JP2003507059A

JP2003507059A - アルカリバチルスアミラーゼ

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Publication number: JP2003507059A
Application number: JP2001518846A
Authority: JP
Inventors: オットルプ，ヘレ; レンフェルトニールセン，ビヤルネ; ヘデガートフェック，リスベト; トエーネアンデルセン，イェンス
Original assignee: ノボザイムスアクティーゼルスカブ
Priority date: 1999-08-20
Filing date: 2000-08-21
Publication date: 2003-02-25
Anticipated expiration: 2020-08-21
Also published as: AU6686200A; DK1212409T3; DE60033945D1; JP4741128B2; WO2001014532A2; WO2001014532A3; EP1212409B1; DE60033945T2; CN1240832C; EP1212409A2; ATE356868T1; CN1399676A

Abstract

(57)【要約】本発明は、低温でアルカリ性洗浄剤溶液において改良された洗浄性能を有するアミラーゼに関する。より特定には、本発明はアルカリ性溶液、特に9−11のpHでのアルカリ性洗浄剤溶液において改良された性能を有する、バチルスsp. からのα−アミラーゼを提供する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】発明の分野：本発明は、低温でアルカリ洗浄溶液において改良された洗浄性能を有するアミ
ラーゼに関する。

【０００２】発明の背景：長年、α−アミラーゼ酵素は、種々の異なった目的、最も重要なことは、澱粉
液化、織物糊抜き、製紙及びパルプ産業における澱粉変性、及び醸造及びベーキ
ングのために使用されて来た。ますます重要になって来ているα−アミラーゼの
さらなる使用は、アルカリ性pHでの洗浄剤による洗浄の間、澱粉染色の除去であ
る。

【０００３】市販のα−アミラーゼ製品の例は、Novo Nordisk A/S, Denmarkから入手でき
る、Termamyl（商標）, BAN（商標）及びFungamyl（商標）である。他の市販
源からのそれらの及び類似する製品は、典型的には、pH5〜pH7.5の範囲で、酸性
〜中性pH最適性を有し、そしてそれらは、アルカリ性pHでの洗浄剤溶液において
最適活性を示さない。 WO95/26397号は、pH8で最適活性を有する、バチルス株からのα−アミラーゼ
を開示する。WO96/23873号は、洗浄条件下で改良された性能を有するバチルス変
異体アミラーゼを記載する。

【０００４】アメリカ特許第5,147,796号は、α−アミラーゼ活性を有するアルカリプルラ
ナーゼを記載する。この特許の図2bは、pH8−8.5での最適アミラーゼ活性を示す
。 M. Takagiなど., J. Ferment. Bioeng. Vol82, No.6, 557-559 (1996)は、バ
チルスsp.からの親アルカリ性α−アミラーゼ−プルラナーゼを記載する。この
酵素は、pH9で最適アミラーゼ活性を有するが、しかしその活性はより高いpHで
急速に低下し、そしてpH10での活性はpH7での活性よりも低い。アルカリ性溶液、特に９〜11近くのpHでのアルカリ性洗浄剤溶液において改良
された性能を有する新規α−アミラーゼを供給することが本発明の目的である。

【０００５】発明の要約：本発明は、ａ）バチルスsp. NCIMB40916により生成されるポリペプチド、又はｂ）配列番号２の位置１−556に示されるようなアミノ酸配列に有するポリペ
プチド、又はｃ）エスシェリシア・コリDSM13001 (NN049489) に存在するプラスミド中にク
ローン化されたDNA配列のα−アミラーゼコード部分によりコードされるポリペ
プチド、又はｄ）i）前記（ａ）又は（ｂ）に定義されるポリペプチドと少なくとも60％相
同性であるか、又は ii) １又は複数のアミノ酸の置換、欠失及び/又は挿入により前記ポリペ
プチド起因する、前記ポリペプチドの類似体であるα−アミラーゼを提供する。

【０００６】もう１つの観点においては、本発明は、１又は複数の次の特徴を有するα−ア
ミラーゼを提供する：・37℃で測定される場合、pH7.3での活性よりも少なくとも２倍高い、pH10.5
での活性；・37℃で測定される場合、pH7.3での活性よりも少なくとも４倍高い、pH9.5で
の活性；・37℃で測定される場合、約9.5の最適pH；

