロモーター；大腸菌ｌａｃ、ｔｒｐ、ｐｈｏＡ、およびｔａｃプロモーター；ＳＶ４０初期および後期プロモーター；ならびにレトロウイルスＬＴＲのプロモーターなどの適切なプロモーターに作動可能に連結することができる。また、適切なプロモーターには、エンハンサーを有するｐＣＭＶベクター、ｐｃＤＮＡ３．１；エンハンサーおよびイントロンを有するｐＣＭＶベクター
、ｐＣＩｎｅｏ；エンハンサー、イントロン、および三者間リーダーを有するｐＣＭＶベクター、ｐＴＴ２、ならびにＣＨＥＦ１も含まれる。他の適切なプロモーターは当業者に周知であろう。プロモーター配列には、バックグラウンドを超えて検出可能なレベルでの目的遺伝子の転写を開始するために必要な、最小数の塩基または要素が含まれる。プロモーター配列内には、転写開始部位、およびＲＮＡポリメラーゼの結合を司るタンパク質結合ドメイン（コンセンサス配列）が存在し得る。本発明の真核プロモーターは多くの場合「ＴＡＴＡ」ボックスおよび「ＣＡＴ」ボックスを含むが、必ず含むわけではない。
本発明は、組織特異的な様式で機能するプロモーターの制御下でヒトを含めた動物においてＦＧＦＲ融合分子をｉｎ ｖｉｖｏで発現させるためのベクターを提供する。例えば、本発明のＦＧＦＲ融合タンパク質の発現を駆動するプロモーターは、ＰＣＴ／ＵＳ０６／００６６８号に記載のように肝臓特異的であり得る。
続く取扱いおよび保存の間ずっと、宿主細胞の精製物中における安定性および持続を改善するために、追加のアミノ酸、特に帯電したアミノ酸の領域をポリペプチドのＮ末端に付加し得る。また、精製を容易にするためにアミノ酸部分をポリペプチドに付加し得る。そのようなアミノ酸は、ポリペプチドの最終的な調製の前に除去しても除去しなくてもよい。本発明のＦＧＦＲ融合タンパク質は、融合したポリペプチドの精製を容易にする、ペプチドなどのマーカー配列に融合することができる。マーカーアミノ酸配列は、多くが市販されているもののうち、とりわけｐＱＥベクター（Ｑｉａｇｅｎ、カナダ、オンタリオ州Ｍｉｓｓｉｓｓａｕｇａ）中に提供されるタグなどのヘキサヒスチジンペプチドであり得る。例えば、Ｇｅｎｔｚら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．、８６：８２１〜８２４頁（１９８９年）に記載のように、ヘキサヒスチジンは融合タンパク質の好都合な精製を提供する。精製に有用な別のペプチドタグである赤血球凝集素ＨＡタグは、インフルエンザ赤血球凝集素タンパク質に由来するエピトープに対応する（Ｗｉｌｓｏｎら、Ｃｅｌｌ ３７：７６７〜７７８頁（１９８４年））。上記マーカーのうちの任意のものを、本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチドを用いて操作することができる。
本発明の発現構築体はさらに、転写開始部位、転写停止部位、および転写領域中に翻訳のためのリボソーム結合部位を含む。構築体によって発現される転写物のコード部分には、先頭に翻訳開始コドンおよび翻訳するポリペプチドの最後に適切に配置された停止コドン（ＵＡＡ、ＵＧＡ、またはＵＡＧ）が含まれることができる。
（宿主細胞）
本発明のＦＧＦＲ融合タンパク質は、当分野で知られている手順に従って、例えば以下の例および図に示すように、細菌細胞などの原核細胞ならびに真菌細胞、植物細胞、昆虫細胞、および哺乳動物細胞などの真核細胞によって発現かつ産生させることができる。ＦＧＦＲ融合タンパク質は、細菌性大腸菌細胞；Ｃｏｓ７細胞；哺乳動物腎臓上皮２９３細胞；ならびにＣＨＯ細胞に由来するＣＨＯ−ＳおよびＤＧ４４細胞を含めたチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞によって発現かつ産生させることができる。これらはまた、融合タンパク質をコードしている核酸分子を用いて操作または形質移入した動物においてｉｎ ｖｉｖｏで産生させることもできる。例えば、ＦＧＦＲ融合分子をコードしているＤＮＡを注射したマウスは、尾静脈形質移入（ＴＶＴ）後にＦＧＦＲ融合分子を発現することができる。
ＦＧＦＲ融合タンパク質の宿主細胞内への導入は、リン酸カルシウム形質移入、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介の形質移入、カチオン性脂質媒介の形質移入、電気穿孔、形質導入、感染症、または他の既知の方法によって達成することができる。そのような方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ， Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」、第３版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（２００１年）などの多くの標準的な実験手引書に記載されている。本発明のＦＧＦＲ融合タンパク質は、以下により詳細に記載するように、一過的または安定して宿主細胞内に形質移入することができる。本発明のＦＧＦＲ融合タンパク質は、接着培養または懸濁液中のどちらかで成長させた宿主細胞から精製することができ、以下により詳細に記載するように、ＦＧＦＲの生物学的特性を保持することができる。
本発明の宿主細胞は、慣用の方法に従ってタンパク質およびポリペプチドを発現することができ、方法は発現の目的に依存する。タンパク質の大スケールの産生には、大腸菌、枯草菌、出芽酵母などの単細胞生物；バキュロウイルスベクターと組み合わせた昆虫細胞；または脊椎動物などの高等生物の細胞、例えば、哺乳動物２９３（２９３−６Ｅを含む）、ＣＨＯ（ＤＧ４４を含む）、もしくはＣＯＳ７細胞を発現宿主細胞として用いることができる。一部の状況では、真核遺伝子を真核細胞中で発現させることが望ましく、コードされているタンパク質はネイティブの折畳みおよびグリコシル化などの翻訳後修飾から利点を得る。
したがって、本発明は、ＦＧＦＲ融合タンパク質をコードしている核酸分子を含む組換え宿主細胞、そのような核酸分子を含むベクター、またはそれを含むＦＧＦＲ融合タンパク質および培養物を提供する。これらの宿主細胞に、本発明のＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３、およびＦＧＦＲ４の融合タンパク質を産生させ得る。例えば、これらにＦＧＦＲ−Ｆｃ融合タンパク質ならびにその改変体および断片を産生させ得る。宿主細胞は、一過的な形質移入および安定した形質移入に適切であり得る。本明細書中に記載の任意の方法によって発現したＦＧＦＲ融合タンパク質は、当分野で知られている方法によって検出し得る。
本発明の融合タンパク質の翻訳後グリコシル化は、以下により詳細に記載するように、その産生源に応じて変化し得る。タンパク質のグリコシル化プロフィールはその特性および／または機能に影響を与える場合がある。したがって、本発明は、天然に存在する形態と比較して変化したグリコシル化プロフィールを有するまたは有さない組換えＦＧＦＲ融合タンパク質を提供する。これらは、異なる宿主細胞中で産生させ得る。例えば、グリコシル化されていないＦＧＦＲ融合タンパク質は、大腸菌から産生させることができる。グリコシル化されたＦＧＦＲ融合タンパク質の形態は、出芽酵母もしくはピキアパストリスなどの酵母細胞、またはアスペルギルスなどの真菌細胞中で産生させることができる。グリコシル化されたＦＧＦＲ融合タンパク質の形態は、コメ、コムギ、カラスムギなどの植物から産生させることができる。グリコシル化されたＦＧＦＲタンパク質の形態は、２９３細胞もしくはＣＨＯ細胞またはその誘導体などの哺乳動物細胞中で産生させることができる。例えば、本発明は、Ｎ連結した糖を付加するための追加のアルギニン残基を有する突然変異構築体を提供する。これらの構築体は、アルギニン残基による点突然変異を含み得るか、またはアルギニン残基を含めた領域とのより大きな置換を有し得る。本発明はまた、アルギニン残基が取り除かれた突然変異構築体も提供する。本発明のグリコシル化突然変異体は、当業者に知られている方法を用いて天然に存在する配列を変更することによって作製することができる。
本発明の組換え宿主細胞は、誘導条件および非誘導条件をどちらも含めた、当分野で慣用の条件下で培養する。ＦＧＦＲ融合タンパク質は、例えば宿主細胞が大腸菌細胞である場合は封入体中などの細胞内で作製するか、または、宿主細胞が哺乳動物細胞であり、哺乳動物発現系を用いて、例えば分泌リーダー配列を用いてタンパク質を発現させる場合などは、細胞培養物中に分泌させ得る。本発明は、ＦＧＦＲ融合タンパク質が培地中に存在するか、または細胞内に滞留するかにかかわらず、ＦＧＦＲ融合タンパク質を含む細胞培養物を提供する。
（ＦＧＦＲ融合タンパク質の精製）
本発明は、そのそれぞれが当分野で慣用の技術の組合せを用いてＦＧＦＲ融合タンパク質を精製する方法を提供する。これらの技術には、それだけには限定されないが、親和性マトリックスの使用および疎水性相互作用クロマトグラフィー、例えばアフィニティークロマトグラフィーが含まれる。適切な親和性リガンドには、ＦＧＦＲ細胞外ドメインもしくは融合パートナー、またはそれに対する抗体の任意のリガンドが含まれる。例えば、プロテインＡ、プロテインＧ、プロテインＡ／Ｇ、または抗体親和性カラムを用いてＦｃ融合パートナーを結合し、ＦＧＦＲ融合タンパク質を精製し得る。また、融合タンパク質のＦＧＦＲ部分または融合パートナーに対する抗体を用いても、融合タンパク質を精製し得る。疎水性相互作用クロマトグラフィーも、本発明のＦＧＦＲ融合タンパク質の精製に適切である。例えば、ブチルまたはフェニルカラムを用い得る。当業者に知られている他の精製方法も、本発明のＦＧＦＲ融合分子の精製に適切であり得る。
プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーを用いて、Ｆｃドメインを含む本発明のＦＧＦＲ融合タンパク質を精製し得る。プロテインＡとは、黄色ブドウ球菌のいくつかの株によって産生される細胞壁の構成成分であり、組換え様式で作製することができる。これは、重量が約４２，０００ダルトンの単一のポリペプチド鎖からなり、炭水化物をわずかしか、またはまったく含まない。プロテインＡは、ＩｇＧを含めたほとんどの免疫グロブリン分子のＦｃ領域に特異的に結合する（Ｓｊｏｑｕｉｓｔら、Ｅｕｒ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２９：５７２〜５７８頁（１９７２年）；Ｈｊｅｌｍら、Ｅｕｒ． Ｊ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．、５７：３９５〜４０３頁（１９７５年））。
プロテインＧアフィニティークロマトグラフィーを用いても、Ｆｃドメインを含む本発明のＦＧＦＲ融合タンパク質を精製し得る。プロテインＧとは、Ｇ群連鎖球菌によって産生される細菌細胞壁のタンパク質であり、組換え様式で作製することもできる。プロテインＡと同様に、プロテインＧは、主にそのＦｃ領域を介してほとんどの哺乳動物免疫グロブリンに結合する（Ｂｊｏｒｃｋら、Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１３３：９６９〜９７４頁（１９８４年）；Ｇｕｓｓら、ＥＭＢＯ Ｊ．、５：１５６７〜１５７５頁（１９８６年）；Ａｋｅｒｓｔｒｏｍら、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．、２６１：１０、２４０〜１０、２４７頁（１９８６年））。キメラＦｃ結合分子を用いたアフィニティークロマトグラフィーをさらに用いて、Ｆｃドメインを含む本発明のＦＧＦＲ融合タンパク質を精製し得る。例えば、プロテインＡ／Ｇは、プロテインＡおよびプロテインＧの両方のＩｇＧ結合プロフィールを合わせた、遺伝子操作したタンパク質である。プロテインＡ／Ｇは遺伝子融合産物であり、とりわけ非病原性の枯草菌から分泌させることができる。プロテインＡ／Ｇの典型的な重量は約５０，０００ダルトンであり、プロテインＡからの４つのＦｃ結合ドメインおよびプロテインＧからの２つを含むように設計されている（Ｓｉｋｋｅｍａ、Ａｍｅｒ． Ｂｉｏｔｅｃｈ． Ｌａｂ．、７：４２頁（１９８９年）；Ｅｌｉａｓｓｏｎら、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．、２６３：４３２３〜４３２７頁（１９８８年）。
（水力学的尾静脈形質移入（ＴＶＴ））
本発明は、水力学に基づいた尾静脈注射の手順にしたがって、動物におけるＦＧＦＲ融合タンパク質の発現を提供する（Ｌｉｕ， Ｆ．ら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．、６：１２５８〜１２６６頁（１９９９年）；米国特許第６，６２７，６１６号；およびＺｈａｎｇら、Ｈｕｍ． Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．、１０：１７３５頁（１９９９年）。この技術は、ミニサークルベクター構築体中で産生させた、融合タンパク質をコードしている核酸分子の投与後における、ｉｎ ｖｉｖｏでのＦＧＦＲ融合タンパク質の産生を提供する。融合タンパク質を含む、このような注射した動物由来の血清を用いて、最初に細胞培養発現系から融合タンパク質を産生および精製せずにタンパク質のさらなる特徴づけを行い得る。
一実施形態では、本発明は、動物に投与するための、ＦＧＦＲ融合タンパク質をコードしている核酸分子を含むベクター、およびそのような核酸分子を含むミニサークルＤＮＡの水力学的注射ののちに、それによって作製されるＦＧＦＲ融合タンパク質を提供する。注射用のベクターを、例えばＣｈｅｎら、Ｍｏｌ． Ｔｈｅｒ．、８：４９５〜５００頁（２００３年）および米国特許出願第２００４／０２１４３２９Ａ１号に記載の系によって構築することができる。手短に述べると、ＦＧＦＲ遺伝子の発現カセットにはリコンビナーゼの付着部位が隣接し、これは、発現カセットの外側にあるベクター配列の部分で、誘導性の様式で発現される。組換え後、大腸菌は、発現カセットをＦＧＦＲ融合タンパク質遺伝子と共に含むミニサークルベクターを生じる。Ｃｈｅｎらに記載されているベクターは、ベクター中に存在するイントロン中にではなく、イントロンの後にＦＧＦＲ融合タンパク質をコードしている核酸分子を挿入することによって修飾することができる。
ミニサークルＤＮＡベクターは、ｐＢＡＤ．φＣ３１．ｈＦＩＸおよびｐＢＡＤ．φＣ３１．ＲＨＢに類似のプラスミドを用いて調製することができ、大腸菌を形質転換させるために用いる。当分野で知られているリコンビナーゼ、例えばλおよびｃｒｅがミニサークルベクター中で有用である。発現カセットは、転写開始部位、転写停止部位、および転写領域中に翻訳のためのリボソーム結合部位を含み得る。構築体によって発現される転写物のコード部分には、先頭に翻訳開始コドンおよび翻訳するポリペプチドの最後に適切に配置された停止コドン（ＵＡＡ、ＵＧＡ、またはＵＡＧ）が含まれることができる。プラスミドには、少なくとも１つの選択マーカー、例えば、真核細胞培養物ではジヒドロ葉酸還元酵素、Ｇ４１８、またはネオマイシン耐性のマーカー；ならびに大腸菌中での培養および他の原核細胞の培養物ではテトラサイクリン、カナマイシン、またはアンピシリン耐性遺伝子が含まれ得る。プラスミドを生じるミニサークルには、適切な真核または原核宿主細胞中でのベクターの増殖を可能にする、少なくとも１つの複製起点が含まれ得る。例えば「Ｇｅｎｅｓ ＩＩ」、Ｌｅｗｉｎ， Ｂ．編、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８５年）に記載のとおり、複製起点は当分野で知られている。ミニサークルから産生されたＦＧＦＲ融合タンパク質も、上述のマーカー配列に融合することができる。
（融合パートナーおよびコンジュゲート）
遺伝子操作技術により、望ましい薬物動態学特性を与える融合パートナーを有する組換え治療タンパク質の開発および使用が可能となった。その免疫原性エピトープおよび他の断片を含めたＦＧＦＲポリペプチドは、異種分子と組み合わせることができ、その結果、治療上有用な融合分子が生じる。本発明は、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３、およびＦＧＦＲ４のうちの任意のものの細胞外ドメインを含む融合分子を提供する。これは、好ましい薬物動態学および／または薬力学をＦＧＦＲに与えることができる融合パートナーを提供する。一実施形態では、本発明は、ＦＧＦＲ１−ＩＩＩｂ、ＦＧＦＲ１−ＩＩＩｃ、ＦＧＦＲ２−ＩＩＩｂ、ＦＲＦＲ２−ＩＩＩｃ、ＦＧＦＲ３−ＩＩＩｂ、ＦＧＦＲ３−ＩＩＩｃ、ＦＧＦＲ４、またはその断片の細胞外ドメインの全体または一部と抗体Ｆｃドメインなどの融合パートナーとを含む融合分子を提供する。
ＦＧＦＲは多くの正常組織中で発現され、多くの細胞種は複数のＦＧＦＲを発現する。このことを考慮して、ＦＧＦＲを標的とする治療剤を、正常組織に害を与えずに、治療した対象の循環中に十分長い間持続するようにさせる方法は、明らかではない。
本発明の融合分子は、ＦＧＦＲ細胞外ドメインと比較してｉｎ ｖｉｖｏでの半減期が増加している。本明細書中に記載のＦＧＦＲ融合分子の長期の半減期は、ＦＧＦＲ単独よりも低い用量および頻度の低い投薬レジメンしか必要としない可能性がある。結果としてもたらされるＦＧＦＲ血清レベルの変動の減少により、ＦＧＦＲ治療剤の安全性および許容性を向上させることができる。
融合パートナーをＦＧＦＲのＣ末端に連結するか、または、ＦＧＦＲを融合パートナーのＣ末端に連結することができる。融合パートナーは、酵素の切断部位を含んでいても含んでいなくてもよいリンカー、例えばペプチドリンカーを含み得る。また、融合パートナーは、酸性細胞内区画、例えば酸エンドソームまたはリソソーム内のＦＧＦＲに対する受容体結合性の向上を与えることによってｉｎ ｖｉｖｏでの半減期を延ばす分子も含み得る。
本発明の融合パートナーには、ポリマー、ポリペプチド、親油性部分、およびスクシニル基が含まれる。ポリペプチド融合パートナーの例には、血清アルブミンおよび抗体Ｆｃドメインが含まれる。ポリマー融合パートナーは、１つまたは複数のポリエチレングリコール部分、分枝鎖または直鎖を含み得る。親油性融合パートナーは、融合分子の皮膚透過性を増加させ得る。
（オリゴマー化ドメイン融合タンパク質）
オリゴマー化は、融合タンパク質に多価結合、結合強度の増加、および異なるドメインの合わせた機能を含めた機能的利点を提供する。これらの特徴は天然タンパク質で見られ、タンパク質工学によっても導入し得る。したがって、本発明はＦＧＦＲ融合分子を提供し、融合パートナーはオリゴマー化ドメイン、例えば二量体化ドメインを含む。適切なオリゴマー化ドメインには、α−ヘリックスコイルドコイルドメインを含めたコイルドコイルドメイン；コラーゲンドメイン；コラーゲン様ドメイン、および二量体免疫グロブリンドメインが含まれる。本発明の適切なコイルドコイルポリペプチド融合パートナーには、テトラネクチンコイルドコイルドメイン、軟骨オリゴマーマトリックスタンパク質のコイルドコイルドメイン；アンジオポイエチンコイルドコイルドメイン；およびロイシンジッパードメインが含まれる。融合パートナーとしてコラーゲンまたはコラーゲン様オリゴマー化ドメインを有するＦＧＦＲ融合分子は、例えば、コラーゲン中に見つかるもの、マンノース結合レクチン、肺界面活性プロテインＡおよびＤ、アディポネクチン、フィコリン、コングルチニン、マクロファージスカベンジャー受容体、およびエミリンを含み得る。
（抗体Ｆｃドメイン融合タンパク質）
一実施形態では、本発明は、Ｆｃ免疫グロブリンドメインを有する融合分子を提供する。本発明のＦＧＦＲ融合タンパク質は、Ｆｃ、哺乳動物免疫グロブリンの重鎖もしくは軽鎖の定常領域の様々なドメインおよび／またはヒトＣＤ４ポリペプチドの最初の２つのドメインを含むことができる。
一実施形態では、ヒトＦｃドメイン融合パートナーはＦｃドメイン全体を含む。一実施形態では、これは、Ｆｃドメインの１つまたは複数の断片を含む。例えば、これは、ヒンジとヒトＩｇＧ、例えば、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、またはＩｇＧ４のＣＨ２およびＣＨ３定常ドメインとを含み得る。本発明はＦＧＦＲ融合タンパク質を提供し、融合パートナーは改変体Ｆｃポリペプチドまたは改変体Ｆｃポリペプチドの断片である。改変体Ｆｃは、米国特許第６，９００，２９２号に記載のように、Ｐ３３１Ｓ突然変異を有するヒトＩｇＧ２のヒンジ、ＣＨ２、およびＣＨ３ドメインを含み得る。
一実施形態では、本発明の融合タンパク質は、ＩｇＧのＦｃのヒンジ領域中のシステイン残基を介して連結したホモ二量体タンパク質であってよく、これにより、ＩｇＧ分子に類似しているがＣＨ１ドメインおよび軽鎖を有さない分子が生じる。
融合タンパク質を作製する方法は当業者に周知である。一実施形態では、本発明のＦｃ融合パートナーは、配列番号１７１、配列番号１７２、および配列番号１７３のうちの任意のアミノ酸配列を含む。
（アルブミン融合タンパク質）
本発明は、ヒト血清由来のアルブミン（ヒト血清アルブミンすなわち「ＨＳＡ」）、アルブミンの１つもしくは複数の断片、アルブミンに結合するペプチド、および／またはアルブミンに結合する脂質もしくは他の分子とコンジュゲート形成する分子を含むアルブミン融合パートナーを有する、ＦＧＦＲ融合分子を提供する。一実施形態では、本明細書中に記載し、インターフェロンα−ＨＳＡ融合分子に関して米国特許第６，６８６，１７９号にさらに記載されているように、ＦＧＦＲ−ＨＳＡ融合分子を調製し得る。
（二量体ＦＧＦＲ融合タンパク質）
本発明はＦＧＦＲ融合タンパク質を提供し、融合パートナーはＦＧＦＲ細胞外ドメインまたはその活性のある断片を含む。例えば、融合タンパク質は、２つのＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３、もしくはＦＧＦＲ４細胞外ドメインまたは生物活性のあるその断片を含み得る。また、融合分子は、上記により詳細に記載したように、２つの異なるＦＧＦＲ細胞外ドメインまたは生物活性のあるその断片の異種の組合せを含み得る。
一実施形態では、ＦＧＦＲ融合タンパク質は、ＦＧＦＲの細胞外ドメインおよび／またはその活性断片の１つを含み、二量体化ドメインならびにＦＧＦＲ細胞外ドメインを含む融合パートナーをさらに含む。融合パートナーがＦｃドメインまたはその活性のある断片などの二量体化ドメインを含む場合は、哺乳動物細胞発現系中で発現されるＦＧＦＲ融合タンパク質は、産生プロセス中に自然に二量体を形成し得る。
（ペグ化された部分を有する融合タンパク質）
上述の組換え分子に加えて、本発明はＦＧＦＲ融合分子を提供し、融合パートナーは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分などのポリマーを含む。本発明のＰＥＧ部分は、分枝鎖または直鎖ポリマーであり得る。一実施形態では、本発明は、モノ−またはポリ−（例えば２−４）ＰＥＧ部分を含めた、化学的に誘導体化したポリペプチドを企図する。ペグ化は、当分野で知られている任意のペグ化反応によって実施し得る。ペグ化されたタンパク質産物の調製方法は一般に当分野で知られている。最適な反応条件は、既知のパラメータおよび所望の結果に応じてケースバイケースの基準で決定する。
当業者が利用可能ないくつかのＰＥＧ付着方法、例えば、欧州特許ＥＰ０ ４０１ ３８４号；Ｍａｌｉｋら、Ｅｘｐ． Ｈｅｍａｔｏｌ．、２０：１０２８〜１０３５頁（１９９２年）；Ｆｒａｎｃｉｓ、Ｆｏｃｕｓ ｏｎ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒｓ、３：４〜１０頁（１９９２年）；欧州特許ＥＰ０ １５４ ３１６号；欧州特許ＥＰ０ ４０１ ３８４；国際公開公報ＷＯ９２／１６２２１号；国際公開公報ＷＯ９５／３４３２６号；および本明細書中で引用したペグ化に関連する他の出版物が存在する。
ペグ化は、反応性ポリエチレングリコール分子を用いたアシル化反応またはアルキル化反応を介して行い得る。したがって、本発明のタンパク質産物にはペグ化されたタンパク質が含まれ、ＰＥＧ基はアシルまたはアルキル基を介して付着している。そのような産物は、モノ−ペグ化またはポリ−ペグ化されていてよい（例えば２−６もしくは２−５ＰＥＧ基を含むもの）。ＰＥＧ基は、一般に、アミノ酸のα−またはε−アミノ基でタンパク質に付着しているが、ＰＥＧ基が、適切な反応条件下でＰＥＧ基に付着することができるように十分な反応性を有する、タンパク質に付着している任意のアミノ基に付着できることも、企図される。
アシル化によるペグ化は、一般に、ＰＥＧの活性エステル誘導体を本発明のポリペプチドと反応させることを含む。アシル化反応には、選択したポリマー（または複数のポリマー）は、典型的には単一の反応性エステル基を有する。任意の既知または今後発見される反応性ＰＥＧ分子を用いて、ペグ化反応を実施し得る。適切な活性化したＰＥＧエステルの例は、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）にエステル化したＰＥＧである。本明細書中で使用するアシル化には、限定はしないが、治療剤タンパク質とＰＥＧなどのポリマーとの間の以下の種類の連結、すなわちアミド、カルバミン酸、ウレタンなどが含まれることが企図される。例えば、Ｃｈａｍｏｗ、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．、５：１３３〜１４０頁（１９９４年）を参照されたい。反応条件は、ペグ化の分野で知られている条件または今後開発される条件のうち任意のものから選択し得るが、修飾するポリペプチドを失活させる温度、溶媒、およびｐＨなどの条件を回避すべきである。
アシル化によるペグ化は、一般にポリ−ペグ化されたタンパク質をもたらす。結合する連結はアミドであり得る。生じる産物は、実質的にモノ、ジ−またはトリ−ペグ化のみ（例えば＞９５％）され得る。しかし、より高い程度のペグ化を有する一部の種を、用いる特定の反応条件に依存する量で形成し得る。所望する場合は、とりわけ透析、塩析、限外濾過、イオン−交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、および電気泳動を含めた標準の精製技術によって、より精製されたペグ化種を混合物（具体的には未反応の種）から分離し得る。
アルキル化によるペグ化は、一般に、還元剤の存在下でＰＥＧの末端アルデヒド誘導体をポリペプチドと反応させることを含む。還元性アルキル化反応には、選択したポリマー（または複数のポリマー）は、単一の反応性アルデヒド基を有するべきである。例示的な反応性ＰＥＧアルデヒドは、水に安定なポリエチレングリコールプロピオンアルデヒド、またはそのモノＣ１〜Ｃ１０アルコキシもしくはアリールオキシ誘導体である。例えば、米国特許第５，２５２，７１４号を参照されたい。
（改変体および突然変異体ポリペプチド）
本発明のＦＧＦＲ融合タンパク質は、ＦＧＦＲ融合タンパク質のネイティブ特徴を改善または変更するためのタンパク質工学によって作製することができる。当業者に知られている組換えＤＮＡ技術を用いて、単一または複数のアミノ酸の置換、欠失、および付加を含めた、新規突然変異体タンパク質すなわち「ムテイン」を作製することができる。このような修飾ポリペプチドは、活性の増強または安定性の増加など、治療剤において望ましい特性を保有することができる。さらに、これらをより高い収量で精製してもよく、少なくとも特定の精製および保存条件下で、対応する天然ポリペプチドよりも水溶性が高くてもよい。
（ＦＧＦＲのＥＣＤの突然変異体）
上述のように、本発明は、ＦＧＦＲ細胞外ドメインのアミノ酸配列のアミノおよび／またはカルボキシル末端から１つまたは複数の残基が欠失したポリペプチド融合分子を提供する。例えば、本発明は、Ｃ末端領域に欠失を有する、ＦＧＦＲ細胞外ドメインの欠失突然変異体を提供する。本発明は、膜貫通ドメインのＮ末端側で隣接する領域中の１つまたは複数のアミノ酸を欠く欠失突然変異体を提供する。
一実施形態では、本発明は、野生型ＦＧＦＲポリペプチドのＥＣＤの改変体を含むＦＧＦＲ融合タンパク質を提供し、改変体はＥＣＤのＣ末端、例えばＭＭＰ−２切断部位の領域中に欠失または点突然変異を有する。これらの改変体は、野生型ＦＧＦＲ細胞外ドメインよりもＭＭＰ−２による切断に対して高い耐性を有し得る。一実施形態では、本発明は、ＭＭＰ−２切断部位が除去され、野生型ＦＧＦＲ細胞外ドメインよりもＭＭＰ−２による切断に対する耐性が高い欠失突然変異体である、ＦＧＦＲ細胞外ドメインを提供する。例えば、本発明は、ＩｇＩＩＩドメインのＣ末端かつＦｃドメインのＮ末端側で、ＦＧＦＲ細胞外ドメインのその領域の欠失突然変異体を提供する。この領域中の７つのＦＧＦＲ細胞外ドメインのうちの任意のドメインの、任意の１つまたは複数のアミノ酸が、欠失または他の様式で突然変異していてよい。例として、本発明は、図１Ａに示すＲ１Ｍｕｔ１、Ｒ１Ｍｕｔ２、Ｒ１Ｍｕｔ３、およびＲ１Ｍｕｔ４；図１Ｂに示すＲ１Ｍｕｔ７；ならびに図２に示すＲ４Ｍｕｔ１、Ｒ４Ｍｕｔ２、Ｒ４Ｍｕｔ３、Ｒ４Ｍｕｔ４、およびＲ４Ｍｕｔ５に対応する、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３、およびＦＧＦＲ４の欠失突然変異体を提供する。これらの改変体およびそれらの親の突然変異していないポリペプチドはすべて、少なくとも１つのＦＧＦリガンドに結合する。これらの突然変異体およびそれらの親ＦＧＦＲのリガンド結合特徴は、当分野で知られている結合アッセイによって決定することができる。
一実施形態では、本発明は、ＦＧＦＲおよび／またはその生物活性のある断片の１つまたは複数の可溶性細胞外ドメインを含む第１の分子と第２の分子とを含むＦＧＦＲ融合分子を提供し、第２の分子は動物中の第１の分子に半減期の延長を与え、第２の分子は天然に存在するＦｃポリペプチド以外であり、融合分子は改変体Ｆｃポリペプチドである。
