ES2337762T5 - Plantas no transgénicas resistentes a herbicidas - Google Patents
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- Peptides Or Proteins (AREA)
Description
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DESCRIPCION
Plantas no transgenicas resistentes a herbicidas
1. Campo de la invencion
La presente invencion se refiere a la produccion de una planta no transgenica resistente o tolerante a un herbicida de la familia de la fosfonometilglicina, p. ej., el glifosato. La presente invencion tambien se refiere al uso de una oligonucleobase recombinagenica para generar una mutacion deseada en las secuencias cromosomicas o episomicas de una planta en el gen que codifica la 5-enolpiruvilshikimato-3-fosfato sintasa (EPSPS). La protelna mutada, que mantiene sustancialmente la actividad catalltica de la protelna natural, permite una mayor resistencia o tolerancia de la planta a un herbicida de la familia de la fosfonometilglicina y permite el crecimiento o desarrollo sustancialmente normales de la planta, sus organos, tejidos o celulas en comparacion con la planta natural independientemente de la presencia o ausencia del herbicida. La presente invencion tambien se refiere a una celula vegetal no transgenica en la cual se ha mutado el gen EPSPS, una planta no transgenica regenerada a partir de esta, as! como tambien una planta que resulte de un cruce que utiliza una planta no transgenica regenerada que tiene un gen EPSPS mutado.
2. Antecedentes de la invencion
2.1 Herbicidas de tipo fosfonometilglicina
Las plantas tolerantes herbicidas podran reducir la necesidad de labranza para controlar las malezas y de esta manera reducir eficazmente la erosion del suelo. Un herbicida que es el objeto de grandes esfuerzos de investigacion en este aspecto es la N-fosfonometilglicina, denominada comunmente glifosato. El glifosato inhibe la ruta del acido shiklmico que conduce a la bioslntesis de compuestos aromaticos incluidos aminoacidos, hormonas y vitaminas. Especlficamente, el glifosato frena la conversion de acido fosfoenolpiruvico (PEP) y acido 3- fosfoshiklmico en acido 5-enolpiruvil-3-fosfoshiklmico inhibiendo la enzima 5-enolpiruvilshikimato-3-fosfato sintasa (denominada posteriormente en la presente EPSP sintasa o EPSPS). A efectos de la presente invencion, el termino “glifosato” incluye cualquier forma eficaz como herbicida de la N-fosfonometilglicina (incluida cualquiera de sus sales), otras formas que resulten en la produccion del anion glifosato en plantas y cualesquiera otros herbicidas de la familia de la fosfonometilglicina.
La tolerancia de las plantas al glifosato se puede aumentar introduciendo en el genoma de la planta un gen EPSPS mutante que tiene una alteracion en la secuencia que codifica los aminoacidos de EPSPS. En las siguientes patentes se describen ejemplos de algunas mutaciones en el gen EPSPS para inducir la tolerancia al glifosato: patente de EE. UU. N.° 5 310 667; patente de EE. UU. N.° 5 866 775; patente de EE. UU. N.° 5 312 910; patente de EE. UU. N.° 5 145 783. Estas mutaciones propuestas tienen normalmente una K mayor para el glifosato que la enzima EPSPS natural lo que confiere el fenotipo tolerante al glifosato, pero estas variantes tambien estan caracterizadas por una Km elevada para PEP lo que hace que la enzima sea menos eficiente cineticamente (Kishore et al., 1988, Ann. Rev. Biochem. 57:627-663; Schulz et al., 1984, Arch. Microbiol. 137: 121-123; Sost et al., 1984, FEBS Lett. 173: 238-241; Kishore et al., 1986, Fed. Proc. 45: 1506; Sost y Amrhein, 1990, Arch. Biochem. Biophys. 282: 433-436). Muchas mutaciones del gen EPSPS se escogen de modo que produzcan una enzima EPSPS que sea resistente a herbicidas, pero desafortunadamente, la enzima EPSPS producida por el gen EPSPS mutado tiene una actividad enzimatica significativamente menor que la EPSPS natural. Por ejemplo, la Km aparente para PEP y la Ki aparente para el glifosato de la EPSPS natural de E. coli son 10 pM y 0.5 pM, mientras que para un aislado tolerante al glifosato que tiene una sustitucion de un unico aminoacido de alanina por glicina en la posicion 96, estos valores son 220 pM y 4.0 mM, respectivamente. Varios genes EPSPS tolerantes al glifosato han sido construidos mediante mutagenesis. De nuevo, la EPSPS tolerante al glifosato tuvo una eficacia catalltica (Vmax/Km) mas baja, tal como lo muestra un incremento en la Km para PEP y una ligera reduccion de la Vmax de la enzima vegetal natural (Kishore et al., 1988, Ann. Rev. Biochem. 57:627-663).
Debido a que las constantes cineticas de las enzimas variantes estan alteradas respecto a PEP, se ha propuesto que se requerirlan niveles elevados de la sobreproduccion de la enzima variante, 40-80 veces, para mantener una actividad catalltica normal en plantas en presencia del glifosato (Kishore et al., 1988, Ann. Rev. Biochem. 57:627663). Se ha demostrado que pueden producirse plantas tolerantes al glifosato insertando en el genoma de la planta la capacidad para producir un nivel mas alto de EPSP sintasa en el cloroplasto de la celula (Shah et al., 1986, Science 233, 478-481), donde la enzima es preferentemente tolerante al glifosato (Kishore et al., 1988, Ann. Rev. Biochem. 57:627-663).
La introduccion de los genes EPSPS mutantes exogenos en una planta es un proceso muy documentado. Por ejemplo, de acuerdo con la patente de EE. UU. N.° 4 545 060, para incrementar la resistencia de una planta al glifosato, se introduce en el genoma de la planta un gen que codifica una variante de EPSPS que tiene al menos una mutacion que hace que la enzima sea mas resistente a su inhibidor competitivo, es decir, el glifosato. Sin embargo, muchas complicaciones y problemas estan asociados con estos ejemplos. Muchas mutaciones de este tipo conllevan una expresion baja del gen EPSPS mutado o conllevan un producto del gen EPSPS con una actividad enzimatica significativamente mas baja en comparacion con el producto natural. La expresion baja o la actividad enzimatica baja de la enzima mutada conllevan unos niveles anormalmente bajos de crecimiento y desarrollo de la planta.
Aunque este tipo de variantes de las EPSP sintasas han demostrado ser utiles para obtener plantas transgenicas tolerantes al glifosato, serla aun mas beneficioso obtener un gen de EPSPS variante que sea sumamente tolerante al glifosato pero mantenga su eficacia cinetica, de modo que se pueda obtener tal tolerancia mejorada con un nivel
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de expresion natural.
2.2 Oligonucleobases recombinagenicas
Las oligonucleobases recombinagenicas y su uso para llevar a cabo cambios geneticos en celulas eucariotas se describen en la patente de Estados Unidos N.° 5 565 350 de Kmiec (Kmiec I). Kmiec I describe un metodo para introducir alteraciones geneticas especlficas en un gen diana. Kmeic I divulga, entre otros, oligonucleobases recombinagenicas que tienen dos hebras, en las cuales una primera hebra contiene dos segmentos de al menos 8 nucleotidos de tipo ARN que estan separados por un tercer segmento de entre 4 y aproximadamente 50 nucleotidos de tipo ADN, denominado un “segmento de ADN interpuesto”. Los nucleotidos de la primera hebra tienen sus bases emparejadas con los nucleotidos de tipo ADN de la segunda hebra. Ademas, la primera y la segunda hebras estan unidas por un segmento de nucleotidos monocatenario de modo que la primera y la segunda hebras son parte de una unica cadena de oligonucleotidos. Kmiec I describe ademas un metodo para introducir alteraciones geneticas especlficas en un gen diana. De acuerdo con Kmiec I, las secuencias de los segmentos de ARN se seleccionan para que sean homologas, es decir, identicas, respecto a la secuencia de un primer y un segundo fragmento del gen diana. La secuencia del segmento de ADN interpuesto es homologa respecto a la secuencia del gen diana entre el primer y el segundo fragmento excepto por una region de diferencia, denominada la “region heterologa”. La region heterologa puede presentar una insercion o una delecion o puede contener una o mas bases que tengan un emparejamiento erroneo con la secuencia del gen diana de modo que se produzca una sustitucion. De acuerdo con Kmiec I, la secuencia del gen diana se altera segun lo dirija la region heterologa, de modo que el gen diana se vuelve homologo respecto a la secuencia de la oligonucleobase recombinagenica. Kmiec I describe especlficamente que los nucleotidos que contienen ribosa y 2'-0-metilribosa, es decir, la 2'-metoxirribosa, se pueden utilizar en las oligonucleobases recombinagenicas y que nucleotidos que contienen desoxirribosa presente de manera natural se pueden utilizar como nucleotidos de tipo ADN.
La patente de EE. UU. N.° 5 731 181 de Kmiec (Kmiec II) divulga especlficamente el uso de oligonucleobases recombinagenicas para llevar a cabo cambios geneticos en celulas vegetales y divulga ejemplos adicionales de analogos y derivados de nucleotidos de tipo ARN y de tipo ADN que se pueden utilizar para llevar a cabo cambios geneticos en genes diana especlficos. Otras patentes que estudian el uso de oligonucleobases recombinagenicas incluyen: las patentes de EE. UU. N.os 5 756 325; 5 871 984; 5 760 012; 5 888 983; 5 795 972; 5 780 296; 5 945 339; 6 004 804 y 6 010 907 y en la patente internacional N.° PCT/US00/23457; y en las publicaciones de patente internacional N.os WO 98/49350; WO 99/07865; WO 99/58723; WO 99/58702 y WO 99/40789. Las oligonucleobases recombinagenicas incluyen moleculas que contienen compuestos que no son nucleotidos, oligonucleotidos bicatenarios mixtos descritas en Kmiec II y otras moleculas descritas en las patentes y publicaciones de patentes mencionadas anteriormente.
La cita o identificacion de cualquier referencia de la Seccion 2, o cualquier seccion de esta solicitud, no debe interpretarse como una admision de que tal referencia esta disponible como parte de la tecnica anterior de la presente invencion.
3. Compendio de la invencion
La presente invencion se refiere a un metodo para producir una celula vegetal o planta no transgenicas que tienen una o mas mutaciones en el gen EPSPS, donde la planta tiene una mayor resistencia o tolerancia a un miembro de la familia de la fosfonometilglicina y donde la planta exhibe un crecimiento o desarrollo sustancialmente normales de la planta, sus organos, tejidos o celulas en comparacion con la celula o planta naturales correspondientes. La presente invencion tambien se refiere a un metodo para producir una planta no transgenica que tiene una mutacion en el gen EPSPS, donde la planta es resistente a un miembro de la familia de la fosfonometilglicina, p. ej., glifosato, o tiene una mayor tolerancia a este, donde la protelna EPSPS tiene sustancialmente la misma actividad catalltica en comparacion con la protelna EPSPS natural.
La presente invencion tambien se refiere a un metodo para producir una planta no transgenica que tiene un gen EPSPS mutado que mantiene sustancialmente la actividad catalltica de la protelna natural independientemente de la presencia o ausencia de un herbicida de la familia de la fosfonometilglicina. El metodo comprende introducir en una celula vegetal una oligonucleobase recombinagenica con una mutacion dirigida en el gen EPSPS e identificar una celula, semilla o planta que tiene un gen EPSPS mutado.
En las siguientes publicaciones de patente, las cuales incorporan a la presente por referencia en su totalidad, se pueden consultar ejemplos ilustrativos de una oligonucleobase recombinagenica: patente de EE. UU. N.os 5 565 350; 5 756 325; 5 871 984; 5 760 012; 5 731 181; 5 888 983; 5 795 972; 5 780 296; 5 945 339; 6 004 804 y 6 010 907 y en la patente internacional N.° PCT/US00/23457; y en las publicaciones de patente internacional N.os Wo 98/49350; WO 99/07865; WO 99/58723; WO 99/58702 y WO 99/40789.
