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JP2003513618A - 非トランスジェニック除草剤耐性植物 - Google Patents

非トランスジェニック除草剤耐性植物

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Publication number
JP2003513618A
JP2003513618A JP2001527631A JP2001527631A JP2003513618A JP 2003513618 A JP2003513618 A JP 2003513618A JP 2001527631 A JP2001527631 A JP 2001527631A JP 2001527631 A JP2001527631 A JP 2001527631A JP 2003513618 A JP2003513618 A JP 2003513618A
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JP
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leu
ser
ala
plant
epsps
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Pending
Application number
JP2001527631A
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English (en)
Inventor
ビータム，ペーター，アール．
アビッサー，パトリシア，エル．
ウォーカー，ケイト，エイ．
メッツ，リチャード，エイ．
Original Assignee
バリゲン（ユーエス） インコーポレイテッド
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
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First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=26854680&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=JP2003513618(A) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by バリゲン（ユーエス） インコーポレイテッド filed Critical バリゲン（ユーエス） インコーポレイテッド
Publication of JP2003513618A publication Critical patent/JP2003513618A/ja
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Abstract

(57)【要約】 本発明は、ホスホノメチルグリシンファミリーのメンバー（例えばグリホサート）に対して耐性または抵抗性のある、非トランスジェニック植物の作製に関するものである。本発明はまた、5−エノールピルビルシキメート-3-リン酸合成酵素（EPSPS）をコードする遺伝子内の植物染色体または染色体外の配列に所望の突然変異をもたらすためのオリゴ核酸塩基の使用にも関する。該突然変異型タンパク質は、野生型タンパク質と比較して触媒活性を実質的に維持しており、ホスホノメチルグリシンファミリーの除草剤に対する植物の耐性または抵抗性を増大させ、かつ、該植物、その期間、組織もしくは細胞の野生型植物と比較して、除草剤が存在するか否かに関係なく、正常な成長または発達をもたらす。本発明はまた、突然変異を導入したEPSPS遺伝子を有する非トランスジェニック植物細胞、そこから再生された該非トランスジェニック植物、ならびに突然変異型EPSPS遺伝子を有する再生非トランスジェニック植物を交配して得られる植物にも関するものである。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】１．発明の属する技術分野 本発明は、ホスホノメチルグリシンファミリーの除草剤、たとえばグリホサー
トに対して耐性または抵抗性の非トランスジェニック植物の生産に係る。また本
発明は、組換え原性(recombinagenic)オリゴ核酸塩基を用いて、植物の染色体ま
たはエピソーム配列内の５−エノールピルビルシキミ酸−３−リン酸シンターゼ
（ＥＰＳＰＳ）をコードしている遺伝子中に所望の突然変異を起こす方法に係る
。この変異したタンパク質は野生型のタンパク質の触媒活性を実質的に維持して
おり、野生型植物と比較して、ホスホノメチルグリシンファミリーの除草剤の存
否に関わらず、植物のその除草剤に対する耐性または抵抗性を増大することがで
き、また植物、その器官、組織または細胞の実質的に正常な成長または生育が可
能になる。さらに本発明は、ＥＰＳＰＳ遺伝子に突然変異を有する非トランスジ
ェニック植物細胞、それから再生される非トランスジェニック植物、および変異
したＥＰＳＰＳ遺伝子を有する再生された非トランスジェニック植物を用いて交
配により選られる植物にも係る。
【０００２】２．発明の背景 ２．１ ホスホノメチルグリシン除草剤 除草剤耐性植物は雑草を駆除する耕作技術の必要性を低減することにより土壌
侵食を有効に低減することができる。この点で多くの研究の主題となる一つの除
草剤は一般にグリホサートといわれるＮ−ホスホノメチルグリシンである。グリ
ホサートは、アミノ酸、ホルモンおよびビタミンを始めとする芳香族化合物の生
合成に至るシキミ酸経路を阻害する。特に、グリホサートは、５−エノールピル
ビルシキミ酸−３−リン酸シンターゼ（以下、ＥＰＳＰシンターゼまたはＥＰＳ
ＰＳという）という酵素を阻害することにより、ホスホエノールピルビン酸（Ｐ
ＥＰ）と３−ホスホシキミ酸から５−エノールピルビル−３−ホスホシキミ酸へ
の変換を抑制する。本発明の目的から、「グリホサート」という用語は、Ｎ−ホ
スホノメチルグリシン（そのあらゆる塩を含む）の除草剤として有効ないかなる
形態も包含し、植物内でグリホサートアニオンを生成することになる他の形態そ
の他ホスホノメチルグリシンファミリーのあらゆる除草剤を包含する。
【０００３】 植物のグリホサートに対する抵抗性は、ＥＰＳＰＳアミノ酸コード配列中に変
異を有する突然変異ＥＰＳＰＳ遺伝子を植物のゲノム中に導入することによって
増大させることができる。グリホサート抵抗性を誘発するＥＰＳＰＳ遺伝子の突
然変異のいくつかの例が米国特許第５，３１０，６６７号、同第５，８６６，７
７５号、同第５，３１２，９１０号および同第５，１４５，７８３号に記載され
ている。これらの提案された突然変異は一般にグリホサート抵抗性表現型を付与
する野生型ＥＰＳＰＳ酵素よりグリホサートに対するＫiが高いが、これらの変
異体はまたＰＥＰに対するＫmが高いことも特徴であり、そのため酵素は反応論
的な効率が落ちている（Kishoreら, 1988, Ann. Rev. Biochem. 57:627-663; Sc
hulzら, 1984, Arch. Microbiol. 137:121-123; Sostら, 1984, FEBS Lett. 173
:238-241; Kishore ら, 1986, Fed. Proc. 45:1506; Sost and Amrhein, 1990,
Arch. Biochem. Biophys. 282:433-436）。ＥＰＳＰＳ遺伝子の突然変異の多く
が除草剤に対して耐性のＥＰＳＰＳ酵素を生産するように選択されているが、残
念なことに、そのようなＥＰＳＰＳ遺伝子により生産されるＥＰＳＰＳ酵素は野
生型のＥＰＳＰＳより酵素活性がずっと低い。たとえば、大腸菌に由来する野生
型ＥＰＳＰＳのＰＥＰに対するみかけのＫmとグリホサートに対するみかけのＫi はそれぞれ１０μＭと０．５μＭであるが、位置９６のグリシンがアラニンに置
換された単一のアミノ酸置換を有するグリホサート抵抗性単離体はこれらの値が
それぞれ２２０μＭと４．０ｍＭである。たくさんのグリホサート抵抗性ＥＰＳ
ＰＳ遺伝子が突然変異誘発によって構築されている。ここでも、ＰＥＰに対する
Ｋmが増大し、野生型植物酵素のＶmaxが多少低下することにより示されるように
（Kishore ら, 1988, Ann. Rev. Biochem. 57:627-663）、このようなグリホサ
ート抵抗性ＥＰＳＰＳは触媒効率（Ｖmax／Ｋm）が低い。
【０００４】 これら変異酵素の反応定数はＰＥＰに関して損なわれているので、グリホサー
トの存在下で植物の正常な触媒活性を維持するためには変異酵素の高レベルの過
剰生産、すなわち４０〜８０倍が必要であろうという提案がなされている（Kish
ore ら, 1988, Ann. Rev. Biochem. 57:627-663）。細胞の葉緑体中でより高い
レベルのＥＰＳＰシンターゼを生産する能力を植物のゲノム中に挿入することに
よってグリホサート抵抗性植物を製造することができるということが示されてお
り（Shahら, 1986, Science 233, 478-481）、この酵素は好ましいことにグリホ
サート抵抗性である（Kishoreら, 1988, Ann. Rev. Biochem. 57:627-663）。
【０００５】 外因性の突然変異ＥＰＳＰＳ遺伝子の植物中への導入は文献に充分記載されて
いる。たとえば、米国特許第４，５４５，０６０号によると、植物のグリホサー
トに対する耐性を増大するために、酵素の競合阻害剤、すなわちグリホサートに
対するその酵素の耐性を高くする突然変異を少なくとも１つ有するＥＰＳＰＳ変
異体をコードしている遺伝子を植物ゲノム中に導入する。しかし、これらの例に
ついては複雑な問題が多く伴っている。そのような突然変異の多くは、変異した
ＥＰＳＰＳ遺伝子産物の発現が低くなるか、または野生型と比べて触媒活性がず
っと低いＥＰＳＰＳ遺伝子産物が生成する。この変異した酵素の低い発現または
低い酵素活性のため、植物の成長と生育のレベルが異常に低くなる。
【０００６】 ＥＰＳＰシンターゼのそのような変異はグリホサートに対して抵抗性のトラン
スジェニック植物を得るのに有用であることが立証されているが、グリホサート
抵抗性が高いが、それでも反応論的に効率がよく、野生型の発現レベルで改良さ
れた抵抗性を得ることができるような変異したＥＰＳＰＳ遺伝子産物が得られれ
ばさらに有益であろう。