ＦＧＦＲ１−ＩＩＩｃ−Ｆｃ融合タンパク質を宿主細胞中で産生させ、動物内に注射し、ゲル電気泳動によって検査した場合、ｉｎ ｖｉｖｏおよびｉｎ ｖｉｔｒｏの両方でＦＧＦＲ１−ＩＩＩｃ−Ｆｃが部分的に切断されたことが観察された。細胞培養培地および血清試料中の分解された断片は、Ｆｃ融合パートナーを融合タンパク質から切断した後に予測された断片の大きさと矛盾がなかった。ＦＧＦＲ１−ＩＩＩｃ−Ｆｃにｉｎ ｖｉｔｒｏで外因的に付加したＭＭＰ−２は、血清および培地中で観察された分解された断片を再現した。
したがって、本発明は、切断に耐性があり、天然に存在する形態と比較して改善した薬物動態学プロフィールを有する組換えＦＧＦＲ融合タンパク質を提供する。例えば、本発明は、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏのどちらにおいても分解に対する耐性がより高いＦＧＦＲ融合タンパク質を提供する。これらのＦＧＦＲ融合タンパク質構築体は、血清プロテアーゼの切断部位中に単一のアミノ酸変化を有し得る。また、これらは、切断部位の全体的な欠失を有し得る。これらの構築体は、当業者に知られている方法を用いて天然に存在する配列を変更することによって作製することができる。本発明はまた、当業者に知られている方法によって、受容体の細胞外ドメインと膜貫通ドメインとの間の接合部が改変されてタンパク質分解部位が除去されているＦＧＦＲ構築体も提供する。
上述の欠失突然変異体に加えて、本発明は、ＭＭＰ−２による切断に対する耐性を有する置換突然変異体などの単一点突然変異体を提供する。ＭＭＰ−２の天然基質は、ＭＭＰ−２切断部位に３残基Ｎ末端側でプロリンが優勢であるが、この部位でメチオニンまたはグリシン残基を有すると記載されていない。したがって、本発明は、Ｒ１Ｍｕｔ８（Ｐ３６４Ｍ）、Ｒ１Ｍｕｔ９（Ｍ３６７Ｎ）、およびＲ１Ｍｕｔ１０（Ｐ３６４Ｇ）に対応する点突然変異体、例えば図１Ｂに示すものを提供する。Ｐ３６４Ｍは類似の疎水性プロフィールを有することが予測され、Ｐ３６４Ｇは野生型よりも柔軟性が高いことが予測される。また、例として、本発明は、ＭＭＰ−２切断部位のメチオニンのＭ３６７Ｎ置換突然変異を提供する。アスパラギン（Ｎ）はどの天然または合成ＭＭＰ−２基質にも記載されていないので、その置換はＭＭＰ−２による切断を減弱または防止すると予測できる。Ｍ３６７Ｎ突然変異はまた、潜在的なグリコシル化部位、すなわちＮＴＳをＦＧＦＲ１のＥＣＤ内に導入する。このグリコシル化部位がｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで宿主細胞によって利用される場合は、Ｎ連結した糖は、ＦＧＦＲ１−ＩＩＩｂまたはＦＧＦＲ１−ＩＩＩｃ細胞外ドメインをタンパク質分解からさらに遮蔽することができる。本発明はさらに、ＦＧＦＲ１−ＩＩＩｂまたはＦＧＦＲ１−ＩＩＩｃの二重改変体、Ｐ３６４Ｇ／Ｍ３６７Ｎを提供する。本発明の任意の突然変異体は、任意選択でリンカー配列を含み得る。
上述のＦＧＦＲ融合分子の欠失および置換突然変異体に加えて、本発明は、挿入、反転、および反復突然変異体を提供する。ＦＧＦＲ融合分子のいくつかのアミノ酸配列は、タンパク質の構造または機能に顕著な影響を与えずに変化させることができる一方で、他のアミノ酸配列は活性の決定に重大である。したがって、本発明は、実質的なＦＧＦＲポリペプチド活性を示す、および／またはＦＧＦＲ細胞外ドメインの領域が含まれる、ＦＧＦＲ融合タンパク質の改変体が含まれる。本発明の突然変異体は、野生型ＦＧＦＲの受容体活性を有し得るか、あるいはＦＧＦリガンド結合能力に関して、野生型と比較して、活性が増強もしくは減少しているか、または範囲が広がっていてよい。これらの突然変異体の作製方法は一般に当分野で知られている。
本発明のＦＧＦＲ融合タンパク質の改変体を作製することができ、それらは本明細書中に含まれる。どのようにして表現型がサンレントなアミノ酸置換を行うかの指針は、Ｂｏｗｉｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４７：１３０６〜１３１０頁（１９９０年）に提供されている。遺伝子操作技術を用いてＦＧＦＲ融合タンパク質の特異的な位置でアミノ酸変化を導入することができ、選択すなわちスクリーニングを用いて機能性を維持している配列を同定することができる。
例えば、本明細書中で言及した技術に従って、アミノ酸置換に耐用があるタンパク質を産生することができる。この技術は、どのアミノ酸変化がタンパク質の特定の位置で許容される可能性が高いかを示す。例えば、ほとんどの埋まったアミノ酸残基は無極性の側鎖を必要とするが、表面側鎖のいくつかの特徴は一般に保存される。典型的には、脂肪族アミノ酸Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、およびＩｌｅ間の１つから別のものへの置換；ヒドロキシル残基ＳｅｒおよびＴｈｒの相互交換、酸性残基ＡｓｐおよびＧｌｕの交換、アミド残基ＡｓｎおよびＧｌｎ間の置換、塩基性残基ＬｙｓおよびＡｒｇの交換、ならびに芳香族残基ＰｈｅおよびＴｙｒ間の置換などの、ＦＧＦＲ融合タンパク質の保存的置換が耐用される。帯電したアミノ酸を他の帯電したまたは中性のアミノ酸で置換することにより、凝集の軽減などの望ましい改善された特徴を有するタンパク質が産生され得る。凝集は、活性を低下させるだけでなく、例えば、凝集体は免疫原性である場合があるので、薬剤配合物を調製する際にも問題となり得る（Ｐｉｎｃｋａｒｄら、Ｃｌｉｎ． Ｅｘｐ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２：３３１〜３４０頁（１９６７年）；Ｒｏｂｂｉｎｓら、Ｄｉａｂｅｔｅｓ、３６：８３８〜８４５頁（１９８７年）；Ｃｌｅｌａｎｄら、Ｃｒｉｔ． Ｒｅｖ． Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ、１０：３０７〜３７７頁（１９９３年））。上述のＦＧＦリガンドとＦＧＦＲとの結合は、選択的であり重複している。選択されたリガンドは特定のＦＧＦＲに結合するが、複数のリガンドが１つの受容体に結合することができ、１つのＦＧＦリガンドは複数のＦＧＦＲに結合し得る。本発明のＦＧＦＲ融合タンパク質中のアミノ酸を突然変異させることにより、ＦＧＦＲに対するＦＧＦリガンド結合の選択性を変更することができる。
（トランスジェニック、ノックアウト、および他の動物）
本発明は、それぞれ外来性ＦＧＦＲを発現するおよび内在性ＦＧＦＲを欠くトランスジェニックおよびノックアウト動物、ならびに本発明のＦＧＦＲ融合タンパク質またはそれをコードしている核酸分子を注射した動物を提供する。本発明のトランスジェニック動物は一般に、外来性プロモーターおよびＦＧＦＲ細胞外ドメインを含むベクターを用いて本明細書中に記載のＦＧＦＲ融合分子を発現させ、ベクターを事前に決定された座位に標的化することによって作製し、ＦＧＦＲ融合導入遺伝子の発現パターンは外来性プロモーターの発現パターンによって決定される。ノックアウトマウスは一般に、内在性ＦＧＦＲを選択的に失活させ、それを突然変異体対立遺伝子で置き換えることによって作製する。
それだけには限定されないが、マウス、ラット、ウサギ、ハムスター、モルモット、ブタ、マイクロブタ、ヤギ、ヒツジ、ウシ、ならびに非ヒト霊長類、例えば、ヒヒ、サル、およびチンパンジーを含めた任意の種の非ヒト動物を用いて、トランスジェニックおよびノックアウト動物を作製し得る。具体的な実施形態では、本明細書中に記載の技術または他の様式で当分野において知られている技術を用いて、ヒト中で本発明のＦＧＦＲ融合分子を遺伝子治療プロトコルの一部として発現させる。
当分野で知られている任意の技術を用いて、ＦＧＦＲ導入遺伝子を動物内に導入してトランスジェニック動物の創始系を作製し得る。既知の技術を用いて、内在性ＦＧＦＲ遺伝子の「ノックアウト」も行い得る。トランスジェニックおよびノックアウトマウスを作製するための技術には、それだけには限定されないが、前核微量注入（Ｐａｔｅｒｓｏｎら、Ａｐｐｌ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、４０：６９１〜６９８頁（１９９４年）；Ｃａｒｖｅｒら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ （ＮＹ）、１１：１２６３〜１２７０頁（１９９３年）；Ｗｒｉｇｈｔら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ （ＮＹ）、９：８３０〜８３４頁（１９９１年）；およびＨｏｐｐｅら、米国特許第４，８７３，１９１号（１９８９年））；レトロウイルスに媒介された生殖系列、胚盤胞、または胚への遺伝子導入（Ｖａｎ ｄｅｒ Ｐｕｔｔｅｎら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．、８２：６１４８〜６１５２頁（１９８５年））；胚性幹細胞中への遺伝子標的化（Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、Ｃｅｌｌ、５６：３１３〜３２１頁（１９８９年））；細胞または胚の電気穿孔（Ｌｏ、Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ．、３：１８０３〜１８１４頁（１９８３年））；遺伝子銃を用いた本発明のポリヌクレオチドの導入（Ｕｌｍｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５９：１７４５頁（１９９３年））；核酸構築体を胚性分化多能性幹細胞内に導入し、幹細胞を胚盤胞内に戻して形質移入させること；および精子媒介の遺伝子導入（Ｌａｖｉｔｒａｎｏら、Ｃｅｌｌ、５７：７１７〜７２３頁（１９８９年）が含まれる。そのような技術の総説には、Ｇｏｒｄｏｎ、Ｉｎｔｌ． Ｒｅｖ． Ｃｙｔｏｌ．、１１５：１７１〜２２９頁（１９８９年）；米国特許第５，４６４，７６４号（Ｃａｐｅｃｃｈｉら）；米国特許第５，６３１，１５３号（Ｃａｐｅｃｃｈｉら）；米国特許第４，７３６，８６６号（Ｌｅｄｅｒら）；および米国特許第４，８７３，１９１号（Ｗａｇｎｅｒら）を参照されたい。当分野で知られている任意の技術、例えば、静止状態を誘導した、培養した胚性、胎児、または成体細胞由来の核の徐核した卵母細胞内への核移植を用いて、本発明のポリヌクレオチドを含むトランスジェニッククローンを作製し得る（Ｃａｍｐｂｅｌｌら、Ｎａｔｕｒｅ、３８０：６４〜６６頁（１９９６年）；Ｗｉｌｍｕｔら、Ｎａｔｕｒｅ、３８５：８１０〜８１３頁（１９９７年））。
遺伝子標的化を用いてＦＧＦＲ導入遺伝子を内在遺伝子の染色体部位内に組み込むことができる。手短に述べると、染色体配列との相同組換えを介して内在遺伝子のヌクレオチド配列内に組み込んでその機能を破壊する目的のために、内在遺伝子に相同的なヌクレオチド配列を含むベクターを設計する。また、例えばＧｕら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２６５：１０３〜１０６頁（１９９４年）の教示に従うことによって、ＦＧＦＲ導入遺伝子を特定の細胞種内に選択的に導入し、それによりその細胞種内でのみ内在ＦＧＦＲ遺伝子を不活性化してもよい。そのような細胞種特異的な不活性化に必要な調節配列は目的の特定細胞種に依存し、当業者には明らかである。
組換えＦＧＦＲ導入遺伝子またはノックアウト対立遺伝子の発現は、標準の技術を用いて本発明の動物でアッセイを行い得る。最初のスクリーニングは、導入遺伝子またはヌル対立遺伝子の組込みが起こったことを確認するためにサザンブロット分析またはＰＣＲ技術によって行い得る。動物組織における導入遺伝子またはヌル対立遺伝子のｍＲＮＡ発現のレベルは、それだけには限定されないが、ノーザンブロット分析、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション分析、および逆転写酵素−ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）が含まれる技術によって評価し得る。ＦＧＦＲ導入遺伝子を発現する試料またはＦＧＦＲヌル組織の試料も、特異的抗体を用いて免疫細胞科学的または免疫組織化学的に評価し得る。
本発明は、そのすべての細胞中にＦＧＦＲ導入遺伝子を保有するトランスジェニック動物、およびモザイクまたはキメラ動物などの、その一部の細胞中に導入遺伝子を保有する動物を提供する。導入遺伝子は、コンカテマー、例えば、頭−頭の直列もしくは頭−尾の直列などで、単一の導入遺伝子または複数コピーとして組み込まれていてよい。また、例えばＬａｓｋｏら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．、８９：６２３２〜６２３６頁（１９９２年））の教示に従うことによって、ＦＧＦＲ導入遺伝子を特定の細胞種内に選択的に導入して活性化させてもよい。そのような細胞種に特異的な活性化に必要な調節配列は目的の特定細胞種に依存し、当業者には明らかである。
創始トランスジェニック動物を繁殖、同系繁殖、異系繁殖、または交雑繁殖して特定の動物のコロニーを作製し得る。そのような繁殖戦略の例には、それだけには限定されないが、個別の系を確立するために複数の組込み部位を用いた、創始動物の異系繁殖；それぞれの導入遺伝子の付加的発現効果により導入遺伝子をより高いレベルで発現する複合トランスジェニックを作製するための、個別の系の同系繁殖；発現を増強するためおよびＤＮＡ分析によって動物のスクリーニングを行う必要性を排除するために所定の組込み部位に対してホモ接合性の動物を作製するための、ヘテロ接合性トランスジェニック動物の交雑；複合ヘテロ接合またはホモ接合系を作製するための、個別のホモ接合系の交雑；ならびに導入遺伝子を目的の実験モデルに適切な、明瞭な背景に配置するための繁殖が含まれる。
一実施形態では、本発明のＦＧＦＲ融合タンパク質は、国際公開公報ＷＯ０３／０２０７４３号に記載の方法によって作製したトランスジェニック非ヒト動物中で発現させる。この方法では、ほとんどまたはすべての細胞種で発現される座位を含めた１つまたは複数の事前に決定した座位を、導入目的遺伝子を含むカセットの標的とする。カセットは、導入遺伝子およびカセット中の任意選択の制御またはアクセサリー遺伝子の発現を指示する自律単位として機能することができる。導入遺伝子は、カセット内の外来性プロモーターの制御下で発現される。したがって、導入遺伝子の発現パターンは外来性プロモーターの性質によって決定される。
本発明のトランスジェニックおよびノックアウト動物は、それだけには限定されないが、ＦＧＦＲの生物学的機能を詳しく調べるために有用な動物モデル系、ＦＧＦＲの異常発現に関連する状態および／または障害の研究、ならびにこれらの状態および／または障害の改変または寛解に有効な化合物のスクリーニングを含む用途を有する。
本発明の核酸分子またはＦＧＦＲ融合タンパク質を含む動物は、例えば水力学的尾静脈形質移入方法によって、および例えば既に記載したミニサークルベクター構築体を用いて、ＦＧＦＲ融合タンパク質または核酸構築体のどちらかを注射した動物である。
（囮受容体トラップとしてのＦＧＦＲ融合タンパク質）
本発明のＦＧＦＲ融合タンパク質は、ＦＧＦリガンドを捕捉して、細胞表面上のＦＧＦＲとのその相互作用を阻害する囮受容体として機能することができる。本発明のものなどの囮受容体は、高い親和性および特異性でそのリガンドを認識するが、シグナル伝達を行う能力を構造的に有さない。これらはリガンド結合に対して野生型受容体と競合し、リガンド／受容体の相互作用に参加し、したがって機能的受容体の活性もしくは数および／または受容体から下流の細胞活性を調節する。囮受容体は、作用リガンドの分子トラップとして働くことによってリガンドに誘発される受容体活性化を阻害することができる。
本発明の教示以前には、腫瘍もしくは増殖性細胞がｉｎ ｖｉｖｏでＦＧＦ成長因子に依存しているかどうか、または腫瘍の進行もしくは細胞増殖を阻害するためにどのＦＧＦリガンドを遮断し得るかは、知られていなかった。さらに、ＦＧＦに誘発される増殖を遮断する能力がＦＧＦＲ活性化のレベルの低下と相関していることは、以前に報告されていない。
本発明のＦＧＦＲ融合タンパク質は、他の囮受容体トラップと組み合わせて用いることができる。エタネルセプト（Ｅｎｂｒｅｌ（登録商標））は、ヒトＴＮＦ−α受容体の細胞外リガンド結合ドメインとヒトＩｇＧ１のＦｃ領域との融合タンパク質を含む、遺伝子操作した囮受容体トラップの例である。これは、ＴＮＦ−αと細胞表面上の天然に存在するＴＮＦ−α受容体との結合を競合的に阻害することでＴＮＦ−αに誘発される炎症誘発活性を阻害することによって、囮として働く。エタネルセプトはサイトカインの「スポンジ」およびＴＮＦ−α拮抗剤として働き、ＴＮＦ−αを生物学的に不活性にする（Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒｇら、Ｃｌｉｎ． Ｔｈｅｒ．、２１：７５〜８７頁（１９９９年））。これは、関節リウマチ、若年性関節リウマチ、乾癬性関節炎、および強直性脊椎炎の治療に用いられる。
また、本発明のＦＧＦＲ融合タンパク質は、可溶性組換え囮融合タンパク質の別の例であり、現在臨床治験中であるＶＥＧＦトラップと共に用いることもできる。ヒト血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）受容体の１つまたは複数の細胞外リガンド結合ドメインとヒトＩｇＧ１のＦｃ領域との遺伝子操作した融合タンパク質であるＶＥＧＦトラップは、天然に存在する細胞表面ＶＥＧＦ受容体に対する囮として働くことによって血管形成を阻害する。ＶＥＧＦ囮は、血管形成を阻害することによって、その生存能が血管形成に依存する腫瘍を縮小することができる。囮トラップの生物活性は、トラップ中で用いる受容体の部分に依存する。例えば、ＶＥＧＦＲ１受容体アイソフォームの最初の３つのＩｇドメインとヒトＩｇＧ１のＦｃ領域との融合タンパク質は、ピコモル範囲の親和性でＶＥＧＦと結合し、強力な抗腫瘍活性を有するが、短いｉｎ ｖｉｖｏでの半減期および顕著な毒性を有する（Ｈｏｌａｓｈら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．、９９：１１、３９３〜１１、３９８頁（２００２年））。ＶＥＧＦ囮融合タンパク質は、ｉｎ ｖｉｖｏでの薬物動態学および薬力学的なプロフィールを延長する、毒性を最小限にする、ならびに成長および血管化を強力に阻害するように、操作することができる。塩基性の高い１０個のアミノ酸配列を第３のＶＥＧＦ１のＩｇドメインから除去すること、第１のＶＥＧＦ１のＩｇドメイン全体を除去すること、およびＶＥＧＦＲ１の第２のＩｇドメインとＶＥＧＦＲ２の第３のＩｇドメインとを融合することにより、臨床的パラメータが改善されることが報告されている（Ｈｏｌａｓｈら、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．、９９：１１、３９３〜１１、３９８頁（２００２年））。ＦＧＦＲ融合タンパク質およびＶＥＧＦトラップの組合せは、血管形成の阻害において、どちらか単独よりも強力である可能性がある。
本発明はＦＧＦＲ囮受容体トラップ融合タンパク質を提供し、以下により詳細に示すように、これらがリガンドとＦＧＦＲとの結合を阻害することを実証する。囮融合タンパク質は、リガンドを捕捉してリガンド−受容体の結合を阻止する。ＦＧＦＲ受容体トラップ融合タンパク質が受容体−リガンド結合を阻害する能力は、以下により詳細に記載するように、当分野で知られているアッセイ、例えば競合ＥＬＩＳＡアッセイを用いて実証することができる。
本発明は、治療剤としてのＦＧＦＲ囮受容体トラップを提供する。本発明のＦＧＦＲ囮受容体トラップは、正常状態と比較して増殖性疾患状態で過剰発現されることが実証されている、本明細書中により詳細に記載する様々なＦＧＦと結合する。これらのトラップは、非常に高い親和性でＦＧＦリガンドと結合することができ、例えば、約１５ピコモーラーのＫｄでＦＧＦ−２と結合し得る。さらに、これらのトラップは異常組織においてＦＧＦシグナル伝達を妨げることができる。例えば、本発明のＦＧＦＲ１−ＩＩＩｃ−ＦｃおよびＦＧＦＲ４−Ｆｃトラップは、ＦＧＦＲ１−ＩＩＩｃおよびＦＧＦＲ４、ならびに場合によってはＦＧＦＲファミリー他のメンバーのシグナル伝達を弱めることができる（Ｚｈａｎｇら、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．、２８１：１５、６９４〜１５、７００頁（２００６年））。
遺伝子トラップベクターを胚性幹細胞内に導入することにより、目的の受容体ドメインの遺伝子発現パターンを反映するトランスジェニック動物系が作製されている（Ｃｏｆｆｉｎら、「Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ」、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂ． Ｐｒｅｓｓ（１９９７年））。したがって、本発明は、正常および疾患状態に関連するシグナル伝達現象中のＦＧＦＲ遺伝子の離散的な発現パターンを同定するための、ＦＧＦＲ遺伝子トラップベクターの使用を提供する。レポーター遺伝子の活性化が活性転写単位内へのその挿入に依存するように、レポーター遺伝子を有するがプロモーターを欠く構築体を設計する。組込みの結果、内在転写単位のパターンを反映する発現パターンがもたらされる。レポーター遺伝子は、転写単位の「トラップ」された遺伝子をクローニングするための分子タグを提供する。遺伝子トラップベクターと共に用いることができるレポーター系は当分野で知られている。挿入に続いて、レポーター遺伝子産物についてアッセイを行うことによって、タグ付けした遺伝子を空間的および時間的に検出することができる。
（リガンド−受容体結合の実時間検出）
本明細書中に記載のように、ＦＧＦは特定の病状において過剰発現される。囮受容体トラップとして働くことによって、ＦＧＦＲ融合タンパク質は過剰発現されたＦＧＦの生物活性を弱毒化する。特定のＦＧＦＲ融合タンパク質とｉｎ ｖｉｔｒｏで結合するＦＧＦのプロフィールにより、その融合タンパク質のｉｎ ｖｉｖｏでの治療プロフィールを予測することができる。したがって、本発明は、本発明のＦＧＦＲ融合タンパク質のリガンド結合プロフィールおよびＦＧＦリガンドを過剰発現する疾患を治療するために本発明のＦＧＦＲ融合分子を使用する方法を提供する。
本発明は、結合相互作用を実時間で測定するためにバイオセンサーチップを利用するＢｉａｃｏｒｅ技術（Ｂｉａｃｏｒｅ；ニュージャージー州Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ）を用いた表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）による、直接のリガンド−受容体結合の測定を提供する（Ｄａｗｓｏｎら、Ｍｏｌｅｃ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ．、２５：７７３４〜７７４２頁（２００５年））。この技術はＳＰＲ光学現象に基づいており、センサーチップの表面近くで起こる屈折率の変化を検出する。相互作用する構成成分の一方を、センサーチップ表面に連結した柔軟なデキストラン層上に固定し、相互作用の相手を溶液中で、表面を横断するように流す。２つの構成成分間の相互作用により相互作用の相手が固定され、センサーチップ表面の質量が増加する。質量が増加した結果、光シグナルが生じ、これを共鳴単位（ＲＵ）で記録する。１ＲＵは、約１ピコグラムの表面に結合したタンパク質を表す。Ｂｉａｃｏｒｅ技術は、米国特許第６，９９９，１７５Ｂ２号；第６，８０８，９３８Ｂ２号；および第５，６４１，６４０号に記載されている。
以下により詳細に記載するように、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を測定するために、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）Ｘシステムを用いて本発明の融合タンパク質とのＦＧＦリガンド結合を測定した。この方法により、本発明のＦＧＦＲ融合タンパク質、例えば、ＦＧＦＲ１−ＩＩＩｃ−Ｆｃ、Ｒ１Ｍｕｔ４、ＦＧＦＲ３−ＩＩＩｃ−Ｆｃ、およびＦＧＦＲ４−Ｆｃに対するＦＧＦリガンドの相対的な親和性の順位が提供された。したがって、本発明は、本発明の結合ＦＧＦＲ融合タンパク質を投与することによる、正常よりも高いレベルで発現される１つまたは複数のＦＧＦを特徴とする疾患の治療方法を提供する。
（ＦＧＦＲ融合分子治療のバイオマーカー）
バイオマーカーを用いて、臨床治験の終点としての有効性の実証を含めた、ＦＧＦＲ融合タンパク質を用いた対象の治療の結果を監視することができる。適切なバイオマーカーは、ＦＧＦ−ＦＧＦＲシグナル伝達経路がＦＧＦＲ融合タンパク質によって影響を受けることを示す。例えば、ＦＧＦＲ１融合タンパク質で治療した対象におけるＦＧＦ−２レベルの減少は、融合タンパク質がＦＧＦ−２と結合し、活性ＦＧＦＲからそれを捕捉することを示し、したがって治療の有効性が実証されたことを示すので、ＦＧＦ−２はＦＧＦＲ１の適切なバイオマーカーである。
また、ＦＧＦＲシグナル伝達経路の構成成分も、治療の有効性を実証するためのバイオマーカーとして役割を果たし得る。例えば、ＦＧＦＲは、細胞内シグナル伝達によって細胞外リガンド結合に対する細胞内応答を生じる。無処置の膜貫通受容体の細胞外ドメインに結合するＦＧＦは、受容体の細胞質部分に存在する触媒的チロシンキナーゼドメインを活性化する。リガンドは、ＦＧＦＲが細胞質チロシン残基を自己リン酸化することを誘導し、これはその後、細胞内シグナル伝達タンパク質の高親和性の結合部位の一部として役割を果たす。これらのシグナル伝達タンパク質の一群である細胞外シグナル制御キナーゼ（Ｅｒｋ）（マイトジェン活性化タンパク質（ＭＡＰ）キナーゼとしても知られる）は、ＦＧＦＲがＥｒｋタンパク質上のスレオニンおよび近隣のチロシンをリン酸化した際に活性化される。報告によると、細胞表面ＦＧＦＲとのリガンド結合により、ＥｒｋからホスホＥｒｋ（ｐＥｒｋ）へのリン酸化が含まれるシグナル伝達カスケードが開始される。したがって、Ｅｒｋ活性化は、スレオニンおよびチロシン残基のリン酸化を測定することによって定量することができるＦＧＦＲ細胞内シグナル伝達活性の測定値を提供することによって、ＦＧＦＲ融合分子治療のバイオマーカーを提供する。Ｅｒｋ活性化は当分野で知られており、以下により詳細に実証されている方法によって決定することができる。細胞溶解液からＥｒｋを免疫学的に検出する市販の試薬が利用可能である。当分野で周知の方法によって、リン酸化されたＥｒｋを同定かつ測定するためにこれらの試薬を用いてＥＬＩＳＡおよび／またはウェスタンブロット分析を行うことができる。
また、ＦＧＦＲシグナル伝達経路の測定値を提供することによって、他のバイオマーカーを用いてＦＧＦＲ融合タンパク質治療を監視してもよい。例えば、リン酸化されたＦＧＦＲ（ｐＦＧＦＲ）の低下、または線維芽細胞成長因子受容体基質２（ｐＦＲＳ２）および／もしくは二重特異性ホスファターゼ（ＤＳＰ）の基底リン酸化レベルの低下は、効果的なＦＧＦＲ融合タンパク質を用いた治療を示す。
（ＦＧＦＲ融合タンパク質は増殖性細胞の生存度および／または増殖を阻害する）
増殖性細胞では、多くの場合、その生存および成長は成長因子による細胞外シグナル伝達に依存する。本発明のＦＧＦＲ融合タンパク質は、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏのどちらにおいても、癌細胞および他の増殖性細胞の生存度および／または増殖を阻害することができる。したがって、本発明は、本明細書中に記載のＦＧＦＲ融合タンパク質を提供し、融合タンパク質を対象に投与することによる、増殖性細胞の生存度および／または増殖の阻害方法、血管形成の阻害方法、ならびに対象における癌の治療方法を提供する。ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける細胞生存度および／または増殖に対するＦＧＦＲ融合タンパク質の効果を培養腫瘍細胞で検査し、ｉｎ ｖｉｖｏにおける腫瘍細胞の生存度および増殖に対するその効果を動物腫瘍モデルで検査した。
本発明では、細胞の生存度および増殖を決定するために、培養物中の生細胞の数を測定するために設計されたＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（商標）発光性細胞生存度アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ；ウィスコンシン州Ｍａｄｉｓｏｎ）（Ｓｕｓｓｍａｎら、Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃ． Ｄｅｖ．、５：７１〜７１頁（２００２年）を使用した。細胞性アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）のレベルは細胞生存度を示し、細胞が生存能を失った場合にＡＴＰレベルは迅速に低下する。このアッセイでは、代謝的に活性のある細胞、すなわち生細胞の指標としてＡＴＰを測定するために、ホタルルシフェラーゼの安定型を用いる。ルシフェラーゼは、ＡＴＰ、マグネシウム、および酸素の存在下で昆虫のルシフェリンを酸化ルシフェリンに変換する。その結果生じる発光性シグナルは、培養物中に存在する生細胞の数に比例し、ルミノメーターまたはＣＣＤカメラを用いて検出することができる。シグナルは細胞数に比例するので、これにより生存度および増殖をどちらも測定する。示した培地および血清条件下では、アッセイは広い範囲の細胞数にわたって直線的である。