La planta puede ser cualquier especie de planta dicotiledonea, monocotiledonea o gimnosperma, incluida cualquier especie de planta lenosa que crezca como un arbol o matorral, cualquier especie herbacea o cualquier especie que produzca verduras, semillas o frutos comestibles, o cualquier especie que produzca flores aromaticas o coloridas. Por ejemplo, la planta se podra seleccionar entre una especie de planta procedente del grupo constituido por canola, girasol, tabaco, remolacha azucarera, algodon, malz, trigo, cebada, arroz, sorgo, tomate, mango, melocoton, manzana, pera, fresa, platano, melon, patata, zanahoria, lechuga, cebolla, especies de soja, cana de azucar, guisante, habas comunes, alamo, uva, cltricos, alfalfa, centeno, avena, cesped y hierbas forrajeras, lino, colza oleaginosa, pepino, campanillas, balsamo, pimiento, berenjena, calendula, loto, repollo, margarita, clavel, tulipan, iris, azucena y plantas que producen frutos secos siempre que no se hayan mencionado de manera especlfica
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previamente.
La oligonucleobase recombinagenica se puede introducir en una celula vegetal utilizando cualquier metodo de uso comun en la tecnica incluidos, sin caracter limitante, microportadores (suministro biollstico), microfibras, electroporacion y microinyeccion.
Tambien se divulga un metodo para controlar de manera selectiva las malezas en un campo, comprendiendo el campo plantas con las alteraciones del gen EPSPS divulgadas y malezas, comprendiendo el metodo la aplicacion al campo de un herbicida al cual dichas plantas se han vuelto resistentes.
Tambien se divulgan mutaciones novedosas en el gen EPSPS que confieren resistencia o tolerancia a un miembro de la familia de la fosfonometilglicina, p. ej., glifosato, a una planta o donde la EPSPS mutada tiene sustancialmente la misma actividad enzimatica en comparacion con la EPSPS natural.
3.1 Definiciones
La invencion se debe entender de acuerdo con las siguientes definiciones.
Una oligonucleobase es un pollmero de nucleobases, donde el pollmero puede hibridarse mediante un emparejamiento de bases de Watson-Crick a un ADN que tiene la secuencia complementaria.
Las nucleobases comprenden una base, que es una purina, pirimidina o un derivado o un analogo de estas. Las nucleobases incluyen nucleobases peptldicas, las subunidades de acidos nucleicos peptldicos, y nucleobases morfollnicas as! como tambien nucleosidos y nucleotidos. Los nucleosidos son nucleobases que contienen un resto de tipo pentosafuranosilo, p. ej., un ribosido o 2'-desoxirribosido sustituidos opcionalmente. Los nucleosidos pueden estar unidos mediante uno de entre varios restos de union, que podra contener fosforo o no contenerlo. Los nucleosidos que estan unidos mediante enlaces de tipo fosfodiester no sustituidos se denominan nucleotidos.
Una cadena de oligonucleobases tiene un unico fragmento 5'-terminal y 3'-terminal, constituidos por las ultimas nucleobases del pollmero. Una cadena de oligonucleobases concreta puede contener nucleobases de todos los tipos. Un compuesto de tipo oligonucleobase es un compuesto que comprende una o mas cadenas de oligonucleobase que son complementarias y se hibridan mediante un emparejamiento de bases de Watson-Crick. Las nucleobases son de tipo desoxirribo o de tipo ribo. Las nucleobases de tipo ribo son pentosafuranosilos que contienen nucleobases donde el carbono 2' es un metileno sustituido con un hidroxilo, alquiloxi o halogeno. Las nucleobases de tipo desoxirribo son nucleobases distintas de las nucleobases de tipo ribo e incluyen todas las nucleobases que no contienen un resto pentosafuranosilo.
Una hebra de oligonucleobases incluye, de manera generica, ambas cadenas de oligonucleobases y segmentos o regiones de cadenas de oligonucleobases. Una hebra de oligonucleobases tiene un extremo 3' y un extremo 5'. Cuando una hebra de oligonucleobases tiene los mismos llmites o extension que una cadena, los extremos 3' y 5' de la hebra son tambien los fragmentos 3'-terminal y 5'-terminal de la cadena.
De acuerdo con la presente invencion, se define el crecimiento sustancialmente normal de una planta, organo vegetal, tejido vegetal o celula vegetal como la tasa de crecimiento o tasa de division celular de la planta, organo vegetal, tejido vegetal o celula vegetal que es al menos un 35%, al menos un 50%, al menos un 60% o al menos un 75% de la tasa de crecimiento o tasa de division celular en una planta, organo vegetal, tejido vegetal o celula vegetal correspondientes que expresan la protelna EPSPS natural.
De acuerdo con la presente invencion, se define el crecimiento sustancialmente normal de una planta, organo vegetal, tejido vegetal o celula vegetal como la presencia de uno o mas eventos del desarrollo en la planta, organo vegetal, tejido vegetal o celula vegetal que son sustancialmente identicos a los que estan presentes en una planta, organo vegetal, tejido vegetal o celula vegetal correspondientes que expresan la protelna EPSPS natural.
De acuerdo con la presente invencion, los organos vegetales incluyen, sin caracter limitante, hojas, tallos, ralces, brotes vegetativos, brotes florales, meristemos, embriones, cotiledones, endosperma, sepalos, petalos, pistilos, carpelos, estambres, anteras, microsporas, polen, tubos pollnicos, ovulos, ovarios y frutos o secciones, porciones o discos extraldos a partir de estos. Los tejidos vegetales incluyen, sin caracter limitante, tejidos callosos, tejidos fundamentales, tejidos vasculares, tejidos de almacenamiento, tejidos meristematicos, tejidos foliares, tejidos de las ramas, tejidos radiculares, tejidos de las cecidias, tejidos de tumores vegetales y tejidos reproductivos. Las celulas vegetales incluyen, sin caracter limitante, celulas aisladas con paredes celulares, agregados de estas con diversos tamanos y protoplastos.
Las plantas son sustancialmente “tolerantes” al glifosato cuando se exponen a este y proporcionan una curva de dosis/respuesta que esta desplazada en comparacion con la proporcionada por plantas de tipo no tolerante expuestas de manera similar. En tales curvas de dosis/respuesta se representa la “dosis” en el eje X y el “porcentaje de aniquilacion”, “efecto herbicida”, etc. se representa en el eje Y. Las plantas tolerantes requeriran mas herbicida que las plantas de tipo no tolerante con el fin de producir un efecto herbicida concreto. Las plantas que son sustancialmente “resistentes” al glifosato exhiben pocas lesiones necroticas, llticas, cloroticas o de otro tipo, o ninguna en absoluto, cuando se someten al glifosato con las concentraciones y tasas que son empleadas normalmente por la comunidad agroqulmica para aniquilar las malezas en el campo. Las plantas que son resistentes a un herbicida tambien son tolerantes al herbicida. Los terminos “resistente” y “tolerante” se han de interpretar como “tolerante y/o resistente” dentro del contexto de la presente solicitud.
4. Descripcion breve de las Figuras
La FIG. 1A es la secuencia de ADN del gen EPSPS de Arabidopsis thaliana (SEQ ID NO:1). Los residuos
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nucleotidicos en negrita y subrayados son los residuos objetivo.
La FIG. 1B es la secuencia de aminoacidos de la protelna EPSPS de Arabidopsis thaliana (SEQ ID NO:2). Los residuos aminoacldicos en negrita y subrayados son los residuos objetivo.
La FIG. 2 es una lista de las secuencias de nucleotidos y aminoacidos de EPSPS natural y mutante de Arabidopsis thaliana en la region de la posicion aminoacldica 173 a la 183; secuencia de nucleotidos natural (SEQ ID NO:1) y secuencia de aminoacidos natural (SEQ ID NO:2), secuencia de nucleotidos (SEQ ID NO:3) y secuencia de aminoacidos (SEQ ID NO:4) del mutante A177; secuencia de nucleotidos (SEQ ID NO:5) y secuencia de aminoacidos (SEQ ID NO:6) del mutante I178; secuencia de nucleotidos (SEQ ID NO:7) y secuencia de aminoacidos (SEQ ID NO:8) del mutante A177I178; secuencia de nucleotidos (SEQ ID NO:9) y secuencia de aminoacidos (SEQ ID NO:10) del mutante I178S182; secuencia de nucleotidos (SEQ ID NO:11) y secuencia de aminoacidos (SEQ ID NO:12) del mutante A177S182; secuencia de nucleotidos (SEQ ID NO:13) y secuencia de aminoacidos (SEQ ID NO:14) del
mutante A177I178S182; secuencia de nucleotidos (SEQ ID NO:15) y secuencia de aminoacidos (SEQ ID NO:16) del
mutante V177S182; secuencia de nucleotidos (SEQ ID NO:17) y secuencia de aminoacidos (SEQ ID NO:18) del
mutante L118S182; secuencia de nucleotidos (SEQ ID NO:19) y secuencia de aminoacidos (SEQ ID NO:20) del
mutante A177V118; secuencia de nucleotidos (SEQ ID NO:21) y secuencia de aminoacidos (SEQ ID NO:22) del
mutante A177L182.
La FIG. 3A-C es una alineacion del ADN del gen EPSPS de Arabidopsis thaliana realizada mediante DNAStar (LaserGene), (SEQ ID NO:1) con las secuencias de nucleotidos del gen EPSPS de Brassica napus (SEQ ID NO:23); Petunia hybrida (SEQ ID NO:24); y Zea mays (SEQ ID NO:25). Las secuencias se alinean utilizando el metodo de J. Hein con una tabla de peso de residuos ponderada.
La FIG. 4 es una alineacion de la secuencia de aminoacidos de EPSPS de Arabidopsis thaliana (SEQ ID NO:2) con las secuencias de aminoacidos de EPSPS de Brassica napus (SEQ ID NO:26); Petunia hybrida (SEQ ID NO:27) y Zea mays (SEQ ID NO:28). Las secuencias se alinean utilizando el metodo de J. Hein con una tabla de peso de residuos ponderada.
La FIG. 5 es una lista de los cebadores de mutagenesis utilizados, con los codones objetivo con letras en negrita (cebador del mutante A177 (SEQ ID NO:29); cebador del mutante I178 (SEQ ID NO:30); cebador del mutante A177I178 (SEQ ID NO:31); cebador del mutante I178S182 (SEQ ID NO:32); cebador del mutante A177S182 (SEQ ID NO:34); cebador del mutante A177I178S182 (SEQ ID NO:35); cebador del mutante V177S182 (SEQ ID NO:35); cebador del mutante L178S182 (SEQ ID NO:36); cebador del mutante A177V178 (SEQ ID NO: 37) y cebador del mutante A177L182 (SEQ ID NO:38)).
La FIG. 6 es el crecimiento medido mediante la densidad optica a 600 nm de clones de Arabidopsis en presencia (+) y ausencia (-) de glifosato 17 mM.
La FIG. 7 (cuadro superior) es una inmunoelectrotransferencia que muestra la expresion de protelnas EPSPS de Bacillus y de Arabidopsis naturales (WT) y mutadas (AS) marcadas con His aisladas de lisados celulares (L) y eluidos (E). La Salmonella no transformada como control negativo no muestra expresion de EPSPS. El cuadro inferior es un gel duplicado tenido con plata.
5. Descripcion detallada de la invencion
La presente invencion se refiere a un metodo para producir una planta o celula vegetal no transgenicas que tiene una mutacion en el gen EPSPS, donde la planta tiene una mayor resistencia o tolerancia a un miembro de la familia de la fosfonometilglicina y donde la planta muestra un crecimiento o desarrollo sustancialmente normales de la planta, sus organos, tejidos o celulas en comparacion con la planta o celula naturales correspondientes. La presente invencion tambien se refiere a una planta no transgenica que tiene una mutacion en el gen EPSPS, donde la planta es resistente o tiene una mayor tolerancia a un miembro de la familia de la fosfonometilglicina, p. ej., glifosato, donde la protelna EPSPS mutada tiene sustancialmente la misma actividad catalltica en comparacion con la protelna EPSPS natural.
