MX2012006397A

MX2012006397A - PROTEINAS DE ENLACE QUE ENLAZAN A FGFR1C HUMANO, ß-KLOTHO HUMANA Y TANTO FGFR1C HUMANO COMO ß-KLOTHO HUMANA.

Info

Publication number: MX2012006397A
Application number: MX2012006397A
Authority: MX
Inventors: Peng Li; Alice Bakker; Amy N Duguay; Richard Smith; Yang Li
Original assignee: Amgen Inc
Priority date: 2009-12-02
Filing date: 2010-12-01
Publication date: 2012-11-30
Also published as: TW201129377A; US8372952B2; EP2679234A2; US20110150901A1; CA2782814A1; EP2506861A1; EP2679234A3; AR079247A1; WO2011068893A1; AU2010326024A1; US20130197191A1; JP2013512672A

Abstract

Se proporcionan las proteínas de enlace que se enlazan específicamente a ß-Klotho o porciones de las mismas, FGFR1c o porciones del mismo, o ambos FGFR1c y ß-Klotho, y opcionalmente también otras proteínas. También se proporcionan las secuencias de codificación, métodos de tratamiento y composiciones farmacéuticas.

Description

PROTEÍNAS DE ENLACE QUE ENLAZAN A FGFRlc HUMANO, ß-KLOTHO HUMANA Y TANTO FGFRlc HUMANO COMO ß-KLOTHO HUMANA CAMPO DE LA INVENCIÓN Se proporcionan las proteínas de enlace que se enlazan específicamente a ß-Klotho o porciones de las mismas, FGFRlc o porciones del mismo, o ambos FGFRlc y ß-Klotho, y opcionalmente también otras proteínas ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN El Factor 21 de Crecimiento de Fibroblastos (FGF21) es un polipéptido secretado que pertenece a una subfamilia de Factores de Crecimiento de Fibroblastos (FGFs) que incluye FGF19, FGF21, y FGF23 (Itoh et al., (2004) Trend Genet . 20:563-69). FGF21 es un FGF atípico en que es independiente de la heparina y funciona, como una hormona en la regulación de la glucosa, lípidos,' y metabolismo de energía.

FGF21 es altamente expresado en el hígado y el páncreas y es el único miembro de la familia FGF que se expresa principalmente en.' el hígado. Los ratones transgénicos que sobreexpresan FGF21 muestran fenotipos metabólicos de baja tasa de crecimiento, bajos niveles de glucosa de plasma y triglicéridos, y una ausencia de diabetes tipo 2 asociada con la edad, hiperplasia de isletas, y obesidad. La administración farmacológica de proteina recombinante FGF21 en modelos de roedores y de primates resulta en niveles normalizados de glucosa en plasma, niveles reducidos de colesterol y triglicéridos, y tolerancia mejorada a la glucosa y sensibilidad a la insulina. Además, el FGF21 reduce el peso corporal y la grasa corporal por incremento en el gasto de energía, actividad física, y tasa metabólica. (Xu et al. 2009 Diabetes 58:250-259). También existe evidencia de que FGF21 puede tener un efecto protector en la pancreatitis aguda (Johnson et al. 2009 Gasteroenterology 137 (5): 1795-1804) .

La investigación experimental proporciona apoyo para la administración farmacológica de FGF21 para el tratamiento de diabetes tipo 2, obesidad, dislipidemia, y otras afecciones o trastornos metabólicos en humanos. (Xu et al., 2009 Am J Physiol Endocrinol Metab. 297 : E1105-E1114 ; Revisado en Ryden 2009 Cell Mol Life Sci. 66 : 2067-73) .

FGF21 es una hormona endocrina derivada del hígado que estimula la absorción de la glucosa en los adipocitos y la homeostasis de lípidos a través de la activación de su receptor. De manera interesante, además del receptor canónico FGF, FGFRlc, el receptor FGF21 también consiste de la ß-Klotho asociada a membranas como un cofactor esencial. La activación del receptor FGF21 lleva a efectos benéficos múltiples en una variedad de parámetros metabólicos.

En los mamíferos, los FGFs median su acción por medio de un conjunto de cuatro receptores FGF, FGFR1-4, que a su vez se expresan en múltiples variantes empalmadas. Cada receptor FGF contiene un dominio intracelular de tirosina cinasa que se activa con el enlace a ligandos, lo que conduce a trayectorias de señalización cadena abajo que involucran APKs (Erkl/2), RAF1, AKT1 y STATs. (Kharitonenkov et al., (2008) BioDrugs 22:37-44) . Diversos informes sugirieron que las variantes de empalme del reportero "c" de FGFR1-3 muestran afinidad específica a |¾-Klotho y puede actuar como receptor endógeno para FGF21 (Kurosu et al., (2007) J. Biol . Chem. 282:26687-26695); Ogawa et al., (2007) Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 104:7432-7437); Kharitonenkov et al., (2008) J. Cell Physiol. 215:1-7). En el hígado, que expresa abundantemente tanto ß-Klotho como FGFR4, FGF21 no induce la fosforilación de APK si bien es cierto el fuerte enlace de FGF21 al complejo -Klotho-FGFR4.. En las células 3T3-L1 y el tejido adiposo blanco, FGFR1 es por mucho el receptor más abundante, y es por lo- tanto más probable, que los receptores funcionales principales de FGF21 en este tejido sean los complejos de ß-Klotho/FGFRlc .

La presente descripción proporciona proteínas de enlace, incluyendo proteínas de enlace biespecíficas , que pueden activar la señalización mediada por FGF21, esto es, una proteina de enlace agonista que imita la función de FGF21. Tal proteina de enlace puede ser una molécula con actividad y selectividad, del tipo FGF21 pero con características terapéuticamente deseables añadidas tal como estabilidad de proteínas, carencia de inmunogenicidad, facilidad de producción y vida media prolongada in vivo.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN En un aspecto de la descripción actual se proporciona una proteína de enlace que selectivamente enlaza ß-Klotho. En una modalidad la proteína de enlace comprende una o más de : C[AGP] [APS] [DGN] [ EQ] F [QRT ] C [GNRS ] [GNS] [GT] [GKQS] [-IK]C[ILV] P[LQRV] [AEHP] W [LRV] CDG [ DLV] [DN] DCGD [GN] SDE [AEKPS] [GL PS] [-AEV] [-IT]C; (SEQ ID NO: 254) CLPDEFQC [SG] SGRCIPQ [HT] W [VL] CDGLNDCGDGSDE [ PS] PA [HT] C; (SEQ ID NO: 597) y C[AGPR] [AP] [DGNS] [EQ] F [QRT] C [GSK] N [GT] [GHR] [R]C[ILV] [PS] [ALQ] [NST] W [LRV] CDG [DEV] DDCfGL] DGSDE [AET] [DNS] [-A] [-T] C (SEQ ID NO:249) , en donde los aminoácidos en los paréntesis indican aminoácidos alternativos . en una posición específica y "-" indica ningún aminoácido en la posición específica. En modalidades específicas la proteína de enlace de la reivindicación 1, en donde la proteína de enlace comprende una o más de: CGPDQFRCSSGKCI PQHWLCDGLNDCGDGSDESPATC (SEQ ID NO: 255) CGANEFQCRSTGICVPVEWVCDGDNDCGDGSDEPPVC (SEQ ID NO: 256) CGADQFRCGNGSCVPRAWRCDGVDDCGDGSDEAPEIC (SEQ ID NO: 257) CGPDEFRCNNGQCIPLPWRCDGVDDCGDNSDEPLEIC (SEQ ID NO: 258) CASGEFTCNNGQCVPLAWRCDGVNDCQDGSDEKGC ( SEQ ID NO: 259) ; CGPDEFRCNNGQCIPLPWRCDGVDDCGDNSDEPLEIC (SEQ ID NO: 260) CPPDEFQCRGTKKCLPLAWVCDGDNDCEDDSDEESC (SEQ ID NO: 261) ; CLPDEFQCGSGRCIPQHWLCDGLNDCGDGSDEPPAHC (SEQ ID NO:1237) CLPDEFQCGSGRCIPQHWLCDGLNDCGDGSDEPPAHC (SEQ ID NO:1326) CAPGEFTCKNTGRCIPLN.WRCDGDDDCGDGSDETDC (SEQ ID NO: 1327) ; CGPDEFRCNNGQCI PLPW CDGVDDCGDNSDEPLEIC (SEQ ID NO: 1328) Se proporciona una proteína de enlace que selectivamente enlaza ß-Klotho. En una modalidad la proteína de enlace comprende una o más de: CQSNEFRCRSGRCI PQH LCDGLNDCGDGSDE [ PS ] [PQ] [AQ] [-H]C; (SEQ ID NO: 394) C [ELPQR] [APS] [DGIN] [EGQ] [FQ] [FKPQRT] [-E]C[GNRS] [NS]G[HNQR]C[IV]P[AELPQRV] [AHPQRT ] W [LRV] CDG [ DEV] [DNP ] DC [GLQ] D [DGNS] SDE [AEKT] [DGLNS] [-A] [-H]C; (SEQ ID NO: 217); y C[AGP] [APS] [DGN] [EQ] F [QRT] C [GNRS] [GNS] [GT] [GKQS] [-IK] C[ILV] P [LQRV] [AEHP] W [LRV] CDG [ DLV] [ D ] DCGD [GN ] SDE [AEKPS ] [GL PS] [-AEV] [-IT]C, (SEQ ID NO: 254) en donde los aminoácidos en los paréntesis indican aminoácidos alternativos en una posición especifica y "-" indica ningún aminoácido' en la posición especifica. En modalidades específicas la proteína de enlace comprende una o más de: CQSNEFRCRSGRCIPQHWLCDGLNDCGDGSDESQQC (SEQ ID NO: 159); CRAGEFRCSNGRCVPLTWLCDGEDDCQDNSDEKNC (SEQ ID NO: 1323); CPSNQFPCRSTGICIPLA VCDGLNDCGDGSDESPAHC (SEQ ID NO: 1324); y CQSNEFRCRSGRCIPQHWLCDGLNDCGDGSDEPPAHC (SEQ ID NO: 1325).

En otro aspecto de la descripción actual se proporciona una proteína de enlace gue selectivamente enlaza FGFRlc. En una modalidad la proteína de enlace comprende: CG[AE] [GS] LFTC [GR] [NRS] [AST] [KN] ICIS [EHQS] [AV] W [ IV] CDG [ I V] DDC [ DE ] DNSDE [ DKMNT ] [NSY] C, (SEQ ID NO: 108) en donde los aminoácidos en los paréntesis indican aminoácidos alternativos en una posición específica y "-" indica ningún aminoácido en la posición específica.

En modalidades específicas- la proteína de enlace comprende una o más de: CGAGLFTCRS TNICISQVWV CDGVDDCEDN SDEDSC (SEQ ID NO: 109); CGAGLFTCRS TNICISQA V CDGVDDCEDN SDENYC (SEQ ID NO: 110) ; CGAGLFTCRS TNICISQAWV CDGVDDCEDN SDETNC (SEQ ID NO : 111) ; CGEGLFTCGS TNICISSAWV CDGVDDCEDN SDENNC (SEQ ID NO: 112); CGEGLFTCRS T ICIS.HA V CDGVDDCEDN SDENNC (SEQ ID NO: 113) ; CGEGLFTCRS TNICISEAWI CDGVDDCEDN SDEKNC (SEQ ID NO: 114) ; CGAGLFTCRS AKICISHAWV CDGIDDCEDN SDENNC (SEQ ID NO: 115) ; CGAGLFTCRN SKICISQAWV CDGVDDCDDN SDEKYC (SEQ ID NO: 116) ; CGASLFTCRR SNICISQA V CDGVDDCEDN SDE NC (SEQ ID NO: 117); y CGAGLFTCRS TKICISQAWV CDGVDDCEDN SDEKNC (SEQ ID NO: 118).

La proteina de enlace puede comprender además una ligadura que comprende la secuencia SAPASEPPGSL (SEQ ID NO: 12).

Aún en otras modalidades especificas la proteina de enlace comprende una o más de: CGAGLFTCRSTNICISQVWVCDGV'DDCEDNSDEDSCSAPASEPPGSL (SEQ ID NO: 293); CGAGLFTCRSTNICISQAWVCDGVDDCEDNSDENYCSAPASEPPGSL (SEQ ID NO: 294) ; CGAGLFTCRSTNICISQAWVCDGVDDCEDNSDETNCSAPASEPPGSL (SEQ ID NO: 295); CGEGLFTCGSTNICISSA VCDGVDDCEDNSDENNCSAPASEPPGSL (SEQ ID NO : 448); CGEGLFTCRSTNICISHAWVCDGVDDCEDNSDENNCSAPASEPPGSL (SEQ ID NO: 297) ; CGEGLFTCRSTNICISEAWICDGVDDCEDNSDEKNCSAPASEPPGSL (SEQ ID NO: 449); CGAGLFTCRSAKICISHAWVCDGI DDCEDNSDENNCSAPASEPPGSL (SEQ ID NO: 450) ; CGAGLFTCRNSKICISQA VCDGVDDCDDNSDEKYCSAPASEPPGSL (SEQ ID NO: 464); CGASLFTCRRSNICISQA VCDGVDDCEDNSDEMNCSAPASEPPGSL (SEQ ID NO: 296) ; y CGAGLFTCRSTKICISQAWVCDGVDD'CEDNSDEKNCSAPASEPPGSL (SEQ ID NO: 287).

Aún en otra modalidad la proteína de enlace comprende la secuencia: CGEGLFTCRSTNICISHAWVCDGVDDCEDNSDENNCSAPASEPPGSL (SEQ ID NO: 297) .

En un aspecto adicional de la descripción actual se proporciona una proteína de enlace que selectivamente enlaza ß-Klotho. En una modalidad la proteina de enlace comprende: (a) un primer dominio de enlace ß-Klotho . que comprende una secuencia seleccionada del grupo representado por las secuencias : C[AGP] [APS] [DGN] [EQ] F [QRT] C [GNRS] [GNS] [GT] [GKQS] [-IK]C[ILV]P[LQRV] [AEHP] W [LRV] CDG [DLV] [DN] DCGD [GN] SDE [AEKPS] [GL PS] [-AEV] [-IT] C; (SEQ ID NO: 254) CLPDEFQC [SG] SGRCIPQ [HT] W [VL] CDGLNDCGDGSDE [ PS ] PA [HT] C (SEQ ID NO: 597) C[AGPR] [AP] [DGNS] [EQ] F [QRT] C [GSK] [GT] [GHR] [-R]C[ILV] [PS] [ALQ] [ ST ] W [LRV] CDG [ DEV] DDC [GL] DGSDE [AE ] [DNS] [-A] [ -T ] C (SEQ- ID NO:249) ; y (b) un segundo dominio de enlace ß-Klotho que comprende una secuencia seleccionada del grupo representado por las secuencias : CQSNEFRCRSGRCI PQHWLCDGLN.DCGDGSDE [ PS ] [PQ] [AQ] [-H]C; (SEQ ID NO: 394) C [ELPQR] [APS] [DGIN] [EGQ] [FQ] [FKPQRT] [-E]C[GNRS] [NS]G[HNQR]C[IV]P[AELPQRV] [AHPQRT ] W [LRV] CDG [ DEV] [DNP ] DC[GLQ] D[DGNS] SDE [AEKT] [DGLNS] [-A] [-H]C; (SEQ ID NO: 217); y C[AGP] [APS] [DGN] [EQ] F [QRT] C [GNRS] [GNS] [GT] [GKQS] [-IK]C[ILV] P[LQRV] [AEHP ] W [LRV] CDG [ DLV] [DN] DCGD [GN] SDE [AEKPS] [GL PS] [-AEV] [-IT]C, (SEQ ID NO: 254) en donde los aminoácidos en los paréntesis indican aminoácidos alternativos en una . posición especifica y "-" indica ningún aminoácido en la posición especifica.

En una modalidad la proteina de enlace comprende además al menos una ligadura .que une (a) y (b) . La ligadura puede ser, por ejemplo, uno o más de: ETPT (SEQ ID NO: 1319), GDSHILPFSTPGPST (SEQ ID NO: 14), SAPASEPPGSL (SEQ ID N0:12), PAPT (SEQ ID NO: 1320), QAPT (SEQ ID NO: 1321), AQPT (SEQ ID NO: 1322), AHT, PERT (SEQ ID NO: 7), TTRT (SEQ ID NO: 8), GTTGPT (SEQ ID NO: 9), ETSGPT (SEQ ID NO: 10), SQDPEFHKVS (SEQ ID NO: 11), GRPGPGATSAPAA (SEQ ID NO: 13). En otras modalidades especificas el dominio de enlace ß-Klotho de (a) comprende una o más de: CGPDQFRCSSGKCIPQHWLCDGLNDCGDGSDESPATC (SEQ ID NO: 255); CGANEFQCRSTGICVPVEWVCDGDNDCGDGSDEPPVC (SEQ ID NO: 256); CGADQFRCGNGSCVPRAWRCDGVDDCGDGSDEAPEIC (SEQ ID NO: 257); CGPDEFRCNNGQCI PLPWRCDGVDDCGDNSDEPLEIC (SEQ ID NO: 258); CASGEFTCNNGQCVPLAWRCDGVNDCQDGSDEKGC (SEQ ID NO: 259); CGPDEFRCNNGQCI PLPWRCDGVDDCGDNSDEPLEIC (SEQ ID NO: 260); CPPDEFQCRGTKKCLPLAWVCDGDNDCEDDSDEESC (SEQ ID NO: 261); CLPDEFQCGSGRCIPQHWLCDGLNDCGDGSDEPPAHC ( SEQ I D NO : 1237 ) ; CLPDEFQCGSGRCIPQHWLCDGLNDCGDGSDEPPAHC (SEQ ID NO: 1326); CAPGEFTCKNTGRCIPLNWRCDGDDDCGDGSDETDC (SEQ ID NO:1327); y CGPDEFRCNNGQCIPLPWRCDGVDDCGDNSDEPLEIC (SEQ ID NO: 1328).

Aún en otras modalidades especificas el dominio de enlace ß-Klotho de (b) comprende una o más de: CQSNEFRCRSGRCIPQHWLCDGLNDCGDGSDESQQC (SEQ ID NO: 159); CRAGEFRCSNGRCVPLTWLCDGEDDCQDNSDEKNC (SEQ ID NO: 1323); CPSNQFPCRSTGICIPLAWVCDGLNDCGDGSDESPAHC (SEQ ID NO: 1324); y CQSNEFRCRSGRCIPQHWLCDGLNDCGDGSDEPPAHC (SEQ ID NO: 1325).

Todavía en otro aspecto de la descripción actual se proporciona una proteína de enlace que selectivamente enlaza ß-Klotho y FGFRlc. ' En una modalidad la proteína de enlace comprende (a) uno o más dominios que selectivamente enlaza ß-Klotho, y (b) uno o más dominios que selec ivamente enlaza FGFRlc, en donde la proteína de enlace comprende: (a) un dominio de enlace ß-Klotho que comprende uno o más de: C[AGP] [APS] [DGN] [EQ] F [QRT] C [GNRS ] [GNS] [GT] [GKQS] [- IK]C[ILV] P[LQRV] [AEHP] W [LRV] CDG [DLV] [DN] DCGD [GN] SDE [AEKPS] [GL PS] [-AEV] [-IT]C; (SEQ ID NO: 254) CLPDEFQC [SG] SGRCIPQ [HT] W [VL] CDGLNDCGDGSDE [ PS ] PA [ HT] C; (SEQ ID NO: 597) C[AGPR] [AP] [DGNS] [EQ] F [QRT] C [GSK] N [GT] [GHR] [- R]C[ILV] [PS] [ALQ] [NST] W [LRV] CDG [DEV] DDC [GL] DGSDE [AET] [DNS] [- A][-T]C; (SEQ ID NO : 2 9 ) ; (b) un dominio de enlace FGFRlc que comprende uno o más de: CG[AE] [GS] LFTC [GR] [NRS] [AST] [ KN ] ICIS [ EHQS ] [AV] W [ IV] CDG [ I V ] DDC [ DE ] DNSDE [ DKMNT ] [NSY]C; (SEQ ID NO: 108); y en donde los aminoácidos en los paréntesis indican aminoácidos alternativos en una- posición especifica y "-" indica ningún aminoácido, en la posición especifica. La proteina de enlace puede comprender además al menos una ligadura que une (a) y (b) . En modalidades especificas la ligadura es uno o más de: ETPT (SEQ ID NO: 1319), GDSHILPFSTPGPST (SEQ ID NO: 14), SAPASEPPGSL (SEQ ID NO: 12), PAPT (SEQ ID NO: 1320), QAPT (SEQ ID NO: 1321), AQPT (SEQ ID NO: 1322), AHT, PERT (SEQ ID NO: 7), TTRT (SEQ ID NO: 8), GTTGPT (SEQ ID NO: 9), ETSGPT (SEQ ID NO: 10), SQDPEFHKVS (SEQ ID NO: 11), GRPGPGATSAPAA (SEQ ID NO: 13). En otras modalidades especificas (i) el dominio de enlace ß-Klotho de (a) comprende una o más de: CGPDQFRCSSGKCI PQHWLCDGL DCGDGSDESPATC (SEQ ID NO: 255); CGANEFQCRSTGICVPVEWVCDGDNDCGDGSDEPPVC (SEQ ID NO: 256); CGADQFRCGNGSCVPRAWRCDGVDDCGDGSDEAPEIC (SEQ ID NO: 257); CGPDEFRCNNGQCIPLPWRCDGVDDCGDNSDEPLEIC (SEQ ID NO: 258); CASGEFTCNNGQCVPLAWRCDGVNDCQDGSDEKGC (SEQ ID NO: 259); CGPDEFRCNNGQCIPLPWRCDGVDDCGDNSDEPLEIC (SEQ ID NO: 260); CPPDEFQCRGTKKCLPLAWVCDGDNDCEDDSDEESC (SEQ ID NO: 261); CLPDEFQCGSGRCI PQH LCDGL DCGDGSDEPPAHC (SEQ ID NO : 1237 ) ; CLPDEFQCGSGRCIPQHWLCDGLNDCGDGSDEPPAHC (SEQ ID NO: 1326); CAPGEFTCKNTGRCIPLNWRCDGDDDCGDGSDETDC (SEQ ID NO:1327); y CGPDEFRCNNGQCIPLPWRCDGVDDCGDNSDEPLEIC (SEQ ID NO:1328); y (ii) el dominio de enlace FGFRlc de (b) comprende una o más de: CGAGLFTCRS TNICISQVWV CDGVDDCEDN SDEDSC (SEQ ID NO: 109); CGAGLFTCRS TNICISQAWV CDGVDDCEDN SDENYC (SEQ ID NO: 110); CGAGLFTCRS T ICISQAWV CDGVDDCEDN SDETNC (SEQ ID NO: 111) ; CGEGLFTCGS TNICISSAWV CDGVDDCEDN SDENNC (SEQ ID NO: 112) ; CGEGLFTCRS TNICISHAWV CDGVDDCEDN SDENNC (SEQ ID NO: 113) ; CGEGLFTCRS TNICISEAWI CDGVDDCEDN SDEKNC (SEQ ID NO: 114) ; CGAGLFTCRS AKICISHAWV CDGIDDCEDN SDENNC (SEQ ID NO: 115); CGAGLFTCRN SKICISQAWV CDGVDDCDDN SDEKYC (SEQ ID NO: 116); CGASLFTCRR SNICISQAWV CDGVDDCEDN SDEMNC (SEQ ID NO: 117); y CGAGLFTCRS TKICISQAWV CDGVDDCEDN SDEKNC (SEQ ID NO: 118) .

Todavía en otras modalidades especificas el dominio de enlace FGFRlc de (b) comprende además una ligadura que comprende la secuencia SAPASEPPGSL (SEQ ID NO: 12) . Aún en otras modalidades específicas el dominio de enlace FGFRlc comprende una o más de: CGAGLFTCRSTNICISQVWVCDGVDDCEDNSDEDSCSAPASEPPGSL (SEQ ID NO: 293); CGAGLFTCRSTNICISQAWVCDGVDDCEDNSDENYCSAPASEPPGSL (SEQ ID NO: 294); CGAGLFTCRSTNICISQAWVCDGVDDCEDNSDETNCSAPASEPPGSL (SEQ ID NO: 295); CGEGLFTCGSTNICISSAWVCDGVDDCEDNSDENNCSAPASEPPGSL (SEQ ID NO: 448); CGEGLFTCRSTNICISHAWVCDGVDDCEDNSDENNCSAPASEPPGSL (SEQ ID NO: 297) ; CGEGLFTCRSTNICISEAWICDGVDDCEDNSDEKNCSAPASEPPGSL (SEQ ID NO: 449); CGAGLFTCRSAKICISHA VCDGI DDCEDNSDENNCSAPASEPPGSL (SEQ ID O: 450); CGAGLFTCRNSKICISQAWVCDGVDDCDDNSDEKYCSAPASEPPGSL (SEQ ID O: 464); CGASLFTCRRSNICISQAWVCDGVDDCEDNSDE NCSAPASEPPGSL (SEQ ID NO : 296); y CGAGLFTCRSTKICISQA VCDGVDDCEDNSDEKNCSAPASEPPGSL (SEQ ID NO: 287) .

Todavía en otro aspecto de la descripción actual se proporciona una proteína de enlace que selectivamente enlaza ß-Klotho y FGFRlc que comprende (a) uno o más dominios que selectivamente enlaza ß-Klotho, y (b) uno o más dominios que selectivamente enlaza FGFRlc. En una modalidad la proteína de enlace comprende: (a) un dominio de enlace ß-Klotho que comprende uno o más de: CQSNEFRCRSGRCIPQHWLCDGLNDCGDGSDE [PS] [PQ] [AQ] [-H]C; (SEQ ID NO: 394) C [ELPQR] [APS] [DGIN] [EGQ] [FQ] [FKPQRT] [-E]C[GNRS] [NS] G [HNQR] C [IV] P [AELPQRV] [AHPQRT ] W [LRV] CDG [ DEV] [DNP ] DC [GLQ] D [DGNS] SDE [AEKT] [DGLNS] [-A] [-H]C; ( SEQ ID NO: 217); C[AGP] [APS] [DGN] [EQ] F [QRT] C [GNRS] [GNS ] [GT] [GKQS] [-IK]C[ILV] P [LQRV] [AEHP] W [LRV] CDG [ DLV] [ D ] DCGD [G ] SDE [AEKPS ] [GL PS] [-AEV] [-IT]C; (SEQ ID NO: 254) y (b) un dominio de enlace FGFRlc que comprende una secuencia seleccionada del grupo representado por la secuencia: CG[AE] [GS]LFTC'[GR] [NRS] [AST] [ KN ] ICIS [ EHQS ] [AV] W [ IV] CDG [ I V] DDC [ DE ] DNSOE [ DKMNT ] [NSY]C; (SEQ ID NO : 108) en donde los aminoácidos en los paréntesis indican aminoácidos alternativos en una- posición especifica y "-" indica ningún aminoácido, en la posición especifica. La proteina de enlace puede comprender además al menos una ligadura que une (a) y (b) . En modalidades especificas la ligadura es. uno o más de: ETPT (SEQ ID NO: 1319), GDSHILPFSTPGPST (SEQ ID NO: 14), SAPASEPPGSL (SEQ ID NO: 12), PAPT (SEQ ID NO-.1320), QAPT (SEQ ID NO:1321), AQPT (SEQ ID NO: 1322), AHT, PERT (SEQ ID NO: 7), TTRT (SEQ ID NO: 8), GTTGPT (SEQ ID NO: 9), ETSGPT (SEQ ID NO: 10), SQDPEFHKVS (SEQ ID NO: 11), GRPGPGATSAPAA (SEQ ID NO: 13). En modalidades particulares (i) el dominio de enlace ß-Klotho de (a) comprende una o más de: CQSNEFRCRSGRCI PQHWLCDGL DCGDGSDESQQC (SEQ ID NO: 159) ; CRAGEFRCSNGRCVPLTWLCDGEDDCQDNSDEKNC (SEQ ID NO: 1323); CPSNQFPCRSTGICIPLAWVCDGLNDCGDGSDESPAHC (SEQ ID NO:1324); y CQSNEFRCRSGRCI PQHWLCDGLNDCGDGSDEPPAHC (SEQ ID NO: 1325); y (ii) el dominio de enlace FGFRlc de (b) comprende una o más de: CGAGLFTCRS TNICISQVWV CDGVDDCEDN SDEDSC (SEQ ID NO: 109) ; CGAGLFTCRS TNICISQAWV CDGVDDCEDN SDENYC (SEQ ID NO: 110) ; CGAGLFTCRS TNICISQAWV CDGVDDCEDN SDETNC (SEQ ID NO: 111); CGEGLFTCGS TNICISSAWV CDGVDDCEDN SDENNC (SEQ ID NO: 112) ; CGEGLFTCRS TNICISHAWV CDGVDDCEDN SDENNC (SEQ ID NO: 113) ; CGEGLFTCRS TNICISEAWI CDGVDDCEDN SDEKNC (SEQ ID NO: 114) ; CGAGLFTCRS AKICISHA V CDGIDDCEDN SDENNC (SEQ ID NO: 115) ; CGAGLFTCRN SKICISQAWV CDGVDDCDDN SDEKYC (SEQ ID NO: 116); CGASLFTCRR SNICISQAWV CDGVDDCEDN SDEMNC (SEQ ID NO: 117) ; y CGAGLFTCRS TKICISQAWV CDGVDDCEDN SDEKNC (SEQ ID NO: 118) .

El dominio de enlace FGFRlc de (b) puede comprender además una ligadura; en una modalidad la ligadura comprende la secuencia SAPASEPPGSL (SEQ ID NO: 12) . En modalidades particulares el dominio de enlace. FGFRlc comprende una o más de: CGAGLFTCRSTNICISQVWVCDGVDDCEDNSDEDSCSAPASEPPGSL (SEQ ID NO: 293); CGAGLFTCRSTNICISQAWVCDGVDDCEDNSDENYCSAPASEPPGSL (SEQ ID NO: 294); CGAGLFTCRSTNICISQA VCDGVDDCEDNSDETNCSAPASEPPGSL (SEQ ID NO: 295); CGEGLFTCGSTNICISSAWVCDGVDDCEDNSDENNCSAPASEPPGSL (SEQ ID NO : 448) ; CGEGLFTCRSTNICISHAWVCDGVDDCEDNSDENNCSAPASEPPGSL (SEQ ID NO: 297); CGEGLFTCRSTNICISEAWICDGVDDCEDNSDEKNCSAPASEPPGSL (SEQ ID NO : 449 ) ; CGAGLFTCRSAKICISHAWVCDGIDDCEDNSDENNCSAPASEPPGSL ( SEQ ID NO: 450); CGAGLFTCRNSKICISQAWVCDGVDDCDDNSDEKYCSAPASEPPGSL (SEQ ID NO: 464); CGASLFTCRRSNICISQAWVCDGVDDCEDNSDEMNCSAPASEPPGSL (SEQ ID NO: 296); y CGAGLFTCRSTKICISQAWVCDGVDDCEDNSDEKNCSAPASEPPGSL (SEQ ID NO: 287) .

Todavía en otro aspecto se proporciona una proteina de enlace que selectivamente enlaza ß-Klotho y FGFRlc que comprende (a) uno o más dominios que selectivamente enlaza ß-Klotho, y (b) uno. o más dominios que selectivamente enlaza FGFRlc. En una modalidad la proteína de enlace comprende: (a) un dominio de enlace . -Klotho que comprende: (i) un primer dominio de enlace que comprende uno o más de: C[AGP] [APS] [DGN] [EQ] F [QRT] C [GNRS] [GNS] [GT] [GKQS] [-IK]C[ILV] P [LQRV] [AEHP] W [LRV] CDG [DLV] [DN] DCGD [GN] SDE [AEKPS] [GL PS] [-AEV] [-IT]C; (SEQ ID NO: 254); CLPDEFQC [SG] SGRCIPQ [HT] W [VL] CDGLNDCGDGSDE [ PS] PA [HT] C; (SEQ ID NO: 597) ; C[AGPR] [AP] [DGNS] [ EQ] F [QRT ] C [GSK] N [GT ] [GHR] [-R]C[ILV] [PS] [ALQ] [NST ] W [LRV] CDG [ DEV] DDC [GL ] DGSDE [AET ] [DNS] [-A] [-T]C; (SEQ ID NO:249); (ii) un segundo dominio de enlace que comprende uno o más de: CQSNEFRCRSGRCI PQH LCDGLNDCGDGSDE [ PS ] [PQ] [AQ] [-H]C; (SEQ ID NO: 394) ; C [ELPQR] [APS] [DGIN] [EGQ] [FQ] [FKPQRT] [-E]C[GNRS] [NS]G[HNQR]C[IV]P[AELPQRV] [AHPQRT] W [LRV] CDG [DEV] [DNP ] DC[GLQ]D [DGNS] SDE [AEKT] [DGLNS] [-A] Í-H]C; (SEQ ID NO: 217); C[AGP] [APS] [DGN] [EQ] F [QRT] C [GNRS] [GNS] [GT] [GKQS] [-IK]C[ILV] P[LQRV] [AEHP] W [LRV] CDG [ DLV] [DN] DCGD [GN] SDE [AEKPS] [GL PS] [-AEV] [-IT]C; (SEQ ID NO: 254);. y (iii) una ligadura que une el primer dominio de enlace y el segundo dominio de enlace; y (b) un dominio de enlace FGFRlc que comprende una secuencia seleccionada del grupo representado por la secuencia: C6[AE] [GS] LFTC [GR] [NRS] [AST] [KN] ICIS [EHQS] [AV] W [ IV] CDG [ I ] DDC [ DE ] NSOE [ DKMNT ] [NSY]C; (SEQ ID NO: 108) y (c) una ligadura que une las secuencias de (a) y (b) , en donde los aminoácidos en los paréntesis indican aminoácidos alternativos en una posición especifica y "-" indica ningún aminoácido' en la posición especifica. En modalidades particulares el primer dominio de enlace de (a) comprende una o más de: CGPDQFRCSSGKCIPQHWLCDGLNDCGDGSDESPATC (SEQ ID NO: 255); CGANEFQCRSTGICVPVEWVCDGDNDCGDGSDEPPVC (SEQ ID NO: 256) ; CGADQFRCGNGSCVPRAWRCDGVDDCGDGSDEAPEIC (SEQ ID NO: 257); CGPDEFRCNNGQCI PLP RCDGVDDCGDNSDEPLEIC (SEQ ID NO: 258); CASGEFTCNNGQCVPLA RCDGVNDCQDGSDEKGC (SEQ ID NO: 259); CGPDEFRCNNGQCI PLPWRCDGVDDCGDNSDEPLEIC (SEQ ID NO: 260); CPPDEFQCRGTKKCLPLAWVCDGDNDCEDDSDEESC (SEQ ID NO: 251); CLPDEFQCGSGRCIPQHWLCDGLNDCGDGSDEPPAHC (SEQ ID NO: 1237); CLPDEFQCGSGRCI PQHWLCDGL DCGDGSDEPPAHC (SEQ ID NO: 1326); CAPGEFTCKNTGRCIPLNWRCDGDDDCGDGSDETDC (SEQ ID NO:1327); y CGPDEFRCNNGQCI PLPWRCDGVDDCGDNSDEPLEIC (SEQ ID NO: 1328).

En otras modalidades particulares el segundo dominio de enlace de (a) comprende una o más de: CQSNEFRCRSGRCI PQHWLCDGLNDCGDGSDESQQC (SEQ ID NO: 159); CRAGEFRCSNGRCVPLTWLCDGEDDCQDNSDEKNC (SEQ ID NO: 1323) CPSNQFPCRSTGICIPLAWVCDGLNDCGDGSDESPAHC (SEQ ID NO:1324); y CQSNEFRCRSGRCI PQHWLCDGLNDCGDGSDEPPAHC (SEQ ID NO: 1325) .

Aún en otras modalidades la ligadura de (a) comprende una o más de: ETPT (SEQ ID NO: 1319), GDSHILPFSTPGPST (SEQ ID NO: 14), SAPASEPPGSL (SEQ ID NO: 12), PAPT (SEQ ID NO: 1320) y QAPT (SEQ ID NO: 1321). Todavía en modalidades adicionales el dominio de enlace FGFRlc comprende una o más de: CGAGLFTCRS TNICISQV V CDGVDDCEDN SDEDSC (SEQ ID NO: 109); CGAGLFTCRS TNICISQAWV CDGVDDCEDN SDENYC (SEQ ID NO: 110); CGAGLFTCRS TNICISQAWV CDGVDDCEDN SDETNC (SEQ ID NO: 111) ; CGEGLFTCGS TNICISSAWV CDGVDDCEDN SDENNC (SEQ ID NO: 112) ; CGEGLFTCRS TNICISHAWV CDGVDDCEDN SDENNC (SEQ ID NO: 113) ; CGEGLFTCRS TNICISEAWI CDGVDDCEDN SDEKNC (SEQ ID NO : 114) ; CGAGLFTCRS AKICISHAWV CDGIDDCEDN SDENNC (SEQ ID NO: 115) ; CGAGLFTCRN SKICISQAWV CDGVDDCDDN SDEKYC (SEQ ID NO : 116) ; CGASLFTCRR SNICISQAWV CDGVDDCEDN SDEMNC (SEQ ID NO : 117) ; y CGAGLFTCRS TKICISQAWV CDGVDDCEDN SDEKNC (SEQ ID NO : 118) .

El dominio de enlace FGFRlc puede comprender además una ligadura que comprende la secuencia SAPASEPPGSL (SEQ ID NO: 12) y, en modalidades especificas puede comprender uno o más de: CGAGLFTCRSTNICISQVWVCDGVDDCEDNSDEDSCSAPASEPPGSL (SEQ ID NO: 293); CGAGLFTCRSTNICISQA VCDGVDDCEDNSDENYCSAPASEPPGSL (SEQ ID NO : 294); CGAGLFTCRSTNICISQAWVCDGVDDCEDNSDETNCSAPASEPPGSL ( SEQ ID NO: 295) ; CGEGLFTCGSTNICISSAWVCDGVDDCEDNSDENNCSAPASEPPGSL (SEQ ID NO : 448); CGEGLFTCRSTNICISHAWVCDGVDDCEDNSDENNCSAPASEPPGSL (SEQ ID NO: 297); CGEGLFTCRSTNICISEAWICDGVDDCEDNSDEKNCSAPASEPPGSL (SEQ ID NO: 449) ; CGAGLFTCRSAKICISHAWVCDGIDDCEDNSDENNCSAPASEPPGSL (SEQ ID NO: 450); CGAGLFTCRNSKICISQAWyCDGVDDCDDNSDEKYCSAPASEPPGSL (SEQ ID NO: 464); CGASLFTCRRSNICISQAWVC.DGVDDCEDNSDEMNCSAPASEPPGSL (SEQ ID NO: 296); y CGAGLFTCRSTKICISQAWVCDGVDDCEDNSDEKNCSAPASEPPGSL (SEQ ID NO: 287) . Por ejemplo, el dominio de enlace FGFRlc puede comprender uno o más de: CGEGLFTCRSTNICISHAWVCDGVDDCEDNSDENNCSAPASEPPGSL (SEQ ID NO: 297). Todavía en modalidades adicionales la ligadura de (c) puede comprender uno o más de: AQPT (SEQ ID NO: 1322), AHT, PERT (SEQ ID NO: 7), TTRT (SEQ ID NO: 8), GTTGPT (SEQ ID NO: 9), ETSGPT (SEQ ID NO: 10), · SQDPEFHKVS (SEQ ID NO: 11), SAPASEPPGSL (SEQ ID NO: 12), GRPGPGATSAPAA (SEQ ID NO: 13), y GDSHILPFSTPGPST (SEQ ID NO: 14). En una modalidad particular la proteína de enlace comprende la secuencia: CGADQFRCGNGSCVPRAWRCDGVDDCGDGSDEAPEICETPTCQSNEFRCRSGRCIPQHWLC DGLNDCGDGSDESQQCSAPASEPPGSLCGEGLFTCRSTNICISHAWVCDGVDDCEDNSDEN NCSAPASEPPGSL (SEQ ID NO: 359) . En otra modalidad particular la proteína de enlace comprende la secuencia: CLPDEFQCGSGRCIPQHWLCDGLNDCGDGSDEPPAHCSAPASEPPGSLCRAGEFRCSNGRC VPLTWLCDGEDDCQDNSDEKNCAQPTCGEGLFTCRSTNICISHAWVCDGVDDCEDNSDENN CSAPASEPPGSL (SEQ ID NO:339).' Aún en otra modalidad particular la proteína de enlace comprende la secuencia: CAPGEFTCKNTGRCIPLN RCDGDDDCGDGSDETDCPAPTCPSNQFPCRSTGICIPLA VC DGLNDCGDGSDESPAHCSAPASEPPGSLCGEGLFTCRSTNICISHAWVCDGVDDCEDNSDE NNCSAPASEPPGSL (SEQ ID NO:1270). . Todavía en una modalidad particular adicional la proteína de enlace comprende la secuencia: CGPDEFRCNNGQCIPLPWRCDGVDDCGDNSDEPLEICQAPTCQSNEFRCRSGRCIPQHWLC DGL DCGDGSDEPPAHCSAP SEPPGSLCGEGLFTCRSTNICI SHAWVCDGVDDCEDNSDE NNCSAPASEPPGSL (SEQ ID NO: 1271).

En otro aspecto se proporciona una proteína de enlace que comprende: (Bl)a-(Ll)x-(B2)b-(L2)y-(lC)c-(L3)z en donde a, b, c, x, y, y z es 0, 1, o 2, sin embargo con la condición de que al menos uno de a, b, y c es 1 o 2; en donde Bl es una secuencia de aminoácidos que comprende uno o más de: C [AGP] [APS ] [ DGN] [EQ] F [QRT] C [GNRS ] [GNS ] [GT] [GKQS ] [ -IK]C[ILV] P[LQRV] [AEHP] W [LRV] CDG [ DLV] [ DN ] DCGD [GN ] SDE [AEKPS ] [GL PS] [-AEV] [-IT] C (SEQ ID NO: 254); CLPDEFQC[SG]SGRCIPQ[HT]W[VL]CDGLNDCGDGSDE[PS]PA[HT]C (SEQ ID NO: 597); y C[AGPR] [AP] [DGNS] [EQ] F [QRT] C [GSK] N [GT] [GHR] [R]C[ILV] [PS] [ALQ] [NST] [LRV] CDG [DEV] DDC [GL] DGSDE [AET] [DNS] [-A] [-T]C (SEQ ID NO: 249); en donde B2 es una secuencia de aminoácidos que comprende uno o más de: CQSNEFRCRSGRCIPQHWLCDGL DCGDGSDE [ PS] [PQ] [AQ] [-H]C (SEQ ID NO: 394) ; C [ELPQR] [APS] [DGIN] [EGQ] [FQ] [FKPQRT] [- E]C[GNRS] [NS] G [HNQR] C [IV] P [AELPQRV] [AHPQRT] [LRV] CDG [DEV] [DNP ] DC [GLQ] D [DGNS] SDE [AEKT] [DGLNS] [-A] [-H]C (SEQ ID NO: 217); y C[AGP] [APS] [DGN] [EQ] F [QR ] C [GNRS] [GNS] [GT] [GKQS] [-IK]C[ILV] P[LQRV] [AEHP ] W [ LRV] CDG [ DLV] [DN] DCGD [GN] SDE [AEKPS] [GL PS] [-AEV] [-IT] C (SEQ ID NO: 254);- en donde los aminoácidos en los paréntesis indican . aminoácidos alternativos en una posición específica y' "-" indica ningún aminoácido en la posición específica; en donde 1C es una secuencia de aminoácidos que comprende C6[AE] [GS ] LFTC [GR] . [NRS] [AST] [ K ] ICIS [ EHQS ] [AV] W [ IV] CDG [ IV] DDC [ DE ] DNSDE [ DKMNT ] [NSY]C (SEQ ID NO: 108); en donde los aminoácidos en los paréntesis indican aminoácidos alternativos en una posición específica y "-" indica ningún aminoácido en la posición específica; en donde Ll es una secuencia de aminoácidos que comprende uno o más de: ETPT (SEQ ID NO: 1319), GDSHILPFSTPGPST (SEQ ID NO: 14), SAPASEPPGSL (SEQ ID NO: 12), PAPT (SEQ ID NO: 1320) y QAPT (SEQ ID NO: 1321); en donde L2 es una secuencia de aminoácidos que comprende uno o más de: AQPT (SEQ ID NO: 1322), AHT, PERT (SEQ ID NO: 7), TTRT (SEQ ID NO: 8), GTTGPT (SEQ ID NO: 9), ETSGPT (SEQ ID NO: 10), SQDPEFHKVS (SEQ ID NO: 11), SAPASEPPGSL (SEQ ID NO: 12), GRPGPGATSAPAA (SEQ ID NO: 13), y GDSHILPFSTPGPST (SEQ ID NO: 14); y en donde L3 es SAPASEPPGSL.

En un aspecto adicional, las proteínas de enlace proporcionadas en la presente pueden comprender además una porción que extiende la vida media que incrementa la vida media en suero de la proteína de enlace en un mamífero comparada con la vida media en suero de la proteína de enlace que carece de la porción que extiende la vida media en un mamífero. Por ejemplo, la porción que extiende la vida media es una o más de: polietilen glicol (PEG), albúmina de suero humana (HSA) , una inmunoglobulina (IgG), y una porción Fe. La porción que extiende la vida media también puede comprender una secuencia de proteína que específicamente enlaza un factor de sangre, tal como albúmina de suero, una inmunoglobulina o un eritrocito.

En otro aspecto la proteína de enlace puede comprender una secuencia de aminoácidos que comprende uno o más aminoácidos que no se presentan naturalmente.

También se proporciona un polinucleótido que codifica una proteína de enlace que comprende, en varias modalidades, uno o más de: (a) un dominio de' enlace ß-Klotho; (b) un dominio de enlace FGFRlc; (c) uno o más dominios de enlace ß-Klotho y un dominio de enlace FGFRlc; y (c) una proteína de enlace que comprende la secuencia de aminoácidos CGADQFRCGNGSCVPRAWRCDGVDDCGDGSDEAPEICETPTCQSNEFRCRSGRCIPQH LC DGLNDCGDGSDESQQCSAPASEPPGSLCGEGLFTCRSTNICISHA VCDGVDDCEDNSDEN NCSAPASEPPGSL (SEQ ID NO: 359); CLPDEFQCGSGRCIPQHWLCDGLNDCGDGSDEPPAHCSAPASEPPGSLCRAGEFRCSNGRC VPLTWLCDGEDDCQDNSDEKNCAQPTCGEGLFTCRSTNICISHAWVCDGVDDCEDNSDENN CSAPASEPPGSL . (SEQ ID NO:339); CAPGEFTCKNTGRCIPLNWRCDGDDDCGDGSDETDCPAPTCPSNQFPCRSTGICIPLAWVC DGLNDCGDGSDESPAHCSAPASEPPGSLCGEGLFTCRSTNICISHAWVCDGVDDCEDNSDE NNCSAPASEPPGSL . (SEQ ID NO:1270); o CGPDEFRCNNGQCIPLPWRCDGVDDCGDNSDEPLEICQAPTCQSNEFRCRSGRCIPQHWLC DGLNDCGDGSDEPPAHCSAPASEPPGSLCGEGLFTCRSTNICISHAWVCDGVDDCEDNSDE NNCSAPASEPPGSL (SEQ ID NO: 1271). Las proteínas de enlace codificadas también pueden comprender una porción que extiende la vida media. También se proporcionan un vector de expresión que comprende cualquiera de los polinucleótidos proporcionados, así como células hospederas que comprenden el vector de expresión. También se proporciona un método para hacer una proteína de enlace y comprende incubar las células hospederas descritas bajo condiciones adecuadas para inducir expresión de la proteína de enlace, y opcionalmente aislar el polipéptido expresado.

En otro aspecto, ' se proporciona una composición farmacéutica y en modalidades particulares comprende: (a) una proteína de enlace proporcionada en la presente; y (b) un agente de formulación farmacéuticamente aceptable. El agente de formulación farmacéuticamente aceptable puede ser un portador, adyuvante, solubilizador, estabilizador, o antioxidante.

Todavía en un aspecto adicional se proporciona un método para tratar un trastornó metabólico. El método comprende administrar a un paciente humano que necesita del mismo las composiciones farmacéuticas descritas. El trastorno metabólico puede ser, por ejemplo, uno o más de: diabetes, obesidad, dislipidemia , hipertensión, hepatosteaotosis , esteatohepatitis no alcohólica (NASH) , pancreatitis aguda, síndrome metabólico, enfermedad cardiovascular, tal como ateroesclerosis , y envejecimiento. En una modalidad específica el trastorno metabólico es diabetes, y en otra modalidad específica el trastorno metabólico es obesidad.

En un aspecto la descripción actual proporciona proteínas de enlace, monómeros y multímeros que comprenden secuencias de aminoácidos que son al menos 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, o 99% idénticos a las secuencias de aminoácidos de la proteína de enlaces, monómeros y multímeros descritos en la presente.

En otro aspecto, las proteínas de enlace, monómeros y multímeros descritos en la presente son recombinantes, y de esta manera no se encuentran en la naturaleza. Tales proteínas de enlace, monómeros y multímeros se preparan por ingeniería como se describen en la presente.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La Figura 1 es un dibujo que esquemáticamente representa cómo las proteínas de enlace descritas en la presente imitan la actividad de señalización in vivo de FGF21.

La Figura 2 es una alineación de la secuencia de aminoácidos parcial de una variedad los dominios de clase A del receptor LDL (SEQ- ID NOS 768-780, respectivamente, en orden de aparición) para demostrar las cisteínas. conservadas. La conectividad de cisteínas en los tres enlaces de disulfuro del dominio plegado se ilustra esquemáticamente en la secuencia de consenso. Los residuos cuyas cadenas laterales contribuyen al enlace de calcio se designaron con un asterisco en la secuencia de consenso.

La Figura 3, panel A es una secuencia que ilustra esquemáticamente un ejemplo de un dominio A. El panel A esquemáticamente ilustra aminoácidos conservados en un dominio A de alrededor de 40 aminoácidos de largo. Los residuos de cisteína conservados se indican por C, y los aminoácidos negativamente cargados conservados se indican por un círculo con un signo de menos ("-") . Los círculos con una "H" indican residuos hidrofóbicos conservados. El panel B es un dibujo que ilustra esquemáticamente dos dominios A plegados conectados por medio de una ligadura. El panel B también destaca dos sitios de enlace a calcio, círculos oscuros con Ca+2, y tres enlaces de disulfuro dentro de cada dominio A plegado durante un total de 6 enlaces de disulfuro.

La Figura 4 es una lista que destaca algunos de los ligandos reconocidos por miembros que se presentan naturalmente de la familia del receptor LDL, que incluyen inhibidores, proteasas, complejos de proteasa, complejos de vitamina-portador, proteínas involucradas en el metabolismo de lipoproteína, ligandos no humanos, antibióticos, virus, y otros .

La Figura 5 es una alineación de dominios A (SEQ ID NOS 781-966, 1241 y 967-996, respectivamente, en orden de aparición). En la parte superior de la figura, las letras pequeñas (a-q) indican residuos conservados.

La Figura 6 es un dibujo que ilustra esquemáticamente un esquema general para identificar dominios de monómero que enlazan a una proteína objetivo, aislar los dominios de monómero seleccionados, crear multímeros de los dominios de monómero seleccionados al unir los dominios de monómero seleccionados en varias combinaciones y seleccionan los multímeros para identificar multímeros que comprenden más de un monómero que enlaza a un ligando.

La Figura 7 es un dibujo que ilustra esquemáticamente una estrategia de selección guiada. Se identifica un dominio de monómero con propiedades de enlace apropiadas de una biblioteca de dominios de monómero. El dominio de monómero identificado luego se liga a dominios de monómero de una colección nativa de dominios de monómero para formar una colección de multimeros. La colección de multimero se selecciona para identificar un par de dominios de monómero que enlaza simultáneamente al objetivo. Este proceso luego puede repetirse hasta que las propiedades de enlace óptimas se obtienen en el multimero.

La Figura 8 es un dibujo que representa una conformación posible de un multimero de la descripción actual que comprende al menos un dominio de monómero que enlaza a una molécula que extiende la vida media y uno o más dominios de monómero enlazados a una o más moléculas objetivo (por ejemplo, ß-Klotho y FGFRlc) . En la figura, dos dominios de monómero enlazan a una primera molécula objetivo (Objetivo 1) y un dominio de monómero enlaza, a una segunda molécula objetivo (Objetivo 2); el dominio de monómero que enlaza a una molécula que extiende- la vida media puede colocarse en ya sea la terminal N o C del multimero.

La Figura 9 es una tabla que representa ejemplos de varias secuencias dé ligadura que pueden formar un elemento de una proteina de enlace de la descripción actual; se muestran ligaduras que comprenden 4 residuos; 6 residuos; 9 residuos (SEQ ID NO: 18), 11 residuos (SEQ ID NO: 12), 13 residuos (SEQ ID NO: 13) y 15 residuos (SEQ ID NO: 14).

La Figura 10 es una tabla que representa monómeros de enlace FGFRlc identificados (SEQ ID NOS 997-1029, respectivamente, en orden de aparición) y sus propiedades; las secuencias comprenden ' la etiqueta de purificación SLQKASGALEHHHHHHHH (SEQ ID NO: 1)..

La Figura 11 es una tabla que representa monómeros de enlace ß-Klotho identificados derivados de la inmunoadsorción de la biblioteca de andamiaje Al nativa (SEQ ID NOS 1030-1066, respectivamente, en orden de aparición) y sus propiedades; las secuencias comprenden la etiqueta de purificación SLQKASGALEHHHHHHHH (SEQ ID NO: 1) .

La Figura 12 es una tabla que representa monómeros de enlace ß-Klotho identificados derivados de la inmunoadsorción de la biblioteca de andamiaje LNR nativa (SEQ ID NOS: 1166 y 1299-1318, respectivamente, en orden de aparición) y sus propiedades; las secuencias comprenden la etiqueta de purificación SLQKASGALEHHHHHHHH (SEQ ID. NO: 1) .

La Figura 13 es una tabla que representa monómeros de enlace ß-Klotho (SEQ ID NOS 1067-1098, respectivamente, en orden de aparición) generados al mutar los . monómeros de enlace ß-Klotho M01, M25, M42 y M50 (SEQ ID NOS 493, 519 y 305-306, respectivamente, en orden de aparición) ; las secuencias comprenden la etiqueta de purificación SLQKASGALEHHHHHHHH (SEQ ID NO: 1) .

La Figura 14 es una tabla que representa proteínas de enlace que enlazan ß-Klotho diméricas (SEQ ID NOS 1099-1159, respectivamente, en orden de aparición) generadas basadas en los monómeros de enlace ß-Klotho M01 (SEQ ID NO: 493), M06 (SEQ ID NO: 499), M08 (SEQ ID NO: 694), M21 (SEQ ID NO: 508), M42 (SEQ ID NO: 305) y M50 (SEQ ID NO:306), así como los valores EC50 asociados.

La Figura 15 es una tabla que representa las secuencias de proteínas de enlace (SEQ ID NOS 1160-1179, respectivamente, en orden de aparición) que comprende monómeros M03 de enlace FGFRlc (SEQ ID NO: 287), M08 (SEQ ID NO: 694), M15 (SEQ ID NO:289), M23 (SEQ ID NO: 290), M31 (SEQ ID NO: 291) y M33 (SEQ ID NO: 292), monómeros de enlace ß-Klotho newM03, mutM07, mutM19 y RI M02, y dímeros de enlace ß-Klotho D01 (SEQ ID NO: 11Q7), D02 (SEQ ID NO: 1108), D31 (SEQ ID NO: 1143), D02 (SEQ ID NO: 1140), D05 (SEQ ID NO: 1155), D06 (SEQ ID NO: 1105), D07 ( SEQ ID NO: 1156), D09 (SEQ ID NO: 1123), WD25 (SEQ ID NO: 640) y D25 (SEQ ID NO: 1129) usados para generar proteínas de enlace con propiedades potenciadas; las secuencias comprenden la etiqueta de purificación SLQKASGALEHHHHHHHH (SEQ ID NO: 1) .

La Figura 16 es una tabla que representa las propiedades de las proteínas de enlace mostradas en la Figura 15.

La Figura 17 es un esquemático que representa un ensayo de enlace AlphaScreen de proteina Fc-receptor.

La Figura 18 es un esquemático que representa un ensayo de enlace AlphaScreen de proteina objetivo biotinilado.

La Figura 19 es un esquemático que representa un ensayo de inhibición independiente del ligando AlphaScreen.

La Figura 20 es un esquemático que representa un ensayo de inhibición dependiente del ligando AlphaScreen.

La Figura 21 es un esquemático que representa un ensayo de inhibición dependiente del ligando AlphaScreen para proteínas de enlace que comprenden un dominio de vida media de monómero antihuIgG.

La Figura 22 es una tabla que representa proteínas de enlace (SEQ ID NOS 1180-1200, respectivamente, en orden de aparición) que comprende monómeros de enlace ß-Klotho 01 (SEQ ID NO: 493), M42 (SEQ ID NO: 305) y M50 (SEQ ID NO: 306) con monómero M15 de ' enlace FGFRlc (SEQ ID NO: 510) en varias configuraciones con ya sea ligadura no lineal o con una G4S (SEQ ID NO: 2), (G4S)2 (SEQ ID NO: 3) o (G4S)3 (SEQ ID NO: 4); las secuencias comprenden la etiqueta de purificación, SLQKASGALEHHHHHHHH (SEQ ID NO: 1) .

La Figura 23 es una tabla que representa las propiedades de las proteínas de enlace mostradas en la Figura 22 (SEQ ID NOS 1180-1200, respectivamente, en orden de aparición) . (1XG4S) descritas como SEQ ID NO: 2, (2XG4S) descritas como SEQ ID NO: 3) y (3XG4S) descritas como SEQ ID NO: 4.

La Figura 24 es una serie de gráficas generadas usando ensayos ELISA que demuestran que las proteínas de enlace C2114 (SEQ ID NO: 1180), C2122 (SEQ ID NO: 1183), C2116 (SEQ ID NO: 1187), C2120 (SEQ ID NO: 1188), C2117 (SEQ ID NO: 1195) y C2121 (SEQ ID NO: 1196) . tienen la capacidad de enlazar tanto FGFRlc como ß- lotho. 3XG4S se describe como SEQ ID NO: 4 y 1XG4S se describe como SEQ ID NO: 2.

La Figura 25 es una serie de gráficas generadas usando ensayos Alphascreen que demuestran que las proteínas de enlace C2114 (SEQ ID .NO: 1180), C2122 (SEQ ID NO: 1183), C2116 (SEQ ID NO: 1187), C2120 (SEQ ID NO: 1188), C2117 (SEQ ID NO: 1195) y C2121 (SEQ ID NO: 1196) tienen la capacidad de enlazar tanto ß-Klotho humana como murino. (G4S)3 se describe como SEQ ID NO: 4 y (G4S)1 se describe como SEQ ID NO: 2.

La Figura 26 es una serie de gráficas generadas usando ensayos Alphascreen que demuestran que las proteínas de enlace C2114 (SEQ ID NO: 1180), C2122 (SEQ ID NO: 1183), C2116 (SEQ ID NO: 1187), C2120 (SEQ ID NO: 1188) no tienen la capacidad de bloquear FGF-21 enlazado a un complejo de FGFRlc y ß-Klotho y que las proteínas de enlace C2117 (SEQ ID NO: 1195) aún C2121 (SEQ ID NO: 1196) bloquea FGF-21 enlazado a un complejo de FGFRlc y ß-Klotho. (G4S)3 se describe como SEQ ID NO: 4 y (G4S) 1 se describe como SEQ ID NO: 2.

La Figura 27 es una serie de gráficas generadas usando ensayos Alphascreen que demuestran que las proteínas de enlace C2114 (SEQ ID NO: 1180), C2122 (SEQ ID NO: 1183), C2116 (SEQ ID NO: 1187), C2120 (SEQ ID NO: 1188), C2117 (SEQ ID NO: 1195) y C2121 (SEQ ID NO: 1196) tienen la capacidad de enlazar tanto FGFRlc como ß-Klotho y no bloquean la interacción entre FGFRlc y ß-Klotho. (G4S)3 se describe como SEQ ID NO: 4 y (G4.S) 1 se describe como SEQ ID NO: 2.

La Figura 28 es una tabla y gráfica generada usando un ELISA de enlace que demuestra que las proteínas de enlace C2114 (SEQ ID NO: 1180), C2116 (SEQ ID NO: 1187), C2117 (SEQ ID NO: 1195) tiene afinidad mejorada para el complejo FGFRlc-ß-Klotho sobre monómeros de enlace FGFRlc y ß-Klotho; 3XG4S se describe como SEQ ID NO: 4 y 1XG4S se describe como SEQ ID NO: 2.

La Figura 29 es una serie de gráficas y tablas generadas usando un ensayo de citometría de flujo que demuestra que las proteínas de enlace C2114 (SEQ ID NO: 1180), C2139 (SEQ ID NO: 1181), C2140 (SEQ ID NO: 1182), C2122 (SEQ ID NO: 1183), C2130 (SEQ ID NO: 1184), C2131 (SEQ ID NO: 1185), C2132 (SEQ ID NO: 1186), C2116 (SEQ ID NO: 1187), C2120 (SEQ ID NO: 1188), C2120A (SEQ ID NO: 1188), C2141 (SEQ ID NO: 1189), C2142 (SEQ ID NO: 1190), C2133 (SEQ ID NO: 1191), C2134 (SEQ ID NO: 1192), C2135 (SEQ ID NO: 1193), C2136 (SEQ ID NO: 1194), C2117 (SEQ ID NO: 1195), C2121 (SEQ ID NO: 1196), C2143 (SEQ ID NO: 1197), C2144 (SEQ ID NO: 1198), C2137 (SEQ ID NO: 1199) y C2138 (SEQ. ID NO: 1200) muestran enlace potenciado a células AM ID que expresan FGFRlc y ß-Klotho humana que sus monómeros precursores de enlace ß-Klotho' (M01, M42 y M50, SEQ ID NOS 493 y 305-306, respectivamente, en orden de aparición); (0XG4S) y (1XG4S) se describen como SEQ ID NO: 2, (2XG4S) se describe como SEQ ID NO: 3 y (3XG4S) se describe como SEQ ID NO: 4.

La Figura 30 es una serie de gráficas y tablas generadas usando un ensayo basado en células, que demuestra que las proteínas de enlace mostradas en la Figura 29 (SEQ ID NOS 493 y 305-306, respectivamente, .en orden de aparición) muestra actividad agonista . contra una línea celular reportera responsiva FGF21; (0XG4S) y (1XG4S) se describen como SEQ ID NO: 2, (2XG4S) se describe como SEQ ID NO: 3 y (3XG4S) se describe como SEQ ID NO: 4.

La Figura 31 es una serie de gráficas de barras que demuestran niveles de actividad agonista observada en un ensayo celular reportero responsivo FGF-21 para proteínas de enlace generadas usando los monómeros y dímeros mostrados en la Figura 17.

La Figura 32 es una tabla que representa las secuencias de proteínas de enlace (SEQ ID NOS 314-392, 1201-1234 y 1265-1275 respectivamente, en orden de aparición) que comprende monómeros M03 de enlace FGFRlc (SEQ ID NO: 287), M08 (SEQ ID NO: 694), M15 (SEQ ID NO: 289), M31 (SEQ ID NO: 291), M23 (SEQ ID NO: 290), y. M33 (SEQ ID NO: 292), M03mutM01 (SEQ ID NO: 293), M03mutM04 (SEQ ID NO: 294), M03mutM05 (SEQ ID NO: 295), M03mut 06 (SEQ ID NO: 296),' M03mutM09 (SEQ ID NO: 297), 23mutM10 (SEQ ID NO: 298), M23mutMll (SEQ ID NO: 299), M23mutM14 (SEQ ID NO: 300), 23mutM15 (SEQ ID NO: 301), M23mutM16 (SEQ ID NO: 302), M23mutM17 (SEQ ID NO: 303), y dímeros D01 de enlace ß-Klotho (SEQ ID NO: 307), D02 (SEQ ID NO: 308), WD03 (SEQ. ID NO:309), WD04 (SEQ ID NO: 601), M03 (SEQ ID NO: 287), RI_D09 (SEQ ID NO: 620), WD05 (SEQ ID NO: 605), WD06 (SEQ ID NO: 310), WD21 (SEQ ID NO: 633), WD22 (SEQ ID NO: 311), D25 (SEQ ID NO: 640), D28 (SEQ ID NO: 643), -D29' (SEQ ID NO: 312),. y WD31 (SEQ ID NO: 656).

La Figura 33 es una serie de . gráficas generadas usando un ensayo basado en células que demuestra que las proteínas de enlace C2737 (SEQ ID NO: 370), C2738 (SEQ ID NO:371), C2739 (SEQ ID NO:372), C2740 (SEQ ID NO:373) y C2741 (SEQ ID NO:374) (panel izquierdo) y C2742 (SEQ ID NO:375), C2743 (SEQ ID NO:376), C2744 (SEQ ID NO:377), C2745 (SEQ ID NO:378) y C2747 (SEQ ID NO: 379) (panel derecho) inducen actividad de señalización tipo FGF21 en cuatro lineas celulares reportera de luciferasa estables diferentes.

La Figura 34 es una' serie de gráficas generadas usando un ensayo basado en células que demuestra que las proteínas de enlace C2748 ( SEQ ID NO:380), C2749 (SEQ ID NO:381), C2750 (SEQ ID NO-.382), C2751 (SEQ ID NO:383) y C2752 (SEQ ID NO:384) (panel izquierdo) y C2753 (SEQ ID NO:385), C2754 (SEQ ID NO:386), y C2757' (SEQ ID NO : 387 ) (panel derecho) inducen actividad de señalización .tipo FGF21 en cuatro líneas celulares reporteras luciferasa estables diferentes.

La Figura 35 es una serie de gráficas generadas usando un ensayo basado en células que demuestra que las proteínas de enlace C2794 (SEQ ID' NO:390), C2795 (SEQ ID NO:391) y C2796 (SEQ ID NO: 392) inducen actividad de señalización tipo FGF21 en cuatro líneas celulares reporteras de luciferasa estables diferentes.

La Figura 36 es una gráfica generada usando un ensayo basado en células de adipocito que demuestra que las proteínas de enlace C2739 (SEQ ID NO:372), C2742 (SEQ ID NO:375), C2748 (SEQ ID NO:380), C2752 (SEQ ID NO:384), C2794 (SEQ ID NO: 390) inducen actividad de señalización tipo FGF21.

La Figura 37 es una serie de gráficas de barras generadas usando un ' ensayo basado en células L6 transitoriamente transfectado y demuestra que la capacidad de proteínas de enlace C2794 (SEQ- ID NO: 390), C2745 (SEQ ID NO:378), C2748 (SEQ ID NO:380), C2751 (SEQ ID NO:383), y C2740 (SEQ ID NO: 373) para inducir actividad de señalización tipo FGF21 requiere la presencia de tanto FGFRlc como ß-Klotho.

La Figura 38. es una serie de gráficas generadas usando un ensayo basado en células que demuestra que las proteínas de enlace C3090 (SEQ ID NO: 335), C3091 (SEQ ID NO: 336), C3092 (SEQ ID NO:337), C3093 (SEQ ID NO:338), C3094 (SEQ ID NO:339), C3095 (SEQ ID NO:340), C3096 (SEQ ID NO:341), C3097 (SEQ ID NO:342), C3098 (SEQ ID NO:343), C3099 (SEQ ID NO:344), C3100 (SEQ ID NO:345), C3102 (SEQ ID NO:346), C3103 (SEQ ID NO:347), C3104 (SEQ ID NO : 348 ) , y C3105 (SEQ ID NO: 349) muestran actividad de señalización tipo FGF21 en una primera línea celular reportera de luciferasa que expresa FGFRlc y ß- lotho humana.

La Figura 39 es una serie de gráficas generadas usando un ensayo basado en células que demuestra que las proteínas de enlace C3090 (SEQ ID NO:335), C3091 (SEQ ID NO:336), C3092 (SEQ ID NO:337), C3093 (SEQ ID NO:338), C3094 (SEQ ID NO:339), C3095 (SEQ ID NO:340), C3096 (SEQ ID NO:341), C3097 (SEQ ID NO:342), C3098 ¦ (SEQ ID NO:343), C3099 (SEQ ID NO:344), C3100 (SEQ ID NO:345), C3102 (SEQ ID NO:346), C3103 ( SEQ ID NO:347), C3104 ( SEQ ID NO:348), y C3105 (SEQ ID NO: 349) muestran actividad de señalización tipo FGF21 en una segunda linea celular reportera de luciferasa que expresa FGFRlc y ß-Klotho humana.

La Figura 40 es una serie de gráficas generadas usando un ensayo basado en células que demuestra que las proteínas de enlace C3090 (SEQ ID NO:335), C3091 (SEQ ID NO:336), C3092 (SEQ ID NO:337), C3093 (SEQ ID NO:338), C3094 ( SEQ ID NO:339), C3095 (SEQ ID NO:340), C3096 (SEQ ID NO:341), C3097 (SEQ ID NO:342),' C3098 (SEQ ID NO:343), C3099 (SEQ ID NO-.344), C3100 (SEQ ID NO-.345), C3102 (SEQ ID NO:346), C3103 (SEQ ID NO:347), C3104 (SEQ ID NO:348), y C3105 (SEQ ID NO: 349) muestran actividad de señalización tipo FGF21 en una tercera línea celular reportera de luciferasa que expresa FGFRlc y ß-Klotho humana.

La Figura 41 es una serie de gráficas generadas usando un ensayo basado en células que demuestra que las proteínas de enlace C3090 (SEQ ID NO:335), C3091 (SEQ ID NO:336), C3092 (SEQ ID NO:337), C3093 (SEQ ID NO:338), C3094 (SEQ ID NO:339), C3095 (SEQ ID NO:340), C3096 (SEQ ID NO:341), C3097 (SEQ ID NO:342), C3098 (SEQ ID NO:343), C3099 (SEQ ID NO:344), C3100 (SEQ ID NO:345), C3102 (SEQ ID NO:346), C3103 (SEQ ID NO:347), C3104 (SEQ ID NO:348), y C3105 (SEQ ID NO: 349) muestran actividad de señalización tipo FGF21 en una cuarta línea celular reportera de luciferasa que expresa FGFRlc y ß-Klotho humana.

La Figura 42 es una serie de gráficas generadas usando un ensayo basado en células que demuestra que las proteínas de enlace C3192 (SEQ ID NO:350), C3193 (SEQ ID NO:351), C3194 (SEQ ID NO:352), C3195 - (SEQ ID NO:353), C3196 (SEQ ID NO:354), C3197 (SEQ ID O:355), C3198 (SEQ ID NO:356), C3199 (SEQ ID NO:357), C3200 (SEQ ID NO:358), C3201 (SEQ ID NO:359), C3202 (SEQ ID NO:360), C3203 (SEQ ID NO:361), C3204 (SEQ ID NO:362), C32.05 (SEQ ID NO:363), C3206 (SEQ ID NO:364), C3207 (SEQ ID NO:365), C3208 (SEQ ID NO:366), C3209 (SEQ ID NO:367), C3210 (SEQ ID NO:368), y C3211 (SEQ ID NO: 369) muestran actividad de señalización tipo FGF21 en una primera linea celular reportera de luciferasa que expresa FGFRlc y ß-Klotho humana.

La Figura 43 es una serie de gráficas generadas usando un ensayo basado en células que demuestra que las proteínas de enlace C3192 (SEQ ID NO-.350), C3193 (SEQ ID NO:351), C3194 (SEQ ID NO:352), C3195 (SEQ ID NO:353), C3196 (SEQ ID NO:354), C3197 (SEQ ID'NO:355), C3198 (SEQ ID NO:356), C3199 (SEQ ID NO:357), C3200 (SEQ ID NO:358), C3201 (SEQ ID NO:359), C3202 (SEQ ID NO:360), C3203 (SEQ ID NO:361), C3204 (SEQ ID NO:362), C3205 (SEQ ID NO:363), C3206 (SEQ ID NO:364), C3207 (SEQ ID NO:365), C3208 (SEQ ID NO:366), C3209 (SEQ ID NO:367), C3210 (SEQ ID NO:368), y C3211 (SEQ ID NO: 369) muestran actividad de señalización tipo FGF21 en una segunda linea celular reportera de luciferasa que expresa FGFRlc y ß-Klotho humana.

La Figura 44 es una serie de gráficas generadas usando un ensayo basado en células que demuestra que las proteínas de enlace C3192 (SEQ ID NO:350), C3193 (SEQ ID NO: 351), C3194 (SEQ ID NO:352), C3195 (SEQ I D NO : 353 ) , C3196 (SEQ ID NO:354), C3197 ( SEQ ID NO:355), C3198 (SEQ ID NO:356), C3199 (SEQ ID NO:357), C3200 ' (SEQ ID NO:358), C3201 (SEQ ID NO:359), C3202 (SEQ ID NO:360)., C3203 (SEQ ID NO:361), C3204 (SEQ ID NO:362), C3205 (SEQ ID NO: 363), C3206 (SEQ ID NO:364), C3207 (SEQ ID NO:365), C3208 (SEQ ID NO:366), C3209 (SEQ ID NO:367), C3210 (SEQ ID NO : 368 ) , y C3211 (SEQ ID NO: 369) muestran actividad de señalización tipo FGF21 en una tercera línea celular reportera de luciferasa que expresa FGFRlc y ß-Klotho humana.

La Figura 45 es una serie de gráficas generadas usando un ensayo basado en células que demuestra que las proteínas de enlace C3192 (SEQ ID NO:350), C3193 (SEQ ID NO:351), C3194 (SEQ ID NO:352), C3195 (SEQ ID NO:353), C3196 (SEQ ID NO:354), C3197 (SEQ ID NO:355), C3198 (SEQ ID NO:356), C3199 (SEQ ID NO:357), C3200 (SEQ ID NO:358), C3201 (SEQ ID NO:359), C3202 ( SEQ ID NO:360), C3203 (SEQ ID NO:361), C3204 (SEQ ID NO:362), C3205 (SEQ ID NO:363), C3206 (SEQ ID NO:364), C3207 (SEQ ID NO:365), C3208 (SEQ ID NO:366), C3209 (SEQ ID NO:367), C321.0 (SEQ ID NO:368), y C3211 (SEQ ID NO: 369) muestran actividad de señalización tipo FGF21 en una cuarta línea celular reportera de luciferasa que expresa FGFRlc y ß-Klotho humana.

La Figura 46 es una serie de gráficas generadas usando células que no expresan ß-Klótho, y demuestra que la capacidad de proteínas de enlace C3192 ( SEQ ID NO: 350), C3193 (SEQ ID NO:351), C3194 (SEQ ID NO:352), C3195 (SEQ ID NO:353), C3196 (SEQ ID NO:354), C3197 (SEQ ID NO:355), C3198 (SEQ ID NO:356), C3199 (SEQ ID NO:357), C3200 (SEQ ID NO:358), C3201 (SEQ ID.NO:359), C3202 (SEQ ID NO:360), C3203 (SEQ ID NO:361), C3204 (SEQ ID NO:362), C3205 (SEQ ID NO:363), C3206 (SEQ ID NO:364), C3207 (SEQ ID NO:365), C3208 (SEQ ID NO:366), C3209 (SEQ ID NO:367), C3210 (SEQ ID NO:368), y C3211 (SEQ ID NO:369) para inducir actividad de señalización tipo FGF21 requiere la presencia de tanto FGFRlc como ß-Klotho.

La Figura 47 es una serie de gráficas generadas usando células que expresan FGFRlc cynomolgus y ß-Klotho cynomolgus, y demuestran que las proteínas de enlace C3090 (SEQ ID NO:335), C3091 (SEQ ID.NO:336), C3092 (SEQ ID NO:337), C3093 (SEQ ID NO:338), C3094 (SEQ ID NO:339), C3095 (SEQ ID NO:340), C3096 (SEQ ID NO:341), C3097 (SEQ ID NO:342), C3098 (SEQ ID NO:343), C3099 (SEQ ID NO:344), C3100 (SEQ ID NO:345), C3102 (SEQ ID NO:346), C3103 (SEQ ID NO:347), C3104 (SEQ ID NO:348), C3105 (SEQ ID NO:349), C2739 (SEQ ID NO:372) y C2752 (SEQ ID NO:384) muestran actividad de señalización tipo FGF21 en una cuarta linea celular reportera de luciferasa que expresa establemente FGFRlc humano y transfectada transitoriamente con ß-Klotho de mono cynomolgus; las secuencias de aminoácidos para FGFRlc humano y FGFRlc de mono cynomolgus son idénticas.

La Figura 48 es una serie de gráficas generadas usando células que expresan FGFRlc cynomolgus y ß-Klotho cynomolgus, y demuestran que las proteínas de enlace C3192 (SEQ ID NO:350), C3193 (SEQ ID NO:351), C3194 (SEQ ID NO:352), C3195 (SEQ ID NO:353), C3196 ( SEQ ID NO:354), C3197 (SEQ ID NO:355), C3198 (SEQ ID NO:356), C3199 (SEQ ID NO:357), C3200 (SEQ ID NO:358), C3201 (SEQ ID NO:359), C3202 (SEQ ID NO:360), C3203 (SEQ ID NO:361), C3204 (SEQ ID NO:362), C3205 (SEQ ID NO:363), C3206 (SEQ ID NO:364), C3207 (SEQ ID NO:365), C3208 (SEQ ID NO:366), C3209 (SEQ ID NO:367), C3210 ( SEQ ID NO:368), y C3211 (SEQ ID NO:369) muestran actividad de señalización tipo FGF21 en una cuarta línea celular reportera de luciferasa que expresa establemente FGFRlc humano y transitoriamente transfectada con ß-Klotho de mono cynomolgus; las secuencias de aminoácidos para FGFRlc humano y FGFRlc de mono cynomolgus son idénticas.

La Figura 49 es una serie de gráficas generadas usando células que expresan FGFRlc humano y ß-Klotho humana, y demuestran que las proteínas de enlace C3094 (SEQ ID NO: 339), C4168 (SEQ ID NO: 1265), C4169 (SEQ ID NO: 1266), C4170 (SEQ ID NO: 1267 ), C4171 (SEQ ID NO: 1268), C4172 (SEQ ID NO: 351), C4173 (SEQ ID NO: 1269), C4174 (SEQ ID NO: 1270), C4175 (SEQ ID NO: 355), C4176 (SEQ ID NO: 1271), C4177 (SEQ ID NO: 1272), y C4178 (SEQ ID NO: 1273) son capaces de inducir señalización tipo FGF21.

La Figura 50 es una serie de gráficas generadas usando cuatro lineas reporteras de luciferasa estables diferentes que expresan luciferasa cuando se estimulan con FGF-21, y demuestran que las proteínas de enlace C4311 (LNRM01_RlcM03mut 09) ' (SEQ ID NO: 1274) y C4312 (Rlc 03mutM09_LNRM01) (SEQ ID NO: 1275) son capaces de inducir señalización tipo FGF21.

La Figura 51 es una serie de gráficas generadas usando células que expresan FGFRlc cynomolgus y ß-Klotho cynomolgus, y demuestran que las proteínas de enlace C3201-HSA (SEQ ID NO:713), C3203-HSA (SEQ ID NO: 714 ) , . HSA-C3201 (SEQ ID NO:711) y. HSA-C3203 (SEQ ID NO: 712) son capaces de inducir señalización tipo FGF21. · La Figura 52 es una serie de gráficas generadas usando células que expresan FGFRlc humano y ß-Klotho humana, y demuestran que las proteínas de enlace C3201-GGGGSGGGGSGGGGS-HSA (SEQ ID NO: 4) y C3201-GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS-HSA (SEQ ID NO: 418) son capaces de inducir señalización tipo FGF21 con eficacia y potencia equivalente a C3201-HSA (SEQ ID NO:713), donde la proteína, de enlace se liga a HSA por una ligadura GGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 3) .

La Figura 53 es una serie de gráficas generadas usando células que expresan FGFRlc humano y ß-Klotho humana, y demuestran que las proteínas de enlace C3201-HSA (SEQ ID NO: 713) , C3201-HSA (N14S/S86G) (SEQ ID NO: 1288), C3201-HSA (S16Q/S86G) (SEQ ID NO: 1289), C3201-HSA (S16N/S86G) (SEQ ID NO: 1290) y C3201-HSA (S16G/S86G) (SEQ ID NO: 1291) son capaces para inducir señalización tipo FGF21 con eficacia y potencia equivalente.

La Figura 5 . es una serie de gráficas generadas usando células que expresan FGFRlc humano y ß-Klotho humana, y demuestran que las proteínas de enlace C3094-HCFC (SEQ ID NO: 1295), C3201-HCFC (SEQ ID NO: 1294), C4174-HCFC (SEQ ID NO: 1296) y C4176-HCFC ( SEQ ID NO: 1297) son capaces de inducir señalización tipo FGF21.

La Figura 55 es un diagrama que representa gráficamente el diseño de estudio durante un estudio de 68 días realizado en monos cynomolgos obesos.

La Figura 56 es una gráfica que representa los efectos del vehículo y C3201-HSA (SEQ ID NO: 713) en ingesta de alimento AM de los monos cynomolgos obesos estudiados.

La Figura 57 es una gráfica que representa los efectos del vehículo y C3201-HSA (SEQ ID NO: 713) en ingesta de manzana de los monos cynomolgos obesos estudiados.

La Figura 58 es una gráfica que representa los efectos del vehículo y C3201-HSA (SEQ ID NO: 713) en ingesta de alimento PM de los monos cynomolgos obesos estudiados.

La Figura 59 es una gráfica que representa los efectos del vehículo y C3201-HSA (SEQ ID NO: 713) en peso corporal de los monos cynomolgos obesos estudiados.

La Figura 60 es una gráfica que muestra los efectos del vehículo y C3201-HSA (SEQ ID NO: 713) en índice de masa corporal (BMI) de los monos cynomolgos obesos estudiados.

La Figura 61 es una gráfica que muestra los efectos del vehículo y C3201-HSA (SEQ ID . NO: 713) 'en la circunferencia abdominal (AC) de los monos cynomolgos obesos estudiados.

La Figura 62 es una gráfica que muestra los efectos del vehículo y C3201-HSA ( SEQ ID NO: 713) en el grosor en pliegue de la piel (SFT) de los monos, cynomolgos obesos estudiados.

La Figura 63 es una gráfica que muestra los efectos del vehículo y C3201-HSA (SEQ ID NO: 713) en niveles de glucosa de plasma durante las pruebas de tolerancia de glucosa de los monos cynomolgos obesos estudiados.

La Figura 64 es una gráfica que muestra los efectos del vehículo y C3201-HSA (SEQ ID NO: 713) en niveles de insulina de plasma durante las pruebas de tolerancia a la glucosa de los monos cynomolgos obesos estudiados.

La Figura 65 es una gráfica que muestra los efectos del vehículo y C3201-HSA (SEQ ID NO: 713) en niveles de glucosa de plasma en ayunar de los monos cynomolgos obesos estudiados.

La Figura 66 es. una gráfica que muestra los efectos del vehículo y C3201-HSA (SEQ ID NO,: 713) en niveles de insulina de plasma en ayunas de los monos cynomolgos obesos estudiados.

La Figura 67 es una gráfica que muestra los efectos del vehículo y C3201-HSA (SEQ ID NO: 713) en niveles de triglicéridos de plasma alimentados de los monos cynomolgos obesos estudiados.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN DEFINICIONES Los encabezados de sección usados en la presente son solamente para propósitos de organización y no se constituyen como limitantes de la materia objeto descrita. ? menos que se defina de otra manera en la presente, los términos científicos y técnicos usados en conjunto con la solicitud actual tendrán los significados que se entienden comúnmente por aquellos de experiencia ordinaria en la técnica. Además, a menos que. se requiera de otra manera por el contexto, los términos en singular incluirán pluralidades y los términos en plural incluirán el singular.

Siguiendo la convención estándar, como se usa en la presente, "un" y "uno" significa uno o más a menos que se indique específicamente de otra manera.

Como se usa en la presente, el uso de paréntesis en una porción de secuencia indica que las posiciones dentro de los corchetes pueden estar presentes o ausentes (por ejemplo, " [ekq] " indica que la posición está ausente o cualquier E, K, o Q puede estar en tal posición) . Cuando más de una "x" se usa en el paréntesis (por ejemplo, "[xx]"), cada x representa una posición posible. De esta manera "[xx]" indica que cero, uno o dos aminoácidos pueden estar en tales posiciones, donde cada aminoácido está independientemente seleccionado de cualquier aminoácido. Los aminoácidos ausentes también pueden designarse por El término "Actividad de señalización tipo FGF21" significa que muestra un nivel de eficacia agonista tipo FGF21 de igual a o mayor que 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85% y preferiblemente igual a o mayor que 90%,· 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, o 100% de la actividad de FGF21 en uno de los siguientes ensayos: (1) un reportero, por ejemplo luciferasa, ensayo en una línea celular recombinante preparada por ingeniería para responder a FGF21 tal como el ensayo descrito en el Ejemplo 9; (2) en ensayo que demuestra cambios en las moléculas de señalización cadena abajo, por ejemplo, ERK-fosforilación en una línea celular recombinante, por ejemplo, células L6 mioblásticas de rata preparadas por ingeniería para responder a FGF21, tal como el ensayo descrito en el Ejemplo 10; y (3) en ensayo que demuestra cambios en las moléculas de señalización cadena abajo, por ejemplo, ERK-fosforilación en adipocitos humanos primarios que responden a FGF21, tal como el ensayo descrito en el Ejemplo 11. La "potencia" de la actividad sustancial de tal proteína de enlace se define como que tiene EC50 de igual de o menos de lOOnM y preferiblemente menos de 10n de la proteína de enlace en los ensayos antes mencionados .

Como se usa en la presente, el término "proteína de enlace" se refiere a una . proteína que específicamente enlaza una proteína objetivo específica, tal como FGFRlc, ß-Klotho o tanto FGFRlc como ß-Klotho, por ejemplo, FGFRlc humano, ß-Klotho humana o tanto FGFRlc humano como ß-Klotho humana. Una proteína de enlace puede comprender uno o más monómeros, como se define y describe en la presente, unidos entre si por medio de una secuencia de ligadura para formar un "multímero" . Para claridad, la definición de una proteina de enlace específicamente excluye anticuerpos.

