JP2003519383A - アミロイド形成性タンパクの検出方法 - Google Patents
アミロイド形成性タンパクの検出方法Info
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Abstract
(57)【要約】
アミロイド特異的な分光学的プローブ、例えば、コンゴレッドおよび関連する類似体を用いて、様々な凝集形態のアミロイドペプチドを検出する方法/アッセイが記載されている。かかるアッセイは、線維形成の他の可能性のある阻害薬の存在下で、ペプチドの凝集状態を評価するのに用いることができたが、これはインビトロモデルにおいて凝集の阻害薬を試験するための有用なモデルを提供する。かかるアッセイの結果は、ニューロン細胞に対するアミロイドペプチドの毒性を減少させるように凝集の過程を妨害することができる段階を決定するのに有用であり得る。具体的な例では、β-アミロイドペプチドの凝集形態を評価するのに、円偏光二色性、ＵＶ吸収および蛍光分光学が各々用いられる。
Description
【０００１】
（技術分野）
本発明は、凝集形態のアミロイドポリペプチドを評価する方法に関する。さら
に、本発明は、アミロイドーシスに関連する疾患または障害、例えば、アルツハ
イマー病の新しい治療法を開発するために、可能性のあるアミロイドーシス阻害
薬をインビトロまたはインビボで試験する方法に関する。
に、本発明は、アミロイドーシスに関連する疾患または障害、例えば、アルツハ
イマー病の新しい治療法を開発するために、可能性のあるアミロイドーシス阻害
薬をインビトロまたはインビボで試験する方法に関する。
【０００２】
（背景技術）
アルツハイマー病は、神経細胞の周囲に沈着した脳アミロイドプラークの存在
により特徴付けられる。脳アミロイドプラークは、結果的に、脳の正常な過程を
侵食し、破壊する。かかるプラークの１次タンパク成分は、β-アミロイドタン
パク(Ａβ)の３９〜４３残基アイソフォームの凝集形態である。アルツハイマー
病の主要な病因事象は、脳の実質組織および血管構造におけるこれら線維アミロ
イドプラークの形成である。これらアミロイドポリペプチドの線維凝集体の沈着
は、培養したニューロン細胞に毒性であるクロス-β-シートコンホンメーション
からなる巨大分子構造へのポリペプチドの自己集合によるものであることが示さ
れている。
により特徴付けられる。脳アミロイドプラークは、結果的に、脳の正常な過程を
侵食し、破壊する。かかるプラークの１次タンパク成分は、β-アミロイドタン
パク(Ａβ)の３９〜４３残基アイソフォームの凝集形態である。アルツハイマー
病の主要な病因事象は、脳の実質組織および血管構造におけるこれら線維アミロ
イドプラークの形成である。これらアミロイドポリペプチドの線維凝集体の沈着
は、培養したニューロン細胞に毒性であるクロス-β-シートコンホンメーション
からなる巨大分子構造へのポリペプチドの自己集合によるものであることが示さ
れている。
【０００３】
アルツハイマー病を治療することの目標は、凝集体の形成を予防するか、およ
び/または、タンパクの毒性効果を逆転するために、この疾患が診断された後に
、凝集体形成の阻害薬を治療的に投与することである。巨大分子凝集体の形成を
妨害する薬剤は、かくして細胞毒性を阻害するのに有効に作用することができ、
また、それらは抗アルツハイマー薬として有効に作用することができるので、医
薬的に興味深い。凝集阻害薬であると報告されているいくつかの小さい分子の中
で、コンゴレッド、すなわちビフェニルジアゾスルホン化色素は、神経保護化合
物であると報告されている(ポラック(Pollack)ら、ニューロサイエンス・レター
ズ(Neurosci. Lett.),1995,197:211-214；ロレンツォ(Lorenzo)ら、プロシーデ
ィングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・オブ・ザ
・ユナイテッド・ステイツ・オブ・アメリカ(Proc. Natl. Acad. Sci. USA),199
4,91:12243-12247；およびバージュヴァン(Burgevin)ら、ニューロ・リポート(N
euro Report),1994,5:2429-2432)。ＰＣＴ出願PCT/US93/06637(「'637出願」)は、
アミロイド形成性疾患、その中でもアルツハイマー病を治療するためのコンゴレ
ッドおよびその医薬上許容される塩またはその誘導体の使用を記載している。コ
ンゴレッドは、報告されている所によれば、アミロイドーシスを妨害するか、ま
たはすでに形成されたアミロイド構造を不安定化させる。これらの性質は、アミ
ロイド形成性タンパクがプラーク状に沈着することに関連する症状を治療するた
めにコンゴレッドを投与することを主張する'637出願の基礎を確立する。治療薬
としてのコンゴレッドは、アミロイド形成性タンパクの形成を妨害するのに、ま
たは、すでに形成されたアミロイドの不安定化に十分な量でインビボで投与すれ
ばよい。かくして、コンゴレッドは、報告されている所によれば、アミロイドプ
ラークに結合するだけでなく、アミロイド形成性タンパクの蓄積を阻害すること
もできる。
び/または、タンパクの毒性効果を逆転するために、この疾患が診断された後に
、凝集体形成の阻害薬を治療的に投与することである。巨大分子凝集体の形成を
妨害する薬剤は、かくして細胞毒性を阻害するのに有効に作用することができ、
また、それらは抗アルツハイマー薬として有効に作用することができるので、医
薬的に興味深い。凝集阻害薬であると報告されているいくつかの小さい分子の中
で、コンゴレッド、すなわちビフェニルジアゾスルホン化色素は、神経保護化合
物であると報告されている(ポラック(Pollack)ら、ニューロサイエンス・レター
ズ(Neurosci. Lett.),1995,197:211-214；ロレンツォ(Lorenzo)ら、プロシーデ
ィングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・オブ・ザ
・ユナイテッド・ステイツ・オブ・アメリカ(Proc. Natl. Acad. Sci. USA),199
4,91:12243-12247；およびバージュヴァン(Burgevin)ら、ニューロ・リポート(N
euro Report),1994,5:2429-2432)。ＰＣＴ出願PCT/US93/06637(「'637出願」)は、
アミロイド形成性疾患、その中でもアルツハイマー病を治療するためのコンゴレ
ッドおよびその医薬上許容される塩またはその誘導体の使用を記載している。コ
ンゴレッドは、報告されている所によれば、アミロイドーシスを妨害するか、ま
たはすでに形成されたアミロイド構造を不安定化させる。これらの性質は、アミ
ロイド形成性タンパクがプラーク状に沈着することに関連する症状を治療するた
めにコンゴレッドを投与することを主張する'637出願の基礎を確立する。治療薬
としてのコンゴレッドは、アミロイド形成性タンパクの形成を妨害するのに、ま
たは、すでに形成されたアミロイドの不安定化に十分な量でインビボで投与すれ
ばよい。かくして、コンゴレッドは、報告されている所によれば、アミロイドプ
ラークに結合するだけでなく、アミロイド形成性タンパクの蓄積を阻害すること
もできる。
【０００４】
アルツハイマー病の可能な治療としてのコンゴレッドの価値および有効性は、
コンゴレッドが血液脳関門を通過することができないので、さらに実験を必要と
する。コンゴレッドの誘導体、類似体、塩などは、β-アミロイドペプチドに対
してコンゴレッドと同じ作用様式を有しうる、すなわち、かかる誘導体も神経保
護的でありうる。
コンゴレッドが血液脳関門を通過することができないので、さらに実験を必要と
する。コンゴレッドの誘導体、類似体、塩などは、β-アミロイドペプチドに対
してコンゴレッドと同じ作用様式を有しうる、すなわち、かかる誘導体も神経保
護的でありうる。
【０００５】
現在のところ、抗体に基づく方法およびチオフラビンＴを用いる蛍光法が抗ア
ルツハイマー薬をスクリーニングする凝集ペプチドを検出するのに用いられつつ
ある。蛍光相関分光法は、アミロイドペプチドの重合を測定するのに用いられて
いる(チェルンベルグ(Tjernberg)ら、ケミストリー・アンド・バイオロジー(Che
mistry & Biology),1999,6:53-62)。しかし、これらの技術は様々なコンホメー
ション形態の凝集ポリペプチドを区別しない。
ルツハイマー薬をスクリーニングする凝集ペプチドを検出するのに用いられつつ
ある。蛍光相関分光法は、アミロイドペプチドの重合を測定するのに用いられて
いる(チェルンベルグ(Tjernberg)ら、ケミストリー・アンド・バイオロジー(Che
mistry & Biology),1999,6:53-62)。しかし、これらの技術は様々なコンホメー
ション形態の凝集ポリペプチドを区別しない。
【０００６】
別のコンホメーション形態の凝集アミロイドポリペプチドを検出するアッセイ
は、従来技術には開示されていない。かかるアッセイは、特に線維形成の阻害薬
の存在下で、ポリペプチドの凝集状態を迅速に評価するのに用いることができる
。
は、従来技術には開示されていない。かかるアッセイは、特に線維形成の阻害薬
の存在下で、ポリペプチドの凝集状態を迅速に評価するのに用いることができる
。
【０００７】
かくして、アミロイドーシスおよびアミロイドプラークを調べる方法が当該分
野で必要とされている。今度は、アミロイド形成性タンパクがアルツハイマー病
を引き起こす過程を研究する必要性に向かうことになる。特に、アミロイドポリ
ペプチドの凝集体のコンホメーションおよび凝集状態を特徴付け、かつ、特にア
ルツハイマー病において、可能性のあるアミロイドーシス阻害薬の効果を区別す
る生物物理学的および分析的な方法を含むアッセイを開発する必要がある。アル
ツハイマー病における毒性凝集体の性質および脳におけるこれら凝集体の形成メ
カニズムについては、ほとんど知られていないので、可能性のある阻害薬がイン
ビトロ試験系で所望の効果を生ずるかどうかを決定するには、アッセイの組合せ
が必要である。また、血漿または脳脊髄液などの体液中におけるアミロイドポリ
ペプチドのコンホメーションに対する試験化合物の効果を測定するアッセイも必
要とされる。
野で必要とされている。今度は、アミロイド形成性タンパクがアルツハイマー病
を引き起こす過程を研究する必要性に向かうことになる。特に、アミロイドポリ
ペプチドの凝集体のコンホメーションおよび凝集状態を特徴付け、かつ、特にア
ルツハイマー病において、可能性のあるアミロイドーシス阻害薬の効果を区別す
る生物物理学的および分析的な方法を含むアッセイを開発する必要がある。アル
ツハイマー病における毒性凝集体の性質および脳におけるこれら凝集体の形成メ
カニズムについては、ほとんど知られていないので、可能性のある阻害薬がイン
ビトロ試験系で所望の効果を生ずるかどうかを決定するには、アッセイの組合せ
が必要である。また、血漿または脳脊髄液などの体液中におけるアミロイドポリ
ペプチドのコンホメーションに対する試験化合物の効果を測定するアッセイも必
要とされる。
【０００８】
（発明の開示）
本発明は、様々な凝集形態のアミロイドポリペプチドを、例えば、アミロイド
特異的な色素、例えば、コンゴレッドおよび他の関連する類似体、または発蛍光
団標識したアミロイドペプチドを用いて、検出する方法に関する。これらの方法
は、ポリペプチドの凝集状態を測定するのに、ならびに、凝集の調節物質をイン
ビトロモデルで試験するのに有用である。この方法は、凝集の過程における妨害
が毒性、例えば、ニューロン細胞に対するＡβペプチドを減少させる段階を決定
するのに用いることができる。また、これらの方法は、アミロイドーシスまたは
他の関連する疾患の治療的または予防的な処置のための阻害薬または抗アルツハ
イマー薬の効果を決定するのに用いることができる。
特異的な色素、例えば、コンゴレッドおよび他の関連する類似体、または発蛍光
団標識したアミロイドペプチドを用いて、検出する方法に関する。これらの方法
は、ポリペプチドの凝集状態を測定するのに、ならびに、凝集の調節物質をイン
ビトロモデルで試験するのに有用である。この方法は、凝集の過程における妨害
が毒性、例えば、ニューロン細胞に対するＡβペプチドを減少させる段階を決定
するのに用いることができる。また、これらの方法は、アミロイドーシスまたは
他の関連する疾患の治療的または予防的な処置のための阻害薬または抗アルツハ
イマー薬の効果を決定するのに用いることができる。
【０００９】
かくして、ある態様では、本発明は、アミロイドポリペプチドの凝集コンホメ
ーションを測定する方法を提供する。この方法は、ポリペプチドの凝集を可能に
する条件下でアミロイドポリペプチドと接触させたアミロイド特異的な分光学的
プローブ、例えば、スルホン化ジアゾ色素または発蛍光団標識したアミロイドペ
プチドの複合体の分光学的な性質を、アミロイド特異的なプローブと公知のコン
ホメーションを有する凝集アミロイドポリペプチドとの複合体の予め測定された
分光学的な性質と相関させることからなる。
ーションを測定する方法を提供する。この方法は、ポリペプチドの凝集を可能に
する条件下でアミロイドポリペプチドと接触させたアミロイド特異的な分光学的
プローブ、例えば、スルホン化ジアゾ色素または発蛍光団標識したアミロイドペ
プチドの複合体の分光学的な性質を、アミロイド特異的なプローブと公知のコン
ホメーションを有する凝集アミロイドポリペプチドとの複合体の予め測定された
分光学的な性質と相関させることからなる。
【００１０】
さらなる態様では、本発明は、アミロイド形成の阻害、破壊または分離につい
て試験化合物の効果を検出する方法を提供する。この方法は、(ａ)ポリペプチド
の凝集を可能にする条件下でアミロイドポリペプチドおよび試験化合物と接触さ
せたアミロイド特異的な分光学的プローブ、例えば、スルホン化ジアゾ色素また
は発蛍光団標識したアミロイドペプチドの複合体および(ｂ)凝集を可能にする条
件下でアミロイドポリペプチドと接触させたアミロイド特異的な分光学的プロー
ブの複合体(対照)の分光学的な性質を相関させることからなる。分光学的プロー
ブは、凝集前に、または、それがアミロイド特異的な色素であれば、凝集後に、
試料と接触させることができる。分光学的プローブが発蛍光団標識したペプチド
であれば、アミロイドポリペプチドと凝集することを可能にされる必要がある。
試験化合物は、凝集前または凝集後に加えることができる。分光学的な性質の差
は、試験化合物がアミロイド形成に対する効果を有することを示す。
て試験化合物の効果を検出する方法を提供する。この方法は、(ａ)ポリペプチド
の凝集を可能にする条件下でアミロイドポリペプチドおよび試験化合物と接触さ
せたアミロイド特異的な分光学的プローブ、例えば、スルホン化ジアゾ色素また
は発蛍光団標識したアミロイドペプチドの複合体および(ｂ)凝集を可能にする条
件下でアミロイドポリペプチドと接触させたアミロイド特異的な分光学的プロー
ブの複合体(対照)の分光学的な性質を相関させることからなる。分光学的プロー
ブは、凝集前に、または、それがアミロイド特異的な色素であれば、凝集後に、
試料と接触させることができる。分光学的プローブが発蛍光団標識したペプチド
であれば、アミロイドポリペプチドと凝集することを可能にされる必要がある。
試験化合物は、凝集前または凝集後に加えることができる。分光学的な性質の差
は、試験化合物がアミロイド形成に対する効果を有することを示す。
【００１１】
本発明のこれらの態様および他の態様は、図面、発明の詳細な説明および実施
例を参照することにより、より良く理解される。
例を参照することにより、より良く理解される。
【００１２】
本発明は、様々な凝集形態のアミロイドポリペプチドにおけるコンホメーショ
ンの差を検出するのに用いることができるアッセイを記載する。本発明は、部分
的には、凝集に対するコンゴレッド、すなわち蛍光性のアミロイド特異的な分光
学的プローブの効果の観察に基づいている。効果は、コンゴレッドを、ある実験
では、凝集の開始点でアミロイドポリペプチド(Ａβペプチド)溶液に、また、別
の実験では、予め形成された凝集体に加えることにより測定される。コンゴレッ
ドは、インビトロで、βアミロイドと少なくとも２つの明確な複合体を形成する
ことが見出された。ペプチドがβシートに凝集する前にＡβペプチドと結合した
コンゴレッドは、それがすでにβシートに凝集した後にＡβペプチド(いわゆる
線維ペプチド)と結合した場合と異なるスペクトルの性質を有した。コンゴレッ
ドは、Ａβペプチドの線維凝集体の形成を防止するように作用し、また、すでに
凝集したペプチドの毒性効果を減少させた。得られた共凝集体の複合体および線
維形態を有するコンゴレッド複合体は、両方の場合に、分光学的な分析により異
なることが示されたが、ペプチドの毒性効果はコンゴレッドの付加により減少さ
れた。
ンの差を検出するのに用いることができるアッセイを記載する。本発明は、部分
的には、凝集に対するコンゴレッド、すなわち蛍光性のアミロイド特異的な分光
学的プローブの効果の観察に基づいている。効果は、コンゴレッドを、ある実験
では、凝集の開始点でアミロイドポリペプチド(Ａβペプチド)溶液に、また、別
の実験では、予め形成された凝集体に加えることにより測定される。コンゴレッ
ドは、インビトロで、βアミロイドと少なくとも２つの明確な複合体を形成する
ことが見出された。ペプチドがβシートに凝集する前にＡβペプチドと結合した
コンゴレッドは、それがすでにβシートに凝集した後にＡβペプチド(いわゆる
線維ペプチド)と結合した場合と異なるスペクトルの性質を有した。コンゴレッ
ドは、Ａβペプチドの線維凝集体の形成を防止するように作用し、また、すでに
凝集したペプチドの毒性効果を減少させた。得られた共凝集体の複合体および線
維形態を有するコンゴレッド複合体は、両方の場合に、分光学的な分析により異
なることが示されたが、ペプチドの毒性効果はコンゴレッドの付加により減少さ
れた。
【００１３】
実験結果は、毒性の減少をもたらす分子メカニズムが２つの場合で有意に異な
ることを示す。これらの結果の応用は、凝集過程における妨害が、例えば、神経
細胞に対する毒性を最適に減少させる段階の決定を容易にする。また、これらの
方法は、原型の小さい阻害薬分子と結合している異なるポリペプチドから生じる
様々なタンパク複合体を同定するのに用いることができる。可能性のある線維形
成阻害薬の存在下でアミロイドポリペプチドの凝集状態を迅速に評価するのに用
いることができるアッセイが記載されている。
ることを示す。これらの結果の応用は、凝集過程における妨害が、例えば、神経
細胞に対する毒性を最適に減少させる段階の決定を容易にする。また、これらの
方法は、原型の小さい阻害薬分子と結合している異なるポリペプチドから生じる
様々なタンパク複合体を同定するのに用いることができる。可能性のある線維形
成阻害薬の存在下でアミロイドポリペプチドの凝集状態を迅速に評価するのに用
いることができるアッセイが記載されている。
【００１４】
Ａβペプチドは毒性を媒介することが知られ、アルツハイマー病におけるニュ