La presente invencion tambien se refiere a un metodo para producir una planta no transgenica que tiene un gen EPSPS mutado que mantiene sustancialmente la actividad catalltica de la protelna natural independientemente de la presencia o ausencia de un herbicida de la familia de la fosfonometilglicina. El metodo comprende introducir en una celula vegetal una oligonucleobase recombinagenica con una mutacion dirigida en el gen EPSPS e identificar una celula, semilla o planta que tiene un gen EPSPS mutado.
Se pueden consultar ejemplos ilustrativos de una oligonucleobase recombinagenica en las siguientes publicaciones de patente: patentes de EE. UU. N.os 5 565 350; 5 756 325; 5 871 984; 5 760 012; 5 731 181; 5 888 983; 5 795 972; 5 780 296; 5 945 339; 6 004 804 y 6 010 907 y en la patente internacional N.° PCT/US00/23457; y en las publicaciones de patente internacional N.os WO 98/49350; WO 99/07865; WO 99/58723; WO 99/58702 y WO 99/40789.
La planta puede ser cualquier especie de planta dicotiledonea, monocotiledonea o gimnosperma, incluida cualquier especie de planta lenosa que crezca como un arbol o matorral, cualquier especie herbacea o cualquier especie que produzca verduras, semillas o frutos comestibles, o cualquier especie que produzca flores aromaticas o coloridas. Por ejemplo, la planta se podra seleccionar entre una especie de planta procedente del grupo constituido por canola, girasol, tabaco, remolacha azucarera, algodon, malz, trigo, cebada, arroz, sorgo, tomate, mango, melocoton, manzana, pera, fresa, platano, melon, patata, zanahoria, lechuga, cebolla, especies de soja, cana de azucar, guisante, habas comunes, alamo, uva, cltricos, alfalfa, centeno, avena, cesped y hierbas forrajeras, lino, colza
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La oligonucleobase recombinagenica se puede introducir en una celula vegetal utilizando cualquier metodo de uso comun en la tecnica incluidos, sin caracter limitante, microportadores (suministro biolistico), microfibras, electroporacion y microinyeccion.
Se divulga un metodo para controlar de manera selectiva las malezas en un campo, comprendiendo el campo plantas con las alteraciones del gen EPSPS divulgadas y malezas, comprendiendo el metodo la aplicacion al campo de un herbicida al cual dichas plantas se han vuelto resistentes.
Se divulgan ademas mutaciones novedosas en el gen EPSPS que confieren resistencia o tolerancia a un miembro de la familia de la fosfonometilglicina, p. ej., glifosato, a una planta o donde la EPSPS mutada tiene sustancialmente la misma actividad enzimatica en comparacion con la EPSPS natural.
5.1 Oligonucleobases recombinagenicas
La invencion se puede llevar a la practica con oligonucleobases recombinagenicas que tienen las conformaciones y propiedades quimicas descritas en el gen de la patente de Estados Unidos N.° 5 565 350 de Kmiec (Kmiec I) y la patente de EE. UU. N.° 5 731 181 (Kmiec II). Kmiec I describe un metodo para introducir alteraciones geneticas especificas en un gen diana. Las oligonucleobases recombinagenicas de Kmiec I y/o Kmiec II contienen dos hebras complementarias, una de las cuales contiene al menos un segmento de nucleotidos de tipo ARN (un “segmento de ARN”) cuyas bases se emparejan con los nucleotidos de tipo ADN de la otra hebra.
Kmiec II divulga que los componentes que no son nucleotidos que contienen bases de tipo purina y pirimidina pueden ser sustituidas por nucleotidos. Las patentes de EE. UU. N.os 5 756 325; 5 871 984; 5 760 012; 5 888 983; 5 795 972; 5 780 296; 5 945 339; 6 004 804 y 6 010 907 y en la patente internacional N.° PCT/US00/23457; y en las publicaciones de patente internacional N.os WO 98/49350; WO 99/07865; WO 99/58723; WO 99/58702 y WO 99/40789, se divulgan moleculas recombinagenicas adicionales que se pueden utilizar para la presente invencion. La expresion “oligonucleobase recombinagenica” se utiliza en la presente para referirse a moleculas que se pueden utilizar en los metodos de la presente invencion e incluyen moleculas que contienen oligonucleotidos o compuestos que no son nucleotidos bicatenarios mixtos descritos en Kmiec II, oligodesoxinucleotidos monocatenarios y otras moleculas recombinagenicas descritas en las patentes y publicaciones de patente mencionadas anteriormente.
La oligonucleobase recombinagenica es un oligonucleotido bicatenario mixto en el cual los nucleotidos de tipo ARN del oligonucleotido bicatenario mixto se vuelven resistentes a la RNasa reemplazando el 2'-hidroxilo con una funcionalidad de tipo fluoro, cloro o bromo o colocando un sustituyente en el 2'-O. Los sustituyentes adecuados incluyen los sustituyentes descritos en Kmiec II. Los sustituyentes alternativos incluyen los sustituyentes descritos en la patente de EE. Uu. N.° 5 334 711 (Sproat) y los sustituyentes descritos en las publicaciones de patente EP 629 387 y EP 679 657 (de manera global, las solicitudes Martin). Tal y como se utiliza en la presente, un derivado de tipo 2'-fluoro, cloro o bromo de un ribonucleotido o un ribonucleotido que tiene un 2'-OH sustituido con un sustituyente descrito en las solicitudes Martin o Sproat se denomina un “(ribonucleotido sustituido en 2')”. Tal y como se utiliza en la presente, la expresion “nucleotido de tipo ARN” se refiere a un nucleotido 2'-hidroxilo o sustituido en 2' que esta unido a otros nucleotidos de un oligonucleotido bicatenario mixto mediante una union de tipo fosfodiester no sustituido o cualquiera de las uniones no naturales descritas en Kmiec I o Kmiec II. Tal y como expresa la presente, la expresion “nucleotido de tipo desoxirribo” se refiere a un nucleotido que tiene un 2'-H, el cual puede estar unido a otros nucleotidos de un MDON mediante una union de tipo fosfodiester no sustituido o cualquiera de las uniones no naturales descritas en Kmiec I o Kmiec II.
La oligonucleobase recombinagenica es un oligonucleotido bicatenario mixto que esta unido unicamente mediante enlaces de tipo fosfodiester no sustituido. Como una alternativa, la union se realiza mediante fosfodiesteres sustituidos, derivados de fosfodiester y uniones no basadas en el fosforo como los descritos en Kmiec II. Como alternativa, cada nucleotido de tipo ARN del oligonucleotido bicatenario mixto es un nucleotido sustituido en 2'. Los ribonucleotidos sustituidos en 2' podran ser ribonucleotidos con una sustitucion de tipo 2'-fluoro, 2'-metoxi, 2'- propiloxi, 2'-aliloxi, 2'-hidroxietiloxi, 2'-metoxietiloxi, 2'-fluoropropiloxi y 2'-trifluoropropiloxi. Los ribonucleotidos sustituidos en 2' preferidos son los nucleotidos con una sustitucion de tipo 2'-fluoro, 2'-metoxi, 2'-metoxietiloxi y 2'- aliloxi. Como alternativa, el oligonucleotido bicatenario mixto esta unido mediante enlaces de tipo fosfodiester no sustituido.
Aunque el oligonucleotido bicatenario mixto que tiene un unico tipo de nucleotido de tipo ARN sustituido en 2' se sintetiza de manera mas conveniente, los metodos se pueden llevar a la practica con oligonucleotidos bicatenarios mixtos que tienen dos o mas tipos de nucleotidos de tipo ARN. La funcion de un segmento de ARN podra no verse afectada por la interruption causada por la introduction de un desoxinucleotido entre dos trinucleotidos de tipo ARN, en consecuencia, la expresion “segmento de ARN” engloba un “segmento de ARN interrumpido” de este tipo. Un segmento de ARN no interrumpido se denomina un segmento de ARN contiguo. En una realization alternativa, un segmento de ARN puede contener nucleotidos 2'-OH no sustituidos y resistentes a la RNasa alternantes. Los oligonucleotidos bicatenarios mixtos preferentemente tendran menos de 100 nucleotidos y mas preferentemente menos de 85 nucleotidos pero mas de 50 nucleotidos. La primera y segunda hebras presentan un emparejamiento de bases de Watson-Crick. Las hebras del oligonucleotido bicatenario mixto estan enlazadas covalentemente
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mediante un conector, tal como un hexa-, penta- o tetranucleotido monocatenario de manera que la primera y segunda hebras son segmentos de una cadena oligonucleotidica sencilla que tiene un unico extremo 3' y un unico extremo 5'. Los extremos 3' y 5' pueden protegerse mediante la adicion de una “caperuza de tipo horquilla” de manera que los nucleotidos 3'- y 5'-terminales presenten un emparejamiento de Watson-Crick con los nucleotidos adyacentes. Se puede colocar, adicionalmente, una segunda caperuza de tipo horquilla en la union entre la primera y segunda hebras distante de los extremos 3' y 5', de modo que el emparejamiento de Watson-Crick entre la primera y segunda hebras se estabilice.
La primera y segunda hebras contienen dos regiones que son homologas a dos fragmentos del gen EPSPS diana, es decir, tienen la misma secuencia que el gen diana. Una region homologa contiene los nucleotidos de un segmento de ARN y podra contener uno o mas nucleotidos de tipo ADN del segmento de ADN conector y tambien podra contener nucleotidos de tipo ADN que no estan comprendidos en el segmento de ADN intercalado. Las dos regiones de homologia estan separadas por una region que tiene una secuencia que difiere de la secuencia del gen diana, denominada una “region heterologa”, y cada una de ellas es adyacente a dicha region. La region heterologa puede contener uno, dos o tres nucleotidos emparejados erroneamente. Los nucleotidos emparejados erroneamente pueden ser contiguos o, como alternativa, pueden estar separados por uno o dos nucleotidos que son homologos al gen diana. Como alternativa, la region heterologa tambien puede contener una insercion de uno, dos, tres o de cinco o menos nucleotidos. Como alternativa, la secuencia del oligonucleotido bicatenario mixto podra diferir de la secuencia del gen diana unicamente por la delecion de uno, dos, tres o cinco o menos nucleotidos del oligonucleotido bicatenario mixto. En este caso, se considera que la longitud y posicion de la region heterologa es la longitud de la delecion, aun cuando no esten comprendidos en la region heterologa nucleotidos del oligonucleotido bicatenario mixto. La distancia entre los fragmentos del gen diana que son complementarios con las dos regiones homologas es exactamente la longitud de la region heterologa cuando se pretende una sustitucion o sustituciones. Cuando la region heterologa contiene una insercion, las regiones homologas estan separadas de esta manera en el oligonucleotido bicatenario mixto mas lejos de lo que lo estan sus fragmentos homologos complementarios en el gen y el caso inverso es aplicable cuando la region heterologa codifica una delecion.
Cada uno de los segmentos de ARN de los oligonucleotidos bicatenarios mixtos son parte de una region homologa, es decir, una region cuya secuencia es identica a un fragmento del gen diana, cuyos segmentos juntos contienen preferentemente al menos 13 nucleotidos de tipo ARN y, preferentemente, entre 16 y 25 nucleotidos de tipo ARN o, aun mas preferentemente, 18-22 nucleotidos de tipo ARN o, de la manera mas preferida, 20 nucleotidos. En una realizacion, los segmentos de ARN de las regiones de heterologia estan separados, es decir, “conectados” por un segmento de ADN intercalado y son adyacentes a este. En una realizacion, cada nucleotido de la region heterologa es un nucleotido del segmento de aDn intercalado. Un segmento de ADN intercalado que contiene la region heterologa de un oligonucleotido bicatenario mixto se denomina un “segmento mutador”.
