CN105651752B - 淀粉样蛋白的检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种淀粉样蛋白的检测方法。具体而言，本发明是以碳基量子点为荧光探针，利用碳基量子点独特的结构和发光特性而实现的。本发明不仅为淀粉样蛋白聚集检测提出了新的方案，并且避免了传统荧光检测方法中对待测体系造成的干扰。

Description

淀粉样蛋白的检测方法

技术领域

本发明涉及淀粉样蛋白的检测方法，尤其涉及利用碳基量子点检测淀粉样蛋白的方法，涉及蛋白结构检测领域。

背景技术

淀粉样变性的发生源自蛋白质的错误折叠，以沉淀的形式沉积在身体组织或器官，并直接导致阿尔兹海默症、帕金森综合症、疯牛病等病症(Cell,2012,148,1188.)。淀粉样蛋白具体聚集过程如下，溶液中蛋白质发生错误折叠，向β-片层结构发生转变，继而组装成具有生理毒性的极小寡聚体与弥散型小寡聚体、环形原纤维、原纤维、纤维，最终形成斑块。如检测跟踪淀粉样蛋白结构的改变，是当今研究热点，目前，硫黄素T和刚果红是最常用检测该过程的荧光探针(Nature.2011,472,226.)。然而，这些方法在检测过程中会对体系产生干扰。为了探究更多的检测方法，多种纳米材料如：金纳米颗粒、聚集诱导发光分子和光子晶体(Chem.Commun.,2015,51,1866.)等受到了广泛研究。然后这些材料的制备过程繁琐且生物相容性一般，为临床应用带来了很大的不便。

发明内容

本发明的目的是提供一种利用碳基量子点检测淀粉样蛋白的方法，该检测方法可有效检测淀粉样蛋白含量，还可有效检测淀粉样蛋白聚集动力学行为。本发明方法简便、成本低，成本低且碳基量子点材料生物相容性好；检测过程对体系不产生干扰；解决了现今检测方法单一、检测过程引入干扰的技术瓶颈。

为实现上述目的，本发明的技术方案如下：

本发明首先提供碳基量子点在淀粉样蛋白检测上的应用。

所述应用至少包括用于检测淀粉样蛋白的凝聚构象，用于检测淀粉样蛋白聚集动力学，或用于检测淀粉样蛋白含量等。

本发明还提供一种检测淀粉样蛋白的凝聚构象的方法，所述方法包括：

1)将待确定凝聚构象的淀粉样蛋白与碳基量子点相结合，获得其光谱特征；

2)将已知凝聚构象的淀粉样蛋白与碳基量子点相结合，获得预定光谱特征；

通过比较步骤1)和步骤2)所得的光谱特征，确定所述待确定凝聚构象的淀粉样蛋白的凝聚构象；其中所述光谱特征是用荧光光谱法评估的。

优选地，所述已知凝聚构象包括纤维状构象。

本发明还提供一种检测淀粉样蛋白聚集动力学的方法，所述方法包括将碳基量子点与孵育不同时间的淀粉样蛋白溶液进行混合，根据碳基量子点荧光强度的变化，检测淀粉样蛋白的聚集动力学行为。

具体地，上述检测淀粉样蛋白聚集动力学的方法，包括以下步骤：

1)将淀粉样蛋白粉末配成完全溶解的有机溶液，恒温孵育一段时间后，氮气吹干，分散在超纯水中形成一定浓度的淀粉样蛋白水溶液；之后，将样品置于摇床中，恒温、恒速老化；

2)每隔一定时间从上述溶液中取出定量样品，滴入细胞培养板(如96孔板)，并加入碳基量子点溶液，混合均匀；优选每次至少取三组平行样品进行实验；每次取点后，淀粉样蛋白原液都放回摇床；