【０００７】・20％のSTPP、25％のNa₂SO₄、15％のNa₂CO₃、20％のLAS、5％のC₁₂−C₁₅アル
コールエトキシレート、5％のNa₂Si₂O₅、0.3％のNaClを含む、3g/lの試験洗浄剤
の溶液におけるpH10.5で25℃での20分間のインキュベーションの後、その活性の
90％以上を保持し、そして同じ溶液における30℃での20分間のインキュベーショ
ンの後、その活性の90％以下を保持するするような熱安定性；・SDS−PAGEにより決定される場合、約55kDaの分子量；・等電点電気泳動により決定される場合、約５の等電点。

【０００８】本発明はまた、α−アミラーゼをコードする単離されDNA配列を提供し、ここ
で前記α−アミラーゼは上記に記載されるα−アミラーゼであり、又は前記DNA
配列は、ａ）配列番号１の位置94−1764に示されているDNA配列、又はｂ）i)前記DNAと少なくとも60％相同であり、又は ii)少なくとも55℃で前記DNA配列とハイブリダイズする、ａ）において定
義されたDNAの類似体を含んで成る。

【０００９】本発明の他の観点は、前記DNA配列を含んで成る組換え発現ベクター、及び前
記DNA配列又は組換え発現ベクターにより形質転換された細胞を提供する。本発明はまた、前記細胞、及び前記α−アミラーゼを含んで成る洗浄剤組成物
を培養することによってα−アミラーゼを生成するための方法を提供する。

【００１０】発明の特定の記載：微生物源：本発明のα−アミラーゼは、バチルスの株に由来することができる。好ましい
株は、バチルスsp. NCIMB40916である。この株は、National Collection of Ind
ustrial and Marine Bacteria (NCIMB), 23St. Machar Drive, Aberdeen AB2 1R
Y, Scotland, United Kingdomに、特許手続の目的のための微生物の寄託の国際
的承認に基づくブダペスト条約下で発明者により、1998年１月28日に寄託された
。プラスミドpJA386においてクローン化された配列番号１で示されるα−アミラ
ーゼ遺伝子を含むNN049489と称するE.コリ株はまた、Deutshe Sammmlung von Mi
croorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ), Mascheroder Weg 1b, D-38124
Braunschweig DEに、ブダペスト条約下で、1999年8月７日に寄託され、そして受
託番号DSM13001が付与された。

【００１１】 α−アミラーゼの生成：本発明のα−アミラーゼは、適切な栄養培地において、バチルスの適切なアミ
ラーゼ生成株又は本発明の形質転換された宿主細胞を培養し、そして前記培養培
地からα−アミラーゼを回収することによって生成され得る。細胞を培養するために使用される培地は、問題の宿主細胞を増殖し、そして本
発明のα−アミラーゼの発現を得るために適切ないずれかの従来の培地であり得
る。適切な培地は、市販されており、又は公開されているレセピー（例えば、Am
erican Type Culture Collection のカタログに記載されるような）に従って調
製され得る。

【００１２】宿主細胞から分泌されるα−アミラーゼは、遠心分離又は濾過により培地から
細胞を分離し、そして塩、例えば硫酸アンモニウムによりタンパク質成分を沈殿
し、続いてクロマトグラフィー方法、例えばイオン交換クロマトグラフィー、親
和性クロマトグラフィー又は同様のものを用いることを包含する良く知られてい
る方法により培養培地から回収され得る。

【００１３】 α−アミラーゼの性質：好ましいα−アミラーゼは、バチルスsp. NCIMB40916に由来する。それは、実
施例に記載のようにして生成され得る。アミラーゼの十分な長さのアミノ酸配列
及びそれをコードするDNAは、配列番号１及び２で示される。次の特徴が、本発
明のアミラーゼ（NCIMB40916からの精製されたα−アミラーゼ）について見出さ
れた： Novex、すなわち４−25％のグラジエントゲルを用いて、SDS−PAGEにより決定
される場合、約55kDaの分子量。約５のpIが，等電点電気泳動（Ampholine PAG, pH3.5-9.5）により決定された
。