本発明は、異形成細胞であれ、前悪性細胞であれ、悪性腫瘍細胞であれ、複数の増殖性細胞種の生存度および／または増殖を阻害するために本発明のＦＧＦＲ融合タンパク質を用いる方法；内皮細胞などの他の細胞種の生存度および／または増殖を阻害する方法；ならびにｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｅｘ ｖｉｖｏ、またはｉｎ ｖｉｖｏで血管形成を阻害する方法を提供する。以下により詳細に記載するように、本発明のＦＧＦＲ融合タンパク質を用いて、例えば、肺、腎臓、脳、乳房、肝臓、卵巣、前立腺、および／または結腸直腸の癌細胞を含めた様々な癌細胞種を阻害することができる。本発明のＦＧＦＲ融合タンパク質はそれぞれ、以下により詳細に示すように異なる癌細胞種に対して異なる特異性を有し、そのような特異性に応じて異なる種類の腫瘍の治療に用いることができる。
例えば、ＦＧＦＲ１−ＩＩＩｃ−Ｆｃ融合タンパク質などの本発明のＦＧＦＲ融合タンパク質を用いて、悪性ヒト神経膠腫細胞（例えばＵ２５１細胞）；悪性ヒト脳癌細胞（例えばＳＦ２６８細胞）；ヒト肺癌細胞（例えばＡ５４９細胞）；悪性肺非扁平上皮癌細胞（例えば、ＮＣＩ−Ｈ５２２およびＮＣＩ−Ｈ２２６細胞）；悪性膠芽細胞腫細胞（例えば、Ｕ１１８およびＷＴ１１１細胞）；ならびに悪性腎細胞（例えばＣａｋｉ−１細胞）の生存度および／または増殖を阻害することができる。
本発明はまた、腫瘍細胞および内皮細胞などの他の増殖性細胞の増殖をｉｎ ｖｉｖｏで阻害するために本発明のＦＧＦＲ融合タンパク質を用いる方法も提供する。このｉｎ ｖｉｖｏ活性は、動物異種移植モデルにおいて腫瘍のｉｎ ｖｉｖｏ形成を阻害するために本発明のＦＧＦＲ融合タンパク質を投与することによって実証することができる。本明細書中に示すように、このモデルにおいてＦＧＦＲ１−ＩＩＩｃ−Ｆｃは腫瘍成長を有効に阻害した。したがって、本発明は、本発明のＦＧＦＲ融合タンパク質を含む組成物を提供すること、および組成物を対象に投与することによる、対象において腫瘍成長および腫瘍細胞の増殖を阻害する方法を提供する。
本発明は、そのような細胞の増殖が望ましくない状態において、内皮細胞などの増殖性細胞の生存度および／または増殖を阻害する方法を提供する。例えば、黄斑変性症および腫瘍血管形成は、血管、したがって内皮細胞の過剰な成長が望ましくない状態である。したがって、本発明はさらに、本発明のＦＧＦＲ融合タンパク質をそのような治療を必要としている対象に投与することによる、血管形成を阻害する方法を提供する。以下により詳細に記載するように、投薬スケジュールおよび投薬経路は一般に当分野で知られており、後者には静脈内、皮下、腹腔内、および経口投与が含まれ得る。
ヒト癌におけるＦＧＦおよびＦＧＦＲの発現
遺伝子増幅は、特定の種類の癌をもたらすことができる癌遺伝子活性化の機構の１つである。本発明は、登録商標をもつＧｅｎｅＬｏｇｉｃデータベースに属する乳癌組織の遺伝子発現プロフィールの分析、およびＦＧＦＲ１遺伝子が乳癌患者の１０〜１５％で増幅されていたという発見を提供する。本明細書中に記載のように、このような遺伝子増幅は腫瘍細胞の成長および／または生存を示唆しており、したがってＦＧＦＲとＦＧＦリガンドとの間のシグナル伝達を中断することは、腫瘍成長を阻害するために有用な手法である。
本発明はまた、登録商標をもつＧｅｎｅＬｏｇｉｃデータベースに属する様々な腫瘍の種類の、ＦＧＦおよびＦＧＦＲの発現に関する発現プロフィールのさらなる分析、ならびに特定の腫瘍がＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ３、および／またはＦＧＦＲ４をより高いレベルで発現したという発見も提供する。本発明はさらに、特定の腫瘍が特定のＦＧＦリガンドをより高いレベルで発現したことを提供し、これにより、癌細胞または癌細胞に栄養を与える内皮細胞の生存度および／または増殖能力の維持に活性のあるＦＧＦ／ＦＧＦＲシグナル伝達経路が示唆された。ＦＧＦＲおよび／またはＦＧＦを過剰発現する腫瘍の種類に関する情報は、以下の表に提供する。
したがって、本発明は、ＦＧＦＲ、ＦＧＦ、または両方の過剰発現を特徴とする増殖性疾患の治療における使用に適した、ＦＧＦＲ融合タンパク質の方法および組成物を提供する。本明細書中で行い、実施例でより詳細に記載した分析は、様々な過剰増殖性組織のＦＧＦＲおよびＦＧＦの遺伝子発現プロフィールを提供する。したがって、ＦＧＦＲおよびそのリガンドの過剰発現は特定の病状と相関している。本発明のＦＧＦＲ融合タンパク質は、ＦＧＦＲの構成成分またはそのリガンドが過剰発現される疾患の治療に効果的である。
（治療用の組成物および配合物）
（投与経路および担体）
本発明のＦＧＦＲ融合分子は、静脈内、動脈内、皮下、非経口、鼻腔内、筋肉内、心臓内、脳室内、気管内、頬側、直腸、腹腔内、皮内、局所的、経皮、およびくも膜下腔内を含めた様々な経路によって、またはそうでない場合移植もしくは吸入によって、ｉｎ ｖｉｖｏで投与することができる。これらは、以下により詳細に記載するように、配合物中で投与し得る。これらは、鼻腔内または吸入によって散剤形態で投与し得る。これらは、例えば、体温で融解するが室温で固化している、乳化基剤、水溶性基剤、カカオ脂、カーボワックス、およびポリエチレングリコールなどの様々な基剤と混合することによって配合する坐薬として投与し得る。筋肉内または皮内投与にはジェット注射を用いることができる（Ｆｕｒｔｈら、Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２０５：３６５〜３６８頁（１９９２年））。文献（Ｔａｎｇら、Ｎａｔｕｒｅ ３５６：１５２〜１５４頁（１９９２年））に記載のようにＤＮＡを金微粒子上にコーティングし、微粒子銃装置、すなわち「遺伝子銃」によって皮内送達することができ、この方法において、金の微粒子弾にＤＮＡをコーティングし、その後、皮膚細胞内に打ち込む。これらのｉｎ ｖｉｖｏ投与方法は、当分野で知られている。
一部の実施形態では、融合分子組成物を、その様々な種類が当分野で知られている薬学的に許容される担体と共に、配合物中で提供する（Ｇｅｎｎａｒｏ、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ： Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ ｗｉｔｈ Ｆａｃｔｓ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｓ： Ｄｒｕｇｆａｃｔｓ Ｐｌｕｓ」、第２０版（２００３年）；Ａｎｓｅｌら、「Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ」、第７版、Ｌｉｐｐｅｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ａｎｄ Ｗｉｌｋｉｎｓ（２００４年）；Ｋｉｂｂｅら、「Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ」、第３版、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｐｒｅｓｓ（２０００年））。ビヒクル、アジュバント、担体、または希釈剤などの薬学的に許容される担体が公的に利用可能である。さらに、ｐＨ調節剤および緩衝剤、等張性調節剤、安定化剤、湿潤剤などの薬学的に許容される補助剤が公的に利用可能である。
本発明の融合分子は、非経口投与用の薬剤組成物を含むように適切な製薬担体と組み合わせて用い得る。したがって、本発明は、本発明のＦＧＦＲ融合分子および薬学的に許容される担体を含む組成物を提供する。そのような組成物は、治療上有効な量のポリペプチド、作用剤、または拮抗剤および薬学的に許容される担体を含む。そのような担体には、それだけには限定されないが、生理食塩水、緩衝生理食塩水、デキストロース、水、グリセロール、エタノール、およびそれらの組合せが含まれる。配合物は投与様式に適しているべきである。
製薬的な用量では、ＦＧＦＲ融合分子組成物は、その薬学的に許容される塩の形態で、単独でまたは他の薬学的に活性のある化合物との適切な会合もしくは組合せのいずれかで、投与することができる。ＦＧＦＲ融合分子組成物は投与様式に従って配合する。したがって、主題組成物は、錠剤、カプセル、散剤、顆粒、軟膏、液剤、坐薬、浣腸、注射剤、吸入剤、およびエアロゾルなどの固体、半固体、液体、または気体の形態で、調製物中に配合することができる。本明細書中で言及した方法および賦形剤は単に例示的であり、いかなる様式でも限定するものではない。
薬剤、ポリヌクレオチド、およびポリペプチドは、植物または他の類似の油などの水性または非水性の溶媒、合成脂肪酸グリセリド、高級脂肪酸またはプロピレングリコールのエステル中に、所望する場合は可溶化剤、等張化剤、懸濁剤、乳化剤、安定化剤および保存料などの慣用の添加剤と共に、それを溶解、懸濁、または乳化することによって、注射用調製物中に配合することができる。これらは、吸入による投与用の調製物中に配合してもよく、例えば、ジクロロジフルオロメタン、プロパン、窒素などの許容される加圧噴霧剤中に配合する。本発明のＦＧＦＲ融合タンパク質は、当分野で知られている技術を用いて、たとえば生分解性または非生分解性のポリマーを用いて、持続放出マイクロカプセル中に配合することができる。本発明での使用に適した生分解性配合物の例には、ポリ乳酸−グリコール酸ポリマーが含まれる。本発明での使用に適した非生分解性配合物の例には、ポリグリセリン脂肪酸エステルが含まれる。これらの配合物の作製方法は、例えば、欧州特許ＥＰ１ １２５ ５８４Ａ１号に記載されている。当分野で慣用の非経口送達用の他の配合物を用いることもできる。
ＦＧＦＲ融合分子組成物は、個々の対象の臨床的状態、融合分子組成物の送達部位、投与方法、投与スケジュール、および医師に知られている他の要素を考慮して、優良な医療行為に矛盾しない様式で配合および投薬する。したがって、本明細書中に記載の目的のためのＦＧＦＲ融合分子の有効量は、このような考慮によって決定される。
本発明はまた、有効な用量の本発明の製薬ＦＧＦＲ融合タンパク質組成物の１つもしくは複数を満たした１つまたは複数の容器を含む、製薬パックまたはキットを提供する。このような容器（または複数の容器）には、医薬品または生物学的製品の製造、使用、または販売を制御する政府当局が規定した形の注意書を付随させることができる。そのような注意書は、ヒト投与のための製造、使用、または販売に対する当局の認可を反映する。さらに、本発明のＦＧＦＲ融合分子は他の治療剤と併せて用い得る。
それぞれの単位用量が１つまたは複数の薬剤を含む事前に決定した量の組成物を含む、単位剤形を提供することができる。一実施形態では、ＦＧＦＲ融合分子組成物を１回使用の事前に充填した注射用シリンジ中で供給する。組成物は、生理食塩水、スクロースなど；リン酸緩衝液などの緩衝液等を含んでいてよく、安定かつ有効なｐＨ範囲内で配合する。一実施形態では、ＦＧＦＲ融合分子組成物を複数回使用のバイアル中に凍結乾燥粉末として提供し、これは、適切な液体、例えば滅菌した静菌水を加えた際に再構成することができる。一実施形態では、ＦＧＦＲ融合分子組成物は、それだけには限定されないが、スクロースまたはアルギニンを含めたタンパク質の凝集を阻害する１つまたは複数の物質を含む。一実施形態では、本発明の組成物は、ヘパリンおよび／またはプロテオグリカンを含む。
これらの薬剤組成物は、特定の適応症の治療および／または予防に有効な量で投与する。有効量は、典型的には、治療する対象の重量、彼もしくは彼女の体調または健康状態、治療する状態の広範さ、および／または治療する対象の年齢に依存する。一般に、本発明のＦＧＦＲ融合タンパク質は、体重１ｋｇあたり約５ｕｇ〜体重１ｋｇあたり約１０ｍｇ／用量の範囲の量で投与すべきである。任意選択で、本発明のＦＧＦＲ融合タンパク質は、体重１ｋｇあたり約１０ｕｇ〜体重１ｋｇあたり約９ｍｇ／用量の範囲の量で投与することができる。さらに任意選択で、本発明のＦＧＦＲ融合タンパク質は、体重１ｋｇあたり約１００ｕｇ〜体重１ｋｇあたり約８ｍｇ／用量の範囲の量で投与することができる。さらに任意選択で、本発明のＦＧＦＲ融合タンパク質は、体重１ｋｇあたり約１ｍｇ〜体重１ｋｇあたり約７ｍｇ／用量の範囲の量で投与することができる。
ＦＧＦＲ融合タンパク質組成物は、ＦＧＦリガンド／ＦＧＦＲシグナル伝達経路の阻害を必要としている対象に、必要に応じて投与することができる。投与頻度の決定は、治療する状態、治療する対象の年齢、治療する状態の重篤度、治療する対象の一般的な健康状態などの考慮に基づいて、担当医などの当業者によって行うことができる。一実施形態では、有効用量のＦＧＦＲ融合タンパク質を、対象に１回または複数回投与する。一実施形態では、本発明のＦＧＦＲ融合タンパク質を、対象に少なくとも週に２回、少なくとも１週間の間投与する。別の実施形態では、ＦＧＦＲ融合タンパク質を、少なくとも週に３回、少なくとも１週間の間投与する。さらなる実施形態では、ＦＧＦＲ融合タンパク質を、対象に少なくとも２週間の間投与する。さらに別の実施形態では、本発明のＦＧＦＲ融合タンパク質を、対象に少なくとも３週間の間投与する。ＦＧＦＲ融合タンパク質の投与は、少なくとも２もしくは３週間の間に連続的であるか、または治療を１もしくは２週間中断し、そのような中断の後に治療を再開するなどの非連続的であることができる。
（組合せ療法）
本発明のＦＧＦＲ融合分子は、単独で、または他の治療様式と共に投与し得る。これらは、他の治療様式、例えば、手術、化学療法、放射線療法、または治療用抗体などの生物剤の投与の前、実質的に同時に、または後に提供し得る。したがって、本発明は、線維芽細胞成長因子および受容体が利用するシグナル伝達経路を遮断する治療と他の成長因子が利用するシグナル伝達経路を遮断する治療とを組み合わせる方法を提供し、これは、ＦＧＦおよび／またはＦＧＦＲ、ならびに他の成長因子および／またはその受容体を発現する腫瘍を有する患者においてより有効であると予測することができる。この治療手法は、迅速に成長している腫瘍および高度に血管新生した腫瘍、例えば膠芽細胞腫に適用することができる。本発明のＦＧＦＲ融合分子は、他の成長因子受容体の融合分子と組み合わせて用いることができる。例えば、本発明のＦＧＦＲ融合タンパク質は、腫瘍成長を阻害するため、および／または腫瘍において血管形成を阻害するために、可溶性ＶＥＧＦＲと組み合わせることができる。
さらに、本発明は、ＦＧＦならびにＰＤＧＦ、ＶＥＧＦ、および／またはＥＧＦシグナル伝達経路などの他のシグナル伝達経路を遮断する組合せ療法を提供する。本発明のＦＧＦＲ融合分子をこのような組合せ療法で用いることができる。治療において使用するために、ＰＤＧＦＲ−α、ＰＤＧＦＲ−β、ＶＥＧＦＲ、および／またはＥＧＦ受容体を阻害する１つまたは複数の薬剤を、本発明のＦＧＦＲ融合タンパク質と組み合わせることができる。ＦＧＦシグナル伝達経路を遮断する組成物は、ＰＤＧＦ、ＶＥＧＦ、および／もしくはＥＧＦシグナル伝達経路を遮断する組成物と同時に、またはそれと共に任意の順序で逐次的に提供し得る。組合せ療法には、ＰＤＧＦＲ−α、ＰＤＧＦＲ−β、ＶＥＧＦＲ、ＥＧＦＲの細胞外ドメインを含む融合タンパク質、および本発明のＦＧＦＲ融合タンパク質の使用が含まれ得る。
（ＦＧＦＲ融合分子の使用）
過剰活性もしくは過剰量のＦＧＦリガンドもしくはＦＧＦＲによって直接または間接的に媒介される障害を診断するため、その予後診断を提供するため、予防するため、治療するため、およびその治療を開発するために、本発明のＦＧＦＲ融合分子ならびにその断片および改変体を用い得る。本発明のＦＧＦＲ融合分子ならびにその断片および改変体を、そのような障害の危険性にある、またはそれに罹患した患者に投与し得る。
したがって、本発明は、１つまたは複数のＦＧＦと１つまたは複数のＦＧＦＲとの受容体リガンド結合を実時間で測定することによる、１つもしくは複数のＦＧＦおよび／もしくはＦＧＦＲまたはその断片もしくは改変体の過剰発現を特徴とする疾患の診断方法を提供する。この方法は、例えば、対象から生物学的検体を提供し、検体中のＦＧＦリガンドまたはＦＧＦＲと１つまたは複数の同族ＦＧＦＲまたはＦＧＦリガンドとの結合を測定することによって行うことができる。結合の測定の結果を用いて、ＦＧＦ（もしくは複数のＦＧＦ）またはＦＧＦＲ（もしくは複数のＦＧＦＲ）の過剰発現を特徴とする疾患が存在することまたは存在しないことを診断することができる。
本発明はまた、本発明のＦＧＦＲ融合分子を含む組成物を提供すること、および組成物を対象に投与することを含む、対象において増殖性疾患、癌および血管形成障害を含めた状態を治療する方法を提供する。本発明のＦＧＦＲ融合分子は、癌細胞の増殖および／または生存度の阻害に有用である。本発明のＦＧＦＲ融合分子は、ヒトを含めた動物の癌を治療するために、様々な設定においてしかるべく使用することができる。
本発明のＦＧＦＲ融合分子を用いて、悪性、前悪性、および良性の腫瘍を治療、調節、または予防することができる。例えば、これらにより、典型的には腫瘍発生の進行期にあり、生命を脅かし得る転移性または非転移性の悪性腫瘍を治療することができる。また、これらを用いて、典型的には良性腫瘍よりも進行した腫瘍発生段階にあるが、悪性疾患までは進行していない前悪性腫瘍を治療することもできる。さらに、これらを用いて、典型的にはある程度の異常な細胞特徴を示し、腫瘍発生の初期段階にある良性腫瘍を治療することができる。良性腫瘍は、前悪性または悪性の腫瘍に進行する場合もしない場合もある。本発明のＦＧＦＲ融合分子を用いて、組織または器官に局在する細胞の集合によって形成される固形腫瘍、例えば、それだけには限定されないが、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨原性肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫、滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸癌、結腸直腸癌、胃癌、膵臓癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、扁平細胞癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭癌、乳頭腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気管支原性癌、腎細胞癌、肝細胞癌、肝臓転移、胆管癌、絨毛癌、精上皮腫、胚性癌腫、未分化甲状腺癌などの甲状腺癌、ウィルムス腫瘍、子宮頸癌、精巣腫瘍、小細胞肺癌および非小細胞肺癌などの肺癌、膀胱癌、上皮肉腫、神経膠腫、星細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、上衣腫、松果体腫、血管芽腫、聴神経腫、乏突起神経膠腫、髄膜腫、黒色腫、神経芽細胞腫、ならびに網膜芽細胞腫などの肉腫を治療することができる。また、本発明の範囲内の癌には、とりわけ、血液悪性疾患、浸潤性導管癌および腺癌などの乳癌；扁平細胞癌、非小細胞肺癌、肺腺癌などの肺癌；前立腺癌；膀胱癌；膵臓癌；卵巣癌、唾液腺癌；下垂体癌；腎細胞癌；黒色腫；膠芽細胞腫；網膜芽細胞腫；および／または前立腺癌からの骨転移を含めた骨の癌転移も含まれる。
例えば子宮頸部、食道、および肺を含めた上皮組織中に見つかるものなどの、過形成、化生、および異形成などの増殖不良性の変化を含む腫瘍も、本発明を用いて治療、調節、または予防することができる。過形成とは、構造または機能の顕著な変更のない、組織または器官内の細胞数の増加を伴う制御された細胞増殖の一形態である。例として、多くの場合、子宮内膜過形成が子宮内膜癌に先行して起こる。化生とは、成人細胞または完全に分化した細胞の一種が別の種類の成人細胞に置き換わる、制御された細胞成長の一形態である。化生は上皮または結合組織細胞中で起こることができる。異型化生は、多少不規則な化生上皮を伴う。異形成は多くの場合癌の前兆であり、主に上皮中に見つかる。これは、非新生細胞成長の不規則な形態であり、個々の細胞の均一性および細胞の構築的配向の損失を伴う。異形成は、慢性の過敏または炎症が存在する場合に特徴的に起こり、多くの場合、子宮頸部、気道、口腔、および胆嚢中に見つかる。本発明に従って治療、調節または予防することができる良性腫瘍の他の例には、動静脈（ＡＶ）奇形、特に頭蓋内部位および骨髄腫におけるものが含まれる。
本発明のＦＧＦＲ融合分子、またはその改変体もしくは断片を用いて、ＦＧＦＲシグナル伝達の効果に感受性のある癌患者を治療することができる。これらは、ＦＧＦＲ１および／またはＦＧＦ−２を過剰発現する患者の部分集合、例えば、乳癌、肺癌、腎臓癌、前立腺癌、および膠芽細胞腫に罹患している患者の部分集合において有用である。治療の有効性は、上述のように、例えば患者のバイオマーカーのレベル、例えば、ＦＧＦ−２、ｐＦＧＦＲ、ＤＳＰ、および／またはｐＦＲＳ２を測定することによって評価することができる（Ｇｕｄｄｏら、Ｈｕｍ． Ｐａｔｈｏｌ．、３０：７８８〜７９４頁（１９９９年））。
本発明はまた、迅速に成長し、かつ高度に血管新生化した腫瘍である膠芽細胞腫を治療するための組成物および方法を提供する。血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）は、多くのヒト膠芽細胞腫中で高いレベルで発現される。さらに、腫瘍細胞の成長および生存を促進するその役割に加えて、ＦＧＦは、膠芽細胞腫などの血管性の高い腫瘍の成長を促進すると予測され得る強力な血管新生因子である。したがって、細胞の成長または生存に対するＰＤＧＦの効果の遮断および本発明のＦＧＦＲ融合タンパク質を用いたＦＧＦシグナル伝達経路の遮断を合わせることで、膠芽細胞腫の発生の進行を遅延させ得る。
ＦＧＦ−２およびＦＧＦＲ１は、腫瘍細胞および腫瘍関連間質細胞ならびに非小細胞肺癌に罹患している患者の血管中で発現される。ＦＧＦ−２がＦＧＦＲ１に結合することにより増殖刺激を遮断して腫瘍成長を阻害するために、例えばＦＧＦＲ１−ＩＩＩｃ−ＦｃまたはＲ１Ｍｕｔ４などの本発明のＦＧＦＲ融合タンパク質を、そのような患者に投与することができる。
間質−上皮の相互作用は、悪性対良性の前立腺成長の重要な決定要因である（Ｃｏｎｔｅら、Ｉｎｔ． Ｊ． Ｃａｎｃｅｒ、１０７：１〜１０頁（２００３年））。前立腺癌、ならびに乳癌、腎臓癌、および多発性骨髄腫は、骨に転移する傾向がある。乳癌の骨転移は溶解性骨病変を形成する傾向がある一方で、前立腺癌転移は、異常に高密度の骨の過剰を特徴とする芽細胞病変を形成する傾向がある。その後、前立腺癌転移と局所的な骨環境とのさらなる相互作用が正常な骨の恒常性を変化させ、それを骨芽細胞の表現型へと移行させ得る。腎臓転移は、溶解性および芽細胞の骨病変をどちらも示し得る。
ＦＧＦは正常な骨形成に寄与し、骨間質環境において局所的に発現されるので、これらは前立腺癌の骨転移の播種、成長、および生存に役割を果たし得る。ＦＧＦは、骨芽前駆細胞の複製、骨芽細胞の分化、およびアポトーシスに影響を与えるとして、骨形成に関連づけられている。したがって、本発明のＦＧＦＲ融合分子またはその改変体もしくは断片を含めたＦＧＦ／ＦＧＦＲの相互作用を遮断する薬剤を用いて、前立腺癌における骨転移を治療することができる。そのような薬剤は、局所的な骨芽細胞の変換現象を阻害するだけでなく、前立腺癌の骨転移の播種、成長、および生存も阻害する。
本発明はまた、例えば腫瘍化および黄斑変性症において血管形成を阻害するための、本発明のＦＧＦＲ融合タンパク質またはその改変体もしくは断片の使用方法を提供する。例として、ＦＧＦＲ１−ＩＩＩｃおよび／またはＦＧＦＲ４を含む融合タンパク質を用いて、望ましくない血管形成促進性ＦＧＦと結合させて血管形成を低下させ得る。有用な組成物には、Ｆｃ融合パートナーを有する組成物を含めた、本明細書中に記載の本発明の融合タンパク質を含む融合分子を含む組成物が含まれる。
本発明は、他の癌治療剤に耐性のある癌の治療方法を提供する。例えば、本発明のＦＧＦＲ融合タンパク質を用いて、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）などのＥｒｂＢ癌遺伝子阻害剤に耐性のある癌を治療することができる。また、これらは、Ａｖａｓｔｉｎ（登録商標）などのＶＥＧＦの阻害剤に耐性のある癌の治療にも有用である。
ＦＧＦＲ融合タンパク質およびそれをコードしているポリヌクレオチド分子は、癌を含めた、増殖性疾患および血管形成に関与する疾患の治療に有用である。これらを用いて、このような疾患を診断、予防、および治療することができる。
値の範囲に関して、本発明には、文脈により別段にそうでないと明確に指定しない限りは、下限の単位の少なくとも１０分の１までは、範囲の上限と下限の間のそれぞれの値が包含される。さらに、本発明には、間の任意の他の記述した値が含まれる。さらに、本発明には、記述した範囲から具体的に排除しない限りは、範囲の上限および下限のどちらかまたは両方を含めた範囲も包含される。
別段に定義しない限りは、本明細書中で用いるすべての技術用語および科学用語の意味は、本発明が属する分野の技術者に一般的に理解される意味である。また、当業者は、本明細書中に記載のものに類似または均等の任意の方法および材料も、本発明を実施または試験するために用いることができることを理解されよう。
本明細書および添付の特許請求の範囲内で使用する単数形「ａ」、「または」、および「ｔｈｅ」には、文脈により別段にそうでないと明確に指定しない限りは、指示対象の複数形が含まれることに注意されたい。したがって、例えば、「（ａ）対象のポリペプチド」への言及には、複数のそのようなポリペプチドが含まれ、「（ｔｈｅ）薬剤」への言及には、１つまたは複数の薬剤および当業者に知られているその均等物への言及が含まれ、その他もそうである。
さらに、明細書および特許請求の範囲中で用いる成分の量、反応条件、％純度、ポリペプチドおよびポリヌクレオチドの長さなどを表すすべての数は、別段に指定しない限りは、用語「約」によって修飾される。したがって、明細書および特許請求の範囲中に記載する数値パラメータは、本発明の所望の特性に応じて変化し得る近似値である。最低限でも、また特許請求の範囲の均等論の適用を限定する試みとしてではなく、それぞれの数値パラメータは、通常の丸め技術を適用して、報告された有効桁数に照らして解釈すべきである。そうとはいえ、具体的な例に記載した数値は、可能な限り正確に報告されている。しかし、すべての数値は、その実験測定値の標準偏差からのある程度の誤差を本質的に含む。
本明細書は、本明細書中で引用する参考文献に照らして最も完全に理解される。これらの参考文献のそれぞれは、その全体で参考として本明細書中に組み込まれている。
（本発明を実施するための例示的な様式）
純粋に本発明の例示であることを意図し、したがっていかなる様式でも本発明を限定すると見なされるべきでない実施例も、上述の本発明の態様および実施形態を記載および詳述する。実施例は、以下の実験が行った実験のすべてである、または行った実験はこれだけであることを表すことを意図しない。用いた数（例えば、量、温度など）に関して精度を保証する努力はなされているが、ある程度の実験誤差および偏差を考慮すべきである。別段に指定しない限りは、部とは重量部であり、分子量とは重量平均分子量であり、温度とは摂氏であり、圧力は大気圧またはその付近である。
（実施例１）
（ＦＧＦＲおよびＦＧＦＲ改変体の部分ＩｇＩＩＩドメインおよび膜隣接領域の配列アラインメント）
図１Ａは、Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（ＥＭＢＬ）生物情報学検索サイトのＣｌｕｓｔａｌ Ｗプログラムバージョン１．８を用いた、７つのＦＧＦＲファミリーメンバー、すなわちＦＧＦＲ１−ＩＩＩｂ、ＦＧＦＲ１−ＩＩＩｃ、ＦＧＦＲ２−ＩＩＩｂ、ＦＧＦＲ２−ＩＩＩｃ、ＦＧＦＲ３−ＩＩＩｂ、ＦＧＦＲ３−ＩＩＩｃ、およびＦＧＦＲ４のそれぞれのＩｇＩＩＩドメインの一部のアミノ酸配列のアラインメントを示す。
図１Ａは、親ＦＧＦＲ１−ＩＩＩｃ−Ｆｃ融合タンパク質（ヌクレオチド配列番号４、タンパク質配列番号９５）および対応する突然変異体の構成も例示する。ＩｇＩＩＩドメインにＥＣＤのＣ末端部分が続き、それに抗体のＦｃ部分が続く。アラインメントには、ＦＧＦＲ１−ＩＩＩｃのＲ１Ｍｕｔ１（ヌクレオチド配列番号６、タンパク質配列番号９７）、Ｒ１Ｍｕｔ２（ヌクレオチド配列番号７、タンパク質配列番号９８）、Ｒ１Ｍｕｔ３（ヌクレオチド配列番号８、タンパク質配列番号９９）、Ｒ１Ｍｕｔ４（ヌクレオチド配列番号９、タンパク質配列番号１００）、およびＲ１Ｍｕｔ５（ヌクレオチド配列番号１０、タンパク質配列番号１０１）改変体の切断位置ならびにＩｇＧ抗体のＦｃ部分の位置を標識する。また、Ｒ１Ｍｕｔ１、Ｒ１Ｍｕｔ２、Ｒ１Ｍｕｔ３、Ｒ１Ｍｕｔ４、およびＲ１Ｍｕｔ５は、アミノ酸「ＧＳ」をコードしているリンカーがＦＧＦＲ１−ＩＩＩｃとＦｃドメインとの間から除去されていた。
図１Ｂは、やはり本発明で産生および使用した、親ＦＧＦＲ１−ＩＩＩｃ−Ｆｃ由来のさらなる改変体を例示する。図１Ｂに示す改変体は、すべてリンカーＧＳが除去されていた。改変体Ｒ１Ｍｕｔ６（ヌクレオチド配列番号５、タンパク質配列番号９６）は、ＧＳリンカーのみが欠失していた。別の改変体Ｒ１Ｍｕｔ７（ヌクレオチド配列番号１１、タンパク質配列番号１０２）は、アミノ酸残基ＰＡが欠失していた。改変体Ｒ１Ｍｕｔ８（ヌクレオチド配列番号１２、タンパク質配列番号１０３）は、プロリン残基がメチオニンで置換されたアミノ酸置換Ｐ３６４Ｍを有していた。改変体Ｒ１Ｍｕｔ９（ヌクレオチド配列番号１３、タンパク質配列番号１０４）は、メチオニン残基がアスパラギンで置換されたアミノ酸置換Ｍ３６７Ｎを有していた。改変体Ｒ１Ｍｕｔ１０（ヌクレオチド配列番号４４、タンパク質配列番号１３５）は、プロリン残基がグリシンで置換されたアミノ酸置換Ｐ３６４Ｇを有していた。