3)将细胞培养板(如96孔板)中的混合液置于荧光光谱仪中，设定激发和发射波长，测定相应时间碳基量子点的荧光强度；

4)以时间为横坐标，荧光强度为纵坐标，绘制碳基量子点的荧光强度随时间变化趋势图，对数据进行拟合，得到碳量子点检测的淀粉样蛋白聚集行为动力学曲线。

上述检测淀粉样蛋白聚集动力学的方法，其中

步骤1)所述有机溶液为六氟异丙醇(HFIP)。

步骤1)所述淀粉样蛋白水溶液浓度为5-100μM。

步骤2)所述一定时间间隔为10-60min。

步骤2)所述碳基量子点溶液的浓度为0.5-5mg/mL。

步骤3)所述荧光光谱的激发波长在350nm至450nm之间，发射波长在450nm至550nm之间；优选地，所述荧光光谱的激发波长为400nm，发射波长为500nm。

本发明还提供一种用于检测淀粉样蛋白含量的试剂盒，所述试剂盒包括碳基量子点。

优选地，所述试剂盒包括0.5-5mg/mL的碳基量子点溶液；优选地，所述试剂盒包括1-2mg/mL的碳基量子点溶液。

本发明还提供一种检测淀粉样蛋白含量的方法，该方法是以碳基量子点作为探针的荧光光谱检测方法。

本发明所述荧光光谱的激发波长在350nm至450nm之间，发射波长在450nm至550nm之间。优选地，所述荧光光谱的激发波长为400nm，发射波长为500nm。

本发明所述检测淀粉样蛋白含量的方法，包括标准曲线的绘制、样品待测液的制备和快速检测。

所述样品待测液包括脑脊液、血液等。

具体地，所述检测淀粉样蛋白含量的方法，其中标准曲线的绘制包括以下步骤：

1)制备1mg/mL的碳基量子点溶液；

2)将Aβ粉末配成1mg/mL的溶液，溶剂为六氟异丙醇(HFIP)；于37℃孵育3小时后，氮气吹干，以1％体积含量的二甲基亚砜(DMSO)为助溶剂，分散在超纯水中形成浓度分别为50mg/mL，100mg/mL，150mg/mL，200mg/mL，250mg/mL，300mg/mL的6份Aβ单体溶液；取上述6份溶液各100微升，分别与100微升1mg/mL的碳基量子点溶液在96孔板中混合；之后，置于荧光光谱仪中，测定碳基量子点的荧光强度，设定激发波长为400nm，发射波长为500nm；以Aβ单体含量mg/mL为横坐标，荧光强度值(a.u.)为纵坐标，绘制Aβ单体标准曲线。

所绘制的Aβ单体标准曲线如图4(a)所示。

其线性回归方程为Y＝ax+b，相关系数R为0.9557，其中x代表Aβ单体的浓度mg/mL，Y代表荧光强度值(a.u.)；a＝-5.2，b＝1829.5。

具体地，所述检测淀粉样蛋白含量的方法，其中样品待测液的制备包括以下步骤：

将待测样品(例如脑脊液、血液等)经适当处理，去除干扰物质后，保留淀粉样蛋白，从而获得样品待测液。

具体地，所述检测淀粉样蛋白含量的方法，其中快速检测包括以下步骤：

1)制备1mg/mL的碳基量子点溶液；

2)取上述样品待测液100微升与100微升1mg/mL的碳基量子点溶液在96孔板中混合；之后，置于荧光光谱仪中，测定碳基量子点的荧光强度，设定激发波长为400nm，发射波长为500nm；同时做空白对照试验，按下式计算待检样品中Aβ单体含量：

x＝(I-I₀)/a

其中，x为待测样品中Aβ单体含量，I为待测样品的荧光强度数值，I₀为空白量子点荧光强度数值，a为标准曲线的斜率数值-5.2。

3)将正常样品中Aβ单体含量与所得待检样品中Aβ单体含量进行比较，获得待检样品中异常淀粉样蛋白的含量(所述异常淀粉样蛋白例如为纤维状淀粉样蛋白)；具体地，通过步骤2)方法获得正常样品中Aβ单体含量x₀，与待检样品中Aβ单体含量x对比，得到待检样品中异常淀粉样蛋白的含量为x₀-x。