Una proteína de enlace se dice que "específicamente enlaza" su objetivo cuando la constante de disociación (KD) es =10~7 M. Una proteína de enlace específicamente enlaza su objetivo con "alta afinidad" cuando la KD es =5x 10"9 M, y con "muy alta afinidad" cuando la KD es 5x 10~10 M cuando se prueba usando un ensayo de enlace, tal como el ensayo descrito en el Ejemplo 7. En una modalidad, una proteína de enlace enlazará a FGFRlc, ß-Klotho o tanto FGFRlc como ß-Klotho, por ejemplo FGFRlc humano, ß-Klotho humana o tanto FGFRlc humano como ß-Klotho humana, con un EC50 de entre alrededor de 1CT8 M y 10"10 M como se determina por ELISA de enlace, y aún en otra modalidad las proteínas de enlace se enlazan con un EC50 =5x 10~9' como se determina por ELISA de enlace. De esta manera, la- frase "específicamente (o selectivamente) enlaza" a un polipéptido, cuando se refiere a un monómero, multímero, o proteína de enlace, se refiere a una reacción de enlace que puede ser determinativa de la presencia del polipéptido en una población heterogénea de proteínas (por ejemplo, un lisado de célula o tejido) y otros biológicos. De esta manera, bajo ensayos o condiciones estándares usados en ensayos de enlace a anticuerpo, una proteina de enlace (por ejemplo, un monómero o multimero) específicamente enlaza a una molécula objetivo particular arriba del fondo (por ejemplo, 2X, 5X, 10X o más arriba del fondo) y no se enlaza en una cantidad importante a otras moléculas presentes en la muestra.

Los términos "dominio de monómero" o "monómero" se usan intercambiablemente en la presente se refieren a una región discreta encontrada en una proteína o polipéptido. Un dominio de monómero puede formar una estructura tridimensional nativa en solución en la ausencia de secuencia de aminoácido nativas flanqueadas. Algunos dominios de monómero descritos en la presente pueden específicamente enlazar a una molécula objetivo. Por ejemplo, un polipéptido que forma una estructura tridimensional que enlaza a una molécula objetivo es un dominio de monómero. Como se usa en la presente, el término "dominio de monómero" no abarca la región que determina la complementariedad (CDR) de un anticuerpo. Dos o más monómeros pueden unirse entre sí por medio de una secuencia de ligadura para formar un multimero.

El término "variante de dominio de monómero" se refiere a un dominio de monómero que resulta de manipulación humana de una secuencia de dominio de monómero. Los ejemplos de cambios manipulados humanos incluyen, por ejemplo, mutagénesis aleatoria, mutagénesis especificas del sitio, recombinados, evolución dirigida, eventos cruzados forzados dirigidos a oligo, incorporación de síntesis del gen dirigido de mutación, etc. El término "variante de dominio de monómero" no abarca una región que determina la complementariedad mutagenizada (CDR) de un anticuerpo.

El término "rizo" se refiere a una porción de un dominio de monómero que se expone típicamente al ambiente por el ensamble de la estructura de andamiaje de la proteína de dominio de monómero, y que se involucra en el enlace objetivo. La descripción actual proporciona tres tipos de rizos que son identificados por características específicas, tales como, potencial para enlace. de disulfuro, puenteo entre las estructuras de proteína secundarias, y dinámicos moleculares (por ejemplo, flexibilidad) . Los tres tipos de secuencias de rizo son una secuencia de rizo defina por cisteína, una secuencia de rizo definida por estructura, y una secuencia de rizo definida por el factor B.

Como se usa en la presente, el término "secuencia de rizo definida por cisteína" se refiere a una subsecuencia de un secuencia que codifica el dominio de monómero que se presenta naturalmente que- se enlaza a cada extremo por un residuo de cisteína que se conserva con respecto a al menos otro dominio de monómero que se presenta naturalmente de la misma familia. Las secuencias de rizo definidas por cisteina se identifican por alineación de secuencia múltiple de los dominios de monómero que se presentan naturalmente, seguido por análisis de secuencia para identificar residuos de cisteina conservados. La secuencia entre cada par consecutivo de residuos de cisteina conservados es una secuencia de rizo, definido por cisteina. La secuencia de rizo definida por cisteina no incluye los residuos de cisteina adyacentes a cada terminal. Los dominios de monómero que tienen secuencias de rizo definidas por cisteina incluyen los dominios A del receptor LDL, dominios tipo EGF, dominios sushi, dominios 1 tipo Fibronectina, y similares. De esta manera, por ejemplo, en el caso de dominios A del receptor LDL representado por la secuencia de consenso, CX6CX4CX6CX5CX8C (SEQ ID NO: 5), en donde X5, Xif X5, y X8 cada una representa una secuencia de rizo definida por cisteina que comprende el número designado de aminoácidos.

El término "secuencia de rizo definida por el factor B" se refiere a una subsecuencia de al menos tres residuos de aminoácido de una secuencia de codificación de dominio de monómero en la cual los factores B para los carbonos alfa en el rizo definido por el factor B están entre los factores B de carbono alfa más altos al 25% en el dominio de monómero. Típicamente el factor . B de carbono alfa promedio para la subsecuencia es al menos alrededor de 65. Como se usa en la presente, el término "factor B" (o "factor de temperatura" o "factor Debye- aller") es derivado de datos de dispersión de rayos X. El factor B es un factor que puede aplicarse a la terminal de dispersión de rayos X. para cada átomo, o para grupos de átomos, que describe el grado al cual la densidad de electrones se extiende de los factores B empleados en la práctica descritos en la presente pueden ser ya será isotrópicos o anisotrópicos . El término "factor B de carbono alfa promedio" se refiere a: n (? factor BCai) / n i=l donde n corresponde al número de residuos en el rizo, y es al menos 3, y factor BCai es el factor B para el carbono alfa del residuo de aminoácido i del rizo.

El término "multimero" se usa en la presente para indicar una proteina que comprende al menos dos dominios de monómero. Los dominios de monómero separados en un multimero pueden unirse juntos por una ligadura. Un multimero también se conoce como una proteina de mosaico combinatoria o una proteina de mosaico recombinante .

El término "familia" y "clase de familia" se usan intercambiablemente para indicar proteínas que se agrupan juntos basados en similitudes . en sus secuencias de aminoácido. Estas secuencias similares se conservan generalmente debido a que son importantes para la función de la proteina y/o el mantenimiento de la estructura tridimensional de la proteina. Los ejemplos de tales familias incluyen familia del dominio A del receptor LDL, la subfamilia FGF19 de la familia FGF, y similares. Adicionalmente , las secuencias relacionadas que enlazan a la misma molécula objetivo pueden dividirse en familias basadas en porciones de secuencia comunes.

El término "ligando," también se refiere en la presente como una "molécula objetivo," que abarca una variedad amplia de sustancias y moléculas, cuyo intervalo es desde moléculas sencillas hasta objetivos complejos. Las moléculas objetivo pueden ser proteínas, ácidos nucleicos, lípidos, carbohidratos o cualquier otra molécula capaz de reconocimiento por un dominio de monómero. Por ejemplo, una molécula objetivo puede incluir un compuesto químico (esto es, compuesto no biológico tal como, por ejemplo, una molécula orgánica, una molécula inorgánica, o una molécula que tiene tanto átomos orgánicos como inorgánicos, pero excluyendo polinucleótidos y proteínas), una mezcla de compuestos químicos, una configuración de compuestos espacialmente localizados, una macromolécula biológica, una colección de despliegue de péptido de bacteriófago, una colección de despliegue dé péptido de polisoma, un extracto hecho de los materiales biológicos tal como células o tejido de bacterias, plantas, hongos, o animal (por ejemplo, mamíferos) , una proteína, una toxina, una hormona de péptido, una célula, un virus, o similares. Otras moléculas objetivo incluyen, por ejemplo, una célula completa, un tejido completo, una mezcla de proteínas relacionadas o no relacionadas, una mezcla de virus o cepas bacterianas o similares. Las moléculas objetivo también pueden definirse por inclusión en ensayos de selección descritos en la presente o al potenciar o inhibir una interacción de proteína específica (esto es, un agente que selectivamente inhibe una interacción de enlace entre dos polipéptidos predeterminados) . Los ejemplos de moléculas objetivo incluyen ß-Klotho y FGFRlc.

El término "ligadura" se usa en la presente para indicar una porción o grupo de porciones que une o conecta dos o más dominios de monómero separados discretos. Una ligadura permite los dominios de monómero separados discretos para permanecer separados cuando se unen juntos en un multímero. Una porción de ligadura es típicamente una porción sustancialmente lineal. Las ligaduras adecuadas incluyen polipéptidos, ácidos polinucleicos, ácidos nucleicos de péptido y similares. Las ligaduras adecuadas también incluyen porciones alquileno opcionalmente sustituidas que tienen uno o más átomos de oxigeno incorporados en la estructura de carbono.. Típicamente, el peso molecular de la ligadura es menos que alrededor de 2000 daltons. Más típicamente, el peso molecular de la ligadura es menos que alrededor de 1500 daltons y a menudo es menos que alrededor de 1000 daltons. Una ligadura puede ser suficientemente pequeña para permitir que los dominios de monómero separados discretos cooperen, por ejemplo, donde cada uno de los dominios de monómero separados discretos en un multímero enlaza a la misma molécula objetivo por medio de sitios de enlace separados. Las ligaduras ejemplares incluyen un polinucleótido que codifica un polipéptido, o un polipéptido de aminoácidos u otras porciones que no se presentan naturalmente. Una ligadura puede ser una porción de una secuencia nativa, una variante de la misma, o una secuencia sintética. Las ligaduras pueden comprender, por ejemplo, aminoácidos que se presentan naturalmente, que no se presentan naturalmente, o una combinación de ambos. Los ejemplos de ligaduras particulares que pueden emplearse en las proteínas de enlace descritas en la presente incluyen ATHT (SEQ ID NO: 6), PERT (SEQ ID NO: 7), TTRT '(SEQ ID NO: 8), GTTGPT (SEQ ID NO: -9), ETSGPT (SEQ ID NO: 10), SQDPEFHKVS (SEQ ID NO: 11), SAPASEPPGSL (SEQ ID NO: 12), GRPGPGATSAPAA (SEQ ID NO: 13), GDSHILPFSTPGPST (SEQ ID NO: 14), [AEKPT] [AEKLPT] [EHPR]T (SEQ ID NO: 15), [AEKRT] [AGS] [APSV] [AEGV] [HP] T (SEQ ID NO: 16), PTKRPEEV (SEQ ID NO: 17), SQDPEFHKV (SEQ ID NO: . 18), SAPASEPPGSL (SEQ ID NO: 12), GRPGPGATSAPAA (SEQ ID NO: 13), GDSHILPFSTPGPST (SEQ ID NO: 14), [AEPT] [AEPQ] [HP] T (SEQ ID NO: 22), [EGT] [AGR] [AST] [EGV] [PR]T (SEQ ID NO: 23), KAPVPT (SEQ ID NO: 24), SQDPGFHKV (SEQ ID' NO: 25), [APK] [AT] [HPR] T (SEQ ID NO: 26), [EQ] [ART] [HP]T (SEQ ID NO: 27), EQRT (SEQ ID NO: 28), RRAAHT (SEQ ID NO: 29), [AK] [AG] [ PS ] [EG] [HP] T (SEQ ID NO: 30), ETPT (SEQ ID NO: 1319), PAPT (SEQ ID NO: 1320), QAPT (SEQ ID NO:1321), AQPT (SEQ ID N0.1322)., y secuencias .que comprende sustituciones conservadoras, en donde los aminoácidos en los paréntesis indican aminoácidos alternativos en una posición específica.

El término "separado" se usa en la presente para indicar una propiedad de una porción que es independiente y permanece independiente aún cuando está en complejo con otras porciones, incluyendo por ejemplo, otros dominios de monómero. Un dominio de monómero es un dominio separado en una proteína debido a que tiene una propiedad independiente que puede reconocerse y separarse de la proteína. Por ejemplo, la capacidad de enlace del ligando de FGFRlc es una propiedad independiente. Otros ejemplos de separar incluyen los dominios de monómero separados en un multímero que mantiene separados los dominios separados independientes aún cuando están complejos o unidos juntos en el multímero por una ligadura. Otro ejemplo de una propiedad separada es los sitios de enlace separados, en un multímero para un ligando.

Como se usa en la presente, "evolución dirigida" se refiere a un proceso por el cual las variantes de polinucleótido se generan, expresan, y seleccionan para una actividad (por ejemplo, un polipéptido con actividad de enlace) en un proceso recursivo. Uno o más candidatos en la pantalla se seleccionan y el proceso luego se repite usando polinucleótidos que codifican los candidatos seleccionados para generar nuevas variantes. La evolución dirigida involucra al menos dos rondas de generación de variación y puede incluir 3, 4, 5, 10, 20 o más rondas de generación y selección de variación. La variación puede generarse por cualquier método conocido para aquellos de experiencia en la técnica, incluyendo, por ejemplo, por PCR propenso a error, recombinación de gen, mutagénesis química y similares.

El término "transposición" se usa en la presente para indicar recombinación entre secuencias no idénticas. En algunas modalidades, la transposición puede incluir cruce por medio de recombinación homologa o por medio de recombinación no homologa, tal como por medio de sistemas cre/lox y/o flp/frt. La transposición puede llevarse a cabo al emplear una variedad de formatos diferentes, incluyendo por ejemplo, formatos de transposición in vitro e in vivo, formatos de transposición in silico, formatos de transposición que utilizan ya sea plantillas de hebra sencilla o hebra doble, formatos de transposición basados en cebador, formatos de transposición basados en fragmentación de ácido nucleico, y formatos de transposición mediados por oligonucleótido, todos de los cuales se basan ' en eventos de recombinación entre secuencias no idénticas y se describen en más detalle o referencian en la presente a continuación, asi como otros formatos basados en recombinación similares.

El término "aleatorio" como se usa en la presente se refiere a una secuencia de polinucleótido o una secuencia de aminoácidos compuesta de dos o más aminoácidos y construida por un proceso estocástico o aleatorio. La secuencia de polinucleótido o secuencia de aminoácido aleatorio puede incluir porciones de estructura o andamiaje, que puede comprender secuencias invariantes.

El término "pseudoal-eatorio" como se usa en la presente se refiere a un conjunto de secuencias de polinucleótido o polipéptido que tienen variabilidad limitada, de manera que el grado de variabilidad de residuo en algunas posiciones se limita, pero cualquier posición pseudoaleatoria se permite al menos en algún grado de variación del residuo.

Los términos "polipéptido," "péptido, " y "proteína" se usan en la presente intercambiablemente para referir a una secuencia de aminoácidos de dos o más aminoácidos.

El término "aminoácido" se refiere a aminoácidos que se presentan naturalmente o sintéticos, así como análogos de aminoácido/imitadores de aminoácido/aminoácidos que no se presentan naturalmente que funcionan en una manera similar a los aminoácidos que se presentan naturalmente. Los aminoácidos que se presentan naturalmente son aquellos codificados por el código genético, así como aquellos aminoácidos que se · modifican después, por ejemplo, hidroxiprolina, ?-carboxiglutamato, y 0-fosfoserina . Los análogos de aminoácido se refieren a compuestos que tienen la misma estructura química básica como un aminoácido que se presenta naturalmente, esto es, un carbono a que se enlaza a un hidrogeno, un grupo carboxilo, un grupo amino, y un grupo R, por ejemplo, homoserina, nprleucina, sulfóxido de metionina, metionina metil sulfonio. Tales análogos tienen grupos R modificados (por ejemplo, norleucina) o estructuras de péptido modificadas, pero mantienen la misma estructura química básica como' un aminoácido que se presenta naturalmente. Un "imitador de aminoácido" es . un compuesto químico que tiene una estructura que es diferente de la estructura química general de un aminoácido, pero que funciona en una manera similar a un aminoácido que se presenta naturalmente. Un "aminoácido que no se presenta naturalmente" es un compuesto que tiene la misma estructura química básica como un aminoácido que se presenta naturalmente, pero no se incorpora en una cadena de polipéptido en crecimiento por el complejo de traducción. "Aminoácido que no se presenta naturalmente" también incluye, pero no se limita a, aminoácidos que ocurren por modificación (por ejemplo, modificaciones posttraduccionales ) de un aminoácido naturalmente codificado (incluyendo pero no limitado a, los 20 aminoácidos comunes) pero no se incorporan naturalmente por sí mismos en una cadena de polipéptido en crecimiento por el complejo de traudcción. Una lista no limitante de ejemplos de aminoácidos que no se presentan naturalmente que pueden insertar en una secuencia de proteína de enlace o sustituirse por un residuo de tipo natural en una secuencia de enlace a antígeno incluye aminoácidos ß, homoaminoácidos, aminoácidos cíclicos y aminoácidos con cadenas laterales derivatizadas . Los ejemplos incluyen (en la forma L o forma D; abreviados como en paréntesis) : citrulina (Cit) , homocitrulina (hCit) , Na-metilcitrulina (NMeCit) , Noí-metilhomocitrulina (?a-MeHoCit ) , ornitina (Orn) , Na-Metilornitina (? -MeOrn o N eOrn) , sarcosina (Sar) , homolisina (hLys . o hK) , homoarginina (hArg o hR) , homoglutamina (hQ) , ?a-metilarginina (N eR) , Na-metileucina (?a-MeL o NMeL) , N-metilhomolisina (NMeHoK) , Na-metilglutamina (NMeQ) , norleucina (Nle) , norvalina (Nva) , 1, 2, 3, 4-tetrahidroisoquinolina (Tic), ácido octahidroindol-2-carboxilico (Oic) , 3- ( 1-naftil) alanina (1-Nal), 3-(2-naftil ) alanina (2-Nal), 1, 2, 3, -tetrahidroisoquinolina (Tic), 2-indanilglicina (Igl), para-yodofenilalanina (pl-Phe) , para-aminofenilalanina (4AmP o 4-Amino-Phe) , 4-guanidino fenilalanina (Guf ) , glicilisina (abreviado "K (?e-glycyl ) " o "K(glycyl)" o "K(gly)"), nitrofenilalanina (nitrophe) , aminofenilalanina (aminophe o Amino-Phe) , bencilfenilalanina (bencilphe) , ácido ?-carboxiglutámico (?-carboxiglu) , hidroxiprolina (hidroxipro) , p-carboxil-fenilalanina (Cpa) , ácido Oí-aminoadipico (Aad) , ?a-metil valina (NMeVal) , N-a-metil leucina (NMeLeu) , ? -metilnorleucina (NMeNle) , ciclopentilglicina (Cpg) , ciclohexilglicina (Chg) , acetilarginina (acetilarg) , . ácido OÍ, ß-diaminopropionoico (Dpr), ácido a, ?-diaminobutirico (Dab) , ácido diaminopropiónico (Dap) , ciclohexilalanina (Cha) , 4-metil-fenilalanina (MePhe) , ß, ß-difenil-alanina (BiPhA) , ácido aminobutirico (Abu) , 4-fenil-fenilalanina (o bifenilalanina; 4Bip) , ácido a-amino-isobutírico (Aib) , beta-alanina, ácido beta-aminopropiónico , ácido piperidinico, ácido aminocaprioico, ácido aminoheptanoico, ácido aminopimélico, desmosina, ácido diaminopimélico, N-etilglicina, N-etilaspargina, hidroxilisina , alo-hidroxilisina , isodesmosina, alo-isoleucina, N-metilglicina, N-metilisoleucina, N-metilvalina, 4-hidroxiprolina (Hyp) , ?-carboxiglutamato, e-?, , N-trimetilisina, e-?-acetilisina, 0-fosfoserina, N-acetilserina, N-formilmetionina, 3-metilhistidina, 5-hidroxilisina, ?-metilarginina, ácido 4-Amino-O-ftálico (4APA), y otros aminoácidos similares, y formas derivadas de cualquiera de aquellos específicamente enlistados.

"Sustitución conservadora de aminoácido" se refiere a la intercambiabilidad de residuos que tienen cadenas laterales similares. Por ejemplo,, un grupo de aminoácidos que tiene cadenas laterales alifáticas es glicina, alanina, valina, leucina, y isoleucina;' un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales hidroxilo alifáticas es serina y treonina; un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales que contienen amida es asparagina y glutamina; un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales aromáticas es fenilalanina, tirosina, y triptofano; un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales básicas es lisina, arginina, e histidina; y un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales que contienen azufre es cisteína y metionina. Los grupos de sustitución de aminoácidos conservados preferidos son: valina-leucina-isoleucina, fenilalanina-tirosina, lisina-arginina , alanina-valina, y asparagina-glutamina .

Como se usa en la presente el término "recombinante", cuando se usa en el contexto de una proteina de enlace, monómero o multímero, significa que la proteina de enlace, monómero o multímero no se encuentra en la naturaleza y no puede aislarse de una fuente no alterada encontrada en la naturaleza (por ejemplo, una célula, tejido o fluido biológico) . Cuando el término se usa con referencia a, por ejemplo, una célula, o ácido nucleico, proteína, o vector, indica que la célula, ácido nucleico, proteína o vector, se ha modificado por la introducción de una proteína o ácido nucleico heterólogo o la alteración de una proteína o ácido nucleico nativo, o que la célula se deriva de una célula así modificada. De esta manera, por ejemplo, las células recombinantes expresan genes que no se encuentran dentro de la forma (no recombinante) nativa de la célula o expresan genes nativos que de otra manera se expresan anormalmente, sub-expresados o no expresado en absoluto.

Como se usa en la presente el término "no recombinante", cuando se usa en el contexto de una proteína de enlace, monómero o multímero, significa que la proteína de enlace, monómero o multímero se encuentra en la naturaleza y puede aislarse de una fuente no alterada encontrada en la naturaleza (por ejemplo, una célula, tejido o fluido biológico) .

La frase "secuencia de ácido nucleico" se refiere a un polímero de hebra sencilla o doble de bases desoxiribonucleótido o ribonucleótido leídas del extremo 5' al 3' o un análogo del mismo.

El término "que codifica", se refiere a una secuencia de polinucleótido que codifica uno o más aminoácidos. El término no requiere un codón de inicio o paro. Una secuencia de aminoácidos puede codificarse en cualquiera de uno de los seis cuadros de lectura diferentes proporcionados por una secuencia de polinucleótido.

El término "promotor" se refiere a regiones o secuencias ubicadas cadena arriba y/o cadena abajo del inicio de transcripción que se involucran en el reconocimiento y enlace de polimerasa de ARN y otras proteínas para iniciar la transcripción.

Un "vector" se refiere a un polinucleótido, que cuando es independiente del cromosoma hospedero, es capaz de replicación en un organismo hospedero. Los ejemplos de vectores incluyen plásmidos. · Los vectores típicamente tienen un origen de replicación. Los vectores pueden comprender, or ejemplo, terminadores de transcripción y traducción, secuencia de inicio de transcripción y traducción, y promotores útiles para regulación de la expresión del ácido nucleico particular.

Los términos "idéntico" o porcentaje de "identidad," en el contexto de dos o más ácidos nucleicos o secuencias de polipéptido, se refieren a dos o más secuencias o subsecuencias que son las mismas. "Porcentaje de identidad" significa el porcentaje, de residuos idénticos entre los aminoácidos o nucleótidos en las moléculas comparadas y se calcula con base en él tamaño de las más pequeñas de las moléculas que se comparan. Para estos cálculos, los espacios en las alineaciones (si hubiera) deben dirigirse por un modelo matemático o ' programa de computadora particular (esto es, un "algoritmo") . Los métodos que pueden usarse para calcular la identidad de los ácidos nucleicos o polipéptidos alineados incluyen aquellos descritos en Computational Molecular Biology, (Lesk, A. M . , ed. ) , (1988) New York: Oxford University Press; ¦ Biocomputing Informatics and Genome Projects, (Smith, D. W., ed. ) , 1993, New York: Academic Press; Computer Analysis of Sequence Data, Parte I, (Griffin, A. M. , and Griffin, H. G., eds . ) , 1994, New Jersey: Human Press; von Heinje, G., (1987) Sequence Analysis in Molecular Biology, New York: Academic Press; Sequence Analysis Primer, (Gribskov, M. y Devereux, J. , eds.), 1991, New York: M.

Stockton Press; , y Carillo e al., (1988) SIAM J. Applied Math. 48:1073.

Al calcular el porcentaje de identidad, las secuencias que se comparan se alinean en una forma que da el emparejado más grande entre las secuencias. El programa de computadora usado para determinar el porcentaje de identidad es el paquete de programa GCG, que incluye GAP (Devereux et al., (1984) Nucí. Acid Res. 12:387; Genetics Computer Grupo, University of isconsin, Madison, WI) . El GAP de algoritmo de computadora se usa para alinear los dos polipéptidos o polinucleótidos para los cuales el porcentaje de identidad de secuencia es a determinarse. Las secuencias se alinean para emparejado óptimo de su aminoácido o nucleótido respectivo (el "intervalo de coincidencia", como se determina por el algoritmo) . Una penalización de abertura de espacio (que se calcula como 3x' la diagonal promedio, en donde la "diagonal promedio" es el promedio- de la diagonal de la matriz de comparación que se usa; la "diagonal" es el registro o número asignado a cada juego de aminoácido perfecto por la matriz de comparación particular) y una penalización de extensión de espacio (que es usualmente 1/10 veces la penalización de abertura de espacio), asi como una matriz de comparación tal como PAM 250 o BLOSU 62 se usan en conjunto con el algoritmo. En ciertas modalidades, una matriz de comparación estándar (ver, Dayhoff et al., (1978) Atlas of Protein Sequence and Structure 5: 345-352 para la matriz de comparación PAM 250; Henikoff et al., (1992) Proc. Nati. Acad. Sci. E.U.A. 89:10915-10919 para la matriz de comparación BLOSUM 52) también se usa por el algoritmo.

Los parámetros recomendados para determinar el porcentaje de identidad para polipéptidos o secuencias de nucleótido usando el programa GAP son los siguientes: Algoritmo: Needleman et al., 1970, J. Mol. Sioí. 48:443-453; Matriz de comparación: BLOSUM 62 de Henikoff et al., 1992, supra; Penalización de espacio: 12 (pero sin penalización por espacios finales) Penalización de longitud de espacio: 4 Umbral de similitud: 0 Ciertos esquemas de alineación para alinear dos secuencias de aminoácidos pueden resultar en emparejado de sólo una región corta de las dos secuencias, y esta región alineada pequeña puede tener identidad de secuencia muy alta aunque no existe relación importante entre las dos secuencias de longitud completa. En consecuencia, el método de alineación seleccionado (por ejemplo, el programa GAP) puede ajustarse si asi se desea para resultar en una alineación que abarca al menos 50 aminoácidos contiguos del polipéptido objetivo.

"Sustancialmente idéntico" se refiere a dos o más secuencias de ácidos nucleicos o polipéptido que tienen un porcentaje especifico de residuos de aminoácido o nucleotidos que son los mismos (por ejemplo, 60% de identidad, opcionalmente 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, o 95% de identidad sobre una región especifica, o, cuando no es especifico, sobre la secuencia completa) , cuando se compara y alinea para correspondencia máxima sobre una ventana de comparación, o región designada como se mide usando uno de los siguientes algoritmos de comparación de secuencia o por alineación manual e inspección visual. Opcionalmente, la identidad o identidad sustancial existe sobre una región que es al menos alrededor de 50 nucleotidos de longitud, o sobre una región que es 100 hasta 500 o 1000 o más nucleotidos o aminoácidos de longitud, o si no se especifica, sobre la longitud de una secuencia. La descripción actual proporciona polipéptidos que comprende secuencias de enlace que enlazan a FGFRlc, ß-Klotho o tanto FGFRlc como ß-Klotho, en donde las secuencias de enlace son sustancialmente idénticas (por ejemplo, al menos 65%, ' 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, o 95% idénticas) a al menos una secuencia, de enlace que enlaza a FGFRlc y ß-Klotho, como se proporciona en la presente, incluyendo pero no limitado a, cualquiera de SEQ ID NOS: 335-392 y SEQ ID NOS : 1180-1200.

Una secuencia de . polinucleótido o aminoácido es "heteróloga a" una segunda secuencia si las dos secuencias no se ligan de la misma manera como se encuentra en las secuencias que se presentan naturalmente. Por ejemplo, un promotor operablemente ligado a una secuencia de codificación heteróloga se refiere a una secuencia de codificación que es diferente de cualquiera de las variantes alélicas que se presentan naturalmente. El término "ligadura heteróloga," cuando se usa en referencia a un multimero, indica que el multimero comprende una ligadura y un monómero que no se encuentran en la misma relación una con la otra en la naturaleza (por ejemplo, forman una proteina de fusión recombinante que no se 'expresa normalmente en la naturaleza).

"Porcentaje de identidad de secuencia" se determina al comparar dos secuencias óptimamente alineadas sobre una ventana de comparación, en donde la porción de la secuencia de polinucleótido en la ventana de comparación puede comprender adiciona o eliminaciones (esto es, espacios) como se compara con la secuencia de referencia (que no comprende adiciones o eliminaciones) para alineación óptima de las dos secuencias. El porcentaje se calcula al determinar el número de posiciones en las cuales el residuo de aminoácido o base de ácido nucleico idéntico ocurre en ambas secuencias para proporcionar el número de. posiciones emparejadas, dividiendo el número de posiciones emparejadas por el número total de posiciones en la ventana de comparación y multiplicando el resultado por 100 para proporcionar el porcentaje de identidad de secuencia.

Una "ventana de comparación", como se usa en la presente, incluye referencia a un segmento de cualquiera de uno del número de posiciones contiguas seleccionadas del grupo que consiste desde 20 hasta 600, usualmente alrededor de 50 hasta alrededor de 200, más usualmente alrededor de 100 hasta alrededor de 150 en las cuales una secuencia puede compararse con una secuencia de referencia del mismo número de posiciones contiguas después de que las dos secuencias se alinean óptimamente. Los métodos de alineación de secuencias para comparación son .bien conocidos en la técnica. La alineación óptima de secuencias para comparación pueden conducirse, por ejemplo, por el algoritmo de homología local de Smith and Waterman (1970) Adv. Appl . Math. 2:482c, por el algoritmo de alineación de homología de Needleman and Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:443, por la búsqueda para método de similitud de Pearson and- Lipman (1988) Proc. Nat'l. Acad. Sel. USA 85:2444, por implementaciones computarizadas de estos algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA, y TFASTA en el isconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, I), o por alineación manual e inspección visual {ver, por ejemplo, Ausubel et al., Current Protocols ín Molecular Biology (1995 complemento) ) .

Un ejemplo de un algoritmo útil es el algoritmo BLAST 2.0, que se describe en Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410, respectivamente. El software para realizar análisis BLAST está disponible públicamente a través del Centro Nacional para Información de Biotecnología. Este algoritmo involucra primero identificar pares de secuencia de registro alto (HSPs, por sus siglas en inglés) al identificar palabras cortas de longitud W en la secuencia de pregunta, que ya sea coincide o satisface algún registro de umbral valorado positivo T cuando se alinea con una palabra de la misma longitud en una secuencia de base de datos. T se refiere como el umbral de registro de palabra en la vecindad (Altschul et al., supra) . Estos aciertos de palabra en la vecindad iniciales actúan como semillas para iniciar búsquedas para encontrar HSPs más largas que las contienen. Los aciertos de palabra se extienden en ambas dirección a lo largo de cada secuencia en lo que la medida del registro de alineación acumulativo puede incrementarse. Los registros acumulativos se calculan usando, para secuencias de nucleótido, los parámetros M (registro de recompensa para un par de residuos que coinciden; siempre > 0) y N (registro de penalización para residuos sin coincidencia; siempre < 0) . Para secuencias de aminoácido, una matriz de registro se usa para calcular el registro acumulativo. La extensión de los aciertos de la palabra en cada dirección se para cuando: el registro de alineación . acumulativo falla por la cantidad X de su valor alcanzado máximo; el registro acumulativo va a cero o debajo, debido a la acumulación de una o más alineaciones de residuo de registró negativo; o se alcanza el final de cualquier secuencia. Los parámetros de algoritmo BLAST , T, y X determinan la sensibilidad y velocidad de la alineación. El programa BLASTN (para secuencias de nucleótido) usa como omisiones una longitud de palabra (W) de 11, una expectativa (E) o 10, M=5, N=-4 y una comparación de ambas hebras. Para secuencias de aminoácido, el programa. BLASTP usa como omisiones una longitud de palabra de 3, y expectativa (E) de 10, y la matriz de registro BLOSUM62 (ver Henikoff and Henikoff (1989) Froc. Nati. Acad. Sci. EUA 89:10915) alineaciones (B) de 50, expectativa (E) de 10, =5, N=-4, y una comparación de ambas hebras.

El algoritmo BLAST también realiza un análisis estadístico de la similitud entre dos secuencias (ver, por ejemplo, Karlin and Altschul (1993) Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 90:5873-5787). Una medición de similitud proporcionado 11 por el algoritmo BLAST es la probabilidad de suma más pequeña (P(N)), que proporciona una indicación de la probabilidad por la cual un emparejado entre dos secuencias de aminoácidos o nucleótido ocurrirán por casualidad. Por ejemplo, un ácido nucleico se considera similar a una secuencia de referencia si la probabilidad de suma más pequeña en una comparación del ácido nucleico de prueba para el ácido nucleico de referencia es menor que alrededor de 0.2, más preferiblemente menor que alrededor de 0.01, y lo más preferiblemente menor que alrededor de 0.001..

I . INTRODUCCIÓN La descripción actual proporciona proteínas de enlace que pueden inducir señalización mediada por FGF21, como se define en la presente. In vivo,- la forma madura de FGF21 es la forma activa de la molécula. Se proporciona la secuencia de nucleótidoS que codifica FGF21 de longitud completa; los nucleótidos que codifican la secuencia de señal se subrayan. ATG GAC TCG GAC GAG ACC GGG TTC GAG CAC TCA GGA CTG TGG GTT TCT GTG CTG GCT GGT CTT CTG CTG GGA GCC TGC CAG GCA CAC CCC ATC CCT GAC TCC AGT CCT CTC CTG CAA TTC GGG GGC CAA GTC CGG CAG CGG TAC CTC TAC ACA GAT GAT GCC CAG CAG ACA GAA GCC CAC CTG GAG ATC AGG GAG GAT GGG ACG GTG GGG GGC GCT GCT GAC CAG AGC CCC GAA AGT CTC CTG CAG CTG AAA GCC TTG AAG CCG GGA GTT ATT CAA ATC TTG GGA GTC AAG ACA TCC AGG TTC CTG TGC CAG CGG CCA GAT GGG GCC CTG TAT GGA TCG CTC CAC TTT GAC CCT GAG GCC TGC AGC TTC CGG GAG CTG CTT CTT GAG GAC GGA TAC AAT GTT TAC CAG TCC GAA GCC CAC GGC CTC CCG CTG CAC CTG CCA GGG AAC AAG TCC CCA CAC CGG GAC CC.T GCA CCC CGA GGA CCA GCT CGC TTC CTG CCA CTA CCA GGC CTG CCC CCC GCA CCC CCG GAG CCA CCC GGA ATC CTG GCC CCC CAG CCC CCC GAT GTG GGC TCC TCG GAC CCT CTG AGC ATG GTG GGA CCT TCC. CAG GGC CGA AGC CCC AGC TAC GCT TCC TGA (SEQ ID NO: 31) Se proporciona la secuencia' de aminoácidos de FGF21 de longitud completa; los aminoácidos que hacen la secuencia de señal están subrayados: M D S D E T G F E H S G L W V S V L A G L L L G A C Q A H P I P D S S P L L Q F G G Q V R Q R Y L Y T D D A Q Q T E A H L E I R E D G T V G G A A D Q S P E S L L Q L K A L K P G V I Q I L G V K T S R F L C Q R P D G A LY G S L H F D P E A C S F R E L L L E D G Y N V Y Q S E A H G L P L H L P G N S P H R D P A P R G P A R F L .P L P G L P P A P P E P P G I L A P Q P P D V G S S D P L S M V G P S Q G R S P S Y A S (SEQ ID NO: 32) La descripción actual proporciona proteínas de enlace que no se expresan en organismo no recombinantes y que enlazan a FGFRlc , ß-Klotho, o tanto FGFRlc como ß-Klotho. In vivo, FGFRlc y ß-Klotho asociados con FGF21 para formar un complejo de señalización. Ver Figura 1, diagrama A. Algunas proteínas de enlace .que enlazan a tanto FGFRlc como ß-Klotho pueden imitar la actividad de señalización FGF21 in vivo al localizar FGFRlc y ß-Klotho, y por lo tanto pueden tomar el lugar de FGF21 en el complejo de señalización. Ver Figura 1, diagrama B. Tales proteínas de enlace se describen en la presente.

Generalmente, las proteínas de enlace de la descripción actual comprenden uno o más dominios de monómero que enlazan a FGFRlc, ß-Klotho, o tanto FGFRlc como ß-Klotho. Estos dominios pueden identificarse fácilmente usando una variedad de andamiajes de polipéptido para generar una pluralidad de variantes de polipéptido y luego seleccionar una variante que enlaza a FGFRlc, ß-Klotho o tanto FGFRlc como ß-Klotho. La descripción actual por lo tanto también proporciona métodos para seleccionar una proteína que enlaza a FGFRlc, ß-Klotho, o tanto FGFRlc como ß-Klotho.. Las proteínas que enlazan tanto FGFRlc como ß-Klotho son útiles para una variedad de propósitos, incluyendo, por ejemplo, para tratar, trastornos metabólicos, tal como diabetes, obsesidad, dislipidemia, hipertensión, hepatosteatosis, esteatohepatitis no alcohólica (NASH) , pancreatitis aguda, enfermedad cardiovascular, tal como ateroesclerosis , y envejecimiento. Los polipéptidos descritos en la presente también son útiles para detectar y cuantificar FGFRlc y/o ß-Klotho en una muestra. Las secuencias de aminoácidos de FGFRlc humano (SEQ ID NO: 33) y ß-Klotho humana (SEQ ID NO: 34) se conocen y se proporcionan: FGFRlc humano (SEQ ID NO: 33) MWS KCLLF AVLVTATLCTARPSPTLPEQAQP GAPVEVESFLVHPGDLLQLRCRLRDDV QSINWLRDGVQLAESNRTRITGEEVEVQDSVPADSGLYACVTSSPSGSDTTYFSVNVSDAL PSSEDDDDDDDSSSEE ETDNTKPNPVAPY TSPEKMEKKLHAVPAAKTVKFKCPSSGTPN PTLRWLKNGKEFKPDHRIGGYKVRYATWSIIMDSWPSDKGNYTCIVENEYGSINHTYQLD VVERSPHRPILQAGLPANKTVALGSNVEFMCKVYSDPQPHIQ LKHIEVNGSKIGPDNLPY VQILKTAGVNTTDKEMEVLHLRNVSFEDAGEYTCLAGNSIGLSHHSA LTVLEALEERPAV TSPLYLEI 11YCTGAFLIS'C VGSVIVYKMKSGTKKSDFHSQ AVHKLAKSIPLRRQVTV SADSSASMNSGVLLVRPSRLSSSGTP LAGVSEYELPEDPR ELPRDRLVLGKPLGEGCFG QVVLAEAIGLD DKPNRVTKVAVKMLKSDATEKDLSDLISEMEMMKMIG HKNI INLLGAC TQDGPLYVIVEYASKGNLREYLQARRPPGLEYCYNPSHNPEEQLSSKDLVSCAYQVARGME YLASKKCIHRDLAARNVLVTEDNV KIADFGLARDIHHIDYYKKTTNGRLPVKWMAPEALF DRIYTHQSDVWSFGVLLWEI FTLGGSPYPGVPVEELFKLLKEGHRMDKPSNCTNELYMM R DCWHAVPSQRPTFKQLVEDLDRIVALTSNQEYLDLSMPLDQYSPSFPDTRSSTCSSGEDSV FSHEPLPEEPCLPRHPAQLANGGLKRR B-Klotho humana (SEQ ID NO: 34) MKPGCAAGSPGNEWIFFSTDEITTRYRNTMSNGGLQRSVILSALILLRAVTGFSGDGRAIW S NPNFTPVNESQLFLYDTFPKNFFWGIGTGALQVEGS KKDGKGPSI DHFIHTHLKNVS STNGSSDSYIFLEKDLSALDFIGVSFYQFSIS PRLFPDGIVTVANAKGLQYYSTLLDALV LRNIEPIVTLYH DLPLALQEKYGGWKNDTI IDIFNDYATYCFQMFGDRVKYWITIHNPYL VAWHGYGTGMHAPGEKGNLAAVYTVGHNLIKAHSKVWHNYNTHFRPHQKG LSITLGSHWI EPNRSENTMDIFKCQQSMVSVLGWFANPIHGDGDYPEGMRKKLFSVLPIFSEAEKHEMRGT ADFFAFSFGPNNFKPLNTMAKMGQNVSLNLREALN IKLEYNNPRILIAENG FTDSRVKT EDTTAIYMMKNFLSQVLQAIRLDEIRVFGYTAWSLLDGFEWQDAYTIRRGLFYVDFNSKQK ERKPKSSAHYYKQIIRENGFSLKESTPDVQGQFPCDFSWGVTESVLKPESVASSPQFSDPH LYVWNATGNRLLHRVEGVRLKTRPAQCTDFVNIKKQLE LARMKVTHYRFALD ASVLPTG NLSAVNRQALRYYRCVVSEGLKLGISAMVTLYYPTHAHLGLPEPLLHADG LNPSTAEAFQ AYAGLCFQELGDLVKLWITINEPNRLSDIYNRSG DTYGAAHNLLVAHALA RLYDRQFRP SQRGAVSLSLHADWAEPAÑPYADSHWRAAERFLQFEIAWFAEPLFKTGDYPAAMREYIASK HRRGLSSSALPRLTEAERRLLKGTVDFCALNHFTTRFVMHEQLAGSRYDSDRDIQFLQDIT RLSSPTRLAVI PWGVRKLLR VRRNYGDMDIYITASGIDDQALEDDRLRKYYLGKYLQEVL KAYLI D VRIKGYYAFKLAEE SKPRFGFFTSDFKAKSSIQFYNKVISSRGFPFENSSSRC SQTQENTECTVCLFLVQKKPLIFLGCCFFSTLVLLLSIAIFQRQKRRKF KAKNLQHIPLK KGKRVVS Aunque la descripción actual se proporciona para proteínas de enlace que comprenden varios dominios sencillos asociados por ligaduras y otras secuencias, los multímeros de los dominios también pueden sintetizarse y usarse. En algunas modalidades, algunos (u opcionalmente todos, en algunas modalidades) de los dominios de una proteína de enlace enlaza FGFRlc, ß-Klotho, o tanto FGFRlc como (3-Klotho. En algunas de estas modalidades, dos o más de los dominios son idénticos y enlazan a la misma porción de una proteína objetivo, tal como FGFRlc y/o ß-Klotho. En otras modalidades, al menos algunos de los dominios en el multimero enlazan a diferentes porciones de FGFRlc y/o ß-Klotho. Aún en otras modalidades, al menos alguno de los dominios de una proteina de enlace enlaza a una molécula o moléculas diferentes de FGFRlc o ß-Klotho (por ejemplo, un factor de sangre tal como albúmina de suero, una inmunoglobulina, o a eritrocitos) .

II. DISCUSIÓN GENERAL DE DOMINIOS DE MONÓMERO Las proteínas de enlace descritas en la presente comprenden uno o más dominios de monómero. Los dominios de monómero que son particularmente adecuados para generar las proteínas de enlace de la descripción actual son dominios ricos en cisteína que comprenden enlaces de disulfuro. Los dominios ricos en cisteína que forman elementos de las proteínas de enlace descritas en la presente típicamente no forman una hélica , una lámina ß, o una estructura de ß-barril. Típicamente, los enlaces de disulfuro promueven el plegado del dominio en una estructrua tridimensional. Usualmente, los dominios ricos en cisteína tienen al menos dos enlaces de disulfuro, más típicamente al menos tres enlaces de disulfuro. En algunas modalidades, al menos .5, 10, 15 o 20% de los aminoácidos en un dominio de monómero son cisteinas .

Los dominios de rrionómero pueden tener cualquier número de características. Por ejemplo, en algunas modalidades, los dominios tienen baja o no tienen inmunogenicidad en un animal (por ejemplo, un humano) . Los dominios de monómero también pueden tener un tamaño pequeño. En algunas modalidades, los dominios son suficientemente pequeños para penetrar la piel u otros tejidos. Adicionalmente, los dominios de monómero pueden tener un intervalo de vidas medias ín vivo o estabilidades.

Los dominios de monómero ilustrativos adecuados para uso en las proteínas de enlace descritos en la presente incluyen, por ejemplo, un dominio tipo EGF, un dominio Kringle, un dominio tipo I de fibronectina, un dominio tipo II de fibronectina, un dominio tipo III de fibronectina, un dominio PAN, un dominio Gla, un dominio SRCR, un dominio inhibidor de tripsina pancreática de bovino/Kunitz, un dominio inhibidor de serina proteasa tipo Kazal, un dominio (tipo P) de trébol, un dominio tipo C del factor von Willebrand, un dominio tipo Anafilatoxina, un dominio CUB, una repetición tipo I de tiroglobulina, dominio de clase A del receptor LDL, un dominio Sushi, un dominio Link, un dominio tipo I de Tromboespondina, un dominio tipo inmunoglobulina , un dominio de lectina tipo C, un dominio MAM, un dominio tipo A del factor von Willebrand, un dominio de Somatomedina B, un dominio de cuatro núcleos de disulfuro tipo WAP, un dominio tipo C F5/8, un dominio de Hemopexina, un dominio SH2, un dominio SH3, un dominio tipo EGF tipo Laminina, un dominio C2, y otros tales dominios conocidos para aquellos de experiencia ordinaria en la técnica, asi como derivados y/o variantes de los mismos. La Figura 2 coloca en diagrama esquemáticamente varios tipos ¦ de dominios de monómero encontrados en moléculas en la familia del receptor LDL .

En algunas modalidades, los dominios de monómero adecuados {por ejemplo, dominios con la capacidad de plegar independientemente o con alguna asistencia limitada) pueden seleccionarse de las familias de dominios de proteina que contienen estructuras tridimensaionales de intercalado ß o barril ß como se define por tales herramientas de análisis de secuencia computacional como Herramienta de Investigación de Arquitectura Modular Sencilla (SMART), ver Shultz et al., SMART: a web-based tool for the¦ study of genetically mobile ¦ domains, (2000) nucleics acids Research 28 ( 1 ): 231-234 ) o CATH (ver Pearl et.al., Assigning genomic sequences to CATH, (2000) Nucleics Acids Research 28 ( 1) : 277-282 ) .

En otra modalidad, los dominios de monómero de las proteínas de enlace descritas incluyen dominios diferentes a dominio tipo III de fibronectina , un dominio anticalina y un dominio tipo Ig de CTLA-4. Algunos aspectos de estos dominios se describen en WO01/64942, W099/16873 - y WO 00/60070.

Como se describe en la presente, los dominios de monómero pueden ser ricos en cisteina. Los dominios de monómero ricos en cisteina adecuados incluyen, por ejemplo, el dominio clase A del receptor LDL ("dominio A") o el dominio EGF. Los dominios de monómero también pueden tener un grupo de residuos negativamente cargados. La Figura 3A muestra un ejemplo de un dominio A.

Como se describe en la presente, los dominios de monómero pueden seleccionarse por la capacidad de enlazar a un objetivo diferente del objetivo que un dominio que se presenta naturalmente homólogo puede enlazar. De esta manera, en algunas modalidades, los dominios de monómero (y multimeros que comprenden tales monómeros) no están con la condición de enlazar al objetivo o la clase o familia de las proteínas objetivo que un dominio de monómero que se presenta naturalmente sustancialmente idéntico puede enlazar.

Las características de un dominio de monómero pueden incluir la capacidad .de plegarse independientemente y la capacidad de formar una estructura estable. De esta manera, la estructura del dominio de monómero a menudo se conserva, aunque la secuencia de polinucleótido que codifica el monómero no necesita conservarse. Por ejemplo, la estructura de dominio A se conserva entre los miembros de la familia de dominio A, mientras que la secuencia de ácido nucleico de dominio A no se conserva.. De esta manera, por ejemplo, un dominio de monómero se clasifica como un dominio A por sus residuos de cisteiná y su afnidad por calcio, no necesariamente por su secuencia de ácido nucleico. Ver Figura 3B.

Específicamente', los dominios A (algunas veces llamados "repeticiones tipo complemento" o "dominio tipo o clase A del receptor LDL") contienen alrededor de 30-50 o 30-65 aminoácidos. En algunas modalidades, los dominios comprenden alrededor de 35-45 aminoácidos y en algunos casos alrededor de 35-40 aminoácidos. . Dentro de los 30-50 aminoácidos, existen alrededor de 6 residuos de cisteína. De las seis cisteínas, los enlaces 'de disulfuro típicamente se encuentran entre las siguientes cisteínas: Cl y C3, C2 y C5, C4 y C6. Los residuos de cisteína del dominio están ligados a disulfuro para formar una porción compacta, estable, funcionalmente independiente. Ver Figura 3B. Los grupos de estas repeticiones hacen un dominio de enlace de ligando, y la agrupación diferencial puede impartir especificidad con respecto al enlace de- ligando. La Figura 4 presenta una lista ejemplar de varios- ligandos que se reconocen por los miembros de la familia del receptor- LDL.

Una secuencia de consenso típica útil para identificar dominios A es la siguiente: C- [VILMA] -X(5)-C- [DNH] -X(3)- [DENQHT] -C-X(3,4)- [STADE] - [ DEH] - [ DE ] -X a, 5) -C (SEQ ID NO: 35) . Consistente con la definición proporcionada anteriormente, los residuos en corchetes indican residuos posibles en una posición. "?(#)" indica número de residuos. Estos residuos pueden ser cualquier residuo de aminoácido. Los parentéticos que contienen dos números se refieren al intervalo de aminoácidos que pueden ocupar tal posición (por ejemplo, " [DE] -X(i,5)-C" (SEQ ID. NO: 36) significa que los aminoácidos DE se siguen por 1, 2, 3, 4, o. 5 residuos, seguido por cisteína, "C") . Esta secuencia de consenso sólo representa la porción del dominio A que inicia en la tercera cisteína. Un segundo consenso es como sigue: C-X(3_i5)-C-X(4-i5)-C-X(6-7)-C-[N,D]-X(3>-[D,E,N,Q,H,S,T]-C-XM-6>-D-E-X(2-8)-C (SEQ ID NO: 37) . El segundo consenso .predice residuos de aminoácido que abarcan los seis residuos de cisteína. En algunas modalidades, las variantes de dominio A comprenden secuencias sustancialmente idénticas a cualquiera de las secuencias descritas arriba. Se nota que la referencia para el dominio de "clase A del receptor LDL", para los propósitos de la descripción actual, no se- pretende para indicar propiedades de enlace u origen del dominio.

Los dominios A ejemplares adicionales incluyen la siguiente secuencia: CaX3-i5CbX3-i5CcX6-7Cd(D,N)X4CeX4-6DEX2-8Cf (SEQ ID NO: 38) en donde C es cisteina, Xn-m representa entre número n y m de aminoácidos independientemente seleccionados, y (D,N) indica que la posición puede ser ya sea D o N; y en donde Ca-Cc, Cb-Ce y Cd-Cf forman enlaces de disulfuro.

A la fecha, al menos 290 dominios A humanos que se presentan naturalmente se han identificado con base en las secuencias cADN. Ver Figura 5. Las proteínas ejemplares que contienen dominios A que se presentan naturalmente, por ejemplo, componentes de complemento (por ejemplo, C6, C7, C8, C9, y Factor I) , serina . proteasas (por ejemplo, enteropeptidasa, matriptasa, y corina) , proteínas de transmembrana (por ejemplo, ST7, LRP3, LRP5 y LRP6) y receptores endocíticos (por ejemplo, receptor relacionado con Sortilina, receptor LDL, VLDLR, LRP1, LRP2 , y ApoER2) . Los dominios A y variantes de dominio A pueden funcionar como dominios de monómero y variantes de los mismos en las proteínas de enlace descritas en la presente. La descripción adicional de dominios A puede encontrarse en las siguientes publicaciones y referencias citadas aquí: Howell and Hertz, The LDL receptor gene family: . signaling functions during development, (2001) Current Opinión in Neurobiology 11:74-81; Krieger, The "best" of cholesterols , the "worst" of cholesterols : A tale of two receptors, (1998) PNAS 95: 4077-4080; Goldstein y Brown, The Cholesterol Quartet, (2001) Science, 292: 1310-1312; y, Moestrup y Verroust, Megalin-and Cubilin-Mediated Endocytosis of Protein-Bound Vitamins , Lipids, and Hormones in Polarized Epithelia, (2001) Ann . Rev. Nutr. 21:407-28.

Un número de otros tipos de dominio también pueden usarse para generar dominios de monómero de enlace a FGFRlc y/o ß-Klotho. Los dominios de monómero EGF ejemplares incluyen la secuencia: CaX3-i4CbX3-7CcX4-i6CdX1.2CeX8-23Cf (SEQ ID NO: 39) en donde C es cisteina, Xn-m representa entre el número n y m de aminoácidos independientemente seleccionados; y en donde Ca-Cc, Cb-Ce y Cd-Cf forman enlace de disulfuro.

Cada uno de los. dominios descritos en la presente emplean porciones ejemplares (esto es, andamiajes). Ciertas posiciones se marcan x, indicando que cualquier aminoácido puede ocupar la posición. Eestas posiciones pueden incluir un número de posibilidades de aminoácido diferentes, por ello se permite para diversidad de secuencia y de esta manera la afinidad para moléculas objetivo diferentes. El uso de corchetes en porciones indica aminoácidos posibles alternos dentro de una posición (por ejemplo, "[ekq]" indica que ya sea E, K o Q puede estar en tal posición) . Como se usa en la presente, el uso de paréntesis en una porción de secuencia indica que las posiciones dentro de los paréntesis están presentes o ausentes (por ejemplo, "([ekq])" indica que la posición está ausente o cualquier E, , o Q puede estar en tal posición) . Cuando más de una "x" se usa en paréntesis (por ejemplo, " (xx) ") , cada x representa una posición posible. De esta manera "(xx)" indica que cero, uno o dos aminoácidos pueden estar en tales posiciones, donde cada aminoácido está independientemente seleccionado de cualquier aminoácido. Los aminoácidos ausentes también pueden designarse por a representa un aminoácido aromatico/hhidrofóbico tal como, por ejemplo, W, Y, F, o L; ß representa un aminoácido hidrofóbico tal como, por ejemplo, V, I, L, A, M, o F; ? representa un aminoácido polar más pequeño tal como, por ejemplo, G, A, S, o T; d representa un aminoácido cargado tal como, por ejemplo, K, R, E, Q, o D; e representa un aminoácido pequeño tal como, por ejemplo, ; V, A, S, o T; y F representa un aminoácido negativamente cargado tal como, por ejemplo, D, E, o.N.

Los dominios adecuados incluyen, por ejemplo dominios tipo 1 de tromboespondina, dominios.de trébol, y dominios de tiroglobulina .

Los dominios tipo 1 de tromboespondina ("TSPl") contienen alrededor de 30-50 o 30-65 aminoácidos. En algunas modalidades, los . dominios comprenden alrededor de 35-55 aminoácidos y en algunos casos alrededor de 50 aminoácidos. Dentro de los 35-55 aminoácidos, existen típicamente alrededor de 4 hasta alrededor de 6 residuos de cisteina. De las seis cisteínas, los enlaces de disulfuro típicamente se encuentran entre las siguientes cisteínas: Cl y C5, C2 y C6, C3 y C4. Los residuos de- cisteina del dominio están ligados a disulfuro para formar una porción compacta, estable, funcionalmente independiente que comprende hebra beta distorcionadas . Los grupos de estas repeticiones hacen un dominio de enlace de .ligando, y la agrupación diferencial puede impartir especificidad con respecto al enlace de ligando.

Las secuencias . de dominio TSP1 y secuencias de conseso ejemplares son como siguen (SEQ ID NOS 40-45, respectivamente, en orden de aparición) : (1) ( XX XXXX ) C 1 XXXC2X XXXX ( X ) XXXXXC3XXXX ( XXX ) XX XXXC4xxxxxx ( X ) XXXC5 ( X ) xxxxC6 (SEQ ID NO: 40); (2) ( xx xx) CiXxxC2x Gx (x) xRxxxCs xx ( Pxx) xxxxxC^xxxxxx (x) xxxCs (x) xxxxC6 (SEQ ID NO: 41.) ; (3) (wxxWxx) CiSxtC2xxGxx (x) xRxrxC3xxxx ( Pxx) xxxxxC4xxxxxx (x) xxxC5 (x) xxxxC6 (SEQ ID NO: 42) ; (4) (WxxWxx) Ci [Stnd] [Vkaq] [Tspl] C2xx [Gq] xx (x) x [Re] x [Rktvm] [C3vldr ] xxx ( [Pq] xx) xxxxx [C4ldae] xxxxxx (x) xxxC5 (x) xxxxC6 (SEQ ID NO: 43). (5) (WxxWxx) Ci [Stnd] [Vkaq] [Tspl] C2xx [Gq] xx (x) x [Re] x [Rktvm] x [C3vldr ] xxxx ( [Pq] xx) xxxxx [C ldae] xxxxxx (x) xxxC5 (x) xxxxC6 (SEQ ID NO: 44); y (6) Ci [nst ] [aegiklqrstv] [adenpqrst] C2 [adetgs] xgx [ikqrstv] x [aqrst] x [almrtv] xC3xxxxxxxxx (xxxxxxx) C4xxxxxxxxx (xx) CSXXXXCÉ (SEQ "ID NO : 45); En algunas modalidades, las variantes de dominio tipo 1 de tromboespondina comprenden secuencias sustancialmente idénticas a cualquiera de las secuencias descritas arriba.

A la fecha, al menos 1677 .dominios de tromboespondina que se presentan naturalmente se han identificado con base en las secuencias cADN . Las proteínas ejemplares que contienen los dominios de tromboespondina que se presentan naturalmente incluyen, por ejemplo, proteínas en la trayectoria de complemento (por ejemplo, properdina, C6, C7, C8A, C8B, y C9) , proteínas de matriz extracelular (por ejemplo, mindina, F-espondina, SCO-espondina, ) , proteina 2 de superficie circumesporozoita, y proteínas TRAP de Plasmodium. Los dominios tipo 1 de tromboespondina se describen además en, por ejemplo, Roszmusz et al., BBRC 296:156 (2002); Higgins et al., J Immunol. 155:5777-85 (1995); Schultz-Cherry et al., J. Biol. Chem. 270:7.304-7310 (1995); Schultz-Cherry et al., J. Biol. Chem. 269:26783-8 (1994); Bork, FEBS Lett 327:125-30 (1993); y Leung-Hagesteij n et al., Cell 71:289-99 (1992).

Otro dominio de monómero ejemplar adecuado para uso al generar las proteínas de enlace de la descripción actual es el dominio de trébol. Los dominios de monómero de trébol están típicamente alrededor de 30-50 o 30-65 aminoácidos. En algunas modalidades, los dominios comprenden alrededor de 35-55 aminoácidos y en algunos casos alrededor de 45 aminoácidos. Dentro' de los 35-55 aminoácidos, existen típicamente alrededor de 6 residuos de cisteína. De las seis cisteínas, los enlaces de disulfuro típicamente se encuentran entre las siguientes cisteínas: Cl y C5, C2 y C4, C3 y C6.

Al menos 149 dominios de trébol que se presentan naturalmente se han identicado con base en secuencias cADN. Las proteínas ejemplares que contienen dominios de trébol que se presentan naturalmente incluyen, por ejemplo, proteína pS2 (TFF1), péptido SP espasmolítico (TFF2), factor de trébol intestinal (TFF3), surceasa-isomaltasa intestinal, y proteínas que pueden involucrarse en defensa contra infecciones microbianas al- proteger el epitelio (por ejemplo, Xenopus xPl, xP4 , mucinas integumentarias A.l y C.l. Los dominios de trébol se describen además en, por ejemplo, Sands and Podolsky, Annu. Rev. Physiol. 58:253-273 (1996); Carr et al., PNAS EUA 91:2206-2210 (1994); DeA et al., PNAS EUA 91:1084-1088 (1994); Hoffman et al., Trends Biochem Sci 18:239-243 (1993).

Las secuencias de consenso y secuencias de dominio de trébol ejemplares son como siguen (SEQ ID NOS 46-51, respectivamente, en orden de aparición) : (1) Ci (xx) xxxxxxxxxC2xx (x) XXXXXXXC3XXXXC4C5XXXXX (x) xxxxxC6 (SEQ ID NO: 46) ; (2 ) Ci (xx) xxxxxxRxxC2xx (x) XXXXXXXC3XXXXC4C5XXXXX (x) ??????d (SEQ ID NO: 47) ; ( 3 ) Ci (xx) xxxpxxRxnC2gx (x) pxitxxxCsxxxgCjCsfdxxx (x) xxxpwCgf (SEQ ID NO: 48) ; (4) Ci (xx) xxx [Pvae] xxRx [ndpm] C2 [Gaiy] [ypfst] ( [de] ) [pskq] [Ivap] [T sa] xx [qedk] C3xx [ krln] [Gnk] C4C5 [Fwy] [Dnrs] [sdpnte] xx (x) xxx [pki] [ eash]C6[Fy] (SEQ ID NO: 49); (5) Ci ( xx) xxx [Pvae] xxRx [ndpm] C2 [Gaiy] [ypfst] ( [de]x) [pskq] x [ Ivap] [T sa] xx [ keqd] C3X [ krln] [Gnk] C C5 [OÍ] [Dnrs] [sdpnte] xx (x) xxx [pki] [W eash]C6[Fy] (SEQ ID NO: 50); (6) Ci ( [dnps] ) [adiklnprstv] [dfilmv] [adenprst] [adelprv] [ehklnqrs] [ adegknsv] [kqr] [fiklqrtv] [dnpqs ] C2 [agiy] [flpsvy] [dknpqs] [adfgh lp] [aipv] [st] [aegkpqrs] [adegkpqs] [deiknqt ] C3 [adefknqrt ] [adegk nqs] [gn] C4C5 [wyfh] [deinrs]'[adgnpst] [aefgqlrstw] [giknsvmq] ( [afm prstv] [degklns] [afiqstv] [iknpv] w) C6 (SEQ ID NO: 51).

Aún otro dominio de monómero ejemplar adecuado para uso al generar las proteínas de enlace de la descripción actual es el dominio de tiroglobulina . Los dominios de monómero de tiroglobulina están típicamente alrededor de 30-85 o 30-80 aminoácidos. En algunas modalidades, los dominios comprenden alrededor de 35-75 aminoácidos y en algunos casos alrededor de 65 aminoácidos. Dentro de los 35-75 aminoácidos, existen típicamente alrededor de 6 residuos de cisteína. De las seis cisteínas, los enlaces de disulfuro típicamente se encuentran entre las siguientes cisteínas: Cl y C2, C3 y C4, C5 y C6.

Al menos 251 dominios de tiroglobulina que se presentan naturalmente se han identificado con base en secuencias cAD . La sección de terminal N de Tg contiene 10 repeticiones de un dominio de alrededor de 65 aminoácidos que se conoce como la repetición tipo 1 Tg. Ver, por ejemplo, althiéry Y, Lissitzky S., Eur J Biochem. (1987) 165 (3) : 491-8 ; Molina et al., Eur. J. Biochem., 240:125-133 (1996). Las proteínas ejemplares que contienen dominios de tiroglobulina que se presentan .naturalmente incluyen por ejemplo, la cadena invariante asociada a la clase II de HLA, proteínas marcadoras de carcinoma pancreático humano, nidogeno (entactina) , proteínas de enlace del factor de crecimiento tipo insulina (IGFBP) , saxifilina, inhibidor de cisteína proteinasa de heuvo de salmón chum, y equistatina. Los dominios Thyr-1 y relacionados pertenecen a la familia 131 del inhibidor de proteinasa MEROPS, clan IX. Los dominios de tiroglobulina se describen además en, por ejemplo, Molina et al., Eur. J. Biochem. 240:125-133 (1996); Guncar et al., EMBO J 18:793-803 (1999); Chong y Speicher, DW 276:5804-5813 (2001) .

Las secuencias de consenso y secuencias de' dominio de tiroglobulina ejemplares son como siguen (SEQ ID NOS 52-56, respectivamente, en orden de aparición) : (1) CiXXXXXXXXXXXXXXX ( XXXXXXXXXX ) XXXXXXXXXXXC2XXXXXXXXXXC3X (x) X (xx x)xxxxC4 XC5 XXX (x) xxxxxxxxxxxxxx (xx) x (SEQ ID NO: 52); (2) ????????????????? (xxxxxxxxxx) xxxxxxxYxPxC2xxxGxxxxxQC3x (x) x (xx x) XXXXC4WC5VXXX (x) GxxxxGxxxxxxxx (xx) xC6 (SEQ ID NO: 53); (3) Cixxxxxxxxxxxxxxx (xxxxxxxxxx) xxxxxxxyxPxC2XXxGxyxxxQC3x (x) s (xx x)xxgxC4W C5VDxx (x) GxxxxGxxxxxgxx (xx) C6 (SEQ ID NO: 54); (4) Ci [QERL] xxxxxxxxxxxxxx (xxxxxxxxxx) xxxxxx [YFHP] PxC2xxxGx [YF] xx [VKRL] QC3x (x [SA] xxx) xx [GSA] xC4 [WYF] C5V [DNYFL] xx (x) Gxxxx [GDNE ] xxxxxgxx (xx) C6 (SEQ ID NO: 55); ' . (5) Ci [QERL] xxxxxxxxxxxxxx (xxxxxxxxxx) xxxxxxx [OÍHP] xPxC2xxxGx [a] xx [VKRL]QC3x (x [SA] xxx) xx [GAS] xC4 [a] C5V [DNa] xx (x) Gxxxx [<Dg] xxxxxGxx (xx) xC6 (SEQ ID NO: 56) ; Todavía otro dominio de monómero ejemplar que puede usarse al generar las proteínas de enlace de la descripción actual es un dominio de laminina-EGF. Los dominios de laminina-EGF son típicamente alrededor de 30-85 o 30-80 aminoácidos. En algunas modalidades, los dominios comprenden alrededor de 45-65 aminoácidos y en algunos casos alrededor de 50 aminoácidos. Dentro de los 45-65 aminoácidos, existen típicamente alrededor de 8 residuos de cisteína uqe interactúan para formar 4 enlaces de disulfuro. Las lamininas son un componente no colagenoso mayor de membranas básales que median la adhesión celular, migración de crecimiento, y diferenciación. Se componen de distintas pero cadenas relacionadas alfa, beta, y gamma. Las tres cadenas forman una molécula en forma cruzada que consiste de una extremidad larga y tres extremidades globulares cortas. La extremidad larga consiste de una estructura de hélice superenrollada contribuida por las tres cadenas y reticulada por enlaces de disulfuro de intercadena.

Las secuencias de consenso y secuencias de dominio EGF de laminina ejemplares son como siguen (SEQ ID NOS 57-59, respectivamente, en orden de aparición) : (1) C1 C2 XXX ( XXX ) XXC3XXX ( XXXXXX ) XXXXC4XC5XXXXXXXXC6XXC7XXXXXXX (x xxxx) xxxxxC8 (SEQ ID NO: 57) (2) CixC2xxxxxx (xxx) xxC3xxx (xxxxxx) xxgxC4xC5xxxxxGxxC6xxC7xxxxxxx (x xxxx) xxxxxCg (SEQ ID NO: 58) (3) C 1XC2 [NDH] xxxxx (xxx) XXC3XXX (xxxxxx) xxGxC4 xC5xxxxxGxxC 6 [DENQ] xC7 x [GN] [YFHT] xxx (xxxxx) xxxxxC8 (SEQ ID NO: 59) En algunas modalidades, el dominio de monómero es un dominio de monómero Notch/LNR, un dominio de monómero DSL, un dominio de monómero Anato, un dominio de monómero beta integrina, y un dominio de monómero Ca-EGF.

En algunas modalidades, el dominio de monómero Ca-EGF comprende la siguiente secuencia (SEQ ID NO: 60): DxDECiXX (xx) xxxxC2x (xx) xxxxxC3xNxxGxfxC4 (xxx) xC5xxgxxxxxx x (xxxxx) xxxC6.

En algunas modalidades, . el dominio de monómero Notch/LNR, comprende la siguiente secuencia (SEQ ID NO: 61) : Cixx (xx) xxxC2xxxxxNGxC3XXxC4nxxxC5xxDGxDC6 En algunas modalidades, el dominio de monómero DSL comprende la siguiente secuencia: CiXxxYYGxxC2XxFC3xxxxDxxxHxxC xxxGxxxC5XxGWxGxxC6 (SEQ ID NO: 62).

El dominio de monómero Anato comprende la siguiente secuencia (SEQ ID NO: 63) : CiC2XDGxxxxx (x) xxxxC3exrxxxxxx (xx) XXC4 XXF XC5C6 .

En algunas modalidades, el dominio de monómero beta integrina comprende la siguiente secuencia (SEQ ID NO: 1240) : CiXxC2X XxpxC3xWC4 xxxxFxxx (Gx) xxxxRC5DxxxxLxxxgC6; y "x" es cualquier aminoácido.

En algunas modalidades, C1-C5 , C2-C4 y C3-C6 del dominio de monómero Notch/LNR forman enlaces de disulfuro; y C1-C5 , C2-C4 y C3-C6 del dominio de monómero DSL forman enlaces de disulfuro.

En algunas modalidades, el dominio de monómero Ca-EGF comprende la siguiente secuencia: ?[ß] [DN] ECiXX (xx) xxxxC2 [PDG] (Dx) xxxxxC3xNxxG [SGT] [a] xC4 (xxx) C5x [GSN] [as] xxxxxx (xxxxx) xxxC5 (SEQ ID NO: 64).

En algunas modalidades, el dominio de monómero Notch/LNR, comprende la siguiente secuencia: Cixx (? [ß ] ) xxxC2 [Os] x [F] [GK] C3 [ND] [OSA] C4 [OS] xx [AEG] C5x [a] DGxDC6 ( SEQ ID NO: 65) .

En algunas modalidades, el dominio de monómero DSL comprende la siguiente secuencia: Cixxx[a] [OÍH] [GSNA]xxC2xx[ ]C3x[PAE]xx[DA]xx[xL] [HRGK] [aK]xC4[D NSG] xxGxxxC5xxG [a] xGxxC6 (SEQ ID NO: 66).

En algunas modalidades, el dominio de monómero Anato comprende la siguiente secuencia: C!C2x[DHTL] [GA] xxxx [PLANT] (xx) xxxxC3 [ESQDAT] x [RLPS] xxxx ( [GEP A]x)xxC4xx[AVFPT] [FQVY]xxC5C6 (SEQ ID NO: 67).

En algunas modalidades, el dominio de monómero beta integrina comprende la siguiente secuencia: CixxC2 [ß] xx [GHDS] [PK] xC3 [?] [x] C4xxxx [a] xxx ( [GR] xx) x [?] xRC5 [ DNAE ] xxxxL [ß?] xx [GN] C6 (SEQ ID NO: 68); a se selecciona de: W, Y, F, y L; ß se selecciona de: V, I, L, A, M, y F; ? se selecciona de: G, A, S, ' y T; d se selecciona de: K, R, E, Q, y D; e se selecciona de: V, A, S, y T; y se selecciona de: D, E, y N.

En algunas modalidades, el dominio de monómero Ca-EGF comprende la siguiente secuencia: DfVILF] [DN] ECiXX (xx)xxxxC2 [PDG] ( Dx ) xxxxxC3xNxxG [ SGT] [FY]xC4x(x xx) xC5x [GSN] [aS] xxxxxx (xxxxx) xxC6 (SEQ ID NO: 69).

En algunas modalidades, el dominio de monómero Notch/LNR, comprende la siguiente secuencia: Cixx (x [YIFLV] ) xxxC2 [DENS] xxx [NDE] [GK] xC3 [ND] x [DENSA] C4 [NSDE] x[AEG]C5x[WYF]DGxDC6 (SEQ 1D NO: 70).

En algunas modalidades, el dominio de monómero DSL comprende la siguiente secuencia: Cxxxx[Y F] [YFH] [GASN] xxC2xx [FY] C3x [PAE] xx [DA] xx [GLAST] [HRGK] [Y KFW] xC4 [DSGN] xGxxxC5xxG [WLFY] GxxC5 (SEQ ID NO: 71).

En algunas modalidades, el dominio de monómero Anato comprende la siguiente secuencia: CxC2x [ADEHLT] gxxxxxxxx (x) [DERST] C3xxxxxxxx (xx [AERSV] ) C4xx [APV T] [FMQ] [EKLQRTV] [ADEHQRSK] (x) C5C6 (SEQ ID NO: 72).

En algunas modalidades, el dominio de monómero beta integrina comprende la siguiente secuencia: Ci [AEGKQRST] [KREQD] C2 [ IL] [AELQRV] [VILAS] [DGHS] [KP] C3 [GAST] [WY ]C xxxx[FL]xxxx(xxxx[VILAR]R)C5[AND] [DILRT] [ IKLPQRV] [ADEPS] [AE NQ]L[IKLQV]x[ADKNR] [GN]C6 (SEQ ID NO: 73).

Los polinucleótidos que codifican los dominios de monómero típicamente se emplean para hacer dominios de monómero por medio de expresión. Los ácidos nucleicos que codifican dominios de monómero pueden derivarse de una variedad de fuentes diferentes. Las bibliotecas de dominios de monómero pueden prepararse al expresar una pluralidad de ácidos nucleicos diferentes* que codifican dominios de monómero que se presentan naturalmente, dominios de monómero alterados (esto es, variante de dominio de monómeros), o combinaciones de los mismos. Por ejemplo, las bibliotecas pueden diseñarse en las cuales un andamiaje de aminoácidos permanece constante (por ejemplo, un dominio del receptor LDL A, dominio EGF) mientras que los aminoácidos intervenidos en el andamiaje comprenden aminoácidos aleatoriamente generados.

También se proporcionan en la presente métodos para identificar dominios de monómero que enlazan a un ligando seleccionado o deseado o mezcla de ligandos. En algunas modalidades, los dominios de monómero se identifican o seleccionan por una propiedad deseada (por ejemplo, afinidad de enlace) y luego los dominios de monómero se forman en multimeros. Ver Figura 6. Para aquellas modalidades, cualquier método que resulta en selección de dominios con una propiedad deseada (por ejemplo,, una propiedad de enlace especifica) puede usar'se. Por ejemplo, los métodos pueden comprender proporcionar una pluralidad de ácidos nucleicos diferentes, cada ácido nucleico que codifica un dominio de monómero; traducir la pluralidad de ácidos nucleicos diferentes, por ello proporciona una pluralidad de dominios de monómero diferentes; seleccionar la pluralidad de dominios de monómero diferentes para enlace del ligando deseado o una mezcla de ligandos; e, identificar miembros de la pluralidad de dominios de monómero . diferentes que enlazan el ligando deseado o mezcla de ligandos.

Los dominios de monómero pueden ser no recombinantes (por ejemplo, aislados de una célula) o alterados (por ejemplo, variantes recombinantes) . El término "no recombinante" se usa en este contexto para indicar que una secuencia de proteina puede encontrarse en la naturaleza. Por ejemplo, los dominios de monómero no recombinantes pueden incluir dominios de monómero humanos u opcionalmente , dominios derivados de especies o fuentes diferentes, por ejemplo, mamíferos, primates, roedores, peces, pájaros, reptiles, plantas, etc. Los dominios de monómero no recombinantes pueden obtenerse por un número de métodos, por ejemplo, por amplificación- PCR de ADN genómico o cADN.

Los dominios de monómero descritos en la presente, ya sea un elemento de una proteína de enlace o no, pueden ser variantes recombinantes o dominios no recombinante. Las bibliotecas de dominio.s de monómero pueden contener dominio de monómero no recombinante, variantes de dominio de monómero recombinantes, o una combinación de los mismos.

Las variantes de dominio de monómeros pueden incluir dominios ancestrales, dominios quiméricos, dominios aleatorios, dominios mutados, y similares. Por ejemplo, los dominios ancestrales - pueden basarse en análisis filogenéticos . Los dominios quiméricos son dominios en los cuales una o más regiones se reemplazan por regiones correspondientes de otros dominios de la misma familia. Por ejemplo, los dominios quiméricos pueden construirse al combinar secuencias de rizo de dominios relacionados múltiples de la misma familia para formar dominios novedosos con inmunogenicidad potencialmente disminuida. Aquellos de experiencia en . la técnica reconocerán el beneficio inmunológico de construir monómeros de dominio de enlace modificados al combinar regiones de rizo de varios dominios relacionados de la misma familia en vez de crear secuencias de aminoácido aleatorias. Por ejemplo, al construir dominios variantes al combinar secuencias de rizo o aún secuencias de rizo múltiples que ocurren naturalmente en dominios clase A del receptor LDL humano, los dominios resultantes pueden contener propiedades de enlace novedosas pero no pueden contener cualquiera de las secuencias de proteina inmunogenicas debido a que todos de los rizos expuestos son de origen humano. La combinación de secuencias de aminoácidos de rizo en el contexto endógeno puede aplicarse a todos de los constructos de monómero descritos en la presente. De esta manera también se proporciona un método para generar una biblioteca de dominios de monómero quiméricos derivados de proteínas humanas, el método que comprende: proporcionar secuencias de rizo correspondientes a al menos un rizo de cada uno de al menos dos variantes que se presentan naturalmente diferentes de una proteina humana, en donde las secuencias de rizo son secuencias de polinucleótido o polipéptido; y secuencias de rizo covalentemente combinadas para generar una colección de al menos dos secuencias quiméricas diferentes, en donde cada secuencia quimérica codifica un dominio de monómero quimérico que tiene al menos dos rizos. Típicamente,- un dominio quimérico tiene al menos cuatro rizos, y usualmente al menos seis rizos. Como se describe arriba, la descripción actual proporciona tres tipos de rizos que se identifican por características específicas, tales como, potencial para enlace de disulfuro, poteado entre estructuras de proteína secundarias, y dinámicas moleculares (esto es, flexibilidad). Los tres tipos de secuencias de rizo son una secuencia de rizo definida por cisteiná, una secuencia de rizo definida por estructura, y una secuencia de rizo definida por el factor B.

Los dominios aleatorios son dominios en los cuales una o más regiones son aleatorias. La aleatorización puede basarse en aleatorización completa, u opcionalmente, aleatorización parcial basada en distribución natural de diversidad de secuencia .

La descripción actual también proporciona ácidos nucleicos recombinantes que codifican una o más proteínas de enlace que comprenden una o una pluralidad de dominios de monómero que enlazan FGFRlc o ß-Klotho o tanto FGFRlc como ß-Klotho. Por ejemplo, la proteína de enlace puede seleccionarse para comprender un dominio no recombinante del grupo que consiste de: un dominio tipo EGF, un dominio Kringle, un dominio tipo I de fibronectina , un dominio tipo II de fibronectina, un dominio tipo III de fibronectina, un dominio PAN, un dominio Gla, un dominio SRCR, un dominio inhibidor de tripsina pancréatica de bovino/Kunitz, un domnio inhibidor de serina proteasa tipo Kazal, un dominio (tipo P) de trébol, un dominio 'tipo C del factor von Willebrand, un dominio tipo Anafilatoxina, un dominio CUB, una repetición de tipo I de tiroglobulina, dominio clase A del receptor LDL, un dominio Sushi, un dominio Link, un dominio tipo I de Tromboespondina, un dominio tipo inmunoglobulina, un dominio de lectina tipo C, un dominio MAM, un dominio tipo A del factor von Willebrand, un dominio de Somatomedina B, un dominio de cuatro núcleos de disulfuro tipo WAP, un dominio tipo C F5/8, un dominio, de Hemopexina, un dominio SH2, un dominio SH3, un dominio tipo EGF tipo Laminina, un dominio C2 y variantes de uno o más de los mismos. En otra modalidad, el polipéptido que se presenta naturalmente codifica un dominio de monómero encontrado e la base de datos Pfam y/o la base de datos SMART.

Todas las composiciones de la descripción actual, incluyendo las proteínas de enlace producidas por los métodos descritos en la presente y/o descritos en la presente, por ejemplo, dominios de monómero, multímeros y bibliotecas de los mismos, pueden enlazarse opcionalmente a una matriz de un material de afinidad. Los éjemplos de material de afinidad incluyen perlas, una columna,, un soporte sólido, una microconfiguración, otros grupos de soportes de reactivo, y similares.

Además, todas las proteínas de enlace producidas por los métodos descritos en la presente y/o descritas en la presente pueden opcionalmente comprender aminoácidos que no se presentan naturalmente. El término "aminoácido que no se presenta naturalmente" también incluye, pero no se limita a, aminoácidos que ocurren por modificación (por ejemplo, modificaciones post-traduccionales). de un aminoácido que se codifica naturalmente (incluyendo pero no limitado a, los 20 aminoácidos comunes) pero, no se incorporan naturalmente por sí mismos en una cadena de polipéptido en crecimiento por el complejo de traducción. Los ejemplos de tales aminoácidos que no se presentan naturalmente incluyen, pero no se limitan a, N-acetilglucosaminil-L-serina, -acetilglucosaminil-L-treonina, O-fosfotirosina, y aquellos proporcionados anteriormente.

III. MONÓMEROS DE LA DESCRIPCIÓN ACTUAL La descripción actual proporciona proteínas de enlace que comprenden uno. o más monómeros. En particular, métodos, composiciones y kits, asi como dominios de monómero discretos que enlazan a FGFRlc y/o ß-Klotho, y que pueden formar elementos de un multimero (también conocidos como una proteina de mosaico combinatoria o una proteina de mosaico recombinante) que comprende dos o más dominios de monómero que se unen por medio, de una ligadura se describen. Los multimeros pueden seleccionarse para identificar aquellos que tienen un fenotipo mejorado tal como avidez o afinidad mejorada o especificidad alterada por el ligando o la mezcla de ligandos, comparados con el dominio de monómero discreto; se proporcionan multimeros . identificados usandos estos y otros enfoques.

Los dominios de monómero pueden ser de cualquier tamaño. En algunas modalidades, los dominios de monómero tienen alrededor de 25 hasta alrededor de 500, alrededor de 30 hasta alrededor de 200, alrededor de 30 hasta alrededor de 100, alrededor de 35 hasta alrededor de 50, alrededor de 35 hasta alrededor de 100, alrededor de 90 hasta alrededor de 200, alrededor de 30 hasta alrededor de 250, alrededor de 30 hasta alrededor de 60, alrededor de 9 hasta alrededor de 150, alrededor de 100 hasta alrededor de 150, alrededor de 25 hasta alrededor de 50, o alrededor de 30 hasta alrededor de 150 aminoácidos. De manera similar, un dominio de monómero puede comprender, por ejemplo, desde alrededor de 30 hasta alrededor de 200 aminoácidos; desde alrededor de 25 hasta alrededor de 180 aminoácidos; desde alrededor, de 40 hasta alrededor de 150 aminoácidos; desde alrededor de 50 hasta alrededor de 130 aminoácidos; o desde alrededor de 75 hasta alrededor de 125 aminoácidos. ' Los dominios de monómero pueden típicamente mantener una conformación estable en solución, y a menudo están estables al calor, por ejemplo, estable a 95°C durante al menos 10 minutos sin pérdida de afinidad de enlace. En algunas modalidades, los dominios de monómero pueden plegarse independientemente en una conformación estable. ' En una modalidad, la conformación estable se estabiliza por iones (por ejemplo, tal como iones de metal o calcio) . La conformación estable puede opcionalmente contener los enlaces de disulfuro (por ejemplo, al menos uno, dos, o tres o más enlaces de disulfuro) . Los enlaces de disulfuro pueden opcionalmente formarse entre dos residuos de cisteína. En algunas modalidades, los dominios de monómero, o variantes de dominio de monómero, son sustancialmente idénticos. a las secuencias ejemplificadas.

Como se describe en la presente, los dominios de monómero pueden ser ricos en cisteína. Los dominios de monómero ricos en cisteína adecuados incluyen, por ejemplo, el dominio clase A del receptor LDL ("dominio A") o el dominio tipo EGF. Los dominios de monómero también pueden tener un grupo de residuos negativamente cargados. Específicamente, los dominios A (algunas veces nombrados "repeticiones tipo complemento") contienen alrededor de 30-50 o 30-65 aminoácidos. En algunas modalidades, los dominios comprenden alrededor de 35-45 aminoácidos y en algunos casos alrededor de 40 aminoácidos. Dentro de los 30-50 aminoácidos, existe un número par de residuos de cisteína, típicamente alrededor de 6 residuos de cisteína. De las seis cisteínas, los enlaces de disulfuro típicamente se encuentran entre las siguientes cisteínas: Cl y C3, C2 y C5, C4 y C6. El dominio A constituye una porción de enlace al ligando. Los residuos de . cisteína del dominio están ligados a disulfuro para formar una porción compacta, estable, funcionalmente independiente. Los grupos de estas repeticiones hacen un dominio de enlace de ligando, y la agrupación diferencial puede impartir especificidad con respecto al enlace de ligando.

Otras características de dominios de monómero incluyen la capacidad de enlazar ligandos (por ejemplo, como en el dominio clase A del receptor LDL, o el dominio CÜB (Clr/Cls de complemento, Uegf, y dominio de proteína-1 morfogénico del hueso), la. capacidad de participar en endocitosis o internalización (por ejemplo, como en la cola citoplásmica del receptor LDL o la cola citoplásmica de Megalin) , la capacidad de enlazar un ión (por ejemplo, enlace Ca2+ por el dominio A del receptor LDL) , y/o la capacidad para involucrarse en adhesión celular (por ejemplo, como en el dominio tipo EGF) . Otros dominios de monómero que enlazan iones para mantener su estructura secundaria incluyen, por ejemplo, dominio A, dominio EGF, EF Hand (por ejemplo, tal como aquellos encontrados en la presente en calmodulina y troponina C) , dominio de Cadherina, lectina tipo C, dominioi C2, Anexina, dominio Gla, dominio tipo 3 de Tromboespondina, todos de los cuales enlazan calcio, y dedos de zinc (por ejemplo, tipo C2H2, tipo C3HC4 (dedo RING), dominio de enlace de Integrasa de Zinc, dedo PHD, dedo de zinc GATA, dedo de zinc FYVE, dedo de zinc de cuadro B) , que enlaza zinc.

Las características de un dominio de monómero incluyen la capacidad de plegar independientemente y la capacidad de formar una estructura estable. De esta manera, la estructura del dominio de monómero a .menudo se conserva, aunque la secuencia de polinucleótido que codifica el monómero no necesita conservarse. Por ejemplo, la estructura de dominio A se conserva entre los miembros de la familia de dominio A, aunque la secuencia de ácido nucleico de dominio A no se conserva. De esta manera, por ejemplo, un dominio de monómero se clasifica como un dominio A por sus residuos de cisteina y su afinidad para calcio, no necesariamente por su secuencia de ácido nucleico.

Como se describe en la presente, los dominios de monómero pueden seleccionarse por la capacidad de enlazar a objetivos diferentes del objetivo que un dominio que se presenta naturalmente' homólogo puede enlazar. De esta manera, en algunas modalidades, los dominios de monómero (y multimeros que comprenden tales monómeros) se proporcionan que no enlazan al objetivo o la clase o familia de proteínas objetivo que un dominio que se presenta, naturalmente homólogo puede enlazar.

