KR102258048B1

KR102258048B1 - 아밀로이드 베타 올리고머의 검출 방법

Info

Publication number: KR102258048B1
Application number: KR1020190063647A
Authority: KR
Inventors: 조원우; 이상명; 고경옥; 르반롱; 이준옥; 박혜정
Original assignee: 주식회사 캔티스
Priority date: 2019-05-30
Filing date: 2019-05-30
Publication date: 2021-05-31
Anticipated expiration: 2039-05-30
Also published as: WO2020242246A1; KR20200138497A

Abstract

본 발명은 높은 정확도로 아밀로이드 베타 올리고머를 검출할 수 있는 방법에 관한 것이다.

Description

아밀로이드 베타 올리고머의 검출 방법{METHOD FOR DETECTING AMYLOID BETA OLIGOMER}

본 발명은 아밀로이드 베타 올리고머의 검출 방법에 관한 것이다.

최근 고령화와 함께 지난 4년간 노인인구가 17.4%가 증가하였으며 이중 치매노인의 수가 26.8%가 증가하였다. 보건복지부에 따르면 이러한 추이로 증가 시 2025년에는 100만명이 넘는 노인에게 치매가 올 것으로 예상하고 있다.

한편 이러한 치매는 퇴행성 뇌신경 질환으로 인한 알츠하이머형 치매가 60~80%를 차지하고 있는데, 증상은 주로 이름과 최근의 일을 기억 못하는 것으로 시작하여, 말기에는 판단착오, 길을 잃음, 행동 및 언어장애, 삼킴 장애 등이 나타나다 사망에 이르게 된다.

이러한 질환은 발병이 서서히 진행되고 출생 후 오랜 기간 동안 정상적인 기능을 하다가 증상이 나타나며, 일단 발병하면 사망할 때까지 몇 년 또는 몇십 년에 걸쳐 지속적으로 병이 진행되는 것이 특징인데, 현재 근본적인 치료 방법이 개발되지 않은 상황이다. 따라서 병의 증상을 완화시키고 병의 진행을 지연시킬 수 있는 약물의 치료 효과를 높이기 위해서는 무엇보다도 병을 조기에 발견하는 것이 중요하다.

알츠하이머병의 발병기전은 뇌에 존재하는 베타 아밀로이드 중합체의 비율이 증가하여 발병하는 것으로 알려져 있고 베타 아밀로이드는 수용성물질로 뇌혈관장벽(Blood Brain barrier)을 통과하는 것으로 알려져있어 혈액에서 베타 아밀로이드양을 측정하여 알츠하이머병을 진단하고자 하는 노력이 진행되고 있다.

베타 아밀로이드(beta amyloid)는 뇌에 축적되면서 뇌신경 세포를 파괴하는 독성 단백질로서, 점차 베타 아밀로이드가 뭉쳐 신경 세포 밖에서 덩어리를 이루는 구조(plaque)가 된다. 또한 신경 세포 안의 단백질(타우 단백질, tau protein)은 비정상적으로 꼬이는 구조(tangle)가 나타나면서 신경세포 및 신경세포 연접의 손상과 함께 뇌의 피질부로 확산되는 퇴행성 질병이다.

현재까지 알츠하이머병을 위한 치료 약물은 없고 단순히 병의 증상을 호전시키기 위하여 알츠하이머병이 진행되면서 감소되는 신경전달물질의 투여를 증가시키는 것이다.

따라서, 알츠하이머병이 진행되기 전의 수십 년 전부터 생체 내에서 증가되는 베타 아밀로이드와 타우 단백질의 응집 혹은 미스폴딩되는 현상을 조기진단하고, 문제를 해결하는 것이 필요하다.

한국등록특허 제1971224호

본 발명은 높은 정확도로 아밀로이드 베타 올리고머를 검출할 수 있는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

1. 아밀로이드 베타 항체에 시료를 가하는 단계;

액상에서 전하를 띠고, 아밀로이드 베타 단백질에 특이적으로 결합하는 염료를 상기 항체에 가하는 단계; 및

상기 염료를 가한 후 액상에서의 전기적 신호의 변화를 측정하는 단계;를 포함하는 아밀로이드 베타 올리고머의 검출 방법.