ーロン細胞死に関与していると考えられる。現在のところ、Ａβペプチドの神経
毒性を媒介するタンパクを同定するのに非常に大きな興味が存在する。ここに記
載する方法は、凝集形態のＡβペプチドとタンパクとの相互作用を特徴付け、ま
た、可能性のある試験化合物が相互作用を破壊するかどうかを決定するのに用い
ることができる。また、これらの方法の適用は、アルツハイマー病の分子メカニ
ズムに付加的な洞察を与え、これは現在のところ神経変性における薬物発見の努
力の基礎である。これらの発見は、他のアミロイドポリペプチドを同様に評価す
るのに適用することができる。
ーロン細胞死に関与していると考えられる。現在のところ、Ａβペプチドの神経
毒性を媒介するタンパクを同定するのに非常に大きな興味が存在する。ここに記
載する方法は、凝集形態のＡβペプチドとタンパクとの相互作用を特徴付け、ま
た、可能性のある試験化合物が相互作用を破壊するかどうかを決定するのに用い
ることができる。また、これらの方法の適用は、アルツハイマー病の分子メカニ
ズムに付加的な洞察を与え、これは現在のところ神経変性における薬物発見の努
力の基礎である。これらの発見は、他のアミロイドポリペプチドを同様に評価す
るのに適用することができる。
【００１５】
コンゴレッドの存在下および非存在下におけるポリペプチドの凝集の程度を測
定するツールとして、３つの異なる技術が提供された。また、阻害薬がアミロイ
ドポリペプチドの自己集合に対して有する効果および細胞毒性に対する同時の効
果を調べた。
定するツールとして、３つの異なる技術が提供された。また、阻害薬がアミロイ
ドポリペプチドの自己集合に対して有する効果および細胞毒性に対する同時の効
果を調べた。
【００１６】
１．コンゴレッドの存在下または非存在下でエイジングしたアミロイドポリペ
プチドのコンホメーションを同定および区別するのに、円偏光二色性(ＣＤ)分光
学が提供された。この方法は、遠紫外領域におけるアミロイドポリペプチドおよ
び近紫外領域におけるコンゴレッドのＣＤ吸収の変化に基づいている。凝集体-
複合体の遠紫外および近紫外スペクトルの両方がスキャンされた。遠紫外ＣＤス
ペクトルは、アミロイドポリペプチドの２次構造を測定するのに有用であった。
近紫外ＣＤスペクトルは、コンゴレッド複合体を区別するのに有用であった。緩
衝液中、コンゴレッドの非存在下におけるアミロイドポリペプチド単独は、近紫
外領域に認めうるほどのＣＤ吸収シグナルを生じなかった。コンゴレッドは、自
由な状態では固有のＣＤスペクトルを有しないので、アミロイドタンパクに結合
することにより誘発されるスペクトル変化は、様々な形態のアミロイド形成性タ
ンパクを同定するのに有用である。誘発されたＣＤ吸収効果は、コンゴレッドと
アミロイドポリペプチドとの共凝集体およびコンゴレッドと予め形成された凝集
体または線維形態のポリペプチドとの複合体では明確に異なる。特定の理論によ
り拘束されることを意図しないが、コンゴレッドの近紫外ＣＤスペクトルの変化
は、整列した線維形態のタンパクに結合することによるキラルな環境の誘発によ
るものであると考えられる。
プチドのコンホメーションを同定および区別するのに、円偏光二色性(ＣＤ)分光
学が提供された。この方法は、遠紫外領域におけるアミロイドポリペプチドおよ
び近紫外領域におけるコンゴレッドのＣＤ吸収の変化に基づいている。凝集体-
複合体の遠紫外および近紫外スペクトルの両方がスキャンされた。遠紫外ＣＤス
ペクトルは、アミロイドポリペプチドの２次構造を測定するのに有用であった。
近紫外ＣＤスペクトルは、コンゴレッド複合体を区別するのに有用であった。緩
衝液中、コンゴレッドの非存在下におけるアミロイドポリペプチド単独は、近紫
外領域に認めうるほどのＣＤ吸収シグナルを生じなかった。コンゴレッドは、自
由な状態では固有のＣＤスペクトルを有しないので、アミロイドタンパクに結合
することにより誘発されるスペクトル変化は、様々な形態のアミロイド形成性タ
ンパクを同定するのに有用である。誘発されたＣＤ吸収効果は、コンゴレッドと
アミロイドポリペプチドとの共凝集体およびコンゴレッドと予め形成された凝集
体または線維形態のポリペプチドとの複合体では明確に異なる。特定の理論によ
り拘束されることを意図しないが、コンゴレッドの近紫外ＣＤスペクトルの変化
は、整列した線維形態のタンパクに結合することによるキラルな環境の誘発によ
るものであると考えられる。
【００１７】
(アミロイドポリペプチドとコンゴレッドとの)共凝集体の近紫外ＣＤスペクト
ルは、コンゴレッドと接触させた予め形成された線維複合体のそれとは有意に異
なることが示された。複合体のスペクトルにおいて観察された差は、コンゴレッ
ドの異なる複合体化状態の形成によるものであった。予め形成された線維の励起
子結合ＣＤスペクトルがコンゴレッドとペプチドの整列したβシートコンホメー
ションとの複合体化(すなわち、ねじれβシート構造の形成による；ウッディ，
アール・ダブリュー(Woody, R.W.)、「ザ・サーキュラー・ダイクロイズム・オブ
・バイオポリマーズ(The Circular Dichroism of Biopolymers)」、プロシーディ
ングズ・オブ・エフ・イー・シー・エス・インターナショナル・カンファレンス
・オブ・サーキュラー・ダイクロイズム(Proc. F.E.C.S. Int. Conf. Dichroism
)、1987年(開催年1985年)、第270-295頁)を示すのに対し、共凝集体のスペクト
ルはコンゴレッドと中間凝集構造との複合体化に一致した。
ルは、コンゴレッドと接触させた予め形成された線維複合体のそれとは有意に異
なることが示された。複合体のスペクトルにおいて観察された差は、コンゴレッ
ドの異なる複合体化状態の形成によるものであった。予め形成された線維の励起
子結合ＣＤスペクトルがコンゴレッドとペプチドの整列したβシートコンホメー
ションとの複合体化(すなわち、ねじれβシート構造の形成による；ウッディ，
アール・ダブリュー(Woody, R.W.)、「ザ・サーキュラー・ダイクロイズム・オブ
・バイオポリマーズ(The Circular Dichroism of Biopolymers)」、プロシーディ
ングズ・オブ・エフ・イー・シー・エス・インターナショナル・カンファレンス
・オブ・サーキュラー・ダイクロイズム(Proc. F.E.C.S. Int. Conf. Dichroism
)、1987年(開催年1985年)、第270-295頁)を示すのに対し、共凝集体のスペクト
ルはコンゴレッドと中間凝集構造との複合体化に一致した。
【００１８】
凝集アミロイドポリペプチドのＣＤスペクトルを様々な時点でスキャンして、
チオフラビンに結合する巨大分子集合体(凝集体)の形成をβシートコンホメーシ
ョンの出現と相関させた。チオフラビン(ＴｈＴ)結合を用いる蛍光分光学を用い
て、ポリペプチドにおけるβシート形成を確認した。チオフラビンによる誘発さ
れた蛍光は、アミロイドβひだ折れ線維に特異的であるが、他のβシート構造ま
たは可溶性オリゴマー形態のポリペプチドには特異的でない。
チオフラビンに結合する巨大分子集合体(凝集体)の形成をβシートコンホメーシ
ョンの出現と相関させた。チオフラビン(ＴｈＴ)結合を用いる蛍光分光学を用い
て、ポリペプチドにおけるβシート形成を確認した。チオフラビンによる誘発さ
れた蛍光は、アミロイドβひだ折れ線維に特異的であるが、他のβシート構造ま
たは可溶性オリゴマー形態のポリペプチドには特異的でない。
【００１９】
２．ＵＶ分光学は、予め形成された線維および共凝集体の２つの複合体のコン
ゴレッド吸収スペクトルを区別するのに用いた。アミロイドポリペプチドの存在
下および非存在下におけるコンゴレッドの吸収スペクトルの変化を、線維、非線
維および他の別形態の複合体に結合することによるコンゴレッドの環境の変化と
して測定する。
ゴレッド吸収スペクトルを区別するのに用いた。アミロイドポリペプチドの存在
下および非存在下におけるコンゴレッドの吸収スペクトルの変化を、線維、非線
維および他の別形態の複合体に結合することによるコンゴレッドの環境の変化と
して測定する。
【００２０】
３．蛍光分光学は、コンゴレッドの複合体を区別するのに用いた。コンゴレッ
ドは、予め形成された線維に結合するだけでなく、中間凝集形態のアミロイドポ
リペプチドに結合する。コンゴレッドの固有の蛍光は、それが凝集形態に結合し
た場合に有意に増強される。また、凝集体結合状態におけるコンゴレッドの蛍光
励起スペクトルは、遊離形態のポリペプチドに対してレッドシフトする。コンゴ
レッドの蛍光の性質の変化は、コンゴレッドの凝集状態に依存する。共凝集体お
よび線維ポリペプチドとコンゴレッドとの複合体の観察されたスペクトルの特徴
の差は、予め形成された線維および共凝集体との複合体における結合部位の相対
的な疎水性の差および結合したコンゴレッド分子の数によるものである。
ドは、予め形成された線維に結合するだけでなく、中間凝集形態のアミロイドポ
リペプチドに結合する。コンゴレッドの固有の蛍光は、それが凝集形態に結合し
た場合に有意に増強される。また、凝集体結合状態におけるコンゴレッドの蛍光
励起スペクトルは、遊離形態のポリペプチドに対してレッドシフトする。コンゴ
レッドの蛍光の性質の変化は、コンゴレッドの凝集状態に依存する。共凝集体お
よび線維ポリペプチドとコンゴレッドとの複合体の観察されたスペクトルの特徴
の差は、予め形成された線維および共凝集体との複合体における結合部位の相対
的な疎水性の差および結合したコンゴレッド分子の数によるものである。
【００２１】
本発明においては、コンゴレッドは、アミロイドポリペプチドと共凝集した場
合、βシートコンホメーションにある安定な中間体の形成を促進することが示さ
れている。コンゴレッドは予め形成された線維を結合するだけでなく、中間凝集
形態のアミロイドポリペプチドを結合するが、ランダムコイル状態のポリペプチ
ドとの相互作用に関する証拠は存在しない。結果はアミロイドポリペプチドと共
凝集した場合のコンゴレッドの蛍光スペクトルが遊離形態に対して８倍に増強さ
れることを示している。また、予め形成された線維は、コンゴレッドに結合する
ことが示されているが、予め形成された線維とコンゴレッドとの間の複合体の蛍
光増強は、遊離形態のコンゴレッドに対して２倍に増強されるだけである。かく
して、蛍光技術を用いて、本研究はコンゴレッドがβアミロイドタンパク１-４
０と２通りの相互作用の様式を有することを示す。Ａβ39-43アイソフォームは
ランダムコイルからβシート形態に転換するので、コンゴレッドの相互作用は、
すべてのアイソフォームのＡβペプチドについて同様であるはずである。
合、βシートコンホメーションにある安定な中間体の形成を促進することが示さ
れている。コンゴレッドは予め形成された線維を結合するだけでなく、中間凝集
形態のアミロイドポリペプチドを結合するが、ランダムコイル状態のポリペプチ
ドとの相互作用に関する証拠は存在しない。結果はアミロイドポリペプチドと共
凝集した場合のコンゴレッドの蛍光スペクトルが遊離形態に対して８倍に増強さ
れることを示している。また、予め形成された線維は、コンゴレッドに結合する
ことが示されているが、予め形成された線維とコンゴレッドとの間の複合体の蛍
光増強は、遊離形態のコンゴレッドに対して２倍に増強されるだけである。かく
して、蛍光技術を用いて、本研究はコンゴレッドがβアミロイドタンパク１-４
０と２通りの相互作用の様式を有することを示す。Ａβ39-43アイソフォームは
ランダムコイルからβシート形態に転換するので、コンゴレッドの相互作用は、
すべてのアイソフォームのＡβペプチドについて同様であるはずである。
【００２２】
本発明に記載する分光学的な結果は、コンゴレッドなどの阻害薬がアミロイド
ポリペプチドと少なくとも２つの明確な複合体を形成することを示している。予
め形成された線維および共凝集体の両方は、コンゴレッドに結合した場合に大き
い分子量の物質(およそ５０ｋＤまたはそれ以上)を形成することが示されている
。コンゴレッドはＡβペプチドの中間凝集体に結合し、それゆえ、線維ペプチド
の毒性を弱めるが、共凝集体における「不溶性」複合体の形成は依然として起こ
ることができ、このことは、凝集に対してかかる効果を生じる試験化合物がアル
ツハイマー病における治療的または予防的な作用に対するそれらの適性に関して
調べる必要があることを示唆している。
ポリペプチドと少なくとも２つの明確な複合体を形成することを示している。予
め形成された線維および共凝集体の両方は、コンゴレッドに結合した場合に大き
い分子量の物質(およそ５０ｋＤまたはそれ以上)を形成することが示されている
。コンゴレッドはＡβペプチドの中間凝集体に結合し、それゆえ、線維ペプチド
の毒性を弱めるが、共凝集体における「不溶性」複合体の形成は依然として起こ
ることができ、このことは、凝集に対してかかる効果を生じる試験化合物がアル
ツハイマー病における治療的または予防的な作用に対するそれらの適性に関して
調べる必要があることを示唆している。
【００２３】
以下の実施例でさらに詳しく説明するこれらの特定の観察に基づいて、凝集ア
ミロイドポリペプチドの凝集形態を調べる蛍光プローブ、すなわちスルホン化ジ
アゾ色素または発蛍光団標識したアミロイドペプチドの一般的な能力が発見され
た。この分析的ツールは、アミロイドーシスを阻害または逆転する試験化合物の
能力に関する様々なスクリーニング技術の基礎を提供する。
ミロイドポリペプチドの凝集形態を調べる蛍光プローブ、すなわちスルホン化ジ
アゾ色素または発蛍光団標識したアミロイドペプチドの一般的な能力が発見され
た。この分析的ツールは、アミロイドーシスを阻害または逆転する試験化合物の
能力に関する様々なスクリーニング技術の基礎を提供する。
【００２４】
本発明の様々な具体例および態様がここで考察される。特定の見出し(太字、
下線)および副見出し(太字、斜体、下線)は、本発明の理解を容易にするために
与えられ、限定することを意図するものではない。
下線)および副見出し(太字、斜体、下線)は、本発明の理解を容易にするために
与えられ、限定することを意図するものではない。
【００２５】
一般的な定義(太字)
「アミロイド」、「アミロイドプラーク」および「アミロイド線維」なる用語
は、一般的には、物質中に見出されるタンパクまたは他の分子の組成に依存しな
い特定の物理的特徴を有する不溶性のタンパク性物質を意味する。アミロイドは
、その無定形な構造、エオシン好性染色、チオフラビン蛍光の変化、および同種
の外観により同定することができる。アミロイドのタンパクまたはペプチド成分
は、ここでは「アミロイドポリペプチド」と呼ばれ、β-アミロイドペプチド(Ａ
β)、例えば、Ａβの最初の２８、４０または４２アミノ酸に対応する合成βＡ
Ｐ、すなわち、それぞれＡβ(１-２８)、Ａβ(１-４０)、Ａβ(１-４２)、なら
びに、Ａβのアミノ酸２５〜３５に対応する合成βＡＰ、すなわちＡβ25-35；
スクレイピータンパク前駆体またはプリオンタンパク；免疫グロブリン、例えば
、骨髄腫により生産されるκまたはλ軽鎖または重鎖、あるいはその断片；血清
アミロイドＡ；β２ミクログロブリン；アポＡ１；ゲルソリン；シスタチンＣ；
(プロ)カルシトニン；心房性ナトリウム利尿因子；アミリンとしても知られる膵
島アミロイドポリペプチド(ウェスターマーク(Westermark)ら、プロシーディン
グズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・オブ・ザ・ユ
ナイテッド・ステイツ・オブ・アメリカ(Proc. Natl. Acad. Sci. USA),1987,84
:3881-85；ウェスターマーク(Westermark)ら、アメリカン・ジャーナル・オブ・
フィジオロジー(Am. J. Physiol.),1987,127:414-417；クーパー(Cooper)ら、プ
ロシーディングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・
オブ・ザ・ユナイテッド・ステイツ・オブ・アメリカ(Proc. Natl. Acad. Sci.
USA),1987,84:8628-32；クーパー(Cooper)ら、プロシーディングズ・オブ・ザ・
ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・オブ・ザ・ユナイテッド・ステ
イツ・オブ・アメリカ(Proc. Natl. Acad. Sci. USA),1988,85:7763-66；アミエ
ル(Amiel)、ランセット(Lancet),1993,341;1249-50を参照)；などが挙げられる
が、これらに限定されない。本開示の目的では、アミロイドポリペプチドは、凝
集を可能にする条件下における誘発、例えば、種を用いて、自発的に凝集するこ
とができる。ヒトアミリンはインビトロで自発的に凝集するが、ヒトアミリンと
６個のアミノ酸残基が異なるラットアミリンは、非アミロイド形成性であり、線
維を形成しないことに注目すべきである(ロレンツォ(Lorenzo)ら、ネーチャー(N
ature),1994,368:756-760)。特定の態様では、「アミロイド」なる用語は、ここ
ではＡβを含有する物質を意味するのに用いられる。「アミロイドーシス」は、
アミロイドプラークまたは線維を形成するタンパクのインビボでの沈着または凝
集を意味する。
は、一般的には、物質中に見出されるタンパクまたは他の分子の組成に依存しな
い特定の物理的特徴を有する不溶性のタンパク性物質を意味する。アミロイドは
、その無定形な構造、エオシン好性染色、チオフラビン蛍光の変化、および同種
の外観により同定することができる。アミロイドのタンパクまたはペプチド成分
は、ここでは「アミロイドポリペプチド」と呼ばれ、β-アミロイドペプチド(Ａ
β)、例えば、Ａβの最初の２８、４０または４２アミノ酸に対応する合成βＡ
Ｐ、すなわち、それぞれＡβ(１-２８)、Ａβ(１-４０)、Ａβ(１-４２)、なら
びに、Ａβのアミノ酸２５〜３５に対応する合成βＡＰ、すなわちＡβ25-35；
スクレイピータンパク前駆体またはプリオンタンパク；免疫グロブリン、例えば
、骨髄腫により生産されるκまたはλ軽鎖または重鎖、あるいはその断片；血清
アミロイドＡ；β２ミクログロブリン；アポＡ１；ゲルソリン；シスタチンＣ；
(プロ)カルシトニン；心房性ナトリウム利尿因子；アミリンとしても知られる膵
島アミロイドポリペプチド(ウェスターマーク(Westermark)ら、プロシーディン
グズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・オブ・ザ・ユ
ナイテッド・ステイツ・オブ・アメリカ(Proc. Natl. Acad. Sci. USA),1987,84
:3881-85；ウェスターマーク(Westermark)ら、アメリカン・ジャーナル・オブ・
フィジオロジー(Am. J. Physiol.),1987,127:414-417；クーパー(Cooper)ら、プ
ロシーディングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・
オブ・ザ・ユナイテッド・ステイツ・オブ・アメリカ(Proc. Natl. Acad. Sci.