【００１４】 pH−活性曲線が図１に示され、ここでpH7.3での活性が100％として取られる。
それは、特に種々のpH値に調節された50mMのBritten−Robinson緩衝液を用いて
のPhadebesアッセイを用いて決定された。参照のために、２種の従来技術のバチ
ルスアミラーゼ（B.リケニホルミス由来のTermamyl，及びWO95/26397号に従って
生成されたSP722）のpHプロフィールが、同じ条件下で測定され、そしてまた図
１に示される。図１は、本発明のアミラーゼがpH9.5で２種の従来のアミラーゼ
よりも約10倍高い活性を有することを示す。図１はまた、最適活性が約pH9.5で
あることを示す。

【００１５】温度−活性曲線が、pH9.5に調節された50mMのBritten−Robinson緩衝液により
種々の温度でPhadebasアッセイを用いて測定された。その結果は、図２に示され
る。本発明のアミラーゼが約55℃で最適活性を有することが、図２から見出され
る。アミラーゼの安定性が、30分のインキュベーションの後、22, 37, 45, 55及び
65℃でpH10.5（50mMのCAPS）で測定された。酵素が緩衝液において40NU/mlに希
釈され、そして25mlのサンプルがそれぞれの温度でインキュベートされた。30分
後、サンプルが氷上で急冷され、そして残留活性が決定された。本発明のアミラ
ーゼ及び従来技術のアミラーゼ（SP722）の安定性プロフィールが図３に示され
る。

【００１６】安定性が、pH10.5及び６°dH (German硬度、Ca：Mg＝２：１)での3g/lの上記A
/Pモデル洗浄剤の溶液において、40NU/mlのアミラーゼをインキュベートするこ
とによって試験された。インキュベーションの後、残留活性がpH7.3でPhadebas
により測定された。その結果は、25℃でのインキュベーションの後、95％の残留
活性であり、そして30℃で87％の残留活性であった。

【００１７】ポリペプチド及びDNA配列の相同性：アミノ酸配列相同性が、第２配列からの第１配列の相違を示す２種の配列間の
同一性の程度として決定され得る。相同性は、当業界において知られているコン
ピュータープログラムにより適切に決定され得る。従って、GCGバーション８で
提供されるFASTA（Needleman, S. B. and Wunsch, C. D., (1970), Journal of
Molecular Biology, 48, 443-453）が次の設定により使用され得る：Scoringマ
トリックス：GenRunData：Blosum 50. cmp, 使用される種々のPamfactor, Gap
創造ペナルティー：12、Gap延長ペナルティー：２。

【００１８】アミノ酸配列は、配列番号２の位置１−556に示されるアミン酸配列と、少な
くとも60％、好ましくは少なくとも70％、より好ましくは少なくとも80％、特に
少なくとも90％又は少なくとも95％、さらにより特定には少なくとも97％又は少
なくとも99％の同一性の程度を示す。 DNA配列相同性は、第２配列からの第１配列の派生を示す２種の配列間の同一
性の程度として決定され得る。相同性は、当業界において知られているコンピュ
ータープログラム、例えばGDGプログラムパッケージで供給されるGAPにより適切
には決定され得る（上記に記載される）。従って、Gap GCGv8は、次のデフォー
ルトパラメーターにより使用され得る：5.0のGAP創造ペナルティー、及び3.0のG
AP延長ペナルティー。GAPは、一列整列を製造するためにNeedleman/Wunsch/Sell
ersの方法を使用する。

【００１９】本発明のDNA構造体は、配列番号１の位置94−1764に示される核酸配列と、少
なくとも60％、好ましくは少なくとも70％、より好ましくは少なくとも80％、特
に少なくとも90％又は少なくとも95％、さらにより特定には少なくとも97％又は
少なくとも99％の同一性の程度を示すDNA配列を含んで成る。

【００２０】ハイブリダイゼーション：ハイブリダイゼーションは、所定のDNA配列が配列番号１に対応するヌクレオ
チドプローブに類似することを示すために使用される。ハイブリダイゼーション
条件は、下記に詳細に記載される。