III .A. Proteínas de enlace FGFRlc En algunos aspectos, los dominios de monómero se proporcionan que enlazan a (por ejemplo, selectivamente enlazan) FGFRlc humano o una porción del mismo. Una porción de FGFRlc puede comprender, por ejemplo, al menos 5, 10, 15, 20, 30, 50, 100, o más aminoácidos contiguos del polipéptido. En algunas modalidades, los monómeros enlazarán a FGFRlc con una afinidad más fuerte que 10"3 (por ejemplo, 10"4 M, etc.). En algunas modalidades, la afinidad es más fuerte que 10~4 M, 10"5 M, 10"6 M, 10"7 M, 10"8 M, 10"9 M o 10"10 M.

Un número grande de secuencias de enlace FGFRlc se generaron que tienen un andamiaje de dominio A. Como se describe en detalle en los Ejemplos, se identificaron tres familias (esto es, Familias 1-3, o "Fam 1-3") de dominios de monómero que enlazan a FGFRlc. Las porciones de consenso generadas basadas en estas familias indican residuos de aminoácido comunes entre los aglutinantes dentro de la familia .

III. A.1. Secuencias.de la Familia 1 La familia 1 tiene la siguiente porción de consenso (SEQ ID NO: 74) : C [AGLQRV] [ALPST] [DGINRS] [ELQ] P'[ PQT] C [GHKNQRS] [DGNS] [GST] [EGKNRS] [IRST-]C[ILV] [PS] [LPQRV] [AHKPQRT] [ LRV] CDG [ DEV] [ DNP] DC [ EGR] D [DGNS] SDE[AEKST] [DGNPS] [AD-] [IH-]C Las secuencias ejemplares que comprenden la porción de la Familia 1 de FGFRlc incluyen las siguientes secuencias: CASGQFQCSNGNCVPQHWVCDGD DCEDNSDEEDC (SEQ ID NO: 75), CASGQFTCRSTNICLSLAWLCDGDDDCEDNSDESPAIC (SEQ ID NO: 76), CGAGLFTCRSTKICISQAWVCDGVDDCEDNSDEKNC (SEQ ID NO: 77), CRSRQFQCKGSSTCIPVQWVCDGDNDCGDSSDEAGC (SEQ ID NO: 78), CGAGQFQCRSTNICISLK VCDGVDDCEDNSDETSC (SEQ ID NO: 79), CGAGQFQCRSTNICVSLAWRCDGEDDCEDNSDETSC (SEQ ID NO: 80), CGAGQFTCNSTNICISPRWVCDGVNDCEDNSDEKNC SEQ ID NO: 81) , CGAGQFTCRDTNICISRAWRCDGVDDCEDNSDEADC SEQ ID NO: 82) , CGAGQFTCRSTKICISQA VCDGVDDCEDNSDEAGC SEQ ID NO: 83) , CGAGQFTCRSTKICISQAWVCDGVDDCEDNSDEKNC SEQ ID NO: 84) , CGAGQFTCRST ICISQAWVCDGVDDCEDNSDETSC SEQ ID NO: 85) , CGAGQFTCRSTNICLPLQWVCDGVDDCEDNSDEAGC SEQ ID NO: 86) , CGANQFTCHNTNICISLTWVCDGVDDCEDGSDESPDHC (SEQ ID NO: 87), CGANQFTCHNTNICISLT VCDGVDDCEDNSDEAGC SEQ ID NO: 88) , CGANQFTCHNT ICISQAWVCDGVDDCEDNSDEKNC SEQ ID NO: 89) , CGARQFPCRGSRICISQPWVCDGDNDCEDNSDEKNC SEQ ID NO: 90) , CGPGQFTCQDTEICISQAWVCDGVDDCEDNSDEKNC SEQ ID NO: 91) , CGPIQFTCRNTNICLSVHWVCDGEDDCEDGSDEEGC SEQ ID NO: 92) , CGPNQFTCRSTNICLSQT VCDGVDDCEDGSDETNC SEQ ID NO: 93) , CGPSQFTCRNTNICISLRWRCDGVDDCEDNSDEEGC SEQ ID NO: 94) , CGSNQFTCRSTNICISQAWVCDGVDDCEDDSDE.TGC SEQ ID NO: 95) , CGSSEFQCRNSRRCI PPAWVCDGDNDCGDSSDEKSC SEQ ID NO: 96) , CGSSQFTCHNTNICLPQA VCDGVDDCEDNSDEKNC SEQ ID NO: 97) , CGSSQFTCHNTNICLPRARVCDGVDDCEDNSDEAGC SEQ ID NO: 98) , CGSSQFTCHNTNICLPRAWVCDGVDDCEDNSDEAGC SEQ ID NO: 99) , CGSSQFTCHNTNICLPRAWVCDGVDDCEDNSDEKNC SEQ ID NO: 100) , CGTGQFTCRSTKICISQA VCDGVDDCEDNSDEKNC SEQ ID NO: 101) , CLSDQFTCRSTNICLPLQWVCDGDDDCEDNSDEEDC SEQ ID NO: 102) , CQSNEFQCRSTGRCISVAWVCDGEDDCRDSSDEADC SEQ ID NO: 103) , CRLNEFPCGSGSCISLH VCDSVPDCRDDSDETDC. (SEQ ID NO : 104), CVPGQFQCNNGNCIPVTWLCDGDNDCGDSSDEAPAHC (SEQ ID NO: 105), CVSGQFQCGNGNCIPQAWLCDGDNDCGDSSDEKDC (SEQ ID NO: 106), y CVSGQFQCGNGNCIPRPWRCDGDNDCGDSSDETGC (SEQ ID NO: 107).

III. A.2. Secuencias de la Familia 2 La Familia 2 tiene la siguiente porción de consenso (SEQ ID NO: 108) : CG [AE] [GS] LFTC [GR] [NRS] [AST] [ KN ] ICIS [ EHQS ] [AV] [ IV] CDG [ I V] DDC [ DE ] DNSDE [ DKMNT ] [NSY]C Las secuencias ejemplares que comprenden la porción de la Familia 2 de FGFRlc incluyen las siguientes secuencias: CGAGLFTCRS TNICISQVWV CDGVDDCEDN SDEDSC (SEQ ID NO: 109) CGAGLFTCRS TNICISQAWV CDGVDDCEDN SDENYC (SEQ ID NO: 110) CGAGLFTCRS TNICISQAWV CDGVDDCEDN SDETNC (SEQ ID NO: 111) CGEGLFTCGS TNICISSAWV CDGVDDCEDN SDENNC (SEQ ID NO: 112) CGEGLFTCRS TNICISHA V CDGVDDCEDN SDENNC (SEQ ID NO: 113) CGEGLFTCRS TNICISEAWI CDGVDDCEDN SDEKNC (SEQ ID NO: 114) CGAGLFTCRS AKICISHAWV CDGIDDCEDN SDENNC (SEQ ID NO: 115) CGAGLFTCRN SKICISQAWV CDGVDDCDDN SDEKYC (SEQ ID NO: 116) CGASLFTCRR SNICISQAWV CDGVDDCEDN SDEMNC (SEQ ID NO: 117) CGAGLFTCRS TKICISQAWV CDGVDDCEDN SDEKNC (SEQ ID NO: 118) III. A.3. Secuencias de la Familia 3 La Familia 3 tiene la siguiente porción de consenso (SEQ ID NO: 119) : CG[APST] [DN] [LMQ] FTC [QR] [RS] TN[IM] CIS [DKPQR] [ATV]WVCDGVD DC [ DE ] D [ DENY] SDE [IQRT ]· [AGTV] C .

Las secuencias ejemplares que comprenden la porción de la Familia 3 de FGFRlc incluyen las siguientes secuencias: CGANLFTCQS TNICISDAWV CDGVDDCEDN SDETTC (SEQ ID NO: 120), CGTNMFTCQR TNICISDAWV CDGVDDCEDY SDETAC (SEQ ID NO: 121), CGTNLFTCRS TNMCISQAWV CDGVDDCEDN SDETVC (SEQ ID NO: 122), CGSNLFTCRR TNICISKAWV CDGVDDCEDN SDETGC (SEQ ID NO: 123), CGANLFTCRS TNICISPAWV CDGVDDCEDY SDEIGC (SEQ ID NO: 124), CGANLFTCRS TNICISPTWV CDGVDDCDDN SDEIGC (SEQ ID NO: 125) , CGPNLFTCRS TNICISRAWV CDGVDDCDDE SDEQGC (SEQ ID NO: 126), CGSNLFTCRS TNICISPAWV CDGVDDCDDD SDETGC (SEQ ID NO: 127), CGSDMFTCRS TNICISKVWV CDGVDDCEDD SDERGC (SEQ ID NO: 128), y CGSNQFTCRS TNICISQAWV CDGVDDCEDD SDETGC (SEQ ID NO: 129) .

Como se describe en la presente, los dominios de monómero pueden ligarse para formar multímeros que enlazan el mismo objetivo (por ejemplo, FGFRlc). La descripción actual proporciona polipéptidos que comprenden tanto homo (esto es, al menos dos monómeros idénticos) y hetero (esto es, monómeros diferentes que enlazan el mismo objetivo) multímeros. ¦ III. B. Proteínas de enlace de Monómero ß-Klotho En algunos aspectos, los dominios de monómero se proporcionan que enlazan a (por ejemplo, selectivamente enlazans) un polipéptido ß-Klotho o una porción del mismo. Una porción de un polipéptido puede ser, por ejemplo, al menos 5, 10, 15, 20, 30, 50, 100, o más aminoácidos contiguos del polipéptido. En algunas modalidades, los monómeros enlazarán a ß-Klotho con una afinidad más fuerte que 10"3 M (por ejemplo, 10"4 M, etc.). En algunas modalidades, la afinidad es más fuerte que 10~4 , 10"5 M, 10"6 M, 10"7 M, 10"8 o 10"9 M.

Un número grande de secuencias de enlace ß-Klotho se generaron que tienen un andamiaje de dominio A. Como se describe en detalle en los ejemplos, se identificaron cinco familias (esto es, ' Familias 6-9, o "Fam 6-9") de dominios de monómero que enlazan a ß-Klotho. Las porciones de consenso generadas con base en estas familias indican residuos de aminoácido comunes entre los aglutinantes dentro de la familia. Además de un número de secuencias de enlace ß-Klotho se generaron que tienen un andamiaje LNR/Notch. Como se describe en detalle en los Ejemplos, se ha identificado una familia (Familia 5 o "Fam 5") de dominios de monómero LNR/Notch que enlazan a ß-Klotho. Las porciones de consenso generadas con base en esta familia indica residuos de aminoácido comunes entre los aglutinantes dentro de la familia.

III. B.l. Secuencias de la Familia 4 La Familia 4 tiene la siguiente porción de consenso (SEQ ID NO: 130) : C [ LAPRVKQGHS ] [APSHR] [-T] [DNGSHAF] [EHQ] F [HPQTRW] C [GSQRNLHK] [SND] [GSTNY] [RHQGHNSE] [RI T-]C[ILV] [HNPS] [AGHLSQPREV] [ T'PGSRAHN-] [WL] [ILRV]CD[GMW] [GYDVEL] [PWLDN].DC [GERQLK] D [GNDSKWHY] [PQSW]D [EPQY] [APS- ] [LPQS-] [AEHKLTV] [HILSTDNGMVW] C; Las secuencias ejemplares que comprenden la porción de la Familia 4 de ß-Klotho que incluyen las siguientes secuencias : CLPDEFQCG SGRCIPQTW VCDGLNDCGD ' GSDESPAHC (SEQ ID NO: 131); CAANEFTCR SGRCLSRPW LCDGENDCGD GSDEADC (SEQ ID NO: 132); CGSNQFTCR STNICISQAW VCDGVDDCED DSDETGC (SEQ ID NO: 133); CPSNQFPCR STGICIPLAW VCDGLNDCGD GSDESPATC (SEQ ID NO: 134); CPSNQFPCR STGICIPLAW VCDGLNDCGD GSDESPATC (SEQ ID NO: 135); CAANEFRCS NGRCIPEPW LCDGLNDCGD GSDEPPHC (SEQ ID NO: 136); CPSNEFQCQ NSGRCIPRRW LCDGE.DDCGD NSDEASC (SEQ ID NO: 137); CQSSEFQCS NGSCIPRPL VCDGENDCGD SSDETDC (SEQ ID NO: 138); CRPGEFRCR STNTCISQSL RCDGEPDCRD GSDEPEDC (SEQ ID NO: 139) ; CRSSEFPCH GYSTCISLSL LCDGVDDCAD NSDEESC (SEQ ID NO: 140) ; CHHHHFHCL SGECINTW RCDGGPDCKD KSDEENC (SEQ ID NO: 141); CSRAHFHCL SGECIHHH RCDGGPDCKD KSDEENC (SEQ ID NO: 142); CSAFEFHCL SGECIHSSW RCD DWDCKD QPDQLWC (SEQ ID NO: 143); CSAFEFHCL SGECIHSSW RCDWYWDCKD YWDPLVC (SEQ ID NO: 144); CSAFEFHCL SGECIHSSW RCDWDDDCKD WQDYVMC (SEQ ID NO: 145); CSAFEFHCL SGECIHSSW RCDWDLDCKD HPDEVMC (SEQ ID NO: 146); CVPNQFPRG NGSCIPLPL VCDGVDDCLD DSDEKNC (SEQ ID NO: 147); CVPNQFQCG SGRCLPHPL GCDGVDDCLD GSDEASC (SEQ ID NO: 148); CVSDEFPCR DNNICVLLHL LCDGVDDCLD SSDETGC (SEQ ID NO: 149); CAPSQFQCH DNNICLLEGL LCDGEDDCAD GSDEAPVC (SEQ ID NO: 150) CRSSQFPCQ DSNICVLETL LCDGVDDCVD DSDEEDC (SEQ ID NO: 151) ; CRSNQFRCN SGHCLPRPW LCDGVDDCQD DSDETDC (SEQ ID NO: 152); CRPGQFWCN SGRCLPPAW . RCDGVNDCGD DSDEPLALC (SEQ ID NO: 153) CLPNQFRCG NGHCLSRTW VCDGVPDCED NSDESLAHC (SEQ ID NO: 154) CPAGQFQCG NGQCLSLTW LCDGVPDCGD NSDESSALC (SEQ ID NO: 155) CPPSQFTCG NGRCVSLGW VCDGLNDCGD GSDESPALC (SEQ ID NO: 156) CPPSQFTCG NGRCVSLGW VCDGLNDCGD GSDESPALC (SEQ ID NO: 157) CRPNEFPCN NGRCLSQTW VCDGLNDCGD GSDESPELC (SEQ ID NO: 158) CQSNEFRCR SGRCIPQHW LCDGLNDCGD GSDESQQC (SEQ ID NO: 159); CQPDEFTCS SGRCIPQPW LCDGLNDCGD GSDEPPAHC (SEQ ID NO: 160) CQPDEFTCR SGRCIPQPW LCDGLNDCGD GSDEPPGHC (SEQ ID NO: 161) CPPNQFRCG NGHCLSVSW LCDGVPDCGD NSDEALAIC (SEQ ID NO: 162) CRANEFRCN SGRCLSQTW VCDGVDDCED GSDESLAIC (SEQ ID NO: 163) CRANQFTCN NGHCLSRTW LCDGVPDCED NSDESLAIC (SEQ ID NO: 164) CRANQFTCN NGHCLSRTW LCDGVPDCED ' NSDESLAIC (SEQ ID NO: 165] CRANQFTCN NGHCLSRTW LCDGVPDCED NSDESLAIC (SEQ ID NO: 166] CLPGQFRCN SGHCLSQTW VCDGYNDCGD GSDEPLATC (SEQ ID NO: 167; CKPTNEFRCS NGHCISRAL LCDGENDCED NSDETSC (SEQ ID NO: 168) CASSEFQCR STRTCVPLGW VCDGD DCPD NSDETDC (SEQ ID NO: 169) CHSFNQFECR NGQCIPLHL' VCDGVPDCGD NSDETDC (SEQ ID NO: 170) CQATAQFQCD NGHCLSANW RCDGVDDCGD NSDEEDC (SEQ ID NO: 171) CQATAQFQCD NGHCLSANW RCDGVDDCGD NSDEEDC (SEQ ID NO: 172); CKSIAQFECS NGHCLSRTW LCDGVDDCGD NSDEALATC (SEQ ID NO: 173); CRPSEFQCG NGSCLSATW LCDGVPDCGD GSDESPETC (SEQ ID NO: 174); CRPNEFQCG NGHCLSANW LCDGVDDCGD DSDETSC (SEQ ID NO: 175); CPSSQFQCK NGHCLSRTW LCDGVDDCQD GSDESPAIC (SEQ ID NO: 176); CPSSQFQCK NGHCLSRTW LCDGVDDCQD GSDESPATC (SEQ ID NO: 177); CRSSQFQCN NGHCLSPTW VCDGYDDCED GSDEANC (SEQ ID NO: 178); CRSSEFQCN NGHCLSATW VCDGYDDCED GSDEANC (SEQ ID NO: 179); CPANQFRCN NGHCLSRTW VCDGYDDCED GSDEANC (SEQ ID NO: 180); CPANQFRCN NGHCLSGTW LCDGVDDCGD NSDESSATC (SEQ ID NO: 181); CRSSEFQCG NGHCLSRTW LCDGVNDCGD DSDEKNC (SEQ ID NO: 182); CLSNQFQCD NGHCLSLTW RCDGYNDCGD SSDEENC (SEQ ID NO: 183); y CRSSEFKCK NGHCLSATW VCDGYVDCGD DSDEEDC (SEQ ID NO: 184).

III. B.2. Secuencias de la Familia 5 La Familia 5 se generó al hacer la inmunoadsorción de la biblioteca de andamiaje LNR/Notch nativa en ß-Klotho recombinante .

La Familia 5 tiene la siguiente porción de. consenso (SEQ ID NO: 1242) : C[HNP-] [AP-] [HIKLMPRV-] [AEILY] [ADEGQRY] [ADEHIKLNPQS] [ DHLMSY] C [AEKPQT] [AEHKNQRS] [FLR Y] [DFVY] GDG [DEGIKNRSV]C[DEGHN.QRS] [EKPQS] [ADEGHPQ] C [ DGNS ] [FLNS T] [AEPSY] [AEGKR ] C [ADGILNSV] WDG [ DFGLMV] [DN]C (SEQ ID NO: 1242} Las secuencias ejemplares que comprenden la porción de la Familia 5 de ß-Klotho incluyen las siguientes secuencias: CIAAKLCEALDGDGVCHKECDLEECDWDGGDCQRIFLTDPT (SEQ ID NO: 1243); CPPHIEDHCERRDGDGVCQKPCDFYGCLWDGVNCDMDLVQELT (SEQ ID NO: 1244) ; CNPI IQHYCETYDGDGLCESACNFYGCAWDGFDCQVISDKDST (SEQ ID NO: 1245); CMAYNLCTALVGDGECDQECDTPTCNWDGGDCAVKSAPDST (SEQ ID NO: 1246); CMEAKSCQARDGDGDCGQGCNLAECI DGMDCRPE IRELT (SEQ ID NO: 1247); CNPLYDDHCAAFFGDGGCGPECSLAECLWDGGDCEEERDADVT (SEQ ID NO: 1248); CNDVKCKRLDGDGHASNLVTNAECLWDGLDCPDVVISDLT (SEQ ID NO: 1249); CIAAKLCERLDGDGSCQSECGNATCGWDGMDCDEKENDELT (SEQ ID NO: 1250) ; C AYLLCKKYYGDGICRSECDTATCSWDGFDCPVNEIEDLT (SEQ ID NO: 1251) ; CPPHIEDHCERRDGDGVCQKPCDFYGCLWDGVDCDMDLVEELT (SEQ ID NO: 1252); CMAYNLCQALVGDGSCNSECDTETCGWDGMDCATVEGAEAT (SEQ ID NO: 1253); CREYSMCTRFDGDGICHEQCGYPRCLWDGLDCANNFDHEVT (SEQ ID O: 1254); CNPLYDPHCRSYFGDGDCGPGCDLAACLWDGGDCPGVAAAELT (SEQ ID NO 1255) ; CHPLIREYCEKFFGDGGCDSGCNNSRCDWDGDDCGLIQHGDVT (SEQ ID NO 1256) ; CNPLYDDHCAAFFGDGGCGPECSLAECLWDGGDCEEERDADVT (SEQ ID NO 1257) ; CNPKYDAHCASYFGDGECDPACSLAECVWDGDDCDPNFLTDVT (SEQ ID NO 1258) ; CPPHIEDHCERRDGDGVCQKPCDFYGCLWDGVDCDMDLVEELT (SEQ ID NO 1259) ; CNPPIGQYCTQLFGDGDCGPDCDLAECVWDGDDCDPVAVPDVT (SEQ ID NO 1260) ; CNPVYDPYCAAFFGDGGCGPHCGLAECVWDGMDCDHKEVRELT (SEQ ID NO 1261) ; CHPLIREYCTHYDGDGECDKGCDSAKCK DGDDCDMDVLAEVT (SEQ ID NO 1262); CHPLIREYCTHYDGDGECDKGCDSAKCKWDGDDCDMDVLAEVT (SEQ ID. NO 1263) ; III. B.3. Secuencias de la Familia 6 La Familia 6 se generó al mutar ß-Klotho M01 (SEQ ID NO: 493) y seleccionarse para dominios de monómero con afinidad de enlace incrementada para ß-Klotho.

La Familia 6 tiene la siguiente porción de consenso (SEQ ID NO: 185) : C[LMP] [PST] [DH]EF[QR]C[GR]SG[RW]CIP[LQR] [AKRST] W [GV] CDGL NDCGDGSGE [ SW] PA [HLQ] C; Las secuencias ejemplares que comprenden la porción de la Familia 6 ß-Klotho incluyen las siguientes secuencias: CLPDEFQCGSGRCIPLTWVCDGLNDCGDGSDESPAHC (SEQ ID NO: 186); CLPDEFQCRSGRCIPQTWVCDGLNDCGDGSDESPAQC (SEQ ID NO: 187); CLPHEFQCGSGRCIPQTWVCDGLNDCGDGSDEWPAQC (SEQ ID NO: 188); CLPHEFQCRSGRCIPQAWGCDGLNDCGDGSDESPAQC (SEQ ID NO: 189); CLSDEFQCRSGRCIPQRWVCDGLNDCGDGSDEWPAQC (SEQ ID NO: 190); CMPDEFQCRSGRCI PRSWVCDGLNDCGDGSDESPSHC (SEQ. ID NO: 191); CMTDEFRCRSGRCI PQT VCDGLNDCGDGSDEWPAQC (SEQ ID NO: 192); y CPPDEFQCRSGWCIPQKWVCDGLNDCGDGSDESPALC (SEQ ID NO: 193) .

III. B.4. Secuencias de la Familia 7 La Familia 7 se generó al mutar ß-Klotho M25 (SEQ ID NO: 519) y seleccionarse para dominios de monómero con afinidad de enlace incrementada para ß-Klo'tho.

La Familia 7 tiene la siguiente porción de consenso (SEQ ID NO: 194) : C[LRW] [PST] [GS] [AEHQS] F[HQ]C[NS] [NT] GHCLS [APQRS] [ST]WVCD G[FY] [DEVY] DC [DEG] D [GW] SDE [ASV] [KN]C; Las secuencias ejemplares que comprenden la porción de la Familia 7 de ß- lotho incluyen las siguientes secuencias: CLPSQFQCNNGHCLSRTWVCDGYDDCGDWSDESNC (SEQ ID NO: 195) CLSGQFQCSNGHCLSRT VCDGYVDCEDGSDEAKC (SEQ ID NO: 196) CLSSSFQCNNGHCLSRTWVCDGYYDCEDGSDEVNC (SEQ ID NO: 197) CRSGQFQCNNGHCLSATWVCDGYDDCDDGSDEANC (SEQ ID NO: .198) CRSGQFQCNNGHCLSQT VCDGYDDCDDGSDEANC (SEQ ID NO: 199) CRSGQFQCNNGHCLSRTWVCDGYDDCDDGSDEANC (SEQ ID NO: 200) CRSGQFQCNNGHCLSSTWVCDGFDDCEDGSDEANC (SEQ ID NO: 201) CRSSEFQCNNGHCLSATWVCDGYDDCEDG'SDESNC (SEQ ID NO: 202) CRSSEFQCNTGHCLSRTWVCDGYDDCGDGSDEANC (SEQ ID NO: 203) CRTSHFHCNNGHRLSRTWVCDGYEDCEDGSDEANC (SEQ ID NO: 204) CWSSAFQCNNGHCLSPSWVCDGYDDCGDGSDEANC (SEQ ID NO: 205) CRSGQFQCNNGHCLSATWVCDGYDDCDDGSDEANC (SEQ ID NO: 206) III. B.5. Secuencias de la Familia 8 La Familia 8 se generó al mutar ß-Klotho M42 (SEQ ID NO: 305) y seleccionarse para dominios de monómero con afinidad de enlace incrementada para ß-Klotho.

La Familia 8 tiene la siguiente porción de consenso (SEQ ID NO: 207) : C[EQ] [PS] [DE] EF[MRT]C[RS] SGRCIP [QV] [HIST] LCDGLNDCGDGSDE [PR]P[AE] [HQ]C; Las secuencias ejemplares que comprenden la porción de la Familia 8 de ß-Klotho incluyen las siguientes secuencias CEPEEFRCRSGRCIPQTWLCDGLNDCGDGSDEPPAHC (SEQ ID NO: 208) ; CQPDEFTCRSGRCIPQSWLCDGLNDCGDGSDEPPAHC (SEQ ID NO: 209) ; CQPDEFTCSSGRCIPQI LCDGLNDCGDGSDERPEHC (SEQ ID NO: 210) ; y CQSDEFMCSSGRCIPVHWLCDGLNDCGDGSDERPAQC (SEQ ID NO: 211) .

III. B.5. Secuencias de la Familia 9 La Familia 9 se generó al mutar ß-Klotho M50 (SEQ ID NO: 306) y seleccionarse para dominios de monómero con afinidad de enlace incrementada para ß-Klotho.

La Familia 9 tiene la siguiente porción de consenso (SEQ ID NO: 212) : .

C[HNP] [STW]F[HN] [HKQ] F [EK] CRN [GR] QCIPL [HY] LVCDGVPDC [AG] D [DN] SDET [ADY] C; Las secuencias ejemplares que comprenden la porción de la Familia 9 de ß-Klotho incluyen las siguientes secuencias: CHSFNQFECRNRQCIPLYLVCDGVPDCADNSDETDC (SEQ ID NO: 213); CHTFNKFECRNGQCIPLYLVCDGVPDCGDNSDETAC (SEQ ID NO: 214); CNSFNQFECRNRQCIPLYLVCDGVPDCGDNSDETYC (SEQ ID NO: 215); y CPWFHHFKCRNGQRI PLHLVCDGVPDCGDDSDETDC (SEQ ID NO: 216) .

III. C. Proteínas de enlace de Dimero ß-Klotho Como se describe en la presente, los dominios de monómero pueden ligarse para formar multimeros que enlazan el mismo objetivo (por ejemplo, ß-Klotho) . La descripción actual proporciona polipéptidos que comprende tanto homo (esto es, al menos dos monómeros idénticos) y hetero (esto es, monómeros diferentes que enlazan el mismo objetivo) multimeros. Las bibliotecas adicionales, se refiere como "bibliotecas ambulantes," se generaron al ligar monómeros seleccionados del despliegue de fagos (esto es monómeros seleccionados) con la representación completa de una biblioteca de monómeros nativa.

En algunos aspectos, los dominios de dimero se proporcionan que enlazan a (por ejemplo, selectivamente enlazans) un polipéptido ß-Klotho o una porción del mismo. Una porción de un polipéptido puede ser, por ejemplo, al menos 5, 10, 15, 20, 30, 50, 100, o más aminoácidos contiguos del polipéptido. En algunas modalidades, los dimeros enlazarán a ß-Klotho con una afinidad más fuerte que 10"3 (por ejemplo, 10~4 , etc.). En algunas modalidades, la afinidad es más fuerte que 10~4 M, 10"5 M, 10"6 M, 10"7 M, 10"8, 10"9 M o 10"10 M.

Un número grande de secuencias de enlace ß-Klotho se generaron que comprenden dos dominios de monómero. Como se describe en detalle en los ejemplos, doce familias (esto es, Familias 10-21, o "Fam 10-21") de dominios de monómero que enlazan a ß-Klotho se han identificado. Estos se resumen en la Figura 14. Las porciones de consenso generadas con base en estas familias indican residuos de aminoácido comunes entre los aglutinantes dentro de la familia.

III. C.l. Secuencias de la Familia 10 La Familia 10 se generó al ligar la representación completa de una colección de monómero nativa para la terminal C de ß-Klotho M01 (SEQ . ID NO: 493) y seleccionarse para dominios de dimero con afinidad de enlace incrementada para ß-Klotho.

La Familia 10 tiene la siguiente porción de consenso para el segundo dominio (SEQ ID NO: 217): C [ ELPQR] [APS] [DGIN] [EGQ] [FQ] [FKPQRT] [- E]C[GNRS] [NS] G [HNQR] C [IV] P [AELPQRV] [AHPQRT] W [LRV] CDG [ DEV] [DNP ] DC[GLQ] D[DGNS] SDE [AEKT] [DGLNS] [-A] [-H]C Las secuencias ejemplares que . comprenden la porción de la Familia 10 de ß-Klotho (segundo dominio) incluyen las siguientes secuencias: betaKlotho DOl GRAGEFRCSNGRCVPLTWLCDGEDDCQDNSDEKNC (SEQ ID NO: 218) ; betaKlothoWD02 CPSSEFRCNNGRCIPLHWVCDGDDDCQDNSDETDC (SEQ ID NO: 219) ; betaKlotho D03 CRPGEFRCNNGRCVPQTWVCDGEDDCGDNSDETDC (SEQ ID NO: 220) ; betaKlothoWD04 CLSDQFRCGNGRCVPRA LCDGDNDCQDGSDETNC ( SEQ ID NO: 221) ; betaKlothoWD05 CLPGQFPCGNGRCIPETWLCDGDDDCQDGSDEKGC (SEQ ID NO: 222) ; betaKlothoWD06 CQPNEFQCGNGRCIPAQWLCDGEDDCQDNSDEEDC (SEQ ID NO: 223) ; betaKlotho D07 CESIGQFECGNGHCIPPTWLCDGVNDCQDSSDEALAHC (SEQ ID NO: 224) betaKlothoWD08 CQSNEFRCRNGQCIPLTWLCDGDNDCLDSSDEESC (SEQ ID NO: 225) ; betaKlothoWD09 CPSGEFTCGSGRCIPPTWVCDGEPDCLDGSDEKSC (SEQ ID NO: 226) ; betaKlothoWDlO CLPDEFKCGSGRCI PLRWVCDGDDDCQDGSDETDC (SEQ ID NO: 227) ; betaKlotho D15 CPSNQFPCRSTGICIPLAWVCDGLNDCGDGSDESPATC (SEQ ID NO: 228) BK_Rlc_Dl4 CRSDEFRCGNGRCIPLTWVCDGEDDCQDSSDETGC (SEQ ID NO: 229) ; BK_Rlc_Dl5 CRSNQFTCGNGNCIPQPWVCDGEDDCGDDSDEESC (SEQ ID NO: 230) ; y BK_Rlc_Dl6 CPPGQFRCNNGRCIPVHWRCDGENDCQDDSDEKSC (SEQ ID NO: 231) .

III. C.2. Secuencias de la Familia 11 La Familia 11 se generó al ligar la representación completa de una colección de monómero nativa a la terminal N de ß-Klotho M01 (SEQ ID NO: 493) y seleccionarse para dominios de dimero con afinidad de enlace incrementada para ß-Klotho.

La Familia 11 tiene la siguiente porción de consenso para el segundo dominio (SEQ ID NO: 232): C [AGLP] PD [EQ] F [KR] C [GKNRS] SG [NQRS] C [IL] P [ELQ] [DHNT] W [LRV] CDG [ DLV] [DN] DC [EGV] D [GS] SDE [AET] [DGNP] [-D] [-L]C Las secuencias ejemplares que comprenden la porción de la Familia 11 de. ß-Klotho (segundo dominio) incluyen las siguientes secuencias:-betaKlothoWDll CPPDQFRCRSGRCIPQH LCDGLNDCGDGSDEANC (SEQ ID NO: 233) ; betaKlotho D12 CAPDQFRCSSGQCIPETWLCDGDDDCVDSSDEAGC (SEQ ID NO: 234) ; betaKlotho D13 CGPDEFRCNSGRCLPLD RCDGVDDCEDGSDEAPDLC (SEQ ID NO: 235) ; betaKlotho D14 CGPDQFRCKSGNCLPLNWVCDGVDDCGDSSDEEGC (SEQ ID NO: 236) ; betaKlotho D16 CLPDEFRCGSGRCI PQTWVCDGLNDCGDGSDETGC (SEQ ID NO: 237) ; BK Rlc D06 CAPDQFRCSSGQCIPET LCDGDDDCVDSSDEAGC (SEQ ID NO: 238) ; y BK_Rlc_D12 CGPDQFKCNSGSCIPLT VCDGDNDCGDDSDETDC (SEQ ID NO: 239) .

III. C.3. Secuencias de la Familia 12 La Familia 12 se generó al ligar la representación completa de una colección de monómero nativa a la terminal N of ß-Klotho 06 (SEQ ID NO: 499) y seleccionarse para dominios de dimero con afinidad de enlace incrementada para ß-Klotho.

La Familia 12 tiene la siguiente porción de consenso para el segundo dominio (SEQ ID NO: 240) : CA[PS] [DNS] [EQ] F [QR] C [GH] [DN] [GNT] [GHN] [- IT]C[IL] [LPS] [ER] [AGT] [WL]LC DG [ DEV] [DN] DC [AEG] DGSDE [AE] [DG]C Las secuencias ejemplares que comprenden la porción de la Familia 12 de ß-Klotho (segundo dominio) incluyen las siguientes secuencias: betaKlotho D18 CASNQFRCGÑGHCLSRT LCDGVNDCEDGSDEADC (SEQ ID NO: 241) ; betaKlotho WD19 CAPDEFRCHNTGTCI PRAWLCDGDNDCGDGSDEEGC ( SEQ ID NO: 242) ; betaKlotho WD20 CAPSQFQCHDNNICLLEGLLCDGEDDCADGSDEADC ID NO: 243) ; y BK_Rlc_D09 CASNQFRCGNGHCLSRTWLCDGVNDCEDGSDEADC ( SEQ ID NO: 244) .

III. C.4. Secuencias de la Familia 13 La Familia 13 se generó al ligar la representación completa de una biblioteca de monómeros nativa para la terminal C de ß-Klotho M06 (SEQ ID NO: 499) y . seleccionarse para dominios de dimero con afinidad de enlace incrementada para ß-Klotho.

La Familia 13 tiene la siguiente porción de consenso para el segundo dominio (SEQ ID NO: 245) : C[AP]P[DG] [EQ] F[RT]C.[KNR] [NS ] G [QR] C [ IV] P [LQ] [AHP] W [LV] CDG [ DE] [ DN] DC [GQ] DNSDE [EST] [DNP] [-A] [-T]C Las secuencias ejemplares que comprenden la porción de la Familia 13 de ß-Klotho (segundo dominio) incluyen las siguientes secuencias: betaKlothoWD17 CPPDQFRCRNGRCVPLAWVCDGEDDCQDNSDETDC (SEQ ID NO: 246); BK_Rlc_D19 CAPGEFTCKSGQCIPLHWLCDGDNDCGDNSDESPATC (SEQ ID NO: 247) ; y BK_Rlc_D20 CPPGQFRCNNGRCIPQP LCDGDDDCQDNSDEENC (SEQ ID NO: 248) .

III. C.5. Secuencias de la Familia 14 La Familia 14 se generó al ligar la representación completa de una biblioteca de monómeros nativa a la terminal N of ß-Klotho M08 (SEQ ID NO: 694) y seleccionarse para dominios de dimero con afinidad de enlace incrementada para ß-Klotho.

La Familia 14 tiene la siguiente porción de consenso para el segundo dominio (SEQ ID NO: 249) : C[AGPR] [AP] [DGNS] [EQ] F [QRT] C [GSK] N [GT] [GHR] [- R]C[ILV] [PS] [ALQ] [NST ] W [ LRV] CDG [ DEV] DDC [GL] DGSDE [AET ] [DNS] [-A] [-T]C Las secuencias ejemplares que comprenden la porción de la Familia 14 de ß-Klotho (segundo dominio) incluyen las siguientes secuencias: betaKlotho WD21 CAPGEFTCKNTGRCIPLNWRCDGDDDCGDGSDETDC (SEQ ID NO: 250) ; betaKlotho WD22 CPADEFRCSNTGRCVPLSWLCDGEDDCGDGSDETNC (SEQ ID NO: 251) ; betaKlotho WD23 CGPSQFQCSNGRCLPATWVCDGDDDCLDGSDEASATC (SEQ ID NO: 252) ; y BK_Rlc_D25 CRPNEFRCGNGHCLSQTWVCDGVDDCLDGSDEESC (SEQ ID NO: 253) .

III. C.6. Secuencias d la Familia 15 La Familia 15 se generó al ligar la representación completa de una biblioteca de monómeros nativa a la terminal N of ß-Klotho M21 (SEQ ID NO: 508) y seleccionarse para dominios de dimero con afinidad de enlace incrementada para ß-Klotho.

La Familia 15 tiene la siguiente porción de consenso para el segundo dominio (SEQ ID NO: 254) : C[AGP] [APS] [DGN] [EQ] F [QRT] C [GNRS] [GNS] [GT] [GKQS] [-IK] C[ILV] P [LQRV] [ EHP ] W [ LRV] CDG [ DLV] [DN] DCGD [GN] SDE [AEKPS] [GL PS] [-AEV] [-IT]C Las secuencias ejemplares que comprenden la porción de la Familia 15 de ß-Klotho (segundo dominio) incluyen las siguientes secuencias: betaKlotho WD27 CGPDQFRCSSGKCIPQHWLCDGLNDCGDGSDESPATC (SEQ ID NO: 255) ; betaKlotho WD28 CGANEFQCRSTGICVPVE VCDGDNDCGDGSDEPPVC (SEQ ID NO: 256) ; betaKlotho WD29 CGADQFRCGNGSCVPRAWRCDGVDDCGDGSDEAPEIC (SEQ ID NO: 257) ; betaKlotho WD25 CGPDEFRCNNGQCIPLPWRCDGVDDCGDNSDEPLEIC (SEQ ID NO: 258) ; BK_Rlc_D08 CASGEFTCNNGQCVPLAWRCDGVNDCQDGSDEKGC (SEQ ID NO: 259); BK_Rlc_Dll CGPDEFRCNNGQCI PLPWRCDGVDDCGDNSDEPLEIC (SEQ ID NO: 260) ; y BK_Rlc_D18 CPPDEFQCRGTKKCLPLAWVCDGDNDCEDDSDEESC (SEQ ID NO: 261) .

III. C.7. Secuencias de la Familia 16 La Familia 16 se generó al ligar la representación completa de una biblioteca de- monómeros nativa para la terminal C of ß-Klotho M2.1 (SEQ ID NO: 508) y seleccionarse para dominios de dímero con afinidad de enlace incrementada para ß-Klotho.

La Familia 16 tiene la siguiente porción de consenso para el segundo dominio (SEQ ID NO: 262) : C[AP] [AP] [GN]QF[RT]C[GR]NG[NS]CIP[AL] [HT] W [LV] CDGDNDC [GQ] D [GN ] SDE [ET] [DN]C Las secuencias ejemplares que comprenden la porción de la Familia 17 de. ß-Klotho (segundo dominio) incluyen las siguientes secuencias: betaKlotho WD24 CPPGQFRCRNGSCI PATWLCDGDNDCGDNSDEEDC (SEQ ID NO: 263) ; y betaKlotho WD26 CAANQFTCGNGNCI PLHWVCDGDNDCQDGSDETNC (SEQ ID NO:264) .

III. C.8. Secuencias de la Familia 17 La Familia 17 se generó al ligar la representación completa de una biblioteca de monómeros nativa a la terminal N of ß-Klotho M42 (SEQ ID NO: 305) y seleccionarse para dominios de dimero con afinidad de enlace incrementada para ß-Klotho.

La Familia 17 tiene la siguiente porción de consenso para el segundo dominio (SEQ ID NO: 265) : C[APQR] [ASP] [DG] [EQ] F [PQ] C [EKNR] [NS] [GT] [GHN] [-R]C[ILV] [PS] [ALPR] [ANRT] W [LRV] CDG [EV] [DN] DC [AGR] D [GNS] SDE [AEK S] [GLNS] [-A] [-H]C Las secuencias ejemplares que comprenden la porción de la Familia 17 de ß-Klot o (segundo dominio) incluyen las siguientes secuencias: betaKlotho D31 CAPDQFRCKSGNCIPLA RCDGEDDCRDGSDEESC (SEQ ID NO: 266) ; betaKlotho WD32 CQAGQFQCESGNCVPPN LCDGENDCADSSDEANC (SEQ ID NO: 267) ; BK_Rlc_D21 CPSGQFQCNNGHCLSAT LCDGVDDCGDGSDEKGC (SEQ ID NO: 268) ; y BK_Rlc_D24 CRPDEFPCRSTGRCVPRRWVCDGVDDCGDNSDESLAHC (SEQ ID NO: 269) . . .

III. C.9. Secuencias de la Familia 18 La Familia 18 se generó al ligar la representación completa de una biblioteca de monómeros nativa para la terminal C of ß-Klotho M42 (SEQ ID NO: 305) y seleccionarse para dominios de dímero con afinidad de enlace incrementada para ß-Klotho.

La Familia 18 tiene la siguiente porción de consenso para el segundo dominio (SEQ ID NO: 270) : CRP [DG] EF [QR] C [GKR] [NS] G [HR] C [ IV] P [GLQ] [ PT] W [RV] CDG [ DE] [DP]DC QD [GS] SDE [AET] [DGN] C Las secuencias ejemplares que comprenden la porción de la Familia 18 de ß-Klotho (segundo dominio) incluyen las siguientes secuencias: betaKlotho D30 CRPGEFQCGSGHCIPGPWVCDGDPDCQDGSDEANC (SEQ ID NO: 271) ; BK_Rlc_D22 CRPDEFRCKNGRCIPQTWVCDGEDDCQDSSDETDC (SEQ ID NO: 272) ; y BK_Rlc_D23 CRPDEFRCRNGRCVPLT RCDGEDDCQDGSDEEGC (SEQ ID NO: 273) .

III. CIO. Secuencias de la Familia 19 La Familia 19. se generó al ligar la representación completa de una biblioteca de monómeros nativa a la terminal N of ß-Klotho M50 (SEQ ID NO: 306) y seleccionarse para dominios de dimero con afinidad de enlace incrementada para ß-Klotho.

La Familia 19 tiene la siguiente porción de consenso para el segundo dominio (SEQ ID NO: 274): C [AGLR] [APS] [DGN] [EQ] F [RQT] C [GHKNRS] [NS] [GSTY] [DEGNR] [- RT] C [ ILV] P [AGLPRV] [AHNP ] W [LRV] CDG [ DEV] [ DN ] DC [AEGRV] D [ DG ] SDE [AEST] [ADGNS] [-D] C Las secuencias ejemplares que comprenden la porción de la Familia 19 de ß-Klotho (segundo dominio) incluyen las siguientes secuencias: betaKlotho WD35 CAPGEFQCSNGNCLPPNWLCDGVDDCGDGSDESADC (SEQ ID NO: 275) ; betaKlotho WD36 CAPDEFRCRNGNCIPLP VCDGENDCRDDSDEEDC (SEQ ID NO: 276) ; betaKlotho WD37 CLSDQFQCNNYETCIPRPWLCDGDDDCVDGSDEEDC (SEQ ID NO: 277) ; betaKlotho WD38 CAAGEFQCSSGRCLPRP VCDGDNDCGDDSDETNC (SEQ ID NO: 278) ; betaKlotho WD39 ' CRSGEFRCKNGRCIPQH VCDGENDCGDDSDETNC (SEQ ID NO: 279) ; BK_Rlc_D05 CAAGQFRCHNSDTCLPGA VCDGDNDCGDNSDEASC (SEQ ID NO: 280); BK_Rlc_D07 CAPNEFRCRSTGRCIPVN VCDGDDDCADNSDEAGC (SEQ ID NO: 281); BK_Rlc_D10 CGADQFQCGSGRCVPATWRCDGEDDCGDGSDEENC (SEQ ID NO: 282) ; y BK_Rlc_D17 CLPGQFTCGNGRCIPLPWVCDGVNDCEDNSDEESC (SEQ ID NO: 283) .

III. C.11. Secuencias de la Familia 20 La Familia 20 se generó al ligar la representación completa de una biblioteca de monómeros nativa para la terminal C of ß-Klotho M50 (SEQ ID NO: 306) y seleccionarse para dominios de dimero con afinidad de enlace incrementada para ß-Klotho.

La Familia 20 tiene la siguiente porción de consenso para el segundo dominio (SEQ ID NO: 284): C[LQ] [PS] G [EQ] FRC[KQ] [NT] [GT]R[-T]C[IL]P[LR] [AK] [LW] [LV] CDGVDDC [EL] DDSDE [AK] DC Las secuencias ejemplares que comprenden la porción de la Familia 20 de ß-Klotho (segundo dominio) incluyen las siguientes secuencias: betaKlotho WD33 CQSGEFRCQNTRTCLPLKLLCDGVDDCLDDSDEKDC (SEQ ID NO: 285) ; y betaKlotho WD34 CLPGQFRCKTGRCIPRAWVCDGVDDCEDDSDEADC (SEQ ID NO: 286) .

III.D. Proteínas de enlace Biespecificas de FGFRlc y ß-Klotho Un número de proteínas de enlace se hicieron que específicamente enlazan tanto FGFRlc como ß-Klotho. Estas proteínas de enlace biespecificas se formaron al unir una secuencia de enlace a FGFRlc seleccionada de una de las Familias i-3 a ¦ una . secuencia de enlace de ß-Klotho seleccionada de una de las Familias 4-20 en varias combinaciones por medio de una ligadura. Las secuencias de las Familias 1-3 que se usaron al preparar las proteínas biespecíficas fueron: CGAGLFTCRSTKICISQAWVCDGVDDCEDNSDEKNCSAPASEPPGSL (SEQ ID NO: 287) CGAGQFTCRDTNICISRAWRCDGVDDCEDNSDEADCSQDPEFHKV (SEQ ID NO: 288) CGANQFTCHNTNICISQAWVCDGVDDCEDNSDEKNCSAPASEPPGSL (SEQ ID NO: 289) CGSNQFTCRSTNICISQA VCDGVDDCEDDSDETGCSQDPEFHKV (SEQ ID NO: 290) CLSDQFTCRSTNICLPLQWVCDGDDDCEDNSDEEDCSAPASEPPGSL (SEQ ID NO: 291) CRLNEFPCGSGSCISLHWVCDSVPDCRDDSDETDCPERT (SEQ ID NO: 292) CGAGLFTCRSTNICISQV VCDGVDDCEDNSDEDSCSAPASEPPGSL (SEQ ID NO: 293) CGAGLFTCRSTNICISQA VCDGVDDCEDNSDENYCSAPASEPPGSL (SEQ ID NO: 294) CGAGLFTCRSTNICISQAWVCDGVDDCEDNSDETNCSAPASEPPGSL (SEQ ID NO: 295) CGASLFTCRRSNICISQAWVCDGVDDCEDNSDEMNCSAPASEPPGSL (SEQ ID NO: 296) CGEGLFTCRSTNICISHAWVCDGVDDCEDNSDENNCSAPASEPPGSL (SEQ ID NO: 297) CGANLFTCQSTNICISDAWVCDGVDDCEDNSDETTCSQDPEFHKV (SEQ ID NO: 298) CGANLFTCRSTNICISPAWVCDGVDDCEDYSDEIGCSQDPEFHKV (SEQ ID NO: 299) CGSDMFTCRSTNICISKV VCDGVDDCEDDSDERGCSQDPEFHKV (SEQ ID NO: 300) CGSNLFTCRRTNICISKAWVCDGVDDCEDNSDETGCSQDPEFHKV (SEQ ID NO: 301) CGSNLFTCRSTNICISPAWVCDGVDDCDDDSDETGCSQDPEFHKV (SEQ ID NO: 302) CGTNLFTCRSTNMCISQAWVCDGVDDCEDNSDETVCSQDPEFHKV (SEQ ID NO: 303) Las secuencias de las Familias 4-20 que se usaron al preparar las proteínas biespecíficas fueron: M01 CLPDEFQCGSGRCIPQTWVCDGLNDCGDGSDESPAHCSQDPEFHKV (SEQ ID NO: 304) M42 CQPDEFTCSSGRCIPQPWLCDGLNDCGDGSDEPPAHCSAPASEPPGSL (SEQ ID NO: 305) M50 CHSFNQFECRNGQCIPLHLVCDGVPDCGDNSDETDCGDSHILPFSTPGPST (SEQ ID NO: 306) LNR M01 CIAAKLCEALDGDGVCHKECDLEECDWDGGDCQRIFLTDPT ( SEQ ID NO: 1243) WD01 CLPDEFQCGSGRCIPQH LCDGLN.DCGDGSDEPPAHCSAPASEPPGSLCRAGEFRC SNGRCVPLTWLCDGEDDCQDNSDEKNCAQPT (SEQ ID NO: 307) WD02 CLPDEFQCSSGRCIPQTWVCDGLNDCGDGSDESPAHCSQDPEFHKVCPSSEFRCNN GRCIPLHWVCDGDDDCQDNSDETDCERSGRT (SEQ ID NO: 308) D03 CLPDEFQCGSGRCIPQT VCDGLNDCGDGSDESPAHCSQDPEFHKVCRPGEFRCNN GRCVPQTWVCDGEDDCGDNSDETDCSAPASEPPGSL (SEQ ID NO : 309) D04 CLPDEFQCGSGRCIPQT VCDGLNDCGDGSDESPAHCSQDPEFHKVCLSDQFRCGNGRCVP RAWLCDGDNDCQDGSDETNCEQPT (SEQ ID NO: 601) D05 CLPDEFQCGSGRCIPQTWVCDGLNDCGDGSDESPAHCSQDPEFHKVCLPGQFPCGNGRCIP ET LCDGDDDCQDGSDEKGCAQPT (SEQ ID NO: 1264) D06 CLPDEFQCGSGRCIPQT VCDGLNDCGDGSDESPAHCSQDPEFHKVCQPNEFQCGN GRCIPAQWLCDGEDDCQDNSDEEDCTEHT (SEQ ID NO: 310) D08 CLPDEFQCGSGRCIPQTWVCDGLNDCGDGSDESPAHCSQDPEFHKVCQSNEFRCRNGQCIP LTWLCDGDNDCLDSSDEESCPAHT (SEQ ID NO: 603) WD21 CAPGEFTCKNTGRCIPLNWRCDGDDDCGDGSDETDCPAPTCPSNQFPCRSTGICIPLAWVC DGLNDCGDGSDESPAHCSAPASEPPGSL (SEQ ID NO: 633) WD22 CPADEFRCSNTGRCVPLSWLCDGEDDCGDGSDETNCKAHTCPSNQFPCRSTGICIP LA VCDGLNDCGDGSDESPATCKAPVPT (SEQ ID NO: 311) D25 CGPDEFRCNNGQCI PLPWRCDGVDDCGDNSDEPLEICQAPTCQSNEFRCRSGRCIPQHWLC DGLNDCGDGSDEPPAHCSAPASEPPGSL (SEQ ID NO: 640) WD28 CGANEFQCRSTGICVPVEWVCDGDNDCGDGSDEPPVCGDSHILPFSTPGPSTCQPDEFTCS SGRCIPQPWLCDGLNDCGDGSDEPPAHCSAPASEPPGSL (SEQ ID NO: 643) WD29 CGADQFRCGNGSCVPRAWRCDGVDDCGDGSDEAPEICETPTCQSNEFRCRSGRCIP QHWLCDGLNDCGDGSDESQQCSAPASEPPGSL (SEQ ID NO: 312) WD31 ¦ CLPDEFRCGNGNCISVAWRCDGVDDCEDGSDEEDCESPEHTCQSNEFRCRSGRCIP QHWLCDGLNDCGDGSDESPAHCSQDPEFHKV (SEQ ID NO: 313) Los polipéptidos biespecificos que se generaron incluyen las siguientes secuencias (resumidas en las Figuras 22 y 32): Rlc Ml5-bK 01 (C2114) CGANQFTCHNTNICISQAWVCDGVDDCEDNSDEKNCSAPASEPPGSLCLPDEFQCG SGRCIPQT VCDGLNDCGDGSDESPAHCSQDPEFHKV (SEQ ID NO: 314) Rlc M15-(G4S) (SEQ ID NO: 2)-bKM01 (C2139) CGANQFTCHNTNICISQA VCDGVDDCEDNSDEKNCSAPASEPPGSLGGGGSCLPD EFQCGSGRCIPQTWVCDGLNDCGDGSDESPAHCSQDPEFHKV (SEQ ID NO: 315) Rlc M15-(G4S)2 (SEQ ID NO: 3)-bKM01 (C2140) CGANQFTCHNTNICISQAWVCDGVDDCEDNSDEKNCSAPASEPPGSLGGGGSGGGG SCLPDEFQCGSGRCIPQTWVCDGLNDCGDGSDESPAHCSQDPEFHKV (SEQ ID NO: 316) Rlc M15-(G4S)3 (SEQ ID NO: 4)-bKM01 (C2122) CGANQFTCHNTNICISQAWVCDGVDDCEDNSDEKNCSAPASEPPGSLGGGGSGGGG SGGGGSCLPDEFQCGSGRCIPQTWVCDGLNDCGDGSDESPAHCSQDPEFHKV (SEQ ID NO: 317) bKMOl-Rlc MI 5 (C2130) CLPDEFQCGSGRCI PQTW.VCDGLNDCGDGSDESPAHCSQDPEFHKVCGANQFTCHN TNICISQAWVCDGVDDCEDNSDEKNCSAPASEPPGSL (SEQ ID NO: 318) bKM01-(G4S)2 (SEQ ID NO: 3)-Rlc M15 (C2131) CLPDEFQCGSGRCI PQTWVCDGLNDCGDGSDESPAHCSQDPELHKVSLGGGGSGGG GSCGANQFTCHNTNICISQAWVCDGVDDCEDNSDEKNCSAPASEPPGSL (SEQ ID NO: 319) bKM01-(G4S)3 (SEQ ID NO: 4)-Rlc M15 (C2132) CLPDEFQCGSGRCI PQTWVCDGLNDCGDGSDESPAHCSQDPELHKVSLGGGGSGGG GSGGGGSCGANQFTCHNTNICISQAWVCDGVDDCEDNSDEKNCSAPASEPPGSL ( SEQ ID NO: 320) Rlc M15-bKM42 (C211.6) CGANQFTCHNTNICISQAWVCDGVDDCEDNSDEKNCSAPASEPPGSLCQPDEFTCS SGRCIPQPWLCDGLNDCGDGSDEPPAHCSAPASEPPGSL (SEQ ID NO: 321) Rlc M15-(G4S) (SEQ ID NO: 2)-bKM42 (C2120) CGANQFTCHNTNICISQAWVCDGVDDCEDNSDEKNCSAPASEPPGSLGGGGSCQPD EFTCSSGRCIPQPWLCDGLNDCGDGSDEPPAHCSAPASEPPGSL (SEQ ID NO: 322) Rlc M15-(G4S)2 (SEQ ID NO: 3)-bKM42 (C2141) CGANQFTCHNTNICISQA VCDGVDDCEDNSDEKNCSAPASEPPGSLGGGGSGGGG SCQPDEFTCSSGRCIPQP LCDGLNDCGDGSDEPPAHCSAPASEPPGSL (SEQ ID NO: 323) Rlc 15-(G4S)3 (SEQ ID NO: 4)-bKM42 (C2142) CGANQFTCHNTNICISQAWVCDGVDDCEDNSDEKNCSAPASEPPGSLGGGGSGGGG SGGGGSCQPDEFTCSSGRCIPQPWLCDGLNDCGDGSDEPPAHCSAPASEPPGSL (SEQ ID NO: 324) bKM42-Rlc M15 (C2133) CQPDEFTCSSGRCIPQPWLCDGLNDCGDGSDEPPAHCSAPASEPPGSLCGANQFTC HNTNICI SQAWVCDGVDDCEDNSDEKNCSAPASEPPGSL (SEQ ID NO: 325) bKM42-(G4S) (SEQ ID NO: 2)-Rlc'M15 (C2134) CQPDEFTCSSGRCIPQPWLCDGLNDCGDGSDEPPAHCSAPASEPPGSLSLGGGGSC GANQFTCHNTNICISQAWVCDGVDDCEDNSDEKNCSAPASEPPGSL (SEQ ID NO: 326) bKM42-(G4S)2 (SEQ ID NO: 3)-Rlc -15 (C2135) CQPDEFTCSSGRCIPQPWLCDGLNDCGDGSDEPPAHCSAPASEPPGSLSLGGGGSG GGGSCGANQFTCHNTNICISQAWVCDGVDDCEDNSDEKNCSAPASEPPGSL (SEQ ID NO: 327) bKM42-(G4S)3 (SEQ ID NO: 4)-Rlc M15 (C2136) CQPDEFTCSSGRCIPQPWLCDGLNDCGDGSDEPPAHCSAPASEPPGSLSLGGGGSG GGGSGGGGLFMCGANQFTCHNTNICISQAWVCDGVDDCEDNSDEKNCSAPASEPPGSL (SEQ ID NO: 328) Rlc M15-bKM50 (C2117) CGANQFTCHNTNICISQAWVCDGVDDCEDNSDEKNCSAPASEPPGSLCHSFNQFEC RNGQCI PLHLVCDGVPDCGDNSDETDCGDSHILPFSTPGPST (SEQ ID NO : 329) Rlc M15-(G4S) (SEQ ID NO: 2)-bKM50 (C2121) CGANQFTCHNTNICISQAWVCDGVDDCEDNSDEKNCSAPASEPPGSLGGGGSCHSF NQFECRNGQCIPLHLVCDGVPDCGDNSDETDCGDSHILPFSTPGPST (SEQ ID NO : 330) Rlc M15-(G4S)2 (SEQ ID NO: 3)-bKM50 (C2143) CGANQFTCHNTNICISQAWVCDGVDDCEDNSDEKNCSAPASEPPGSLGGGGSGGGG SCHSFNQFECRNGQCIPLHLVCDGVPDCGDNSDETDCGDSHILPFSTPGPST (SEQ ID NO: 331) Rlc M15-(G4S)3 (SEQ ID NO : 4)-bKM50 (C2144) CGANQFTCHNTNICISQAWVCDGVDDCEDNSDEKNCSAPASEPPGSLGGGGSGGGG SGGGGSCHSFNQFECRNGQCI PLHLVCDGVPDCGDNSDETDCGDSHILPFSTPGPST (SEQ ID NO: 332) bKM50-Rlc M15 (C2137) CHSFNQFECRNGQCIPLHLVCDGVPDCGDNSDETDCGDSHILPFSTPGPSTCGANQ FTCHNTNICISQAWVCDGVDDCEDNSDEKNCSAPASEPPGSL (SEQ ID NO: 333) bKM50-(G4S) (SEQ ID. NO: 2)-Rlc M15 (C2138) CHSFNQFECRNGQCIPLHLVCDGVPDCGDNSDETDCGDSHILPFSTPGPSTGGGGS CGANQFTCHNTNICISQAWVCDGVDDCEDNSDEKNCSAPASEPPGSL (SEQ ID NO: 334) bKWD01_RlcM03mut01 ' (C3090) CLPDEFQCGSGRCI PQHWLCDGL DCGDGSDEPPAHCSAPASEPPGSLCRAGEFRC SNGRCVPLTWLCDGEDDCQDNSDEKNCAQPTCGAGLFTCRSTNICISQV VCDGVDDCEDN SDEDSCSAPASEPPGSL (SEQ ID NO: 335); bK D01_RlcM03mut04 (C3091) CLPDEFQCGSGRCI QHWLCDGLNDCGDGSDEPPAHCSAPASEPPGSLCRAGEFRC SNGRCVPLTWLCDGEDDCQDNSDEKNCAQPTCGAGLFTCRST ICISQAWVCDGVDDCEDN SDENYCSAPASEPPGSL (SEQ -ID NO: 336) ; b WD01_Rlc 03mut05 (C3092) CLPDEFQCGSGRCIPQHWLCDGLNDCGDGSDEPPAHCSAPASEPPGSLCRAGEFRC SNGRCVPLTWLCDGEDDCQDNSDEKNCAQPTCGAGLFTCRSTNICISQAWVCDGVDDCEDN SDETNCSAPASEPPGSL (SEQ ID NO: 337); bK D01_RlcM03mut06 (C3093) CLPDEFQCGSGRCIP.QHWLCDGLNDCGDGSDEPPAHCSAPASEPPGSLCRAGEFRC SNGRCVPLT LCDGEDDCQDNSDEKNCAQPTCGASLFTCRRSNICISQAWVCDGVDDCEDN SDEMNCSAPASEPPGSL (SEQ ID NO: 338');. bKWD01_RlcM03mut09 (C3094) CLPDEFQCGSGRCIPQHWLCDGLNDCGDGSDEPPAHCSAPASEPPGSLCRAGEFRC SNGRCVPLTWLCDGEDDCQDNSDEKNCAQPTCGEGLFTCRSTNICISHAWVCDGVDDCEDN SDENNCSAPASEPPGSL -(SEQ.ID NO: 339); bKWD01_RlcM23mutlO (C3095) CLPDEFQCGSGRCIP.QHWLCDGLNDCGDGSDEPPAHCSAPASEPPGSLCRAGEFRC SNGRCVPLTWLCDGEDDCQDNSDEKNCAQPTCGANLFTCQSSNICISDAWVCDGVDDCEDN SDETTCSQDPEFHKV (SEQ ID NO : 340); . b WD01_RlcM23mutll (C3096) CLPDEFQCGSGRCIPQHWLCDGLNDCGDGSDEPPAHCSAPASEPPGSLCRAGEFRC SNGRCVPLTWLCDGEDDCQDNSDEKNCAQPTCGANLFTCRSTNICISPAWVCDGVDDCEDY SDEIGCSQDPEFHKV (SEQ ID NO: 341); bKWD01_Rlc 23mutl4 (C3097) CLPDEFQCGSGRCIPQHWLCDGLNDCGDGSDEPPAHCSAPASEPPGSLCRAGEFRC SNGRCVPLTWLCDGEDDCQDNSDEKNCAQPTCGSDMFTCRSTNICISKV VCDGVDDCEDD SDERGCSQDPEFHKV (SEQ ID NO: 342);' bKWD01_RlcM23mutl5 (C3098) CLPDEFQCGSGRCIPQHWLCDGLNDCGDGSDEPPAHCSAPASEPPGSLCRAGEFRC SNGRCVPLTWLCDGEDDCQDNSDEKNCAQPTCGSNLFTCRRTNICISKAWVCDGVDDCEDN SDETGCSQDPEFHKV (SEQ ID NO: 343); bKWD01_RlcM23mutl6 (C3099) CLPDEFQCGSGRCI PQHWLCDGLNDCGDGSDEPPAHCSAPASEPPGSLCRAGEFRC SNGRCVPLTWLCDGEDDCQDNSDEKNCAQPTCGSNLFTCRSTNICISPA VCDGVDDCDDD SDETGCSQDPEFHKV (SEQ ID NO: 344); bKWD01_RlcM23mutl7 (C3100) CLPDEFQCGSGRCI PQHWLCDGLNDCGDGSDEPPAHCSAPASEPPGSLCRAGEFRC SNGRCVPLT LCDGEDDCQDNSDEKNCAQPTCGTNLFTCRSTNMCISQAWVCDGVDDCEDN SDETVCSQDPEFHKV (SEQ ID NO: 3'45); b WD03_RlcM15 (C3102) CLPDEFQCGSGRCI PQTWVCDGLNDCGDGSDESPAHCSQDPEFHKVCRPGEFRCNN GRCVPQTWVCDGEDDCGDNSDETDCSAPASEPPGSLCGANQFTCHNTNICISQAWVCDGVD DCEDNSDEKNCSAPASEPPGSL (SEQ ID NO: 346); bKWD06_RlcM15 (C3103) CLPDEFQCGSGRCI PQTWVCDGLNDCGDGSDESPAHCSQDPEFHKVCQPNEFQCGN GRCIPAQWLCDGEDDCQDNSDEEDCTEHTCGANQFTCHNTNICISQAWVCDGVDDCEDNSD EKNCSAPASEPPGSL (SEQ ID NO: 347); bKWD22_RlcM15 (C3104) CPADEFRCSNTGRCVPLSWLCDGEDDCGDGSDETNCKAHTCPSNQFPCRSTGICIP LAWVCDGLNDCGDGSDESPATCKAPVPTCGANQFTCHNTNICISQA VCDGVDDCEDNSDE KNCSAPASEPPGSL (SEQ ID NO: 348); bKWD29_Rlc 15 (C3105.) CGADQFRCGNGSCVPRAWRCDGVDDCGDGSDEAPEICETPTCQSNEFRCRSGRCIP QHWLCDGLNDCGDGSDESQQCSAPASEPPGSLCGANQFTCHNTNICISQA VCDGVDDCED NSDEKNCSAPASEPPGSL (SEQ ID NO : 349); bK D06_RlcM03mut06 (C3192) CLPDEFQCGSGRCIPQTWVCDGLNDCGDGSDESPAHCSQDPEFHKVCQPNEFQCGN GRCI PAQWLCDGEDDCQDNSDEEDCTEHTCGASLFTCRRS ICISQAWVCDGVDDCEDNTD EMNCSAPASEPPGSL (SEQ ID NO: 350); bKWD06_RlcM03mut09 (C3193) CLPDEFQCGSGRCI PQTWVCDGL DCGDGSDESPAHCSQDPEFHKVCQPNEFQCGN GRCIPAQWLCDGEDDCQDNSDEEDCTEHTCGEGLFTCRSTNICISHAWVCDGVDDCEDNSD ENNCSAPASEPPGSL (SEQ ID NO: 351); bKWD06_RlcM03mutll (C3194) CLPDEFQCGSGRCIPQTWVCDGLNDCGDGSDESPAHCSQDPEFHKVCQPNEFQCGN GRCIPAQWLCDGEDDCQDNSDEEDCTEHTCGANLFTCRSTNICISPAWVCDGVDDCEDYSD EIGCSQDPEFHKV (SEQ ID NO: 352); bKWD06_Rlc 03mutl7 (C3195) CLPDEFQCGSGRCIPQT VCDGLNDCGDGSDESPAHCSQDPEFHKVCQPNEFQCGN GRCIPAQWLCDGEDDCQDNSDEEDCTEHTCGTNLFTCRSTNMCISQAWVCDGVDDCEDNSD ETVCSQDPEFHKV (SEQ ID NO: 353); b D22_Rlc 03raut06 (C3196) CPADEFRCSNTGRCVPLSWLCDGEDDCGDGSDETNCKAHTCPSNQFPCRSTGICIP LA VCDGLNDCGDGSDESPATCKAPVPTCGASLFTCRRSNICISQAWVCDGVDDCEDNSDE MNCSAPASEPPGSL (SEQ ID NO: 354); bKWD22_RlcM03mut09 (C3197) CPADEFRCSNTGRCVPLSWLCDGEDDCGDGSDETNCKAHTCPSNQFPCRSTGICIP LA VCDGLNDCGDGSDESPATCKAPVPTCGEGLFTCRSTNICISHA VCDGVDDCEDNSDE NNCSAPASEPPGSL (SEQ ID NO: 355); bK D22_RlcM03mutll (C3198) CPADEFRCSNTGRCVPLS LCDGEDDCGDGSDETNCKAHTCPSNQFPCRSTGICIP LA VCDGLNDCGDGSDESPATCKAPVPTCGANLFTCRSTNICISPAWVCDGVDDCEDYSDE IGCSQDPEFHKV (SEQ ID NO : 356); bKWD22_Rlc 03mutl7 (C3199) CPADEFRCSNTGRCVPLS LCDGEDDCGDGSDETNCKAHTCPSNQFPCRSTGICIP LA VCDGLNDCGDGSDESPATC APVPTCGTNLFTCRSTNMCISQAWVCDGVDDCEDNSDE TVCSQDPEFHKV (SEQ ID NO: 357); bKWD29_RlcM03mut06 (C3200) CGADQFRCGNGSCVPRAWRCDGVDDCGDGSDEAPEICETPTCQSNEFRCRSGRCIP QH LCDGLNDCGDGSDESQQCSAPASEPPGSLCGASLFTCRRSNICISQA VCDGVDDCED NSDEMNCSAPASEPPGSL (SEQ ID NO : 358); bKWD29_RlcM03mut09 (C3201) CGADQFRCGNGSCVPRAWRCDGVDDCGDGSDEAPEICETPTCQSNEFRCRSGRCIP QHWLCDGLNDCGDGSDESQQCSAPASEPPGSLCGEGLFTCRSTNICISHAWVCDGVDDCED NSDENNCSAPASEPPGSL (SEQ ID NO: 359); bKWD29_RlcM03mutll (C3202) CGADQFRCGNGSCVPRAWRCDGVDDCGDGSDEAPEICETPTCQSNEFRCRSGRCIP QHWLCDGLNDCGDGSDESQQCSAPASEPPGSLCGANLFTCRSTNICISPA VCDGVDDCED YSDEIGCSQDPEFHKV (SEQ ID NO: 360); bK D29_RlcM03mutl7 (C3203) CGADQFRCGNGSCVPRA RCDGVDDCGDGSDEAPEICETPTCQSNEFRCRSGRCIP QHWLCDGL DCGDGSDESQQCSAPASEPPGSLCGTNLFTCRSTNMCISQA VCDGVDDCED NSDETVCSQDPEFHKV (SEQ ID NO: 361) ; RlcM03mut06_bKWD22 (C3204) CGASLFTCRRSNICISQAWVCDGVDDCEDNSDEMNCSAPASEPPGSLCPADEFRCS NTGRCVPLSWLCDGEDDCGDGSDETNCKAHTCPSNQFPCRSTGICIPLAWVCDGLNDCGDG SDESPATCKAPVPT (SEQ ID'NO: 362); RlcM03mut09_bKWD22 (C3205) CGEGLFTCRSTNICISHAWVCDGVDDCEDNSDENNCSAPASEPPGSLCPADEFRCS NTGRCVPLSWLCDGEDDCGDGSDETNCKAHTCPSNQFPCRSTGICIPLA VCDGLNDCGDG SDESPATCKAPVPT (SEQ ID NO: 363); RlcM03mutll_bKWD22 (C3206) CGANLFTCRSTNICISPAWVCDGVDDCEDYSDEIGCSQDPEFHKVCPADEFRCSNT GRCVPLSWLCDGEDDCGDGSDETNCKAHTCPSNQFPCRSTGICIPLAWVCDGLNDCGDGSD ESPATCKAPVPT (SEQ ID NO: 364)'; RlcM03mutl7_bKWD22 (C3207).

CGTNLFTCRSTNMCISQA VCDGVDDCEDNSDETVCSQDPEFHKVCPADEFRCSNT GRCVPLSWLCDGEDDCGDGSDETNCKAHTCPSNQFPCRSTGICIPLAWVCDGLNDCGDGSD ESPATCKAPVPT (SEQ ID NO: 365) ; RlcM03mut06__bKWD29 (C3208) CGASLFTCRRSNICISQA VCDGVDDCEDNSDEMNCSAPASEPPGSLCGADQFRCG NGSCVPRA RCDGVDDCGDGSDEAPEICETPTCQSNEFRCRSGRCIPQHWLCDGLNDCGDG SDESQQCSAPASEPPGSL (SEQ ID NO: 366); RlcM03mut09_bKWD2 (C3209).

CGEGLFTCRSTNICISHAWVCDGVDDCEDNSDENNCSAPASEPPGSLCGADQFRCG NGSCVPRAWRCDGVDDCGDGSDEAPEICETPTCQSNEFRCRSGRCIPQH LCDGLNDCGDG SDESQQCSAPASEPPGSL (SEQ ID NO: 367); RlcM03mutll_bKWD29 (C3210) CGANLFTCRSTNICISPAWVCDGVDDCEDYSDEIGCSQDPEFHKVCGADQFRCGNG SCVPRAWRCDGVDDCGDGSDEAPEICETPTCQSNEFRCRSGRCIPQHWLCDGLNDCGDGSD ESQQCSAPASEPPGSL (SEQ ID NO: 368); RlcM03mutl7_b WD29 (C3211) CGTNLFTCRSTN CISQAWVCDGVDDCEDNSDETVCSQDPEFHKVCGADQFRCGNG SCVPRA RCDGVDDCGDGPDEAPEICETPTCQSNEFRCRSGRCIPQHWLCDGLNDCGDGSD ESQQCSAPASEPPGSL ( SEQ ID NO: 369); RlcM03_BK D01 (C2737) CGAGLFTCRSTKICISQAWVCDGVDDCEDNSDEKNCSAPASEPPGSLCLPDEFQCG SGRCI PQHWLCDGL DCGDGSDEPPAHCSAPASEPPGSLCRAGEFRCSNGRCVPLTWLCDG EDDCQDNSDE NCAQPT (SEQ ID NO: 370); Rlc 03_BKWD02 (C2738) CGAGLFTCRSTKICISQAWVCDGVDDCEDNSDEKNCSAPASEPPGSLCLPDEFQCS SGRCI PQTWVCDGLNDCGDGSDESPAHCSQDPEFHKVCPSSEFRCNNGRCI PLHWVCDGDD DCQDNSDETDCERSGRT (SEQ ID NO: 371); BKWD02_RlcM03 (C2739) CLPDEFQCSSGRCI PQTWVCDGLNDCGDGSDESPAHCSQDPEFHKVCPSSEFRCNN GRCIPLHWVCDGDDDCQDNSDETDCERSGRTCGAGLFTCRST IC'ISQAWVCDGVDDCEDN SDEKNCSAPASEPPGSL (SEQ ID NO: 372); Rlc 03_BKWD25 (C2740) CGAGLFTCRST ICISQAWVCDGVDDCEDNSDEKNCSAPASEPPGSLCGPDEFRCN NGQCIPLPWRCDGVDDCGDNSDEPLEICQAPTCQSNEFRCRSGRCIPQHWLCDGLNDCGDG SDEPPAHCSAPASEPPGSL (SEQ ID NO: 373); RlcM08_BKWD01 (C2741) CGAGQFTCRDTNICISRAWRCDGVDDCEDNSDEADCSQDPEFHKVCLPDEFQCGSG RCIPQHWLCDGLNDCGDGSDEPPAHCSAPASEPPGSLCRAGEFRCSNGRCVPLTWLCDGED DCQDNSDEKNCAQPT (SEQ ID O: 374); BKWD01_RlcM08 (C2742) CLPDEFQCGSGRCIPQHWLCDGLNDCGDGSDEPPAHCSAPASEPPGSLCRAGEFRC SNGRCVPLTWLCDGEDDCQDNSDEKNCAQPTCGAGQFTCRDTNICISRA RCDGVDDCEDN SDEADCSQDPEFHKV (SEQ ID NO : 375); RlcM08_BKWD02 (C2743) CGAGQFTCRDTNICISRA RCDGVDDCEDNSDEADCSQDPEFHKVCLPDEFQCSSG RCIPQTWVCDGLNDCGDGSDESPAHCSQDPEFHKVCPSSEFRCNNGRCIPLHWVCDGDDDC QDNSDETDCERSGRT (SEQ ID NO : 376); BKWD02_RlcM08 (C2744) CLPDEFQCSSGRCI PQTWVCDGLNDCGDGSDESPAHCSQDPEFHKVCPSSEFRCNN GRCIPLH VCDGDDDCQDNSDETDCERSGRTCGAGQFTCRDTNICISRA RCDGVDDCEDN SDEADCSQDPEFHKV (SEQ ID NO: 377); RlcM08_BKWD25 (C2745) CGAGQFTCRDTNICISRAWRCDGVDDCEDNSDEADCSQDPEFHKVCGPDEFRCNNG QCI PLPWRCDGVDDCGDNSDEPLEICQAPTCQSNEFRCRSGRCIPQHWLCDGLNDCGDGSD EPPAHCSAPASEPPGSL (SEQ ID NO: 378');.

RlcM15_BKWD01 (C2747) CGANQFTCHNTNICISQAWVCDGVDDCEDNSDEKNCSAPASEPPGSLCLPDEFQCG SGRCIPQHWLCDGLNDCGDGSDEPPAHCSAPASEPPGSLCRAGEFRCSNGRCVPLTWLCDG EDDCQDNSDEKNCAQPT (SEQ .ID NO: 379); RlcM31_BKWD25 (C2748) CLSDQFTCRSTNICL.PLQWVCDGDDDCEDNSDEEDCSAPASEPPGSLCGPDEFRCN NGQCIPLP RCDGVDDCGDNSDEPLEICQAPTCQSNEFRCRSGRCIPQHWLCDGLNDCGDG SDEPPAHCSAPASEPPGSL (SEQ ID NO : 3'80) ; RlcM15_BKWD02 (C2749) CGANQFTCHNTNICISQA VCDGVDDCEDNSDEKNCSAPASEPPGSLCLPDEFQCS SGRCIPQTWVCDGLNDCGDGSDESPAHCSQDPEFHKVCPSSEFRCNNGRCIPLHWVCDGDD DCQDNSDETDCERSGRT (SEQ-ID NO: 381); BK D02_RlcM15 (C2750) CLPDEFQCSSGRCIPQTWVCDGLNDCGDGSDESPAHCSQDPEFHKVCPSSEFRCNN GRCIPLHWVCDGDDDCQDNSDETDCERSGRTCGANQFTCHNTNICISQAWVCDGVDDCEDN SDEKNCSAPASEPPGSL (SEQ ID NO: 382); RlcM15_BKWD25 (C2751) CGANQFTCHNTNICISQAWVCDGVDDCEDNSDEKNCSAPASEPPGSLCGPDEFRCN NGQCIPLP RCDGVDDCGDNSDEPLEICQAPTCQSNEFRCRSGRCIPQHWLCDGLNDCGDG SDEPPAHCSAPASEPPGSL (SEQ ID ??: 383); BKWD01_Rlc 23 (C2752) CLPDEFQCGSGRCI PQHWLCDGLNDCGDGSDEPPAHCSAPASEPPGSLCRAGEFRC SNGRCVPLTWLCDGEDDCQDNSDEKNCAQPTCGSNQFTCRSTNICISQA VCDGVDDCEDD SDETGCSQDPEFHKV (SEQ ID NO: 384); RlcM23_BK D02 (C2753) CGSNQFTCRSTNICISQAWVCDGVDDCEDDSDETGCSQDPEFHKVCLPDEFQCSSG RCIPQTWVCDGLNDCGDGSDESPAHCSQDPEFHKVCPSSEFRCNNGRCI PLHWVCDGDDDC QDNSDETDCERSGRT (SEQ ID NO : 3'85); BK D02_RlcM23 (C2754) CLPDEFQCSSGRCIPQTWVCDGLNDCGDGSDESPAHCSQDPEFHKVCPSSEFRCNN GRCI PLHWVCDGDDDCQDNSDETDCERSGRTCGSNQFTCRSTNICISQAWVCDGVDDCEDD SDETGCSQDPEFHKV (SEQ ID NO: 386); BK D01_RlcM31 (C2757) CLPDEFQCGSGRCI PQH LCDGLNDCGDGSDEPPAHCSAPASEPPGSLCRAGEFRC SNGRCVPLTWLCDGEDDCQDNSDEKNCAQPTCLSDQFTCRSTNICLPLQWVCDGDDDCEDN SDEEDCSAPASEPPGSL (SEQ ID NO:' 387);.

BKWD05_RlcM08 (C2792) CAAGQFRCHNSDTCLPGAWVCDGDNDCGDNSDEASCQKRTCHSFNQFECRNGQCIP LHLVCDGVPDCGDNSDETDCGDSHILPFSTPGPSTCGAGQFTCRDTNICISRAWRCDGVDD CEDNSDEADCSQDPEFHKV (SEQ ID NO: 388); BK D06_RlcM08 (C2793.) CAPDQFRCSSGQCI PETWLCDGDDDCVDSSDEAGCASTVPTCLPDEFQCGSGRCIP QTWVCDGLNDCGDGSDESPAHCSQDPEFHKVCGAGQFTCRDTNICISRA RCDGVDDCEDN SDEADCSQDPEFHKV (SEQ ID NO : 389); BKWD01_RlcM15 (C2794) CLPDEFQCGSGRCIPQHWLCDGLNDCGDGSDEPPAHCSAPASEPPGSLCRAGEFRC SNGRCVPLTWLCDGEDDCQDNSDEKNCAQPTCGANQFTCHNTNICISQAWVCDGVDDCEDN SDEKNCSAPASEPPGSL (SEQ ID NO : 390); RlcM15_BKWD31 (C2795) CGANQFTCHNTNICISQA VCDGVDDCEDNSDEKNCSAPASEPPGSLCLPDEFRCG NGNCISVAWRCDGVDDCEDGSDEEDCESPEHTCQS EFRCRSGRCIPQHWLCDGLNDCGDG SDESPAKCSQDPEFHKV (SEQ ID NO: 391); RlcM15_BK D06 (C2796) CGANQFTCHNTNICISQAWVCDGVDDCEDNSDEKNCSAPASEPPGSLCAPDQFRCS SGQCIPET LCDGDDDCVDSSDEAGCASTVPTCLPDEFQCGSGRCIPQTWVCDGNDCGDGS DESPAHCSQDPEFHKV (SEQ ID NO: 392) ; bKWD02_RlcM03mutM09 (C4168) CLPDEFQCSSGRCIPQTWVCDGLNDCGDGSDESPAHCSQDPEFHKVCPSSEFRCNNGRCIP LHWVCDGDDDCQDNSDETDCAQPTCGEGLFTCRSTNICISHAWVCDGVDDCEDNSDENNCS APASEPPGSL (SEQ ID NO: 1265); bKWD03_RlcM03mutM09 (C4169) CLPDEFQCGSGRCIPQTWVCDGLNDCGDGSDESPAHCSQDPEFHKVCRPGEFRCNNGRCVP QTWVCDGEDDCGDNSDETDCAQPTCGEGLFTCRSTNICISHAWVCDGVDDCEDNSDENNCS APASEPPGSL (SEQ ID NO: 1266); bKWD04_RlcM03mutM09 (C4170) CLPDEFQCGSGRCIPQTWVCDGLNDCGDGSDESPAHCSQDPEFHKVCLSDQFRCGNGRCVP RAWLCDGDNDCQDGSDETNCEQPTCGEGLFTCRSTNICISHAWVCDGVDDCEDNSDENNCS APASEPPGSL (SEQ ID NO: 1267); bKWD05_RlcM03mutM09 (C4171) CLPDEFQCGSGRCIPQTWVCDGLNDCGDGSDESPAHCSQDPEFHKVCLPGQFPCGNGRCIP ET LCDGDDDCQDGSDEKGCAQPTCGEGLFTCRSTNICISHA VCDGVDDCEDNSDENNCS APASEPPGSL (SEQ ID NO: 1268); bKWD08_RlcM03mutM09 (C4173) CLPDEFQCGSGRCIPQTWVCDGLNDCGDGSDESPAHCSQDPEFHKVCQSNEFRCRNGQCIP LTWLCDGDNDCLDSSDEESCPAHTCGEGLFTCRSTNICISHA VCDGVDDCEDNSDENNCS APASEPPGSL (SEQ ID NO: 1269); bK D21_RlcM03mutM09 (C4174) CAPGEFTCKNTGRCIPLNWRCDGDDDCGDGSDETDCPAPTCPSNQFPCRSTGICIPLAWVC DGLNDCGDGSDESPAHCSAPASEPPGSLCGEGLFTCRSTNICISHAWVCDGVDDCEDNSDE NNCSAPASEPPGSL(SEQ. ID NO: 1270); bKWD25_RlcM03mutM09 (C4176) CGPDEFRCNNGQCI PLPWRCDGVDDCGDNSDEPLEICQAPTCQSNEFRCRSGRCIPQH LC DGLNDCGDGSDEPPAHCSAPASEPPGSLCGEGLFTCRSTNICISHAWVCDGVDDCEDNSDE NNCSAPASEPPGSL(SEQ ID NO: 1271); ¦ bKWD28_RlcM03mutM09 (C4177) CGANEFQCRSTGICVPVEWVCDGDNDCGDGSDEPPVCGDSHILPFS PGPSTCQPDEFTCS SGRCI PQPWLCDGLNDCGDGSDEPPAHCSAPASEPPGSLCGEGLFTCRSTNICISHAWVCD GVDDCEDNSDENNCSAPASEPPGSL (SEQ ID NO : 1272); RlcM03mutM09_bK D01 (C4178) CGEGLFTCRSTNICISHAWVCDGVDDCEDNSDENNCSAPASEPPGSLCLPDEFQCGSGRCI PQH LCDGLNDCGDGSDEPPAHCSAPASEPPGSLCRAGEFRCSNGRCVPLT LCDGEDDCQ DNSDEKNCAQPT (SEQ ID NO: 1273); LNR 01_RlcM03mutM09 (C4311) CIAAKLCEALDGDGVCHKECDLEECD DGGDCQRIFLTDPTCGEGLFTCRSTNICISHA V CDGVDDCEDNSDENNCSAPASEPPGSL (SEQ ID NO: 1274); y RlcM03mut 09_LNR 01 (C4312) CGEGLFTCRSTNICISHAWVCDGVDDCEDNSDENNCSAPASEPPGSLCIAAKLCEALDGDG VCHKECDLEECDWDGGDCQRIFLTDPT (SEQ ID NO: 1275) IV. VIDA MEDIA DEL SUERO MEJORADA La descripción actual proporciona además dominios de monómero que enlazan (por ejemplo, selectivamente enlazan) a un factor de sangre (por ejemplo, albúmina de suero, inmunoglobulina, o a eritrocitos) . En algunas modalidades, los monómeros descritos en la presente enlazarán a un factor de sangre con una afinidad de- menos de 10"3 M (esto es, enlaza más fuerte que una afinidad de 1CT3 M) . En algunas modalidades, la afinidad (esto es, KD) es menor que 10"4 M, 10"5 M, 1CT6 M, 1CT7 M, 1CT8 M o 10"9 M.

En algunas modalidades, los dominios de monómero enlazan a una inmunoglobulina polipéptido o una porción de la misma.