【０００７】２．２ 組換え原性オリゴ核酸塩基 組換え原性オリゴ核酸塩基およびこれを用いて真核細胞の遺伝子を変化させる
ことはKmiecの米国特許第５，５６５，３５０号（Kmiec I）に記載されている。
Kmiec Iは特定の遺伝的変化を標的遺伝子に導入する方法を教示している。特に
、Kmiec Iは、２つのストランドを有する組換え原性オリゴ核酸塩基を開示して
おり、ここで、第一のストランドは少なくとも８個のＲＮＡ様ヌクレオチドから
なる２つのセグメントを含有しており、これらセグメントは「介在ＤＮＡセグメ
ント」と称される４〜約５０個のＤＮＡ様ヌクレオチドからなる第三のセグメン
トによって分離されている。この第一ストランドのヌクレオチドは第二のストラ
ンドのＤＮＡ様ヌクレオチドと塩基対を形成する。この第一と第二のストランド
はさらに一本鎖のヌクレオチドセグメントによって結合されていて、これら第一
と第二のストランドが単一のオリゴヌクレオチド鎖の一部となっている。Kmiec
Iはさらに、特定の遺伝的変化を標的遺伝子に導入する方法を教示している。Kmi
ec Iによると、ＲＮＡセグメントの配列は、標的遺伝子の第一と第二のフラグメ
ントの配列と相同、すなわち同一であるように選択される。介在ＤＮＡセグメン
トの配列は、「異種領域」と称される差がある領域を除いて、標的遺伝子の第一
と第二のフラグメントの間の配列と相同である。この異種領域は挿入もしくは欠
失となることができ、または置換となるように標的遺伝子の配列と整合していな
い塩基を1個以上含有していることができる。Kmiec Iによると、標的遺伝子の配
列は異種領域により指令されるように変更されていて、標的遺伝子が組換え原性
オリゴヌクレオチドの配列と相同になるようになっている。Kmiec Iは特に、２
’−Ｏ−メチルリボース、すなわち２’−メトキシリボースを含有するヌクレオ
チドが組換え原性オリゴ核酸塩基に使用することができること、および天然のデ
オキシリボースを含有するヌクレオチドがＤＮＡ様ヌクレオチドとして使用する
ことができることを教示している。
【０００８】 Kmiecの米国特許第５，７３１，１８１号（Kmiec II）は、特に、組換え原性
オリゴ核酸塩基を用いて植物細胞で遺伝的変化を起こさせることを開示しており
、また、特定の標的遺伝子で遺伝的変化を起こさせるのに使用することができる
ＲＮＡ様およびＤＮＡ様ヌクレオチドの類似体および誘導体の別の例を開示して
いる。組換え原性オリゴ核酸塩基の使用について論じている別の特許として、米
国特許第５，７５６，３２５号、同第５，８７１，９８４号、同第５，７６０，
０１２号、同第５，８８８，９８３号、同第５，７９５，９７２号、同第５，７
８０，２９６号、同第５，９４５，３３９号、同第６，００４，８０４号および
同第６，０１０，９０７号ならびに国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ００／２３４５７号
および国際公開第９８／４９３５０号、同第９９／０７８６５号、同第９９／５
８７２３号、同第９９／５８７０２号および同第９９／４０７８９号がある。組
換え原性オリゴ核酸塩基には、混合二本鎖オリゴヌクレオチド、Kmiec IIに教示
されている非ヌクレオチド含有分子ならびに上記特許および出願公開に教示され
ている他の分子が包含される。
【０００９】 本願明細書のこの第２欄または他の欄で引用した特許または文献はそのような
文献が本発明に対する従来技術として利用されることを認めるものではない。
【００１０】３．発明の概要 本発明は、ＥＰＳＰＳ遺伝子に１つ以上の突然変異を有する非トランスジェニ
ック植物または植物細胞に関し、この植物はホスホノメチルグリシンファミリー
のものに対する耐性または抵抗性が増大しており、また対応する野生型植物また
は細胞と比較して植物、その器官、組織または細胞の実質的に正常な成長または
生育を示す。また、本発明は、ＥＰＳＰＳ遺伝子に突然変異を有する非トランス
ジェニック植物に関し、この植物はホスホノメチルグリシンファミリーのもの、
たとえばグリホサートに対する抵抗性が増大しており、またこの変異したＥＰＳ
ＰＳタンパク質は野生型ＥＰＳＰＳタンパク質と比べて実質的に同じ触媒活性を
もっている。
【００１１】 本発明はまた、ホスホノメチルグリシンファミリーの除草剤の存否に関わらず
野生型のタンパク質の触媒活性を実質的に維持している変異したＥＰＳＰＳ遺伝
子を有する非トランスジェニック植物を製造する方法にも関する。この方法は、
ＥＰＳＰＳ遺伝子に標的突然変異をもつ組換え原性オリゴ核酸塩基を触媒細胞中
に導入し、変異したＥＰＳＰＳ遺伝子を有する細胞、種子または植物を同定する
ことからなる。
【００１２】 組換え原性オリゴ核酸塩基の代表例は、米国特許第５，５６５，３５０号、同
第５，７５６，３２５号、同第５，８７１，９８４号、同第５，７６０，０１２
号、同第５，７３１，１８１号、同第５，８８８，９８３号、同第５，７９５，
９７２号、同第５，７８０，２９６号、同第５，９４５，３３９号、同第６，０
０４，８０４号および同第６，０１０，９０７号ならびに国際出願第ＰＣＴ／Ｕ
Ｓ００／２３４５７号および国際公開第９８／４９３５０号、同第９９／０７８
６５号、同第９９／５８７２３号、同第９９／５８７０２号および同第９９／４
０７８９号に見られる。これら特許および公開は引用によりその内容全体が本明
細書に含まれているものとする。
【００１３】 植物は、木もしくは低木として成長する任意の木質植物種を始めとする双子葉
類、単子葉類もしくは裸子植物の任意の種、任意の草本性種、または食用果実、
種子もしくは野菜を生じる任意の種、または着色もしくは芳香性の花を生じる任
意の種であることができる。植物は、たとえば、カノラ、ヒマワリ、タバコ、サ
トウダイコン、ワタ、トウモロコシ、コムギ、オオムギ、コメ、モロコシ、トマ
ト、マンゴ、モモ、リンゴ、ナシ、イチゴ、バナナ、メロン、ジャガイモ、ニン
ジン、レタス、タマネギ、ダイズ、エンドウ、インゲンマメ(field bean)、ポプ
ラ、ブドウ、柑橘類、アルファルファ、ライ、オートムギ、芝生および牧草、ア
マ、アブラナ、キュウリ、アサガオ、バルサム、コショウ、ナス、マリーゴール
ド、ハス、キャベツ、デイジー、カーネーション、チューリップ、アイリス、ユ
リ、ならびにすでに挙げたものを除く木の実を生じる植物より成る群の中の植物
の種から選択することができる。
【００１４】 組換え原性オリゴ核酸塩基は、限定されることはないがマイクロキャリアー（
バイオリスティック送達）、マイクロファイバー、エレクトロポレーション、マ
イクロインジェクションを始めとして当分野で一般的に用いられている何らかの
方法を用いて植物細胞中に導入することができる。
【００１５】 本発明はまた、種子を生産する植物（以後「稔性植物」とする）を得るための
、本発明の方法に従って突然変異させた細胞の培養、およびそのような稔性植物
からの種子および別の植物の生産にも関する。
【００１６】 さらに本発明は、開示したＥＰＳＰＳ遺伝子の変異を有する触媒と雑草を含む
圃場で雑草を選択的に防除する方法にも関し、この方法は前記の植物が耐性とな
っている除草剤をその圃場に施用することからなる。
【００１７】 また本発明は、ホスホノメチルグリシンファミリーのもの、たとえばグリホサ
ートに対する耐性または抵抗性を植物に付与するＥＰＳＰＳ遺伝子内の新規な突
然変異にも関しており、ここで、突然変異したＥＰＳＰＳは野生型のＥＰＳＰＳ
と比べて実質的に同じ酵素活性をもっている。
【００１８】３．１ 定義 本発明は以下の定義に従うものと了解されたい。
【００１９】 オリゴ核酸塩基は、核酸塩基のポリマーであり、ワトソンクリック塩基対形成
により相補的な配列を有するＤＮＡとハイブリダイズすることができるものであ
る。
【００２０】 核酸塩基は、プリン、ピリミジン、またはこれらの誘導体もしくは類似体であ
る塩基を含む。核酸塩基としては、ペプチド核酸塩基、ペプチド核酸のサブユニ
ット、およびモルホリン核酸塩基ならびにヌクレオシドおよびヌクレオチドがあ
る。ヌクレオシドは、ペントースフラノシル部分、たとえば任意に置換されたリ
ボシドまたは2'-デオキシリボシドを含有する核酸塩基である。ヌクレオシドは
、複数の結合部分（リンを含有していてもいなくてもよい）の１つにより結合し
ていてよい。置換されてないホスホジエステル結合で結合したヌクレオシドはヌ
クレオチドといわれる。
【００２１】 オリゴ核酸塩基鎖は、そのポリマーの最終的な核酸塩基である５’末端と３’
末端をひとつずつもっている。個々のオリゴ核酸塩基鎖はあらゆるタイプの核酸
塩基を含有することができる。オリゴ核酸塩基化合物は、相補的であってワトソ
ンクリック塩基対形成によりハイブリダイズしている１つ以上のオリゴ核酸塩基
鎖を含む化合物である。核酸塩基はデオキシリボ型またはリボ型のいずれかであ
る。リボ型の核酸塩基はペントースフラノシルを含有する核酸塩基であり、2'炭
素原子はヒドロキシ、アルキルオキシまたはハロゲンで置換されたメチレンであ
る。デオキシリボ型の核酸塩基はリボ型の核酸塩基以外の核酸塩基であり、ペン
トースフラノシル部分を含有していないあらゆる核酸塩基を包含する。
【００２２】 オリゴ核酸塩基ストランドとは一般に、オリゴ核酸塩基鎖と、オリゴ核酸塩基
鎖のセグメントまたは領域の両方を包含する。オリゴ核酸塩基ストランドは３’
端と５’端とをもっている。オリゴ核酸塩基ストランドが鎖と同じ長さである場
合、そのストランドの３’端と５’端はその鎖の３’末端と５’末端でもある。
【００２３】 本発明において、植物、植物器官、植物組織または植物細胞の実質的に正常な
成長とは、野生型ＥＰＳＰＳタンパク質を発現する対応する植物、植物器官、植
物組織または植物細胞における成長速度または細胞分裂の速度の少なくとも３５
％、少なくとも５０％、少なくとも６０％または少なくとも７５％に当たる植物
、植物器官、植物組織または植物細胞の成長速度または細胞分裂の速度と定義さ
れる。
【００２４】 本発明において、植物、植物器官、植物組織または植物細胞の実質的に正常な
発達とは、野生型ＥＰＳＰＳタンパク質を発現する対応する植物、植物器官、植
物組織または植物細胞において起こる発生・発達事象と実質的に同じ発生・生育
事象の１つ以上がその植物、植物器官、植物組織または植物細胞で起こることと
定義される。
【００２５】 本発明において、植物器官とは、葉、茎、根、植物の芽、花芽、分裂組織、胚
芽、子葉、内乳、がく片、花弁、めしべ、心皮、おしべ、やく、小胞子、花粉、
花粉管、胚珠、子房および果実、またはこれらから得られる切片、薄片もしくは
