JP2007125032A

JP2007125032A - 微生物検査室における日常的診断用の臨床検体からの通常の細菌病原体および抗生物質耐性遺伝子を迅速に検出および同定するための特異的および普遍的プローブおよび増幅プライマー

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Publication number: JP2007125032A
Application number: JP2006351083A
Authority: JP
Inventors: Michel G Bergeron; ミシエル・ジエ・ベルジユロン; Marc Ouellette; マルク・ウエレツト; Paul H Roy; ポール・アシユ・ロワ
Original assignee: Infectio Diagnostic IDI Inc
Current assignee: Infectio Diagnostic IDI Inc
Priority date: 1994-09-12
Filing date: 2006-12-27
Publication date: 2007-05-24
Also published as: NZ292494A; JP4176146B2; EP0804616B1; CA2199144A1; DK0804616T3; US6001564A; US20090047671A1; BR9508918A; EP1138786A3; MX9701847A; EP1138786A2; AU705198B2; AU3468195A; EP1138786B1; DE69527154D1; WO1996008582A3; JPH10504973A; NO971111L; EP0804616A2; ES2176336T3

Abstract

【課題】臨床検体または細菌コロニーから細菌病原体、抗生物質耐性遺伝子、および細菌耐性特異的検出方法を提供する。
【解決手段】ゲノムライブラリーまたはデータバンクからハイブリダイゼーションによって選択されたすべての種特異的ゲノムＤＮＡ断片からのＤＮＡ配列、ならびにＰＣＲまたは任意の他の核酸増幅方法用のプローブまたは増幅プライマーとして使用できるこれらの配列に由来する特定配列を有する任意のオリゴヌクレオチド配列からなる。また、選択された臨床的に関連する抗生物質耐性遺伝子からのＤＮＡ配列を含む。
【選択図】なし

Description

細菌の古典的同定
細菌は、古典的には、ＡＰＩ２０Ｅ^ＴＭシステムのごとき生化学検査の使用を通じて炭素源および窒素源としての異なる基質を利用するその能力によって同定される。グラム陰性桿菌の感受性検査は微量希釈検査法まで進歩した。ＡＰＩおよび微量希釈システムはコスト的に有利であるが、検体から細菌を単離し同定するのに２晩連続してインキュベーションする必要があるため、予備的結果を得るのに少なくとも２日必要である。高性能で高価な装置を用いるいくつかのより迅速な検出方法が開発されてきた。例えば、最も速い同定システム、ａｕｔｏＳＣＡＮ−Ｗａｌｋ−Ａｗａｙ^ＴＭシステムは、２時間で、単離された細菌コロニーからのグラム陰性およびグラム陽性菌を共に同定し、わずか７時間で抗生物質に対する感受性パターンを同定する。しかしながら、このシステムは、特に腸内細菌科（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）以外の細菌種に関し、許容されない誤差限界を有する（Ｙｏｒｋら、１９９２、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３０：２９０３−２９１０）。それにも拘わらず、この最も迅速な方法でさえ純粋培養体として細菌を一次単離する必要があり、このプロセスは、もし純粋培養体があれば少なくとも１８時間を要し、あるいはもし混合された培養体があれば、２〜３日要する。

尿検体
細菌同定のために日常的に診断微生物検査室で受容される検体の主体（４０−５０％）は尿検体である（Ｐｅｚｚｌｏ，１９８８，Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．１：２６８−２８０）。尿管感染（ＵＴＩ）は極めて一般的であり、女性の２０％までが罹り、入院患者のなかで罹患率が高くまた死亡率の増大が報告されている（ＪｏｈｎｓｏｎおよびＳｔａｍｍ，１９８９；Ａｎｎ．Ｉｎｔｅｒｎ．Ｍｅｄ．１１１：９０６−９１７）。ＵＴＩは細菌性病因の一般的なものであって、抗微生物薬療法を要する。グラム陰性桿菌大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）は、断然、最も普通の尿病原体であって、ＵＩＴの５０〜６０％と見積もられている（Ｐｅｚｚｌｏ，１９８８，前掲）。「ＣｅｎｔｒｅＨｏｓｐｉｔａｌｉｅｒｄｅｌ’ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｅＬａｖａｌ（ＣＨＵＬ）」で最近観察された尿検体から単離された細菌病原体に対する罹患率を表１および表２に示した。

尿検体における通常の病原体同定
尿検体中の病原体の検査は日常的微生物検査室で圧倒的に多く実施されるので、膨大な検査法が開発されてきた。その中心的方法（ｇｏｌｄｓｔａｎｄａｒｄ）は依然として古典的な半定量的平板培養方法であり、この方法では、１検量ループの尿を平板上に画線し、１８−２４時間インキュベートする。次いで、コロニーを計数して、尿１リットル当たりのコロニー形成単位（ＣＦＵ）の総数を決定する。細菌性ＵＴＩは、通常、尿中の≧１０^７ＣＦＵ／Ｌの細菌数に関連している。しかしながら、尿中１０^７未満のＣＦＵ／Ｌでの感染も、特に、病気の発症率の高い患者やカテーテル処置した患者では可能である（ＳｔａｒｋおよびＭａｋｉ，１９８４，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３１１：５６０−５６４）。重要な点は、検査した尿検体の８０％近くが陰性であることである（＜１０７ＣＦＵ／Ｌ；表３）。

細菌病原体についての正確で迅速な尿スクリーニング方法は、陰性結果のより迅速な判定と患者のより効果的な臨床診断を可能とするであろう。いくつかの迅速な判定方法（Ｕｒｉｓｃｒｅｅｎ^ＴＭ，ＵＴＩｓｃｒｅｅｎ^ＴＭ，ＦｌａｓｈＴｒａｃｋ^ＴＭＤＮＡプローブ等）が最近、細菌病原体の培養に基づいたより遅い標準的生化学法と比較されている。かなり速いのであるが、これらの迅速テストは、感度が低くかつ特異性が低いうえに、偽陰性および偽陽性結果の数も多い（Ｋｏｅｎｉｎｇら，１９９２，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３０：３４２−３４５；Ｐｅｚｚｌｏら，１９９２，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３０：６４０−６８４）。

培養によって陽性であることが分かった尿検体はさらに、細菌病原体を同定するために標準的な生化学検査法を用いて特徴付けられ、また抗生物質に対する感受性について検査される。

臨床検体
本明細書中で具体例として使用された尿検体に関しては、本出願人のプローブおよび増幅用プライマーは任意の他の臨床検体に対しても適用できる。本発明で提供されるＤＮＡを主体とする検査法は、迅速性および正確さの点で、日常的診断で現在使用されている標準的方法よりも優れている。高パーセンテージの尿検体が陰性である一方、多くの他の臨床検体では、９５％を超える培養体が陰性である（表４）。これらのデータはさらに、陰性の臨床検体をスクリーニングするための普遍的プローブの使用を支持する。ヒト以外の生物（例えば、他の霊長類、哺乳動物、農場動物または家畜）からの臨床検体も使用できる。

迅速なＤＮＡ主体の診断検査法の開発
迅速な診断検査法は感染の管理に対して重要な影響を与えるべきである。臨床試料中の病原体および抗生物質耐性遺伝子の同定については、ＤＮＡプローブおよびＤＮＡ増幅技術が常法よりも優れたいくつかの利点を提供する。継代培養をする必要がなく、従って、生物を臨床試料で直接的に検出でき、それにより、病原体の単離に伴うコストおよび時間を減少させる。ＤＮＡを主体とする技術は、臨床微生物検査室において特定の利用者に極めて有用である。例えば、臨床検体中の病原体の直接的検出のためのハイブリダイゼーションプローブまたはＤＮＡ増幅の使用に基づく栄養条件の面倒な生物の検出用キットは、商業的に入手可能である（Ｐｅｒｓｉｎｇら，１９９３，ＤｉａｇｎｏｓｔｉｃＭｏｌｅｃｅｕｌａｒＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ；ＰｒｉｎｃｉｐｌｅｓａｎｄＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ＡｍｅｒｉｃａｎＳｏｃｉｅｔｙｆｏｒＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．）。

本発明は、日常的診断のために病院の臨床微生物検査室および私的な診療所で使用される通常の培養同定方法に対する有利な代替法である。かなり速いという以外に、ＤＮＡ主体の診断検査法は、診断に現在使用されている標準的な生化学検査法よりもより正確である。何故ならば、細菌の遺伝子型（例えば、ＤＮＡレベル）は細菌表現型（例えば、生化学的特性）よりもより安定だからである。本発明の独創性は、通常遭遇する細菌病原体の１２種に特異的なゲノムＤＮＡ断片（少なくとも１００塩基対のサイズ）をゲノムライブラリーまたはデータバンクから選択した。ゲノムライブラリーからまたは選択したデータバンク配列からハイブリダイゼーションによって同定された種特異的ＤＮＡ断片の配列に共に由来する増幅プライマーまたはオリゴヌクレオチドプローブ（共に長さが１００ヌクレオチド未満）を診断検査法を開発するためのベースとして使用する。一般的に遭遇し臨床的に重要な細菌耐性遺伝子の検出用のオリゴヌクレオチドプローブおよびプライマーも含まれる。例えば、ＡｎｎｅｘＩおよびＩＩには、すべてゲノムライブラリーまたはデータバンク配列から選択された種特異的ＤＮＡ断片に由来する適当なオリゴヌクレオチドプローブおよびＰＣＲプライマーのリストがある。当業者は、Ａｎｎｅｘ１および２にリストされたもの以外の前記細菌種の特異的検出に適するオリゴヌクレオチド配列を種特異的断片または選択されたデータバンク配列から得ることが明らかに可能であろう。例えば、オリゴヌクレオチドは、本出願人が選択したものよりも短くても長くてもよく、また、同定された種特異的配列または選択されたデータバンク配列のいずれの他のところからも選択できる。あるいは、オリゴヌクレオチドはＰＣＲ以外の増幅方法での使用のために設計することもできる。したがって、本発明の核心部分は、細菌ゲノムＤＮＡライブラリーからの種特異的ゲノムＤＮＡ断片の同定、および種特異的かつ遍在的オリゴヌクレオチド源として使用されるデータバンク配列からのゲノムＤＮＡ断片の選択である。種特異的断片の配列または選択されたデータバンク配列からの診断目的に適したオリゴヌクレオチドの選択はかなり努力を要するが、当業者には、本出願人の見出した断片または選択したデータバンク配列から、本出願人が選択し具体例としてテストしたもの（ＡｎｎｅｘＩおよびＩＩ）とは異なる適当なオリゴヌクレオチドを選び出すのは全く可能である。

なかには、本出願人がその種特異的配列を同定した細菌病原体のいくつかについてそれらの検出および同定のためのＤＮＡ主体の検査法を開発した者もいる（ＰＣＴ出願公開第ＷＯ９３／０３１８６号）。しかしながら、それらの戦略は高度に保存された１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の増幅、およびその後の内部種特異的オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションに基づくものであった。本発明の戦略はかなり簡単でより迅速であるが、これは、種特異的細菌ゲノムＤＮＡ断片に由来するオリゴヌクレオチドを用いて種特異的標的の直接的増幅を可能とするからである。

臨床検体の高パーセンテージは陰性であるので、臨床検体で恐らくは遭遇するすべての細菌病原体を検出して、臨床検体が感染されているか否かを判定するために、オリゴヌクレオチドプライマーおよびプローブを高度に保存的な１６Ｓまたは２３ＳｒＲＮＡ遺伝子から選択した。この戦略は、細菌学的検査に付された多数の陰性臨床検体の迅速なスクリーニングを可能とする。

本出願人はさらに、一般的に遭遇し臨床的に関連する細菌耐性遺伝子を標的化することによって、細菌同定を同時に行い、抗生物質に対する推定感受性を迅速に測定するために、他のＤＮＡ主体検査法を開発している。選択された抗生物質耐性遺伝子からの配列が利用でき、それを用いてそれらの検出のためのＤＮＡ主体の検査法が開発されてきたが（ＥｈｒｌｉｃｈおよびＧｒｅｅｎｂｅｒｇ，１９９４，ＰＣＲ−ｂａｓｅｄＤｉａｇｎｏｓｔｉｃｓｉｎＩｎｆｅｃｔｉｏｕｓＤｉｓｅａｓｅ，ＢｌａｃｋｗｅｌｌＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＰｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｂｏｓｔｏｎ，Ｍｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ；Ｐｅｒｓｉｎｇら、１９９３，ＤｉａｇｎｏｓｔｉｃＭｏｌｅｃｕｌａｒＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ：ＰｒｉｎｃｉｐｌｅｓａｎｄＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ＡｍｅｒｉｃａｎＳｏｃｉｅｔｙｆｏｒＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．）、本出願人のアプローチは細菌の培養に基づく現在の「中心的方法たる」診断法よりも優れた主要な改良を示す点で革新的である。何故なら、１時間以内で直接的に臨床検体から、特異的細菌病原体の存在の迅速な同定および抗生物質に対するその感受性の評価を可能にするからである。

本出願人は、本出願人が開発して細菌培養に基づかない迅速で単純な診断検査法が病院の臨床微生物検査室および個人的診療所で現在使用されている時間のかかる通常の細菌同定方法と徐々に置き換わるであろうと信じている。本出願人の意見では、ひどくかつ通常の細菌病原体および抗生物質耐性についてのこれらの迅速なＤＮＡ主体診断検査法は（ｉ）治療を最適化することによって生命を救い、（ｉｉ）広域スペクトル抗生物質の使用を減少させることによって抗生物質耐性を低減させ、（ｉｉｉ）入院をなくしまたは短期間とすることによって総健康費用を低減させるであろう。

発明の概要

本発明により、臨床検体中の通常に遭遇する細菌病原体（すなわち、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）、クレブシェラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａｐｎｕｅｍｏｎｉａｅ）、シュウドモナス・アエルギノーサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、プロテウス・ミラビリス（Ｐｒｏｔｅｕｓｍｉｒａｂｉｌｉｓ）、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｏｓａｕｒｅｕｓ）、スタフィロコッカス・エピデルミディス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｏｓｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）、エンテロコッカス・フェカリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓｆａｅｃａｌｉｓ）、スタフィロコッカス・サプロフィティカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｏｓｓａｐｒｏｐｈｙｔｉｃｕｓ）、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｙｏｇｅｎｅｓ）、ヘモフィラス・インフルエンザ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）およびモラキセラ・カタルハリス（Ｍｏｒａｘｅｌｌａｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ））の検出に特異的である、ゲノムライブラリーまたはデータバンクからハイブリダイゼションによって選択されたゲノムＤＮＡ断片（配列表に記載した全部又は少なくとも１００塩基対のサイズ）からの配列が提供される。これらの細菌種は、尿管感染の約９０％に、および敗血症、髄膜炎、肺炎、腹腔内感染、皮膚感染および多くの他の重症呼吸器管感染の高パーセンテージに関連する。総じて、前記細菌種は、日常的微生物検査室で単離された細菌病原体の８０％までを占める。

ハイブリダイゼーション（プローブ）またはＤＮＡ増幅（プライマー）のための合成オリゴヌクレオチドは、前記種特異的ＤＮＡ断片（０.２５〜５.０キロベース対（ｋｂｐ）のサイズ範囲）または選択されたデータバンク配列（ＧｅｎＢａｎｋおよびＥＭＢＬ）に由来するものであった。そのオリゴヌクレオチドプローブおよび増幅プライマーのいくつかが、選択されたデータバンク配列に由来する細菌種は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）、エンテロコッカス・フェカリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓｆａｅｃａｌｉｓ）、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｏｓｐｙｏｇｅｎｅｓ）およびシウドモナス・アエルギノーサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）である。当業者ならば、本発明の重要な革新部分が、ハイブリダイゼーションによって細菌ゲノムライブラリーから、またはデータバンク配列から選択された種特異的ＤＮＡ断片の同定であることが分かるだろう。診断目的に適したこれらの断片からのオリゴヌクレオチドの選択も革新的であることが分かるだろう。実際にテストされたものとは異なる特異的かつ普遍的オリゴヌクレオチドは本発明の具体例とみなされる。

臨床検体からの病原体の検出用のハイブリダイゼーション（断片またはオリゴヌクレオチドプローブを使用する）またはＤＮＡ増幅プロトコルの開発は非常に迅速な細菌同定を可能にする。これは、臨床検査室において病原体の同定に現在必要とされている時間を大いに短縮する。これらの技術は、細菌ＤＮＡを放出させるための任意の生物学的検体の前処理が最小であって、臨床検体から直接細菌の検出および同定に適用できるからである。１００％特異的であることに加えて、プローブおよび増幅プライマーは直接的に、臨床検体から、あるいは単離したコロニーから細菌種の同定を可能にする。ＤＮＡ増幅アッセイは、ハイブリダイゼーションアッセイよりも速くかつ感度が良いというさらなる利点を有する。それらのアッセイは、細菌ゲノムからのＤＮＡの標的セグメントの迅速で指数的なイン・ビトロ複製を可能とするからである。いずれの細菌病原体の検出も可能とする、細菌間で高度に保存された１６Ｓ又は２３ＳｒＲＮＡ遺伝子から選択された普遍的プローブおよび増幅プライマーは、診断検査室で受容された多数の陰性臨床検体をスクリーニングする手法として供されるであろう。一般的に遭遇し臨床的に重要な耐性遺伝子を同定するための抗生物質耐性をコードする特徴付けられた細菌遺伝子に相補的なオリゴヌクレオチドプローブまたはプライマーも本発明の範囲内にある。

発明の詳細な説明

種特異的ＤＮＡプローブの開発
以下の細菌種：大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）、クレブシェラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａｐｎｕｅｍｏｎｉａｅ）、シウドモナス・アエルギノーサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、プロテウス・ミラビリス（Ｐｒｏｔｅｕｓｍｉｒａｂｉｌｉｓ）、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｏｓａｕｒｅｕｓ）、スタフィロコッカス・エピデルミディス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｏｓｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）、スタフィロコッカス・サプロフィティカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｏｓｓａｐｒｏｐｈｙｔｉｃｕｓ）、ヘモフィラス・インフルエンザ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）およびモラキセラ・カタルハリス（Ｍｏｒａｘｅｌｌａｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ）についてＤＮＡ断片プローブを開発した。（エンテロコッカス・フェカリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓｆａｅｃａｌｉｓ）およびストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｏｓｐｙｏｇｅｎｅｓ）については、オリゴヌクレオチド配列は、絶対的に、選択されたデータバンク配列に由来した）。これらの種特異的断片を、種々のグラム陽性およびグラム陰性細菌種からのＤＮＡに対するハイブリダイゼーションによって細菌ゲノムライブラリーから選択した（表５）。

プローブが求められる各細菌種からの染色体ＤＮＡは標準的な方法を用いて単離した。Ｓａｕ３ＡＩのごとき頻繁に切断する制限酵素でＤＮＡを消化し、次いで、適当な制限エンドヌクレアーゼ消化によって線状化した細菌プラスミドベクターｐＧＥＭ３Ｚｆ（Ｐｒｏｍｅｇａ）に連結した。次いで、組換えプラスミドを用いて、コンピテントな大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株ＤＨ５αを形質転換し、それにより、ゲノムライブラリーを得た。標準的な方法を用いて形質転換細菌細胞のプラスミド含量を分析した。０．２５〜５．０キロベース対（ｋｂｐ）のサイズ範囲の標的細菌のＤＮＡ断片を、種々ののエンドヌクレアーゼでの組換えプラスミドの消化によってベクターから切り出した。アガロース電気泳動によってインサートをベクターから分離し、低融点アガロースゲル中で精製した。次いで、細菌ゲノムＤＮＡの精製断片の各々を特異性テストのためのプローブとして用いた。

各与えられた種につき、コーディング可能性が未知のゲル精製制限断片を、ランダムプライミング標識反応によってＤＮＡ断片に取り込まれた放射性ヌクレオチドα−^３２Ｐ（ｄＡＴＰ）で標識した。標識として使用するために、非放射性の改変されたヌクレオチドもこの方法によってＤＮＡに取り込むことができた。