【００２１】ヌクレオチドプローブと相同DNA又はRNA配列との間のハイブリダイゼーション
を決定するために適切な条件は、５×SSC（標準の塩水クエン酸塩）においてハ
イブリダイズするためにDNAフラグメント又はRNAを含むフィルターの10分間のプ
レソーキング、及び５×SSC（Sambrookなど., 1989）、５×Denhardt’s溶液（S
ambrookなど., 1989）、0.5％のSDS及び100μg/mlの変性され、音波処理された
サケ精子DNA（Sambrookなど., 1989）の溶液におけるフィルターのプレハイブリ
ダイゼーション、続いて、ランダムに感作された（Feinberg, A. P. and Vogels
tcin, B. (1983) Anal. Biochem. 132:6-13）、³²P−dCTP−ラベルされた（比活
性＞１×10⁹cpm/μg）プローブを含む同じ溶液における約45℃での12時間のハイ
ブリダイゼーションを包含する。

【００２２】次に、フィルターは、２×SSC、0.5％SDSにおいて、少なくとも55℃、より好
ましくは少なくとも60℃、より好ましくは少なくとも65℃、さらにより好ましく
は少なくとも70℃、特に少なくとも75℃で、30分間、２度洗浄される。オリゴヌクレオチドプローブがそれらの条件下でハイブリダイズする分子は、
x−線フィルターを用いて検出される。

【００２３】組換え発現ベクター：本発明の発現ベクターは典型的には、プロモーター、オペレーター、リボソー
ム結合部位、翻訳開始シグナル、及び任意には、リプレッサー遺伝子又は種々の
活性化因子遺伝子をコードする制御配列を包含する。本発明のα−アミラーゼをコードするDNA配列を担持する組換え発現ベクター
は、組換えDNA方法に便利にはゆだねられ得るいずれかのベクターであり得、そ
してそのベクターの選択はしばしば、それが導入される宿主細胞に依存する。従
って、ベクターは、自律的に複製するベクター、すなわちその複製が染色体複製
に無関係である、染色体実在物として存在するベクター、例えばプラスミド、バ
クテリオファージ又は染色体外要素、ミニクロモソーム又は人工染色体であり得
る。他方では、ベクターは、宿主細胞中に導入される場合、宿主細胞ゲノム中に
組み込まれ、そしてそれが組み込まれた染色体と共に複製されるベクターであり
得る。

【００２４】ベクターにおいては、DNA配列は適切なプロモーター配列に操作可能的に結合
されるべきである。プロモーターは、選択の宿主細胞において転写活性を示すい
ずれかのDNA配列であり得、そして宿主細胞に対して相同であるか又は異種であ
るタンパク質をコードする遺伝子に由来することができる。特に細菌宿主におい
て本発明のα−アミラーゼをコードするDNA配列の転写を方向づけるための適切
なプロモーターの例は、E.コリのlacオペロンのプロモーター、ストレプトミセ
ス・コエリカラーアガラーゼ遺伝子dagAプロモーター、バチルス・リケニホル
ミスα−アミラーゼ遺伝子（amyL）のプロモーター、バチルス・ステアロサーモ
フィラスアミラーゼ遺伝子（amyM）のプロモーター、バチルス・アミロリケフ
ァシエス α−アミラーゼ（amyQ）のプロモーター、バチルス・サズチリスxylA
及びxylB遺伝子のプロモーター、等である。

【００２５】菌類宿主における転写に関しては、有用なプロモーターの例は、A.オリザエTA
KAアミラーゼ、リゾムコル・ミエヘイアスパラギン酸プロティナーゼ、A.ニガー
中性α−アミラーゼ、A.ニガー酸安定性α−アミラーゼ、A.ニガーグルコアミラ
ーゼ、リゾムコル・ミエヘイリパーゼ、A.オリザエアルカリプロテアーゼ、A.オ
リザエトリオスリン酸イソメラーゼ、又はA.ニジュランスアセトアミダーゼ
をコードする遺伝子に由来するそれらのプロモーターである。