ディスクがあるが限定されることはない。植物組織としては、カルス組織、基本
組織、維管束組織、貯蔵組織、分裂組織、葉組織、苗条組織、根組織、ゴール(g
all)組織、植物腫瘍組織、および生殖組織があるが限定されることはない。植物
細胞としては、細胞壁を有する単離細胞、そのさまざまな大きさの凝集体および
プロトプラストがあるが限定されることはない。
【００２６】 植物は、これをグリホサートに暴露し、同様に暴露した非抵抗性の類似の植物
で得られる用量／応答曲線と比較して右にシフトした用量／応答曲線が得られる
ときにグリホサートに対して実質的に「抵抗性」である。このような用量／応答
曲線はＸ軸に「用量」をプロットし、ｙ軸に「殺草パーセント」、「除草効果」
などをプロットして得られる。抵抗性の植物は、所与の除草効果を生じるために
非抵抗性の類似の植物より多くの除草剤を必要とする。グリホサートに対して実
質的に「耐性」である植物は、圃場で雑草を駆除するために農芸化学分野で通常
用いられる濃度と割合でグリホサートに暴露したときに壊死性、溶解性、萎黄病
その他の損傷をほとんど示さない。除草剤に対して耐性である植物はその除草剤
に対して抵抗性でもある。「耐性」および「抵抗性」という用語は、本出願にお
いては「抵抗性および／または耐性」と考えられたい。
【００２７】４．図面の簡単な説明 （後記参照）５．詳細な説明 本発明は、対応する野生型の植物または細胞と比較して、ホスホノメチルグリ
シンファミリーのメンバーに対する耐性または抵抗性が増大し、かつ植物、器官
、組織または細胞の実質的に正常な成長または発達を示す、EPSPS遺伝子に突然
変異を有する非トランスジェニック植物または植物の細胞に関するものである。
本発明はまた、ホスホノメチルグリシンファミリーのメンバー（例えばグリホサ
ート）に対して耐性であるかまたは抵抗性が増大しており、突然変異型EPSPSタ
ンパク質が野生型EPSPSタンパク質と比較して実質的に同じ触媒活性を有する、E
PSPS遺伝子に突然変異を有する非トランスジェニック植物に関するものである。
【００２８】 本発明はまた、ホスホノメチルグリシンファミリーの除草剤が存在するか否か
に関係なく野生型タンパク質の触媒活性を実質的に維持している突然変異型EPSP
S遺伝子を有する非トランスジェニック植物を作成する方法に関する。この方法
は、植物細胞に組換え原性オリゴ核酸塩基をEPSPS遺伝子に標的化突然変異を行
うことによって導入し、かつ突然変異型EPSPS遺伝子を有する細胞、種子または
植物を同定することを含む。
【００２９】 組換え原性オリゴ核酸塩基として例示できるものは、以下の特許公報：米国特
許第5,565,350号；第5,756,325号；第5,871,984号；第5,760,012号；第5,731,18
1号；第5,888,983号；第5,795,972号；第5,780,296号；第5,945,339号；第6,004
,804号；および第6,010,907号、ならびに国際特許PCT/US00/23457号；および国
際特許公開WO 98/49350号; WO 99/07865号; WO 99/58723号; WO 99/58702号;お
よびWO 99/40489号; に見出され、それらは参照によりその本明細書中に全体を
組み入れられるものとする。
【００３０】 植物は、双子葉植物、単子葉植物または裸子植物の何れの種であってもよく、
高木または低木として成長するあらゆる木本植物種、あらゆる草本種、または食
用果実、種子もしくは野菜を生産するあらゆる種、または色彩のあるもしくは芳
香を産するあらゆる種が含まれる。例えば、植物は、カノーラ、ヒマワリ、タバ
コ、テンサイ、綿花、トウモロコシ、コムギ、オオムギ、イネ、モロコシ、トマ
ト、マンゴー、モモ、リンゴ、ナシ、イチゴ、バナナ、メロン、ジャガイモ、ニ
ンジン、レタス、タマネギ、ダイズ種、サトウキビ、エンドウマメ、ソラマメ、
ポプラ、ブドウ、柑橘類、アルファルファ、ライムギ、オーツムギ、シバおよび
飼料用草、アマ、アブラナ、キュウリ、アサガオ、バルサム、ペッパー、ナス、
マリーゴールド、ハス、キャベツ、デージー、カーネーション、チューリップ、
アイリス、ユリおよび豆を生産する植物であってよいが、上記に言及していない
ものでもよい。
【００３１】 組換え原性オリゴ核酸塩基は、当技術分野で一般的に用いられるあらゆる方法
を用いて植物細胞に導入することができ、その方法には、限定するものではない
が、微小担体法（バイオリスティック送達）、マイクロファイバー法、電気穿孔
法、マイクロインジェクション法が含まれる。
【００３２】 本発明はまた、種子を生産する植物（以下、「稔性植物」）を得る目的で本発
明の方法に従って突然変異した細胞の培養、ならびにそのような繁殖植物からの
種子および追加的な植物の生産に関する。
【００３３】 本発明はさらに、本明細書において開示するEPSPS遺伝子改変を有する植物と
雑草とを含む圃場の雑草を選択的に制御する方法に関する。該方法は、上記植物
が耐性を獲得した除草剤を圃場に適用することを含む。
【００３４】 本発明はまた、ホスホノメチルグリシンファミリーのメンバー（例えばグリホ
サート）に対する耐性もしくは抵抗性を植物に付与するか、または突然変異型EP
SPSが野生型EPSPSと比較して実質的に同じ酵素活性を有する、EPSPS遺伝子にお
ける新規の突然変異にも関する。
【００３５】５．１． 組換え原性オリゴ核酸塩基 本発明は、Kmiecの米国特許第5,565,350号(Kmiec I)および米国特許第5,731,1
81号(Kmiec II)の遺伝子に記載の高次構造および化学的性質を持つ組換え原性オ
リゴ核酸塩基を用いて実施することができる（上記米国特許は参照により本明細
書に組み入れることとする）。Kmiec Iは特定の遺伝子の改変を標的遺伝子に導
入するための方法を教示する。Kmiec Iおよび／またはKmiec II中の組換え原性
オリゴ核酸塩基は２つの相補的な鎖を含んでおり、鎖の１つはもう一方の鎖のDN
A型ヌクレオチドと対をなす塩基であるRNA型ヌクレオチドのセグメント（RNAセ
グメント）を少なくとも１つ含んでいる。
【００３６】 Kmiec IIは、プリンおよびピリミジン塩基を含む非ヌクレオチドをヌクレオチ
ドと置換できることを開示する。米国特許第5,756,325号; 第5,871,984号; 第5,
760,012号; 第5,888,983号; 第5,795,972号; 第5,780,296号; 第5,945,339号;
第6,004,804号; および第6,010,907号および国際特許公開WO 98/49350号; WO 99
/07865号; WO 99/58723号; WO 99/58702号; およびWO 99/40789号（これらそれ
ぞれの全体を本明細書に組み入れることとする）は、、本発明に用いることがで
きるさらなるの組換え原性分子を開示する。本明細書中に用いる「組換え原性オ
リゴ核酸塩基」という用語は、本発明の方法に使用できる分子を意味し、混合二
本鎖オリゴヌクレオチド、Kmiec IIに示される分子を含む非ヌクレオチド、一本
鎖オリゴデオキシヌクレオチドおよび前掲の特許および特許公開に示されたその
他の組換え原性分子を含む。
【００３７】 ある実施形態では、組換え原性オリゴ核酸塩基が、混合二本鎖オリゴヌクレオ
チドのRNA型ヌクレオチドが、その2’-ヒドロキシル基をフッ素、塩素または臭
素の官能基で置換することによって、またはその2’-O上に置換基を配置するこ
とによって、リボヌクレアーゼ耐性となった混合二本鎖オリゴヌクレオチドであ
る。適切な置換基はKmiec IIに示される置換基を含む。代替できる置換基には、
米国特許第5,334,711号(Sproat)に示される置換基および特許公開EP629387号お
よびEP679657号（全てMartinの出願）により示される置換基があり、それらは参
照により本明細書中に組み入れられるものとする。本明細書中では、リボヌクレ
オチドまたはMartinの出願もしくはSproatにより記載される置換基で2’-OHを置
換したリボヌクレオチドの2’-フルオロ、クロロ、ブロモ誘導体は、「2’-置換
リボヌクレオチド」と称する。本明細書中で用いる「RNA型ヌクレオチド」とい
う用語は、無置換のホスホジエステル結合またはKmiec IもしくはKmiec IIによ
り示される非天然の結合のいずれかによって混合二本鎖オリゴヌクレオチドの他
のヌクレオチドに連結された2’-ヒドロキシルもしくは2’-置換ヌクレオチドを
意味する。本明細書中で用いる「デオキシリボ型ヌクレオチド」という用語は、
無置換のホスホジエステル結合またはKmiec IもしくはKmiec IIにより示される
非天然の結合のいずれかによってMDONの他のヌクレオチドに連結し得る2’-Hを
有するヌクレオチドを意味する。
【００３８】 本発明の特定の実施形態では、組換え原性オリゴ核酸塩基は無置換のホスホジ
エステル結合のみによって連結された混合二本鎖オリゴヌクレオチドである。他
の実施形態では、その結合は、置換されたホスホジエステル、ホスホジエステル
誘導体およびKmiec IIにより示されるようなリンが関与しない結合によるもので
ある。さらにそれ以外の実施形態では、混合二本鎖オリゴヌクレオチド中のRNA
型ヌクレオチドが2’-置換ヌクレオチドである。2’-置換リボヌクレオチドの特
に好ましい実施形態は、2’-フルオロ、2’-メトキシ、2’-プロピロキシ、2’-
アリルオキシ、2’-ヒドロキシルエチルオキシ、2’-メトキシエチルオキシ、2
’-フルオロプロピルオキシおよび2’-トリフルオロプロピルオキシ置換リボヌ
クレオチドである。2’-置換リボヌクレオチドのより好ましい実施形態は、2’-
フルオロ、2’-メトキシ、2’-メトキシエチルオキシおよび2’-アリルオキシ置
換リボヌクレオチドである。もう一つの実施形態では、混合二本鎖オリゴヌクレ
オチドは無置換のホスホジエステル結合によって連結されている。
【００３９】 2’-置換RNA型ヌクレオチドを1種類のみ有する混合二本鎖オリゴヌクレオチド
はより簡便に合成することができるが、本発明の方法は、RNA型ヌクレオチドを2
種類以上有する混合二本鎖オリゴヌクレオチドを用いて行うことも可能である。
RNAセグメントの機能は、2つのRNA型トリヌクレオチドの間にデオキシヌクレオ
チドを導入することにより起こる分断によっても影響を受けない。従って、RNA
セグメントという用語にはこのような「分断されたRNAセグメント」も包含する
。分断の無いRNAセグメントは連続したRNAセグメントと称する。他の実施形態で