USA),1987,84:8628-32；クーパー(Cooper)ら、プロシーディングズ・オブ・ザ・
ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・オブ・ザ・ユナイテッド・ステ
イツ・オブ・アメリカ(Proc. Natl. Acad. Sci. USA),1988,85:7763-66；アミエ
ル(Amiel)、ランセット(Lancet),1993,341;1249-50を参照)；などが挙げられる
が、これらに限定されない。本開示の目的では、アミロイドポリペプチドは、凝
集を可能にする条件下における誘発、例えば、種を用いて、自発的に凝集するこ
とができる。ヒトアミリンはインビトロで自発的に凝集するが、ヒトアミリンと
６個のアミノ酸残基が異なるラットアミリンは、非アミロイド形成性であり、線
維を形成しないことに注目すべきである(ロレンツォ(Lorenzo)ら、ネーチャー(N
ature),1994,368:756-760)。特定の態様では、「アミロイド」なる用語は、ここ
ではＡβを含有する物質を意味するのに用いられる。「アミロイドーシス」は、
アミロイドプラークまたは線維を形成するタンパクのインビボでの沈着または凝
集を意味する。
【００２６】
「アミロイド特異的な分光学的プローブ」なる用語は、凝集形態のアミロイド
と相互作用し、凝集体のコンホメーションに依存して異なる分光学的な性質を示
す、アミロイドに結合する色素化合物またはペプチド-発蛍光団複合体を意味す
る。当然、当業者が容易に認識できるように、発蛍光団は、必然的に発色団とし
て作用する、すなわち、それは特異的な吸収スペクトルを有する。さらに、凝集
アミロイドに束縛されている場合、それは誘発されたＣＤスペクトルを有すると
思われる。プローブはアミロイド形成に影響を与えうるが、好ましくは影響を与
える。スルホン化ジアゾ色素および発蛍光団標識したアミロイドペプチドは、ア
ミロイド特異的な分光学的プローブの両方の例である。
と相互作用し、凝集体のコンホメーションに依存して異なる分光学的な性質を示
す、アミロイドに結合する色素化合物またはペプチド-発蛍光団複合体を意味す
る。当然、当業者が容易に認識できるように、発蛍光団は、必然的に発色団とし
て作用する、すなわち、それは特異的な吸収スペクトルを有する。さらに、凝集
アミロイドに束縛されている場合、それは誘発されたＣＤスペクトルを有すると
思われる。プローブはアミロイド形成に影響を与えうるが、好ましくは影響を与
える。スルホン化ジアゾ色素および発蛍光団標識したアミロイドペプチドは、ア
ミロイド特異的な分光学的プローブの両方の例である。
【００２７】
「発蛍光団標識したアミロイドペプチド」は、発蛍光団(蛍光分子)と複合体化
した、アミロイドポリペプチド由来のペプチド、例えば、Ａβである。アミロイ
ドペプチドは、アミロイドポリペプチドと共凝集することができるアミロイドポ
リペプチドまたはその一部とすることができる。発蛍光団標識したアミロイドペ
プチドは、しかし、それ自体が凝集することができる必要はない。アミロイドペ
プチドを標識するための発蛍光団の例としては、フルオレセイン、テキサスレッ
ド、ルテニウムβピリジル錯体およびローダミンが挙げられるが、これらに限定
されない。また、発蛍光団は、ＵＶに有用な吸収スペクトルを有しうるし、有用
なＩＲスペクトルの性質を有しうる。好ましくは、発蛍光団標識したアミロイド
ペプチドは、試料中の全ペプチドの約１０％またはそれ以下、より好ましくは約
１％またはそれ以下、最も好ましくは約０.１％またはそれ以下を表す。
した、アミロイドポリペプチド由来のペプチド、例えば、Ａβである。アミロイ
ドペプチドは、アミロイドポリペプチドと共凝集することができるアミロイドポ
リペプチドまたはその一部とすることができる。発蛍光団標識したアミロイドペ
プチドは、しかし、それ自体が凝集することができる必要はない。アミロイドペ
プチドを標識するための発蛍光団の例としては、フルオレセイン、テキサスレッ
ド、ルテニウムβピリジル錯体およびローダミンが挙げられるが、これらに限定
されない。また、発蛍光団は、ＵＶに有用な吸収スペクトルを有しうるし、有用
なＩＲスペクトルの性質を有しうる。好ましくは、発蛍光団標識したアミロイド
ペプチドは、試料中の全ペプチドの約１０％またはそれ以下、より好ましくは約
１％またはそれ以下、最も好ましくは約０.１％またはそれ以下を表す。
【００２８】
その最も広い意味で、「アミロイドに結合する」色素は、アミロイドと会合す
る傾向を有する発色団である。好ましくは、色素は、特定の条件下で発蛍光団で
もある、すなわち蛍光を発することができる。本発明の目的では、また、アミロ
イドーシスの研究においては、例証的な色素はスルホン化ジアゾ色素、より好ま
しくはコンゴレッド(例えば、米国特許第5,276,059号およびPCT/US93/06637を参
照)である。しかし、コンゴレッドの関連化合物または同等物、例えば、コンゴ
レッドのカルボキシレート類似体であるクリサミンＧは、本発明の範囲内にある
ことを意図される。コンゴレッドおよびクリサミンＧの構造を以下に示す。
る傾向を有する発色団である。好ましくは、色素は、特定の条件下で発蛍光団で
もある、すなわち蛍光を発することができる。本発明の目的では、また、アミロ
イドーシスの研究においては、例証的な色素はスルホン化ジアゾ色素、より好ま
しくはコンゴレッド(例えば、米国特許第5,276,059号およびPCT/US93/06637を参
照)である。しかし、コンゴレッドの関連化合物または同等物、例えば、コンゴ
レッドのカルボキシレート類似体であるクリサミンＧは、本発明の範囲内にある
ことを意図される。コンゴレッドおよびクリサミンＧの構造を以下に示す。
【００２９】
【化１】
【００３０】
【化２】
【００３１】
凝集を可能にする条件は、アミロイドポリペプチドが凝集することができるよ
うなｐＨ、イオン強度、温度、および、低濃度のカオトロピックまたはリオトロ
ピック試薬、好ましくはカオトロピックまたはリオトロピック試薬が存在せず、
または少なくとも検出できない程度であることである。アミロイドの「種」の存
在は、ポリペプチドが凝集する傾向を増大させる。
うなｐＨ、イオン強度、温度、および、低濃度のカオトロピックまたはリオトロ
ピック試薬、好ましくはカオトロピックまたはリオトロピック試薬が存在せず、
または少なくとも検出できない程度であることである。アミロイドの「種」の存
在は、ポリペプチドが凝集する傾向を増大させる。
【００３２】
「凝集複合体」は、アミロイド特異的な分光学的プローブ、例えば、コンゴレ
ッドと、凝集アミロイドペプチドとの相互作用により形成される複合体を意味す
る。この複合体は、共凝集の結果として、すなわち、アミロイド特異的な分光学
的プローブが凝集の誘発前にアミロイドポリペプチドと共に存在する場合に、形
成することができる。あるいは、複合体は色素と予め形成されたアミロイドポリ
ペプチド凝集体との相互作用の結果として形成することができる。
ッドと、凝集アミロイドペプチドとの相互作用により形成される複合体を意味す
る。この複合体は、共凝集の結果として、すなわち、アミロイド特異的な分光学
的プローブが凝集の誘発前にアミロイドポリペプチドと共に存在する場合に、形
成することができる。あるいは、複合体は色素と予め形成されたアミロイドポリ
ペプチド凝集体との相互作用の結果として形成することができる。
【００３３】
「凝集形態」なる用語は、ここではその凝集状態にあるアミロイドポリペプチ
ドにより採用される構造またはコンホメーションを意味するのに用いられる。例
えば、凝集Ａβは、βシートまたはねじれβシート形態を形成することができる
。実際問題として、２次および４次(ペプチド-ペプチド)コンホメーションは分
光学的な性質の差により表される。言い換えれば、凝集アミロイドポリペプチド
の構造を詳細に知ることなく、ポリペプチドまたはアミロイド特異的な分光学的
プローブのいずれかの分光学的な性質の差を検出することにより、構造的な差を
検出することができる。これらの差から、今度は、インビトロまたはインビボで
、細胞毒性またはアミロイドーシス関連の病原性に対するそれらの効果を評価す
ることができる。
ドにより採用される構造またはコンホメーションを意味するのに用いられる。例
えば、凝集Ａβは、βシートまたはねじれβシート形態を形成することができる
。実際問題として、２次および４次(ペプチド-ペプチド)コンホメーションは分
光学的な性質の差により表される。言い換えれば、凝集アミロイドポリペプチド
の構造を詳細に知ることなく、ポリペプチドまたはアミロイド特異的な分光学的
プローブのいずれかの分光学的な性質の差を検出することにより、構造的な差を
検出することができる。これらの差から、今度は、インビトロまたはインビボで
、細胞毒性またはアミロイドーシス関連の病原性に対するそれらの効果を評価す
ることができる。
【００３４】
「ポリペプチド凝集体」または「凝集体」なる用語は、線維形態または非線維
形態のいずれかを形成するポリペプチドの自己集合種を意味し、かつニューロン
培養物に対して毒性または非毒性のものを意味する。
形態のいずれかを形成するポリペプチドの自己集合種を意味し、かつニューロン
培養物に対して毒性または非毒性のものを意味する。
【００３５】
ここで用いるように、「分光学的な性質」なる用語は、凝集複合体により吸収
される放射線の量、または放射線の吸収により励起された凝集複合体から放射さ
れるエネルギーを意味する。特定の具体例では、円偏光二色性(ＣＤ)紫外(ＵＶ)
スペクトルが遠紫外領域および近紫外領域で得られる。別の具体例では、ＵＶ吸
収スペクトルが得られる。また、さらなる具体例では、蛍光発光スペクトルが得
られる。また、さらなる具体例では、赤外(ＩＲ)スペクトルが得られる。一般的
には、スペクトルは、凝集複合体を含む試料-対-参照試料において、所定の波長
で透過または吸収される光の量の差を測定することにより得られる。蛍光スペク
トルは、所定の励起光波長における発光の強度を検出することにより得られる。
蛍光励起スペクトルは、蛍光の強度を吸収波長の関数として評価することにより
得ることができる。これらの概念は当該分野で公知である(例えば、キャンター(
Cantor)およびシンメル(Schimmel)、バイオフィジカル・ケミストリー(Biophysi
cal Chemistry)、ダブリュー・エイチ・フリーマン・アンド・カンパニー(W.H.
Freeman and Company)：サンフランシスコ、1980年；シルバースタイン(Silvers
tein)ら、スペクトロメトリック・アイデンティフィケーション・オブ・オーガ
ニック・カンパウンズ(Spectrometric Identification of Organic Compounds)
、ジョン・ワイリー・アンド・サンズ(John Wiley & Sons)：ニューヨーク、198
1年を参照)。
される放射線の量、または放射線の吸収により励起された凝集複合体から放射さ
れるエネルギーを意味する。特定の具体例では、円偏光二色性(ＣＤ)紫外(ＵＶ)
スペクトルが遠紫外領域および近紫外領域で得られる。別の具体例では、ＵＶ吸
収スペクトルが得られる。また、さらなる具体例では、蛍光発光スペクトルが得
られる。また、さらなる具体例では、赤外(ＩＲ)スペクトルが得られる。一般的
には、スペクトルは、凝集複合体を含む試料-対-参照試料において、所定の波長
で透過または吸収される光の量の差を測定することにより得られる。蛍光スペク
トルは、所定の励起光波長における発光の強度を検出することにより得られる。
蛍光励起スペクトルは、蛍光の強度を吸収波長の関数として評価することにより
得ることができる。これらの概念は当該分野で公知である(例えば、キャンター(
Cantor)およびシンメル(Schimmel)、バイオフィジカル・ケミストリー(Biophysi
cal Chemistry)、ダブリュー・エイチ・フリーマン・アンド・カンパニー(W.H.
Freeman and Company)：サンフランシスコ、1980年；シルバースタイン(Silvers
tein)ら、スペクトロメトリック・アイデンティフィケーション・オブ・オーガ
ニック・カンパウンズ(Spectrometric Identification of Organic Compounds)
、ジョン・ワイリー・アンド・サンズ(John Wiley & Sons)：ニューヨーク、198
1年を参照)。
【００３６】
疾患に冒された組織またはその近傍にアミロイドが沈着するか、アミロイドプ
ラークが見出される場合、または、疾患が不溶性または不溶性になり得るタンパ
クの過剰生産により特徴付けられる場合、その疾患または障害はアミロイドーシ
スに関連している。アミロイドプラークは、病理学的な効果を公知または未知の
メカニズムにより直接または間接的に引き起こし得る。アミロイド疾患の例とし
ては、全身性疾患、例えば、慢性炎症性疾患、多発性骨髄腫、マクログロブリン
血症、家族性アミロイドポリニューロパシー(ポルトガル人)および心筋症(デン
マーク人)、全身性老人性アミロイドーシス、家族性アミロイドポリネフロパシ
ー(アイオワ)、家族性アミロイドーシス(フィンランド人)、ゲルストマン-スト
ロイスラー-シャインカ症候群、蕁麻疹および難聴を伴う家族性アミロイドネフ
ロパシー(マックル-ウェルズ症候群)、甲状腺髄様癌、限局性心房性アミロイド
、および、血液透析に関連するアミロイドーシス(ＨＡＡ)；および神経変性疾患
が挙げられるが、これらに限定されない。
ラークが見出される場合、または、疾患が不溶性または不溶性になり得るタンパ
クの過剰生産により特徴付けられる場合、その疾患または障害はアミロイドーシ
スに関連している。アミロイドプラークは、病理学的な効果を公知または未知の
メカニズムにより直接または間接的に引き起こし得る。アミロイド疾患の例とし
ては、全身性疾患、例えば、慢性炎症性疾患、多発性骨髄腫、マクログロブリン
血症、家族性アミロイドポリニューロパシー(ポルトガル人)および心筋症(デン
マーク人)、全身性老人性アミロイドーシス、家族性アミロイドポリネフロパシ
ー(アイオワ)、家族性アミロイドーシス(フィンランド人)、ゲルストマン-スト
ロイスラー-シャインカ症候群、蕁麻疹および難聴を伴う家族性アミロイドネフ
ロパシー(マックル-ウェルズ症候群)、甲状腺髄様癌、限局性心房性アミロイド
、および、血液透析に関連するアミロイドーシス(ＨＡＡ)；および神経変性疾患
が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３７】
II型糖尿病は、膵臓、特にインスリンを生産する膵島細胞のアミロイド線維ま
たは沈着物に関連している。アルツハイマー病のアミロイドプラークの場合のよ
うに、II型糖尿病のアミロイドプラークまたは線維は病理学的効果を引き起こす
。特に、線維が形成するヒトアミリンの濃縮は、ヒトおよびラットの膵島インス
リン生産β細胞に対して毒性である(ロレンツォ(Lorenzo)ら、1994年、ネイチャ
ー(Nature),368:758-760)。従って、特定の具体例では、本発明はII型糖尿病ア
ミロイドーシスに関する。
たは沈着物に関連している。アルツハイマー病のアミロイドプラークの場合のよ
うに、II型糖尿病のアミロイドプラークまたは線維は病理学的効果を引き起こす
。特に、線維が形成するヒトアミリンの濃縮は、ヒトおよびラットの膵島インス
リン生産β細胞に対して毒性である(ロレンツォ(Lorenzo)ら、1994年、ネイチャ
ー(Nature),368:758-760)。従って、特定の具体例では、本発明はII型糖尿病ア
ミロイドーシスに関する。
【００３８】
慢性炎症性疾患、例えば、特発性家族性地中海熱、マックル-ウェルズ症候群
、慢性マラリア感染症などは、血清アミロイドＡ、すなわち、さらにプロセッシ
ングを受けて、アミロイド沈着物およびプラークを形成しうる急性期タンパクの
発現をもたらし得る。例えば、第三世界では、慢性マラリアが患者の脾臓および
/または肝臓のアミロイドーシスに至り得る。生じた臓器の機能不全は、最終的
には死に至り得る。多発性骨髄腫は、免疫グロブリンの過剰生産に関連している
。免疫グロブリンまたはその断片は、循環系と接触する臓器または組織にアミロ
イド沈着物およびプラークを形成することができる。トランスサイレチンの沈着
は、家族性アミロイドポリニューロパシー(ポルトガル人)、家族性アミロイド心
筋症(デンマーク人)、または全身性老人性アミロイドーシスをもたらし得る。血
液透析に関連するアミロイドーシスは、長期の血液透析患者の間における合併症
であり、β２ミクログロブリンがアミロイド線維の主要なタンパク成分である(
ドリューケ(Drueeke)、1991年、ミネラル・アンド・エレクトロライト・メタボ
リズム(Miner. Electrolyte Metab.),17:261-272；ゲイジョー(Geyjo)ら、1985
年、バイオケミカル・アンド・バイオフィジカル・リサーチ・コミュニケーショ
ンズ(Biochem. Biophys. Res. Commun.),129:701-706；ゴレヴィック(Gorevic)
ら、1986年、プロシーディングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・
サイエンシズ・オブ・ザ・ユナイテッド・ステイツ・オブ・アメリカ(Proc. Nat
l. Acad. Sci. USA),83:7908-12；シラハマ(Shirahama)ら、1985年、ラボラトリ
ー・インベスティゲーション(Lab. Invest.),53:705-709)。
、慢性マラリア感染症などは、血清アミロイドＡ、すなわち、さらにプロセッシ
ングを受けて、アミロイド沈着物およびプラークを形成しうる急性期タンパクの
発現をもたらし得る。例えば、第三世界では、慢性マラリアが患者の脾臓および
/または肝臓のアミロイドーシスに至り得る。生じた臓器の機能不全は、最終的
には死に至り得る。多発性骨髄腫は、免疫グロブリンの過剰生産に関連している
。免疫グロブリンまたはその断片は、循環系と接触する臓器または組織にアミロ
イド沈着物およびプラークを形成することができる。トランスサイレチンの沈着
は、家族性アミロイドポリニューロパシー(ポルトガル人)、家族性アミロイド心
筋症(デンマーク人)、または全身性老人性アミロイドーシスをもたらし得る。血
液透析に関連するアミロイドーシスは、長期の血液透析患者の間における合併症
であり、β２ミクログロブリンがアミロイド線維の主要なタンパク成分である(
ドリューケ(Drueeke)、1991年、ミネラル・アンド・エレクトロライト・メタボ
リズム(Miner. Electrolyte Metab.),17:261-272；ゲイジョー(Geyjo)ら、1985
年、バイオケミカル・アンド・バイオフィジカル・リサーチ・コミュニケーショ
ンズ(Biochem. Biophys. Res. Commun.),129:701-706；ゴレヴィック(Gorevic)
ら、1986年、プロシーディングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・
サイエンシズ・オブ・ザ・ユナイテッド・ステイツ・オブ・アメリカ(Proc. Nat
l. Acad. Sci. USA),83:7908-12；シラハマ(Shirahama)ら、1985年、ラボラトリ
ー・インベスティゲーション(Lab. Invest.),53:705-709)。
【００３９】
上記したように、全身性アミロイドーシスに加えて、本発明は、特にアミロイ
ドーシスを伴う神経変性疾患に関する。「神経変性疾患」なる用語は、脳または
神経の機能不全を特徴とする症状、例えば、短期または長期の記憶の間違いまた
は欠如、痴呆、認識不足、平衡および協調の問題、ならびに感情および行動の欠
乏を伴って現れる、特に脳に関係する神経系の疾患または障害である。かかる疾
患は、かかる症状を示す患者の脳組織の組織病理学的(生検)試料がアミロイドプ
ラーク形成を示す場合、「アミドードーシスに関連」している。脳、特にヒト脳
の生検試料は生きている患者から得るのは非常に困難であるか、あるいは全く入
手できないかもしれないので、神経変性疾患の症状とアミロイドーシスとの関連
は、生検試料中におけるプラークまたは線維などのアミロイド沈着物の存在以外
の基準に基づいている場合が多い。
ドーシスを伴う神経変性疾患に関する。「神経変性疾患」なる用語は、脳または
神経の機能不全を特徴とする症状、例えば、短期または長期の記憶の間違いまた
は欠如、痴呆、認識不足、平衡および協調の問題、ならびに感情および行動の欠
乏を伴って現れる、特に脳に関係する神経系の疾患または障害である。かかる疾
患は、かかる症状を示す患者の脳組織の組織病理学的(生検)試料がアミロイドプ
ラーク形成を示す場合、「アミドードーシスに関連」している。脳、特にヒト脳
の生検試料は生きている患者から得るのは非常に困難であるか、あるいは全く入
手できないかもしれないので、神経変性疾患の症状とアミロイドーシスとの関連
は、生検試料中におけるプラークまたは線維などのアミロイド沈着物の存在以外
の基準に基づいている場合が多い。
【００４０】
特定の具体例では、本発明によれば、アミロイドーシスに関連する神経変性疾
患はアルツハイマー病(ＡＤ)である。他の具体例では、この疾患は、アミロイド
前駆体タンパク(ＡＰＰ)のβＡＰ部分のアミノ末端近傍におけるＡＰＰの二重の
ＫＭからＮＬへの変異により特徴付けられる希なスウェーデン人の疾患である(
レヴィ(Levy)ら、1990年、サイエンス(Science),248:1124-26)。別のかかる疾患
は、アミロイドーシス(ＨＣＨＡまたはＨＣＨＷＡ)-ドイツ型を伴う遺伝性の脳
出血である(ロゼミュラー(Rozemuller)ら、1993年、アメリカン・ジャーナル・
オブ・パソロジー(Am. J. Pathol.),142:1449-57；ルーズ(Roos)ら、1991年、ア
ナルズ・オブ・ザ・ニューヨーク・アカデミー・オブ・サイエンシズ(Ann. N.Y.