図２は、ＥＭＢＬ（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）生物情報学検索サイトのＣｌｕｓｔａｌ Ｗプログラムバージョン１．８を用いた、７つのＦＧＦＲファミリーメンバーのそれぞれのＩｇＩＩＩドメインの一部のアミノ酸配列のアラインメントを示す。図２は、ＦＧＦＲ４−Ｆｃ融合タンパク質（ヌクレオチド配列番号６５、タンパク質配列番号１５６）および対応する突然変異体の構成を例示する。アラインメントには、ＦＧＦＲ４のＲ４Ｍｕｔ１（ヌクレオチド配列番号７１、タンパク質配列番号１６２）、Ｒ４Ｍｕｔ２（ヌクレオチド配列番号７２、タンパク質配列番号１６３）、Ｒ４Ｍｕｔ３（ヌクレオチド配列番号７３、タンパク質配列番号１６４）、Ｒ４Ｍｕｔ４（ヌクレオチド配列番号７４、タンパク質配列番号１６５）、Ｒ４Ｍｕｔ５（ヌクレオチド配列番号７５、タンパク質配列番号１６６）およびＲ４Ｍｕｔ６（ヌクレオチド配列番号６６、タンパク質配列番号１５７）改変体の切断位置を標識する。図２は、ＩｇＧ抗体のＦｃ部分の位置も示す。また、Ｒ４Ｍｕｔ１、Ｒ４Ｍｕｔ２、Ｒ４Ｍｕｔ３、Ｒ４Ｍｕｔ４、Ｒ４Ｍｕｔ５、およびＲ４Ｍｕｔ６は、アミノ酸「ＧＳ」をコードしているリンカーがＦＧＦＲ４とＦｃドメインとの間から除去されていた。
（実施例２）
（ＦＧＦＲ融合タンパク質の発現）
本発明の融合タンパク質は、２９３−６Ｅ細胞（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ；カナダＭｏｎｔｒｅａｌ）内に形質移入したｐＴＴ５ベクター（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ；カナダＭｏｎｔｒｅａｌ）を用いて２９３−６Ｅ宿主細胞中で発現させ、その後これを培養することで融合タンパク質を産生させた。ヒトＦＧＦＲ１−ＩＩＩｃの細胞外ドメイン（配列番号１）をコードしているＦＧＦＲ１−ＩＩＩｃ−ＦｃのｃＤＮＡ（配列番号４）を含む発現ベクターを、内部で調製したオープンリーディングフレームｃＤＮＡライブラリから構築した。このｃＤＮＡを、アミノ酸ＧＳをコードしているリンカーを介してそのＣ末端でヒトＩｇＧ１重鎖のＦｃ断片をコードしているｃＤＮＡ（配列番号８０）に連結させ、融合構築体を作製した。これを本明細書中で以降「ＦＧＦＲ１−ＩＩＩｃ−Ｆｃ ｃＤＮＡ」と呼び、その発現産物を「ＦＧＦＲ１−ＩＩＩｃ−Ｆｃタンパク質」と呼ぶ。Ｆｃ断片も内部で調製したオープンリーディングフレームｃＤＮＡライブラリから得た。このｃＤＮＡ融合構築体を慣用技術によってｐＴＴ５ベクター内に挿入し、ＦＧＦＲ１−ＩＩＩｃ−Ｆｃ／ｐＴＴ５発現ベクターを作製した。
ｐＴＴ５ベクターを用いてＦＧＦＲ３−ＩＩＩｃ−Ｆｃ（ヌクレオチド配列番号８５、タンパク質配列番号１７６）およびＦＧＦＲ４−Ｆｃ融合タンパク質を２９３−６Ｅ宿主細胞中で発現させるための発現構築体を、内部で調製したｃＤＮＡおよび慣用技術を用いて、上述と同様の様式で作製した。ｐＴＴ５ベクターを用いてＲ１Ｍｕｔ１、Ｒ１Ｍｕｔ２、Ｒ１Ｍｕｔ３、Ｒ１Ｍｕｔ４、Ｒ１Ｍｕｔ５、Ｒ１Ｍｕｔ６（ＧＳ欠失）、Ｒ１Ｍｕｔ７（ＰＡ欠失）、Ｒ１Ｍｕｔ８（Ｐ３６４Ｍ）、Ｒ１Ｍｕｔ９（Ｍ３６７Ｎ）、Ｒ４Ｍｕｔ１、Ｒ４Ｍｕｔ２、Ｒ４Ｍｕｔ３、Ｒ４Ｍｕｔ４、Ｒ４Ｍｕｔ５、およびＲ４Ｍｕｔ６（ＧＳ欠失）などのＦＧＦＲ改変体を発現させるための類似の発現構築体を、ＰＣＲおよび慣用の突然変異誘発技術を用いて、ＦＧＦＲ１−ＩＩＩｃ−Ｆｃ ｃＤＮＡからそれぞれ作製した。
この様式で産生させた改変体Ｒ１Ｍｕｔ１、Ｒ１Ｍｕｔ２、Ｒ１Ｍｕｔ３、Ｒ１Ｍｕｔ４、およびＲ１Ｍｕｔ５は、実施例１に記載のように、リンカーアミノ酸ＧＳの欠失および野生型ＦＧＦＲ１−ＩＩＩｃ細胞外ドメインのＣ末端の特定のアミノ酸残基の欠失以外は、それぞれ親ＦＧＦＲ１−ＩＩＩｃ−Ｆｃ融合タンパク質（タンパク質配列番号９５）と同じアミノ酸配列を含んでいた。Ｒ１Ｍｕｔ１は、Ｆｃ断片の直前にアミノ酸残基ＭＴＳＰで終わるアミノ酸配列を含んでいた。Ｒ１Ｍｕｔ２は、Ｆｃ断片の直前にアミノ酸残基ＲＰＡＶで終わるアミノ酸配列を含んでいた。Ｒ１Ｍｕｔ３は、Ｆｃ断片の直前にアミノ酸残基ＥＲＰＡで終わるアミノ酸配列を含んでいた。Ｒ１Ｍｕｔ４は、Ｆｃ断片の直前にアミノ酸残基ＬＥＡＬで終わるアミノ酸配列を含んでいた。Ｒ１Ｍｕｔ５は、Ｆｃ断片の直前にアミノ酸残基ＡＷＬＴで終わるアミノ酸配列を含んでいた。やはりこの様式で産生させた改変体Ｒ１Ｍｕｔ６、Ｒ１Ｍｕｔ７、Ｒ１Ｍｕｔ８、およびＲ１Ｍｕｔ９は、それぞれリンカーＧＳが除去された親ＦＧＦＲ１−ＩＩＩｃ−Ｆｃと同じアミノ酸配列を含んでいた。
また、実施例１に記載した改変体Ｒ４Ｍｕｔ１、Ｒ４Ｍｕｔ２、Ｒ４Ｍｕｔ３、Ｒ４Ｍｕｔ４、Ｒ４Ｍｕｔ５、およびＲ４Ｍｕｔ６を、ＦＧＦＲ１−ＩＩＩｃ−ＦｃおよびＲ１突然変異体について記載した様式で、ｐＴＴ５ベクターを用いて２９３−６Ｅ宿主細胞から産生させた。Ｒ４Ｍｕｔ１は、Ｆｃ断片の直前にアミノ酸残基ＡＡＰＥで終わるアミノ酸配列を含んでいた。Ｒ４Ｍｕｔ２は、Ｆｃ断片の直前にアミノ酸残基ＰＴＷＴで終わるアミノ酸配列を含んでいた。Ｒ４Ｍｕｔ３は、Ｆｃ断片の直前にアミノ酸残基ＬＰＥＥで終わるアミノ酸配列を含んでいた。Ｒ４Ｍｕｔ４は、Ｆｃ断片の直前にアミノ酸残基ＴＶＬＰで終わるアミノ酸配列を含んでいた。Ｒ４Ｍｕｔ５は、Ｆｃ断片の直前にアミノ酸残基ＬＴＶＬで終わるアミノ酸配列を含んでいた。Ｒ４Ｍｕｔ６は、Ｆｃ断片の直前にアミノ酸残基ＲＹＴＤで終わるアミノ酸配列を含んでいた。
宿主細胞系ＣＨＯ−Ｓは、特定の実施形態では、２９３−６Ｅ宿主細胞系よりも高い収量で、かつ／またはそれとは異なるグリコシル化パターンを有する組換えタンパク質を産生することができる。本発明の融合タンパク質は、ベクターｐｃＤＮＡ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；カリフォルニア州Ｃａｒｌｓｂａｄ）を用いてＣＨＯ−Ｓ宿主細胞中で発現させた。発現ベクターをＣＨＯ−Ｓ宿主細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；カリフォルニア州Ｃａｒｌｓｂａｄ）内に形質移入し、その後、これを培養して融合タンパク質を産生させた。ＰＣＲおよび慣用のサブクローニング技術を用いて、ＦＧＦＲ１−ＩＩＩｃ−Ｆｃ
ｃＤＮＡをｐｃＤＮＡ３．１ベクター内にサブクローニングした。ｐｃＤＮＡ３．１ベクターを用いてＣＨＯ−Ｓ宿主細胞中でＦＧＦＲ３−ＩＩＩｃ−ＦｃおよびＦＧＦＲ４−Ｆｃ融合タンパク質を発現させるための発現構築体を、ＰＣＲおよび慣用のサブクローニング技術を用いて、上述と同様の様式で作製した。
ＦＧＦＲ４−Ｆｃ改変体Ｒ４Ｍｕｔ１、Ｒ４Ｍｕｔ２、Ｒ４Ｍｕｔ３、Ｒ４Ｍｕｔ４、Ｒ４Ｍｕｔ５、およびＲ４Ｍｕｔ６をＣＨＯ−Ｓ宿主細胞中で、ｐｃＤＮＡ３．１ベクターを用いて発現させるための同様の発現構築体を、ＰＣＲおよび慣用のサブクローニング技術を用いて、ＦＧＦＲ４−Ｆｃ ｃＤＮＡから作製した。他のＦＧＦＲ−Ｆｃ融合タンパク質および改変体用の発現ベクターも同様の様式で作製し、当分野で知られている方法を用いて融合タンパク質を本明細書中に記載のように発現させることができる。
ＤＧ４４とは、ＣＨＯ−Ｓ細胞系の細胞系誘導体であり、一部の実施形態では、ＣＨＯ−Ｓ細胞よりも高い収量で組換えタンパク質を産生することができる。本発明の融合タンパク質は、ＤＧ４４細胞内に形質移入したｐＤＥＦ３８ベクター（ＩＣＯＳ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ；ワシントン州Ｂｏｔｈｅｌｌ）を宿主細胞として用いて、ＤＧ４４宿主細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；カリフォルニア州Ｃａｒｌｓｂａｄ）中で発現させ、その後、これを培養して融合タンパク質を産生させた。例えば、ＰＣＲおよび慣用のサブクローニング技術を用いてＦＧＦＲ１−ＩＩＩｃ−Ｆｃ ｃＤＮＡをｐＤＥＦ３８ベクター内にサブクローニングした。
ｐＤＥＦ３８ベクターを用いてＦＧＦＲ１−ＩＩＩｃ−Ｆｃ改変体Ｒ１Ｍｕｔ４をＤＧ４４宿主細胞中で発現させるための類似の発現構築体を、ＰＣＲおよび慣用のサブクローニング技術を用いて作製した。他のＦＧＦＲ−Ｆｃ融合タンパク質および改変体、例えば、ＦＧＦＲ３−ＩＩＩｃ−ＦｃおよびＦＧＦＲ４−Ｆｃのための発現ベクターも同様の様式で作製し、融合タンパク質を本明細書中に記載のように発現させることができる。
融合構築体を有するミニサークルベクターを用いたマウスにおける融合タンパク質の長期的な発現を、スタンフォード大学（カリフォルニア州Ｓｔａｎｆｏｒｄ）のＭａｒｋ Ｋａｙ博士から得た親ベクターを用いて、Ｃｈｅｎら、Ｈｕｍ． Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．、１６：１２６〜１３１頁（２００５年）；Ｒｕｉ， Ｅ．ら、Ｈｕｍ． Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．、１６：５５８〜５７０頁（２００５年）；および国際公開公報ＷＯ０４／０２０６０５号に記載のように行った。この親ベクターは、α１−抗トリプシンプロモーター、ａｐｏＥエンハンサー、ヒトＩＸ因子イントロン、およびウシポリＡ配列を含んでいた。親ベクターは、ＰＣＲおよび慣用のサブクローニング技術を用いて、ＦＧＦＲ１−ＩＩＩｃ−Ｆｃ、ＦＧＦＲ４−Ｆｃ、またはＲ１Ｍｕｔ４のｃＤＮＡを目的遺伝子として、そのようなｃＤＮＡを親ベクター中にヒトＩＸ因子イントロンの直後に配置して挿入することによって改変した。当分野で知られている方法を用いて、本明細書中に記載のように、ＦＧＦＲ３−ＩＩＩｃ−Ｆｃおよび本明細書中に記載の改変体を含めた他のＦＧＦＲ−Ｆｃ融合タンパク質用の類似の発現ベクターも作製し、融合タンパク質を発現させることができる。
（実施例３）
（２９３−６Ｅ細胞およびＣＨＯ−Ｓ宿主細胞中での融合タンパク質の一過的発現）
ＦＧＦＲ１−ＩＩＩｃ−Ｆｃ／ｐＴＴ５発現ベクターを、２９３−６Ｅ宿主細胞中での一過的発現を提供するために設計した。２９３−６Ｅ細胞を無血清懸濁培養Ｆｒｅｅ−Ｓｔｙｌｅ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；カリフォルニア州Ｃａｒｌｓｂａｄ）に事前に適応させた。対数増殖期（対数期の成長）中の９×１０５個／ｍｌ〜１．２×１０６個／ｍｌの細胞密度中に、発現ベクターを用いて細胞の形質移入を行った。
５００ｍｌの細胞懸濁液の形質移入を行うために、最初に２５ミリリットル（ｍｌ）の滅菌リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中の５００マイクログラム（ｕｇ）の発現ベクターＤＮＡを、２５ｍｌの滅菌ＰＢＳ中の１ミリグラム（ｍｇ）のポリエチレンイミン（滅菌水中に溶液１ｍｌあたり約１ｍｇの濃度）と混合することによって、形質移入混合物を作製した。この形質移入混合物を、１５分間、室温でインキュベーションを行った。インキュベーション後、形質移入混合物を対数期の成長中の２９３−６Ｅ細胞に加えて、細胞の形質移入を行った。その後、３７℃、５％のＣＯ２中で細胞および形質移入混合物のインキュベーションを行った。２４時間のインキュベーション後、Ｔｒｙｐｔｏｎ−Ｎ１（Ｏｒｇａｎｏｔｅｃｈｎｉｅ Ｓ．Ａ．；フランスＬａ Ｃｏｕｒｎｅｕｖｅ；滅菌ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ培地中に２０％の溶液）を０．５％（ｖ／ｖ）の最終濃度まで加えた。細胞の密度が約３〜４×１０６個の細胞／ｍｌに達し、約８０％を超える生存度が実証されるまで、混合物を３７℃、５％のＣＯ２中で約６〜８日間維持した。融合タンパク質を細胞培地から収集するために、細胞を４００×ｇで１５分間、４℃でペレットにし、上清を傾瀉し、その後、３，３１５×ｇで１５分間、４℃での遠心分離によって細胞細片を除去して清澄にした。その後、以下により詳細に記載するように、融合タンパク質を含む清澄な上清を精製した。
ＦＧＦＲ融合タンパク質ＦＧＦＲ３−ＩＩＩｃ−Ｆｃ、ＦＧＦＲ４−Ｆｃ、ならびにＦＧＦＲ融合改変体Ｒ１Ｍｕｔ１、Ｒ１Ｍｕｔ２、Ｒ１Ｍｕｔ３、Ｒ１Ｍｕｔ４、Ｒ１Ｍｕｔ５、Ｒ１Ｍｕｔ６、Ｒ１Ｍｕｔ７、Ｒ１Ｍｕｔ８、およびＲ１Ｍｕｔ９を、実施例２に記載のように構築したｐＴＴ５ベクターにおいて、２９３−６Ｅ細胞中での一過的発現によって同様に産生させた。他のＦＧＦＲ−Ｆｃ融合タンパク質および改変体も、本明細書中に記載の方法を用いて、同様に作製して２９３−６Ｅ宿主細胞中で発現させることができる。
例えばｉｎ ｖｉｖｏ研究で用いるためのＲ１Ｍｕｔ４タンパク質の小バッチ（約１〜２ｍｇ）を、懸濁液中で増殖させ、プラスミド構築体Ｒ１Ｍｕｔ４／ｐｃＤＮＡ３．１を用いて一過的に形質移入したＣＨＯ−Ｓ細胞から迅速に産生させた。手短に述べると、懸濁させたＣＨＯ−Ｓ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；カリフォルニア州Ｃａｒｌｓｂａｄ）を、Ｌ−グルタミンを添加したＣＤ−ＣＨＯ無血清培地および１×ヒポキサンチン／チミジン（ＨＴ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；カリフォルニア州Ｃａｒｌｓｂａｄ）中で培養した。形質移入の前日にＣＨＯ−Ｓ細胞を約５×１０５個／ｍｌの密度で振盪フラスコ中に播種し、形質移入の日には約１×１０６個／ｍｌの密度に達していた。細胞を収集し、約１×１０７個の細胞／形質移入反応物を遠心分離によってペレットにした。それぞれの細胞ペレットを０．１ｍｌのＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ Ｖ溶液に再懸濁させ、Ａｍａｘａ
Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒキュベット（Ａｍａｘａ；ドイツＣｏｌｏｇｎｅ）に移した。約５ｕｇのＲ１Ｍｕｔ４／ｐｃＤＮＡ３．１プラスミドＤＮＡを加え、キュベット中の懸濁させたＣＨＯ−Ｓ細胞と混合した。その後、Ｕ−０２４プログラムを用いて細胞をＡｍａｘａ Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒで電気穿孔した。
より大きなバッチも作製することができる。例えば、２００ｍｌを作製するためには、１２回の形質移入反応を実施し、電気穿孔した細胞をＣＤ−ＣＨＯ培地（Ｌ−グルタミン、１×ヒポキサンチン／チミジン（ＨＴ）を添加）中で、０．５×１０６個／ｍｌの密度で培養した。６日後、細胞密度が約６〜７×１０６個／ｍｌに達し、生存度は約９５％であった。培養物からの上清を遠心分離によって収集し、これは精製に適していた。この方法を用いて、２００ｍｌの一過的に形質移入した培養細胞から１ｍｇのＲ１Ｍｕｔ４タンパク質を約１週間で産生することができる。
ＦＧＦＲ融合タンパク質ＦＧＦＲ１−ＩＩＩｃ−Ｆｃ、ＦＧＦＲ３−ＩＩＩｃ−Ｆｃ、およびＦＧＦＲ４−Ｆｃ、ならびに改変体Ｒ４Ｍｕｔ１、Ｒ４Ｍｕｔ２、Ｒ４Ｍｕｔ３、Ｒ４Ｍｕｔ４、Ｒ４Ｍｕｔ５、およびＲ４Ｍｕｔ６を、実施例２に記載のように構築したｐｃＤＮＡ３．１ベクターにおいて、ＣＨＯ−Ｓ細胞中での一過的発現によって同様に産生させた。他のＦＧＦＲ−Ｆｃ融合タンパク質および改変体も、本明細書中に記載の方法を用いて、作製およびＣＨＯ−Ｓ宿主細胞中で発現させることができる。
（実施例４）
（ＣＨＯ−Ｓ宿主細胞中で融合タンパク質を安定して産生させるための細胞系の開発）
ＣＨＯ−Ｓなどの適切な哺乳動物細胞中で安定した発現を提供するために、ＦＧＦＲ１−ＩＩＩｃ−Ｆｃ／ｐｃＤＮＡ３．１発現ベクターを設計した。このベクターを、ＣＤ−ＣＨＯ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；カリフォルニア州Ｃａｒｌｓｂａｄ）中での無血清懸濁培養に適応させることによって接着性ＣＨＯ−Ｋ１細胞から由来した、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）遺伝子を含むＣＨＯ−Ｓ細胞内に形質移入した。
形質移入は、製造者の推奨に従って、Ａｍａｘａ Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ ＩＩ（Ａｍａｘａ；ドイツＣｏｌｏｇｎｅ）を用いて実施した。このプロセスでは、約１×１０６個のＣＨＯ−Ｓ細胞を３００ｕｌのＡｍａｘａのＳｏｌｕｔｉｏｎ Ｖ（Ａｍａｘａ；ドイツＣｏｌｏｇｎｅ）に再懸濁させ、電気穿孔キュベット内に移した。ＦＧＦＲ１−ＩＩＩｃ−Ｆｃ／ｐｃＤＮＡ３．１発現ベクターを含む約５ｕｇのプラスミドＤＮＡをキュベット中の細胞に加え、Ａｍａｘａ製Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ Ｄｅｖｉｃｅ ＩＩ内のＡｍａｘａ Ｕ−０２４プログラムを用いてＤＮＡ転移を開始した。ＣＨＯ−Ｓ細胞へのＤＮＡ転移後、細胞懸濁液を直ちに１ｍｌの予熱したＣＤ−ＣＨＯ培地中に移し、その後、３７℃で１０分間インキュベーションを行った。その後、細胞懸濁液を１０ｍｌの予熱したＣＤ−ＣＨＯ培地中に移し、Ｔ−７５フラスコ中で４８時間、３７℃、５％のＣＯ２で培養した。ベクターｐｃＤＮＡ３．１はＧ４１８選択遺伝子を保有していた（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；カリフォルニア州Ｃａｒｌｓｂａｄ）。ＦＧＦＲ１−ＩＩＩｃ−Ｆｃ／ｐｃＤＮＡ３．１を用いたＤＮＡ転移の約４８時間後、Ｇ４１８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；カリフォルニア州Ｃａｒｌｓｂａｄ）選択試薬を４００ｕｇ／ｍｌの最終濃度まで加えた。選択圧を導入した約２〜３週間後、かつ細胞がコンフルエントに達した際、これらを新鮮な選択培地を有するＴ−２２５フラスコに拡大させた。その後、使用時まで細胞を凍結保存した。
凍結保存培地は、４６．２５％のＣＤ−ＣＨＯ培地、４６．２５％の条件ＣＤ−ＣＨＯ培地（通常は凍結保存した培地からの上清）および７．５％のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を含んでいた。約５〜１０×１０６個の細胞／バイアルを１ｍｌの凍結保存培地に再懸濁させ、約−８０℃までゆっくりと凍結した（約１℃／分）。翌日、凍結した細胞を液体Ｎ２（約−１９０℃）に移した。使用時には、凍結保存バイアルを３７℃水浴中に移すことによって細胞を急速に解凍し、解凍した細胞懸濁液を少なくとも１０ｍｌの新鮮なＣＤ−ＣＨＯ培地に再懸濁させた。通常は細胞の約６０％が回復し、解凍後約２４〜４８時間で増殖し始める。
凍結保存および回復に続いて、細胞を２個の細胞／ウェル／２００ｕｌの密度で９６ウェルプレートに植え、ＣＤ−ＣＨＯ培地中で３７℃、５％のＣＯ２で３週間培養した。細胞増殖が再開された後にＧ４１８選択圧（４００ｕｇ／ｍｌ）を加えた。ＦＧＦＲ１−ＩＩＩｃ−Ｆｃ融合タンパク質を発現する形質移入された細胞クローンを同定するために、各ウェルの細胞培養上清をウェスタンブロットによってスクリーニングした。ＦＧＦＲ１−ＩＩＩｃ−Ｆｃは、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）にコンジュゲートさせたポリクローナルヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃγ特異的抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ；ペンシルバニア州Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ）を用いて検出した。
形質移入したＣＨＯ−Ｓ細胞から産生させたＦＧＦＲ１−ＩＩＩｃ−Ｆｃは、形質移入した２９３−６Ｅ細胞から産生させたものよりも高い分子量を有しており、これは、ＣＨＯ−Ｓ細胞の産物ではグリコシル化が増加していたことを示す。ウェスタンブロットにおいて明確なＦｃ−免疫反応性のバンドを生じたウェルからの３１個の細胞クローンを、１０ｍｌのＣＤ−ＣＨＯ培地および４００ｕｇ／ｍｌのＧ４１８を有するＴ−７５フラスコに移した。２週間後、これらの培養物それぞれからの上清をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって試験し、非常に良く見えるバンドを生じる形質移入細胞クローンのみをさらなる分析用に持続させた。１４個の最も発現の高いクローンを細胞特異的産生能について試験し、それに従って順序をつけた。２個の最も産生の高いクローンを、１カ月の期間をかけて懸濁培養に適応させた。合計１０個の異なる培養培地を、体積測定のタンパク質産生能およびタンパク質の完全性に関して試験した。
ｐｃＤＮＡ３．１発現ベクターからＦＧＦＲ４−Ｆｃ融合タンパク質を産生する安定したＣＨＯ−Ｓ宿主細胞系も、上述と同様の様式でＦＧＦＲ１−ＩＩＩｃ−Ｆｃについて作製した。他のＦＧＦＲ−Ｆｃ融合タンパク質および改変体を産生する安定したＣＨＯ−Ｓ宿主細胞系も、実施例２に記載のｐｃＤＮＡ３．１発現ベクターを用いて、本明細書中に記載の様式と同様に作製することができる。
（実施例５）
（ＤＧ４４細胞中で融合タンパク質を安定して産生させるための細胞系の開発）
実施例２に記載のＲ１Ｍｕｔ４／ｐＤＥＦ３８を含む発現ベクターを用いて、Ｒ１Ｍｕｔ４融合タンパク質を安定して産生させるためのＤＧ４４細胞の形質移入を行った。このプロセスでは、形質移入していないＤＨＦＲ−陰性ＣＨＯ細胞系ＤＧ４４を、８ｍＭのＬ−グルタミン、１×ヒポキサンチン／チミジン（ＨＴ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；カリフォルニア州Ｃａｒｌｓｂａｄ）、および１８ｍｌ／ＬのＰｌｕｒｏｎｉｃ−６８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；カリフォルニア州Ｃａｒｌｓｂａｄ）を添加したＣＨＯ−ＣＤ無血清培地（Ｉｒｖｉｎｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ；カリフォルニア州Ｉｒｖｉｎｅ）中で培養した。最初に、制限酵素ＰｖｕＩを用いた消化によってＲ１Ｍｕｔ４／ｐＤＥＦ３８を含む約５０ｕｇのプラスミドＤＮＡを直鎖状にし、その後、エタノールを加えることによって沈殿させ、手短に空気乾燥させ、次いで４００ｕｌの滅菌蒸留水に再懸濁させた。形質移入の前日に、宿主細胞としての培養したＤＧ４４細胞を約４×１０５個／ｍｌの細胞密度で振盪フラスコに播種し、形質移入の日には約０．８×１０６個／ｍｌの密度に達していた。細胞を収集し、約１×１０７個の細胞／形質移入単位を遠心分離によってペレットにした。
細胞は、それぞれの細胞ペレットを０．１ｍｌのＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ Ｖ溶液に再懸濁させ、懸濁液をＡｍａｘａ Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒキュベット（Ａｍａｘａ；ドイツＣｏｌｏｇｎｅ）に移すことによって形質移入した。約５ｕｇの再懸濁させた直鎖状プラスミドＤＮＡを加え、キュベット中の懸濁させたＤＧ４４細胞と混合した。その後、Ｕ−０２４プログラムを用いて細胞をＡｍａｘａ Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ Ｄｅｖｉｃｅ ＩＩで電気穿孔した。電気穿孔した細胞をＣＨＯ−ＣＤ培地中で２日間培養し、その後、８ｍＭのＬ−グルタミン、１８ｍｌ／ＬのＰｌｕｒｏｎｉｃ−６８、および１０％の透析ウシ胎児血清（ＦＣＳ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；カリフォルニア州Ｃａｒｌｓｂａｄ；ＨＴなし）を添加したＣＨＯ−ＣＤ無血清培地を含む選択培地に移した。この選択培地は週に１回交換した。約１２日後、１ｕｇ／ｍｌのＲ３ Ｌｏｎｇ ＩＧＦ Ｉ成長因子（Ｓｉｇｍａ；ミズーリ州Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ）を培地に加え、培養をさらに４日間、コンフルエントになるまで続けた。安定に形質移入した細胞系のプール由来の上清を、生成物の力価を決定するために、サンドイッチＦＧＦＲ１−ＩＩＩｃ−Ｆｃ ＥＬＩＳＡによってアッセイした（このサンドイッチＥＬＩＳＡの詳細には実施例１５を参照されたい）。この形質移入方法では、安定に形質移入した細胞のプールから約２１ｕｇ／ｍｌのＲ１Ｍｕｔ４の発現レベルが生じた。
ｐＤＥＦ３８発現ベクターからＦＧＦＲ１−ＩＩＩｃ−Ｆｃ融合タンパク質を産生する安定したＤＧ４４宿主細胞系も、Ｒ１Ｍｕｔ４について本明細書中に記載した様式と同様に作製した。他のＦＧＦＲ−Ｆｃ融合タンパク質および改変体を産生する安定したＤＧ４４宿主細胞系も、実施例２に記載のｐＤＥＦ３８発現ベクターを用いて、本明細書中に記載した様式と同様に作製することができる。
（実施例６）
（細胞培養物の産生中のＦＧＦＲ１−ＩＩＩ−Ｆｃ、Ｒ１Ｍｕｔ４および他のＦＧＦＲ１−ＩＩＩｃ−Ｆｃ改変体のｉｎ ｖｉｔｒｏ切断の分析）
一過的タンパク質発現中におけるＦＧＦＲ１−ＩＩＩｃ−Ｆｃのｉｎ ｖｉｔｒｏ切断に対する耐性を、ＦＧＦＲ１−ＩＩＩｃ−Ｆｃ改変体Ｒ１Ｍｕｔ１、Ｒ１Ｍｕｔ２、Ｒ１Ｍｕｔ３、Ｒ１Ｍｕｔ４、Ｒ１Ｍｕｔ５、Ｒ１Ｍｕｔ６、Ｒ１Ｍｕｔ７、Ｒ１Ｍｕｔ８およびＲ１Ｍｕｔ９と比較した。融合タンパク質は、実施例２に記載のｐＴＴ５ベクターを用いた一過的の形質移入を介してそれぞれ２９３−６Ｅ細胞中で発現させた。それぞれの形質移入体の上清を形質移入後４日目に採取し、それぞれの約５ｕｌを、還元条件下の４〜１２％アクリルアミドゲルのＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて分離した。上清は、細胞数、生存度、および形質移入条件が一致した培養物由来のものであった。その後、分離したタンパク質を、西洋ワサビ−ペルオキシダーゼにコンジュゲートさせた抗ヒトＦｃ抗体（抗ヒトＦｃ ＨＲＰ；Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．；ペンシルバニア州Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ）を用いてプロービングを行った。結果を図３Ａに示し、これは、約２８〜３９ｋＤを移動する親ＦＧＦＲ１−ＩＩＩｃ−Ｆｃから切断されたＦｃ断片を示す。融合タンパク質を切断改変体Ｒ１Ｍｕｔ１、Ｒ１Ｍｕｔ２、Ｒ１Ｍｕｔ３、Ｒ１Ｍｕｔ４、およびＲ１Ｍｕｔ５から作製した場合は、はるかに少ないＦｃ産物が得られた。同様の実験により、ＦＧＦＲ１−ＩＩＩｃ−Ｆｃの改変体Ｒ１Ｍｕｔ６、Ｒ１Ｍｕｔ７も、一過的タンパク質発現中において親ＦＧＦＲ１−ＩＩＩｃ−Ｆｃ融合タンパク質よりも少ないｉｎ ｖｉｔｒｏ切断を有していたことが実証された。
安定に形質移入したＤＧ４４宿主細胞から産生させたＦＧＦＲ１−ＩＩＩｃ−ＦｃおよびＲ１Ｍｕｔ４のｉｎ ｖｉｔｒｏ切断を比較するために、類似した細胞生存度（ＦＧＦＲ１−ＩＩＩｃ−Ｆｃでは８２．９％、Ｒ１Ｍｕｔ４では７９．２％）、同じ培養期間（４日間）、および類似の細胞密度（ＦＧＦＲ１−ＩＩＩｃ−Ｆｃでは０．９５×１０６個／ｍｌ、Ｒ１Ｍｕｔ４では０．６５×１０６個／ｍｌ）を有するＦＧＦＲ１−ＩＩＩｃ−ＦｃおよびＲ１Ｍｕｔ４を産生する細胞の培養物からの上清をプールした。発現させた組換えタンパク質を４〜１２％のビス−トリスＰＡＧＥゲル（Ｂｉｏ−Ｒａｄ；カリフォルニア州Ｈｅｒｃｕｌｅｓ）で分離し、続いてニトロセルロース膜に移した。無処置の分子および遊離ヒトＦｃ断片の切断産物を、ヤギ抗ヒトＦｃ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．；ペンシルバニア州Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ）を用いてウェスタンブロットによって可視化した。結果を図３Ｂに示す。ウェスタンブロットの左側パネルは、５０ｎｇ、１００ｎｇ、および３００ｎｇの、ＣＨＯ−Ｓ細胞から産生させた精製ＦＧＦＲ１−ＩＩＩｃ−Ｆｃタンパク質を示す。右側のパネルは、ＤＧ４４細胞から産生させたＦＧＦＲ１−ＩＩＩｃ−ＦｃおよびＲ１Ｍｕｔ４の上清の比較を示し、ＦＧＦＲ１−ＩＩＩｃ−ＦｃからのＦｃ切断産物の存在を明らかにしているが、Ｒ１Ｍｕｔ４からはＦｃ切断産物がわずかしかまたはまったく存在しないことを明らかにしている。これらの結果は、Ｒ１Ｍｕｔ４は、その親分子ＦＧＦＲ１−ＩＩＩｃ−Ｆｃよりもタンパク質分解に対して耐性を有し、産生中により少ない産物が切断されたことを示している。
一過的タンパク質発現中における親ＦＧＦＲ４−Ｆｃのｉｎ ｖｉｔｒｏ切断に対する耐性を、ＦＧＦＲ４−Ｆｃ改変体Ｒ４Ｍｕｔ１、Ｒ４Ｍｕｔ２、Ｒ４Ｍｕｔ３、Ｒ４Ｍｕｔ４、Ｒ４Ｍｕｔ５、およびＲ４Ｍｕｔ６（ΔＧＳ）と比較した。融合タンパク質は、実施例２に記載のｐＴＴ５ベクターおよび技術を用いた一過的の形質移入を介してそれぞれ２９３−６Ｅ細胞中で発現させた。それぞれの形質移入体の上清を形質移入後７日目および８日目に採取し、それぞれの約５ｕｌを、還元条件下の４〜１２％アクリルアミドゲルのＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離した。培養物から得られた上清は、細胞数、生存度、および形質移入条件について一致していた。その後、分離したタンパク質を、西洋ワサビ−ペルオキシダーゼにコンジュゲートさせた抗ヒトＦｃ抗体（抗ヒトＦｃ ＨＲＰ；Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．、ペンシルバニア州Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ）を用いてプロービングを行った。結果を図４に示す。Ｆｃ断片は親ＦＧＦＲ４−Ｆｃから切断され、約３０〜４３ｋＤを移動していた。融合タンパク質を切断改変体Ｒ４Ｍｕｔ１、Ｒ４Ｍｕｔ３、およびＲ４Ｍｕｔ４から作製した場合は、親構築体、Ｒ４Ｍｕｔ２、Ｒ４Ｍｕｔ５、およびＲ４Ｍｕｔ６と比較してはるかに少ないＦｃ産物が切断された。