は、RNAセグメントには改変されたリボヌクレアーゼ耐性をもつ無置換の2’-OH
ヌクレオチドが含まれ得る。混合二本鎖オリゴヌクレオチドは、好ましくは100
個未満のヌクレオチドを有し、より好ましくは85個未満のヌクレオチドであるが
、51個以上のヌクレオチドを有する。第１鎖と第2鎖はワトソン-クリックの塩基
対である。ある実施形態においては、混合二本鎖オリゴヌクレオチドの鎖が、一
本鎖の６ヌクレオチド、５ヌクレオチドまたは４ヌクレオチドなどのリンカーに
より共役結合されており、そのために第１鎖と第2鎖とが１つの3’末端と１つの
5’末端を有する一本鎖オリゴヌクレオチドのセグメントとなっている。3’末端
および5’末端は、「ヘアピンキャップ」を付加することで保護され得る。そう
することによって、3’末端および5’末端のヌクレオチドは隣接するヌクレオチ
ドとワトソン-クリック型塩基対を形成する。加えて、第二のヘアピンキャップ
を3’末端および5’末端から離れた第１鎖および第2鎖のあいだの連結部に配置
することができる。これにより、第１鎖と第2鎖の間のワトソン-クリック型対合
が安定化される。
【００４０】 第１鎖および第2鎖は標的EPSPS遺伝子の2つの断片と相同な2つの領域を含んで
いる。すなわち、標的遺伝子と同じ配列を有している。相同的な領域はRNAセグ
メントの領域のヌクレオチドを含んでおり、連結するDNAセグメントのDNA型ヌク
レオチドを一個以上含んでいてもよく、また介在するDNAセグメントには含まれ
ないDNA型ヌクレオチドも含んでいてよい。相同な二つの領域は、それぞれが標
的遺伝子の配列とは異なる配列を有する領域（「非相同領域」と称す）に隣接し
ており、該領域によって分離されている。非相同領域は1個、2個または3個のミ
スマッチのヌクレオチドを含み得る。ミスマッチのヌクレオチドは連続的であっ
てよく、または1または2個の標的遺伝子と相同のヌクレオチドにより分断されて
いてもよい。あるいは、非相同領域はまた、1個、2個、3個または5個以下のヌク
レオチドの挿入を含み得る。あるいは、混合二本鎖オリゴヌクレオチドの配列は
、混合二本鎖オリゴヌクレオチドから1個、2個、3個または5個以下のヌクレオチ
ドが欠失していることのみによって標的遺伝子の配列と異なっていてもよい。こ
の場合、非相同領域の長さと位置は、混合二本鎖オリゴヌクレオチドのヌクレオ
チドが非相同領域内に無いとしても、欠失され得る長さとみなすことができる。
2つの相同領域に相補的な標的遺伝子の断片の間の距離は、置換が意図された場
合は、非相同領域の長さと一致する。非相同領域が挿入部を含んでいる場合は、
したがって相同領域は、それらに相補的な相同する断片の遺伝子中での位置より
も離れて混合二本鎖オリゴヌクレオチド中では分離されている。そして、非相同
領域が欠失をコードする場合には、その逆のことが起こる。
【００４１】 混合二本鎖オリゴヌクレオチドのRNAセグメントはそれぞれ相同領域、すなわ
ち標的遺伝子の断片と配列が同一の領域の一部分である。該セグメントは共に好
ましくは13個以上のRNA型ヌクレオチドを含有しており、好ましくは16〜25個のR
NA型ヌクレオチドを含有しており、またはより好ましくは18〜22個のRNA型ヌク
レオチドを含有しており、または最も好ましくは20個のRNA型ヌクレオチドを含
有している。ある実施形態においては、相同領域のRNAセグメントは、隣接する
介在するDNAセグメントによって分割され、すなわち介在DNAセグメントによって
「連結されている」。ある実施形態においては、非相同領域の各ヌクレオチドが
介在DNAセグメントのヌクレオチドである。混合二本鎖オリゴヌクレオチドの非
相同領域を含有する介在DNAセグメントを「突然変異セグメント」と称する。
【００４２】 標的EPSPS遺伝子にされる改変は、非相同領域によりコードされる。標的EPSPS
遺伝子に導入される改変は、EPSPS遺伝子配列のうちの1以上の塩基の改変であっ
てよく、または1以上の塩基の付加もしくは欠失であってよい。
【００４３】 本発明のもう一つの実施形態においては、組換え原性オリゴ核酸塩基は一本鎖
のオリゴデオキシヌクレオチド突然変異ベクターまたは、国際特許出願PCT/US00
/23457（参照によりその全体を組み入れるものとする）に記載されるSSOMVであ
る。SSOMVの配列は、米国特許第5,756,325号; 第5,871,984号; 第5,760,012号;
第5,888,983号; 第5,795,972号; 第5,780,296号; 第5,945,339号; 第6,004,804
号;および第6,010,907号;ならびに国際特許公開WO 98/49350号; WO 99/07865号;
WO 99/58723号; WO 99/58702号;およびWO 99/40789号に記載される突然変異ベ
クターと同じ原理に基づいている。SSOMVの配列は、所望の遺伝子の改変を有す
る突然変異領域と称する領域によって分断された、標的配列と相同な2つの領域
を含有する。突然変異領域は、標的配列内で相同領域を分断するが配列と同じ長
さであるが配列の異なる配列を有し得る。このような突然変異領域は置換を引き
起こし得る。あるいは、同じ配列を有する標的遺伝子中の領域が1個、2個または
3個のヌクレオチドにより分断されている場合には、SSOMV中の相同領域はお互い
に一続きであることができる。そのようなSSOMVは、標的遺伝子からSSOMVに存在
しないヌクレオチドの欠失を引き起こす。最後に、相同領域と同一の標的遺伝子
の配列は、標的遺伝子中で隣接していながらSSOMV中の1個、2個またはそれ以上
のヌクレオチドによって分断されていても良い。そのようなSSOMVは、標的遺伝
子の配列に挿入を引き起こす。
【００４４】 SSOMVのヌクレオチドは、3’末端および/または5’末端のヌクレオチド間結合
あるいは3’末端および/または5’末端の2つのヌクレオチド間結合がホスホロチ
オエートもしくはホスホアミドであり得るということを除いては、改変のないホ
スホジエステル結合により連結されているデオキシリボヌクレオチドである。本
明細書中で用いる場合、ヌクレオチド間結合とはSSOMVのヌクレオチド間の結合
であり、3’末端ヌクレオチドまたは5’末端ヌクレオチドと前出の保護置換基と
の間の結合は含まない。特定の実施形態では、SSOMVの長さは21〜55デオキシヌ
クレオチドであり、従って、相同領域の長さは、合計の長さが少なくとも20デオ
キシヌクレオチドであり、少なくとも2つの相同領域がそれぞれ少なくとも8デオ
キシヌクレオチドの長さを有するべきである。
【００４５】 SSOMVは標的遺伝子のコード鎖または非コード鎖のどちらかに相補的であるよ
うに設計することができる。所望の突然変異が1塩基置換である場合には、突然
変異ヌクレオチドはともにピリミジンであることが好ましい。所望する機能的結
果を達成するためには、突然変異ヌクレオチドと相補鎖中の標的ヌクレオチドは
両方ともピリミジンであることが好ましい。特に好ましくは、塩基転換型突然変
異をコードするSSOMVである。すなわち、CまたはT突然変異ヌクレオチドがそれ
ぞれ相補鎖中のCまたはTヌクレオチドにミスマッチするものである。
【００４６】 オリゴデオキシヌクレオチドに加えて、SSOMVはリンカーを介して5’末端の炭
素原子に結合した5’保護置換基を含むことができる。リンカーの化学的性質は
、その長さが少なくとも6原子の長さであってリンカーは屈曲性があるべきだと
いう点を除いては重要ではない。ビオチン、コレステロールもしくは他のステロ
イドなどの無毒性の各種置換基または非インターカレーティング(non-intercala
ting)陽イオン蛍光色素を利用することができる。SSOMVを調製する試薬として特
に好ましいのは、Glen Research, Sterling VAによりCy3(商標)およびCy5(商標)
として市販されている試薬である。それらは保護されたホスホロアミダイトであ
り、オリゴヌクレオチドに組み込まれると、それぞれ、3,3,3’,3’-テトラメチ
ルN,N’-イソプロピル置換インドモノカルボシアニンおよびインドジカルボシア
ニン色素を生じる。Cy3が最も好ましい。インドカルボシアニンがN-オキシアル
キル置換されている場合、5’末端リン酸とのホスホジエステルによってオリゴ
デオキシヌクレオチドの5’末端に容易に連結され得る。色素とオリゴデオキシ
ヌクレオチドとの間の色素リンカーの化学的性質は重要ではなく、合成が容易に
なるように選択される。市販のCy3ホスホロアミダイトを指示どおり用いる場合
、得られる5’の修飾は、ともにN-ヒドロキシプロピル、N’-ホスファチジルプ
ロピル3,3,3’,3’-テトラメチルインドモノカルボシアニンである保護置換基お
よびリンカーからなる。
【００４７】 好ましい実施形態では、インドカルボシアニン色素はインドール環の3位およ
び3’位が四置換されたものである。理論には拘束されないが、これらの置換は
色素がインターカレーティング色素になることを防ぐ。これらの位置の置換基の
同一性は重要ではない。SSOMVは加えて3’保護置換基を有していてもよい。3’
保護基の化学的性質もまた重要ではない。
【００４８】５．２ EPSPS遺伝子に導入した変異の部位および型 本発明の１つの実施形態において、シロイヌナズナEPSPS遺伝子（図１Ａ参照
）およびそれに対応するEPSPS酵素（図１Ｂ参照）は、Leu173、Gly177、Thr178
、Ala179、Met180、Arg181、Pro182、Ser98、Ser255およびLeu198から構成され
るグループより選択された１もしくはそれ以上のアミノ酸残基、または、EPSPS
パラログにおける相同な位置における変異を含み、そしてこの変異により野生型
の配列と比較してEPSPS酵素において１つ以上の下記のアミノ酸置換がもたらさ
れる： （i）Leu173-Phe （ii）Gly177-AlaあるいはIle （iii）Thr178-IleあるいはValあるいはLeu （iv）Ala179-Gly （v）Met180-Cys （vi）Arg181-LeuあるいはSer （vii）Pro182-LeuあるいはSer （viii）Ser98-Asp （ix）Ser255-Ala （x）Leu198-Lys。
【００４９】 本発明の別の実施形態において、EPSPS遺伝子産物において置換されるアミノ酸
残基は、連続した配列Leu-Tyr-Leu-Gly-Asn（配列番号２９）中のLeuであり、こ
れはPheに置換される。あるいは置換されるアミノ酸残基は、連続した配列Asn-A