2. 위 1에 있어서, 상기 염료는 티오플라빈 T, 티오플라빈 S, 콩고 레드, BSB((trans,trans)-1-Bromo-2,5-bis-(3-hydroxycarbonyl-4-hydroxy)styrylbenzene), Chrysamine G, 1,4-bis(3-carboxy-4-hydroxy phenylethenyl)-benzene), ISB((E,E)-1-iodo-2,5-bis(3-hydroxycarbonyl-4-hydroxy)styrylbenzene), IMSB(1-iodo-2,5-bis-(3-hydroxycarbonyl-4-methoxy)styrylbenzene), PiB(Pittsburgh Compound B), FDDNP(2-(1-{6-[(2-[fluorine-18]fluoroethyl)(methyl)amino]-2-naphthyl}-ethylidene)malononitrile) 또는 IMPY(6-iodo-2 -(4´-dimethylamino)-phenyl-imidazo[1,2-a]pyridine)인, 방법.

3. 위 1에 있어서, 상기 염료가 아밀로이드 베타 단백질에 결합하여 발생하는 전기적 신호 변화를 측정하여, 그 변화 정도가 클수록 액상 시료에 아밀로이드 베타 올리고머가 많이 포함된 것으로 판단하는, 방법.

4. 위 1에 있어서, 상기 염료를 가한 후부터 전기적 신호 변화 완료시점까지 전기적 신호를 실시간으로 측정하는, 방법.

5. 위 1에 있어서, 상기 전기적 신호는 임피던스, 어드미턴스, 저항, 전도도, 위상, 리액턴스 및 서셉턴스로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나인, 방법.

6. 위 1에 있어서, 상기 항체는 웰 플레이트 상에 고정된 것인, 방법.

7. 위 1에 있어서, 상기 항체는 자성 마이크로 비드 상에 고정된 것인, 방법.

8. 위 1에 있어서, 상기 항체는 교차전극 사이에 구비된 것인, 방법.

9. 위 1에 있어서, 상기 항체에 결합된 아밀로이드 베타 올리고머를 해리시키는 단계; 및

상기 해리 전, 후의 전기적 신호를 측정하여 비교하는 단계;를 더 포함하는, 방법.

10. 위 9에 있어서, 상기 해리 전 후의 전기적 신호의 차이가 클수록 시료에 아밀로이드 베타 올리고가 많이 포함된 것으로 판단하는, 방법.

11. 액상에서 전하를 띠는 염료가 결합되고, 항체에 결합된 아밀로이드 베타 올리고머를 액상에서 해리시키는 단계; 및

상기 해리 전, 후의 액상에서의 전기적 신호를 측정하여 비교하는 단계;를 포함하는 아밀로이드 베타 올리고머의 검출 방법.

12. 위 11에 있어서, 상기 염료는 티오플라빈 T, 티오플라빈 S, 콩고 레드, BSB((trans,trans)-1-Bromo-2,5-bis-(3-hydroxycarbonyl-4-hydroxy)styrylbenzene), Chrysamine G, 1,4-bis(3-carboxy-4-hydroxy phenylethenyl)-benzene), ISB((E,E)-1-iodo-2,5-bis(3-hydroxycarbonyl-4-hydroxy)styrylbenzene), IMSB(1-iodo-2,5-bis-(3-hydroxycarbonyl-4-methoxy)styrylbenzene), PiB(Pittsburgh Compound B), FDDNP(2-(1-{6-[(2-[fluorine-18]fluoroethyl)(methyl)amino]-2-naphthyl}-ethylidene)malononitrile) 또는 IMPY(6-iodo-2 -(4´-dimethylamino)-phenyl-imidazo[1,2-a]pyridine)인, 방법.

13. 위 11에 있어서, 상기 전기적 신호는 임피던스, 어드미턴스, 저항, 전도도, 위상, 리액턴스 및 서셉턴스로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나인, 방법.

14. 위 11에 있어서, 상기 항체는 웰 플레이트 상에 고정된 것인, 방법.

15. 위 11에 있어서, 상기 항체는 자성 마이크로 비드 상에 고정된 것인, 방법.

16. 위 11에 있어서, 상기 해리 전 후의 전기적 신호의 차이가 클수록 시료에 아밀로이드 베타 올리고머가 많이 포함된 것으로 판단하는, 방법.

13. 위 11에 있어서, 상기 항체는 교차전극 사이에 구비된 것인, 방법.

본 발명의 방법은 시료 내 포함된 아밀로이드 베타 올리고머의 양을 보다 정확히 측정할 수 있다.