次いで、各ＤＮＡ断片プローブ（すなわち、ゲノムライブラリーからランダムに選択されたクローンから切り出した少なくとも１００ｂｐ長さの細菌ゲノムＤＮＡのセグメント）を、種々の細菌種からのＤＮＡとのハイブリダイゼーションによってその特異性についてテストした（表５）。二本鎖標識ＤＮＡプローブを熱変性して、標識された一本鎖ＤＮＡが得られ、これを次いで固体支持体に固定化されたまたは溶液中のいずれかの一本鎖標的ＤＮＡにハイブリダイズさせることができた。標的ＤＮＡは、臨床試料で見い出された細菌種の列からの全細胞ＤＮＡよりなるものであった（表５）。各標的ＤＮＡを細菌細胞から遊離させ、常法によって変性し、次いで、固体支持体（例えば、ナイロンまたはニトロセルロース膜）に不可逆的に固定し、あるいは溶液中に遊離させた。次いで、固定した一本鎖標的ＤＮＡを一本鎖プローブとハイブリダイズさせた。プレ−ハイブリダイゼーション、ハイブリダイゼーションおよびポスト−ハイブリダイゼーション条件は以下の通りであった：（１）プレ−ハイブリダイゼーション；１ＭＮａＣｌ＋１０％デキストラン硫酸＋１％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）＋１００μｇ／ｍｌサケ精子ＤＮＡ中、６５℃１５分、（ｉｉ）ハイブリダイゼーション；標識したプローブを含有する新鮮なプレ−ハイブリダイゼーション溶液中、６５℃一晩、（ｉｉｉ）ポスト−ハイブリダイゼーション；１％ＳＤＳを含有する３×ＳＳＣ（１×ＳＳＣは０．１５ＭＮａＣｌ、０．０１５Ｍクエン酸ナトリウムである）中で２回、および０．１％ＳＤＳを含有する０．１×ＳＳＣ中で２回洗浄；全ての洗浄は６５℃において１５分間であった。洗浄したフィルターのオートラジオグラフィーは、選択的にハイブリダイズしたプローブの検出を可能とした。特異的標的ＤＮＡとプローブのハイブリダイゼーションは、これらの２のＤＮＡのヌクレオチド配列間の高度の類似性を示した。

０．２５〜５．０ｋｂｐのサイズ範囲の種々の細菌ゲノムライブラリーから選択した種特異的ＤＮＡ断片を、前記したごとくに行った種々の細菌からの染色体ＤＮＡに対するハイブリダイゼーションに基づいて、１０種の通常の細菌病原体（表６）につき単離した。テストした細菌種のすべて（表５にリストした６６種）は通常の感染に関連した病原体または臨床検体から単離できる可能な夾雑物のようであった。ＤＮＡ断片プローブは、それを単離した病原体のみにハイブリダイズした場合のみ、特異的とみなされた。特異的であることが判明したＤＮＡ断片プローブを、引き続いて、目的とする種の約１０〜８０種の臨床単離体からの細菌ＤＮＡに対するハイブリダイゼーションによってその遍在性につきテストした（すなわち、遍在性プローブは標的種のほとんどの単離体を認識した）（表６）。ＤＮＡを変性し、ナイロン膜に固定し、前記したごとくにハイブリダイズさせた。

種特異的断片プローブの配列決定
Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ（ＵＳＢＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）またはＴ７ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用いて行ったジデオキシヌクレオチド終止配列決定法を用いて、単離された種特異的ＤＮＡ断片（表６）の全体または一部のヌクレオチド配列を決定した。これらのヌクレオチド配列を配列表に示す。また、データバンク（ＧｅｎＢａｎｋおよびＥＭＢＬ）から選択した配列を、大腸菌、エンテロコッカス・フェカリス、ストレプトコッカス・ピオゲネスおよびシウドモナス・アエルギノーサ用の診断目的でオリゴヌクレオチド源として用いた。この戦略では、データバンクから選択した種々のゲノムＤＮＡ断片（１００ｂｐを超えるサイズ）に由来する適当なオリゴヌクレオチドプライマーまたはプローブの列を、後記するごとく、ＰＣＲおよびハイブリダイゼーションアッセイにおいてそれらの特異性および普遍性につきテストした。データバンク配列は、利用できる配列情報に応じて種特異的であるそれらの可能性に基づいて選択されたことに注意するのが重要である。種特異的オリゴヌクレオチドが由来するデータバンク配列のみが本発明に含まれる。

ゲノムライブラリーからまたはデータバンク配列から選択された種特異的断片に由来するオリゴヌクレオチドプローブおよび増幅用プライマーを、自動ＤＮＡ合成装置（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて合成した。合成に先立ち、すべてのオリゴヌクレオチド（ハイブリダイゼーション用のプローブおよびＤＮＡ増幅用のプライマー）を、標準的なプログラム（例えば、ＧｅｎｅｔｉｃｓＣｏｍｐｕｔｅｒＧｒｏｕｐ（ＧＣＧ）およびＯｌｉｇｏ^ＴＭ４．０（ＮａｔｉｏｎａｌＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ））を用いるコンピューター解析によるポリメラーゼ連鎖反応によって、ハイブリダイゼーションまたはＤＮＡ増幅についてのそれらの適性につき評価した。また、ＰＣＲプライマー対の可能な適性も、１ヌクレオチドの長いストレッチ、３’末端における高い割合のＧまたはＣ残基、および３’−末端Ｔ残基のごとき望まない特徴の不存在を確認することによって合成に先立ち評価した（Ｐｅｒｓｉｎｇら、１９９３，ＤｉａｇｎｏｓｔｉｃＭｏｌｅｃｌｕｌａｒＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ：ＰｒｉｎｃｉｐｌｅｓａｎｄＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ＡｍｅｒｉｃａｎＳｏｃｉｅｔｙｆｏｒＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．）。

オリゴヌクレオチドプライマーとのハイブリダイゼーション
ハイブリダイゼーション実験では、オリゴヌクレオチド（１００ヌクレオチド未満のサイズ）は、大量調製の容易性、バッチ間の結果の一致性、および化学的安定性のごとき、細菌検出用のＤＮＡ断片プローブとしてのいくつかの利点を有する。簡言すれば、ハイブリダイゼーションでは、オリゴヌクレオチドはＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用いて放射性ヌクレオチドγ^３２Ｐ（ＡＴＰ）で５’−末端標識した。ＳｅｐｈａｄｅｘＧ５０カラムを通して標識一本鎖オリゴヌクレオチドを通過させることによって取り込まれなかった放射性ヌクレオチドを除去した。別法として、オリゴヌクレオチドをビオチンで、酵素的にそれらの３’末端にて標識し、またはジゴキシゲニンで、それらの５’末端にて合成の間に直接的に取り込んだ。当業者ならば、３つの前記標識以外の標識手段が使用できることを認識するであろう。

標的ＤＮＡを変性し、固体支持体に固定し、ＤＮＡ断片プローブにつき前記したごとくにハイブリダイズさせた。プレ−ハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーションについての条件は前記した通りである。ポスト−ハイブリダイゼーション洗浄条件は以下の通りである：１％ＳＤＳを含有する３×ＳＳＣ中で２回、１％ＳＤＳを含有する２×ＳＳＣ中で２回、および１％ＳＤＳを含有する１×ＳＳＣ中で２回（これらの洗浄の全ては６５℃において１５分間）、および２５℃で１５分間の１％ＳＤＳを含有する０．１×ＳＳＣ中での最終洗浄。放射性標識で標識したプローブについては、ハイブリッドの検出は前記したオートラジオグラフィーによった。非放射性標識については、検出は比色または化学発光法によった。

オリゴヌクレオチドプローブは二本鎖ＤＮＡのいずれかの鎖に由来するものでよい。プローブは塩基Ａ、Ｇ、Ｃ、またはＴまたは類似体よりなるものでよい。プローブは任意の適当な長さでよく、ゲノムライブラリーからまたはデータバンク配列から選択された種特異的ゲノムＤＮＡ断片内の全ての場所から選択できる。

ＤＮＡ増幅
広く使用されるＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）方法によるＤＮＡ増幅については、プライマー対は、配列決定した種特異的ＤＮＡ断片から、またはデータバンク配列からのいずれかに由来するものであり、あるいは、オリゴヌクレオチドプローブの短縮バージョンである。合成に先立ち、Ｏｌｉｇｏ^ＴＭ４．０（ＮａｔｉｏｎａｌＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いるこによって潜在的なプライマー対を分析して、それらがＰＣＲ増幅用の候補であるかを確認した。

ＰＣＲによるＤＮＡ増幅の間に、各々が細菌ゲノムからの変性二本鎖標的ＤＮＡの各鎖に結合する２つのオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、ＤＮＡの変性、プライマーのアニーリングおよび各サイクルにおける新しい標的の合成を行う連続的熱サイクルによってイン・ビトロにて標的ＤＮＡを指数的に増幅させた（Ｐｅｒｓｉｎｇら、１９９３，ＤｉａｇｎｏｓｔｉｃＭｏｌｅｃｕｌａｒＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ：ＰｒｉｎｃｉｐｌｅｓａｎｄＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ＡｍｅｒｉｃａｎＳｏｃｉｅｔｙｆｏｒＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．）。簡言すると、ＰＣＲプロトコルは以下の通りである。５０ｍＭＫＣｌ、１０ｍＭトリス−ＨＣｌｐＨ８．３、２．５ｍＭＭｇＣｌ２、０．４μＭの２つのプライマーの各々、２００μＭの４のｄＮＴＰの各々、および１．２５ユニットのＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を含有する５０μＬＰＣＲ反応混合物に、臨床的検体または細菌コロニーを直接添加した。次いで、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ４８０^ＴＭサーマルサイクラーを用いて、ＰＣＲ反応を熱サイクル（９５℃で３分、続いて９５℃で１秒および５５℃で１秒の３０サイクル）に付し、続いて、標準的なエチジウムブロミド−染色アガロースゲル電気泳動によって分析した。日常的診断についてのより速くより実用的であり得る、特異的増幅産物の検出用の他の方法を使用できるのは明らかである。かかる方法は、増幅後の蛍光（例えば、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒからのＴａｑＭａｎ^ＴＭシステムまたはＢｉｏｔｒｏｎｉｃｓからのＡｍｐｌｉｓｅｎｓｏｒ^ＴＭ）または特異的増幅産物の内部配列に結合するオリゴヌクレオチドプローブとの液体ハイブリダイゼーションの検出に基づくものであってよい。これらの新規プローブは本出願人の種特異的断片プローブから作成することができる。蛍光の検出に基づく方法は、特に、非常に迅速で定量的かつ自動化できるので、日常的診断での利用に有望である。

ＰＣＲ効率を確実とするために、グリセロールまたはジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）または他の関連溶媒を用いて、ＰＣＲの感度を増加させ、高いＧＣ含量または強い二次構造を伴う標的での増幅に関連する問題を克服することができる。グリセロールおよびＤＭＳＯについての濃度範囲は、各々、５−１５％（ｖ／ｖ）および３−１０％（ｖ／ｖ）である。ＰＣＲ反応混合物については、増幅プライマーおよびＭｇＣｌ２についての濃度範囲は、各々、０．１−１．０μＭおよび１．５−３．５ｍＭである。外部およびネステッド（ｎｅｓｔｅｄ）プライマー（すなわち、ネステッド（ｎｅｓｔｅｄ）ＰＣＲ）を用いる、あるいは１を超えるプライマー対（すなわち、多重ＰＣＲ）を用いる標準的なＰＣＲプロトコルの改良型を用いることもできる（Ｐｅｒｓｉｎｇら、１９９３，ＤｉａｇｎｏｓｔｉｃＭｏｌｅｃｕｌａｒＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ：ＰｒｉｎｃｉｐｌｅｓａｎｄＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ＡｍｅｒｉｃａｎＳｏｃｉｅｔｙｆｏｒＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．）。ＰＣＲプロトコルおよびアンプリコン検出方法についてのより詳細は、実施例７および８を参照されたい。

ＤＮＡ増幅の当業者は、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、転写−ベース増幅システム（ＴＡＳ）、自己保持配列複製（３ＳＲ）、核酸配列−ベース増幅（ＮＡＳＢＡ）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）および分岐ＤＮＡ（ｂＤＮＡ）のごとき他の迅速な増幅手法の存在を知っているであろう（Ｐｅｒｓｉｎｇら，１９９３，ＤｉａｇｎｏｓｔｉｃＭｏｌｅｃｕｌａｒＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ：ＰｒｉｎｃｉｐｌｅｓａｎｄＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ＡｍｅｒｉｃａｎＳｏｃｉｅｔｙｆｏｒＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．）。本発明の範囲はＰＣＲによる増幅の使用に限定されず、むしろ、検査の迅速性および感度を増加させるのに使用できるいずれの迅速な核酸増幅方法またはいずれの他の手法の使用も含む。ＰＣＲ以外のアプローチによる核酸の増幅に適し、本明細書に含まれる種特異的断片からの、および選択された抗生物質耐性遺伝子配列から由来のオリゴヌクレオチドも本発明の範囲内にある。

オリゴヌクレオチドプローブおよびプライマーについての特異性および遍在性テスト
配列決定した種特異的断片またはデータバンク配列のいずれかに由来するオリゴヌクレオチドプローブの特異性を、前記した表５にリストした細菌種の列からのＤＮＡに対するハイブリダイゼーションによってテストした。特異的であることが判明したオリゴヌクレオチドを、ひき続いて、断片プローブにつき前記したごとく標的種の約８０の単離体からの細菌ＤＮＡに対するハイブリダイゼーションによってそれらの遍在性につきテストした。プローブが単離体の少なくとも８０％からのＤＮＡと特異的にハイブリダイズした場合にプローブを遍在性とみなした。オリゴヌクレオチドプローブについての特異性および遍在性テストの結果は表６にまとめた。増幅プライマー対の特異性および遍在性は、同一細菌株の培養体（実施例７参照）から直接テストした。特異性および遍在性テストについては、ＰＣＲアッセイは、標的種の約８０の単離体の細菌コロニーから直接行った。結果を表７にまとめた。調べた１２の細菌種の各々についてのすべての特異的および普遍的オリゴヌクレオチドプローブおよび増幅用プライマーを、各々、ＡｎｎｅｘＩおよびＩＩにリストする。配列決定したＤＮＡ断片において分岐（ｄｉｖｅｒｇｅｎｃｅ）が起こり得、これらの配列またはその一部の分岐がプローブまたは増幅用プライマーの特異性に影響しない限り、細菌ＤＮＡ変異体は本発明の範囲内にある。

普遍的細菌検出
日常的微生物検査室においては、細菌同定のために送られた臨床検体は高パーセンテージで陰性である（表４）。例えば、２年以上の期間にわたり、「ＣｅｎｔｅｒＨｏｓｐｉｔａｌｉｅｒｄｅｌ’ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｅＬａｖａｌ（ＣＨＵＬ）」の検査室が受け取った尿検体の約８０％が陰性であった（すなわち、＜１０^７ＣＦＵ／Ｌ）（表３）。特異的同定に先立って、細菌の存在につき検出し、多数の陰性検体をスクリーニングするための、普遍的プローブまたは普遍的増幅プライマーで臨床試料を検査することは、したがって、コストを節約し、患者の臨床的管理を迅速に方向づけるので有用である。従って、データバンクで入手できる細菌１６Ｓまたは２３ＳリボソームＲＮＡ遺伝子配列の高度に保存された部分から、いくつかのオリゴヌクレオチドおよび増幅プライマーを合成した（ＡｎｎｅｘＩＩＩおよびＩＶ）。ハイブリダイゼーションテストにおいて、７つのオリゴヌクレオチドのプール（ＡｎｎｅｘＩ；表６）が表５にリストしたすべての細菌種からのＤＮＡに強くハイブリダイズした。放射性ヌクレオチドまたは任意の他の改変ヌクレオチドで標識した普遍的プローブのこのプールは、したがって、尿試料中の細菌の検出で非常に有用であり、≧１０^７ＣＦＵ／Ｌの感度範囲である。また、これらのプローブは他の臨床試料における細菌検出に適用することもできる。

やはり高度に保存されたリボソームＲＮＡ遺伝子の配列に由来する増幅プライマーを、直接臨床検体から普遍的細菌を検出するための代替戦略として使用した（ＡｎｎｅｘＩＶ；表７）。検査の感度および迅速性を増大させるために、ＤＮＡ増幅戦略を開発した。この増幅は普遍的である。というのは、臨床検体で遭遇する２３の異なる細菌種からのＤＮＡを特異的に増幅したからである。

リボソームＲＮＡ遺伝子以外のよく保存された細菌遺伝子も直接的な臨床検体からの普遍的細菌検出についての良好な候補である。かかる遺伝子は細菌生存に必須の過程（例えば、蛋白質合成、ＤＮＡ合成、細胞分裂またはＤＮＡ修復）に関連し得、従って、進化の間に高度に保存されたのであろう。本出願人は、直接臨床検体から細菌を普遍的に検出するための新しい迅速な検査法を開発するためにこれらの候補遺伝子について研究をしている。

抗生物質耐性遺伝子
抗微生物耐性は治療を複雑化し、しばしば、治療の失敗に導く。さらに、抗生物質の過剰使用は不可避的に細菌耐性の出現に導く。本出願人の目標は、１時間以内に、臨床医に必要な情報を提供して、最適の治療を可能にすることにある。遍在性細菌検出用のＤＮＡ主体の検査での陰性臨床検体の迅速な同定および特異的細菌検出用のＤＮＡ主体の検査で陽性検体における特異的病原体の存在の同定に加え、臨床医は、細菌病原体が抗生物質治療に抵抗する能力についてのタイムリーな情報も必要とする。本出願人は、抗微生物剤に対する細菌耐性を迅速に評価する最も効果的な戦略は、臨床検体から最も普通で重要な抗生物質耐性遺伝子を直接検出すること（すなわち、抗生物質耐性遺伝子の検出用のＤＮＡ主体の検査）であると感じる。最も重要で普通の細菌の抗生物質耐性遺伝子からの配列はデータバンクから入手できるので、本出願人の戦略は、全遺伝子または一部からの配列を用いて、迅速なＤＮＡ主体の検査の開発用のベースとして使用される特異的オリゴヌクレオチドを設計することである。その臨床的罹患率（すなわち、高い発症率および重要性）に基づいて選択した細菌抗生物質耐性遺伝子からの配列を配列表に示す。表８は選択した抗生物質耐性遺伝子のいくつかの特徴をまとめたものである。

実施例
以下の実施例は本発明の種々の方法および化合物を説明することを意図したものである。

断片の単離およびクローニング
大腸菌株ＡＴＣＣ２５９２２、クレブシェラ・ニューモニエ株ＣＫ２、シウドモナス・アエルギノーサ株ＡＴＣＣ２７８５３、プロテウス・ミラビリス株ＡＴＣＣ３５６５７、ストレプトコッカス・ニューモニエ株ＡＴＣＣ２７３３６、スタフィロコッカス・アウレウス株ＡＴＣＣ２５９２３、スタフィロコッカス・エピデルミディス株ＡＴＣＣ１２２２８、スタフィロコッカス・サプロフィティカス株ＡＴＣＣ１５３０５、ヘモフィラス・インフルエンザ参照株Ｒｄおよびモラキセラ・カタルハリス株ＡＴＣＣ５３８７９からのゲノムＤＮＡを標準的な手法を用いて調製した。細菌ゲノムＤＮＡは前記したもの以外の株から単離してもよいことは理解されるであろう（エンテロコッカス・フェカリスおよびストレプトコッカス・ピオゲネスについては、オリゴヌクレオチド配列は専らデータバンクに由来した）。Ｓａｕ３ＡＩのごときＤＮＡをしばしば切断する制限酵素で各ＤＮＡを消化した。得られたＤＮＡ断片をプラスミドベクター（ｐＧＥＭ３Ｚｆ）に連結して、組換えプラスミドを得、コンピテントな大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞（ＤＨ５α）に形質転換した。ベクターおよび対応するコンピテント細胞は特に例示した前記のものに限定されないことは理解されるであろう。組換えプラスミドおよび形質転換細胞を得る目的は、プローブとして有用なＤＮＡ断片を容易に再生できる供給源として供することにある。従って、挿入された断片が標的細菌ＤＮＡに対して特異的で選択的である限り、いずれの組換えプラスミドおよび対応する形質転換宿主細胞も本発明の範囲内のものである。形質転換細菌細胞のプラスミド含量は標準的な方法を用いて分析した。０．２５〜５．０ｋｂｐのサイズ範囲の標的細菌からのＤＮＡ断片を、種々の制限エンドヌクレアーゼでの組換えプラスミドの消化によってベクターから切り出した。インサートをアガロースゲル電気泳動によってベクターから分離し、低融点アガロースゲル中で精製した。次いで、精製断片の各々を特異的テストのために使用した。