la-Gly-Thr-Ala（配列番号３０）中のGlyであり、これがAlaまたはIleに置換さ
れる。あるいは置換されるアミノ酸は連続した配列Ala-Gly-Thr-Ala-Met（配列番
号３１）中のThrであり、これはIle、ValあるいはLeuに置換される。あるいは置
換されるアミノ酸は連続した配列Gly-Thr-Ala-Met-Arg（配列番号３２）中のAla
であり、これはGlyに置換される。あるいは置換されるアミノ酸は連続した配列Th
r-Ala-Met-Arg-Pro（配列番号３３）中のMetであり、Cysに置換される。あるいは
置換されるアミノ酸は連続した配列Ala-Met-Arg-Pro-Leu（配列番号３４）中のA
rgであり、これはLeuあるいはSerに置換される。あるいは置換されるアミノ酸は
以下の配列Met-Arg-Pro-Leu-Thr（配列番号３５）中のProであり、これはLeuあ
るいはSerに置換される。あるいは置換されるアミノ酸は連続したPro-Gly-Ser-Ly
s-Ser（配列番号３６）中のSerであり、これはAspに置換される。あるいは置換
されるアミノ酸は以下の配列Ile-Ser-Ser-Gln-Tyr（配列番号３７）中のSerであ
り、これはAlaに置換される。あるいは置換されるアミノ酸は連続した配列Tyr-Va
l-Leu-Asp-Gly（配列番号３８）中のLeuであり、これはLysに置換される。他の実
施形態において、前記の１つ以上の置換が該EPSPSアミノ酸配列に導入されてもよ
い。
【００５０】 上記に代えて、かつ／または上記に加えて、変異は図１B（配列番号２）に示さ
れているEPSPSタンパク質において256番目、284~288番目および353~356番目に対
応する位置にあるいかなるアミノ酸の置換をもたらすものであってもよい。
【００５１】 本発明における特定の実施形態において、EPSPS遺伝子は177番目のアミノ酸位
におけるGlyをAlaに置換された変異を有する。別の特定の実施形態は、178番目の
アミノ酸位におけるThrからIleへの置換である。さらに他の特定の実施形態は、
177番目のアミノ酸位においてGlyをAlaへ置換する変異に加え、さらに178番目の
アミノ酸位におけるThrからIleへの置換を含む。本発明における他の特定の実施
形態として、178番目のアミノ酸位におけるThrをIleに置換する変異に加え、さら
に182番目のアミノ酸位においてProをSerへ置換する変異が示されている。他の
実施形態は、177番目のアミノ酸位におけるGlyからAlaへの置換に加え、さらに18
2番目のアミノ酸位においてProをSerへ置換する変異を含む。他の変異EPSPS配列
は、177番目のアミノ酸位におけるGlyからAlaへの置換に加え、178番目のアミノ
酸位においてThrからIleへの置換、加えて182番目のアミノ酸位においてProをSe
rへ置換するさらなる変異を含む。別の実施形態は、178番目のアミノ酸位におけ
るThrからValへの置換および182番目のアミノ酸位においてProをSerへ置換する
さらなる変異である。さらなる特定の実施形態は、178番目の位置におけるThrか
らLeuへの置換に加え、182番目のアミノ酸位においてProをSerへ置換する変異を
含む。さらなる実施形態は、177番目のアミノ酸位におけるGlyからAlaへの置換に
加え、178番目の位置におけるThrからValへの置換を含む。本発明はまた177番目の
アミノ酸位におけるGlyからAlaへの置換に加え、178番目のアミノ酸位におけるTh
rからLeuへの置換も包含する（図２参照）。
【００５２】 EPSPS遺伝子における前記の変異は、シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana
）EPSPS遺伝子（配列番号１）およびそのタンパク質（配列番号２）を用いて記
載している。本発明はまた他の種（パラログ）の突然変異型EPSPS遺伝子も包含
する。しかしながら、異なる種のEPSPS遺伝子の多様性により、ある種における置
換されるアミノ酸残基の数が別の種においては異なることがある。しかしながら
、当業者によって、配列相同性によって相同な位置が容易に同定される。例えば
、図３Ａ-Ｃにはヌクレオチド配列のアライメントを示し、図４にはシロイヌナズ
ナ、トウモロコシ（Zea mays）、ペチュニア（Petunia hybrida）およびアブラ
ナ（Brassica napus）の４つのパラログのEPSPS遺伝子からのアミノ酸配列のア
ライメントが示されている。従って、トウモロコシにおける相同な位置は、Leu97 、Gly101、Thr102、Ala103、Met104、Arg105、Pro106、Ser23、Ser179およびLeu 122 である。従って、トウモロコシEPSPSアミノ酸配列は、下記のアミノ酸位置：
のうちの1つ以上の変異を有し、該変異により１つ以上の下記の置換がもたらさ
れる： （i）Leu97-Phe （ii）Gly101-AlaあるいはIle （iii）Thr102-IleあるいはValあるいはLeu （iv）Ala103-Gly （v）Met104-Cys （vi）Arg105-LeuあるいはSer （vii）Pro106-LeuあるいはSer （viii）Ser23-Asp （ix）Ser179-Ala （x）Leu122-Lys。
【００５３】 本発明における別の実施形態において、トウモロコシEPSPS遺伝子産物において
置換されるアミノ酸残基は、連続した配列Leu- Phe -Leu-Gly-Asn（配列番号３
９）中のLeuであり、これがPheに置換される。あるいは置換されるアミノ酸残基
は、連続した配列Asn-Ala-Gly-Thr-Ala（配列番号３０）中のGlyであり、これが
AlaまたはIleに置換される。あるいは置換されるアミノ酸は連続した配列Ala-Gly
-Thr-Ala-Met（配列番号３１）中のThrであり、これがIle、ValまたはLeuに置換
される。あるいは置換されるアミノ酸は連続した配列Gly-Thr-Ala-Met-Arg（配
列番号３２）中のAlaであり、これがGlyに置換される。あるいは置換されるアミ
ノ酸は連続した配列Thr-Ala-Met-Arg-Pro（配列番号３３）中のMetであり、これ
がCysに置換される。あるいは置換されるアミノ酸は連続した配列Ala-Met-Arg-Pr
o-Leu（配列番号３４）中のArgであり、これがLeuまたはSerに置換される。ある
いは置換されるアミノ酸は以下の配列Met-Arg-Pro-Leu-Thr（配列番号３５）中
のProであり、LeuまたはSerに置換される。あるいは置換されるアミノ酸は連続し
たPro-Gly-Ser-Lys-Ser（配列番号３６）中のSerであり、これがAspに置換され
る。あるいは置換されるアミノ酸は連続した配列Ile-Ser-Ser-Gln-Tyr（配列番
号３７）中のSerであり、これがAlaに置換される。あるいは置換されるアミノ酸
は連続した配列Tyr-Val-Leu-Asp-Gly（配列番号３８）中のLeuであり、これがLy
sに置換される。他の実施形態において、１つ以上の前記の置換が該EPSPSアミノ酸
配列に導入されても良い。
【００５４】 アブラナにおいて、相同なアミノ酸位置は、Leu169、Gly173、Thr174、Ala175 、Met176、Arg177、Pro178、Ser94、Ser251およびLeu194である。従って、アブラ
ナEPSPSアミノ酸配列は、下記のアミノ酸位置において1つ以上の変異を有し、該
変異により１つ以上の下記の置換がもたらされる： （i）Leu169-Phe （ii）Gly173-AlaまたはIle （iii）Thr174-IleまたはValまたはLeu （iv）Ala175-Gly （v）Met176-Cys （vi）Arg177-LeuまたはSer （vii）Pro178-LeuまたはSer （viii）Ser94-Asp （ix）Ser251-Ala （x）Leu194-Lys。
【００５５】 本発明における別の実施形態において、アブラナ EPSPS遺伝子産物において置
換されるアミノ酸残基は、連続した配列Leu- Tyr -Leu-Gly-Asn（配列番号２９
）中のLeuであり、これがPheに置換される。あるいは置換されるアミノ酸残基は
、連続した配列Asn-Ala-Gly-Thr-Ala（配列番号３０）中のGlyであり、これがAl
aまたはIleに置換される。あるいは置換されるアミノ酸は連続した配列Ala-Gly-T
hr-Ala-Met（配列番号３１）中のThrであり、これがIle、ValまたはLeuに置換さ
れる。あるいは置換されるアミノ酸は連続した配列Gly-Thr-Ala-Met-Arg（配列
番号３２）中のAlaであり、これがGlyに置換される。あるいは置換されるアミノ
酸は連続した配列Thr-Ala-Met-Arg-Pro（配列番号３３）中のMetであり、これが
Cysに置換される。あるいは置換されるアミノ酸は連続した配列Ala-Met-Arg-Pro-
Leu（配列番号３４）中のArgであり、これがLeuまたはSerに置換される。あるい
は置換されるアミノ酸は連続した配列Met-Arg-Pro-Leu-Thr（配列番号３５）中
のProであり、これがLeuあるいはSerに置換される。あるいは置換されるアミノ酸
は連続したPro-Gly-Ser-Lys-Ser（配列番号３６）中のSerであり、これがAspに
置換される。あるいは置換されるアミノ酸は連続した配列Ile-Ser-Ser-Gln-Tyr
（配列番号３７）中のSerであり、これがAlaに置換される。あるいは置換される
アミノ酸は連続した配列Tyr-Val-Leu-Asp-Gly（配列番号３８）中のLeuであり、
これがLysに置換される。他の実施形態において、１つ以上の前記の置換が該EPSPS
アミノ酸配列に導入されても良い。
【００５６】 ペチュニア（Petunia hybrida）において、相同な位置は、Leu169、Gly173、T
hr174、Ala175、Met176、Arg177、Pro178、Ser94、Ser251およびLeu194である。
従って、ペチュニア EPSPSアミノ酸配列は、下記のアミノ酸位置において1つ以上
の変異を有し、該変異により１つ以上の下記の置換がもたらされる： （i）Leu169-Phe （ii）Gly173-AlaまたはIle （iii）Thr174-IleまたはValまたはLeu （iv）Ala175-Gly （i）Met176-Cys （vi）Arg177-LeuまたはSer （vii）Pro178-LeuまたはSer （vii）Ser94-Asp （ix）Ser251-Ala （x）Leu194-Lys。