De esta manera, la descripción actual proporciona un método para extender la vida media en suero de una proteina de enlace, incluyendo, por ejemplo, un multimero o una proteina de interés, en un animal, incluyendo humanos. En una modalidad, el método comprende primero proporcionar un dominio de monómero que se ha identificado como una proteina de enlace que específicamente enlaza a un extensor de vida media tal como una molécula o célula que porta sangre, tal como albúmina de suero (por ejemplo, albúmina de suero humana), IgG, glóbulos .rojos, etc. El monómero de enlace del extensor de vida media luego se liga covalentementa a otro dominio de monómero que tiene una afinidad de enlace para una proteina de interés (por ejemplo, FGFRlc, ß-Klotho o tanto FGFRlc como ß-Klotho, o un objetivo diferente) . Esta formación de complejo resulta eri la extensión de . ida media que protege el multimero y/o proteínas enlazadas de degradación proteolítica y/u otra eliminación del multimero y/o proteínas y por ello extienden la vida media de la proteína y/o multimero. Una variación de este uso de las proteínas de enlace descrita en la presente incluyen el monómero de enlace del extensor de vida media covalentamente ligado a la proteína de interés. La proteína de interés puede incluir un dominio de monómero, un multimero de dominios de monómero, o un · fármaco sintético. Alternativamente, los monómeros que enlazan a cualquiera de las inmunoglobulinas o eritrocitos pueden generarse usando el método de arriba y pueden usarse para extensión de vida media.

Los multímeros de enlace del extensor de vida media son típicamente multímeros- de al menos dos dominios, dominios quiméricos, o dominios mutagenizados (por ejemplo, uno que enlaza a FGFRlc, uno que enlaza a ß-Klotho, o uno de cada tipo de monómero, y uno que enlaza a la molécula o célula que porta sangre) . Los dominios adecuados incluyen todos de aquellos descritos en la presente, que se escogen y seleccionan además para enlace del extensor de vida media. Los multimeros de enlace del extensor de vida media se generan de acuerdo con los métodos para hacer multimeros descritos en la presente, usando, . por ejemplo, dominios de monómero pre-seleccionados para . la activida de enlace del extensor de vida media. La vida media en suero de una molécula puede extenderse para se, por ejemplo, al menos 1, 2, 3, 4, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 400, 500 o más horas.

Los dominios de monómero que extienden la vida media pueden ligarse a la terminal N, C o tanto a la terminal N como C de una proteina de enlace (por ejemplo, una proteina que comprende dominio de monómero de enlace a FGFRlc, ß-Klotho o tanto FGFRlc como ß-Klotho.) .

En algunas modalidades el multimero puede ligarse covalentemente a la terminal N o C de albúmina de suero humana o a la terminal N o C del dominio Fe de inmunoglobulina G. Tales fusiones tienen vida media de suero potenciada como un resultado de pasar a través de la trayectoria depuradora FcRn en el endotelio que se usa por albúmina de suero endógena nativa e IgG. La vida media en suero de una molécula puede extenderse para ser, por ejemplo, al menos 1, 2, 3, 4, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250, 400, 500 o más horas.

En algunas modalidades las secuencias de terminal N se agregan a la proteina de enlace para permitir la adición de porciones de polietilenglicol (PEG) por medio de química de ligadura de amida. La adición de PEG incrementa el radio hidrodinámico de la proteína de enlace, de esta manera reduce la excreción por medio de filtración de riñon. Las moléculas PEG disponibles para tales propósitos vienen en un intervalo de pesos moleculares y como ya sea moléculas lineales o ramificadas.

V. MÜLTÍMEROS Los métodos para generar multímeros forman otro aspecto de la descripción actual. Los multímeros, que comprenden algunas de las proteínas de enlace descritas en la presente, comprenden al menos dos dominios de monómero (por ejemplo, un dominio que enlaza un FGFRlc y un dominio que enlaza un ß-Klotho, dos dominios que enlajan ß-Klotho o dos dominios que enlazan FGFRlc). Por ejemplo, los multímeros pueden comprender desde 2 hasta alrededor de 10 dominios de monómero, desde 2 y alrededor de 8 dominios de monómero, desde alrededor de 3 y alrededor de 10 dominios de monómero, alrededor de 7 dominios de monómero, alrededor de 6 dominios de monómero, alrededor de '5 dominios de monómero, o alrededor de 4 dominios de monómero. En algunas modalidades, el multimero comprende 3 o al menos 3 dominios de monómero. En algunas modalidades, los multimeros no tienen más de 2, 3, 4, 5, 6, 7, u 8 dominios - de monómero. En vista del intervalo posible de los tamaños del dominio de monómero, los multimeros pueden ser, por ejemplo, menores que 100 kD, menos que 90kD, menores que 80kD, menores que 70kD, menores que 60kD, menores que 50kD, menores que 40kD, menores que 30kD, menores que 25kD, menores que 20kD, menores que 15kD, menores que lOkD o pueden ser más pequeños o más grandes. En algunos casos, los dominios de monómero se han pre-seleccionado para enlazar a una molécula .objetivo de interés (por ejemplo, FGFRlc o ß-Klotho) . En algunas modalidades, los multimeros enlazarán a FGFRlc , ß-Klotho o tanto FGFRlc como ß-Klotho (o, por ejemplo, un factor de sangre tal como HSA o IgG) con una afinidad de menos de 10"3 M (esto es, enlaza más fuerte que una afinidad de 10~3' M) . En algunas modalidades, la afinidad es menor que 10"4 M, 10"5 M, 10"6 M, 10"7 M, 10"8 M, 10"9 M, o 10"10 M. En algunas modalidades, la afinidad de un multimero será más fuerte (menos) que la suma de . afinidiades de los dominios de monómero respectivos en el multimero.

En algunas modalidades, cada dominio de monómero específicamente enlaza a una' molécula objetivo (por ejemplo, FGFRlc o ß-Klotho) , aunque en otras modalidades cada monómero enlaza a la misma molécula objetivo (por ejemplo, ß-Klotho o FGFRlc) , posiblemente en ubicaciones diferentes en la misma proteína objetivo. En algunas de estas modalidades, cada monómero enlaza a una posición diferente (análogo a un epítopo) en una molécula objetivo. Los dominios de monómero múltiples que enlazan a la misma molécula objetivo resultan en un efecto de avidez que resulta en afinidad mejorada del multímero para la molécula objetivo comparada con la afinidad de cada monómero individual. En algunas modalidades, el multímero tiene una afinidad de al menos alrededor de 1.5, 2, 3, 4, 5, 10, 20, 50, 100,.200, 500, o 1000 veces la afinidad de un dominio de monómero solo. En algunas modalidades, al menos uno, dos, tres, cuatro o más (por ejemplo, todos) monómeros de. un multímero enlazan un ión tal como ión de calcio u otro ión..

Los multímeros pueden comprender una variedad de combinaciones de dominios de monómero. Por ejemplo, en un multímero sencillo, los dominios de monómero pueden ser idénticos (por ejemplo, dos o más dominios idénticos que enlazan a FGFRlc, o dos o más dominios idénticos que enlazan a ß-Klotho) o diferentes (por ejemplo, uno o más dominios que enlazan a FGFRlc y uno o más dominios que enlazan a ß-Klotho) . Además, los dominios de monómero seleccionados pueden comprender varios dominios de monómero diferentes del la misma familia de dominio de monómero, o varios dominios de monómero de diferentes familias de dominio, u opcionalmente , una combinación de ambos. Por ejemplo, los dominios de monómero pueden seleccionarse de las Familias 1-3 de dominios de monómero de enlace a FGFRlc o Familias 4-10 de los dominios de monómero de enlace a ß-Klotho. En algunas modalidades, al menos uno de los dominios de monómero se selecciona de las Familias 1-3 (monómeros de enlace a FGFRlc) y otro dominio de monómero se selecciona de las Familias 4-10 (monómeros de enlace a ß-Klotho) . Los dimeros de enlace a FGFRlc, ß-Klotho y FGFRlc y ß-Klotho biespecificos ejemplares se proporcionan en la presente.

Los ejemplos adicionales de multimeros que pueden generarse incluyen los siguientes: (1) Un homo-multimero (un multimero del mismo dominio, esto es, Al-Al-Al-Al); (2) Un hetero-multimero de diferentes dominios de la misma clase de dominio, por ejemplo, A1-A2-A3-A4. Por ejemplo, hetero-multimero incluye multimeros donde Al, A2, A3 y A4 son variantes recombinantes diferentes de los dominios de clase A del receptor particulares, o donde alguno de Al, A2, A3, y A4 son variantes no recombinantes de un dominio clase A del receptor LDL. (3) Un hetero-multimero de dominios de diferentes clases de dominio de monómero, por ejemplo, A1-B2-A2-B1. Por ejemplo, donde Al y A2 son dos diferentes dominios de monómero (ya sea recombinante o no recombinante) dé clase A, y Bl y B2 del LDL son dos diferentes dominios de monómero (ya sea recombinante o no recombinante) del dominio tipo clase EGF) .

En otra modalidad, el multimero comprende dominios de monómero con especificidades para diferentes moléculas objetivo (por ejemplo, un factor de sangre tal como albúmina de suero, inmunoglobulina, o eritrocitos) . Por ejemplo, en algunas modalidades, los multimeros comprenden 1, 2, 3, o más dominios de monómero que enlazan a FGFRlc, ß-Klotho o tanto FGFRlc como ß-Klotho, y al menos un dominio de monómero que enlaza a una segunda molécula objetivo. Las moléculas objetivo ejemplares incluyen, por ejemplo, una molécula de suero que extiende la vida media en suero del multimero (por ejemplo, una inmunoglobulina o albúmina de suero) . Las moléculas ejemplares que extienden la vida media en suero de un multimero incluyen, por ejemplo, glóbulos rojos {esto es, eritrocitos), IgG, y albúmina de suero tal como HSA. Un ejemplo de un multimero puede incluir, por ejemplo, un dominio de monómero de las Familias 1-3 de los dominios de enlace a FGFRlc y un .monómero de las Familias 4-19 de los dominios de enlace a ß-Klotho (y opcionalmente 2, 3, 4, o más dominios de enlace a FGFRlc y/o ß-Klotho) y un dominio de monómero de enlace a. inmunoglobulina .

Las bibliotecas de multímero pueden contener homo-multimeros, hetero-multimeros de diferentes dominios de monómero de la misma clase de monómero, o hetero-multimeros de dominios de monómero de diferentes clases de monómero, o combinaciones de los mismos.

Los dominios de monómero, como se describe en la presente, también pueden emplearse fácilmente en un heteromultimero que contiene, un inmuno-dominio (esto es, un multímero que tiene al menos una variante de inmuno-dominio y una variante de dominio de monómero) . De esta manera, los multímeros pueden tener al menos un inmuno-dominio tal como un minicuerpo, un anticuerpo de dominio sencillo, un fragmento de variable de cadena sencilla (ScFv) , o un fragmento Fab; y al menos un dominio de monómero, tal como, por ejemplo, un dominio tipo EGF, un dominio Kringle, un dominio tipo I de fibronectina, un dominio tipo II de fibronectina, un dominio tipo III de fibronectina, un dominio PAN, un dominio Gla, un dominio SRCR, un dominio inhibidor de tripsina pancréatica de bovino/Kunitz, un dominio inhibidor de serina proteasa tipo Kazal, un dominio (tipo P) de trébol, un dominio tipo C del factor von Willebrand, un dominio tipo Anafilatoxina, un dominio CUB, una repetición de tipo I .de tiroglobulina, dominio clase A del receptor LDL, un dominio Sushi, un dominio Link, un dominio tipo I de Tromboespondina, un dominio tipo inmunoglobulina, un dominio de lectina tipo C, un dominio MAM, un dominio tipo A del factor von Willebrand, un dominio de Somatomedina B, un dominio de cuatro núcleos de disulfuro tipo WAP, un dominio tipo C F5/8, un dominio de Hemopexina, un dominio SH2, un dominio SH3, un dominio tipo EGF tipo Laminina, un dominio C2, o variantes de los mismos.

Los dominios no necesitan- seleccionarse antes de que los dominios se liguen para formar multímeros . Por otro lado, los dominios pueden seleccionarse por la capacidad de enlazar a una molécula objetivo antes de que se ligue en los multímeros. De esta manera, por ejemplo, un multímero puede comprender dos dominios que enlazan a una molécula objetivo (por ejemplo, ß-Klotho) y un tercer dominio que enlaza a una segunda molécula objetivo {por ejemplo, FGFRlc) , y un cuarto dominio que enlaza a un dominio modulador de la vida media. Ver Figura 8.

Los multímeros pueden tener una o más de las siguientes calidades: multivalente , multiespecífico, cadena sencilla, estable al calor, vida media de suero extendido y/o anaquel.

Además ninguno, uno, más de uno o todos de los dominios de monómero pueden enlazar un ión (por ejemplo, un ión de metal o un ión de calcio) , ninguno, uno, más de uno o todos de los dominios de monómero pueden derivarse de los dominios A del LDL y/o dominios tipo EGF, al menos uno, más de uno o todos de los dominios de monómero pueden ser recombinantes, y/o al menos uno, más de uno o todos de los dominios de monómero pueden comprender 1, 2, 3, o 4 enlaces de disulfuro por dominio de monómero. En algunas modalidades, los multímeros comprenden al menos dos (o al menos tres) dominios de monómero, en donde al menos un dominio de monómero es un dominio de monómero recombinante y los dominios de monómero enlazan a calcio. En algunas modalidades, los multímeros comprenden al menos 4 dominios de monómero, en donde al menos un dominio de monómero es recombinante, y en donde: a. cada dominio de monómero está entre 30-100 aminoácidos y cada uno de las dominios de monómero comprende al menos una ligadura de disulfuro o b. cada dominio de monómero está entre 30-100 aminoácidos y se deriva de una proteína extracelular; o c. cada dominio de monómero está entre 30-100 aminoácidos y enlaza a una proteína objetivo.

En algunas modalidades, . los multímeros comprenden al menos 4 dominios de monómero, en donde al menos un dominio de monómero es recombinante, y en donde: a. cada dominio de monómero está entre 35-100 aminoácidos; o b. cada dominio comprende al menos un enlace de disulfuro y se deriva de una proteína humana y/o una proteína extracelular.

En algunas modalidades, los multímeros comprenden al menos dos dominios de monómero, en donde al menos un dominio de monómero es recombinante, y en donde cada dominio es: a. 25-50 aminoácidos de largo y comprende al menos un enlace de disulfuro; o b. 25-50 aminoácidos de largo y se deriva de una proteína extracelular; o . c. 25-50 aminoácidos y enlaza a una proteína objetivo; o d. 35-50 aminoácidos de largo.

En algunas modalidades, los multímeros comprenden al menos dos dominios de monómero, en donde al menos un dominio de monómero es recombinante y: a. cada dominio de monómero comprende al menos un enlace de disulfuro; o b. al menos un dominio de monómero se deriva de una proteína extracelular; o ¦ c. al menos un dominio de monómero enlaza a una proteína objetivo.

Los dominios de monómero y/o multímeros identificados pueden tener actividad biológica, gue se entiende gue incluye al menos enlace selectivo de un ligando u objetivo seleccionado o deseado, y, en algunos casos, incluirán además la capacidad de bloquear el enlace de otros compuestos, para estimular o inhibir una trayectoria metabólica, para actuar como una señal o mensajero, para estimular o inhibir la actividad celular, y similares. En algunas modalidades, uno o más de los dominios de monómero de las proteínas de enlace proporcionadas en la presente enlazan a FGFRlc o ß-Klotho o tanto FGFRlc como ß-Klotho. En algunas modalidades, el enlace de uno o más dominios de monómero ya sea bloquea el enlace de otras moléculas a FGFRlc o ß-Klotho o, significativamente y como se muestra en los Ejemplos proporcionados en la presente, imitar la actividad in vivo de FGF21 y consecuentemente activa los eventos de señalización mediados por FGF21.

Un ligando sencillo puede usarse, u opcionalmente un variedad de ligandos puede usarse para seleccionar los dominios de monómero y/o multímeros. Un dominio de monómero puede enlazar un ligando sencillo o una variedad de ligandos. Un multímero de la presente invención puede tener sitios de enlace discretos múltiples para un ligando sencillo, u opcionalmente, puede tener sitios de enlace múltiples para una variedad de ligandos.

En algunas modalidades, los multimeros enlazan a los mismos u otros multimeros para formar agregados. La agregación puede mediarse, por ejemplo, por la presencia de dominios hidrofóbicos en dos dominios de monómero, resultando en la formación de interacciones no covalentes entre dos dominios de monómero. Alternativamente, la agregación puede facilitarse por uno o más dominios de monómero en un multimero que tiene especificidad de enlace por un dominio de monómero en otro multimero. Los¦ agregados también pueden formarse debido a la presencia de péptidos de afinidad en los dominios de monómero o multimeros. Los agregados pueden contener más dominios de enlace de molécula objetivo que un multimero sencillo.

Los multimeros con afinidad para tanto un objetivo de superficie celular (por ejemplo, ß-Klotho o FGFRlc) y un segundo objetivo pueden proporcionarse para efectos de avidez incrementados. En algunos casos, la fluidez de membrana puede ser más flexible que las ligaduras de proteina al optimizar (por auto-ensamble) el espaciado y valencia de las interacciones. En algunos casos, los multimeros enlazarán a dos objetivos diferentes, cada uno en una célula diferente o uno en una célula y otro en una molécula con sitios de enlace múltiples .

En algunas modalidades, los monómeros o multimeros descritos en la presente se ligan a otro polipéptido para formar una proteina de fusión. Cualquier polipéptido puede usarse como un compañero de fusión, aunque puede ser deseable si el compañero de fusión forma multimeros. Por ejemplo, los monómeros o multimeros pueden, por ejemplo, fusionarse a las siguientes ubicaciones o combinaciones de ubicaciones de un anticuerpo: 1. En la terminal N de los dominios VHl y/o VL1, opcionalmente justo después del péptido lider y antes de que el dominio inicie (región de estructura 1); 2. En la terminal N del dominio CH1 o CL1, reemplazando el dominio VHl o VLl; 3. En la terminal N de la cadena pesada, opcionalmente después del dominio CH1 y antes de los residuos de cisteína en la bisagra (fusión Fe) ; 4. En la terminal N del dominio CH3; 5. En la terminal C del dominio CH3, opcionalmente unido al último residuo de aminoácido por medio de una ligadura corta; 6. En la terminal C del dominio CH2, reemplazando el dominio CH3; 7. En la terminal C del dominio CL1 o CH1, opcionaIntente después de la cisteina que forma el disulfuro de intercadena; o 8. En la terminal C del dominio VH1 o VL1.

En algunas modalidades, uno o más dominios de monómero o multimero, tal como aquellos descritos en la presente, se ligan a una molécula (por ejemplo, una proteina, ácido nucleico, molécula pequeña orgánica, etc.) para formar un farmacéutico. Las proteínas farmacéuticas ejemplares adecuadas para fusión con una proteína de enlace incluyen, por ejemplo, citocinas, anticuerpos, quimiocinas, factores de crecimiento, interleucinas , proteínas de superficie celular (por ejemplo, FGFRlc o ß-Klotho) , dominios extracelulares , receptores de superficie celular, citotoxinas, etc. Los farmacéuticos de molécula pequeña ejemplares incluyen toxinas o agentes terapéuticos. En algunas modalidades, un metal puede enlazarse a las proteínas de enlace descrito en la presente. Esto puede ser útil, por ejemplo, como un agente de contraste para uso en MRI .

En algunas modalidades un polipéptido de albúmina de suero humana (HSA) se fusiona a la terminal N o C de un monómero o multimero. Como se describe en la presente, una secuencia heteróloga puede ser una secuencia de aminoácidos o un polímero que no contiene aminoácido. Las secuencias HSA pueden fusionarse ya sea directamente al monómero o multimero o por medio de una ligadura o molécula adaptadora. Una ligadura o molécula adaptadora puede ser uno o más residuos de aminoácido (o méros), por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, o 9 residuos (o méros), preferiblemente desde 10 hasta 50 residuos de aminoácido (o méros), por ejemplo, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40,. 45, o 50 residuos (o méros), y más' preferiblemente desde 15 hasta 35 residuos de aminoácido (o méros). Una ligadura o molécula adaptadora también puede desiñarse con un sitio de desdoblamiento para una endonucleasa de restricción de ADN o para una proteasa que - se permite para la separación de las porciones fusionadas.

En algunas modalidades, los monómeros o multimeros se seleccionan para enlazar a una proteina objetivo especifica de tejido o enfermedad. Las proteínas específicas de tejido son proteínas que se expresan exclusivamente, o en un nivel signifiticativamente superior, en uno o más tejidos particulares diversos comparados con otros tejidos en un animal.

En algunas modalidades, los monómeros o multimeros que enlazan a una o más- proteínas objetivo se ligan a una proteína farmacéutica o molécula pequeña de manera que el complejo o fusión resultante se dirige a las células relacionadas a la enfermedad o tejido específico donde la proteína objetivo (por ejemplo, FGFRlc o ß-Klotho) se expresa. Los monomeros o multímeros para uso en tales complejos o fusiones pueden seleccionarse inicialmente para enlazar a la proteína objetivo y pueden seleccionarse posteriormente por selección negativa contra otras células o tejido (por ejemplo, para evitar que la médula ósea dirigida u otros tejidos que ajustan el límite inferior de toxicidad de fármaco) donde se desea que el enlace se reduzca o elimine en otros tejidos o células no objetivo. Al mantener la forma farmacéutica de tejidos sensibles, la ventana terapéutica se incrementa de manera que una dosis superior puede administrarse de forma segura. En otra alternativa, la inmunoadsorción in vivo puede realizarse en animales al inyectar una biblioteca de monomeros o multímeros en un animal y luego aislar los monomeros o multímeros que enlazan a un tejido o célula particular de interés.

Las proteínas de enlace descritas en la presente también pueden incluir un péptido de ligadura entre la proteína farmacéutica y el monómero o multímeros.' Una secuencia de ligadura de péptido puede emplearse para separar, por ejemplo, los componentes de polipéptido por una distancia suficiente para asegurar que cada polipéptido se pliega en sus estructuras secundarias y terciarias. Las proteínas de fusión pueden generalmente prepararse usando técnicas estándares, incluyendo conjugación química. Las proteínas de fusión también pueden expresarse como proteínas recombinantes en un sistema de expresión por. técnicas estándares.

Los dominios de multímeros o monómero pueden producirse de acuerdo a cualquiera de los métodos conocidos en la técnica. En algunas modalidades, E. coli que comprende un plásmido que codifica los polipéptidos bajo control transcripcional de un promotor inducible se usa para expresar la proteína. Después de cosechar las bacterias, que pueden lisarse por métodos mecánicos tal como sonicación y homogenización, extracción química con detergente o por la aplicación de calor, y luego clarificarse por centrifugación.

Los polipéptidos pueden .purificarse usando elución de agarosa Ni-NTA (si 6xHis (SEQ ID NO: 393) etiquetado) o elución de sefarosa DEAE (si no está etiquetado) y replegado, tal como por diálisis. Las proteínas mal plegadas pueden neutralizarse al limitar los sulfhidrilos libres con ácido yodoacético. La elución de sefarosa Q, fenil sefarosa a través de flujo, butil sefarosa a través de flujo, elución de sefarosa SP, elución de sefarosa DEAE, y/o elución de sefarosa CM pueden usarse para purificar los polipéptidos. Las etapas de purificación de intercambio de cationes y/o aniones equivalentes también pueden emplearse.

En algunas modalidades, los monómeros o multímeros pueden purificarse usando lisis por calor, típicamente seguido por un enfriamiento rápido para prevenir la mayoría de las proteínas de renaturalización. Debido a la estabilidad de calor de las proteínas descrita en la presente, las proteínas deseadas no se desnaturalizarán por el calor y por lo tanto se permitirán para una etapa de purificación que resulta en pureza alta. En algunas modalidades, se usa un proceso de calentamiento de flujo continuo para purificar los monómeros o multímeros de cultivos celulares bacterianos. Por ejemplo, una suspensión celular puede pasarse a' través de una bobina de acero inoxidable sumergida en un baño de agua ajustado a una temperatura que resulta en lisis de las bacterias (por ejemplo, alrededor de 65-100 grados C) . El efluente lisado se enruta a un baño de¦ enfriamiento para obtener enfriamiento rápido y prevenir la renaturalización de proteínas E. coli desnaturalizadas. Las proteínas E. coli se desnaturalizan y previenen de renaturalización, pero el monómero o multímeros no se desnaturalizan bajo estas condiciones debido a la estabilidad excepcional de su andamiaje. El tiempo de calentamiento puede controlarse al ajusfar la velocidad de flujo y longitud de la bobina. Este enfoque proporciona proteínas activas con rendimiento alto y pureza excepcionalmente alta (por ejemplo, >80%, >85%, >90%, >95%, >96%, >97%, >98%, o >99%) comparada con enfoques alternativos y es capaz de producción a gran escala de material clínico.

En algunas modalidades, después de la generación de los monómeros o multimeros descritos en la presente, las proteínas de enlace se almacenan en una solución que comprende ácido yodoacético para prevenir amontonamiento de ligaduras de enlace de disulfuro. En algunas modalidades, 0.1-100 mM (por ejemplo, 1-10 mM) ácido yodoacético se incluye en las soluciones para almacenamiento. Si se desea, el ácido yodoacético puede removerse antes de administrarse a un individuo.

En algunas modalidades, el polipéptido que comprende un monómero o multímero se liga a sí mismo (terminal C hasta terminal N) , por ejemplo, para estabilidad de proteína.

VI. LIGADURAS Los dominios de monómero pueden unirse por una ligadura para formar un multímero. Por ejemplo, una ligadura puede posicionarse entre cada dominio de monómero discreto separado en un multímero.

Unir los dominios de monómero seleccionados por medio de una ligadura puede realizarse usando una variedad de técnicas conocidas en el arte. . Por ejemplo, ensamble combinatorio de polinucleótidos que codifica dominios de monómero seleccionados puede alcanzarse por digestión y re-ligación de restricción, por reacciones de traslape auto-cebadas, basadas en PCR, u otros métodos recombinantes . La ligadura puede unirse a un monómero antes de que el monómero se identifique por su capacidad para enlazar a un multímero objetivo o después de que el monómero se ha seleccionado por la capacidad de enlazar a un multímero objetivo.

La ligadura puede 'estar presente naturalmente, sintética o una combinación de ambas. Por ejemplo, la ligadura sintética puede ser una ligadura aleatoria, por ejemplo, tanto en secuencia como tamño. En un aspecto, la ligadura aleatoria 'puede comprender una secuencia completamente aleatoria, u opcionalmente , la ligadura aleatoria puede estar basada en secuencias de ligadura natural. La ligadura puede comprender, por ejemplo, una porción no de polipéptido, un polinucleótido, un polipéptido o la ligadura. Ver Figura 9, que proporciona ejemplos de ligaduras basadas en diversidad que se presentan naturalmente en ligaduras de dominio A tomadas del genoma humano que pueden formar un componente de las proteínas de enlace proporcionadas en la presente.

Una ligadura puede ser rígida, o flexible, o una combinación de ambos. La flexibilidad, de la ligadura puede ser una función de la composición de tanto la ligadura como los dominios de monómero que interactua con la ligadura. La ligadura une dos dominios de monómero seleccionados, y mantiene los dominios de monómero como dominios de monómero discretos separados. La ligadura puede permitir que los dominios de monómero discretos separados cooperen aún en mantener las propiedades separadas tal como sitios de enlace separados múltiples para el mismo ligando en un multimero, o por ejemplo, sitios de enlace separados múltiples para ligandos diferentes en un multimero. La ligadura puede por si misma interactuar con el ligando o ligandos, proporcionando un sitio de enlace además de aquellos sitios de enlace proporcionados por los monómeros del multimero constituyentes.

La elección de una ligadura adecuada para un caso especifico donde dos o más dominios de monómero son para conectarse puede depender de una variedad de parámetros incluyendo, por ejemplo, la- naturaleza de los dominios de monómero, la estructura y naturaleza del objetivo al cual el multimero de polipéptido debe enlazar y/o la estabilidad de la ligadura de péptido hacia proteólisis y oxidación.

La descripción actual proporciona métodos para optimizar la elección de la ligadura una vez que los dominios/variantes de monómero deseados se han' identificado. Generalmente, las bibliotecas de multímeros que tienen una composición que se fija con respecto a la composición del dominio de monómero, pero variable en composición y longitud de ligadura, puede prepararse y seleccionarse fácilmente como se describe arriba.

La discusión adicional de ligaduras puede encontrarse en la Publicación de Patente de E.U.A. No. 2005/0048512, por ejemplo, que se incorpora en la presente como referencia.

VII. IDENTIFICAR MONÓ EROS O MULTÍMEROS CON AFINIDAD PARA UNA MOLÉCULA OBJETIVO Aquellos de experiencia en la técnica pueden fácilmente identificar dominios de monómero con una propiedad deseada (por ejemplo, afinidad de enlace) . En este sentido, puede usarse cualquier método que resulta en selección de dominios con una propiedad deseada (por ejemplo, una propiedad de enlace especifica). Por ejemplo, los métodos pueden comprender proporciona una pluralidad de ácidos nucleicos diferentes, cada ácido nucleico que codifica un dominio de monómero; traduce la pluralidad de ácidos nucleicos diferentes, por ello proporciona una pluralidad de dominios de monómero diferentes; seleccionar la pluralidad de dominios de monómero diferentes para enlace del ligando deseado o una mezcla de ligandos; e, identificar miembros de la pluralidad de dominios de monómero diferentes que enlazan el ligando deseado o mezcla de ligandos.

Además, cualquier método de mutagénesis, tal como mutagénesis dirigida al sitio y mutagénesis aleatoria (por ejemplo, mutagénesis química) puede usarse para producir dominios de monómero, por ejemplo, para una biblioteca de dominio de monómero. En algunas modalidades, la PCR propensa a error puede emplearse para crear variantes. Los métodos adicionales incluyen alinear una pluralidad de dominios de monómero que se presentan naturalmente al alinear aminoácidos conservados en la pluralidad- de dominios de monómero que se presentan naturalmente; y, diseñar el dominio de monómero recombinante al mantener los aminoácidos conservados e insertar, eliminar o alterar aminoácidos alrededor de los aminoácidos conservados para generar el dominio de monómero recombinante. En una modalidad, los aminoácidos conservados comprenden cisteínas. En otra modalidad, la etapa de insertar usa aminoácidos aleatorios, u opcionalmente, la etapa de insertar usa porciones de los dominios de monómero que se presentan naturalmente. Las porciones pueden idealmente codificar rizos de dominios de la misma familia. Los aminoácidos se insertan o intercambian usando oligonucleótidos sintéticos, o por transposición, o por recombinación basada en enzima de restricción. Los dominios quiméricos humanos de la descripción actual pueden emplearse en aplicaciones terapéuticas donde se desea inmunogenicidad mínima. La descripción actual proporciona métodos para generar bibliotecas de dominios quiméricos humanos. Las bibliotecas de dominio de' monómero quimérico humanas pueden construirse al combinar secuencias de rizo de variantes diferentes de un dominio de monómero humano, como se describe arriba. Las secuencias de rizo que se combinan pueden ser rizos definidos por- secuencia, rizos definidos por estructura, rizos definidos por el factor B, o una combinación de cualquiera de los dos o más de los mismos.

Alternativamente, una biblioteca de dominio quimérico humano puede generarse al modificar dominios de monómero humanos que se presentan naturalmente en el nivel de aminoácido, como se compara con el nivel de rizo. En algunas modalidades, para minimizar el potencial para inmunogenicidad, sólo aquellos residuos que se presentan naturalmente en las secuencias de proteína de la misma familia de dominios de monómero humanos se utilizan para crear las secuencias quiméricas. Esto puede alcanzarse al proporcionar una alineación de secuencia de al menos dos dominios de monómero humanos de la misma familia de dominios de monómero, identificando residuos de aminoácido en posiciones correspondientes en la secuencia de dominio de monómeros humana que difiere entre los dominios de monómero humanos, generando dos o más dominios de monómero quiméricos humanos, en donde cada secuencia de dominio de monómero quimérica humana consiste de residuos de aminoácido que corresponde en tipo y posición a residuos de dos o más dominios de monómero humanos de la misma familia de dominios de monómero. Las bibliotecas de dominios de monómero quiméricos humanos pueden emplearse para identificar dominios de monómero quiméricos humanos que enlazan a un objetivo de interés al seleccionar la biblioteca de dominios de monómero quiméricos humanos para enlazar a una molécula objetivo, e identificar un dominio de monómero quimérico humano que enlaza a la molécula objetivo. La secuencia de dominios de monómero humana que se presenta naturalmenbte adecuada empleada en la etapa de alineación de la secuencia inicial incluyen .aquellos correspondientes a cualquiera de los dominios de monómero que se presentan naturalmente descritos en la presente.

Los dominios de bibliotecas de variante de monómero humanas de la descripción actual (si se generan al variar rizos o residuos de aminoácido sencillos) pueden prepararse por métodos conocidos para aquellos que tienen experiencia ordinaria en la técnica. Los métodos particularmente adecuados para generar estas bibliotecas son formato de acumulado/grupo dividido y formato de síntesis de trinucleótido como se describe en WO01/23401, incorporada en la presente como referencia.

En algunas modalidades, los dominios de monómero de la descripción se seleccionan para inmunogenicidad potencial al: (a) proporcionar una secuencia de proteina candidata; (b) comparar la secuencia de proteina candidata con una base de datos de las secuencias de proteina humanas; (c) identificar porciones de la secuencia de proteina candidata que corresponde a las porciones de las secuencias de proteínas humanas de la base de datos; y (d) determinar la extensión de correspondencia entre la secuencia de proteína candidata y las secuencias de proteína humanas de la base de datos.

En general, cuanto mayor la extensión de correspondencia entre la secuencia de proteína candidata y una o más de las secuencias de proteína humanas dé la base de datos, menor el potencial para inmunogenicidad se predice como se compara con una proteína candidata que tiene poca correspondencia con cualquiera de las secuencias de proteína humanas de la base de datos. Una base de datos de las secuencias de proteína humanas que es adecuada para uso en la práctica del método de la invención para seleccionar proteínas candidatas pueden encontrarse en el sitio web para el Centro Nacional para Información de Biotecnología (NCBI) . Este sitio web proporciona el algoritmo de Herramienta de Investigación de Alineación Local Básica (BLAST) como un recurso que puede usarse para encontrar 'regiones de similitud local entre las secuencias. El programa compara las secuencias de nucleótido o proteina con las bases de datos de secuencias y calcula la importancia estadística de que coinciden. Las bases de datos disponibles para comparación contienen información de secuencia de genomas completos ¦ de muchas especies de vertebrados, invertebrados, plantas, hongos, protozoarios , procarióticas y arcaicas. El BLAST puede usarse para deducir relaciones funcionales y .evolucionarlos entre las secuencias así como ayudar a identificar miembros de las familias del gen. Una segunda herramienta disponible en NCBI, COBALT (herramienta de alineación basada en fuerza) permite la alineación simultánea de secuencias múltiples que pueden aplicarse a búsquedas de bases de datos. Estos métodos son particularmente útiles al determinar si una secuencia cruzada en una proteína quimérica, tal comó, por ejemplo, un dominio de monómero quimérico, es probable que provoque un evento inmunogénico . Si la secuencia cruzada corresponde a una porción de una secuencia, encontrada en la base de datos de secuencias de proteína humanas, es posible que la secuencia cruzada sea menos 'probable para provocar un evento inmunogénico.

La información que pertenece a porciones de secuencia de protelna humanas de la base de datos puede usarse para diseñar una colección de proteina de proteínas quiméricas tipo humanas. Tal colección puede generarse al usar información que pertenece a "secuencias cruzadas" que existen en proteínas humanas que se presentan naturalmente. Como se usa en la presente el término "secuencia cruzada" se refiere a una secuencia que se encuentra en su totalidad en al menos una proteína humana que se presenta naturalmente, en la cual las porciones de la secuencia se encuentran en dos o más proteínas que se presentan naturalmente. De esta manera, la recombinación de las últimas dos o más proteínas que se presentan naturalmente debe generar una proteína quimérica en la cual la porción quimérica de la secuencia actualmente corresponde a una secuencia encontrada en otra proteína que se presenta naturalmente. La secuencia cruzada contiene una unión quimérica de dos posiciones de residuo de aminoácido consecutivas en las cuales la primera posición de aminoácido se ocupa por un residuo de aminoácido idéntico en tipo y posición encontrado en una primera y segunda secuencia de proteína humana que se presenta naturalmente, pero no a una tercera secuencia dé proteína humana que se presenta naturalmente. La segunda posición de aminoácido se ocupa por un residuo de aminoácido idéntico en tipo y posición encontrado en una segunda y tercera secuencia de proteína humana que se presenta naturalmente, pero no la primera secuencia de proteina humana que se presenta naturalmente. En otras palabras, la "segunda" secuencia de proteina humana que se presenta naturalmente corresponde a la proteina humana que se presenta naturalmente en la cual la secuencia cruzada aparece en su totalidad, como se describe arriba.

En algunas modalidades, una colección de proteínas quiméricas tipo humanas se genera al: (a) identificar secuencias de proteína humanas de una base de datos que corresponden a proteínas de la misma familia de proteínas; alineando las secuencias de proteína humanas de la misma familia de proteínas a una secuencia de proteína de referencia; (b) identificar un conjunto de subsecuencias derivados de secuencias de proteína humanas diferentes de la misma familia, en donde cada subsecuencia comparte una región de identidad con al menos otra subsecuencia derivada de una secuencia de proteína humana que se presenta naturalmente diferente; y (c) identificar una unión quimérica de una primera, una segunda, y una tercera subsecuencia, en donde cada subsecuencia se deriva de una secuencia de proteína humana que se presenta naturalmente diferente, y en donde la unión quimérica comprende dos posiciones de residuo de aminoácido consecutivas en las ' cuales la primera posición de aminoácido se ocupa por un residuo de aminoácido común a la primera y segunda secuencia de proteina humana que se presenta naturalmente, pero no la tercera secuencia de proteina humana que se presenta naturalmente, y la seguna posición de aminoácido se ocupa por un residuo de aminoácido común a la segunda y tercera secuencia de proteina humana que se presenta naturalmente, y generar moléculas de proteina quimérica tipo humana cada una correspondiente en secuencia a dos o más subsecuencias del conjunto de subsecuencias, y cada una comprende una o más de las uniones quiméricas identificadas.

De esta manera, por ejemplo, si la primera secuencia de proteina humana que se presenta naturalmente es, A-B-C, y la segunda es, B-C-D-E, y la tercera es, D-E-F, entonces la unión quimérica es C-?.- Alternativamente, si la primera secuencia de proteina humana que se presenta naturalmente es D-E-F-G, y la segunda es B-C-D-E-F, y la tercera es A-B-C-D, entonces la unión quimérica es D-E. Las moléculas de proteina quimérica tipo humanas pueden generarse en una variedad de formas. Por ejemplo, los oligonucleótidos que comprenden secuencias que codifican las uniones quiméricas pueden recombinarse con oligonucleótidos correspondientes en secuencia a dos o más subsecuencias del conjunto descrito arriba de subsecuencias para generar una proteina quimérica tipo humana, y bibliotecas de las mismas. La secuencia de referencia usada para alinear las proteínas humanas que se presentan naturalmente es una secuencia de la misma familia de proteínas humanas que se presentan naturalmente, o una quimera u otra variante de proteínas en la familia.

Los ácidos nucleicos que codifican fragmentos de dominios de monómero que. se presentan naturalmente también pueden mezclarse y/o recombinarse (por ejemplo, al usar fragmentos producidos 'químicamente o enzimáticamente) para generar dominios de monómero modificados de longitud completa. Los fragmentos y el dominio de monómero también pueden recombinarse al manipular ácidos nucleicos que codifican dominios o fragmentos de los mismos. Por ejemplo, ligando un constructo de ácido nucleico que codifica fragmentos del dominio de monómero puede usarse para generar un dominio de monómero alterado.

Los dominios de monómero alterados también pueden generarse al proporciona una colección de oligonucleotidos sintéticos (por ejemplo, oligonucleotidos traslapado) que codifica la secuencia conservada, aleatoria, pseudoaleatoria, o una definida de las secuencias de péptido que luego se insertan por ligación en un sitio predeterminado en un polinucleótido que codifica un dominio de monómero. De manera similar, la diversidad de secuencia de uno o más dominios de monómero puede expandirse al mutar los dominios de monómero con mutagénesis dirigida al sitio, mutación aleatoria, mutación pseudoaleatoria, mutación nuclear definida, mutación basada en codón, y similares. Las moléculas de ácido nucleico resultantes pueden propagarse en un hospedero para clonación y amplificación. En algunas modalidades, los ácidos nucleicos se revuelven.

. La descripción actual también proporciona un método para recombinar una pluralidad de ácidos nucleicos que codifica dominios de monómero y selecciona la colección resultante para dominios de monómero que enlazan a la mezcla o ligando deseado de ligandos o similares. Los ácidos nucleicos de dominio de monómero seleccionados también pueden cruzarse de nuevo por t ansposición con secuencias de polinucleótido que codifican secuencias . neutrales (esto es, secuencias que tienen un efecto funcional insustancial en enlace) , tal como por ejemplo, al cruzar de nuevo con una secuencia de tipo natural o que se presenta naturalmente sustancialmente idéntica a una secuencia seleccionada para producir dominios de monómero funcionales tipo nativos. Generalmente, durante el cruce de nuevo, la selección posterior se aplica para mantener la propiedad, por ejemplo, enlace al ligando.

En algunas modalidades, una biblioteca de monómeros se prepara por transposición. En tal caso, los dominios de monómero se aislan y revuelven para recombinar combinatoriamente las secuencias de ácido nucleico que codifican los dominios de monómero (la recombinación puede ocurrir entre o dentro de dominios de monómero, o ambos). La primera etapa involucra identificar un dominio de monómero que tiene la propiedad deseada, por ejemplo, afinidad para un cierto ligando. Mientras que mantiene los aminoácidos conservados durante la recombinación, las secuencias de ácido nucleico que codifican los dominios de monómero pueden recombina se , o recombinarse y unirse en mu1timeros .

Una ventaja de los métodos y composiciones descritas en la presente es que los ligandos conocidos, o ligandos desconocidos pueden usarse para seleccionar los dominios de monómero y/o multimeros. No se requiere información previa con respecto a la estructura de ligando para aislar los dominios de monómero de interés o los multimeros de interés. Los dominios de monómero y/o multimeros identificados pueden tener actividad biológica, que significa que incluya al menos afinidad de enlace, especifica para un ligando seleccionado o deseado, y, en algunos casos, incluirán además la capacidad de bloquear el enlace de otros compuestos, para estimular o inhibir trayectorias metábólicas, para actuar como una señal o mensajero, para estimular o inhibir la actividad celular, y similares. Los dominios de monómero también pueden generarse para funcionar como ligandos para receptores donde el ligando natural para el receptor aún no se ha identificado (receptores huérfanos).. Estos ligandos huérfanos pueden crearse para ya sea bloquear o activar el receptor al cual se enlazan .

Un ligando sencillo puede usarse, u opcionalmente una variedad de ligandos puede usarse para seleccionar los dominios de monómero y/o multimeros. Un dominio de monómero de la descripción actual puede enlazar un ligando sencillo o una variedad de ligandos. Un multimero de la descripción actual puede tener Sitios de enlace discretos múltiples para un ligando sencillo, u opcionalmente, puede tener sitios de enlace múltiples para una variedad de ligandos.

En algunas modalidades, los multimeros o monómeros se seleccionan por la capacidad de enlazar a una proteina de especies diferentes múltiples' (por ejemplo, 2, 3, o más) . Por ejemplo, proteínas ortólogas humanas y de primate pueden seleccionarse, por. ello generan polipéptidos que enlazan las proteínas (por ejemplo, IgG, HSA u otro extensor de vida media de suero u otra proteína) de tanto un humano como un primate, por ello se permite para facilidad de análisis de toxicología en primates para uso en humanos.

También se describen composiciones que se producen por métodos descritos en la presente. Por ejemplo, la descripción actual incluye dominios de monómero seleccionados o identificados de una colección y/o bibliotecas que comprenden dominios de monómero producidos por los métodos descritos en la presente.

La descripción actual' también proporciona bibliotecas de dominios de monómero y bibliotecas de ácidos nucleicos que codifican dominios de monómero. Las bibliotecas pueden comprender, por ejemplo, alrededor de 100, 250, 500 o más ácidos nucleicos que codifican dominios de monómero, o la colección puede incluir, por ejemplo, alrededor de 100, 250, 500 o más polipéptidos que codifican dominios de monómero. Las bibliotecas pueden incluir dominios de monómero que contienen el mismo cuadro de cisteina, por ejemplo, dominios A o dominios tipo EGF.

En algunas modalidades, las variantes se generan al recombinar dos o más secuencias diferentes de la misma familia de dominios de monómero (por ejemplo, el dominio de clase A del receptor LDL) . Alternativamente, dos o más dominios de monómero diferentes de familias diferentes pueden combinarse para formar un multimero. En algunas modalidades, los multimeros se forman de monómeros o variantes de monómero de al menos una de las siguientes clases de familia: un dominio tipo EGF, un dominio Kringle, un dominio tipo I de fibronectina, un dominio tipo II de fibronectina, un dominio tipo III de fibronectina, un dominio PAN, un dominio Gla, un dominio SRCR, un dominio inhibidor de tripsina pancréatica de bovino/Kunitz, un domnio inhibidor de serina proteasa tipo Kazal, un dominio (tipo P) de trébol, un dominio tipo C del factor von illebrand, un dominio tipo Anafilatoxina, un dominio CUB, una repetición de tipo I de tiroglobulina , dominio clase A del receptor LDL, un dominio Sushi, un dominio Link, un dominio tipo I de Tromboespondina, un dominio tipo inmunoglobulina , un dominio de lectina tipo C, un dominio MAM, un dominio tipo A del factor von Willebrand, un dominio de Somatomedina B, un dominio de cuatro núcleos de disulfuro tipo WAP, un dominio tipo C F5/8, un dominio de Hemopexina, un dominio SH2, un dominio SH3, un dominio tipo EGF tipo Laminina, un dominio C2 y derivados de los mismos. En otra modalidad, el dominio de monómero y el dominio de monómero diferente puede incluir uno o más dominios encontrados en la base de datos Pfam y/o la base de datos SMART . Las bibliotecas producidas por los métodos de arriba, una o más células que comprenden uno o más miembros de la colección, y una o más despliegues que comprenden uno o más miembros de la colección también forman el aspecto de la descripción actual.

Opcionalmente, un conjunto de datos de cadenas de caracteres de ácido nucleico que codifica dominios de monomero puede generarse por ejemplo, al mezclar una primera serie de caracteres que codifica un dominio de monomero, con una o más serie de caracteres que codifica un dominio de monomero diferente, por ello produce un conjunto de datos de las series de caracteres de ácidos nucleicos que codifica dominios de monomero, incluyendo aquellos descritos en la presente. En otra modalidad, el dominio de monomero y el dominio de monomero diferente puede incluir uno o más dominios encontrados en la base de datos Pfam y/o la base de datos S ART . Los métodos pueden comprender además insertar la primera serie de caracteres que codifica el dominio de monomero y una o más segunda serie de caracteres que codifica el dominio de monomero diferente en una computadora y genera las series o bibliotecas de ' caracteres de multimero, del mismo en la computadora.

Las bibliotecas pueden seleccionarse por una propiedad deseada tal como enlace de un ligando deseado o mezcla de ligandos. Por ejemplo, los miembros de la biblioteca de dominios de monomero pueden exhibirse y preseleccionarse para enlazar a un ligando conocido o desconocido o una mezcla de ligandos. Las secuencias de dominio de monomero luego pueden mutagenizarse (por ejemplo, recombinarse, alterarse químicamente, etc.) o de otra manera alterarse y los nuevos dominios de monómero pueden seleccionarse de nuevo para enlazar al ligando o la mezcla de ligandos con una afinidad mejorada. Los dominios de monómero seleccionados pueden combinarse o unirse para formar multimeros, que luego pueden seleccionarse por una afinidad o avidez mejorada o especificidad alterada para el ligando o la mezcla de ligandos. La especificidad alterada puede significar que la especificidad se amplia, por ejemplo, enlace de virus relacionados múltiples, u opcionalmente, especificidad alterada puede significar que la especificidad se reduce, por ejemplo, enlace dentro de una región específica de un ligando. Aquellos de experiencia en la técnica reconocerán que existe un número de métodos disponibles para calcular la avidez. Ver, por ejemplo,' ammen et al., Angew Chem Int. Ed. 37:2754-2794 (1998); Muller et al., Anal. Biochem. 261:149-158 (1998) .

VIII . SELECCIÓN DE DOMINIOS DE MONÓMERO QUE ENLAZAN FGFRlc O p-KLOTHO Las selecciones preliminarse pueden conducirse al seleccionar los agentes capaces de enlazar a FGFRlc o ß-Klotho. Los ensayos de enlace pueden involucrar poner en contar una proteina FGFRlc o ß-Klotho (o un fragmento de la misma) con uno o más agentes de prueba {esto es, monómeros o multimeros descritos en la presente) y que permiten tiempo suficiente para la proteina y agentes de prueba para formar un complejo de enlace. Cualquiera de los complejos de enlace formados puede detectarse usando cualquiera de un número de técnicas analíticas establecidas. Los ensayos de enlace de proteína incluyen, pero no se limitan a, ensayos inmunosorbentes ligados a la enzima (ELISA) , Alphascreen (ensayo homogéneo de proximidad luminiscente amplificado) , ensayos de enlace inmunohistoquímico, citometría de flujo u otros ensayos. Las proteínas FGFRlc y ß-Klotho utilizadas en tales ensayos pueden expresarse naturalmente, clonarse o sintetizarse. Los métodos similares pueden usarse para identificar dominios de monómero o multimeros que enlazan a IgG o HSA.

Los métodos seleccionados descritos en la presente pueden realizarse como ensayos in vitro o basados en célula. Los ensayos basados en célula pueden realizarse en cualquiera de las células en las cuales se expresa FGFRlc, ß-Klotho o tanto FGFRlc como ß-Klotho. Los ensayos basados en célula pueden involucrar celular completas o fracciones celulares que contienen FGFRlc y/o ß-Klotho para seleccionar el enlace del agente o modulación de actividad por el agente. Los tipos celulares ejemplares que pueden usarse de acuerdo a los métodos descritos en . la presente incluyen, por ejemplo, cualquiera de las células mamiferas, asi como células de hongos, incluyendo levadura, y células bacterianas. Las células pueden ser células primarias o células de tumor u otros tipos de lineas celulares- inmortales. Por supuesto, FGFRlc o ß-Klotho pueden expresarse recombinantemente en células que no contienen endógenamente FGFRlc o ß-Klotho.

Los ensayos de actividad FGFRlc o ß-Klotho también pueden usarse para identificar un modulador (antagonista o agonista) de FGFRlc o ß-Klotho. Adicionalmente, los ensayos de la actividad para identificar moduladores de la actividad mediada por FGF21, tal como aquellos descritos en los Ejemplos, también pueden emplearse. En estas modalidades, uno o más agentes de prueba se ponen en contacto con una célula que expresa FGFRlc, o tanto FGFRlc como ß-Klotho, y luego se prueban para actividad mediada por FGFRlc, o FGF21, respectivamente. Con objeto de determinar que el modulador tiene actividad dependiente de ß-Klotho (una característica de FGF-21) es necesaria para mostrar que puede inducir actividad agonista en células que co-expresan un miembro de la familia FGFR (FGFRlc, FGFR2c, FGFR3C, y FGFR4) y ß-Klotho (ver, por ejemplo, Figura 37). Las actividades mediadas por FGFRlc ejemplares incluyen activación de expresión de luciferasa bajo el control de un promotor sensitivo de trayectoria ERK en respuesta a FGF-1 en ausencia de ß-Klotho (ver, por ejemplo, Figura 46) y las actividades mediadas por FGF21 ejemplares incluyen activación de expresión de luciferasa bajo el control de un promotor sensitivo de trayectoria ERK en respuesta a FGF-21 en presencia de ß-Klotho (ver, por ejemplo, Figuras 30 y 31, 33 hasta 35, 38, 45, y 47 hasta 49) . En .otras modalidades, los eventos moleculares cadena abajo también pueden monxtorearse para determinar la actividad de señalización. Por ejemplo, la transducción de señal mediada por FGF21 se media por la trayectoria ERK y varios métodos se conocen para medir la señalización a través de la trayectoria ERK, incluyendo aquellos descritos en la presente, por ejemplo, en los Ejemplos 9, 10 y 11.

En algunas modalidades, los ensayos de actividad, tal como aquellos descritos en la presente en el Ejemplo 9, también pueden usarse para confirmar que monómeros o multimeros agonistas identificados (por ejemplo, aquellos que enlazan a tanto FGFRlc o ß-Klotho) carecen de actividad antagonista (esto es, que no bloquean la señalización mediada por FGF21) .

Los agentes que se identifican inicialmente por cualquiera de los métodos de selección anteriores pueden probarse además para validar la actividad aparente. Tales estudios pueden conducirse con modelos de animal adecuados.

El formato básico de tales métodos involucra administrar un agente de interés identificado durante urra pantalla inicial para un animal que sirve como un modelo para humanos y luego determinar si la señalización mediada por FGF21 de hecho se modula y/o un efecto fisiológico deseado se. observa (por ejemplo, disminución de niveles de glucosa en la sangre, niveles de insulina en la sangre o niveles de lipido en la sangre) y/o una enfermedad o afección se alivia (por ejemplo, diabetes u obesidad) . Los modelos de animal utilizados en estudios de validación generalmente son mamíferos de cualquier tipo. Los ejemplos específicos de animales adecuados incluyen, pero no se limitan a, primates no humanos (incluyendo monos cynomolgos y rhesus), ratones y ratas.

La selección de dominios de monómero que enlazan FGFRlc o ß-Klotho de una biblioteca, de dominios puede realizarse usando cualquiera de una variedad de procedimientos. Por ejemplo, un método para identificar dominios de monómero que tienen una propiedad deseada (por ejemplo, FGFRlc o ß-Klotho de enlace o IgG) involucra traducir una pluralidad de ácidos nucleicos, donde cada ácido nucleico codifica un dominio de monómero, selecciona los polipéptidos codificados por la pluralidad de ácidos nucleicos, e identifica aquellos dominios de monómero que, por ejemplo, enlazan a un ligando deseado o mezcla de ligandos, por ello produce un dominio de monómero seleccionado. Los dominios de monómero expresados por cada uno de los. ácidos nucleicos pueden probarse por su capacidad de enlazar al ligando por métodos conocidos en la técnica (por ejemplo, inmunoadsorción, cromatografía de afinidad, ELISA, Alphascreen, o análisis FACS, como se describen en la presente) .

Como se anota en la presente, la selección de dominios de monómero puede basarse en enlace a un ligando tal como FGFRlc o ß-Klotho, o un fragmento del mismo u otra molécula objetivo (por ejemplo, lípido, carbohidrato, ácido nucleico y similares) . El ligando puede proporcionarse ya sea como una proteína purificada recombinante, o expresarse en la superficie de una célula, tal como una célula bacteriana, de hongos, insecto o mamífera. Otras moléculas pueden opcionalmente incluirse en' los métodos junto con el objetivo, por ejemplo, iones tal como Ca+2.

Cuando un dominio de monómero se selecciona con base en su capacidad para enlazar a un ligando, la base de selección puede incluir selección basada en una velocidad de disociación lenta, que es predice us.ualmente de alta afinidad. La valencia del ligando también puede variarse para controlar la afinidad de enlace promedio de dominios de monómero seleccionados. El ligando puede enlazarse a una superficie o sustrato en densidades variadas, tal como al incluir un compuesto competidor, por dilución, o por otro método conocido para aquellos en la técnica. La densidad alta (valencia) de ligando predeterminado puede usarse para enriquecer los dominios de monómero que tienen afinidad relativamente baja, mientras que una densidad baja (valencia) puede enriquecer preferencialmente los dominios de monómero de afinidad superior.

Una variedad de sistemas o vectores de despliegue de cobertura pueden usarse para expresar ácidos nucleicos que codifican los dominios de monómero y/o multimeros descritos en la presente y para probar una actividad deseada. Por ejemplo, un sistema de despliegue de fagos es un sistema en el cual los dominios de monómero se expresan como proteínas de fusión en la superficie de fago (Pharmacia, ilwaukee Wis.). El despliegue de fagos puede involucrar la presentación de una secuencia de polipéptido que codifica dominios de monómero en la superficie de un bacteriófago filamentoso, típicamente como una fusión con una proteína recubierta con bacteriófago.

Generalmente en estos métodos, cada célula o partícula de fago sirve como un miembro de colección individual que exhibe una especie sencilla de polipéptido exhibido además del fago natural o secuencias de proteína celular. Los ácidos nucleicos se clonan en el ADN de fago en un sitio que resulta en la transcripción de una proteina de fusión, una porción de la cual sé codifica por la pluralidad de los ácidos nucleicos. El fago que contiene una molécula de ácido nucleico experimenta replicación y transcripción en la célula. La secuencia líder de la proteína de fusión dirige el transporte de la proteína de fusión a la punta de la partícula de fago. De esta manera, la proteína de fusión que se codifica parcialmente por el ácido nucleico se exhibe en la partícula de fago para detección y selección por los métodos descritos arriba y a continuación. Por ejemplo, la colección de fago puede incubarse con un ligando predeterminado tal como FGFRlc o ß-Klotho o un fragmento del mismo, de manera que las partículas en fago que presentan una secuencia de proteína de fusión que enlaza al ligando puede dividirse diferencialmente de aquellos que no presentan secuencias de polipéptido que enlazan al ligando predeterminado. Por ejemplo, la separación puede proporcionarse al inmovilizar el ligando predeterminado. Las partículas de fago (esto es, miembros de colección) que se enlazan al ligadno inmovilizado luego se recuperan, y replican para amplificar la subpoblacion de fago seleccionado para una ronda posterior de enriquecimiento de afinidad y replicación de fago. Después de varias rondas de enriquecimiento de afinidad y replicación de fago, los miembros de la colección de fago que son de esta manera seleccionados se. aislan y la secuencia de nucleótido que codifica la secuencia de polipéptido exhibida se determina, por ello identifica las secuencias de los polipéptidos que enlazan al ligando predeterminado. Tales métodos se describen además en la Publicación PCT Nos. WO 91/17271, WO 91/18980, O 91/19818 y WO 93/08278.

Los ejemplos de otros sistemas de despliegue incluyen despliegues de ribosoma, un despliegue ligado al nucleótido (ver, por ejemplo, Patentes de E.U.A. Nos. 6,281,344; 6,194,550, 6,207,446, 6,214,553, y 6,258,558), despliegue de polisoma, despliegues de superficie celular y similares. Los despliegues de superficie celular incluyen una variedad de células, por ejemplo, E. coli, levadura y/o células mamiferas. Cuando una célula se usa como un despliegue, los ácidos nucleicos, por ejemplo, aquellos obtenidos por amplificación PCR seguido por digestión, se introducen en la célula y traducen. Opcionalmente, los polipéptidos que codifican los dominios de monómero o los multimeros descritos en la presente pueden introducirse, por ejemplo, por inyección, en la célula.

Las bibliotecas de monómero y multimero de la descripción actual pueden seleccionarse por una propiedad deseada tal como enlace de un ligando deseado (por ejemplo, FGFRlc o ß-Klotho) o una mezcla de ligandos. Por ejemplo, miembros de la biblioteca de dominios de monómero pueden exhibirse y preseleccionarse para enlazar a un ligando conocido o desconocido o una mezcla de ligandos. Las secuencias de dominio de monómero luego pueden mutagenizarse (por ejemplo, recombinarse, alterarse químicamente, etc.) o de otra manera alterarse y los nuevos dominios de monómero pueden seleccionarse de nuevo para enlace al ligando o la mezcla de ligandos con una afinidad mejorada. Los dominios de monómero seleccionados pueden combinarse o unirse para formar multímeros, que luego pueden, seleccionarse para una afinidad o avidez mejorada o especificidad alterada para el ligando o la mezcla de ligandos. La especificidad alterada puede significar que la especificidad está amplia, por ejemplo, enlace de ligandos relacionados múltiples, u opcionalmente, la especificidad alterada puede significar que la especificidad está reducida, por ejemplo, enlace dentro de una región específica de un ligando. Aquellos de experiencia en la técnica reconocerán que existe un número de métodos disponibles para calcular la avidez. Ver, por ejemplo, Mammen et al., . Angew Chem Int. Ed. 37:2754-2794 (1998); Muller et al., Anal. Biochem. 261:149-158 (1998).

Aquellos de experiencia en la técnica reconocerán que las etapas de generación de variación y selección para una propiedad deseada pueden repetirse (esto es, realizadas recursivamente) para optimizar los resultados. Por ejemplo, en una colección de despliegue de fagos u otro tipo similar, una primera selección de una colección puede realizarse en estringencia relativamente inferior, por ello selecciona tantas partículas asociadas con una molécula objetivo como sean posibles. Las partículas seleccionadas luego pueden aislarse y los polinucleótidos que codifican el monómero o multímero pueden aislarse de las partículas. Las variaciones adicionales luego pueden generarse de estas secuencias y posteriormente seleccionar una afinidad superior.

Todas las composiciones de - la descripción actual, por ejemplo, dominios de monómero así como multímeros y bibliotecas de los mismos, pueden enlazarse opcionalmente a una matriz de un material de afinidad. Los ejemplos de material de afinidad incluyen perlas, una columna, un soporte sólido, una microconfiguración, otros grupos de soportes de reactivo, y similares.

Cuando los multímeros capaces de enlazar objetivos relativamente grandes se desean, pueden generarse por un método de selección "ambulante", como se realizó para generar un número de las proteínas de enlace descritas. Este método se lleva a cabo al proporcionar una biblioteca de dominios de monómero y slecciona la biblioteca de dominios de monómero para afinidad a una primera molécula objetivo. Se identifica una vez que al menos un monómero enlaza al objetivo, que el monómero se liga covalentemente a una nueva colección o cada miembro restante de la colección original de dominios de monómero. Esta nueva colección de multimeros (dímeros) luego se selecciona para multimeros que enlazan al objetivo con una afinidad incrementada, y un multimero que enlaza al objetivo con una afinidad incrementada puede identificarse. El método de selección de monómero "ambulante" proporciona una forma para ensamblar un multimero que está compuesto de monómeros que pueden actuar aditivamente o aún sinérgicamente uno con el otro dando las limitaciones de la longitud de ligadura. Esta técnica ambulante es muy útil cuando se selecciona para y ensambla multimeros que son capaces de enlazar proteínas objetivo grandes con alta afinidad. El método ambulante puede repetirse para agregar más monómeros por ello resulta en un multimero que comprende 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 o más monómeros ligados juntos. Este método "ambulante" se empleó en la generación de proteínas de enlace específicas de ß-Klotho, como se describe en el Ejemplo 7.

En algunas modalidades, el multimero seleecionado comprende más de dos dominios. Tales multimeros pueden generarse en una forma de etapa, por ejemplo, donde la adición de cada nuevo dominio se prueba individualmente y el efecto de los dominios se prueba en una forma secuencial. Ver Figura 7. En una modalidad alterna, los dominios se ligan para formar multimeros que comprenden más de dos dominios y seleccionan para enlazarse sin conocimiento previo de cómo enlazar multimeros más pequeños, o alternativamente, como enlazar cada dominio.

Los métodos de la descripción actual también incluyen métodos de evolucionar los' monómeros o multimeros. La recombinación de intra-dominio puede introducirse en monómeros a través del monómero completo o al tomar porciones de monómeros diferentes para formar nuevas unidades recombinadas . La recombinación interdominio (por ejemplo, recombinar monómeros diferentes en o entre multimeros) o recombinación de módulos (por ejemplo, monómeros múltiples dentro de un multimero) pueden lograrse. La recombinación inter-colección también se contempla.

Los métodos para evolucionar monómeros o multimeros pueden comprender, por ejemplo, cualquier o todas de las siguientes etapas: proporcionar- una pluralidad de ácidos nucleicos diferentes, donde cada ácido nucleico codifica un dominio de monómero; · traducir la pluralidad de ácidos nucleicos diferentes, que proporciona una pluralidad de dominios de monómero diferentes; seleccionar la pluralidad de dominios de monómero diferentes para enlace del ligando deseado (por ejemplo, FGFRlc o ß-Klotho) o mezcla de ligandos; identificar miembros de la pluralidad de dominios de monómero diferentes que enlazan el ligando deseado o mezcla de ligandos, que proporcionan dominios de monómero seleccionados; unir los dominios de monómero seleccionados con al menos una ligadura, para generar al menos un multimero, en donde al menos un multimero comprende al menos dos de los dominios de monómero seleccionados y al menos una ligadura; y, seleccionar al menos un multimero para una afinidad o avidez mejorada o especificidad alterada para el ligando deseado o mezcla de ligandos como se compara con los dominios de monómero seleccionados.

La variación puede introducirse en ya sea monómeros o multimeros. Un ejemplo de monómeros mejorados incluye recombinación intra-dominio en la cual dos o más (por ejemplo, tres, cuatro, cinco, o más) porciones del monómero se amplifican separadamente bajo condiciones para introducir variación (por ejemplo por transposición u otro método de recombinación) en los productos de amplificación resultantes, por ello sintetiza una colección de variantes para porciones diferentes del monómero. Al ubicar los extremos 5' de los cebadores medios en una secuencia "media" o "traslape" que ambos de los fragmentos PCR tienen en común, las bibliotecas del lado "izquierdo" y lado "derecho" resultante pueden combinarse por PCR de traslape para generar variantes novedosas del grupo original de monómeros. Estas nuevas variantes luego pueden seleccionarse para propiedades deseadas, por ej emplo, inmunoadsorcion contra un objetivo o selección para un efecto funcional. Los cebadores "medios" pueden seleccionarse para corresponder a cualquier segmento del monómero, y típicamente se basarán en el andamiaje o uno o más aminoácidos de consenso dentro del monómero (por ejemplo, cisteínas tal como aquellas encontradas en dominios A) .

De manera similar, los . multímeros pueden crearse al introducir variación en el nivel de monómero y luego recombinar las bibliotecas de variante de monómero. En una escala mayor, los multímeros (sencillos o gurpos) con propiedades deseadas pueden recombinarse para formar multímeros más largos. En algunos casos la variación se introduce (típicamente de forma sintética) en los monómeros o en las ligaduras para formar bibliotecas. Esto puede lograrse, por ejemplo, con dos multímeros diferentes que enlazan a dos objetivos diferentes, por ello eventualmente seleccionan un multímero con . una porción que enlaza a un objetivo y una porción que enlaza un segundo objetivo.

La variación adicional puede introducirse al insertar ligaduras de longitud y composición diferente entre los dominios. Esto se permite para la selección de ligaduras óptimas entre los dominios. En algunas modalidades, la composición y longitud óptima de las ligaduras se permitirá para enlace óptimo de dominios. En algunas modalidades, los dominios con las afinidades de enlace particulares se ligan por medio de ligaduras diferentes y las ligaduras óptimas se seleccionan en un ensayo de enlace. Por ejemplo, los dominios se seleccionan para propiedades de enlace deseadas y luego se forman en una colección que comprende una variedad de ligaduras. La colección luego puede seleccionarse para identificar ligaduras óptimas. Alternativamente, las bibliotecas de multimero pueden formarse donde el efecto de dominio o ligadura en el enlace de molécula objetivo no se conoce .

Los métodos de la descripción actual también incluyen generar uno o más multímeros seleccionados al proporcionar una pluralidad de¦ dominios de monómero. La pluralidad de dominios de monómero se seleccionan para enlace de un ligando deseado o mezcla de ligandos. Los miembros de la pluralidad de dominios que enlazan el ligando deseado o mezcla de ligandos se identifican, por ello proporcionan dominios con una afinidad deseada. Los dominios identificados se unen con al menos una ligadura para generar los multímeros, en donde cada multimero comprende al menos dos de los dominios seleccionados y al menos una ligadura; y, los multimeros se seleccionan para una afinidad o avidez mejorada o especificidad alterada para el ligando deseado o mezcla de ligandos como se compara con los dominios seleccionados, por ello identifica uno o más multimeros seleccionados.

Las bibliotecas de multimero pueden generarse, en algunas modalidades, al · combinar dos o más bibliotecas o monómeros o multimeros en un enfoque basado en recombinasa, donde cada miembro de colección comprende como sitio de recombinación (por ejemplo, un sitio lox) . Un grujpo más grande de miembros de colección molecularmente diversos en principio esconden más variantes con propiedades deseadas, tal como afinidades de enlace objetivo superiores y actividades funcionales. Cuando las bibliotecas se construyen en vectores de fago, que pueden transformarse en E. colí, tamaño de colección (típicamente 109 - 1010 miembros) se limita por la eficiencia de transformación de E. colí. Un sistema del sitio de recombinasa/recombinación (por ejemplo, el sistema Cre-IoxP) y recombinación in vivo puede explotarse para generar bibliotecas que no se limitan en tamaño por la eficiencia de transformación de E. coli.

Por ejemplo, el sistema Cre-loxP puede usarse para generar bibliotecas de dimero con 1010, 1011, 1012, 1013 miembros, o aún mayor diversidad. En algunas modalidades, se usan E. coli como un hospedero para una biblioteca de monómeros nativo y un fago filamentoso que porta una segunda biblioteca de monómeros nativa. El tamaño de colección en este caso se limita sólo por el número de fago infectivo (que porta una colección) y el número de células E. coli infectibles (que portan la otra colección) . Por ejemplo, 1012 células E. coli infectadas (1L¦ en OD600=1) con >1012 fago puede producir tanto como 1012 combinaciones de dimero.

La selección de multimeros puede realizarse usando una variedad de técnicas incluyendo aquellas mencionadas arriba para identificar dominios de monómero. Otros métodos de selección incluyen, por ejemplo, una selección basada en una afinidad o avidez mejorada o especificidad alterada para el ligando comparada con dominios de monómero seleccionados. Por ejemplo, una selección puede basarse en enlace selectivo para tipos celulares específicos, o para un conjunto de células relacionadas o tipos de proteína (por ejemplo, serotipos de virus diferentes) . La optimización de la propiedad seleccionada para, por ejemplo, avidez de un ligando, luego puede lograrse al recombinar los dominios, así como manipular la secuencia de aminoácido de los dominios de monómero individuales o el dominio de ligadura o la secuencia de nucleótido que codifica tales dominios, como se menciona en la descripción actual.

Un método para identificar multimeros puede realizarse al exhibir los multimeros. Como con los dominios de monómero, los multimeros opcionalmente se expresan o muestran en una variedad de sistema de despliegue, por ejemplo, despliegue de fagos, despliegue de ribosoma, despliegue de polisoma, despliegue ligada a nucleótido (ver, por ejemplo, Patente de E.U.A. Nos. 6,281,344; 6,194,550, 6,207,446, 6,214,553, y 6,258,558) y/o despliegue de superficie celular, como se describe arriba. . Los . despliegues de superficie celular pueden incluir pero no se limitan a E. coli, levadura o células mamiferas. Además, las bibliotecas de despliegue de multimeros con sitios de enlace múltiples pueden separarse en sus pares de bases para avidez o afinidad o especificidad alterada para un ligando ó para ligandos múltiples.

Los monómero.s o multimeros pueden cribarse para actividad de enlace objetivo en células de levadura usando un ensayo de selección de dos híbridos. En este tipo de separación la biblioteca de monómeros o multímero a seleccionarse se clona en un vector que dirige la formación de una proteína de fusión entre cada monómero o multímero de la colección y un fragmento activador transcripcional de levadura (esto es, Gal4). Las secuencias que codifican la proteína "objetivo" se clonan en un vector que resulta en la producción de una proteína de fusión entre el objetivo y el resto de la proteina Gal4 (el dominio de enlace de ADN) . Un tercer plásmido contiene un gen reportero correinte debajo de la secuencia de ADN del sitio de enlace Gal4. Un monómero que puede enlazar a la proteina objetivo se pontea con el dominio de activación Gal4, de esta manera reconstituye una proteina Gal4 funcional. Esta proteina Gal4 funcional enlaza al sitio de enlace cadena arriba del gen reportero que resulta en la expresión del gen reportero y selección del monómero o multimero como una proteina de enlace objetivo. (ver Chien et.al. (1991) Proc. Nati. Acad. Sci. (EUA) 88:9578; Fields S. and Song O. (1989) Nature 340: 245). Usando un sistema de dos híbridos para selección de colección se describe además en la Patente de E.U.A. No. 5,811,238 (ver también Silver S.C.' and Hunt S-.W. (1993) Mol. Biol. Rep. 17:155; Durfee et al. (1993) Genes Devel. 7:555; Yang et al. (1992) Science 257:680; Luban et al. (1993) Cell 73:1067; Hardy et al. (1992) Genes Devel. 6:801; Bartel et al. (1993) Biotechniques 14:920; y Vojtek et al. (1993) Cell 74:205). Otro sistema de selección útil es el sistema de selección interactivo E.coli/BCCP (Germino et al. (1993) Proc. Nat. Acad. Sci. (E.U.A.) 90:993; Guarente L. (1993) Proc. Nat. Acad. Sci. (E.U.A.) 90:1639).

Otras variaciones incluyen el uso de compuestos de enlace múltiples, de manera que los dominios de monómero, multimeros o bibliotecas de estas moléculas pueden seleccionarse simultáneamente por una multiplicidad de lígandos o compuestos' que tienen especificidad de enlace diferente. Los compuestos o ligandos predeterminados múltiples pueden seleccionarse concomitantemente en una colección sencilla, ' o selección secuencial contra un número de dominios de monómero o multimeros. En una variación, los ligandos o compuestos múltiples, cada uno codificado en una perla separada (o subconjunto de perlas), puede mezclarse e incubarse con dominios de monómero, multimeros o bibliotecas de estas moléculas bajo condiciones de enlace adecuadas. La colección de perlas, que comprende ligandos o comuestos múltiples, luego puede usarse para aislar, por selección de afinidad, dominios de monómero seleccionados, multimeros seleccionados o miembros de colección. Generalmente, las rondas de selección' de afinidad posterior pueden incluir la misma mezcla de perlas, subconjuntos de los mismos, o perlas que contienen sólo uno o. dos ligandos o compuestos individuales. Este enfoque proporciona selección eficiente, y es compatible con automatización de laboratorio, procesamiento de lote, · y métodos de selección de alto desempeño.

En otra modalidad, los multimeros pueden seleccionarse simultáneamente por la capacidad de enlazar ligandos múltiples, en donde cada ligando comprende una etiqueta diferente. Por ejemplo, cada ligando puede etiquetarse con una etiqueta fluorescente diferente, puesto en contacto simultáneamente con una biblioteca de multimero o multimero. Los multimeros con la afinidad deseada luego se identifican (por ejemplo, por clasificación FACS) basados en la presencia de las etiquetas ligadas a las etiquetas deseadas.

Las bibliotecas de cualquiera de los dominios de monómero o multimeros (referidos en la siguiente discusión para conveniencia como "agentes de afinidad") pueden seleccionarse (esto es, inmunoadsorbidos ) simultáneamente contra ligandos múltiples en un número de formatos diferentes. Por ejemplo, ligandos múltiples pueden seleccionarse en una mezcla sencilla, en una configuración, exhibidos en una célula o tejido (por ejemplo, una célula o tejido proporciona moléculas numerosas que pueden enlazarse por los dominios de monómero o multimeros descritos en la presente), y/o inmovilizados. Las bibliotecas de agentes de afinidad pueden opcionalmente exhibirse en sistema de despliegue de levadura o fagos. De forma similar, si se desea, los ligandos (por ejemplo, codificados en una colección cADN) pueden exhibirse en un sistema de despliegue de levadura o fagos.

Inicialmente, la biblioteca del agente de afinidad se separa en sus pares de bases contra los ligandos múltiples. Opcionalmente, los "aciertos" resultantes se inmunoadsorben contra los . ligandos una o más veces para enriquecer la población resultante de los agentes de afinidad.

Si se desea, puede determinarse la identidad de los agentes y/o ligandos de afinidad individual. En algunas modalidades, los agentes de afinidad se muestran en fago. Los agentes de afinidad identificados como enlace en la selección inicial se dividen en una primera y segunda porción. La primera porción se infecta en bacterias, resultando en sus placas o colonias bacterianas, dependiendo del tipo de fago usado. El fago expresado se inmoviliza y luego se coloca en sonda con ligandos exhibidos en fago seleccionados como se describe a continuación.

La segunda porción se acopla a perlas o de otra manera inmovilizada y una biblioteca de . despliegue de fagos que contienen al menos algunos de los ligandos en la mezcla original se pone en contacto con la segunda porción inmovilizada. El fago que enlaza a la segunda porción se eluye y pone en contacto posteriormente al fago inmovilizado descrito en el párrafo de arriba. Se detectan las interacciones de fago-fago (por ejemplo, usando un anticuerpo monoclonal específico para el fago que expresa ligando) y los polinucleotidos de fago resultantes pueden aislarse.

En algunas modalidades, la identidad de un par de ligando de agente de afinidad se determina. Por ejemplo, cuando tanto el agente- de afinidad como el ligando se muestran en un fago o levadura, el ADN del par puede aislarse y procesarse por secuencia. En algunas modalidades, se amplifican los polinucleótidos específicos para el ligando y agente de afinidad. Los cebadores de amplificación para cada reacción pueden incluir secuencias 5' que son complementarias de manera que los productos de amplificación resultantes se fusionan, por ello forman un polinucleótido híbrido que comprende un polinucleótido que codifica al menos una porción del agente de afinidad y al menos una porción del ligando. El híbrido resultante puede usarse para colocar en sonda las bibliotecas de polinucleótido de ligando o agente de afinidad (por ejemplo, que codifica el cADN) para identificar tanto agente como ligando de afinidad.

Los métodos descritos arriba pueden combinarse fácilmente con "encaminado" para generar simultáneamente e identificar multímeros múltiples, cada uno de los cuales enlaza a un ligando en una mezcla de ligandos. En estas modalidades, una primera biblioteca de agentes de afinidad (dominios de monómero o multímeros) se inmunoadsorben contra ligando.s múltiples y los agentes de afinidad eluidos se ligan a la primera o una segunda biblioteca de agentes de afinidad para formar una biblioteca de agentes de afinidad multiméricos (por ejemplo, que comprende 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, o más monómeros), que se inmunoadsorben posteriormente contra los ligandos múltiples. Este método puede repetirse para continuar generando agentes de afinidad multiméricos más grandes. Incrementar el número de dominios de monómero puede resultar en afinidad y avidez incrementada para un objetivo particular. Por supuesto, en cada etapa, la inmunoadsorción se repite opcionalmente para enriquecer los aglutinantes importantes. En algunos casos, el encaminado se facilitará al insertar sitios de recombinación (por ejemplo, sitios lox) en los extremos de monómeros y bibliotecas de monómero recombinadas por un evento mediado por recombinasa.

Los multimeros seleccionados de los métodos de arriba pueden manipularse además, por ejemplo, al recombinar o reestructurar los multimeros seleccionados (la recombinación puede ocurrir entre o' dentro de los multimeros o ambos), mutando los multimeros seleccionados, y similares. Esto resulta en multimeros alterados que luego pueden elegirse y seleccionarse por ' miembros que tienen una propiedad potenciada comparada con el multimero seleccionado, por ello producen multimeros alterados seleccionados. En vista de la descripción en la presente, es claro que el siguiente proceso puede seguirse. Los dominios de monómero recombinantes o no recombinantes pueden ser recombinados o pueden formarse variantes. Opcionalmente los dominios inicialmente o después se seleccionan para aquellas ' secuencias que son menos probables para ser inmunogénicas en el hospedero para el cual se pretenden. Opcionalmente, una biblioteca de fago que comprende los dominios recombinados se inmunoadsorbe para una afinidad deseada. Los dominios de monómero o multímeros expresados por el fago, pueden seleccionarse por IC50 para un objetivo. Los multímeros hetero u homoméricos pueden seleccionarse. Los polipéptidos seleccionados pueden seleccionarse por su afinidad a cualquier objetivo, incluyendo, por ejemplo, objetivos hetero u homomultiméricos .

Las ligaduras, multímeros o multímeros seleccionados producidos por los métodos descritos en la presente forman aspectos de la descripción actual. Las bibliotecas que comprende multímeros, por ejemplo, una biblioteca que comprende alrededor de 100, 250, 500 o más miembros, se proporcionan producidas como se describen en la presente o seleccionan por los. métodos descritos en la presente. En algunas modalidades, uno o más miembros que comprenden célula de las bibliotecas, también se incluyen. Las bibliotecas de los polipéptidos recombinantes también son una característica de la descripción actual, por ejemplo, una biblioteca que comprende alrededor de 50, 100, 250, 500 o más polipéptidos recombinantes diferentes.

Las composiciones que comprenden los polipéptidos descritos en la presente pueden enlazarse a una matriz de un material de afinidad, por ejemplo, los polipéptidos recombinantes. Los ejemplos de material de afinidad incluyen, por ejemplo, perlas, una columna, un soporte sólido, y/o similares.

IX. MÉTODOS DE TRATAMIENTO TERAPÉUTICO Y PROFILÁCTICO En otros aspectos, la descripción actual . también proporciona métodos para tratar terapéuticamente o profilácticamente una enfermedad o trastorno al administrar in vivo o ex vivo uno o más ácidos nucleicos o proteínas de enlace descritas en la presente (o composiciones que comprenden un excipiente farmacéuticamente aceptable y uno o más ácidos nucleicos o polipéptidos) a un sujeto, incluyendo, por ejemplo, un mamífero, incluyendo un humano, primate, ratón, cerdo, vaca, cabra, conejo, rata, conejillo de indias, hámster, caballo, oveja; o un vertebrado no mamífero tal como un pájaro (por ejemplo, un pollo o pato), pez, o invertebrado.

Las proteínas de enlace que enlazan FGFRlc, ß-Klotho o tanto FGFRlc como ß-Klotho, particularmente aquellas que activan señalización mediada por- FGF21, incluyendo proteínas de enlace que comprenden dominios de monómero o multimeros de enlace a FGFRlc y/o ß-Klotho, pueden emplearse para tratar un número de enfermedades humanas. ¦ Los dominios de enlace ejemplares incluyen' las secuencias especificas descritas en la presente, incluyendo, pero no limitado a: Porción de la Familia 1: C [AGLQRV] [ALPST] [DGINRS] [ELQ] F [ PQT] C [GHKNQRS] [DGNS] [GST] [EGKN RS] [IRST-]C[ILV] [PS] [LPQRV] [AHKPQRT] [LRV] CDG[DEV] [ DNP] DC [ EGR] D [ DGNS ] S DE [AEKS ] [DGNPS] [AD-] [ÍH-]C; (SEQ ID NO: 74) (Al sin tratar) Porción de la Familia 2: CG[AE] [GS ] LFTC [GR] [NRS] [AST] [ KN ] ICIS [ EHQS ] [AV] W [ IV] CDG [ IV] DDC [ DE ] DNSDE [ DK NT ] [NSY]C; (SEQ ID NO: 108) (mutantesM03/M15 ) Porción de la Familia 3: CG[APST] [DN] [L Q] FTC [QR] [ RS] T [ IM] CIS [ DKPQR] [ATV] WVCDGVDDC [ DE ] D [ DENY] SDE [ IQRT ] [AGTV]C (SEQ ID NO: 119) (mutantes M23) Porción de la Familia 4: C [LAPRVKQGHS ] [APSHR] [- T] [DNGSHAF] [EHQ] F [HPQTRW] C [GSQRNLHK] [SND] [GSTNY] [RHQGHNSE] [RI T-]C[ILV] [HNPS] [AGHLSQPREV] [TPGSRAHN- ] [WL] [ILRV]CD[GMW] [GYDVEL] [ PWLDN] DC [GERQLK] D [GNDSKWHY] [PQS ]D [EPQY] [APS-] [LPQS-] [AEHKLTV] [HILSTDNGMVW] C; (SEQ ID NO: 130) (ß-Klotho Al sin tratar) Porción de la Familia 5: C[HNP-] [AP-] [HIKLMPRV- ] [AEILY] [ADEGQRY] [ADÉHIKLNPQS ] [ DHLMSY] C [AEKPQ ] [AEHKNQRS] [FLR Y] [ DFVY ] GDG [ DEGIKNRSV] C [ DEGHNQRS ] [EKPQS] [ADEGHPQ] C [DGNS] [FLNS T] [AEPSY] [AEGKRT ] C [ADG1LNSV] DG [ DFGLMV] [DN]C (SEQ ID NO:1242) (ß-Klotho nativo LNR/Notch) Porción de la Familia 6: C[LMP] [PST] [DH]EF[QR]C[GR]SG[RW]CIP[LQR] [AKRST ] W [GV] CDGLNDCGD GSGE [ S ] PA [HLQ] C; (SEQ ID NO: 185) Mutagénesis de ß-Klotho M01 Porción de la Familia 7: C[LR ] [PST] [GS] [AEHQS] F[HQ]C[NS] [NT] GHCLS [APQRS] [ ST ] VCDG [ FY] [DEVY] DC [ DEG] D [GW] SDE [ASV] [KN]C; (SEQ ID NO: 194) Mutagénesis de ß-Klotho M25 Porción de la Familia 8: C[EQ] [PS] [DE] EF [MRT] C [RS] SGRCIP [QV] [HIST] LCDGLNDCGDGSDE [ PR] P [AE] [HQ]C; (SEQ ID NO: 207) Mutagénesis de ß-Klotho 42 Porción de la Familia 9: C[HNP] [STW]F[HN] [HKQ] F [EK] CRN [GR] QCIPL [HY] LVCDGVPDC [AG] D [ DN] S DET [ADY] C; (SEQ ID NO: 212) Mutagénesis de ß-Klotho M50 Porción de la Familia 10: C [ELPQR] [APS] [DGIN] [EGQ] [FQ] [FKPQRT] [- E]C[GNRS] [NS] G [HNQR]C[IV] P [AELPQRV] [AHPQRT ] W [LRV] CDG [ DEV] [DNP ] DC [GLQ] D [DGNS] SDE [AEKT] [DGLNS] [-A] [-H]C; (SEQ ID NO: 217) Recorrido del C-terminal de ß-Klotho M01 (SEQ ID NO: 493) Porción de la Familia 11: C [AGLP] PD [EQ] F [KR] C [GKNRS] SG [NQRS] C [IL] P [ELQ] [DHNT] W [LRV] CDG [ DLV] [DN] DC [EGV] D [GS] SDE [AET] [DGNP] [-D] [-L]C; (SEQ ID NO: 232) Terminal encaminada de ß-Klotho M01 (SEQ ID NO: 493) Porción de la Familia 12: CA[PS] [DNS] [EQ] F[QR]C[GH] [DN] [GNT] [GHN] [- IT]C[IL] [LPS] [ER] [AGT] [WL] LCDG [ DEV] [DN] DC [AEG] DGSDE [AE] [DG]C; (SEQ ID NO: 240) Recorrido del N-terminal de ß-Klotho M06 (SEQ ID NO: 499) Porción de la Familia 13: C[AP]P[DG] [EQ] F[RT]C[KNR] [NS] G [QR] C [ IV] P [LQ] [AHP] W [LV] CDG [ DE] [DN] DC [GQ] DNSDE [EST] [DNP] [-A] [-T] C; (SEQ ID NO: 245) Recorrido del C-terminal de ß-Klotho M06 (SEQ ID NO: 499) Porción de la Familia 14: C[AGPR] [AP] [DGNS] [EQ] F [QRT] C [GSK] N [GT] [GHR] [- R]C[ILV] [PS].[ALQ] [NST] W [LRV] CDG [DEV] DDC [GL] DGSDE [AET] [DNS] [-A][-T]C; (SEQ ID NO: 249) Recorrido del N-terminal de ß-Klotho M08 (SEQ ID NO: 694) Porción de la Familia 15: C[AGP] [APS] [DGN] [EQ] F [QRT] C [GNRS] [GNS] [GT] [GKQS] [-IK]C[ILV] P[LQRV] [AEHP] W [LRV] CDG [DLV] [ DN ] DCGD [GN ] SDE [AEKPS ] [GL PS] [-AEV] [-IT]C; (SEQ ID NO: 254) Recorrido del N-terminal de ß-Klotho M21 (SEQ ID NO: 481) Porción de la Familia 16: CQSNEFRCRSGRCIPQHWLCDGLNDCGDGSDE [PS] [PQ] [AQ] [-H]C; (SEQ ID NO: 394) Recorrido del C-terminal de ß-Klotho M21 (SEQ ID NO: 481) Porción de la Familia 17:.