ＤＮＡ断片プローブの標識化
使用した標識はα^３２Ｐ（ｄＡＴＰ）であり、これは、二本鎖ＤＮＡ分子に酵素的に取り込むことができる放射性ヌクレオチドである。９５℃で５分間加熱することによって目的の断片をまず変性し、次いで、ランダムプライマーの混合物を断片の鎖にアニールさせた。これらのプライマーは、一旦アニールされると、ＤＮＡ合成のための開始点を提供する。ＤＮＡポリメラーゼ、通常はクレノウ断片を４つのヌクレオチドに沿って供し、そのうちの１つは放射性である。反応を停止させたら、新しいＤＮＡ分子の混合物を再度変性して放射性の一本鎖ＤＮＡ分子（すなわち、プローブ）を供する。前記したごとく、他の改変ヌクレオチドを用いてプローブを標識することもできる。

ＤＮＡ断片プローブについての特異性および遍在性テスト
０．２５〜５．０ｋｂｐのサイズ範囲の種特異的ＤＮＡ断片を、種々の細菌からの染色体に対するハイブリダイゼーションに基づいて１０種の通常の細菌病原体（表６）につき単離した。表５にリストした各細菌株についての全細胞ＤＮＡの試料を、ドットブロット装置を用いてナイロン膜に移し、不可逆的に固定する前に洗浄し変性した。ハイブリダイゼーション条件は前記した通りである。ＤＮＡ断片プローブは、それが単離された病原体のみにハイブリダイズした場合にのみ特異的とみなした。次いで、標的細菌種に対してのみ特異的にハイブリダイズする（すなわち、特異的である）標識ＤＮＡ断片を、前記したごとくに、目的の種の約１０〜８０単離体からのＤＮＡに対するハイブリダイゼーションによってそれらの遍在性につきテストした。プレ−ハイブリダイゼーション、ハイブリダイゼーションおよびポスト−ハイブリダイゼーションについての条件は前記した通りである。オートラグオグラフィー（または使用した非放射性標識に適した他の検出手段）の後、各個々のプローブの特異性を決定することができる。特異的であること（すなわち、それが単離された細菌種からのＤＮＡに対してのみハイブリダイズすること）および普遍的であること（すなわち、標的種のほとんどの単離体にハイブリダイズすること）が判明した各プローブをさらなる実験のために保存した。

株のテストがコロニーハイブリダイゼーションによる以外は実施例１に同じ。細菌株を、栄養寒天上に置いたナイロン膜に接種した。該膜を３７℃で２時間インキュベートし、次いで、細菌の溶解およびＤＮＡ変性を標準的な方法に従って行った。ＤＮＡハイブリダイゼーションは前記したごとくに行った。

細菌を直接臨床試料から検出した以外は実施例１に同じ。いずれの生物学的試料も直接ドットブロット装置にロードし、細胞を細菌検出のためにイン・サイチュ（ｉｎｓｉｔｕ）溶解させた。ドットブロット装置への便利なローディングを妨げる凝固を回避するために、血液試料はヘパリン処理すべきである。

ＤＮＡ断片のヌクレオチド配列決定
特異的および普遍的であることが判明した各断片の全部または一部のヌクレオチド配列（実施例１）を、ジデオキシヌクレオチド終止配列決定法（Ｓａｎｇｅｒら、１９７７，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ７４：５４６３−５４６７）を用いて決定した。これらのＤＮＡ配列を配列表に示す。オリゴヌクレオチドプローブおよび増幅用プライマーはこれらのヌクレオチド配列から選択するか、あるいは、選択したデータバンクから選択し、次いで、ホスホアミダイト化学を用いて、自動Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ合成装置（ＭｉｌｌｉｐｏｒｅＴＭ）で合成した。

オリゴヌクレオチドの標識化
前記したごとくに、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼによって、各オリゴヌクレオチドをγ３２Ｐ−ＡＴＰで５’末端標識した。標識は非放射性であってもよい。

オリゴヌクレオチドプローブについての特異的テスト
前記したごとくに、種々のグラム陽性およびグラム陰性細菌種からのＤＮＡに対するハイブリダイゼーションによって、すべての標識したオリゴヌクレオチドプローブをそれらの特異性につきテストした。種特異的プローブは、それが単離された細菌種からのＤＮＡに対してのみハイブリダイズするものであった。特異的であることが判明したオリゴヌクレオチドプローブを以下のごとくに遍在性テストに供した。

オリゴヌクレオチドプローブについての遍在性テスト
次いで、特異的オリゴヌクレオチドプローブを、標的種の約８０株につき遍在性テストで用いた。単離体からの染色体ＤＮＡをナイロン膜に移し、特異性テストにつき前記したごとくに標識オリゴヌクレオチドプローブとハイブリダイズさせた。各標的種について構築した約８０の単離体群は参照ＡＴＣＣ株ならびに種々の供給源から得られた臨床単離体を含む。普遍的プローブは、標的種の臨床的単離体群からのＤＮＡの少なくとも８０％にハイブリダイズするものであった。特異的および普遍的オリゴヌクレオチドプローブの例はＡｎｎｅｘ１にリストする。

細菌同定のために特異的オリゴヌクレオチドプローブのプールを用いて、（ｉ）感度を増加させ、１００％遍在性を確実とし、あるいは（ｉｉ）１を超える細菌種を同時に同定する。細菌同定は単離コロニーから、あるいは直接臨床検体から行うことができた。

ＰＣＲ増幅
ＰＣＲの技術を用いてテストの感度および迅速性を増加させた。使用したＰＣＲプライマーはしばしばハイブリダイゼーションアッセイにつき従前に開発したオリゴヌクレオチドの広範なセットのより短い誘導体であった（表６）。プライマーセットを、直接細菌コロニーまたは細菌懸濁液から行ったＰＣＲアッセイでテストして（実施例７参照）、それらの特異性および遍在性を測定した（表７）。特異的および普遍的ＰＣＲプライマー対の例をＡｎｎｅｘＩＩにリストする。

増幅プライマーについての特異性および遍在性テスト
すべての選択されたＰＣＲプライマーの特異性を、オリゴヌクレオチドプライマーをテストするのに使用したグラム陰性およびグラム陽性菌群に対してテストした（表５）。次いで、各種につき特異的であることが判明したプライマー対をそれらの遍在性につきテストして、プライマーの各セットが標的種の約８０の単離体群からのＤＮＡの少なくとも８０％を増幅できることを確認した。各種につき構築した単離体群は参照ＡＴＣＣ株および各種についての臨床的多様性に代表的な種々の臨床単離体を含む。

偽陽性ＰＣＲ結果を回避するための標準的注意を払うべきである。ウラシル−Ｎ−グリコシラーゼによる不活性化のごときＰＣＲ増幅産物を不活性化する方法を用いてＰＣＲ持ち込し（ｃａｒｒｙｏｖｅｒ）を制御することができる。

細菌コロニーまたは懸濁液からの直接的増幅
ＰＣＲアッセイを、細菌コロニーまたは細菌懸濁液から直接的に行ったが、後者は標準ＭｃＦａｒｌａｎｄ０．５に調整した（１．５×１０^８細菌／ｍＬに対応）。コロニーからの直接増幅の場合、プラスチックロッドを用いて、該コロニーの一部を直接５０μＬＰＣＲ反応混合物（５０ｍＭＫＣｌ、１０ｍＭトリスｐＨ８．３、２．５ｍＭＭｇＣｌ_２、各０．４μＭの２つのプライマー、各２００μＭの４つのｄＮＴＰおよび１．２５ユニットのＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を含有）に移した。細菌懸濁液については、４μＬの細胞懸濁液を４６μＬの同一ＰＣＲ反応混合物に添加した。両戦略につき、反応混合物に５０μＬの鉱油を重層し、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ４８０^ＴＭサーマルサイクラーにて、９５℃における３分間の最初の変性工程、続いての９５℃における１秒間の変性工程および５５℃における１秒間のアニーリング工程からなる３０サイクルを行った。次いで、標準的なアガロースゲル（２％）電気泳動によってＰＣＲ増幅産物を分析した。増幅産物を、２５４ｎｍの紫外線下で、２．５μｇ／ｍＬのエチジウムブロミドを含有するアガロースゲル中で可視化した。全ＰＣＲアッセイは約１時間内に完了することができる。

また、「ホットスタート（ｈｏｔｓｔａｒ）」プロトコルを用いる以外は前記と同様にして、細菌培養からの増幅を行った。その場合、標的ＤＮＡ、プライマーおよびｄＮＴＰを含有する最初の反応混合物を、ＰＣＲ反応混合物の他の成分の添加に先立って、８５℃で加熱した。すべての試薬の最終濃度は前記した通りである。引き続いて、前記したごとくにＰＣＲ反応物をサーマルサイクルおよび分析に付した。

臨床検体からの直接的増幅
尿検体からの増幅には、４μＬの非希釈または希釈（１：１０）尿を前記ＰＣＲ反応混合物４６μＬに直接添加し、前記したごとくに増幅した。

細菌細胞溶解を改良し、臨床検体のＰＣＲ阻害作用を排除するために、試料を、界面活性剤を含有する溶解緩衝液にルーチン的に希釈した。続いて、溶解物をＰＣＲ反応混合物に直接添加した。ＤＮＡ増幅に先立って、サーモサイクラーまたはマイクロ波オーブンを用いる溶解物の加熱処理を行って、細胞溶解の効率を増加させることもできた。

１つの戦略は、臨床検体のＰＣＲ阻害作用を排除し、細菌細胞を溶解させて、直接的に種々の生物学的試料からＤＮＡ増幅を行うための迅速で簡便なプロトコルを開発することである。ＰＣＲは粗製ＤＮＡ調製物に適合するという利点を有する。例えば、血液、脳脊髄液および血清を、簡単な加熱処理の後にＰＣＲアッセイで直接使用することができる。本出願人は、かかる迅速で簡便な戦略を使用して、種々の臨床検体からのＤＮＡ増幅用の迅速なプロトコルを開発することを意図する。

抗生物質耐性遺伝子の検出
頻繁に遭遇し臨床的に重要な特異的抗生物質耐性遺伝子の存在は、前章に記載したＰＣＲ増幅またはハイブリダイゼーションプロトコルを用いて同定される。ＤＮＡ主体の検査のベースとして使用される特異的オリゴヌクレオチドは抗生物質耐性遺伝子配列から選択される。これらの検査は直接的に臨床検体からまたは細菌コロニーから行うことができ、特異的細菌同定についての診断用検査を補完するべきである。

多重ＰＣＲによって（すなわち、単一ＰＣＲ反応における数個の対のプライマーを用いて）アッセイを行って、（ｉ）特異的標的病原体につき１００％の遍在性に到達するか、または（ｉｉ）細菌病原体のいくつかの種を同時に検出する以外は実施例７および８に同じ。

例えば、大腸菌の検出は、１００％の遍在性を確認するには３対のＰＣＲプライマーを要する。従って、それらのプライマー対での（「ホット−スタート」プロトコル（実施例７）を用いる）多重ＰＣＲアッセイを開発した。また、この戦略を、１００％の遍在性に到達するのに要する１を超えるプライマー対についての他の細菌病原体で用いた。

また、多重ＰＣＲアッセイを用いて、（ｉ）いくつかの細菌種を同時に測定し、あるいは、（ｉｉ）直接に臨床検体からまたは細菌コロニーから、細菌病原体を同時に同定し、特異的抗生物質耐性遺伝子を検出した。

これらの適用については、アンプリコン検出方法を適用して、生じた種々のアンプリコンを区別すべきである。標準的なアガロースゲル電気泳動はそれらのサイズに基づいてアンプリコンを区別するので、それを用いることができた。この目的でもう１つの有用な戦略は、各々が、増幅の間に分解して発蛍光団を放出する蛍光クエンチャーに結合した特異的オリゴヌクレオチドとカップリングする、異なる波長で放射する種々の発蛍光団（例えば、ＴａｑＭａｎ^ＴＭ、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を用いる検出である。

増幅産物の検出
当業者ならば、標準的なアガロースゲル電気泳動（実施例７）以外の別法を増幅産物の解明に使用できることを認識するであろう。かかる方法は、増幅後の蛍光（例えば、Ａｍｐｌｉｓｅｎｓｏｒ^ＴＭ，Ｂｉｏｔｒｏｎｉｃｓ；ＴａｑＭａｎ^ＴＭ）またはビオチンのごとき他の標識（ＳＨＡＲＰＳｉｇｎａｌ^ＴＭ，ＤｉｇｅｎｅＤｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）の検出に基づくものであり得る。これらの方法は定量的であって、容易に自動化される。種特異的断片プローブに由来するアンプリコンに特異的な増幅プライマーまたは内部オリゴヌクレオチドプローブの１つを発蛍光団または任意の他の標識とカップリングさせる。蛍光の検出に基づく方法は、迅速で、異なる波長を放射する発蛍光団をフレキシブルに利用できる（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）ので、診断用検査に特に適する。

種特異的、普遍的および抗生物質耐性遺伝子増幅用プライマーを、検査の感度を増加させるために、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、転写ベース増幅システム（ＴＡＳ）、自己保持配列複製（３ＳＲ）、核酸配列ベース増幅（ＮＡＳＢＡ）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）および分岐ＤＮＡ（ｂＤＮＡ）またはいずれかの他の方法のごとき他の迅速な増幅手法で用いることができる。増幅は、単離した細菌コロニーからまたは直接に臨床検体から行うことができる。従って、本発明の方法は、ＰＣＲの使用に限定されず、むしろ検査の迅速性および感度を増加させるのに使用できる、細菌ＤＮＡを特異的に同定するための任意の手法を含む。

検査キットは、各細菌に特異的なプローブのセットならびに普遍的プローブのセットを含有する。該キットは、非放射性標識で標識した普遍的プローブのセットならびに特異的臨床試料中の目的の各細菌の検出用の標識特異的プローデよりなる、検査成分の形態で提供される。該キットは、プレ−ハイブリダイゼーション、ハイブリダイゼーション、洗浄工程およびハイブリッド検出を行うのに必要な検査試薬も含む。最終的に、公知の抗生物質耐性遺伝子（またはそれからの誘導体）の検出用の検査成分が含まれる。勿論、該キットは、各ハイブリダイゼーション検査用の陰性および陽性対照として使用される標準的試料を含むであろう。

キットに含めるべき成分は各検体の種類に適合させ、その種類の検体で通常遭遇する病原体を検出する。また、細菌の普遍的検出用の試薬も含まれるであろう。感染の部位に基づき、病原体の特異的検出のための以下のキットを開発できる：
細菌ゲノムの高度に保存された領域に特異的なプローブのセットを含有する、ほとんどの臨床検体からの細菌病原体の普遍的検出用のキット、
８つの特異的検査成分（大腸菌、エンテロコッカス・フェカリス、クレブシェラ・ニューモニエ、プロテウス・ミラビリス、シュードモナス・アエルギノーサ、スタフィロコッカス・サプロフィティカス、スタフィロコッカス・アウレウスおよびスタフィロコッカス・エピデルミディスの検出用のプローブセット）を含有する、尿試料からの細菌病原体の検出用のキット、
７つの特異的検査成分（ストレプトコッカス・ニューモニエ、モラキセラ・カトルハリス、ヘモフィラス・インフルエンザ、クレブシェラ・ニューモニエ、シュードモナス・アエルギノーサ、ストレプトコッカス・ピオゲネスおよびスタフィロコッカス・アウレウスを検出するためのプローブセット）を含有する呼吸器系病原体の検出用のキット、
１１個の特異的検査成分（ストレプトコッカス・ニューモニエ、モラキセラ・カトルハリス、ヘモフィラス・インフルエンザ、プロテウス・ミラビリス、クレブシェラ・ニューモニエ、シュードモナス・アエルギノーサ、大腸菌、エンテロコッカス・フェカリス、スタフィロコッカス・アウレウス、ストレプトコッカス・ピオゲネスおよびスタフィロコッカス・エピデルミディスの検出用のプローブセット）を含有する、血液試料からの病原体の検出用のキット、
４つの特異的検査成分（ヘモフィラス・インフルエンザ、ストレプトコッカス・ニューモニエ、大腸菌およびシュードモナス・アエルギノーサの検出用のプローブセット）を含有する、髄膜炎を引き起こす病原体の検出用のキット、
細菌耐性に関連する１９個の以下の遺伝子：ｂｌａ_ｔｅｍ、ｂｌａ_ｒｏｂ、ｂｌ_ａｓｈｖ、ａａｄＢ、ａａｃＣ１、ａａｃＣ２、ａａｃＣ３、ａａｃＡ４、ｍｅｃＡ、ｖａｎＡ、ｖａｎＨ、ｖａｎＸ、ｓａｔＡ、ａａｃＡ−ａｐｈＤ、ｖａｔ、ｖｇａ、ｍｓｒＡ、ｓｕｌおよびｉｎｔの少なくとも１つの特異的検出のためのプローブセットを含有する臨床的に重要な抗生物質耐性遺伝子の検出用のキット、
皮膚、腹部負傷からの病原体の検出に適した他のキットまたはいずれかの他の臨床的に重要なキット、
が開発される。

検査キットがＤＮＡ増幅アッセイを行うための全ての試薬および対照を含有する以外は実施例１３に同じ。診断用キットは、直接的に臨床検体または細菌コロニーから行うＰＣＲ（または他の増幅方法）による増幅に適する。普遍的細菌検出、細菌同定および抗生物質耐性遺伝子検出に必要な成分が含まれる。

試験管中、または多数のウェルを有するミクロ滴定プレート中にて、増幅アッセイを行うことができた。プレートにおけるアッセイでは、ウェルは、特異的増幅プライマーおよび対照ＤＮＡで被覆され、増幅産物の検出は自動化されるであろう。普遍的細菌検出のための試薬および増幅用プライマーは、直接的に臨床検体から行う検査用キットに含まれる。細菌同定および抗生物質耐性遺伝子検出に要する成分は、直接的にコロニーから検査するためのキット、ならびに直接的に臨床検体から検査するためのキットに含まれる。

該キットは、ハイブリダイゼーション−ベース診断キットのための実施例１３に記載した各種の検体での使用に適するであろう。

細菌の検出および同定用の本発明で記載したプローブおよび増幅用プライマーの使用は、臨床的微生物への適用に限定されない。事実、本出願人は、他の分野もこれらの新しい技術から恩恵を受け得ると感じている。例えば、これらの検査は、食品、水、医薬品、その他微生物抑制を必要とする他の製品の品質管理のための産業において使用できるであろ。また、これらの検査法を使用して、ヒト以外の生物（例えば、他の霊長類、哺乳動物、農場動物および家畜）からの生物学的試料中の細菌を検出し同定し得る。また、これらの診断手段は、臨床試験および疫学的研究を含めた研究目的でも非常に有用であろう。