上述所述检测淀粉样蛋白含量的方法，其中正常样品中Aβ单体含量也可通过现有技术获得。

本发明总体上是基于发现碳基量子点可用作荧光探针与淀粉样蛋白相结合，利用碳基量子点独特的结构和发光特性，不同构象淀粉样蛋白(如单体或纤维状)对碳基量子点的荧光强度不同而实现的。

碳基量子点是一类新型的准零维纳米材料，它是由无定型碳颗粒或几层小于100nm的石墨烯片构成(Science,2008,320,356.)。碳基量子点内部电子在各方向上的运动都受到局限，量子局限效应显著，在电子学、光电学和电磁学等方面有独特性质。碳基量子点表面丰富的官能团赋予了其与淀粉样蛋白相互作用(静电相互作用、氢键、π-π相互作用等)的能力，另外，这些官能团与不同构象淀粉样蛋白(单体或纤维)的作用力强弱随蛋白构象的改变而改变。这些相互作用力的不同会体现在碳基量子点的荧光强度上。因此，通过测定碳基量子点的荧光强度特征即可判断淀粉样蛋白构象特征。

本发明所述碳基量子点可由现有技术制备，也可自行制备。

例如所述碳基量子点的制备方法包括：取一定量的碳基材料，与强氧化剂混合，反应后，将得到产物过滤、离心和透析，即可获得碳基量子点。

优选地，所述碳基材料为天然石墨，碳纤维。

优选地，所述强氧化剂为硝酸钠，浓硫酸。

优选地，碳基量子点有效浓度为0.5～5mg/mL。

在以下实施例中给出了一种碳基量子点的制备方法。

本发明所述淀粉样蛋白包括β淀粉样蛋白(Aβ)、胰淀素、α-突触蛋白、多聚谷氨酰胺、朊蛋白、TDP43蛋白、胰岛素、αB-晶状体蛋白、溶菌酶等。优选地，所述淀粉样蛋白为β淀粉样蛋白(Aβ)。进一步优选地，所述淀粉样蛋白为β淀粉样蛋白1-42(Aβ₄₂)

所述淀粉样蛋白Aβ₄₂，其序列为：DAEFR HDSGY EVHHQ KLVFF AEDVG SNKGA IIGLMVGGVV IA。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

本发明所述的检测淀粉样蛋白聚集行为的方法所用碳基量子点材料成本低，生物相容性好，为在生物体内应用提供可能。另外，本发明不同于传统的检测方法，检测中对淀粉样蛋白的聚集体系并不产生影响。

附图说明

图1为本发明实施例1所制备的碳基量子点的透射电子显微镜(TEM)照片。

图2为本发明实施例1所制备的碳基量子点的荧光光谱。

图3为本发明实施例1所制备的碳基量子点的尺寸分布。

图4为碳基量子点对β淀粉样蛋白单体和纤维的检测。

图5为碳基量子点对β淀粉样蛋白不同纤维含量的检测。

图6为碳基量子点对β淀粉样蛋白聚集动力学的检测。

图7为碳基量子点对β淀粉样蛋白聚集动力学的检测。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。

除非特别指明，以下实施例中所用水溶液的溶剂均为无菌超纯水溶液。

除非特别指明，以下实施例中所用的试剂均为分析纯试剂。

实施例1：碳基量子点的制备

1)1g石墨粉与200mL浓硫酸和40g硝酸钠混合，冷却至零度。随后，缓慢加入4g高锰酸钾，温度保持在10℃，剧烈搅拌。

2)上述混合物搅拌均匀后，转移至30℃油浴中，反应50分钟。紧接着，将温度升高至140℃，再反应20h。

3)反应后，将产物冷却至室温，用500mL去离子水稀释，并用Na2CO3调节pH值至3左右。经过0.22μm的滤膜过滤，取上清液。置于离心机中，10000rpm离心10分钟。最后，用截留分子量1000Da的透析袋透析3天，得到最终量子点。

透射电子显微镜可以直观地反映碳基量子点的尺寸特点，图1为实施例1所制碳基量子点的透射电子显微镜(TEM)照片。图3为本发明实施例1所制备的碳基量子点的尺寸分布。从图中可以看出，制备得到的碳基量子点为5nm大小的纳米片层。