【００５７】 本発明における別の実施形態において、ペチュニアEPSPS遺伝子産物において置
換されるアミノ酸残基は、連続した配列Leu- Phe -Leu-Gly-Asn（配列番号３９
）中のLeuであり、これがPheに置換される。あるいは置換されるアミノ酸残基は
、連続した配列Asn-Ala-Gly-Thr-Ala（配列番号３０）中のGlyであり、これがAl
aまたはIleに置換される。あるいは置換されるアミノ酸は連続した配列Ala-Gly-T
hr-Ala-Met（配列番号３１）中のThrであり、これがIle、ValあるいはLeuに置換
される。あるいは置換されるアミノ酸は連続した配列Gly-Thr-Ala-Met-Arg（配
列番号３２）中のAlaであり、これがGlyに置換される。あるいは置換されるアミ
ノ酸は連続した配列Thr-Ala-Met-Arg-Pro（配列番号３３）中のMetであり、これ
がCysに置換される。あるいは置換されるアミノ酸は連続した配列Ala-Met-Arg-Pr
o-Leu（配列番号３４）中のArgであり、これがLeuまたはSerに置換される。ある
いは置換されるアミノ酸は連続した配列Met-Arg-Pro-Leu-Thr（配列番号３５）
中のProであり、これがLeuまたはSerに置換される。あるいは置換されるアミノ酸
は以下のPro-Gly-Ser-Lys-Ser（配列番号３６）中のSerであり、これがAspに置
換される。あるいは置換されるアミノ酸は連続した配列Ile-Ser-Ser-Gln-Tyr（
配列番号３７）中のSerであり、これがAlaに置換される。あるいは置換されるア
ミノ酸は連続した配列Tyr-Val-Leu-Asp-Gly（配列番号３８）中のLeuであり、こ
れがLysに置換される。他の実施形態において、１あるいはそれ以上の前記の置換
がこのEPSPSアミノ酸配列に導入されても良い。
【００５８】５．３ 植物細胞への組換え原性オリゴ核酸塩基の送達 組換え原性オリゴ核酸塩基により植物細胞を形質転換するためには、本発明に
おける方法において一般的に知られているいかなる方法をも用いることができる
。方法の実例は以下に挙げる。
【００５９】５．３．１ マイクロキャリアーおよびマイクロファイバー セルロース細胞壁を持つ植物細胞内に発射貫通によって大きなDNA断片を導入
するために、金属製のマイクロキャリアー（微小球）を用いることは、これに関
連した技術（以下、バイオリスティック送達と言う）に精通する者にとって自明
である。米国特許第４,９４５,０５０号、第５,１００,７９２号および第５,２０
４,２５３号に、マイクロキャリアーを選択する一般的な技術や、それらを発射
する装置について記載されている。
【００６０】 本発明の方法においてマイクロキャリアーを用いるための特定の条件は、国際
公開公報WO９９／０７８６５号に記載されている。ある実例となる技術として、
氷冷したマイクロキャリアー（60mg/ml）、混合二本鎖オリゴヌクレオチド（60m
g/ml）、2.5M CaCl2および0.1Mスペルミジンをこの順序で加え、この混合物を例
えばボルテックスで10分間穏やかに撹拌し、室温で10分間放置した上でマイクロ
キャリアーを5倍量のエタノールで希釈し、遠心分離して100%エタノールに再懸
濁する。濃度が8〜10μg/μlのマイクロキャリアー、14〜17μg/mlの混合二本鎖
オリゴヌクレオチド、1.1〜1.4 MのCaCl2および18〜22mMのスペルミジンの粘ち
ょう溶液を用いて良い結果が得られる。最良の結果は、8μg/μlのマイクロキャ
リアー、16.5μg/mlの混合二本鎖オリゴヌクレオチド、1.3MのCaCl2、21mMのス
ペルミジンの条件下で認められた。
【００６１】 本発明の実施により、組換え原性オリゴ核酸塩基はまた、細胞壁および細胞膜
を貫通させるためにマイクロファイバーを用いて植物細胞内に導入することがで
きる。Coffeeらの米国特許第５,３０２,５２３号には、Black Mexican Sweetトウ
モロコシ懸濁培養物の形質転換促進のために30×0.5μmおよび10×0.3μmのシリ
コンカーバイドファイバーを用いることが記載されている。トランスミューテー
ションのために組換え原性オリゴ核酸塩基を導入するためには、植物細胞を形質
転換するためにマイクロファイバーを用いてDNAを導入することが出来るいかな
る機械的な技術も用いることが可能である。
【００６２】 マイクロファイバーによる組換え原性オリゴ核酸塩基の送達の技術として例示
できるものは以下のとおりである。滅菌したマイクロファイバー（2μg）を約10
μgの混合二本鎖オリゴヌクレオチドを含む150μlの植物培養液に懸濁する。懸濁
培養物を静置しておき、等量の濃縮細胞および滅菌したファイバー／ヌクレオチ
ドの懸濁液を10分間ボルテックスにかけてからプレートに広げる。特定の性質に
応じて適宜、選択培地を、直ちにまたは最大約１２０時間遅らせて適用する。
【００６３】５．３．２ プロトプラストエレクトロポレーション 別の実施形態において、植物の一部分由来のプロトプラストのエレクトロポレ
ーションによって、組換え原性オリゴ核酸塩基を植物細胞に導入することが出来
る。プロトプラストは、当業者にとって自明である技術に従って、植物の一部分
、特に葉に酵素的処理を行うことで形成される。例えば、Galloisら、1996, Meth
ods in Molecular Biology 55:89-107, Humana Press, Totowa, NJ、 Kippら, 1
999, Methods in Molecular Biology 133:213-221, Humana Press, Totowa, NJ
を参照。プロトプラストは、エレクトロポレーションを行う前に育成培地中で培
養する必要はない。エレクトロポレーションの条件として例示できるものは、0.6
〜4μg/mlの濃度の組換え原性オリゴ核酸塩基を含む総量0.3mlに3×105のプロト
プラストを含むものである。
【００６４】５．３．３ ウィスカーおよびマイクロインジェクション さらに別のそれに代わる実施形態において、植物細胞へのウィスカーまたはマ
イクロインジェクションによって、組換え原性オリゴ核酸塩基を植物細胞に送達
することが出来る。いわゆるウィスカー技術は基本的に、Frameら, 1994, Plant
J. 6:941-948の記載に従って実施する。組換え原性オリゴ核酸塩基をウィスカー
に付着させ、植物細胞を形質転換するのに用いる。組換え原性オリゴ核酸塩基を
、植物細胞内でリコンビナーゼを形成することが出来るタンパク質をコードする
配列を含むプラスミドと共にインキュベートしてもよい。そうすることで、オリ
ゴヌクレオチドとEPSPS遺伝子内の標的配列との間の組換え反応が触媒される。
【００６５】５．４ グリホサート耐性植物の選択 当技術分野において一般的に知られた方法を用いて、植物または植物細胞のあ
る除草剤に対する耐性または抵抗性を試験することができる。例えば、植物ある
いは植物細胞を除草剤存在下で生育させて生育速度を測定し、除草剤非存在下に
おける生育速度と比較する。
【００６６】６．実施例 以下の実験は、除草剤グリホサートに耐性であり、植物細胞の増殖速度を維持
させる変異型のシロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）EPSPS遺伝子の作製を
説明するものである。
【００６７】６．１ 材料および方法 ６．１．１ シロイヌナズナEPSPS cDNAの単離 プライマーAtEXPEXPM1およびAtEXPEXP2CM-2を用い、シロイヌナズナcDNA ライ
ブラリーからPCRによって1.3kbのDNA断片を増幅した。この2つのプライマーは、
成熟ペプチドから終止コドンまでのcDNAを増幅するように設計されている。5’プ
ライマーのAtEXPEXPM1はXbaI認識部位（下線部）を含み、3’プライマーのAtEXPE
XP2CM-2はBglII認識部位（下線部）を含み、これらの認識部位は発現ベクターに
この断片をクローニングするために用いられる。 AtEXPEXPM1 5’-GCTCTAGAGAAAGCGTCGGAGATTGTACTT-3’（配列番号４０） AtEXPEXP2CM-2 5’-GCAGATCTGAGCTCTTAGTGCTTTGTGATTCTTTCAAGTAC-3’（配列番号４１）
【００６８】 PCRバンドをアガロースゲルから回収して精製した（GeneClean, Biol社製）。
次に、この配列がシロイヌナズナEPSPS遺伝子の成熟ペプチド配列であることを確
認した。
【００６９】６．１．２ 発現ベクターの調製 以下のプライマー： BsAroE5’Xba 5’-GCGTCTAGAAAAACGAGATAAGGTGCAG-3’（配列番号４２） および BsAroE3’BamHI 5’-GCGGATCCTCAGGATTTTTTCGAAAGCTTATTTAAATG-3’（配列番号４３） を用いたPCRにより、AroE 枯草菌（Bacillus subtilis）遺伝子のEPSPSコード領
域を得た。
【００７０】 開始コドン（ATG）を持たないPCR 断片を、pACLacIMH6RecAベクターのフレー
ム内に、XbaIおよびBamHIで切断してRecAのORFと入れ換えることによりクローニ
ングした。pACLacIMH6RecA には、1440〜3176の部位にPet21のLacI領域、3809〜
5188の部位にMH6 RecA、5445〜218（5446〜5885および1〜218）の部位に存在す
るクロラムフェニコール耐性遺伝子および581〜1424の部位にp15A複製起点が含
まれている。RecA遺伝子のコード領域は、開始コドンおよびpUC19のLacZプロモー
ター下流にある6ヒスチジンリンカー（MH6）をフレーム内に有するように大腸菌
からクローニングした。
【００７１】６．１．３ シロイヌナズナEPSPS遺伝子の細菌発現ベクターへのクローニング シロイヌナズナの1.3kbPCR断片をXbaIおよびBamHI（BglIIで代用可能）で切断
し、枯草菌遺伝子の代わりにプラスミドpACYCLacIMH6EPSPSにクローニングした。
【００７２】 次に、（クロラムフェニコールで選択して）得られたクローンの配列を調べ、
陽性であることを確認した。確認したクローンの１つ（pAtEPS-12）を選択し、さ