Claims

大腸菌、クレブシエラ・ニューモニエ、シュードモナス・アエルギノーサ、プロテウス・ミラビリス、ストレプトコッカス・ニューモニエ、スタフィロコッカス・アウレウス、スタフィロコッカス・エピデルミディス、エンテロコッカス・フェカリス、スタフィロコッカス・サプロフィチカス、ストレプトコッカス・ピオゲネス、ヘモフィラス・インフルエンザおよびモラキセラ・カタルハリスからなる群より選択される細菌種からの核酸の存在および／または量を、該細菌性核酸を含有すると思われる任意の試料において、特異的、普遍的および感受性であるプローブ（断片および／またはオリゴヌクレオチド）および／または増幅プライマーを用いて測定する方法であって、該細菌性核酸またはそれらの変異体またはそれらの一部が該プローブもしくはプライマーとハイブリダイズし得る選択された標的領域を含み、該方法が、該試料を該プローブもしくはプライマーと接触させる工程、およびハイブリダイズしたプローブおよび／または増幅産物の存在および／または量を該細菌種の存在および／または量の指標として検出する工程を包含する方法。
任意の細菌からの核酸の存在および／または量を該細菌性核酸を含有すると思われる任意の試料から測定するために普遍的かつ感受性であるプローブ（断片および／またはオリゴヌクレオチド）および／または増幅用プライマーをさらに用いる方法であって、ここに該細菌性核酸またはそれらの変異体またはそれらの一部が該プローブもしくはプライマーとハイブリダイズし得る選択された標的領域を含み、該方法が、該試料を該プローブもしくはプライマーと接触させる工程、およびハイブリダイズしたプローブおよび／または増幅産物の存在および／または量を該任意の細菌の存在および／または量の指標として検出する工程を包含する請求項１記載の方法。
ｂｌａ_ｔｅｍ、Ｂｌａ_ｒｏｂ、Ｂｌａ_ｓｈｖ、ａａｄＢ、ａａｃＣ１、ａａｃＣ２、ａａｃＣ３、ａａｃＡ４、ｍｅｃＡ、ｖａｎＡ、ｖａｎＨ、ｖａｎＸ、ｓａｔＡ、ａａｃＡ−ａｐｈＤ、ｖａｔ、ｖｇａ、ｍｓｒＡ、ｓｕｌおよびｉｎｔからなる群より選択される抗生物質耐性遺伝子からの核酸の存在および／または量を該細菌性核酸を含有することが疑われる任意の試料から測定するために特異的、普遍的および感受性であるプローブ（断片および／またはオリゴヌクレオチド）および／または増幅用プライマーをさらに用いる方法であって、ここに該細菌性核酸またはそれらの変異体またはそれらの一部が該プローブもしくはプライマーとハイブリダイズし得る選択された標的領域を含み、該方法が、該試料を該プローブもしくはプライマーと接触させる工程、およびハイブリダイズしたプローブおよび／または増幅産物の存在および／または量を該抗生物質耐性遺伝子の存在および／または量の指標として検出する工程を包含する請求項１記載の方法。
ヒト患者、動物、環境または食品から得られる試料に対して直接行われる、請求項１、２および３のいずれか１項に記載の方法。
１以上の細菌性コロニーからなる試料に対して直接行われる、請求項１、２および３のいずれか１項記載の方法。
前記細菌性核酸が、
ａ）ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、
ｂ）リガーゼ連鎖反応、
ｃ）核酸配列ベース増幅、
ｄ）自己保持配列複製、
ｅ）鎖置換増幅、
ｆ）分岐ＤＮＡシグナル増幅、
ｇ）ネステッドＰＣＲ、および
ｈ）多重ＰＣＲ
からなる群より選択される方法により増幅される、請求項１ないし５のいずれか１項に記載の方法。
前記細菌性核酸をＰＣＲで増幅する、請求項６記載の方法。
各増幅サイクルに対して、いかなる伸長工程もなくして、５５℃でのわずか１秒間のアニーリング工程および９５℃でのわずか１秒間の変性工程を行うことにより前記細菌性核酸の存在を１時間以内に決定するようにＰＣＲプロトコルを変更する、請求項７記載の方法。
試験試料または細菌コロニーから直接大腸菌を検出、同定および／または定量する方法であって、
ａ）該試料または該試料から単離された細菌の実質的に均質な集団の細菌性ＤＮＡを不活性支持体に沈着させて固定し、または溶液中に遊離させる工程、あるいは、
該試料または該試料から単離された細菌の実質的に均質な集団を不活性支持体に接種し、該接種された試料または単離された細菌をイン・サイトゥ溶解して細菌性ＤＮＡを放出させる工程であって、ここに該細菌性ＤＮＡが実質的に一本鎖の形態にある工程、
ｂ）該一本鎖ＤＮＡをプローブと接触させる工程であって、ここに該プローブが、ヌクレオチド配列が配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、それらに相補的な配列、それらの一部およびそれらの変異体からなる群より選択され、かつ該プローブの核酸が該細菌性ＤＮＡと選択的にハイブリダイズでき、それによりハイブリダイゼーション複合体が形成されるような条件下で、大腸菌の株またはその代表株と特異的かつ普遍的にアニールする少なくとも１つの一本鎖核酸を含み、該複合体は標識手段によって検出され、該標識は該プローブ上に存在するか、もしくは該標識は該標識手段の第１の反応性構成要素上に存在し、該第１の反応性構成要素は該プローブ上に存在する第２の反応性構成要素と反応する工程、および
ｃ）該不活性支持体上または該溶液中の該標識の存在または強度を該検査試料における大腸菌の存在および／または量の指標として検出する工程、
を包含する方法。
前記プローブが、
１）その配列が配列番号３またはその相補的配列に含まれる、１２−２２７ヌクレオチド長を有するオリゴヌクレオチド、
２）その配列が配列番号４またはその相補的配列に含まれる、１２−２７８ヌクレオチド長を有するオリゴヌクレオチド、
３）その配列が配列番号５またはその相補的配列に含まれる、１２−１５９６ヌクレオチド長を有するオリゴヌクレオチド、
４）その配列が配列番号６またはその相補的配列に含まれる、１２−２７０３ヌクレオチド長を有するオリゴヌクレオチド、
５）その配列が配列番号７またはその相補的配列に含まれる、１２−１３９１ヌクレオチド長を有するオリゴヌクレオチド、および
大腸菌の株およびその代表株と特異的かつ普遍的にアニールするそれらの変異体、
からなる群から選択される請求項９記載の方法。
大腸菌由来の核酸配列を検出するためのプローブが、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４およびそれらに相補的な配列からなる群から選択される請求項１０記載の方法。
検査試料中の大腸菌の存在および／または量を検出する方法であって、
ａ）該試料を、長さが少なくとも１２ヌクレオチドである少なくとも１対のオリゴヌクレオチドプライマーを含有する水溶液で処理する工程であって、該プライマの一方は標的配列を含む大腸菌ＤＮＡの２つの相補鎖の一方と選択的にハイブリダイズでき、該プライマーの他方は該鎖の他方とハイブリダイズでき、これによって鋳型として標的配列を含有する伸長産物を形成することが可能であり、該プライマーの少なくとも１対は配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６および配列番号７のうちの１つの配列内から選択される工程、
ｂ）標的配列を含有する該プライマーの各々の伸長産物を合成し、もしあれば、該標的配列を検出可能なレベルまで増幅する工程、および
ｃ）該増幅された標的配列の存在および／または量を該検査試料における大腸菌の存在および／または量の指標として検出する工程、
を包含する方法。
該プライマーの少なくとも１対が
ａ）配列番号４２および配列番号４３、
ｂ）配列番号４６および配列番号４７、
ｃ）配列番号５５および配列番号５６、並びに
ｄ）配列番号１３１および配列番号１３２、
からなる群から選択される請求項１２記載の方法。
検査試料または細菌コロニーから直接クレブシエラ・ニューモニエを検出、同定および／または定量する方法であって、
ａ）該試料または該試料から単離された細菌の実質的に均質な集団の細菌性ＤＮＡを不活性支持体に沈着させて固定し、または溶液中に遊離させる工程、あるいは、
該試料または該試料から単離された細菌の実質的に均質な集団を不活性支持体に接種し、該接種された試料または単離された細菌をイン・サイトゥ溶解して細菌性ＤＮＡを放出させる工程であって、ここに該細菌性ＤＮＡが実質的に一本鎖の形態にある工程、
ｂ）該一本鎖ＤＮＡをプローブと接触させる工程であって、該プローブが、そのヌクレオチド配列が配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、それらに相補的な配列、それらの一部およびそれらの変異体からなる群より選択され、かつ該プローブの核酸が該細菌性ＤＮＡと選択的にハイブリダイズでき、それによりハイブリダイゼーション複合体が形成されるような条件下で、クレブシエラ・ニューモニエの株またはその代表株と特異的かつ遍在的にアニールする少なくとも１つの一本鎖核酸を含み、該複合体は標識手段によって検出され、該標識は該プローブ上に存在するか、もしくは該標識は該標識手段の第１の反応性構成要素上に存在し、該第１の反応性構成要素は該プローブ上に存在する第２の反応性構成要素と反応する工程、および
ｃ）該不活性支持体上または該溶液中の該標識の存在または強度を該検査試料におけるクレブシエラ・ニューモニエの存在および／または量の指標として検出する工程、
を包含する方法。
前記プローブが、
１）その配列が配列番号８またはその相補的配列に含まれる、１２−２３８ヌクレオチド長を有するオリゴヌクレオチド、
２）その配列が配列番号９またはその相補的配列に含まれる、１２−３８５ヌクレオチド長を有するオリゴヌクレオチド、
３）その配列が配列番号１０またはその相補的配列に含まれる、１２−４６２ヌクレオチド長を有するオリゴヌクレオチド、
４）その配列が配列番号１１またはその相補的配列に含まれる、１２−７３０ヌクレオチド長を有するオリゴヌクレオチド、および
クレブシエラ・ニューモニエの株およびその代表株と特異的かつ遍在的にアニールするそれらの変異体、
からなる群から選択される請求項１４記載の方法。
クレブシエラ・ニューモニエからの核酸配列を検出するためのプローブが、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６９およびそれらに相補的な配列からなる群から選択される請求項１５記載の方法。
検査試料中のクレブシエラ・ニューモニエの存在および／または量を検出する方法であって、
ａ）該試料を、長さが少なくとも１２ヌクレオチドである少なくとも１対のオリゴヌクレオチドプライマーを含有する水溶液で処理する工程であって、該プライマの一方は標的配列を含むクレブシエラ・ニューモニエＤＮＡの２つの相補鎖の一方と選択的にハイブリダイズでき、該プライマーの他方は該鎖の他方とハイブリダイズでき、それによって鋳型として標的配列を含有する伸長産物を形成することが可能であり、該プライマーの少なくとも１対は配列番号８、配列番号９、配列番号１０および配列番号１１のうちの１つの配列内から選択される工程、
ｂ）標的配列を含有する該プライマーの各々の伸長産物を合成し、もしあれば、該標的配列を検出可能なレベルまで増幅する工程、および
ｃ）該増幅された標的配列の存在および／または量を該検査試料におけるクレブシエラ・ニューモニエの存在および／または量の指標として検出する工程、
を包含する方法。
該プライマーの少なくとも１対が、
ａ）配列番号６１および配列番号６２、
ｂ）配列番号６７および配列番号６８、
ｃ）配列番号１３５および配列番号１３６、並びに
ｄ）配列番号１３７および配列番号１３８、
からなる群から選択される請求項１７記載の方法。
検査試料または細菌コロニーから直接プロテウス・ミラビリスを検出、同定および／または定量する方法であって、
ａ）該試料または該試料から単離された細菌の実質的に均質な集団の細菌性ＤＮＡを不活性支持体に沈着させて固定し、または溶液中に遊離させる工程、あるいは、
該試料または該試料から単離された細菌の実質的に均質な集団を不活性支持体に接種し、該接種された試料または単離された細菌をイン・サイトゥ溶解して細菌性ＤＮＡを放出させる工程であって、ここに該細菌性ＤＮＡが実質的に一本鎖の形態にある工程、
ｂ）該一本鎖ＤＮＡをプローブと接触させる工程であって、該プローブが、そのヌクレオチド配列が配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、それらに相補的な配列、それらの一部およびそれらの変異体からなる群より選択され、かつ該プローブの核酸が該細菌性ＤＮＡと選択的にハイブリダイズでき、それによりハイブリダイゼーション複合体が形成されるような条件下で、プロテウス・ミラビリスの株またはその代表株と特異的かつ遍在的にアニールする少なくとも１つの一本鎖核酸を含み、該複合体は標識手段によって検出され、該標識は該プローブ上に存在するか、もしくは該標識は該標識手段の第１の反応性構成要素上に存在し、該第１の反応性構成要素は該プローブ上に存在する第２の反応性構成要素と反応する工程、および
ｃ）該不活性支持体上または該溶液中の該標識の存在または強度を該検査試料におけるプロテウス・ミラビリスの存在および／または量の指標として検出する工程、
を包含する方法。
前記プローブが、
１）その配列が配列番号１２またはその相補的配列に含まれる、１２−２２５ヌクレオチド長を有するオリゴヌクレオチド、
２）その配列が配列番号１３またはその相補的配列に含まれる、１２−４０２ヌクレオチド長を有するオリゴヌクレオチド、
３）その配列が配列番号１４またはその相補的配列に含まれる、１２−１５７ヌクレオチド長を有するオリゴヌクレオチド、
４）その配列が配列番号１５またはその相補的配列に含まれる、１２−１３４８ヌクレオチド長を有するオリゴヌクレオチド、および
プロテウス・ミラビリスの株およびその代表株と特異的かつ遍在的にアニールするそれらの変異体、
からなる群から選択される請求項１９記載の方法。
プロテウス・ミラビリスからの核酸配列を検出するためのプローブが、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３、配列番号７６、配列番号７７、配列番号８０、配列番号８１、配列番号８２およびそれらに相補的な配列からなる群から選択される請求項２０記載の方法。
検査試料中のプロテウス・ミラビリスの存在および／または量を検出する方法であって、
ａ）該試料を、長さが少なくとも１２ヌクレオチドである少なくとも１対のオリゴヌクレオチドプライマーを含有する水溶液で処理する工程であって、該プライマの一方は標的配列を含むプロテウス・ミラビリスＤＮＡの２つの相補鎖の一方と選択的にハイブリダイズでき、該プライマーの他方は該鎖の他方とハイブリダイズでき、それによって鋳型として標的配列を含有する伸長産物を形成することが可能であり、該プライマーの少なくとも１対は配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４および配列番号１５のうちの１つの配列内から選択される工程、
ｂ）標的配列を含有する該プライマーの各々の伸長産物を合成し、もしあれば、該標的配列を検出可能なレベルまで増幅する工程、および
ｃ）該増幅された標的配列の存在および／または量を該試験試料におけるプロテウス・ミラビリスの存在および／または量の指標として検出する工程、
を包含する方法。
該プライマーの少なくとも１対が
ａ）配列番号７４および配列番号７５、並びに
ｂ）配列番号１３３および配列番号１３４、
からなる群から選択される請求項２２記載の方法。
検査試料または細菌コロニーから直接スタフィロコッカス・サプロフィチカスを検出、同定および／または定量する方法であって、
ａ）該試料または該試料から単離された細菌の実質的に均質な集団の細菌性ＤＮＡを不活性支持体に沈着させて固定し、または溶液中に遊離させる工程、あるいは、
該試料または該試料から単離された細菌の実質的に均質な集団を不活性支持体に接種し、該接種された試料または単離された細菌をイン・サイトゥ溶解して細菌性ＤＮＡを放出させる工程であって、ここに該細菌性ＤＮＡが実質的に一本鎖の形態にある工程、
ｂ）該一本鎖ＤＮＡをプローブと接触させる工程であって、該プローブが、そのヌクレオチド配列が配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、それらに相補的な配列、それらの一部およびそれらの変異体からなる群より選択され、かつ該プローブの核酸が該細菌性ＤＮＡと選択的にハイブリダイズでき、それによりハイブリダイゼーション複合体が形成されるような条件下で、スタフィロコッカス・サプロフィチカスの株またはその代表株と特異的かつ遍在的にアニールする少なくとも１つの一本鎖核酸を含み、該複合体は標識手段によって検出され、該標識は該プローブ上に存在するか、もしくは該標識は該標識手段の第１の反応性構成要素上に存在し、該第１の反応性構成要素は該プローブ上に存在する第２の反応性構成要素と反応する工程、および
ｃ）該不活性支持体上または該溶液中の該標識の存在または強度を該検査試料におけるスタフィロコッカス・サプロフィチカスの存在および／または量の指標として検出する工程、
を包含する方法。
前記プローブが、
１）その配列が配列番号２１またはその相補的配列に含まれる、１２−１７２ヌクレオチド長を有するオリゴヌクレオチド、
２）その配列が配列番号２２またはその相補的配列に含まれる、１２−１５５ヌクレオチド長を有するオリゴヌクレオチド、
３）その配列が配列番号２３またはその相補的配列に含まれる、１２−１４５ヌクレオチド長を有するオリゴヌクレオチド、
４）その配列が配列番号２４またはその相補的配列に含まれる、１２−２６５ヌクレオチド長を有するオリゴヌクレオチド、および
スタフィロコッカス・サプロフィチカスの株およびその代表株と特異的かつ遍在的にアニールするそれらの変異体、
からなる群から選択される請求項２４記載の方法。
スタフィロコッカス・サプロフィチカスからの核酸配列を検出するためのプローブが、配列番号９６、配列番号９７、配列番号１００、配列番号１０１、配列番号１０２、配列番号１０３、配列番号１０４およびそれらに相補的な配列からなる群から選択される請求項２５記載の方法。
検査試料中のスタフィロコッカス・サプロフィチカスの存在および／または量を検出する方法であって、
ａ）該試料を、長さが少なくとも１２ヌクレオチドである少なくとも１対のオリゴヌクレオチドプライマーを含有する水溶液で処理する工程であって、該プライマの一方は標的配列を含むスタフィロコッカス・サプロフィチカスＤＮＡの２つの相補鎖の一方と選択的にハイブリダイズでき、該プライマーの他方は該鎖の他方とハイブリダイズでき、これによって鋳型として標的配列を含有する伸長産物を形成することが可能であり、該プライマーの少なくとも１対は配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３および配列番号２４のうちの１つの配列内から選択される工程、
ｂ）標的配列を含有する該プライマーの各々の伸長産物を合成し、もしあれば、該標的配列を検出可能なレベルまで増幅する工程、および
ｃ）該増幅された標的配列の存在および／または量を該検査試料におけるスタフィロコッカス・サプロフィチカスの存在および／または量の指標として検出する工程、
を包含する方法。
該プライマーの少なくとも１対が
ａ）配列番号９８および配列番号９９、並びに
ｂ）配列番号１３９および配列番号１４０、
からなる群から選択される請求項２７記載の方法。
試験試料または細菌コロニーから直接モラキセラ・カタルハリスを検出、同定および／または定量する方法であって、
ａ）該試料または該試料から単離された細菌の実質的に均質な集団の細菌性ＤＮＡを不活性支持体に沈着させて固定し、または溶液中に遊離させる工程、あるいは、
該試料または該試料から単離された細菌の実質的に均質な集団を不活性支持体に接種し、該接種された試料または単離された細菌をイン・サイトゥ溶解して細菌性ＤＮＡを放出させる工程であって、ここに該細菌性ＤＮＡが実質的に一本鎖の形態にある工程、