荧光光谱可以反映材料的荧光特性，如图2所示，得到的碳基量子点的荧光光谱。

实施例2：碳基量子点对β淀粉样蛋白单体和纤维的检测

1)碳基量子点对β淀粉样蛋白单体的检测

将Aβ粉末配成1mg/mL的六氟异丙醇(HFIP)溶液，37℃孵育3小时后，氮气吹干，以1％体积含量的二甲基亚砜(DMSO)为助溶剂，分散在超纯水中形成浓度分别为50mg/mL,100mg/mL,150mg/mL,200mg/mL,250mg/mL,300mg/mL的6份Aβ单体溶液。取上述6份溶液各100微升，分别与100微升1mg/mL的碳基量子点溶液在96孔板中混合。之后，置于荧光光谱仪中，测定碳基量子点的荧光强度，设定激发波长为400nm，发射波长为500nm。得到碳基量子点的荧光强度随Aβ单体浓度变化曲线。曲线如图4(a)所示，碳基量子点荧光强度随Aβ单体浓度的增加呈现线性降低的趋势。

2)碳基量子点对β淀粉样蛋白纤维的检测

将Aβ粉末配成1mg/mL的六氟异丙醇(HFIP)溶液，37℃孵育3小时后，氮气吹干，以1％体积含量的二甲基亚砜(DMSO)为助溶剂，分散在超纯水中形成浓度为20μM的Aβ溶液。其为Aβ单体分散液。

将Aβ粉末配成1mg/mL的六氟异丙醇(HFIP)溶液，37℃孵育3小时后，氮气吹干，以1％体积含量的二甲基亚砜(DMSO)为助溶剂，分散在超纯水中形成浓度为20μM的Aβ溶液。之后，将样品置于摇床中，37℃恒温，150rpm恒速老化，孵育7天，得到Aβ纤维分散液。

取实施例1中合成的碳基量子点(1.5mg/mL)100微升，分别与100微升上述Aβ单体和Aβ纤维分散液混合后，测定上述两种混合液以及碳基量子点的荧光光谱图。得到相应的荧光光谱如图4(b)所示。说明，碳基量子点对Aβ单体和Aβ纤维的检测能力出不同，Aβ单体可使碳基量子点荧光强度明显降低，而Aβ纤维却对碳基量子点荧光强度无明显影响。

实施例3：碳基量子点对β淀粉样蛋白纤维含量的检测

Aβ单体溶液和Aβ纤维溶液的制备方法：同实施例2。

1)将制备得到的Aβ单体和纤维溶液按照Aβ纤维的质量百分比从0到100％混合，得到不同比例的Aβ单体/纤维混合液。

2)分别取上述溶液100微升与100微升碳基量子点(0.8mg/mL)混合，加入96孔板中，设定激发波长为400nm，发射波长为450nm。测定不同比例的Aβ单体/纤维混合液中碳基量子点的荧光强度。结果如图5所示。结果表明，碳基量子点的荧光强度随混合液中纤维含量的增加呈线性增长趋势。

实施例4：碳基量子点对浓度为20μM的β淀粉样蛋白聚集动力学的检测

1)将Aβ粉末配成1mg/mL的六氟异丙醇(HFIP)溶液，37℃孵育6小时后，氮气吹干，以1％体积含量的二甲基亚砜(DMSO)为助溶剂，分散在超纯水中形成浓度为20μM的Aβ溶液。之后，将样品置于摇床中，37℃恒温，150rpm恒速老化。

2)每隔30分钟从上述溶液中取出100微升溶液，加入96孔板中，并加入浓度为1mg/mL的碳基量子点溶液，混合均匀。每次取三组平行样品进行实验。每次取点后，Aβ原液都放回摇床继续孵育。