C[APQR] [ASP] [DG] [ EQ] F [ PQ] C [EKNR] [NS] [GT] [GHN] [- R]C[ILV] [PS] [ALPR] [ANRT] W [LRV] CDG [EV] [DN] DC [AGR] D [GNS ] SDE [AEK S] [GLNS] [-A] [-H]C; (SEQ ID NO: 265) Recorrido del N-terminal de ß-Klotho M42 (SEQ ID NO: 305) Porción de la Familia 18: CRP [ DG] EF [QR] C [GKR] [NS] G [HR] C [ IV] P [GLQ] [ PT ] W [RV] CDG [ DE ] [DP]DC QD [GS] SDE [AET] [DGN] C; (SEQ ID NO: 270) Recorrido del C-terminal de ß-Klotho M42 (SEQ ID NO: 305) Porción de la Familia 19: C [AGLR] [APS] [DGN] [ EQ] F [ RQT ] C [GHKNRS ] [NS] [GSTY] [DEGNR] [-RT]C[ILV] P[AGLPRV] [AHNPT] W [LRV] CDG [DEV] [DN] DC [AEGRV] D [ DGN] SDE [AEST] [ADGNS] [-D]C; (SEQ ID NO: 274) Recorrido del N-terminal de ß-Klotho M50 (SEQ ID NO: 306) Porción de la Familia 20: C[LQ] [PS] G [EQ] FRC[KQ] [NT] [GT]R[- T]C[IL]P[LR] [AK] [LW] [LV] CDGVDDC [EL] DDSDE [AK] DC; (SEQ ID NO: 284) Recorrido del C-terminal de ß-Klotho M50 (SEQ ID NO: 306) Las enfermedades humanas ejemplares para las cuales la activación de la señalización mediada por FGF21 es mejorador incluyen, por ejemplo, diabetes, obesidad, dislipidemia, hipertensión, hepatosteaotosis, esteatohepatitis no alcohólica (NASH) , pancreatitis aguda, síndrome metabólico, enfermedad cardiovascular, tal como ateroesclerosis, y enve ecimiento.

En algunos aspectos, un monómero o multímero descrito en la presente se administra a un sujeto con al menos otra molécula usada para tratamiento de una de las enfermedades enlistadas arriba. La otra molécula puede prepararse en una formulación con el monómero o multímero o puede administrarse simultáneamente o antes o después de que el monómero o multímero se administra.

En otro aspecto, la descripción actual proporciona un método para tratar un sujeto por diabetes con un monómero o multímero terapéutico de la descripción actual, tal como los monómeros y multímeros descritos en la presente, junto con uno o más de otros tratamientos. En una modalidad, tal terapia de combinación alcanza un efecto sinérgico. Los monómeros o multímeros pueden administrarse en combinación con uno o más de los tratamientos de diabetes tipo 2 actualmente disponibles. Estos tratamientos incluyen biguanida (metaformina)., y sulfonilureas (tal como gliburido, glipizida) . Los tratamientos adicionales dirigidos para mantener homeostasis de glucosa incluyendo antagonistas PPAR gamma (pioglitazona, rosiglitazona ) ; e inhibidores de alfa glucosidasa (acarbosa, ' voglibosa) . Los tratamientos adicionales incluyen tratamientos inyectables tal como Exenatide® (péptido tipo glucagón) , y Symlin® (pramlintida) .

En algunas modalidades, una proteina de enlace que comprende un monómero o multimero descrito en la presente que enlaza FGFRlc, ß-Klotho o tanto FGFRlc como ß-Klotho se usa para disminuir los . niveles de glucosa en la sangre y/o niveles de triglicéridos en la sangre y/o niveles de lipido en la sangre y/o niveles de insulina en la sangre en un sujeto. El sujeto puede ser uno quien tiene una historia genética (que se presénta naturalmente o inducida) de diabetes u obesidad, o de otra manera está en riesgo de los efectos nocivos para la salud de niveles altos de glucosa, niveles altos de triglicéridos o niveles altos de lipidos. FGF21 es un mediador de los niveles de lipido y glucosa en la sangre. Esto se evidencia por el hecho de que la administración de FGF21 en ratones reduce glicemia (Berglund et al 2009 Endocrinology 150: 4084-93), invierte la esteatosis hepática, incrementa el gasto de energía, y mejora la sensibilidad de insulina (Xu et al 2009 Diabetes 58: 250-9) y corrige la obesidad (Coskun et al 2008 Endocrinology 149: 6018-27). En monos Rhesus diabéticos la administración de FGF21 crónica se ha mostrado para reducir la glucosa en plasma de ayunas, fructosamina, triglicéridos, insulina, y glucagon sin provocoár hipoglicemia . Adicionalmente las mejoras en los perfiles de lipido de suero además se observó una reducción pequeña pero importante en peso (Kharitonenkov et al., (2007) Endocrinology 148: 774-81).

En algunas modalidades, una proteina de enlace que comprende un monómero o multimero descrito en la presente que enlaza FGFRlc , ß-Klotho o tanto FGFRlc como ß-Klotho se usa para reducir daño inflamatorio en pancreatitis aguda. Esto se evidencia por la enfermedad severa que sigue la inducción experimental de pancreatitis con ceruleina en ratones con genes inactivados FGF21. Los ratones transgénicos constitutivamente expresan FGF21 humano de un promotor especifico del hígado que muestra inflamación disminuida en el páncreas después de administración de ceruleina (Johnson et al., (2009) Gasteroenterology 137 ( 5 ): 1795-1804 ) .

En algunas modalidades, una proteína de enlace que comprende un monómero o multimero descrito en la presente que enlaza FGFRlc, ß-Klotho o tanto FGFRlc como ß-Klotho se administra en combinación con un fármaco que reduce los niveles de glucosa en la- sangre y/o lípidos en la sangre. Las estatinas, resinas ( colestiramina , colestipol, colesevalam) y ácido nicotínico son ejemplos de fármacos que reducen los niveles de lipido. Las estatinas ejemplares incluyen, pero no se Limitan a, atorvastatina, fluvastatina, lovastatina, pravastatina, rosuvastatina, y simvastatina . Los ejemplos de compuestos . que disminuyen los. niveles de glucosa en la sangre incluyen insulina y rosiglitizona .

En un aspecto de la descripción, en métodos ex vivo, una o más células o una población de células de interés de un sujeto (por ejemplo, células de tumor, muestra de tejido de tumor, células de órgano, células de sangre, células de la piel, pulmón, corazón, músculo, cerebro, mucosa, hígado, intestino, bazo, estómago, ¦ sistema linfático, cuello del útero, vagina, próstata, boca, lengua, etc.) se obtienen o remueven del sujeto y ponen en contacto con una cantidad de una proteína de enlace seleccionada proporcionada en la presente que es efectiva al tratar profilácticamente o terapéuticamente la enfermedad, trastorno, u otra afección. Las células puestas en contacto luego se regresan o suministran al sujeto al sitio del cual se obtuvieron o a otro sitio (por ejemplo, incluyendo aquellas definidas arriba) de interés en el sujeto a tratarse. Si se desea, las células puestas en contacto pueden injertarse en un tejido, órgano, o sitio del' sistema (incluyendo todos los descritos arriba) de interés en el sujeto usando técnicas de injerto estándares y bien conocidas o, por ejemplo, suministradas a la sangre o sistema linfático usando técnicas de transfusión o suministro estándares.

También se proporcionan métodos in vivo en los cuales una o más células o una población de células de interés del sujeto se ponen en contacto directamente o indirectamente con una cantidad de una proteina de enlace seleccionada descrita en la presente efectiva al tratar profilácticamente o teerapeuticamente la enfermedad, trastorno, u otra afección. En formatos de contacto directo/administración, la proteina de enlace selecciona típicamente se administra o transfiere directamente a las células a tratarse o al sitio de tejido de interés (por ejemplo, células de tumor, muestra de tejido de tumor, células del órgano, células sanguíneas, células de la piel, pulmón, corazón, músculo, cerebro, mucosa, hígado, intestino, bazo, estómago, sistema linfático, cuello del útero, vagina, próstata, boca, lengua, etc.) por cualquiera de una variedad de formatos, incluyendo administración tópica, inyección (por ejemplo, al usar una aguja o jeringa), o vacuna o suministro' por pistola de gen, enpujando en un tejido, órgano, o sitio de la piel. La proteína de enlace seleccionada puede suministrarse, por ejemplo, intramuscularmente , ' intradérmicamente, subdérmicamente , subcutáneamente, oralmente, intraperitonealmente, intratecalmente , intravenosamente, o colocada dentro de una cavidad del cuerpo (incluyendo,. por ejemplo, durante cirugía), o por inhalación o administración vaginal o rectal.

El suministro ejemplar incluye, por ejemplo, suministro oral (bucal o absorción/suministró intestinal), inyección interior (por ejemplo, formulada en alrededor de un volumen de 1.4 mi o menos) , absorción/suministro transdérmico, bomba subcutáneamente implantable, absorción/suministro pulmonar (sistémico o no sistémico) , absorción/suministro de sangre-cerebro-barrera, y/o absorción/suministro nasal.

Los enfoques de diseño para suministro oral incluyen, por ejemplo, incluido en la proteina de enlace a afinidad de enlace para transportadores de péptido mucosales tal como PepTl, PepT2, HPT1, familia ABC; adición de un dominio de transubicacion (PE38 o PE40 de Pseudomonas exotoxina A) a la proteina de enlace; o incluyendo, una afinidad de enlace para transportadores de barrera de la sangre-cerebro tal como receptor de Transíerrina .

Los cuatros mecanismos primarios para suministro transepitelial son: (1) Transcelular : a través de la célula por difusión: en su mayoría por moléculas pequeñas. (2) Paracelular: alrededor de las células a través de uniones desmosomas/estrechas : en su mayoría usadas por péptidos hidrofílicas (3) Transcitosis : a través de las células dentro de las vesículas por pinocitosis (4) Mediado por portador o Transportador, para moléculas que enlazan al transportador/portador.

En otro enfoque, la proteína de enlace se diseña para enlazar a los receptores en la superficie celular o dentro de las vesículas que se transportan activamente a través de la célula al suero, portanto el fármaco solo. Tales receptores se llaman Transportadores. Tal receptor es el receptor Fe de inmunoglobulina neonatal. (FcRn) que puede usarse para suministro pulmonar e intestinal al suero. Otro receptor es el receptor de Tránsferrina, que puede transportarse a través de la barrera de sangre-cerebro en el fluido cerebroespinal. Alternativamente, el monómero o multímero se diseña para enlazar al receptor' Fe neonatal para transporte pulmonar e intestinal. Este método puede comprender preparar por ingeniería el producto del fármaco final para liberación sensitiva de pH.

Considerando la descripción actual, un intervalo de estrategias es posible. Las proteínas de enlace que enlazan transportadores conocidos (por ejemplo, PepTl, HPT-1, PepT2, la familia ABC, TAPl, TAP2, MDR) pueden identificarse. Otros aglutinantes útiles pueden identificarse al identificar monómeros o multímeros que enlazan a células Caco2 (por ejemplo, usando un' ensayo de bloque de absorción usando absorción 14C-Cefalexina por células Caco2) . Ver, por ejemplo, Blanchette, J., et al. Biomedicine and Pharmacotherapy 58:142-151 (2004); Low, S.C., et al. Human Reproduction - acceso de avance 7 de abril de 2005; Lee, V. J. Nati Cáncer Institute, Monographs 29 (2001); Rubas, W., et al. J. Pharm. Sci. 85:165-169 (1996); Yang, C.Y., et al. Pharmaceutical Research 16:1331-1343 (1999); Dietrich, C.G., et al. Gut 52:1788-1799 (2003); Cleland, J.L., et al. Current Opinión in Biotechnology 12:212-219 (2001); Nielsen, CU. y Brodin, B. Current Drug Targets 4:373-388 (2004); Kunta, J.R., et al. Current Drug Metabolism 5:109-124 (2004).

En otro enfoque, una biblioteca de fagos de multimeros puede aplicarse a la cavidad oral de un mamífero y fago o ADN del fago puede recuperarse en el suero del animal para enriquecer las secuencias que son agentes bien suministrados. Los dominios o péptidos nautrales que se conocen para transportarse oralmente también pueden fusionarse a monómeros o multimeros descritos en' la presente. Aún en otra alternativa, los dominios que muestran fago se seleccionan para resistencia al fluido corporal apropiado (nasal, intestinal, etc) o para proteasas purificadas.

En formatos de contacto/administración indirecta in vivo, la proteína de enlace seleccionada típicamente se administra o transfiere indirectamente a las células a tratarse o al sitio de tejido de interés, incluyendo aquellos descritos arriba (tales como, por ejemplo, células de la piel, sistemas del órgano, sistema linfático, o sistema de glóbulos rojos, etc) , al ' poner en contacto o administrar el polipéptido directamente a una o más células o población de células de las cuales el tratamiento puede facilitarse. Por ejemplo, células de tumor dentro del cuerpo del sujeto puede tratarse al poner en contacto células de la sangre o sistema linfático, piel, o un órgano con una cantidad suficiente de la proteina de enlace seleccionada de manera que el suministro de la proteina de enlace seleccionada al sitio de interés (por ejemplo, tejido, órgano, o células de interés o sangre o sistema linfático dentro del cuerpo) ocurre y resulta en tratamiento terapéutico o profiláctico efectivo. Tal contacto, administración, o transferencia típicamente se hace al usar una o más de las vías o modos de administración descritos arriba.

En otro aspecto, la descripción actual proporciona métodos ex vivo en los cuales una o más células de interés o una población de células de interés del sujeto (por ejemplo, células de tumor, muestra de tejido del tumor, células del órgano, células sanguíneas, células de la piel, pulmón, corazón, músculo, cerebro, mucosa, hígado, intestino, bazo, estómago, sistema linfático, cuello del útero, vagina, próstata, boca, lengua, etc.) se obtienen o remueven del sujeto y transforman al poner en contacto una o más células o población de células con un constructo de polinucleótido que comprende una secuencia de ácido nucleico descrita en la presente que codifica una proteina de enlace biológicamente activa de interés (por ejemplo, un dominio de monómero y/o multimero seleccionado) que es efectivo al tratar profilácticamente o terapéuticamente la enfermedad, trastorno, u otra afección. Una o más células o población de células se pone en contacto con una cantidad suficiente del constructo de polinucleótido y un promotor que controla la expresión de la secuencia de ácido nucleico de manera que la reabsorción del constructo de polinucleótido (y promotor) en las células ocurre y resulta expresión suficente de la secuencia de ácido nucleico objetivo para producir una cantidad del polipéptido biológicamente activo, que codifica una proteina de ¦ enlace suficiente, efectiva para tratar profilácticamente o terapéuticamente la enfermedad, trastorno, o afección. El constructo de polinucleótido puede comprender una secuencia del promotor (por ejemplo, secuencia del promotor CMV) que controla la expresión de la secuencia de ácido nucleico y/o, si se desea, una o más secuencias de nucleótido adicionales qué codifican al menos uno o más de otro polipéptido descrito en la presente, una citocina, adyuvante, o molécula co-estimuladora, u otro polipéptido de interés.

Después de la transfección, las células transformadas se regresan, suministran, o transfectan al sujeto para el sitio o sistema del tejido del cual se obtienen o a otro sitio (por ejemplo, células de tumor, muestra de tejido de tumor, células del órgano, células sanguíneas, células de la piel, pulmón, corazón, músculo, cerebro, mucosa, hígado, intestino, bazo, estómago, sistema linfático, cuello del útero, vagina, próstata, boca, lengua, etc.) para tratarse en el sujeto. Si se desea, las células pueden injertarse en un tejido, piel, órgano, o sistema corporal de interés en el sujeto usando técnicas de injerto estándares y bien conocidos o suministrados a la sangre o sistema linfático usando suministro estándar o técnicas de transfusión. Tal suministro, administración, o transferencia de células transformadas típicamente se hace al usar una o más de las vias o modos de administración descritos arriba. La expresión del ácido nucleico objetivo ocurre naturalmente o puede inducirse (como se describe en mayor detalle en la presente) y una cantidad del polipéptido codificado se expresa suficiente y efectiva para tratar la enfermedad o afección en el sitio o sistema de tejido.

En otro aspecto, también se proporcionan métodos in vivo en los cuales una o más células de interés o una población de celular del sujeto (por ejemplo, incluyendo aquellas células y sistemas de células y sujetos descritos arriba) se transforman en el cuerpo del sujeto al poner en contacto las células o población de células con (o administrar o transferir a las células o población de células usando una o más de las vías o modos de administración descritos arriba) un constructo de polinucleótido que comprende una secuencia de ácido nucleico de la descripción actual que codifica una proteína de enlace biológicamente activa de interés (por ejemplo, un dominio . de monómero y/o multímero seleccionado) que es efectiva al tratar profilácticamente o terapéuticamente la enfermedad, trastorno, u otra afección.

El constructo de polinucleótido puede administrarse o transferirse directamente a las células que padecen de la enfermedad o trastorno (por ejemplo, por contacto directo usando una o más . de las vías o modos de administración descritos arriba) . Alternativamente, el constructo de polinucleótido puede administrarse o transferirse indirectamente a células que padecen de la enfermedad o trastorno primero al contactar directamente células no enfermas u otras células enfermas usando una o más de las vías o modos de administración descritas arriba con una cantidad suficiente del constructo de polinucleótido que comprende la secuencia de ácido nucleico que codifica la proteina de enlace biológicamente activa, y un promotor que controla la expresión de la secuencia de ácido nucleico, de manera que la absorción del constructo de polinucleótido (y promotor) en las células ocurre y expresión suficiente de la secuencia de ácido nucleico resulta para producir una cantidad de la proteína de enlace biológicamente activa efectia para tratar profilácticamente o terapéuticamente la enfermedad o trastorno, y por ello el constructo de polinucleótido o la proteína de enlace expresada resultante se transfiere naturalmente o. automáticamente del sitio de suministro inicial, sistema, tejido u órgano del cuerpo del sujeto al sitio enfermo, tejido, órgano o . sistema del cuerpo del sujeto (por ejemplo, por medio de la sangre o sistema linfático) . La expresión del ácido nucleico objetivo ocurre naturalmente o puede inducirse (como se describe en mayor detalle a continuación) de manera que una cantidad de proteína de enlace expresada es suficiente y efectiva para tratar la enfermedad o afección en el sitio o sistema de tejido. El constructo de polinucleótido puede comprender una secuencia promotora (por ejemplo, secuencia promotora CMV) que controla la expresión de la secuencia de ácido nucleico y/o, si se desea, uno o más secuencias de nucleótido adicionales que codifica al menos uno o más de otra proteína de enlace descrita en la presente, una citocina, adyuvante, o molécula co-estimuladora, u otra proteina de enlace de interés.

En cada uno de los métodos de tratamiento in vivo y ex vivo como se describe en la presente, una composición que comprende un excipiente y la proteina de enlace o ácido nucleico de la descripción actual puede administrarse o suministrarse. En otro aspecto, una composición que comprende un excipiente farmacéuticamente aceptable y una proteina de enlace o ácido nucleico descrito en la presente se administra o suministra al sujeto como se describe arriba en una cantidad efectiva para tratar la enfermedad o trastorno.

En otro aspecto, en cada método de tratamiento in vivo y ex vivo descrito arriba, la cantidad de polinucleótido administrada a las células o sujeto puede ser una cantidad de manera que la absorción del polinucleótido en una o más células del sujeto ocurre y expresión suficiente de la secuencia de ácido nucleico resulta para producir una cantidad de una proteina de enlace biológicamente activa efectiva para potenciar una respuesta inmunitaria en el sujeto, incluyendo una respuesta inmunitaria inducida por un inmunógeno (por ejemplo, un antigeno) . En otro aspecto, para cada método, la cantidad de proteina de enlace administrada a las células o sujeto puede ser una cantidad suficiente para potenciar una respuesta inmunitaria en el sujeto, incluyendo que' induce por un inmunóqeno (por ejemplo, un antigeno) .

Aún en otro aspecto, en un método in vivo o tratamiento in vivo en el cual un constructo de polinucleótido (o composición que comprende un constructo de polinucleótido) se usa para suministrar una proteína de enlace fisiológicamente activa a un sujeto, la expresión del constructo de polinucleótido puede inducirse al usar un sistema de expresión encendido y apagado inducible. Los ejemplos de tales sistemas de expresión del gen encendido y apagado incluyen el Sistema de Expresión del Gen Tet-On™ y Sistema de Expresión Gen Tet-Off™ {ver, por ejemplo, Clontech Catálogo 2000, pg . 110-111 para una descripción detallada de cada sistema), respectivamente. Otros sistemas de expresión gel gen encendido y apagado inducible o controlable se conocen para aquellos de experiencia ordinaria en la técnica. Con tal sistema, expresión del nucleico objetivo del constructo de polinucleótido puede regularse en una manera precisa, reversible, y cuantitativa. La expresión del gen del ácido nucleico objetivo puede inducirse, por ejemplo, después de que las células transf ctadas estables que contienen el constructo de polinucleótido que comprende el ácido nucleico objetivo se suministran o transfieren a o se hacen en contacto con el tejido del sitio, órgano o sistema de interés. Tales sistemas son de beneficio particular en formatos y métodos de tratamiento en los cuales es ventajoso para retrasar o precisamente controlar la expresión del ácido nucleico objetivo (pqr ejemplo, permite el tiempo para terminar la cirugía y/o curación después de la cirugía; permite el tiempo para el constructo de polinucleótido que comprende el ácido nucleico objetivo para alcanzar el sitio, células, sistema, o tejido a tratarse; permite el tiempo para el injerto que contiene las células transformadas con el constructo de incorporarse en el tejido u órgano dentro o en en el cual se ha empalda o unido, etc. ) .

X. USOS ADICIONALES DE MULTIMEROS Las aplicaciones, potenciales de multímeros de la descripción actual son diversos e incluyen cualquier uso donde se desea un agente de afinidad, particularmente una proteína de enlace . y más particularmente una proteína de enlace biespecífica que se enlaza a FGFRlc, ß-Klotho o tanto FGFRlc como ß-Klotho.

En . algunos casos, se' seleccionan un par de monómeros o multímeros para enlazarse al mismo objetivo (es decir, para uso en ensayos basados en intercalado) . Para seleccionar un par monómero o multímero emparejado, dos monómeros o multimeros diferentes típicamente son capaces de enlazarse a la proteína objetivo simultáneamente. Un enfoque para identificar tales pares involucra lo siguiente: (1) inmovilizar el fago o mezcla de proteína que se seleccionó previamente para enlazar la proteína objetivo (2) poner en contacto la proteína objetivo al fago o proteína inmovilizada y lavar; (3) poner en contacto el fago o mezcla de proteína al objetivo enlazado y lavar; y (4) eluir el fago o proteína enlazado sin eluir el fago o proteina inmovilizada.

Un uso de los multimeros o dominios de monómero proporcionados en la presente es para reemplazar anticuerpos u otros agentes de afinidad en la detección u otros ensayos basados en afinidad. De esta manera, en algunas modalidades, los dominios de monómero' o multimeros se seleccionan contra la capacidad para enlazar componentes diferentes a un objetivo en una mezcla. El enfoque general puede incluir realizar la selección por afinidad bajo condiciones que se asemejan cercanamente a las condiciones del ensayo, incluyendo imitar la composición de una muestra durante el ensayo. De esta manera, una etapa de selection pudiera incluir poner en contacto un dominio de monómero o multímero a una mezcla no incluyendo el ligando objetivo y seleccionar contra cualquiera de los dominios de monómero o multimeros que se enlazan a la mezcla. De esta manera, las mezclas (ausente el ligando objetivo, que puede eliminarse usando un anticuerpo, dominio de monómero o multimero) representa laq muestra en un ensayo (suero, sangre, tejido, células, orina, semen, etc) pueden usarse como un agente de bloqueo. Tal enfoque puede ser deseable, por ejemplo, para crear proteínas farmacéuticas que enlazan a su objetivo pero no troas proteínas de suero o tejidos no objetivos.

Por ejemplo, pueden crearse agonistas, tales como aquellos descritos. en la presente, en los cuales los dominios de monómero o multimeros seleccionados imitan eventos de señalización que se producen de la asociación in vivo de dos proteínas, por ejemplo, FGFRlc y ß-Klotho. Ver Figura 1. Opcionalmente, los métodos descritos en la presente pueden emplearse para generar antagonistas. Por ejemplo, multimeros que enlazan dos proteínas diferentes, por ejemplo, enzima y sustrato, pueden inhibir la función de la proteína, incluyendo, por ejemplo, actividad enzimática y/o conversión de sustrato.

En algunas modalidades, los dominios de monómero se usan para la inhibición del ligando, liberación del ligando o estimulación del ligando. Los ligandos posibles en .estos métodos pueden incluir, por ejemplo, FGFRlc y/o ß-Klotho.

En otra modalidad, un multimero que comprende al menos dos monómeros que enlazan a receptores se usan para llevar dos receptores en proximidad ambos enlazando el multimero, por ello activando los receptores. Un subconjunto de proteínas de enlace descritas en la presente se comportan de esta manera. Ver, por ejemplo, Ejemplo 11.

Ejemplos adicionales de usos potenciales de las composiciones descritas en la presente incluyen dominios de monómero, y multímeros de los mismos, que son capaces de enlazar fármaco (por ejemplo, radionucleótidos enlazados para formación de objetivo, enlazado farmacéutico para extensión de vida medio de los fármacos, enlace de sustancia controlada para tratamiento de sobredosis . y terapia de adición) , modulación de la función inmunitaria (por ejemplo, bloqueo de inmunogenicidad al enlazar receptores tales como CTLA-4, aumento de la inmunogenicidad al enlazar receptores tales como CD80, o activación por complemento por enlace de tipo Fe) , y suminsitro especializado (por ejemplo, liberación lenta por desdoblamiento del ligador, dominios de electrotransporte, dominios de dimerización, o enlace específico a: dominios de entrada de célula, receptores de liberación tales como FcR, receptores de suminsitro oral tal como plgR para transporte trans-mucosal, y receptores de transferencia he atoencefá lica tal como transferrinR) .

En modalidades adicionales, monómeros o multimeros pueden ligarse covalentemente a una etiqueta detectable (por ejemplo, Cy3, Cy5, etc.) o expresada como un polipéptido de fusión fusionado a un producto del gen reportero (por ejemplo, CAT, luciférasa, peroxidasa de rábano gigante, fosfotasa alcalina, GFP, etc.).

XI. DOMINIOS DE MONÓMERO Y/O ÁCIDOS NUCLEICOS DE MULTIMERO Y POLIPEPTIDOS MANIPULADOS ADICIONALES Como se describe en la presente, pueden alterarse las proteínas de enlace' de la descripción actual. Las descripciones de una variedad de procedimientos de generación diversificados para generar secuencias de ácido nucleico modificado o alterado que codifica estas proteínas de enlace como se describe en la presente y las referencias proporcionadas.

Otro aspecto de la descripción actual incluye la clonación y expresión¦ de dominios de monómero, dominios de monómero seleccionados, multimeros y/o ácidos nucleicos que codifican multimeros seleccionados. De esta manera, los dominios de multímero pueden sintetizarse como una proteína sencilla usando sistemas de expresión bien conocidos en la técnica. Los textos generales que describen técnicas de biología molecular útiles en la presente, incluyendo el uso de vectores, promotores y muchos otros tópicos relevantes para expresar ácidos nucleicos tales como dominios de monómeros, dominios de monómero seleccionados, multimeros y/o multímeros seleccionados, incluyendo Berger y Kimmel, Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology volume 152 Academic Press, Inc., San Diego, CA (Berger); Sambrook: et al., Molecular Cloning - A Laboratory Manual (2a Ed. ) , Vol . 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1989 y Current Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubel et al., eds . , Current Protocols, a joint venture between Greene Publishing Associates, Inc. y John Wiley & Sons, Inc. Los ejemplos de técnicas suficientes para dirigir personas de experiencia a través de los métodos de amplificación in vitro, útiles para identificar, aislar y clonar dominios de. monómero y. ácidos nucleicos que codifican multimeros, que incluyen la reacción de cadena de polimerasa (PCR) la reacción de cadena de ligasa (LCR) , amplificación de Q-replicasa y otras técnicas mediadas por polimerasa de ARN (por ejemplo, NASBA) , se encuentran en Berger, Sambrook, y Ausubel, asi como Mullís et al., (1987) Patente E.U.A. No. 4,683,202; PCR Protocols A Guide to Methods and Applications (Innis et al. eds) Academic Press Inc. San Diego, CA (1990) (Innis); Arnheim & Levinson (1 octubre 1990) C&EN 36-47; The Journal Of NIH Research (1991) 3, 81-94; (Kwoh et al. (1989) Proc. Nati. Acad. Sci, USA 86, 1173; Guatelli et al. (1990) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 87, 1874; Lomell et al. (1989) J. Clin. Chem 35, 1826; Landegren et al., (1988) Science 241, 1077-1080; Van Brunt (1990) Biotechnolcgy 8, 291-294; u and allace, (1989) Gene 4, 560; Barringer et al. (1990) Gene 89, 117, y Sooknanan and Malek (1995) Biotechnology 13: 563-564. Los métodos mejorados para clonar ácidos nucleicos amplificados in vitro se describen en Wallace et al., Patente E.U.A. No. 5,426,039. Los métodos mejorados para amplificar ácidos nucleicos grandes por PCR se resumen en Cheng et al. (1994) Nature 369: 684-685 y las referencias en la presente, en las cuales se generan aplicones de PCR de hasta 40kb. Alguien experto apreciará que esencialmente cualquier ARN puede convertirse en un ADN de hebra doble apropiado para digestión pro restricción, expansión de PCR y procesado en secuencia usando transcriptasa inversa y una polimerasa. Ver, por ejemplo, Ausubel, Sambrook y Berger.

La descripción actual también se refiere a la introducción de vectores de la descripción actual en células hospederas, y la producción de dominio de monómeros, dominios de monómero seleccionados, multímeros y/o multimeros seleccionados de la descripción actual por técnicas recombinantes . Las células hospederas se producen por ingeniería genéticamente (es decir, transducidas , transformadas o transíectadas) con los vectores de la descripción actual, que puede ser, por ejemplo, un vector de clonación o un vector de expresión. El vector puede estar, por ejemplo, en la forma de un plásmido, una partícula vírica, un fago, etc. Las células hospederas producidas por ingeniería pueden cultivarse en medio nutriente convencional modificado como sea apropiado para promotores de activación, seleccionar transformantes, o amplificar el dominio de monómero, dominio de monómero seleccionado, multímero y/o genes de multímero seleccionados de interés. Las condiciones de cultivo, tales como temperatura, pH y similares, son aquellas previamente usadas con la célula hospdera seleccionada para expresión, y serán aparentes para aquellos expertos en la técnica en las referencias citadas en la presente, incluyendo, por ejemplo, Freshney (1994) Culture of Animal Cells, a Manual of Basic Technique, tercera edición, Wiley-Liss, New York y las referencias citadas en la presente.

Como se menciona antes, las proteínas de enlace de la descripción actual también pueden producirse en células no animales tales como plantas, levadura, hongos, bacterias y similares. En efecto, como- se nota a través de esta, el despliegue de fagos es una técnica especialmente relevante para producir tales polipéptidos . Además de Sambrook, Berger y Ausubel, los detalles con respecto al. cultivo celular pueden encontrarse en Payne et al. (1992) Plant Cell and Tissue Culture in Liquid Systems John iley & Sons, Inc. New York, NY; Gamborg and Phillips (eds) (1995) Plant Cell, Tissue andy Organ Culture; Fundamental Methods Springer Lab Manual, Springer-Verlag (Berlín Heidelberg New York) y Atlas and Parks (eds) The Handbook of Microbiological Media (1993) CRC Press, Boca Ratón, FL.

La descripción actual también proporciona alteraciones de los dominios de -monómero, dominios inmunitarios y/o multímeros para mejorar propiedades farmacológicas, para reducir la inmunogenicidad, o para facilitar el transporte del multímero y/o dominio de monómero en una célula o tejido (por ejemplo, a través de la barrera hematocelular, o a través de la piel). Estos tipos de alteraciones incluyen una variedad de modificaciones' (por ejemplo, la adición de grupos de azúcar o glicosilación) , la adición de PEG, la adición de dominios de proteína que enlazan una cierta proteína (por ejemplo, HSA u otra proteína de suero), la adición de fragmentos de proteínas o secuencias que señalan el movimiento o transporte en, fuera y através de la célula, la adición de proteínas o dominios de proteína (por ejemplo, HSA u otra proteína de suero), que extienden la vida media del multímero en el suero. También pueden agregarse componentes adicionales a un multimero y/o dominio de monómero para manipular las propuedades del multimero y/o dominio de monómero. Una variedad de componentes también puede agregarse incluyendo, por ejemplo, un dominio que se enelaza a un receptor conocido (por ejemplo, un dominio de proteina de región Fe que se enlaza a un receptor Fe) , toxinas o parte de una toxina, un prodominio que puede escindirse opcionalmente para activar el multimero o dominio de monómero, una molécula reportera (por ejemplo, proteina fluorescente verde) , un componente que enlaza una molécula reportera (tal como un radionúclido para radioterapia, biotina o avidina) o una combinación de modificaciones.

XII. MODELOS DE ANIMALES Otro aspecto de la descripción actual es el desarrollo de modelos de animal no humano en el cual se prueba la inmunogenicidad de proteínas de enlace que comprenden monómero o dominios de .multimero. El método para producir tal modelo animal no humano comprende: introducir en al menos algunas células de un animal no humano receptor, los vectores comprenden genes que codifican una pluralidad de protéinas humanas de la misma familia de proteínas, en donde los genes se ligan cada uno operablemente a un promotor que es funcional en al menos algunas de las células en las cuales los vectores se introducen de tal manera que se obtiene un animal no humano genéticamente modificado que puede expresar la pluralidad de proteínas humanas de la misma familia de proteínas .

Los animales no humanos apropiados empleados en la práctica de los métodos y composición descrita en la presente incluyen todos los animales vertebrados, excepto humanos (por ejemplo, ratón, rata, conejo, oveja, y similares) . Típicamente, la pluralidad de miembros de una familia de proteínas incluye al menos dos miembros de tal familia, y usualmente al menos diez . miembros de la familia. En algunas modalidades, la pluralidad incluye todos los miembros conocidos de la familia de proteínas. Los genes ejemplares que pueden usarse incluye aquellos que codifican dominios de monómero, tal como, por ejemplo, miembros de la familia de dominio de clase A ' del receptor LDL, la familia de domino tipo EGF, así como las otras familias de domino descritas en la presente.

Los modelos animales no humanos de la descripción actual pueden usarse para seleccionar inmunigenicidad de una proteína de enlace que comprende un monómero o dominio de multímero que se deriva de la misma familia de proteínas expresada por el modelo animal no humano. La descripción actual incluye el modelo animal no humano hecho de acuerdo con el método descrito antes, así como animales no humanos transgénicos cuya somática y células germinales contienen y expresan moléculas de ADN que codifican una pluralidad de proteínas humanas de la misma familia de proteínas (tales como los dominios de monómero descritos en la presente) , en donde las moléculas de ADN se han introducido en el animal no humano transgénico en una etapa embriónica, y en donde las moléculas de ADN se han introducido en el animal no humano transgénico en una fase embriónica, y en donde las moléculas de ADN se ligan operablemente a un promotor en al menos alguna de las células en las cuales las moléculas de ADN se han introducido.

Un ejemplo de un modelo de ratón útil para seleccionar proteínas de enlace derivadas del dominio de clase A del receptor LDL se describe como sigue. Los agrupamientos de genes que codifican los monómeros del dominio de clase A del receptor LDL humano de tipo natural se amplifican a partir de células humanas usando PCR. · Casi todos los 200 dominios A diferentes pueden amplificarse sólo con tres reacciones de amplificación PCR separadas de alrededor de 7kb cada uno. Estos fragmentos se usan entonces para generar ratones transgénicos de acuerdo con el método descrito antes. Los ratones transgénicos reconocerán los dominios A humanos coOmo "propios", imitando de esta manera la "similitud" de un humano con respecto a los dominios A. Los monomeros o multimeros derivados del dominio A individuales se prueban en estos ratones al inyectar los monómeros o multimeros derivados del dominio A en los ratones, luego se analiza la respuesta inmunitaria (o carencia de respuesta) generada. Se prueban los ratones para determinar si han desarrollado una respuesta anti-humana de ratón (MAHR) . Los monómeros y multimeros que no resultan en la genreación de una MAHR igualmente para ser no inmunogénico cuando se administra a humanos.

Históricamente, se usa la prueba MAHR en ratones transgénicos para probar ' proteínas individuales en ratones que son transgénicos para tal proteína sencilla. En contraste, el método antes descrito proporciona un modelo animal no humano que reconoce una familia completa de proteínas humanas como' "propias", y que pueden usarse para evaluar un número enorme de proteínas variantes que cada una son capaces de variar de forma vasta las actividades de enlace y usos.

XIII. KITS Los kits que comprenden componentes que pueden emplearse en lso métodos descritos (típicamente en una forma no mezclada ) y materiales de empacado, instrucciones para usar los componentes y/o realizar los métodos, y uno o más recipientes para mantener los componentes (tubos de reacción, columnas, etc.) forman un aspecto de la descripción actual. Los kits que comprenden compuestos y métodos descritos en la presente pueden comprender una biblioteca de multimero, o una proteina de enlace que comprende un tipo sencillo de monómero o multimero, por ejemplo, una o más de las proteínas FGFRlc y/o ß-Klotho de enlace descritas en la presente. Los kits también pueden incluir reactivos apropiados para promover el enlace de la molécula objetivo, tal como soluciones amortiguadoras o reactivos que facilitan la detección, incluyendo moléculas etiquetadas de forma detectable. Lso estándares para calibrar un ligando enlazado a un dominio de monómero o similares, también pueden incluirse en los kits.

La descripción actual también proporciona ensayos y kits de enlace comercialmente valiosos para practicar los ensayos. En algunos de los. ensayos, se emplea uno o más ligandos para detectar el enlace de un dominio de monómero, dominio inmunitarios y/o multimero. Tales ensayos se basan en cualquier método conocido en la técnica, por ejemplo, citometría de flujo, microscopio fluorescente, resonancia de plasmón, y similares, para detectar el enlace de un ligando a la proteína de enlace.

También se proporcionan kits basados en los ensayos descritos. Tal kit puede comprender un recipiente y uno o más ligandos. Un kit también puede comprender direcciones para realizar los ensayos, reactivos de detección adicionales, soluciones amortiguadoras, o instrucciones para uso de cualquiera de estos componentes, o similares. Alternativamente, los kits pueden incluir células, vectores, (por ejemplo, vectores de expresión, vectores de secreción que comprenden un polipéptido descrito en la presente) , para la expresión de una proteína de enlace de la descripción actual .

En un aspecto adicional, se proporciona el uso de cualquier composición, dominio de monómero, dominios inmunitario, multímero, célula, cultivo celular, aparato, componente de aparato o kit proporcionado en la presente, para la práctica de cualquier método o ensayo en la presente, y/o para el uso de cualquier aparato o kit para practicar cualquier ensayo o método en la presente y/o para el uso de las células, cultivos celulares, composiciones u otras características en la presente como una formulación terapéutica. También se proporciona la fabricación de todos los componentes en la presente como formulaciones terapéuticas para los tratamientos descritos en la presente..

XIV. SISTEMAS INTEGRADOS La descripción actual proporciona computadoras, medios legibles en computadora y sistemas integrados que comprenden hileras de caracteres que corresponden a dominios de monómero, dominios de monómero seleccionados, multimero y/o multimeros seleccionados y ácidos nucleicos que codifican tales proteínas de · enlace. Estas secuencias pueden manipularse por métodos de recombinación in silico, o por alineación de secuencia estándar o software de procesamiento de palabras.

Por ejemplo, pueden detectarse diferentes tipos de similitud y consideraciones de severidad variada y longitud de hilera de carácter y reconocerse en los sistemas integrados en la presente. Por ejemplo, muchos métodos de determinación de homología se han diseñado para análisis competitivo de secuencias, de biopolímeros, para revisión en detalle en el procesador de palabras, y para recuperación de datos de varias bases de datos. Con un entendimiento de las interacciones de complemento en pares de hélice doble entre cuatro nucleobases principales en polinucleótidos naturales, también pueden usarse modelos que estimulan la combinación en sus pares de bases de hileras de polinucleótido homólogo complementario como un fundamento de la alineación de secuencia u otras operaciones realizadas típicamente en las hileras de carácter que corresponden a las secuencias en la presente (por ejemplo, manipulaciones en el procesamiento de palabras, construcción de figuras que comprenden hileras de carácter de secuencia o subsecuencia, tablas de resultados, etc.). Un ejemplo de un paquete de software con Gos para calcular similitud de secuencia es BLAST, que puede adaptarse para ingresar hileras de carácter que corresponden a las secuencias en la presente.

BLAST se describe en Altschul et al., (1990) J. Mol. Biol . 215:40,3-410. El software para realizar el análisis BLAST está públicamente, disponible a través del Centro Nacional para Información Biotecnológica . Este algoritmo involucra identificar primero pares de secuencias de alta predisposición (HSPs) al identificar palabras cortas de longitud W en la secuencia de pregunta, que ya sea se alinea o satisface algún registro T de umbral de valor positivo cuando se alinea con una palabra de la misma longitud en una secuencia de base de datos. T se refiere como el umbral de registro de palabra vecina (Altschul et al., svpra) . Estas lineas de palabra vecina inicial actúa como señillas para iniciar búsquedas para encontrar HSPs más largas que las que las contienen. Las lineas de palabra se extienden entonces en ambas direcciones a lo largo de cada secuencia de manera que puede incrementarse el registro de alineación acumulativo.

Los registros acumulativos se calculan usando, para secuencias de nucleótido, los parámetros M (registro de recompensa para un par de residuos alineados; siempre >0) y N (registro de penalización para residuos no alineados; siempre <0) . Para secuencias de aminoácidos, se usa una matriz de registro para calculas el registro acumulado. La extensión de las lineas de palabra en cada dirección se interrumpen cuando: el registro de alineación acumulado falla por la cantidad de Z desde su valor alcanzado máximo; el registro acumulado va hasta cero o debajo,, debido a la acumulación de una o más alineaciones de residuo de registro negativa; o el final de cualguier secuencia se alcanza. Los parámetros de algoritmo BLAST W, T, y X determinan la sensibilidad y velocidad de la alineación. El programa BLASTN (para secuencias de nculeótido) usa como predeterminado una longitud de palabra . (W) de 11, una expectación (E) de 10, un corte de 100, M=5, N=-4, y una comparación de ambas hileras. Para secuencias de aminoácidos, el programa BLASTP usa como predetemrinado una longitud de palabra (W) de 3, una expectación (E) de 10, y la matriz de registro BLOSUM62 (ver Henikoff & Henikoff (1989) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 89:10915).

Un ejemplo adicional de un algoritmo de secuencia útil es PILEUP. PILEUP crea una alineación de secuencia múltiple desde un grupo de secuencias relacionado que usa alineaciones en pares, progresivas. También puede agruparse las relaciones en grupo usadas para crear la alineación. PILEUP usa una simplificación del método de alineación progresivo de Feng & Doolittle, (1987) J. Mol. Evol . 35:351-360. El método usado es similar al método descrito por Higgins & Sharp, (1989) CABIOS 5:151-153. El programa puede alinear, por ejemplo, hasta 300 secuencias de longitud máxima de 5,000 letras. El procedimiento de alineación múltiple inicia con la alineación en partes de las dos secuencias más similares, que producen un grupo de dos secuencias alineadas. Este grupo puede entonces alinearse a la siguiente secuencia más relacionada o agrupamiento de secuencias alineadas. Pueden alinearse dos agrupamientos de secuencia por una extensión sencilla de la alineación en pares de dos secuencias individuales. Se alcanza la alineación final por una secie de alineaciones en pares, progresiva. El programa también puede usarse para forma runa gráfica de un dendograma o representación en árbol de las relaciones agrupadas. El programa se corre al diseñar secuencias especificas y sus coordinados de nucleótido o aminoácido para regiones de comparación de secuencia. Por ejemplo, con objeto de determinar los aminoácidos conservados en una familia de dominios de monómero o para comparar las secuencias de dominios de monómero en una familia, la secuencia en cuestión, o ácidos nucleicos que la codifican, se alinean para proporcionar información de estructura-función.

En un aspecto, el sistema de computadora se usa para realizar la recombinación de secuencia "ir¡ silico" o transposición de hileras de carácter correspondientes a los dominios de monómero. Una variedad de tales métodos se establece en "Methods For Making Character Strings, Polynucleotides & Polypeptides Having Desired Characteristics" ' por Selifonov and Stemmer, presentada el 5 de febrero de 1999 (USSN 60/118854) y "Methods For Making Character Strings, Polynucleotides & Polypeptides Having Desired Characteristics" por Selifonov and Stemmer, presentada el 12 de octubre de 1999 (USSN 09/416,375). En breve, se usan operadores genéticos en algoritmos genéticos para cambiar las secuencias dadas, por ejemplo, al imitar eventos genéticos . tales como mutación, recombinación, muerte y similares. También puede realizarse el análisis multi-dimensional para optimizar secuencias en el sistema de computadora, por ejemplo, como se describe en la solicitud ?375.

También puede instruirse un sintetizador de oligonucleótido para sintetizar oligonucleotidos, por ejemplo, usado para reconstrucción o recombinación de genes, o para ordenar oligonucleótidos de fuentes comerciales (por ejemplo, al imprimir, formas de orden apropiado o al ligarse a una forma de orden en la Internet) .

El sistema digital también puede incluir elementos de salida para controlar la síntesis del ácido nculeico (por ejemplo, con base en una secuencia o una alineación de un dominio de monómero recombinante , por ejemplo recombinado, como en la presente) , es decir, un sistema integrado de la descripción actual incluye opcionalmente un sintetizador de oligonucleótido o un controlador de síntesis de oligonucleóptido . El sistema¦ puede incluir otras operaciones que se presentan cadena debajo de una alineación u otra operación realizada usando una hilera de carácter que corresponde a una secuencia en la presente, por ejempo, como se nota abajo con referencia a los ensayos.

EJEMPLOS Aunque la invención anterior se ha descrito en algún detalle para propósitos de claridad y entendimiento, será claro para alguien experto en el campo a partir de la lectura de esta descripción, que pueden hacerse varios cambios en la forma y detalla sin salirse del alcance real de la invención. Por ejemplo, todas las técnicas, métodos, composiciones, aparatos y sistemas descritos antes pueden usarse en varias combinaciones. Todas las publicaciones, patentes, solicitudes de patente, u otros' documentos citados en esta solicitud se incorporan para referencia en su totalidad para todos los propósitos en la misma extensión como si cada publicación individual, patente, solicitud de patente, u otro documento se indicara individualmente para incorporarse por referencia para todos los propósitos- Las solicitudes PCT PCT/US02/13257 y PCT/US03/35664 y Publicación E.U.A de Patente No. 2005/0089932 se incorporan por ello para referencia en su totalidad.

EJEMPLO 1 Este ejemplo describe la selección de dominios de monómero y la creación de multimeros.

Los materiales de partida para identificar dominios de monómero y crear multimeros a partir de los dominios de monómero seleccionados y · procedimientos pueden derivarse de cualquiera de una variedad de secuencias humanas y/o no humanas. Por ejemplo, para producir un dominios de monómero seleccionado con enlace especifico para un ligando deseado o mezcla de ligandos, se seleccionan uno o más genes de dominio de monómero a partir de una familia de dominios de monómero que se enlazan a un cierto ligando. Las secuencias de ácido nucleico que codifican uno o más genes de dominio de monómero pueden obtenerse por amplificación por PCR de ADN genómico o cADN, u opcionalmente, pueden producirse sintéticamente usando oligonucleót idos traslapados.

Más comúnmente, estas secuencias se clonan entonces en un formato que exhibe la superficie celular (es decir, despliegue de supérficie celular de bacteria, levadura, o mamífero (COS) ; despliegue de fagos) para expresión y selección. Las secuencias recombinantes se transfectan (transducen o transforman) en la célula hospedera apropiada donde se expresan y muestran .en la superficie celular. Por ejemplo, las células pueden teñirse con un ligando deseado, etiquetado (por ejemplo, fluorescentemente etiquetado) . Las células teñidas se clasifican por citometría de flujo, y se recuperan los dominios de monómero seleccionados que codifican genes (por ejemplo, por aislado de plásmido, PCR o expansión y clonación) a partir de las células positivas. El proceso para teñir y clasificar puede repetirse varias veces (por ejemplo, usando concentraciones progresivamente reducidas del ligando deseado o mezcla de ligandos hasta que se obtiene un nivel deseado de enriquecimiento) . Alternativamente, cualquier método de selección o detección conocido en la técnica que puede usarse para identificar células que enlazan el ligando deseado o mezcla de ligandos puede emplearse.

Los genes que codifican multimero seleccionados recuperados del ligando deseado o mezcla de células enlazadas a ligandos pueden recombinarse opcionalmente de acuerdo con cualquiera de los métodos descritos en la presente o en las referencias citadas. Las secuencias recombinantes producidas en esta ronda de diversificación se seleccionan entonces por el mismo método o uno similar para identificar genes recombinantes con avidad o afinidad mejorada o especificidad alterada para el ligando deseado u objetivo. El proceso de diversificación y selección se repite opcionamente hasta que se obtiene la avidez o afinidad o especificidad alterada.

EJEMPLO 2 Este ejemplo describe recombinación intra-proteína in vivo para generar bibliotecas de diversidad mayor.

Un vector plásmido que codifica el monómero (vector derivado de pCK; ver enseguida) , flanqueado por sitios loxP ortólogos, se recombinó en una manera dependiente de Cre con un fago vector por medio de sus sitios loxP compatibles. Los vectores fago recombinantes se detectaron por PCR usando cebadores específicos para el constructo recombinante . El procesado por secuencia del ADN indica que se generó el producto recombinante correcto.

Reactivos y Procedimientos Experimentales pCK-cre-lox-Monómero-loxP. Este vector tiene dos características particularmente relevantes. Primero, porta el gen cre, que codifica la recombinasa Cre de ADN de sitio específico, bajo el control de Piac- Se aplificó por PCR Cre a partir dé p705-cre (de GeneBridges) con cebadores específicos de cre que incorporan · Xbal (5') y Sfil (3' ) en los extremos del producto PCR. Este producto se digirió con Xbal y Sfil y se clona en los sitios idénticos de pCK, un bla~, derivado CmR ' de pCK11.0919-HC-Bla (pACYC ori), proporcionado pCK-cre.

La segunda característica es la biblioteca de dominios A intactos flanqueado por dos sitios loxP ortólogos, _ZoxP(wild-type) y loxP(FAS), que se requieren para la recombinación de ADN de sitio específica catalizada por Cre. Ver, por ejemplo, Siegel, R.W., et al.. FEBS Letters 505:467-473 (2001). Estos sitios raramente se recombinan con otros. Los sitios loxP se construyeron en pCK-cre secuencialmente. Los oligonucleótidos 5' -fosforilados loxP(K) y- loxP(K_rc), gue portan loxP(WT) y EcoRI y salientes compatibles con HinDIH para permitir el ligado al pCK digerido con EcoRI y HinOIII, se hibridizaron en conjunto y ligaron a pCK-cre en una reacción de ligado estándar (ligasa T4; durante la noche a 16°C) .

El plásmido resultante se digirió con EcoRI y Sphl y se liga a los oligos loxP(L) y loxP . (L_rc) 5' -fosforilados, hibridizados, que portan loxP(FAS) y EcoRI y salientes compatibles con Sphl . Para preparar la construcción de la biblioteca, se realizó una purificación a gran escala (Qiagen MAXI prep) de pCK-cre-lox-P (wt) -loxP (FAS) de acuerdo con el protocolo de Qiagen. El plásmido purificado por Qiagen se sometió a centrifugado de gradiente CsCl para purificación adicional. Este constructo se digirió entonces con Sphl y BglII y se ligan al inserto de biblioteca de dominio A intacto digerido, que se obtuvo por medio de amplificación por PCR de un agrupamiento de biblioteca de dominio A preexistente. Al diseñarlos, los sitios loxP y el monómero están en estructura, lo que genera monómeros con ligaduras codificados por loxP. Esta biblioteca se utilizó en el procedimiento de recombinación in vivo como se detalla enseguida.

Vector fUSE5HA-Monómero-lox-lox. El vector es un derivado de fUSE5 del laboratorio de George Smith (University of Missouri) . Se modificó posteriormente para transportar una etiqueta HA para ensayos de inmunodetección. Los sitios loxP se construyeron en fUSE5HA secuencialmente . Se hibridizaron oligonucleótidos loxP(I) y loxP(I)_rc 5'-fosforilados , que portan loxP (WT ) , una hilera de codones de detención y Xmal y salientes compatiables con Sfil, en conjunto y ligaron a fUSE5HA digerida con Xmal- y Sfil en una reacción de ligado estándar (ligasa T4 de New England Biolabs; durante la noche a 16°C)'.

El vector de fago resultante se digirió a continuación con Xmal y Sphl y se liga a los oligos loxP(J) y loxP(J)_rc hibridizados , que transportan loxP(FAS) y salientes compatibles con Xmal y Sphl. Este constructo se digirió con Xmal/Sfil y luego se . liga a un inserto de biblioteca de dominio A intacto (Xmal/Sfil) previamente cortado (producto PCR) . Los codones de paro se localizan entre los sitios loxP, lo que previene la .expresión de gilí y consecuentemente, la producción de fago infeccioso.

El vector/biblioteca ligado se transformó posteriormente en un hospedero de E. coli que porta un plásmido que expresa gilí que permite el rescate del fago fUSE5HA-Monómero-lox-lox, como se detalla enseguida. pCK-gTIJ. Este plásmido porta gilí bajo el control de su promotor nativo. Se construyó por amplificación de PCR gilí y su promotor del fago auxiliar VCSM13 (Stratagene) con cebadores gIIIPromoter_EcoRI y gIIIPromoter_HinDIII . Este producto se digirió con EcoRI y HinOIII y clona en los mismos sitios de pCK110919-HC-Bla. Como glll está bajo el control de su propio promotor, la expresión gilí es presumiblemente constitutiva. Se . transformó pCK-glII en E. coli EC100 (Epicentre) .

Procedimiento de recombinación in vivo. En resumen, el procedimiento involucra las siguientes etapas clave: a) producción de infección (es decir, rescate) de biblioteca fUSE5HA-Monómero-lox-lqx con un hospedero de E. coli que expresa gilí a partir de un plásmido; b) Clonación de la 2a biblioteca (pCK) y transformación en F+ TG1 E. coli; c) Infección del cultivo que porta la 2a biblioteca con la biblioteca de fago fUSE5HA-Monómero-lox-lox rescatada. a. .Rescate del vector de fago. Se prepararon células electrocompetentes que portan pCK-gJII por un protocolo estándar. Estas células tienen una frecuencia de transformación ,de A x l08/ q ADN y se procesaron por electroporacion con ligaciones a gran escala (~5 yg de vector de ADN) del vector fUSE5HA-lox-lox y el inserto de biblioteca de dominio A intacto. Después de las electroporaciones individuales (100 ng ADN/electroporación) con ~ 70 \iL células/cubeta, se agregaron .930 L de medio SOC tibio, y las células se permitieron recuperar con agitación a 37 °C por 1 hora. A continuación, se agregó tetraciclina hasta una cocnentración final de 0.2 yg/mL, y las células se agitaron por ~ 45 minutos a 37C. Se removió una alícuota de este cultivo, se diluye en serie 10 veces y se coloca en una placa para determinar el tamaño de biblioteca resultante (1.8 x 107) . Se diluyó el cultivo restante en 2 x 500 mL 2xYT (con 20 yg/mL de cloramfenicol y 20 pg/mL de tetraciclina para seleccionar pCK-glII y el vector basado en fUSE5HA, respectivamente) y se hace crecer durante la noche a 30C.

Se cosecharon los fagos rescatados usando un protocolo de precipitación PEG/NaCl estándar. La concentración fue de aproximadamente 1 x 1012 unidades transducidas/mL. b. Clonación de la 2a biblioteca y transformación en un hospedero de E. coli. La biblioteca del dominio ligado A intacto/pCKA se procesa por electroporación en un hospedero F+ bacteriano, con un tamaño de biblioteca esperado de aproximadamente 108. Después de un periodo de recuperación de una hora de duración a 37C con agitación, las células electropradas se diluyeron hasta OD6oo~ 0.05 en 2xYT (plus 20 yg/mL cloramfenicol ) y se hacen crecer hasta una fase log media a 37C antes de la infección, por fUSEHA-Monómero-lox-lox . c. Infección del cultivo que transporta la 2a biblioteca con la biblioteca de fago fUSESHA-Monómero-lox-lox rescatada . Para maximizar la generación de recombinantes, es deseable una relación de infección alta (> 50%) de E.coli dentro de un cultivo. La infectividad de E. coli depende de un número de factores, incluyendo la expresión del F pilus y condiciones de crecimiento. Los respaldos de E. coli TG1 (que porta un F' ) y K91 (una cepa Hfr) fueron hospederos para el sistema de recombinación.

Oligonucleótidos loxP(K) [P-5' agcttataacttcgtatagaaaggtatatacgaagttatagatctcgtgctgcatgcggtg cg] (SEQ ID NO: 395) loxP (K_rc) [P-5' aattcgcaccgcatgcagcacgagatctataacttcgtatatacctttctatacgaagtta taagct] (SEQ ID NO: 396) loxP(L) [P-5' ataacttcgtatagcatacattatacgaagttatcgag] (SEQ ID NO: 397) loxP (L_rc) [P-5' ctcgataacttcgtataatgtatgctatacgaagttatg] (SEQ ID NO: 398) 1l?o?x?P((?I)) [ [ PP55'' ccccggggggaaggccaaggggggccaattggccttaaaaggttggaaggttaaaattaaaaggttggaaggttaaaaaattaaaaccttttccggttaattaattaacccctt ttttccttaattaaccggaaaaggttttaattccggttccttgg]] ((SSEEQQ IIDD NNOO:: 339999)) llooxxPP((II))__rrcc [[P?--55'' atgccctgctc] (SEQ ID NO: 400) loxP(J) [5' ccgggaccagtggcctctggggccataacttcgtatagcatacattatacgaagttatg] (SEQ ID NO: 401) loxP(J)_rc [5' cataacttcgtataatgtatgctatacgaagttatggccccagaggccactggtc] (SEQ ID NO: 402) gl II Promoter_EcoRI [5' atggcgaattctcattgtcggcgcaactat (SEQ ID NO: 403) gIIIPromoter_HinDIII [5' gataagctttcattaagactccttattacgcag] (SEQ ID NO: 404) EJEMPLO 3 Este ejemplo describe la construcción de una biblioteca de monómeros basada en EGF.

La biblioteca de dominio CaEGF, E3, codifica un dominio de proteina de 36-43 aminoácidos que tiene el siguiente patrón: X(5,C1-X(4 6)-C2-X(4,5)-C3-X(8)-C4-X(i)-C5-X(8/i2)-C6 (SEQ ID NO: 405) La tabla enseguida describe para cada posición que aminoácidos se codifican en la biblioteca con base en la diversidad natural de dominios EGF enlazados a calcio humanos: La biblioteca de secuencias de ADN, E3, que codifican dominios EGF enlazados al calcio' monomérico, se creó pro PCR de ensamble como se describe en Stemmer et al., Gene 164:49-53 (1995) . Los oligonucleotidos usados en esta reacción PCR están en dos grupos, Grupo 1 y Grupo 2. Estos son: Grupo 1 (SEQ ID NOS 406-411, respectivamente, en orden de aparición) : 1. 5' -AAAAGGCCTCGAGGGCCTGGGTGGCAATGGT-3' (SEQ ID NO: 406) 2 . 5 ' -CCTGAACCACCACAKH ACCGYKSNBGCACGGAYYCG CRMACATTCA TYAAYATCTDYACCATTGCCACCC-3 ' (SEQ ID NO: 407) 3. 5 ' -CCTGAACCACCACAKNTGSCGYYGYKMHSGCACGGAYYCGRCRMACA TTCATYAAYATCTDYACCATTGCCACCC-3 ' (SEQ ID NO: 408) 4. 5 ' -CCTGAACCACCACAKHKACCGYKSNBGCAARBAYBCGVAHYC SKBY ACATTCATYAAYATCTDYACCATTGCCACCC-3 ' (SEQ ID NO: 409) 5. 5 ' -CCTGAACCACCACAKNTGSCGYYGYKMHSGCAARBAYBCGVAHYCW SKBYACATTCATYAAYATCTDYACCATTGCCACCC-3 ' (SEQ ID NO: 410) 6. 5 ' -TGAATTTTCTGTATGAGGTTTTGCTAAACAACTTTCAACAGTTTCGGCCCCA GAGGCCCTGGAGCCACCTGAACCACCACA-3 ' (SEQ ID NO: 411) Grupo 2 (SEQ ID NOS: 412-415, respectivamente, en orden de aparición) : 1. 5 ' -ACGGTGCCTACCCGTATGATGTTCCGGATTATGCCCCGGGTGGCAATG GT-3' (SEQ ID NO: 412) 2. 5 ' -CCTGAACCACCACAGHKTDBACCGGHAWAGCCTKSCRSGCASHBACAK YKAWAGCYACCCDSTRWATYT BACCATTGCCACCC-3' ( SEQ ID NO: 413) 3. 5' -CCTGAACCACCACAKBYKBTKCYGKYCBSABYCNGCDBAWAGCCTKBG BKGCASHBACAKYKAWAGCYACCCDSTRWATYT BACCATTGCCACCC-3' (SEQ ID NO: 414) 4. 5 ' -AAAAGGCCCCAGAGGCCCCTGAACCACCACA-3 ' (SEQ ID NO: 415) donde R=A/G, Y=C/T, M=A/C, K=G/T, S=C/G, W=A/T, B=C/G/T, D=A/G/T, H=A/C/T, V=A/C/G, y N=A/C/G/T.

Después de las PCRs separadas de los oligonucleótidos del Grupo 1 y 2, se digirieron los fragmentos PCR del Grupo 1 con Bpml y se digirieron los fragmentos PCR del Grupo 2 con BsrDI. Se purificaron los productos de digestión usando columnas Qiagen Qiaquick y luego se liga en conjunto. El ADN ligado se amplificó entonces en un PCR usando dos cebadores. Los cebadores usados fueron: 5 ' -AAAAGGCCTCGAGGGCCTGGGTGGCAATGGT-3 ' (SEQ ID NO: 416) 5 ' -AAAAGGCCCCAGAGGCCCCTGAACCACCACA-3 ' (SEQ ID NO: 417) Se purificaron' los productos PCR con columnas Qiagen Qiaquick y digirieron con Sfil. El producto digerido se purificó con columnas Qiagen Qiaquick. Los fragmentos de ADN se ligaron en los sitios de restricción Sfil del vector que exhibe fago fuse5-HA (G4S) 4 (SEQ ID NO: 418), un derivado de fuse5 que transporta un . epítopo HA en la estructura y una ligadura flexible de glicina, serina. La mezcla de ligación se procesó por elec'troporesis en células de E. coli electrocompetentes TransforMax™ EC100™. Se hicieron crecer las células de E. coli transformadas durante la noche a 37°C en medio 2xYT que contienen 20 µ?/?a? de tetraciclina . La biblioteca resultante contiene 2xl09 clones independientes. Se purificaron las partículas de fago del medio de cultivo por precipitación PEG. La concentración del fago fue 1.3xl012/ml . Se determinaron las secuencias de 24 clones individuales y estas fueron consistentes con el diseño de biblioteca.

EJEMPLO 4 Este ejemplo describe la recombinación intra-proteína in vitro para generar bibliotecas que se pueden recombinar y un método para generar bibliotecas con circuitos inter-cisteina en forma aleatoria..

Puede usarse la recombinación para optimización intradominio . Por ejemplo, puede usarse una reacción de traslape PCR que recombina dos o más segmentos de un dominio sencillo con relación al otro. Se puede usar dos, tres, cuatro, cinco o más reacciones de traslape de fragmento en la misma manera como se ilustra. Este proceso de recombinación tiene muchas aplicaciones. Una aplicación es recombinar una agrupación grande de cientes de clones previamente seleccionados sin información de secuencia. Todo lo que se necesita para trabajar, cada traslape es una región conocida de secuencia constante (relativamente) que exista en la misma ubicación en cada uno de los clones (enfoque de sitio fijado) . Para dominios A, estos clones típicamente deben derivarse de una biblioteca en la cual 20-25 aminoácidos distribuidos todos sobre cinco segmentos inter-cisteina se colocan aleatoriamente. El método de recombinación intra-dominio también puede realizarse en un grupo de dominios de monómero relacionados a la secuencia por recombinación de ADN estándar (por ejemplo, Stemmer, Nature 370:389-391 (1994)) con base en la fragmentación aleatoria y reensamblado con base en la homología de secuencia de ADN, que no requiere un sitio de traslape fijo en todos los clones que se recombinan.

Otra aplicación de este proceso es crear múltiples bibliotecas intactas (que significa sin inmunoadsorber ) , separadas, en cada una de las cuales uno de los circuitos intercisteína está colocado en forma aleatoria, para aleatorizar un circuito diferente en cada biblioteca. Después de la inmunoadsorción de estas bibliotecas de forma separada contra el objetivo, se recombinan entonces los clones seleccionados. De cada biblioteca alineada en sus pares de bases sólo se amplifica el segmento aleatorizado por PCR y se combinan entonces mútliples segmentos aleatorizados en un dominios sencillo, creando una biblioteca transpuesta que se inmunoadsorbe y/o se selecciona para potencia incrementada. Este proceso también puede usarse para revolver un número pequeño de clones de secuencia conocida.

Cualquier secuencia común puede usarse como un punto de cruce. Para dominios A u otros monómeros que contienen cisteína, los residuos de cisteína son lugares lógicos para el cruce. Sin embargo, hay otras maneras para determinar los sitios de cruce óptimos, tal como modelado por computadora. Alternativamente, . los residuos con entropía más alta, o el menor número de contactos intramoleculares, también pueden ser sitios para cruce buenos.

Un método ejemplar para generar bibliotecas que comrpenden proteínas con circuitos inter-cisteína aleatorizados se presenta enseguida. En este ejemplo, en contraste al circuito separado, el enfoque de biblioteca separada descrito antes, los circuitos intercisteína múltiples se aleatorizan simultáneamente en la misma biblioteca.

Se construyó una biblioteca NNK del dominio A que codifica un dominio de proteína de 39-45 aminoácidos que tienen el siguiente patrón: CI-X(4,6)-EI-F-RI-C2-A-X,2,4)-GI-R2-C3-I-P-SI-S2-W-V-C4-DI-G2-E2-D2- D3-C5-G3-D4-G4-S3-D5-E3-X(4,6)-C6 (SEQ ID NO: 419); donde, Ci-Cg: cisteínas; X(n) : secuencia de n aminoácidos con. cualquier residuo en cada posición; E1-E3.: glutamina;.

F: fenilalanina; Ri-R2: arginina; A: alanina; G1-G4 : glicina; I: isoleucina; P: prolina; S1-S3: serina; : triptofano; V: valina; Di-D5: ácido aspártico; y C1-C3, C2-C5 C4-C6 forman disulfuros.

Se constuyó la biblioteca al crear una biblioteca de secuencias de ADN, que contienen codones de tirosina (TAT) o codones no conservados variables (NNK) , al ensamblar PCR como se describe en Stemmer et al., Gene 164:49-53 (1995). Comparado con el andamiaje del dominio A nativo y el diseño que se usó para construir la biblioteca Al (descrita previamente) este enfoque: 1) mantiene la mayoría de los residuos existentes en su lugar en lugar de aleatorizar estos residuos potencialmente críticos,, y 2) inserta una hilera de aminoácidos de región variable de todos los 20 aminoácidos (codón NNK) , de tal manera que el número promedio de residuos inter-cisteína se . extienden más alia del dominio A natural o la biblioteca Al. La relación de residuos de tirosina se incrementó al incluir codones de tirosina en los oligonucleótidos , debido a que las tirosinas se encontraron que se sobrerepresentan en sitios enlazados al anticuerpo, presumiblemente debido al gran número de contactos diferentes que puede hacer la tirosina. Los oligonucleótyidos usados en esta reacción PCR son (SEQ ID. NOS: 420-446, respectivamente, en orden de aparición) : 1. 5' - ATATCCCGGGTCTGGAGGCGTCTGGTGGTTCGTGTNNKNNKNNKNNKGAATTCCGA- 3 ' (SEQ ID NO: 420) 2. 5'- ATATCCCGGGTCTGGAGGCGTCTGGTGGTTCGTGTNNKNNKNNKNNKNNKGAATTCCGA-3' (SEQ ID NO: 421) 3. 5'- ATATCCCGGGTCTGGAGGCGTCTGGTGGTTCGTGTNNKNNKNNKNNKNNKNNKGAATTCCG A- 3' (SEQ ID NO: 422) 4. 5'- ATATCCCGGGTCTGGAGGCGTCTGGTGGTTCGTGTTATNNKNNKNNKGAATTCCGA- 3 ' (SEQ ID NO: 423) 5. 5'-ATATCCCGGGTCTGGAGGCGTCTGGTGGTTCGTGTNNKTATNNKNNKNNKGAATTCCGA-3' ( SEQ ID NO: 424) 6. 5'- ATATCCCGGGTCTGGAGGCGTCTGGTGGTTCGTGTNNKTATNNKNNKGAATTCCGA- 3 ' (SEQ ID NO: 425) 7. 5'- ATATCCCGGGTCTGGAGGCGTCTGGTGGTTCGTGTNNKNNKTATNNKGAATTCCGA- 3 ' (SEQ ID NO: 426) 8. 5'-ATATCCCGGGTCTGGAGGCGTCTGGTGGTTCGTGTNNKNNKNNKTATGAATTCCGA- 3' (SEQ ID NO: 427) 9. 5'- ATATCCCGGGTCTGGAGGCGTCTGGTGGTTCGTGTNNKNNKNNKTATNNKGAATTCCGA-3' (SEQ ID NO: 428) 10. 5' -ATACCCAAGAAGACGGTATACATCGTCCMNNMNNTGCACATCGGAATTC-3' (SEQ ID NO: 429) 11. 5 ' -ATACCCAAGAAGACGGTATACATCGTCC NN NN NNTGCACATCGGAATTC-3' (SEQ ID NO: 430) 12. 5'-ATACCCAAGAAGACGGTATACATCGTCCMNNMNNMNNMNNTGCACATCGGAATTC- 3' (SEQ ID NO: 431) 13. 5 ' -ATACCCAAGAAGACGGTATACATCGTCCATAMNNMNNTGCACATCGGAATTC-3' (SEQ ID NO: 432) ¦ 14. 5'-ATACCCAAGAAGACGGTATACATCGTCCMNNATAMNNMNNTGCACATCGGAATTC- 3' (SEQ ID NO: 433) 15. 5 ' -ATACCCAAGAAGACGGTATACATCGTCCMNNATA NNTGCACATCGGAATTC-3' (SEQ ID NO: 434) 16. 5 ' -ATACCCAAGAAGACGGTATACATCGTCCMNNMNNATATGCACATCGGAATTC-3' (SEQ ID NO: 435) 17. 5'- ATACCCAAGAAGACGGTATACATCGTCCMNNMNNATAMNNTGCACATCGGAATTC- 3 ' (SEQ ID NO: 436) 18. 5'- ACCGTCTTCTTGGGTATGTGACGGGGAGGACGATTGTGGTGACGGATCTGACGAG- 3 ' (SEQ ID NO: 437) 19. 5'- ATATGGCCCCAGAGGCCTGCAATGATCCACCGCCCCCACAMNN NNMNNMNNCTCGTCAGA TCCGT- 3' (SEQ ID NO: 438) 20. 5'- ATATGGCCCCAGAGGCCTGCAATGATCCACCGCCCCCACAMNNMNNMNNMNNMNNCTCGTC AGATCCGT- 3' (SEQ ID NO: 439) 21. 5'-ATATGGCCCCAGAGGCCTGCAATGATCCACCGCCCCCACAMNNMNNMNNMNNMNNMNNCTC GTCAGATCCGT- 3' (SEQ ID NO: 440) 22. 5'- ATATGGCCCCAGAGGCCTGCAATGATCCACCGCCCCCACAATAMNNMNNMNNCTCGTCAGA TCCGT- 3' (SEQ ID NO: 441) 23. 5'- ATATGGCCCCAGAGGCCTGCAATGATCCACCGCCCCCACAMNNATAMNNMNNMNNCTCGTC AGATCCGT- 3' (SEQ ID NO: 442)· 24. 5'- ATATGGCCCCAGAGGCCTGCAATGATCCACCGCCCCCACAMNNATAMNNMNNCTCGTCAGA TCCGT- 3' (SEQ ID NO: 443) 25. 5'- ATATGGCCCCAGAGGCCTGCAATGATCCACCGCCCCCACAMNN NNATAMNNCTCG TCAGATCCGT- 3' (SEQ ID NO: 444) 26. 5'- ATATGGCCCCAGAGGCCTGCAATGATCCACCGCCCCCACAMNNMNNMNNATACTCG TCAGATCCGT- 3' (SEQ ID NO: 445) 27. 5'- ATATGGCCCCAGAGGCCTGCAATGATCCACCGCCCCCACAMNNMNNMNNATAMNNCTCGTC AGATCCGT- 3' (SEQ ID NO: 446) donde R=A/G, Y=C/T, M=A/C, K=G/T, S=C/G, W=A/T, B=C/G/T, D=A/G/T, H=A/C/T, V=A/C/G, y N=A/C/G/T Se construyó la biblioteca a través de una ronda inicial de 10 ciclos de amplificación PCR usando una mezcla de 4 agrupamientos de oligonucleótidos, cada agrupamiento contiene 400 pmoles de ADN . El agrupamiento 1 contiene los oligonucleótidos 1-9, agrupamiento 2 contiene los 10-17, agrupamiento 3 sólo contiene el 18 y agrupamiento 4 contiene los 19-27. Se obtuvo la biblioteca de ensamble completo a través de 8 ciclos adicionales de PCR usando el agrupamiento 1 y 4. Los fragmentos de biblioteca se digirieron con Xmal y Sfil. Se ligaron los fragmentos de ADN en los sitios de restricción correspondientes del . fago que exhibe el vector fUse5-HA, un derivado de fuse5 transportado en un epitopo HA-en estructura. La mezcla de ligado se procesó por electroporesis en células de E. coli electrocompetentes TransforMax™ EC100™ resultando en una biblioteca de 2X109 clones individuales. Las células de E. coli transformadas se hicieron crecer durante la noche a 37°C en medio 2xYT que contiene 20 µg/ml de tetraciclina . Se purificaron las partículas de fago del medio de cultivo por precipitación por PEG y se determinó una concentración de l.lX1013/ml. Se determinaron las secuencias de 24 clones y fueron consistentes con las expectaciones del diseño de biblioteca.

EJEMPLO 5 Este ejemplo describe la optimización de multímeros al optimizar monómeros y/o ligaduras para enlazarse al objetivo.

Un enfoque para optimizar el enlace del multimero a objetivos involucra la optimización de monómeros, multímeros y ligaduras. Primero se inmunoadsorbe una biblioteca de monómeros para enlazarse al objetivo (por ejemplo, FGFRlc o ß-Klotho) . Sin embargo, algunos de los monómeros pueden enlazarse en ubicaciones en el objetivo que están muy alejadas una de la otra, de tal manera que los dominios que se enlazan a estos sitios no se conectan por un péptido ligador. Por lo . tanto es útil crear y seleccionar una biblioteca grande de homo- o¦ heterotrímeros de estos monómeros antes de la optimización de los monómeros. Estas bibliotecas de trímero pueden seleccionarse, por ejemplo, en un fago (típico para heterotrímeros creados de un agrupación grande de monómeros) o hacerse y evaluarse de forma separada (por ejemplo, para homotrímeros ) . Por este métodos, se identifica el mejor trímero. Los ensayos pueden incluir ensayos de enlace a un objetivo o agonista o determinación de potencia antagonista del multímero en ensatos basados en proteína o célula funcionales.

Los dominios monoméricos del mejor trímero sencillo se optimizan en una segunda etapa. Los homomultímeros son más fáciles de optimizar, ya que sólo existe una secuencia de dominio, aunque también · pueden sintetizarse los heteromultímeros . Para homomultímeros, un incremento en el enlace por el multímero comparado, con el monómero es un efecto de avidez.

Después de la optimización de la secuencia de dominio por sí misma (por ejemplo, por recombinación o aleatorización NNK) e inmunoadsorción de fagos, se usan los monómeros mejorados para construir un dímero con una biblioteca de ligadura. Pueden formarse las bibliotecas de ligadura, por ejemplo, a partir de ligaduras con una composición NNK y/o longitud de secuencia variable.

Después de la inmunoadosrición de esta biblioteca de ligaduras, los mejores clones (por ejemplo, determinados por su potencia en la inhibición u otro ensayo funcional) se convierten en multímeros compuestos de múltiples (por ejemplo, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, etc.) dominios optimizados por secuencia y ligaduras optimizados por longitud y secuencia.

EJEMPLO 6 Este ejemplo describe un análisis estructural de dominios A.

Como ocurre con casi todas las proteínas, sólo una fracción pequeña de la superficie total de un dominio A participa en enlazar un objetivo sencillo. Con base en la estructura de solución del dominio, las posiciones del residuo adyacentes pueden identificarse que son probables para ser capaces de cooperar en el enlace a un objetivo dado. En la presente, tales Grupos de residuos adyacentes se refieren como categorías estructurales. Como un ejemplo, cuatro categorías se han identificado a través del examen de la estructura del dominio A, designados Parte Superior, Inferior, Rizo 1, y Rizo 2. Al diseñar las bibliotecas que sólo permiten la diversidad dentro de una categoría dada, el espacio de secuencia teórico permitido por una biblioteca puede reducirse significativamente, permitiendo un recubrimiento mejor del espacio teórico por la biblioteca física. Además, en el caso de las categorías no traslapadas tal como las categorías de la Parte superior e inferior, las secuencias de dominio medio seleccionadas contra objetivos diferentes pueden combinarse en una secuencia sencilla que pueden ser capaces de enlazarse simultáneamente o alternativamente a los objetivos seleccionados. En cualquier caso, crear sitios de enlace que ocupan sólo la mitad de un dominio que se permite para la creación de moléculas que son la mitad de grande y deben tener la mitad del número de epítopos inmunogénicos , reduciendo el riesgo de inmunogenicidad .

Clasificación Estructural de Posiciones el Dominio A Una secuencia de dominio A canónica (SEQ ID NO: 447) se muestra a continuación con posiciones de diversidad alta representadas como una X. Las posiciones que pertenecen a ya sea las categorías Parte superior, Inferior, Rizo 1, o Rizo 2 se designan con una estrella. 2 3 4 5 6 7 8 9 l'O 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 C X X X X F X C X X X X , c I X X X W X Parte superior • O • • O • • • O • O o • O O • Inferior 0 O • o • • • • • 0 • Rizo 1 • O O O o 0 0 o • Rizo 2 o o O o 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 ' 36 C D G X X D C X D. X S D E X X C Parte superior O O O O O • O • O • • • • • • Inferior • • • • • • • O • • • • Rizo 2 O o o • • • Tabla 2 EJEMPLO 7 Este ejemplo describe selección para monómeros o multimeros que enlazan FGFRlc humano o ß-Klotho humana.

Las bibliotecas de fago se iñmunoadsorben a través de varias rondas ya sea en soporte sólido (por ejemplo, placas Nunc MaxiSorp o perlas Dynal) o en solución (por ejemplo, captura con perlas Dynal)-. Los grupos de fago de salida con (a) la frecuencia más alta de clones de fago individuales que enlazan a FGFRlc humano (huFGFRlc) o ß-Klotho humana recombinante (rhp-klotho) y (b) diversidad de secuencia alta entre los clones de fago positivos de enlace se eligieron para selección de proteina.

I . Ronda 1 (placas MaxiSorp o Perlas Dynal) 1. Recubrimiento de huFGFRlc-Fe Objetivo A. Recubrimiento de placas : Cinco o seis pozos para cada biblioteca de dominio A se recubrieron directamente con huFGFRlc-Fc 50 nM (Sistemas R y D) diluidos en TBS [pH 7.5]/ CaCl2 2 mM (100 uL de volumen/pozo total) durante 1-2 horas con agitación a temperatura ambiente. Además, un pozo/biblioteca de control negativo se incubó con TBS [pH 7.5]/ CaCl2 2 mM únicamente. Para ciertos linajes seleccionados, las bibliotecas se pre-enlazaron a perlas de Proteina A recubiertas con huIgG para sustraer el fago de enlace a huIgG. Para ciertos otros linajes, se agregó la proteina MIO (que enlaza a Fe humano) para bloquear el fago de biblioteca Al de enlace al epitopo MIO de huFGFRlc-Fc durante las etapas de incubación de enlace al fago.

B. Recubrimiento de perlas: 20 µ?? de perlas de Proteina A (Dynal ASA) se incubaron con huFGFRlc-Fc 50 nM en 500 uL de TBS[pH 7.5]/CaCl2 2 mM y giraron a temperatura ambiente durante 1 hr en tubos Eppendorf. Como un control negativo, 20 µ?. de perlas de Proteina A sin objetivo se incubaron en 500 pL de TBS [pH 7.5]/ CaCl2 2 mM y giraron a temperatura ambiente durante 1 hr. Se nota que las perlas Dynal se lavaron al menos dos veces con TBS [pH 7.5]/CaCl2 2 mM antes de agregar el objetivo, y las perlas se recubrieron en volumen. Para ciertos linajes de inmunoadsorción, las bibliotecas se pre-enlazaron a huIgG para sustraer el fago de enlace a huIgG. Para .ciertos otros linajes, se agregó proteína MIO (que enlaza a Fe humano) para bloquear el fago de biblioteca Al ce enlace al epítopo MIO de huFGFRlc-Fc durante las etapas de incubación de enlace al fago. Tres rondas de inmunoadsorción se condujeron con una concentración objetivo constante de 50 nM para algunos linajes. Otros linajes emplean una disminución de cinco veces en concentración objetivo (por ejemplo, 50 nM para la Ronda 1, 10 nM para la Ronda 2 y 2 nM para la Ronda 3) cada ronda. 2. Recubrimiento de be a-klotho humana recombinante objetivo A. Recubrimiento de placas: Cinco o seis pozos para cada biblioteca (Al, 1AJJ, DSL, y LNR) usadas en la inmunoadsorción se recubrieron directamente con 50 nM o 100 nM (Ronda 1) de beta-klotho humana recombinante (rhp-klotho) diluida en TBS[pH 7.5]/CaCl2 2 mM (100 pL de volumen/pozo total) durante 1-2 horas con agitación a temperatura ambiente. Además, un pozo/biblioteca de control negativo se incubó con TBS[pH 7.5]/CaCl2 2 mM únicamente. Para ciertos linajes de inmunoadsorción, un anticuerpo de etiqueta anti-HIS se recubrió primero en las. placas, seguido por rhp-klotho etiquetado HIS, para presentar el objetivo por medio del anticuerpo. Para ciertos linajes seleccionados, los aglutinantes de dominio Fe de inmunoglobulina se sustrajeron de bibliotecas usando Proteina A/FGFRlc-Fc antes de que se aplique a rh ~k.lotho. Para ciertos otros linajes, la Proteina A recubierta en placas se usó para formar complejos compuestos de huFGFRlc-Fc (50 nM) y rh -klotho (250 nM) (Ronda 1); 10 nM/ 25 nM (Ronda 2); y 2 nM/ 5 nM (Ronda 3).

B. Perlas de Recubrimiento: La fusión de ß-Klotho-Fc humana recombinante se inmovilizó en perlas de la Proteina A, perlas Dyax StrepAvidin o en · perlas Invitrogen Talón y se inmunoadsorbieron contra las bibliotecas (Al, 1AJJ, DSL, y LNR) . Para ciertos linajes de inmunoadsorción, los aglutinantes Fe se sustrajeron de bibliotecas usando Proteina A/IgG antes de que se -aplique a rh -klotho mientras que los aglutinantes de Estrepavidina se sustrajeron de bibliotecas usando perlas de Estrepavina. Además, el complejo preformado de huFGFRlc-Fc (50 nM) con rh -klotho-HIS (250 nM) se capturó por 20 uL de perlas de Proteina A y se inmunoadsorbieron contra las bibliotecas Al y 1AJJ. Tres rondas de inmunoadsorción se condujeron con una concentración objetivo constante de 50 nM. para algunos linajes, y ciertos linajes emplean una disminución de cinco veces en la concentración objetivo (por ejemplo, 50 nM para la Ronda 1, 10 nM para la Ronda 2 y 2 nM para la -Ronda 3) cada ronda. 3. Bloqueo A. Placas de Bloqueo: La solución de recubrimiento se removió y los pozos se lavaron una vez con 200 pL/pozo de TBS[pH 7.5]/CaCl2 2 mM. 250 µ?/???? de BSA al 1% (libre de proteasa) en TBS [pH 7.5]/CaCl2 2 mM se agregó e incubó durante 1 hr. A temperatura ambiente con agitación. Los reactivos alternativos (por ejemplo, caseína o leche) puede usarse para bloqueo.

B. Perlas de Bloqueo: La solución de recubrimiento se removió y las perlas se lavaron dos veces con TBS [pH 7.5]/ CaCl2 2 mM. 500 µ? de B.SA al 1% (libre de proteasa) se agregó en TBS [pH 7.5]/CaCl2 2 mM y giró durante 1 hr a temperatura ambiente. Como se anota arriba, puede usarse reactivos de bloqueo alternativos. 4. Lavados A. Lavado de Placas: Los pozos se lavaron tres veces con 200 yL/pozo de TBS [pH 7.5]/CaCl2 2 mM para remover el exceso de obj etivo/bloqueador .