Acad. Sci.),640:155-60；ティンマーズ(Timmers)ら、1990年、ニューロサイエ
ンス・レターズ(Neurosci. Lett.),118:223-6；ハーン(Haan)ら、1990年、アー
カイブズ・オブ・ニューロロジー(Arch. Neurol.),47:965-7)。当該分野で公知
であり、本発明の範囲内にある他のかかる疾患としては、散発性脳アミロイドア
ンギオパシー、遺伝性脳アミロイドアンギオパシー、ダウン症候群、グアムのパ
ーキンソン-痴呆症、および年齢に関係する無症候性アミロイドアンギオパシー(
例えば、ハーン(Haan)およびルース(Roos)、1990年、クリニカル・ニューロロジ
ー・アンド・ニューロサージェリー(Clin. Neurol. Neurosurg.),92:305-310；
グレンナー(Glenner)およびマーフィー(Murphy)、1989年、ニュー・ニューロジ
カル・サイエンシズ(N. Neurol. Sci.),94:1-28；フランジョーネ(Frangione)、
1989年、アナルズ・オブ・メディスン(Ann. Med.),21:69-72；ハーン(Haan)ら、
1992年、クリニカル・ニューロロジー・アンド・ニュロサージェリー(Clin. Neu
rol. Neurosurg.),94:317-8；フレイザー(Fraser)ら、1992年、バイオケミスト
リー(Biochem.),31:10716-23；コリア(Coria)ら、1988年、ラボラトリー・イン
ベスティゲーション(Lab. Invest.),58:454-8を参照)が挙げられるが、これらに
限定されない。これらの疾患の各々に関与するβＡＰの実際のアミノ酸組成およ
びサイズは、当該分野で公知のように変化しうる(上記文献およびウィズニエフ
スキー(Wisniewski)ら、1991年、バイオケミカル・アンド・バイオフィジカル・
リサーチ・コミュニケーションズ(Biochem. Biophys. Res. Commum.),179:1247-
54および1991年、バイオケミカル・アンド・バイオフィジカル・リサーチ・コミ
ュニケーションズ(Biochem. Biophys. Res. Commum.),180:1528[出版時の誤植]
；プレリ(Prelli)ら、1990年、バイオケミカル・アンド・バイオフィジカル・リ
サーチ・コミュニケーションズ(Biochem. Biophys. Res. Commum.),170:301-307
；レヴィ(Levy)ら、1990年、サイエンス(Science),248:1124-26を参照)。
患はアルツハイマー病(ＡＤ)である。他の具体例では、この疾患は、アミロイド
前駆体タンパク(ＡＰＰ)のβＡＰ部分のアミノ末端近傍におけるＡＰＰの二重の
ＫＭからＮＬへの変異により特徴付けられる希なスウェーデン人の疾患である(
レヴィ(Levy)ら、1990年、サイエンス(Science),248:1124-26)。別のかかる疾患
は、アミロイドーシス(ＨＣＨＡまたはＨＣＨＷＡ)-ドイツ型を伴う遺伝性の脳
出血である(ロゼミュラー(Rozemuller)ら、1993年、アメリカン・ジャーナル・
オブ・パソロジー(Am. J. Pathol.),142:1449-57；ルーズ(Roos)ら、1991年、ア
ナルズ・オブ・ザ・ニューヨーク・アカデミー・オブ・サイエンシズ(Ann. N.Y.
Acad. Sci.),640:155-60；ティンマーズ(Timmers)ら、1990年、ニューロサイエ
ンス・レターズ(Neurosci. Lett.),118:223-6；ハーン(Haan)ら、1990年、アー
カイブズ・オブ・ニューロロジー(Arch. Neurol.),47:965-7)。当該分野で公知
であり、本発明の範囲内にある他のかかる疾患としては、散発性脳アミロイドア
ンギオパシー、遺伝性脳アミロイドアンギオパシー、ダウン症候群、グアムのパ
ーキンソン-痴呆症、および年齢に関係する無症候性アミロイドアンギオパシー(
例えば、ハーン(Haan)およびルース(Roos)、1990年、クリニカル・ニューロロジ
ー・アンド・ニューロサージェリー(Clin. Neurol. Neurosurg.),92:305-310；
グレンナー(Glenner)およびマーフィー(Murphy)、1989年、ニュー・ニューロジ
カル・サイエンシズ(N. Neurol. Sci.),94:1-28；フランジョーネ(Frangione)、
1989年、アナルズ・オブ・メディスン(Ann. Med.),21:69-72；ハーン(Haan)ら、
1992年、クリニカル・ニューロロジー・アンド・ニュロサージェリー(Clin. Neu
rol. Neurosurg.),94:317-8；フレイザー(Fraser)ら、1992年、バイオケミスト
リー(Biochem.),31:10716-23；コリア(Coria)ら、1988年、ラボラトリー・イン
ベスティゲーション(Lab. Invest.),58:454-8を参照)が挙げられるが、これらに
限定されない。これらの疾患の各々に関与するβＡＰの実際のアミノ酸組成およ
びサイズは、当該分野で公知のように変化しうる(上記文献およびウィズニエフ
スキー(Wisniewski)ら、1991年、バイオケミカル・アンド・バイオフィジカル・
リサーチ・コミュニケーションズ(Biochem. Biophys. Res. Commum.),179:1247-
54および1991年、バイオケミカル・アンド・バイオフィジカル・リサーチ・コミ
ュニケーションズ(Biochem. Biophys. Res. Commum.),180:1528[出版時の誤植]
；プレリ(Prelli)ら、1990年、バイオケミカル・アンド・バイオフィジカル・リ
サーチ・コミュニケーションズ(Biochem. Biophys. Res. Commum.),170:301-307
；レヴィ(Levy)ら、1990年、サイエンス(Science),248:1124-26を参照)。
【００４１】
さらなる態様では、神経変性疾患は、亜急性海綿状脳症であり、例えば、スク
レイピー、クロイツフェルト-ヤコブ病、ゲルストマン-ストロイスラー病、クー
ルー、ミュールジカおよびヘラジカの慢性消耗病、ウシの牛海綿状脳症、および
ミンクの伝達性脳症が挙げられるが、これらに限定されない。
レイピー、クロイツフェルト-ヤコブ病、ゲルストマン-ストロイスラー病、クー
ルー、ミュールジカおよびヘラジカの慢性消耗病、ウシの牛海綿状脳症、および
ミンクの伝達性脳症が挙げられるが、これらに限定されない。
【００４２】
本発明は、動物、より好ましくは哺乳動物、例えば、ヒトならびにイヌ、ネコ
、ウマ、ウシ、ブタ、モルモット、マウスおよびラットなどの哺乳動物に由来す
るアミロイド形成性ポリペプチドの凝集形態を評価することを意図する。
、ウマ、ウシ、ブタ、モルモット、マウスおよびラットなどの哺乳動物に由来す
るアミロイド形成性ポリペプチドの凝集形態を評価することを意図する。
【００４３】
ここで用いるように、「約」または「およそ」なる用語は、与えられた値の５
０％以内、好ましくは２０％以内、より好ましくは１０％以内、さらにより好ま
しくは５％以内、最も好ましくは与えられた値の１％以内を意味する。あるいは
、「約」または「およそ」なる用語は、ある値がそのタイプの値に対する科学的
に許容される誤差範囲に入り得ることを意味する。これは測定にどれぐらい定性
的な利用可能ツールが与えられ得るかに依存する。「約」または「およそ」は、
単一の値よりむしろ、平均値の周囲の分布を定義しうる。
０％以内、好ましくは２０％以内、より好ましくは１０％以内、さらにより好ま
しくは５％以内、最も好ましくは与えられた値の１％以内を意味する。あるいは
、「約」または「およそ」なる用語は、ある値がそのタイプの値に対する科学的
に許容される誤差範囲に入り得ることを意味する。これは測定にどれぐらい定性
的な利用可能ツールが与えられ得るかに依存する。「約」または「およそ」は、
単一の値よりむしろ、平均値の周囲の分布を定義しうる。
【００４４】
アミロイド形成の誘発(太字)
一般に、アミロイドポリペプチドの凝集は、濃度および時間に依存する事象で
ある。アミロイドポリペプチドは、適当な緩衝液、好ましくは生理学的な状態に
匹敵するイオン強度を有する緩衝溶液、例えば、リン酸緩衝食塩水(ＰＢＳ)、ト
リス(TRISTM)緩衝液、ヘペス(HEPESTM)緩衝液、またはニューロベイサル(NEUROB
ASALTM)培地に溶解する。凝集アミロイドポリペプチドは、慣習的な方法により
、例えば、以下に記載のように検出される。
ある。アミロイドポリペプチドは、適当な緩衝液、好ましくは生理学的な状態に
匹敵するイオン強度を有する緩衝溶液、例えば、リン酸緩衝食塩水(ＰＢＳ)、ト
リス(TRISTM)緩衝液、ヘペス(HEPESTM)緩衝液、またはニューロベイサル(NEUROB
ASALTM)培地に溶解する。凝集アミロイドポリペプチドは、慣習的な方法により
、例えば、以下に記載のように検出される。
【００４５】
アミロイドに結合する色素は、凝集形態を評価するために、凝集前または凝集
後にアミロイドポリペプチドと接触させることができる。アミロイド特異的な分
光学的プローブは、アミロイドポリペプチドをほぼ同じ濃度(モル濃度)で、また
は、大小の大きさの順に与えることができる。ただし、(ａ)色素からの分光学的
なシグナルは、利用可能な分光計で検出することができる；および(ｂ)ポリペプ
チド凝集体と複合体化した色素からのシグナルは、複合体化していない色素から
のシグナル上に検出可能である。これらの因子は実験的に容易に決定される。
後にアミロイドポリペプチドと接触させることができる。アミロイド特異的な分
光学的プローブは、アミロイドポリペプチドをほぼ同じ濃度(モル濃度)で、また
は、大小の大きさの順に与えることができる。ただし、(ａ)色素からの分光学的
なシグナルは、利用可能な分光計で検出することができる；および(ｂ)ポリペプ
チド凝集体と複合体化した色素からのシグナルは、複合体化していない色素から
のシグナル上に検出可能である。これらの因子は実験的に容易に決定される。
【００４６】
Ａβの凝集(太字、斜体)。インビトロでのインキュベーションの間の濃度に依
存する遅延期間の後、合成Ａβの可溶性調製物は、天然のアミロイドに類似した
線維凝集体を徐々に形成し、沈降分離法またはチオフラビン-Ｔに基づく蛍光に
より測定可能である。これらのインビトロアッセイにおける可溶性Ａβの凝集の
速度は、少量の予め凝集したβアミロイド「種」材料の添加により促進される。
存する遅延期間の後、合成Ａβの可溶性調製物は、天然のアミロイドに類似した
線維凝集体を徐々に形成し、沈降分離法またはチオフラビン-Ｔに基づく蛍光に
より測定可能である。これらのインビトロアッセイにおける可溶性Ａβの凝集の
速度は、少量の予め凝集したβアミロイド「種」材料の添加により促進される。
【００４７】
特定の具体例では、１００％ヘキサフルオロイソプロパノールに２００または
４００μＭで溶解したＡβ(１-４０)は、窒素気流下で乾燥させる。ヘキサフル
オロイソプロパノールがまずペプチドのコンホメーションをランダムコイル状態
に転換する。ペプチドフィルムは、約５〜４０秒間の簡単な音波処理および５秒
またはそれ以下の簡単なボルテックスミキサー攪拌により、ＰＢＳ緩衝液(ｐＨ
７.４)に最終濃度５０μＭで溶解する。次いで、この溶液をエイジングして、凝
集を起こさせる。
４００μＭで溶解したＡβ(１-４０)は、窒素気流下で乾燥させる。ヘキサフル
オロイソプロパノールがまずペプチドのコンホメーションをランダムコイル状態
に転換する。ペプチドフィルムは、約５〜４０秒間の簡単な音波処理および５秒
またはそれ以下の簡単なボルテックスミキサー攪拌により、ＰＢＳ緩衝液(ｐＨ
７.４)に最終濃度５０μＭで溶解する。次いで、この溶液をエイジングして、凝
集を起こさせる。
【００４８】
あるいは、４２アミノ酸Ａβの最初の２８アミノ酸(Ａβ１-２８)および最初
の４０アミノ酸(Ａβ１-４０)を表現する合成のＨＰＬＣ精製したペプチドをベ
イケム(Bachem；カリフォルニア州トランス)から得てもよい。異なる濃度におけ
る可溶性Ａβ１-２８およびＡβ１-４０の凝集は、ｐＨ４.７〜７.５の０.１Ｍ
酢酸ナトリウム(ＮａＯＡｃ)の添加により開始することができる。ミリモル以下
のＡβ濃度での定量的な凝集体形成は、レヴィン(LeVine)の方法(プロテイン・
サイエンス(Protein Science),1992,2:404-410)を用いて検出すればよい。簡単
に説明すると、１０μＭチオフラビン-Ｔ(アルドリッチ(Aldrich))/５０ｍＭリ
ン酸カリウム緩衝液(ｐＨ６.０)に加えた凝集体の蛍光を、パーキン・エルマー(
Perkin Elmer)LS-50B分光蛍光計を用いて、４５０±５ｎｍで励起し、４８２±
１０ｎｍにおける発光の検出により測定する。
の４０アミノ酸(Ａβ１-４０)を表現する合成のＨＰＬＣ精製したペプチドをベ
イケム(Bachem；カリフォルニア州トランス)から得てもよい。異なる濃度におけ
る可溶性Ａβ１-２８およびＡβ１-４０の凝集は、ｐＨ４.７〜７.５の０.１Ｍ
酢酸ナトリウム(ＮａＯＡｃ)の添加により開始することができる。ミリモル以下
のＡβ濃度での定量的な凝集体形成は、レヴィン(LeVine)の方法(プロテイン・
サイエンス(Protein Science),1992,2:404-410)を用いて検出すればよい。簡単
に説明すると、１０μＭチオフラビン-Ｔ(アルドリッチ(Aldrich))/５０ｍＭリ
ン酸カリウム緩衝液(ｐＨ６.０)に加えた凝集体の蛍光を、パーキン・エルマー(
Perkin Elmer)LS-50B分光蛍光計を用いて、４５０±５ｎｍで励起し、４８２±
１０ｎｍにおける発光の検出により測定する。
【００４９】
低(生理学的)濃度におけるＡβの凝集は、ブルディック(Burdick)らの方法(ジ
ャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー(J. Biol. Chem.),1992,267:54
6-554)により定量すればよい。Ａβの合成調製物を、好ましくは「種」の存在下
で、５ｎＭの最終濃度に希釈すればよい。３７℃で様々なインキュベーション期
間の後、凝集反応を評価すればよい。
ャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー(J. Biol. Chem.),1992,267:54
6-554)により定量すればよい。Ａβの合成調製物を、好ましくは「種」の存在下
で、５ｎＭの最終濃度に希釈すればよい。３７℃で様々なインキュベーション期
間の後、凝集反応を評価すればよい。
【００５０】
アミリンの凝集(太字、斜体)。インビトロでのインキュベーションの間の濃度
に依存する遅延期間の後、合成アミリンの可溶性調製物は、天然のアミロイドに
類似した線維凝集体を徐々に形成し(ロレンツォ(Lorenzo)ら、ネイチャー(Natur
e),1994,368:756-760)、電子顕微鏡法により、または偏光下でのコンゴレッドの
複屈折により測定可能である(フレーザー(Fraser)ら、バイオフィジカル・ジャ
ーナル(Biophys. J.),1991,90:1194-1201)。これらのインビトロアッセイにおけ
る可溶性アミリンの凝集は、少量の予め凝集したアミリン「種」材料の添加によ
り促進されると期待される。
に依存する遅延期間の後、合成アミリンの可溶性調製物は、天然のアミロイドに
類似した線維凝集体を徐々に形成し(ロレンツォ(Lorenzo)ら、ネイチャー(Natur
e),1994,368:756-760)、電子顕微鏡法により、または偏光下でのコンゴレッドの
複屈折により測定可能である(フレーザー(Fraser)ら、バイオフィジカル・ジャ
ーナル(Biophys. J.),1991,90:1194-1201)。これらのインビトロアッセイにおけ
る可溶性アミリンの凝集は、少量の予め凝集したアミリン「種」材料の添加によ
り促進されると期待される。
【００５１】
特定の具体例では、３７アミノ酸のヒトまたはラット膵島アミロイドポリペプ
チドまたはアミリンを表現する合成のＨＰＬＣ精製したペプチドは、標準的なペ
プチド合成法または市販品の起源、例えば、ベイケム(Bachem；カルフォルニア
州トランス)またはペニンシュラ・ラボラトリーズ(Peninsula Laboratories)か
ら得ればよい。ミリモル以下のアミリン濃度での定量的な凝集体形成は、レヴィ
ン(LeVine)の方法(プロテイン・サイエンス(Protein Science),1992,2:404-410)
を用いて検出すればよい。簡単に説明すると、１０μＭチオフラビン-Ｔ(アルド
リッチ(Aldrich))/５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液(ｐＨ６.０)に加えた凝集体の
蛍光は、パーキン・エルマー(Perkin Elmer)LS-50B分光蛍光計を用いて、４５０
±５ｎｍで励起し、４８２±１０ｎｍにおける発光の検出により測定することが
できる。あるいは、偏光下でのコンゴレッドの複屈折を用いて、凝集を検出する
ことができる(フレーザー(Fraser)ら、前出)。少量の予め形成された凝集体また
は「核形成用種」を可溶性アミリンに加え、例えば、０.１Ｍ酢酸ナトリウムを
用いて、凝集を開始すればよい。可溶性アミリン(２５０μＭ)および０.２Ｍリ
ン酸ナトリウム緩衝液(ｐＨ７.５)を３７℃でインキュベートして、「アミリン
種」と呼ばれる予め形成された凝集体を生成させればよい。インキュベーション
後、種調製物のタンパク濃度を測定し、緩衝液で最終濃度１５０μＭに調節する
。
チドまたはアミリンを表現する合成のＨＰＬＣ精製したペプチドは、標準的なペ
プチド合成法または市販品の起源、例えば、ベイケム(Bachem；カルフォルニア
州トランス)またはペニンシュラ・ラボラトリーズ(Peninsula Laboratories)か
ら得ればよい。ミリモル以下のアミリン濃度での定量的な凝集体形成は、レヴィ
ン(LeVine)の方法(プロテイン・サイエンス(Protein Science),1992,2:404-410)
を用いて検出すればよい。簡単に説明すると、１０μＭチオフラビン-Ｔ(アルド
リッチ(Aldrich))/５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液(ｐＨ６.０)に加えた凝集体の
蛍光は、パーキン・エルマー(Perkin Elmer)LS-50B分光蛍光計を用いて、４５０
±５ｎｍで励起し、４８２±１０ｎｍにおける発光の検出により測定することが
できる。あるいは、偏光下でのコンゴレッドの複屈折を用いて、凝集を検出する
ことができる(フレーザー(Fraser)ら、前出)。少量の予め形成された凝集体また
は「核形成用種」を可溶性アミリンに加え、例えば、０.１Ｍ酢酸ナトリウムを