본 발명의 방법은 시료에 극소량의 아밀로이드 베타 올리고머가 포함된 경우에도 측정이 가능하다.

본 발명의 방법은 알츠하이머형 치매와 경도인지장애의 진단에 임상적 유효성을 가지는 진단결과를 산출 가능하다.

도 1 및 2는 본 발명의 일 구현예에 따른 측정 방법의 순서도이다.
도 3은 염료의 첨가시에 아밀로이드 베타 단백질에 결합하는 것과 어드미턴스가 변하는 것을 나타낸 것이다.
도 4는 혈액 플라즈마 시료를 사용하여 본 발명의 일 구현예에 따른 방법에 따라 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 검출소자의 전극 패턴의 실시예와 패턴 사이에 항체가 고정되어 있는 전극 단면을 나타낸다.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 아밀로이드 베타 올리고머의 검출 방법을 제공한다.

본 발명의 방법은 아밀로이드 베타 항체에 시료를 가하는 단계; 액상에서 전하를 띠고, 아밀로이드 베타 단백질에 특이적으로 결합하는 염료를 상기 항체에 가하는 단계; 및 상기 염료를 가하기 전, 후에 액상에서의 임피던스를 측정하여 비교하는 단계;를 포함한다.

이하 본 발명의 일 구현예에 따른 방법을 상세히 설명한다.

먼저, 아밀로이드 베타 항체에 액상 시료를 가한다.

아밀로이드 베타 올리고머는 아밀로이드 단백질 2개 이상, 예를 들어 2개 내지 25개, 보다 구체적으로 4 내지 25개의 중합체일 수 있다.

시료는 아밀로이드 베타 올리고머를 포함하는, 또는 아밀로이드 베타 올리고머를 포함할 것으로 판단되는 시료일 수 있다. 그 용매 종류는 제한되지 않는다.

시료는 구체적으로는 개체로부터 분리된 시료일 수 있고, 개체는 아밀로이드 베타 중합체에 의해 유발되는 알츠하이머병 환자 또는 알츠하이머병을 가질 것으로 의심되는 개체일 수 있다. 시료는 구체적인 예를 들자면 혈액, 혈장 등일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

시료에 아밀로이드 베타 올리고머가 포함된다면, 아밀로이드 베타올리고머가 항체에 결합되게 된다.

항체는 예를 들면, 웰플레이트 상에 고정된 것일 수 있다.

또한, 항체는 자성 마이크로비드 상에 고정된 것일 수 있다. 그러한 경우에 일반적인 항원-항체 반응에 비해 보다 안정적인 결합을 유도할 수 있다.

그리고, 액상에서 전하를 띠고, 아밀로이드 베타 단백질에 특이적으로 결합하는 염료를 상기 항체에 가할 수 있다.

염료는 액상에서 전하를 띠면서 아밀로이드 베타 단백질에 특이적으로 결합할 수 있다면 그 종류는 제한되지 않는다. 예를 들자면 티오플라빈 T(CAS Number: 2390-54-7), 티오플라빈 S(CAS Number: 1326-12-1), 콩고 레드(3,3′-([1,1′-biphenyl]-4,4′-diyl)bis(4-aminonaphthalene-1-sulfonic acid의 나트륨염), BSB((trans,trans)-1-Bromo-2,5-bis-(3-hydroxycarbonyl-4-hydroxy)styrylbenzene), Chrysamine G, 1,4-bis(3-carboxy-4-hydroxy phenylethenyl)-benzene), ISB((E,E)-1-iodo-2,5-bis(3-hydroxycarbonyl-4-hydroxy)styrylbenzene), IMSB(1-iodo-2,5-bis-(3-hydroxycarbonyl-4-methoxy)styrylbenzene), PiB(Pittsburgh Compound B), FDDNP(2-(1-{6-[(2-[fluorine-18]fluoroethyl)(methyl)amino]-2-naphthyl}-ethylidene)malononitrile), IMPY(6-iodo-2 -(4´-dimethylamino)-phenyl-imidazo[1,2-a]pyridine) 등일 수 있으며, 구체적으로는 BSB일 수 있다.

상기 항체에 염료를 가하면 염료가 항체에 결합된 아밀로이드 베타 올리고머에 결합한다.

이후, 상기 염료를 가하고 액상에서의 전기적 신호의 변화를 측정한다.