らにこのcDNAとクローニングプラスミド間の結合部が、予想した配列と同じであ
ることを確認した。
【００７３】６．１．４ EPSPS遺伝子における新規の点変異 シロイヌナズナEPSPS遺伝子の異なる１０の変異型を設計した（図２参照）。変
異誘発実験のため、PCRプライマーに１、２あるいは３つの変異が含まれるよう
に設計した。PCR反応は、通常の近傍のプライマー（5’ATEPS-198: 5’-GAAAGCGT
CGGAGATTGTAC-3’（配列番号４４））および変異を持つプライマー（図５参照）
の１つを用いて行った。
【００７４】 得られた353bpのPCR断片を精製し（Qiagen PCR Purification kit）、それら
の配列を確認した。次に、それらの断片をPstI（プライマー配列中の下線部）お
よびBamHIで切断し、あらかじめPstIおよびBamHIで切断したpAtEPS-12ベクターに
つないだ。形質転換にはJM109（Promega社製）コンピテントセルを用い、クロラム
フェニコールを含むLB培地上で平板培養した。次に、各々の変異誘発実験で得られ
たクローンを単離し、それらの配列を確認した。
【００７５】６．１．５ グリホサート耐性アッセイ LacZ ネズミチフス菌（Salmonella typhi）株であるSA4247のエレクトロコン
ピテント細胞を通常の手順（Current Protocols in Molecular Biology（Wiley
and Sons, Inc.）参照）に従って調製した。シロイヌナズナの野性型および変異
型のEPSPSタンパク質、枯草菌の野生型EPSPSをコードする各々のプラスミドDNA
20ngを用い、対照としては擬似のトランスフェクションを用い、30μlのSA4247
コンピテント細胞をエレクトロポレーションにかけた。エレクトロポレーション
の設定は、25μF、2.5KVおよび200オームであった。エレクトロポレーションの後
、細胞を15ml培養管に移し、970μlのSOC培地を加えた。この培養物を1.5時間、37℃
、225rpmでインキュベートした。50μlの各培養物を17μg/mlのクロラムフェニコ
ールを含む LBプレート上に平板培養し（二連で行った）、37℃で一晩インキュ
ベートした。翌日、各々の培地から5つのコロニーを拾い、M9プレートに移して37℃
で一晩インキュベートした。
【００７６】 M9固形培地上で一晩インキュベートしたコロニーを4mlのM9液体培地に接種し、
37℃で一晩増殖させた。翌日、クロラムフェニコール、IPTGおよび17mMまたは0mM
グリホサート（Aldrich社製, 33775-7）を含む25mlのM9液体培地に各々の一晩培
養物1〜2 mlを接種し（二連で行った）、初期OD値（600nmにおける）を測定して
全ての培養物が同じOD値で開始するように標準化した。OD値の測定は、1時間毎に
7時間行った。細菌増殖の対照として、ネズミチフス菌の非形質転換体の培養物も
また通常のLB培地中に接種した。２つの独立した実験において、A177I178、A177V 178 、A177L178およびI177のクローンはM9培地で増殖せず、ゆえにこれらにおいて
はグリホサート耐性アッセイが実行されなかった可能性があった。
【００７７】６．１．７ 細菌クローンからの発現タンパク質の単離および精製 各々の細菌クローンの一晩培養物１ミリリットルを、クロラムフェニコールを
含む100mlのLB液体培地中に接種する。細胞をOD値が0.5〜0.7に達するまで（およ
そ3.5時間）37℃で増殖させた。次に、培養物に濃度が1.0mMとなるように IPTG
を加えた。細胞をさらに５時間増殖させた。 次に、それらを4000rpmで20分間4℃で
沈殿させた。
【００７８】 ヒスチジンで標識されたタンパク質の単離および精製は、Qiagen Ni-NTA Prot
ein Purification Systemに従って行った。細胞溶解物および溶出物を二連で12.5
％アクリルアミドゲル上で泳動した。ゲルの１つは直ちに可視化するために銀染
色を行い、２枚目のゲルはMillipore Immobilon-Pメンブレンに転写し、TBS-T中5
％のミルク中で一晩ブロッキングを行った。次に、このメンブレンを抗ヒスチジ
ン一次抗体溶液（Amersham Pharmacia biotech社、カタログ番号37-4710）にさ
らした後、抗マウスIgG二次抗体溶液（NIF825, Amersham Pharmacia biotech ECL
ウェスタンブロッティング解析システム、カタログ番号RPN2108）にさらした。
洗浄および検出反応は製造元の説明に従って行った。放射線写真は5分間感光した
後に現像した。
【００７９】６．２ 結果 EPSPS遺伝子内の変異を有する細胞は、除草剤グリホサートに耐性であり、野生
型細胞と比較して、グリホサートの存在に関わりなくグリホサート非存在下ある
いは存在下において、実質的に同じ増殖速度を有する細胞を作成した（図６参照
）。
【００８０】 また、変異型のEPSPS遺伝子を含むシロイヌナズナクローンが、野生型のタン
パク質と実質的に同水準で、変異型のタンパク質を発現していることも証明され
た（図７）。
【００８１】 本明細書中で特許請求し、記載した本発明は、特定の実施形態の範囲に制限さ
れることはなく、限定されるものではないが寄託された微生物の実施形態を包含
するものであり、これらの実施形態が本発明の各々の態様の実例となるように本
明細書中に記載した。実際に、本明細書中に明記および記載したものに加えて、本
発明の様々な改良が前記の記述から当業者によって明らかになるであろう。この
様な改良もまた、本明細書中の特許請求の範囲に含まれるものとする。
【００８２】 いくつかの参照がここに引用され、それらの開示の全ては参照によりそれらの
全体を本明細書中に組み込まれるものとする。
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】 Ａは、イロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana)のＥＰＳＰＳ遺伝子のＤＮＡ配
列（配列番号１）である。太字の下線を付したヌクレオチド残基は標的残基であ
る。Ｂは、イロイヌナズナのＥＰＳＰＳタンパク質のアミノ酸配列（配列番号２
）である。太字の下線を付したアミノ酸残基は標的残基である。
【図２】 イロイヌナズナの野生型と突然変異型のＥＰＳＰＳのアミノ酸位置１７３〜１
８３の領域におけるヌクレオチド配列とアミノ酸配列のリストである。野生型ヌ
クレオチド配列（配列番号１）と野生型アミノ酸配列（配列番号２）、突然変異
Ａ177のヌクレオチド配列（配列番号３）とアミノ酸配列（配列番号４）、突然
変異Ｉ178のヌクレオチド配列（配列番号５）とアミノ酸配列（配列番号６）、
突然変異Ａ177Ｉ178のヌクレオチド配列（配列番号７）とアミノ酸配列（配列番
号８）、突然変異Ｉ178Ｓ182のヌクレオチド配列（配列番号９）とアミノ酸配列
（配列番号１０）、突然変異Ａ177Ｓ182のヌクレオチド配列（配列番号１１）と
アミノ酸配列（配列番号１２）、突然変異Ａ177Ｉ178Ｓ182のヌクレオチド配列
（配列番号１３）とアミノ酸配列（配列番号１４）、突然変異Ｖ177Ｓ182のヌク
レオチド配列（配列番号１５）とアミノ酸配列（配列番号１６）、突然変異Ｌ17 8 Ｓ182のヌクレオチド配列（配列番号１７）とアミノ酸配列（配列番号１８）、
突然変異Ａ177Ｖ178のヌクレオチド配列（配列番号１９）とアミノ酸配列（配列
番号２０）、突然変異Ａ177Ｌ182のヌクレオチド配列（配列番号２１）とアミノ
酸配列（配列番号２２）。
【図３】 イロイヌナズナのＥＰＳＰＳ遺伝子のＤＮＡ（配列番号１）を、アブラナ（配
列番号２３）、ペチュニア（配列番号２４）、およびトウモロコシのＥＰＳＰＳ
遺伝子のヌクレオチド配列（配列番号２５）と並べたものである。DNAStar (Las
erGene)によって実施した。配列は、J. Hein法により重み付き残基重量表を用い
て並べてある。
【図４】 イロイヌナズナのＥＰＳＰＳアミノ酸配列（配列番号２）を、アブラナ（配列
番号２６）、ペチュニア（配列番号２７）、およびトウモロコシのＥＰＳＰＳア
ミノ酸配列（配列番号２８）と並べたものである。配列は、J. Hein法により重
み付き残基重量表を用いて並べてある。
【図５】 使用した突然変異誘発プライマーのリストであり、標的コドンを太字で示した
。突然変異プライマーＡ177（配列番号２９）、突然変異プライマーＩ178（配列
番号３０）、突然変異プライマーＡ177Ｉ178（配列番号３１）、突然変異プライ
マーＩ178Ｓ182（配列番号３２）、突然変異プライマーＡ177Ｓ182（配列番号３
４）、突然変異プライマーＡ177Ｉ178Ｓ182（配列番号３５）、突然変異プライ
マーＶ177Ｓ182（配列番号３５）、突然変異プライマーＬ178Ｓ182（配列番号３
６）、突然変異プライマーＡ177Ｖ178（配列番号３７）、突然変異プライマーＡ 177 Ｌ182（配列番号３８）。
【図６】 １７ｍＭのグリホサートの存在下（＋）および不在下（−）においてシロイヌ
ナズナクローンの６００ｎｍの光学密度で測定した成長の図である。
【図７】 上のパネルは、細胞溶解産物（Ｌ）および溶出物（Ｅ）から単離されたＨｉｓ
で標識されたバシルス、シロイヌナズナ野生型（ＷＴ）および突然変異（ＡＳ）
ＥＰＳＰＳタンパク質の発現を示すウェスタンブロットである。ネガティブコン
トロールとしての形質転換してないネズミチフス菌はＥＰＳＰＳ発現を示さない
。下のパネルは銀染色した二重ゲルである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ， ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ， ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＢＺ，Ｃ Ａ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ， ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，Ｋ Ｅ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ， ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，Ｒ Ｕ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ， ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 ウォーカー，ケイト，エイ． アメリカ合衆国 92130 カリフォルニア 州 サン ディエゴ，ロキシトン サーク ル 13315 (72)発明者 メッツ，リチャード，エイ． アメリカ合衆国 08648 ニュージャージ ー州 ローレンスヴィレ，ウィンスロップ ロード 37 Ｆターム(参考） 2B030 AD05 CA11 CA15 CA17 CA19 4B024 AA07 AA08 BA07 CA04 CA07 DA01 DA05 EA01 EA04 GA11 GA25 HA03 HA20 4B050 CC03 CC04 DD02 FF14 LL10