【００２６】本発明の発現ベクターはまた、適切な転写ターミネーター及び真核生物におい
ては、本発明のα−アミラーゼをコードするDNA配列に操作可能的に連結された
ポリアデニル化配列を含んで成る。終結及びポリアデニル化配列は、適切にはプ
ロモーターと同じ源に由来することができる。ベクターはさらに、問題の宿主細胞におけるベクターの複製を可能にするDNA
配列を含んで成る。そのような配列の例は、プラスミドpUC19，pACYC177，pUB11
0, pE194, pAMB1及びpIJ702の複製の起点である。

【００２７】ベクターはまた、選択マーカー、例えばその生成物が宿主細胞のおける欠陥を
補足する遺伝子、例えばB．サズチリス又はB.リケニホルミスからのdal遺伝子、
又は抗生物質耐性、例えばアンピシリン、カナマイシン、クロラムフェニコール
又はテトラサイクリン耐性を付与する遺伝子を含んで成る。さらに、ベクターは
、アスペルギラス選択マーカー、例えばamdS, argB, niaD及びsC、ヒグロマイ
シン耐性を生ぜしめるマーカーを含んで成ることができ、又はその選択は、例え
ばWO91/17243号に記載されるように、同時形質転換により達成され得る。

【００２８】細胞内発現はいくつかの観点において好都合であるが、例えば宿主細胞として
ある細胞を用いる場合、一般的に、発現は細胞外であることが好ましい。 α−アミラーゼをコードし、そしてそれぞれ、プロモーター、ターミネーター
及び他の要素を含む本発明のベクターを構成するために適切な方法は、当業者［
例えば、Sambrookなど., (1989)］に良く知られている。

【００２９】宿主細胞： DNA構造体又は上記で定義されたような本発明の発現ベクターのいずれかを含
んで成る本発明の細胞は、好都合には、本発明のα−アミラーゼの組換え生成に
おいて宿主細胞として使用される。細胞は、便利には、宿主染色体にDNA構造体
（１又は複数のコピーにおいて）を組み込むことによって、アミラーゼをコード
する本発明のDNA構造体により形質転換され得る。この組み込みは一般的に、DNA
配列がたぶん、細胞において安定して維持されるので、好都合であると思われる
。宿主染色体へのDNA構造体の組み込みは、従来の方法に従って、例えば相同又
は異種組換えにより行われ得る。他方では、細胞は、異なった型の宿主細胞に関
して上記に記載のようにして発現ベクターにより形質転換され得る。

【００３０】本発明の細胞は、高等生物、例えば哺乳類又は昆虫の細胞であり得るが、しか
し好ましくは、微生物細胞、例えば細菌又は菌類（例えば、酵母）細胞である。培養に基づいて、本発明の酵素を生成することができる細菌宿主細胞の例は、
次のものである；グラムー陽性細菌、例えばバチルス(Bacillus) 株、例えば、B
.サブチリス(B. subcili)、B.リケニホルミス(B. licheniformis)、B.レンタン(
B. lentus)、B.クラウジ(B. clausii)、B.ブレビス(B. brevis)、B.ステアロサ
ーモフィラス(B. stearotheromophilus)、B.アルカロフィラス(B. alkalophilus
)、B.アミロリケファシエンス(B. amyloliquefaciens)、B.コアギランス(B. coa
qulans)、B.シルキュランス(B. circulans)、B.ラウタス(B. lautus)、B.メガテ
リウム(B. megaterium)、又はB.スリンジエンシス(B. thuringiensis)の株、又
はストレプトミセス(Streptomyses)、例えばS.リビダンス(S. lividans)又はS.
ムリナス(S. murinus)の株、又はグラムー陰性細胞、例えばE.コリ。細菌の形質
転換は、プロトプラスト形質転換、エレクトロポレーション、接合により、又は
それ自体既知の態様（例えば、Sambrookなど.,前記）でコンピテント細胞を用い
てもたらされ得る。

【００３１】酵母生物は好ましくは、サッカロミセス又はシゾサッカロミセスの種、例えば
サッカロミセス・セレビシアエから選択され得る。糸状菌は好都合には、アスペ
ルギラスの種、例えばアスペルギラス・オリザエ又はアスペルギラス・ニガーに
属する。細菌細胞は、プロトプラスト形成及びプロトプラストの形質転換、それ
自体既知の態様での細胞壁の続く再生を包含する工程により形質転換され得る。
アスペルギラス宿主細胞の形質転換のための適切な方法は、ヨーロッパ特許第23
8023号に記載される。