전기적 신호는 모든 전기적 파라미터를 제한없이 일컫는 것으로서, 예를 들면 임피던스(impedance), 어드미턴스(admittance), 저항(resistance), 전도도(conductivity), 위상(phase), 리액턴스(reactance) 및 서셉턴스(susceptance) 등일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 염료는 액상에서 전하를 띠는 것이므로, 염료가 가해지는 순간에 액상에서의 전기적 신호가 변화하고, 염료가 아밀로이드 베타 올리고머에 결합하면서 전기적 신호가 또 변화한다.

즉, 염료를 가하기 전과 가한 직후의 전기적 신호가 상이하고, 염료를 가한 직후부터 염료가 아밀로이드 베타 올리고머에 결합하게 되므로 결합이 완료될 때까지 전기적 신호가 실시간으로 변화하게 된다.

따라서, 상기 염료를 가하고 염료가 아밀로이드 베타 단백질에 결합하여 발생하는 전기적 신호 변화를 측정하여, 그 변화 정도가 클수록 시료에 아밀로이드 베타 올리고머가 얼마나 많이 포함되어 있는지 알 수 있다.

보다 정확하게 실시간 변화를 확인하기 위해, 상기 염료를 가한 후부터 임피던스 변화 완료시점까지 전기적 신호를 실시간으로 측정할 수 있다.

전기적 신호는 전극에 의해 측정될 수 있고, 전극은 액상에 위치한 것일 수 있다.

전극은 교차 전극(interdigitated microelectrode)일 수 있고, 도 5에 예시된 바와 같이, 상기 항체는 교차 전극((interdigitated microelectrode) 사이에 고정된 것일 수 있다. 도 5의 단면 A-A를 보면 교차전극 사이에 항체가 고정된 것을 확인할 수 있다. 항체가 전극 사이에 위치하는 경우에 전기적 신호 변화를 보다 정확히, 민감하게 측정할 수 있다.

또한, 교차 전극은 엣지에 굴곡을 갖는 것일 수 있다. 전계 분포는 직선 전극의 뾰쪽한 엣지에 몰려 나타날 수 있는데, 그러한 경우 전극의 특정부분으로 전기 신호의 전파가 이루어져서 전극면 전체의 임피던스 변화를 측정하기에 좋지 않을 수 있다.

따라서, 엣지에 굴곡을 갖는 전극 사이에 항체가 고정된 경우에 전기장 분포가 전기장 분포가 전극 주변에 전체적으로 고르게 분포하여 두 개의 전극을 통해 임피던스를 측정하기에 민감도가 높다.

필요에 따라, 본 발명의 방법은 상기 항체에 결합된 아밀로이드 베타 올리고머를 해리시키는 단계; 및 상기 해리 전, 후의 전기적 신호를 측정하여 비교하는 단계;를 더 포함할 수 있다.

아밀로이드 베타 올리고머를 해리시키면 올리고머가 단량체화되어 항체에 결합되어 있는 단량체를 제외하고 나머지 단량체들은 반응액 내로 해리된다. 그러한 경우 반응액 내 전기적 신호의 변화가 발생하게 된다.

즉, 해리 전과 후의 전기적 신호가 상이하고, 해리 시작부터 해리 완료시까지 전기적 신호가 실시간으로 변화하게 된다. 따라서, 해리 전, 후의 전기적 신호를 측정하여, 전과 후의 전기적 신호 차이가 클수록 아밀로이드 베타 올리고머가 많다고 판단할 수 있다.

보다 정확하게 실시간 변화를 확인하기 위해, 해리 시작부터 임피던스 변화 완료시점까지 전기적 신호를 실시간으로 측정할 수 있다.

또한, 아밀로이드 베타 올리고머의 해리시에 아밀로이드 베타 단백질에 결합된 염료도 부분적으로 함께 해리되므로, 염료의 해리에 의해서도 전기적 신호가 변화하게 된다.

아밀로이드 베타 단백질만 해리될 때에는 전기적 신호 변화가 미미할 수 있으나, 염료의 해리에 의한 전기적 신호 변화도 나타나므로 전기적 신호 변화가 보다 크게 나타나, 보다 민감하고 정확하게 아밀로이드 베타 단백질의 검출이 가능하다.