（実施例７）
（ＦＧＦＲ１−ＩＩＩｃ−Ｆｃの精製）
タンパク質−Ａアフィニティークロマトグラフィーおよびブチル疎水性相互作用クロマトグラフィーの組合せを用いて、組換え宿主細胞から発現させたＦＧＦＲ１−ＩＩＩｃ−Ｆｃを細胞培養上清から精製した。ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ａｋｔａ Ｐｕｒｉｆｉｅｒ １００（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅｓ；ニュージャージー州Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ）を用いて、培地の構成成分を最初にタンパク質−Ａセファロースカラムで、次いでブチルセファロースカラムで分離した。タンパク質−Ａセファロース４Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅｓ；ニュージャージー州Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ）を、融合分子のＦｃ領域に結合するためのアフィニティーマトリックスとして用いた。カラムを１０倍カラム体積の１０ｍＭのリン酸カリウム、５００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．０の滅菌緩衝液で平衡化し、その後、細胞培養上清液をカラムに載せた。カラムを８倍カラム体積の滅菌した１０ｍＭのリン酸カリウム、５００ｍＭのＮａＣｌの緩衝液、ｐＨ７．０で洗浄し、その後、ＦＧＦＲ１−ＩＩＩｃ−Ｆｃを含めた結合した物質を、１０ｍｌ／分の速度で、段階勾配の溶出緩衝液（１００ｍＭのグリシン、５００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ２．７）を用いて、それぞれ２倍カラム体積の１５％、３０％、４５％、６０％、７５％、および９０％の溶出緩衝液、次いで５倍カラム体積の１００％の溶出緩衝液の逐次的な段階を用いて溶出させた。溶出液を中和するために、１ｍｌの１Ｍトリス、ｐＨ７．０（Ａｍｂｉｏｎ；テキサス州Ａｕｓｔｉｎ）を含むチューブ内に１０ｍｌ画分を採取した。ＦＧＦＲ１−ＩＩＩｃ−Ｆｃを含む画分をゲル電気泳動によって同定し、プールした。ＦＧＦＲ１−ＩＩＩｃ−Ｆｃは約３０〜４５％の勾配強度の溶出緩衝液で溶出された。
その後、バルクのＦＧＦＲ１−ＩＩＩｃ−Ｆｃを含むプールしたタンパク質−Ａカラム溶出液を、ブチルセファロース疎水性相互作用クロマトグラフィーによるさらなる精製に供した。等体積の２．４Ｍの硫酸アンモニウムをタンパク質−Ａカラムからの溶出液に加えたのち、溶出液を、５倍カラム体積の滅菌した１０ｍＭのリン酸カリウム、１．２Ｍの硫酸アンモニウム、ｐＨ７．０で平衡化したブチルセファロース４Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅｓ；ニュージャージー州Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ）に載せた。カラムを４倍カラム体積の平衡緩衝液で洗浄し、結合した物質を、５ｍｌ／分の速度で、合計体積が１３倍カラム体積にわたって１００％の平衡緩衝液から開始して１００％の溶出緩衝液（１０ｍＭのリン酸カリウム、３０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．０）で終わる直線勾配、次いでさらに５倍カラム体積の１００％の溶出緩衝液を用いて溶出させた。画分（１４ｍｌ）を採取し、バルクのＦＧＦＲ１−ＩＩＩｃ−Ｆｃを含む画分をゲル電気泳動によって同定し、プールした。ＦＧＦＲ１−ＩＩＩｃ−Ｆｃは約２０〜５０％の溶出緩衝液で溶出された。
精製後、カブトガニ血球抽出物（ＬＡＬ）アッセイ（Ｃａｍｂｒｅｘ；メリーランド州Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ）によって内毒素レベルを点検した。値が１内毒素単位（ＥＵ）／ｍｇのＦＧＦＲ１−ＩＩＩ−Ｆｃタンパク質よりも高かった場合は、Ｃｅｌｌｕｆｉｎｅ（商標）ＥＴＣｌｅａｎクロマトグラフィー（Ｃｈｉｓｓｏ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ；東京）によって、製造者の指示に従ってさらなる精製を行った。ＰＢＳを用いてＦＧＦＲ１−ＩＩＩｃ−Ｆｃの透析を行い、ＰＢＳで事前に平衡化したＣｅｌｌｕｆｉｎｅ（商標）ＥＴ Ｃｌｅａｎカラム（１０×０．９ｃｍ（Ｉ．Ｄ．）；９．６ｍｌ）に載せ、タンパク質を０．５ｍｌ／分の流速で、流動中に採取した。その後、ＬＡＬアッセイによって評価した値が１ＥＵ／ｍｇのタンパク質以下であることを確認するために、最終ＦＧＦＲ１−ＩＩＩｃ−Ｆｃ溶液（Ｃａ２＋／Ｍｇ２＋なしでＰＢＳ中）の再試験を行った。
これらの精製プロトコルを用いて、ＦＧＦＲ３−ＩＩＩｃ−ＦｃおよびＲ１Ｍｕｔ４などの他のＦＧＦＲ−Ｆｃ融合タンパク質および改変体を精製した。これらの精製プロトコルは、他のＦＧＦＲ−Ｆｃ融合タンパク質および改変体の精製に用いてもよく、また、ＦＧＦＲ−Ｆｃ融合タンパク質、例えば他のＦＧＦＲ１−Ｆｃ融合タンパク質改変体、ＦＧＦＲ２−Ｆｃ融合タンパク質および改変体、ＦＧＦＲ３−ＩＩＩｃ−Ｆｃ融合タンパク質改変体、ならびにＦＧＦＲ４−Ｆｃタンパク質および改変体を実質的に精製するために、当分野で知られている方法を用いて調節してもよい。例えば、細胞培養上清培地の構成成分を、タンパク質−Ａのステップの前または後のどちらかに、疎水性クロマトグラフィーによって分離し得る。タンパク質−Ａおよび疎水性のクロマトグラフィーはどちらも、カラム、スラリー、または他の類似の実施形態において行うことができる。カラムの大きさは、細胞培養上清中に存在すると推定されるＦＧＦＲ−Ｆｃの量に依存してよく、例えば、上述のプロトコルを用いてＦＧＦＲ１−ＩＩＩｃ−Ｆｃを形質移入した２５リットルのＣＨＯ細胞上清培地から約８ｍｇ／Ｌ、または２００ｍｇの実質的に純粋なＦＧＦＲ１−ＩＩＩｃ−Ｆｃが産生された。
（実施例８）
（Ｂｉａｃｏｒｅ分析によって測定した、ＦＧＦＲ１−ＩＩＩｃ−Ｆｃ、Ｒ１Ｍｕｔ４、ＦＧＦＲ３−ＩＩＩｃ−Ｆｃ、およびＦＧＦＲ４に対するリガンド結合の特異性および親和性）
ＦＧＦＲ１−ＩＩＩｃ−Ｆｃ、Ｒ１Ｍｕｔ４、ＦＧＦＲ３−ＩＩＩｃ−Ｆｃ、およびＦＧＦＲ４−Ｆｃに対するＦＧＦリガンド結合の特異性は、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）Ｔ１００表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）技術（Ｂｉａｃｏｒｅ；ニュージャージー州Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ）を用いて評価した。ＦＧＦＲ１−ＩＩＩｃ−Ｆｃ、Ｒ１Ｍｕｔ４、およびＦＧＦＲ４−Ｆｃ融合タンパク質は、実施例２、４、および５に記載のようにＣＨＯ−Ｓ宿主細胞から産生させた。ＦＧＦＲ３−ＩＩＩｃ−Ｆｃ融合タンパク質は、実施例２および３に記載のように２９３−６Ｅ宿主細胞から産生させた。タンパク質−Ａを製造者の指示に従ってＣＭ５チップに共有結合させ、その後、Ｆｃドメインとタンパク質−Ａとの相互作用によってＦＧＦＲ融合タンパク質をチップに結合させた。５０ｕｇ／ｍｌのヘパリン（Ｓｉｇｍａ；ミズーリ州Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ）を添加したＨＢＳ−Ｐ緩衝液（Ｂｉａｃｏｒｅ；ニュージャージー州Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ）の存在下で、やはり製造者の指示に従ってＦＧＦリガンドをＦＧＦＲ融合タンパク質と接触させた。
Ｗａｋｏ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（バージニア州Ｒｉｃｈｍｏｎｄ）からのＦＧＦ−１８以外は、すべての組換えＦＧＦリガンドはＲ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ（ミネソタ州Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ）からのものであった。ＦＧＦリガンドは、それぞれ４．５ｎｇ／ｍｌ〜１０ｕｇ／ｍｌの範囲の６〜８つの濃度で試験した。組換えマウス由来であったＦＧＦ８ｂおよびＦＧＦ−１８以外は、ＦＧＦリガンドは組換えおよびヒト由来のものであった。
ＦＧＦＲ１−ＩＩＩｃ−Ｆｃ、Ｒ１Ｍｕｔ４、ＦＧＦＲ３−ＩＩＩｃ−Ｆｃ、およびＦＧＦＲ４−Ｆｃと様々なＦＧＦリガンドとの結合を実時間で測定した。図３２は、ＦＧＦＲ１−ＩＩＩｃ−ＦｃおよびＲ１Ｍｕｔ４を用いた実験からのいくつかの代表的な結合の追跡を示し、以下の表３は、これらの研究から決定された、生じた結合定数（ｋａ）、解離定数（ｋｄ）および平衡解離定数（ＫＤ）を示す。
表８−１に要約したように、ＦＧＦＲ１−ＩＩＩｃ−Ｆｃに対するＦＧＦ結合親和性の相対順序は、ＦＧＦ−１＞ＦＧＦ−１８＞ＦＧＦ−２、ＦＧＦ−４＞ＦＧＦ−９、ＦＧＦ−２０＞ＦＧＦ−５＞ＦＧＦ−１９であった。Ｒ１Ｍｕｔ４に対するＦＧＦ結合親和性の相対順序は、ＦＧＦ−１＞ＦＧＦ−４、ＦＧＦ−１８＞ＦＧＦ−２＞ＦＧＦ２０＞ＦＧＦ−９＞ＦＧＦ−５＞ＦＧＦ−１９であった。ＦＧＦＲ３−ＩＩＩｃ−Ｆｃに対するＦＧＦ結合親和性の相対順序は、ＦＧＦ−１８＞ＦＧＦ−１＞ＦＧＦ−９＞ＦＧＦ−２、ＦＧＦ−４＞ＦＧＦ−２０＞ＦＧＦ−５＞ＦＧＦ−７＞ＦＧＦ−１９であった。ＦＧＦＲ４−Ｆｃに対するＦＧＦ結合親和性の相対順序は、ＦＧＦ−１＞ＦＧＦ−２であった。
上述と同様の様式で実施したＦＧＦＲ４−Ｆｃと様々なＦＧＦとの別の結合の研究では、生じた平衡解離定数（ＫＤ）およびＦＧＦＲ４−Ｆｃに対するＦＧＦ結合親和性の相対順序は、ＦＧＦ−１８（ＫＤは０．４×１０−９Ｍ）＞ＦＧＦ−１７（ＫＤは１．０×１０−９Ｍ）＝ＦＧＦ−２０（ＫＤは１．２×１０−９Ｍ）＞ＦＧＦ−８（ＫＤは３．９×１０−９Ｍ）＝ＦＧＦ−４（ＫＤは４．６×１０−９Ｍ）＞ＦＧＦ−９（ＫＤは９．８×１０−９Ｍ）＝ＦＧＦ−１６（ＫＤは９．７×１０−９Ｍ）＞ＦＧＦ−１９（ＫＤは１２．３×１０−９Ｍ）＞ＦＧＦ−１（ＫＤは１６．３×１０−９Ｍ）＞ＦＧＦ−６（ＫＤは２６．２×１０−９Ｍ）＞ＦＧＦ−２（ＫＤは４４．２×１０−９Ｍ）＞ＦＧＦ−３（ＫＤは５１．８×１０−９Ｍ）であった。ＦＧＦ−５はこの実験では結合を示さなかった。
ＦＧＦ−１９以外は、試験したリガンドすべてに対するＲ１Ｍｕｔ４の親和性は親ＦＧＦＲ１−ＩＩＩｃ−Ｆｃ分子よりも高かった。さらに、リガンド親和性の相対順序も、Ｒ１Ｍｕｔ４および親ＦＧＦＲ１−ＩＩＩｃ−Ｆｃ分子で異なっていた。
Figure 2013017484
（実施例９）
（競合ＥＬＩＳＡによって測定した、ＦＧＦＲ４−ＦｃおよびＦＧＦＲ４−Ｆｃ欠失突然変異体に対するリガンド結合の特異性および親和性）
実施例１、２、および３に記載のように作製したＦＧＦＲ４−Ｆｃ融合タンパク質および欠失改変体を、可溶性ＦＧＦリガンドＦＧＦ−１、ＦＧＦ−２、およびＦＧＦ−８ｂを捕捉し、プレート上にコーティングしたＦＧＦＲ４−Ｆｃ融合タンパク質に対するリガンド結合を阻害するその能力について試験した。
手短に述べると、ＨＩ ＢＩＮＤハーフウェルをＣＨＯ−Ｓ由来のＦＧＦＲ４−Ｆｃを用いて、ＰＢＳ中に５ｕｇ／ｍｌの濃度、２５ｕｌ／ウェルの体積で、１時間、室温でコーティングした。１５０ｕｌのＢＬＯＴＴＯ／ウェルを加え、２時間、室温でインキュベーションを行うことによってウェルを遮断した。その後、未結合のＦＧＦＲ１−ＩＩＩｃ−ＦｃおよびＢＬＯＴＴＯ除去するために、コーティングしたハーフウェルプレートをＰ
ＢＳおよび０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０で６回洗浄した。
ＣＨＯ−Ｓ細胞から産生した様々な量のＦＧＦＲ４−Ｆｃ融合タンパク質および欠失改変体、または１０ｕｇ／ｍｌの陰性対照ヒトＩｇＧ（Ｃａｌｔａｇ；カリフォルニア州Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ）を、５０ｕｌで、６０ｎｇ／ｍｌの組換えヒトＦＧＦ−１（Ｒ＆Ｄ
Ｓｙｓｔｅｍｓ；ミネソタ州Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓから）と共に、ＰＢＳ中に０．１×ＢＬＯＴＴＯ中の２０ｕｇ／ｍｌのヘパリンの存在下で、３０分間、３７℃で、振盪器上で、それぞれ最初に９６ウェルのＵ字底プレート中でプレインキュベーションを行った。その後、ＦＧＦ−１と共にプレインキュベーションを行った約４０ｕｌの上記融合タンパク質を、ＦＧＦＲ４−Ｆｃをコーティングした洗浄したハーフウェルプレートに加え、３０分間、３７℃で振盪しながらインキュベーションを行った。インキュベーション後、すべての未結合のＦＧＦ−１を除去するために、プレートを以前のようにＰＢＳおよび０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０で６回洗浄した。洗浄後、１×ＢＬＯＴＴＯ中に約２ｕｇ／ｍｌの抗ヒトＦＧＦ−１ポリクローナルビオチン標識抗体（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ；ミネソタ州Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ）をプレートの各ウェルに加え、その後、それを３０分間、３７℃で振盪しながらインキュベーションを行い、次いで、すべての未結合の抗ＦＧＦ−１抗体を除去するために、以前のように洗浄した。結合した抗ＦＧＦ−１抗体は、ＡＢＣキット（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ；カリフォルニア州Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ）中に提供されたストレプトアビジン−ＨＲＰリンカーを用いて、製造者のプロトコルに従って検出した。以前のように洗浄した後、再構成した（ＯＰＤ）溶液（Ｓｉｇｍａ；ミズーリ州Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ）を加えた。検出反応を１０〜２０分間、室温で進行させ、次いで４５０ｎｍでの吸光度を読み取った。競合ＥＬＩＳＡからの結合曲線および生じたＥＣ５０値を図５Ａに示す。
図５Ａは、ＦＧＦＲ４欠失改変体Ｒ４Ｍｕｔ１、Ｒ４Ｍｕｔ２、Ｒ４Ｍｕｔ３、Ｒ４Ｍｕｔ４、Ｒ４Ｍｕｔ５、およびＲ４Ｍｕｔ６が、ＦＧＦ−１に対して親ＦＧＦＲ４−Ｆｃよりも高い親和性を有していたことを示している。ＦＧＦＲ４−Ｆｃ欠失改変体は、約０．０３３ｕｇ／ｍｌ〜約０．０５７ｕｇ／ｍｌのＥＣ５０値を有していた。対照的に、親ＦＧＦＲ４−Ｆｃは、約０．１２３ｕｇ／ｍｌのＥＣ５０値を有していた。ヒトＩｇＧ１陰性対照は、ＦＧＦ−１がプレート上にコーティングしたＦＧＦＲ４−Ｆｃに結合することを阻害しなかった。
類似の競合ＥＬＩＳＡ実験を実施し、組換えヒトＦＧＦ−２（２００ｎｇ／ｍｌで使用）および組換えマウスＦＧＦ−８ｂ（２００ｎｇ／ｍｌで使用）（すべてＲ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ；ミネソタ州Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓから）とＣＨＯ−Ｓ細胞に由来し、アッセイプレート上に固定したＦＧＦＲ４−Ｆｃとの結合を阻害する、ＣＨＯ−Ｓ宿主細胞中で産生させたＦＧＦＲ４−Ｆｃ融合タンパク質およびＦＧＦＲ４−Ｆｃ欠失改変体の能力を比較した。
図５Ｂは、ＦＧＦＲ４欠失改変体Ｒ４Ｍｕｔ１、Ｒ４Ｍｕｔ２、Ｒ４Ｍｕｔ３、Ｒ４Ｍｕｔ４、およびＲ４Ｍｕｔ５が、ＦＧＦ−２に対して親ＦＧＦＲ４−Ｆｃよりも高い親和性を有していたことを示している。ＦＧＦＲ４−Ｆｃ欠失改変体Ｒ４Ｍｕｔ１、Ｒ４Ｍｕｔ２、Ｒ４Ｍｕｔ３、Ｒ４Ｍｕｔ４、およびＲ４Ｍｕｔ５は、約０．０９１ｕｇ／ｍｌ〜約０．４５７ｕｇ／ｍｌのＥＣ５０値を有していた。Ｒ４Ｍｕｔ３がＦＧＦ−２に対して最も高い親和性を有しており、ＥＣ５０は約０．０９１ｕｇ／ｍｌであった。対照的に、親ＦＧＦＲ４−Ｆｃは１０ｕｇ／ｍｌを超えるＥＣ５０値を有しており、欠失改変体Ｒ４Ｍｕｔ６もそうであった。ヒトＩｇＧ１陰性対照は、ＦＧＦ−１とプレートに固定したＦＧＦＲ４−Ｆｃとの結合を阻害しなかった。
図５Ｃは、ＦＧＦＲ４欠失改変体Ｒ４Ｍｕｔ１、Ｒ４Ｍｕｔ２、Ｒ４Ｍｕｔ３、Ｒ４Ｍｕｔ４、Ｒ４Ｍｕｔ５、およびＲ４Ｍｕｔ６が、ＦＧＦ−８ｂに対して親ＦＧＦＲ４−Ｆｃよりも高い親和性を有していたことを示している。ＦＧＦＲ４−Ｆｃ欠失改変体は、約０．１３７ｕｇ／ｍｌ〜約０．２０９ｕｇ／ｍｌのＥＣ５０値を有していた。対照的に、親ＦＧＦＲ４−Ｆｃは、約０．６３１ｕｇ／ｍｌのＥＣ５０値を有していた。ヒトＩｇＧ１陰性対照は、ＦＧＦ−１がプレート上にコーティングしたＦＧＦＲ４−Ｆｃに結合することを阻害しなかった。
これらの実験により、ＦＧＦＲ４欠失突然変異体Ｒ４Ｍｕｔ１、Ｒ４Ｍｕｔ２、Ｒ４Ｍｕｔ３、Ｒ４Ｍｕｔ４およびＲ４Ｍｕｔ５が、ＦＧＦ−１（図５Ａに示す）、ＦＧＦ−２（図５Ｂに示す）、およびＦＧＦ−８ｂ（図５Ｃに示す）とプレートに固定したＦＧＦＲ４−Ｆｃとの結合を阻害するその能力に関して、親ＦＧＦＲ４−Ｆｃよりも高い親和性を有していたことが実証された。
（実施例１０）
（直接ＥＬＩＳＡによって測定した、ＦＧＦＲ１−ＩＩＩｃ−Ｆｃ欠失突然変異体に対するリガンド結合の親和性）
直接ＦＧＦ−２結合ＥＬＩＳＡアッセイによって、Ｒ１Ｍｕｔ１、Ｒ１Ｍｕｔ２、Ｒ１Ｍｕｔ３、Ｒ１Ｍｕｔ４、およびＲ１Ｍｕｔ５融合タンパク質を、ＦＧＦ−２と結合するその能力について、親ＦＧＦＲ１−ＩＩＩｃ−Ｆｃ融合タンパク質と比較した（すべて実施例３に記載のように２９３−６Ｅ宿主細胞から産生）。手短に述べると、ＦＧＦ−２（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ；ミネソタ州Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ）を用いて、ＦＧＦ−２をＰＢＳ中に、５ｕｇ／ｍｌの濃度、２５ｕｌ体積／ウェルで希釈し、１時間、室温で振盪しながらインキュベーションを行うことによって、ハーフウェルＨＩ ＢＩＮＤウェル（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ；ニュージャージー州Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ）をコーティングした。その後、１５０ｕｌのＢＬＯＴＴＯ（Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ；イリノイ州Ｒｏｃｋｆｏｒｄ）を各ウェルに加え、１時間、室温でインキュベーションを行うことによって、ウェルを遮断した。その後、ＦＧＦ−２およびＢＬＯＴＴＯを除去するために、０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳでプレートを６回洗浄し、ウェルを、様々な濃度のＦＧＦＲ１−ＩＩＩｃ−Ｆｃ、Ｒ１Ｍｕｔ１、Ｒ１Ｍｕｔ２、Ｒ１Ｍｕｔ３、Ｒ１Ｍｕｔ４、Ｒ１Ｍｕｔ５、またはヒトＩｇＧ（陰性対照として）と共に、ＰＢＳ中の０．１×ＢＬＯＴＴＯに希釈した１０ｕｇ／ｍｌのヘパリンの存在下で、終夜４℃でインキュベーションを行った。プレートを以前のように洗浄し、その後、ＢＬＯＴＴＯ中に２．５ｕｇ／ｍｌの２５ｕｌのＨＲＰにコンジュゲートさせた抗ヒトＦｃ抗体と共に、１時間、室温、プレート振盪器上でインキュベーションを行った。その後、ＢＬＯＴＴＯを除去し、プレートを再度以前のように洗浄した。洗浄後、ウェルを、再構成したＯＰＤ溶液（Ｓｉｇｍａ；ミズーリ州Ｓａｉｎｔ Ｌｏｕｉｓ）と共に１０〜２０分間、室温でインキュベーションを行い、４５０ｎｍでの吸光度を測定した。
図６に示すように、Ｒ１Ｍｕｔ１、Ｒ１Ｍｕｔ２、Ｒ１Ｍｕｔ３、およびＲ１Ｍｕｔ４はそれぞれ、親ＦＧＦＲ１−ＩＩＩｃ−Ｆｃと同等またはそれ以上にＦＧＦ−２と結合することができたが、Ｒ１Ｍｕｔ５はそうではなかった。Ｒ１Ｍｕｔ４が、この実験で試験したすべての融合タンパク質の中で最も高い見かけ上の親和性を有していた。ＭＭＰ−２切断部位突然変異体Ｒ１Ｍｕｔ７、Ｒ１Ｍｕｔ８、およびＲ１Ｍｕｔ９（すべて実施例２に記載のように発現ベクターｐＴＴ５を用いて２９３−６Ｅ宿主細胞中で産生）も、親ＦＧＦＲ１−ＩＩＩｃ−Ｆｃと同様の親和性でＦＧＦ−２と結合した。
（実施例１１）
（ＦＧＦＲ融合タンパク質はＦＧＦＲ１−ＩＩＩｃ−Ｆｃのリガンド結合を阻害する）
実施例１、２、および３に記載のように作製した、２９３−６ＥおよびＣＨＯ細胞から産生させたＦＧＦＲ１−ＩＩＩｃ−Ｆｃ融合タンパク質を、可溶性ＦＧＦリガンドＦＧＦ−１、ＦＧＦ−２、およびＦＧＦ−８ｂを捕捉し、ならびにプレート上にコーティングしたＦＧＦＲ１−ＩＩＩｃ−Ｆｃ融合タンパク質に対するリガンド結合を阻害するその能力について、競合ＥＬＩＳＡアッセイで試験した。
手短に述べると、ＨＩ ＢＩＮＤハーフウェルを、２９３−６Ｅ由来のＦＧＦＲ１−ＩＩＩｃ−Ｆｃを用いて、ＰＢＳ中に５ｕｇ／ｍｌの濃度、２５ｕｌ／ウェルの体積で、１時間、室温でコーティングした。１５０ｕｌのＢＬＯＴＴＯ／ウェルを加え、２時間、室温でインキュベーションを行うことによってウェルを遮断した。その後、未結合のＦＧＦＲ１−ＩＩＩｃ−ＦｃおよびＢＬＯＴＴＯを除去するために、コーティングしたハーフウェルプレートをＰＢＳおよび０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０で６回洗浄した。
２９３−６Ｅ細胞もしくはＣＨＯ細胞から産生させた様々な量のＦＧＦＲ１−ＩＩＩｃ−Ｆｃ融合タンパク質、または１０ｕｇ／ｍｌの陰性対照ヒトＩｇＧ（Ｃａｌｔａｇ；カリフォルニア州Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ）を、５０ｕｌの２００ｎｇ／ｍｌの組換えヒトＦＧＦ−２（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓから）と共に、ＰＢＳ中に０．１×ＢＬＯＴＴＯ中の２０ｕｇ／ｍｌのヘパリンの存在下で、３０分間、３７℃で、振盪器上で、それぞれ最初に９６ウェルのＵ字底プレート中でプレインキュベーションを行った。その後、ＦＧＦ−２と共にプレインキュベーションを行った約４０ｕｌの上記融合タンパク質を、ＦＧＦＲ１−ＩＩＩｃ−Ｆｃをコーティングした洗浄したハーフウェルプレートに加え、３０分間、３７℃で振盪しながらインキュベーションを行った。インキュベーション後、すべての未結合のＦＧＦ−２を除去するために、プレートを以前のようにＰＢＳおよび０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０で６回洗浄した。洗浄後、１×ＢＬＯＴＴＯ中に約２ｕｇ／ｍｌの抗ヒトＦＧＦ−２ポリクローナルビオチン標識抗体（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓから）をプレートの各ウェルに加え、その後、それを３０分間、３７℃で振盪しながらインキュベーションを行い、次いで、すべての未結合の抗ＦＧＦ−２抗体を除去するために、以前のように洗浄した。結合した抗ＦＧＦ−２抗体は、ＡＢＣキット（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、カリフォルニア州Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ）中に提供されたストレプトアビジン−ＨＲＰリンカーを用いて、製造者のプロトコルに従って検出した。以前のように洗浄した後、再構成したＯＰＤ溶液（Ｓｉｇｍａ；ミズーリ州Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ）を加えた。検出反応を１０〜２０分間、室温で展開させ、次いで４５０ｎｍでの吸光度を読み取った。結果を図７に示す。
図７は、２９３−６ＥおよびＣＨＯ細胞から産生させたＦＧＦＲ１−ＩＩＩｃ−Ｆｃが、ＦＧＦ−２競合アッセイにおいてＦＧＦ−２を捕捉するその能力について、ほぼ同等の結合強度を有していたことを示す。２つの融合タンパク質のそれぞれが、約０．２４ｕｇ／ｍｌのＥＣ５０値を示した。対照的に、ヒトＩｇＧ１陰性対照は、ＦＧＦ−２がプレート上にコーティングしたＦＧＦＲ１−ＩＩＩｃ−Ｆｃと結合することを阻害しなかった。
類似の競合ＥＬＩＳＡ実験を実施し、組換えヒトＦＧＦ−１（６０ｎｇ／ｍｌの濃度）、組換えヒトＦＧＦ−２（２００ｎｇ／ｍｌの濃度）、および組換えマウスＦＧＦ−８ｂ（２００ｎｇ／ｍｌの濃度）（すべてＲ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ；ミネソタ州Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓから）と２９３細胞に由来し、アッセイプレート上に固定したＦＧＦＲ１−ＩＩＩｃ−Ｆｃとの結合を阻害する、どちらもＤＧ４４宿主細胞中で産生させたＦＧＦＲ１−ＩＩＩｃ−Ｆｃ融合タンパク質およびＲ１Ｍｕｔ４融合タンパク質の能力を比較した。これらの実験はすべて、Ｒ１Ｍｕｔ４および親ＦＧＦＲ１−ＩＩＩｃ−Ｆｃ融合タンパク質が、ＦＧＦ−１（図８Ａに示す）、ＦＧＦ−２（図８Ｂに示す）、およびＦＧＦ−８ｂ（図９に示す）とプレートに固定したＦＧＦＲ１−ＩＩＩｃ−Ｆｃとの結合を阻害するその能力において同等であったことを実証している。
ＤＧ４４宿主細胞中で産生させたＦＧＦＲ１−ＩＩＩｃ−Ｆｃならびに２９３−６Ｅ宿主細胞中で産生させたＦＧＦＲ３−ＩＩＩｃ−ＦｃおよびＦＧＦＲ４−Ｆｃも、２９３細胞中で産生させ、アッセイプレート上に固定したＦＧＦＲ１−ＩＩＩｃ−Ｆｃに対するリガンド結合を阻害した。上述のように実施した競合ＥＬＩＳＡアッセイでは、組換えヒトＦＧＦ−１、組換えヒトＦＧＦ−２、および組換えマウスＦＧＦ−８ｂを用いた（すべてＲ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ；ミネソタ州Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓから）。ヒトＩｇＧを陰性対照として用いた。結果を図１０、図１１、および図１２に示し、これらは、リガンド−受容体結合を遮断することにおける囮融合タンパク質の有効性、およびその対応するリガンドに対する融合タンパク質の特異性をどちらも実証している。
図１０は、ＦＧＦＲ１−ＩＩＩｃ−Ｆｃ、ＦＧＦＲ３−ＩＩＩｃ−Ｆｃ、およびＦＧＦＲ４−Ｆｃがすべて、ＦＧＦ−１とアッセイプレート上に固定したＦＧＦＲ１−ＩＩＩｃ−Ｆｃとの結合を阻害したことを示す。図１１は、ＦＧＦＲ３−ＩＩＩｃ−ＦｃおよびＦＧＦＲ４−Ｆｃが、ＦＧＦ−２とアッセイプレート上に固定したＦＧＦＲ１−ＩＩＩｃ−Ｆｃとの結合の阻害においてＦＧＦＲ１−ＩＩＩｃ−Ｆｃよりもはるかに有効性が低かったことを示す。図１２は、ＦＧＦＲ１−ＩＩＩｃ−Ｆｃ、ＦＧＦＲ３−ＩＩＩｃ−Ｆｃ、およびＦＧＦＲ４−Ｆｃが、ＦＧＦ−８とプレート上に固定したＦＧＦＲ１−ＩＩＩｃ−Ｆｃとの結合の阻害において、すべで同様に有効であったことを示す。
（実施例１２）
（ＦＧＦＲ１−ＩＩＩｃ−ＦｃはＦＧＦ−２によるｐｈｏｓｐｈｏ−Ｅｒｋシグナル伝達を阻害した）
２９３−６ＥまたはＣＨＯ細胞に由来するＦＧＦＲ１−ＩＩＩｃ−Ｆｃ融合タンパク質は、ＦＧＦ−２による生物学的シグナル伝達の阻害においてほぼ同等に強力であった。Ｔ−１７５フラスコ中で増殖中のＦＧＦＲ１−ＩＩＩｃで形質移入したＬ６細胞（ＥＴＨ；スイスＺｕｒｉｃｈ）をトリプシン処理し、洗浄し、１０，０００個の細胞／ウェルの濃度、１００ｕｌの体積で、９６ウェル平底プレート中の０．５％のＦＣＳおよび０．１％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を添加したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）に、１６時間播種した。ＦＧＦＲ１−ＩＩＩｃ−Ｆｃ融合タンパク質またはヒトＩｇＧ１を０．００５〜１０ｕｇ／ｍｌの濃度で含む活性化培地を調製し（１００ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ−２、１０ｕｇ／ｍｌのヘパリンを含む０．１％のＢＳＡ ＤＭＥＭ中）、３０分間、３７℃で、プレート振盪器上でインキュベーションを行った。その後、Ｌ６細胞を、２５ｕｌの活性化培地／ウェルに５分間、３７℃で曝した。その後、細胞を２００ｕｌの氷冷ＰＢＳで１回洗浄し、ＰａｔｈＳｃａｎ ｐｈｏｓｐｈｏ−ｐ４４／４２ＭＡＰＫ（Ｔ２０２／Ｙ２０４）Ｓａｎｄｗｉｃｈ ＥＬＩＳＡキット（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ；マサチューセッツ州Ｄａｎｖｅｒｓ）の製造者の推奨に従って、１００ｕｌの氷冷１×溶解緩衝液で３０分間、氷上で溶解した。溶解期間の終了後、溶解物をピペットで約５回、発泡を最小限にしながら吸入、排出を行った。約８０ｕｌのＳａｍｐｌｅ Ｄｉｌｕｅｎｔ（Ｐａｔｈｓｃａｎ Ｓａｎｄｗｉｃｈ ＥＬＩＳＡキットから）をｐｈｏｓｐｈｏ−ＥＲＫ ＥＬＩＳＡプレートの各ウェルに加え、８０ｕｌの細胞溶解液を加え、混合した。その後、プレートをプラスチック接着材で密封し、２時間、３７℃でインキュベーションを行い、０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳで６回洗浄した。その後、１００ｕｌのｐｈｏｓｐｈｏ−ＥＲＫ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ｐａｔｈｓｃａｎ Ｓａｎｄｗｉｃｈ ＥＬＩＳＡキットから）を各ウェルに加えた。プレートを接着性カバーで密封し、１時間、３７℃でインキュベーションを行い、以前のように洗浄し、１００ｕｌのＨＲＰ連結二次抗体（Ｐａｔｈｓｃａｎ Ｓａｎｄｗｉｃｈ ＥＬＩＳＡキットから）を各ウェルに加えた。プレートを再度密封し、３０分間、３７℃でインキュベーションを行い、その後、以前のように洗浄した。その後、約１００ｕｌのＴＭＢ基質（３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン、Ｐａｔｈｓｃａｎ Ｓａｎｄｗｉｃｈ ＥＬＩＳＡキットから）を各ウェルに加え、プレートを３０分間、２５℃でインキュベーションを行った。１００ｕｌのＳＴＯＰ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｐａｔｈｓｃａｎ Ｓａｎｄｗｉｃｈ ＥＬＩＳＡキットから）を各ウェルに加えて混合することによって、発色を完了させた。４５０ｎｍでの吸光度を記録し、図１３に示すようにプロットした。