El cambio que se va introducir en el gen EPSPS diana esta codificado por la region heterologa. El cambio que se va introducir en el gen EPSPS puede ser un cambio en una o mas bases de la secuencia del gen EPSPS o la adicion o delecion de una o mas bases.
Como alternativa, la oligonucleobase recombinagenica es un vector mutacional oligodesoxinucleotidico monocatenario o SSOMV, que se divulga en la solicitud de patente internacional PCT/US00/23457. La secuencia del SSOMV esta basada en los mismos principios que los vectores mutacionales descritos en las patentes de EE. UU. N.os 5 756 325; 5 871 984; 5 760 012; 5 888 983; 5 795 972; 5 780 296; 5 945 339; 6 004 804 y 6 010 907 y en las publicaciones internacionales N.os WO 98/49350; WO 99/07865; WO 99/58723; WO 99/58702 y WO 99/40789. La secuencia del SSOMV contiene dos regiones que son homologas a la secuencia diana separadas por una region que contiene la alteracion genetica deseada denominada la region mutadora. La region mutadora puede tener una secuencia que tiene la misma longitud que la secuencia que separa las regiones homologas en la secuencia diana, pero que tiene una secuencia diferente. Una region mutadora de este tipo puede provocar una sustitucion. Como alternativa, las regiones homologas del SSOMV pueden ser contiguas entre si, mientras que las regiones en el gen diana que tienen la misma secuencia estan separadas por uno, dos o mas nucleotidos. Un SSOMV de este tipo provoca una delecion en el gen diana de los nucleotidos que estan ausentes del SSOMV. Por ultimo, la secuencia del gen diana que es identica a las regiones homologas podra ser adyacente en el gen diana pero estar separada por uno o mas nucleotidos en la secuencia del SSOMV. Un SSOMV de este tipo provoca una insercion en la secuencia del gen diana.
Los nucleotidos del SSOMV son desoxirribonucleotidos que estan unidos mediante enlaces fosfodiester no modificados excepto en que la union internucleotidica 3'-terminal y/o 5'-terminal o, como alternativa, las dos uniones internucleotidicas 3'-terminal y/o 5'-terminal pueden ser un fosforotioato o un fosfoamidato. Tal y como se utiliza en la presente, una union internucleotidica es la union entre nucleotidos del SSOMV y no incluye la union entre el nucleotido del extremo 3' o el nucleotido del extremo 5' y un sustituyente de bloqueo, consulte la parte anterior. La longitud del SSOMV esta comprendida entre 21 y 55 desoxinucleotidos y las longitudes de las regiones de homologia tienen, en consecuencia, una longitud total de al menos 20 desoxinucleotidos y al menos dos regiones de homologia deberian tener cada una longitudes de al menos 8 desoxinucleotidos.
El SSOMV se puede disenar para que sea complementario tanto a la hebra codificante como a la no codificante del gen diana. Cuando la mutacion deseada es una sustitucion de una unica base, se prefiere que el nucleotido mutador sea una pirimidina. En la medida en que esto es coherente con la consecucion del resultado funcional deseado, se prefiere que el nucleotido mutador y el nucleotido diana de la hebra complementaria sean pirimidinas. Son
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particularmente preferidos los SSOMV que codifican mutaciones de transversion, es decir, un nucleotido mutador C o T se empareja de manera erronea, respectivamente, con un nucleotido C o T de la hebra complementaria.
Ademas del oligodesoxinucleotido, el SSOMV puede contener un sustituyente de bloqueo 5' que se una a los carbonos 5'-terminales mediante un conector. Las propiedades qulmicas del conector no son cruciales, con la excepcion de su longitud, que deberla tener preferentemente al menos una longitud de 6 atomos y del hecho de que el conector deberla ser flexible. Se pueden utilizar varios sustituyentes atoxicos, tales como biotina, colesterol u otros esteroides o un tinte fluorescente cationico no intercalante. Son reactivos particularmente preferidos para generar SSOMV los reactivos comercializados como Cy3™ y CyS™ por Glen Research, Sterling VA, que son fosforoamiditos bloqueados que, tras la incorporation en un oligonucleotido, producen los tintes indomonocarbocianina e indodicarbocianina con una sustitucion 3,3,3',3'-tetrametilo N,N'-isopropilo,
respectivamente. Cy3 es el mas preferido. Cuando la indocarbocianina esta sustituida con N-oxialquilo se puede unir convenientemente al oligodesoxinucleotido 5'-terminal mediante un fosfodiester con un fosfato 5'-terminal. Las propiedades qulmicas del tinte conector entre el tinte y el oligodesoxinucleotido no son cruciales y se escogen por su conveniencia sintetica. Cuando se utiliza el fosforamidito comercializado Cy3 segun las indicaciones, la modification 5' resultante consiste en un sustituyente de bloqueo y el conector juntos que son una indomonocarbocianina con una sustitucion de tipo 3,3,3',3'-tetrametilo N-hidroxipropilo, N’-fosfatidilpropilo.
El tinte de tipo indocarbocianina podra estar tetrasustituido en las posiciones 3 y 3' de los anillos de indol. Sin desear cenirse a la teorla, estas sustituciones evitan que el tinte sea un tinte intercalante. La identidad de los sustituyentes en estas posiciones no es crucial. Ademas, el SSOMV puede tener un sustituyente de bloqueo 3'. Nuevamente, las propiedades qulmicas del sustituyente de bloqueo 3' no son cruciales.
5.2 La ubicacion y el tipo de mutation introducida en el gen EPSPS
En una realization de la presente invention, el gen EPSPS de Arabidopsis thaliana (remltase a la Figura 1A) y la enzima EPSPS correspondiente (remltase a la Figura 1B) comprenden una mutacion en uno o mas residuos aminoacldicos seleccionados a partir del grupo constituido por Leu173, Gly177, Thr178, Ala179, Metro Arg181, Pro182, Ser98, Ser225 y Leu198 o en un residuo aminoacldico analogo en un gen EPSPS de otra especie y la mutacion resulta en una o mas de las siguientes sustituciones de aminoacidos en la enzima EPSPS en comparacion con la secuencia
- natural:
- (i)
- Leu173 - Phe
- (ii)
- Gly177 - Ala o Ile
- (iii)
- Thr178 - Ile o Val o Leu
- (iv)
- Ala179 - Gly
- (v)
- Met180 - Cys
- (vi)
- Arg-isi - Leu o Ser
- (vii)
- Pro182 - Leu o Ser
- (viii)
- Ser98 - Asp
- (ix)
- Ser255 - Ala
- (x)
- Leu198 - Lys.
En otra realizacion de la presente invencion, en el producto del gen EPSPS, el residuo aminoacldico que se va a cambiar es Leu en la secuencia contigua Leu-Tyr-Leu-Gly-Asn (SEQ ID NO:29) y se cambia a Phe; o en el residuo aminoacldico que se va a cambiar es Gly en la secuencia contigua Asn-Ala-Gly-Thr-Ala (SEQ ID NO:30) y se cambia a Ala o Ile; o el aminoacido que se va a cambiar es Thr en la secuencia contigua Ala-Gly-Thr-Ala-Met (SEQ ID NO:31) y se cambia a Ile, Val o Leu; o el aminoacido que se va a cambiar es Ala en la secuencia contigua Gly- Thr-Ala-Met-Arg (SEQ ID NO:32) y se cambia a Gly; o el aminoacido que se va a cambiar es Met en la secuencia contigua Thr-Ala-Met-Arg-Pro (SEQ ID NO:33) y se cambia a Cys; o el aminoacido que se va cambiar es Arg en la secuencia contigua Ala-Met-Arg-Pro-Leu (SEQ ID NO:34) y se cambia a Leu o Ser; o el aminoacido que se va cambiar es Pro en la secuencia contigua Met-Arg-Pro-Leu-Thr (SEQ ID NO:35) y se cambia a Leu o Ser; o el aminoacido que se va cambiar es Ser en la secuencia contigua Pro-Gly-Ser-Lys-Ser (SEQ ID NO:36) y se cambia a Asp; o el aminoacido que se va cambiar es Ser en la secuencia contigua Ile-Ser-Ser-Gln-Tyr (SEQ ID NO:37) y se cambia a Ala; o el aminoacido que se va cambiar es Leu en la secuencia contigua Tyr-Val-Leu-Asp-Gly (SEQ ID NO:38) y se cambia a Lys. En otras realizaciones, se pueden realizar uno o mas de los cambios anteriores en la secuencia de aminoacidos de EPSPS.
Como alternativa, y/o ademas, la mutacion podrla resultar en el reemplazo de cualquier aminoacido en las posiciones correspondientes a la 256, 284-288 y 353-356 con respecto a la protelna EPSPS representada en la Figura 1B (SEQ ID NO.2).
Como alternativa, se muta el gen EPSPS en la position aminoacldica 177, en la cual se reemplaza Gly por Ala. Como alternativa, se trata de la sustitucion de Thr en la posicion aminoacldica 178 por Ile. Como alternativa, una mutacion en la posicion aminoacldica 177 en la cual Gly se reemplaza por Ala, mas la sustitucion adicional de Thr en la posicion 178 por Ile. Como alternativa, mutaciones en la posicion aminoacldica 178, en la cual Thr se reemplaza por Ile, mas la mutacion adicional en la posicion 182, en la cual Pro se reemplaza por Ser. Como alternativa, incluye la sustitucion de Gly en la posicion aminoacldica 177 por Ala, mas la mutacion adicional en la posicion aminoacldica 182, en la cual Pro se sustituye por Ser. Otras secuencias de EPSPS mutadas comprenden la
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sustitucion de Gly en la posicion 177 por Ala, mas la sustitucion en la posicion 178, en la cual Thr se reemplaza por Ile, mas la sustitucion adicional de Pro en la posicion aminoacidica 182 por Ser. Como alternativa, la sustitucion de Thr en la posicion aminoacidica 178 por Val y la mutacion adicional en la posicion aminoacidica 182, en la cual Pro se reemplaza por Ser. Como alternativa, incluye la sustitucion de Thr en la posicion 178 por Leu, mas la mutacion en la posicion aminoacidica 182, en la cual Pro se reemplaza por Ser. Una realizacion adicional incluye la sustitucion en la posicion aminoacidica 177 en la cual Gly se reemplaza por Ala, mas la sustitucion de Thr en la posicion 178 por Val. La sustitucion en la posicion aminoacidica 177 en la cual Gly se reemplaza por Ala, mas el reemplazo de Thr en la posicion aminoacidica 178 por Leu (remitase a la Figura 2).
Las mutaciones anteriores en el gen EPSPS se describieron utilizando el gen (SEQ ID NO:1) y la proteina (SEQ ID NO:2) EPSPS de Arabidopsis thaliana. La presente invencion tambien engloba los genes EPSPS mutantes de otras especies. Sin embargo, debido a las variaciones en los genes EPSPS de diferentes especies, el numero de los residuos aminoacidicos que se ha de cambiar en una especie podra ser diferente en otra especie. No obstante, el experto en la tecnica podra identificar facilmente la posicion analoga mediante la homologia de secuencias. Por ejemplo, las Figuras 3A-C muestran las secuencias alineadas de nucleotidos y la Figura 4 muestra las secuencias de aminoacidos alineadas de cuatro genes EPSPS de Arabidopsis thaliana, Zea mays, Petunia hybrida y Brassica napus. Por lo tanto, las posiciones analogas en Zea mays son Leug7, Gly101, Thr102, Ala103, Met104, Arg105, Pro106, Ser23, Ser179 y Leu122. Por lo tanto, la secuencia de aminoacidos de EPSPS de Zea mays se muta en una o mas de las siguientes posiciones aminoacidicas y resulta en una o mas de las siguientes sustituciones:
- (i)
- Leu97 - Phe
- (ii)
- Gly101 - Ala o Ile
- (iii)
- Thr102 - Ile o Val o Leu
- (iv)
- Ala103 - Gly
- (v)
- Met104 - Cys
- (vi)
- Arg105 - Leu o Ser
- (vii)
- Pro106 - Leu o Ser
- (viii)
- Ser23 - Asp
- (ix)
- Ser179 - Ala
- (x)
- Leu122 - Lys.