아밀로이드 베타 올리고머의 해리 방법은 특별히 제한되지 않고, 예를 들면 계면활성제를 가하여 수행될 수 있다. 계면활성제는 예를 들면 HEPES, EPPS, Tween 등을 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

또한, 본 발명의 다른 일 구현예에 따르면, 본 발명의 아밀로이드 베타 올리고머의 검출 방법은 액상에서 전하를 띠는 염료가 결합되고, 항체에 결합된 아밀로이드 베타 올리고머를 액상에서 해리시키는 단계; 및 상기 해리 전, 후의 전기적 신호를 측정하여 비교하는 단계;를 포함한다.

아밀로이드 베타 올리고머에는 액상에서 전하를 띠는 염료가 결합된 상태일 수 있다.

염료는 전술한 범위 내의 것일 수 있다.

그리고 아밀로이드 베타 올리고머는 항체에 결합되어 있을 수 있고, 이를 액상에서 해리시킨다.

해리는 앞서 예시한 방법으로 수행할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

이후, 상기 해리 전, 후의 전기적 신호를 측정하여 비교한다.

보다 정확하게 실시간 변화를 확인하기 위해, 해리 시작부터 전기적 신호 변화 완료시점까지 전기적 신호를 실시간으로 측정할 수 있다.

따라서, 엣지에 굴곡을 갖는 전극 사이에 항체가 고정된 경우에 전기장 분포가 전극 주변에 전체적으로 고르게 분포하여 두 개의 전극을 통해 임피던스를 측정하기에 민감도가 높다.

이하, 본 발명을 구체적으로 설명하기 위해 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다.

실시예

1. 아밀로이드 베타 올리고머의 검출

96웰 마이크로 플레이트에 Protein G 자성마이크로 비드의 상층액을 제거하고 베이스 버퍼와 아밀로이드 베타 항체를 소정의 양으로 주입한다. 이때 베이스 버퍼 400㎕에 아밀로이드 베타 항체를 13㎕ 주입한 후, 20분간 반응시키면서 항체의 Fc region이 비드에 결합하도록 한다. 이후, 결합되지 않은 항체 혹은 nonspecific binding 등을 없애기 위하여 PBS 버퍼로 워싱을 한다.

도 1 ①은 96웰 마이크로 플레이트에 혈액 플라즈마와 항체가 결합된 자성 마이크로비드를 주입한 것을 나타낸다. 이때 소정의 시간(1시간 30분) 동안 1000~2000RPM으로 Shaking하여 반응시킴으로써 플라즈마 내에 있는 아밀로이드 베타의 결합을 증가시킨다.

아밀로이드 베타의 면역학적 반응이 완료되면, PBS로 washing 한다. 아밀로이드 베타(1-42) 항체와 결합하지 않은 단백질 혹은 유기물, 무기물은 PBS 버퍼 등을 통해 제거하며, 도 1 ②는 이러한 아밀로이드 베타(1-42) 단백질이 면역학적으로 결합한 상태를 나타낸다.

도 1 ③은 위 ②에서 아밀로이드 베타의 면역학적 반응이 끝나고 아밀로이드 베타 단백질에 특이적으로 결합하는 염료를 주입한 것을 나타낸다.

아밀로이드 베타(1-42) 단백질에 특이적으로 결합하는 (Trans, trans)-1-bromo-2,5-bis-(3-hydroxycarbonyl-4-hydroxy)styrylbenzene(BSB)염료 20μM을 200㎕ 주입하면 도 1 ④와 같이 (Trans, trans)-1-bromo-2,5-bis-(3-hydroxycarbonyl-4-hydroxy)styrylbenzene(BSB)가 pi-pi 결합, 수소결합 등의 결합을 통해 아밀로이트 베타(1-42) 단백질의 베타시트 구조 사이에 특이적으로 부착된다. 이때 아밀로이드 베타의 올리고머 양이 많을수록 결합되는 BSB가 증가하여 용액 내 BSB의 농도가 감소된다. 이때 BSB는 검출소자의 전기적 신호 세기와 아밀로이드 베타 단백질의 양에 따라 0.1nM~100μM에서 소정의 범위로 농도를 조절할 수 있다.

이러한 과정은 검출소자를 가지고 실시간 용액의 상태를 전기화학적으로 측정하는 진단 시스템을 통해 분석할 수 있다. 웰 안에 검출소자를 위치시키고 두 전극 사이에 전기적 필드를 가하면 전극 사이에 형성되는 캐패시터 및 저항 값의 변화가 생긴다. 예를 들어 캐패시턴스와 컨덕턴스 및 이를 포함하는 어드미턴스 등의 전기적 구성요소의 변화량이 감소한다. 이들 변화량을 확인하면, 혈액 플라즈마 내 아밀로이드 베타의 올리고머 양을 측정할 수 있다.