3)将96孔板中的混合液置于荧光光谱仪中，测定碳基量子点的荧光强度，设定激发波长为450nm，发射波长为500nm。

4)以时间为横坐标，荧光强度为纵坐标，绘制碳基量子点的荧光强度随时间变化趋势图，对数据进行拟合，得到碳量子点检测的淀粉样蛋白聚集行为动力学曲线。曲线如图6所示。结果表明以碳基量子点为探针，可成功得到β淀粉样蛋白纤维的生长动力学曲线，纤维在12小时后达到生长平台期。

实施例5：碳基量子点对浓度为50μM的β淀粉样蛋白聚集动力学的检测

1)将Aβ粉末配成1mg/mL的六氟异丙醇(HFIP)溶液，37℃孵育6小时后，氮气吹干，以1％体积含量的二甲基亚砜(DMSO)为助溶剂，分散在超纯水中形成浓度为50μM的Aβ水溶液。之后，将样品置于摇床中，37℃恒温，150rpm恒速老化。

2)每隔20分钟从上述溶液中取出100微升溶液，加入96孔板中，并加入浓度为2mg/mL的碳基量子点溶液，混合均匀。每次取三组平行样品进行实验。每次取点后，Aβ原液都放回摇床。

3)将96孔板中的混合液置于荧光光谱仪中，测定碳基量子点的荧光强度，设定激发波长为350nm，发射波长为450nm。

4)以时间为横坐标，荧光强度为纵坐标，绘制碳基量子点的荧光强度随时间变化趋势图，对数据进行拟合，得到碳量子点检测的淀粉样蛋白聚集行为动力学曲线。曲线如图7所示。结果表明以碳基量子点为探针，可成功得到β淀粉样蛋白纤维的生长动力学曲线，纤维在12小时后达到生长平台期。

实施例6

一种检测Aβ聚集行为的方法，所述方法包括以下步骤：

1)将Aβ粉末配成1mg/mL溶解在六氟异丙醇(HFIP)中，37℃孵育3小时后，氮气吹干，以1％体积含量的二甲基亚砜(DMSO)为助溶剂，分散在超纯水中。之后，将样品置于摇床中，37℃恒温，150rpm恒速老化。

2)每隔30分钟从上述溶液中取出100微升溶液，加入96孔板中，并加入浓度为1mg/mL的碳基量子点溶液，混合均匀。每次取三组平行样品进行实验。每次取点后，Aβ原液都放回摇床。

3)将96孔板中的混合液置于荧光光谱仪中，测定碳基量子点的荧光强度，设定激发波长为400nm，发射波长为500nm。

4)以时间为横坐标，荧光强度为纵坐标，绘制碳基量子点的荧光强度随时间变化趋势图，对数据进行拟合，得到碳量子点检测的淀粉样蛋白聚集行为动力学曲线。

实施例7

一种检测淀粉样蛋白含量的方法，包括标准曲线的绘制、样品待测液的制备和快速检测；具体如下：

所述标准曲线的绘制包括以下步骤：

1)制备1mg/mL的碳基量子点溶液；

2)将Aβ粉末配成1mg/mL的溶液，溶剂为六氟异丙醇(HFIP)，37℃孵育3小时后，氮气吹干，以1％体积含量的二甲基亚砜(DMSO)为助溶剂，分散在超纯水中形成浓度分别为50mg/mL，100mg/mL，150mg/mL，200mg/mL，250mg/mL，300mg/mL的6份Aβ单体溶液；取上述6份溶液各100微升，分别与100微升1mg/mL的碳基量子点溶液在96孔板中混合；之后，置于荧光光谱仪中，测定碳基量子点的荧光强度，设定激发波长为400nm，发射波长为500nm；以Aβ单体含量mg/mL为横坐标，荧光强度值(a.u.)为纵坐标，绘制Aβ单体标准曲线。