B. Lavado de Perlas : . Las perlas se lavaron tres veces con 1000 uL de TBS[pH 7.5]/CaCl2 2 mM para remover el exceso de ob etivo/bloqueador . Las perlas se permitieron recolectar en un magneto durante unos pocos minutos después de cada lavado para evitar la pérdida de perlas. 5. Adición de fago A. Adición de fago a Placas: Alrededor de 100-1000 equivalentes de biblioteca (bibliotecas basadas en el dominio Al u otras, tal como bibliotecas de fago LNR, DSL, etc.) se agregaron en solución amortiguadora de adición de fago (leche seca sin grasa al 1 /BSA al 0.2% (libre de proteasa) , u otro agente de bloqueo apropiado, en TBS [pH 7.5]/CaCl2 2 mM) e incubaron a temperatura ambiente durante 1-2 hr con agitación. En las rondas 2-3, 25-60 µL total de. fago cosechado se agregó a cada uno de los 5-6 pozos (control negativo + 1) diluido en solución amortiguadora de adición de fago.

B. Adición de fago a Perlas: Alrededor de 100-1000 equivalentes de biblioteca (bibliotecas basadas en el dominio Al u otras, tal como bibliotecas de fago LNR, DSL, etc.) se agregaron en 500 µ? de leche seca sin grasa al 1% + 100 µ? de BSA al 1% (libre de proteasa) en TBS [pH 7.5]/CaCl2 2 mM e incubaron con agitación a temperatura ambiente durante 1-2 hr. En las rondas 2-3, 100 µ?, total de fago cosechado se agregaron a las perlas. 6. Lavados A. Lavado de Placas: Las placas se lavaron 5 hasta 7 veces con 200 µ?/???? de TBS [pH 7.5]/C.aCl22 mM/Tween-20 al 0.1 %.

B. Lavado de Perlas: Las perlas se lavaron 8-12 times con 800 µ? de TBS [pH 7.5]/CaCl2 2 mM/Tween-20 al 0.1%. La resuspensión de perla se facilitó al dispersar solución amortiguadora de¦ lavado directamente en las perlas recolectadas o al pipetear hacia arriba y abajo. Alternativamente, un aparato KingFisher (Thermo LabSystems), o equivalente, se usa para lavado de perla. 7. Elución de fagos A. Elución completa de Placas: 100 µ?/???? de solución amortiguadora de pH bajo [glicina 0.2 M pH 2.0] se agregó, y las placas se incubaron a temperatura ambiente durante 10 min con agitación. Luego, 100 µ? de Tris 1M pH 7.5 se agregó a cada pozo para neutralizar la solución.

B. Elución completa de Perlas: 100 µ? de glicina 0.2 M pH 2.0 se agregó a las perlas, que luego se incubaron a temperatura ambiente (en un estante Eppendorf) durante 10 min con agitación. . Luego, 400 µ1· de Tris 1M pH 7.5 se agregó a cada pozo para neutralizar la solución.

C. .Elución ß infección concomitante: Los fagos se eluyeron por glicina 0.2 pH 2.0 como arriba y luego los fagos restantes se recubrieron usando 200-500 µ?* de células E. coli BlueKan 91 de fase log en OD6oo ~ 0.5-0.8. Las células se agregaron a cada pozo (para placas) o para perlas aspiradas. La infección se permitió procesar durante 30 min a 37°C sin agitación. Después, los volúmenes de 200 pL se agruparon y agregaron a ~ 3-5 mL . de 2xYT/0.2 g/mL de tetraciclina y agitaron durante 15 min a.37°C. 8. Infección: (lo mismo para la Placa y Protocolo de Perla) Un volumen apropiado de E. coli BlueKan K91 de fase log (en 2xYT/40 µg/mL canamicina) se hizo crecer hasta ODéoo ~ 0.5-0.8. Cuando el cultivo alcanza este ODgoo/ se usó ya sea inmediatamente o colocó en hielo antes del uso, aunque el tiempo en hielo se minimizó generalmente.

A. En un tubo cónico estéril de 50 mL, los fagos eluidos se mezclaron con 3 mL de cultivo E. coli BlueKan K91 de fase log e incubaron a 37 °C durante 25 min sin agitación. Los tubos cónicos estériles se cubrieron con cinta AirPore (Qiagen) para facilitar la aeración.

B. Se agregó tetraciclina a una concentración final de 0.2 ug/mL y agitación durante 15 min a 37°C.

C. Una alícuota de 10 µ!? se colocó en muestra para titulación y diluyó en serie 10 veces (10_1 hasta 10"6) en 2xYT, colocó en 8 yL/manchas de dilución (o 70-90 en 2xYT/20 g/ml de placas de tetraciclina e incubó durante la noche a 30°C o 37°C. Estas placas proporcionan colonias sencillas usadas para ELISA de enlace al objetivo de fago.

D. Los cultivos de 3 mL infectados se diluyeron ~10 veces en 50 mL de 2xYT/20 µg/mL de tetraciclina e incubaron con agitación a 30°C durante la noche para saturación. 9. Se usó titulación de fago de entrada en la ronda actual de inmunoadsorción (lo mismo para Flaca y Protocolo de Perlas) A. Se hicieron diluciones en serie 100 veces (10"4 hasta 10" 10) de fago cosechado en 2xYT.

B. Se agregó 100 pL/pozo de un cultivo E. colí BlueKan K91 de fase log en ODgoo 0.5-0.6 a 7 pozo de una placa de polipropileno de 96 pozos.

C. Se agregó 10 \iL de fago diluido a los pozos que contienen 100 pL de E. 'coli BlueKan K91.

D. Se incubaron mezclas de fago/célula a 37 °C durante 25 min sin agitación, y las placas se cubrieron con cinta AirPore (Qiagen) para permitir la aeración.

E. Se agregó tetraciclina a una concentración final de 0.2 Ug/mL y la placa se' agitó durante 15 min a 37°C.

F. 8 µ?- de cada dilución (10~4 hasta 10~10) se colocó en placa en un placa seca de agar 2xYT/20 pg/mL de tetraciclina.

G. Las placas se incubaron a 30°C o 37 °C durante la noche. 10. Fago cosechado (lo mismo para la Placa y Protocolos de Perla) A. Se centrifugaron los cultivos durante la noche a 6500 o 6800 rpm en tubos de 50 mL desechables durante 15 min para células peletizadas.

B. Se realizó un procedimiento de precipitación de fago de PEG/NaCl estándar' al agregar 1/5 volúmenes de una solución madre se PEG al 20%/NaCl al 15% para cultivar el sobrenadante. Se mezcló bien al invertir e incubar repetidamente en hielo durante 45 min hasta 1 hr.

C. El cultivo se centrifugó a 6500 o 6800 rpm durante 40 min al fago peletizado y el sobrenadante se descarto.

D. El peletizado de fago se volvió a suspender en 1 mL de TBS [pH 7.5]/CaCl2 2 mM, transfirió a un tubo Eppendorf y centrifugo a 13K rpm durante al menos 2 min al insoluble material peletizado.

E. El sobrenadante se transfirió a un tubo fresco y se agregó 1/5 volúmenes de PEG/NaCl, mezcló e incubó en hielo durante ~ 5-20 min.

F. La mezcla luego se centrifugó a 13,000 rpm durante al menos 2 min, y el sobrenadante se removió. El fago purificado, peletizado se volvió a suspender en aproximadamente 1 mL de TBS [pH 7.5]/CaCl2 2mM y almacenó a 4°C.

Los monómeros identificados como enlace a FGFRlc se muestran en la Figura 10, y los monómeros identificados como enlace a ß-Klotho se muestran en la Figura 11.

II . Inmunoadsorción de la ronda 2 y ronda 3 En general, las condiciones de inmunoadsorción de la 2a y 3a ronda fueron las mismas como en la Ronda 1 descrita arriba, excepto que los objetivos recubiertos fueron ya sea mantenidos en la concentración de partida (por ejemplo, 50 nM) , o la concentración objetivo se disminuyó aproximadamente 2 hasta 5 veces para cada ronda posterior, y las placas (o perlas) se lavaron aproximadamente 2-4 veces adicionales en cada ronda posterior de inmunoadsorción.

III. Optimización de monómeros anti-FGFRlc a través de mutagénesis e inmunoadsorción de despliegue de fagos Las bibliotecas de mutagénesis se construyeron con base en los monómeros anti-FGFRlc M03, M23 y M33 cuyas secuencias respectivas (SEQ ID NOS 287, 290 y 292, respectivamente, en orden de aparición) son como siguen: Tabla 3 Los cebadores usados para bibliotecas de mutagénesis se enlistan en la siguiente tabla (SEQ ID NOS 451-460, respectivamente, en orden, de aparición) donde un cebador 5'-de rescate común se diseñó para todas las bibliotecas junto con un cebador 3' -de rescate único para cada biblioteca. Las letras mayúsculas representan bases fijas, mientras que las letras minúsculas representan mezclas de bases en una proporción de de 0.85:0.05:0.05:0.05 (por ejemplo, a' indica una mezcla de 0.85A, 0.05T, 0.05G, y 0.05C).

Tabla 4 Las bibliotecas de mutagénesis se construyeron como sigue. Los oligonucleótidos mutagénicos 'DEL' y ' INV para cada monómero se combinaron en sus pares de bases por . medio de un traslape de 9 pares de bases (tgcgacggc) (SEQ ID NO: 461) a 30-31°C y extendieron para crear ADN de hebra doble por extensión de PCR usando polimerasa LA Taq (Takara) . Los insertos de biblioteca ensamblados se amplificaron por un par de cebadores 5' /3' "de rescate", purificados por columnas (Qiagen) , y digeridos por Sfil y Xmal (NEB) . Los insertos de biblioteca digeridos se purificaron en gel y ligaron en vector fUSE5HA digerido por Sfil/Xmal. El vector fUSE5HA ligado se purificó por etanol o precipitación de isopropanol, y se electroporó en células electrocompetentes EC100 (Epicentre Technologies). Las células electroporadas se hicieron crecer durante la noche y el fago se cosechó para uso en la inmunoadsorción.

El protocolo de inmunoadsorción fue esencialmente como se describe arriba pero con cambios. huFGFRlc se recubrió en placas o perlas de Proteína A en 2 o 20 nM (Ronda 1); 0.1, 0.5 o 5 nM (Ronda 2); 0.02, 0.1 o 1 nM (Ronda 3). Después de la incubación del fago con el objetivo, -las placas o perlas se lavaron 7X, 9X, o 13X. Algunas inmunoadsorciones tienen 11X lavados a 37 °C, o las inmunoadsorciones fueron en la presencia de 10X o 500X exceso molar de proteína de enlace de monómero precursor purificada.

IV. Optimización de monómeros anti-rhp-klotho a través de mutagenesis e inmunoadsorción de fagos Las bibliotecas de mutagénesis se construyeron con base en monómeros anti-rhp^klotho M01, M25, M42, y M50 cuyas secuencias respectivas (SEQ ID NOS 462-463 y 305-306, respectivamente, en orden de aparición) fueron como sigue: CLPDEFQCGSGRCI PQTWVCDGLNDCGDGSDESPAHCSQDPEFHKVSL SEQ ID NO: 462 CRSSQFQCNNGHCLSPTWVCDGYDDCEDGSDEANCPTHTSL SEQ ID NO: 463 CQPDEFTCSSGRCI PQPWLCDGLNDCGDGSDEPPAHCSAPASEPPGSL SEQ ID NO: 305 CHSFNQFECRNGQCIPLHLVCDGVPDCGDNSDETDCGDSHILPFSTPGPST SEQ ID NO: 306 Tabla 5 La construcción fue esencialmente la misma como se describe para bibliotecas de mutagénesis FGFRlc. Las secuencias de cebador se muestran en la siguiente tabla (SEQ ID NOS 466-478, respectivamente, en orden de aparición) donde las letras mayúsculas representan bases fijas, mientras que las letras inferiores representan, mezclas de bases en una proporción de 0.91:0.03:0.03:0.03 (por ejemplo, "a" indica una mezcla de 0.91A, 0.03T, 0.03G, y 0.03C).

Tabla 6 Los oligonucleótidos "DEL" y "INV" para cada monómero se usaron para construir cada biblioteca, como se describe para bibliotecas de mutagénesis FGFRlc.

El protocolo de inmunoadsorción fue esencialmente como se describe arriba pero con los siguientes cambios: rh -klotho y beta-klotho de murino recombinante (mup-klotho) se recuberiron en 2 nM y 10 n (Ronda 1); 3.3 nM y 0.67 nM (Ronda 2 y 3) . En ciertos linajes, el objetivo fue rh -klotho en las Rondas 1-3; rmup-klotho en las Rondas 1-3; rhp-klotho (Ronda 1), rmup-klotho (Ronda 2), luego rhp-klotho (Ronda 3). El número de lavados fue 7, 9 y 11 veces, respectivamente, para la Ronda 1, 2 y 3.

La Figura 13 muestra las secuencias de monómeros de enlace a ß-Klotho generados usando, este método.

V. Optimización de monómeros anti-rl^-klotho a través del dominio encaminado para crear dimeros Dos conjuntos de bibliotecas de "dimero encaminado" se construyeron. El conjunto 1 contiene monómeros de semilla 01, M02, M08, 21 y M42 (SEQ ID NOS 304, 480, 694, 481 y 305, respectivamente, en la siguiente tabla; los 'monómeros de punta' que inducen señal incrementada arriba de la señal inicial total en ensayos AlphaScreen) , y el conjunto 2 contiene monómeros se semilla. M06, 46 y M50 (SEQ ID NOS 483-484 y 306, respectivamente, en la siguiente tabla; los monómeros 'sin punta' que no varían la señal de la señal inicial total en ensayos AlphaScreen) . Las secuencias de aminoácidos de estos monómeros son como siguen: Tabla 7 Cada conjunto de monómeros se fusionó a una biblioteca de proteina de enlace' intacta (por ejemplo, biblioteca de dominio Al) en ya. sea terminal N o terminal C para construir "bibliotecas encaminadas/de encaminado", que son bibliotecas de dimero que comprenden de ya sea los monómeros del Conjunto 1 o Conjunto 2 fusionados a una biblioteca de dominio Al intacto. Estas bibliotecas se construyeron de la siguiente manera. PCR se usó para amplificarse, en dos reacciones separadas: a) las secuencias de codificaion de los monómeros seleccionados con pETF (ACCCGTATGATGTTCCGGATTA; (SEQ ID NO: 486) /pETB2r (GATGTATTCGGCCCCAGA GGCCTGCAATGAC; SEQ ID NO: 487) ; y b) las secuencias de codificación de monómeros intactos en una biblioteca de monómeros con 21newl (gaaattcacctcgaaagcaa; (SEQ ID NO: 488) /23 (atgggttcctattgggct; SEQ ID NO: 489). Los productos -200 bp se aislaron de un gel de agarosa al 2-3% y purificaron con columnas de giro Qiagen QIAquick. Cada producto de (a) y (b) de arriba se digirió con ya sea BsrDI o Bpml (NEB) en reacciones separadas. Los monómeros digeridos por Bpml tienen un saliente que puede ligarse a monómeros digeridos por BsrDI. Los productos de digestión purificados se ligaron uno con el ótro usando ligasa de ADN T4 (NEB) . La ligación de monómeros intactos de corte BsrDI con monómeros seleccionados de corte. Bpml genera una biblioteca de dimero de encaminado que comprende de monómeros intactos de terminal N fusionados a monómeros seleccionados de terminal C (del conjunto 1 o 2) . La ligación de monómeros intactos de corte Bpml con monómeros seleccionados de corte BsrDI genera una biblioteca de dimero de encaminado que comprende monómeros intactos de terminal C fusionados a la monómeros seleccionados de terminal N (del conjunto 1 o 2) . Los cebadores pETF/pETB2r se usaron . para amplificar por PCR el dimero ligado de la ligación, y los productos purificados se digirieron con Sfil · seguido por Xmal. Los productos digeridos se ligaron al vector fUSE5HA de fago para la generación de una "biblioteca encaminada/de encaminado" de dimero de despliegue de fagos, típicamente con 108-109 miembros únicos.

El protocolo de inmunoadsorción fue esencialmente como se describe arriba pero con cambios, rh^-klotho se recubrió en 10 nM y 2 nM (Ronda 1); 3/3 nM y 0.67 nM (Ronda 2); 1.1 nM y 0.22 nM (Ronda 3). El número de lavados fue 7, 9 y 11 veces, respectivamente, para la Ronda 1, 2 y 3.

La Figura 14 muestra las secuencias de multímeros de enlace ß-Klotho generados usando el método de dímeros encaminados .

VI. Análisis de producción de inmunoadsorción (lo mismo para placa y protolocos de perla) ELISAs de fago: Para cada "grupo de fago" de salida a analizarse (típicamente Rondas 2, 3 y 4, si es aplicable), los cultivos de clones independientes se inocularon en 1 mL (2xYT/ 20 µg/mL de te'traciclina ) crecen en placas de pozo profundo de polipropileno de 96 pozos Costar. Las puntas inoculadas se dejaron en, y las placas se agitaron durante la noche a 37°C. Las células se peletizaron por centrifugación a 3600 rpm durante 15 min. Los sobrenadantes de cultivo se mantuvieron y los ELISAs se realizaron como se describen a continuación.

Las proteínas objetivo (hFGFRlc o ?ß??????) diluidas a 20 nM en TBS [pH 7.5]/ CaCl2 2 mM se recubren directamente a 100 µ?/???? en placas Nunc Maxisorp de 96 pozos. Para cada clon de fago, un pozo sin objetivo también se recubrió usando 100 uL/pozo TBS [pH 7.5]/ CaCl2 2 mM solo. Las placas se incubaron O/N a 4°C o 1.5 hrs a temperatura ambiente con agitación. Las placas se vaciaron y los pozos se bloquearon con 200 pL/pozo de BSA al 1% (fracción V) /TBS [pH 7.5]/ CaCl2 2 mM e incubaron a TA durante 1 hr con agitación. Las placas luego se lavaron tres veces con TBS [pH 7.5]/CaCl2 1 mM. Después, 40 µ?^ de cada sobrenadante de 'fago se agregó a pozos en la presencia de 60 µ?, de BSA¦ al 0.2%/[pH 7.5]/CaCl2 2 m /Tween-20 al 0.02%. Las placas recubiertas se incubaron a TA durante 1.5 hr con agitación. ¦ Las placas se lavaron tres veces con TBS [pH 7.5]/CaCl2 1 mM/Tween-20 al 0.02%. ¦ Después, 100 L/pozo de anticuerpo monoclonal (X-M13-HRP (Amersham Pharmacia), diluido 1:5000 en TBS [pH 7.5]/CaCl2 2 mM + Tween-20 al 0.02%, se agregó. Las placas se incubaron a .temperatura ambiente durante 1 hr con agitación. Las placas se lavaron tres veces con TBS [pH 7.5]/CaCl2 2 mM/Tween-20 al 0.02%. 100 µ?/???? de mezcla TMB/H202 (Pierce) , diluido 1:1, se agregó para desarrollo de ELISA. Las reacciones se permitieron volverse azul hasta las señales ODÉSO más fuertes alcanzan ~ 1.0. La reacción se detuvo con 100 L/pozo H2S04 2N, y pozos positivos cambiados en color de azul a amarillo. Una vez que la reacción se detuvo, se leyó a OD450 en un lector de placa ELISA usando software SoftMaxPro.

Los grupos de fago positivos ELISA de fago se eligieron para subclonarse en un vector de expresión si ^tienen (a) una frecuencia alta de clones de fago individuales que enlazan a hFGFRlc o hbKlotho y (b) diversidad de secuencia alta entre los clones de fago positivos de enlace. Los grupos que cumplen este criterio se eligieron para selección de proteina en el proceso resumido a- continuación. Para subclonar la secuencia de monómero o multimero de un grupo de fago dado en el vector de expresión, pEve, aproximadamente 108-1010 de fago se amplificaron por 25 ciclos- de PCR como sigue: Fórmula PCR 0.5 - 1 pL de fago purificado 5 µ? 10X de solución amortiguadora 8 pL de dNTPs 2.5mM 5 pL de cebador VS-For lOu 5' -ATCATCTGGCCGGTCCGGCCTACCCGTATGATGTTCCGGA-3' ; (SEQ ID NO: 490) 5 pL cebador EveNut lOuM 5' -AAAAGGCCCCAGAGGCCTTCTGCAATGAC-3' ; (SEQ ID NO: 491) 26 pL de H20 0.5 µ?_ de polimerasa LA Taq (1 unidad) (Takara) Ciclos: 25 X [ 94 °C/10seg . , -45 °C/30seg . , -72 °C/30seg . ] Los productos PCR se corrieron en un gel de agarosa al 2% para análisis. El producto de monómero o multimero (aproximadamente 200 bp) se purificó con una columna de giro QIAquick (Qiagen) , digerida con Sfi I (NEB) , purificada de nuevo con una columna QIAquick y luego ligada usando Ligasa de ADN T4 (NEB) al vector digerido. Sfi I, pEve . La ligación se transformó en E. coli BL21 de electrocompetente (DE3) y colocó en placas en placas 2xYT que contienen canamicina en 40 pg/mL. Después del crecimiento durante la noche, aproximadamente 3000-6000 clones individuales se inocularon en 2xYT/canamicina y se hicieron crecer durante la noche. Los controles positivos y negativos también se incluyeron en las placas.

VII . Selección de miles de proteínas de monómero en Usados celulares de 1 mL Producción de proteina de 1 mL de lisados calentados (Dia 1) : Los clones individuales se inocularon en pozos de una placa de pozo profundo Costar de 96 pozos que contienen 500 yL/pozo de 2xYT/40 pg/mL de canamicina. Los cultivos se hicieron crecer durante la noche (las puntas inoculadas se dejaron en los pozos) mientras se agita en 300 rpm a 37°C. Este proceso permite seleccionar miles de monómeros parcialmente purificados, individuales en el nivel del lisado celular.

(Dia 2) 100 L de cultivo durante la noche se inoculó en una placa de pozo profundo Costar de 96 pozos nueva que contiene 1 mL/pozo de 2xYT/40 yg/mL de canamicina + CaCl2 1 mM. (El cultivo restante durante la noche se archivó por la adición de concentración de glicerol final al 25% y luego almacenaron a -80°C para último uso.) Las placas se cubrieron con Cinta AirPore (Qiagen) y los cultivos se hicieron crecer con agitación en 300 rpm a 37 °C hasta que unh OD6oo de ~ 0.8 hasta 1.0 se alcanzó. Una vez que se alcanzó el OD60o deseado, loscultivos se indujeron con IPTG 1 mM durante 3 hr mientras se agita en 375 rpm a 37°C. Las placas que contienen cultivos ¦ inducidos luego se centrifugaron durante 15 min en 3600 rpm a 4°C para células de peletizado. El sobrenadante se removió y descartó, y el peletizado celular restante se volvió a suspender en 100 de TBS [pH 7.5]/CaCl2 1 mM. Las células resuspendidas se transfirieron de la placa de pozo profundo de 96 pozos a una placa PCR de polipropileno de 96 pozos y calentaron durante 5 min a 65°C en una maquina PCR. Las células calentadas/lisadas luego se centrifugaron durante 15 min en 3600 rpm a 4°C. Después de la centrifugación, la producción de proteina se completó, y los Usados de proteina se leyeron para caracterización en una selección primaria por medio de ELISA de enlace y/o ensatos AlphaScreen de competencia.

ELISA de Proteína FGFRlc y ß-Klotho: Las placas Maxisorp de 96 pozos se recubrieron con 100 L/pozo de huFGFRlc/Fc 20 nM o hupKlotho-His 20 nM diluido en TBS [pH 7.5]/CaCl2 1 mM, y la placa recubierta se incubó a 4°C durante la noche o temperatura ambiente (TA) durante 1.5 hr con agitación. Para proteínas de enlace que comprenden un dominio de monómero antihuIgG, huFGFRlc-His se recubrió en lugar de huFGF-Fc.

Los pozos se vaciaron y luego bloquearon con 200 uL/pozo de BSA al 1% (fracción V) TBS [pH7.5 ] /CaCl2 1 mM. La placa recubierta se incubó a TA durante 1 hr con agitación. La placa se lavó tres veces con TBS [pH 7.5]/CaCl2 1 mM. La proteina de preparaciones de lisado de 1 mL se agregó a los pozos como una concent-ración de punto sencillo idluida 1:10 en TBS [pH 7.5]/CaCl2 1 mM/BSA al 0. l%/Tween-20 al 0.02% a un volumen final de 100 pL por pozo. Para proteínas purificadas en Ni/Q,- una curva de titulación inicia en 1-3 µ? y se diluye en serie en TBS [pH 7.5]/CaCl2 1 mM/BSA al 0. l%/Tween-20 al 0.02% 1:3 para monómeros o . 1:4 para monómeros mutantes o dimeros encaminados para 12 pts., último punto sin proteína, se agregó en 100 uL/pozo para la placa. Las placas recubiertas se incubaron a TA durante 1.5 hr con agitación. La placa se lavó tres veces con TBS [pH 7.5]/CaCl2 1 mM/Twéen-20 al 0.02%. Se agregó 100 uL/pozo de anticuerpo de detección anti-HA-HRP (Roche/12013819001) diluido 1:2000 en TBS [pH 7.5]/CaCl2 1 mM/BSA al 0. l%/Tween-20 al 0.02%. Las placas recubiertas se incubaron a TA durante 1 hr con agitación. La placa se lavó tres veces con TBS [pH 7.5]/CaCl2 1 mM/Tween-20 alo 0.02%. Se agregó 100 µL/pozo de mezcla TMB/H2S04 diluida 1:1. El color se permitió volverse azul hasta que OD650 de las señales más fuertes alcanzan ~ 1.0. La reacción se detuvo con 100 L/pozo de H2S04 2N. Una vez que se detuvo, la placa' se leyó en el lector de placa ELISA en OD450 usando software SoftMaxPro.

Ensayo de enlace AlphaScreen de proteína Fe del receptor: Todos los componentes del ensayo se diluyeron en solución amortiguadora AlphaScreen: HEPES 40 mM [pH 7.4] p/NaOH, CaCl2 1 mM, BSA al 0.1 % (p/v) , Tween-20 al 0.05%, NaCl 100 mM. Tres adiciones se hicieron con una placa ensayo de microtitulación Greiner, de volumen reducido, de 384 pozos, blanco sin tiempo de incubación entre las adiciones. El volumen final de ensayo fue 6 \i . Primero, se agregó 2 pL de una dilución 1:50 de proteína de preparaciones de lisado de 1 mL a la placa (1:150 dilución de ensayo final.) Para proteína purificada pór Ni/Q, 2. pL/pozo de una curva de titulación inicia en 1 µ? final y diluida 1:3 para 12 pts., último punto sin proteína, se agregó a la placa. En segundo lugar, 2 pL/pozo . de hFGFRlc/Fc en 9 nM (concentración de ensayo final 3 nM) se agregó a la placa. Alternativamente, 2 pL/pozo de objetivo de miembros de la familia-Fc en 9 nM (concentración de ensayo final 3 nM) se agregó a la placa. Para mutagénesis de monómero, las concentraciones Fe objetivo se redujeron 6X, para concentración de ensayo final 0.5 nM. Se nota que el resto del ensayo se hizo en luz filtrada verde o suave ya que las perlas AlphaScreen son sensibles a la luz.

En tercera, 2 µ?,/???? de una mezcla de biotina-rata-antiHA Ab (clon 3F10, Roche/12 158 167 001) en 3 nM (concentración final 1 nM) y "perlas donadoras" de Estreptavidina AlphaScreen y "perlas aceptoras" de Proteina A ( PerkinElmer/6760617M) ambas diluidas para 40 pg/mL (10 pg/mL de concentración de ensayo final) se agregó a la placa, como se muestra en la Figura' 17. La placa de ensayo luego se recubrió con sello superior y .centrifugó durante ~ 1 min. en 800 rpm. La placa luego se incubó durante la noche en la oscuridad temperatura ambiente y leyó el dia siguiente en el lector de placa de fusión (PerkinElmer) .

Ensayo de Enlace AlphaScreen de Proteina Objetivo de Biotina: Todos los componentes de ensayo se diluyeron en solución amortiguadora AlphaScreen: HEPES 40 mM ' [pH 7.4] p/ NaOH, CaCl2 1 mM, BSA al 0.1% (p/v) , Tween-20 al 0.05 %, NaCl 100 mM. Tres adiciones se hicieron con una placa de ensayo de microtitulacion Greiner, de volumen reducido, de 384 pozos, blanca sin tiempo de incubación entre las adiciones. El volumen final de ensayo fue 6 L. Primero, 2 L de una dilución 1:50 de proteina de preparaciones de lisado de 1 mL se agregó a la placa (1:150 dilución de ensayo final.) Para proteina purificada Ni/Q, 2 uL/pozo de una curva de titulación iniciando en 1 uM final y diluida 1:3 para 12 pts., último punto sin proteina, se agregó a la placa. En segundo lugar, 2 pL/pozo de biotina-bKlotho-His en 15 n (concentración de ensayo final 5 nM) se agregó a la placa. Alternativamente, 2 µ?,/???? de biotina objetivo del miembros de la familia en 15 nM (concentración de ensayo final 5 nM) se agregó a la placa. El resto del ensayo se hizo en luz filtrada verde o tenue ya que las perlas AlphaScreen son sensibles a la luz. En tercero, 2 pL/pozo de una mezcla de rata-antiHA Ab (clon 3F10, Roche/11 867 431 001) en 6 nM (concentración final 2 nM) y Estreptavidina deAlphaScreen "perlas donadoras" y antimuIgG "perlas aceptoras" (PerkinElmer/6760606M) ambas diluidas a 40 ug/mL (10 pg/mL concentración de ensayo final) se agregó a la placa, como se muestra en la Figura 18. La placa de ensayo luego se recubrió con sello superior y centrifugó durante ~ 1 min. a 800 rpm. La placa luego se incubó durante la noche en la oscuridad a temperatura ambiente y leyó el dia siguiente en el lector de Placa de Fusión ( PerkinElmer ) .

Ensayo de Inhibición Independiente del Ligando AlphaScreen: Todos los componentes de ensayo se diluyeron en solución amortiguadora de AlphaScreen: HEPES 40 mM [pH 7.4] p/NaOH, CaCl2 1 mM, BSA al 0.1 % (p/v) , Tween-20 al 0.05 %, NaCl 100 mM. Se hicieron tres adiciones a una placa de ensayo de microtitulación Greiner, de volumen reducido, de 384 pozos, blanca sin tiempo de incubación entre las adiciones. El volumen final de ensayo fue 6 L. Primero, 2 L de una dilución 1:5 de proteína de preparaciones de lisado de 1 mL se agregó a la placa (1:15 dilución de ensayo final.) Para proteína purificada por Ni/Q, 2..pL/pozo de una curva de titulación inicia en 1 uM' final y diluida 1:3 para 12 pts., el último punto sin proteína, se agregó a la placa. En segundo lugar, 2 pL/pozo de biotina- Klotho-His en 15 nM (concentración de ensayo final 5 nM) se agregó a la placa. Se nota que el resto del ensayo se hizo en luz filtrada verde 0 tenue ya que las perlas AlphaScreen son sensibles a la luz. En tercero, 2 pL/pozo de una mezcla de hFGFRlc/Fc en 90 nM (concentración final 30 nM) y Estreptavidina deAlphaScreen "perlas donadoras" y Proteína A "perlas aceptoras" (PerkinElmer/6760617M) ambas diluidas a 40 pg/mL (10 pg/mL concentración de ensayo final) se agregó a la placa, como se muestra en la Figura 19. Alternativamente, 2 uL/pozo hFGFR4/Fc en 15 nM (concentración final 5 nM) y AlphaScreen (misma dilución como arriba) se agregó a la placa. La placa de ensayo luego se recubrió con topseal y centrifugó durante 1 min. en 800 rpm. La placa luego se incubó durante la noche en la oscuridad a temperatura . ambiente y leyó el día siguiente en el lector de Placa de Fusión ( PerkinElmer) .

Ensayo de Inhibición Dependiente del Ligando AlphaScreen: Todos los componentes de ensayo se diluyeron en solución amortiguadora de AlphaScreen: HEPES 40 mM [pH 7.4] p/ NaOH, CaCl2 1 mM, BSA 0.1 % (p/v) , Twéen-20 0.05 %, NaCl 100 mM. Se hicieron tres adiciones a una placa de ensayo de microtitulación Greiner, de volumen reducido, de 384 pozos, blanca sin tiempo de incubación entre las adiciones. El volumen final de ensayo fue 8 pL. Primero, 2 L de proteina de preparaciones de lisado no diluidas de 1 mL se agregó a la placa (1:4 dilución de ensayo final.) Para proteina purificada por Ni/Q, 2 pL/pozo de una curva de titulación inicia en 1 uM final y diluida 1:3 para 12 pts., el último punto sin proteina, se agregó a la placa. Para un control positivo, una curva de titulación de huFGF21 no etiquetado inicia en 1 uM final y diluida 1:3 para 12 pts., el último punto sin ligando se agregó en 2 L/pozo a la placa.] En segundo lugar, 4 µ?,/???? de una mezcla de hubKlotho-His (o mubKlotho-His ) en 80 nM (concentración de ensayo final 40 nM) y huFGFRlc/Fc en 60 nM (concentración de ensayo final 30 nM) se agregó a la placa. Alternativamente, 4 L/pozo de una mezcla de hubKlotho-His (o mubKlotho-His) en 14 nM (concentración de ensayo final 7 nM) y huFGFR4/Fc en 10 nM (concentración de ensayo final 5 nM) se agregó a la placa.

El resto del ensayo se' hizo en luz filtrada verde o tenue ya que las perlas AlphaScreen son sensibles a la luz. En tercero, 2 L/pozo de una mezcla de biotina-huFGF21 en 28 nM (concentración final 7 nM) y Estreptavidina deAlphaScreen "perlas donadoras" y Proteina A "perlas aceptoras" (PerkinElmer/6760617M) ambas diluidas a 40 µq/mL (10 µ?/p?]., concentración de ensayo final) se agregó a la placa, como se muestra en la Figura 20. La placa de ensayo luego se recubrió con topseal y centrifugó, durante ~ 1 min. en 800 rpm. La placa luego se incubó durante la noche en la oscuridad a temperatura ambiente y leyó el día siguiente en el lector de Placa de Fusión ( PerkinElme ) .

Ensayo de Inhibición . Dependiente del Ligando AlphaScreen (para proteínas de enlace que comprenden un dominio de vida media de monómero antihuIgG) : Todos los componentes de ensayo se diluyeron en solución amortiguadora de AlphaScreen: HEPES 40 mM [pH 7.4] p/ NaOH, CaCl2 1 mM, BSA al 0.1 % (p/v) , Tween-20 al 0.05 %, NaCl 100 mM. ' Se hicieron tres adiciones a una placa de ensayo de microtitulación Greiner, de volumen reducido, de 384 pozos, blanca sin tiempo de incubación entre las adiciones. El volumen final de ensayo fue 8 L. Primero, 2 µL·/pozo de una curva de titulación de proteína de enlace purificada por Ni/Q + dominio de monómero IgG inicia en 1 uM final y diluida 1:3 para 12 pts., el último punto sin proteina, se agregó a la placa. Para un control positivo, una curva de titulación de huFGF21 no etiquetado inicia en 1 µ? y diluida 1:3 para 12 pts., el último punto sin ligando se agregó en 2 pL/pozo a la placa. En segundo lugar, 4 uL/pozo de una mezcla de hubKlotho-His (o mubKlotho-His) en 80 nM (concentración de ensayo final 40 nM) y huFGFRlc-His en 60 nM (concentración de ensayo final 30 nM) se agregó a la placa. Alternativamente, 4 L/pozo de una mezcla de hubKlotho-His (o mubKlotho-His) en 14. nM (concentración de ensayo final 7 nM) y huFGFR4-His en 10 nM (concentración de ensayo final 5 nM) se agregó a la placa. El resto del ensayo se hizo en luz filtrada verde o tenue ya que las perlas AlphaScreen son sensibles a la luz. En tercero, 2 µ?/???? de una mezcla de biotina-huFGF21 en 28 nM (concentración final 7 nM) y Estreptavidina deAlphaScreen "perlas donadoras" y quelado de níquel "perlas aceptoras" (PerkinElmer/6760619M) ambas diluidas a 40 pg/mL (10 ug/mL de concentración de ensayo final) se agregó a la placa, como se muestra en la Figura 21. La placa de ensayo luego se recubrió con topseal y centrifugó durante ~ 1 min. en 800 rpm. La placa luego se incubó durante la noche en la oscuridad a temperatura ambiente y leyó el día siguiente en el lector de Placa de Fusión ( PerkinElmer ) .

VIII. Multimerización y recombinación de monómeros seleccionados de despliegue de fagos Los monómeros que se succionaron en pEve (pEve/monómero) se multimizaron en una de las dos siguientes formas. Los plássmidos de pEve/monómero (individualmente o en grupos) se digirieron con ya sea BsrDI o Bpml (NEB) . Los fragmentos ~1.1 kb BsrDI y ~2.9 Bpml se aislaron de geles de agarosa al 1% y purificaron con columnas de giro Qiagen QIAquick. Los grupos de cada uno de los dos fragmentos se ligaron usando ligasa de ADN T4 ' (NEB) ; posteriormente, la ligación se purificó con una columna de giro Qiagen QIAquick. Usando los cebadores VS-For y EveNut descritos en la sección de subclonacion de fago de arriba, las secuencias que codifican multimero fueron amplificadas por PCR de la ligación. Los productos PCR se purificaron y digirieron con Sfil (NEB) , seguido por ligación con pEve y transformación de BL21 (DE3) E. colí. El otro' método para generar multimeros es amplificar los monómeros de plásmidos pEve/monómero (individualmente o en grupos) con los cebadores VS-For y EveNut como se describen arriba. Los monómeros amplificados se purificaron, digeridos con ya sea BsrDI o Bpml (NEB) , y ligados para crear multimeros. Los productos ligados se amplificaron con cebadores VS-For y EveNut, seguido por purificación, digestión con Sfil, ligación con vector pEVE y transformación en E. coli BL21 (DE3) . Los productos PCR se purificaron y digirieron con Sfil (NEB) , seguido por ligación con pEve y transformación de E. coli BL21 (DE3) . Este método crea dimeros que comprenden de combinaciones diferentes de los monómeros de partida. Este método también puede usarse para generar otros multimeros, tal como trímeros. Cuando se hacen trímeros, los grupos de pEve/dímeros y pEve/monómeros son los materiales de partida. Se procesan como arriba. Un procedimiento de biología molecular similar a aquel descrito debajo para hacer "bibliotecas encaminadas" también, se usó para generar multimeros. En todos los casos, las proteínas se expresaron, purificaron y seleccionaron como arriba.

Las bibliotecas adicionales,' referidas como "bibliotecas encaminadas," se generaron al ligar monómeros seleccionados por despliegue de fagos (es decir, monómeros seleccionados) con la representación completa de una biblioteca de monómeros intacto. Estas bibliotecas se construyeron de la siguiente manera. El PCR se usó para amplificarse en dos reacciones separadas: a) las secuencias de codificación de los monómeros seleccionados con pETF (ACCCGTATGATGTTCCGGATTA; SEQ ID NO: 486) /pETB2r (GATGTATTCGGCCCCAGA GGCCTGCAATGAC ; SEQ ID NO: 487) ; y b) las ???µ?????e de codificación de monómeros intactos en una. biblioteca de monómeros con 21newl (gaaattcacctcgaaagcaa; SEQ ID NO: 488) /23 (atgggttcctattgggct; SEQ ID NO: 489) . Los productos de -200 bp se aislaron de un gel de agarosa al 3% y purificaron con columnas de giro Qiagen QIAquick. Cada producto de (a) y (b) de arriba se digirió con ya sea BsrDI o Bpml (NEB) en reacciones separadas. Los monómeros digeridos con Bpml tienen una saliente que puede ligarse a monómeros digeridos por BsrDI. Los productos de digestión purificados se ligaron uno con el otro usando ligasa de ADN T4 (NEB) . La ligación de monómeros intactos ¦ de . corte BsrDI con monómeros seleccionados de corte Bpml genera una biblioteca de dimero encaminada que comprende de monómeros intactos de terminal N fusionados a monómeros seleccionados de terminal C. La ligación de monómeros intactos de corte Bpml con monómeros seleccionados . de corte BsrDI genera una biblioteca de dimero encaminada que comprende de monómeros intactos de terminal C fusionados a monómeros seleccionados de terminal N. Los cebadores pETF/pETB2r se usaron para amplificar por PCR las secuencias de codificación de dimero ligado de la ligación, y los productos purificados se digirieron con Sfil seguido por Xmal. Los productos digeridos se ligaron al vector ÍUSE5HA de fago par la generación de una "biblioteca encaminada" de dimero de despliegue de fagos, típicamente con 108-109 miembros únicos Una "biblioteca encaminada" de trímero (o multímero más grande puede generarse en una forma similar, excepto que los materiales de partida son dímeros (o más grandes) y monomeros intactos. Las bibliotecas encaminadas se inmunoadsorbieron contra ß-Klotho y seleccionan como se describen arriba.

IX. Caracterización de monomeros purificados en ensayos de enlace y competencia Una vez que las proteínas se caracterizan en el nivel del lisado de proteína climatizada, los mejores monomeros se eligieron para caracterización adicional. Los cultivos a gran escala de clones individuales se prepararon y los monomeros, que portan una etiqueta 8xHis (SEQ ID NO: 492) , se purificaron por medio de resina Ni-NTA. Estos monomeros purificados por níquel se procesaron por ensayo en ELISAs de enlace y el ensayo de competencia AlphaScreen. Los datos de la secuencia de proteína y datos bioquímicos de caracterización de monomeros purificados son de las Figuras 10-12.

Purificación de Proteína ' de Cultivos de 500 mL para NiNTA: (Día 1) En un tubo de cultivo de 15 mL que contiene 3 mL de 2xYT + 40 g /mL de canamicina, se inoculó la solución madre de glicerol archivada del "pozo de acierto primario" apropiada. El cultivo se agitó durante la noche en 300 rpm a 37°C.

(Día 2) 2 mL de cultivo durante la noche se inoculó en matraz de agitación Erlenmeyer de 1 L que contiene 500 mL de 2xYT + 40 ug/mL de canamicina. Los cultivos se hicieron crecer con agitación en 375 rpm a 37°C hasta que un OD6oo de alrededor de 0.8-1.0 se alcanzó. Una vez que se alcanzó el OD6oo deseado, los cultivos se indujeron con concentración final 1 mM de IPTG durante 3 hr ' aunque con agitación en 375 rpm. Después de 3 hr de inducción, el cultivo de 500 mL se transfirió al tubo Sorvall limpio/autodesdoblado y centrifugó durante 8 min en 8000 rpm a 4°C para células de peletizado.

Una vez que las células se peletizaron, el sobrenadante se removió y descartó,, y 20 mL de solución amortiguadora de lavado/enlace de níquel (Tris 20 M [pH 7.5] /Imidazol 20 mM/NaCl 300 mM/CaCl2 0.2 mM) se agregó a cada tubo. El peletizado se volvió a suspender con 10 mL de pipeta serológica hasta que no fueron visibles los grupos, y luego las células resuspendidas (~ 30 mL). se transíectaron en tubos Oakridge de 35 mL y calentaron en un baño de agua durante 10 min a 80°C para células de lisado. Después del calentamiento, los tubos Oakridge calientes que contienen células lisadas se colocaron en un baño de hielo/agua durante ~ 10 min para enfriamiento. Una vez enfriados, los tubos se centrifugaron durante 30 min en 18,000 rpm a 4°C para células de peletizado.

La resina NiNTA (Qiagen) se lavó con solución amortiguadora de enlace de níquel 3X antes de la adición del lisado de la proteína con objeto de equilibrar la resina. Un total de 1.5 mL de resina NiNTA en solución amortiguadora de lavado/enlace de níquel se agregó al tubo de tapa en rosca de 50 mL limpio apropiadamente etiquetado (con proteína ID) . Después las células lisadas se peletizaron, el sobrenadante de proteína se removió y agregó al tubo de 50 mL que contiene el 1.5 mL de resina NiNTA lavada. La proteína se permitió enlazar a la resina NiNTA al balancear suavemente durante 0.5 horas a temperatura ambiente. Después de la incubación con resina NiNTA, tubos de 50 mL con NiNTA enlazado a la proteína se centrifugó durante 10 min en -1500 rpm. El sobrenadante se vació suavemente y descartó.

La resina NiNTA + proteína de enlace se transfirió a columnas Clontech de 15 mL apropiadamente etiquetadas al agregar 1 mL de solución amortiguadora de lavado/enlace de níquel al tubos de 50 mL que contiene resina, girándolo para resuspender, luego pipetear la mezcla en una columna que se ha montado en un colector al vacío. La resina NiNTA + proteína de enlace se lavó con al menos 10 volúmenes de columna (15 mL) de solución amortiguadora de lavado NiNTA. Las columnas de 15 mL que contienen resina NiNTA + proteína de enlace y lavado se transíectaron a los tubos de recolección de tapa en rosca de 15 mL limpios y 4 mL de solución amortiguadora de elución de Ni (Tris 20 mM [pH 7.5], NaCl 200 mM, CaCl2 0.1 mM, imidazol 200 mM) se agregó a cada columna para eluir completamente la proteina en el tubo de recolección de 15 mL. Luego se permitió para eluir por gravedad.

La proteina eluida se transfirió al cásete "Slide-A-Lyzer" (corte apropiado de PM para monómeros usados en corte de 3.5 kDa y para dimeros y trímeros usados en corte de 10 kDa) usando aguja de calibre 18.5 y jeringa de 5 mL para cargar el cásete. Los casetes con lisador de portaobjetos A que contienen proteínas eluidas se colocaron en solución amortiguadora de diálisis durante la noche que contiene reactivos redox (Tris 20 mM [pH 7.5], NaCl 100 mM, CaCl2 1 mM, 2-mercaptoetanol 1 mM, 2-hidroxietildisulfuro 0.25 mM) .

(Día 3) Casetes Slide-A-lyzer que contienen proteínas dializadas durante la noche se transfirieron en solución amortiguadora de diálisis sin redox (Tris 20 mM [pH 7.5], NaCl 50 mM, CaCl2 1. mM) . Después de 3 hr de diálisis, los casetes Slide-A-lyzer se transfirieron en TBS/CaCl2 fresco sin redox durante otras 3 hr. Después del 2o cambio de diálisis, las proteínas se removieron de casetes Slide-A-lyzer usando aguja de calibre 18.5 y 5 mL de jeringa, y la proteína se transfirió . por filtración usando filtro de jeringa de 0.2 micron en tubo ' de polipropileno de 15 mL apropiadamente etiquetado.- Las proteínas de enlace purificadas, que se seleccionaron como los "mejores agonistas" en ensayos de célula reportera, se purificaron además por intercambio de aiones deQ -Sefarosa pa,ra remover los contaminantes.

Purificación de Q-Sefarosa: 1 mL de Resina de flujo rápido de Q-Sefarosa (Amersham Biosciences) se agregó a columna Clontech de 15 mL. La resina con 15 volúmenes de columna (o 15 mL) de Tris 20 mM [pH 7.5], NaCl 50 mM, CaCl2 1 m se equilibró. 2 mL (~ 5 mg) de proteína purificada NiNTA filtrada se agregó a la resina y la proteína se permitió para enlazar a la resina por gravedad. Se recolectó a través de flujo en la primera columna de la placa de 96 pozos. Las columnas cargadas con .proteína se transfirieron al tubo de recolección de 15 mL y la proteína de resina/enlace se lavó con 10 volúmenes de columna (o 10 mL) de Tris 20 mM [pH 7.5], NaCl 50 mM, CaCl2 1 mM. Una vez que se lavó, la elución de gradiente NaCl de la proteína se inició. La concentración de NaCl se varió en el gradiente como sigue: NaCl 100 mM, 150 mM, 180 mM, 200 mM, 220 mM, 250 mM, para una base de Tris 20 mM [pH 7.5], CaCl2.1 mM. Las fracciones se recolectaron en placa de polipropileno de pozo profundo de 96 pozos de 2 mL/fracción, en incrementos de 1 mL. Las fracciones que contienen proteina se probaron por Bradford y analizaron por SDS PAGE. Las fracciones se probaron en ELISAs de enlace y ensayos de competencia como se describe arriba con el siguiente cambio. La proteina de preparaciones purificadas de NiNTA 500 mL o NiNTA' + preparaciones purificadas de Q-sefarosa se agregó a la placa como una curva de concentración de dos puntos iniciando con una primera dilución 1:5 hasta 1:100 y luego diluciones en serie 1:4 después de eso con el último punto como solución amortiguadora únicamente.

Monómeros de enlace FGFRlc Lo siguiente es un resumen de los monómeros FGFRlc identificados de la inmunoadsorción de la biblioteca Al intacta ( SEQ ID NOS 493-508, 288, 290, 511, 292, 513, 291, 515-517, 289, 519-522, 287 y 524-525, respectivamente, en orden de aparición; ver la Figura 10) : 1 50 M01 CASGQFQCSN GN . CVPQHWV CDGDNDCEDN SDEED.. CGD SHILPFSTPG M24 CGSSEFQCRN SRRCIPPAWV CDGDNDCGDS SDEKS..CGD SHILPFSTPG 39 CVSGQFQCGN GN.CIPRPWR CDGDNDCGDS SDETG.. CGD SHILPFSTPG 36 CVPGQFQCNN GN.CIPVTWL CDGDNDCGDS SDEAP..AHC ETSGP ....

M38 CVSGQFQCGN GN.CIPQAWL CDGDNDCGDS SDEKD..CTT RT M04 CRSRQFQCKG SSTCIPVQWV CDGDNDCGDS SDEAG..CSA PASEPPGSL..

M06 CGAGQFQCRS TNICVSLA R CDGEDDCEDN SDETS..CAT HT M09 CGAGQFTCRS TKICISQAWV CDGVDDCEDN SDEAG.. CGD SHILPFSTPG M12 CGAGQFTCRS TNICLPLQ V CDGVDDCEDN SDEAG..CGD SHILPFSTPG M14 CGANQFTCHN TNlCISLTWV CDGVDDCEDN SDEAG..CGD SHILPFSTPG M26 CGSSQFTCHN TNICLPRARV CDGVDDCEDN SDEAG..CGD SHILPFSTPG M27 CGSSQFTCHN TNICLPRAWV CDGVDDCEDN SDEAG..CGD SHILPFSTPG M13 CGANQFTCHN TNICISLTWV CDGVDDCEDG SDESPDHCGR PGPGATSAPA M19 CGPIQFTCRN TNICLSVHWV CDGEDDCEDG SDEEG.. CGR PGPGATSAPA M20 CGPNQFTCRS TNICLSQTWV CDGVDDCEDG SDETN ..CGR PGPGATSAPA M21 CGPSQFTCRN TNICISLRWR CDGVDDCEDN SDEEG.. CGT TGPT M08 CGAGQFTCRD TNICISRAWR CDGVDDCEDN SDEAD ..CSQ DPEFHKV... 23 CGSNQFTCRS TN-ICTSQAWV CDGVDDCEDD SDETG..CSQ DPEFHKV... M32 CQSNEFQCRS TGRCISVAWV CDGEDDCRDS SDEAD..CSQ DPEFHKV... M33 CRLNEFPCGS .GSCISLHWV CDSVPDCRDD SDETD..CPE RT M02 CASGQFTCRS TNICLSLAWL CDGDDDCEDN SDESPAICSA PASEPPGSL. M31 CLSDQFTCRS TNICLPLQWV CDGDDDCEDN SDEED..CSA PASEPPGSL. M05 CGAGQFQCRS TNICISLKWV CDGVDDCEDN SDETS..CSA PASEPPGSL. M07 CGAGQFTCNS TNICISPRWV CDGVNDCEDN SDEKN..CSA PASEPPGSL. M16 CGARQFPCRG SRICISQPWV CDGDNDCEDN SDEKN..CSA PASEPPGSL. M15 CGANQFTCHN TNICISQAWV CDGVDDCEDN SDEKN.. CSA PASEPPGSL. M25 CGSSQFTCHN TNICLPQAWV CDGVDDCEDN SDEKN..CSA PASEPPGSL. 29 CGSSQFTCHN TNICLPRAWV CDGVDDCEDN SDEKN..CSA PASEPPGSL. M18 CGPGQFTCQD TEICISQAWV CDGVDDCEDN SDEKN..CSA PASEPPGSL. Mil CGAGQFTCRS TKICISQAWV CDGVDDCEDN SDETS..CSA PASEPPGSL.

M03 CGAGLFTCRS TKICISQAWV CDGVDDCEDN SDEKN.. CSA PASEPPGSL. MIO CGAGQFTCRS TKICISQAWV CDGVDDCEDN SDEKN.. CSA PASELPGSL. M30 CGTGQFTCRS TKICISQAWV CDGVDDCEDN SDEKN.. CSA PASEPPGSL. 51 M01 PST M24 PST M39 PST M36 M38 M04 M06 M09 PST M12 PST M14 PST M26 PST M27 PST M13 A.

M19 A.

M20 M21 M08 M23 M32 M33 ...

M02 ...

M31 ...

M05 ...

M07 ...

M16 ...

M15 M25 ...

M29 ...

M18 ...

Mil ...

M03 ...

MIO M30 La siguiente es una secuencia de consenso para los de enlace a FGFRlc. Los residuos conservados están en negritas. Las cisteinas de estructura se denotan como C. El intervalo de ligaduras identificadas también se enlistan.

C(A/G/L/Q/R/V) (A/L/P/S/T) ( D/G/ I /N/R/S ) (E/L/Q) F (P/Q/T) C (G/H/K/ N/Q/R/S) (D/G/N/S) (G/S/T) (E/G/K/N/R/S) (I/R/S/T/- )C(I/L/V) (P/S) (L/P/Q/R/V) (A/H/K/P/Q/R/T ) W (L/R/V) CDG ( D/E/V) (D/ N/P)DC(E/G/R)D(D/G/N/S)SDE(A/E/K/S/T) (D/G/N/P/S) (A/D/-) (I/H/-)C (SEQ ID NO: 74) Ligaduras: ATHT (SEQ ID NO: 6), PERT .(SEQ ID NO: 7), TTRT (SEQ ID NO: 8) GTTGPT (SEQ ID NO: 9), ETSGPT (SEQ ID NO: 10) SQDPEFHKVS (SEQ ID NO: 11) SAPASEPPGSL (SEQ ID NO: 12) GRPGPGATSAPAA (SEQ. ID NO: 13) GDSHILPFSTPGPST (SEQ ID NO: 14) Lo siguiente es un resumen de los monómeros de enlace a FGFRlc identificados de la inmunoadsorción de la biblioteca de monómeros mutante M03/M15 ( SEQ ID NOS 293-295, 448, 297, 449-450, 464, 296 y 28.7, respectivamente, en orden de aparición) 1 . 47 M03mut01 CGAGLFTCRS TNICISQVWV CDGVDDCEDN SDEDSCSAPA SEPPGSL 03mut04 CGAGLFTCRS TNICISQAWV CDGVDDCEDN SDENYCSAPA SEPPGSL M03mut05 CGAGLFTCRS TNICISQAWV CDGVDDCEDN SDETNCSAPA SEPPGSL M03mut07 CGEGLFTCGS TNICISSAWV CDGVDDCEDN SDENNCSAPA SEPPGSL M03mut09 CGEGLFTCRS TNICISHAWV CDGVDDCEDN SDENNCSAPA SEPPGSL M03mut08 CGEGLFTCRS TNICISEAWI CDGVDDCEDN' SDEKNCSAPA SEPPGSL M03mut03 CGAGLFTCRS AKICISHAWV CDGIDDCEDN SDENNCSAPA SEPPGSL M03mut02 CGAGLFTCRN SKICISQAWV CDGVDDCDDN SDEKYCSAPA SEPPGSL M03mut06 CGASLFTCRR SNICISQAWV CDGVDDCEDN SDEMNCSAPA SEPPGSL M03ori CGAGLFTCRS TKICISQAWV CDGVDDCEDN SDEKNCSAPA SEPPGSL Lo siguiente es una secuencia de consenso para los monómeros FGFRlc identificados de la inmunoadsorción de la biblioteca de monómeros mutante M03/M15. Los residuos conservados están en negritas. Las cisteinas de estructura se denotan como C. . El intervalo de ligaduras identificado también se enlista.

CG(A/E) (G/S)LFTC(G/R) (N/R/S) (A/S/T) (K/N) ICIS (E/H/Q/S) (A/V) (I /V)CDG(I/V)DDC(D/E)DNSDE(D/K/M/N/T) (N/S/Y)C (SEQ ID NO: 108) Ligadura: SAPASEPPGSL (.SEQ ID NO: 12) Lo siguiente es un resumen de los monómeros FGFRlc identificados de la inmunoadsorción de la biblioteca del monómero mutante M23 (SEQ ID NOS 298, 479, 303, 301, 299, 482, 485, 302, 300 y 290, respectivamente, en. orden de aparición) 1 45 M23mutl0 CGANLFTCQS TNICISDAWV CDGVDDCEDN SDETTCSQDP EFHKV M23mutl8 CGTNMFTCQR TNICISDAWV CDGVDDCEDY. SDETACSQDP EFHKV M23mutl7 CGTNLFTCRS TNMCISQAWV CDGVDDCEDN SDETVCSQDP EFHKV M23mutl5 CGSNLFTCRR TNICISKA V CDGVDDCEDN SDETGCSQDP EFHKV M23mutll CGANLFTCRS TNICISPAWV CDGVDDCEDY SDEIGCSQDP EFHKV M23mutl2 CGANLFTCRS TNICISPTWV CDGVDDCDDN SDEIGCSQDL EFHKV M23mutl3 CGPNLFTCRS TNICISRAWV CDGVDDCDDE SDEQGCSQDP EFHKV M23mutl6 CGSNLFTCRS TNICISPAWV CDGVDDCDDD SDETGCSQDP EFHKV 23mutl4 CGSDMFTCRS TNICISKVWV CDGVDDCEDD SDERGCSQDP EFHKV M23ori CGSNQFTCRS TNICISQAWV CDGVDDCEDD SDETGCSQDP EFHKV Lo siguiente es una secuencia de consenso para los monómeros FGFRlc identificados de la inmunoadsorción de la biblioteca del monomero del mutante . M23. Los residuos conservados están en negritas. Las cisteinas de estructura se denotan como C. El intervalo de las ligaduras identificado también se enlista.

CG(A/P/S/T) (D/N) (L/M/Q) FTC (Q/R) (R/S) TH ( I/M) CIS ( D/K/P/Q/R) (A/T/V)WVCD6VDDC(D/E)D(D/E/N/Y) SDE(I/Q/R/T) (A/G/T/V)C (SEQ ID NO: 119) Ligadura: SQDPEFHKVS (SEQ ID NO: 11) Monómeros y dimeros de enlace a ß?-Lotho Lo siguiente es un resumen de los monómeros pKlotho identificados de la inmunoadsorción de la biblioteca Al intacta (SEQ ID NOS 304, 510, 290, 512, 512, 480, 514, 518, 523, 527-536, 484, 537-541, 483, 483, 542, 481, 305, 543-547, 547-550, 306, 551, 551-562, 1235 y 563, respectivamente, en orden de aparición; ver la Figura- 11) 1 50 M01 .CLPDEFQCG S.GRCIPQTW VCDGLNDCGD GSDESPAHCS QDPEFHKV.

M15 . CAANEFTCR S.GRCLSRPW LCDGENDCGD GSDE..ADCS QDPEFHKV. M29 . CGSNQFTCR STNICISQAW VCDGVDDCED DSDET..GCS QDPEFHKV.

M08 .CPSNQFPCR STGICIPLAW VCDGLNDCGD GSDES . PATC KAPVPT.

M13 .CPSNQFPCR STGICIPLAW VCDGLNDCGD GSDES. PATC KAPVPT.

M02 . CAANEFRCS N.GRCIPEPW LCDGLNDCGD GSDEP.PHCA PPT....

M07 .CPSNEFQCQ NSGRCIPRRW LCDGEDDCGD NSDEA.SCGR PGPGATSAPA 22 .CQSSEFQCS N.GSCIPRPL VCDGEN'DCGD SSDET.DCKE PT 16 . CRPGEFRCR STNTCISQSL RCDGEPDCRD GSDEP..EDC ESVAHT M34 .CRSSEFPCH GYSTCISLSL LCDGVDDCAD NSDE...ESC RAAGHT ....

M30 . CHHHHFHCL SG.ECIN.TW RCDGGPDCKD KSDEENCPTK RPEEV 41 . CSRAHFHCL SG.ECIHHHW RCDGGPDCKD KSDEENCPTK RPEEV M37 .CSAFEFHCL SG.ECIHSSW RCDMDWDCKD QPDQLWCALE T M40 .CSAFEFHCL SG.ECIHSSW RCDWYWDCKD YWDPLVCELE A M38 .CSAFEFHCL SG.ECIHSSW RCDWDDDCKD WQDYVMCALE A M39 .CSAFEFHCL SG.ECIHSSW RCDWDLDCKD HPDEVMCALE A M18 . CVPNQFPRG NG. SCIPLPL VCDGVDDCLD DSDEKN..CT PPT M26 . CVPNQFQCG SG.RCLPHPL GCDGVDDCLD GSDEAS..CA PPT M27 .CVSDEFPCR DNNICVLLHL LCDGVDDCLD SSDET..GCA KPT M46 . CAPSQFQCH DNNICLLEGL LCDGEDDCAD GSDEAP . VCG DSHILPFSTP M57 .CRSSQFPCQ DSNICVLETL LCDGVDDCVD DSDEE..DCG DSHILPFSTP 17 . CRSNQFRCN SG . HCLPRPW LCDGVDDCQD DSDETD..CP ART M24 . CRPGQFWCN SG . RCLPPAW RCDGV DCGD DSDEPLALCE KHT M03 . CLPNQFRCG NG.HCLSRTW VCDGVPDCED NSDESLAHCS APASEPPGSL M04 . CPAGQFQCG NG . QCLSLTW LCDGVPDCGD NSDESSALCS APASEPPGSL M06 .CPPSQFTCG NG.RCVSLGW VCDGLNDCGD GSDESPALCS APASEPPGSL M14 .CPPSQFTCG NG.RCVSLGW VCDGLNDCGD GSDESPALCS APASEPPGSL M45 . CRPNEFPCN NG . RCLSQTW VCDGLNDCGD GSDESPELCS APASEPPGSL M21 .CQSNEFRCR SG.RCIPQHW LCDGLNDCGD GSDESQ.QCS APASEPPGSL M42 . CQPDEFTCS SG.RCIPQPW LCDGLNDCGD GSDEPPAHCS APASEPPGSL M48 . CQPDEFTCR SG.RCIPQPW LCDGLNDCGD GSDEPPGHCT APASEPPGSL M05 . CPPNQFRCG NG.HCLSVSW LCDGVPDCGD NSDEALAICR ASEHT M09 . CRANEFRCN SG. RCLSQTW VCDGVDDCED GSDESLAICG DSHILPFSTP Mil .CRANQFTCN NG.HCLSRTW LCDGVPDCED NSDESLAIRG DSHILPFSTP M23 .CRANQFTCN NG.HCLSRTW LCDGVPDCED NSDESLAICG DSHILPFSTP M51 .CRANQFTCN NG.HCLSRTW LCDGVPDCED NSDESLAICG DSHILPFSTP M53 . CLPGQFRCN SG.HCLSQTW VCDGYNDCGD GSDEPLATCG DSHILPFSTP 19 CKPTNEFRCS NG.HCISRAL LCDGENDCED NSDETS..CG DSHILPFSTP M28 . CASSEFQCR STRTCVPLGW VCDGDNDCPD NSDET .. DCG DSHILPFSTP M50 CHSFNQFECR NG . QCIPLHL VCDGVPDCGD NSDETD..CG DSHILPFSTP M32 CQATAQFQCD NG . HCLSANW RCDGVDDCGD NSDEED..CG DSHILPFSTP M54 CQATAQFQCD NG.HCLSANW RCDGVDDCGD NSDEED.. CG DSHILPFSTP M43 CKSIAQFECS NG.HCLSRTW LCDGVDDCGD NSDEALATCG DSHILPFSTP M33 .CRPSEFQCG NG.SCLSATW LCDGVPDCGD GSDESPETCG DSHILPFSTP M44 . CRPNEFQCG NG.HCLSANW LCDGVDDCGD DSDET..SCG DSHILPFSTP M20 .CPSSQFQCK NG.HCLSRTW LCDGVDDCQD GSDESPAICT ASGHT M55 .CPSSQFQCK NG.HCLSRTW LCDGVDDCQD GSDESPATCG DSHILPFSTP M25 . CRSSQFQCN NG.HCLSPTW VCDGYDDCED GSDEA .. CP THT M36 . CRSSEFQCN NG.HCLSATW VCDGYDDCED GSDEAN.. CP THT M47 . CPANQFRCN NG.HCLSRTW VCDGYDDCED GSDEAN.. CP THT M31 .CPANQFRCN NG.HCLSGTW LCDGVDDCGD NSDESSATCE PHT M12 . CRSSEFQCG NG.HCLSRTW LCDGVNDCGD DSDEKN..CA GAAPT M52 . CLSNQFQCD NG.HCLSLTW RCDGYNDCGD SSDEEN..CA ASEHT M56 . CRSSEFKCK NG.HCLSATW VCDGYVDCGD DSDEED..CA TSGHT 51 M01 M15 M29 M08 M13 M02 M07 A M22 M16 .

M34 .... 30 ....

M41 .... 37 M40 ....

M38 ....

M39 ....

M18 ....

M26 .... M27 ....

M46 GPST 57 GPST M17 M24 .... M03 04 .... 06 ....

M14 ....

M45 .... M21 ....

M42 ....

M48 ....

M05 ....

M09 GPST Mil GPST M23 GPST 51 GPST M53 GPST M19 GPST M28 GPST M50 GPST M32 GPST M54 GPST M43 GPST M33 GPST M44 GPST M20 ....

M55 GPST M25 M36 ....

M47 M31 M12 M52 M56 ....

La siguiente es una secuencia de consenso para los monómeros de enlace ß-Klotho. Los residuos conservados están en negritas. Las cisternas de armazón denotadas como C.

También se enlista el rango de ligaduras identificados.

C(L/A/P/R/V/K/Q/G/H/S) (A/P/S/H/R) <-/T) (D/N/G/S/H/A/F) ( E/H/Q) F (H/P/Q/T/R/W)C(G/S/Q/R/N/L/H/K) (S/N/D) (G/S/T/N/Y) (R/H/Q/G/H/N /S/E) (R/I/T/- )C(I/L/V) (H/N/P/S) (A/G/H/L/S/Q/P/R/E/V) (T/P/G/S/R/A/H/N/-) (W/L) (I/L/R/V)CD(G/M/W) (G/Y/D/V/E/L) (P/W/L/D/N) DC (G/E/R/Q/L/ K)D(G/N/D/S/K/W/H/Y) ( P/Q/S/W) D (E/P/Q/Y) (A/P/S/-) (L/P/Q/S/-) (A/E/H/K/L/T/V) (H/I/L/S/T/D/N/G/M/V/W) C (SEQ ID NO: 130) Ligaduras : 4 aminoácidos: (A/E/K/P/T) (A/E/K/L/P/T) (E/H/P/R)T (SEQ ID NO: 15) 6 aminoácidos: (A/E/K/R/T) (A/G/S) (A/P/S/V) (A/E/G/V) (H/P)T (SEQ ID NO: 16) 8 aminoácidos: PTKRPEEV (SEQ ID NO: 17) 9 aminoácidos: SQDPEFHKV (SEQ ID NO: 18) 11 aminoácidos: SAPASEPPGSL (SEQ ID NO: 12) 13 aminoácidos: GRPGPGATSAPAA (SEQ ID NO: 13) 15 aminoácidos: GDSHILPFSTPGPST (SEQ ID NO: 14) El siguiente es un resumen de^ los monómeros ß-Klotho monómeros identificados de la inmunoadsorción de la biblioteca intacta LNR (SEQ ID NOS 1243, 1246, 1253, 1251, 1250, 1276, 1247, 1254, 1277, 1255, 1257, 1261, 1258, 1260, 1278, 1244, 1252, 1279, 1245, 1256 y 1262 respectivamente, en orden de aparición, Familia 5; véa La Figura 12. 1 4 LNR_M01 C .. IAAKLCE ALDGDGVCHK ECDLEECDWD GGDCQRIFLT DPT (SEQ ID NO: 1243) LNR_M05 C..MAYNLCT ALVGDGECDQ ECDTPTCNWD GGDCAVKSAP DST (SEQ ID NO: 1246) LNR_M11 C .. MAYNLCQ ALVGDGSCNS ECDTETCGWD G DCATVEGA EAT (SEQ ID NO: 1253) LNR_M09 C..MAYLLCK KYYGD'GICRS ECDTATCSWD GFDCPVNEIE DLT (SEQ ID NO: 1251) LNR_M08 C .. IAAKLCE RLDGDGSCQS ECGNATCGWD GMDCDEKEND ELT (SEQ ID NO: 1250) LNR_M04 C .. REYISCP NFYGDGRCQQ DCNLAKCVWD GLDCADVWSE DLT (SEQ ID NO: 1276) LNR_M06 C .. MEAKSCQ ARDGDGDCGQ GCNLAECIWD GMDCRPEWIR ELT (SEQ ID NO: 1247) LNR_M12 C..REYSMCT RFDGDGICHE QCGYPRCLWD GLDCANNFDH EVT (SEQ ID NO: 1254) LNR_M07 C...LYQDCK EYYGDGNCSK GCNLAECLWD GGDCGTIFLA DVT (SEQ ID NO: 1277) LNR_M13 CNPLYDPHCR SYFGDGDCGP GCDLAACLWD GGDCPGVAAA ELT (SEQ ID NO: 1255) LNR_M15 CNPLYDDHCA AFFGDGGCGP ECSLAECLWD GGDCEEERDA DVT (SEQ ID NO: 1257) LNR_M1.9 CNPVYDPYCA AFFGDGGCGP HCGLAECV D GMDCDHKEVR ELT (SEQ ID NO: 1261) LNR_M16 CNPKYDAHCA SYFGDGECDP ACSLAECVWD GDDCDPNFLT DVT (SEQ ID NO: 1258) LNR_M18 CNPPIGQYCT QLFGDGDCGP DCDLAECVWD GDDCDPVAVP DVT (SEQ ID NO: 1260) LNR_M20 CNPPIGQYCT QLFGDGDCGP ECNLAECV D GDDCDPVAVP ELT (SEQ ID NO: 1278) LNR_ 02 CPPHIEDHCE RRDGDGVCQK PCDFYGCLWD GVNCDMDLVQ ELT (SEQ ID NO: 1244) LNR_M10 CPPHIEDHCE RRDGDGVCQK PCDFYGCLWD GVDCDMDLVE ELT (SEQ ID NO: 1252) LNR_M17 CPAHYGTHCE ERDGDGKCHQ GCDFATCDWD GMDCGMDLVR ELT (SEQ ID NO: 1279) LNR_M03 CNPIIQHYCE TYDGDGLCES ACNFYGCAWD GFDCQVISDK DST (SEQ ID NO: 1245) LNR_M14 CHPLIREYCE KFFGDGGCDS GCNNSRCDWD GDDCGLIQHG DVT (SEQ ID NO: 1256) LNR_M21 CHPLIREYCT HYDGDGECDK GCDSAKCKWD GDDCDMDVLA EVT (SEQ ID NO: 1262) La siguiente es una secuencia de consenso para los raonómeros de enlace ß-Klotho identificados de la inmunoadsorción de la biblioteca LNR. Las cisteinas de armazón denotadas como C.

C[HNP-] [AP-] [ HIKLMPRV-] [AEILY] [ADEGQRY] [ADEHIKLNPQS] [DHLMSY] C [AEKPQT] [AEHKNQRS] [FLRY] [ DFVY] GDG [ DEGIKNRSV] C [ DEGHNQRS] [EKPQ S] [ADEGHPQ] C [ DGNS] [FLNST] [AEPSY] [AEGKRT ] C [ADGILNSV] DG [ DFGLMV ] [DN]C (SEQ ID NO: 1280) Todos los monómeros derivados de la inmunoadsorción de la biblioteca LNR contra ß-Klotho tienen 9 ligaduras largos de aminoácidos. La siguiente es una secuencia de consenso para estas ligaduras.

[ADEGPQR] [DEHLMPRTV] [DEIKNV] [AEFLQRSVW] [ADGHILNSV] [ADEGHPQRT] [DE] [ALPSV]T (SEQ ID:NO 1281) El siguiente es un resumen de los monómeros ß-Klotho identificados de la inmunoadsorción de la biblioteca de mutagénesis construida dé ß-Klotho M01 (SEQ ID NOS 19-21, 526, 465, 509 y 563, respectivamente, en orden de aparición, Familia 6; ver La Figura 13) 1 46 bKmutMOl CLPDEFQCGS GRCIPLTWVC DGLNDCGDGS DESPAHCSQD PEFHKV (SEQ ID NO: 19) b mutM03 CLPHEFQCGS GRCIPQTWVC DGLNDCGDGS DEWPAQCSQD PEFHKV (SEQ ID NO: 20) bKmut 04 CLPHEFQCRS GRCIPQA GC DGLNDCGDGS DESPAQCSQD PEFHKV (SEQ ID NO: 21) bKmutM02 CLPDEFQCRS GRCIPQTWVC DGLNDCGDGS DESPAQCSQD PEFHKV (SEQ ID NO: 526) bKmut 05 CLSDEFQCRS GRCIPQRWVC DGLNDCGDGS DEWPAQCSQD PEFHKV (SEQ ID NO: 465) bKmutM07 CMTDEFRCRS GRCIPQTWVC DGLNDCGDGS DEWPAQCSQD PEFHKV (SEQ ID NO: 509) bKmutM08 CPPDEFQCRS GWCÍPQKWVC DGLNDCGDGS DESPALCSQD PEFHKV (SEQ ID NO: 563) La siguiente es una secuencia de consenso para los monómeros de enlace ß-Klotho identificados de la inmunoadsorción de la biblioteca de mutagénesis construida de ß-Klotho 01. Las císteinas de armazón denotadas como C.

C[LMP] [PST] [DH]EF[QR]C[GR]SG[RW]CIP[LQR] [AKRST ] W [GV] CDGLNDCGD GSGE[SW] PA[HLQ]C; (SEQ ID NO: 185) La ligadura en C-terminal para todos los miembros de la familia 6; SQDPEFHKV (SEQ ID NO: 18) El siguiente es un¦ resumen de los monómeros ß-Klotho identificados de la inmunoadsorción de la biblioteca de mutagénesis construida de ß-Klotho M25 (SEQ ID NOS 564-569 y 569-574, respectivamente, en orden' de aparición, Familia 7; vea La Figura 13) 1 39 bKmutM09 CLPSQFQCNN GHCLSRT VC DGYDDCGDWS DESNCPTHT (SEQ ID NO: 564) bKmutM16 CRSSEFQCNN GHCLSATWVC DGYDDCEDGS DESNCPTHT (SEQ ID NO: 565) bKmutM17 CRSSEFQCNT GHCLSRTWVC DGYDDCGDGS DEANCPTHT (SEQ ID NO: 566) bKmutM19 CWSSAFQCNN GHCLSPSWVC DGYDDCGDGS DEANCPTHT (SEQ ID NO: 567) bKmutMIO CLSGQFQCSN GHCLSRTWVC DGYVDCEDGS DEAKCPTHT (SEQ ID NO: 568) bKmutM12 CRSGQFQCNN GHCLSATWVC DGYDDCDDGS DEANCPTHT (SEQ ID NO: 569) bKmutM20 CRSGQFQCNN GHCLSATWVC DGYDDCDDGS DEANCPTHT (SEQ ID NO: 569) bKmutMl3 CRSGQFQCNN GHCLSQTWVC DGYDDCDDGS DEANCPTHT (SEQ ID NO: 570) bKmutM14 CRSGQFQCNN GHCLSRTWVC DGYDDCDDGS DEANCPTHT ( SEQ ID NO: 571) bKmutM15 CRSGQFQCNN GHCLSSTWVC DGFDDCEDGS DEANCPTHT (SEQ ID NO: 572) bKmutMll CLSSSFQCNN GHCLSRTWVC DGYYDCEDGS DEVNCPTHT (SEQ ID NO: 573) bKmut 18 CRTSHFHCNN GHRLSRTWVC DGYEDCEDGS DEANCPTHT (SEQ ID NO: 574) La siguiente es una secuencia de consenso para los monómeros de enlace ¦ ß-Klotho identificados de la inmunoadsorción de la biblioteca de mutagénesis construida de ß-Klotho M25. Las císteinas de armazón denotadas como C.

C[LRW] [PST] [GS] [AEHQS] F [HQ] C [NS] [NT] GHCLS [APQRS ] [ST] VCDG [ FY] [ DEVY] DC [ DEG] D [GW] SDE [ASV] [KN] C; (SEQ ID NO: 194) La ligadura C-terminal para todos los miembros de la familia 7; PTHT (SEQ ID NO: 575) El siguiente es un resumen de los monómeros ß-Klotho identificados de la inmunoadsorción de la biblioteca de mutagénesis construida de ß-Klotho- M42 (SEQ ID NOS 576-579, respectivamente, en orden de aparición, Familia 8; vea La Figura 13) 1 48 bKmutM21 CEPEEFRCRS GRCIPQTWLC DGLNDCGDGS DEPPAHCSAP ASEPPGSL (SEQ ID NO: 576) bKmutM22 CQPDEFTCRS GRCIPQSWLC DGLNDCGDGS DEPPAHCSAP ASEPPGSL (SEQ ID NO: 577) bKmutM23 CQPDEFTCSS GRCIPQI LC DGLNDCGDGS DERPEHCSAP ASEPPGSL (SEQ ID NO: 578) bKmutM24 CQSDEFMCSS. GRCIPVHWLC DGLNDCGDGS DERPAQCSAP ASEPPGSL (SEQ ID NO: 579) La siguiente es una secuencia de consenso para los monómeros de enlace ß-Klotho identificados de la inmunoadsorción de la biblioteca de mutagénesis construida de ß-Klotho M42. Las cisteinas de armazón denotadas como C.

C[EQ] [PS] [DE] EF[MRT] C[RS] SGRCIP [QV] [HIST] WLCDGLNDCGDGSDE [PR] P [AE] [HQ]C; (SEQ ID NO: 207) La ligadura C-terminal para los miembros de la familia 8; SAPASEPPGSL (SEQ ID .NO: 12) El siguiente es un resumen de los monómeros ß-Klotho identificados de la inmunoadsorción de la biblioteca de mutagénesis construida de ß-Klotho M50 (SEQ ID NOS 580-583, respectivamente, en orden de aparición, Familia 9; vea La Figura 13) 1 50 bKmutM25 CHSFNQFECR NRQCIPLYLV CDGVPDCADN SDETDCGDS. YLPFSTPGPS bKmut 27 CNSFNQFECR NRQCIPLYLV CDGVPDCGDN SDETYCGDSH ILPFSTPGPS bKmutM26 CHTFNKFECR NGQCIPLYLV CDGVPDCGDN SDETACGDSH ILPFSTPGPS bKmutM28 CPWFHHFKCR NGQRIPLHLV CDGVPDCGDD SDETDCGDSH ILPFSTPGPS 51 bKmutM25 T (SEQ ID NO: 580). bKmutM27 T (SEQ ID NO: 581) bKmutM26 T (SEQ ID NO: 582) bKmutM28 T (SEQ ID NO: 583) La siguiente es una secuencia de consenso para los monómeros de enlace ß-Klotho identificados de la inmunoadsorción de la biblioteca de mutagénesis construida de ß-Klotho M50. Las cisteinas de armazón denotadas como C. C[HNP] [ST ]F[HN] [HKQ] F [EK.] CRN [GR] QCIPL [HY] LVCDGVPDC [AG] D [ DN] S DET [ADY] C; (SEQ ID NO: 212) La ligadura en C-terminal para todos los miembros de la familia 9; GDSHILPFSTPGPST (SEQ ID NO: 14) El siguiente es un resumen de los dimeros encaminados ß- Klotho identificados de la inmunoadsorción de la biblioteca de dimeros encaminados ß-Klotho 01 N-terminal (SEQ ID NOS 584 y 584-590, respectivamente, en orden de aparición, Familia 10; vea La Figura 14) . 1 50 BK Rlc D06 CAPDQFRCSS GQCIPETWLC DGDDDCVDSS DEAGCASTV. PTCLPD bKWD12 CAPDQFRCSS GQCIPETWLC DGDDDCVDSS DEAGCASTV. PTCLPD bKWD14 CGPDQFRCKS GNCLPLNWVC DGVDDCGDSS DEEGCA ... PTCLPD BK Rlc D12 CGPDQFKCNS GSCIPLTWVC DGDNDCGDDS DETDCTKR.. . TCLPD bK Dll CPPDQFRCRS GRCIPQHWLC DGLNDCGDGS DEANCEKR .. .TCLPD bKWD15 CLPDEFQCGS GRCIPQTWVC DGLNDCGDGS DESPAHCSQD PEFHKVCPSN bKWD16 CLPDEFRCGS GRCIPQTWVC DGLNDCGDGS DETG CRRPG. ..PTCLPD bKWD13 CGPDEFRCNS GRCLPLDWRC DGVDDCEDGS DEAPDLCKTP ... ARTCLPD 51 94 BK Rlc D06 EFQCGS . GRC IPQTWVCDGL NDCGDGSDES PAHCSQDPEF HKV. ( SEQ ID NO: 584) bKWD12 EFQCGS . GRC IPQTWVCDGL NDCGDGSDES PAHCSQDPEF HKV. ( SEQ ID NO: 584) bKWD14 EFQCGS. GRC IPQTWVCDGL NDCGDGSDES PAHCSQDPEF HKV. (SEQ ID NO: 585) BK_Rlc_D12 EFQCGS. GRC IPQTWVCDGL NDCGDGSDES PAHCSQDPEF HKV. (SEQ ID NO: 586) bKWDll EFQCGS. GRC IPQTWVCDGL NDCGDGSDES PATCKAPVPT .... (SEQ ID NO: 587) bKWD15 QFPCRSTGIC IPLAWVCDGL NDCGDGSDES PATCKAPVPT .... (SEQ ID NO: 588) bKWD16 EFQCGS. GRC IPQTWVCDGL NDCGDGSDES QQCSAPASEP PGSL(SEQ ID NO: 589) bKWD13 EFQCGS. GRC IPQTWVCDGL NDCGDGSDES PAHCSQDPEF HKV. (SEQ ID NO: 590) La siguiente es una secuencia de consenso para los monómeros en el N-terminal de los dimeros identificados de la inmunoadsorción de la biblioteca de dimeros encaminados ß-Klotho M01 N-terminal. Las cisteinas de armazón denotadas como C.

C [ELPQR] [APS] [DGIN] [EGQ] [FQ] [FKPQRT] [E]C[GNRS] [NS] G [HNQR] C [ IV ] P [AELPQRV] [AHPQRT] [LRV] CDG [DEV]- [DNP] DC [GLQ] D [ DGNS ] SDE [AEKT] [DGLNS] [-A] [-H]C (SEQ ID NO: 217) Los siguientes, son las ligaduras entre el dominio de monómeros 1 y 2 de los dimeros identificados de la inmunoadsorción de la biblioteca de dimeros encaminados the ß-Klotho MOl C-terminal.

ASTVPT (SEQ ID NO: 591) ATPT (SEQ ID NO: 592) TKRT (SEQ ID NO: 593) EKRT (SEQ ID NO: 594) .

SQDPEFHKV (SEQ ID NO: 18) RRPGPT (SEQ ID NO: 595) KTPART, (SEQ ID NO: 5.96) La siguiente es una secuencia de consenso para los monómeros en el C-terminal de los dimeros identificados de la inmunoadsorción de la biblioteca de dimeros encaminados ß- Klotho MOl N-terminal. Las cisteinas de armazón denotadas como C.