ｂ）該一本鎖ＤＮＡをプローブと接触させる工程であって、該プローブが、そのヌクレオチド配列が配列番号２８、配列番号２９、それらに相補的な配列、それらの一部およびそれらの変異体からなる群より選択され、かつ該プローブの核酸が該細菌性ＤＮＡと選択的にハイブリダイズでき、それによりハイブリダイゼーション複合体が形成されるような条件下で、モラキセラ・カタルハリスの株またはその代表株と特異的かつ遍在的にアニールする少なくとも１つの一本鎖核酸を含み、該複合体は標識手段によって検出され、該標識は該プローブ上に存在するか、もしくは該標識は該標識手段の第１の反応性構成要素上に存在し、該第１の反応性構成要素は該プローブ上に存在する第２の反応性構成要素と反応する工程、および
ｃ）該不活性支持体上または該溶液中の該標識の存在または強度を該検査試料におけるモラキセラ・カタルハリスの存在および／または量の指標として検出する工程、
を包含する方法。
前記プローブが、
１）その配列が配列番号２８またはその相補的配列に含まれる、１２−５２６ヌクレオチド長を有するオリゴヌクレオチド、
２）その配列が配列番号２９またはその相補的配列に含まれる、１２−４６６ヌクレオチド長を有するオリゴヌクレオチド、および
モラキセラ・カタルハリスの株およびその代表株と特異的かつ遍在的にアニールするそれらの変異体、
からなる群から選択される請求項２９記載の方法。
モラキセラ・カタルハリスからの核酸配列を検出するためのプローブが、配列番号１０８、配列番号１０９、配列番号１１０、配列番号１１１、配列番号１１４、配列番号１１５、配列番号１１６、配列番号１１７およびそれらに相補的な配列からなる群から選択される請求項３０記載の方法。
検査試料中のモラキセラ・カタルハリスの存在および／または量を検出する方法であって、
ａ）該試料を、長さが少なくとも１２ヌクレオチドである少なくとも１対のオリゴヌクレオチドプライマーを含有する水溶液で処理する工程であって、該プライマの一方は標的配列を含むモラキセラ・カタルハリスＤＮＡの２つの相補鎖の一方と選択的にハイブリダイズでき、該プライマーの他方は該鎖の他方とハイブリダイズでき、これによって鋳型として標的配列を含有する伸長産物を形成することが可能であり、該プライマーの少なくとも１対は配列番号２８および配列番号２９のうちの１つの配列内から選択される工程、
ｂ）標的配列を含有する該プライマーの各々の伸長産物を合成し、もしあれば、該標的配列を検出可能なレベルまで増幅する工程、および
ｃ）該増幅された標的配列の存在および／または量を該検査試料におけるモラキセラ・カタルハリスの存在および／または量の指標として検出する工程、
を包含する方法。
該プライマーの少なくとも１対が
ａ）配列番号１１２および配列番号１１３、
ｂ）配列番号１１８および配列番号１１９、並びに
ｃ）配列番号１６０および配列番号１１９、
からなる群から選択される請求項３２記載の方法。
検査試料または細菌コロニーから直接シュードモナス・アエルギノーサを検出、同定および／または定量する方法であって、
ａ）該試料または該試料から単離された細菌の実質的に均質な集団の細菌性ＤＮＡを不活性支持体に沈着させて固定し、または溶液中に遊離させる工程、あるいは、
該試料または該試料から単離された細菌の実質的に均質な集団を不活性支持体に接種し、該接種された試料または単離された細菌をイン・サイトゥ溶解して細菌性ＤＮＡを放出させる工程であって、ここに該細菌性ＤＮＡが実質的に一本鎖の形態にある工程、
ｂ）該一本鎖ＤＮＡをプローブと接触させる工程であって、該プローブが、そのヌクレオチド配列が配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、それらに相補的な配列、それらの一部およびそれらの変異体からなる群より選択され、かつ該プローブの核酸が該細菌性ＤＮＡと選択的にハイブリダイズでき、それによりハイブリダイゼーション複合体が形成されるような条件下で、シュードモナス・アエルギノーサの株またはその代表株と特異的かつ遍在的にアニールする少なくとも１つの一本鎖核酸を含み、該複合体は標識手段によって検出され、該標識は該プローブ上に存在するか、もしくは該標識は該標識手段の第１の反応性構成要素上に存在し、該第１の反応性構成要素は該プローブ上に存在する第２の反応性構成要素と反応する工程、および
ｃ）該不活性支持体上または該溶液中の該標識の存在または強度を該検査試料におけるシュードモナス・アエルギノーサの存在および／または量の指標として検出する工程、
を包含する方法。
前記プローブが、
１）その配列が配列番号１６またはその相補的配列に含まれる、１２−２１６７ヌクレオチド長を有するオリゴヌクレオチド、
２）その配列が配列番号１７またはその相補的配列に含まれる、１２−１８７２ヌクレオチド長を有するオリゴヌクレオチド、
３）その配列が配列番号１８またはその相補的配列に含まれる、１２−３４５１ヌクレオチド長を有するオリゴヌクレオチド、
４）その配列が配列番号１９またはその相補的配列に含まれる、１２−７４４ヌクレオチド長を有するオリゴヌクレオチド、
５）その配列が配列番号２０またはその相補的配列に含まれる、１２−２７６０ヌクレオチド長を有するオリゴヌクレオチド、および
シュードモナス・アエルギノーサの株およびその代表株と特異的かつ遍在的にアニールするそれらの変異体、
からなる群から選択される請求項３４記載の方法。
シュードモナス・アエルギノーサからの核酸配列を検出するためのプローブが、配列番号８７、配列番号８８、配列番号８９、配列番号９０、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９５およびそれらに相補的な配列からなる群から選択される請求項３５記載の方法。
検査試料中のシュードモナス・アエルギノーサの存在および／または量を検出する方法であって、
ａ）該試料を、長さが少なくとも１２ヌクレオチドである少なくとも１対のオリゴヌクレオチドプライマーを含有する水溶液で処理する工程であって、該プライマの一方は標的配列を含むシュードモナス・アエルギノーサＤＮＡの２つの相補鎖の一方と選択的にハイブリダイズでき、該プライマーの他方は該鎖の他方とハイブリダイズでき、これによって鋳型として標的配列を含有する伸長産物を形成することが可能であり、該プライマーの少なくとも１対は配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９および配列番号２０のうちの１つの配列内から選択される工程、
ｂ）標的配列を含有する該プライマーの各々の伸長産物を合成し、もしあれば、該標的配列を検出可能なレベルまで増幅する工程、および
ｃ）該増幅された標的配列の存在および／または量を該検査試料におけるシュードモナス・アエルギノーサの存在および／または量の指標として検出する工程、
を包含する方法。
該プライマーの少なくとも１対が
ａ）配列番号８３および配列番号８４、並びに
ｂ）配列番号８５および配列番号８６、
からなる群から選択される請求項３７記載の方法。
検査試料または細菌コロニーから直接スタフィロコッカス・エピデルミディスを検出、同定および／または定量する方法であって、
ａ）該試料または該試料から単離された細菌の実質的に均質な集団の細菌性ＤＮＡを不活性支持体に沈着させて固定し、または溶液中に遊離させる工程、あるいは、
該試料または該試料から単離された細菌の実質的に均質な集団を不活性支持体に接種し、該接種された試料または単離された細菌をイン・サイトゥ溶解して細菌性ＤＮＡを放出させる工程であって、ここに該細菌性ＤＮＡが実質的に一本鎖の形態にある工程、
ｂ）該一本鎖ＤＮＡをプローブと接触させる工程であって、該プローブが、そのヌクレオチド配列が配列番号３６、それに相補的な配列、その一部およびその変異体からなる群より選択され、かつ該プローブの核酸が該細菌性ＤＮＡと選択的にハイブリダイズでき、それによりハイブリダイゼーション複合体が形成されるような条件下で、スタフィロコッカス・エピデルミディスの株またはその代表株と特異的かつ遍在的にアニールする少なくとも１つの一本鎖核酸を含み、該複合体は標識手段によって検出され、該標識は該プローブ上に存在するか、もしくは該標識は該標識手段の第１の反応性構成要素上に存在し、該第１の反応性構成要素は該プローブ上に存在する第２の反応性構成要素と反応する工程、および
ｃ）該不活性支持体上または該溶液中の該標識の存在または強度を該検査試料におけるスタフィロコッカス・エピデルミディスの存在および／または量の指標として検出する工程、
を包含する方法。
前記プローブが、その配列が配列番号３６に含まれる１２−７０５ヌクレオチド長を有するオリゴヌクレオチド、並びにスタフィロコッカスの株およびその代表株と特異的かつ遍在的にアニールするそれらの変異体からなる群から選択される請求項３９記載の方法。
検査試料中のスタフィロコッカス・エピデルミディスの存在および／または量を検出する方法であって、
ａ）該試料を、長さが少なくとも１２ヌクレオチドである少なくとも１対のオリゴヌクレオチドプライマーを含有する水溶液で処理する工程であって、該プライマの一方は標的配列を含むスタフィロコッカス・エピデルミディスＤＮＡの２つの相補的鎖の一方と選択的にハイブリダイズでき、該プライマーの他方は該鎖の他方とハイブリダイズでき、これによって鋳型として標的配列を含有する伸長産物を形成することが可能であり、該プライマーの少なくとも１対は配列番号３６の配列内から選択される工程、
ｂ）標的配列を含有する該プライマーの各々の伸長産物を合成し、もしあれば、該標的配列を検出可能なレベルまで増幅する工程、および
ｃ）該増幅された標的配列の存在および／または量を該検査試料におけるスタフィロコッカス・エピデルミディスの存在および／または量の指標として検出する工程、
を包含する方法。
該プライマーの少なくとも１対が
ａ）配列番号１４５および配列番号１４６、並びに
ｂ）配列番号１４７および配列番号１４８、
からなる群から選択される請求項４１記載の方法。
検査試料または細菌コロニーから直接スタフィロコッカス・アウレウスを検出、同定および／または定量する方法であって、
ａ）該試料または該試料から単離された細菌の実質的に均質な集団の細菌性ＤＮＡを不活性支持体に沈着させて固定し、または溶液中に遊離させる工程、あるいは、
該試料または該試料から単離された細菌の実質的に均質な集団を不活性支持体に接種し、該接種された試料または単離された細菌をインシトゥ溶解して細菌性ＤＮＡを放出させる工程であって、ここに該細菌性ＤＮＡが実質的に一本鎖の形態にある工程、
ｂ）該一本鎖ＤＮＡをプローブと接触させる工程であって、該プローブが、そのヌクレオチド配列が配列番号３７、それに相補的な配列、その一部およびその変異体からなる群より選択され、かつ該プローブの核酸が該細菌性ＤＮＡと選択的にハイブリダイズでき、それによりハイブリダイゼーション複合体が形成されるような条件下で、スタフィロコッカス・アウレウスの株またはその代表株と特異的かつ遍在的にアニールする少なくとも１つの一本鎖核酸を含み、該複合体は標識手段によって検出され、該標識は該プローブ上に存在するか、もしくは該標識は該標識手段の第１の反応性構成要素上に存在し、該第１の反応性構成要素は該プローブ上に存在する第２の反応性構成要素と反応する工程、および
ｃ）該不活性支持体上または該溶液中の該標識の存在または強度を該検査試料におけるスタフィロコッカス・アウレウスの存在および／または量の指標として検出する工程、
を包含する方法。
前記プローブが、その配列が配列番号３７に含まれる１２−４４２ヌクレオチド長を有するオリゴヌクレオチド、並びにスタフィロコッカス・アウレウスの株およびその代表株と特異的かつ遍在的にアニールするそれらの変異体からなる群から選択される請求項４３記載の方法。
検査試料中のスタフィロコッカス・アウレウスの存在および／または量を検出する方法であって、
ａ）該試料を、長さが少なくとも１２ヌクレオチドである少なくとも１対のオリゴヌクレオチドプライマーを含有する水溶液で処理する工程であって、該プライマーの一方は標的配列を含むスタフィロコッカス・アウレウスＤＮＡの２つの相補的鎖の一方と選択的にハイブリダイズでき、該プライマーの他方は該鎖の他方とハイブリダイズでき、それによって鋳型として標的配列を含有する伸長産物を形成することが可能であり、該プライマーの少なくとも１対は配列番号３７の配列内から選択される工程、
ｂ）標的配列を含有する該プライマーの各々の伸長産物を合成し、もしあれば、該標的配列を検出可能なレベルまで増幅する工程、および
ｃ）該増幅された標的配列の存在および／または量を該検査試料におけるスタフィロコッカス・アウレウスの存在および／または量の指標として検出する工程、
を包含する方法。
該プライマーの少なくとも１対が
ａ）配列番号１４９および配列番号１５０、
ｂ）配列番号１４９および配列番号１５１、並びに
ｃ）配列番号１５２および配列番号１５３、
からなる群から選択される請求項４５記載の方法。
検査試料または細菌コロニーから直接ヘモフィルス・インフルエンゼを検出、同定および／または定量する方法であって、
ａ）該試料または該試料から単離された細菌の実質的に均質な集団の細菌ＤＮＡを不活性支持体に沈着させて固定し、または溶液中に遊離させる工程、あるいは
該試料または該試料から単離された細菌の実質的に均質な集団を不活性支持体に接種し、該接種された試料または単離された細菌をイン・サイトゥ溶解して細菌性ＤＮＡを放出させる工程であって、ここに該細菌ＤＮＡが実質的に一本鎖の形態にある工程；
ｂ）該一本鎖ＤＮＡをプローブと接触させる工程であって、該プローブが、そのヌクレオチド配列が、当該プローブの核酸が該細菌ＤＮＡと選択的にハイブリダイズでき、それにより、ハイブリダイゼーション複合体が形成される条件下で、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、これらの相補配列、これらの一部、およびヘモフィルス・インフルエンゼの株類または代表株と特異的におよび普遍的にアニールしているこれらの変異体からなる群から選択される少なくとも一つの一本鎖核酸からなり、該複合体は標識手段により検出され、標識が該プローブ上に存在するか、または標識が該標識手段の第１の反応性構成要素上に存在し、該第１の反応性構成要素が該プローブ上に存在する第２の反応性構成要素と反応する工程；および、
ｃ）該不活性支持体上または該溶液中の該標識の存在または強度を該検査試料におけるヘモフィルス・インフルエンゼの存在および／または量の指標として検出する工程；
からなる方法。
該プローブが、
１）配列が配列番号２５またはその相補配列に包含される、長さが１２−８４５ヌクレオチドのオリゴヌクレオチド、
２）配列が配列番号２６またはその相補配列に包含される、長さが１２−１５９８ヌクレオチドのオリゴヌクレオチド、
３）配列が配列番号２７またはその相補配列に包含される、長さが１２−９１００ヌクレオチドのオリゴヌクレオチド、および
ヘモフィルス・インフルエンゼの株類または代表株と特異的におよび普遍的にアニールしているこれらの変異体
からなる群から選択される請求項４７記載の方法。
ヘモフィルス・インフルエンゼから核酸配列を検出するためのプローブが、配列番号１０５、配列番号１０６、配列番号１０７およびこれらの相補配列からなる群から選択される請求項４８記載の方法。
検査試料中のヘモフィルス・インフルエンゼの存在および／または量を検出する方法であって、
ａ）該試料を、長さが少なくとも１２ヌクレオチドであるオリゴヌクレオチドプライマーの少なくとも１対を含有する水溶液で処理する工程であって、該プライマーの一方は標的配列を含むヘモフィルス・インフルエンゼＤＮＡの２つの相補的鎖の一方と選択的にハイブリダイズでき、かつ該プライマーの他方は該鎖の他方とハイブリダイズできて、鋳型として標的配列を含有する伸長産物を形成し、該プライマーの少なくとも１対は、配列番号２５、配列番号２６、および配列番号２７の一つのうちから選択される；
ｂ）伸長産物が標的配列を含有する該プライマーの各々の伸長産物を合成し、該標的配列を、もしあれば、検出可能なレベルまで増幅する工程；および
ｃ）該検査試料におけるヘモフィルス・インフルエンゼの存在および／または量の指標として、該増幅された標的配列の存在および／または量を検出する工程
からなる方法。
該プライマーの少なくとも１対が、配列番号１５４および配列番号１５５からなる請求項５０記載の方法。
ａ）試料の、またはこの試料から単離した細菌の実質的に均質な集団の細菌ＤＮＡを不活性支持体上に沈着させおよびそれに固定し、または溶液中に遊離させるか、あるいは
該試料を、またはこの試料から単離した細菌の該実質的に均質な集団を、不活性支持体に接種し、次いで、該接種した試料または単離した細菌をイン・サイトゥ溶解させて細菌ＤＮＡを放出させる工程、
ここに、該細菌ＤＮＡは実質的に一本鎖の形態である；
ｂ）該一本鎖ＤＮＡをプローブと接触させる工程、ここに、該プローブは、そのヌクレオチド配列が、当該プローブの核酸が該細菌ＤＮＡと選択的にハイブリダイズでき、それにより、ハイブリダイゼーション複合体が形成される条件下で、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３４、配列番号３５、これらの相補配列、これらの一部、およびストレプトコッカス・ニューモニエの株類または代表株と特異的におよび普遍的にアニールしているこれらの変異体からなる群から選択される少なくとも一つの一本鎖核酸からなり、該複合体は標識手段により検出され、標識が該プローブ上に存在するか、または標識が該標識手段の第１の反応性構成要素上に存在し、該第１の反応性構成要素が該プローブ上に存在する第２の反応性構成要素と反応する；および、
ｃ）該検査試料におけるストレプトコッカス・ニューモニエの存在および／または量の指標として、該不活性支持体上、または該溶液中の該標識の存在または強度を検出する工程；
からなる、直接的に試験試料からまたは細菌コロニーからストレプトコッカス・ニューモニエを検出、同定および／または定量する方法。
該プローブが、
１）配列が配列番号３０またはその相補配列に包含される、長さが１２−６３１ヌクレオチドのオリゴヌクレオチド、
２）配列が配列番号３１またはその相補配列に包含される、長さが１２−３７５４ヌクレオチドのオリゴヌクレオチド、
３）配列が配列番号３４またはその相補配列に包含される、長さが１２−８４１ヌクレオチドのオリゴヌクレオチド、
４）配列が配列番号３５またはその相補配列に包含される、長さが１２−４５００ヌクレオチドのオリゴヌクレオチド、および
ストレプトコッカス・ニューモニエの株類または代表株と特異的におよび普遍的にアニールしているこれらの変異体
からなる群から選択される請求項５２記載の方法。
ストレプトコッカス・ニューモニエから核酸配列を検出するためのプローブが、配列番号１２０、配列番号１２１およびこれらの相補配列からなる群から選択される請求項５３記載の方法。
ａ）試料を、少なくとも１２ヌクレオチド長を有するオリゴヌクレオチドプライマーの少なくとも１対を含有する水性溶液で処理する工程、ここに、該プライマーのうち一方は、標的配列を含有するストレプトコッカス・ニューモニエＤＮＡの２個の相補的鎖の一方と選択的にハイブリダイズでき、該プライマーの他方は該鎖の他方とハイブリダイズできて、鋳型として標的配列を含有する伸長産物を形成し、該プライマーの少なくとも１対は、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３４および配列番号３５の一つのうちから選択される；
ｂ）伸長産物が標的配列を含有する該プライマーの各々の伸長産物を合成し、該標的配列を、もしあれば、検出可能なレベルまで増幅する工程；および
ｃ）該検査試料におけるストレプトコッカス・ニューモニエの存在および／または量の指標として、該増幅された標的配列の存在および／または量を検出する工程