En el producto del gen EPSPS de Zea mays, el residuo aminoacidico que se va a cambiar es Leu en la secuencia contigua Leu-Phe-Leu-Gly-Asn (SEQ ID NO:39) y se cambia a Phe; o en el residuo aminoacidico que se va a cambiar es Gly en la secuencia contigua Asn-Ala-Gly-Thr-Ala (SEQ ID NO:30) y se cambia a Ala o Ile; o el aminoacido que se va a cambiar es Thr en la secuencia contigua Ala-Gly-Thr-Ala-Met (SEQ ID NO:31) y se cambia a Ile, Val o Leu; o el aminoacido que se va a cambiar es Ala en la secuencia contigua Gly-Thr-Ala-Met-Arg (SEQ ID NO:32) y se cambia a Gly; o el aminoacido que se va a cambiar es Met en la secuencia contigua Thr-Ala-Met-Arg- Pro (SEQ ID NO:33) y se cambia a Cys; o el aminoacido que se va cambiar es Arg en la secuencia contigua Ala- Met-Arg-Pro-Leu (SEQ ID NO:34) y se cambia a Leu o Ser; o el aminoacido que se va cambiar es Pro en la secuencia contigua Met-Arg-Pro-Leu-Thr (SEQ ID NO:35) y se cambia a Leu o Ser; o el aminoacido que se va cambiar es Ser en la secuencia contigua Pro-Gly-Ser-Lys-Ser (SEQ ID NO:36) y se cambia a Asp; o el aminoacido que se va cambiar es Ser en la secuencia contigua Ile-Ser-Ser-Gln-Tyr (SEQ ID NO:37) y se cambia a Ala; o el aminoacido que se va cambiar es Leu en la secuencia contigua Tyr-Val-Leu-Asp-Gly (SEQ ID NO:38) y se cambia a Lys. Como alternativa, se pueden realizar uno o mas de los cambios anteriores en la secuencia de aminoacidos de EPSPS.
En Brassica napus, las posiciones aminoacidicas analogas son Leu169, Gly173, Thr174, Ala175, Met176, Arg177, Pro178, Serg4, Ser251 y Leu194. Por lo tanto, la secuencia de aminoacidos de EPSPS de Brassica napus se muta en una o mas de las siguientes posiciones aminoacidicas y resulta en una o mas de las siguientes sustituciones:
- (i)
- Leu169 - Phe
- (ii)
- Gly173 - Ala o Ile
- (iii)
- Thr174 - Ile o Val o Leu
- (iv)
- Ala175 - Gly
- (v)
- Met176 - Cys
- (vi)
- Arg177 - Leu o Ser
- (vii)
- Pro17s - Leu o Ser
- (viii)
- Ser94 - Asp
- (ix)
- Ser251 - Ala
- (x)
- Leu^4 - Lys.
En el producto del gen EPSPS de Brassica napus, el residuo aminoacidico que se va a cambiar es Leu en la secuencia contigua Leu-Tyr-Leu-Gly-Asn (SEQ ID NO:29) y se cambia a Phe; o en el residuo aminoacidico que se va a cambiar es Gly en la secuencia contigua Asn-Ala-Gly-Thr-Ala (SEQ ID NO:30) y se cambia a Ala o Ile; o el aminoacido que se va a cambiar es Thr en la secuencia contigua Ala-Gly-Thr-Ala-Met (SEQ ID NO:31) y se cambia a Ile, Val o Leu; o el aminoacido que se va a cambiar es Ala en la secuencia contigua Gly-Thr-Ala-Met-Arg (SEQ ID NO:32) y se cambia a Gly; o el aminoacido que se va a cambiar es Met en la secuencia contigua Thr-Ala-Met-Arg- Pro (SEQ ID NO:33) y se cambia a Cys; o el aminoacido que se va cambiar es Arg en la secuencia contigua Ala- Met-Arg-Pro-Leu (SEQ ID NO:34) y se cambia a Leu o Ser; o el aminoacido que se va cambiar es Pro en la
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secuencia contigua Met-Arg-Pro-Leu-Thr (SEQ ID NO:35) y se cambia a Leu o Ser; o el aminoacido que se va cambiar es Ser en la secuencia contigua Pro-Gly-Ser-Lys-Ser (SEQ ID NO:36) y se cambia a Asp; o el aminoacido que se va cambiar es Ser en la secuencia contigua Ile-Ser-Ser-Gln-Tyr (SEQ ID NO:37) y se cambia a Ala; o el aminoacido que se va cambiar es Leu en la secuencia contigua Tyr-Val-Leu-Asp-Gly (SEQ ID NO:38) y se cambia a Lys. Como alternativa, se pueden realizar uno o mas de los cambios anteriores en la secuencia de aminoacidos de EPSPS.
En Petunia hybrids, las posiciones aminoacldicas analogas son Leui69, Glyi73, Thri74, Alai75, Meti76, Argi77, Proi78, Ser94, Ser25i y Leui94. Por lo tanto, la secuencia de aminoacidos de EPSPS de Petunia hybrids se muta en una o mas de las siguientes posiciones aminoacldicas y resulta en una o mas de las siguientes sustituciones:
- (i)
- Leui69 - Phe
- (ii)
- Glyi73 - Ala o Ile
- (iii)
- Thri74 - Ile o Val o Leu
- (iv)
- Alai75 - Gly
- (v)
- Meti76 - Cys
- (vi)
- Argi77 - Leu o Ser
- (vii)
- Proi78 - Leu o Ser
- (viii)
- Ser94 - Asp
- (ix)
- Ser25i - Ala
- (x)
- Leui94 - Lys.
En el producto del gen EPSPS de Petunia hybrids, el residuo aminoacldico que se va a cambiar es Leu en la secuencia contigua Leu-Phe-Leu-Gly-Asn (SEQ ID NO:29) y se cambia a Phe; o en el residuo aminoacldico que se va a cambiar es Gly en la secuencia contigua Asn-Ala-Gly-Thr-Ala (SEQ ID NO:30) y se cambia a Ala o Ile; o el aminoacido que se va a cambiar es Thr en la secuencia contigua Ala-Gly-Thr-Ala-Met (SEQ ID NO:3i) y se cambia a Ile, Val o Leu; o el aminoacido que se va a cambiar es Ala en la secuencia contigua Gly-Thr-Ala-Met-Arg (SEQ ID NO:32) y se cambia a Gly; o el aminoacido que se va a cambiar es Met en la secuencia contigua Thr-Ala-Met-Arg- Pro (SEQ ID NO:33) y se cambia a Cys; o el aminoacido que se va cambiar es Arg en la secuencia contigua Ala- Met-Arg-Pro-Leu (SEQ ID NO:34) y se cambia a Leu o Ser; o el aminoacido que se va cambiar es Pro en la secuencia contigua Met-Arg-Pro-Leu-Thr (SEQ ID NO:35) y se cambia a Leu o Ser; o el aminoacido que se va cambiar es Ser en la secuencia contigua Pro-Gly-Ser-Lys-Ser (SEQ ID NO:36) y se cambia a Asp; o el aminoacido que se va cambiar es Ser en la secuencia contigua Ile-Ser-Ser-Gln-Tyr (SEQ ID NO:37) y se cambia a Ala; o el aminoacido que se va cambiar es Leu en la secuencia contigua Tyr-Val-Leu-Asp-Gly (SEQ ID NO:38) y se cambia a Lys. Como alternativa, se pueden realizar uno o mas de los cambios anteriores en la secuencia de aminoacidos de EPSPS.
5.3 El suministro de oligonucleobases recombinagenicas a celulas vegetales
En los metodos de la presente invencion, se puede utilizar cualquier metodo de uso comun para transformar una celula vegetal con oligonucleobases recombinagenicas. A continuacion, se enumeran metodos ilustrativos.
5.3.i Microportadores y microfibras
El uso de microportadores (microesferas) metalicos para introducir fragmentos grandes de ADN en celulas vegetales que tienen paredes celulares de celulosa mediante la penetracion de proyectiles es muy conocida por los expertos en la tecnica relevante (en lo sucesivo en la presente, suministro biollstico). Las patentes de Estados Unidos N.os 4 945 050; 5 i00 792 y 5 204 253 describen tecnicas generales para seleccionar micro portadores y dispositivos para proyectarlos.
Las condiciones especlficas para utilizar microportadores en los metodos de la presente invencion se describen en la publicacion internacional WO 99/07865. En una tecnica ilustrativa, se anaden microportadores enfriados con hielo (60 mg/mL), oligonucleotido bicatenario mixto (60 mg/mL), CaCl2 2.5 M y espermidina 0.i M en ese orden; la mezcla se agita suavemente, p. ej., mediante agitacion vorticial, durante i0 minutos y se deja que repose a temperatura ambiente durante i0 minutos, tras lo cual los microportadores se diluyen en 5 volumenes de etanol, se centrifugan y se resuspenden en etanol al i00%. Se pueden obtener buenos resultados con una concentracion en la solucion de adhesion de 8-i0 pg/pL de microportadores, i4-i7 pg/mL de oligonucleotido bicatenario mixto, CaCl2 i.i-i.4 M y espermidina i8-22 mM. Se observaron los resultados optimos con condiciones de 8 pg/pL de micro portadores, i6.5 pg/mL de oligonucleotido bicatenario mixto, CaCl2 i.3 M y espermidina 2i mM.
Las oligonucleobases recombinagenicas tambien se pueden introducir en celulas vegetales para llevar a la practica la presente invencion utilizando microfibras para penetrar en la pared celular y la membrana celular. La patente de EE. UU. N.° 5 302 523 de Coffee et al. describe la utilizacion de fibras de carburo de silicio de 30 x 0.5 pm y i0 x 0.3 pm para facilitar la transformacion de cultivos de malz en suspension de Black Mexican Sweet. Cualquier tecnica mecanica que se pueda utilizar para introducir ADN para la transformacion de la celula vegetal utilizando micro fibras se puede utilizar para suministrar las oligonucleobases recombinagenicas para la transmutacion.
Una tecnica ilustrativa para el suministro con microfibras de una oligonucleobase recombinagenica es de la siguiente manera: se suspenden microfibras esteriles (2 pg) en 150 pL de medio de cultivo vegetal que contiene aproximadamente i0 pg de oligonucleotido bicatenario mixto. Se permite que el cultivo de suspension sedimente y se agitan de manera vorticial volumenes identicos de celulas empaquetadas y la suspension de fibra esteril/nucleotido durante i0 minutos y se siembra en placas. Se aplica medio selectivo inmediatamente o con un
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retraso de hasta aproximadamente 120 horas segun proceda para el rasgo concreto.
5.3.2 Electroporacion de protoplastos
En una realization alternativa, las oligonucleobases recombinagenicas se pueden suministrar a la celula vegetal mediante la electroporacion de un protoplasto derivado de una parte de la planta. Los protoplastos se forman mediante el tratamiento enzimatico de una parte de la planta, particularmente una hoja, de acuerdo con tecnicas muy conocidas por los expertos en la tecnica. Remltase a, p. ej., Gallois et al., 1996, en Methods in Molecular Biology 55:89-107, Humana Press, Totowa, NJ; Kipp et al., 1999, en Methods in Molecular Biology 133:213-221, Humana Press, Totowa, NJ. No es necesario cultivar los protoplastos en medio de cultivo antes de la electroporacion. Las condiciones ilustrativas para la electroporacion son 3 x 105 protoplastos en un volumen total de 0.3 mL con una concentration de oligonucleobase recombinagenica de entre 0.6-4 pg/mL.