【００３２】産業上の用途：アルカリpH値でのそれらの活性のために、本発明のα−アミラーゼは、種々の
産業上の工程への使用のために十分に適切であり、特に前記酵素は洗浄剤、例え
ば洗濯及び硬質表面清浄洗剤組成物における成分として使用されるが、しかしそ
れはまた、澱粉からの甘味剤及びエタノールの生成においても有用である。従っ
て、それは、従来の澱粉転換工程、例えばアメリカ特許第3,912,590号及びヨー
ロッパ特許公開第252,730号及び第63,909号に記載される液化及び糖化工程にお
いて使用され得る。

【００３３】本発明のアルカリα−アミラーゼはまた、特に再パルプ化が７以上のpHで生じ
、そしてアミラーゼが強化澱粉の分解を通して廃棄材料の砕解を促進できる場合
、澱粉強化された故紙及び厚紙からのリグノセルロース材料、例えばパルプ、紙
及び厚紙の製造にも使用され得る。本発明のα−アミラーゼは、澱粉被覆された
印刷紙から紙製造用パルプを製造するための工程において特に有用である。前記
方法は、WO95/14807号に記載のようにして行われ得、ここで前記方法は、ａ）パルプを製造するために紙を砕解し、ｂ）段階ａ）の前、その間又はその後、澱粉―分解酵素により処理し、そしてｃ）段階ａ）及びｂ）の後、パルプからインキ粒子を分離する段階を含んで成
る。

【００３４】本発明のα−アミラーゼはまた、酵素的に変性された澱粉がアルカリ性充填剤
、例えば炭酸カルシウム、カオリン及びクレーと共に紙製造において使用される
場合、澱粉の変性において非常に有用である。本発明のアルカリα−アミラーゼ
により、充填剤の存在下で澱粉を変性し、従ってより単純な統合された工程を可
能にすることが可能になる。

【００３５】本発明のα−アミラーゼはまた、織物糊抜きにおいて非常に有用である。織物
加工産業においては、α−アミラーゼは、製織の間、よこ糸上で保護被膜として
作用している澱粉含有糊剤の除去を促進するために糊抜き工程において助剤とし
て従来使用される。製織の後、糊剤被膜の完全な除去は、布が精練され、漂白さ
れ、そして染色される続く工程において最適な結果を確保するために重要である
。酵素による澱粉の分解は、それが繊維材料に対するいずれの有害な効果も包含
しないので、好ましい。加工費用を低め、そしてミル処理量を高めるために、糊
抜き工程は時々、精練及び漂白段階を組合される。

【００３６】そのような場合、非酵素助剤、例えばアルカリ又は酸化剤は、従来のα−アミ
ラーゼが高いpHレベル及び漂白剤と非常に適合できないので、典型的には、澱粉
を分解するために使用される。澱粉サイズの非酵素分解は、使用されるかなりの
凝集化学薬品のために、いくらかの繊維損傷を導く。従って、本発明のα−アミ
ラーゼはアルカリ性溶液において改良された性能を有するので、それらのα−ア
ミラーゼを使用することが所望される。α−アミラーゼは、セルロース含有布又
は織物を糊抜きする場合、単独で又はセルラーゼと組合して使用され得る。本発明のα−アミラーゼはまた、ビール製造工程において非常に有用であり；
そのα−アミラーゼは典型的には、すり潰す工程の間に添加されるであろう。

【００３７】洗浄剤組成物：本発明によれば、α−アミラーゼは典型的には、洗浄剤組成物、例えば洗濯洗
浄剤組成物の成分でのあり得る。それは、非ダスチング粒状物、安定化された液
体又は保護された酵素の形で洗浄剤組成物に含まれ得る。非タスチング粒状物は
、例えばアメリカ特許第4,106,991号及び第4,661,452号（両者とも、Novo Indus
tri A/Sからの）に開示されるようにして生成され得、そして任意には、当業界
において知られている方法により被覆され得る。