用いて、凝集を開始すればよい。可溶性アミリン(２５０μＭ)および０.２Ｍリ
ン酸ナトリウム緩衝液(ｐＨ７.５)を３７℃でインキュベートして、「アミリン
種」と呼ばれる予め形成された凝集体を生成させればよい。インキュベーション
後、種調製物のタンパク濃度を測定し、緩衝液で最終濃度１５０μＭに調節する
。
【００５２】
低(生理学的)濃度におけるアミリンの凝集は、ブルディック(Burdick)らの方
法(ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー(J. Biol. Chem.),1992,2
67:546-554)により定量すればよい。アミリンの合成調製物を、好ましくは様々
な「種」の存在下で、５ｎＭの最終濃度に希釈する。３７℃で様々なインキュベ
ーション期間の後、凝集反応を評価することができる。
法(ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー(J. Biol. Chem.),1992,2
67:546-554)により定量すればよい。アミリンの合成調製物を、好ましくは様々
な「種」の存在下で、５ｎＭの最終濃度に希釈する。３７℃で様々なインキュベ
ーション期間の後、凝集反応を評価することができる。
【００５３】
凝集形態の評価(太字)
いったんアミロイド特異的な分光学的プローブとアミロイドとの複合体が形成
されれば、それは分光光度法により評価することができる。ポリペプチドまたは
色素のいずれかの分光学的な性質を分析することができるが、ポリペプチドにつ
いては、最も関連した情報は遠紫外ＣＤ分光法で見出される。
されれば、それは分光光度法により評価することができる。ポリペプチドまたは
色素のいずれかの分光学的な性質を分析することができるが、ポリペプチドにつ
いては、最も関連した情報は遠紫外ＣＤ分光法で見出される。
【００５４】
遠紫外ＣＤ分光法(太字、斜体)
例えば、約２００ｎｍ〜約２６０ｎｍにおける遊離のポリペプチドの遠紫外Ｃ
Ｄスペクトルおよびアミロイド特異的な分光学的プローブと凝集ポリペプチドと
の複合体の遠紫外ＣＤスペクトルは、ポリペプチドのコンホメーションに関する
情報を与える。実際、このスペクトルは、ポリペプチドの二色性吸収を測定する
。しかし、以前の実験データはＡβが凝集した場合にβシート２次コンホメーシ
ョンを採用することを示しているのに対し、初めて、異なる凝集形態間の凝集構
造の差が観察され、評価することができる。
Ｄスペクトルおよびアミロイド特異的な分光学的プローブと凝集ポリペプチドと
の複合体の遠紫外ＣＤスペクトルは、ポリペプチドのコンホメーションに関する
情報を与える。実際、このスペクトルは、ポリペプチドの二色性吸収を測定する
。しかし、以前の実験データはＡβが凝集した場合にβシート２次コンホメーシ
ョンを採用することを示しているのに対し、初めて、異なる凝集形態間の凝集構
造の差が観察され、評価することができる。
【００５５】
以下の表は、典型的なスルホン化ジアゾ色素であるコンゴレッドと複合体化し
た凝集Ａβのコンホメーションに関して、遠紫外ＣＤスペクトルからのいくつか
の情報を与える。
た凝集Ａβのコンホメーションに関して、遠紫外ＣＤスペクトルからのいくつか
の情報を与える。
【００５６】
【表１】
【００５７】
近紫外ＣＤスペクトル(太字、斜体)
例えば、約３００ｎｍ〜約７００ｎｍにおける近紫外ＣＤスペクトルは、色素
の吸光度を測定し、それゆえ、色素とアミロイドとの複合体の異なる構造を評価
するのに用いることができる。ポリペプチド単独、およびコンゴレッドは、近紫
外領域には、認めうるほどのＣＤシグナルを生じない。色素とポリペプチド凝集
体との複合体のＣＤスペクトルの差は、最大シグナルの強度および波長において
明らかである。
の吸光度を測定し、それゆえ、色素とアミロイドとの複合体の異なる構造を評価
するのに用いることができる。ポリペプチド単独、およびコンゴレッドは、近紫
外領域には、認めうるほどのＣＤシグナルを生じない。色素とポリペプチド凝集
体との複合体のＣＤスペクトルの差は、最大シグナルの強度および波長において
明らかである。
【００５８】
以下の表ならびに図２は、近紫外ＣＤスペクトルから、典型的なスルホン化ジ
アゾ色素であるコンゴレッドと複合体化した凝集Ａβのコンホメーションの差の
いくつかを示す。
アゾ色素であるコンゴレッドと複合体化した凝集Ａβのコンホメーションの差の
いくつかを示す。
【００５９】
【表２】
【００６０】
ＵＶ分光学(太字、斜体)
ＵＶスペクトル分析は、異なる凝集形態を有する色素の複合体の吸収スペクト
ルを区別することができる。例えば、コンゴレッドは、それがポリペプチドの前
凝集体または共凝集体と複合体化しているかどうかに依存して、異なるＵＶ吸収
および差スペクトルの性質を有する。色素の吸収の性質を特異的に調べるために
、複合体化スペクトルから凝集アミロイドポリペプチドスペクトルを差し引くこ
とが好ましい。
ルを区別することができる。例えば、コンゴレッドは、それがポリペプチドの前
凝集体または共凝集体と複合体化しているかどうかに依存して、異なるＵＶ吸収
および差スペクトルの性質を有する。色素の吸収の性質を特異的に調べるために
、複合体化スペクトルから凝集アミロイドポリペプチドスペクトルを差し引くこ
とが好ましい。
【００６１】
あるいは、差色素ＵＶ吸光度スペクトルは、凝集アミロイドポリペプチドと複
合体化した色素の吸光度から色素の通常の吸光度を差し引くことにより得ること
ができる。
合体化した色素の吸光度から色素の通常の吸光度を差し引くことにより得ること
ができる。
【００６２】
ＵＶ吸収スペクトルは、約２００ｎｍ〜約７００ｎｍ；好ましくは、約２５０
ｎｍ〜約７００ｎｍで得ることができる。遊離のコンゴレッドに対して得られた
コンゴレッドとアミロイドペプチドとの複合体のスペクトル(図４を参照)の差は
、複合体が高色素性であることを示し、遊離形態の吸収に対して５５０ｎｍ付近
での吸光度が上昇している。両方の複合体、予め形成された凝集体に結合したコ
ンゴレッドおよび共凝集体の吸収スペクトルは、差スペクトルの４８０ｎｍ付近
に負の吸収を示す。スペクトルの差の起源は、遊離のコンゴレッドのその結合形
態への転換によるものであり、それゆえ、その吸収スペクトルに深色団シフトを
生じる。また、図３および４のスペクトルを調べると、５００ｎｍ〜５５０ｎｍ
の吸収増大が共凝集体におけるよりもコンゴレッドと予め形成された凝集体の複
合体の場合に大きいことが示唆される。コンゴレッドとアミロイドペプチドとの
複合体化は、４８０ｎｍ付近における光吸収(これは化合物の遊離形態による)の
減少および同時に５００〜５５０ｎｍのスペクトル範囲における光吸収(これは
複合体化による)の上昇をもたらす。
ｎｍ〜約７００ｎｍで得ることができる。遊離のコンゴレッドに対して得られた
コンゴレッドとアミロイドペプチドとの複合体のスペクトル(図４を参照)の差は
、複合体が高色素性であることを示し、遊離形態の吸収に対して５５０ｎｍ付近
での吸光度が上昇している。両方の複合体、予め形成された凝集体に結合したコ
ンゴレッドおよび共凝集体の吸収スペクトルは、差スペクトルの４８０ｎｍ付近
に負の吸収を示す。スペクトルの差の起源は、遊離のコンゴレッドのその結合形
態への転換によるものであり、それゆえ、その吸収スペクトルに深色団シフトを
生じる。また、図３および４のスペクトルを調べると、５００ｎｍ〜５５０ｎｍ
の吸収増大が共凝集体におけるよりもコンゴレッドと予め形成された凝集体の複
合体の場合に大きいことが示唆される。コンゴレッドとアミロイドペプチドとの
複合体化は、４８０ｎｍ付近における光吸収(これは化合物の遊離形態による)の
減少および同時に５００〜５５０ｎｍのスペクトル範囲における光吸収(これは
複合体化による)の上昇をもたらす。
【００６３】
蛍光分光学(太字、斜体)
色素、例えば、コンゴレッドの蛍光発光または励起スペクトルは、アミロイド
の凝集形態を調べるのに用いることができる。コンゴレッドとアミロイドポリペ
プチドとの複合体の蛍光スペクトルは、遊離形態のコンゴレッドの発光スペクト
ルに比べて、少し長波長側にシフトする(レッドシフト)。励起波長５００ｎｍを
用いて、コンゴレッドの発光スペクトルを記録した。コンゴレッドの複合体の発
光極大は、約６０５ｎｍを中心とする。遊離のコンゴレッドの発光スペクトルお
よび新鮮なポリペプチド(単量体ペプチド)の存在下におけるコンゴレッドの発光
スペクトルは、６２０ｎｍ付近を中心とする。また、遊離および結合形態のコン
ゴレッドの励起スペクトルは有意に異なる。共凝集体および予め形成された凝集
体の複合体の両方における結合形態のコンゴレッドの励起極大は、５２５ｎｍ付
近を中心とする。これらのスペクトルは、それゆえ、遊離形態のコンゴレッドに
対して、有意にレッドシフトする。蛍光スペクトルの差は、アミロイドポリペプ
チドに結合することによるコンゴレッドの微小環境の変化によるものである。
の凝集形態を調べるのに用いることができる。コンゴレッドとアミロイドポリペ
プチドとの複合体の蛍光スペクトルは、遊離形態のコンゴレッドの発光スペクト
ルに比べて、少し長波長側にシフトする(レッドシフト)。励起波長５００ｎｍを
用いて、コンゴレッドの発光スペクトルを記録した。コンゴレッドの複合体の発
光極大は、約６０５ｎｍを中心とする。遊離のコンゴレッドの発光スペクトルお
よび新鮮なポリペプチド(単量体ペプチド)の存在下におけるコンゴレッドの発光
スペクトルは、６２０ｎｍ付近を中心とする。また、遊離および結合形態のコン
ゴレッドの励起スペクトルは有意に異なる。共凝集体および予め形成された凝集
体の複合体の両方における結合形態のコンゴレッドの励起極大は、５２５ｎｍ付
近を中心とする。これらのスペクトルは、それゆえ、遊離形態のコンゴレッドに
対して、有意にレッドシフトする。蛍光スペクトルの差は、アミロイドポリペプ
チドに結合することによるコンゴレッドの微小環境の変化によるものである。
【００６４】
強度に基づく測定に加えて、他の蛍光技術、例えば、(ｉ)蛍光異方性法および
(ii)共凝集体および予め形成された凝集体の複合体の存在下におけるコンゴレッ
ドの減衰時間を同定および分解する時間分解蛍光発光測定法は、アミロイド構造
を区別するのに有用である。
(ii)共凝集体および予め形成された凝集体の複合体の存在下におけるコンゴレッ
ドの減衰時間を同定および分解する時間分解蛍光発光測定法は、アミロイド構造
を区別するのに有用である。
【００６５】
蛍光異方性法(太字、斜体)
発蛍光団の分極または異方性は、光の吸収と放出との間における発蛍光団の角
分散により生じる。角分散は、発蛍光団の励起状態の寿命の間における回転分散
の速度および程度に依存する(ラコビッチ，ジェイ・アール(Lakowicz, J.R.)、
プリンシプルズ・オブ・フルオレスンス・スペクトロスコピー(Principles of F
luorescence Spectroscopy)、プレナム・プレス(Plenum Press)、ニューヨーク
、1983年)。分散運動は、いくつかのパラメーターに依存する。本出願に最も重
要なものは、アミロイドタンパクの分子サイズおよび形状の変化である。蛍光異
方性法は、試験化合物の非存在下および存在下における凝集によるタンパク-タ
ンパク相互作用によるアミロイドタンパクに分子サイズの増大を測定するのに用
いうる。より具体的には、分極の測定は、小さい分子が「等方性」；すなわち、
それらは溶液中で自由に回転するという原理に基づいている。それらが巨大分子
に結合または付着した場合、回転およびタンブリング運動がより遅く、それゆえ
、発光に異方性を与える。自己蛍光の小さい分子をプローブとして用いる場合、
分子の発光は、巨大分子に結合することにより「分極」する(リー，ワイ・シー(
Lee, Y.C.)、ジャーナル・オブ・バイオケミストリー(J. Biochem.),1997,121(5
):818-825)。蛍光の性質の変化は、２通りに用いることができる。第１は、コン
ゴレッドなどの小さい分子の蛍光異方性の変化を用いて、タンパクの複合体の分
子サイズが異なるかどうかを決定しうる。第２の方法では、アミロイドタンパク
を発蛍光団で直接標識して、２つの異なる場合に、タンパクの分子サイズを測定
することができる。
分散により生じる。角分散は、発蛍光団の励起状態の寿命の間における回転分散
の速度および程度に依存する(ラコビッチ，ジェイ・アール(Lakowicz, J.R.)、
プリンシプルズ・オブ・フルオレスンス・スペクトロスコピー(Principles of F
luorescence Spectroscopy)、プレナム・プレス(Plenum Press)、ニューヨーク
、1983年)。分散運動は、いくつかのパラメーターに依存する。本出願に最も重
要なものは、アミロイドタンパクの分子サイズおよび形状の変化である。蛍光異
方性法は、試験化合物の非存在下および存在下における凝集によるタンパク-タ
ンパク相互作用によるアミロイドタンパクに分子サイズの増大を測定するのに用
いうる。より具体的には、分極の測定は、小さい分子が「等方性」；すなわち、
それらは溶液中で自由に回転するという原理に基づいている。それらが巨大分子
に結合または付着した場合、回転およびタンブリング運動がより遅く、それゆえ
、発光に異方性を与える。自己蛍光の小さい分子をプローブとして用いる場合、
分子の発光は、巨大分子に結合することにより「分極」する(リー，ワイ・シー(
Lee, Y.C.)、ジャーナル・オブ・バイオケミストリー(J. Biochem.),1997,121(5
):818-825)。蛍光の性質の変化は、２通りに用いることができる。第１は、コン
ゴレッドなどの小さい分子の蛍光異方性の変化を用いて、タンパクの複合体の分
子サイズが異なるかどうかを決定しうる。第２の方法では、アミロイドタンパク
を発蛍光団で直接標識して、２つの異なる場合に、タンパクの分子サイズを測定
することができる。
【００６６】
第１の場合、典型的な実験では、遊離のコンゴレッドの蛍光分極は、アミロイ
ドタンパクの非存在下で測定される。次いで、試験化合物の共凝集体の複合体に
おけるコンゴレッドの結合形態の異方性値のその遊離形態に対する上昇を用いて
、ポリペプチド凝集に対する試験化合物の効果を測定する手段として、アミロイ
ドタンパクのサイズおよび形状の差を評価することができる。
ドタンパクの非存在下で測定される。次いで、試験化合物の共凝集体の複合体に
おけるコンゴレッドの結合形態の異方性値のその遊離形態に対する上昇を用いて
、ポリペプチド凝集に対する試験化合物の効果を測定する手段として、アミロイ
ドタンパクのサイズおよび形状の差を評価することができる。
【００６７】
第２の場合には、発蛍光団標識したアミロイドペプチドを用いて、コンゴレッ
ドまたは試験化合物の存在下において形成された凝集体を区別することができる
。ルテニウムビピリジル錯体、フルオレセインおよびローダミンなどの発蛍光団
は、異方性アッセイの有用なプローブである。ルテニウムリガンド錯体は、大き
い分子量のタンパクの分子サイズを区別するのに特に適している。ルテニウムビ
ピリジル錯体は、蛍光寿命が通常１０ナノ秒のオーダーであるフルオレセインま
たはローダミン基などの他の発蛍光団に比べて、減衰時間が４００ｎｓのオーダ
ーで長い。ルテニウム錯体のより長い減衰時間は、溶液中で非常に遅い時間スケ
ールでタンブリングするより大きいタンパク分子の分子量を調べるのに適してい
る。フルオレセインなどの発蛍光団は、他方、５０,０００ダルトンに対応する
分子量およびサイズの範囲内にあるＡβペプチドのより小さいオリゴマーを区別
するのに有用である。
ドまたは試験化合物の存在下において形成された凝集体を区別することができる
。ルテニウムビピリジル錯体、フルオレセインおよびローダミンなどの発蛍光団
は、異方性アッセイの有用なプローブである。ルテニウムリガンド錯体は、大き
い分子量のタンパクの分子サイズを区別するのに特に適している。ルテニウムビ
ピリジル錯体は、蛍光寿命が通常１０ナノ秒のオーダーであるフルオレセインま
たはローダミン基などの他の発蛍光団に比べて、減衰時間が４００ｎｓのオーダ
ーで長い。ルテニウム錯体のより長い減衰時間は、溶液中で非常に遅い時間スケ
ールでタンブリングするより大きいタンパク分子の分子量を調べるのに適してい
る。フルオレセインなどの発蛍光団は、他方、５０,０００ダルトンに対応する
分子量およびサイズの範囲内にあるＡβペプチドのより小さいオリゴマーを区別
するのに有用である。
【００６８】
典型的な実験では、試験化合物またはコンゴレッドをアミロイドタンパクの存
在下で凝集させる。Ａβペプチドは、スクシンイミジルエステルおよびイソチオ
シアネート基の標準的なカップリング化学を用いて、フルオレセイン、ローダミ
ンまたはルテニウムなどの発蛍光団に結合させて、標識したペプチドを得ること
ができる(シマシンスキー(Szmacinski)ら、バイオフィジカル・ケミストリー(Bi
ophys. Chem.),1996,62:109-120)。最初の実験では、遊離の発蛍光団の定常状態
異方性を測定する。標識したペプチドの異方性値は、分子の急速なタンブリング
運動により小さい。アミロイドタンパクの存在下における蛍光ペプチドのエイジ
ングは、アミロイドタンパクの分子サイズの増大および形状の変化により、発蛍
光団の異方性値を上昇させる。標識したペプチドは、主に蛍光プローブとして用
いられるので、その濃度は、典型的には、アミロイドタンパクの濃度より約１０
倍〜約１０００倍低い。
在下で凝集させる。Ａβペプチドは、スクシンイミジルエステルおよびイソチオ
シアネート基の標準的なカップリング化学を用いて、フルオレセイン、ローダミ
ンまたはルテニウムなどの発蛍光団に結合させて、標識したペプチドを得ること
ができる(シマシンスキー(Szmacinski)ら、バイオフィジカル・ケミストリー(Bi
ophys. Chem.),1996,62:109-120)。最初の実験では、遊離の発蛍光団の定常状態
異方性を測定する。標識したペプチドの異方性値は、分子の急速なタンブリング
運動により小さい。アミロイドタンパクの存在下における蛍光ペプチドのエイジ
ングは、アミロイドタンパクの分子サイズの増大および形状の変化により、発蛍
光団の異方性値を上昇させる。標識したペプチドは、主に蛍光プローブとして用
いられるので、その濃度は、典型的には、アミロイドタンパクの濃度より約１０
倍〜約１０００倍低い。
【００６９】
第２の実験では、エイジングの間にアミロイドタンパクおよび試験化合物と接
触させた標識したペプチドの蛍光異方性値を測定する。異方性の増大は、タンパ
クの分子サイズの増大によるものである。あるいは、異方性値の上昇を用いて、
より高分子量の凝集体の形成の速度を測定して、試験化合物の効果を同定するこ
とができる。
触させた標識したペプチドの蛍光異方性値を測定する。異方性の増大は、タンパ
クの分子サイズの増大によるものである。あるいは、異方性値の上昇を用いて、
より高分子量の凝集体の形成の速度を測定して、試験化合物の効果を同定するこ
とができる。