5.3.3 Filamentos finos y microinyeccion
En otra realizacion alternativa mas, la oligonucleobase recombinagenica se puede suministrar a la celula vegetal mediante filamentos finos o microinyeccion de la celula vegetal. La denominada tecnica con filamentos finos se realiza esencialmente tal y como se describe en Frame et al., 1994, Plant J., 6:941-948. La oligonucleobase recombinagenica se anade a los filamentos finos y se utiliza para transformar las celulas vegetales. La oligonucleobase recombinagenica se podra incubar conjuntamente con plasmidos que comprendan las secuencias que codifican las protelnas capaces de formar complejos de recombinasa en celulas vegetales, de modo que se cataliza la recombination entre el oligonucleotido y la secuencia diana en el gen EPSPS.
5.4 Selection de plantas resistentes al glifosato
Las plantas o las celulas vegetales se pueden estudiar para determinar la resistencia o tolerancia a un herbicida utilizando metodos de uso comun en la tecnica, p. ej., cultivando la planta o celula vegetal en presencia de un herbicida y midiendo la tasa de crecimiento en comparacion con la tasa de crecimiento en ausencia del herbicida.
6. Ejemplo
Los siguientes experimentos demuestran la production de los genes EPSPS mutantes de Arabidopsis thaliana que son resistentes al herbicida glifosato y que permiten que las celulas vegetales mantengan una tasa de crecimiento.
6.1 Materiales y metodos
6.1.1 Aislamiento de ADNc de EPSPS de Arabidopsis thaliana
Se amplifico un fragmento de ADN de 1.3 kb mediante PCR a partir de una coleccion de ADNc de Arabidopsis utilizando los cebadores AtEXPEXPM1 y AtEXPEXP2CM-2. Se disenaron los dos cebadores para amplificar el ADNc desde el peptido maduro hasta el codon de termination. El cebador 5' AtEXPEXPM1 contiene un sitio Xbal (subrayado) y el cebador 3' AtEXPEXP2CM-2 contiene un sitio Bglll (subrayado), y dichos sitios seran utiles para la donation del fragmento en el vector de expresion.
AtEXPEXPM1
5'-GCTCTAGAGAAAGCGTCGGAGATTGTACTT-3' (SEQ ID NO:40)
AtEXPEXP2CM-2
5'-GCAGATCTGAGCTCTTAGTGCTTTGTGATTCTTTCAAGTAC-3' (SEQ ID NO:41)
Se escindio la banda de PCR del gel de agarosa y se purifico (GeneClean, Biol). A continuation se confirmo que su secuencia era la secuencia del peptido maduro del gen EPSPS de Arabidopsis thaliana.
6.1.2 Preparation del vector de expresion
Se obtuvo la region codificante de EPSPS del gen AroE de Bacillus subtilis mediante PCR utilizando los siguientes cebadores:
BsAroE5'Xba
5'-GCGTCTAGAAAAACGAGATAAGGTGCAG-3' (SEQ ID NO:42) y BsAroE3'BamHI
5'-GCGGATCCTCAGGATTTTTTCGAAAGCTTATTTAAATG-3' (SEQ ID NO:43).
El fragmento de PCR, que carece de un codon de initiation (ATG), se clono en fase con el marco de lectura del vector pACLacIMH6RecA reemplazando el ORF de RecA mediante la digestion con Xbal y BamHI. PACLacIMH6RecA contuvo la region LacI de Pet21 en las posiciones 1440-3176, la MH6 RecA en las posiciones 3809-5188, el gen de resistencia al cloranfenicol en las posiciones 5445-218 (5446-5885 y 1-218) y el origen de replication p15A en las posiciones 5811-1424. La region codificante del gen RecA se clono de E. coli en fase con el marco de lectura del codon de inicio y el conector de 6 histidinas (MH6) detras del promotor LacZ de pUC19.
6.1.3 Clonacion del gen EPSPS de Arabidopsis en un vector de expresion bacteriano
El fragmento de PCR de 1.3 kb de Arabidopsis se digirio con Xbal y BamHI (compatible con BgIII) y se clono en el plasmido pACYCLacIMH6EPSPS, en lugar del gen de Bacillus.
Los clones obtenidos (seleccionados con cloranfenicol) se secuenciaron a continuacion y se confirmo que eran positivos. Se selecciono uno de los clones confirmados (pAtEPS-12) y se confirmo tambien que las uniones entre el
Claims (16)
- 510152025303540455055REIVINDICACIONES1. Un metodo para producir una planta no transgenica que es resistente o tolerante a un herbicida de la familia de la fosfonometilglicina, que comprende:(a) introducir en celulas vegetales una oligonucleobase recombinagenica con una mutacion dirigida en el gen EPSPS para producir celulas vegetales con un gen EPSPS mutante que exprese una protelna EPSPS que esta mutada en una o mas posiciones aminoacldicas, donde dichas posiciones se seleccionan a partir del grupo constituido por Leui73, Alai79, Meti80, Argisi, Ser98, Ser255 y Leuigs de la protelna EPSPS de Arabidopsis o en un residuo aminoacldico analogo de un gen EPSPS de otra especie;(b) identificar una celula vegetal que tiene un crecimiento normal en comparacion con la celula vegetal natural correspondiente en presencia de glifosato; y(c) regenerar una planta no transgenica resistente o tolerante a herbicidas que tiene dicho gen EPSPS mutado a partir de dicha celula vegetal;donde la planta no transgenica resistente o tolerante a herbicidas muestra un crecimiento y desarrollo normales en comparacion con los de las plantas naturales correspondientes y donde la enzima EPSPS mutada tiene la misma actividad catalltica en comparacion con la de la enzima natural.
- 2. Un metodo para producir una planta no transgenica que es resistente o tolerante a un herbicida de la familia de la fosfonometilglicina, que comprende:(a) introducir en celulas vegetales una oligonucleobase recombinagenica con una mutacion dirigida en el gen EPSPS para producir celulas vegetales con un gen EPSPS mutante que exprese una protelna EPSPS mutante que esta mutada en una o mas posiciones aminoacldicas, donde dichas posiciones se seleccionan a partir del grupo constituido por Leui73, Alai79, Metis0, Argisi, Sergs, Ser255 y Leuigs de la protelna EPSPS de Arabidopsis o en un residuo aminoacldico analogo de un gen EPSPS de otra especie;(b) identificar una celula vegetal que tiene una protelna EPSPS mutante que tiene la misma actividad catalltica en comparacion con una protelna EPSPS natural correspondiente en presencia de glifosato; y(c) regenerar una planta no transgenica resistente o tolerante a herbicidas que tiene dicho gen EPSPS mutado a partir de dicha celula vegetal;donde la planta no transgenica resistente o tolerante a herbicidas muestra un crecimiento y desarrollo normales en comparacion con los de las plantas naturales correspondientes y donde la enzima EPSPS mutada tiene la misma actividad catalltica en comparacion con la de la enzima natural.
- 3. El metodo de acuerdo con la reivindicacion i o 2, en el cual la oligonucleobase recombinagenica es un nucleotido bicatenario mixto o un vector mutacional oligodesoxinucleotldico monocatenario (SSOMV).
- 4. El metodo de acuerdo con la reivindicacion 3, en el cual el nucleotido bicatenario mixto contiene una primera region homologa que tiene una secuencia identica a la secuencia de al menos 6 pares de bases del primer fragmento del gen EPSPS diana y una segunda region homologa que tiene una secuencia identica a la secuencia de al menos 6 pares de bases de un segundo fragmento del gen EPSPS diana y una region intercalada que contiene al menos una nucleobase heterologa respecto al gen EPSPS diana, donde la region intercalada conecta la primera y segunda regiones homologas.
- 5. El metodo de acuerdo con la reivindicacion i o 2, en el cual la oligonucleobase recombinagenica se introduce mediante electroporacion.
- 6. El metodo de acuerdo con la reivindicacion i, en el cual las posiciones aminoacldicas se seleccionan a partir del grupo constituido por Leu97, Alai03, Meti04, Argi05, Ser23, Seri79 y Leui22 del gen EPSPS de Zea mays.
- 7. El metodo de acuerdo con la reivindicacion i, en el cual las posiciones aminoacldicas se seleccionan a partir del grupo constituido por Leui69, Alai75, Meti76, Argi77, Ser94, Ser25i y Leui94 del gen EPSPS de una Brassica sp.s. El metodo de acuerdo con la reivindicacion i, en el cual las posiciones aminoacldicas se seleccionan a partir del grupo constituido por Leui69, Alai75, Meti76, Argi77, Ser94, Ser25i y Leui94 del gen EPSPS de Petunia hybrida.
- 9. El metodo de acuerdo con la reivindicacion i o 2, en el cual las celulas vegetales se seleccionan a partir del grupo constituido por malz, trigo, arroz, cebada, soja, algodon, remolacha azucarera, colza oleaginosa, canola, lino, girasol, patata, tabaco, tomate, alfalfa, alamo, pino, eucalipto, manzana, lechuga, guisantes, lentejas, uva, hierbas forrajeras y Brassica sp.
- 10. El metodo de acuerdo con la reivindicacion 2, en el cual las posiciones aminoacldicas se seleccionan a partir del grupo constituido por Leu97, Alai03, Meti04, Argi05, Ser23, Seri79 y Leui22 en el gen EPSPS de Zea mays.
- 11. El metodo de acuerdo con la reivindicacion 2, en el cual las posiciones aminoacldicas se seleccionan a partir del grupo constituido por Leui69, Alai75, Meti76, Argi77, Ser94, Ser25i y Leui94 en el gen EPSPS de una Brassica napus.
- 12. El metodo de acuerdo con la reivindicacion 2, en el cual las posiciones aminoacldicas se seleccionan a partir del grupo constituido por Leui69, Alai75, Meti76, Argi77, Ser94, Ser25i y Leui94 en el gen EPSPS de Petunia hybrida.
- 13. Un metodo para producir una planta no transgenica que es resistente o tolerante a un herbicida de la familia de la fosfonometilglicina que comprende:(a) introducir en celulas vegetales una oligonucleobase recombinagenica con una mutacion dirigida en el gen271015EPSPS para producir celulas vegetales con un gen EPSPS mutante que expresa una protelna EPSPS que esta mutada en dos posiciones aminoacldicas, donde dichas posiciones se seleccionan a partir del grupo constituido por Thri78 y Pro182, en la protelna EPSPS de Arabidopsis o en un residuo aminoacldico analogo en un gen EPSPS de otra especie, donde Thr178 se cambia por Val o Leu y Pro182 se cambia a serina;(b) identificar una celula vegetal que tiene un crecimiento normal en comparacion con la celula vegetal natural correspondiente en presencia de glifosato; y(c) regenerar una planta no transgenica resistente o tolerante a herbicidas que tiene dicho gen EPSPS mutado a partir de dicha celula vegetal,donde la planta no transgenica resistente o tolerante a herbicidas muestra un crecimiento y un desarrollo normales en comparacion con las plantas naturales correspondientes, ydonde la enzima EPSPS mutada tiene la misma actividad catalltica en comparacion con la de la enzima natural.
- 14. El metodo de acuerdo con la reivindicacion 13, en el cual las posiciones aminoacldicas son Thr102 y Pro106 del gen EPSPS de Zea mays.
- 15. El metodo de acuerdo con la reivindicacion 13, en el cual las posiciones aminoacldicas son Thr174 y Pro178 del gen EPSPS de una Brassica napus.