【００３８】蝋質被膜材料の例は、1000〜20000の平均分子量を有するポリ（酸化エチレン
）生成物（ポリエチレングリコール、PEG）；16〜50個の酸化エチレン単位を有
するエトキシル化されたノニルフェノール；アルコールが12〜20個の炭素原子を
含み、そして15〜80個の酸化エチレン単位が存在するエトキシルされた脂肪アル
コール；脂肪アルコール；脂肪酸；及び脂肪酸のモノ−、ジ−及びトリ−グリセ
リドである。

【００３９】流動層技法による適用のために適切なフィルム−形成被膜材料の例は、イギリ
ス特許第1483591号に与えられている。液体酵素調製物は、確立された方法に従
って、ポリオール、例えばプロピレングリコール、糖又は糖アルコール、乳酸又
は硼酸を添加することによって安定化され得る。他の酵素安定剤は、当業界にお
いて良く知られている。保護された酵素は、ヨーロッパ特許第238,216号に開示
される方法に従って調製され得る。

【００４０】本発明のα−アミラーゼの性質は、pH9.5〜10.5でのアルカリ洗浄剤への使用
のために、及び20〜40度の低温での洗浄のために特に適切にする。本発明の洗浄剤組成物は、いずれかの便利な形、例えば粉末、顆粒、ペースト
又は液体として存在することができる。液体洗浄剤は、水性であり、典型的には
、70％までの水及び0〜30％の有機溶媒を含み、又は非水性であり得る。

【００４１】洗浄剤組成物は、１又は複数の界面活性剤を含んで成り、それらの個々は、ア
ニオン性、カチオン性又は両性（両性イオン性）であり得る。洗浄剤は通常、0
〜50％のアニオン性界面活性剤、例えば線状アルキルベンゼンスルホネート（LA
S）、α−オレフィンスルホネート（AOS）、アルキルスルフェート（脂肪アルコ
ールスルフェート）（AS）、アルコールエトキシスルフェート（AEOS又はAES）
、第２アルカンスルホネート（SAS）、α−スルホ脂肪酸メチルエステル、アル
キル−又はアルケニル琥珀酸又は石鹸を含むであろう。

【００４２】それらはまた、0〜40％の非イオン界面活性剤、例えばアルコールエトキシレ
ート（AEO又はAE）、アルコールプロポキシレート、カルボキシル化されたアル
コールエトキシレート、ノニルフェノールエトキシレート、アルキルポリグリコ
シド、アルキルジメチルアミンオキシド、エトキシル化された脂肪酸モノエタノ
ールアミド、脂肪酸モノエタノールアミド又はポリヒドロキシアルキル脂肪酸ア
ミド（例えば、WO92/06154号に記載されるように）を含むことができる。

【００４３】洗浄剤組成物はさらに、１又は複数の他の酵素、例えばプルラナーゼ、エステ
ラーゼ、リパーゼ、クチナーゼ、プロテアーゼ、セルラーゼ、ペルオキシダーゼ
又はオキシダーゼ、例えばラッカーゼを含むことができる。通常、洗浄剤は、１〜65％の洗浄剤ビルダー、又は錯化剤、例えばゼオライト
、ジホスフェート、トリホスフェート、ホスフェート、シトレート、ニトリロ三
酢酸（NTA）、エチレンジアミン四酢酸（EDTA）、ジエチレントリアミノ五酢酸
（DTMPA）、アルキル−又はアルキレン琥珀酸、可溶性シリケート又は積層され
たシリケート（例えば、HoechstからのSKS−６）を含む。

【００４４】洗浄剤ビルダーは、リン含有及び非リン含有型に細分にされ得る。リン含有無
機アルカリ洗浄剤ブルダーの例は、水溶性塩、特にアルカリ金属のピロホスフェ
ート、オルトホスフェート、ポリホスフェート及びホスホネートを包含する。非
リン含有無機ビルダーの例は、水溶性アルカリ金属カーボネート、ボレート、及
びシリケート、並びに積層されたジシリケート及び種々の型の水不溶性結晶性又
は非晶質アルミノシリケートを包含し、この中でゼオライトが最良に知られてい
る代表物である。