【００７０】
時間分解した蛍光(太字、斜体)
コンゴレッドなどの発蛍光団または蛍光標識したペプチド(蛍光異方性法で説
明)の蛍光減衰速度論を用いて、試験化合物とアミロイドタンパクとの複合体を
同定し、区別することができる。この方法は、結合および遊離形態の阻害薬の放
射および非放射減衰速度の変化によるタンパクに結合することにより蛍光寿命が
変化するという前提に基づいている。コンゴレッドの蛍光寿命は、周波数ドメイ
ンまたは時間ドメインの装置を用いて測定することができる。例えば、コンゴレ
ッドまたは蛍光標識したペプチドのパラメーター、平均寿命を評価することがで
きる。平均寿命は、結合および遊離形態の発蛍光団の寿命および濃度の関数であ
る。あるいは、寿命に基づくアプローチを生きたニューロン培養物に適用するこ
ともできる。寿命の分布は、細胞の蛍光イメージングを用いて、遊離および複合
体化した形態のコンゴレッドについて評価しうる。二次元イメージング(ＦＬＩ
Ｍまたは蛍光寿命イメージング)のこの方法は、フェーズフローサイトメーター
を用いて、それらがレーザービームを通過する際のセルバイセル基準でコンゴレ
ッドの分布を提供する。分泌または細胞外形態のアミロイドタンパクは、ＦＬＩ
Ｍ法を用いて同定することができる。ＦＬＩＭアプローチは、細胞培養物の培地
中または組織試料の媒体中に分泌されたアミロイドタンパクを検出するのに非常
に有用である。
明)の蛍光減衰速度論を用いて、試験化合物とアミロイドタンパクとの複合体を
同定し、区別することができる。この方法は、結合および遊離形態の阻害薬の放
射および非放射減衰速度の変化によるタンパクに結合することにより蛍光寿命が
変化するという前提に基づいている。コンゴレッドの蛍光寿命は、周波数ドメイ
ンまたは時間ドメインの装置を用いて測定することができる。例えば、コンゴレ
ッドまたは蛍光標識したペプチドのパラメーター、平均寿命を評価することがで
きる。平均寿命は、結合および遊離形態の発蛍光団の寿命および濃度の関数であ
る。あるいは、寿命に基づくアプローチを生きたニューロン培養物に適用するこ
ともできる。寿命の分布は、細胞の蛍光イメージングを用いて、遊離および複合
体化した形態のコンゴレッドについて評価しうる。二次元イメージング(ＦＬＩ
Ｍまたは蛍光寿命イメージング)のこの方法は、フェーズフローサイトメーター
を用いて、それらがレーザービームを通過する際のセルバイセル基準でコンゴレ
ッドの分布を提供する。分泌または細胞外形態のアミロイドタンパクは、ＦＬＩ
Ｍ法を用いて同定することができる。ＦＬＩＭアプローチは、細胞培養物の培地
中または組織試料の媒体中に分泌されたアミロイドタンパクを検出するのに非常
に有用である。
【００７１】
赤外およびＮＭＲ分光学(太字、斜体)
アミロイドタンパクの赤外吸収スペクトルは、試験化合物またはコンゴレッド
と複合体化した場合の凝集体におけるアミロイドタンパクの構造を決定するのに
有用なツールである。ペプチド結合のカルボニル伸縮振動を表すアミドＩバンド
の周波数は、ペプチド骨格のコンホメーション、それゆえ、ポリペプチドの２次
構造に敏感である。βシート構造のアミドＩバンドは、１６２０〜１６４０ｃｍ −１ で吸収し、１６８０〜１６９５ｃｍ−１のより高い周波数で弱く吸収する。
ポリペプチドが試験化合物またはスルホン化色素の非存在下および存在下におい
て凝集する場合のアミロイドポリペプチドのコンホメーションの変化は、アミド
Ｉ吸収バンドの差に基づいて解釈することができる。
と複合体化した場合の凝集体におけるアミロイドタンパクの構造を決定するのに
有用なツールである。ペプチド結合のカルボニル伸縮振動を表すアミドＩバンド
の周波数は、ペプチド骨格のコンホメーション、それゆえ、ポリペプチドの２次
構造に敏感である。βシート構造のアミドＩバンドは、１６２０〜１６４０ｃｍ −１ で吸収し、１６８０〜１６９５ｃｍ−１のより高い周波数で弱く吸収する。
ポリペプチドが試験化合物またはスルホン化色素の非存在下および存在下におい
て凝集する場合のアミロイドポリペプチドのコンホメーションの変化は、アミド
Ｉ吸収バンドの差に基づいて解釈することができる。
【００７２】
ＮＭＲは、試験化合物またはコンゴレッドの非存在下および存在下で凝集した
場合のタンパクに関する構造情報を得るのに同様に有用である。アミロイドポリ
ペプチドの構造は、好ましくはプロトンまたは１３Ｃもしくは１５Ｎなどの他の
核の化学シフトを用いて解明しうる。プロトンの化学シフトは、構造の特定に、
ごく一般的に用いられる。βシート領域がαＨ共鳴に対して低磁場シフトを示す
ことは文献に詳しく記載されている。ヘリックス領域は、他方、高磁場シフトを
示す。５０００アミドプロトンおよびαＨシフトを含むデータセットに基づいて
、ヘリックスおよびシートの平均的なαＨ位置は、ほぼ０.８ｐｐｍだけ異なっ
ており、２つの分布の間でほんのわずかしか重複していない(メソッズ・イン・
エンザイモロジー(Methods in Enzymology)、第239巻、パートＣ、第363-392頁(
1994年))。この一般的な傾向は、アミドプロテインについても同様に当てはまり
、それゆえ、βシート形態を同定することができる。ヘリックスのＮ末端におけ
るアミドプトロンは、Ｃ末端におけるものに比べて、低磁場側にシフトする傾向
がある。プトロン共鳴におけるかかる化学シフトは、それゆえ、モノマーのポリ
ペプチドと、試験化合物の非存在下および存在下における凝集形態との構造的な
差を特定するのに用いることができる。
場合のタンパクに関する構造情報を得るのに同様に有用である。アミロイドポリ
ペプチドの構造は、好ましくはプロトンまたは１３Ｃもしくは１５Ｎなどの他の
核の化学シフトを用いて解明しうる。プロトンの化学シフトは、構造の特定に、
ごく一般的に用いられる。βシート領域がαＨ共鳴に対して低磁場シフトを示す
ことは文献に詳しく記載されている。ヘリックス領域は、他方、高磁場シフトを
示す。５０００アミドプロトンおよびαＨシフトを含むデータセットに基づいて
、ヘリックスおよびシートの平均的なαＨ位置は、ほぼ０.８ｐｐｍだけ異なっ
ており、２つの分布の間でほんのわずかしか重複していない(メソッズ・イン・
エンザイモロジー(Methods in Enzymology)、第239巻、パートＣ、第363-392頁(
1994年))。この一般的な傾向は、アミドプロテインについても同様に当てはまり
、それゆえ、βシート形態を同定することができる。ヘリックスのＮ末端におけ
るアミドプトロンは、Ｃ末端におけるものに比べて、低磁場側にシフトする傾向
がある。プトロン共鳴におけるかかる化学シフトは、それゆえ、モノマーのポリ
ペプチドと、試験化合物の非存在下および存在下における凝集形態との構造的な
差を特定するのに用いることができる。
【００７３】
分析的な超遠心分離(太字、斜体)
分光学的な方法と共に、分析的な超遠心分離法は、アミロイドポリペプチドの
溶液分子量を測定し、分子同質性の程度を評価するのに有用である。沈降法は、
アミロイドポリペプチドの凝集体が溶液中に存在するかどうか、また、凝集体が
自然で可逆または非可逆であるかを迅速に決定するのに用いることができる。本
質的に２つの沈降法が存在する：沈降速度法および沈降平衡法である。第１の方
法は、凝集したポリペプチドのサイズ、形状および分子量を評価する迅速な手段
を提供する。後者の方法は、ポリペプチドの浮遊分子量を測定するのに有用であ
る。試験化合物の非存在下および存在下で凝集したポリペプチドの平均分子量の
差は、沈降速度法および沈降平衡法を用いて測定しうる。これらの方法の適用は
、コンゴレッドまたは他の試験化合物の存在下で形成されたものなどの凝集体の
サイズおよび性質を区別するのに、また、核形成段階において、または、さらに
伸長段階の間に、ポリペプチドの凝集を阻止する際における試験化合物の効力を
評価するのに役立つ。この情報は、分光学的な方法により得られた構造情報を補
足する。
溶液分子量を測定し、分子同質性の程度を評価するのに有用である。沈降法は、
アミロイドポリペプチドの凝集体が溶液中に存在するかどうか、また、凝集体が
自然で可逆または非可逆であるかを迅速に決定するのに用いることができる。本
質的に２つの沈降法が存在する：沈降速度法および沈降平衡法である。第１の方
法は、凝集したポリペプチドのサイズ、形状および分子量を評価する迅速な手段
を提供する。後者の方法は、ポリペプチドの浮遊分子量を測定するのに有用であ
る。試験化合物の非存在下および存在下で凝集したポリペプチドの平均分子量の
差は、沈降速度法および沈降平衡法を用いて測定しうる。これらの方法の適用は
、コンゴレッドまたは他の試験化合物の存在下で形成されたものなどの凝集体の
サイズおよび性質を区別するのに、また、核形成段階において、または、さらに
伸長段階の間に、ポリペプチドの凝集を阻止する際における試験化合物の効力を
評価するのに役立つ。この情報は、分光学的な方法により得られた構造情報を補
足する。
【００７４】
アッセイ(太字)
上記の分光学的な技術の１種またはそれ以上は、所望により、超遠心分離など
の非分光学的な技術と共に、インビトロでアミロイドーシスを阻害または逆転す
るその能力を評価した試験化合物の効果を測定するのに用いることができる。実
際、本願に記載した分光学的な技術の１種より多く、好ましくはすべての結果か
らの情報を組み合わせることにより、試験化合物がどのようにアミロイド形成に
影響を与えるかをある程度詳細にかつ確実に決定することができる。これらのデ
ータは、アミロイドーシスに関連する疾患または障害、特にアルツハイマー病を
治療する化合物をスクリーニングおよび試験するのに非常に重要な含蓄を有する
。
の非分光学的な技術と共に、インビトロでアミロイドーシスを阻害または逆転す
るその能力を評価した試験化合物の効果を測定するのに用いることができる。実
際、本願に記載した分光学的な技術の１種より多く、好ましくはすべての結果か
らの情報を組み合わせることにより、試験化合物がどのようにアミロイド形成に
影響を与えるかをある程度詳細にかつ確実に決定することができる。これらのデ
ータは、アミロイドーシスに関連する疾患または障害、特にアルツハイマー病を
治療する化合物をスクリーニングおよび試験するのに非常に重要な含蓄を有する
。
【００７５】
ここで用いるように、「化合物」なる用語は、アミロイドーシスに影響を与え
る分子または１個より多くの分子の複合体を意味する。本発明は、合成の小さい
分子の薬剤、化学的な化合物、化学的な複合体、およびその塩のスクリーンだけ
でなく、天然物、例えば、植物抽出物や、発酵液から得た物質のスクリーンを意
図する。本発明のスクリーンを用いて同定することができる他の分子としては、
タンパクおよびペプチド断片、ペプチド、核酸およびオリゴヌクレオチド、炭水
化物、リン脂質および他の脂質誘導体、ステロイドおよびステロイド誘導体、プ
ロスタグランジンおよび関連のアラキドン酸誘導体などが挙げられる。
る分子または１個より多くの分子の複合体を意味する。本発明は、合成の小さい
分子の薬剤、化学的な化合物、化学的な複合体、およびその塩のスクリーンだけ
でなく、天然物、例えば、植物抽出物や、発酵液から得た物質のスクリーンを意
図する。本発明のスクリーンを用いて同定することができる他の分子としては、
タンパクおよびペプチド断片、ペプチド、核酸およびオリゴヌクレオチド、炭水
化物、リン脂質および他の脂質誘導体、ステロイドおよびステロイド誘導体、プ
ロスタグランジンおよび関連のアラキドン酸誘導体などが挙げられる。
【００７６】
ある具体例では、凝集、すなわちアミロイド形成またはアミロイドーシスに至
る条件下で、試験化合物を可溶性アミロイドポリペプチドとインキュベートする
。次いで、得られた物質(場合によっては、凝集体である)をアミロイド特異的な
分光学的プローブと接触させて、１種またはそれ以上のスペクトルを得る。さら
なる具体例では、色素を加える前に試験化合物をポリペプチドから除去する。
る条件下で、試験化合物を可溶性アミロイドポリペプチドとインキュベートする
。次いで、得られた物質(場合によっては、凝集体である)をアミロイド特異的な
分光学的プローブと接触させて、１種またはそれ以上のスペクトルを得る。さら
なる具体例では、色素を加える前に試験化合物をポリペプチドから除去する。
【００７７】
別の具体例では、色素は凝集を誘発する前に試験化合物および可溶形態のアミ
ロイドポリペプチドと共に存在する。
ロイドポリペプチドと共に存在する。
【００７８】
さらに別の具体例では、アミロイドポリペプチドの予め形成された凝集体を試
験化合物で処理して、試験化合物が凝集体に対してどのような効果(存在するな
ら)を有するのかを決定する。この効果は、凝集体を試験化合物とインキュベー
トした後で凝集体を色素と接触させることにより評価することができる。
験化合物で処理して、試験化合物が凝集体に対してどのような効果(存在するな
ら)を有するのかを決定する。この効果は、凝集体を試験化合物とインキュベー
トした後で凝集体を色素と接触させることにより評価することができる。
【００７９】
さらに別の具体例では、試験化合物自体は、アミロイド特異的な分光学的プロ
ーブ、または、発色団的、好ましくは発蛍光団的な性質を有する関連分子であり
うる。かくして、試験化合物を用いて、凝集体の形態を調べるだけでなく、凝集
体の形態を破壊または阻害することができる。
ーブ、または、発色団的、好ましくは発蛍光団的な性質を有する関連分子であり
うる。かくして、試験化合物を用いて、凝集体の形態を調べるだけでなく、凝集
体の形態を破壊または阻害することができる。
【００８０】
ＵＶおよび蛍光分光学的な技術は、それらを直接的な構造情報の単一読出しに
頼るように変更することができるので、高処理量スクリーンに容易に適合させる
ことができる。しかし、すべての関連するスペクトルにわたる技術のすべてを用
いることにより、候補の試験化合物の集合から有望な化合物を同定するのに役立
つ凝集形態のより微妙な変化を同定することができる。
頼るように変更することができるので、高処理量スクリーンに容易に適合させる
ことができる。しかし、すべての関連するスペクトルにわたる技術のすべてを用
いることにより、候補の試験化合物の集合から有望な化合物を同定するのに役立
つ凝集形態のより微妙な変化を同定することができる。
【００８１】
分光学的な分析を可能にするためにアッセイはインビトロで行われるが、いか
なる起源に由来するアミロイドポリペプチド、すなわち天然または合成のポリペ
プチドを用いることができる。例えば、Ａβを含有しうる脳脊髄液を試験するこ
とができる。別の具体例では、異なるアミロイドポリペプチドの１種を含有しう
る血液、血清または血漿を試験することができる。さらなる具体例では、体液、
例えば、ＣＳＦおよび血液または血液生産物は明確なスペクトルを得るのを妨害
しうるので、これらの起源の１種またはそれ以上に由来するアミロイドポリペプ
チドは標準的な緩衝液中で単離し、試験することができる。
なる起源に由来するアミロイドポリペプチド、すなわち天然または合成のポリペ
プチドを用いることができる。例えば、Ａβを含有しうる脳脊髄液を試験するこ
とができる。別の具体例では、異なるアミロイドポリペプチドの１種を含有しう
る血液、血清または血漿を試験することができる。さらなる具体例では、体液、
例えば、ＣＳＦおよび血液または血液生産物は明確なスペクトルを得るのを妨害
しうるので、これらの起源の１種またはそれ以上に由来するアミロイドポリペプ
チドは標準的な緩衝液中で単離し、試験することができる。
【００８２】
実施例
本発明は、以下の実施例を参照することにより、より良く理解されるが、これ
らの実施例は、例示のために与えられるのであって、限定のために与えられるの
ではない。
らの実施例は、例示のために与えられるのであって、限定のために与えられるの
ではない。
【００８３】
実施例１：アミロイドペプチドの線維形成の特徴付け
アミロイド形成性ペプチドの自己集合に対する小さい分子の阻害薬の効果およ
び細胞毒性に対する同時の効果を測定する継続的な関心が存在する。この目標に
向かって、コンゴレッドの存在下および非存在下におけるペプチドの線維化の程
度を測定するために、定量的な蛍光法およびＣＤ法を行った。この研究は、(ｉ)
チオフラビンＴおよびＣＤ分光学の蛍光の変化を用いて、βひだ折れシートコン
ホメーションの形成の同時評価；(ii)ペプチドの凝集の速度に対する媒体の効果
；(iii)ＬＤＨの放出をインジケーターとして用いる、海馬細胞培養物に対する
凝集したペプチドの毒性；および(iv)チオフラビンの存在下におけるコンゴレッ
ドとペプチドとの相互作用を示す。
び細胞毒性に対する同時の効果を測定する継続的な関心が存在する。この目標に
向かって、コンゴレッドの存在下および非存在下におけるペプチドの線維化の程
度を測定するために、定量的な蛍光法およびＣＤ法を行った。この研究は、(ｉ)
チオフラビンＴおよびＣＤ分光学の蛍光の変化を用いて、βひだ折れシートコン
ホメーションの形成の同時評価；(ii)ペプチドの凝集の速度に対する媒体の効果
；(iii)ＬＤＨの放出をインジケーターとして用いる、海馬細胞培養物に対する
凝集したペプチドの毒性；および(iv)チオフラビンの存在下におけるコンゴレッ
ドとペプチドとの相互作用を示す。
【００８４】
方法(太字)
蛍光分光学(太字、斜体)。チオフラビンは、アミロイド線維に結合して、スペ
クトルの特徴的な高色素性蛍光シフトを誘発する(レヴィン(LeVine)、ジャーナ
ル・オブ・エクスペリメンタル・アンド・クリニカル・インベスティゲーション
(J. Exp. Clin. Invest.),2:1-6,1995)。チオフラビンによる誘発された蛍光は
、アミロイドβひだ折れ線維に特異的であるが、他のβシート構造や、可溶性オ
リゴマー形態のペプチドに特異的ではない。遊離のチオフラビンは、励起極大が
３３０ｎｍである弱い発蛍光団である。アミロイド線維に結合することにより、
チオフラビンの蛍光は、励起スペクトルにおいて、遊離形態に対して１００ｎｍ
だけレッドシフトして増強される。我々は、凝集事象を特徴付けるために、それ
ぞれ４４０ｎｍおよび４８５ｎｍの励起波長および発光波長における蛍光強度の
増大を用いた。
クトルの特徴的な高色素性蛍光シフトを誘発する(レヴィン(LeVine)、ジャーナ
ル・オブ・エクスペリメンタル・アンド・クリニカル・インベスティゲーション
(J. Exp. Clin. Invest.),2:1-6,1995)。チオフラビンによる誘発された蛍光は
、アミロイドβひだ折れ線維に特異的であるが、他のβシート構造や、可溶性オ
リゴマー形態のペプチドに特異的ではない。遊離のチオフラビンは、励起極大が
３３０ｎｍである弱い発蛍光団である。アミロイド線維に結合することにより、
チオフラビンの蛍光は、励起スペクトルにおいて、遊離形態に対して１００ｎｍ
だけレッドシフトして増強される。我々は、凝集事象を特徴付けるために、それ
ぞれ４４０ｎｍおよび４８５ｎｍの励起波長および発光波長における蛍光強度の
増大を用いた。
【００８５】