- 16. El metodo de acuerdo con la reivindicacion 13, en el cual las posiciones aminoacldicas son Thr174 y Pro178 del gen EPSPS de Petunia hybrida.Secuencia de ADN:cccttcatgtcttttgtagaaaccccattatctttcttagggcccaattgaaaacccacattttctttcacctaacccaccaaagccttgcacatgttgacgtgaacaccaaactaacacgtgtcatactgccagtggttatgataaatgctcataccataccagagtcatagagtttttggttggtgaaagatttgacggatgccttcttctcatttctcaccaactccctccaaacccaacaaaatgtttatattagcaaagccgccaaagtgtaaacgaaagtttataaatttcatttctgtgatcttacgtaattggaggaagatcaaaattttcaatccccattcttcgattgcttcaattgaagtttctccg[inicio del peptido de transito]ATGGCGCAAGTTAGCAGAATCTGCAATGGTGTGCAGAACCCATCTCTTATCTCCAATCTCTCGAAATCCAGTCAACGCAAATCTCCCTTATCGGTTTCTCTGAAGACGCAGCAGCATCCACGAGCTTATCCGATTTCGTCGTCGTGGGGATTGAAGAAGAGTGGGATGACGTTAATTGGCTCTGAGCTTCGTCCTCTTAAGGTCATGTCTTCTGTTTCCACGGCGGAG[inicio del peptido maduro]AAAGCGTCGGAGATTGTACTTCAACCCATTAGAGAAATCTCCGGTCTTATTAAGCTTCCTGGCTCCAAGTCTCTATCAA ATCGGATCCTGCTTCTCGCTGCTCTGTCTGAGGTATATATCACTTCGTTTCGTCCTTCTCTGTAATCTGAACTTAGATT ATAAAGATTGATACTTTACCATTTTGCTGTGGTTTTATAGGGAACAACTGTAGTGGACAACTTGTTGAATAGCGATGAC ATCAATTACATGCTTGATGCGTTGAAGAGATTGGGACTTAATGTGGAAACTGACAGTGAAAATAATCGTGCTGTAGTTG AAGGATGTGGCGGGATATTCCCAGCTTCCATAGATTCAAAGAGTGATATCGAACTTTACCTCGGTAATGCAGGAACAGC AATGCGTCCACTTACCGCTGCGGTCACTGC7GCAGGTGGAAACGCAAGGTAGATTGAAGGAGTTGATGCTTCTTGGTAT TTGATGTTTAAGGAATGGAGCTTTTGTTGATGCTTTATGATCCATTTATTCCAGTTATGTGCTTGATGGGGTGCCTCGT ATGAGAGAAAGACCTATAGGGGATTTGGTTGTTGGTCTTAAGCAGCTTGGTGCTGATGTTGAATGTACTCTTGGAACTA ACTGCCCTCCTGTTCGTGTCAACGCTAATGGTGGCCTTCCCGGTGGAAAGGTTAGATCTTGCAAATGGCATGTGAATAT GTAATCTCGTTCCTTACTCTATGAACACTTGCAGAAATGTGTGTTCATCATAGCCTTAGCTTGACAAGATTTCAGTTTT TAATCTACTCTCAACGGATGGATCCTAAAATAGAATCGGATTTGGTGATTGGTTTTCGTTCTCGATTACCGTTTTCGTT GTATGATnCTTGATTAACAATTAGGAGACATGTTATGCATTTGCAGGTGAAGCTTTCTGGATCAATTAGTAGTCAGTA CTTGACTGCTCTGCTCATGTCTGCTCCCTTAGCTCTTGGAGACGTCGAGATTGAGATTGTCGATAAATTAATTTCTGTT CCATATGTTGAAATGACATTGAAGTTGATGGAACGTTTCGGGGTTAGTGTCGAGCATAGTGATAGCTGGGATCGTTTCT TTGTCAAGGGCGGGCAAAAATACAAGTAGGAGTTATTCTnTCTTCCTTTTCTGAAATCACATCCCTTAGCTTGACAAT ATAATGACTAAAAGGTGAATGATTCAGGTCTCCGGGTAATGCGTATGTAGAAGGTGATGCTTCTAGTGCATGTTATTTC TTGGCTGGTGCTGCCATTACCGGTGAAACTGTCACAGTCGAAGGTTGTGGAACTACCAGCTTGCAGGTAATATTTGTAC ACTGAATCATCGACGAGGCTGTTAAGTTTATAGTGAAATTCGTCTAGGTCAAAGTTTCATC7AAr.ATATTrnrAAOATTrTAAOrTrAATTTGACAAGT7G7A7A7nTTTC ATCA ATriTTACCC ac atct a a a ATT rnrrn acctc r-rrn ac a a----------- . . - - - - ---------------- -.........................• i \j i nnnn i i i v>v_r l l \j/~ujrv“\AA7GGGA7G7AAAG7G7CC7GGACAGAGAACAG7G7GAC7G7GACAGGACCACC7AGAGA7GC7TT7GGAA7GAGACACT7GCGGGC7AT7GA7G7CAACA7GAACAAAA7GCC7GA7G7AGCCA7GACCCT7GCCG7CGT7GC7C7C7T7GC7GACGG7CCAACCACCAT7AGAGA7GG7AAG7AAAAAGC7C7C7C77A7AAT7AAGGT7TC7CAA7A77CA7GA7CAC77AAT7C7GTT7GGT7AA7A7AG7GGC7AGC7GGAGAG7AAAGGAGACAGAAAGGA7GA77GCCATT7GCACAGAGCT7AGAAAAG7AAGAGA77CT7A7C7C7C7CT7TC7G7C7CT7GACAG7GC7CAT7C7AAG7AAT7AGC7CA7AAATT7G7G7GTT7G7GT7CAGC7GGGAGC7ACAG7GGAAGAAGGT7CAGAT7AT7G7G7GA7AAC7CCGCCCAAAAAGG7GAAAACGGCAGAGA77GA7ACA7A7GA7GA7CA7AGAA7GGCAA7GGCA77C7C7C77GCAGC77G7GC7GA7G77CCAA7CACCA7CAACGAC7C7GGT7GCACCAGGAAAACCT7CCCCGAC7ACT7CCAAG7ACT7GAAAGAA7CACAAAGCAC7AAacaataaactctgttttttcttctgatccaagcttFIG.1ASecuencia de la protefna;MAQVSRICNGVQNPSLISNLSKSSQRKSPLSVSLKTQQHPRAYPISSSWGLKKSGMTLIGSELRPLKVMSSVSTAE KASEIVLQPIREISGLIKLPGSKSLSNRILLLAALSEGTTVVDNLLNSDDINYMLDALKRLGLNVETDSENNRAW EGCGGIFPASIDSKSDIELYLGNAGIAMRELTAAVTAAGGNASYVLDGVPRMRERPIGDLVVGLKOLGADVECTLG TNCPPVRVNANGGLPGGKVKLSGSISSOYLTALLMSAPLALGDVEIEIVDKLISVPYVEMTLKLMERFGVSVEHSD SWDRFFVKGGQKYKSPGNAYVEGDASSACYFLAGAAITGETVTVEGCGTTSLQGDVKFAEVLEKMGCKVSWTENSV TVTGPPRDAFGMRHLRAIDVNMNKMPDVAMTLAVVALFADGPTTIRDVASWRVKETERMIAICTELRKLGATVEEG SDYCVITPPKKVKTAEIDTYDDHRMAMAFSLAACADVPITINDSGCTRKTFPDYFQVLERITKHFIG. 1 B
- Position
- Secuencia natural de Arabidopsis thaliana: 173 174 175 176 177 178 179 180 181 182 183 LG NAGTA MRPL CTC GGT AAT GCA GGA ACA GCA ATG CGT CCA CTT
- Nombre A177
- Secuencias mutantes de Arabidopsis thaliana: CTC GGT AAT GCA GCA ACA GCA ATG CGT CCA CTT LGNAATAMRPL
- *178
- CTC GGT AAT GCA GCA ATA GCA ATG CGT CCA CTT LGNAGIAMRPL
A1771178 CTC GGT GCA GCA ATA GCA ATG CGT CCA CTTLGNAAIAMRPL- I178S182
- CTC GGT AAT GCA GGA ATA GCA ATG CGT TCA CTT LGNAGIAMRSL
- A177s182
- CTC GGT AAT GCA GCA ACA GCA ATG CGT TCA CTT LGNAATAMRSL
A177I178S182 CTC GGT MT GCA GCA ATA GCA ATG CGT TCA CTT LGNAAIAMRSL- V178S182
- CTC GGT AAT GCA GGA GTA GCA ATG CGT TCA CTT LGNAGZAMRSL
- L178S182
- CTC GGT AAT GCA GGA TTA GCA ATG CGT TCA CTT LGNAGLAMRSL
- A177v178
- CTC GGT AAT GCA GCA GTA GCA ATG CGT CCA CTT LGNAAVAMRPL
- a177l178
- CTC GGT AAT GCA GCA TTA GCA ATG CGT CCA CTT LG NAAL AMR PL
- FIG.2
1020304050607080MjlAT^fifvuGTTAGCAGAATCTGCAATGGlt6TGCAGftACCCAT• - •CTCftATCTCCMTCTCTCGAAATCCAGlCAACGCAAATCTCC- ■ -CTTATCGG ADNcepspsat.SEQ1 ATffiCGCAATCTAGCAGMTCTGCCATGGCGTGCAGfliACCCATGTGTTATCATCTCCAATCTCTCCAAATCCAACCAAAACAMTCACC- • -TTTCTCCG ADNcepsbn.SEQ1 ATGGCACAAATTAACAACATGGCTCAAGGGATACAAACCCTTA- - -ATCCCAATTCCAATTTCCATAAACCCCAAGTTCCTAAATCTTCAAGTTTTCTTG ADNcaroapet.SEQ,•.«•••«•*••*•*•»»•••••*••••******************* iJLv(1 GCGG...............................mi. TTTrT^^rTr^flGflCGCAGCAGCATCCACGftGCTTATCCGATTTCGTCGTCGTGGGGATTG^AGftAGftGTGQGATGftCGnAATIGGCTCTGftGCTTCG ADNcepspsat.SEQM ™ SmcKAJCAGC---CTCGAQCTT..............................CTTCGTGGGGATTGAAGAAGAGTGGAACGATGCTAAACGGTTCTGTAATTCG ADNcepsbn.SEQ98 TTT^GGATCTAMAMCTGAAAAATTCAGCMATT..............................CTATGrTGGTTTTGAAWAAGATTCAATnT..............TATOmn™ ADNcaroapet.SEQ - 5 .......................................................................................................................................1201301401ST160"no"190190lg2 TCCTCTTAAGGrCATGTCTTCTGTTTCCACGGCGGAGAAAGCGTCGGAGATTGTACTTCAACCCATTAGAGAAATCTCCGGTCTTATTAAGCTTCCTGGC ADNcepspsat.SEQ 80 CCCffiTTAAGGTAACAGCTTCTGTTTCCACGTCCGAGAAAGCTTCAGAGATTGTGCTTCAACCAATCAGACAAATCTCGGGTCTCATTAAGCTACCCGGA ADNcepsbn.SEQ 180 TTCCTTTAGGATTTCAGCATCAGTGGCTACAGCACAGAAGCCTTCTGAGATAGTGTTGCAACCCATTAAAGAGATTTCAGGCACTGTTAAATTGCCTGGC ADNcaroapet.SEQM ...................................................AGATCGTGCTGCAGCCCATCAAGGAGATCTCCKaCACCGTCAAGCTGCCGGGG epspszm.SEQ220230240250290270280290-*nn 11 n 320 o3U ^^-----rir.