図１３は、ＥＬＩＳＡによって決定されたＥｒｋリン酸化が、２９３−６ＥまたはＣＨＯ細胞のどちらかから作製させたＦＧＦＲ１−ＩＩＩｃ−Ｆｃによって同様に阻害されることを示す。より低い用量では、ＦＧＦＲ１−ＩＩＩｃ−ＦｃはＥｒｋ活性化を鈍らせ、より高い用量ではＦＧＦ−２による活性化を妨げた。１００ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ−２の存在下で、２９３細胞由来およびＣＨＯ細胞由来のＦＧＦＲ１−ＩＩＩｃ−ＦｃのＥＣ５０値はそれぞれ０．２３ｕｇ／ｍｌおよび０．２９ｕｇ／ｍｌであった。ヒトＩｇＧ１はＦＧＦ−２で活性化させたＥｒｋリン酸化を阻害しなかった。
２９３−６Ｅ細胞によって産生させたＦＧＦＲ１−ＩＩＩｃ−ＦｃおよびＲ１Ｍｕｔ４融合タンパク質は、Ｅｒｋリン酸化を阻害しなかったＲ１Ｍｕｔ５とは対照的に、ほぼ同じ強度でＥｒｋリン酸化を阻害した。０．１０ｕｇ／ｍｌのＦＧＦ−２の存在下で、ＦＧＦＲ１−ＩＩＩｃ−ＦｃのＥＣ５０は０．１８ｕｇ／ｍｌであり、Ｒ１Ｍｕｔ４のＥＣ５０は０．２９ｕｇ／ｍｌであった。低用量では、ＦＧＦＲ１−ＩＩＩｃ−ＦｃおよびＲ１Ｍｕｔ４はどちらもＥｒｋ活性化を鈍らせ、高用量では、どちらも活性化を妨げた。結果を図１４に示す。
（実施例１３）
（ＦＧＦＲ１−ＩＩＩｃ−Ｆｃが癌細胞の生存度および増殖を低下させた）
本発明のＦＧＦＲ−Ｆｃ融合タンパク質は、製造者の指示に従ってＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（商標）発光性細胞生存度アッセイで測定すると（Ｐｒｏｍｅｇａ；ウィスコンシン州Ｍａｄｉｓｏｎ）、培養癌細胞の生存度および／または増殖を低下させた。このアッセイでは、発光が生細胞の数と定量的に相関する。
アメリカンタイプカルチャーコレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）（ＡＴＣＣ）（バージニア州Ｍａｎａｓｓａｓ）から得たＵ２５１悪性膠芽細胞腫脳癌細胞に対するＦＧＦＲ１−ＩＩＩｃ−Ｆｃの効果を図１５〜１７に示す。細胞の生存度および増殖に対するＦＧＦＲ１−ＩＩＩｃ−Ｆｃの効果は、ＦＧＦＲ１−ＩＩＩｃ−Ｆｃの濃度および細胞の成長条件に依存していた。陰性対照ヒトＩｇＧ（２０ｕｇ／ｍｌ）は効果がなかった。陽性対照であるＴＲＡＩＬは、生存度および増殖を低下させた。ＦＧＦ−２（１００ｕｇ／ｍｌ）は増殖および分化を刺激した。より低い試験細胞濃度では、ＦＧＦ−２は２０μｇ／ｍｌのＦＧＦＲ１−ＩＩＩｃ−Ｆｃによって誘導された阻害を鈍らせなかった。
Ｕ２５１細胞を、ＤＭＥＭ中で、１．５グラム／リットル（ｇ／Ｌ）の炭酸水素ナトリウムおよび４．５ｇ／Ｌのグルコース、１０％の熱失活させたＦＣＳを含むように調節した４ｍＭのＬ−グルタミンを含むＤＭＥＭと共に、１００単位／ｍｌのペニシリンおよび１００ｕｇ／ｍｌのストレプトマイシン（ｐｅｎ−ｓｔｒｅｐ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；カリフォルニア州Ｃａｒｌｓｂａｄ）を用いて、７０％〜９０％コンフルエントに達するまでＴ−１５０フラスコ中で増殖させた。細胞を、ハンクス平衡塩類溶液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；カリフォルニア州Ｃａｒｌｓｂａｄ）中の１０ｍｌ／フラスコの０．２５％のトリプシン溶液を用いて、室温で３分間、３７℃で処理し、トリプシン−細胞懸濁液を４０ｍｌのＤＭＥＭ中の氷冷０．１％ＦＣＳと混合した。細胞を９００×ｇ、５分間、室温でペレットにした。この洗浄ステップを５０ｍｌのＤＭＥＭ中の氷冷０．１％ＦＣＳで繰り返し、細胞を５ｍｌのＤＭＥＭ中の氷冷０．１％ＦＣＳに再懸濁させた。
再懸濁させたＵ２５１細胞を、２０ｕｇ／ｍｌのブタ腸管粘膜ヘパリン（Ｓｉｇｍａ；ミズーリ州Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ）の存在下で、９６ウェル平底組織培養グレードプラスチックプレート（Ｎｕｎｃ；ニューヨーク州Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ）中に１５０ｕｌ／ウェルの体積で植えた。細胞は３つの培養条件で植えた：（１）１０００個の細胞／ウェルの濃度、ＤＭＥＭ中に１０％のＦＣＳおよびｐｅｎ−ｓｔｒｅｐの存在下；（２）５０００個の細胞／ウェルの濃度、ＤＭＥＭ中に１．０％のＦＣＳおよびｐｅｎ−ｓｔｒｅｐの存在下；（３）１０，０００個の細胞／ウェルの濃度、ＤＭＥＭ中に０．１％のＦＣＳおよびｐｅｎ−ｓｔｒｅｐの存在下。細胞を、タンパク質１つあたり４つの複製ウェルでＦＧＦＲ１−ＩＩＩｃ−Ｆｃタンパク質または対照タンパク質で処理し、３７℃、５％のＣＯ２で５日間、加湿インキュベーター内でインキュベーションを行った。ＦＧＦＲ１−ＩＩＩｃ−Ｆｃタンパク質を２９３−６Ｅ細胞から作製し、実施例２および７に記載のように実質的に精製した。細胞を２０ｕｇ／ｍｌ、４ｕｇ／ｍｌ、または０．８ｕｇ／ｍｌの濃度のＦＧＦＲ１−ＩＩＩｃ−Ｆｃで処理した。対照タンパク質には、陰性対照として、保存料を除去するためにＰＢＳに対して透析し、その後フィルター滅菌した２０ｕｇ／ｍｌの精製したヒトＩｇＧ（Ｃａｌｔａｇ；カリフォルニア州Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ）、陽性対照として、単独でまたは２０ｕｇ／ｍｌのＦＧＦＲ１−ＩＩＩｃ−Ｆｃと組み合わせて用いた１００ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ−２（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ；ミネソタ州Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ）；および陽性対照として用いた１０ｎｇ／ｍｌのＴＲＡＩＬ（ＡＰＯ２リガンド／腫瘍壊死因子関連アポトーシス誘導リガンド）（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ；ミネソタ州Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ）が含まれていた。
その後、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（商標）発光性細胞生存度アッセイキット（Ｐｒｏｍｅｇａ；ウィスコンシン州Ｍａｄｉｓｏｎ）を用いて、製造者の指示に従って、細胞生存度を決定した。手短に述べると、１００ｕｌ／ウェルの再構成したＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（商標）試薬を細胞に加え、暗所で１０分間インキュベーションを行った。ピペット操作によってウェルの内容物を混合し、各ウェルから１００ｕｌを不透明な白色の９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ；マサチューセッツ州Ａｃｔｏｎ）に移した。各ウェルからの発光性出力を０．６秒／ウェルの記録時間を用いて読み取り、４つの複製の平均相対発光単位（ＲＬＵ）を、その標準偏差と共にプロットした。
図１５に示すように、試験した３つの濃度それぞれにおけるＦＧＦＲ１−ＩＩＩｃ−Ｆｃが、１０％のＦＣＳ中に１０００個の細胞／ウェルの濃度で植えた培養Ｕ２５１悪性膠芽細胞腫細胞の生存度および増殖を低下させた。未処理の細胞は、約４８０のＲＬＵを示した。２０ｕｇ／ｍｌ、４ｕｇ／ｍｌ、および０．８ｕｇ／ｍｌのＦＧＦＲ１−ＩＩＩｃ−Ｆｃで処理した細胞は、それぞれ約３８０、４００、および４００のＲＬＵを示した。ヒトＩｇＧは生存度および増殖を阻害せず、約５００のＲＬＵを示した。ＦＧＦ−２は単独で生存度および増殖を増強し、約６００のＲＬＵを示した。ＦＧＦ−２および２０ｕｇ／ｍｌのＦＧＦＲ１−ＩＩＩｃ−Ｆｃの組合せは細胞の生存度および増殖を低下させ、約４００のＲＬＵを示した。ＴＲＡＩＬを用いた処置はほぼ完全な阻害をもたらし、ＲＬＵは約１０であった。
図１６に示すように、試験した３つの濃度それぞれにおけるＦＧＦＲ１−ＩＩＩｃ−Ｆｃが、１．０％のＦＣＳ中に５０００個の細胞／ウェルの濃度で植えた培養Ｕ２５１悪性膠芽細胞腫細胞の生存度および増殖を低下させた。未処理の細胞は、約３６０のＲＬＵを示した。２０ｕｇ／ｍｌ、４ｕｇ／ｍｌ、および０．８ｕｇ／ｍｌのＦＧＦＲ１−ＩＩＩｃ−Ｆｃで処理した細胞は、それぞれ約６０、１４０、および２００のＲＬＵを示した。ヒトＩｇＧは生存度および増殖を阻害せず、約４００のＲＬＵを示した。ＦＧＦ−２は単独で約３２０のＲＬＵを示した。ＦＧＦ−２および２０ｕｇ／ｍｌのＦＧＦＲ１−ＩＩＩｃ−Ｆｃの組合せは細胞の生存度および増殖を低下させ、約９０のＲＬＵを示した。ＴＲＡＩＬを用いた処置はほぼ完全な阻害をもたらした。
図１７に示すように、ＦＧＦＲ１−ＩＩＩｃ−Ｆｃは、０．１％のＦＣＳ中に１０，０００個の細胞／ウェルの濃度で植えた培養Ｕ２５１悪性膠芽細胞腫細胞の生存度および増殖を低下させた。これらの成長条件により、ウェル間にさらなる可変性が生じたが、図１７は、ＦＧＦＲ１−ＩＩＩｃ−Ｆｃが図１５および図１６に記載した様式と同様にＵ２５１細胞の生存度および増殖を阻害したことを実証している。
ＡＴＣＣ（バージニア州Ｍａｎａｓｓａｓ）またはＮＣＩ（メリーランド州Ｂｅｔｈｅｓｄａ）から得た様々な固形腫瘍の種類を表す癌細胞系由来の癌細胞の生存度および増殖に対するＦＧＦＲ１−ＩＩＩｃ−Ｆｃの効果を、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（商標）発光性細胞生存度アッセイを用いて試験した。それぞれの細胞系に推奨される増殖培地を用いて、細胞を約７０％〜９０％コンフルエントになるまでＴ−１５０フラスコ中で増殖させた。細胞を収集し、Ｕ２５１細胞について上述した様式と同様に処理した。細胞は、１０００個の細胞／ウェルの密度をＤＭＥＭ中に１０％のＦＣＳの存在下で、５０００個の細胞／ウェルをＤＭＥＭ中に１．０％のＦＣＳの存在下で、または１０，０００個の細胞／ウェルをＤＭＥＭ中に０．１％のＦＣＳの存在下で；２０ｕｇ／ｍｌのＦＧＦＲ１−ＩＩＩｃ−Ｆｃを試験薬剤としてまたは２０ｕｇ／ｍｌのヒトＩｇＧを陰性対照として用いて植えた。
試験した癌細胞系には、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５（乳房）、ＭＣＦ７（乳房）、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１（乳房）、Ｔ４７Ｄ（乳房）、Ａ５４９（肺）、ＮＣＩ−Ｈ５２２（肺）、ＮＣＩ−Ｈ４６０（肺）、ＮＣＩ−Ｈ２３（肺）、ＮＣＩ−Ｈ２２６（肺）、Ｕ１１８（脳）、Ｕ８７１１４（脳）、Ｕ２５１（脳）、ＳＦ２６８（脳）、ＷＴ１１（脳）、ＤＵ１４５（前立腺）、ＰＣ−３（前立腺）、ＣＯＬＯ２０５（結腸）、Ｃａｋｉ−１（腎臓）、ＳＫ−ＭＥＬ−２（皮膚）およびＳＫ−ＯＶ−３（卵巣）が含まれていた。結果を図１８に示す。試験した２０個の癌細胞系のうち、８個が、試験した成長条件の１つまたは複数の下でＦＧＦＲ１−ＩＩＩｃ−Ｆｃによる阻害に感受性があった。８個の感受性細胞系は、Ａ５４９（肺）、ＮＣＩ−Ｈ５２２（肺）、ＮＣＩ−Ｈ２２６（肺）、Ｕ１１８（脳）、Ｕ２５１（脳）、ＳＦ２６８（脳）、ＷＴ１１（脳）、およびＣａｋｉ−１（腎臓）であった。
ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（商標）発光性細胞生存度アッセイによって測定すると、ＦＧＦＲ１−ＩＩＩｃ−ＦｃおよびＦＧＦＲ４−ＦｃはどちらもＡ５４９肺癌細胞の生存度および増殖を阻害した。試験したＦＧＦＲ１−ＩＩＩｃ−ＦｃおよびＦＧＦＲ４−Ｆｃタンパク質は、一過的の形質移入を介して２９３−６Ｅ細胞中で産生させ、実施例２および７に記載のように精製した。Ａ５４９細胞に対するＦＧＦＲ１−ＩＩＩｃ−ＦｃおよびＦＧＦＲ４−Ｆｃの効果は、Ｕ２５１細胞について上述したものに類似のプロトコルを用いて試験した。Ａ５４９細胞を、４つの複製ウェルに、２５，０００個の細胞／ウェルの密度、１５０ｕｌの体積で、平底９６ウェルプレート中に、０．１％のＦＣＳ ＤＭＥＭおよびｐｅｎ−ｓｔｒｅｐ中に２０ｕｇ／ｍｌのブタ腸管粘膜ヘパリン（Ｓｉｇｍａ；ミズーリ州Ｓａｉｎｔ Ｌｏｕｉｓ）の存在下で播種した。Ａ５４９細胞は、４倍段階希釈で、約０．０００００９５ｕｇ／ｍｌ〜約１０ｕｇ／ｍｌの範囲の濃度のＦＧＦＲ１−ＩＩＩｃ−Ｆｃタンパク質またはＦＧＦＲ４−Ｆｃタンパク質の存在下、５日間、３７℃、５％のＣＯ２で培養した。ヒトＩｇＧ（１０ｕｇ／ｍｌ）を陰性対照として用いた。図１９に示すように、細胞の生存度および増殖を％阻害、すなわち（未処理の平均ＲＬＵ−試料の平均ＲＬＵ）／（未処理の平均ＲＬＵ）×１００として表した。誤差バーは、％誤差、すなわち（試料の標準偏差／平均試料ＲＬＵ）×１００を示す。
より高い試験濃度では、ＦＧＦＲ１−ＩＩＩｃ−Ｆｃは、ＩｇＧ対照と比較してＡ５４９細胞の生存度および増殖を約４０％まで阻害した。ＦＧＦＲ１−ＩＩＩｃ−ＦｃのＩＣ５０は約９．４ｎｇ／ｍｌであり、これは０．１１ナノモーラー（ｎＭ）に等しい。最も高い試験濃度では、ＦＧＦＲ４−Ｆｃも、ＩｇＧ対照と比較してＡ５４９細胞の生存度および増殖を約４０％まで阻害した。ＦＧＦＲ４−ＦｃのＩＣ５０は約１００ｎｇ／ｍｌであり、これは１．２ｎＭに等しい。これはＦＧＦＲ１−ＩＩＩｃ−Ｆｃで観察されたよりも高く、Ａ５４９細胞の生存度および増殖の阻害においてＦＧＦＲ１−ＩＩＩｃ−ＦｃがＦＧＦＲ４−Ｆｃよりも強力であることを反映している。
（実施例１４）
（ＦＧＦＲ−Ｆｃ融合タンパク質は癌細胞の生存度および増殖を低下させた）
ＦＧＦＲ１−ＩＩＩｂ−Ｆｃ、ＦＧＦＲ１−ＩＩＩｃ−Ｆｃ、ＦＧＦＲ２−ＩＩＩｂ−Ｆｃ、ＦＧＦＲ２−ＩＩＩｃ−Ｆｃ、ＦＧＦＲ３−ＩＩＩｂ−Ｆｃ、ＦＧＦＲ３−ＩＩＩｃ−Ｆｃ、およびＦＧＦＲ４−Ｆｃを、６つの異なる癌細胞系の生存度および／または増殖を阻害する能力について試験した。このアッセイで試験した７つの融合タンパク質は、市販源から得た（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）。癌細胞系には、Ａ５４９（肺）、Ｕ１１８（脳）、Ｕ２５１（脳）、ＳＦ２６８（脳）、Ｔ４７Ｄ（乳房）およびＣａｋｉ−１（腎臓）が含まれていた。
実施例１３に記載のアッセイから得られた結果により、１個のウェルあたり植える癌細胞の数およびその培地中のＦＣＳの濃度を決定するための基礎が提供された。例えば、Ａ５４９肺癌細胞は、２５，０００個の細胞／ウェルで、１５０ｕｌのＤＭＥＭ中、０．１％のＦＣＳおよびｐｅｎ−ｓｔｒｅｐと共に、９６ウェル様式で植えた。これらを約０．０７８１２５ｕｇ／ｍｌ〜約５．０ｕｇ／ｍｌの範囲のＦＧＦＲ１−ＩＩＩｃ−Ｆｃ、ＦＧＦＲ２−ＩＩＩｃ−Ｆｃ、ＦＧＦＲ３−ＩＩＩｃ−Ｆｃ、またはＦＧＦＲ４−Ｆｃの２倍段階希釈で処理した。実施例１１に記載のように、ヒトＩｇＧを陽性対照として用いた。それぞれの融合タンパク質処理は３つ組ウェルで行い、それぞれのデータ点は３つのウェルの平均を表す。５日間処理したのち、Ａ５４９細胞の細胞生存度のアッセイを上述のＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（商標）発光性細胞生存度アッセイで行った。結果を図２０に示し、Ａ５４９細胞のＦＧＦＲ−Ｆｃ融合タンパク質阻害は用量依存性であり、最も高い試験濃度（５ｕｇ／ｍｌ）で約４２％にまで達することが示された。融合タンパク質の強度の順序は、ＦＧＦＲ１−ＩＩＩｃ−Ｆｃ＝ＦＧＦＲ２−ＩＩＩｃ−Ｆｃ＞ＦＧＦＲ３−ＩＩＩｃ−Ｆｃ＝ＦＧＦＲ１−ＩＩＩｂ−Ｆｃ＞ＦＧＦＲ２−ＩＩＩｂ−Ｆｃ＝ＦＧＦＲ４−Ｆｃ＞ＦＧＦＲ３−ＩＩＩｂ−Ｆｃ＞ヒトＩｇＧであった。
生存度および増殖に対するＦＧＦＲ−Ｆｃ融合タンパク質の効果を試験する類似の実験を、癌細胞系Ｕ１１８（図２０Ｂ）、Ｕ２５１（図２０Ｃ）、ＳＦ２６８（図２０Ｄ）、Ｔ４７Ｄ（図２０Ｅ）およびＣａｋｉ−１（図２０Ｆ）で行った。プロトコルは、ヒトＩｇＧを陰性対照として用いることを含めて、上述したものと同様であった。試験したすべての癌細胞系が７つのＦＧＦＲ−Ｆｃ融合タンパク質の１つまたは複数によって阻害された。結果を図２１に要約する。
ＦＧＦＲ１−ＩＩＩｃ−Ｆｃ突然変異体Ｒ１Ｍｕｔ４は、癌細胞系Ａ５４９およびＵ２５１の生存度および増殖を阻害したが、Ｒ１Ｍｕｔ５はそうではなかった（図２０Ｇ）。アッセイプロトコルは上述と同様であった。細胞を、約０．００４５７ｕｇ／ｍｌ〜約１０ｕｇ／ｍｌの範囲の濃度でＦＧＦＲ１−ＩＩＩｃ−Ｆｃ、Ｒ１Ｍｕｔ４、Ｒ１Ｍｕｔ５、またはヒトＩｇＧの３倍段階希釈で処理した。ＦＧＦＲ１−ＩＩＩｃ−Ｆｃ、Ｒ１Ｍｕｔ４、およびＲ１Ｍｕｔ５は、実施例２に記載のｐＴＴ５ベクターを用いて２９３−６Ｅ細胞中で発現させ、実施例７に記載のように精製した。それぞれの融合タンパク質処理は３つ組ウェルで行った。５日間処理したのち、Ａ５４９およびＵ２５１細胞の生存度のアッセイをＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（商標）発光性細胞生存度アッセイで行った。それぞれのデータ点は３つのウェルの平均を表す。結果を図２０Ｇに示す。Ａ５４９細胞は、試験したすべての用量において、ＦＧＦＲ１−ＩＩＩｃ−ＦｃおよびＲ１Ｍｕｔ４のどちらによっても同程度に阻害された（約４０ＲＬＵから２０ＲＬＵ）。Ｕ２５１細胞もＦＧＦＲ１−ＩＩＩｃ−ＦｃおよびＲ１Ｍｕｔ４によって同程度に阻害された。これらは試験した濃度で用量依存性を示し、最も低い用量では阻害が観察されず、最も高い用量で最大の阻害が観察された（約１００ＲＬＵから３０ＲＬＵ）。
（実施例１５）
（マウスにおけるｉｎ ｖｉｖｏのＦＧＦＲ１−ＩＩＩｃ−Ｆｃの持続発現）
動物モデル、例えば動物腫瘍モデルにおけるヒトＦＧＦＲ１−ＩＩＩｃ−Ｆｃ融合タンパク質の持続発現の効果を、マウスにおいてＦＧＦＲ１−ＩＩＩｃ−Ｆｃを発現させるために水力学的尾静脈注射法を用いて試験した。ＦＧＦＲ１−ＩＩＩｃ−Ｆｃ融合タンパク質をコードしている裸の「ミニサークル」ベクターｃＤＮＡを３カ月齢のＣ５７／Ｂ１６雌マウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ；カリフォルニア州Ｈｏｌｌｉｓｔｅｒ）に注射した。この「ミニサークル」ベクターはＦＧＦＲ１ ＩＩＩｃ−Ｆｃ ｃＤＮＡを含んでおり、実施例２に記載のように作製した。Ｌｉｕ， Ｆ．ら、Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ、６：１２５８〜１２６６頁（１９９９年）および米国特許第６，６２７，６１６号に報告されているように、水力学的尾静脈注射法を用いてその尾静脈を介して、生理食塩水中に約１５ｕｇ／ｍｌのＤＮＡ濃度で動物に注射した。約２ｍｌのＤＮＡ組成物を５〜８秒間内にそれぞれのマウスに注射した。３匹のマウスにＦＧＦＲ１−ＩＩＩｃ−Ｆｃ ｃＤＮＡを含むミニサークルＤＮＡを注射し、３匹のマウスに対照として生理食塩水を注射した。約５０ｕｌの体積の血清試料を、尾静脈のニックから、注射後２、９、１６、２４、３０、３７、および４４日目に得た。血清試料中のＦＧＦＲ１−ＩＩＩｃ−Ｆｃタンパク質の濃度を直接ＥＬＩＳＡによって分析し、マウス血清中のＦＧＦＲ１−ＩＩＩｃ−Ｆｃのリガンド結合活性をＦＧＦ−２競合ＥＬＩＳＡによって分析した。どちらのＥＬＩＳＡ方法も以下にさらに詳述する。
ＦＧＦＲ１−ＩＩＩｃ−Ｆｃを検出するための直接サンドイッチＥＬＩＳＡを開発し、注射したマウスの血清中のＦＧＦＲ１−ＩＩＩｃ−Ｆｃを検出するために用いた。手短に述べると、ＨＩ−ＢＩＮＤハーフウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ；マサチューセッツ州Ａｃｔｏｎ）を、３ｕｇ／ｍｌの濃度までＰＢＳ中で希釈した抗ヒトＦＧＦＲ１抗体（ＱＥＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カリフォルニア州Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ）を用いて、１時間、室温でまたは終夜４℃でコーティングし、その後、ウェルを、遮断緩衝液（ＰＢＳ中に３％まで希釈したＢＬＯＴＴＯ）を用いて、２〜５時間、室温で遮断した。プレートを０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳで洗浄し、０．６×ＢＬＯＴＴＯに希釈したそれぞれの試験動物からの５０ｕｌのマウス血清を各ウェルにそれぞれ加え、２時間、室温でインキュベーションを行った。その後、プレートを以前のように洗浄し、遮断緩衝液中に１：３０００に希釈した５０ｕｌ／ウェルのペルオキシダーゼにコンジュゲートさせたＡｆｆｉＰｕｒｅヤギ抗ヒトＦｃ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ−Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ；ペンシルバニア州Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ）と共に、６０分間、室温でインキュベーションを行った。プレートを以前のように洗浄し、ウェルを再構成したＯＰＤ溶液（Ｓｉｇｍａ；ミズーリ州Ｓａｉｎｔ Ｌｏｕｉｓ）と共に１０〜２０分間、室温でインキュベーションを行い、４５０ｎｍでの吸光度を決定した。
結果を図２２に示し、融合タンパク質をコードしているｃＤＮＡを注射した後の日々における、３匹の注射したマウスのそれぞれの血清中のＦＧＦＲ１−ＩＩＩｃ−Ｆｃ融合タンパク質の量が実証された。生理食塩水を注射したマウスは、検出可能なレベルの融合タンパク質を示さなかった。血清中のＦＧＦＲ１−ＩＩＩｃ−Ｆｃの発現は、最も高く発現したマウスにおいて形質移入後少なくとも４４日間は高く保たれた。このマウスにおいて、ＦＧＦＲ１−ＩＩＩｃ−Ｆｃは、２日目に約１０ｕｇ／ｍｌ、９日目に約１００ｕｇ／ｍｌ、１６日目に約８０ｕｇ／ｍｌ、２４日目に約５０ｕｇ／ｍｌ、および３０〜４４日に約３５ｕｇ／ｍｌで検出された。ＦＧＦＲ１−ＩＩＩｃ−Ｆｃ ｃＤＮＡを注射した他の２匹のマウスは、より低いが検出可能なレベルの融合タンパク質を示した。この研究により、ｃＤＮＡを水力学的尾静脈注射した後にマウスにおいてヒトＦＧＦＲ１−ＩＩＩｃ−Ｆｃ融合タンパク質の高いかつ持続した発現を達成できること、およびこれらの動物を使用して、この融合タンパク質を用いた治療を監視できることが実証された。
ＦＧＦ−２競合ＥＬＩＳＡにより、これらの動物中で発現されたＦＧＦＲ１−ＩＩＩｃ−Ｆｃ融合タンパク質が機能的であったことが実証された。上述のｃＤＮＡを注射した動物の血清中のＦＧＦＲ１−ＩＩＩｃ−Ｆｃは、既知のリガンド（例えばＦＧＦ−２）を結合かつ捕捉することができた。手短に述べると、ＦＧＦＲ１−ＩＩＩｃ−Ｆｃ ｃＤＮＡを注射したマウスからの血清をＦＧＦ−２で前処理し、前処理した血清中に残存する遊離ＦＧＦ−２の量により、発現させたＦＧＦＲ１−ＩＩＩｃ−Ｆｃ融合タンパク質がそのリガンドと結合する能力を測定した。遊離ＦＧＦ−２の量は、前処理した血清がアッセイプレート上に固定したＦＧＦＲ１−ＩＩＩｃに結合する能力によって測定した。
注射したマウスからの血清をＦＧＦ−２で前処理した。手短に述べると、血清を０．１×ＢＬＯＴＴＯ（ＰＢＳ中に１：１０に希釈）で１／５００、１／１００、および１／２０に希釈し、２００ｎｇ／ｍｌの組換えヒトＦＧＦ−２（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ；ミネソタ州Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ）と共に、５０ｕｌの体積で、３０分間、３７℃、振盪器上で、２０ｕｇ／ｍｌのヘパリンの存在下で、９６ウェルのＵ字底プレート（Ｎｕｎｃ；ニューヨーク州Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ）に加えた。ＦＧＦ−２を用いた血清の前処理により、血清中のＦＧＦＲ１−ＩＩＩｃ−ＦｃがそのリガンドＦＧＦ−２を結合することができる程度にまでＦＧＦ−２が隔離された。
その後、前処理した血清を、ＦＧＦＲ１−ＩＩＩｃ−Ｆｃでコーティングしたアッセイプレートと共にインキュベーションを行い、血清中の遊離ＦＧＦ−２の結合を測定した。高レベルの遊離ＦＧＦ−２結合は、循環ＦＧＦＲ１−ＩＩＩｃ−ＦｃがそのリガンドＦＧＦ−２に結合できなかったことを示し、低レベルの遊離ＦＧＦ−２結合は、注射したマウスの血清中で発現されたＦＧＦＲ１−ＩＩＩｃ−Ｆｃが機能してそのリガンドＦＧＦ−２に結合したことを示す。
ＨＩ−ＢＩＮＤハーフウェル（Ｃｏｒｎｉｎｇ；マサチューセッツ州Ａｃｔｏｎ）を、２９３−６Ｅ宿主細胞由来のＦＧＦＲ１−ＩＩＩｃ−Ｆｃを用いて、ＰＢＳ中に５ｕｇ／ｍｌの濃度、２５ｕｌ／ウェルの体積で、１時間、室温でコーティングした。１５０ｕｌのＢＬＯＴＴＯ／ウェルを２時間、室温で加えることによって、ウェルを遮断した。その後、コーティングしたハーフウェルプレートを、０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳで洗浄した。その後、洗浄してコーティングしたハーフウェルプレートを、４０ｕｌの前処理した血清と共に、３０分間、３７℃で振盪しながらインキュベーションを行った。０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳでプレートを以前のように洗浄した。その後、ＢＬＯＴＴＯ中に２ｕｇ／ｍｌのビオチン標識抗ＦＧＦ−２ポリクローナル抗体（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ；ミネソタ州Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ）を各ウェルに加え、３０分間、３７℃で振盪しながらインキュベーションを行った。プレートを以前のように再度洗浄し、結合した抗体をＡＢＣキットで、製造者のプロトコルに従って検出した。０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳを用いた最終洗浄ののち、再構成したＯＰＤ溶液（Ｓｉｇｍａ；ミズーリ州Ｓａｉｎｔ Ｌｏｕｉｓ）を各ウェルに加え、１０〜２０分間、室温でインキュベーションを行い、４５０ｎｍでのウェルの吸光度を決定した。
生理食塩水を注射した２匹の対照マウスおよびＦＧＦＲ１−ＩＩＩｃ−Ｆｃ ｃＤＮＡを注射した２匹の実験マウスの結果を図２３に示す。対照マウス１およびマウス２からの前処理した血清は、ＦＧＦＲ１−Ｆｃをコーティングしたプレートに対するＦＧＦ−２の結合の阻害をわずかしか、またはまったく示さなかった。ＦＧＦＲ１−ＩＩＩｃ−Ｆｃを発現したマウス３およびマウス４からの前処理した血清は、ＦＧＦ−２を用量依存性の様式で捕捉し、最も高いレベルの阻害は最も濃縮した血清（１／２０希釈）で観察された。図２３はまた、注射したマウス中の循環ＦＧＦＲ１−ＩＩＩｃ−Ｆｃの量を計算するために用いた精製ＦＧＦＲ１−ＩＩＩｃ−Ｆｃの検量線も示す。実験マウス４の血清は６４ｕｇ／ｍｌのＦＧＦＲ１−ＩＩＩｃ−Ｆｃと機能的に等価であり、実験マウス３の血清は４５ｕｇ／ｍｌの血清ＦＧＦＲ１−ＩＩＩｃ−Ｆｃと機能的に等価であった。
（実施例１６）
（水力学的形質移入を介したＲ１Ｍｕｔ４のｉｎ ｖｉｖｏ発現）
実施例１５に記載の実験に類似の実験を、実施例２に記載のミニサークルベクターを用いてマウス内にＲ１Ｍｕｔ４ ｃＤＮＡを水力学的形質移入することによって行った。Ｒ１Ｍｕｔ４をコードしている裸の「ミニサークル」ベクターｃＤＮＡを４カ月齢のＣＢ１７ ＳＣＩＤマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ；カリフォルニア州Ｈｏｌｌｉｓｔｅｒ）に注射した。約２ｍｌのＤＮＡを、２０μｇ／ｍｌの濃度で、５〜８秒間内に、４匹の対照マウスおよび４匹のＲ１Ｍｕｔ４実験マウスのそれぞれに注射した。血清試料を２日目および７日目に採取した。血清試料中のＲ１Ｍｕｔ４の濃度を、直接ＥＬＩＳＡ（実施例１５参照）、ＦＧＦ−２競合ＥＬＩＳＡ（実施例１５参照）ウェスタンブロットプロービングによって分析した。