Claims (24)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 突然変異型EPSPS遺伝子産物を発現し、野生型EPSPS遺伝子産
    物を発現する植物と比較して実質的に正常な成長を示す、非トランスジェニック
    除草剤耐性植物。
  2. 【請求項２】 突然変異型EPSPS遺伝子産物を発現し、該遺伝子産物が野生
    型EPSPS遺伝子産物と比較して実質的に同レベルの触媒活性を有する、非トラン
    スジェニック除草剤耐性植物。
  3. 【請求項３】 除草剤が、ホスホノメチルグリシンファミリーのメンバーで
    ある、請求項１または２に記載の植物。
  4. 【請求項４】 ホスホノメチルグリシンファミリーのメンバーがグリホサー
    トである、請求項３記載の植物。
  5. 【請求項５】 EPSPS遺伝子が、シロイヌナズナのLeu173、Gly177、Thr178
    、Alal79、Metl80、Arg181、Pro182、Ser98、Ser255およびLeul98からなる群よ
    り選択される１つ以上のアミノ酸位またはEPSPSパラログ内の相同なアミノ酸残
    基に突然変異を有している、請求項１または２に記載の植物。
  6. 【請求項６】 トウモロコシのパラログにおける上記アミノ酸位が、Leu97
    、Gly101、Thr102、Ala103、Met104、Arg105、Pro106、Ser23、Ser179およびLeu 122 からなる群より選択されたものである、請求項５記載の植物。
  7. 【請求項７】 アブラナのパラログにおける上記アミノ酸位が、Leu169、Gl
    y173、Thr174、Ala175、Met176、Arg177、Pro178、Ser94、Ser251およびLeu194
    からなる群より選択されたものである、請求項５記載の植物。
  8. 【請求項８】 ペチュニアのパラログにおける上記アミノ酸位が、Leu169、
    Gly173、Thr174、Ala175、Met176、Arg177、Pro178、Ser94、Ser251およびLeu19 4 からなる群より選択されたものである、請求項５記載の植物。
  9. 【請求項９】 トウモロコシ、コムギ、イネ、オオムギ、ダイズ、綿花、テ
    ンサイ、アブラナ、カノーラ、アマ、ヒマワリ、ジャガイモ、タバコ、トマト、
    アルファルファ、ポプラ、マツ、ユーカリ、リンゴ、レタス、エンドウマメ、レ
    ンズマメ、ブドウおよびシバからなる群より選択される、請求項１または２に記
    載の植物。
  10. 【請求項１０】 突然変異型遺伝子が、EPSPS酵素内に、野生型の配列と比
    較して、下記の： (i) Leu173-Phe、 (ii) Gly177-AlaまたはIle、 (iii) Thr178-IleまたはValまたはLeu、 (iv) Ala179-Gly、 (v) Met180-Cys、 (vi) Arg181-LeuまたはSer、 (vii) Pro182-LeuまたはSer、 (viii) Ser98-Asp、 (ix) Ser255-Ala、 (x) Leu198-Lys： の１つ以上のアミノ酸の置換をもたらす、請求項５記載の植物。
  11. 【請求項１１】 突然変異型遺伝子が、EPSPS酵素内に、野生型の配列と比
    較して、下記の： (i) Leu97-Phe、 (ii) Gly101-AlaまたはIle、 (iii) Thr102-IleまたはValまたはLeu、 (iv) Ala103-Gly、 (v) Met104-Cys、 (vi) Arg105-LeuまたはSer、 (vii) Pro106-LeuまたはSer、 (viii) Ser23-Asp、 (ix) Ser179-Ala、 (x) Leu122-Lys： の１つ以上のアミノ酸の置換をもたらす、請求項６記載の植物。
  12. 【請求項１２】 突然変異型遺伝子が、EPSPS酵素内に、野生型の配列と比
    較して、下記の： (i) Leu169-Phe、 (ii) Gly173-AlaまたはIle、 (iii) Thr174-IleまたはValまたはLeu、 (iv) Ala175-Gly、 (v) Met176-Cys、 (vi) Arg177-LeuまたはSer、 (vii) Pro178-LeuまたはSer、 (viii) Ser94-Asp、 (ix) Ser251-Ala、 (x) Leu194-Lys： の１つ以上のアミノ酸の置換をもたらす、請求項７記載の植物。
  13. 【請求項１３】 突然変異型遺伝子が、EPSPS酵素内に、野生型の配列と比
    較して、下記の： (i) Leu169-Phe、 (ii) Gly173-AlaまたはIle、 (iii) Thr174-IleまたはValまたはLeu、 (iv) Ala175-Gly、 (v) Met176-Cys、 (vi) Arg177-LeuまたはSer、 (vii) Pro178-LeuまたはSer、 (viii) Ser94-Asp、 (ix) Ser251-Ala、 (x) Leu194-Lys： の１つ以上のアミノ酸の置換をもたらす、請求項８記載の植物。
  14. 【請求項１４】 非トランスジェニック除草剤耐性または抵抗性植物を作製
    する方法であって、 a. 組換え原性オリゴ核酸塩基を植物細胞に導入して、突然変異型EPSPS遺伝子
    を作製すること；および b. 突然変異EPSPS遺伝子を有し、かつ対応する野生型植物細胞と比較して実質
    的に正常な成長を示す細胞を特定すること； を含む、上記方法。
  15. 【請求項１５】 非トランスジェニック除草剤耐性または抵抗性植物を作製
    する方法であって、 a. 組換え原性オリゴ核酸塩基を植物細胞に導入して、突然変異型EPSPS遺伝子
    を作製すること；および b. 突然変異型EPSPS遺伝子を有し、該遺伝子にコードされる突然変異型EPSPS
    タンパク質は対応する野生型EPSPSタンパク質と比較して実質的に同じ触媒活性
    を有する細胞を特定すること； を含む、上記方法。
  16. 【請求項１６】 組換え原性オリゴ核酸塩基が混合二本鎖ヌクレオチドまた
    はSSMOVである、請求項14または15記載の方法。
  17. 【請求項１７】 混合二本鎖ヌクレオチドが第１相同領域、第２相同領域、
    および介在領域を含み、該第１領域が標的EPSPS遺伝子の第１フラグメントの少
    なくとも６塩基対からなる配列に同一の配列を有しており、第第２領域は標的EP
    SPS遺伝子の第２フラグメントの少なくとも６塩基対からなる配列に同一の配列
    を有しており、上記介在配列はEPSPS遺伝子とは異種の少なくとも１核酸塩基を
    含み、第１相同領域と第２相同領域とを連結するものである、請求項１６記載の
    方法。
  18. 【請求項１８】 組換え原性オリゴ核酸塩基をエレクトロポレーションによ
    り導入する、請求項１４または１５記載の方法。
  19. 【請求項１９】 突然変異型EPSPS遺伝子が、シロイヌナズナのLeu173、Gly 177 、Thr178、Ala179、Met180、Arg181、Pro182、Ser98、Ser255およびLeu198か
    らなる群より選択される１つ以上のアミノ酸位、またはEPSPSパラログ内の相同
    なアミノ酸残基に突然変異を有する、請求項１４または１５記載の方法。
  20. 【請求項２０】 トウモロコシのパラログにおける上記アミノ酸位が、Leu9 7 、Gly101、Thr102、Ala103、Met104、Arg105、Pro106、Ser23、Ser179およびLe
    u122からなる群より選択されたものである、請求項１９記載の植物。
  21. 【請求項２１】 アブラナのパラログにおける上記アミノ酸位が、Leu169、
    Gly173、Thr174、Ala175、Met176、Arg177、Pro178、Ser94、Ser251およびLeu19 4 からなる群より選択される、請求項１９記載の植物。
  22. 【請求項２２】 ペチュニアのパラログにおける上記アミノ酸位が、Leu169 、Gly173、Thr174、Ala175、Met176、Arg177、Pro178、Ser94、Ser251およびLeu 194 からなる群より選択される、請求項１９記載の植物。
  23. 【請求項２３】 トウモロコシ、コムギ、イネ、オオムギ、ダイズ、綿花、
    テンサイ、アブラナ、カノーラ、アマ、ヒマワリ、ジャガイモ、タバコ、トマト
    、アルファルファ、ポプラ、マツ、ユーカリ、リンゴ、レタス、エンドウマメ、
    レンズマメ、ブドウ、シバおよびアブラナ種からなる群より選択される、請求項
    １４または１５に記載の植物。
  24. 【請求項２４】 配列番号２に示す配列においてアミノ酸位Leu173がPheで
    、Gly177がAlaまたはIleで、Thr178がIleまたはValまたはLeuで、Ala179がGlyで
    、Met180がCysで、Arg181がLeuまたはSerで、Pro182がLeuまたはSerで、Ser98が
    Aspで、Ser255がAlaで、またはLeu198がLysで置換されているアミノ酸配列を含
    んでおり、該突然変異型EPSPSタンパク質は、ホスホノメチルグリシンファミリ
    ーのメンバーである除草剤に対する耐性または抵抗性が増大している、単離され
    た突然変異型EPSPSタンパク質。
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