„ Trr/iflCTrTCTATCAMTCGGATCCTCC'llCICGCTCCTCTG7CTGAGQGAACAACTGTAGTG6ACAA(XrGrTGAATAGCGAT6ACATCAATTACATGC ADNcepspsat.SEQ fm TCCAAATCTCTCtCCAATCGGATCCTCCnCTTGCCGCTCTATCTGAGGGAACTACTGTAGTGSACAACTTGTTGAACAGTGATGACATCAACTACATGC ADNcepsbn.SEQ pen TCTAAATCATTATCTAATAGAATTCTCCTTCTTGCTGCCTTATCTGAAGGAACAACTGTGGTTGACAAnTACTAAGTAGTGATGATATTCATTACATGC ADNcaroapet.SEQ 67 TCCAAGTMCTTTCCAACCGGATCCTCCTACTCGCCGCCCTGTCCGAGGGGACAACAGTGGTTGATAACCTGCTGAACAGTGAGGA'IGTCCACTACATGC epspszm.SEQ400 410 420 -tyv _________ZXZ---------------ziz.7r(^TGCGTTGAAGAGATfGG^CTTAAtGTGGAAACTGACAGTGAAAAtAATCGTGCTGTAG7TGAAGGATGTGGCGGGATATTCCCAGCTTCCATAGA ADNcepspsat.SEQ 380 TTGATGCGTTGAAGAAGCTMGCTTAACGTGGAACGTGACAGTGTAAACAACCGTGCGGTTGTTGAAGGATGCGGTGGAATATTCCCAGCTTCCTTAGA ADNcepsbn.SEQ 380 TTGGTGCC7TGAAAACACTTGGACTGCATGTAGAAGAAGATAGTGCAAACCAACGAGCTGTTGTTGAAGGTTGTGGTGGGCTTTTCCCTGTTGGTAAAGA ADNcaroapet.SEQ 167 Tt^GQCCTTGAQGACTCTTGGTCTCTCTGTCGAAGCGGACAAAGCTGCCAAAAGAGCTGiTAGTTCTTGGCTGTGGTGGAAAGTTCCCAGTTG- - -AGGA epspszm.SEQFIG.3A4304404504904704804$0COCO______525______512______522______5J2______522______552______552______5Z2______580 590492 ^tcamgagtgatatcgaactttacctcggtaatgcaggaacagcmtgcgtccacttaccgctgcggtcactgctgcaggtggaaacgcmgttatgtg480 TrCCAAGAGTGATAnGAGnGTACCnGGGAATGCAGGAACAGCCATGCGTCCACTCACCGCTGCAGTTACAGCTGCAGGTGGCAACGCGAGnATGTA 480 GTCCAAGGAAGAAATTCAACTGTTCCTTGGAAATGCAGGAACAGCAATGCGGCCACTAACAGCAGCAGTTACTGTAGCTGGTGGAAATTCAAGGTATGTA 264 TGCTAAAGAGGAAGrGCAGCTCTTCTTGGGGAATGCTGGAACTGCAATGCGGCCATrGACAGCAGCTGTTACTGCTGCTGGTGGAAATGCAACTTACGTGADNcepspsat.SEQADNcepsbn.SEQADNcaroapet.SEQepspszm.SEQ62° 6i° 6?° 630 640 650 660 67T 680 690592 CTTGATGGGGTGCCTCGTATGAGAGAAAGACCTATAGGGGA'nTGGTTGTTGGTCTTAAGCAGCTTGGTGCTGATGTTGAATGTACTCTTGGAACTAACT 580 CTTGATGGGGTGCCTAGAATGAGGGAAAGACCTATAGGAGATTTGGTTGTTGGTCTTAAGCAGCTTGGTGCTGATGTTGAGTGTACTCTTGGCACTAACT 580 CTTGATCGAGTTCCTCGAATGAGAGAGAGACCAATTAGTGATTTGGTTGATGGTCTTAAACAGCTTGGTGCAGAGGTTGATTGTTTCCTTGGTACGAAAT 364 CTTGATGGAGTACCAAGAATGAGGGAGAGACCCATTGGCGACTTGGTTGTCGGATTGAAGCAGCTrGGrrGCAGATGTrGATTGTTTCCTTGGCACTGACTADNcepspsat.SEQADNcepsbn.SEQADNcaroapet.SEQepspszm.SEQ72° 710 720 730 740 750 760 ~Tl0 780 790692 GCCCTCCTGTTCGTGTCAACGCTAATGGTGGCCTTCCCGGTGGAAAGGTGAAGCTTTCTGGATCAATTAGTAGTCAGTACTTGACTGCTCTGCTCATGTC680 gtcctcctgttcgtgtcaatgctaatggtggccttcccggtggaaaggtgaagctttctggatcgatcagtagtcagtacttgactgccctcctcatggc 680 gtcctcctgttcgaattgtcagcaagggaggtcttcctggagggaaggtcaagctctctggatccattagcagccaatacttgactgctctgcttatggc 464 gcccacctgttcgtgtcaatggaatcggagggctacctggtggcaaggtcaagctgtctggctccatcagcagtcagtacttgagtgccttgctgatggcADNcepspsat.SEQADNcepsbn.SEQADNcaroapet.SEQepspszm.SEQ800 810 820 830 840 850 860 IttO 880 155792 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AATGACCCTGGCTGCACGCGGAAAACCTTCCCTAACTACTTTGATGTACTTCAGCAGTACTCCAAGGATTGA 1264 CGGGACCCTGGGTGCACCCGGAAGACCTTCCCCGACTACTTCGATGTGCTGAGCACTTTCGTCAAGAATTAAFIG.3CADNcepspsat.SEQADNcepsbn.SEQADNcaroapet.SEQepspszm.SEQCOcn
- io s 26 ■ ■.... i----XA-- <----
- 30 _____1____ 40 Y 50 _____1____ 60 m. * 80 90 100
1 MAQVSRICNGVQNP• SLISNLSKSSQRKSPLSVSLICTTPIPRAYPISSSWGLXKSGKniGSELR..........PLKVMSSVSTAEKASEIVLQPIREISGLIKLPGSKSLSN epspsat.SEQ1 MAQSSRICHGVQNPCVTISNLSKSNQNKSPFSVSUCTHQ........PRASSWGLKKSGTHLNGSVIR...........PVKVTASVSTSEKASEIVLQPIREISGLIKLPGSKSLSN epspsbn SEQ1 MAQINNMAQGIQTL• NPNSNFHKPQVPKSSSFLVFGSKK........LKNSA..........NSMLVLXKDSIFMQKFCSFRISASVATAQKPSEIVLQPIKEISGTVKLP6SKSLSN aroapet.SEQ1 AG.....................................................................................................................................................................AEEIVLCPIKEISGFVKLPGSKSLSN epspszm.SEQUO 120 130 140 150 160 170 180 190 200 210104 RILLLAALSEGTTVVt^LLNSDDINYMLDALKRLQilVETDSENNRAVVEGCGGIFPASIDSKSDIELYLGNAGTAHRPLTMVTAAGGNASYVLDGVPRMRERPiaJLVepspsat.SEQ 100 RILiLAALSEGTTVVDNLLNSDDINYMLDALKKLGLNVERDSVNNRAVVEGCGGIFPASLDSKSDIELYLGNAGTAMRPLTMVTAAGGNASYVLDGVPRMRERPIGDLV epspsbn.SEQ 100 RILLLAALSEGTTVVDNLLSSDDIHYMLGALKTLGLHVEEDSANQRAVVEGCGGLFPVGKESKEEIQLfLGNAGTAMRPLTMVTVAGGNSRYVLDGVPRMRERPISDLV aroapet SEQ 29 RILLLAALSEGTTVVDNLLNSEDVHYMLGALRTLGLSVEADKAAKRAVWGCGGKFPV-EDAKEEVQLFLGNAGTANRPLTAAVTAAGGNATYVLDGVPRMRERPIGDLV epspszm.SEQ220 230 240 250 260 270 280 290 300 310 320214 VGLKQLI^VECTLGTNCPPVRVNANffiLPGGKVKL^ISSQYLTALIJISAPULfflVEIEIVDKLISVPYVEMrUCLWERFGVSVEHSDSWDRFFVKGGQKYKSPGNA epspsat.SEQ 210 VGLKQLGADVECTLGTNCPPVRVNANGGLPGGKVKLSGSISSQYLTALLMAAPULGDVEIEIIDKLISVPYVEMTLmiERFGVSAEHSDSWDRFFVKGGQKYKSPGNAepspsbn.SEQ 210 DGLKQLGAEVDCFLGTKCPPVRIVSKGGLPGGKVKLSGSISSQYLTALLHAAPLALGDVEIEIIDKLISVPYVEKTLKLMERFGISVEHSSSWDRFFVRGGQKYKSPGKA aroapet SEQ 138 VGLKQLGADVDCFLGTDCPPVRVNGIGGLPGQCVKLSGSISSQYLSALLMAAPLALGDVEIEIIDKLISIPYVEKTLRLHERFGVKAEHSDSWDRFYIKQQCKYKSPKNA epspszm SEQ330 340 350 360 370 380 390 400 410 420 430~324 YVEGDASSACYFUGAAITGETVTVEGCGnSLQ(I)VKFAEVLEKH(kKVSl^NS\n7TGPPRDAFGMR}1LRAIDVNMNl<HPDVAKrLA\/\/ALFADGPniRDVASWRV epspsat.SEQ 320 YVEGDASSASYFLAGAAITGETVTVEGCGTTSLQGDVKFAEVLEKHGCKVSWTENSVTVTGPSRDAFGMRHLRAVDVNMNKMPDVAMTLAVVALFADGPTTIRDVASWRV epspsbn SEQ 320 FVEGDASSASYFLAGAAVrGGTITVEGCGTNSLQGDVKFAEVLEKHGAE\nWTENSVTVKGPPRSSSGRKHLRAIDVNMNKMPDVAMTLAWALYADGPTAIRDVASWRV aroapet.SEQ 248 YVEGDASSASYFU\GAAITGGlVll/EGCGnSLCH)VKFAEVl£MMGAKVTWTETSVTVTGPPREPFGRKRJ<AIDVNMNI<MPDVAKTLAVVALFADGPTAIRDVASWRV epspszm.SEQ440 450 460 470 480 490 500 510 520434 KETERMiAICTELPKLGATVEEGSDYCVITPPKKVICrAEIDTYDl^RMAHAFSLAACADVPITINDSGCTWG'FPDYFQVLERITKH 430 KETERMIAICTELRKLGATVEEGSDYCVITPPAKVKPAEIDTYDDHRMAMAFSLAACADVPVTIKDPGCTRICTFPDYFQVLfSITKH 430 KETERHIAICTELRKLGATVEEGPDYCIITPPEKLUVTDIDTYDDHRHAMAFSLAACADVPVTINDPGCTRKTFPNYFDVLQQYSKH 358 KETERMVAIRTELTKLGASVEEGPDYCIITPPEKLNVTAIDTYDDHRHAMAFSLAACAEVPVTIRDPGCTRKTFPDYFDVLSTFVKNFIG.4epspsat.SEQepspsbn.SEQaroapet.SEQepspszm.SEQNombre del oligo Secuencia del oligo (5'y3')ateps-a177CGTTT CCACC TGCAGCAGTGAC CGCAGCGGTAAGTGGACGCATTGCTGTTGC TGC ATTAC C6AG ATEPS-AICGTTT CCACCJGCAGCAGT G ACCGCAGCGGT AAGT GG ACGC ATTGCTATTGC T GCATT ACCGAG ATEPS-ISCGTTT CCACCTGCAGC AGTGAC CGCAGCGGT AAGTGAACGC ATTGCTATT CCTGC ATT AC CGAG ATEPS-ASCGTTT CC ACCTGCAGCAGT GACCGCAGCGGT AAGTGAACGC ATTGCT GTTGCTGCATT ACCGAG ATEPS-AISCGTTTCCACCTGCAGCAGTGACCGCAGCGGTAAGTGAACGCATTGCTATTGCTGCATTACCGAG ATEPS-I177CGTTTCCACCTGCAGCAGTGACCGCAGCGGTAAGTGGACGCATTGCTGTTATTGCATTACCGAG ATEPS-VSCGTTTCCACCIGCAGCAGTGACCGCAGCGGTAAGTGAACGCATTGCTACTCCTGCATTACCGAGATEPS-L5CGTTTCCACCTGCAGCAGTGACCGCAGCGGTAAGTGAACGCATTGCTAATCCTGCATTACCGAGATEPS-AVCGTTTCCACCTGCAGCAGTGACCGCAGCGGTAAGTGGACGCATTGCTACTGCTGCATTACCGAGATEPS-ALCGTTT CCACCTGCAGCAGTGACCGCAGCGGTAAGTGGACGCATTGCTAATGCTGCATTACCGAGFIG.5imagen1 BacillusClones de ArabidopsisAS WT( 1 !--------\L E L ESalmonellai \L Eimagen2 FIG.7
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