からなる、検査試料中のストレプトコッカス・ニューモニエの存在および／または量を検出する方法。
該プライマーの少なくとも１対が、
ａ）配列番号７８および配列番号７９、
ｂ）配列番号１５６および配列番号１５７、ならびに
ｃ）配列番号１５８および配列番号１５９、
からなる群から選択される請求項５５記載の方法。
ａ）試料の、またはこの試料から単離した細菌の実質的に均質な集団の細菌ＤＮＡを不活性支持体上に沈着させおよびそれに固定し、または溶液中に遊離させるか、あるいは
該試料を、またはこの試料から単離した細菌の該実質的に均質な集団を、不活性支持体に接種し、次いで、該接種した試料または単離した細菌をイン・サイトゥ溶解させて細菌ＤＮＡを放出させる工程、
ここに、該細菌ＤＮＡは実質的に一本鎖の形態である；
ｂ）該一本鎖ＤＮＡをプローブと接触させる工程、ここに、該プローブは、そのヌクレオチド配列が、当該プローブの核酸が該細菌ＤＮＡと選択的にハイブリダイズでき、それにより、ハイブリダイゼーション複合体が形成される条件下で、配列番号３２、配列番号３３、これらの相補配列、これらの一部、およびストレプトコッカス・ピオジェンの株類または代表株と特異的におよび普遍的にアニールしているこれらの変異体からなる群から選択される少なくとも一つの一本鎖核酸からなり、該複合体は標識手段により検出され、標識が該プローブ上に存在するか、または標識が該標識手段の第１の反応性構成要素上に存在し、該第１の反応性構成要素が該プローブ上に存在する第２の反応性構成要素と反応する；および、
ｃ）該検査試料におけるストレプトコッカス・ピオジェンの存在および／または量の指標として、該不活性支持体上、または該溶液中の該標識の存在または強度を検出する工程；
からなる、直接的に試験試料からまたは細菌コロニーからストレプトコッカス・ピオジェンを検出、同定および／または定量する方法。
該プローブが、
１）配列が配列番号３２またはその相補配列に包含される、長さが１２−１３３７ヌクレオチドのオリゴヌクレオチド、
２）配列が配列番号３３またはその相補配列に包含される、長さが１２−１８３７ヌクレオチドのオリゴヌクレオチド、および
ストレプトコッカス・ピオジェンの株類または代表株と特異的におよび普遍的にアニールしているこれらの変異体
からなる群から選択される請求項５７記載の方法。
ａ）試料を、少なくとも１２ヌクレオチド長を有するオリゴヌクレオチドプライマーの少なくとも１対を含有する水性溶液で処理する工程、ここに、該プライマーのうち一方は、標的配列を含有するストレプトコッカス・ピオジェンＤＮＡの２個の相補鎖の一方と選択的にハイブリダイズでき、該プライマーの他方は該鎖の他方とハイブリダイズできて、鋳型として標的配列を含有する伸長産物を形成し、該プライマーの少なくとも１対は、配列番号３２および配列番号３３の一つのうちから選択される；
ｂ）伸長産物が標的配列を含有する該プライマーの各々の伸長産物を合成し、該標的配列を、もしあれば、検出可能なレベルまで増幅する工程；および
ｃ）該検査試料におけるストレプトコッカス・ピオジェンの存在および／または量の指標として、該増幅された標的配列の存在および／または量を検出する工程
からなる、検査試料中のストレプトコッカス・ピオジェンの存在および／または量を検出する方法。
該プライマーの少なくとも１対が、
ａ）配列番号１４１および配列番号１４２、ならびに
ｂ）配列番号１４３および配列番号１４４、
からなる群から選択される請求項５９記載の方法。
ａ）試料の、またはこの試料から単離した細菌の実質的に均質な集団の細菌ＤＮＡを不活性支持体上に沈着させおよびそれに固定し、または溶液中に遊離させるか、あるいは
該試料を、またはこの試料から単離した細菌の該実質的に均質な集団を、不活性支持体に接種し、次いで、該接種した試料または単離した細菌をインシトゥ溶解させて細菌ＤＮＡを放出させる工程、
ここに、該細菌ＤＮＡは実質的に一本鎖の形態である；
ｂ）該一本鎖ＤＮＡをプローブと接触させる工程、ここに、該プローブは、そのヌクレオチド配列が、当該プローブの核酸が該細菌ＤＮＡと選択的にハイブリダイズでき、それにより、ハイブリダイゼーション複合体が形成される条件下で、配列番号１、配列番号２、これらの相補配列、これらの一部、およびエンテロコッカス・フェカリスの株類または代表株と特異的におよび普遍的にアニールしているこれらの変異体からなる群から選択される少なくとも一つの一本鎖核酸からなり、該複合体は標識手段により検出され、標識が該プローブ上に存在するか、または標識が該標識手段の第１の反応性構成要素上に存在し、該第１の反応性構成要素が該プローブ上に存在する第２の反応性構成要素と反応する；および、
ｃ）該検査試料におけるエンテロコッカス・フェカリスの存在および／または量の指標として、該不活性支持体上、または該溶液中の該標識の存在または強度を検出する工程；
からなる、直接的に検査試料からまたは細菌コロニーからエンテロコッカス・フェカリスを検出、同定および／または定量する方法。
該プローブが、
１）配列が配列番号１またはその相補配列に包含される、長さが１２−１８１７ヌクレオチドのオリゴヌクレオチド、
２）配列が配列番号２に包含される、長さが１２−２２７５ヌクレオチドのオリゴヌクレオチド、および
エンテロコッカス・フェカリスの株類または代表株と特異的におよび普遍的にアニールしているこれらの変異体
からなる群から選択される請求項６１記載の方法。
ａ）試料を、少なくとも１２ヌクレオチド長を有するオリゴヌクレオチドプライマーの少なくとも１対を含有する水性溶液で処理する工程、ここに、該プライマーのうち一方は、標的配列を含有するエンテロコッカス・フェカリスＤＮＡの２個の相補鎖の一方と選択的にハイブリダイズでき、該プライマーの他方は該鎖の他方とハイブリダイズできて、鋳型として標的配列を含有する伸長産物を形成し、該プライマーの少なくとも１対は、配列番号１および配列番号２の一つのうちから選択される；
ｂ）伸長産物が標的配列を含有する該プライマーの各々の伸長産物を合成し、該標的配列を、もしあれば、検出可能なレベルまで増幅する工程；および
ｃ）該検査試料におけるエンテロコッカス・フェカリスの存在および／または量の指標として、該増幅された標的配列の存在および／または量を検出する工程
からなる、検査試料中のエンテロコッカス・フェカリスの存在および／または量を検出する方法。
該プライマーの少なくとも１対が、
ａ）配列番号３８および配列番号３９、ならびに
ｂ）配列番号４０および配列番号４１、
からなる群から選択される請求項５５記載の方法。
ａ）試料の、またはこの試料から単離した細菌の実質的に均質な集団の細菌ＤＮＡを不活性支持体上に沈着させおよびそれに固定し、または溶液中に遊離させるか、あるいは
該試料を、またはこの試料から単離した細菌の該実質的に均質な集団を、不活性支持体に接種し、次いで、該接種した試料または単離した細菌をインシトゥ溶解させて細菌ＤＮＡを放出させる工程、
ここに、該細菌ＤＮＡは実質的に一本鎖の形態である；
ｂ）該一本鎖ＤＮＡを、配列が、当該プローブの核酸が該細菌ＤＮＡと選択的にハイブリダイズでき、それにより、ハイブリダイゼーション複合体が形成される条件下で、配列番号１２２、配列番号１２３、配列番号１２４、配列番号１２５、配列番号１２８、配列番号１２９、配列番号１３０、およびこれらの相補配列からなる群から選択される普遍的プローブと接触させる工程、ここに、該複合体は標識手段により検出され、標識が該プローブ上に存在するか、または標識が該標識手段の第１の反応性構成要素上に存在し、該第１の反応性構成要素が該プローブ上に存在する第２の反応性構成要素と反応する；および、
ｃ）該検査試料における全ての細菌種の存在および／または量の指標として、該不活性支持体上、または該溶液中の該標識の存在または強度を検出する工程；
からなる、直接的に検査試料からまたは細菌コロニーから全ての細菌種の存在および／または量を検出する方法。
ａ）試料を、配列が配列番号１２６および配列番号１２７で規定される普遍的プライマーの１対を含有する水性溶液で処理する工程、ここに、該プライマーのうち一方は、標的配列を含有する全ての細菌種ＤＮＡの２個の相補的鎖の一方と選択的にハイブリダイズでき、該プライマーの他方は該鎖の他方とハイブリダイズできて、鋳型として標的配列を含有する伸長産物を形成する；
ｂ）伸長産物が標的配列を含有する該プライマーの各々の伸長産物を合成し、該標的配列を、もしあれば、検出可能なレベルまで増幅する工程；および
ｃ）該検査試料における該全ての細菌種の存在および／または量の指標として、該増幅された標的配列の存在および／または量を検出する工程
からなる、検査試料中の全ての細菌種の存在および／または量を検出する方法。
ａ）試料の、またはこの試料から単離した細菌の実質的に均質な集団の細菌ＤＮＡを不活性支持体上に沈着させおよびそれに固定し、または溶液中に遊離させるか、あるいは
該試料を、またはこの試料から単離した細菌の該実質的に均質な集団を、不活性支持体に接種し、次いで、該接種した試料または単離した細菌をインシトゥ溶解させて細菌ＤＮＡを放出させる工程、
ここに、該細菌ＤＮＡは実質的に一本鎖の形態である；
ｂ）該一本鎖ＤＮＡをプローブと接触させる工程、ここに、該プローブは、そのヌクレオチド配列が、当該プローブの核酸が該細菌ＤＮＡと選択的にハイブリダイズでき、それにより、ハイブリダイゼーション複合体が形成される条件下で、配列番号１６１、これらの相補配列、これらの一部、およびβ−ラクタマーゼについてコードする細菌抗生物質耐性遺伝子と特異的にアニールしているこれらの変異体からなる群から選択される少なくとも一つの一本鎖核酸からなり、該複合体は標識手段により検出され、標識が該プローブ上に存在するか、または標識が該標識手段の第１の反応性構成要素上に存在し、該第１の反応性構成要素が該プローブ上に存在する第２の反応性構成要素と反応する；および、
ｃ）細菌抗生物質耐性遺伝子ＴＥＭ−１によって媒介されるβ−ラクタム抗生物質類に対する細菌耐性の指標として、該不活性支持体上、または該溶液中の該標識の存在または強度を検出する工程；
からなる、直接的に検査試料からまたは細菌コロニーから細菌抗生物質耐性遺伝子ｂｌａｔｅｍ（ＴＥＭ−１）によって媒介されるβ−ラクタム抗生物質類に対する細菌耐性を評価する方法。
該プローブが、配列番号１６１にハイブリダイズする長さが少なくとも１２ヌクレオチドのオリゴヌクレオチドからなる請求項６７記載の方法。
ａ）試料を、少なくとも１２ヌクレオチド長を有するオリゴヌクレオチドプライマーの少なくとも１対を含有する水性溶液で処理する工程、ここに、該プライマーのうち一方は、標的配列を含有するβ−ラクタマーゼをコードする細菌抗生物質耐性遺伝子の２個の相補鎖の一方と選択的にハイブリダイズでき、該プライマーの他方は該鎖の他方とハイブリダイズできて、鋳型として標的配列を含有する伸長産物を形成し、該プライマーの少なくとも１対は配列番号１６１で規定される配列のうちから選択される；
ｂ）伸長産物が標的配列を含有する該プライマーの各々の伸長産物を合成し、該標的配列を、もしあれば、検出可能なレベルまで増幅する工程；および
ｃ）細菌抗生物質耐性遺伝子ＴＥＭ−１によって媒介されるβ−ラクタム抗生物質類に対する細菌耐性の指標として、該増幅された標的配列の存在および／または量を検出する工程；
からなる、検査試料中の細菌抗生物質耐性遺伝子ｂｌａｔｅｍ（ＴＥＭ−１）によって媒介されるβ−ラクタム抗生物質類に対する細菌耐性を評価する方法。
ａ）試料の、またはこの試料から単離した細菌の実質的に均質な集団の細菌ＤＮＡを不活性支持体上に沈着させおよびそれに固定し、または溶液中に遊離させるか、あるいは
該試料を、またはこの試料から単離した細菌の該実質的に均質な集団を、不活性支持体に接種し、次いで、該接種した試料または単離した細菌をインシトゥ溶解させて細菌ＤＮＡを放出させる工程、
ここに、該細菌ＤＮＡは実質的に一本鎖の形態である；
ｂ）該一本鎖ＤＮＡをプローブと接触させる工程、ここに、該プローブは、そのヌクレオチド配列が、当該プローブの核酸が該細菌ＤＮＡと選択的にハイブリダイズでき、それにより、ハイブリダイゼーション複合体が形成される条件下で、配列番号１６２、これらの相補配列、これらの一部、およびβ−ラクタマーゼをコードする細菌抗生物質耐性遺伝子と特異的にアニールしているこれらの変異体からなる群から選択される少なくとも一つの一本鎖核酸からなり、該複合体は標識手段により検出され、標識が該プローブ上に存在するか、または標識が該標識手段の第１の反応性構成要素上に存在し、該第１の反応性構成要素が該プローブ上に存在する第２の反応性構成要素と反応する；および、
ｃ）細菌抗生物質耐性遺伝子ＲＯＢ−１によって媒介されるβ−ラクタム抗生物質類に対する細菌耐性の指標として、該不活性支持体上、または該溶液中の該標識の存在または強度を検出する工程；
からなる、直接的に検査試料からまたは細菌コロニーから細菌抗生物質耐性遺伝子ｂｌａｒｏｂ（ＲＯＢ−１）によって媒介されるβ−ラクタム抗生物質類に対する細菌耐性を評価する方法。
該プローブが、配列番号１６２にハイブリダイズする長さが少なくとも１２ヌクレオチドのオリゴヌクレオチドからなる請求項７０記載の方法。
ａ）試料を、少なくとも１２ヌクレオチド長を有するオリゴヌクレオチドプライマーの少なくとも１対を含有する水性溶液で処理する工程、ここに、該プライマーのうち一方は、標的配列を含有するβ−ラクタマーゼをコードする細菌抗生物質耐性遺伝子の２個の相補鎖の一方と選択的にハイブリダイズでき、該プライマーの他方は該鎖の他方とハイブリダイズできて、鋳型として標的配列を含有する伸長産物を形成し、該プライマーの少なくとも１対は配列番号１６２で規定される配列のうちから選択される；
ｂ）伸長産物が標的配列を含有する該プライマーの各々の伸長産物を合成し、該標的配列を、もしあれば、検出可能なレベルまで増幅する工程；および
ｃ）細菌抗生物質耐性遺伝子ＲＯＢ−１によって媒介されるβ−ラクタム抗生物質類に対する細菌耐性の指標として、該増幅された標的配列の存在および／または量を検出する工程；
からなる、検査試料中の細菌抗生物質耐性遺伝子ｂｌａｒｏｂ（ＲＯＢ−１）によって媒介されるβ−ラクタム抗生物質類に対する細菌耐性を評価する方法。
ａ）試料の、またはこの試料から単離した細菌の実質的に均質な集団の細菌ＤＮＡを不活性支持体上に沈着させおよびそれに固定し、または溶液中に遊離させるか、あるいは
該試料を、またはこの試料から単離した細菌の該実質的に均質な集団を、不活性支持体に接種し、次いで、該接種した試料または単離した細菌をインシトゥ溶解させて細菌ＤＮＡを放出させる工程、
ここに、該細菌ＤＮＡは実質的に一本鎖の形態である；
ｂ）該一本鎖ＤＮＡをプローブと接触させる工程、ここに、該プローブは、そのヌクレオチド配列が、当該プローブの核酸が該細菌ＤＮＡと選択的にハイブリダイズでき、それにより、ハイブリダイゼーション複合体が形成される条件下で、配列番号１６３、これらの相補配列、これらの一部、およびβ−ラクタマーゼをコードする細菌抗生物質耐性遺伝子と特異的にアニールするこれらの変異体からなる群から選択される少なくとも一つの一本鎖核酸からなり、該複合体は標識手段により検出され、標識が該プローブ上に存在するか、または標識が該標識手段の第１の反応性構成要素上に存在し、該第１の反応性構成要素が該プローブ上に存在する第２の反応性構成要素と反応する；および、
ｃ）細菌抗生物質耐性遺伝子ＳＨＶ−１によって媒介されるβ−ラクタム抗生物質類に対する細菌耐性の指標として、該不活性支持体上、または該溶液中の該標識の存在または強度を検出する工程；
からなる、直接的に検査試料からまたは細菌コロニーから細菌抗生物質耐性遺伝子ｂｌａｓｈｖ（ＳＨＶ−１）によって媒介されるβ−ラクタム抗生物質類に対する細菌耐性を評価する方法。
該プローブが、配列番号１６３にハイブリダイズする長さが少なくとも１２ヌクレオチドのオリゴヌクレオチドからなる請求項７３記載の方法。
ａ）試料を、少なくとも１２ヌクレオチド長を有するオリゴヌクレオチドプライマーの少なくとも１対を含有する水性溶液で処理する工程、ここに、該プライマーのうち一方は、標的配列を含有するβ−ラクタマーゼをコードする細菌抗生物質耐性遺伝子の２個の相補鎖の一方と選択的にハイブリダイズでき、該プライマーの他方は該鎖の他方とハイブリダイズできて、鋳型として標的配列を含有する伸長産物を形成し、該プライマーの少なくとも１対は配列番号１６３で規定される配列のうちから選択される；
ｂ）伸長産物が標的配列を含有する該プライマーの各々の伸長産物を合成し、該標的配列を、もしあれば、検出可能なレベルまで増幅する工程；および
ｃ）細菌抗生物質耐性遺伝子ＳＨＶ−１によって媒介されるβ−ラクタム抗生物質類に対する細菌耐性の指標として、該増幅された標的配列の存在および／または量を検出する工程；
からなる、検査試料中の細菌抗生物質耐性遺伝子ｂｌａｓｈｖ（ＳＨＶ−１）によって媒介されるβ−ラクタム抗生物質類に対する細菌耐性を評価する方法。
ａ）試料の、またはこの試料から単離した細菌の実質的に均質な集団の細菌ＤＮＡを不活性支持体上に沈着させおよびそれに固定し、または溶液中に遊離させるか、あるいは
該試料を、またはこの試料から単離した細菌の該実質的に均質な集団を、不活性支持体に接種し、次いで、該接種した試料または単離した細菌をインシトゥ溶解させて細菌ＤＮＡを放出させる工程、
ここに、該細菌ＤＮＡは実質的に一本鎖の形態である；
ｂ）該一本鎖ＤＮＡをプローブと接触させる工程、ここに、該プローブは、そのヌクレオチド配列が、当該プローブの核酸が該細菌ＤＮＡと選択的にハイブリダイズでき、それにより、ハイブリダイゼーション複合体が形成される条件下で、配列番号１６４、これらの相補配列、これらの一部、およびアミノグリコシド・アデニリルトランスフェラーゼをコードする細菌抗生物質耐性遺伝子と特異的にアニールするこれらの変異体からなる群から選択される少なくとも一つの一本鎖核酸からなり、該複合体は標識手段により検出され、標識が該プローブ上に存在するか、または標識が該標識手段の第１の反応性構成要素上に存在し、該第１の反応性構成要素が該プローブ上に存在する第２の反応性構成要素と反応する；および、
ｃ）細菌抗生物質耐性遺伝子ａａｄＢによって媒介されるアミノグリコシド抗生物質類に対する細菌耐性の指標として、該不活性支持体上、または該溶液中の該標識の存在または強度を検出する工程；
からなる、直接的に検査試料からまたは細菌コロニーから細菌抗生物質耐性遺伝子ａａｄＢによって媒介されるアミノグリコシド抗生物質類に対する細菌耐性を評価する方法。
該プローブが、配列番号１６４にハイブリダイズする長さが少なくとも１２ヌクレオチドのオリゴヌクレオチドからなる請求項７６記載の方法。
ａ）試料を、少なくとも１２ヌクレオチド長を有するオリゴヌクレオチドプライマーの少なくとも１対を含有する水性溶液で処理する工程、ここに、該プライマーのうち一方は、標的配列を含有するアミノグリコシド・アデニリルトランスフェラーゼをコードする細菌抗生物質耐性遺伝子の２個の相補鎖の一方と選択的にハイブリダイズでき、該プライマーの他方は該鎖の他方とハイブリダイズできて、鋳型として標的配列を含有する伸長産物を形成し、該プライマーの少なくとも１対は配列番号１６４で規定される配列のうちから選択される；
ｂ）伸長産物が標的配列を含有する該プライマーの各々の伸長産物を合成し、該標的配列を、もしあれば、検出可能なレベルまで増幅する工程；および
ｃ）細菌抗生物質耐性遺伝子ａａｄＢによって媒介されるアミノグリコシド抗生物質類に対する細菌耐性の指標として、該増幅された標的配列の存在および／または量を検出する工程；
からなる、検査試料中の細菌抗生物質耐性遺伝子ａａｄＢによって媒介されるアミノグリコシド抗生物質類に対する細菌耐性を評価する方法。
ａ）試料の、またはこの試料から単離した細菌の実質的に均質な集団の細菌ＤＮＡを不活性支持体上に沈着させおよびそれに固定し、または溶液中に遊離させるか、あるいは