チオフラビンの誘発された蛍光は、コンゴレッドの存在下では、有意にクエン
チされることが確定された。これらの実験では、チオフラビンは、増加量のコン
ゴレッドで滴定する前に、凝集したペプチドと複合体化した。得られた蛍光強度
の減少は、チオフラビンからコンゴレッドへの蛍光発光のエネルギー転移による
ものである。それゆえ、チオフラビンだけに頼るアッセイは予備アッセイで擬陽
性を生じると思われるのに対し、本発明に記載した分光学的なアッセイはアミロ
イド形成のより有望な阻害薬を同定する。
チされることが確定された。これらの実験では、チオフラビンは、増加量のコン
ゴレッドで滴定する前に、凝集したペプチドと複合体化した。得られた蛍光強度
の減少は、チオフラビンからコンゴレッドへの蛍光発光のエネルギー転移による
ものである。それゆえ、チオフラビンだけに頼るアッセイは予備アッセイで擬陽
性を生じると思われるのに対し、本発明に記載した分光学的なアッセイはアミロ
イド形成のより有望な阻害薬を同定する。
【００８６】
円偏光二色性分光学(太字、斜体)。エイジングの間におけるランダムコイルか
らβシート形態へのペプチドのコンホメーション変化は、２００、２１８または
２２５ｎｍにおけるペプチドのモル楕円率の変化を用いてモニターした。また、
このアッセイは、ＣＤスペクトルの変化がチオフラビンの蛍光スペクトルの変化
と同時に起こるかどうかを決定するのに用いた。ペプチドのＣＤスペクトルを様
々な時点でスキャンして、チオフラビンに結合する巨大分子の集合体の形成とβ
シートコンホメーションの出現とを相関付けた。
らβシート形態へのペプチドのコンホメーション変化は、２００、２１８または
２２５ｎｍにおけるペプチドのモル楕円率の変化を用いてモニターした。また、
このアッセイは、ＣＤスペクトルの変化がチオフラビンの蛍光スペクトルの変化
と同時に起こるかどうかを決定するのに用いた。ペプチドのＣＤスペクトルを様
々な時点でスキャンして、チオフラビンに結合する巨大分子の集合体の形成とβ
シートコンホメーションの出現とを相関付けた。
【００８７】
分光学的アッセイ(太字、斜体)。凝集の程度を測定するために、ペプチドのア
リコットを様々な時間間隔(９時間まで)で取り出し、１０μＭチオフラビンを含
有するＰＢＳ緩衝液に希釈した。蛍光アッセイにおけるペプチドおよびチオフラ
ビンの最終濃度は１０μＭであった。ペプチド-チオフラビン複合体の蛍光強度
は、反応を５分間平衡化させた後、それぞれ４３５ｎｍおよび４８５ｎｍの励起
波長および発光波長で測定した。蛍光スペクトルのスキャンは、スペックス(SPE
XTM)フルオロログ-２分光蛍光計(インスツルメンツ・エス・エイ(Instruments S
.A.；登録商標)、ジョビン・イボン-スペックス(Jobin Yvon-Spex)、ニュージャ
ージー州エジソン)を用いて、励起波長４３５ｎｍおよび発光波長４８５ｎｍを
用いて行った。コンゴレッドの実験では、ペプチド-チオフラビン複合体を０.１
〜３.５マイクロモル濃度の増大する濃度のコンゴレッドで滴定した。蛍光強度
の変化は、上記のスペクトル波長で測定した。蛍光強度をプレート読取り機で測
定する場合、ペプチドは１０μＭチオフラビンを含有するＰＢＳ緩衝液に最終容
量１００μＬに希釈した。
リコットを様々な時間間隔(９時間まで)で取り出し、１０μＭチオフラビンを含
有するＰＢＳ緩衝液に希釈した。蛍光アッセイにおけるペプチドおよびチオフラ
ビンの最終濃度は１０μＭであった。ペプチド-チオフラビン複合体の蛍光強度
は、反応を５分間平衡化させた後、それぞれ４３５ｎｍおよび４８５ｎｍの励起
波長および発光波長で測定した。蛍光スペクトルのスキャンは、スペックス(SPE
XTM)フルオロログ-２分光蛍光計(インスツルメンツ・エス・エイ(Instruments S
.A.；登録商標)、ジョビン・イボン-スペックス(Jobin Yvon-Spex)、ニュージャ
ージー州エジソン)を用いて、励起波長４３５ｎｍおよび発光波長４８５ｎｍを
用いて行った。コンゴレッドの実験では、ペプチド-チオフラビン複合体を０.１
〜３.５マイクロモル濃度の増大する濃度のコンゴレッドで滴定した。蛍光強度
の変化は、上記のスペクトル波長で測定した。蛍光強度をプレート読取り機で測
定する場合、ペプチドは１０μＭチオフラビンを含有するＰＢＳ緩衝液に最終容
量１００μＬに希釈した。
【００８８】
ＣＤスペクトルは、ジャスコ(JASCOTM)分光偏光計モデルJ715(ジャスコ(Jasco
)、メリーランド州イーストン)により、室温、光路長０.１ｃｍのセルで記録し
た。典型的には、ペプチド試料を蛍光用に様々な時間間隔でアリコットし、残り
の溶液を用いて、ＣＤスペクトルをスキャンした。ペプチドのＣＤスペクトルは
、１９０〜２６０ｎｍの遠紫外で記録した。スペクトルの結果は、deg.cm3.dmol -1 で表す。
)、メリーランド州イーストン)により、室温、光路長０.１ｃｍのセルで記録し
た。典型的には、ペプチド試料を蛍光用に様々な時間間隔でアリコットし、残り
の溶液を用いて、ＣＤスペクトルをスキャンした。ペプチドのＣＤスペクトルは
、１９０〜２６０ｎｍの遠紫外で記録した。スペクトルの結果は、deg.cm3.dmol -1 で表す。
【００８９】
神経毒性アッセイ(太字、斜体)。ＣＤおよび蛍光アッセイで決定された終点に
従ってペプチドを凝集させ、初代ニューロン細胞培養物に適用して、凝集したペ
プチドの細胞毒性を評価した。ＬＤＨの放出を用いて、Ａβおよびコンゴレッド
の存在下における細胞生存能力をモニターした。
従ってペプチドを凝集させ、初代ニューロン細胞培養物に適用して、凝集したペ
プチドの細胞毒性を評価した。ＬＤＨの放出を用いて、Ａβおよびコンゴレッド
の存在下における細胞生存能力をモニターした。
【００９０】
Ａβ(１-４０)毒性は、８日間のインビトロ(ＤＩＶ)ラット胎児(Ｅ１８)海馬
培養物を用いて評価した。事前に５００μｌ/ウェルの０.１ｍｇ/ｍｌのポリ-Ｌ
-リジン(１００μｌ/ウェル)で被覆し、引き続いて、１００μｌ/ウェルの５μ
ｇ/ｍｌのマウスラミニンで被覆した４８ウェル皿で細胞を培養した。細胞を全
容量５００μｌのニューロベイサル(NEUROBASALTM)培地(1XB27サプリメント、５
％熱不活化し弱めたウシ胎児血清、０.５ｍＭグルタミン、５０μ/ｍｌペニシリ
ン、および０.０５ｍｇ/ｍｌストレプトマイシンを含有)に９２,３００細胞/ウ
ェルの密度で播種し、最初は、空気中の加湿した５％ＣＯ２中に入れた。２４時
間後、培地を、ペニシリン、ストレプトマイシンおよびウシ胎児血清を欠く新鮮
な培地で置き換え、培養物を、その後は、５％ＣＯ２および９％Ｏ２を含有する
空気中で保持した。第５日目に、新鮮な培地を各ウェルに置き換えた。第７日目
に、インビトロで、培地を、ペニシリン、ストレプトマイシンおよびウシ胎児血
清を欠く酸化防止剤非含有のＢ２７補足培地で置き換えた。毒性試験は、第８日
目に、インビトロで、各ウェルに、５００μｌの第７日目に用いた培地(対照処
理として)、または最終(対照)培地を用いて調製した実験溶液を置き換えること
により開始した。各実験溶液は、５個のウェルに含有される培養物について試験
した。毒性は、第１１日目に、インビトロで、乳酸デヒドロゲナーゼ(ＬＤＨ；
シグマ(Sigma)340-UV)アッセイを用いて評価した。凝集したペプチドを毒性アッ
セイ用として５倍に希釈し、最終濃度１０μＭとした。コンゴレッドと予め形成
された凝集体の複合体および共凝集体中に形成されたものを、媒体対照中の凝集
したペプチドと共に、細胞アッセイで試験した。
培養物を用いて評価した。事前に５００μｌ/ウェルの０.１ｍｇ/ｍｌのポリ-Ｌ
-リジン(１００μｌ/ウェル)で被覆し、引き続いて、１００μｌ/ウェルの５μ
ｇ/ｍｌのマウスラミニンで被覆した４８ウェル皿で細胞を培養した。細胞を全
容量５００μｌのニューロベイサル(NEUROBASALTM)培地(1XB27サプリメント、５
％熱不活化し弱めたウシ胎児血清、０.５ｍＭグルタミン、５０μ/ｍｌペニシリ
ン、および０.０５ｍｇ/ｍｌストレプトマイシンを含有)に９２,３００細胞/ウ
ェルの密度で播種し、最初は、空気中の加湿した５％ＣＯ２中に入れた。２４時
間後、培地を、ペニシリン、ストレプトマイシンおよびウシ胎児血清を欠く新鮮
な培地で置き換え、培養物を、その後は、５％ＣＯ２および９％Ｏ２を含有する
空気中で保持した。第５日目に、新鮮な培地を各ウェルに置き換えた。第７日目
に、インビトロで、培地を、ペニシリン、ストレプトマイシンおよびウシ胎児血
清を欠く酸化防止剤非含有のＢ２７補足培地で置き換えた。毒性試験は、第８日
目に、インビトロで、各ウェルに、５００μｌの第７日目に用いた培地(対照処
理として)、または最終(対照)培地を用いて調製した実験溶液を置き換えること
により開始した。各実験溶液は、５個のウェルに含有される培養物について試験
した。毒性は、第１１日目に、インビトロで、乳酸デヒドロゲナーゼ(ＬＤＨ；
シグマ(Sigma)340-UV)アッセイを用いて評価した。凝集したペプチドを毒性アッ
セイ用として５倍に希釈し、最終濃度１０μＭとした。コンゴレッドと予め形成
された凝集体の複合体および共凝集体中に形成されたものを、媒体対照中の凝集
したペプチドと共に、細胞アッセイで試験した。
【００９１】
アミロイドペプチドの調製(太字、斜体)。Ａβ(１-４０)はアナスペック(Anas
pec；カリフォルニア州サンホゼ)から購入し、その化学的純度は逆相ＨＰＬＣ、
ＥＳＩ-ＭＳおよびタンパク配列決定法を用いて確認した。凍結乾燥したペプチ
ドをヘキサフルオロイソプロパノール(ＨＦＩＰ)溶媒に溶解して、ペプチドの分
離を促進させた。ＨＦＩＰ溶媒中のペプチドは、−８０℃で保存した。使用前に
、ペプチド溶液を解凍し、溶媒を窒素気流下でエバポレートした。ペプチドを濃
度５０μＭが得られるように緩衝液に溶解し、およそ２０〜４０秒間音波処理し
た後、およそ５秒間またはそれ以下にわたり軽くボルテックスミキサー攪拌して
、ペプチドの溶解を促進させた。凝集の速度に対する媒体の効果を測定するため
に、ペプチドを以下の緩衝液の１つに溶解した：ＰＢＳ、５０ｍＭヘペス(HEPES TM )またはニューロベイサル(NEUROBASALTM)培地。ペプチド溶液をマイクロタイ
タープレートに最終濃度４５μＭ/１００μＬで分注した。凝集は、プレートを
回転ミキサーで絶えず振盪することにより開始した。
pec；カリフォルニア州サンホゼ)から購入し、その化学的純度は逆相ＨＰＬＣ、
ＥＳＩ-ＭＳおよびタンパク配列決定法を用いて確認した。凍結乾燥したペプチ
ドをヘキサフルオロイソプロパノール(ＨＦＩＰ)溶媒に溶解して、ペプチドの分
離を促進させた。ＨＦＩＰ溶媒中のペプチドは、−８０℃で保存した。使用前に
、ペプチド溶液を解凍し、溶媒を窒素気流下でエバポレートした。ペプチドを濃
度５０μＭが得られるように緩衝液に溶解し、およそ２０〜４０秒間音波処理し
た後、およそ５秒間またはそれ以下にわたり軽くボルテックスミキサー攪拌して
、ペプチドの溶解を促進させた。凝集の速度に対する媒体の効果を測定するため
に、ペプチドを以下の緩衝液の１つに溶解した：ＰＢＳ、５０ｍＭヘペス(HEPES TM )またはニューロベイサル(NEUROBASALTM)培地。ペプチド溶液をマイクロタイ
タープレートに最終濃度４５μＭ/１００μＬで分注した。凝集は、プレートを
回転ミキサーで絶えず振盪することにより開始した。
【００９２】
結果(太字)
チオフラビンに結合する構造の出現は、ペプチドのβシートコンホメーション
の形成と同時である。ｐＨおよびイオン強度が高いほど、ペプチドの凝集を促進
する(表３)。
の形成と同時である。ｐＨおよびイオン強度が高いほど、ペプチドの凝集を促進
する(表３)。
【００９３】
【表３】
【００９４】
各値は３回の測定の平均である。＋＋は凝集体が形成されたが、終点に到達しな
かったので定量しなかったことを表す。凝集率(％)は、０および４時間でのチオ
フラビン/Ａβの蛍光に対して計算した。この実験では、ペプチドを回転振盪機
中、速さ５００ｒｐｍで攪拌した。*凝集の相対的な速度は、攪拌の速さに非常
に敏感である。
かったので定量しなかったことを表す。凝集率(％)は、０および４時間でのチオ
フラビン/Ａβの蛍光に対して計算した。この実験では、ペプチドを回転振盪機
中、速さ５００ｒｐｍで攪拌した。*凝集の相対的な速度は、攪拌の速さに非常
に敏感である。
【００９５】
アミロイドペプチドは、ＰＢＳ中で９時間エイジングすることにより、ランダ
ムコイル形態から変形したβシートコンホメーションに変化する。変形したコン
ホメーションは、２２５ｎｍにブロードな極小値を持つＣＤ吸収バンドを有する
。レッドシフトしたＣＤスペクトルは、ねじれβシート構造の形成によるもので
あると思われる。
ムコイル形態から変形したβシートコンホメーションに変化する。変形したコン
ホメーションは、２２５ｎｍにブロードな極小値を持つＣＤ吸収バンドを有する
。レッドシフトしたＣＤスペクトルは、ねじれβシート構造の形成によるもので
あると思われる。
【００９６】
チオフラビンの蛍光発光は、ナノモル濃度のコンゴレッドにより有意にクエン
チされる。クエンチングの程度は、マイクロモル濃度のコンゴレッドで横ばい状
態になった。それゆえ、これはペプチドの初期部位が飽和されることを示す。ペ
プチドに結合したチオフラビンの蛍光は、コンゴレッドにより、大きさが１桁よ
り高くクエンチされたのに対し、クエンチング効果は遊離のチオフラビンの場合
のわずか５０％であった。蛍光強度がコンゴレッドによりクエンチされるという
観察は、凝集したペプチド上でのコンゴレッドとチオフラビンとの共局在化に一
致する。
チされる。クエンチングの程度は、マイクロモル濃度のコンゴレッドで横ばい状
態になった。それゆえ、これはペプチドの初期部位が飽和されることを示す。ペ
プチドに結合したチオフラビンの蛍光は、コンゴレッドにより、大きさが１桁よ
り高くクエンチされたのに対し、クエンチング効果は遊離のチオフラビンの場合
のわずか５０％であった。蛍光強度がコンゴレッドによりクエンチされるという
観察は、凝集したペプチド上でのコンゴレッドとチオフラビンとの共局在化に一
致する。
【００９７】
コンゴレッドは、Ａβに曝した細胞培養物に対して神経保護的である。予め形
成された凝集体と複合体化したコンゴレッドおよび共凝集体におけるコンゴレッ
ドは、Ａβの毒性を弱める。凝集ペプチド(４時間エイジングした試料)はニュー
ロン培養物に対して毒性であるのに対し、新鮮なペプチドは７２時間の毒性アッ
セイにおいて非毒性である。
成された凝集体と複合体化したコンゴレッドおよび共凝集体におけるコンゴレッ
ドは、Ａβの毒性を弱める。凝集ペプチド(４時間エイジングした試料)はニュー
ロン培養物に対して毒性であるのに対し、新鮮なペプチドは７２時間の毒性アッ
セイにおいて非毒性である。
【００９８】
考察(太字)
この実施例は、ランダムコイルからβシートコンホメーションへの転換がペプ
チドのチオフラビンに結合するオリゴマー構造の形成と同時に起こることを示し
ている。コンゴレッドおよびチオフラビンは、凝集ペプチドと非競合的に結合す
る。
チドのチオフラビンに結合するオリゴマー構造の形成と同時に起こることを示し
ている。コンゴレッドおよびチオフラビンは、凝集ペプチドと非競合的に結合す
る。
【００９９】
実施例２：コンゴレッド-アミロイド複合体の分光学的評価
アミロイドペプチド(Ａβ)を、以下に記載するように、コンゴレッドの非存在
下および存在下においてエイジングした：Ａβ(１-４０)を最終濃度が２００ま
たは４００μＭになるように１００％ヘキサフルオロイソプロパノールに溶解し
た。ペプチドの溶解を促進するために、溶液を約５秒間、軽く音波処理した。適
当量のペプチド溶液を琥珀色のバイアルに移し、溶媒を窒素気流下でエバポレー
トした。ペプチドフィルムをＰＢＳ緩衝液(ｐＨ７.４)に最終濃度５０μＭで溶
解した。ペプチド溶液を２０秒間音波処理した後、約５秒間ボルテックスミキサ
ー攪拌をした。ペプチドとコンゴレッドとの共凝集体を調製するために、色素を
ペプチドに最終濃度１０μｇ/ｍｌ、２０μｇ/ｍｌまたは３０μｇ/ｍｌで加え
た。ペプチド(媒体対照中のペプチドおよびペプチド＋コンゴレッド)の貯蔵液を
マイクロタイタープレートに最終容量１００μＬ/ウェルでアリコットした。凝
集は、プレートを５００ｒｐｍで振盪することにより開始した。
下および存在下においてエイジングした：Ａβ(１-４０)を最終濃度が２００ま
たは４００μＭになるように１００％ヘキサフルオロイソプロパノールに溶解し
た。ペプチドの溶解を促進するために、溶液を約５秒間、軽く音波処理した。適
当量のペプチド溶液を琥珀色のバイアルに移し、溶媒を窒素気流下でエバポレー
トした。ペプチドフィルムをＰＢＳ緩衝液(ｐＨ７.４)に最終濃度５０μＭで溶
解した。ペプチド溶液を２０秒間音波処理した後、約５秒間ボルテックスミキサ
ー攪拌をした。ペプチドとコンゴレッドとの共凝集体を調製するために、色素を
ペプチドに最終濃度１０μｇ/ｍｌ、２０μｇ/ｍｌまたは３０μｇ/ｍｌで加え
た。ペプチド(媒体対照中のペプチドおよびペプチド＋コンゴレッド)の貯蔵液を
マイクロタイタープレートに最終容量１００μＬ/ウェルでアリコットした。凝
集は、プレートを５００ｒｐｍで振盪することにより開始した。
【０１００】
線維化の程度を測定するために、ペプチド試料のアリコットを取り出し、１０
μＭの発蛍光団チオフラビンＴを含有するＰＢＳ緩衝液に５倍に希釈した。これ
らの試料中におけるペプチドの最終濃度は１０μＭであった。遊離のチオフラビ
ンおよびペプチド-チオフラビン複合体の蛍光発光スペクトルは、蛍光計、この
場合、スペックス(SPEXTM)蛍光計を用いてスキャンした。励起波長４５０ｎｍ(
発光モノクロメーターは４８５ｎｍ)におけるチオフラビンＴの蛍光の増大は、
線維ペプチドの形成を示した。あるいは、プレート蛍光計をいくつかの実験に用
いて、線維化の程度を測定した。これらの実験では、チオフラビンＴの蛍光は、
４４０ｎｍの励起フィルターおよび４９０ｎｍの発光フィルターを用いて、テキ
ャン(TECANTM)プレート蛍光計(テキャン・ユー・エス・インク(Tecan U.S. Inc.
)、ノースカロライナ州リサーチ・トライアングル・パーク)で測定した。
μＭの発蛍光団チオフラビンＴを含有するＰＢＳ緩衝液に５倍に希釈した。これ
らの試料中におけるペプチドの最終濃度は１０μＭであった。遊離のチオフラビ
ンおよびペプチド-チオフラビン複合体の蛍光発光スペクトルは、蛍光計、この
場合、スペックス(SPEXTM)蛍光計を用いてスキャンした。励起波長４５０ｎｍ(
発光モノクロメーターは４８５ｎｍ)におけるチオフラビンＴの蛍光の増大は、
線維ペプチドの形成を示した。あるいは、プレート蛍光計をいくつかの実験に用
いて、線維化の程度を測定した。これらの実験では、チオフラビンＴの蛍光は、
４４０ｎｍの励起フィルターおよび４９０ｎｍの発光フィルターを用いて、テキ
ャン(TECANTM)プレート蛍光計(テキャン・ユー・エス・インク(Tecan U.S. Inc.