도 1 ⑤는 아밀로이드 베타 단백질에 특이적 염료가 결합한 후 PBS로 Wash한 상태를 나타낸다. 이후, 계면활성제를 주입하여 아밀로이드 베타 단백질이 해리되는 과정을 전기적으로 측정할 수 있다.

도 1 ⑥과 같이 아밀로이드 베타 단백질에 특이적 염료를 결합시킨 후, HEPES 1~200mM 혹은 EPPS 1~200mM, Tween 0.001~1%의 소정의 농도로 300㎕ 주입하면, 올리고머 상태로 결합되어 있던 아밀로이드 베타(1-42)단백질이 해리되기 시작한다.

마찬가지로 BSB 염료가 결합된 아밀로이드 베타(1-42) 올리고머가 해리될 때, 웰 안에 검출소자를 위치시키고 두 전극 사이에 전기적 필드를 가하면 전극 사이의 저항과 캐패시턴스의 변화가 생긴다. 예를 들어 캐패시턴스와 컨덕턴스 및 이를 포함하는 어드미턴스의 전기적 구성요소 들의 변화량이 증가한다. 이러한 변화를 통해 혈액 플라즈마 내에 아밀로이드 베타 올리고머의 양을 측정하고 단백질의 응집 정도를 진단한다.

한편, 도 1 ② 과정 이후 도1 ⑥과 같이 HEPES 1~200mM 혹은 EPPS 1~200mM, Tween 0.001~1%를 소정의 농도로 300㎕ 주입하여 올리고머 상태로 결합되어 있던 아밀로이드 베타(1-42)단백질을 해리시킬 수 있다. 이 때 두 전극 사이에 전기적 필드를 가하면 전극 사이에 저항 등이 증가하고 아밀로이드 베타 단백질이 용액 내 어느 정도 해리되었는지 등 용액의 상태를 측정할 수 있다.

2. 아밀로이드 베타 올리고머의 검출

도 2는 96웰 마이크로 플레이트의 웰 표면에 직접 항체를 고정하는 방법이다. NaHCO₃ 버퍼에 희석한 아밀로이드 베타 항체를 폴리스틸렌 well에 100㎕ 씩 분주한 후 4℃에서 12시간 정도 보관하여, Well 표면에 항체가 물리적으로 흡착 고정될 수 있도록 한다.

아밀로이드 베타의 면역학적 반응이 완료되면, PBS로 washing 한다. 아밀로이드 베타(1-42) 항체와 결합하지 않은 단백질 혹은 유기물, 무기물은 PBS 버퍼 등을 통해 제거하며, well 표면에 PBST에 희석한 BSA를 주입한 후 소정의 시간 동안 코팅하여 단백질의 Nonspecific binding을 방지할 수 있다.

도 2 ②는 이러한 아밀로이드 베타(1-42) 단백질이 면역학적으로 결합된 상태를 나타낸다.

다음으로 도 2의 ③과 같이 아밀로이드 베타 단백질에 특이적으로 결합하는 염료를 주입한다.

아밀로이드 베타(1-42) 단백질에 특이적으로 결합하는 BSB 염료를 20μM로 200㎕를 주입하고 검출소자로 측정한다. BSB는 pi-pi 결합, 수소결합 등의 결합을 통해 아밀로이트 베타(1-42) 단백질의 베타시트 구조 사이에 특이적으로 부착되어 용액 내 BSB의 농도가 감소된다. 아밀로이드 베타의 올리고머 양이 많을수록 결합되는 BSB가 증가하고, 이를 검출소자의 전기적 신호변화로 알아내어 혈액 플라즈마 내에 아밀로이드 베타 올리고머의 양을 측정할 수 있다. 예를 들어 웰 안의 검출소자를 위치시키고 두 전극 사이에 전기적 필드를 가하면 전극 사이에 형성되는 캐패시턴스 및 컨덕턴스 등의 어드미턴스가 감소하고 저항이 증가한다.

도 2 ⑤는 아밀로이드 베타 단백질에 특이적 염료가 결합한 후 PBS로 Wash한 상태를 나타낸다. 이후, 계면활성제를 주입하여 아밀로이드 베타 단백질이 해리되는 과정을 전기적으로 측정할 수 있다.