CLPDEFQC[SG]SGRCIPQ[HT] [VL]CDGLNDCGDGSDE[PS]PA[HT]C (SEQ ID NO: 597) Las siguientes son secuencias relacionadas a ß-Klotho ' MOl (sobre las que la alineación de consenso mostrada arriba (SEQ ID NO: 597) que proporciona las semillas para los dimeros encaminados seleccionados derivados de la biblioteca de dimeros encaminados ß-Klotho MOl N-terminal CLPDEFQCSS GRCIPQTWVC DGLNDCGDGS DESPAHC (SEQ ID NO: 1236) CLPDEFQCGS GRCIPQHWLC DGLNDCGDGS DEPPAHC (SEQ ID NO: 1237) CLPDEFQCGS GRCIPQTWVC DGLNDCGDGS DESPATC (SEQ ID NO: 1238) Lo siguiente son ligaduras incorporadas en el C-terminal de los dimeros identificados de la inmunoadsorción de la biblioteca de dimero identificado ß-Klotho MOl N-terminal. SQDPEFHKV (SEQ ID NO: 12) KAPVPT (SEQ ID NO: 24) SAPASEPPGSL (SEQ, ID NO: 18) El siguiente es un resumen de los dimeros encaminados ß-Klotho identificados de la inmunoadsorción de la biblioteca de dimeros encaminados ß-Klotho MOl C-terminal (SEQ ID NOS 598, 307, 599-600, 310, 308-309¦ y 601-606, respectivamente, en orden de aparición, Familia 11; vea La Figura 14). 1 50 BK_Rlc_D1 CLPDEFQCGS GRCIPQTWVC DGLNDCGDGS DEPPAHCSAP ASEPPGSLCR bKWDOl CLPDEFQCGS GRCIPQHWLC DGLNDCGDGS DEPPAHCSAP ASEPPGSLCR BK_Rlc_D15 CLPDEFQCGS GRCIPQTWVC DGLNDCGDGS DEPPAHCSAP ASEPPGSLCR b WDlO CLPDEFQCGS GRCIPQTWVC DGLNDCGDGS DESPATCKAP VPTCL bKWD06 CLPDEFQCGS GRCIPQTWVC DGLNDCGDGS DESPAHCSQD PEF. . HKVCQ bK D02 CLPDEFQCSS GRCIPQTWVC DGLNDCGDGS DESPAHCSQD PEF. . HKVCP bKWD03 CLPDEFQCGS GRCIPQTWVC DGLNDCGDGS DESPAHCSQD PEF. . HKVCR bKWD0 CLPDEFQCGS GRCIPQTWVC DGLNDCGDGS DESPAHCSQD PEF. . HKVCL bKWD07 CLPDEFQCGS GRCIPQTWVC DGLNDCGDGS DESPAHCSQD PEF. . HKVCE bbKKWWDD0088 CCLLPPDDEEFFQQCCGGSS GGRRCCIIPPQQTTWWVVCC DDGGLLNNDDCCGGDDGGSS DDEESSPPAAHHCCSSQQDD PPEEFF....HHKKVVCCQQ B BKK__RRllcc__DD1166 CCLLPPDDEEFFQQCCGGSS GGRRCCIIPPQQTTWWVVCC DDGGLLNNDDCCGGDDGGSS DDEESSPPAAHHCCSSQQDD PPEEFF....HHKKVVCCPP bbKKWWDD0055 CCLLPPDDEEFFQQCCGGSS GGRRCCIIPPQQTTWWVVCC DDGGLLNNDDCCGGDDGGSS DDEESSPPAAHHCCSSQQDD PPEEFF....HHKKVVCCLL bbKKWWDD0099 CCLLPPDDEEFFQQCCGGSS GGRRCCIIPPQQTTWWVVCC DDGGLLNNDDCCGGDDGGSS DDEESSPPAAHHCCSSQQDD PPEEFF....HHKKVVCCPP 51 95 BK_Rlc_D14 SD.EFRCGNG RCIPLTWVCD GEDDCQDSSD ETGCTTPGHT (SEQ ID NO: 598) bKWDOl AG.EFRCSNG RCVPLTWLCD GEDDCQDNSD EKNCAQPT (SEQ ID NO: 307) BK_Rlc_D15 SN.QFTCGNG NCIPQPWVCD GEDDCGDDSD EESCKEHT (SEQ ID NO: 599) bKWDlO PD.EFKCGSG RCIPLRWVCD GDDDCQDGSD ETDCGGAEPT (SEQ ID NO: 600) bKWD06 PN.EFQCGNG RCIPAQWLCD GEDDCQDNSD EEDCTEHT (SEQ ID NO: 310) bKWD02 SS.EFRCNNG RCIPLHWVCD GDDDCQDNSD ETDCERSGRT (SEQ ID NO: 308) bKWD03 PG.EFRCNNG RCVPQTWVCD GEDDCGDNSD ETDCSAPASE PPGSL(SEQ ID NO: 309) bKWD04 SD . QFRCGNG RCVPRAWLCD GDNDCQDGSD ETNCEQPT (SEQ ID NO: 601) bKWD07 SIGQFECGNG HCIPPTWLCD GVNDCQDSSD EALAHCEPPT (SEQ ID NO: 602) bKWD08 SN . EFRCRNG QCIPLTWLCD GDNDCLDSSD EESCPAHT (SEQ ID NO: 603) BK_Rlc_D16 PG . QFRCNNG RCIPVHWRCD GENDCQDDSD EKSCKGPEHT (SEQ ID NO: 604) bKWD05 PG . QFPCGNG RCIPETWLCD GDDDCQDGSD EKGCTASGRT (SEQ ID NO: 605) bKWD09 SG . EFTCGSG RCIPPT VCD GEPDCLDGSD EKSCTATVRT (SEQ ID NO: 606) La siguiente es una secuencia de consenso para los monómeros en el N-terminal de los dimeros identificados de la inmunoadsorción de la biblioteca de dimeros encaminados ß-Klotho M01 C-terminal. Las cisteinas de armazón denotadas como C.

CLPDEFQCGS GRCIPQTWVC DGLNDCGDGS DEPPAHC (SEQ ID NO: 607) Lo siguientes son ligaduras entre el dominio de monómeros 1 y 2 de los dimeros identificados de la inmunoadsorción dé la ¦ biblioteca de dimeros encaminados ß- Klotho M01 C-terminal.

SAPASEPPGSL (SEQ ID NO: 18) KAPVPT (SEQ ID NO: 24) SQDPEFHKV (SEQ ID NO: 12) La siguiente es una secuencia de consenso para los monómeros en el C-terminal de los dimeros identificados de la inmunoadsorción de la biblioteca de' dimeros encaminados ß-Klotho M01 C-terminal. Las cisteinas de armazón denotadas como C.

C[AGLP] PD [EQ] F [KR] C [GKNRS ] SG [NQRS] C [ IL] P [ELQ] [ DHNT] W [LRV] CDG [ DLV] [ D ] DC [EGV] D [GS ] SDE [AET] [DGNP] [-D] [-L]C (SEQ ID O: 232) Las siguientes son ligaduras en el C-terminal de los dimeros identificados de -la inmunoadsorción de la biblioteca de dimeros encaminados ß-Klotho MOl en el C-terminal.

TTPGHT (SEQ ID NO: 608)' AQPT (SEQ ID NO: 609) KEHT (SEQ ID NO: 610) GGAEPT (SEQ ID NO: ' 611) TEHT (SEQ ID NO: 612) ERSGRT (SEQ ID NO: 613) SAPASEPPGSL (SEQ ID NO: 12) EQPT (SEQ ID NO: 614) EPPT (SEQ ID NO: 615) PAHT (SEQ ID NO: 616) KGPEHT (SEQ ID NO: 617)' TASGRT (SEQ ID NO: 618) TATVRT (SEQ ID NO: 619) El siguiente es un resumen de los dimeros encaminados ß- Klotho identificados de la inmunoadsorción de la biblioteca de dimeros encaminados ß-Klotho M06 en el N-terminal (SEQ ID NOS 620 y 620-622, respectivamente, en orden de aparición, Familia 12; vea La Figura 14) . 1 50 BK_Rlc_D09 CASNQFRCGN . GHCLSRTWL CDGVNDCEDG SDEADCSAPA SEPPGSLCPP bKWD18 CASNQFRCGN .GHCLSRTWL CDGVNDCEDG SDEADCSAPA SEPPGSLCPP bKWD19 CAPDEFRCHN TGTCI PRAWL CDGDNDCGDG SDEEGCKG SGPTCPP bKWD20 CAPSQFQCHD NNICLLEGLL CDGEDDCADG SDEADCAAP EHTCPP 5 51 95 BK_Rlc_D09 SQFTCGNGRC VSLGWVCDGL NDCGDGSDES PALCSAPASE PPGSL(SEQ ID NO: 620) bKWD18 SQFTCGNGRC VSLGWVCDGL NDCGDGSDES PALCSAPASE PPGSL(SEQ 10 ID NO: 620) bKWDl9 SQFTCGNGRC VSLGWVCDGL NDCGDGSDES PALCSAPASE PPGSL(SEQ ID NO: 621) bKWD20 SQFTCGNGRC VSLGWVCDGL NDCGDGSDES PALCSAPASE PPGSL(SEQ ID NO: 622) ^t- La siguiente es una secuencia de consenso para los monómeros en el N-terminal de los dimeros identificados de la inmunoadsorción de la biblioteca de dimeros encaminados ß- Klotho M06 en el N-terminal. Las cisteinas de armazón denotadas como C. 20 CA[PS] [DNS] [EQ] F[QR]C[GH] [DN] [GNT] [GHN] [- IT]C[IL] [LPS] [ER] [AGT] [ L]LC DG [DEV] [DN] DC [AEG] DGSDE [AE] [DG]C (SEQ ID NO: 240) Las siguientes son ligaduras entre dominio de monómeros 1 y 2 de los dimeros identificados de la inmunoadsorción de la biblioteca de dimeros encaminados ß-Klotho M06 en el N-terminal .

SAPASEPPGSL (SEQ ID NO: 12) KGSGPT (SEQ ID NO: 623) AAPEHT (SEQ ID NO: 624) La siguiente es una secuencia de consenso para los monómeros en el C-terminal de los dimeros identificados de la inmunoadsorción de la biblioteca de dimeros encaminados ß-Klotho M06 N-terminal. Las cisternas de armazón denotadas como C.

CPPSQFTCGNGRCVSLGWVCDGL NDCGDGSDES PALC (SEQ ID NO: 625) La siguiente es la ligadura en los C-terminales de los dimeros identificados de la inmunoadsorción de la biblioteca de dimeros encaminados ß-Klotho 06 N-terminal.

SAPASEPPGSL (SEQ ID NO: 12) El siguiente es un resumen de los dimeros encaminados ß-Klotho identificados de la inmunoadsorción de la biblioteca de dimeros encaminados ß-Klotho M06 C-terminal (SEQ ID NOS 626-628, respectivamente, en orden de aparición, Familia 13; vea La Figura 14). 1 50 BK_Rlc_D19 CPPSQFTCGN GRCVSLGWVC DGLNDCGDGS DESPALCSAP ASEPPGSLCA BK_Rlc_D20 CPPSQFTCGN GRCVSLGWVC DGLNDCGDGS DESPALCSAP ASEPPGSLCP bKWD17 CPPSQFTCGN GRCVSLGWVC DGLNDCGDGS DESPALCSAP ASEPPGSLCP 51 · 91 BK_Rlc_D19 PGEFTCKSGQ CIPLHWLCDG DNDCGDNSDE SPATCKATVP T ( SEQ ID NO: 626) BK_Rlc_D20 PGQFRCNNGR CIPQPWLCDG DDDCQDNSDE ENCESPGPT. . (SEQ ID NO: 627) bKWD17 PDQFRCRNGR CVPLAWVCDG E.DDCQDNSDE TDCKRSVRT . . (SEQ ID NO: 628) La siguiente es una secuencia de consenso para los monómeros en el N-terminal de los dimeros identificados de la inmunoadsorcion de la biblioteca de dimeros encaminados ß- Klotho M06 en el C-terminal. Las cisteinas de armazón denotadas como C.

CPPSQFTCGNGRCVSLGWVCDGL NDCGDGSDES PALC (SEQ ID NO: 625) La siguiente es la ligadura entre el dominio de monómeros 1 y 2 de los¦ dimeros identificados de la inmunoadsorcion de la biblioteca de dimeros encaminados ß-Klotho M06 en el C-terminal.

SAPASEPPGSL (SEQ ID NO:. 12) La siguiente es una secuencia de consenso para los monómeros en el C-terminal de los dimeros identificados de la inmunoadsorcion de la biblioteca de dimeros encaminados ß-Klotho M06 en el C-terminal. Las cisteinas de armazón denotadas como C.

C[AP]P[DG] [EQ] F [RT] C [KNR] [NS] G [QR] C [ IV] P [LQ] [AHP] W [LV] CDG [ DE] [DN]DC [GQ] DNSDE [EST] [DNP] [-A] [-T]C (SEQ ID NO: 245) Las siguientes son ligaduras en los C-terminales de los dímeros identificados de la inmunoadsorción de la biblioteca de dimeros encaminados ß-Klotho M06 C-terminal.

KATVPT (SEQ ID NO: 629) ESPGPT (SEQ ID NO: 630) KRSVRT (SEQ ID NO: 631) El siguiente es un resumen de los dimeros encaminados ß- Klotho identificados de la inmunoadsorción de la biblioteca de dimeros encaminados ß-Klotho 08 N-terminal (SEQ ID NOS 632-633, 311 y 634, respectivamente, en orden de aparición, Familia 14; vea La Figura 1 ). · 1 50 BK Rlc D25 CRPNEFRCGN . GHCLSQTWV CDGVDDCLDG SDEESCGRPG PGATSAPAAC bKWD21 CAPGEFTCKN TGRCI PLNWR CDGDDDCGDG SDETDCP APTC bKWD22 CPADEFRCSN TGRCVPLSWL CDGEDDCGDG SDETNCK AHTC bKWD23 CGPSQFQCSN . GRCLPATWV CDGDDDCLDG SDEASA T.CATRTC 51 . 98 BK_Rlc_D25 PSNQFPCRGT GICIPLAWVC DGLNDCGDGS DESPATCKAP VPT ( SEQ ID NO: 632) bKWD21 PSNQFPCRST GICIPLAWVC DGLNDCGDGS DESPAHCSAP ASEPPGSL (SEQ ID NO: 633) bKWD22 PSNQFPCRST GICIPLAWVC DGLNDCGDGS DESPATCKAP VPT (SEQ ID NO: 311) bKWD23 PSNQFPCRST GICIPLAWVC DGLNDCGDGS DESPAHCSQD PGFHKV.. ( SEQ ID NO: 634) La siguiente es 'una secuencia de consenso para los monómeros en el N-terminal de los dimeros identificados de la inmunoadsorción de la biblioteca de dimeros encaminados ß-Klotho M08 N-terminal. Las cisteinas de armazón denotadas como C.

C[AGPR] [AP] [DGNS] [EQ] F [QRT] C [GSK] N [GT] [GHR] [-R]C[ILV] [PS] [ALQ] [NST]W [LRV] CDG [ DEV] DDC [GL] DGSDE [AE ] [DNS] [-A] [-T]C (SEQ ID NO: 249) Las siguientes son ligaduras entre dominio de monómeros 1 y 2 de los dimeros identificados de la inmunoadsorción de la biblioteca de dimeros encaminados ß-Klotho M08 en el N-terminal.

GRPGPGATSAPAA (SEQ ID NO: 13) PAPT (SEQ ID NO: 635) KAHT (SEQ ID NO: 636) ATRT (SEQ ID NO: 637) La siguiente es una secuencia de consenso para los monómeros en el C-terminal monómeros de los dimeros identificados de la inmunoadsorción de la biblioteca de dimeros encaminados ß-Klotho M08 N-terminal. Las cisteinas de armazón denotadas como C.

CPSNQFPCRGTGICIPLA VCDGLNDCGDGSDESPATC ( SEQ ID NO: 638) Las siguientes son ligaduras en los C-terminales de los dimeros identificados de la inmunoadsorción de la biblioteca de dimeros encaminados ß-Klotho 08 en el N-terminal.

KAPVPT (SEQ ID NO: 24) SAPASEPPGSL (SEQ ID NO: 12) SQDPGFHKV (SEQ ID NO: '25) El siguiente es un resumen de los dimeros encaminados ß-Klotho identificados de la inmunoadsorción de la biblioteca de dimeros encaminados ß-Klotho M21 N-terminal (SEQ ID NOS 639-640, 312 y 641-643, respectivamente, en orden de aparición, Familia 15; vea La Figura 14). 1 50 BK Rlc D08 CASGEFTCN. NGQCVPLAWR CDGVNDCQDG SDE..KGCTP H bKWD25 CGPDEFRCN .· NGQCIPLPWR CDGVDDCGDN SDEPLEICQA P bKWD29 CGADQFRCG. NGSCVPRAWR CDGVDDCGDG SDEAPEICET P BK Rlc D18 CPPDEFQCRG TKKCLPLAWV CD'GDNDCEDD SDEESCAS AV bKWD27 CGPDQFRCS. SGKCIPQHWL CDGLNDCGDG SDESPATCQR H bKWD28 CGANEFQCRS TGICVPVEWV CDGDNDCGDG SDEPPVCGDS HILPFSTPGP 51 100 BK_Rlc_D08 . TCQSNEFRC RSGRCIPQHW LCDGLNDCGD GSDESPAHCS QDPEFHKV .. (SEQ ID NO: 639) bKWD25 . TCQSNEFRC RSGRCIPQH LCDGLNDCGD GSDEPPAHCS APASEPPGSL (SEQ ID NO: 640) bKWD29 .TCQSNEFRC RSGRCIPQHW LCDGLNDCGD GSDES.QQCS APASEPPGSL (SEQ ID NO: 312) BK_Rlc_D18 HTCQSNEFRC RSGRCIPQHW LCDGLNDCGD GSDES.QQCS APASEPPGSL (SEQ ID NO: 641) bKWD27 . TCQSNEFRC RSGRCIPQHW LCDGLNDCGD GSDES.QQCS APASEPPGSL (SEQ ID NO: 642) bKWD28 STCQPDEFTC SSGRCIPQPW LCDGLNDCGD GSDEPPAHCS APASEPPGSL (SEQ ID NO: 643) La siguiente es una secuencia de consenso para los monómeros en el N-terminal de los dimeros identificados de la inmunoadsorción de la .biblioteca de dimeros encaminados ß-Klotho M21 N-terminal. Las cisteinas de armazón denotadas como C.

C[AGP] [APS] [DGN] [EQ].F [QRT] C [GNRS] [GNS] [GT] [GKQS] [-IK]C[ILV] P[LQRV] [AEHP]W[LRV]CDG[DLV] [DN] DCGD [GN] S'DE.[AEKPS] [GLPS] [-AEV] [-IT]C ) (SEQ ID NO: 254) Las siguientes son ligaduras entre dominio de monómeros 1 y 2 de los dimeros identificados de la inmunoadsorción de la biblioteca de dímeros encaminados ß-Klotho M21 en el N-terminal.

TPHT (SEQ ID NO: 644) QAPT (SEQ ID NO: 645) ETPT (SEQ ID NO: 646) ASAVHT (SEQ ID NO: 647) QRHT (SEQ ID NO: 648) GDSHILPFSTPGPST (SEQ ID NO: 14) La siguiente es una secuencia de consenso para los monómeros en el C-terminal de los dimeros identificados de la inmunoadsorción de la biblioteca de dimeros encaminados ß-Klotho M21 N-terminal. Las cisteinas de armazón denotadas como C .

CQSNEFRCRSGRCIPQHWLCDGLNDCGDGSDE [ SP] [-P] [AQ]QC (SEQ ID NO: 649) Las siguientes son ligaduras en los C-terminales de los dimeros identificados de la inmunoadsorción de la biblioteca de dimeros encaminados ß-Klotho M21 en el N-terminal.

SQDPEFHKV (SEQ ID NO: 18) SAPASEPPGSL (SEQ ID NO: 12) El siguiente es un resumen de los dimeros encaminados ß-Klotho identificados de la inmunoadsorción de la biblioteca de dimeros encaminados ß-Klotho M21 C-terminal (SEQ ID NOS 650-651, respectivamente, en orden de aparición, Familia 16; vea La Figura 14 ) . i 50 bKWD24 CQSNEFRCRS GRCIPQHWLC DGLNDCGDGS DES.QQCSAP ASEPPGSLCP bKWD26 CQSNEFRCRS GRCIPQHWLC DGLNDCGDGS DEPPAHCSAP ASEPPGSLCA 51 87 bKWD24 PGQFRCRNGS CIPATWLCDG DNDCGDNSDE EDCTPPT (SEQ ID NO: 650) bKWD26 ANQFTCGNGN CIPLHWVCDG DNDCQDGSDE TNCEEHT (SEQ ID NO: 651) La siguiente es una secuencia de consenso para los monómeros en el N-terminal de los dimeros identificados de la inmunoadsorción de la biblioteca de dimeros encaminados ß-Klotho M21 C-terminal. Las cisteinas de armazón denotadas como C.

CQSNEFRCRSGRCIPQHWLCDGLNDCGDGSDE [,SP] [-P] [AQ]QC (SEQ ID NO: 649) La siguiente es la ligadura entre los dominios de monómeros 1 y 2 de los dimeros identificados de la inmunoadsorción de. la biblioteca de dimeros encaminados ß-Klotho M21 en el . C-terminal .

SAPASEPPGSL (SEQ ID NO: 12) La siguiente es una secuencia de consenso para los monómeros en el C-terminal de los dimeros identificados de la inmunoadsorción de la biblioteca de dimeros encaminados ß- lotho M21 C-terminal. Las cisteinas de armazón denotadas como C.

C[AP] [AP] [GN]QF[RT]C[GR]NG[NS]CIP[AL] [HT] [LV] CDGDNDC [GQ] D [GN ] SDE [ET] [DN]C (SEQ ID NO: 262) Las siguientes son ligaduras en los C-terminales de los dimeros identificados de la inmunoadsorción de la biblioteca de dimeros encaminados ß-Klotho M21 en el C-terminal.

TPPT (SEQ ID NO: 652) EEHT (SEQ ID NO: 653) El siguiente es un resumen de los dimeros encaminados ß-Klotho identificados de la inmunoadsorción de una biblioteca de dimeros encaminados ß-Klotho M42 en el N-terminal (SEQ ID NOS 654-657, respectivamente, en orden de aparición, Familia 17; vea La Figura 14) . 1 50 BK_Rlc_D21 CPSGQFQCNN . GHCLSATWL CDGVDDCGDG SDEKGCGDSH ILPFSTPGPS BK_Rlc_D24 CRPDEFPCRS TGRCVPRRWV CDGVDDCGDN SDESLAHCQT P bKWD31 CAPDQFRCKS . GNCI PLAWR CDGEDDCRDG SDEESCSAPA SEPPGS.... bKWD32 CQAGQFQCES .GNCVPPNWL CDGENDCADS SDEANCRRAA H 51 99 BK_Rlc_D21 TCQPDEFTCS SGRCIPQPWL CDGLNDCGDG SDEPPAHCSA PASEPPGSL (SEQ ID NO: 654) BK_Rlc_D24 TCQPDEFTCS SGRCIPQPWL CDGLNDCGDG SDEPPAHCSA PASEPPGSL (SEQ ID NO: 655) bKWD31 LCQPDEFTCS SGRCIPQPWL CDGLNDCGDG SDEPPAHCSA PASEPPGSL (SEQ ID NO: 656) bKWD32 TCQPDEFTCS SGRCIPLAWV CDGLNDCGDG SDES.PATCKA PVPT (SEQ ID NO: 657) La siguiente es una secuencia de consenso para los monómeros en el N-terminal de los dimeros identificados de la inmunoadsorción de la biblioteca de dimeros encaminados ß-Klotho M42 N-terminal. Las cisteinas de armazón denotadas como C.

C[APQR] [ASP] [DG] [EQ] F [ PQ] C [EKNR] [NS] [GT] [GHN] [-R]C[ILV] [PS] [ALPR] [ANRT] W[LRV]CDG[EV] [ DN ] DC [AGR] D [GNS ] SDE [AEKS ] [GLNS] [-A] [-H]C (SEQ ID NO: 265) Las siguientes son ligaduras entre el dominio de monómeros 1 y 2 de los dimeros identificados de la inmunoadsorción de la biblioteca de dimeros encaminados ß-Klotho M42 N-terminal.

GDSHILPFSTPGPST (SEQ ID NO: 14) QTPT (SEQ ID NO: 658) SAPASEPPGSL (SEQ ID NO: 12) RRAAHT (SEQ ID NO: 29) La siguiente es una secuencia de consenso para los monómeros en el C-terminal de los dimeros identificados de la inmunoadsorción de la biblioteca de dimeros encaminados ß-Klotho M42 N-terminal. Las cisteinas de armazón denotadas como C.

CQPDEFTCSSGRCIP [LQ] [AP] W [LV] CDGLNDCGDGSDEPPAHC (SEQ ID NO: 659) Una secuencia de semilla adicional que contiene mutaciones múltiples en el dominio de monómero ß-Klotho M42 se identificó en la salida de la inmunoadsorción de la biblioteca de dimeros encaminados ß-Klotho M42 N-terminal. CQPDEFQCGS GRCIPQTWVC DGLNDCGDGS DESPAHC (SEQ ID NO: 1239) Las siguientes son ligaduras en los C-terminales de los dimeros identificados de la inmunoadsorción de la biblioteca de dimeros encaminados ß-Klotho M42 N-terminal.

SAPASEPPGSL (SEQ ID NO: 12) KAPVPT (SEQ ID NO: 24) El siguiente es un resumen de los dimeros encaminados ß-Klotho identificados de la inmunoadsorción de la biblioteca de dimeros encaminados ß-Klotho M42 en el C-terminal (SEQ ID NOS 660-662, respectivamente, en orden de aparición, Familia 18; vea La Figura 14). 1 50 BK_Rlc_D22 CQPDEFTCSS GRCIPQPWLC DGLNDCGDGS DEPPAHCSAP ASEPPGSLCR BK_Rlc_D23 CQPDEFTCSS GRCIPQPWLC DGLNDCGDGS DEPPAHCSAP ASEPPGSLCR bKWD30 CQPDEFQCGS GRCIPQTWVC DGLNDCGDGS DESPAHCSQD P .. EFHKVCR 51 89 BK_Rlc_D22 PDEFRCKNGR CIPQTWVCDG EDDCQDSSDE TDCESTVRT (SEQ ID NO: 660) BK_Rlc_D23 PDEFRCRNGR CVPLTWRCDG EDDCQDGSDE EGCAPPT.. (SEQ ID NO : 661) bKWD30 PGEFQCGSGH CIPGPWVCDG DPDCQDGSDE ANCEQRT .. (SEQ ID NO: 662) La siguiente es una secuencia de consenso para los mónomeros en el N-terminal de los dimeros identificados de la inraunoadsorción de la biblioteca de dimeros encaminados ß-Klotho M42 C-terminal, Las cisteinas de armazón denotadas como C.

CQPDEFTCSSGRCIPQP LCDGLNDCGDGSDEPPAHC (SEQ ID NO: 663) Las siguientes son ligaduras entre dominio de monómeros 1 y 2 de los dimeros identificados de la inmunoadsorción de la biblioteca de dimeros encaminados ß-Klotho M42 C-terminal. SAPASEPPGSL (SEQ ID NO: 12) · SQDPEFHKV (SEQ ID NO: 18) La siguiente es una secuencia de consenso para los monómeros en el C-terminal de los dimeros identificados de la inmunoadsorción de la biblioteca de dimeros encaminados ß-Klotho 42 en el C-terminal. Las cisteinas de armazón denotadas como C.

CRP [ DG] EF [QR] C [GKR] [NS] G [HR] C [ IV] P [GLQ] [ PT] W [RV] CDG [ DE] [DP] DC QD[GS] SDE [AET] [ DG ] C (SEQ ID NO: 270) Las siguientes son ligaduras en los C-terminales de los dimeros identificados de la inmunoadsorción de la biblioteca de dimeros encaminados ß-Klotho M42 C-terminal.

ESTVRT (SEQ ID NO: 664) APPT (SEQ ID NO: 665) EQRT (SEQ ID NO: 28) El siguiente es un resumen de los dimeros encaminados ß-Klotho identificados de la inmunoadsorción de la biblioteca de dimeros encaminados ß-^Klotho 50 N-terminal (SEQ ID NOS 666-674, respectivamente, en orden de aparición, Familia 19; vea La Figura 1 ) . 1 50 BK_Rlc_D05 CAAGQFRCHN SDTCLPGAWV CDGDNDCGDN SDEAS.. CQKRTC BK_Rlc_D07 CAPNEFRCRS TGRCIPVNWV CDGDDDCADN SDEAG CPEPTC bKWD35 CAPGEFQCS. NGNCLPPNWL CDGVDDCGDG SDESAD ....CTEPTC bKWD36 CAPDEFRCR. NGNCIPLPWV CDGENDCRDD SDEEDCEAPG RTC bKWD38 CAAGEFQCS. SGRCLPRPWV CDGDNDCGDD SDETNCR ASAHTC bKWD39 CRSGEFRCK. NGRCIPQHWV CDGENDCGDD SDETNCGRQG PGATSAPAAC BK_Rlc_D10 CGADQFQCG. SGRCVPATWR CDGEDDCGDG SDEENCSQDP .... EFHKVC bKWD37 CLSDQFQCNN YETCIPRPWL CDGDDDCVDG SDEED CETRTC BK Rlc D17 CLPGQFTCG . NGRCIPLPWV CDGVNDCEDN SDEESCEQH TC 51 100 BK_Rlc_D05 HSFNQFECRN GQCIPLHLVC DGVPDCGDNS DETDCGDSHI LPFSTPGPST (SEQ ID NO: 666) BK_Rlc_D07 HSFNRFECRN GQCIPLHLVC DGVPDCGDNS DETDCGDSHI LPFSTPGPST (SEQ ID NO: 667) bKWD35 HSFNQFECRN GQCIPLHLVC DGVPDCGDNS DETDCGDPHI LPFSTPGPST (SEQ ID NO: 668) bKWD36 HSFNQFECRN GQCIPLHLVC DGVPDCGDNS DETDCGDSHI LPFSTPGPST (SEQ ID NO: 669) bKWD38 HSFNQFECRN GQCIPLHLVC DGVPDCGDNS DETDCGDSHI LPFSTPGPST (SEQ ID NO: 670) bK D39 HSFNQFECRN GQCIPLHLVC DGVPDCGDNS DETDCGDSHI LPFSTPGPST (SEQ ID NO: 671) BK_Rlc_D10 HSFNQFECRN GQCIPLHLVC DGVPDCGDNS DETDCGDSHI LPFSTPGPST (SEQ ID NO: 672) bKWD37 HSFNQFECRN GQCIPLHLVC DGVPDCGDNS DETDCGDSHI LPFSTPGPST (SEQ ID NO: 673) BK_Rlc_D17 HSFNQFECRN GQCIPLHLVC DGVPDCGDNS DETDCGDSHI LPFSTPGPST ( SEQ ID NO: 674) La siguiente es una secuencia de consenso para los mónomeros en el N-terminal de los dimeros identificados de la inmunoadsorción de la biblioteca de dimeros encaminados ß-Klotho 50 N-terminal. Las cisteinas de armazón denotadas como C.

C [AGLR] [APS] [DGN] [EQ] F [RQT] C [GHKNRS] [NS] [GSTY] [DEGNR] [-RT]C[ILV] P[AGLPRV] [AHNPT] [LRV] CDG [DEV] [ DN ] DC [AEGRV] D [ DGN ] SDE [AEST ] [ADGNS] [-D]C (SEQ ID. NO: 274) Las siguientes son ligaduras entre dominio de monómeros 1 y 2 de los dimerosidentificados dé la inmunoadsorción de la biblioteca de dímeros encaminados ß-Klotho M50 en el N-terminal.

QKRT (SEQ ID NO: 675) PEPT (SEQ ID NO: 676) TEPT (SEQ ID NO: 677) EAPGRT (SEQ ID NO: 678) RASAHT (SEQ ID NO: 679) GRQGPGATSAPAA (SEQ ID NO: 680) SQDPEFHKV (SEQ ID NO: 18) ETRT (SEQ ID NO: 681) EQHT (SEQ ID NO: 682) La siguiente es una secuencia de consenso para los monómeros en el C-terminal de los dímeros identificados de la inmunoadsorción de. la biblioteca de dímeros encaminados ß- Klotho 50 N-terminal. Las císteinas de armazón denotadas como C.

CHSFNQFECRN GQCIPLHLVC DGVPDCGDNS DETDC (SEQ ID NO: 683) Lo siguiente es la ligadura en los C-terminales de los dímeros identificados de la inmunoadsorción de la biblioteca de dímeros encaminados ß-Klotho M50 del N-terminal.

GDPHILPFSTPGPST (SEQ ID NO: 684) El siguiente es un resumen de los dimeros encaminados ß-Klotho identificados de la inmunoadsorción de la biblioteca de dimeros encaminados ß-Klotho 50 C-terminal (SEQ ID NOS 685-686, respectivamente, en orden de aparición, Familia 20; vea La Figura 1 ) . 1 50 bKWD33 CHSFNQFECR NGQCIP.LHLV CDGVPDCGDN SDETDCGDSH ILPFSTPGPS bKWD34 CHSFNQFECR NGQCIPLHLV CDGVPDCGDN SDETDCGDSH ILPFSTPGPS 51 100 bKWD33 TCQSGEFRCQ NTRTCLPLKL' LCDGVDDCLD DSDEKDCGTT GRT (SEQ ID NO: 685) bKWD34 TCLPGQFRCK TGR.CIPRA VCDGVDDCED DSDEADCGRP GPGATSAPAA (SEQ ID NO: 686) La siguiente es una secuencia de consenso para los mónomeros en el N-terminal de los dimeros identificados de la inmunoadsorción de la biblioteca de dimeros encaminados ß-Klotho M50 en el C-terminal. Las cisteinas de armazón denotadas como C.

CHSFNQFECRN GQCIPLHLVC DGVPDCGDNS DETDC ( SEQ ID NO: 683) La siguiente es la ligadura entre el dominio de monómeros 1 y 2 de los dimeros identificados de la inmunoadsorción de la biblioteca de dimeros encaminados ß-Klotho M50 C-terminal.

GDPHILPFSTPGPST (SEQ ID NO: 684) La siguiente es una secuencia de consenso para los monómeros en el C-terminal de los dimeros identificados de la inmunoadsorción de la biblioteca de dimeros encaminados ß-Klotho M50 C-terminal. Las cisteinas de armazón denotadas como C.

C[LQ] [PS]G[EQ] FRC[KQ] [NT] [GT] R [ -T ] C [ IL] P [LR] [AK] [LW] [LV]CDG VDDC[EL] DDSDE [AK] DC (SEQ ID NO: 284) Las siguientes son ligaduras en los C-terminales de los dimeros identificados de la inmunoadsorción de la biblioteca de dimeros encaminados ß-Klotho M50 en el C-terminal.

GTTGRT (SEQ ID NO: 687) GRPGPGATSAPAA (SEQ ID NO: 13) EJEMPLO 8 Este ejemplo describe proteínas de enlace generadas y separadas por exclusión hechas por la combinación de los monómeros de enlace FGFRlc- y ß??????.

Un método basado en PCR se usó, en el cual los acumulados de secuencias de proteína de codificación ß-Klotho- o FGFRlc donde PCR-amplificado, digerido, y ligado junto para ccrear moléculas biespecíficas .

En general, las secuencias de codificación de (i) monómeros de enlace FGFRlc y (ii) monómero de enlace beta-klotho y proteínas de dímero individualmente fueron PCR-amplificadas' usando 5' cebador U_vs_para (ggtcatactgaaccgATGGCCGGTCCGGCCTAC) (SEQ ID NO: 688) y 3' cebador EveNut (aaa agg ccc cag agg cct tct gca atg a) (SEQ ID NO: 689) para crear "productos A." Estos genes también fueron amplificados por PCR con 5' cebador BpmI_for (atgccccgggtctggaggcgtctggtggttc) (SEQ ID NO: 690) y 3' cebador EveNutUrescate (ggtaccatgcttgcattcGGCCCCAGAGGCCTTCTGCAATGA) (SEQ ID NO: 691) para crear "productos B." ' Los productos PCR se purificaron con un bloque de 96 pocilios Qiagen y entonces se digirieron con endonucleasas de restricción. Los "Productos A" se digirieron con BsrDI, "Productos B" con Bpml; y todos se purificaron con un bloque Qiagen de 96 pocilios.

Las ligaduras de dos fragmentos se realizaron en 12 acumulados. En cada ligadura, 60-120 ng de cada fragmento se ligó en un volumen de 10 ]i usando ligasa ADN T4 (NEB) POR 4 horas en temperatura ambiente. Los productos ligados (es decir, genes para las proteínas de enlace) en 0.5 pL de ligadura preférencialmente se amplificaron por PCR usando cebador 5' Rescate_Fusión_para (ggtcatactgaaccg) (SEQ ID NO: 692) y 3' cebador Rescatel_rev (ggtaccatgcttgcattc) (SEQ ID NO: 693) . Los productos se purificaron, se digirieron con Sfil, y entonces se purificaron con gel, y se subclonaron en el vector de expresión pEVE. Los clones correctos se identificaron por secuencia de ADN.

Proteínas de enlace FGFRlc/PKlotho Se generó una serie de proteínas de enlace heterodiméricas que enlazaría a FGFRlc y ß-Klotho (vea Figuras 22-23) .

Lo siguiente resume los monómeros FGFRlc que se usaron para generar un conjunto de proteínas de enlace que fueron probadas para actividad agonista (vea La Figura 10, 15 y 16) . Los mult ímeros biespecí fieos que resultan se mostraron para enlazar FGFRlc y ß-Klotho por ELISA (La Figura 24) y Alphascreen (La Figura 25) . Los multímeros biespecí fieos pueden bloquear o. no el enlace FGF-21 al complejo FGFRlc/pKlotho en Alphascreen (La Figura 26) pero no bloquear la asociación de FGFRlc y ß-Klotho en Alphascreen (La Figura 27) . Los multímeros muestran la avidez incrementada para el complejo FGFRlc/p-Klotho relativo, a cabezas de combate constituyentes aisladas al enlazar ELISA (La Figura 28) y para el complejo FGFRlc/ .-Klotho sobre la superficie de las células transfectadas por citometría de flujo (La Figura 29) . Adicionalmente, los multímeros inducen un FGF-21 como respuesta agonista cuando se- agrega a las células reportero de luciferasa sensible FGF-21 (La Figura 30).

M03 CGAGLFTCRSTKI.CISQAWVCDGVDDCEDNSDEKNCSAPASEPPGSL (SEQ ID NO: 287) M08 CGAGQFTCRDTNICISRAWRCDGVDDCEDNSDEADCSQDPEFHKV (SEQ ID NO: 694) M15 CGANQFTCHNTNICISQAWVCDGVDDCEDNSDEKNCSAPASEPPGSL (SEQ ID NO: 289) M23 CGSNQFTCRSTNICISQAWVCDGVDDCEDDSDETGCSQDPEFHKV (SEQ ID NO: 290) M31 CLSDQFTCRSTNICLPLQ VCDGDDDCEDNSDEEDCSAPASEPPGSL (SEQ ID NO: 291) M33 CRLNEFPCGSGSCISLHWVCDSVPDCRDDSDETDCPERT (SEQ ID NO: 292) M03mut01 CGAGLFTCRSTNICISQV VCDGVDDCEDNSDEDSCSAPASEPPGSL (SEQ ID NO: 293) M03mut04 CGAGLFTCRSTNICISQAWVCDGVDDCEDNSDENYCSAPASEPPGSL (SEQ ID NO: 294) M03mut05 CGAGLFTCRSTNICISQAWVCDGVDDCEDNSDETNCSAPASEPPGSL (SEQ ID NO: 295) M03mut06 CGASLFTCRRSNICISQAWVCDGVDDCEDNSDEMNCSAPASEPPGSL (SEQ ID NO: 296) 03mut09 CGEGLFTCRSTNICISHA VCDGVDDCEDNSDENNCSAPASEPPGSL (SEQ ID NO: 297) M23mutl0 CGANLFTCQSTNICISDAWVCDGVDDCEDNSDETTCSQDPEFHKV (SEQ ID NO: 298) M23mutll CGANLFTCRSTNICISPAWVCDGVDDCEDYSDEIGCSQDPEFHKV (SEQ ID NO: 299) M23mutl4 CGSDMFTCRSTNICISKVWVCDGVDDCEDDSDERGCSQDPEFHKV (SEQ ID NO: 300) M23mutl5 CGSNLFTCRRTNICISKA VCDGVDDCEDNSDETGCSQDPEFHKV (SEQ ID NO: 695) M23mutl6 CGSNLFTCRSTNICISPA VCDGVDDCDDDSDETGCSQDPEFHKV (SEQ ID NO: 696) 23mutl7 CGTNLFTCRSTNMCISQAWVCDGVDDCEDNSDETVCSQDPEFHKV (SEQ ID NO: 697) Lo siguiente resume los monómeros ß-Klotho y dimeros que se usaron para generar el conjuntó de proteínas de enlace (vea Figuras 15, 16 y 32) : M01 CLPDEFQCGSGRCIPQTWVCDGLNDCGDGSDESPAHCSQDPEFHKV SEQ ID NO: 304) M42 CQPDEFTCSSGRCIPQPWLCDGLNDCGDGSDEPPAHCSAPASEPPGSL SEQ ID NO: 305) M50 CHSFNQFECRNGQCIPLHLVCDGVPDCGDNSDETDCGDSHILPFSTPGPST SEQ ID NO: 306) LNR_M01 CIAAKLCEALDGDGVCHKECDLEECDWDGGDCQRIFLTDPT (SEQ ID NO: 1243) D01 CLPDEFQCGSGRCIPQHWLCDGLNDCGDGSDEPPAHCSAPASEPPGSLCRAGEFRC SNGRCVPLTWLCDGEDDCQDNSDEKNCAQPT (SEQ ID NO: 307) D02 CLPDEFQCSSGRCI QTWVCDGL DCGDGSDESPAHCSQDPEFHKVCPSSEFRCNN GRCI PLHWVCDGDDDCQDNSDETDCERSGRT (SEQ ID NO: 308) WD03 CLPDEFQCGSGRCIPQTWVCDGLNDCGDGSDESPAHCSQDPEFHKVCRPGEFRCNN GRCVPQTWVCDGEDDCGDNSDETDCSAPASEPPGSL (SEQ ID NO: 309) D04 CLPDEFQCGSGRCIPQTWVCDGLNDCGDGSDESPAHCSQDPEFHKVCLSDQFRCGNGRCVP RAWLCDGDNDCQDGSDETNCEQPT (SEQ ID NO: 601) D05 CLPDEFQCGSGRCIPQTWVCDGLNDCGDGSDESPAHCSQDPEFHKVCLPGQFPCGNGRCIP ETWLCDGDDDCQDGSDEKGCAQPT (SEQ ID NO: 1264) WD06 CLPDEFQCGSGRCIPQTWVCDGLNDCGDGSDESPAHCSQDPEFHKVCQPNEFQCGN GRCIPAQWLCDGEDDCQDNSDEEDCTEHT (SEQ ID NO: 310) WD08 CLPDEFQCGSGRCIPQTWVCDGLNDCGDGSDESPAHCSQDPEFHKVCQSNEFRCRNGQCIP LT LCDGDNDCLDSSDEESCPAHT (SEQ ID NO: 603) WD21 CAPGEFTCKNTGRCIPLNWRCDGDDDCGDGSDETDCPAPTCPSNQFPCRSTGICIPLAWVC DGLNDCGDGSDESPAHCSAPASEPPGSL (SEQ ID NO: 633) WD22 CPADEFRCSNTGRCVPLS LCDGEDDCGDGSDETNCKAHTCPSNQFPCRSTGICIP LA VCDGLNDCGDGSDESPATCKAPV.PT (SEQ ID NO: 311) WD25 CGPDEFRCNNGQCIPLPWRCDGVDDCGDNSDEPLEICQAPTCQSNEFRCRSGRCIPQHWLC DGLNDCGDGSDEPPAHCSAPASEPPGSL (SEQ ID NO: 640) WD28 CGANEFQCRSTGICVPVEWVCDGDNDCGDGSDEPPVCGDSHILPFSTPGPSTCQPDEFTCS SGRCI PQPWLCDGLNDCGDGSDEPPÁHCSAPASEPPGSL (SEQ ID NO: 643) D29 CGADQFRCGNGSCVPRAWRCDGVDDCGDGSDEAPEICETPTCQSNEFRCRSGRCIP QHWLCDGLNDCGDGSDESQQCSAPASEPPGSL (SEQ ID NO: 312) WD31 CLPDEFRCGNGNCISVAWRCDGVDDCEDGSDEEDCESPEHTCQSNEFRCRSGRCIP QHWLCDGLNDCGDGSDESPAHCSQDPEFHKV (SEQ ID NO: 313) Preparación y prueba de las proteinas de enlace Las proteinas de enlace se separaron inicialmente para actividad como preparaciones crudas en Usados bacterianos (vea La Figura 31) .

Producción de la protelna de Usados calentados en 1 mL (Día 1): Los clones individuales se inocularon en pocilios de una placa de pocilio profundo Costar de 96 pocilios que contiene 500 pL/well de 2xYT/ 40 µ? /mL de kanamicina. Los cultivos se cultivaron toda la noche (las puntas de inoculación quedaron en los pocilios) mientras se sacuden en 300 rpm a 37°C. Este proceso permitió la separación de miles de monómeros individuales, parcialmente purificados en el nivel de lisado de célula.

(Día 2) 100 pL de cultivo de toda la noche se inoculó en una nueva placa de pocilio profundo Costar de 96 pocilios que contiene 1 mL/pocillo de '2xYT/ 40 µg/mL de kanamicina + 1 mM CaCl2. (El cultivo de toda la noche restante se logró por la adición de 25% concentración de glicerol final y entonces se almacenó en -80°C para un uso posterior.) Las placas se cubrieron con cinta AirPore (Qiagen) y los cultivos se cultivaron sacudiéndose en 37.5 rpm a 37 °C hasta que ODgoo de ~ 0.8 a 1.0 se alcanzó.. Una vez que se alcanzó el ??e?? deseado, los cultivos se inducieron con 1 mM IPTG por 3 hr mientras se sacudían en 375 rpm a 37°C. Las placas que contenían los cultivos inducidos entonces se centrifugaron con 15 min en 3600 rpm a 4°C para células peletizadas. El supernatante se removió y se descartó, y la célula peletizada restante se resuspendió en 100 yL de TBS [pH 7.5] /l mM CaCl2. Las células resuspendidas se transfirieron de la placa de pocilio profundo de 96 pocilios a una placa PCR de prolipopileno de 96 pocilios y calentada por .5 min a 65°C en una máquina de PCR. Las células calentadas/lisadas entonces se centrifugaron por 15 min en 3600 rpm a 4°C. Después de la centrifugación, se completó la producción de proteína, y las lisados de proteína estuvieron listos para la caracterización en ELISA, Alphascreen y' un ensayo de célula reportera de luciferasa sensible FGF-21.

Después de la separación inicial en el nivel de lisado, las proteínas de enlace FGFRlc/ Klotho se seleccionaron para expresión escalada y purificación, utilizando los mismos métodos usados para expresión y purificación de las ojivas originales (vea Ejemplo 7).

EJEMPLO 9 Este ejemplo describe los experimentos que demuestran la activación de expresión de luciferasa en una línea celular reportera en respuesta a las molécula miméticas FGF-21 y FGF-21 Las líneas celulares reporteras usadas fueron derivadas de AM-1D, una línea celular derivada de células de Ovario de Hámster Chino (CHO) y obtenidas del Banco de Células de Amgen Research. Las líneas celulares se mantuvieron en Medio Eagle Modificado de Dúlbecco (DMEM) + 10% suero bovino de feto (FBS) (Gibco) suplementadas con aminoácidos no esenciales (Mediatech) y piruvato de sodio (Mediatech) .

Una línea celular AM-1D establemente expresando FGFRlc humano se derivó (AM-lD-huFGFRlc) . La transfección transitoria de esta línea celular en un formato de placa de 96 pocilios con pTT5-cyno ß-Klotho (25ng ADN/pocillo) , constructo reportero de pFR-luciferasa (150ng ADN/pocillo) (Promega) y transactivador pFA-Gal4-Elk (10ng/well ADN) (Stratagene) producen células que dan respuesta a FGF-21.

Las células AM-1D huFGFRlc se emplacaron sobre un día 1 en una densidad de 2.5 X 104 'células/ pocilio sobre placas de 96 pocilio recubiertas con poli-D-lisina blanca (Becton Dickinson) y se incubaron durante la noche a 37°C, 5% C02. En el día 2 las células se transfectaron con ADN como se describe en la presente y se incubaron durante la noche a 37°C, 5% CO2. EL día 3 el medio se cambió sobre las células y se remplazó con medio de ensayo (medio Ham F12 + 1% albúmina de suero bovina) . . EL día 4 se realizó el ensayo. Las diluciones del articulo probado (lisado bacteriano crudo que contiene una proteina de enlace, o una proteína de enlace purificada) se hicieron en un medio de ensayo y se agregaron a placas de 96 pocilios. Cada placa de 96 pocilios también incluía una valoración de control positivo humano FGF-21. Las células se incubaron a 37 °C, 5% C02 por 4 horas, después de que el reactivo de luciferasa Promega Steadyglo se agregó en una relación de 1:1 con mezcla, de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La actividad agonista fue directamente proporcional a la señal de luminiscencia. una serie de líneas celulares A -1D fueron derivadas que establemente expresaron FGFRlc, ß-Klotho humano más el transactivador Gal4-Elk y' el reportero FA-luciferasa (serie 371F) . Cuatro clones se usaron en estos estudios (371F-1D2, 371F-1E11, 371F-2E10, 371F-2G10) . Las células A -1D 371F se emplacaron el día 1 en una densidad de 2.0 X 104 células/ pocilio sobre placas de 96 pocilios recubiertas con poli-D-lisina blanca (Becton Dickinson) y se incubaron durante la noche a 37°C, 5% C02. EL día 2 el medio se cambió sobre las células y se remplazó con medio de ensayo (medio de Ham F12 + 1% albúmina de suero bovino) . El día 3 se realizó el ensayo. Las diluciones del artículo probado (lisado bacteriano crudo que contiene una proteína de enlace, o una proteína de enlace purificada) se hicieron en un medio de ensayo y se agregaron a las placas de 96 pocilios. Cada placa de 96 pocilios también incluyó una valoración de control positivo de FGF-21 humano. Las células se incubaron · a 37 °C, 5% C02 por 4 horas, después de que el reactivo, de luciferasa Promega Steadyglo se agregó en una., relación de 1:1 con mezcla, de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La actividad agonista fue directamente proporcional a la señal de luminiscencia.

Estos ensayos permitieron la determinación de la potencia y eficacia de la proteína de enlace relativa una a la otra y a FGF-21humano nativo, permitiendo la clasificación de las proteínas de enlace basándose en su actividad biológica. Los ejemplos de los datos de este ensayo se muestran en la Figuras 30, 31, 33-35, 38-49.

EJEMPLO 10 Este ejemplo describe experimentos que permiten la identificación de pares específicos de receptor FGF y el co-receptor de proteína klotho que permite la activación por molécula mimética FGF-21 o una FGF-21. Un ejemplo de estos datos se muestra en La Figura 37.

Las células L6 se mantuvieron en el medio modificado de Eagle modificado de Dulbecco suplementado con 10% suero bovino de feto y penicilina/estreptomicina. Las células se transfectaron con vectores de expresión usando el reactivo de transfección Lipofectamina 2000 (Invitrogen) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Las células L6 se emplacaron en placas de 24 pocilios (106 células/pocilio) se transfectaron con varios receptores FGF, incluyendo FGFRlb, le, 2b, 2c, 3b, 3c y FGFR4 y aKlotho . o Klotho y suero en ayuno de 0.2% albúmina de suero bovina durante la noche antes del tratamiento con molécula mimética FGF-21 o una FGF-21. Los medios se aspiraron después de 10 min y las placas se congelaron instantáneamente en nitrógeno líquido. Las células de cada pocilio se Usaron en 60 µ? de solución amortiguadora de lisis completa y ERK total y fosforilado se midió usando el kit Phospho-ERKl/2 de lisádo de. células enteras MSD (Meso Scale Discovery, Gaithersburg, Maryland) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

EJEMPLO 11 Este ejemplo describe los experimentos que demuestran la inducción de fosforilización Erk en adipocitos humanos cultivados en respuesta a las moléculas miméticas FGF-21 y FGF-21 Cultivo y diferenciación de la células primarias de adipOCitOS h"Tnanog Los preadipocitos humanos subcutáneos criopreservados (Lot#SL0037 ) de Zen-Bio, Research Triangle Park, NC se almacenaron en un tanque de nitrógeno liquido.

Las células se removieron del nitrógeno liquido y se colocaron inmediatamente dentro de un baño de agua de 37 grados con agitación. Las células se agregaron a un tubo de centrifugado de fondo cónico estéril que contiene 10ml de Medio de preadipocito por medio de células (Zen-Bio, PM-1). Las células se centrifugaron en 280xg, 20 grados, 5min. El medio se aspiró y las células se resuspendieron en PM-1.

Las células se contaron y aproximadamente 1.3 X 106 de las células se emplacaron en matraces de cultivo T-175 en medio PM-1. Las células se cultivaron en una incubadora a 37 grados humificados con 5% C02.

Las células se incubaron hasta que fueron confluentes en un 85-90% (cerca de 3-4 días) .

El medio se aspiró y los preadipocitos se lavaron 2 veces con solución estéril PBS . La PBS se removió y las células se liberaron del matraz añadiendo 5ml de solución 0.25% tripsina/2.21mM EDTA. Las células se permitieron tripsinizar por 5 minutos a 37 grados. La tripsina se neutralizó con 15ml de PM-1, se pusieron a girar, resuspendida en PM-1 y contaron. 400,000 células se emplacaron por pocilio en 3ml PM-1 sobre Greiner Bio-One 6-placas de pocilio (V R #82050-842) y se cultivaron en una incubadora a 37 grados humificada 5% C02.

Una vez que las células fueron completamente confluentes (24-48 hrs después de emplacarlas ) , la diferenciación fue inducida removiendo el volumen entero de PM-1 de todos los pocilios y agregando 3ml de Medio de Diferenciación de Adipocitos (Zen-Bio, DM-2). Entonces las células se incubaron por 7 días a 37 grados y 5% C02.

Después de 7 días, se removieron 1.8ml de DM-2 y se agregaron 2.4mi de Medio de Mantenimiento de Adipocito (Zen-Bio, AM-1). Después de eso cada 2-3 días, se removieron 1.8ml de AM-1 y se agregaron 1.8ml de AM-1 fresca. El último intercambio de AM-1 fue el día 14 de diferenciación.

Tratamiento primario de adipocitos humanos para pERK: En el día 17 de diferenciación, todo el medio se removió de los pocilios y cada pocilio se lavó dos veces con 2ml de PBS caliente. Los adipocitos estuvieron en ayunos de suero por 3hrs en medio de adipocito de inanición de suero que comprende de 1:1 DMEM de glucosa baja (Invitrogen, #11885) y F12 (Invitrogen, #11765) con 0.2% BSA libre de ácido graso (Sigma, A9205) , 2ml por pocilio.

Después de 3hr de incubación, se removieron 1. ml de medio y las células con. las dosis propias de proteina de enlace por 10 minutos a 37 grados (agregar 60uL de 11X muestra en medio de inanición para cada pocilio) . El FGF-21 recombiante se usó como control positivo.

Después de lOmin de tratamiento, el medio se aspiró de los pocilios y las células se lavaron dos veces con 2ml PBS fría.

Las células se Usaron en 175pl/pocillo de solución amortiguadora de lisis.

Solución amortiguadora de lisis : 50 mM Tris-HCl, pH 7.4 150 mM NaCl 1% Nonidet P40 desoxicolato de Sodio al 0.25% 1 mM NaF 1 tableta completa de inhibidor /50 mi (Roche, Indianapolis, IN) 0.7 pg/ml Pepstatina 1 m Na3V04 El inhibidor de proteasa, Na3V04, lmM NaF y la pepstanina fresca se agreagron antes de la lisis.

La placa se congeló instantáneamente en nitrógeno liquido y almacenada a -80°C hasta su uso posterior o procedió con la recolección de lisado.

Antes de recolectar la lisado, la placa se sacudió por 20min en 4°C y el lisado. se transfirió a tubos eppendorf de 1.5 mi.

Los Usados se giraron en 15, 000rpm por 30 minutos en 4°C.

Los Usados (no diluidos) se cuantificaron con el ensayo de proteina de DC (Blo-Rad, Hercules, CA, Cat# 500-0116) .

Ensayo MSP total/Fosfo ERK: El kit de lisado de células .enteras fosfo MSD (Meso-Scale Discovery, Gaithersburg, MD) Total ERK1/2 (cat# K11107D-1, V2) se usó para probar los Usados de adipocito humano .

Se siguió el protocolo sobre el paquete insertado incluido en el kit. 25ug de lisado de células se agregó a cada pocilio.

Una vez que terminó el ensayo, el % de fosfoproteína se determinó de acuerdo con la fórmula MSD: %fosfoproteína= ( (2*pERK) / (pERK+Total ERK))*100 Un ejemplo de estos datos se muestra en la Figura 36.

Proteínas de enlace con actividad agonista similar a los ensayos basados en células in vitro FGF-21 Lo siguiente sumariza las secuencias de las proteínas de enlace biespecífico FGFRlc/pKlotho que se ha mostrado tienen potencia similar a, o exceden esa del FGF-21 nativo. Las eficacias de estas proteínas varían de 10% a 100% que la FGF-21 nativa. Los resultados de los ensayos se muestran en las Figuras 38-45, 47-50., Se mostró que estas proteínas no activan señalización en ausencia de ß-Klotho (La Figura 46).

Monómero N-terminal listado primero bK D01_RlcM03mut01 (C3.090) CLPDEFQCGSGRCI PQHWLCDGLNDCGDGSDEPPAHCSAPASEPPGSLCRAGEFRC SNGRCVPLTWLCDGEDDCQDNSDEKNCAQPTCGAGLFTCRSTNICISQVWVCDGVDDCEDN SDEDSCSAPASEPPGSL (SEQ ID NO: 335) ; bKWD01_RlcM03mut04 (C3091) CLPDEFQCGSGRCI PQHW.LCDGLNDCGDGSDEPPAHCSAPASEPPGSLCRAGEFRC SNGRCVPLTWLCDGEDDCQDNSDEKNCAQPTCGAGLFTCRSTNICISQAWVCDGVDDCEDN SDE YCSAPASEPPGSL (SEQ ID NO: 336); bK D01_RlcM03mut05 (C3092) CLPDEFQCGSGRCIPQHWLCDGLNDCGDGSDEPPAHCSAPASEPPGSLCRAGEFRC SNGRCVPLTWLCDGEDDCQDNSDEKNCAQPTCGAGLFTCRSTNICISQAWVCDGVDDCEDN SDETNCSAPASEPPGSL (SEQ ID NO : 337); bKWD01_Rlc 03mut06 (C3093) CLPDEFQCGSGRCIPQHWLCDGLNDCGDGSDEPPAHCSAPASEPPGSLCRAGEFRC SNGRCVPLTWLCDGEDDCQDNSDEKNCAQPTCGASLFTCRRSNICISQAWVCDGVDDCEDN SDE NCSAPASEPPGSL (SEQ ID NO: 338); bKWD01_RlcM03mut09 (C3094) CLPDEFQCGSGRCIPQHWLCDGLNDCGDGSDEPPAHCSAPASEPPGSLCRAGEFRC SNGRCVPLT LCDGEDDCQDNSDEKNCAQPTCGEGLFTCRSTNICISHAWVCDGVDDCEDN SDENNCSAPASEPPGSL (SEQ ID NO: 339); bKWD01_RlcM23mutlO (C3095) CLPDEFQCGSGRCIPQHWLCDGLNDCGDGSDEPPAHCSAPASEPPGSLCRAGEFRC SNGRCVPLTWLCDGEDDCQDNSDEKNCAQPTCGANLFTCQSSNICISDA VCDGVDDCEDN SDETTCSQDPEFHKV (SEQ ID NO: 340); b WDOl Rlc 23mutll (C30S6) CLPDEFQCGSGRCIPQHWLCDGLNDCGDGSDEPPAHCSAPASEPPGSLCRAGEFRC SNGRCVPLTWLCDGEDDCQDNSDEKNCAQPTCGANLFTCRSTNICISPA VCDGVDDCEDY SDEIGCSQDPEFHKV (SEQ ID NO: 341); bKWD01_Rlc 23mutl4 (C3097) CLPDEFQCGSGRCIPQHWLCDGLNDCGDGSDEPPAHCSAPASEPPGSLCRAGEFRC SNGRCVPLT LCDGEDDCQDNSDEKNCAQPTCGSD FTCRSTNICISKV VCDGVDDCEDD SDERGCSQDPEFHKV (SEQ ID NO: 342); bKWD01_RlcM23mutl5 (C3098) CLPDEFQCGSGRCIPQHWLCDGLNDCGDGSDEPPAHCSAPASEPPGSLCRAGEFRC SNGRCVPLTWLCDGEDDGQDNSDEKNCAQPTCGSNLFTCRRTNICISKAWVCDGVDDCEDN SDETGCSQDPEFHKV (SEQ ID NO : 343); bKWD01_RlcM23mutl6 (C3099) CLPDEFQCGSGRCIPQHWLCDGLNDCGDGSDEPPAHCSAPASEPPGSLCRAGEFRC SNGRCVPLTWLCDGEDDGQDNSDEKNCAQPTCGSNLFTCRSTNICISPA VCDGVDDCDDD SDETGCSQDPEFHKV (SEQ ID NO: 344); bK D01_RlcM23mutl7 (C3100) CLPDEFQCGSGRCIPQHWLCDGLNDCGDGSDEPPAHCSAPASEPPGSLCRAGEFRC SNGRCVPLT LCDGEDDCQDNSDEKNCAQPTCGTNLFTCRSTNMCISQAWVCDGVDDCEDN SDETVCSQDPEFHKV (SEQ ID NO: 345); bK D03_RlcM15 (C3102) CLPDEFQCGSGRCIPQTWVCDGLNDCGDGSDESPAHCSQDPEFHKVCRPGEFRCNN GRCVPQTWVCDGEDDCGDNSDETDCSAPASEPPGSLCGANQFTCHNTNICISQAWVCDGVD DCEDNSDEKNCSAPASEPPGSL (SEQ ID NO: 346); bKWD06_RlcM15 (C3103) CLPDEFQCGSGRCI PQT VCDGLNDCGDGSDESPAHCSQDPEFHKVCQPNEFQCGN GRCIPAQWLCDGEDDCQDNSDEEDCTEHTCGANQFTCHNTNICISQAWVCDGVDDCEDNSD EKNCSAPASEPPGSL (SEQ.ID NO: 347); bKWD22_RlcM15 (C3104.) CPADEFRCSNTGRCVPLSWLCDGEDDCGDGSDETNCKAHTCPSNQFPCRSTGICIP LAWVCDGLNDCGDGSDESPATCKAPVPTCGANQFTCHNTNICISQA VCDGVDDCEDNSDE KNCSAPASEPPGSL (SEQ ID NO:- 348); b WD29_RlcM15 (C3105) CGADQFRCGNGSCVPRAWRCDGVDDCGDGSDEAPEICETPTCQSNEFRCRSGRCIP QHWLCDGLNDCGDGSDESQQCSAPASEPPGSLCGANQFTCHNT ICISQAWVCDGVDDCED NSDEKNCSAPASEPPGSL (SEQ ID NO : 349); bK D06_RlcM03mut06 (C3192) CLPDEFQCGSGRCIPQTWVCDGLNDCGDGSDESPAHCSQDPEFHKVCQPNEFQCGN GRCIPAQWLCDGEDDCQDNSDEEDCTEHTCGASLFTCRRSNICISQAWVCDGVDDCEDNTD E NCSAPASEPPGSL (SEQ ID NO: 350); bKWD06jUcM03mut09 (C3193) CLPDEFQCGSGRCIPQTWVCDGLNDCGDGSDESPAHCSQDPEFHKVCQPNEFQCGN GRCIPAQWLCDGEDDCQDNSDEEDCTEHTCGEGLFTCRSTNICISHA VCDGVDDCEDNSD ENNCSAPASEPPGSL (SEQ ID NO: 351);. bK D06_RlcM03mutll (C3194) CLPDEFQCGSGRCIPQTWVCDGLNDCGDGSDESPAHCSQDPEFHKVCQPNEFQCGN GRCI PAQWLCDGEDDCQDNSDEEDCTEHTCGANLFTCRST ICISPAWVCDGVDDCEDYSD EIGCSQDPEFHKV (SEQ ID NO: 352); bKWD06_RlcM03mutl7 (C3195) CLPDEFQCGSGRCI PQTWVCDGL DCGDGSDESPAHCSQDPEFHKVCQPNEFQCGN GRCIPAQ LCDGEDDCQDNSDEEDCTEHTCGTNLFTCRSTNMCISQA VCDGVDDCEDNSD ETVCSQDPEFHKV (SEQ ID NO : 353); . bKWD22_Rlc 03mut06 (C3196) CPADEFRCSNTGRCVPLSWLCDGEDDCGDGSDETNCKAHTCPSNQFPCRSTGICIP LAWVCDGLNDCGDGSDESPATCKAPVPTCGASLFTCRRSNICISQA VCDGVDDCEDNSDE MNCSAPASEPPGSL ( SEQ ID NO: 354); bK D22_Rlc 03mut09 (C3197) CPADEFRCSNTGRCVPLSWLCDGEDDCGDGSDETNCKAHTCPSNQFPCRSTGICIP LAWVCDGLNDCGDGSDESPATCKAPVPTCGEGLFTCRSTNICISHAWVCDGVDDCEDNSDE NNCSAPASEPPGSL (SEQ ID NO: 355) ; · bKWD22_RlcM03mutll (C3198) CPADEFRCSNTGRCVPLSWLCDGEDDCGDGSDETNCKAHTCPSNQFPCRSTGICIP LAWVCDGLNDCGDGSDESPATCKAPVPTCGANLFTCRSTNICISPA VCDGVDDCEDYSDE IGCSQDPEFHKV (SEQ ID NO : 356); bK D22_RlcM03mutl7 (C3199) CPADEFRCSNTGRCVPLSWLCDGEDDCGDGSDETNCKAHTCPSNQFPCRSTGICIP LA VCDGLNDCGDGSDESPATCKAPVPTCGTNLFTCRSTNMCISQAWVCDGVDDCEDNSDE TVCSQDPEFHKV (SEQ ID NO: 357); bKWD29_RlcM03mut06 (C3200) CGADQFRCGNGSCVPRA RCDGVDDCGDGSDEAPEICETPTCQSNEFRCRSGRCIP QHWLCDGLNDCGDGSDESQQCSAPASEPPGSLCGASLFTCRRSNICISQA VCDGVDDCED NSDEMNCSAPASEPPGSL (SEQ ID NO: 358); b WD29_RlcM03mut09 (C3201) CGADQFRCGNGSCVPRAWRCDGVDDCGDGSDEAPEICETPTCQSNEFRCRSGRCIP QHWLCDGLNDCGDGSDESQQCSAPASEPPGSLCGEGLFTCRSTNICISHA VCDGVDDCED NSDENNCSAPASEPPGSL (SEQ ID NO: 359); b WD29_RlcM03mutll (C3202) CGADQFRCGNGSCVPRA RCDGVDDCGDGSDEAPEICETPTCQSNEFRCRSGRCIP QHWLCDGLNDCGDGSDESQQCSAPASEPPGSLCGANLFTCRSTNICISPAWVCDGVDDCED YSDEIGCSQDPEFHKV (SEQ ID NO: 360); bKWD29_RlcM03mutl7 (C3203) CGADQFRCGNGSCVPRAWRCDGVDDCGDGSDEAPEICETPTCQSNEFRCRSGRCIP QH LCDGLNDCGDGSDESQQCSAPASEPPGSLCGTNLFTCRSTNMCISQAWVCDGVDDCED NSDETVCSQDPEFHKV (SEQ ID NO: 361); RlcM03mut06_bKWD22 (C3204) CGASLFTCRRSNICISQA VCDGVDDCEDNSDE NCSAPASEPPGSLCPADEFRCS NTGRCVPLSWLCDGEDDCGDGSDETNCKAHTCPSNQFPCRSTGICIPLA VCDGLNDCGDG SDESPATCKAPVPT (SEQ ID NO: 362); RlcM03mut09_bKWD22 (C3205).

CGEGLFTCRSTNICISHAWVCDGVDDCEDNSDENNCSAPASEPPGSLCPADEFRCS NTGRCVPLS LCDGEDDCGDGSDETNCKAHTCPSNQFPCRSTGICIPLAWVCDGLNDCGDG SDESPATCKAPVPT (SEQ ID NO: 363); RlcM03mutll_bKWD22 (C3206) CGANLFTCRSTNICISPAWVCDGVDDCEDYSDEIGCSQDPEFHKVCPADEFRCSNT GRCVPLSWLCDGEDDCGDGSDETNCKAHTCPSNQFPCRSTGICI PLAWVCDGLNDCGDGSD ESPATCKAPVPT (SEQ ID NO: 364)'; RlcM03mutl7_bKWD22 (C3207).

CGTNLFTCRSTNMCISQAWVCDGVDDCEDNSDETVCSQDPEFHKVCPADEFRCSNT GRCVPLSWLCDGEDDCGDGSDETNCKAHTCPSNQFPCRSTGICIPLAWVCDGLNDCGDGSD ESPATCKAPVPT (SEQ ID NO: 365); RlcM03mut06_bKWD29 (C3208) CGASLFTCRRSNICISQAWVCDGVDDCEDNSDEMNCSAPASEPPGSLCGADQFRCG NGSCVPRAWRCDGVDDCGDGSDEAPEICETPTCQSNEFRCRSGRCIPQHWLCDGLNDCGDG SDESQQCSAPASEPPGSL (SEQ ID NO: 366); RlcM03raut09_bKWD29 (C3209) CGEGLFTCRSTNICISHAWVCDGVDDCEDNSDENNCSAPASEPPGSLCGADQFRCG NGSCVPRAWRCDGVDDCGDGSDEAPEICETPTCQSNEFRCRSGRCIPQHWLCDGLNDCGDG SDESQQCSAPASEPPGSL (SEQ ID NO: 367); RlcM03mutll_bKWD29 (C3210) CGANLFTCRSTNICISPAWVCDGVDDCEDYSDEIGCSQDPEFHKVCGADQFRCGNG SCVPRA RCDGVDDCGDGSDEAPEICETPTCQSNEFRCRSGRCIPQHWLCDGLNDCGDGSD ESQQCSAPASEPPGSL (SEQ ID NO: 368); RlcM03mutl7_bKWD29 (C3211) CGTNLFTCRSTN CISQAWVCDGVDDCEDNSDETVCSQDPEFHKVCGADQFRCGNG SCVPRAWRCDGVDDCGDGPDEAPEICETPTCQSNEFRCRSGRCI.PQHWLCDGLNDCGDGSD ESQQCSAPASEPPGSL (SEQ ID NO: 369); RlcM03_BK D01 (C2737) CGAGLFTCRSTKICISQAWVCDGVDDCEDNSDEKNCSAPASEPPGSLCLPDEFQCG SGRCIPQH LCDGLNDCGDGSDEPPAHCSAPASEPPGSLCRAGEFRCSNGRCVPLTWLCDG EDDCQDNSDEKNCAQPT (SEQ ID NO: 370); RlcM03_BKWD02 (C2738) CGAGLFTCRSTKICISQAWVCDGVDDCEDNSDEKNCSAPASEPPGSLCLPDEFQCS SGRCI PQTWVCDGLNDCGDGSDESPAHCSQDPEFHKVCPSSEFRCNNGRCIPLHWVCDGDD DCQDNSDETDCERSGRT (SEQ ID NO: 371); BKWD02_RlcM03 (C2739) CLPDEFQCSSGRCI PQTWVCDGLNDCGDGSDESPAHCSQDPEFHKVCPSSEFRCNN GRCIPLHWVCDGDDDCQDNSDETDCERSGRTCGAGLFTCRSTKICISQAWVCDGVDDCEDN SDEKNCSAPASEPPGSL (SEQ ID O: 372); .

RlcM03_BKWD25 (C2740) CGAGLFTCRSTKICISQAWVCDGVDDCEDNSDEKNCSAPASEPPGSLCGPDEFRCN NGQCIPLPWRCDGVDDCGDNSDÉPLEICQAPTCQSNEFRCRSGRCIPQHWLCDGLNDCGDG SDEPPAHCSAPASEPPGSL (SEQ ID NO : 373); RlcM08_BKWD01 (C2741) CGAGQFTCRDTNICISRAWRCDGVDDCEDNSDEADCSQDPEFHKVCLPDEFQCGSG RCIPQHWLCDGLNDCGDGSDEPPAHCSAPASEPPGSLCRAGEFRCSNGRCVPLT LCDGED DCQDNSDEKNCAQPT (SEQ ID NO : 374); BKWD01_RlcM08 (C2742) CLPDEFQCGSGRCIPQHWLCDGLNDCGDGSDEPPAHCSAPASEPPGSLCRAGEFRC SNGRCVPLT LCDGEDDCQDNSDE NCAQPTCGAGQFTCRDTNICISRAWRCDGVDDCEDN SDEADCSQDPEFHKV (SEQ ID NO: 375); RlcM08_BKWD02 (C2743) CGAGQFTCRDTNICISRAWRCDGVDDCEDNSDEADCSQDPEFHKVCLPDEFQCSSG RCIPQT VCDGLNDCGDGSDESPAHCSQDPEFHKVCPSSEFRCNNGRCIPLH VCDGDDDC QDNSDETDCERSGRT (SEQ ID NO: 376); BKWD02_RlcM08 (C2744) CLPDEFQCSSGRCI PQTWVCDGL DCGDGSDESPAHCSQDPEFHKVCPSSEFRCNN GRCI PLH VCDGDDDCQDNSDETDCERSGRTCGAGQFTCRDTNICISRA RCDGVDDCEDN SDEADCSQDPEFHKV (SEQ ID NO: 377);' RlcM08_BKWD25 (C2745) CGAGQFTCRDTNICISRAWRCDGVDDCEDNSDEADCSQDPEFHKVCGPDEFRCNNG QCIPLP RCDGVDDCGDNSDEPLEICQAPTCQSNEFRCRSGRCIPQHWLCDGLNDCGDGSD EPPAHCSAPASEPPGSL (SEQ-ID NO: 378); RlcM15_BKWD01 (C2747) CGANQFTCHNTNICISQAWVCDGVDDCEDNSDEKNCSAPASEPPGSLCLPDEFQCG SGRCIPQHWLCDGLNDCGDGSDEPPAHCSAPASEPPGSLCRAGEFRCSNGRCVPLT LCDG EDDCQDNSDEKNCAQPT (SEQ ID NO: 379); RlcM31_BKWD25 (C2748) CLSDQFTCRSTNICLPLQWVCDGDDDCEDNSDEEDCSAPASEPPGSLCGPDEFRCN NGQCIPLPWRCDGVDDCGDNSDEPLEICQAPTCQSNEFRCRSGRCIPQHWLCDGLNDCGDG SDEPPAHCSAPASEPPGSL (SEQ ID NO: 380) ; RlcMl5_BK D02 (C2749) CGANQFTCHNTNICISQAWVCDGVDDCEDNSDEKNCSAPASEPPGSLCLPDEFQCS SGRCIPQTWVCDGLNDCGDGSDESPAHCSQDPEFHKVCPSSEFRCNNGRCIPLHWVCDGDD DCQDNSDETDCERSGRT (SEQ ID NO : 381); 7 BKWD02_RlcM15 (C2750) CLPDEFQCSSGRCIPQTWVCDGLNDCGDGSDESPAHCSQDPEFHKVCPSSEFRCNN GRCIPLHWVCDGDDDCQDNSDETDCERSGRTCGANQFTCHNTNICISQAWVCDGVDDCEDN SDEKNCSAPASEPPGSL (SEQ ID NO:' 382); RlcMl5_BKWD25 (C2751) CGANQFTCHNTNICISQA VCDGVDDCEDNSDEKNCSAPASEPPGSLCGPDEFRCN NGQCI PLP RCDGVDDCGDNSDEPLEICQAPTCQSNEFRCRSGRCIPQH LCDGLNDCGDG SDEPPAHCSAPASEPPGSL (SEQ ID NO : 383); BKWD01_RlcM23 (C2752) CLPDEFQCGSGRCIPQHWLCDGLNDCGDGSDEPPAHCSAPASEPPGSLCRAGEFRC SNGRCVPLTWLCDGEDDCQDNSDEKNCAQPTCGSNQFTCRSTNICISQAWVCDGVDDCEDD SDETGCSQDPEFHKV (SEQ ID NO : 384); RlcM23_B WD02 (C2753) CGSNQFTCRSTNICISQAWVCDGVDDCEDDSDETGCSQDPEFHKVCLPDEFQCSSG RCI PQTWVCDGLNDCGDGSDESPAHCSQDPEFHKVCPSSEFRCNNGRCIPLH VCDGDDDC QDNSDETDCERSGRT (SEQ ID NO : 385); BKWD02_RlcM23 (C2754) CLPDEFQCSSGRCIPQT VCDGLNDCGDGSDESPAHCSQDPEFHKVCPSSEFRCNN GRCIPLHWVCDGDDDCQDNSDETDCERSGRTCGSNQFTCRSTNICISQA VCDGVDDCEDD SDETGCSQDPEFHKV (SEQ ID NO: 386); BKWD01_RlcM31 (C2757) CLPDEFQCGSGRCIPQHWLCDGLNDCGDGSDEPPAHCSAPASEPPGSLCRAGEFRC SNGRCVPLT LCDGEDDCQDNSDEKNCAQPTCLSDQFTCRSTNICLPLQWVCDGDDDCEDN SDEEDCSAPASEPPGSL (SEQ ID NO: 387); BK D05_Rlc 08 (C2792) CAAGQFRCHNSDTCLPGAWVCDGDNDCGDNSDEASCQKRTCHSFNQFECRNGQCIP LHLVCDGVPDCGDNSDETDCGDSHILPFSTPGPSTCGAGQFTCRDTNICISRA RCDGVDD CEDNSDEADCSQDPEFHKV (SEQ ID NO : 388); BKWD06_RlcM08 (C2793) CAPDQFRCSSGQCI PETWLCDGDDDCVDSSDEAGCASTVPTCLPDEFQCGSGRCI P QT VCDGLNDCGDGSDESPAHCSQDPEFHKVCGAGQFTCRDTNICISRAWRCDGVDDCEDN SDEADCSQDPEFHKV (SEQ ID NO: 389); BK D01_RlcM15 (C2794.) CLPDEFQCGSGRCIPQHWLCDGLNDCGDGSDEPPAHCSAPASEPPGSLCRAGEFRC SNGRCVPLT LCDGEDDCQDNSDEKNCAQPTCGANQFTCHNTNICISQAWVCDGVDDCEDN SDEKNCSAPASEPPGSL (SEQ ID ÑO: 390); RlcM15_BKWD31 (C2795) CGANQFTCHNTNICISQAWVCDGVDDCEDNSDEKNCSAPASEPPGSLCLPDEFRCG NGNCISVAWRCDGVDDCEDGSDEEDCESPEHTCQSNEFRCRSGRCIPQHWLCDGLNDCGDG SDESPAHCSQDPEFHKV (SEQ ID NO : 391); , y 5 RlcM15_BKWD06 (C2796) CGANQFTCHNTNICISQAWVCDGVDDCEDNSDEKNCSAPASEPPGSLCAPDQFRCS SGQCIPETWLCDGDDDCVDSSDEAGCASTVPTCLPDEFQCGSGRCIPQTWVCDGNDCGDGS DESPAHCSQDPEFHKV (SEQ ID NO: 392) . 0 bKWD02_Rlc 03mutM09 (C4168) CLPDEFQCSSGRCIPQTWVCDGLNDCGDGSDESPAHCSQDPEFH VCPSSEFRCNNGRCIP LHWVCDGDDDCQDNSDETDCAQPTCGEGLFTCRSTÍSIICISHA VCDGVDDCEDNSDENNCS APASEPPGSL (SEQ ID NO : 1265) *5 bKWD03_RlcM03mutM09 (C4169) CLPDEFQCGSGRCIPQTWVCDGLNDCGDGSDESPAHCSQDPEFHKVCRPGEFRCNNGRCVP QTWVCDGEDDCGDNSDETDCAQPTCGEGLFTCRSTNICISHAWVCDGVDDCEDNSDENNCS APASEPPGSL (SEQ ID NO: 1266) 0 bK D04_RlcM03mutM09 (C4170) CLPDEFQCGSGRCIPQTWVCDGLNDCGDGSDESPAHCSQDPEFH VCLSDQFRCGNGRCVP RA LCDGDNDCQDGSDETNCEQPTCGEGLFTCRSTNICISHAWVCDGVDDCEDNSDENNCS APASEPPGSL ( SEQ ID NO: 1267) bKWD05_RlcM03mutM09 (C4171) CLPDEFQCGSGRCIPQTWVCDGLNDCGDGSDESPAHCSQDPEFHKVCLPGQFPCGNGRCIP ETWLCDGDDDCQDGSDEKGCAQPTCGEGLFTCRSTNICISHAWVCDGVDDCEDNSDENNCS APASEPPGSMSEQ ID NO: 1268) 5 bK D08_RlcM03mutM09 (C4173) CLPDEFQCGSGRCIPQTWVCDGLNDCGDGSDESPAHCSQDPEFHKVCQSNEFRCRNGQCIP LT LCDGDNDCLDSSDEESCPAHTCGEGLFTCRSTNICISHAWVCDGVDDCEDNSDENNCS APASEPPGSL (SEQ ID NO: 1269) 10 bKWD21_RlcM03mutM09 (C4174) CAPGEFTCKNTGRCIPLNWRCDGDDDCGDGSDETDCPAPTCPSNQFPCRSTGICIPLAWVC DGLNDCGDGSDESPAHCSAPASEPPGSLCGEGLFTCRSTNICISHAWVCDGVDDCEDNSDE NNCSAPASEPPGSL (SEQ ID NO : 1270) !5 bKWD25_RlcM03mutM09 (C4176) CGPDEFRCNNGQCIPLPWRCDGVDDCGDNSDEPLEICQAPTCQSNEFRCRSGRCIPQHWLC DGLNDCGDGSDEPPAHCSAPASEPPGSLCGEGLFTCRSTNICISHAWVCDGVDDCEDNSDE NNCSAPASEPPGSL (SEQ ID NO: 1271) 20 bKWD28_RlcM03mutM09 (C4177) CGANEFQCRSTGICVPVEWVCDGDNDCGDGSDEPPVCGDSHILPFSTPGPSTCQPDEFTCS SGRCIPQP LCDGLNDCGDGSDEPPAHCSAPASEPPGSLCGEGLFTCRSTNICISHA VCD GVDDCEDNSDENNCSAPASEPPGSL (SEQ ID NO: 1272) RlcM03mutM09_bKWD01 (C4178) CGEGLFTCRSTNICISHA VCDGVDDCEDNSDENNCSAPASEPPGSLCLPDEFQCGSGRCI PQHWLCDGLNDCGDGSDEPPAHCSAPASEPPGSLCRAGEFRCSNGRCVPLT LCDGEDDCQ DNSDEKNCAQPT (SEQ ID NO: 1273).

LNRM01_RlcM03mutM09 (C4311) CIAAKLCEALDGDGVCHKECDLEECDWDGGDCQRI FLTDPTCGEGLFTCRST ICISHA V CDGVDDCEDNSDENNCSAPASEPPGSL (SEQ ID NO: 1274) RlcM03mutM09_LNRM01 (C4312) CGEGLFTCRSTNICISHAWVCDGVDDCEDNSDENNCSAPASEPPGSLCIAAKLCEALDGDG VCHKECDLEECDWDGGDCQRIFLTDPT (SEQ ID NO: 1275) EJEMPLO 12 Este ejemplo describe los métodos para extender la vida media de las proteínas de enlace in vivo.

A. Enlazadores IgG y extensión de la vida media en suero La descripción actual además proporciona un dominio de monómeros que enlaza a (por ejemplo, selectivamente un enlace) un factor de sangre (por ejemplo, albúmina de suero, immunoglobulina, o eritrocitos) . En algunas modalidades, los monómeros descritos en la presente enlazarán a un factor de sangre con una afinidad de menos que 10"3 M (es decir, enlaza más fuerte que una afinidad de 10"3 ) . En algunas modalidades, la afinidad es menos que 10~4 M, 10"5 M, 10"6 M, 10"7 M, o 10~8 M .

En algunas modalidades, los dominios de monómero enlazan a un polipéptido inmunoglobulina o. una porción de la misma.

En algunas modalidades, los dominios de monómero enlazan a albúmina de suero humana o una porción de la misma.

Se han identificado dos familias . (es decir, dominio A IgG Familias 2 y 3) de dominio de monómeros que enlazan a inmunoglobulina.

La familia 2 IgG comprende el siguiente motivo de consenso (SEQ ID NO: 698): [EQ] FXCRX [ST] XRC [IV] XXX [ ILV] CDGXXDCXD [ DN ] SDE Las secuencias de ej emplificación que comprenden el motivo de la Familia 2 IgG se muestran en la presente. Las referencias a los monómeros de enlace IgG o multimeros abarcan cada secuencia de Familia 2 ejemplificada en los ejemplos.

La Familia 3 IgG comprende cualquiera de los dos siguientes motivos de consenso (SEQ ID NOS 699-700, respectivamente, en orden de aparición) : CXSSGRCIPXXWVCDGXXDCRDXSDE (SEQ ID NO: 699); o CXSSGRCIPXXWLCDGXXDCRDXSDE (SEQ ID NO: 700) .

Las secuencias de ejemplificación que comprenden el motivo de la Familia 3 IgG se muestran en los ejemplos. Las referencias a los monómeros de enlace IgG o multímeros abarcan cada secuencia de Familia 3 ejemplificada en los ejemplos.

El dominio de monómeros que enlazan a los glóbulos rojos (RBC) o albúmina de suero (CSA) se describen en la Publicación de la Patente de E.U.A. No. 2005/0048512, e incluye, por ejemplo SEQ ID NOS: 701-704: RBCA crssqfqcndsricipgrwrcdgdndcqdgsdetgcgdshilpfstpgpst (SEQ ID NO: 701) RBCB cpagefpckngqclpvtwlcdgvndcldgsdekgcgrpgpgatsapaa (SEQ ID NO: 702) RBC11 cppde.fpckngqcipqdwlcdgvndcldgsdekdcgrpgpgatsapaa (SEQ ID NO: 703) CSA-A8 cgagqfpcknghclplnllcdgvndcednsdepselckalt (SEQ ID NO: 704) También se proporciona en la presente un método para extender la vida media en suero de una proteína, incluyendo, por ejemplo, un multímero descrito en la presente o una proteína de interés de un animal. La proteína de interés puede ser cualquier próteína terapéutica, profiláctica, o de otra funcionalidad deseada. Este método primero comprende proporcionar un dominio de monómero que ha sido identificado como una proteína de enlace que específicamente enlaza a un extendedor de la vida media tal como una molécula o célula transportadora de sangre, tal como albúmina de suero (por ejemplo, albúmina de suero humana), IgG, glóbulos rojos, etc. El monómero de enlace extendedor de vida media entonces es ligado covalentemente a otro dominio de monómero que tiene una afinidad de enlace para la proteina de interés (por ejemplo, FGFRlc o un objetivo diferente) . Esta formación compleja resulta en la extensión de la vida media que protegen el multímero y/o proteina (s) de enlace de degradación proteolitica y/u otra remoción del multímero y/o proteina (s) y de este modo se extiende la vida media del multímero y/o multímero. Una variación de este uso incluye incluye el monómero de enlace extendedor de vida media covalentemente ligado a una proteína de interés. La proteína de interés puede incluir un dominio de monómero, un multímero de dominio de monómeros, o un fármaco sintético. Alternativamente, los monómeros que enlazan a ya sea immunoglobulinas o eritrocitos pueden generarse usando el método de arriba y pueden usarse para la extensión de la vida media.

Los multímeros de enlace extendedores de vida media son típicamente multímeros de al menos dos dominios, dominios quiméricos, o dominios mutagenizados (es decir, uno que enlaza a FGFRlc y/o ß-Klotho y uno que enlaza a la molécula o célula transportadora de sangre). Los dominios idóneos incluyen todos aquellos descritos en la presente, que además son separados y seleccionados para enlazar a un extendedor de al vida media. Los multimeros de enlace extendedores de vida media se qeneran de acuerdo con los métodos para hacer multimeros descritos en la presente, usando, por ejemplo, el dominio de monóméros · pre separados para la actividad de enlace del extendedor de la vida media. La vida media en suero de una molécula puede extenderse para ser, por ejemplo, al menos 1, 2, 3, 4, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70 80, 90, 100, 150, 200, 250, 400, 500 o más horas.