所绘制的Aβ单体标准曲线如图4(a)所示。

其线性回归方程为Y＝ax+b，相关系数R为0.9557。其中x代表Aβ单体的浓度mg/mL，Y代表荧光强度值(a.u.)；a＝-5.2，b＝1829.5。

所述样品待测液的制备包括以下步骤：

将待测样品(例如脑脊液、血液等)经适当处理，去除干扰物质后，保留淀粉样蛋白，从而获得样品待测液。

所述快速检测包括以下步骤：

1)制备1mg/mL的碳基量子点溶液；

2)取上述样品待测液100微升与100微升1mg/mL的碳基量子点溶液在96孔板中混合；之后，置于荧光光谱仪中，测定碳基量子点的荧光强度，设定激发波长为400nm，发射波长为500nm；同时做空白对照试验，按下式计算样品中Aβ单体含量：

x＝(I-I₀)/a

其中，x为待测样品中Aβ单体含量，I为待测样品的荧光强度数值，I₀为空白量子点荧光强度数值，a为标准曲线的斜率数值-5.2。

3)将正常样品中Aβ单体含量与所得待检样品中Aβ单体含量进行比较，获得待检样品中纤维状淀粉样蛋白的含量；

具体地，通过上述方法获得正常样品中Aβ单体含量x₀，与待检样品中Aβ单体含量x对比，得到待检样品中纤维状淀粉样蛋白的含量为x₀-x。

实施例8

一种检测淀粉样蛋白的凝聚构象的方法，所述方法包括：

1)将待确定凝聚构象的淀粉样蛋白与碳基量子点相结合，获得其光谱特征；

2)将已知凝聚构象的淀粉样蛋白与碳基量子点相结合，获得预定光谱特征；

通过比较步骤1)和步骤2)所得的光谱特征，确定所述待确定凝聚构象的淀粉样蛋白的凝聚构象。

申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的工艺方法，但本发明并不局限于上述工艺步骤，即不意味着本发明必须依赖上述工艺步骤才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明所选用原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

Claims (3)

1.一种检测淀粉样蛋白含量的方法，其特征在于，该方法是以碳基量子点作为探针的荧光光谱检测方法；包括标准曲线的绘制、样品待测液的制备和快速检测；

所述标准曲线的绘制包括以下步骤：

1）制备1 mg/mL 的碳基量子点溶液；

2）将Aβ粉末配成1mg/mL的溶液，溶剂为六氟异丙醇，37℃孵育3小时后，氮气吹干，以1%体积含量的二甲基亚砜为助溶剂，分散在超纯水中形成浓度分别为50 mg/mL，100 mg/mL，150 mg/mL，200 mg/mL，250 mg/mL，300 mg/mL的6份Aβ单体溶液；取该6份Aβ单体溶液各100微升，分别与100 微升1 mg/mL 的碳基量子点溶液在96孔板中混合；之后，置于荧光光谱仪中，测定碳基量子点的荧光强度，设定激发波长为400 nm，发射波长为500 nm；以Aβ单体含量mg/mL为横坐标，荧光强度值为纵坐标，绘制Aβ单体标准曲线；

其线性回归方程为Y＝ax+b，相关系数R 为0.9557，其中x 代表Aβ单体的浓度mg/mL，Y代表荧光强度值；a=-5.2，b=1829.5；

所述样品待测液的制备包括以下步骤：

将待测样品经适当处理，去除干扰物质后，保留淀粉样蛋白，从而获得样品待测液；

所述快速检测包括以下步骤：

1）制备1 mg/mL 的碳基量子点溶液；

2）取上述样品待测液100微升与100 微升1 mg/mL 的碳基量子点溶液在96孔板中混合；之后，置于荧光光谱仪中，测定碳基量子点的荧光强度，设定激发波长为400 nm，发射波长为500 nm；同时做空白对照试验，按下式计算待检样品中Aβ单体含量：

x=(I-I₀)/a

其中，x为待测样品中Aβ单体含量，I为待测样品的荧光强度数值，I₀为空白量子点荧光强度数值，a为标准曲线的斜率数值-5.2；

3）将正常样品中Aβ单体含量与所得待检样品中Aβ单体含量进行比较，获得待检样品中异常淀粉样蛋白的含量。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3）包括通过上述方法获得正常样品中Aβ单体含量x₀，与待检样品中Aβ单体含量x比较，得到待检样品中异常淀粉样蛋白的含量为x₀-x。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述样品待测液包括脑脊液、血液。