도 2 ⑥과 같이 아밀로이드 베타 단백질에 특이적 염료를 결합시킨 후, HEPES 1~200mM 혹은 EPPS 1~200mM, Tween 0.001~1%의 소정의 농도로 300㎕ 주입하면, 올리고머 상태로 결합되어 있던 아밀로이드 베타(1-42)단백질이 해리되기 시작한다.

BSB 염료가 결합된 아밀로이드 베타(1-42) 올리고머가 해리될 때, 웰 안에 검출소자를 위치시키고 두 전극 사이에 전기적 필드를 가하면 전극 사이의 저항과 캐패시턴스의 변화가 생긴다. 이러한 변화를 통해 혈액 플라즈마 내에 아밀로이드 베타 올리고머의 양을 측정하고 단백질의 응집 정도를 진단한다.

마찬가지로 도 2 ② 과정 이후 도2 ⑥과 같이 HEPES 1~200mM 혹은 EPPS 1~200mM, Tween 0.001~1%를 소정의 농도로 300㎕ 주입하여 올리고머 상태로 결합되어 있던 아밀로이드 베타(1-42)단백질을 바로 해리시킬 수도 있다. 이 때 두 전극 사이에 전기적 필드를 가하면 전극 사이에 저항 등이 증가하고 올리고머 상태로 결합되어 있던 아밀로이드 베타 단백질이 용액 내 어느 정도 해리되었는지 확인할 수 있다.

3. 어드미턴스 변화

도 3은 도 1과 도 2의 실시예에 따라 BSB가 아밀로이드 베타 올리고머에 결합될 때 어드미턴스의 변화를 나타낸다.

A는 특이적 염료를 주입하기 전에 웰 안의 어드미턴스를 나타내고, B는 특이적 염료를 주입하였을 때 전하를 갖는 염료에 따라 웰 안의 어드미턴스가 증가한 것을 나타내며, C는 아밀로이드 베타 올리고머에 염료가 결합하면서 농도 변화가 생기면서 웰 안의 어드미턴스가 감소하는 그래프를 나타낸다.

3. 임상 측정 결과

도 4 ①은 실제 의사의 진단으로 분류된 알츠하이머성 치매와 경도인지장애 환자 및 정상인의 혈액 플라즈마를 주입하여 당사의 단백질분석장치(치매진단시스템)로 측정한 결과를 나타낸다.

측정 결과는 임피던스(Impedance), 저항(Resistance), 리액턴스(reactance)와 어드미턴스(admittance), 전도도 (conductance), 서셉턴스(susceptance) 등의 각 전기적인 요소와 이들의 변화 값으로 나타낼 수 있으며, 도4 ①은 Admittance의 변화값을 나타낸다.

알츠하이머성 치매(AD) 환자의 플라즈마 24ea(그림_빨간색)와 경도인지장애 환자(aMCI) 49ea(그림_연두색) 및 정상인(NC) 23ea(그림_파란색)으로 표시되며, 이는 그래프 X축에서 확인할 수 있듯이 혈액 내 아밀로이드 베타 올리고머의 양이 많을수록 아밀로이드 베타의 베타시트에 결합되는 특이적 염료의 양이 증가하는 것을 나타낸다.

따라서 알츠하이머성 치매(AD) 환자의 플라즈마 24ea는 정상인(NC) 23ea(그림_파란색)에 비해 어드미턴스의 값이 초기 값보다 감소하는 경향을 나타낸다.

도 4 ②는 어드미턴스 측정값이 최저, 최고치를 0~99까지의 수치로 정규화한 그래프 이다.

진단명 별로 0~99까지 정규화한 값(CAI)를 표시하였을 경우, 해당 그래프와 같이 분포하며, 이를 통계적 방법으로 계산할 때 AD민감도: 75%, NC특이도: 90%의 결과를 나타내는 것을 확인할 수 있다.