直接ＥＬＩＳＡ試験からの結果を図２４に示す。Ｍ１〜Ｍ４は、４匹の実験Ｒ１Ｍｕｔ４注射マウスからの血清を表す。マウス１は、２日目に約１４，０００ｕｇ／ｍｌのＲ１Ｍｕｔ４および７日目に約２２，０００ｕｇ／ｍｌのＲ１Ｍｕｔ４を発現し；マウス２は、２日目に約２３，０００ｕｇ／ｍｌのＲ１Ｍｕｔ４および７日目に約１７，０００ｕｇ／ｍｌのＲ１Ｍｕｔ４を発現し；マウス３は、２日目に約１４，０００ｕｇ／ｍｌのＲ１Ｍｕｔ４および７日目に約１５，０００ｕｇ／ｍｌのＲ１Ｍｕｔ４を発現し；マウス４は、２日目に約５，０００ｕｇ／ｍｌのＲ１Ｍｕｔ４および７日目に約５，０００ｕｇ／ｍｌのＲ１Ｍｕｔ４を発現していた。したがって、直接ＥＬＩＳＡによって測定したマウス血清中のＲ１Ｍｕｔ４融合タンパク質の濃度の範囲は約５ｍｇ／ｍｌ〜約２２．５ｍｇ／ｍｌであった。ＦＧＦ−２競合ＥＬＩＳＡおよびウェスタンブロットプロービング技術を用いて、類似の結果が判明した。これらの結果により、ＦＧＦＲ１−ＩＩＩｃ−Ｆｃでの観察と同様、水力学的方法を用いて注射した動物によるＲ１Ｍｕｔ４の高いかつ持続した全身性発現が実証された。
（実施例１７）
（２９３−６ＥおよびＣＨＯ−Ｓ宿主細胞によって産生させたＦＧＦＲ１−ＩＩＩｃ−Ｆｃ融合タンパク質のｉｎ ｖｉｖｏ比較）
実施例５に示すように、ＣＨＯ−Ｓ宿主細胞によって発現させたＦＧＦＲ１−ＩＩＩｃ−Ｆｃは、２９３−６Ｅ宿主細胞によって発現させたＦＧＦＲ１−ＩＩＩｃ−Ｆｃよりも優れたｉｎ ｖｉｔｒｏの安定性を示した。ＣＨＯ−Ｓ宿主細胞によって発現させたＦＧＦＲ１−ＩＩＩｃ−Ｆｃが２９３−６Ｅ宿主細胞によって発現させたＦＧＦＲ１−ＩＩＩｃ−Ｆｃよりも優れたｉｎ ｖｉｖｏ安定性プロフィールを示したかどうかを決定するために、両方の起源のＦＧＦＲ１−ＩＩＩｃ−Ｆｃタンパク質をマウスに注射し、７２時間の経時変化にわたってウェスタンブロットによって比較した。
Ｃ５７ＢＬ６マウスに、尾静脈を介して、ＣＨＯ−Ｓまたは２９３−６Ｅ宿主細胞のどちらかから実施例７および１５に記載のように精製した３ｍｇ／キログラム（ｋｇ）の用量のＦＧＦＲ１−ＩＩＩ−Ｆｃタンパク質を注射した。血液を眼窩後方から注射後５分、３０分、２４時間、４８時間、および７２時間に得、ヘパリン処理した。それぞれの注射したマウスおよび注射していない対照マウスからの血清（１００μｌ）を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって還元性４〜１２％ポリアクリルアミドゲルで分離し、ニトロセルロース膜に移し、ＨＲＰにコンジュゲートさせた抗ヒトＦｃ抗体（抗ヒトＦｃ ＨＲＰ）（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．；ペンシルバニア州Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ）を用いてプロービングした。
図２６に示すように、２９３−６Ｅ細胞から精製し、マウスに注射したＦＧＦＲ１−ＩＩＩｃ−Ｆｃは、ｉｎ ｖｉｖｏで急速に分解され、注射後２４時間にはウェスタンブロットによって検出不可能であった。ＣＨＯ−Ｓ細胞から発現させたＦＧＦＲ１−ＩＩＩｃ−Ｆｃはｉｎ ｖｉｖｏでより安定しており、注射後７２時間でも血清中で容易に検出可能であった。この研究は、ＣＨＯ−Ｓ宿主細胞由来のＦＧＦＲ１−ＩＩＩｃ−Ｆｃが２９
３−６Ｅ宿主細胞由来の物質よりも長い血清半減期を有していたことを示している。
また、図２６には、ＦＧＦＲ１−ＩＩＩｃ−Ｆｃが、２９３−６Ｅ細胞によって発現させた場合にＣＨＯ−Ｓ細胞と比較して異なる電気泳動特性を実証したことも示す。ＣＨＯ−Ｓ細胞によって産生させたＦＧＦＲ１−ＩＩＩｃ−Ｆｃは、還元性ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにおける見かけ上の分子量が約９０ｋＤａであり、２９３−６Ｅ細胞によって産生させたＦＧＦＲ１−ＩＩＩｃ−Ｆｃよりも３〜４ｋＤ高い位置まで移動した。また、ゲルにおけるＣＨＯ−Ｓ由来のＦＧＦＲ１−ＩＩＩｃ−Ｆｃの見かけは、２９３−６Ｅ宿主細胞に由来するＦＧＦＲ１−ＩＩＩｃ−Ｆｃのより拡散したゲルバンドと比較して、よりコンパクトであった。
（実施例１８）
（ＦＧＦＲ１−ＩＩＩｃ−ＦｃおよびＲ１Ｍｕｔ４による腫瘍成長のｉｎ ｖｉｖｏ阻害）
腫瘍成長の異種移植モデルを用いて、癌治療剤のｉｎ ｖｉｖｏ阻害性特性を評価することができる。Ｃａｋｉ−１ヒト腎臓腫瘍細胞（ＡＴＣＣ；バージニア州Ｍａｎａｓｓａｓ）は、重篤な複合免疫不全ＣＢ１７ ｓｃｉｄ／ｓｃｉｄ（ＣＢ１７ＳＣＩＤ）マウスに注射した際に腫瘍を形成する。腫瘍細胞を注射した後にＦＧＦＲ１−ＩＩＩｃ−ＦｃまたはＲ１Ｍｕｔ４を用いて治療することによって、マウス中で形成される腫瘍の大きさが減少する。
Ｃａｋｉ−１腫瘍細胞を注射した後にマウスを水力学的尾静脈形質移入によってＦＧＦＲ１−ＩＩＩｃ−Ｆｃで治療することにより、生理食塩水で偽形質移入した動物と比較して、マウス内で形成された腫瘍の体積が低下した。９週齢の雌ＣＢ１７ＳＣＩＤマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）に、２００μｌの体積の１．５×１０７個のＣａｋｉ−１細胞を皮下に植込んだ。腫瘍移植後の５日目に、「ミニサークル」ＦＧＦＲ１−ＩＩＩｃ−Ｆｃ ｃＤＮＡを７．５μｇ／ｍｌの濃度で、実施例１５に記載のように水力学的尾静脈形質移入によって１３匹の動物に送達した。１５μｇのＦＧＦＲ１−ＩＩＩｃ−Ｆｃ ｃＤＮＡを含む２ｍｌのＦＧＦＲ１−ＩＩＩｃ−Ｆｃ ｃＤＮＡ組成物を、５〜８秒間内に尾静脈に注射した。生理食塩水を１３匹の対照マウスに注射した。２０、２５、２９、３６、４６、５７、および６４日目に、生じた腫瘍をカリパーによって測定した。腫瘍体積（ｍｍ３）は、式（π／６）＊Ｌ２＊Ｗ（式中、Ｌ（ｍｍ）は腫瘍の長さを示し、Ｗ（ｍｍ）は幅を示す）によって計算した。結果を図２５に示し、これは、ＦＧＦＲ１−ＩＩＩｃ−Ｆｃの発現により、測定したすべての時点においてＣａｋｉ−１腫瘍成長が生理食塩水で処置した対照と比較して約２５％〜５０％阻害されたことを実証している。
組換えＦＧＦＲ１−ＩＩＩｃ−Ｆｃも、マウスにおいてＣａｋｉ−１腫瘍の体積を低下させた。ＦＧＦＲ１−ＩＩＩｃ−ＦｃをＣＨＯ−Ｓ宿主細胞によって発現させ、実施例７に記載のように精製した。２００μｌの注射体積でＰＢＳビヒクル中に１．５×１０７個のヒト腫瘍Ｃａｋｉ−１細胞を、４８匹のＣＢ１７ＳＣＩＤマウスの側腹部に皮下注射し、４つの治療グループのうちの１つに割り当てた。グループ１（ｎ＝１２）には生理食塩水のみを与え；グループ２（ｎ＝１１）には１ｍｇ／ｋｇのＦＧＦＲ１−ＩＩＩｃ−Ｆｃを与え；グループ３（ｎ＝１２）には５ｍｇ／ｋｇのＦＧＦＲ１−ＩＩＩｃ−Ｆｃを与え；グループ４（ｎ＝１３）には１５ｍｇ／ｋｇのＦＧＦＲ１−ＩＩＩｃ−Ｆｃを与えた。生理食塩水またはＦＧＦＲ１−ＩＩＩｃ−Ｆｃの処置は、腫瘍を注射した１日後に開始し、週に２回、適切な用量のＦＧＦＲ１−ＩＩＩｃ−Ｆｃを２００μｌの体積で生理食塩水ビヒクルと共に尾静脈中に注射することによって与えた。グループ１の対照マウスにはＰＢＳビヒクル注射のみを与えた。
注射したＣａｋｉ−１細胞から生じたそれぞれの腫瘍の長さおよび幅をカリパーで測定し、上述の方程式、体積＝（π／６）＊Ｌ２＊Ｗを用いて腫瘍体積を計算した。測定はＣａｋｉ−１細胞の注射後１４日目から５７日目の間の７回の時点で行った。結果を図３０Ａに示す。５７日目に、ＦＧＦＲ１−ＩＩＩｃ−ＦｃはＣａｋｉ−１細胞に誘発される腫瘍の成長を約５０％阻害した。ＦＧＦＲ１−ＩＩＩｃ−Ｆｃの３つの用量すべてが成長をほぼ同程度に阻害した。
上記実験を、別のより低い用量範囲のＦＧＦＲ１−ＩＩＩｃ−Ｆｃおよび単一用量のＲ１Ｍｕｔ４を用いて繰り返した。ＦＧＦＲ１−ＩＩＩｃ−Ｆｃタンパク質をＣＨＯ−Ｓ宿主細胞中で産生させ、Ｒ１Ｍｕｔ４タンパク質をＤＧ４４宿主細胞中で産生させ、実施例７に記載のようにタンパク質を精製した。
２００μｌの注射体積でＰＢＳビヒクル中に１．５×１０７個のヒト腫瘍Ｃａｋｉ−１細胞を、９０匹のＣＢ１７ＳＣＩＤマウスの側腹部に皮下注射し、６つの治療グループのうちの１つに割り当てた。グループ１（ｎ＝１５）には生理食塩水のみを与え；グループ２（ｎ＝１５）には５ｍｇ／ｋｇのＦＧＦＲ１−ＩＩＩｃ−Ｆｃを与え；グループ３（ｎ＝１４）には１ｍｇ／ｋｇのＦＧＦＲ１−ＩＩＩｃ−Ｆｃを与え；グループ４（ｎ＝１４）には０．３ｍｇ／ｋｇのＦＧＦＲ１−ＩＩＩｃ−Ｆｃを与え；グループ５（ｎ＝１５）には０．１ｍｇ／ｋｇのＦＧＦＲ１−ＩＩＩｃ−Ｆｃを与え、グループ６（ｎ＝１７）には５ｍｇ／ｋｇのＲ１Ｍｕｔ４を与えた。生理食塩水、ＦＧＦＲ１−ＩＩＩｃ−ＦｃまたはＲ１Ｍｕｔ４の処置は、腫瘍を注射した１日後に開始し、適切な用量のＦＧＦＲ１−ＩＩＩｃ−Ｆｃを２００μｌの体積で生理食塩水ビヒクルと共に尾静脈に注射することによって与えた。グループ１の対照マウスにはＰＢＳビヒクル注射のみを与えた。
注射したＣａｋｉ−１細胞から生じたそれぞれの腫瘍の長さおよび幅をカリパーで測定し、上述の方程式、体積＝（π／６）＊Ｌ２＊Ｗを用いて腫瘍体積を計算した。測定はＣａｋｉ−１細胞の注射後１４日目から２７日目の間の３回の時点で行った。結果を図３０Ｂに示す。週２回の用量の５ｍｇ／ｍｌのＦＧＦＲ１−ＩＩＩｃ−ＦｃまたはＲ１Ｍｕｔ４により、２７日目にＣａｋｉ−１細胞に誘発される腫瘍の成長が約５０％阻害された。これは、Ｒ１Ｍｕｔ４融合タンパク質が、ｉｎ ｖｉｖｏで腫瘍細胞の成長を妨げることにおいて親ＦＧＦＲ１−ＩＩＩｃ−Ｆｃ分子と同様に強力であったことを実証している。また、この実験は、０．３ｍｇ／ｍｌまで低いＦＧＦＲ１−ＩＩＩｃ−Ｆｃの用量が、異種移植動物モデルにおいて腫瘍細胞の成長を阻害したが、０．１ｍｇ／ｍｌは阻害しなかったことも実証している。
（実施例１９）
（２９３−６ＥおよびＣＨＯ−Ｓ細胞によるＦＧＦＲ１−ＩＩＩｃ−Ｆｃのシアリル化およびグリコシル化）
２９３−６Ｅ細胞およびＣＨＯ−Ｓ細胞によって発現させたＦＧＦＲ１−ＩＩＩｃ−Ｆｃの安定性の差異の原因となる要素を調査するために、２つの融合タンパク質のシアル酸含有量を比較した。２９３−６Ｅ細胞によって産生させたＦＧＦＲ１−ＩＩＩｃ−Ｆｃは、ＣＨＯ−Ｓ細胞から産生させたＦＧＦＲ１−ＩＩＩｃ−Ｆｃとは異なるシアリル化パターンを有していた。
２９３−６Ｅ宿主細胞によって発現させたＦＧＦＲ１−ＩＩＩｃ−Ｆｃ、ＣＨＯ−Ｓ宿主細胞によって発現させたＦＧＦＲ１−ＩＩＩｃ−Ｆｃ、およびＣＨＯ−Ｓ宿主細胞によって発現させたＲ１Ｍｕｔ４を、カリフォルニア大学サンディエゴ校のパルスアンペロメトリック検出（ＨＰＡＥＣ−ＰＡＤ）を用いた高ｐＨ陰イオン交換クロマトグラフィーによって、シアル酸含有量について分析を行った。手短に述べると、２ＭのＨＯＡｃを用いてタンパク質を８０℃で３時間処理した。試料からのシアル酸を３，０００ＮＭＷＣＯ膜による限外濾過によって採取し、哺乳動物シアル酸の２つの一般的な型であるＮ−アセチルノイラミン酸（Ｎｅｕ５Ａｃ）およびＮ−グリコリルノイラミン酸（Ｎｅｕ５Ｇｃ）を分離する酢酸ナトリウム勾配を用いて、Ｄｉｏｎｅｘ ＣａｒｂｏＰａｃ ＰＡ−１ ＨＰＡＥＣ−ＰＡＤカラム（Ｄｉｏｎｅｘ；カリフォルニア州Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ）から溶出させた。
以下の表４に示すように、２９３−６Ｅ宿主細胞から産生させたＦＧＦＲ１−ＩＩＩｃ−Ｆｃ、ならびにＣＨＯ−Ｓ宿主細胞からのＦＧＦＲ１−ＩＩＩｃ−ＦｃおよびＲ１Ｍｕｔ４はシアル化が異なっており、Ｎｅｕ５ＡｃおよびＮｅｕ５Ｇｃ型のシアル酸がどちらも、ＣＨＯ−Ｓ細胞由来のタンパク質中でより高いレベルで存在している。ＣＨＯ−Ｓ由来のＦＧＦＲ１−ＩＩＩｃ−Ｆｃの増加したシアル酸含有量が、完全にまたは部分的に、観察された分子量およびｉｎ ｖｉｖｏの安定性の差を説明し得る。
Figure 2013017484
図２７（上部パネル）は、Ｇｌｙｃｏｓｅｐ Ｃカラムでのその分離後の、２９３−６Ｅ細胞から発現させたＦＧＦＲ１−ＩＩＩｃ−ＦｃのＮ標識したグリカンのクロマトグラフィー分析を示す。図２７（下部パネル）は、ＣＨＯ−Ｓ細胞から発現させたＦＧＦＲ１−ＩＩＩｃ−Ｆｃで行った同じ分離を示す。クロマトグラフィー分析はＰｒｏｚｙｍｅ（カリフォルニア州Ｓａｎ Ｌｅａｎｄｒｏ）によって行った。Ｎ標識したグリカンは、２−アミノベンズアミド（２−ＡＢ）で標識したウシフェツインＮ連結グリカンライブラリと比較することによって同定した。中性グリカン、遊離２−ＡＢで標識したグリカン、ならびにモノ−、ジ−、トリ−、およびテトラシアリル化グリカンの位置を示す。
２９３−６Ｅ細胞から発現させたＦＧＦＲ１−ＩＩＩｃ−Ｆｃは、主に中性グリカンを発現した（アシアロ−グリカン）。対照的に、ＣＨＯ細胞から発現させたＦＧＦＲ１−ＩＩＩｃ−Ｆｃは、主に陰性に帯電したシアリル化グリカンを発現した（その炭水化物の約８６％）。２９３−６Ｅ宿主細胞から発現させたＦＧＦＲ１−ＩＩＩｃ−Ｆｃの陰性に帯電したグリカンはほとんどモノシアリル化グリカンであったが、ＣＨＯ−Ｓ宿主細胞から発現させたＦＧＦＲ１−ＩＩＩｃ−Ｆｃの陰性に帯電したグリカンはモノ−、ジ−、トリ−、およびテトラ−シアリル化グリカンを含み、テトラ−シアリル化グリカンが主要構成成分を構成していた。これらの結果は、２９３細胞由来およびＣＨＯ−Ｓ細胞由来のＦＧＦＲ１−ＩＩＩｃ−Ｆｃのシアリル化レベルの差が、実施例１８に示すように、２つのタンパク質間のｉｎ ｖｉｖｏの安定性の差の原因であり得ることを示唆している。
（実施例２０）
（マウスにおけるＦＧＦＲ１−ＩＩＩｃ−Ｆｃの薬力学的研究）
Ｃ５７Ｂ１６マウスにおけるＦＧＦＲ１−ＩＩＩｃ−Ｆｃの薬力学的研究は、融合タンパク質が血清中に注射後約２５日間存在し、約１４日間ＦＧＦ−２結合活性を保持することを示している。研究は、マウスにＣＨＯ−Ｓ細胞によって発現させた組換えＦＧＦＲ１−ＩＩＩｃ−Ｆｃを固定用量で注射することによって行った。９週齢の雌Ｃ５７／Ｂ１６マウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）に、最終用量１５ｍｇ／ｋｇで２００ｕｌのＦＧＦＲ１−ＩＩＩｃ−Ｆｃタンパク質溶液を注射した。注射後３０分、５時間、ならびに１、２、３、４、５、７、１４、および２５日目に、血清試料（１００ｕｌ）を眼窩後方から採取し、それぞれの時点で４匹のマウスを検査した。血清試料中のＦＧＦＲ１−ＩＩＩｃ−Ｆｃの濃度を、実施例１５に記載のように、直接ＥＬＩＳＡおよびＦＧＦ−２競合ＥＬＩＳＡの両方によって分析した。
ＦＧＦＲ１−ＩＩＩｃ−Ｆｃ直接ＥＬＩＳＡの結果を図２８に示す。ＦＧＦＲ１−ＩＩＩｃ−Ｆｃの濃度は、３０分後で約６２ｕｇ／ｍｌ、５時間後で２７ｕｇ／ｍｌ、１日目で２１ｕｇ／ｍｌ、２日目で１９ｕｇ／ｍｌ、３日目で１８ｕｇ／ｍｌ、４日目で１７ｕｇ／ｍｌ、５日目で１８ｕｇ／ｍｌ、７日目で１８ｕｇ／ｍｌ、１４日目で１０ｕｇ／ｍｌ、および２５日目で約２ｕｇ／ｍｌであった。この結果は、少なくとも注射後２５日目までは、組換えＦＧＦＲ１−ＩＩＩｃ−Ｆｃタンパク質がマウスにおいて安定であり、検出可能であったことを示している。
血清ＦＧＦＲ１−ＩＩＩｃ−ＦｃのＦＧＦ−２結合能力を測定するＦＧＦ−２競合ＥＬＩＳＡの結果を図２９に示す。血清を段階希釈し、血清中のＦＧＦＲ１−ＩＩＩｃ−ＦｃとＦＧＦ−２（０．２μｇ／ｍｌ）との結合の量を測定した。図２９に示すように、結合曲線の右方のシフトから見られるように、注射したマウスの血清中のＦＧＦＲ１−ＩＩＩｃ−ＦｃによるＦＧＦ−２結合は時間と共に減少した。ＦＧＦ−２結合能力は、直接ＥＬＩＳＡによって測定されたＦＧＦＲ１−ＩＩＩｃ−Ｆｃの量に粗く平行していた。ＦＧＦ−２結合活性は、１４日目にはマウス血清中のＦＧＦＲ１−ＩＩＩｃ−Ｆｃによって検出可能であったが、２５日目には、競合ＥＬＩＳＡによって試験したマウス血清の量中でＦＧＦ−２結合活性を検出することができなかった。
（実施例２１）
（マウスにおけるＲ１Ｍｕｔ４の薬力学的研究）
Ｃ５７マウスにおけるＲ１Ｍｕｔ４の薬力学的研究は、Ｒ１Ｍｕｔ４がＦＧＦＲ１−ＩＩＩｃ−Ｆｃとほぼ同等のｉｎ ｖｉｖｏ安定性を有することを示している。２〜３カ月齢のＣ５７マウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）に、１０ｍｇ／ｋｇのＦＧＦＲ１−ＩＩＩｃ−ＦｃまたはＲ１Ｍｕｔ４の用量を２００ｕｌの生理食塩水ビヒクル中で皮下注射した。ＦＧＦＲ１−ＩＩＩｃ−ＦｃおよびＲ１Ｍｕｔ４はどちらも、実施例２に記載のようにＣＨＯ−Ｓ細胞におけるｐｃＤＮＡ３．１ベクター中での発現によって調製した。血清試料（２００ｕｌ）を注射後４時間、３日目、および７日目に採取した。血清試料中のＦＧＦＲ１−ＩＩＩｃ−ＦｃおよびＲ１Ｍｕｔ４タンパク質の濃度を、実施例５に記載のようにウェスタンブロットによって分析し、結果を図３１に示した。注射の４時間後、ＦＧＦＲ１−ＩＩＩｃ−ＦｃおよびＲ１Ｍｕｔ４で治療したマウスは、右側パネルに示すＣＨＯ−Ｓ細胞から調製した既知の量のＦＧＦＲ１−ＩＩＩｃ−Ｆｃの標準物質との比較によって決定されるように、抗Ｆｃ抗体との反応性をほぼ同じ量で示した（約６．３ｎｇ以上）。３日目には、標準物質との比較によって決定されるように、すべての動物の血清中に存在するタンパク質の量は約３．１ｎｇ以上まで低下していた。７日目には、すべての動物の血清中に存在するタンパク質の量は、約１．６ｎｇ以上まで低下していた。これらの結果は、組換えＦＧＦＲ１−ＩＩＩｃ−ＦｃおよびＲ１Ｍｕｔ４タンパク質が類似のｉｎ ｖｉｖｏ安定性を有していたことを実証している。
（実施例２２）
（正常組織に対する癌組織中のＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ３、およびＦＧＦＲ４の過剰発現）
ＧｅｎｅＬｏｇｉｃ（メリーランド州Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ）の登録商標をもつ腫瘍学データベースに属する発現データの分析および分別により、対応する正常組織と比較してＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ３、およびＦＧＦＲ４を過剰発現していた癌が本発明で同定された。これらの癌が、本発明のＦＧＦＲ融合タンパク質の治療標的である。ＧｅｎｅＬｏｇｉｃデータベースは、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ Ｕ１３３（カリフォルニア州Ｓａｎｔａ
Ｃｌａｒａ）マイクロアレイチップを、３０００個を超える悪性組織試料に由来するｃＲＮＡおよび４５００個を超える正常組織試料に由来するｃＲＮＡとハイブリダイズさせることによって作製した。Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ Ｕ１３３マイクロアレイチップは、ＦＧＦＲ１に対応するプローブ、ＦＧＦＲ３に対応するプローブ、およびＦＧＦＲ４に対応するプローブを含む。
すべての悪性組織試料およびすべての正常組織試料に由来するデータを、個々の癌種およびその対応する正常組織に対応するデータセットに分離した。７５を超える別個の癌種がデータベースに表されている。対応する正常組織データセットにおけるＦＧＦＲ１の中央発現値を超えて、対応する正常組織データセットにおけるＦＧＦＲ３の中央発現値を超えて、および対応する正常組織データセットにおけるＦＧＦＲ４の中央発現値を超えて発現する試料を含むデータセットを有する癌種が、それぞれＦＧＦＲ１を過剰発現する、ＦＧＦＲ３を過剰発現する、またはＦＧＦＲ４を過剰発現すると見なされた。表５に示すように、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ３、またはＦＧＦＲ４を過剰発現している任意の所定の癌種のデータセットにおける試料の割合を、そのデータセット中の試料の合計数の割合として計算した。
Figure 2013017484
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ＦＧＦＲ１は、Ｂ細胞急性リンパ芽球性白血病、慢性骨髄単球性白血病、慢性リンパ球性白血病、および慢性骨髄性白血病を含めた白血病；ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、および結節外リンパ腫を含めたリンパ腫；形質細胞腫を含めた骨髄腫；骨および軟組織の悪性新生物を含めた肉腫；脳の悪性新生物を含めた神経癌；女性乳房の悪性新生物を含めた乳癌；ファーター膨大部、虫垂、結腸、十二指腸、食道、肝臓、膵臓、腹膜、直腸、小腸、および胃の悪性新生物を含めた消化管／胃腸管系癌；副腎、ランゲルハンス島、および甲状腺の悪性新生物を含めた内分泌癌；眼の悪性新生物を含めた眼癌；膀胱、腎臓、前立腺、および精巣の悪性新生物を含めた泌尿生殖系癌；子宮頸部、子宮筋層、卵巣、子宮、子宮内膜、胎盤、および外陰部の悪性新生物を含めた婦人科癌；喉頭、唾液腺、鼻腔、口腔、耳下腺、および舌の悪性新生物を含めた頭頸部癌；肺、胸腺、および気管の悪性新生物を含めた呼吸器／胸部癌；ならびに皮膚の悪性新生物を含めた皮膚癌において過剰発現されていた（表５）。
ＦＧＦＲ３は、バーキットリンパ腫を含めたリンパ腫；骨および軟組織の悪性新生物を含めた肉腫；脳の悪性新生物を含めた神経癌；女性乳房および男性乳房の悪性新生物を含めた乳癌；ファーター膨大部、結腸、十二指腸、食道、胆嚢、肝臓、膵臓、直腸、小腸、および胃の悪性新生物を含めた消化管／胃腸管系癌；ランゲルハンス島および甲状腺の悪性新生物を含めた内分泌癌；膀胱、腎臓、前立腺、精巣、および輸尿管の悪性新生物を含めた泌尿生殖系癌；子宮頸部、卵巣、子宮、子宮内膜、および外陰部の悪性新生物を含めた婦人科癌；喉頭、口腔、耳下腺、舌、および扁桃腺の悪性新生物を含めた頭頸部癌；肺の悪性新生物を含めた呼吸器／胸部癌；ならびに皮膚の悪性新生物を含めた皮膚癌において過剰発現されていた（表５）。
ＦＧＦＲ４は、非ホジキンリンパ腫を含めたリンパ腫；骨、心臓、および軟組織の悪性新生物を含めた肉腫；女性乳房の悪性新生物を含めた乳癌；結腸、十二指腸、食道、胆嚢、肝臓、膵臓、直腸、小腸、および胃の悪性新生物を含めた消化管／胃腸管系癌；副腎およびランゲルハンス島の悪性新生物を含めた内分泌癌；腎臓および精巣の悪性新生物を含めた泌尿生殖系癌；卵巣および子宮内膜の悪性新生物を含めた婦人科癌；耳下腺の悪性新生物を含めた頭頸部癌；肺の悪性新生物を含めた呼吸器／胸部癌；ならびに皮膚の悪性新生物を含めた皮膚癌において過剰発現されていた（表５）。
表４は、複数のＦＧＦＲを過剰発現していた腫瘍を同定し、例えば、悪性リンパ腫、非ホジキン型は、ＦＧＦＲ１およびＦＧＦＲ４を過剰発現し；骨、軟組織、女性乳房、結腸、十二指腸、食道、肝臓、直腸、小腸、胃、ランゲルハンス島、腎臓、精巣、卵巣、子宮内膜、耳下腺、肺、および皮膚の悪性新生物は、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ３、およびＦＧＦＲ４を過剰発現し；脳、ファーター膨大部、甲状腺、膀胱、前立腺、子宮頸部、子宮、外陰部、喉頭、口腔、および舌の悪性新生物は、ＦＧＦＲ１およびＦＧＦＲ３を過剰発現し；胆嚢の悪性新生物は、ＦＧＦＲ３およびＦＧＦＲ４を過剰発現していた。
本発明者らの分析により、ＦＧＦＲ１、およびＦＧＦＲ３、および／またはＦＧＦＲ４は、多くの場合癌において過剰発現されていたことが示された。この過剰発現は、患部腫瘍の生存度および増殖能力の維持に活性ＦＧＦシグナル伝達経路を関連付ける。本発明者らは、例えばＦＧＦＲ１−Ｆｃ、ＦＧＦＲ３−ＦｃおよびＦＧＦＲ４−Ｆｃ融合タンパク質などの囮受容体、またはそれらの改変体を用いて、患部腫瘍中のこのようなシグナル伝達経路を遮断することにより、これらの腫瘍の生存度および増殖能力が低下すると結論づけた。
（実施例２３）
（正常組織に対する癌組織中のＦＧＦ−１、ＦＧＦ−２、ＦＧＦ−４、およびＦＧＦ−５の過剰発現）
癌組織種および対応する正常組織種におけるＦＧＦ−１、ＦＧＦ−２、ＦＧＦ−４、およびＦＧＦ−５の発現に対するＧｅｎｅＬｏｇｉｃ（メリーランド州Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ）データベースの分析を、本質的に実施例２２に記載のように行った。Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ Ｕ１３３マイクロアレイチップは、ＦＧＦ−１、ＦＧＦ−２、ＦＧＦ−４、およびＦＧＦ−５に対応するプローブを含む。ＦＧＦ−１、ＦＧＦ−２、ＦＧＦ−４、またはＦＧＦ−５を過剰発現している任意の所定の癌種のデータセットにおける試料の割合を、そのデータセット中の試料の合計数の割合として計算し、表６に示す。対応する正常組織と比較してＦＧＦ−１、ＦＧＦ−２、ＦＧＦ−４、およびＦＧＦ−５を過剰発現していた癌が、本発明のＦＧＦＲ融合タンパク質の治療標的である。
Figure 2013017484
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ＦＧＦ−１は、急性単球性／単芽細胞性白血病および慢性骨髄性白血病を含めた白血病；バーキットリンパ腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、および結節外リンパ腫を含めたリンパ腫；骨および軟組織の悪性新生物を含めた肉腫；脳の悪性新生物を含めた神経癌；女性乳房および男性乳房の悪性新生物を含めた乳癌；結腸、食道、胆嚢、肝臓、膵臓、腹膜、直腸、小腸、および胃の悪性新生物を含めた消化管／胃腸管系癌；ランゲルハンス島および甲状腺の悪性新生物を含めた内分泌癌；膀胱、腎臓、前立腺、精巣、および輸尿管の悪性新生物を含めた泌尿生殖系癌；輸卵管、子宮頸部、子宮筋層、卵巣、子宮内膜、および外陰部の悪性新生物を含めた婦人科癌；喉頭、唾液腺、耳下腺、および舌の悪性新生物を含めた頭頸部癌；肺の悪性新生物を含めた呼吸器／胸部癌；ならびに皮膚の悪性新生物を含めた皮膚癌において過剰発現されていた（表６）。
ＦＧＦ−２は、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、および結節外リンパ腫を含めたリンパ腫；形質細胞腫を含めた骨髄腫；骨、心臓、および軟組織の悪性新生物を含めた肉腫；脳の悪性新生物を含めた神経癌；女性乳房の悪性新生物を含めた乳癌；ファーター膨大部、虫垂、結腸、十二指腸、食道、肝臓、膵臓、直腸、小腸、および胃の悪性新生物を含めた消化管／胃腸管系癌；副腎、ランゲルハンス島および甲状腺の悪性新生物を含めた内分泌癌；膀胱、腎臓、前立腺、および精巣の悪性新生物を含めた泌尿生殖系癌；子宮頸部、子宮筋層、卵巣、子宮内膜、胎盤、および外陰部の悪性新生物を含めた婦人科癌；喉頭、唾液腺、耳下腺、および舌の悪性新生物を含めた頭頸部癌；肺、胸腺、および気管の悪性新生物を含めた呼吸器／胸部癌；ならびに皮膚の悪性新生物を含めた皮膚癌において過剰発現されていた（表６）。
ＦＧＦ−４は、前リンパ球性白血病を含めた白血病；非ホジキンリンパ腫および結節外リンパ腫を含めたリンパ腫；骨、心臓、および軟組織の悪性新生物を含めた肉腫；脳の悪性新生物を含めた神経癌；女性乳房の悪性新生物を含めた乳癌；ファーター膨大部、結腸、食道、肝臓、膵臓、腹膜、直腸、および胃の悪性新生物を含めた消化管／胃腸管系癌；ランゲルハンス島および甲状腺の悪性新生物を含めた内分泌癌；膀胱、腎臓、前立腺、および精巣の悪性新生物を含めた泌尿生殖系癌；輸卵管、子宮頸部、子宮筋層、卵巣、子宮内膜、および外陰部の悪性新生物を含めた婦人科癌；喉頭および舌の悪性新生物を含めた頭頸部癌；肺の悪性新生物を含めた呼吸器／胸部癌；ならびに皮膚の悪性新生物を含めた皮膚癌において過剰発現されていた（表６）。
ＦＧＦ−５は、骨および軟組織の悪性新生物を含めた肉腫；男性乳房の悪性新生物を含めた乳癌；肝臓および腹膜の悪性新生物を含めた消化管／胃腸管系癌；甲状腺の悪性新生物を含めた内分泌癌；卵巣および子宮内膜の悪性新生物を含めた婦人科癌；耳下腺の悪性新生物を含めた頭頸部癌；肺の悪性新生物を含めた呼吸器／胸部癌；ならびに皮膚の悪性新生物を含めた皮膚癌において過剰発現されていた（表６）。
表６は、ＦＧＦ−１、ＦＧＦ−２、ＦＧＦ−４およびＦＧＦ−５が、多くの場合癌において過剰発現されていたことを実証する。この過剰発現は、患部腫瘍の生存度または増殖能力の維持に活性ＦＧＦシグナル伝達経路を関連付ける。患部腫瘍中のこのようなシグナル伝達経路を遮断すること、例えばＦＧＦＲ−１、ＦＧＦＲ３、ＦＧＦＲ４−Ｆｃ融合タンパク質、またはそれらの改変体などの囮受容体を用いて、ＦＧＦ−１、ＦＧＦ−２、ＦＧＦ−４、およびＦＧＦ−５とそのそれぞれの受容体との相互作用を遮断することによって、これらの腫瘍の生存度および増殖能力が低下する。
（実施例２４）
（正常組織に対する癌組織中のＦＧＦ−８、ＦＧＦ−１７、ＦＧＦ−１８、ＦＧＦ−９、およびＦＧＦ−２０の過剰発現）
癌組織種および対応する正常組織種におけるＦＧＦ−８、ＦＧＦ−１７、ＦＧＦ−１８、ＦＧＦ−９、またはＦＧＦ−２０の発現に対するＧｅｎｅＬｏｇｉｃ（メリーランド州Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ）データベースの分析を、本質的に実施例２２に記載のように行った。Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ Ｕ１３３マイクロアレイチップは、ＦＧＦ−８、ＦＧＦ−１７、ＦＧＦ−１８、ＦＧＦ−９、およびＦＧＦ−２０に対応するプローブを含む。ＦＧＦ−８、ＦＧＦ−１７、ＦＧＦ−１８、ＦＧＦ−９、またはＦＧＦ−２０を過剰発現している任意の所定の癌種のデータセットにおける試料の割合を、そのデータセット中の試料の合計数の割合として計算し、表６に示す。対応する正常組織と比較してＦＧＦ−８、ＦＧＦ−１７、ＦＧＦ−１８、ＦＧＦ−９、およびＦＧＦ−２０を過剰発現していた癌が、本発明のＦＧＦＲ融合タンパク質の治療標的である。