)、ノースカロライナ州リサーチ・トライアングル・パーク)で測定した。
【０１０１】
ＣＤ分光学を用いて、コンゴレッドの存在下における凝集の時間経過と、新し
く調製した状態のランダムコイル形態からエイジングした状態のβシート形態へ
のペプチドの転換とを測定した。ペプチドを９時間エイジングすると、おそらく
、ねじれβシート構造の形成により、レッドシフトしたβシートのスペクトルが
得られた。
く調製した状態のランダムコイル形態からエイジングした状態のβシート形態へ
のペプチドの転換とを測定した。ペプチドを９時間エイジングすると、おそらく
、ねじれβシート構造の形成により、レッドシフトしたβシートのスペクトルが
得られた。
【０１０２】
コンゴレッドと予め形成された線維との複合体を調製するために、エイジング
したペプチドをコンゴレッドと最終濃度１０μｇ/ｍＬ、２０μｇ/ｍＬおよび３
０μｇ/ｍＬで組み合わせた。
したペプチドをコンゴレッドと最終濃度１０μｇ/ｍＬ、２０μｇ/ｍＬおよび３
０μｇ/ｍＬで組み合わせた。
【０１０３】
ＣＤ分析(太字)
コンゴレッドと予め凝集したペプチドとの複合体およびペプチド共凝集体の遠
紫外ＣＤスペクトルは、２００ｎｍ〜２６０ｎｍでスキャンした(図１)。２００
ｎｍにおける極小値は、新鮮なペプチドのランダムコイルコンホメーションを示
す。
紫外ＣＤスペクトルは、２００ｎｍ〜２６０ｎｍでスキャンした(図１)。２００
ｎｍにおける極小値は、新鮮なペプチドのランダムコイルコンホメーションを示
す。
【０１０４】
エイジングはβシート形態へのコンホメーション変化を誘発した。コンゴレッ
ドの非存在下でエイジングしたペプチドのＣＤスペクトルは、２２５ｎｍの極小
値と２０５ｎｍの極大値から構成されていた。このレッドシフトした２２５ｎｍ
の極小値は、ねじれβシート構造の形成によるものであると思われる。ペプチド
の予め形成された凝集体のこのレッドシフトしたＣＤスペクトルは、コンゴレッ
ドとの複合体化により変化しなかった。
ドの非存在下でエイジングしたペプチドのＣＤスペクトルは、２２５ｎｍの極小
値と２０５ｎｍの極大値から構成されていた。このレッドシフトした２２５ｎｍ
の極小値は、ねじれβシート構造の形成によるものであると思われる。ペプチド
の予め形成された凝集体のこのレッドシフトしたＣＤスペクトルは、コンゴレッ
ドとの複合体化により変化しなかった。
【０１０５】
予め形成された凝集体のＣＤスペクトルと対照的に、コンゴレッドの存在下で
エイジングしたペプチド(共凝集体)のＣＤスペクトルは、典型的なβシートコン
ホメーションへのペプチドの折りたたみによる２１８ｎｍ付近における負のＣＤ
吸収バンドから構成されていた。また、ＣＤスペクトルは共凝集体におけるラン
ダムコイル形態からの増大した寄与に関する証拠を与えた。それゆえ、このこと
は、凝集速度がコンゴレッドの存在下で緩慢化したことを示唆する。２つの形態
のペプチドのＣＤスペクトルの差は、共凝集体におけるランダムコイル形態の増
大によるものであり、また、ペプチドの変化した凝集状態の形成によるものであ
る。
エイジングしたペプチド(共凝集体)のＣＤスペクトルは、典型的なβシートコン
ホメーションへのペプチドの折りたたみによる２１８ｎｍ付近における負のＣＤ
吸収バンドから構成されていた。また、ＣＤスペクトルは共凝集体におけるラン
ダムコイル形態からの増大した寄与に関する証拠を与えた。それゆえ、このこと
は、凝集速度がコンゴレッドの存在下で緩慢化したことを示唆する。２つの形態
のペプチドのＣＤスペクトルの差は、共凝集体におけるランダムコイル形態の増
大によるものであり、また、ペプチドの変化した凝集状態の形成によるものであ
る。
【０１０６】
ペプチド試料の近紫外ＣＤスペクトルは、７００〜３００ｎｍでスキャンした
。この領域は、コンゴレッド複合体を区別するのに有用である。緩衝液中のペプ
チド単独および遊離のコンゴレッドは、近紫外領域に認めうるほどのＣＤシグナ
ルを生じなかった。共凝集体および予め形成された凝集体のＣＤスペクトルの差
は、最大吸収の強度および波長で明白であった；共凝集体のＣＤスペクトルは、
予め形成された凝集体のＣＤスペクトルより弱かった(図２；表２を参照)。ペプ
チドとコンゴレッドとの予め凝集した複合体のＣＤスペクトルは、５８０ｎｍに
おける負の吸収と５１６ｎｍにおける正の吸収バンドから構成されていた。ＣＤ
バンドの強度は、複合体の濃度に比例した。共凝集体のＣＤスペクトルは、５４
５ｎｍを中心とする正のバンドから構成されていた。複合体のスペクトルの差は
、コンゴレッドの異なる複合体化の状態の形成によるものである。励起子結合Ｃ
Ｄスペクトルは、ペプチドの整列したβシートコンホメーションと共に、コンゴ
レッドの複合体化を示す。
。この領域は、コンゴレッド複合体を区別するのに有用である。緩衝液中のペプ
チド単独および遊離のコンゴレッドは、近紫外領域に認めうるほどのＣＤシグナ
ルを生じなかった。共凝集体および予め形成された凝集体のＣＤスペクトルの差
は、最大吸収の強度および波長で明白であった；共凝集体のＣＤスペクトルは、
予め形成された凝集体のＣＤスペクトルより弱かった(図２；表２を参照)。ペプ
チドとコンゴレッドとの予め凝集した複合体のＣＤスペクトルは、５８０ｎｍに
おける負の吸収と５１６ｎｍにおける正の吸収バンドから構成されていた。ＣＤ
バンドの強度は、複合体の濃度に比例した。共凝集体のＣＤスペクトルは、５４
５ｎｍを中心とする正のバンドから構成されていた。複合体のスペクトルの差は
、コンゴレッドの異なる複合体化の状態の形成によるものである。励起子結合Ｃ
Ｄスペクトルは、ペプチドの整列したβシートコンホメーションと共に、コンゴ
レッドの複合体化を示す。
【０１０７】
ＵＶスペクトル分析(太字)
ＵＶスペクトル分析は、予め凝集したペプチドおよび共凝集体とコンゴレッド
との２つの複合体の吸収スペクトルを区別するのに用いた。
との２つの複合体の吸収スペクトルを区別するのに用いた。
【０１０８】
図３は、エイジングしたペプチドに対して測定したコンゴレッドとポリペプチ
ドとの複合体のスペクトルの差を示す。ここで、複合体は、第１の場合には、ア
ミロイドペプチドとコンゴレッドとの共凝集体であり、第２の場合には、予め形
成されたポリペプチド凝集体と複合体化したコンゴレッドである。コンゴレッド
の全濃度は両方の複合体で同じであるので、吸収強度の差は予め形成された凝集
体との複合体が共凝集体に対して高色素性であることを示唆している。
ドとの複合体のスペクトルの差を示す。ここで、複合体は、第１の場合には、ア
ミロイドペプチドとコンゴレッドとの共凝集体であり、第２の場合には、予め形
成されたポリペプチド凝集体と複合体化したコンゴレッドである。コンゴレッド
の全濃度は両方の複合体で同じであるので、吸収強度の差は予め形成された凝集
体との複合体が共凝集体に対して高色素性であることを示唆している。
【０１０９】
図４は、等しい濃度の遊離コンゴレッドに対して測定された、コンゴレッド、
共凝集体および予め形成された凝集体の複合体のスペクトルの差が４８０ｎｍ付
近を中心とするのに対し、複合体化された形態の吸収極大が少し高波長側にシフ
トしていることを示す。４８０ｎｍ付近を中心とする図４における負の吸収ピー
クは、それゆえ、アミロイドポリペプチドに結合して遊離コンゴレッドが減少し
たことによるものである。同様に、５３０ｎｍ付近を中心とする正の吸収ピーク
は、特に予め形成された凝集体とのコンゴレッド複合体の場合には、複合体化に
よりコンゴレッドの吸収の性質が変化したことによるものである。この複合体は
５３０ｎｍを中心とする吸収極大を有するのに対し、共凝集体の吸収極大は５３
０ｎｍで最大に達し、５３０ｎｍを越えて吸収の性質を保持する。共凝集体およ
び予め形成された複合体の吸収スペクトルは、それゆえ、共凝集体および予め形
成された複合体におけるコンゴレッドの固有の吸収の性質を遊離状態から区別す
る。吸収スペクトルの差は、複合体化されていない状態に対するコンゴレッドの
ペプチド結合状態の環境の変化によるものである。コンゴレッドのかかるスペク
トル変化は、コンゴレッドの電子状態または性質の変化により誘発されるものと
思われる。
共凝集体および予め形成された凝集体の複合体のスペクトルの差が４８０ｎｍ付
近を中心とするのに対し、複合体化された形態の吸収極大が少し高波長側にシフ
トしていることを示す。４８０ｎｍ付近を中心とする図４における負の吸収ピー
クは、それゆえ、アミロイドポリペプチドに結合して遊離コンゴレッドが減少し
たことによるものである。同様に、５３０ｎｍ付近を中心とする正の吸収ピーク
は、特に予め形成された凝集体とのコンゴレッド複合体の場合には、複合体化に
よりコンゴレッドの吸収の性質が変化したことによるものである。この複合体は
５３０ｎｍを中心とする吸収極大を有するのに対し、共凝集体の吸収極大は５３
０ｎｍで最大に達し、５３０ｎｍを越えて吸収の性質を保持する。共凝集体およ
び予め形成された複合体の吸収スペクトルは、それゆえ、共凝集体および予め形
成された複合体におけるコンゴレッドの固有の吸収の性質を遊離状態から区別す
る。吸収スペクトルの差は、複合体化されていない状態に対するコンゴレッドの
ペプチド結合状態の環境の変化によるものである。コンゴレッドのかかるスペク
トル変化は、コンゴレッドの電子状態または性質の変化により誘発されるものと
思われる。
【０１１０】
蛍光分析(太字)
コンゴレッドの複合体の蛍光発光スペクトルは、ペプチドを緩衝溶液に５倍に
希釈した後で得た。新しく希釈した線維ペプチドにコンゴレッドを加え、蛍光ス
ペクトルをペプチドの最終濃度１０μＭでスキャンした。蛍光アッセイにおける
ペプチドおよびコンゴレッドの濃度は、それぞれ１０μＭおよび８.６μＭであ
った。共凝集体および予め形成された凝集体-複合体の蛍光強度および発光波長
の差は、２つの場合における結合部位の疎水性の相対的な差によるものであった
。
希釈した後で得た。新しく希釈した線維ペプチドにコンゴレッドを加え、蛍光ス
ペクトルをペプチドの最終濃度１０μＭでスキャンした。蛍光アッセイにおける
ペプチドおよびコンゴレッドの濃度は、それぞれ１０μＭおよび８.６μＭであ
った。共凝集体および予め形成された凝集体-複合体の蛍光強度および発光波長
の差は、２つの場合における結合部位の疎水性の相対的な差によるものであった
。
【０１１１】
考察(太字)
この実施例に記載した分光学的な結果は、コンゴレッドなどのアミロイド阻害
薬がアミロイドペプチドと明確な複合体を形成することを示している。これらの
複合体はペプチドの神経毒性を弱めるのに対し、これら物質の医療での使用は疾
患の段階に従って評価される必要がある。記載した結果は、コンゴレッドが凝集
ペプチドに結合し、それゆえ、その毒性を弱めることを示している。
薬がアミロイドペプチドと明確な複合体を形成することを示している。これらの
複合体はペプチドの神経毒性を弱めるのに対し、これら物質の医療での使用は疾
患の段階に従って評価される必要がある。記載した結果は、コンゴレッドが凝集
ペプチドに結合し、それゆえ、その毒性を弱めることを示している。
【０１１２】
コンゴレッドはペプチドのランダムコイル形態のβシート形態への転換を完全
には阻害しないのに対し、上記の結果はコンゴレッドが中間凝集形態のアミロイ
ドペプチドを安定化することを示している。かかる効果を生じる阻害薬は、かか
る物質が治療または予防作用として投与することができるかどうかを決定するた
めに、アルツハイマー病モデルでインビトロ活性について注意深く評価する必要
がある。ここに記載した分光学的な方法は、アミロイド形成の阻害薬を同定し、
区別するのに、また、薬剤開発プログラムにおいて抗アルツハイマー薬として前
進させられる抗凝集阻害薬だけでなく、他の疾患または障害に関連するアミロイ
ド形成性の線維形成の他の可能性のある阻害薬の作用の分子メカニズムを決定す
るのに用いることができる。
には阻害しないのに対し、上記の結果はコンゴレッドが中間凝集形態のアミロイ
ドペプチドを安定化することを示している。かかる効果を生じる阻害薬は、かか
る物質が治療または予防作用として投与することができるかどうかを決定するた
めに、アルツハイマー病モデルでインビトロ活性について注意深く評価する必要
がある。ここに記載した分光学的な方法は、アミロイド形成の阻害薬を同定し、
区別するのに、また、薬剤開発プログラムにおいて抗アルツハイマー薬として前
進させられる抗凝集阻害薬だけでなく、他の疾患または障害に関連するアミロイ
ド形成性の線維形成の他の可能性のある阻害薬の作用の分子メカニズムを決定す
るのに用いることができる。
【０１１３】
本発明は、ここに記載した特定の具体例により範囲を限定されるべきではない
。実際、ここに記載したものに加えて、本発明の様々な変更が上記の説明および
添付の図面から当業者に明らかとなる。かかる変更は添付の特許請求の範囲に属
すると意図される。 さらに、すべての塩基サイズまたはアミノ酸サイズ、ならびにすべての分子量
(molecular weightまたはmolecular mass)の値は、概算値であり、説明のために
規定されていると理解すべきである。 ここで引用したすべての特許、特許出願、刊行物および他の資料は、出典を示
すことにより、その全体が本明細書の一部をなす。
。実際、ここに記載したものに加えて、本発明の様々な変更が上記の説明および
添付の図面から当業者に明らかとなる。かかる変更は添付の特許請求の範囲に属
すると意図される。 さらに、すべての塩基サイズまたはアミノ酸サイズ、ならびにすべての分子量
(molecular weightまたはmolecular mass)の値は、概算値であり、説明のために
規定されていると理解すべきである。 ここで引用したすべての特許、特許出願、刊行物および他の資料は、出典を示
すことにより、その全体が本明細書の一部をなす。
【図１】 Ａβ(１-４０)のコンホメーションに対するコンゴレッドの効果
。ペプチド凝集体のコンホメーションにおける差を決定するために、コンゴレッ
ドとエイジングされたペプチドおよび新鮮なペプチドとの複合体の遠紫外ＣＤス
ペクトルを、共凝集体の遠紫外ＣＤスペクトルと比較した。緑/菱形：１４.３μ
Ｍコンゴレッドの共凝集体；紫/白四角：２１μＭコンゴレッドの共凝集体；赤/
三角：４７μＭコンゴレッドの共凝集体；青/逆三角：エイジングされたアミロ
イドペプチド；橙/四角：２１μＭコンゴレッドを伴う新鮮なペプチド：薄い橙/
円：２１μＭコンゴレッドを伴うエイジングされたペプチド。
。ペプチド凝集体のコンホメーションにおける差を決定するために、コンゴレッ
ドとエイジングされたペプチドおよび新鮮なペプチドとの複合体の遠紫外ＣＤス
ペクトルを、共凝集体の遠紫外ＣＤスペクトルと比較した。緑/菱形：１４.３μ
Ｍコンゴレッドの共凝集体；紫/白四角：２１μＭコンゴレッドの共凝集体；赤/
三角：４７μＭコンゴレッドの共凝集体；青/逆三角：エイジングされたアミロ
イドペプチド；橙/四角：２１μＭコンゴレッドを伴う新鮮なペプチド：薄い橙/
円：２１μＭコンゴレッドを伴うエイジングされたペプチド。
【図２】 アミロイドペプチドの予め形成された凝集体(白四角)および共凝
集体(白丸)とのコンゴレッド複合体の近紫外ＣＤスペクトル。
集体(白丸)とのコンゴレッド複合体の近紫外ＣＤスペクトル。
【図３】 コンゴレッドと予め形成された凝集体(白丸)および共凝集体(白
四角)との複合体の吸収ＵＶスペクトル。吸収スペクトルはエイジングされたペ
プチドに対して測定した。
四角)との複合体の吸収ＵＶスペクトル。吸収スペクトルはエイジングされたペ
プチドに対して測定した。
【図４】 コンゴレッドとβＡＰ１-４０の予め形成された凝集体(白丸)お
よび共凝集体(白四角)のとの複合体の差スペクトル。吸収スペクトルはコンゴレ
ッドに対して測定した。
よび共凝集体(白四角)のとの複合体の差スペクトル。吸収スペクトルはコンゴレ
ッドに対して測定した。
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フロントページの続き
(51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考）
Ｇ０１Ｎ 33/48 Ｇ０１Ｎ 33/48 Ｍ
// Ａ６１Ｋ 45/00 Ａ６１Ｋ 45/00
Ａ６１Ｐ 25/28 Ａ６１Ｐ 25/28
(81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，
ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ
Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ
，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，
ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，Ｇ
Ｍ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ
，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，
ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，
ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，Ｂ
Ｚ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ
，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，
ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，Ｊ
Ｐ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ
，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，
ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，Ｒ
Ｏ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ
，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，
ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ
Ｆターム(参考） 2G043 AA01 BA16 DA02 EA01 FA03
GA25 GB28 JA01 JA02 KA02
KA03 KA05
2G045 AA40 DA36 FA11 FA27 FB03
FB07 FB12 FB13 GC15
2G059 AA05 BB12 CC16 DD03 EE05
EE07 EE12 FF12 HH01 HH03
HH06
4C084 AA17 BA41 NA20 ZA162
ZC781
Claims (25)
- 【請求項１】 アミロイドポリペプチドの凝集コンホメーションを決定する
方法であって、ポリペプチドの凝集を可能にする条件下でアミロイドポリペプチ
ドと接触させたアミロイド特異的な分光学的プローブの複合体の分光学的性質を
、アミロイド特異的な分光学的プローブと公知コンホメーションの凝集アミロイ
ドポリペプチドとの複合体の予め測定された分光学的性質と相関させることから
なる方法。 - 【請求項２】 アミロイド特異的な分光学的プローブがアミロイドに結合す
る色素である請求項１記載の方法。 - 【請求項３】 アミロイドに結合する色素がスルホン化ジアゾ色素またはそ
の類似体である請求項２記載の方法。 - 【請求項４】 スルホン化ジアゾ色素がコンゴレッドである請求項３記載の
方法。 - 【請求項５】 アミロイド特異的な分光学的プローブが発蛍光団標識したペ
プチドである請求項１記載の方法。 - 【請求項６】 アミロイドポリペプチドがβ-アミロイド(Ａβ)ペプチドで
ある請求項１記載の方法。 - 【請求項７】 分光学的な性質がアミロイドポリペプチドの遠紫外(ＵＶ)円
偏光二色性(ＣＤ)分光学を用いて評価される請求項１記載の方法。 - 【請求項８】 分光学的な性質がスルホン化ジアゾ色素の近紫外(ＵＶ)円偏
光二色性(ＣＤ)分光学を用いて評価される請求項１記載の方法。 - 【請求項９】 分光学的な性質が紫外(ＵＶ)分光学を用いて評価される請求
項１記載の方法。 - 【請求項１０】 分光学的な性質が蛍光分光学を用いて評価される請求項１
記載の方法。 - 【請求項１１】 アミロイドポリペプチドが線維形態で凝集する請求項１記
載の方法。 - 【請求項１２】 アミロイドポリペプチドがアミロイド特異的な分光学的プ
ローブと共凝集する請求項１記載の方法。 - 【請求項１３】 アミロイドの阻害、破壊または分離の対する試験化合物の
効果を検出する方法であって、(ａ)アミロイド特異的な分光学的プローブと、試
験化合物と接触させた凝集アミロイドポリペプチドとの複合体の分光学的な性質
を、(ｂ)試験化合物の非存在下でアミロイド特異的な分光学的プローブの複合体
の予め測定された分光学的な性質と相関させることからなり、分光学的な性質の
差が試験化合物はアミロイドの形成または安定性に対する効果を有することを示
す方法。 - 【請求項１４】 アミロイド特異的な分光学的プローブを予め形成されたア
ミロイドポリペプチド凝集体と接触させる請求項１３記載の方法。 - 【請求項１５】 アミロイド特異的な分光学的プローブがアミロイドペプチ
ドと共凝集する請求項１３記載の方法。 - 【請求項１６】 アミロイド特異的な分光学的プローブがアミロイドに結合
する色素である請求項１３記載の方法。 - 【請求項１７】 アミロイドに結合する色素がスルホン化ジアゾ色素または
その類似体である請求項１６記載の方法。 - 【請求項１８】 スルホン化ジアゾ色素がコンゴレッドである請求項１７記
載の方法。 - 【請求項１９】 アミロイド特異的な分光学的プローブが発蛍光団標識した
ペプチドである請求項１５記載の方法。 - 【請求項２０】 アミロイドポリペプチドがβ-アミロイド(Ａβ)ペプチド
である請求項１０記載の方法。 - 【請求項２１】 分光学的な性質がアミロイドポリペプチドの遠紫外(ＵＶ)
円偏光二色性(ＣＤ)分光学を用いて評価される請求項１３記載の方法。 - 【請求項２２】 分光学的な性質がスルホン化ジアゾ色素の近紫外(ＵＶ)円
偏光二色性(ＣＤ)分光学を用いて評価される請求項１３記載の方法。 - 【請求項２３】 分光学的な性質が紫外(ＵＶ)分光学を用いて評価される請
求項１３記載の方法。 - 【請求項２４】 分光学的な性質が蛍光分光学を用いて評価される請求項１
３記載の方法。 - 【請求項２５】 アミロイドポリペプチドが線維形態で凝集する請求項１３
記載の方法。
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