Claims

아밀로이드 베타 항체에 액상 시료를 가하는 단계;
액상에서 전하를 띠고, 아밀로이드 베타 단백질에 특이적으로 결합하는 염료를 상기 시료가 가해진 항체에 가하는 단계; 및
상기 염료를 가한 후 액상에서의 전기적 신호의 변화를 측정하는 단계;를 포함하는 아밀로이드 베타 올리고머의 검출 방법.
청구항 1에 있어서, 상기 염료는 티오플라빈 T, 티오플라빈 S, 콩고 레드, BSB((trans,trans)-1-Bromo-2,5-bis-(3-hydroxycarbonyl-4-hydroxy)styrylbenzene), Chrysamine G, 1,4-bis(3-carboxy-4-hydroxy phenylethenyl)-benzene), ISB((E,E)-1-iodo-2,5-bis(3-hydroxycarbonyl-4-hydroxy)styrylbenzene), IMSB(1-iodo-2,5-bis-(3-hydroxycarbonyl-4-methoxy)styrylbenzene), PiB(Pittsburgh Compound B), FDDNP(2-(1-{6-[(2-[fluorine-18]fluoroethyl)(methyl)amino]-2-naphthyl}-ethylidene)malononitrile) 또는 IMPY(6-iodo-2 -(4´-dimethylamino)-phenyl-imidazo[1,2-a]pyridine)인, 방법.
청구항 1에 있어서, 상기 염료가 아밀로이드 베타 단백질에 결합하여 발생하는 전기적 신호 변화를 측정하여, 그 변화 정도가 클수록 액상 시료에 아밀로이드 베타 올리고머가 많이 포함된 것으로 판단하는, 방법.
청구항 1에 있어서, 상기 염료를 가한 후부터 전기적 신호 변화 완료시점까지 전기적 신호를 실시간으로 측정하는, 방법.
청구항 1에 있어서, 상기 전기적 신호는 임피던스, 어드미턴스, 저항, 전도도, 위상, 리액턴스 및 서셉턴스로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나인, 방법.
청구항 1에 있어서, 상기 항체는 웰 플레이트 상에 고정된 것인, 방법.
청구항 1에 있어서, 상기 항체는 자성 마이크로 비드 상에 고정된 것인, 방법.
청구항 1에 있어서, 상기 항체는 교차전극 사이에 구비된 것인, 방법.
청구항 1에 있어서, 상기 항체에 결합된 아밀로이드 베타 올리고머를 해리시키는 단계; 및
상기 해리 전, 후의 전기적 신호를 측정하여 비교하는 단계;를 더 포함하는, 방법.
청구항 9에 있어서, 상기 해리 전 후의 전기적 신호의 차이가 클수록 시료에 아밀로이드 베타 올리고가 많이 포함된 것으로 판단하는, 방법.
액상에서 전하를 띠는 염료가 결합되고, 항체에 결합된 아밀로이드 베타 올리고머를 액상에서 해리시키는 단계; 및
상기 해리 전, 후의 액상에서의 전기적 신호를 측정하여 비교하는 단계;를 포함하는 아밀로이드 베타 올리고머의 검출 방법.
청구항 11에 있어서, 상기 염료는 티오플라빈 T, 티오플라빈 S, 콩고 레드, BSB((trans,trans)-1-Bromo-2,5-bis-(3-hydroxycarbonyl-4-hydroxy)styrylbenzene), Chrysamine G, 1,4-bis(3-carboxy-4-hydroxy phenylethenyl)-benzene), ISB((E,E)-1-iodo-2,5-bis(3-hydroxycarbonyl-4-hydroxy)styrylbenzene), IMSB(1-iodo-2,5-bis-(3-hydroxycarbonyl-4-methoxy)styrylbenzene), PiB(Pittsburgh Compound B), FDDNP(2-(1-{6-[(2-[fluorine-18]fluoroethyl)(methyl)amino]-2-naphthyl}-ethylidene)malononitrile) 또는 IMPY(6-iodo-2 -(4´-dimethylamino)-phenyl-imidazo[1,2-a]pyridine)인, 방법.
청구항 11에 있어서, 상기 전기적 신호는 임피던스, 어드미턴스, 저항, 전도도, 위상, 리액턴스 및 서셉턴스로 이루어진 군에서 선택된 적어도 하나인, 방법.
청구항 11에 있어서, 상기 항체는 웰 플레이트 상에 고정된 것인, 방법.
청구항 11에 있어서, 상기 항체는 자성 마이크로 비드 상에 고정된 것인, 방법.
청구항 11에 있어서, 상기 해리 전 후의 전기적 신호의 차이가 클수록 시료에 아밀로이드 베타 올리고머가 많이 포함된 것으로 판단하는, 방법.
청구항 11에 있어서, 상기 항체는 교차전극 사이에 구비된 것인, 방법.