Figure 2013017484
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ＦＧＦ−８は、ランゲルハンス島の悪性新生物を含めた内分泌癌において過剰発現されていた（表７）。
ＦＧＦ−１７は、軟組織の悪性新生物を含めた肉腫；ならびに子宮頸部および卵巣の悪性新生物を含めた婦人科癌において過剰発現されていた（表７）。
ＦＧＦ−１８は、ホジキンリンパ腫および結節外リンパ腫を含めたリンパ腫；骨および軟組織の悪性新生物を含めた肉腫；女性乳房および男性乳房の悪性新生物を含めた乳癌；ファーター膨大部、虫垂、結腸、食道、胆嚢、肝臓、膵臓、腹膜、直腸、および胃の悪性新生物を含めた消化管／胃腸管系癌；甲状腺の悪性新生物を含めた内分泌癌；腎臓および精巣の悪性新生物を含めた泌尿生殖系癌；輸卵管、子宮頸部、卵巣、子宮、および子宮内膜の悪性新生物を含めた婦人科癌；耳下腺の悪性新生物を含めた頭頸部癌；肺の悪性新生物を含めた呼吸器／胸部癌；ならびに皮膚の悪性新生物を含めた皮膚癌において過剰発現されていた（表７）。
ＦＧＦ−９は、Ｂ細胞急性リンパ芽球性白血病を含めた白血病；バーキットリンパ腫および非ホジキンリンパ腫を含めたリンパ腫；骨および軟組織の悪性新生物を含めた肉腫；脳の悪性新生物を含めた神経癌；女性乳房の悪性新生物を含めた乳癌；虫垂、結腸、食道、胆嚢、膵臓、腹膜、直腸、小腸、および胃の悪性新生物を含めた消化管／胃腸管系癌；副腎およびランゲルハンス島の悪性新生物を含めた内分泌癌；膀胱、腎臓、および精巣の悪性新生物を含めた泌尿生殖系癌；子宮頸部、子宮筋層、卵巣、子宮、および子宮内膜の悪性新生物を含めた婦人科癌；唾液腺、耳下腺、および舌の悪性新生物を含めた頭頸部癌；肺および気管の悪性新生物を含めた呼吸器／胸部癌；ならびに皮膚の悪性新生物を含めた皮膚癌において過剰発現されていた（表７）。
表６は、ＦＧＦ−８、ＦＧＦ−１７、ＦＧＦ−１８、ＦＧＦ−９およびＦＧＦ−２０が、多くの場合癌において過剰発現されていたことを実証する。この過剰発現は、患部腫瘍の生存度または増殖能力の維持に活性ＦＧＦシグナル伝達経路を関連付ける。患部腫瘍中のこのようなシグナル伝達経路を遮断すること、例えば、ＦＧＦＲ１−Ｆｃ、ＦＧＦＲ３−ＦｃおよびＦＧＦＲ４−Ｆｃ融合タンパク質などの囮受容体、またはその任意の改変体を用いて、ＦＧＦ−８、ＦＧＦ−１７、ＦＧＦ−９およびＦＧＦ−２０とそのそれぞれの受容体との相互作用を遮断することによって、これらの腫瘍の生存度および増殖能力が低下する。
ＦＧＦ−２０は、結腸の悪性新生物を含めた消化管／胃腸管系癌；ランゲルハンス島および甲状腺の悪性新生物を含めた内分泌癌；ならびに卵巣および子宮内膜の悪性新生物を含めた婦人科癌において過剰発現されていた（表７）。
（実施例２５）
（正常組織に対する癌組織におけるＦＧＦ−１９、ＦＧＦ−２１、およびＦＧＦ−２３の過剰発現）
癌組織種および対応する正常組織種におけるＦＧＦ−１９、ＦＧＦ−２１、またはＦＧＦ−２３の発現に対するＧｅｎｅＬｏｇｉｃ（メリーランド州Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ）データベースの分析を、本質的に実施例２２に記載のように行った。Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ Ｕ１３３マイクロアレイチップは、ＦＧＦ−１９、ＦＧＦ−２１、およびＦＧＦ−２３に対応するプローブを含む。ＦＧＦ−１９、ＦＧＦ−２１、またはＦＧＦ−２３を過剰発現している任意の所定の癌種のデータセットにおける試料の割合を、そのデータセット中の試料の合計数の割合として計算し、表９に示す。対応する正常組織と比較してＦＧＦ−１９、ＦＧＦ−２１、またはＦＧＦ−２３を過剰発現していた癌が、本発明のＦＧＦＲ融合タンパク質の治療標的である。
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ＦＧＦ−１９は、骨および軟組織の悪性新生物を含めた肉腫；脳の悪性新生物を含めた神経癌；結腸、胆嚢、肝臓、膵臓、直腸、小腸、および胃の悪性新生物を含めた消化管／胃腸管系癌；甲状腺の悪性新生物を含めた内分泌癌；精巣の悪性新生物を含めた泌尿生殖系癌；子宮頸部、卵巣、子宮内膜、および外陰部の悪性新生物を含めた婦人科癌；喉頭の悪性新生物を含めた頭頸部癌；肺の悪性新生物を含めた呼吸器／胸部癌；ならびに皮膚の悪性新生物を含めた皮膚癌において過剰発現されていた（表８）。
ＦＧＦ−２１は、肝臓および直腸の悪性新生物を含めた消化管／胃腸管系癌において過剰発現されていた（表８）。
ＦＧＦ−２３は、軟組織の悪性新生物を含めた肉腫；食道の悪性新生物を含めた消化管／胃腸管系癌；子宮筋層の悪性新生物を含めた婦人科癌；ならびに皮膚の悪性新生物を含めた皮膚癌において過剰発現されていた（表８）。
表８は、ＦＧＦ−１９、ＦＧＦ−２１およびＦＧＦ−２３が、多くの場合癌において過剰発現されていたことを実証する。この過剰発現は、患部腫瘍の生存度または増殖能力の維持に活性ＦＧＦシグナル伝達経路を関連付ける。患部腫瘍中のこのようなシグナル伝達経路を遮断すること、例えば、ＦＧＦＲ１−Ｆｃ、ＦＧＦＲ３−ＦｃおよびＦＧＦＲ４−Ｆｃ融合タンパク質などの囮受容体またはそれらの改変体を用いて、ＦＧＦ−１９、ＦＧＦ−２１およびＦＧＦ−２３とそのそれぞれの受容体との相互作用を遮断することによって、これらの腫瘍の生存度または増殖能力が低下する。
（実施例２６）
（正常組織に対する癌組織中のＦＧＦＲ１の過剰発現ならびにＦＧＦ−１、ＦＧＦ−２、ＦＧＦ−４、ＦＧＦ−５、ＦＧＦ−８、ＦＧＦ−９、ＦＧＦ−１７、ＦＧＦ−１９、ＦＧＦ−２０、およびＦＧＦ−２１の過剰発現）
ＦＧＦ−１、ＦＧＦ−２、ＦＧＦ−４、ＦＧＦ−５、ＦＧＦ−８、ＦＧＦ−９、ＦＧＦ−１７、ＦＧＦ−１９、ＦＧＦ−２０、およびＦＧＦ−２１は、ＦＧＦＲ１を発現する癌細胞において増殖を誘導することができる。癌組織種および対応する正常組織種におけるＦＧＦ−１、ＦＧＦ−２、ＦＧＦ−４、ＦＧＦ−５、ＦＧＦ−８、ＦＧＦ−９、ＦＧＦ−１７、ＦＧＦ−１９、ＦＧＦ−２０、およびＦＧＦ−２１の発現に対するＧｅｎｅＬｏｇｉｃ（メリーランド州Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ）データベースの分析を、本質的に実施例２２に記載のように行った。Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ Ｕ１３３マイクロアレイチップは、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦ−１、ＦＧＦ−２、ＦＧＦ−４、ＦＧＦ−５、ＦＧＦ−８、ＦＧＦ−９、ＦＧＦ−１７、ＦＧＦ−１９、ＦＧＦ−２０、およびＦＧＦ−２１に対応するプローブを含む。ＦＧＦＲ１、ＦＧＦ−１、ＦＧＦ−２、ＦＧＦ−４、ＦＧＦ−５、ＦＧＦ−８、ＦＧＦ−９、ＦＧＦ−１７、ＦＧＦ−１９、ＦＧＦ−２０、またはＦＧＦ−２１を過剰発現している任意の所定の癌種のデータセットにおける試料の割合を、そのデータセット中の試料の合計数の割合として計算し、表１０に示す。対応する正常組織と比較してＦＧＦＲ１、ＦＧＦ−１、ＦＧＦ−２、ＦＧＦ−４、ＦＧＦ−５、ＦＧＦ−８、ＦＧＦ−９、ＦＧＦ−１７、ＦＧＦ−１９、ＦＧＦ−２０、およびＦＧＦ−２１を過剰発現していた癌が、本発明のＦＧＦＲ融合タンパク質の治療標的である。
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ＦＧＦＲ１およびＦＧＦ−１はどちらも、慢性骨髄性白血病を含めた白血病；ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、および結節外リンパ腫を含めたリンパ腫；骨および軟組織の悪性新生物を含めた肉腫；脳の悪性新生物を含めた神経癌；女性乳房の悪性新生物を含めた乳癌；結腸、食道、肝臓、膵臓、腹膜、直腸、小腸、および胃の悪性新生物を含めた消化管／胃腸管系癌；ランゲルハンス島、および甲状腺の悪性新生物を含めた内分泌癌；膀胱、腎臓、前立腺、および精巣の悪性新生物を含めた泌尿生殖系癌；子宮頸部、子宮筋層、卵巣、子宮内膜、および外陰部の悪性新生物を含めた婦人科癌；喉頭、唾液腺、耳下腺、および舌の悪性新生物を含めた頭頸部癌；肺の悪性新生物を含めた呼吸器／胸部癌；ならびに皮膚の悪性新生物を含めた皮膚癌において過剰発現されていた（表９）。
ＦＧＦＲ１およびＦＧＦ−２はどちらも、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、および結節外リンパ腫を含めたリンパ腫；形質細胞腫を含めた骨髄腫；骨および軟組織の悪性新生物を含めた肉腫；脳の悪性新生物を含めた神経癌；女性乳房の悪性新生物を含めた乳癌；ファーター膨大部、虫垂、結腸、十二指腸、食道、肝臓、膵臓、直腸、小腸、および胃の悪性新生物を含めた消化管／胃腸管系癌；副腎、ランゲルハンス島、および甲状腺の悪性新生物を含めた内分泌癌；膀胱、腎臓、前立腺、および精巣の悪性新生物を含めた泌尿生殖系癌；子宮頸部、子宮筋層、卵巣、子宮内膜、胎盤、および外陰部の悪性新生物を含めた婦人科癌；喉頭、唾液腺、耳下腺、および舌の悪性新生物を含めた頭頸部癌；肺、胸腺、および気管の悪性新生物を含めた呼吸器／胸部癌；ならびに皮膚の悪性新生物を含めた皮膚癌において過剰発現されていた（表９）。
ＦＧＦＲ１およびＦＧＦ−４はどちらも、非ホジキンリンパ腫、および結節外リンパ腫を含めたリンパ腫；骨および軟組織の悪性新生物を含めた肉腫；脳の悪性新生物を含めた神経癌；女性乳房の悪性新生物を含めた乳癌；ファーター膨大部、結腸、食道、肝臓、膵臓、腹膜、直腸、および胃の悪性新生物を含めた消化管／胃腸管系癌；ランゲルハンス島、および甲状腺の悪性新生物を含めた内分泌癌；膀胱、腎臓、前立腺、および精巣の悪性新生物を含めた泌尿生殖系癌；子宮頸部、子宮筋層、卵巣、子宮内膜、および外陰部の悪性新生物を含めた婦人科癌；喉頭および舌の悪性新生物を含めた頭頸部癌；肺の悪性新生物を含めた呼吸器／胸部癌；ならびに皮膚の悪性新生物を含めた皮膚癌において過剰発現されていた（表９）。
ＦＧＦＲ１およびＦＧＦ−５はどちらも、骨および軟組織の悪性新生物を含めた肉腫；肝臓および腹膜の悪性新生物を含めた消化管／胃腸管系癌；甲状腺の悪性新生物を含めた内分泌癌；卵巣および子宮内膜の悪性新生物を含めた婦人科癌；耳下腺の悪性新生物を含めた頭頸部癌；肺の悪性新生物を含めた呼吸器／胸部癌；ならびに皮膚の悪性新生物を含めた皮膚癌において過剰発現されていた（表９）。
ＦＧＦＲ１およびＦＧＦ−８はどちらも、ランゲルハンス島の悪性新生物を含めた内分泌癌において過剰発現されていた（表９）。
ＦＧＦＲ１およびＦＧＦ−９はどちらも、Ｂ細胞急性リンパ芽球性白血病を含めた白血病；非ホジキンリンパ腫を含めたリンパ腫；骨および軟組織の悪性新生物を含めた肉腫；脳の悪性新生物を含めた神経癌；女性乳房の悪性新生物を含めた乳癌；虫垂、結腸、食道、膵臓、腹膜、直腸、小腸、および胃の悪性新生物を含めた消化管／胃腸管系癌；副腎およびランゲルハンス島の悪性新生物を含めた内分泌癌；膀胱、腎臓、および精巣の悪性新生物を含めた泌尿生殖系癌；子宮頸部、子宮筋層、卵巣、子宮、および子宮内膜の悪性新生物を含めた婦人科癌；唾液腺、耳下腺、および舌の悪性新生物を含めた頭頸部癌；肺および気管の悪性新生物を含めた呼吸器／胸部癌；ならびに皮膚の悪性新生物を含めた皮膚癌において過剰発現されていた（表９）。
ＦＧＦＲ１およびＦＧＦ−１７はどちらも、軟組織の悪性新生物を含めた肉腫；ならびに子宮頸部および卵巣の悪性新生物を含めた婦人科癌において過剰発現されていた（表９）。
ＦＧＦＲ１およびＦＧＦ−１９はどちらも、骨および軟組織の悪性新生物を含めた肉腫；脳の悪性新生物を含めた神経癌；結腸、肝臓、膵臓、直腸、小腸、および胃の悪性新生物を含めた消化管／胃腸管系癌；甲状腺の悪性新生物を含めた内分泌癌；精巣の悪性新生物を含めた泌尿生殖系癌；子宮頸部、卵巣、子宮内膜、および外陰部の悪性新生物を含めた婦人科癌；喉頭の悪性新生物を含めた頭頸部癌；肺の悪性新生物を含めた呼吸器／胸部癌；ならびに皮膚の悪性新生物を含めた皮膚癌において過剰発現されていた（表９）。
ＦＧＦＲ１およびＦＧＦ−２０はどちらも、結腸の悪性新生物を含めた消化管／胃腸管系癌；ランゲルハンス島、および甲状腺の悪性新生物を含めた内分泌癌；ならびに卵巣および子宮内膜の悪性新生物を含めた婦人科癌において過剰発現されていた（表９）。
ＦＧＦＲ１およびＦＧＦ−２１はどちらも、肝臓および直腸の悪性新生物を含めた消化管／胃腸管系癌において過剰発現されていた（表９）。
表９は、ＦＧＦＲ１ならびにＦＧＦ−１、ＦＧＦ−２、ＦＧＦ−４、ＦＧＦ−５、ＦＧＦ−８、ＦＧＦ−９、ＦＧＦ−１７、ＦＧＦ−１９、ＦＧＦ−２０およびＦＧＦ−２１のうちの１つまたは複数が、多くの場合癌において過剰発現されていたことを実証する。この過剰発現は、患部腫瘍の生存度または増殖能力の維持に活性ＦＧＦシグナル伝達経路を関連付ける。患部腫瘍中のこのようなシグナル伝達経路を遮断すること、例えば、ＦＧＦＲ１−Ｆｃ、ＦＧＦＲ３−Ｆｃ、およびＦＧＦＲ４−Ｆｃ融合タンパク質などの囮受容体、またはそれらの改変体を用いて、ＦＧＦ−１、ＦＧＦ−２、ＦＧＦ−４、ＦＧＦ−５、ＦＧＦ−８、ＦＧＦ−０、ＦＧＦ−１７、ＦＧＦ−１９および／またはＦＧＦ−２０とそのそれぞれの受容体と、ならびにＦＧＦＲ１とその結合リガンドとの相互作用を遮断することによって、これらの腫瘍の生存度または増殖能力が低下する。
（実施例２７）
（正常組織に対する癌組織中のＦＧＦＲ３の過剰発現ならびにＦＧＦ−１、ＦＧＦ−２、ＦＧＦ−４、ＦＧＦ−５、ＦＧＦ−８、ＦＧＦ−９、ＦＧＦ−１７、ＦＧＦ−１８、ＦＧＦ−１９、およびＦＧＦ−２０の過剰発現）
ＦＧＦ−１、ＦＧＦ−２、ＦＧＦ−４、ＦＧＦ−５、ＦＧＦ−８、ＦＧＦ−９、ＦＧＦ−１７、ＦＧＦ−１８、ＦＧＦ−１９、およびＦＧＦ−２０は、ＦＧＦＲ３を発現する癌細胞において増殖を誘導することができる。癌組織種および対応する正常組織種におけるＦＧＦ−１、ＦＧＦ−２、ＦＧＦ−４、ＦＧＦ−５、ＦＧＦ−８、ＦＧＦ−９、ＦＧＦ−１７、ＦＧＦ−１８、ＦＧＦ−１９、およびＦＧＦ−２０の発現に対するＧｅｎｅＬｏｇｉｃ（メリーランド州Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ）データベースの分析を、本質的に実施例２２に記載のように行った。Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ Ｕ１３３マイクロアレイチップは、ＦＧＦＲ３、ＦＧＦ−１、ＦＧＦ−２、ＦＧＦ−４、ＦＧＦ−５、ＦＧＦ−８、ＦＧＦ−９、ＦＧＦ−１７、ＦＧＦ−１８、ＦＧＦ−１９、およびＦＧＦ−２０に対応するプローブを含む。ＦＧＦＲ３、ＦＧＦ−１、ＦＧＦ−２、ＦＧＦ−４、ＦＧＦ−５、ＦＧＦ−８、ＦＧＦ−９、ＦＧＦ−１７、ＦＧＦ−１８、ＦＧＦ−１９、およびＦＧＦ−２０を過剰発現している任意の所定の癌種のデータセットにおける試料の割合を、そのデータセット中の試料の合計数の割合として計算し、表１１に示す。対応する正常組織と比較してＦＧＦＲ３、ＦＧＦ−１、ＦＧＦ−２、ＦＧＦ−４、ＦＧＦ−５、ＦＧＦ−８、ＦＧＦ−９、ＦＧＦ−１７、ＦＧＦ−１８、ＦＧＦ−１９、およびＦＧＦ−２０を過剰発現していた癌が、本発明のＦＧＦＲ融合タンパク質の治療標的である。
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ＦＧＦＲ３およびＦＧＦ−１はどちらも、バーキットリンパ腫を含めたリンパ腫；骨および軟組織の悪性新生物を含めた肉腫；脳の悪性新生物を含めた神経癌；女性乳房および男性乳房の悪性新生物を含めた乳癌；結腸、食道、胆嚢、肝臓、膵臓、直腸、小腸、および胃の悪性新生物を含めた消化管／胃腸管系癌；ランゲルハンス島および甲状腺の悪性新生物を含めた内分泌癌；膀胱、腎臓、前立腺、精巣、および輸尿管の悪性新生物を含めた泌尿生殖系癌；子宮頸部、卵巣、子宮内膜、および外陰部の悪性新生物を含めた婦人科癌；喉頭、耳下腺、および舌の悪性新生物を含めた頭頸部癌；肺の悪性新生物を含めた呼吸器／胸部癌；ならびに皮膚の悪性新生物を含めた皮膚癌において過剰発現されていた（表１０）。
ＦＧＦＲ３およびＦＧＦ−２はどちらも、骨および軟組織の悪性新生物を含めた肉腫；脳の悪性新生物を含めた神経癌；女性乳房の悪性新生物を含めた乳癌；ファーター膨大部、結腸、十二指腸、食道、肝臓、膵臓、直腸、小腸、および胃の悪性新生物を含めた消化管／胃腸管系癌；ランゲルハンス島および甲状腺の悪性新生物を含めた内分泌癌；膀胱、腎臓、前立腺、および精巣の悪性新生物を含めた泌尿生殖系癌；子宮頸部、卵巣、子宮内膜、および外陰部の悪性新生物を含めた婦人科癌；喉頭、耳下腺、および舌の悪性新生物を含めた頭頸部癌；肺の悪性新生物を含めた呼吸器／胸部癌；ならびに皮膚の悪性新生物を含めた皮膚癌において過剰発現されていた（表１０）。
ＦＧＦＲ３およびＦＧＦ−４はどちらも、骨および軟組織の悪性新生物を含めた肉腫；脳の悪性新生物を含めた神経癌；女性乳房の悪性新生物を含めた乳癌；ファーター膨大部、結腸、食道、肝臓、膵臓、直腸、および胃の悪性新生物を含めた消化管／胃腸管系癌；ランゲルハンス島および甲状腺の悪性新生物を含めた内分泌癌；膀胱、腎臓、前立腺、および精巣の悪性新生物を含めた泌尿生殖系癌；子宮頸部、卵巣、子宮内膜、および外陰部の悪性新生物を含めた婦人科癌；喉頭および舌の悪性新生物を含めた頭頸部癌；肺の悪性新生物を含めた呼吸器／胸部癌；ならびに皮膚の悪性新生物を含めた皮膚癌において過剰発現されていた（表１０）。
ＦＧＦＲ３およびＦＧＦ−５はどちらも、骨および軟組織の悪性新生物を含めた肉腫；男性乳房の悪性新生物を含めた乳癌；肝臓の悪性新生物を含めた消化管／胃腸管系癌；甲状腺の悪性新生物を含めた内分泌癌；卵巣および子宮内膜の悪性新生物を含めた婦人科癌；耳下腺の悪性新生物を含めた頭頸部癌；肺の悪性新生物を含めた呼吸器／胸部癌；ならびに皮膚の悪性新生物を含めた皮膚癌において過剰発現されていた（表１０）。
ＦＧＦＲ３およびＦＧＦ−８はどちらも、ランゲルハンス島の悪性新生物を含めた内分泌癌において過剰発現されていた（表１０）。
ＦＧＦＲ３およびＦＧＦ−９はどちらも、バーキットリンパ腫を含めたリンパ腫；骨および軟組織の悪性新生物を含めた肉腫；脳の悪性新生物を含めた神経癌；女性乳房の悪性新生物を含めた乳癌；結腸、食道、胆嚢、膵臓、直腸、小腸、および胃の悪性新生物を含めた消化管／胃腸管系癌；ランゲルハンス島の悪性新生物を含めた内分泌癌；膀胱、腎臓、および精巣の悪性新生物を含めた泌尿生殖系癌；子宮頸部、卵巣、子宮、および子宮内膜の悪性新生物を含めた婦人科癌；耳下腺および舌の悪性新生物を含めた頭頸部癌；肺の悪性新生物を含めた呼吸器／胸部癌；ならびに皮膚の悪性新生物を含めた皮膚癌において過剰発現されていた（表１０）。
ＦＧＦＲ３およびＦＧＦ−１７はどちらも、軟組織の悪性新生物を含めた肉腫、ならびに子宮頸部および卵巣の悪性新生物を含めた婦人科癌において過剰発現されていた（表１０）。
ＦＧＦＲ３およびＦＧＦ−１８はどちらも、骨および軟組織の悪性新生物を含めた肉腫；女性乳房および男性乳房の悪性新生物を含めた乳癌；ファーター膨大部、結腸、食道、胆嚢、肝臓、膵臓、直腸、および胃の悪性新生物を含めた消化管／胃腸管系癌；甲状腺の悪性新生物を含めた内分泌癌；腎臓および精巣の悪性新生物を含めた泌尿生殖系癌；子宮頸部、卵巣、子宮、および子宮内膜の悪性新生物を含めた婦人科癌；耳下腺の悪性新生物を含めた頭頸部癌；肺の悪性新生物を含めた呼吸器／胸部癌；ならびに皮膚の悪性新生物を含めた皮膚癌において過剰発現されていた（表１０）。
ＦＧＦＲ３およびＦＧＦ−１９はどちらも、骨および軟組織の悪性新生物を含めた肉腫；脳の悪性新生物を含めた神経癌；結腸を含めた消化管／胃腸管系癌；胆嚢、肝臓、膵臓、直腸、小腸、および胃の悪性新生物；甲状腺の悪性新生物を含めた内分泌癌；精巣を含めた泌尿生殖系癌；子宮頸部、卵巣、子宮内膜、および外陰部の悪性新生物の悪性新生物を含めた婦人科癌；喉頭の悪性新生物を含めた頭頸部癌；肺の悪性新生物を含めた呼吸器／胸部癌；ならびに皮膚の悪性新生物を含めた皮膚癌において過剰発現されていた（表１０）。
ＦＧＦＲ３およびＦＧＦ−２０はどちらも、結腸の悪性新生物を含めた消化管／胃腸管系癌；ランゲルハンス島および甲状腺の悪性新生物を含めた内分泌癌；ならびに卵巣および子宮内膜の悪性新生物を含めた婦人科癌において過剰発現されていた（表１０）。
表１１は、ＦＧＦＲ３ならびにＦＧＦ−１、ＦＧＦ−２、ＦＧＦ−４、ＦＧＦ−５、ＦＧＦ−８、ＦＧＦ−９、ＦＧＦ−１７、ＦＧＦ−１８、ＦＧＦ−１９およびＦＧＦ−２０のうちの１つまたは複数が、多くの場合癌において過剰発現されていたことを実証する。この過剰発現は、患部腫瘍の生存度または増殖能力の維持に活性ＦＧＦシグナル伝達経路を関連付ける。患部腫瘍中のこのようなシグナル伝達経路を遮断すること、例えば、ＦＧＦＲ１−Ｆｃ、ＦＧＦＲ３−ＦｃおよびＦＧＦＲ４−Ｆｃ融合タンパク質などの囮受容体、またはそれらの改変体を用いて、ＦＧＦ−１、ＦＧＦ−２、ＦＧＦ−４、ＦＧＦ−５、ＦＧＦ−８、ＦＧＦ−９、ＦＧＦ−１７、ＦＧＦ−１８、ＦＧＦ−１９および／またはＦＧＦ−２０とそのそれぞれの受容体と、ならびにＦＧＦＲ３とその結合リガンドとの相互作用を遮断することによって、これらの腫瘍の生存度または増殖能力が低下する。
（実施例２８）
（正常組織に対する癌組織中のＦＧＦＲ４の過剰発現ならびにＦＧＦ−１、ＦＧＦ−２、ＦＧＦ−４、ＦＧＦ−８、ＦＧＦ−９、ＦＧＦ−１７、ＦＧＦ−１８、ＦＧＦ−１９、ＦＧＦ−２０、ＦＧＦ−２１、およびＦＧＦ−２３の過剰発現）
ＦＧＦ−１、ＦＧＦ−２、ＦＧＦ−４、ＦＧＦ−８、ＦＧＦ−９、ＦＧＦ−１７、ＦＧＦ−１８、ＦＧＦ−１９、ＦＧＦ−２０、ＦＧＦ−２１、およびＦＧＦ−２３は、ＦＧＦＲ４を発現する癌細胞において増殖を誘導することができる。癌組織種および対応する正常組織種におけるＦＧＦ−１、ＦＧＦ−２、ＦＧＦ−４、ＦＧＦ−５、ＦＧＦ−８、ＦＧＦ−９、ＦＧＦ−１７、ＦＧＦ−１８、ＦＧＦ−１９、およびＦＧＦ−２０の発現に対するＧｅｎｅＬｏｇｉｃ（メリーランド州Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ）データベースの分析を、本質的に実施例２２に記載のように行った。Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ Ｕ１３３マイクロアレイチップは、ＦＧＦＲ３、ＦＧＦ−１、ＦＧＦ−２、ＦＧＦ−４、ＦＧＦ−５、ＦＧＦ−８、ＦＧＦ−９、ＦＧＦ−１７、ＦＧＦ−１８、ＦＧＦ−１９、およびＦＧＦ−２０に対応するプローブを含む。ＦＧＦＲ３、ＦＧＦ−１、ＦＧＦ−２、ＦＧＦ−４、ＦＧＦ−５、ＦＧＦ−８、ＦＧＦ−９、ＦＧＦ−１７、ＦＧＦ−１８、ＦＧＦ−１９、およびＦＧＦ−２０を過剰発現している任意の所定の癌種のデータセットにおける試料の割合を、そのデータセット中の試料の合計数の割合として計算し、表１１に示す。対応する正常組織と比較してＦＧＦＲ３、ＦＧＦ−１、ＦＧＦ−２、ＦＧＦ−４、ＦＧＦ−５、ＦＧＦ−８、ＦＧＦ−９、ＦＧＦ−１７、ＦＧＦ−１８、ＦＧＦ−１９、およびＦＧＦ−２０を過剰発現していた癌が、本発明のＦＧＦＲ融合タンパク質の治療標的である。
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ＦＧＦＲ４およびＦＧＦ−１はどちらも、非ホジキンリンパ腫を含めたリンパ腫；骨および軟組織の悪性新生物を含めた肉腫；女性乳房の悪性新生物を含めた乳癌；結腸、食道、胆嚢、肝臓、膵臓、直腸、小腸、および胃の悪性新生物を含めた消化管／胃腸管系癌；ランゲルハンス島の悪性新生物を含めた内分泌癌；腎臓および精巣の悪性新生物を含めた泌尿生殖系癌；卵巣および子宮内膜の悪性新生物を含めた婦人科癌；耳下腺の悪性新生物を含めた頭頸部癌；肺の悪性新生物を含めた呼吸器／胸部癌；ならびに皮膚の悪性新生物を含めた皮膚癌において過剰発現されていた（表１１）。
ＦＧＦＲ４およびＦＧＦ−２はどちらも、非ホジキンリンパ腫を含めたリンパ腫；骨、心臓、および軟組織の悪性新生物を含めた肉腫；女性乳房の悪性新生物を含めた乳癌；結腸、十二指腸、食道、肝臓、膵臓、直腸、小腸、および胃の悪性新生物を含めた消化管／胃腸管系癌；副腎およびランゲルハンス島の悪性新生物を含めた内分泌癌；腎臓および精巣の悪性新生物を含めた泌尿生殖系癌；卵巣および子宮内膜の悪性新生物を含めた婦人科癌；耳下腺の悪性新生物を含めた頭頸部癌；肺の悪性新生物を含めた呼吸器／胸部癌；ならびに皮膚の悪性新生物を含めた皮膚癌において過剰発現されていた（表１１）。
ＦＧＦＲ４およびＦＧＦ−４はどちらも、非ホジキンリンパ腫を含めたリンパ腫；骨、心臓、および軟組織の悪性新生物を含めた肉腫；女性乳房の悪性新生物を含めた乳癌；結腸を含めた消化管／胃腸管系癌；食道、肝臓、膵臓、直腸、および胃の悪性新生物；ランゲルハンス島の悪性新生物を含めた内分泌癌；腎臓および精巣の悪性新生物を含めた泌尿生殖系癌；卵巣および子宮内膜の悪性新生物を含めた婦人科癌；肺の悪性新生物を含めた呼吸器／胸部癌；ならびに皮膚の悪性新生物を含めた皮膚癌において過剰発現されていた（表１１）。
ＦＧＦＲ４およびＦＧＦ−８はどちらも、ランゲルハンス島の悪性新生物を含めた内分泌癌において過剰発現されていた（表１２）。
ＦＧＦＲ４およびＦＧＦ−９はどちらも、非ホジキンリンパ腫を含めたリンパ腫；骨および軟組織の悪性新生物を含めた肉腫；女性乳房の悪性新生物を含めた乳癌；結腸、食道、胆嚢、膵臓、直腸、小腸、および胃の悪性新生物を含めた消化管／胃腸管系癌；副腎およびランゲルハンス島の悪性新生物を含めた内分泌癌；腎臓および精巣の悪性新生物を含めた泌尿生殖系癌；卵巣および子宮内膜の悪性新生物を含めた婦人科癌；耳下腺の悪性新生物を含めた頭頸部癌；肺の悪性新生物を含めた呼吸器／胸部癌；ならびに皮膚の悪性新生物を含めた皮膚癌において過剰発現されていた（表１１）。
ＦＧＦＲ４およびＦＧＦ−１７はどちらも、軟組織の悪性新生物を含めた肉腫；ならびに卵巣の悪性新生物を含めた婦人科癌において過剰発現されていた（表１１）。
ＦＧＦＲ４およびＦＧＦ−１８はどちらも、非ホジキンリンパ腫を含めたリンパ腫；骨および軟組織の悪性新生物を含めた肉腫；女性乳房の悪性新生物を含めた乳癌；結腸、食道、胆嚢、肝臓、膵臓、直腸、および胃の悪性新生物を含めた消化管／胃腸管系癌；腎臓および精巣の悪性新生物を含めた泌尿生殖系癌；卵巣および子宮内膜の悪性新生物を含めた婦人科癌；耳下腺の悪性新生物を含めた頭頸部癌；肺の悪性新生物を含めた呼吸器／胸部癌；ならびに皮膚の悪性新生物を含めた皮膚癌において過剰発現されていた（表１１）。
ＦＧＦＲ４およびＦＧＦ−１９はどちらも、骨および軟組織の悪性新生物を含めた肉腫；結腸、胆嚢、肝臓、膵臓、直腸、小腸、および胃の悪性新生物を含めた消化管／胃腸管系癌；精巣の悪性新生物を含めた泌尿生殖系癌；卵巣および子宮内膜の悪性新生物を含めた婦人科癌；肺の悪性新生物を含めた呼吸器／胸部癌；ならびに皮膚の悪性新生物を含めた皮膚癌において過剰発現されていた（表１１）。
ＦＧＦＲ４およびＦＧＦ−２０はどちらも、結腸の悪性新生物を含めた消化管／胃腸管系癌；ランゲルハンス島の悪性新生物を含めた内分泌癌；ならびに卵巣および子宮内膜の悪性新生物を含めた婦人科癌において過剰発現されていた（表１１）。
ＦＧＦＲ４およびＦＧＦ−２１はどちらも、肝臓および直腸の悪性新生物を含めた消化管／胃腸管系癌において過剰発現されていた（表１１）。
ＦＧＦＲ４およびＦＧＦ−２３はどちらも、軟組織の悪性新生物を含めた肉腫；食道の悪性新生物を含めた消化管／胃腸管系癌；ならびに皮膚の悪性新生物を含めた皮膚癌において過剰発現されていた（表１１）。
この分析により、ＦＧＦＲ４、ＦＧＦ−１、ＦＧＦ−２、ＦＧＦ−４、ＦＧＦ−５、ＦＧＦ−８、ＦＧＦ−９、ＦＧＦ−１７、ＦＧＦ−１８、ＦＧＦ−１９、ＦＧＦ−２０、ＦＧＦ−２１およびＦＧＦ−２３が、癌において一般的に過剰発現されていたことが実証された。この過剰発現により、患部腫瘍の生存度および／または増殖能力の維持に活性ＦＧＦシグナル伝達経路を関連付ける。例えばＦＧＦＲ１−Ｆｃ、ＦＧＦＲ３−Ｆｃ、またはＦＧＦＲ４−Ｆｃ融合タンパク質を用いた、患部腫瘍中のＦＧＦＲシグナル伝達経路の遮断により、これらの腫瘍の生存度および／または増殖能力が低下する。
表１１は、ＦＧＦＲ４およびＦＧＦ−１、ＦＧＦ−２、ＦＧＦ−４、ＦＧＦ−５、ＦＧＦ−８、ＦＧＦ−９、ＦＧＦ、ＦＧＦ−１７、ＦＧＦ−１８、ＦＧＦ−１９、ＦＧＦ−２０、ＦＧＦ−２１およびＦＧＦ−２３のうちの任意のものが、多くの場合癌において過剰発現されていたことを実証する。この過剰発現は、患部腫瘍の生存度または増殖能力の維持に活性ＦＧＦシグナル伝達経路を関連付ける。患部腫瘍中のこのようなシグナル伝達経路を遮断すること、例えば、ＦＧＦＲ１−Ｆｃ、ＦＧＦＲ３−ＦｃおよびＦＧＦＲ４−Ｆｃ融合タンパク質などの囮受容体、またはそれらの改変体を用いて、ＦＧＦ−１、ＦＧＦ−２、ＦＧＦ−４、ＦＧＦ−８、ＦＧＦ−９、ＦＧＦ−１７、ＦＧＦ−１８、ＦＧＦ−１９、ＦＧＦ−２０およびＦＧＦ−２３間の相互作用；ならびにＦＧＦＲ４とその結合リガンドとの相互作用を遮断することによって、これらの腫瘍の生存度または増殖能力が低下する。
（産業上の利用可能性）
ＦＧＦＲ融合タンパク質およびそれをコードしているポリヌクレオチド分子は、癌を含めた、増殖性疾患および血管形成に関与する疾患の治療に有用である。これらを用いて、このような疾患を診断、予防、および治療することができる。
（配列表）
配列表は、紙形式およびコンピューター可読形式の両方で提供される。これは、送付状に添付される。
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