該試料を、またはこの試料から単離した細菌の該実質的に均質な集団を、不活性支持体に接種し、次いで、該接種した試料または単離した細菌をインシトゥ溶解させて細菌ＤＮＡを放出させる工程、
ここに、該細菌ＤＮＡは実質的に一本鎖の形態である；
ｂ）該一本鎖ＤＮＡをプローブと接触させる工程、ここに、該プローブは、そのヌクレオチド配列が、当該プローブの核酸が該細菌ＤＮＡと選択的にハイブリダイズでき、それにより、ハイブリダイゼーション複合体が形成される条件下で、配列番号１６５、これらの相補配列、これらの一部、およびアミノグリコシド・アセチルトランスフェラーゼをコードする細菌抗生物質耐性遺伝子と特異的にアニールするこれらの変異体からなる群から選択される少なくとも一つの一本鎖核酸からなり、該複合体は標識手段により検出され、標識が該プローブ上に存在するか、または標識が該標識手段の第１の反応性構成要素上に存在し、該第１の反応性構成要素が該プローブ上に存在する第２の反応性構成要素と反応する；および、
ｃ）細菌抗生物質耐性遺伝子ａａｃＣｌによって媒介されるアミノグリコシド抗生物質類に対する細菌耐性の指標として、該不活性支持体上、または該溶液中の該標識の存在または強度を検出する工程；
からなる、直接的に検査試料からまたは細菌コロニーから細菌抗生物質耐性遺伝子ａａｃＣｌによって媒介されるアミノグリコシド抗生物質類に対する細菌耐性を評価する方法。
該プローブが、配列番号１６５にハイブリダイズする長さが少なくとも１２ヌクレオチドのオリゴヌクレオチドからなる請求項７９記載の方法。
ａ）試料を、少なくとも１２ヌクレオチド長を有するオリゴヌクレオチドプライマーの少なくとも１対を含有する水性溶液で処理する工程、ここに、該プライマーのうち一方は、標的配列を含有するアミノグリコシド・アセチルトランスフェラーゼをコードする細菌抗生物質耐性遺伝子の２個の相補鎖の一方と選択的にハイブリダイズでき、該プライマーの他方は該鎖の他方とハイブリダイズできて、鋳型として標的配列を含有する伸長産物を形成し、該プライマーの少なくとも１対は配列番号１６５で規定される配列のうちから選択される；
ｂ）伸長産物が標的配列を含有する該プライマーの各々の伸長産物を合成し、該標的配列を、もしあれば、検出可能なレベルまで増幅する工程；および
ｃ）細菌抗生物質耐性遺伝子ａａｃＣｌによって媒介されるアミノグリコシド抗生物質類に対する細菌耐性の指標として、該増幅された標的配列の存在および／または量を検出する工程；
からなる、検査試料中の細菌抗生物質耐性遺伝子ａａｃＣｌによって媒介されるアミノグリコシド抗生物質類に対する細菌耐性を評価する方法。
ａ）試料の、またはこの試料から単離した細菌の実質的に均質な集団の細菌ＤＮＡを不活性支持体上に沈着させおよびそれに固定し、または溶液中に遊離させるか、あるいは
該試料を、またはこの試料から単離した細菌の該実質的に均質な集団を、不活性支持体に接種し、次いで、該接種した試料または単離した細菌をインシトゥ溶解させて細菌ＤＮＡを放出させる工程、
ここに、該細菌ＤＮＡは実質的に一本鎖の形態である；
ｂ）該一本鎖ＤＮＡをプローブと接触させる工程、ここに、該プローブは、そのヌクレオチド配列が、当該プローブの核酸が該細菌ＤＮＡと選択的にハイブリダイズでき、それにより、ハイブリダイゼーション複合体が形成される条件下で、配列番号１６６、これらの相補配列、これらの一部、およびアミノグリコシド・アセチルトランスフェラーゼをコードする細菌抗生物質耐性遺伝子と特異的にアニールするこれらの変異体からなる群から選択される少なくとも一つの一本鎖核酸からなり、該複合体は標識手段により検出され、標識が該プローブ上に存在するか、または標識が該標識手段の第１の反応性構成要素上に存在し、該第１の反応性構成要素が該プローブ上に存在する第２の反応性構成要素と反応する；および、
ｃ）細菌抗生物質耐性遺伝子ａａｃＣ２によって媒介されるアミノグリコシド抗生物質類に対する細菌耐性の指標として、該不活性支持体上、または該溶液中の該標識の存在または強度を検出する工程；
からなる、直接的に検査試料からまたは細菌コロニーから細菌抗生物質耐性遺伝子ａａｃＣ２によって媒介されるアミノグリコシド抗生物質類に対する細菌耐性を評価する方法。
該プローブが、配列番号１６６にハイブリダイズする長さが少なくとも１２ヌクレオチドのオリゴヌクレオチドからなる請求項８２記載の方法。
ａ）試料を、少なくとも１２ヌクレオチド長を有するオリゴヌクレオチドプライマーの少なくとも１対を含有する水性溶液で処理する工程、ここに、該プライマーのうち一方は、標的配列を含有するアミノグリコシド・アセチルトランスフェラーゼをコードする細菌抗生物質耐性遺伝子の２個の相補鎖の一方と選択的にハイブリダイズでき、該プライマーの他方は該鎖の他方とハイブリダイズできて、鋳型として標的配列を含有する伸長産物を形成し、該プライマーの少なくとも１対は配列番号１６６で規定される配列のうちから選択される；
ｂ）伸長産物が標的配列を含有する該プライマーの各々の伸長産物を合成し、該標的配列を、もしあれば、検出可能なレベルまで増幅する工程；および
ｃ）細菌抗生物質耐性遺伝子ａａｃＣ２によって媒介されるアミノグリコシド抗生物質類に対する細菌耐性の指標として、該増幅された標的配列の存在および／または量を検出する工程；
からなる、検査試料中の細菌抗生物質耐性遺伝子ａａｃＣ２によって媒介されるアミノグリコシド抗生物質類に対する細菌耐性を評価する方法。
ａ）試料の、またはこの試料から単離した細菌の実質的に均質な集団の細菌ＤＮＡを不活性支持体上に沈着させおよびそれに固定し、または溶液中に遊離させるか、あるいは
該試料を、またはこの試料から単離した細菌の該実質的に均質な集団を、不活性支持体に接種し、次いで、該接種した試料または単離した細菌をインシトゥ溶解させて細菌ＤＮＡを放出させる工程、
ここに、該細菌ＤＮＡは実質的に一本鎖の形態である；
ｂ）該一本鎖ＤＮＡをプローブと接触させる工程、ここに、該プローブは、そのヌクレオチド配列が、当該プローブの核酸が該細菌ＤＮＡと選択的にハイブリダイズでき、それにより、ハイブリダイゼーション複合体が形成される条件下で、配列番号１６７、これらの相補配列、これらの一部、およびアミノグリコシド・アセチルトランスフェラーゼをコードする細菌抗生物質耐性遺伝子と特異的にアニールするこれらの変異体からなる群から選択される少なくとも一つの一本鎖核酸からなり、該複合体は標識手段により検出され、標識が該プローブ上に存在するか、または標識が該標識手段の第１の反応性構成要素上に存在し、該第１の反応性構成要素が該プローブ上に存在する第２の反応性構成要素と反応する；および、
ｃ）細菌抗生物質耐性遺伝子ａａｃＣ３によって媒介されるアミノグリコシド抗生物質類に対する細菌耐性の指標として、該不活性支持体上、または該溶液中の該標識の存在または強度を検出する工程；
からなる、直接的に検査試料からまたは細菌コロニーから細菌抗生物質耐性遺伝子ａａｃＣ３によって媒介されるアミノグリコシド抗生物質類に対する細菌耐性を評価する方法。
該プローブが、配列番号１６７にハイブリダイズする長さが少なくとも１２ヌクレオチドのオリゴヌクレオチドからなる請求項８５記載の方法。
ａ）試料を、少なくとも１２ヌクレオチド長を有するオリゴヌクレオチドプライマーの少なくとも１対を含有する水性溶液で処理する工程、ここに、該プライマーのうち一方は、標的配列を含有するアミノグリコシド・アセチルトランスフェラーゼをコードする細菌抗生物質耐性遺伝子の２個の相補鎖の一方と選択的にハイブリダイズでき、該プライマーの他方は該鎖の他方とハイブリダイズできて、鋳型として標的配列を含有する伸長産物を形成し、該プライマーの少なくとも１対は配列番号１６７で規定される配列のうちから選択される；
ｂ）伸長産物が標的配列を含有する該プライマーの各々の伸長産物を合成し、該標的配列を、もしあれば、検出可能なレベルまで増幅する工程；および
ｃ）細菌抗生物質耐性遺伝子ａａｃＣ３によって媒介されるアミノグリコシド抗生物質類に対する細菌耐性の指標として、該増幅された標的配列の存在および／または量を検出する工程；
からなる、検査試料中の細菌抗生物質耐性遺伝子ａａｃＣ３によって媒介されるアミノグリコシド抗生物質類に対する細菌耐性を評価する方法。
ａ）試料の、またはこの試料から単離した細菌の実質的に均質な集団の細菌ＤＮＡを不活性支持体上に沈着させおよびそれに固定し、または溶液中に遊離させるか、あるいは
該試料を、またはこの試料から単離した細菌の該実質的に均質な集団を、不活性支持体に接種し、次いで、該接種した試料または単離した細菌をインシトゥ溶解させて細菌ＤＮＡを放出させる工程、
ここに、該細菌ＤＮＡは実質的に一本鎖の形態である；
ｂ）該一本鎖ＤＮＡをプローブと接触させる工程、ここに、該プローブは、そのヌクレオチド配列が、当該プローブの核酸が該細菌ＤＮＡと選択的にハイブリダイズでき、それにより、ハイブリダイゼーション複合体が形成される条件下で、配列番号１６８、これらの相補配列、これらの一部、およびアミノグリコシド・アセチルトランスフェラーゼをコードする細菌抗生物質耐性遺伝子と特異的にアニールするこれらの変異体からなる群から選択される少なくとも一つの一本鎖核酸からなり、該複合体は標識手段により検出され、標識が該プローブ上に存在するか、または標識が該標識手段の第１の反応性構成要素上に存在し、該第１の反応性構成要素が該プローブ上に存在する第２の反応性構成要素と反応する；および、
ｃ）細菌抗生物質耐性遺伝子ａａｃＡ４によって媒介されるアミノグリコシド抗生物質類に対する細菌耐性の指標として、該不活性支持体上、または該溶液中の該標識の存在または強度を検出する工程；
からなる、直接的に検査試料からまたは細菌コロニーから細菌抗生物質耐性遺伝子ａａｃＡ４によって媒介されるアミノグリコシド抗生物質類に対する細菌耐性を評価する方法。
該プローブが、配列番号１６８にハイブリダイズしている長さが少なくとも１２ヌクレオチドのオリゴヌクレオチドからなる請求項８８記載の方法。
ａ）試料を、少なくとも１２ヌクレオチド長を有するオリゴヌクレオチドプライマーの少なくとも１対を含有する水性溶液で処理する工程、ここに、該プライマーのうち一方は、標的配列を含有するアミノグリコシド・アセチルトランスフェラーゼをコードする細菌抗生物質耐性遺伝子の２個の相補鎖の一方と選択的にハイブリダイズでき、該プライマーの他方は該鎖の他方とハイブリダイズできて、鋳型として標的配列を含有する伸長産物を形成し、該プライマーの少なくとも１対は配列番号１６８で規定される配列のうちから選択される；
ｂ）伸長産物が標的配列を含有する該プライマーの各々の伸長産物を合成し、該標的配列を、もしあれば、検出可能なレベルまで増幅する工程；および
ｃ）細菌抗生物質耐性遺伝子ａａｃＡ４によって媒介されるアミノグリコシド抗生物質類に対する細菌耐性の指標として、該増幅された標的配列の存在および／または量を検出する工程；
からなる、検査試料中の細菌抗生物質耐性遺伝子ａａｃＡ４によって媒介されるアミノグリコシド抗生物質類に対する細菌耐性を評価する方法。
ａ）試料の、またはこの試料から単離した細菌の実質的に均質な集団の細菌ＤＮＡを不活性支持体上に沈着させおよびそれに固定し、または溶液中に遊離させるか、あるいは
該試料を、またはこの試料から単離した細菌の該実質的に均質な集団を、不活性支持体に接種し、次いで、該接種した試料または単離した細菌をインシトゥ溶解させて細菌ＤＮＡを放出させる工程、
ここに、該細菌ＤＮＡは実質的に一本鎖の形態である；
ｂ）該一本鎖ＤＮＡをプローブと接触させる工程、ここに、該プローブは、そのヌクレオチド配列が、当該プローブの核酸が該細菌ＤＮＡと選択的にハイブリダイズでき、それにより、ハイブリダイゼーション複合体が形成される条件下で、配列番号１６９、これらの相補配列、これらの一部、およびペニシリン結合タンパク質をコードする細菌抗生物質耐性遺伝子と特異的にアニールするこれらの変異体からなる群から選択される少なくとも一つの一本鎖核酸からなり、該複合体は標識手段により検出され、標識が該プローブ上に存在するか、または標識が該標識手段の第１の反応性構成要素上に存在し、該第１の反応性構成要素が該プローブ上に存在する第２の反応性構成要素と反応する；および、
ｃ）細菌抗生物質耐性遺伝子ｍｅｃＡによって媒介されるβ−ラクタム抗生物質類に対する細菌耐性の指標として、該不活性支持体上、または該溶液中の該標識の存在または強度を検出する工程；
からなる、直接的に検査試験試料からまたは細菌コロニーから細菌抗生物質耐性遺伝子ｍｅｃＡによって媒介されるβ−ラクタム抗生物質類に対する細菌耐性を評価する方法。
該プローブが、配列番号１６９にハイブリダイズする長さが少なくとも１２ヌクレオチドのオリゴヌクレオチドからなる請求項９１記載の方法。
ａ）試料を、少なくとも１２ヌクレオチド長を有するオリゴヌクレオチドプライマーの少なくとも１対を含有する水性溶液で処理する工程、ここに、該プライマーのうち一方は、標的配列を含有するペニシリン結合タンパク質をコードする細菌抗生物質耐性遺伝子の２個の相補鎖の一方と選択的にハイブリダイズでき、該プライマーの他方は該鎖の他方とハイブリダイズできて、鋳型として標的配列を含有する伸長産物を形成し、該プライマーの少なくとも１対は配列番号１６９で規定される配列のうちから選択される；
ｂ）伸長産物が標的配列を含有する該プライマーの各々の伸長産物を合成し、該標的配列を、もしあれば、検出可能なレベルまで増幅する工程；および
ｃ）細菌抗生物質耐性遺伝子ｍｅｃＡによって媒介されるβ−ラクタム抗生物質類に対する細菌耐性の指標として、該増幅された標的配列の存在および／または量を検出する工程；
からなる、検査試料中の細菌抗生物質耐性遺伝子ｍｅｃＡによって媒介されるβ−ラクタム抗生物質類に対する細菌耐性を評価する方法。
ａ）試料の、またはこの試料から単離した細菌の実質的に均質な集団の細菌ＤＮＡを不活性支持体上に沈着させおよびそれに固定し、または溶液中に遊離させるか、あるいは
該試料を、またはこの試料から単離した細菌の該実質的に均質な集団を、不活性支持体に接種し、次いで、該接種した試料または単離した細菌をインシトゥ溶解させて細菌ＤＮＡを放出させる工程、
ここに、該細菌ＤＮＡは実質的に一本鎖の形態である；
ｂ）該一本鎖ＤＮＡをプローブと接触させる工程、ここに、該プローブは、そのヌクレオチド配列が、当該プローブの核酸が該細菌ＤＮＡと選択的にハイブリダイズでき、それにより、ハイブリダイゼーション複合体が形成される条件下で、配列番号１７０、これらの相補配列、これらの一部、およびバンコマイシン耐性タンパク質をコードする細菌抗生物質耐性遺伝子と特異的にアニールするこれらの変異体からなる群から選択される少なくとも一つの一本鎖核酸からなり、該複合体は標識手段により検出され、標識が該プローブ上に存在するか、または標識が該標識手段の第１の反応性構成要素上に存在し、該第１の反応性構成要素が該プローブ上に存在する第２の反応性構成要素と反応する；および、
ｃ）細菌抗生物質耐性遺伝子ｖａｎＨ、ｖａｎＡおよびｖａｎＸによって媒介されるバンコマイシンに対する細菌耐性の指標として、該不活性支持体上、または該溶液中の該標識の存在または強度を検出する工程；
からなる、直接的に検査試料からまたは細菌コロニーから細菌抗生物質耐性遺伝子ｖａｎＨ、ｖａｎＡおよびｖａｎＸによって媒介されるバンコマイシンに対する細菌耐性を評価する方法。
該プローブが、配列番号１７０にハイブリダイズする長さが少なくとも１２ヌクレオチドのオリゴヌクレオチドからなる請求項９４記載の方法。
ａ）試料を、少なくとも１２ヌクレオチド長を有するオリゴヌクレオチドプライマーの少なくとも１対を含有する水性溶液で処理する工程、ここに、該プライマーのうち一方は、標的配列を含有するバンコマイシン耐性タンパク質をコードする細菌抗生物質耐性遺伝子の２個の相補鎖の一方と選択的にハイブリダイズでき、該プライマーの他方は該鎖の他方とハイブリダイズできて、鋳型として標的配列を含有する伸長産物を形成し、該プライマーの少なくとも１対は配列番号１７０で規定される配列のうちから選択される；
ｂ）伸長産物が標的配列を含有する該プライマーの各々の伸長産物を合成し、該標的配列を、もしあれば、検出可能なレベルまで増幅する工程；および
ｃ）細菌抗生物質耐性遺伝子ｖａｎＨ、ｖａｎＡおよびｖａｎＸによって媒介されるバンコマイシンに対する細菌耐性の指標として、該増幅された標的配列の存在および／または量を検出する工程；
からなる、検査試料中の細菌抗生物質耐性遺伝子ｖａｎＨ、ｖａｎＡおよびｖａｎＸによって媒介されるバンコマイシンに対する細菌耐性を評価する方法。
ａ）試料の、またはこの試料から単離された細菌の実質的に均質な集団の細菌ＤＮＡを不活性担体に付着させそして固定するかまたは溶液に遊離させるか、または、
不活性担体に該試料またはこの試料から単離された細菌の該実質的に均質な集団を接種し、そして該接種試料または単離細菌をインシトゥ溶菌して細菌ＤＮＡを放出させ、
それにより該細菌ＤＮＡは、実質的に一本鎖の形態になり、
ｂ）該一本鎖ＤＮＡをプローブと接触させ、ここにプローブは、ヌクレオチド配列が、配列番号１７３、それに相補的な配列、その一部およびその変異体よりなる群から選択される少なくとも１つの一本鎖核酸よりなり、該プローブの核酸が該細菌ＤＮＡと選択的にハイブリダイズできるような条件下で、ストレプトグラミンＡアセチルトラスフェラーゼをコードする該細菌抗生物質耐性遺伝子と特異的にアニールし、それによりハイブリダイゼーション複合体が形成され、該複合体が標識手段により検出され、標識が該プローブに存在するかまたは標識が該標識手段の第１の反応性構成物に存在し、該第１の反応性構成物が該プローブに存在する第２の反応性構成物と反応し、そして
ｃ）細菌抗生物質耐性遺伝子ｓａｔＡにより媒介されるストレプトグラミンＡに対する細菌耐性の指標として、該不活性担体上、または該溶液中の該標識の存在または強度を検出すること
よりなる、直接的に試験試料からまたは細菌コロニーから細菌抗生物質耐性遺伝子ｓａｔＡによって媒介されるストレプトグラミンＡに対する細菌耐性を評価する方法。
前記プローブが、配列番号１７３とハイブリダイズする少なくとも１２ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドよりなる請求項９７記載の方法。
ａ）少なくとも１２ヌクレオチド長を示すオリゴヌクレオチドプライマーの少なくとも１対を含む水溶液で該試料を処理し、ここにプライマーの１つが、標的配列を含むストレプトグラミンＡアセチルトランスフェラーゼをコードする該細菌抗生物質耐性遺伝子の２つの相補鎖の内の１つと選択的にハイブリダイズでき、そして該プライマーの内の他方は該鎖のもう一方とハイブリダイズでき、それによって鋳型として標的配列を含む伸長産生物が形成され、該プライマーの少なくとも１対は配列番号１７３で定義される配列内から選択され、
ｂ）その伸長産生物が標的配列を含む該プライマーの伸長産物を合成し、該標的配列を、もしあれば、検出可能なレベルまで増幅し、そして
ｃ）細菌抗生物質耐性遺伝子ｓａｔＡにより媒介されるストレプトグラミンＡに対する細菌耐性の指標として、該増幅標的配列の存在および／または量を検出すること
よりなる、直接的に検査試料からまたは細菌コロニーから細菌抗生物質耐性遺伝子ｓａｔＡによって媒介されるストレプトグラミンＡに対する細菌耐性を評価する方法。
ａ）試料の、またはこの試料から単離された細菌の実質的に均質な集団の細菌ＤＮＡを不活性担体に付着させそして固定するかまたは溶液に遊離させるか、または、
不活性担体に該試料またはこの試料から単離された細菌の該実質的に均質な集団を接種し、そして該接種試料または単離細菌をインシトゥ溶菌して細菌ＤＮＡを放出させ、
それにより該細菌ＤＮＡは、実質的に一本鎖の形態になり、