Un dominio de monómero extendedor de la vida media, tal como un monómero que enlaza a IgG o HSA, puede ligarse al N-, C- terminal o ambos los N- y C- terminales de una molécula objetivo (por ejemplo, una proteina de enlace FGFRlc/pKlotho) . Las secuencias de ej emplificación de las proteínas de enlace que enlazan a FGFRlc, PKlotho y IgG incluyen las siguiente (SEQ ID NOS 705-710, respectivamente, en orden de aparición ) : CLPDEFQCGSGRCIPQHWLCDGLNDCGDGSDEPPAHCSAPASEPPGSLCRAGEFRCSNGRC VPLTWLCDGEDDCQDNSDEKNCAQPTCGANQFTCHNTNICISQAWVCDGVDDCEDNSDEKN CSAPASEPPGSLCHPTGQFRCRSSGRCVSPT VCDGDRDCWDGSDEDNCSAPASEPPGSL (SEQ ID NO: 705) CHPTGQFRCRSSGRCVSPTWVCDGDRDC DGSDÉDNCSAPASEPPGSLCLPDEFQCGSGRC IPQHWLCDGLNDCGDGSDEPPAHCSAPASEPPG.SLCRAGEFRCSNGRCVPLTWLCDGEDDC QDNSDE NCAQPTCGANQFTCHNTNICISQAWVCDGVDDCEDNSDEKNCSAPASEPPGSL (SEQ ID NO: 706) CGADQFRCGNGSCVPRAWRCDGVDDCGDGSDEAPEICETPTCQSNEFRCRSGRCIPQHWLC DGLNDCGDGSDESQQCSAPASEPPGSLCGEGLFTCRSTNICISHA VCDGVDDCEDNSDEN NCSAPASEPPGSLCHPTGQFRCRSSGRCVSPTWVCDGDRDCWDGSDEDNCSAPASEPPGSL SLQ (SEQ ID NO: 707) CGADQFRCGNGSCVPRA RCDGVDDCGDG'SDEAPEICETPTCQSNEFRCRSGRCIPQHWLC DGLNDCGDGSDESQQCSAPASEPPGSLCGTNLF.TCRSTNMCISQAWVCDGVDDCEDNSDET VCSQDPEFHRVCHPTGQFRCRSSGRCVSPTWVCDGDRDCWDGSDEDNCSAPASEPPGSLSL Q (SEQ ID NO: 708) CHPTGQFRCRSSGRCVSPT VCDGDRDCWDGSDEDNCSAPASEPPGSLCGADQFRCGNGSC VPRAWRCDGVDDCGDGSDEAPEICETPTCQSNEFRCRSGRCIPQHWLCDGLNDCGDGSDES QQCSAPASEPPGSLCGEGLFTCRSTNICISHAWVCDGVDDCEDNSDENNCSAPASEPPGSL SLQ (SEQ ID NO: 709) CHPTGQFRCRSSGRCVSPTWVCDGDRDCWDGSDEDNCSAPASEPPGSLCGADQFRCGNGSC VPRAWRCDGVDDCGDGSDEAPEICETPTCQSNEFRCRSGRCIPQHWLCDGLNDCGDGSDES QQCSAPASEPPGSLCGTNLFTCRSTNMCISQAWVCDGVDDCEDNSDETVCSQDPEFHRVSL Q (SEQ ID NO: 710) B. Fusiones de albúmina de suero humana En algunas modalidades, los dominios de proteina de enlace se fusionan a. ya sea el N- o C-terminal de albúmina de suero humana. Esto confiere a la vida media del tipo albúmina de suero humana sobre la proteina de enlace objetivizando la proteina de enlace (como parte de la proteina de enlace-polipéptido albúmina de suero humana) hasta la trayectoria de captura del FcRn.. Adicionalmente , el incremento en masa previene la pérdida de la proteina de enlace - albúmina de suero humana de suero por filtración de riñon.

Las fusiones de proteina de enlace- albúmina de suero humana pueden expresarse en levadura o células de mamíferos.

Una proteína de enlace FGFRlc/pKlotho puede ligarse al N- o C-terminal de albúmina de suero humana. La secuencia de proteína de enlace puede ligarse directamente a la secuencia de codificación de albúmina de suero humana, o por medio de una secuencia ligadora intermedia. En este contexto la proteína de enlace sigue funcionando como una agonista, capaz de inducir la señalización del tipo FGF21 en un ensayo de célula reportera (vea, por ejemplo las Figuras 51-53) . Las secuencias de ej emplificación de dichos polipéptidos incluyen las siguientes: HSA-C3201 DAHKSEVAHRF DLGEE FKALVLIAFAQYLQQC-PFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAEN CDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDV MCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLD ELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTE CCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCE PLLEKSHCIAEVENDE PADLPSL AADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSVVLLLRLAKTYETTLEKCCAAADP HECYAKVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVS RNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSVVLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCF SALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMD DFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAALGLGGGGSGGGGSCGADQFRCGNGSCVP RAWRCDGVDDCGDGSDEAPEICETPTCQSNEFRCRSGRCIPQH LCDGLNDCGDGSDESQQ CSAPASEPPGSLCGEG.LFTCRSTNICISHAWVCDGVDDCEDNSDENNCSAPASEPPGSL (SEQ ID NO: 711) HSA-C3203 DAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQCPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAEN CDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDV MCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLD ELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTE CCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSL AADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSWLLLRLAKTYETTLEKCCAAADP HECYAKVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVS RNLGKVGSKCCKHPEAKR PCAEDYLSVVLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCF SALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMD DFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAALGLGGGGSGGGGSCGADQFRCGNGSCVP RAWRCDGVDDCGDGSDEAPEICETPTCQSNEFRCRSGRCIPQHWLCDGLNDCGDGSDESQQ CSAPASEPPGSLCGTNLFTCRSTNMCISQAWVCDGVDDCEDNSDETVCSQDPEFHKV (SEQ ID NO: 712) C3201-HSA SGGSCGADQFRCGNGSCVPRAWRCDGVDDCGDGSDEAPEICETPTCQSNEFRCRSGRCIPQ HWLCDGLNDCGDGSDESQQCSAPASEPPGSLCGEGLFTCRSTNICISHAWVCDGVDDCEDN SDENNCSAPASEPPGSLGGGGSGGGGSDAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQC PFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQE PERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLF FAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVA RLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKEC CEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHP DYSVVLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGE YKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKR PCAEDYLSVVLNQLC VLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQ IKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAV DDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAAL GL (SEQ ID NO : 713) C3203-HSA SGGSCGADQFRCGNGSCVPRAWRCDGVDDCGDGSDEAPEICETPTCQSNEFRCRSGRCIPQ HWLCDGLNDCGDGSDESQQCSAPASEPPGSLCGTNLFTCRSTNMCISQAWVCDGVDDCEDN SDETVCSQDPEFHKVGGGGSGGGGSDAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQCPF EDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGE ADCCAKQEPE RNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLK YLYEIARRHPYFYAPELLFFA KRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARL SQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCE KPLLE SHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDY SVVLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYK FQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSVVLNQLCVL HEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIK KQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAALGL (SEQ ID NO: 714) C3094-HSA SGGSCLPDEFQCGSGRCIPQHWLCDGLNDCGDGSDEPPAHCSAPASEPPG SLCRAGEFRCSNGRCVPLTWLCDGEDDCQDNSDEKNCAQPTCGEGLFTCR STNICISHAWVCDGVDDCEDNSDENNCSAPASEPPGSLGGGGSGGGGSDA HKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQCPFEDHVKLVNEVTEFAKT CVADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGE ADCCAKQEPERNECF LQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAP ELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCAS LQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLE CADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADL PSLAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLG FLYEYARRHPDYSVVLLLRLAKT YETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYK FQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEA RMPCAEDY LSVVLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEF NAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDDFA AFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAALGL (SEQ ID NO: 1282) HSA-C3094 DAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQCPFEDHVKLVNEVTEFAK TCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECF LQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPE LLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQ KFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECAD DRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLA ADFVESKDVCKNYAEAKDVFLG FLYEYARRHPDYSVVLLLRLAKTYETTL EKCCAAADPHECYAKVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALL VRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSVVLNQ LCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFH ADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKA DDKETCFAEEG KLVAASQAALGLGGGGSGGGGSCLPDEFQCGSGRCI PQH LCDGLNDCGDGSDEPPAHCSAPASEPPGSLCRAGEFRCSNGRCVPLT LC DGEDDCQDNSDEKNCAQPTCGEGLFTCRSTNICISHAWVCDGVDDCEDNSD ENNCSAPASEPPGSL (SEQ ID NO: 1331) C4174-HSA SGGSCAPGEFTCKNTGRCIPLNWRCDGDDDCGDGSDETDCPAPTCPSNQF PCRSTGICIPLAWVCDGLNDCGDGSDESPAHCSAPASEPPGSLCGEGLFT CRSTNICISHAWVCDGVDDCEDNSDENNCSAPASEPPGSLGGGGSGGGGS DAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQCPFEDHVKLVNEVTEFA KTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNE CFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFY APELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSA QRLKC ASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDL LECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPA DLPSLAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSVVLLLRLA KTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGE YKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAE DYLSVVLNQLCVLHEKTPVSDRYTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPK EFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDD FAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAALGL (SEQ ID NO : 1283) HSA-C4174 DAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQCPFEDHVKLVNEVTEFA KTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNE CFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFY APELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKC ASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDL LECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPA DLPSLAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSVVLLLRLA KTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGE YKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAE DYLSVVLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPK EFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDD FAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAALGLGGGGSGGGGSCAPGE FTCKNTGRCIPLNWRCDGDDDCGDGSDETDCPAPTCPSNQFPCRSTGICI PLAWVCDGLNDCGDGSDESPAHCSAPASEPPGSLCGEGLFTCRSTNICIS HAWVCDGVDDCEDNSDENNCSAPASEPPGSL ( SEQ ID NO: 1332) C4176-HSA SGGSCGPDEFRCNNGQCIPLPWRCDGVDDCGDNSDEPLEICQAPTCQSNE FRCRSGRCI PQHWLCDGL DCGDGSDEPPAHCSAPASEPPGSLCGEGLFT CRSTNICISHAWVCDGVDDCEDNSDENNCSAPASEPPGSLGGGGSGGGGS DAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQCPFEDHVKLVNEVTEFA TCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNE CFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFY APELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKC ASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDL LECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPA DLPSLAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSVVLLLRLA KTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEF PLVEEPQNLIKQNCELFEQLGE YKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAE DYLSVVLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPK EFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAV DD FAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAALGL (SEQ ID NO: 1284) HSA-C4176 DAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQCPFEDHVKLVNEVTEFA KTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNE CFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFY APELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKC ASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSK.LVTDLTKVHTECCHGDL LECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPA DLPSLAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSVVLLLRLA KTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGE YKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAE DYLSVVLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPK EFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDD FAAFVEKCCKADD ETCFAEEGKKLVAASQAALGLGGGGSGGGGSCGPDE FRCNNGQCIPLPWRCDGVDDCGDNSDEPLEICQAPTCQSNEFRCRSGRCI PQH LCDGLNDCGDGSDEPPAHCSAPASEPPGSLCGEGLFTCRSTNICIS HAWVCDGVDDCEDNS.DENNCSAPASEPPGSL ( SEQ ID NO: 1333} En algunas modalidades cualquier monómero o multimero que enlaza a FGFRlc o ß-Klotho y FGFRlc y ß-Klotho pueden fusionar una HAS (SEQ ID NO:715) DAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQCPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAEN CDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDV MCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLD ELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTE CCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSL AADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHPDYSVVLLLRLAKTYETTLEKCCAAADP HECYAKVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVS RNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSVVLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCF SALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMD DFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAALGL (SEQ ID NO: 715) Los monómeros o multimeros pueden ligarse a HSA usando cualquiera de las ligaduras descritas en la Figura 9 o cualquier otra secuencia polipéptida. La unión del dominio seleccionado de monómeros por medio de una ligadura puede lograse usando una variedad de métodos conocidos en la técnica. Las ligaduras que consisten de GGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 3), GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 4) y GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 418) han sido usados para la ligadura C3201 (SEQ ID NO: 359) para HSA (SEQ ID NO: 715) con las moléculas resultantes reteniendo FGF-21 como actividad agonista (La Figura 52) . Las secuencias de ejemplificación de dichos polipéptidos incluyen las siguientes: C3201-GGGGSGGGGS-HSA (SEQ ID NO: 713) ("GGGGSGGGGS" es descrita como SEQ ID NO: 3) SGGSCGADQFRCGNGSCVPRAWRCDGVDDCGDGSDEAPEICETPTCQSNEFRCRSGRCIPQ H LCDGLNDCGDGSDESQQCSAPASEPPGSLCGEGLFTCRSTNICISHAWVCDGVDDCEDN SDENNCSAPASEPPGSLGGGGSGGGGSDAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQC PFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQE PERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLF FAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKA AVA RLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLT VHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKEC CEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHP DYSVVLLLRLA TYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGE YKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSVVLNQLC VLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQ IKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGK LVAASQAAL GL C3201-GGGGSGGGGSGGGGS-HSA. (SEQ ID NO: 1285) ( "GGGGSGGGGSGGGGS" es descrita como SEQ ID NO: 4) SGGSCGADQFRCGNGSCVPRAWRCDGVDDCGDGSDEAPEICETPTCQSNEFRCRSGRCIPQ HWLCDGLNDCGDGSDESQQCSAPASEPPGSLCGEGLFTCRSTNICISHAWVCDGVDDCEDN SDENNCSAPASEPPGSLGGGGSGGGGSGGGGSDAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQ YLQQCPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADC CAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYA PELLFFAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFK A AVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISS KLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEY ARRHPDYSVVLLLRLAKTYETTLE CCAAADPHECYAKVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELF EQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSVV LNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAE F FHADICTLS EKERQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAA SQAALGL C3201-GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS-HSA (SEQ ID NO: 1286) ( "GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS". es descrita como SEQ ID NO: 418) SGGSCGADQFRCGNGSCVPRAWRCDGVDDCGDGSDEAPEICETPTCQSNEFRCRSGRCIPQ HWLCDGLNDCGDGSDESQQCSAPASEPPGSLCGEGLFTCRSTNICISHA VCDGVDDCEDN SDENNCSAPASEPPGSLGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVL IAFAQYLQQCPFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYG EMADCCAKQEPERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRH PYFYAPELLFFAKRYKAAFTECCQAAÜKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFG ERAFKA AVARLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQ DSISSKLKECCEKPLLEKSHCIAEVENDE PADLPSLAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGM FLYEYARRHPDYSVVLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPLVEEPQNLIKQ NCELFEQLGEYKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAED YLSVVLNQLCVLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHAD ICTLSEKERQIKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGK KLVAASQAALGL En algunas modalidades las fusiones de dominios de proteina de enlace y HSA pueden expresarse en células de mamífero usando una variedad de métodos conocidos en la técnica. La expresión en células de mamífero puede resultar en la adición de restos de carbohidratos a las cadenas laterales de ciertos aminoácidos. Estos sitios de glicosilación pueden identificarse por un número de algoritmos públicamente disponibles. La glicosilación N-ligada ocurre cuando los restos de carbohidratos se agregan a la cadena lateral de los residuos de asparigina si la asparigina se coloca en el contexto del motivo de consenso N-X-[S/T] (SEQ ID NO: 1287), donde X puede ser cualquier aminoácido excepto para prolina. Los motivos de reconocimiento para glicosilación O-ligada (adición de restos de carbohidratos a las cadenas laterales de serina o residuos de treonina) son menos bien definidos, con la glicosilación O-ligada ocurre preferencialmente sobre residuos de serina y treonina encontrados en el contexto de secuencias ricas en prolina .

El análisis de fusión proteina de enlace-HSA C3201-HSA (SEQ ID NO: 713) identificó un sitio de glicosilación religada en N16 y un sitio de glicosilación O-ligada en S86. Las siguientes mutaciones duales se hicieron para eliminar estos sitios de glicosilación para mejorar la homogeneidad de proteina.

C3201-HSA (N14S/S86G) SGGSCGADQFRCGSGSCVPRAWRCDGVDDCGDGSDEAPEICETPTCQSNEFRCRSGRCIPQ HWLCDGLNDCGDGSDESQQCSAPAGEPPGSLCGEGLFTCRSTNICISHAWVCDGVDDCEDN SDENNCSAPASEPPGSLGGGGSGGGGSDAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQC PFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQE PERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLF FA RYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVA RLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKEC CEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHP DYS VLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGE Y FQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSVVLNQLC VLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQ I KQTALVELV HKPKATKEQLKAV DDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAAL GL (SEQ ID NO: 1288) C3201-HSA (S16Q/S86G) SGGSCGADQFRCGNGQCVPRAWRCDGVDDCGDGSDEAPEICETPTCQSNEFRCRSGRCIPQ H LCDGLNDCGDGSDESQQCSAPAGEPPGSLCGEGLFTCRSTNICISHAWVCDGVDDCEDN SDENNCSAPASEPPGSLGGGGSGGGGSDAHKSEVAHRFKDLGEE FKALVLIAFAQYLQQC PFEDHVKLVNEVTEFAKTGVADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGEMADCCAKQE PERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLF FAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKAWAVA RLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKEC CEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHP DYSVVLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAK.VFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGE YKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKR PCAEDYLS VLNQLC VLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSE ERQ IKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAAL GL (SEQ ID NO: 1289)' C3201-HSA (S16N/S86G) SGGSCGADQFRCGNGNCVPRAWRCDGVDDCGDGSDEAPEICETPTCQSNEFRCRSGRCIPQ HWLCDGLNDCGDGSDESQQCSAPAGEPPGSLCGEGLFTCRSTNICISHAWVCDGVDDCEDN SDENNCSAPASEPPGSLGGGGSGGGGSDAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQC PFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGE ADCCAKQE PERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLF FAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKA AVA RLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKEC CEKPLLEKSHCIAEVENDE PADLPSLAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHP DYSVVLLLRLA TYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGE YKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSVVLNQLC VLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQ I KQTALVELVKH PKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAAL GL (SEQ ID NO: 1290) C3201-HSA (S16G/S86G) SGGSCGADQFRCGNGGCVPRA RCDGVDDCGDGSDEAPEICETPTCQSNEFRCRSGRCIPQ H LCDGLNDCGDGSDESQQCSAPAGEPPGSLCGEGLFTCRSTNICISHA VCDGVDDCEDN SDENNCSAPASEPPGSLGGGGSGGGGSDAHKSEVAHRFKDLGEENFKALVLIAFAQYLQQC PFEDHVKLVNEVTEFAKTCVADESAENCDKSLHTLFGDKLCTVATLRETYGE ADCCAKQE PERNECFLQHKDDNPNLPRLVRPEVDVMCTAFHDNEETFLKKYLYEIARRHPYFYAPELLF FAKRYKAAFTECCQAADKAACLLPKLDELRDEGKASSAKQRLKCASLQKFGERAFKA AVA RLSQRFPKAEFAEVSKLVTDLTKVHTECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDSISSKLKEC CEKPLLEKSHCIAEVENDEMPADLPSLAADFVESKDVCKNYAEAKDVFLGMFLYEYARRHP DYSVVLLLRLAKTYETTLEKCCAAADPHECYAKVFDEFKPLVEEPQNLIKQNCELFEQLGE YKFQNALLVRYTKKVPQVSTPTLVEVSRNLGKVGSKCCKHPEAKRMPCAEDYLSVVLNQLC VLHEKTPVSDRVTKCCTESLVNRRPCFSALEVDETYVPKEFNAETFTFHADICTLSEKERQ IKKQTALVELVKHKPKATKEQLKAVMDDFAAFVEKCCKADDKETCFAEEGKKLVAASQAAL GL (SEQ ID NO: 1291) Después de que se .hicieron estos cambios las fusiones de proteina de enlace-HSA mantienen la misma actividad agonista del tipo FGF-21 en células reporteras y ensayos de adipocitos primarios como la fusión precursora de la proteina de enlace-HSA (La Figura 53) .

C . Fusión a un dominio IgG-Fc monovalente En algunas modalidades los dominios de proteina de enlace se fusionan a ya sea el N- o C-terminal de un IgG-Fc monovalente humano, que consisten de dos cadenas pesadas Fes ligados por una ligadura (G4S)7 (GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS) (SEQ ID: 1292) . Este IgG-Fc monovalente humano se describe en la presente y en las Figuras asociadas por la abreviación "HCFC." IgG2-Fc Monovalente humano (HCFC) (SEQ ID: 1293) ERKSSVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVD GVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNG EYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKG QPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDG SFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHE LHNHYTQKSLSLSPGGGGGSGGGGSGGGGSGG GGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSERKSSVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTP EVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKT PREEQFNSTFRVV5VLTVVHQD LNGKE YKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAV EWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYS LTVDKSR QQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKS LSLSPG Esto confiere una extensión de la vida media sobre la proteína de enlace al atacar la proteina de enlace (como parte del polipéptido de proteína de enlace-IgG-Fc monovalente humano) hasta la trayectoria de captura del FcRn. Adicionalmente, el incremento en¦ masa previene la pérdida de la proteína de enlace- IgG-Fc monovalente humano intacta de suero por filtración de riñon.

Las fusiones IgG-Fc humanas monovalentes de proteína de enlace se pueden expresar en células de bacterias, levaduras o de mamíferos.

Una proteína de, enlace FGFRlc/pKlotho se puede ligar al N- o C-terminal de IgG-Fc monovalente humana. La secuencia de la proteína de enlace se puede ligar directamente a la secuencia codificadora monovalente humana de IgG-Fc, o por medio de una secuencia' de ligadura intermedia. En este contexto, la proteina de enlace funciona todavía como un agonista, capaz de inducir la señalización del tipo FGF21 en un ensayo de células reporteras (La Figura 54) . Las secuencias ejemplares de tañes polipéptidos incluyen las siguientes: C3201-HCFC (SEQ ID NO: 1294) SGGSCGADQFRCGNGSCVPRAWRCDGVDDCGDGSDEAPEICETPTCQSNE FRCRSGRCIPQH PCDGLNDCGDGSDESQQCSAPASEPPGSLCGEGLFTC RSTNICISHAWVCDGVDDCEDNSDENNCSAPASEPPGSLASGGGGSG GGGERKSSVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDV SHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNG KEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLT CLVKGFYPSDIAVE ESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSR WQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQ SLSLSPGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSERKSSVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKD TLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFN YVDGVEVHNAKTKPREEQFNST FRVVSVLTVVHQDWLNG EYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVY TLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLD SDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG C3094-HCFC (SEQ ID NO: 1295) SGGSCLPDEFQCGSGRCI PQHWLCDGLNDCGDGSDEPPAHCSAPASEPPG SLCRAGEFRCSNGRCVPLTWLCDGEDDCQDNSDEKNCAQPTCGEGLFTCR STNICISHA VCDGVDDCEDNSDENNCSAPASEPPGSLASGGGGSGG GGERKSSVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS HEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGK EYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTC LVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRW QQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSG GGGSGGGGSGGGGSGGGGSERKSSVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDT LMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFN YVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTF RVVSVLTVVHQD L GKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYT LPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDS DGSFFLYSKLTVDKSR QQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG C4174-HCFC (SEQ ID NO: 1296) SGGSCAPGEFTCKNTGRCIPLNWRCDGDDDCGDGSDETDCPAPTCPSNQF PCRSTGICI PLAWVCDGLNDCGDGSDESPAHCSAPASEPPGSLCGEGLFT CRSTNICISHA VCDGVDDCEDNSDENNCSAPASEPPGSLASGGGGS GGGGERKSSVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVD VSHEDPEVQFN YVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQD LN GKEYKCKVSNKGLPAPIEKTIS TKGQPREPQVYTLPPSREE TKNQVSL TCLVKGFYPSDIAVE ESNGQPENNYKTTPP LDSDGSFFLYSKLTVDKS RWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGSGGGGSGGGGSGGGG SGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSERKSSVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPK DTL ISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNS TFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQV YTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPML DSDGSFFLYSKLTVD SRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG C4176-HCFC (SEQ ID NO : .1297) SGGSCGPDEFRCNNGQCIPLP RCDGVDDCGDNSDEPLEICQAPTCQSNE FRCRSGRCI PQHWLCDGLNDCGDGSDEPPAHCSAPASEPPGSLCGEGLFT CRSTNICISHAWVCDGVDDCEDNSDENNCSAPASEPPGSLASGGGGS GGGGERKSSVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVD VSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRWSVLTVVHQDWLN GKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSL TCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKS RWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGSGGGGSGGGGSGGGG SGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSERKSSVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPK DTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNS TFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTIS TKGQPREPQV YTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPML DSDGSFFLYSKLTVDKSR Q.QGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG Los monómeros o multimeros. descritos arriba pueden ligarse al IgG-Fc monovalente humano por la ligadura ASGGGGSGGGG (SEQ ID NO: 1298). Además, los monómeros o multimeros pueden ligarse al IgG-Fc monovalente humano usando cualquiera de las ligaduras descritas en la presente, por ejemplo aquellas presentadas en La Figura 9, o por medio de cualquier otra secuencia de polímero, incluyendo aquellas comunmente consideradas como secuencias de ligadura (por ejemplo, una secuencia (GxS)y, en donde G es glicina, S es serina y x y y son independientemente cualquier número) . La unión del dominio de monómeros seleccionado por medio de una ligadura puede lograrse usando cualquier método conocido en la técnica, incluyendo la química de. péptido estándar.

D. PEGilación En algunas modalidades las secuencias en el N-terminal se agregan a la molécula de la proteína de enlace para permitir la adición de. restos de polietilenglicol (PEG) por medio de química de ligaduras amida. La adición de PEG incrementa la relación hidrodinámica de la proteína de enlace, de esta manera reduciendo la excreción por medio de la filtración del riñon. Las moléculas PEG disponibles para dichos propósitos vienen en un intervalo de pesos moleculares molecular y ya sea como moléculas lineales o ramificadas. Las moléculas lineales o ramificadas PEG de cualquier tamaño pueden emplearse {por ejemplo, 10. kDa, 20kDa, 30 kDa, 40 kDa, 50 kDa, 60 kDa, 70 kDa, 80 kDa, 90 kDa o 100 kDa.) Al ligar covalentemente el PEG a la proteína de enlace por medio de química de ligadura amida requiere una amina primaria disponible. Una amina primaria puede ser, por ejemplo, la amina N-terminal o la cadena lateral de amina de cualquiera de los residuos de lisina dentro de la secuencia de polipéptido. Los residuos de lisina pueden ingenierizarse fuera de la secuencia de polipéptido, siendo remplazados por residuos de arginina para conservar la carga positiva y mantener la actividad. Las secuencias de ej emplificación donde uno o más residuos de lisina interna fueron sustituidos con uno o más residuos de arginina, y que mantuvieron actividad biológica, incluyendo las siguientes; Secuencias precursoras; CGANLFTCRSTNICISPAWVCDGVDDCEDYSDEIGCSQDPEFHKVCGADQFRCGNGSCVPR AWRCDGVDDCGDGSDEAPEICETPTCQSNEFRCRSGRCIPQHWLCDGLNDCGDGSDESQQC SAPASEPPGSL (SEQ ID NO: 368) CGANLFTCQSTNICISPAWVCDGVDDCEDYSDEIGCSQDPEFHKVCGADQFRCGNGSCVPR AWRCDGVDDCGDGSDEAPEICETPTCQSNEFRCRSGRCIPQHWLCDGLNDCGDGSDESQQC SAPASEPPGSL (SEQ ID NO: 716) CGADQFRCGNGSCVPRAWRCDGVDDCGDGSDEAPEICETPTCQSNEFRCRSGRCIPQHWLC DGLNDCGDGSDESQQCSAPASEPPGSLCGANLFTCQSTNICISPAWVCDGVDDCEDYSDEI GCSQDPEFHKV (SEQ ID NO: 717) CGANLFTCRSSNICISPAWVCDGVDDCEDYSDEIGCSQDPEFHKVCGADQFRCGNGSCVPR A RCDGVDDCGDGSDEAPEICETPTCQSNEFRCRSGRCIPQH LCDGLNDCGDGSDESQQC SAPASEPPGSL (SEQ ID NO: 718) · CGADQFRCGNGSCVPRAWRCDGVDDCGDGSDEAPEICETPTCQSNEFRCRSGRCIPQHWLC DGLNDCGDGSDESQQCSAPASEPPGSLCGANLFTCRSSNICISPAWVCDGVDDCEDYSDEI GCSQDPEFHKV (SEQ ID NO: 719) CGADQFRCGNGSCVPRA RCDGVDDCGDGSDEAPEICETPTCQSNEFRCRSGRCIPQHWLC DGLNDCGDGSDESQQCSAPASEPPGSLCGANLFTCRSTNICISDAWVCDGVDDCEDYSDEI GCSQDPEFHKV (SEQ -ID NO: 720) CGANLFTCRSTNICISPAWVCDGVDDCEDNSDEIGCSQDPEFHKVCGADQFRCGNGSCVPR AWRCDGVDDCGDGSDEAPEICETPTCQSNEFRCRSGRCIPQHWLCDGLNDCGDGSDESQQC SAPASEPPGSL (SEQ ID NO: 721) CGADQFRCGNGSCVPRAWRCDGVDDCGDGSDEAPEICETPTCQSNEFRCRSGRCIPQHWLC DGLNDCGDGSDESQQCSAPASEPPGSLCGANLFTCRSTNICISPAWVCDGVDDCEDNSDEI GCSQDPEFHKV (SEQ ID NO: 722) CGANLFTCRSTNICISPA VCDGVDDCEDYSDETGCSQDPEFHKVCGADQFRCGNGSCVPR AWRCDGVDDCGDGSDEAPEICETPTCQSNEFRCRSGRCIPQHWLCDGLNDCGDGSDESQQC SAPASEPPGSL (SEQ ID NO: 723) ' CGADQFRCGNGSCVPRAWRCDGVDDCGDGSDEAPEICETPTCQSNEFRCRSGRCIPQHWLC DGLNDCGDGSDESQQCSAPASEPPGSLCGANLFTCRSTNICISPAWVCDGVDDCEDYSDET GCSQDPEFHKV (SEQ ID NO: 724) CGANLFTCRSTNICISPAWVCDGVDDCEDYSDEITCSQDPEFHKVCGADQFRCGNGSCVPR AWRCDGVDDCGDGSDEAPEICETPTCQSNEFRCRSGRCIPQHWLCDGLNDCGDGSDESQQC SAPASEPPGSL (SEQ ID NO: 725) CGADQFRCGNGSCVPRAWRCDGVDDCGDGSDEAPEICETPTCQSNEFRCRSGRCIPQHWLC DGLNDCGDGSDESQQCSAPASEPPGSLCGANLFTCRSTNICISPAWVCDGVDDCEDYSDEI TCSQDPEFHKV (SEQ ID NO:' 726) CGADQFRCGNGSCVPRAWRCDGVDDCGDGSDEAPEICETPTCQSNEFRCRSGRCIPQHWLC DGLNDCGDGSDESQQCSAPASEPPGSLCGTNLFTCRSTNMCISQAWVCDGVDDCEDNSDET VCSQDPEFHKV (SEQ ID NO: 361) CLPDEFQCGSGRCIPQHWLCDGLNDCGDGSDEPPAHCSAPASEPPGSLCRAGEFRGSNGRC VPLT LCDGEDDCQDNSDEKNCAQPTCGANQFTCHNTNICISQAWVCDGVDDCEDNSDEKN CSAPASEPPGSL (SEQ ID NO: 390) Secuencias modificadas (sustitución K a R) ; CGANLFTCRSTNICISPA VCDGVDDCEDYSDEIGCSQDPEFHRVCGADQFRCGNGSCVPR AWRCDGVDDCGDGSDEAPEICETPTCQSNEFRCRSGRCIPQHWLCDGLNDCGDGSDESQQC SAPASEPPGSL (SEQ ID NO: 727) CGANLFTCQSTNICISPA VCDGVDDCEDYSDEIGCSQDPEFHRVCGADQFRCGNGSCVPR AWRCDGVDDCGDGSDEAPEICETPTCQSNEFRCRSGRCIPQHWLCDGLNDCGDGSDESQQC SAPASEPPGSL (SEQ ID NO : 728) CGADQFRCGNGSCVPRAWRCDGVDDCGDGSDEAPEICETPTCQSNEFRCRSGRCIPQHWLC DGLNDCGDGSDESQQCSAPASEPPGSLCGANLFTCQSTNICISPAWVCDGVDDCEDYSDEI GCSQDPEFHRV (SEQ ID NO: 729) CGANLFTCRSSNICISPAWVCDGVDDCEDYSDEIGCSQDPEFHRVCGADQFRCGNGSCVPR AWRCDGVDDCGDGSDEAPEICETPTCQSNEFRCRSGRCIPQH LCDGLNDCGDGSDESQQC SAPASEPPGSL (SEQ ID NO: 730) CGADQFRCGNGSCVPRAWRCDGVDDCGDGSDEAPEICETPTCQSNEFRCRSGRCIPQH LC DGLNDCGDGSDESQQCSAPASEPPGSLCGANLFTCRSSNICISPAWVCDGVDDCEDYSDEI GCSQDPEFHRV (SEQ ID NO: 731) CGADQFRCGNGSCVPRAWRCDGVDDCGDGSDEAPEICETPTCQSNEFRCRSGRCIPQHWLC DGLNDCGDGSDESQQCSAPASEPPGSLCGANLFTCRSTNICISDAWVCDGVDDCEDYSDEI GCSQDPEFHRV (SEQ ID NO:. 732) CGANLFTCRSTNICISPA VCDGVDDCEDNSDEIGCSQDPEFHRVCGADQFRCGNGSCVPR AWRCDGVDDCGDGSDEAPEICETPTCQSNEFRCRSGRCI PQHWLCDGL DCGDGSDESQQC SAPASEPPGSL (SEQ ID NO: 733) CGADQFRCGNGSCVPRAWRCDGVDDCGDGSDEAPEICETPTCQSNEFRCRSGRCIPQHWLC DGLNDCGDGSDESQQCSAPASEPPGSLCGANLFTCRSTNICISPAWVCDGVDDCEDNSDEI GCSQDPEFHRV (SEQ ID NO: 734) CGANLFTCRSTNICISPAWVCDGVDDCEDYSDETGCSQDPEFHRVCGADQFRCGNGSCVPR AWRCDGVDDCGDGSDEAPEICETPTCQSNEFRCRSGRCIPQHWLCDGLNDCGDGSDESQQC SAPASEPPGSL (SEQ ID NO: 735) CGADQFRCGNGSCVPRAWRCDGVDDCGDGSDEAPEICETPTCQSNEFRCRSGRCIPQHWLC DGLNDCGDGSDESQQCSAPASEPPGSLCGANLFTCRSTNICISPAWVCDGVDDCEDYSDET GCSQDPEFHRV (SEQ ID NO: 736) CGANLFTCRSTNICISPA VCDGVDDCEDYSDEITCSQDPEFHRVCGADQFRCGNGSCVPR AWRCDGVDDCGDGSDEAPEICETPTCQSNEFRCRSGRCIPQHWLCDGLNDCGDGSDESQQC SAPASEPPGSL (SEQ ID NO: 737) CGADQFRCGNGSCVPRAWRCDGVDDCGDGSDEAPEICETPTCQSNEFRCRSGRCIPQHWLC DGLNDCGDGSDESQQCSAPASEPPGSLCGANLFTCRSTNICISPAWVCDGVDDCEDYSDEI TCSQDPEFHRV (SEQ ID NO: 738) CGADQFRCGNGSCVPRAWRCDGVDDCGDGSDEAPEICETPTCQSNEFRCRSGRCIPQH LC DGLNDCGDGSDESQQCSAPASEPPGSLCGTNLFTCRSTNMCISQAWVCDGVDDCEDNSDET VCSQDPEFHRV (SEQ ID NO: 739) CLPDEFQCGSGRCIPQH LCDGLNDCGDGSDEPPAHCSAPASEPPGSLCRAGEFRCSNGRC VPLT LCDGEDDCQDNSDERNCAQPTCGANQFTCHNTNICISQAWVCDGVDDCEDNSDERN CSAPASEPPGSL (SEQ ID NO : 740) Las secuencias en el N-terminal que permiten la adición de una molécula PEG a la amina primaria en el N-terminal incluyen las siguientes; MDY MHY HH MRD MRY MYV En varias modalidades dos- moléculas PEG pueden agregarse a la región N-terminal; una molécula PEG puede agregarse en la amina primaria N-terminal, y una molécula PEG puede agregarse en un residuo de lisina interna. Los ejemplos de secuencia N-terminal que permiten la adición de dos moléculas PEG a una proteina de enlace incluyen las siguientes; MKH DK EK MRK MYK ??? MKK MDYK (SEQ ID NO: 741) MHYK (SEQ ID NO: 742) MHHK (SEQ ID NO: 743) MRDK (SEQ ID NO: 744 ) ¦ MRYK (SEQ ID NO: 745) YVK (SEQ ID NO: 746) MDYSK (SEQ ID NO: 747) HYSK (SEQ ID NO: 748) MHHSK (SEQ ID NO: 749) MRDSK (SEQ ID NO: 750) MRYSK (SEQ ID NO : 751) YVSK (SEQ ID NO: 752) MDYSAK (SEQ ÍD NO: 753) MHYSAK (SEQ ID NO: 754)' MHHSAK (SEQ ID NO: 755) MRDSVK (SEQ ID NO: 756) MRYSVK (SEQ ID NO: 757) YVSVK (SEQ ID NO : 758) MRDSVSVK (SEQ ID NO : 759) MRDSVYAK (SEQ ID NO: 760) MRDSVRDSVK (SEQ ID NO: 76 MRDSVYARDK (SEQ ID NO: 762) MRDSVRDYASVK (SEQ ID NO: 763) MRDSVGGGGSVK (SEQ ID NO: 764) MRDSVGGGGSGGGGSVK (SEQ ID NO: 765) MRDSVYARDYGGGGSGGGGSVK (SEQ ID NO: 766) MRDSVGGGGSGGGGSGGGGSVK (SEQ ID NO: 767) .

EJEMPLO 13 Estudio en el mono Cynomolgous El constructo de la- proteina de enlace designado como C3201-HSA se generó usando la metodología descrita en los Ejemplos 1-11. C3201-HSA comprende la proteína de enlace C3201 fusionado a albúmina de suero humana (HSA) , pero se refiere en el Ejemplo actual y en las figuras asociadas por la abreviatura "C3201." El componente de enlace de la proteína de enlace de C3201 se describe por la secuencia de SEQ ID NO: 359, que comprende el dímero encaminado ß-Klotho WD29 (SEQ ID NO : 312 ) , y FGFRlc mutM09 (SEQ ID NO:297). Cuando se fusiona con HSA el extendedor de vida media (SEQ ID NO: 715), C3201 (es decir, C3201-HSA) que comprende la secuencia de SEQ ID NO:.713. C3201 se expresó, purificó y caracterizó como se describe en la presente y se estudió in vivo en monos cynomolgous obesos. El diseño experimental y los resultados se muestran abajo. 13.1 Diseño del estudio El estudio se condujo en monos cynomolgous obesos. Los monos tenían 8-19 años. Sus pesos corporales estaban en un intervalo de 7-14 kg y BMI en un intervalo de 36-74 kg/m2. Los monos se aclimataron por 6 semanas previo a la iniciación de la administración compuesta. Durante el periodo de aclimatización, los monos se familiarizaron con procedimientos relacionados al estudio, incluyendo inyección subcutánea con restricción de silla, (PBS, 0.1 ml/kg) , alimentación por sonda (agua, 10 ml/kg) , y extracción de sangre para muestras no OGTT y OGTT. Después de 4 semanas de entrenamiento, se midieron la base OGTT y los parámetros metabólicos de plasma. 30 monos se seleccionaron y aleatorizaron en dos grupos de tratamiento para lograr niveles de base similares de peso corporal, perfiles de OGTT glucosa y glucosa de plasma y niveles de triglicéridos .

El estudio se condujo- en una tendencia ciega. El vehículo (n=10), dosis baja de C3201-HSA (n=10), dosis alta de C3201-HSA (n=10) . El compuesto fue administrado semanalmente en 0.5 rag/kg por las 2 primeras semanas para dosis baja de C3201-HSA y 2.5 mg/kg para dosis alta de C3201-HSA y en 1 mg/kg por las 2 últimas semanas C3201-HSA dosis baja y 5 mg/kg para C3201-HSA dosis alta. Después de 4 inyecciones de C3201-HSA, los animales se monitorearon durante 6 semanas adicionales para el lavado del compuesto y recuperación de los tratamientos. La ingesta de comida, peso corporal, química clínica y OGTT se monitorearon a través del estudio. La ingesta de comida se midió para cada alimento. El peso corporal se midió semanalmente . Las muestras de sangre se recolectaron semanalmente sobre diferentes días en estado de ayuno o sin ayuno para medir los niveles de glucosa, insulina y triglicéridos . Los OGTT se condujeron cada dos semanas después de la iniciación del estudio.. El día que comenzó el tratamiento sé designó como 0 y el plan de estudio detallado se muestra en La Figura 55.

Los resultados presentados en este Ejemplo representan los datos recolectados a través de los 68 días del estudio. 13.2 Efecto de C3201-HSA sobre la ingesta de comida Los animales se. alimentaron dos veces al día, con cada animal recibiendo 120 g de comida formulada establecida durante el periodo de aclimatización . La comida restante se removió y pesó después de cada aliemnto para calcular la ingesta de comida. Los tiempos de alimentación fueron de 8:00 AM a 8:30 AM (±30 minutes) y después de 4:30PM a 5:00PM (±30 minutos) . La fruta (manzana, 150 g) fue proporcionada a cada animal de 11:30 a 12:30 PM (D30 minutos) cada día.

Comparado con el vehículo, las dosis baja y alta de C3201-HSA (n=10) no redujeron la ingesta de comida AM en los monos (La Figura 56) . Sin embargo, la ingesta de manzana se redujo de manera importante entre 7 y 21 días (La Figura 57) y la ingesta de comida PM estadísticamente fue disminuyó con la dosis baja y alta (La Figura 58) . Sin embargo, el efecto disminuido y la ingesta de comida regresó para cerrar para niveles de base o control en 21 días (La Figura 58) . 13.3 Efecto de C3201-HSA sobre Peso corporal El peso corporal se monitoreó semanalmente a través del estudio. Durante el curso de las 4 semanas de tratamiento, el peso corporal de los animales se trató con vehículo que permanece constante mientras el peso corporal de los animales se trató con C3201-HSA (dosis baja y alta) disminuyó progresivamente. El peso corporal regresó al valor de referencia al final de las 6 semanas del periodo de lavado (La Figura 59) . 13.4 Efecto de C3201-HSA sobre índice de masa corporal (BMI) , Circunfernecia abdominal (AC) y Grosor de pliegue de piel (SFT) BMI, AC y SFT se monitorearon semanalmente a través del estudio, tanto en la pre-administ.ración como en la postadministración del compuesto de prueba cuando se tomó el peso corporal. BMI se define como el peso corporal del individuo dividido por el cuadrado de su altura. SFT es el grosor de una capa doble de la piel y la grasa debajo de este medida con un calibración. BMI, SFT y AC son relativamente medidas exactas, simples, y baratas de la composición del cuerpo, particularmente indicativas de grasa subcutánea. Los animales tratados con vehículo mostaron BMI, ' SFT y AC relativamente estables a- través del estudio. Los animales tratados con C3201-HSA mostraron niveles de disminución de BMI, AC y SFT en una tendencia dependiente de dosis en el transcurso de las 4 semanas de estudio, sugiriendo gue el compuesto C3201-HSA resultó, en una reducción de masa de grasa. Los resultados para BMI, AC y SFT se muestran en las Figuras 60-62, respectivamente. Estos parámetros medidos regresaron a los valores base al final de las 6 semanas del perido de lavado. 13.5 Efecto de C3201-HSA sobre Prueba Oral de Tolerancia de Glucosa (OGTT) Las OGTT se condujeron antes y despu+es de la iniciación de los tratamientos. Antes de las inyecciones de C3201-HSA los valores base para glucosa y los niveles de insulina se midieron a través de OGTT (Figuras 57 y 58, respectivamente) y no fueron diferentes estadísticamente de forma importante entre el vehículo y los grupos C3201-HSA. Las OGTT después de las dosis se realizaron cada 2 semanas durante el periodo de tratamiento y después de 3 semanas del periodo de lavado. C3201-HSA dosis alta mejoró ligeramente la tolerancia de glucosa después de 4 semanas de tratamiento. El modelo animal usado no es intolerante a la glucosa, explicando los efectos modestos observados (La Figura 63) . Los niveles de insulina fueron estadísticamente disminuidos de manera importante en animales tratados con C3201-HSA (importancia observada en tiempo 0, 30 y 180 durante la OGTT realizada después de 2 semaans de tratamiento (La Figura 64). 13.6 Efecto de C3201-HSA sobre Ayuno y glucosa con sangre sin ayuno y niveles de insulina La sangre se recolectó de animales que ayunaron toda la noche o en condiciones sin ayuno después de la alimentación AM. En las condiciones con ayuno, la extracción de sangre se condujo semanalmente 5 días después de cada inyección. En las condiciones sin ayuno, la extracción de sangre se condujo en los dias 2, 11, 16, 25 y 46 después de la primera inyección. C3201-HSA no redujo los niveles de glucosa de sangre con ayuno o sin ayuno (Figuras 65) . No se observó hipoglicemia en ninguno de los monos tratados con C3201-HSA. Sin embargo, C3201-HSA resultó en una disminución estadísticamente importante en los niveles de insulina con ayuno y plasma sin ayuno (Figures 66) . 13.7 Efecto de C3201-HSA sobre Niveles de triglicéridos Las medidas se hicieron de las mismas muestras de sangre recolectadas para las medidas de- glucosa e insulina. Los niveles de triglicéridos se redujeron de manera importante en animales tratados con C3201-HSA cuando se midieron en condiciones sin ayuno (Figura 67). 13.8 Conclusiones En un estudio conducido en monos macho cynomolgous obesos, los animales se trataron con C3201-HSA y mostraron parámetros metabólicos mejorados. El peso corporal se redujo y la compsoición del cuerpo se mejoró. Se observó la reducción a corto. plazo de la ingesta de comida- y el efecto disminuido y la ingesta de comida recuperada al valor de referencia o niveles de control en 21 días en el estudio. Los niveles con ayuno' de insulina y de triglicéridos sin ayuno también se redujeron por C3201-HSA. Los niveles de insulina que se midieron durante la OGTT también mejoraron.

Claims

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN Habiendo descrito la presente invención, se considera como novedad, y por lo tanto se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes: REIVINDICACIONES

1. Una proteína de enlace que selectivamente enlaza ß-Klotho, caracterizada porque la proteína de enlace comprende una o más de: C[AGP] [APS] [DGN] [EQ] F [QRT] C [GNRS] [GNS] [GT] [GKQS] [- IK] C[ILV] P [LQRV] [AEHP] W [LRV] CDG [ DLV] [DN] DCGD [GN] SDE [AEKPS] [GL PS] [-AEV] [-IT]C (SEQ ID NO: 254); CLPDEFQC [SG] SGRCIPQ [HT]-W [VL] CDGLNDCGDGSDE [ PS ] PA [HT] C (SEQ ID NO: 597) ; y C[AGPR] [AP] [DGNS] [EQ] F [QRT] C [GSK] [GT] [GHR] [R]C[ILV] [PS] [ALQ] [NST] W [LRV] CDG [ DEV] DDC [GL] DGSDE [AET] [DNS] [-A] [-T]C (SEQ ID NO: 249); en donde los aminoácidos en los paréntesis indican aminoácidos alternativos en una posición específica y "-" indica ningún aminoácido en la posición específica.

2. La proteína de enlace de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la proteína de enlace comprende una o más de: CGPDQFRCSSGKCIPQHWLCDGLNDCGDGSDESPATC (SEQ ID NO: 255); CGANEFQCRSTGICVPVE VCDGDNDCGDGSDEPPVC (SEQ ID NO: 256); CGADQFRCGNGSCVPRAWRCDGVDDCGDGSDEAPEIC (SEQ ID NO: 257); CGPDEFRCNNGQCIPLPWRCDGVDDCGDNSDEPLEIC (SEQ ID NO: 258); CASGEFTCNNGQCVPLAWRCDGVNDCQDGSDEKGC (SEQ ID NO: 259); CGPDEFRCNNGQCI PLPWRCDGVDDCGD SDEPLEIC (SEQ ID NO: 260); CPPDEFQCRGTKKCLPLAWVCDGDNDCEDDSDEESC (SEQ ID NO: 261); CLPDEFQCGSGRCIPQHWLCDGLNDCGDGSDEPPAHC (SEQ ID NO:1237); CLPDEFQCGSGRCIPQHWLCDGLNDCGDGSDEPPAHC (SEQ ID NO: 1326) ; CAPGEFTCKNTGRCI PLN RCDGDDDCGDGSDE DC (SEQ ID NO: 1327); y CGPDEFRCNNGQCIPLPWRCDGVDDCGDNSDEPLEIC (SEQ ID NO:1328).

3. Una proteína de enlace que selectivamente enlaza ß-Klotho, caracterizada porque la proteína de enlace comprende una o más de: CQSNEFRCRSGRCIPQHWLCDGLNDCGDGSD E [PS] [PQ] [AQ] [-H] C (SEQ ID NO: 394); C [ELPQR] [APS] [DGIN] [EGQ] [FQ] [FKPQRT] [-E]C[GNRS] [NS] G [HNQR]C [IV] P [AELPQRV] [AHPQRT] W [LRV] CDG [ DEV] [DNP ] DC [GLQ] D [DGNS] SDE [AE T] [DGLNS] [-A] [-H]C (SEQ ID NO: 217); y C[AGP] [APS] [DGN] [ EQ] F [QRT ] C [GNRS ] [GNS] [GT] [GKQS] [-IK]C[ILV] P[LQRV] [AEHP] W [LRV] CDG [ DLV] [ DN ] DCGD [GN ] SDE [AEKPS ] [GL PS] [-AEV] [-IT] C (SEQ ID NO: 254); en donde los aminoácidos en los paréntesis indican aminoácidos alternativos en una posición especifica y indica ningún aminoácido en la posición especifica.

4. La proteina de enlace de conformidad con la reivindicación 3, caracterizada porque la proteina de enlace comprende una o más de: CQSNEFRCRSGRCIPQHWLCDGLNDCGDGSDESQQC (SEQ ID NO: 159) ; CRAGEFRCSNGRCVPLTWLCDGEDDCQDNSDEKNC (SEQ ID NO: 1323); CPSNQFPCRSTGICIPLAWVCDGLNDCGDGSDESPAHC (SEQ ID NO:1324); y CQSNEFRCRSGRCIPQHWLCDGLNDCGDGSDEPPAHC (SEQ ID NO: 1325) .

5. Una proteina de enlace que selectivamente enlaza FGFRlc, caracterizada porque la proteina de enlace comprende: CG [AE] [GS] LFTC [GR] [NRS] [AST] [KN] ICIS [EHQS] [AV] W [ IV] CDG [ IV] DDC [ DE ] DNSDE [ DKMNT ] [NSY]C (SEQ ID NO: 108).; en donde los aminoácidos en los paréntesis indican aminoácidos alternativos¦ en una posición especifica y "-" indica ningún aminoácido en la posición especifica.

6. La proteina de enlace de conformidad con la reivindicación 5, caracterizada porque la proteina de enlace comprende una o más de: CGAGLFTCRS TNICISQVWV CDGVDDCEDN SDEDSC (SEQ ID NO: 109); CGAGLFTCRS TNICISQAWV CDGVDDCEDN SDENYC (SEQ ID NO: 110); CGAGLFTCRS TNICISQAWV CDGVDDCEDN SDETNC (SEQ ID NO: 111); CGEGLFTCGS TNICISSAWV CDGVDDCEDN SDENNC (SEQ ID NO: 112); CGEGLFTCRS TNICISHAWV CDGVDDCEDN SDENNC (SEQ ID NO: 113); CGEGLFTCRS TNICISEAWI CDGVDDCEDN SDEKNC (SEQ ID NO: 114); CGAGLFTCRS AKICISHAWV CDGI DDCEDN SDENNC (SEQ ID NO : 115); CGAGLFTCRN SKICISQA V CDGVDDCDDN SDEKYC (SEQ ID NO : 116) ; CGASLFTCRR SNICISQA V CDGVDDCEDN SDEMNC (SEQ ID NO: 117); y CGAGLFTCRS TKICISQAWV CDGVDDCEDN SDEKNC (SEQ ID NO: 118) .

7. La proteína de enlacé de conformidad con la reivindicación 6, caracterizada porque la proteína de enlace comprende además una ligadura que comprende la secuencia SAPASEPPGSL (SEQ ID NO:' 12).

8. La proteína de enlace de conformidad con la reivindicación 7, caracterizada porque la proteína de enlace comprende una o más de: CGAGLFTCRSTNICISQVWVCDGVDDCEDNSDEDSCSAPASEPPGSL (SEQ ID NO: 293); CGAGLFTCRSTNICISQAWVCDGVDDCEDNSDENYCSAPASEPPGSL (SEQ ID NO: 294) ; CGAGLFTCRSTNICISQA VCDGVDDCEDNSDETNCSAPASEPPGSL (SEQ ID NO: 295) ; CGEGLFTCGSTNICISSAWVCDGVDDCEDNSDENNCSAPASEPPGSL (SEQ ID NO: 448 ) ; CGEGLFTCRSTNICISHA VCDGVDDCEDNSDENNCSAPASEPPGSL (SEQ ID NO: 297) ; CGEGLFTCRSTNICISEAWICDGVDDCEDNSDEKNCSAPASEPPGSL (SEQ ID NO: 449) ; CGAGLFTCRSAKICISHAWVCDGIDDCEDNSDENNCSAPASEPPGSL (SEQ ID NO: 450) ; CGAGLFTCR SKICISQAWVCDGVDDCDDNSDEKYCSAPASEPPGSL (SEQ ID NO: 464); CGASLFTCRRSNICISQAWVCDGVDDCEDNSDEMNCSAPASEPPGSL (SEQ ID NO: 296) ; y CGAGLFTCRSTKICISQAWVCDGVDDCEDNSDEKNCSAPASEPPGSL (SEQ ID NO: 287).

9. La proteina de enlace de conformidad con la reivindicación 8, caracterizada porque la proteina de enlace comprende la secuencia:. CGEGLFTCRSTNICISHAWVCDGVDDCEDNSDENNCSAPASEPPGSL (SEQ ID NO: 297) .

10. Una proteina de enlace que selectivamente enlaza ß- Klotho, caracterizada porque la proteina de enlace comprende: (a) un primer dominio de enlace ß-Klotho que comprende una secuencia seleccionada del grupo representado por las secuencias: C[AGP] [APS] [DGN] [EQ] F [QRT] C [GNRS ] [GNS] [GT] [GKQS] [- IK]C[ILV] P[LQRV] [AEHP] W [LRV] CDG [ DLV] [ DN ] DCGD [GN ] SDE [AEKPS ] [GL PS] [-AEV] [-IT]C (SEQ ID NO: 254); CLPDEFQC [ SG] SGRCIPQ [HT] [VL] CDGLNDCGDGSDE [ PS ] PA [HT] C (SEQ ID NO: 597) ; C[AGPR] [AP] [DGNS] [ EQ] F [QRT ] C [GSK] N [GT] [GHR] [-R]C[ILV] [PS] [ALQ] [NST] [LRV] CDG [DEV] DDC [GL] DGSDE [AET] [DNS] [-A] [-T]C (SEQ ID NO:249); y (b) un segundo dominio de enlace ß-Klotho que comprende una secuencia seleccionada del grupo representado por las secuencias: CQSNEFRCRSGRCI PQHWLCDGLNDCGDGSD E [PS] [PQ] [AQ] [-H]C (SEQ ID NO: 394); C [ELPQR] [APS] [DGIN] [EGQ] [ FQ] '[ FKPQRT] [-E]C[GNRS] [NS] G [HNQR] C [IV] P[AELPQRV] [AHPQRT] W [LRV] CDG [ DEV] [DNP ] DC [GLQ] D [ DGNS] SDE [AEKT] [DGLNS] [-A] [-H]C (SEQ ID NO: 217) ; y C[AGP] [APS] [DGN] [EQ] F [QRT] C [GNRS] [GNS] [GT] [GKQS] [-IK]C[ILV] P[LQRV] [AEHP] W [LRV] CDG [DLV] [ D ] DCGD [GN ] SDE [AEKPS ] [GL PS] [-AEV] [-IT]C (SEQ ID NO: 254); en donde los aminoácidos en los paréntesis indican aminoácidos alternativos en una posición especifica y "-" indica ningún aminoácido en la posición especifica.

11. La proteína de enlace de conformidad con la reivindicación 10 caracterizada ' porque además comprende al menos una ligadura que une- (a) y (b) .

12. La proteína de enlace de conformidad con la reivindicación 11, caracterizada porque la ligadura es uno o más de: ETPT (SEQ ID NO: 1319), GDSHILPFSTPGPST (SEQ ID NO: 14), SAPASEPPGSL (SEQ ID NO: 12), PAPT (SEQ ID NO: 1320), QAPT (SEQ ID NO: 1321), AQPT (SEQ ID NO: 1322), AHT, PERT (SEQ ID NO: 7), TTRT (SEQ ID NO: .8), GTTGPT (SEQ ID NO: 9), ETSGPT (SEQ ID NO: 10), SQDPEFHKVS (SEQ ID NO: 11), y GRPGPGATSAPAA (SEQ ID NO: 13) .

13. La proteina de enlace de conformidad con la reivindicación 10,. caracterizada porque el dominio de enlace ß-Klotho de (a) comprende una o más de: CGPDQFRCSSGKCIPQH LCDGLNDCGDGSDESPATC (SEQ ID NO: 255); CGANEFQCRSTGICVPVEWVCDGDNDCGDGSDEPPVC (SEQ ID NO: 256); CGADQFRCGNGSCVPRAWRCDGVDDCGDGSDEAPEIC (SEQ ID NO: 257); CGPDEFRCNNGQCIPLPWRCDGVDDCGDNSDEP'LEIC (SEQ ID NO: 258); CASGEFTCNNGQCVPLAWRCDGVNDCQDGSDEKGC (SEQ ID NO: 259); CGPDEFRCNNGQCIPLPWRCDGVDDCGDNSDEPLEIC (SEQ ID NO: 260); CPPDEFQCRGTKKCLPLA VCDGDNDCEDDSDEESC (SEQ ID NO: 261); CLPDEFQCGSGRCIPQH LCDGLNDCGDGSDEPPAHC (SEQ ID NO: 1237); CLPDEFQCGSGRCIPQHWLCDGLNDCGDGSDEPPAHC (SEQ ID NO: 1326); CAPGEFTCKNTGRCIPLNWRCDGDDDCGDGSDETDC (SEQ ID NO: 1327); y CGPDEFRCNNGQCIPLPWRCDGVDDCGDNSDEPLEIC (SEQ ID NO:1328).

14. La proteina de enlace de conformidad con la reivindicación 10, caracterizada porque el dominio de enlace ß-Klotho de (b) comprende una o más. de: CQSNEFRCRSGRCIPQHWLCDGLNDCGDGSDESQQC (SEQ ID NO: 159); CRAGEFRCSNGRCVPLTWLCDGEDDCQDNSDEKNC (SEQ ID NO: 1323); CPSNQFPCRSTGICIPLA VCDGLNDCGDGSDESPAHC (SEQ ID NO:1324); y CQSNEFRCRSGRCIPQHWLCDGLNDCGDGSDEPPAHC (SEQ ID NO: 1325).

15. Una proteina de enlace caracterizada porque selectivamente enlaza ß-Klotho y FGFRlc que comprende (a) uno o más dominios que selectivamente enlaza ß-Klotho, y (b) uno o más dominios que selectivamente enlaza FGFRlc, en donde la proteina de enlace comprende: (a) un dominio de enlace ß-Klotho que comprende uno o más de: C[AGP] [APS] [DGN] [EQ] F [QRT] C [GNRS] [GNS] [GT] [GKQS] [-IK]C[ILV] P[LQRV] [AEHP] W [LRV] CDG [ DLV] [ DN ] DCGD [GN ] SDE [AEKPS ] [GL PS] [-AEV] [-ITJC (SEQ ID NO: 254); CLPDEFQC [SG] SGRCIPQ [HT] W [VL] CDGLNDCGDGSDE [ PS] PA [HT] C (SEQ ID NO: 597) ; C[AGPR] [AP] [DGNS] [EQ] F [QRT] C [GSK] N [GT] [GHR] [-R]C[ILV] [PS] [ALQ] [NST] W [LRV] CDG [DEV] DDC [GL] DGSDE [AET] [DNS] [-A] [-T]C (SEQ ID NO:249); (b) un dominio de enlace FGFRlc que comprende uno o más de: CG[AE] [GS]LFTC[GR]-[NRS] [AST] [KN] ICIS [EHQS] [AV] [ IV] CDG [ I V] DDC [ DE] DNSDE [ DKMNT] [NSY]C (SEQ ID NO: 108); y en donde los aminoácidos en los paréntesis indican aminoácidos alternativos en una posición especifica y "-" indica ningún aminoácido en la posición especifica.

16. La proteina de enlace de conformidad con la reivindicación 10 caracterizada porque además comprende al menos una ligadura que une (a) y (b) .

17. La proteína de enlace de conformidad con la reivindicación 16, caracterizada porque la ligadura es uno o más de: ETPT (SEQ ID NO: 1319), GDSHILPFSTPGPST (SEQ ID NO: 14), SAPASEPPGSL (SEQ ID NO: 12), PAPT (SEQ ID NO: 1320), QAPT (SEQ ID NO:1321), AQPT (SEQ ID NO:1322), AHT, PERT (SEQ ID NO: 7), TTRT (SEQ ID NO: 8), GTTGPT (SEQ ID NO: 9), ETSGPT (SEQ ID NO: 10), SQDPEFHKVS (SEQ ID NO: 11), y GRPGPGATSAPAA (SEQ ID NO: 13) .

18. La proteina de enlace de conformidad con la reivindicación 15, caracterizada porque (i) el dominio de enlace ß-Klotho de (a) comprende una o más de: CGPDQFRCSSGKCIPQHWLCDGLNDCGDGSDESPATC (SEQ ID NO: 255); CGANEFQCRSTGICVPVE VCDGDNDCGDGSDEPPVC (SEQ ID NO: 256); CGADQFRCGNGSCVPRAWRCDGVDDCGDGSDEAPEIC (SEQ ID NO: 257); CGPDEFRCNNGQCIPLPWRCDGVDDCGDNSDEPLEIC (SEQ ID NO: 258); CASGEFTCNNGQCVPLAWRCDGVNDCQDGSDEKGC (SEQ ID NO: 259); CGPDEFRCNNGQCIPLPWRCDGVDDCGDNSDEPLEIC (SEQ ID NO: 260); CPPDEFQCRGTK CLPLA VCDGDNDCEDDSDEESC (SEQ ID NO: 261); CLPDEFQCGSGRCIPQH LCDGLNDCGDGSDEPPAHC (SEQ ID NO: 1237); CLPDEFQCGSGRCIPQHWLCDGLNDCGDGSDEPPAHC (SEQ ID NO: 1326); CAPGEFTCKNTGRCIPLN RCDGDDDCGDGSDETDC (SEQ ID NO:1327); y CGPDEFRCNNGQCIPLPWRCDGVDDCGDNSDEPLEIC (SEQ ID NO: 1328); y (ii) el dominio de enlace FGFRlc de (b) comprende una o má de : CGAGLFTCRS TNICISQVWV CDGVDDCEDN SDEDSC (SEQ ID NO 109); CGAGLFTCRS TNICISQA V CDGVDDCEDN SDENYC (SEQ ID NO 110) ; CGAGLFTCRS TNICISQAWV CDGVDDCEDN SDETNC (SEQ ID NO 111) ; CGEGLFTCGS TNICISSAWV CDGVDDCEDN SDENNC (SEQ ID NO 112) ; CGEGLFTCRS TNICISHAWV CDGVDDCEDN SDENNC (SEQ ID NO 113) ; CGEGLFTCRS TNICISEAWI CDGVDDCEDN SDEKNC (SEQ. ID NO 114); CGAGLFTCRS AKICISHAWV CDGIDDCEDN SDENNC (SEQ ID NO 115) ; CGAGLFTCRN SKICISQAWV CDGVDDCDDN SDEKYC (SEQ ID NO 116) ; CGASLFTCRR SNICISQAWV CDGVDDCEDN SDEMNC (SEQ ID NO 117) ; y CGAGLFTCRS TKICISQAWV CDGVDDCEDN SDEKNC (SEQ ID NO 118) .

19. La proteína de enlace, de conformidad con la reivindicación 18, caracterizada porque el dominio de enlace FGFRlc de (b) comprende además una ligadura que comprende la secuencia SAPASEPPGSL (SEQ ID NO: 12).

20. La proteína de enlace de conformidad con la reivindicación 19, caracterizada porque el dominio de enlace FGFRlc comprende una . o más de: CGAGLFTCRSTNICISQV VCDGVDDCEDNSDEDSCSAPASEPPGSL (SEQ ID NO: 293) ; CGAGLFTCRSTNICISQAWVCDGVDDCEDNSDENYCSAPASEPPGSL (SEQ ID NO: 294) ; CGAGLFTCRSTNICISQAWVCDGVDDCEDNSDETNCSAPASEPPGSL (SEQ ID NO: 295); CGEGLFTCGSTNICISSA VCDGVDDCEDNSDENNCSAPASEPPGSL (SEQ ID NO : 448); CGEGLFTCRSTÑICISHAWVCDGVDDCEDNSDENNCSAPASEPPGSL (SEQ ID NO: 297); CGEGLFTCRSTNICISEAWICDGVDDCEDNSDEKNCSAPASEPPGSL (SEQ ID NO: 449) ; CGAGLFTCRSAKICISHAWVCDGI DDCEDNSDENNCSAPASEPPGSL (SEQ ID NO: 450); CGAGLFTCRNSKICISQAWVCDGVDDCDDNSDEKYCSAPASEPPGSL (SEQ ID O: 464); CGASLFTCRRSNICISQA VCDGVDDCEDNSDEMNCSAPASEPPGSL (SEQ ID NO: 296) ; y CGAGLFTCRST ICI'SQAWVCDGVDDCEDNSDEKNCSAPASEPPGSL (SEQ ID NO: 287) .

21. Una proteína de enlace caracterizada porque selectivamente enlaza ß-Klotho y FGFRlc que comprende (a) uno o más dominios que selectivamente enlaza ß-Klotho, y (b) uno o más dominios que selectivamente enlaza FGFRlc, en donde la proteína de enlace comprende: (a) un dominio dé enlace ß-Klotho que comprende uno o más de: CQSNEFRCRSGRCIPQHWLCDGLNDCGDGSD E [PS] [PQ] [AQ] [-H]C (SEQ ID NO: 394); C [ELPQR] [APS] [DGIN] [EGQ] [FQ] [FKPQRT] [-E]C[GNRS] [NS]G[HNQR]C'[IV] P [AELPQRV] [AHPQRT ] W [LRV] CDG [ DEV] [DNP ] DC [GLQ] D [DGNS] SDE [AEKT] [DGLNS] [-A] [-H]C (SEQ ID NO: 217); C[AGP] [APS] [DGN] [ EQ] F [QRT ] C [GNRS ] [GNS] [GT] [GKQS] [-IK]C[ILV] P [LQRV] [AEHP] W [LRV] CDG [ DLV] [ DN] DCGD [GN] SDE [AEKPS] [GL PS] [-AEV] [-IT]C (SEQ ID NO: 254); y (b) un dominio de enlace FGFRlc que comprende una secuencia seleccionada del grupo representado por la secuencia: CG[AE] [GS ] LFTC [GR] [NRS] [AST] [KN] ICIS [EHQS] [AV] W [ IV] CDG [ I V] DDC [ DE] DNSDE [ DKMNT] [NSY]C (SEQ ID NO: 108); en donde los aminoácidos en los paréntesis indican aminoácidos alternativos . en una posición específica y "-" indica ningún aminoácido en la posición específica.

22. La proteína de enlace de conformidad con la reivindicación 10 caracterizada porque además comprende al menos una ligadura que une (a) y (b) .

23. La proteína de enlace de conformidad con la reivindicación 22, caracterizada porque la ligadura es una o más de: ETPT (SEQ ID NO: 1319), GDSHILPFSTPGPST (SEQ ID NO: 14), SAPASEPPGSL (SEQ ID NO: 12), PAPT (SEQ ID NO: 1320), QAPT (SEQ ID NO:1321), AQPT (SEQ ID NO: 1322), AHT, PERT (SEQ ID NO: 7), TTRT (SEQ ID NO: .8), GTTGPT (SEQ ID NO: 9), ETSGPT (SEQ ID NO: 10), SQDPEFHKVS (SEQ ID NO: 11), y GRPGPGATSAPAA (SEQ ID NO: 13) .

24. La proteína de enlace de conformidad con la reivindicación 21, caracterizada porque (i) el dominio de enlace ß-Klotho de (a) comprende una o más de: CQSNEFRCRSGRCIPQHWLCDGLNDCGDGSDESQQC (SEQ ID NO: 159); CRAGEFRCSNGRCVPLT LCDGEDDCQDNSDEKNC (SEQ ID NO: 1323); CPSNQF CRSTGICI PLAWVCDGLNDCGDGSDESPAHC (SEQ ID NO:1324); y CQSNEFRCRSGRCIPQHWLCDGLNDCGDGSDEPPAHC (SEQ ID NO: 1325) ; y (ii) el dominio de enlace FGFRlc de (b) comprende una o más de: CGAGLFTCRS TNICISQVWV CDGVDDCEDN SDEDSC (SEQ ID NO: 109); CGAGLFTCRS TNICISQAWV CDGVDDCEDN SDENYC (SEQ ID NO: 110); CGAGLFTCRS TNICISQAWV CDGVDDCEDN SDETNC (SEQ ID NO: 111) ; CGEGLFTCGS TNICISSAWV CDGVDDCEDN SDENNC (SEQ ID NO: 112) ; CGEGLFTCRS TNICISHAWV CDGVDDCEDN SDENNC (SEQ ID NO: 113) ; CGEGLFTCRS TNICISEAWI CDGVDDCEDN SDEKNC (SEQ ID NO: 114) ; CGAGLFTCRS AKICISHAWV CDGIDDCEDN SDENNC (SEQ ID NO: 115); CGAGLFTCRN SKICISQAWV CDGVDDCDDN SDEKYC (SEQ ID NO: 116) ; CGASLFTCRR SNICISQAWV CDGVDDCEDN SDEMNC (SEQ ID NO: 117) ; y CGAGLFTCRS TKICISQAWV CDGVDDCEDN SDEKNC (SEQ ID NO: 118) .

25. La proteína de enlace de conformidad con la reivindicación 24, caracterizada porque el dominio de enlace FGFRlc de (b) comprende además una ligadura que comprende la secuencia SAPASEPPGSL (SEQ ID NO: 12).

26. La proteína de enlace de conformidad con la reivindicación 25, caracterizada porque el dominio de enlace FGFRlc comprende una o más de: CGAGLFTCRSTNICISQVWVCDGVDDCEDNSDEDSCSAPASEPPGSL (SEQ ID NO: 293); CGAGLFTCRSTNICISQAWVCDGVDDCEDNSDENYCSAPASEPPGSL (SEQ ID NO: 294); CGAGLFTCRSTNICISQAWVCDGVDDCEDNSDETNCSAPASEPPGSL (SEQ ID NO: 295); CGEGLFTCGSTNICISSA VCDGVDDCEDNSDENNCSAPASEPPGSL (SEQ ID NO : 448 ) ; CGEGLFTCRSTNICISHAWVCDGVDDCEDNSDENNCSAPASEPPGSL (SEQ ID NO: 297); CGEGLFTCRSTNICISEAWICDGVDDCEDNSDEKNCSAPASEPPGSL (SEQ ID O : 449) ; CGAGLFTCRSAKICISHAWVCDGIDDCEDNSDENNCSAPASEPPGSL (SEQ ID O: 450) ; CGAGLFTCRNSKICISQAWVCDGVDDCDDNSDEKYCSAPASEPPGSL (SEQ ID O: 464); CGASLFTCRRSNICISQAWVCDGVDDCEDNSDEMNCSAPASEPPGSL (SEQ ID O: 296) ; y CGAGLFTCRSTKICISQA VCDGVDDCEDNSDEKNCSAPASEPPGSL (SEQ ID O: 287) .

27. Una proteina de enlace caracterizada porque selectivamente enlaza ß-Klotho. y FGFRlc que comprende (a) uno o más dominios que selectivamente enlazan ß-Klotho, y (b) uno o más dominios que selectivamente enlazan FGFRlc, en donde la proteína de enlace comprende: (a) un dominio de enlace ß-Klotho que comprende: (i) un primer dominio de enlace que comprende uno o más de: C[AGP] [APS] [DGN] [EQ] F [QRT ] C [GNRS ] [GNS] [GT] [GKQS] [-IK]C[ILV] P [LQRV] [AEHP] W [LRV] CDG [ DLV] [DN] DCGD [GN] SDE [AEKPS] [GL PS] [-AEV] [-IT] C (SEQ ID NO: 254); CLPDEFQC[SG]SGRCIPQ[HT]W[VL]CDGLNDCGDGSDE[PS]PA[HT]C (SEQ ID NO: 597); C [AGPR] [AP] [DGNS] [EQ] F [QRT] C [GSK] N [GT] [GHR] [-R]C[ILV] [PS] [ALQ] [NST ] W [LRV] CDG [ DEV] DDC [GL] DGSDE [ ET ] [DNS] [-A] [ -T ] C (SEQ ID NO:249); (ii) un segundo dominio de enlace que comprende uno o más de: CQSNEFRCRSGRCIPQHWLCDGLNDCGDGSD E[PS] [PQ] [AQ] [-H]C (SEQ ID NO: 394); C [ELPQR] [APS] [DGIN] [EGQ] [FQ] [FKPQRT] [-E]C[GNRS] [NS] G [HNQR] C [ IV] P [AELPQRV] [AHPQRT] W [LRV] CDG [DEV] [DNP] DC [GLQ] D [ DGN S]SDE[AEKT] [DGLNS] [-A] [-H]C (SEQ ID NO: 217); C[AGP] [APS] [DGN] [ EQ] F [QRT ] C [GNRS ] [GNS] [GT] [GKQS] [- IK]C[ILV]P[LQRV] [AEHP] W [LRV] CDG [DLV] [DN] DCGD [GN] SDE [AEKPS] [GL PS] [-AEV] [-IT] C (SEQ ID NO: 254); y (iii) una ligadura que une el primer dominio de enlace y el segundo dominio de enlace; y (b) un dominio de enlace FGFRlc que comprende una secuencia seleccionada del grupo representado por la secuencia: CG[AE] [GS ] LFTC [GR] [NRS] [AST] [KN] ICIS [EHQS] [AV] W [ IV] CDG [I V]DDC[DE]DNSDE[DKMNT] [NSY]C (SEQ ID NO: 108); y (c) una ligadura que une las secuencias of (a) y (b) , en donde los aminoácidos en los paréntesis indican aminoácidos alternativos en una posición especifica y "-" indica ningún aminoácido en la posición especifica.

28. La proteina de enlace de conformidad con la reivindicación 27, caracterizada porque el primer dominio de enlace of (a) comprende una o más de: CGPDQFRCSSGKCIPQHWLCDGLNDCGDGSDESPATC (SEQ ID NO: 255) ; CGANEFQCRSTGICVPVEWVCDGDNDCGDGSDEPPVC (SEQ ID NO: 256); CGADQFRCGNGSCVPRAWRCDGVDDCGDGSDEAPEIC (SEQ ID NO: 257); CGPDEFRCNNGQCIPLPWRCDGVDDCGDNSDEPLEIC (SEQ ID NO: 258); CASGEFTCNNGQCVPLAWRCDGVNDCQDGSDEKGC (SEQ ID NO: 259) ; CGPDEFRCNNGQCIPLPWRCDGVDDCGDNSDEPLEIC (SEQ ID NO: 260); CPPDEFQCRGTKKCLPLAWVCDGDNDCEDDSDEESC (SEQ ID NO: 261); CLPDEFQCGSGRCIPQHWLCDGLNDCGDGSDEPPAHC (SEQ ID NO: 1237); CLPDEFQCGSGRCIPQHWLCDGLNDCGDGSDEPPAHC (SEQ ID NO: 1326); CAPGEFTCKNTGRCIPLNWRCDGDDDCGDGSDETDC (SEQ ID O:1327); y CGPDEFRCNNGQCIPLPWRCDGVDDCGDNSDEPLEIC (SEQ ID NO:1328).

29. La proteina de enlace de conformidad con la reivindicación 27, caracterizado porque el segundo dominio de enlace of (a) comprende una o más de: CQSNEFRCRSGRCIPQHWLCDGLNDCGDGSDESQQC (SEQ ID NO: 159); CRAGEFRCSNGRCVPLTW.LCDGEDDCQDNSDEKNC ( SEQ ID NO: 1323); CPSNQFPCRSTGICI PLA VCDGLNDCGDGSDESPAHC (SEQ ID NO:1324); y CQSNEFRCRSGRCIPQHWLCDGLNDCGDGSDEPPAHC (SEQ ID NO: 1325).

30. La proteína de enlace de conformidad con la reivindicación 27, caracterizada' porque la ligadura de (a) comprende una o más de: ETPT (SEQ ID NO: 1319), GDSHILPFSTPGPST (SEQ ID NO: 14), SAPASEPPGSL (SEQ ID NO: 12), PAPT (SEQ ID NO:1320) y QAPT (SEQ ID N0.1321).

31. La proteína de enlace de conformidad con la reivindicación 27, caracterizada porque el dominio de enlace FGFRlc comprende una o más de: CGAGLFTCRS TNICISQVWV CDGVDDCEDN SDEDSC (SEQ ID NO: 109); CGAGLFTCRS TNICISQAWV CDGVDDCEDN SDENYC (SEQ ID NO: 110) ; CGAGLFTCRS TNICISQAWV CDGVDDCEDN SDÉTNC (SEQ ID NO: 111); CGEGLFTCGS TNICISSAWV CDGVDDCEDN SDENNC (SEQ ID NO:.112).; CGEGLFTCRS TNICISHAWV CDGVDDCEDN SDENNC (SEQ ID NO : 113); CGEGLFTCRS TNICISEA I CDGVDDCEDN SDEKNC (SEQ ID NO : 114); CGAGLFTCRS AKICISHA V CDGIDDCEDN SDENNC (SEQ ID NO : 115); CGAGLFTCRN SKICISQAWV CDGVDDCDDN SDEKYC (SEQ ID NO : 116); CGASLFTCRR SNICISQAWV CDGVDDCEDN SDEMNC (SEQ ID NO: 117); y CGAGLFTCRS TKICISQAWV CDGVDDCEDN SDEKNC (SEQ ID NO: 118).

32. La proteína de enlace de conformidad con la reivindicación 31, caracterizada porque además comprende una ligadura que comprende la secuencia SAPASEPPGSL (SEQ ID NO: 12).

33. La proteína de enlace de conformidad con la reivindicación 32, caracterizada porque la proteína de enlace comprende una o más de: CGAGLFTCRSTNICISQVWVCDGVDDCEDNSDEDSCSAPASEPPGSL (SEQ ID NO: 293); CGAGLFTCRSTNICISQAWVCDGVDDCEDNSDENYCSAPASEPPGSL (SEQ ID NO: 294); CGAGLFTCRSTNICISQAWVCDGVDDCEDNSDETNCSAPASEPPGSL (SEQ ID NO: 295); CGEGLFTCGSTNICISSAWVCDGVDDCEDNSDENNCSAPASEPPGSL (SEQ ID NO : 448); CGEGLFTCRSTNICISHA VCDGVDDCEDNSDENNCSAPASEPPGSL (SEQ ID NO: 297) ; CGEGLFTCRSTNICISEA ICDGVDDCEDNSDEKNCSAPASEPPGSL (SEQ ID NO : 449); CGAGLFTCRSAKICISHAWVCDGI DDCEDNSDENNCSAPASEPPGSL (SEQ ID NO: 450); CGAGLFTCRNSKICISQAWVCDGVDDCDDNSDEKYCSAPASEPPGSL (SEQ ID NO: 464); CGASLFTCRRSNICISQA' VCDGVDDCEDNSDE NCSAPASEPPGSL (SEQ ID NO: 296) ; y CGAGLFTCRSTKICISQAWVCDGVDDCEDNSDEKNCSAPASEPPGSL (SEQ ID NO: 287) .

3 . La proteína de enlace de conformidad con la reivindicación 33, caracterizada porque el dominio de enlace FGFRlc comprende una o más de: CGEGLFTCRSTNICISHAWVCDGVDDCEDNSDENNCSAPASEPPGSL (SEQ ID NO: 297) .

35. La proteína de enlace de conformidad con la reivindicación 27, caracterizada porque la ligadura de (c) comprende una o más de: AQPT (SEQ ID NO: 1322), AHT, PERT (SEQ ID NO: 7), TTRT (SEQ ID NO: 8), GTTGPT (SEQ ID NO: 9), ETSGPT (SEQ ID NO: 10), SQDPEFHKVS (SEQ ID NO: 11), SAPASEPPGSL (SEQ ID NO: 12), GRPGPGATSAPAA (SEQ ID NO: 13), y GDSHILPFSTPGPST (SEQ ID NO: 14) .

36. La proteína de enlace . de conformidad con la reivindicación 27, caracterizada porque la proteína de enlace comprende la secuencia: CGADQFRCGNGSCVPRAWRCDGVDDCGDGSDEAPEICETPTCQSNEFRCRSGRCIPQHWLC DGLNDCGDGSDESQQCSAPASEPPGSLCGEGLFTCRSTNICISHAWVCDGVDDCEDNSDEN NCSAPASEPPGSL (SEQ ID NO: 359) .

3 . La proteina de enlace de conformidad con la reivindicación 27, caracterizada porque la proteina de enlace comprende la secuencia:. CLPDEFQCGSGRCI PQHWLCDGLNDCGDGSDEPPAHCSAPASEPPGSLCRAGEFRCSNGRC VPLT LCDGEDDCQDNSDEKNCAQPTCGEGLFTCRSTNICISHAWVCDGVDDCEDNSDENN CSAPASEPPGSL (SEQ ID NO: 339).

38. La proteina de enlace de conformidad con la reivindicación 27, caracterizada porque la proteina de enlace comprende la secuencia: CAPGEFTCKNTGRCIPLNWRCDGDDDCGDGSDETDCPAPTCPSNQFPCRSTGICIPLAWVC DGLNDCGDGSDESPAHCSAPASEPPGSLCGEGLFTCRSTNICISHAWVCDGVDDCEDNSDE NNCSAPASEPPGSL (SEQ ID NO: 1270).

39. La proteína . de enlace de conformidad con la reivindicación 27, caracterizada porque la proteína de enlace comprende la secuencia: CGPDEFRCNNGQCIPLP RCDGVDDCGDNSDEPLEICQAPTCQSNEFRCRSGRCIPQH LC DGLNDCGDGSDEPPAHCSAPASEPPGSLCGEGLFTCRSTNICISHA VCDGVDDCEDNSDE NNCSAPASEPPGSL (SEQ ID NO: 1271).

40. Una proteína de enlace caracterizada porque comprende: (Bl)a-(Ll)x-(B2)b-(L2)y-(lC)c-(L3)z en donde a, b, c, x, y, y z es 0r 1, o 2, sin embargo con la condición de que al menos uno de a, b, y c es 1 o 2; en donde Bl es una secuencia de aminoácidos como se establece en la reivindicación 1; en donde B2 es una secuencia de aminoácidos como se establece en la reivindicación 3; en donde 1C es una secuencia de aminoácidos como se establece en la reivindicación 5; en donde Ll es una secuencia de aminoácidos como se establece en la reivindicación 12; en donde L2 es una. secuencia de aminoácidos como se establece en la reivindicación 17; y en donde L3 es SAPASEPPGSL.

41. La proteina de enlace de conformidad con la reivindicación 1, 3, 5, 10, 15, 21, 27, 36, 37, 38, o 39, caracterizada porque la proteina de enlace comprende además una porción que extiende la vida media, que incrementa la vida media en suero de la proteina de enlace en un mamífero comparada con la vida media en suero de la proteína de enlace que carece de la porción que extiende la vida media en un mamífero.

42. La proteína de enlace de conformidad con la reivindicación 41, caracterizada porque la porción que extiende la vida media es uno o más de: polietilenglicol (PEG) , albúmina de suero humana- (HSA) , una inmunoglobulina (IgG), y un resto Fe.

43. La proteina de enlace de conformidad con la reivindicación 41, caracterizada porque la porción que extiende la vida media comprende una secuencia de. proteina que específicamente enlaza un factor de sangre.

44. La proteina de enlace de conformidad con la reivindicación 43, caracterizada porque el factor de sangre es albúmina de suero, una inmunoglobulina o un eritrocito.

45. La proteina de enlace de conformidad con la reivindicación 1, 3, 5, 10, 15,- 21, 27, 36, 37, 38, o 39, caracterizada porque la .proteina de enlace comprende una secuencia de aminoácidos que comprende uno o más aminoácidos que no se presentan naturalmente.

46. Un polinucleótido caracterizado porque codifica una proteina de enlace, que comprende uno o más de: (a) un dominio de enlace ß-Klotho; (b) un dominio de enlace FGFRlc; (c) uno o más dominios de enlace ß-Klotho y un dominio de enlace FGFRlc; y (c) una proteina de enlace- de la reivindicación 1, 3, 5, 10, 15, 21, 27, 36, 37,. 38, o 39.

47. Un vector de expresión caracterizado porque comprende el polinucleótido de la reivindicación 46.

48. Una célula hospedera caracterizada porque comprende el vector de expresión de la reivindicación 47.

49. Un método para hacer una proteina de enlace caracterizado porque comprende incubar la célula hospedera de la reivindicación 48 bajo condiciones adecuadas para inducir la expresión de la proteina de enlace, y opcionalmente aislar el polipéptido expresado.

50. Una composición farmacéutica caracterizada porque comprende: (a) una proteina de enlace de la reivindicación 1, 3, 5, 10, 15, 21, 27, -36, 37, 38, o 39; y (b) un agente de formulación farmacéuticamente aceptable.

51. Una composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 50, · caracterizada porque el agente de formulación farmacéuticamente aceptable es un portador, adyuvante, solubilizador, estabilizador, o anti-oxidante .

52. Un método para tratar un trastorno metabólico caracterizado porque comprende administrar un paciente humano que necesita de la misma composición farmacéutica de la reivindicación 50.

53. El método de ' conformidad con la reivindicación 52, caracterizado porque el trastorno metabólico es uno o más de: diabetes, obesidad, dislipidemia, hipertensión, hepatosteatosis, esteatohepatitis no alcohólica (NASH) , pancreatitis aguda, síndrome metabólico, enfermedad cardiovascular, tal como ateroesclerosis , y envejecimiento.

54. El método de conformidad con la reivindicación 53, caracterizado porque el trastorno metabólico es diabetes.

55. El método de conformidad con la reivindicación 53, caracterizado porque el trastorno metabólico es obesidad.