ｂ）該一本鎖ＤＮＡをプローブと接触させ、ここにプローブは、ヌクレオチド配列が、配列番号１７４、それに相補的な配列、その一部およびその変異体よりなる群から選択される少なくとも１つの一本鎖核酸よりなり、該プローブの核酸が該細菌ＤＮＡと選択的にハイブリダイズできるような条件下で、アミノグリコシドアセチルトラスフェラーゼ−ホスホトランスフェラーゼをコードする該細菌抗生物質耐性遺伝子と特異的にアニールし、それによりハイブリダイゼーション複合体が形成され、該複合体が標識手段により検出され、標識が該プローブに存在するかまたは標識が該標識手段の第１の反応性構成物に存在し、該第１の反応性構成物が該プローブに存在する第２の反応性構成物と反応し、そして
ｃ）細菌抗生物質耐性遺伝子ａａｃＡ−ａｐｈＤにより媒介されるアミノグリコシド抗生物質に対する細菌耐性の指標として、該不活性担体上、または該溶液中の該標識の存在または強度を検出すること
よりなる、直接的に検査試料からまたは細菌コロニーから細菌抗生物質耐性遺伝子ａａｃＡ−ａｐｈＤによって媒介されるアミノグリコシド抗生物質に対する細菌耐性を評価する方法。
前記プローブが、配列番号１７４とハイブリダイズする少なくとも１２ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドよりなる請求項１００記載の方法。
ａ）少なくとも１２ヌクレオチド長を示すオリゴヌクレオチドプライマーの少なくとも１対を含む水溶液で試料を処理し、ここにプライマーの１つが、標的配列を含むアミノグリコシドアセチルトランスフェラーゼ−ホスホトランスフェラーゼをコードする該細菌抗生物質耐性遺伝子の２つの相補鎖の内の１つと選択的にハイブリダイズでき、そして該プライマーの内の他方は該鎖のもう一方とハイブリダイズでき、それによって鋳型として標的配列を含む伸長産物が形成され、該プライマーの少なくとも１対は配列番号１７４で定義される配列内から選択され、
ｂ）その伸長産物が標的配列を含む該プライマーの伸長産物を合成し、該標的配列を、もしあれば、検出可能なレベルまで増幅し、そして、
ｃ）細菌抗生物質耐性遺伝子ａａｃＡ−ａｐｈＤにより媒介されるアミノグリコシド抗生物質に対する細菌耐性の指標として、該増幅標的配列の存在および／または量を検出すること
よりなる、直接的に検査試料からまたは細菌コロニーから細菌抗生物質耐性遺伝子ａａｃＡ−ａｐｈＤによって媒介されるアミノグリコシド抗生物質に対する細菌耐性を評価する方法。
ａ）試料の、またはこの試料から単離された細菌の実質的に均質な集団の細菌ＤＮＡを不活性担体に付着させそして固定する集団は溶液に遊離させるか、または、
不活性担体に該試料またはこの試料から単離された細菌の該実質的に均質な集団を接種し、そして該接種試料または単離細菌をインシトゥ溶菌して細菌ＤＮＡを放出させ、
それにより該細菌ＤＮＡは、実質的に一本鎖の形態になり、
ｂ）該一本鎖ＤＮＡをプローブと接触させ、ここにプローブは、ヌクレオチド配列が、配列番号１７５、それに相補的な配列、その一部およびその変異体よりなる群から選択される少なくとも１つの一本鎖核酸よりなり、該プローブの核酸が該細菌ＤＮＡと選択的にハイブリダイズできるような条件下で、バージニアマイシンアセチルトラスフェラーゼをコードする該細菌抗生物質耐性遺伝子と特異的にアニールし、それによりハイブリダイゼーション複合体が形成され、該複合体が標識手段により検出され、標識が該プローブに存在するかまたは標識が該標識手段の第１の反応性構成物に存在し、該第１の反応性構成物が該プローブに存在する第２の反応性構成物と反応し、そして
ｃ）細菌抗生物質耐性遺伝子ｖａｔにより媒介されるバージニアマイシンに対する細菌耐性の指標として、該不活性担体上、または該溶液中の該標識の存在または強度を検出すること
よりなる、直接的に試験試料からまたは細菌コロニーから細菌抗生物質耐性遺伝子ｖａｔによって媒介されるバージニアマイシンに対する細菌耐性を評価する方法。
前記プローブが、配列番号１７５とハイブリダイズする少なくとも１２ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドよりなる請求項１０３記載の方法。
ａ）少なくとも１２ヌクレオチド長を示すオリゴヌクレオチドプライマーの少なくとも１対を含む水溶液で該試料を処理し、ここにプライマーの１つが、標的配列を含むバージニアマイシンアセチルトランスフェラーゼをコードする該細菌抗生物質耐性遺伝子の２つの相補鎖の内の１つと選択的にハイブリダイズでき、そして該プライマーの内の他方は該鎖のもう一方とハイブリダイズでき、それによって鋳型として標的配列を含む伸長産生物が形成され、該プライマーの少なくとも１対は配列番号１７５で定義される配列内から選択され、
ｂ）その伸長産物が標的配列を含む該プライマーの伸長産物を合成し、該標的配列を、もしあれば検出可能なレベルまで増幅し、そして
ｃ）細菌抗生物質耐性遺伝子ｖａｔにより媒介されるバージニアマイシンに対する細菌耐性の指標として、該増幅標的配列の存在および／または量を検出すること、
よりなる、直接的に検査試料からまたは細菌コロニーから細菌抗生物質耐性遺伝子ｖａｔによって媒介されるバージニアマイシンに対する細菌耐性を評価する方法。
ａ）試料の、またはこの試料から単離された細菌の実質的に均質な集団の細菌ＤＮＡを不活性担体に付着させそして固定するかまたは溶液に遊離させるか、または、
不活性担体に該試料またはこの試料から単離された細菌の該実質的に均質な集団を接種し、そして該接種試料または単離細菌をインシトゥ溶菌して細菌ＤＮＡを放出させ、
それにより該細菌ＤＮＡは、実質的に一本鎖の形態になり、
ｂ）該一本鎖ＤＮＡをプローブと接触させ、ここにプローブは、ヌクレオチド配列が、配列番号１７６、それに相補的な配列、その一部およびその変異体よりなる群から選択される少なくとも１つの一本鎖核酸よりなり、該プローブの核酸が該細菌ＤＮＡと選択的にハイブリダイズできるような条件下で、ＡＴＰ−結合タンパク質をコードする該細菌抗生物質耐性遺伝子と特異的にアニールし、それによりハイブリダイゼーション複合体が形成され、該複合体が標識手段により検出され、標識が該プローブに存在するかまたは標識が該標識手段の第１の反応性構成物に存在し、該第１の反応性構成物が該プローブに存在する第２の反応性構成物と反応し、そして
ｃ）細菌抗生物質耐性遺伝子ｖｇａにより媒介されるバージニアマイシンに対する細菌耐性の指標として、該不活性担体上、または該溶液中の該標識の存在または強度を検出すること
よりなる、直接的に検査試料からまたは細菌コロニーから細菌抗生物質耐性遺伝子ｖｇａによって媒介されるバージニアマイシンに対する細菌耐性を評価する方法。
前記プローブが、配列番号１７６とハイブリダイズする少なくとも１２ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドよりなる請求項１０６記載の方法。
ａ）少なくとも１２ヌクレオチド長を示すオリゴヌクレオチドプライマーの少なくとも１対を含む水溶液で該試料を処理し、ここにプライマーの１つが、標的配列を含むＡＴＰ−結合タンパク質をコードする該細菌抗生物質耐性遺伝子の２つの相補鎖の内の１つと選択的にハイブリダイズでき、そして該プライマーの内の他方は該鎖のもう一方とハイブリダイズでき、これによって鋳型として標的配列を含む伸長産物が形成され、該プライマーの少なくとも１対は配列番号１７６で定義される配列内から選択され、
ｂ）その伸長産物が標的配列を含む該プライマーの伸長産物を合成し、該標的配列を、もしあれば、検出可能なレベルまで増幅し、そして、
ｃ）細菌抗生物質耐性遺伝子ｖｇａにより媒介されるバージニアマイシンに対する細菌耐性の指標として、該増幅標的配列の存在および／または量を検出すること
よりなる、直接的に検査試料からまたは細菌コロニーから細菌抗生物質耐性遺伝子ｖｇａによって媒介されるバージニアマイシンに対する細菌耐性を評価する方法。
ａ）試料の、またはこの試料から単離された細菌の実質的に均質な集団の細菌ＤＮＡを不活性担体に付着させそして固定するかまたは溶液に遊離させるか、または、
不活性担体に該試料またはこの試料から単離された細菌の該実質的に均質な集団を接種し、そして該接種試料または単離細菌をインシトゥ溶菌して細菌ＤＮＡを放出させ、
それにより該細菌ＤＮＡは、実質的に一本鎖の形態になり、
ｂ）該一本鎖ＤＮＡをプローブと接触させ、ここにプローブは、ヌクレオチド配列が配列番号１７７、それに相補的な配列、その一部およびその変異体よりなる群から選択される少なくとも１つの一本鎖核酸よりなり、該プローブの核酸が該細菌ＤＮＡと選択的にハイブリダイズできるような条件下で、エリスロマイシンをコードする該細菌抗生物質耐性遺伝子と特異的にアニールし、それによりハイブリダイゼーション複合体が形成され、該複合体が標識手段により検出され、標識が該プローブに存在するかまたは標識が該標識手段の第１の反応性構成物に存在し、該第１の反応性構成物が該プローブに存在する第２の反応性構成物と反応し、そして
ｃ）細菌抗生物質耐性遺伝子ｍｓｒＡにより媒介されるエリスロマイシンに対する細菌耐性の指標として、該不活性担体上、または該溶液中の該標識の存在または強度を検出すること
よりなる、直接的に検査試料からまたは細菌コロニーから細菌抗生物質耐性遺伝子ｍｓｒＡによって媒介されるエリスロマイシンに対する細菌耐性を評価する方法。
前記プローブが、配列番号１７７とハイブリダイズする少なくとも１２ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドよりなる請求項１０９記載の方法。
ａ）少なくとも１２ヌクレオチド長を示すオリゴヌクレオチドプライマーの少なくとも１対を含む水溶液で該試料を処理し、ここにプライマーの１つが、標的配列を含むエリスロマイシン耐性タンパク質をコードする該細菌抗生物質耐性遺伝子の２つの相補鎖の内の１つと選択的にハイブリダイズでき、そして該プライマーの内の他方は該鎖のもう一方とハイブリダイズでき、それによって鋳型として標的配列を含む伸長産物が形成され、該プライマーの少なくとも１対は配列番号１７７で定義される配列の範囲内から選択され、
ｂ）その伸長産物が標的配列を含む該プライマーの伸長産物を合成し、該標的配列を、もしあれば、検出可能なレベルまで増幅し、そして
ｃ）細菌抗生物質耐性遺伝子ｍｓｒＡにより媒介されるエリスロマイシンに対する細菌耐性の指標として、該増幅標的配列の存在および／または量を検出すること
よりなる、直接的に検査試料からまたは細菌コロニーから細菌抗生物質耐性遺伝子ｍｓｒＡによって媒介されるエリスロマイシンに対する細菌耐性を評価する方法。
ａ）試料の、またはこの試料から単離された細菌の実質的に均質な集団の細菌ＤＮＡを不活性担体に付着させそして固定するかまたは溶液に遊離させるか、または、
不活性担体に該試料またはこの試料から単離された細菌の該実質的に均質な集団を接種し、そして該接種試料または単離細菌をインシトゥ溶菌して細菌ＤＮＡを放出させ、
それにより該細菌ＤＮＡは、実質的に一本鎖の形態になり、
ｂ）該一本鎖ＤＮＡをプローブと接触させ、ここにプローブは、ヌクレオチド配列が配列番号１７１、それに相補的な配列、その一部およびその変異体よりなる群から選択される少なくとも１つの一本鎖核酸よりなり、該プローブの核酸が該細菌ＤＮＡと選択的にハイブリダイズできるような条件下で、インテグラーゼをコードする該細菌抗生物質耐性遺伝子と特異的にアニールし、それによりハイブリダイゼーション複合体が形成され、該複合体が標識手段により検出され、標識が該プローブに存在するかまたは標識が該標識手段の第１の反応性構成物に存在し、該第１の反応性構成物が該プローブに存在する第２の反応性構成物と反応し、そして
ｃ）細菌抗生物質耐性遺伝子ｉｎｔにより媒介されるβ−ラクタム、アミノグリコシド、クロラムフェニコールおよび／またはトリメトプリムに対する潜在的な細菌耐性の指標として、該不活性担体上、または該溶液中の該標識の存在または強度を検出すること
よりなる、直接的に検査試料からまたは細菌コロニーから細菌抗生物質耐性遺伝子ｉｎｔによって媒介されるβ−ラクタム、アミノグリコシド、クロラムフェニコールおよび／またはトリメトプリムに対する潜在的な細菌耐性を評価する方法。
前記プローブが、配列番号１７１とハイブリダイズする少なくとも１２ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドよりなる請求項１１２記載の方法。
ａ）少なくとも１２ヌクレオチド長を示すオリゴヌクレオチドプライマーの少なくとも１対を含む水溶液で該試料を処理し、ここにプライマーの１つが、標的配列を含むインテグラーゼをコードする該細菌抗生物質耐性遺伝子の２つの相補鎖の内の１つと選択的にハイブリダイズでき、そして該プライマーの内の他方は該鎖のもう一方とハイブリダイズでき、それによって鋳型として標的配列を含む伸長産物が形成され、該プライマーの少なくとも１対は配列番号１７１で定義される配列内から選択され、
ｂ）その伸長産物が標的配列を含む該プライマーの伸長産物を合成し、該標的配列を、もしあれば、検出可能なレベルまで増幅し、そして
ｃ）細菌抗生物質耐性遺伝子ｉｎｔにより媒介されるβ−ラクタム、アミノグリコシド、クロラムフェニコールおよび／またはトリメトプリムに対する潜在的な細菌耐性の指標として、該増幅標的配列の存在および／または量を検出すること、
よりなる、直接的に検査試料からまたは細菌コロニーから細菌抗生物質耐性遺伝子ｉｎｔによって媒介されるβ−ラクタム、アミノグリコシド、クロラムフェニコールおよび／またはトリメトプリムに対する潜在的な細菌耐性を評価する方法。
ａ）試料の、またはこの試料から単離された細菌の実質的に均質な集団の細菌ＤＮＡを不活性担体に付着させそして固定するかまたは溶液に遊離させるか、または、
不活性担体に該試料またはこの試料から単離された細菌の該実質的に均質な集団を接種し、そして該接種試料または単離細菌をインシトゥ溶菌して細菌ＤＮＡを放出させ、
それにより該細菌ＤＮＡは、実質的に一本鎖の形態になり、
ｂ）該一本鎖ＤＮＡをプローブと接触させ、ここにプローブは、ヌクレオチド配列が配列番号１７２、それに相補的な配列、その一部およびその変異体よりなる群から選択される少なくとも１つの一本鎖核酸よりなり、該プローブの核酸が該細菌ＤＮＡと選択的にハイブリダイズできるような条件下で、スルホンアミド耐性タンパク質をコードする該細菌抗生物質耐性遺伝子と特異的にアニールし、それによりハイブリダイゼーション複合体が形成され、該複合体が標識手段により検出され、標識が該プローブに存在するかまたは標識が該標識手段の第１の反応性構成物に存在し、該第１の反応性構成物が該プローブに存在する第２の反応性構成物と反応し、そして
ｃ）細菌抗生物質耐性遺伝子ｓｕｌにより媒介されるβ−ラクタム、アミノグリコシド、クロラムフェニコールおよび／またはトリメトプリムに対する潜在的な細菌耐性の指標として、該不活性担体上、または該溶液中の該標識の存在または強度を検出すること
よりなる、直接的に検査試料からまたは細菌コロニーから細菌抗生物質耐性遺伝子ｓｕｌによって媒介されるβ−ラクタム、アミノグリコシド、クロラムフェニコールおよび／またはトリメトプリムに対する潜在的な細菌耐性を評価する方法。
前記プローブが、配列番号１７２とハイブリダイズする少なくとも１２ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドよりなる請求項１１５記載の方法。
ａ）少なくとも１２ヌクレオチド長を示すオリゴヌクレオチドプライマーの少なくとも１対を含む水溶液で該試料を処理し、ここにプライマーの１つが、標的配列を含むスルホンアミド耐性タンパク質をコードする該細菌抗生物質耐性遺伝子の２つの相補鎖の内の１つと選択的にハイブリダイズでき、そして該プライマーの内の他方は該鎖のもう一方とハイブリダイズでき、それによって鋳型として標的配列を含む伸長産物が形成され、該少なくとも１対のプライマーが配列番号１７２で定義される配列内から選択され、
ｂ）その伸長産物が標的配列を含む該プライマーの伸長産物を合成し、該標的配列を、もしあれば、検出可能なレベルまで増幅し、そして
ｃ）細菌抗生物質耐性遺伝子ｓｕｌにより媒介されるβ−ラクタム、アミノグリコシド、クロラムフェニコールおよび／またはトリメトプリムに対する潜在的な細菌耐性の指標として、該増幅標的配列の存在および／または量を検出すること、
よりなる、直接的に検査試料からまたは細菌コロニーから細菌抗生物質耐性遺伝子ｓｕｌによって媒介されるβ−ラクタム、アミノグリコシド、クロラムフェニコールおよび／またはトリメトプリムに対する潜在的な細菌耐性を評価する方法。
前記プローブが、配列番号１〜３７、配列番号１６１〜１７７、それらの一部およびそれらの変異体のいずれかの１つのヌクレオチド配列を示し、一本鎖である場合にプローブまたはプライマーとして標的細菌ＤＮＡと偏在的にそして特異的にハイブリダイズする核酸。
配列番号３８〜１６０のいずれか１つのヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチド。
請求項１１８記載の核酸を含有する組換えプラスミド。
請求項１２０記載の組換えプラスミドにより形質転換された組換え宿主。
前記宿主が大腸菌である請求項１２１記載の組換え宿主。
請求項９、１４、１９、２４、２９、３４、３９、４３、４７、５２、５７および６１のいずれかに記載の細菌種の任意の組合せの核酸の検出および／または定量のための診断用キットであって、上記請求項に定義のプローブの任意の組み合わせを含むキット。
請求項１０、１１、１５、１６、２０、２１、２５、２６、３０、３１、３５、３６、４０、４４、４８、４９、５３、５４、５８、６２および６５のいずれかに記載の細菌種の任意の組合せの核酸の検出および／または定量のための診断用キットであって、上記請求項に定義のオリゴヌクレオチドプローブの任意の組み合わせを含むキット。
請求項１２、１３、１７、１８、２２、２３、２７、２８、３２、３３、３７、３８、４１、４２、４５、４６、５０、５１、５５、５６、５９、６０、６３、６４および６６のいずれかに記載の細菌種の任意の組合せの核酸の検出および／または定量のための診断用キットであって、上記請求項に定義のプライマーの任意の組み合わせを含むキット。
請求項６７、７０、７３、７６、７９、８２、８５、８８、９１、９４、９７、１００、１０３、１０６および１０９のいずれかに記載の細菌種の任意の組合せの核酸の検出および／または定量のための診断用キットであって、上記請求項に定義のプローブの任意の組み合わせを含むキット。
請求項６８、７１、７４、７７、８０、８３、８６、８９、９２、９５、９８、１０１、１０４、１０７および１１０のいずれかに記載の細菌種の任意の組合せの核酸の検出および／または定量のための診断用キットであって、上記請求項に定義のオリゴヌクレオチドプローブの任意の組み合わせを含むキット。
請求項６９、７２、７５、７８、８１、８４、８７、９０、９３、９６、９９、１０２、１０５、１０８および１１１のいずれかに記載の細菌種の任意の組合せの核酸の検出および／または定量のための診断用キットであって、上記請求項に定義のプライマーのいずれかの組み合わせを含むキット。
請求項１２３に定義される細菌プローブの任意の組み合わせと、全部または一部で配列番号１６１〜１７１のいずれかに記載の抗生物質耐性遺伝子に対するプローブの任意の組み合わせとを含む、請求項１２３記載の細菌種の任意の組み合わせの核酸の同時検出および定量のための診断用キット。
請求項１２４に定義される細菌オリゴヌクレオチドプローブの任意の組み合わせと、配列番号１６１〜１７７のいずれかに記載の抗生物質耐性遺伝子とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプローブの任意の組み合わせとを含む、請求項１２４記載の細菌種の任意の組み合わせの核酸の同時検出および定量のための診断用キット。
請求項１２５に定義されるプライマーの任意の組み合わせと、配列番号１６１〜１７７のいずれかに記載の抗生物質耐性遺伝子にアニールするプライマーの任意の組み合わせとを含む、請求項１２５記載の細菌種の任意の組み合わせの核酸の同時検出および定量のための診断用キット。