【００４５】適切な有機ビルダーの例は、アルカリ金属、アンモニウム又は置換されたアン
モニウムのスクシネート、マロネート、脂肪酸マロネート、脂肪酸スルホネート
、カルボキシメトキシスクシネート、ポリアセテート、カルボキシレート、ポリ
カルボキシレート、アミノポリカルボキシレート、及びポリアセチルカルボキシ
レートを包含する。洗浄剤はまた、ビルドされ得ず、すなわち洗浄剤ビルダーを
実質的に有さない。

【００４６】洗浄剤は、１又は複数のポリマーを含んで成る。そのポリマーの例は、カルボ
キシメチルセルロース（CMC）、ポリ（ビニルピロリドン）（PVP）、ポリエチレ
ングリコール（PEG）、ポリ（ビニルアルコール）（PVA）、ポリカルボキシレー
ト、例えばポリアクリレート、ポリマレエート、マレイン酸/アクリル酸のコポ
リマー及びラウリルメタクリレート/アクリル酸のコポリマーである。洗浄剤組成物は、塩素/臭素型又は酸素型の漂白剤を含むことができる。漂白
剤は被覆されても又は封入されても良い。

【００４７】無機塩素/臭素型漂白剤の例は、リチウム、ナトリウム又はカルシウム次亜塩
素酸塩又は次亜臭素酸塩、及び塩素化されたリン酸三ナトリウムである。有機塩
素/臭素型漂白剤の例は、複素環式N−ブロモ及びN−クロロイミド、例えばトリ
クロロイソシアヌル酸、ジブロモイソシアヌル酸及びジクロロイソシアヌル酸、
及び水可溶性カチオン、例えばカリウム及びナトリウムとのそれらの塩である。
漂白システムはまた、例えばアミド、イミド又はスルホン型のペルオキシ酸を含
んで成る。

【００４８】酸素型漂白剤は、無機過酸塩、好ましくは漂白剤活性剤、又はペルオキシ酸化
合物であり得る。無機過酸塩の例は、アルカリ金属の過硼酸塩（四水和物及び一
水和物）、アルカリ金属の過炭酸塩、過珪酸塩及び過リン酸塩である。前記活性
剤は、テトラアセチルエチレンジアミン（TAED）又はノナノイルオキシベンゼン
スルホネート（NOBS）であり得る。

【００４９】本発明の洗浄剤組成物中の酵素は、従来の安定化剤、例えばポリオール、例え
ばプロピレングリコール又はグリセロール、糖又は糖アルコール、乳酸、硼酸、
又は硼酸誘導体、例えば芳香族ボレートエステルを用いて安定化され得、そして
前記組成物は、例えばWO92/19709号及びWO92/19708号に記載のようにして配合さ
れ得る。本発明の酵素はまた、ヨーロッパ特許第0544777B1号に記載されるよう
なタンパク質型の可逆性酵素インヒビターを添加することによって安定され得る
。洗浄剤はまた、他の従来の洗浄剤成分、例えば布用コンディショナー、例えば
クレー、解膠剤材料、発泡増進剤、発泡抑制剤、泡抑制剤、耐蝕剤、土壌−沈殿
防止剤、抗−土壌−再付着剤、顔料、脱水剤、殺菌剤、光学的増白剤又は香料を
含むことができる。

【００５０】 pH（使用濃度での水溶液において測定される）は通常、中性又はアルカリ性、
たとえば７〜11の範囲であろう。より特定には、本発明のα−アミラーゼは、WO96/23873号に記載される洗浄剤
配合物のいずれかに導入され得る。本発明のα−アミラーゼは、洗浄剤に通常使用される濃度で導入され得る。本
発明の洗浄剤は組成物においては、α−アミラーゼは、洗浄流体1L当たり0.0000
1〜1mg（純粋な酵素タンパク質として計算される）のα−アミラーゼに対応する
量で添加され得る。本発明はさらに次の例により例示されるが、それらの本発明の範囲を制限する
ものではない。

【００５１】実施例宿主生物： E.コリSJ2は、Didericheen, B., Wedsted, u., Hedegaard, L., Jensen, B.R.
, Sjoholm, C. (1990) Journal of Bacteriology, Vol. 172, No. 8, p. 4315-4
321に記載される。プラスミド：遺伝子銀行ベクターは、引用により本明細書に組み込まれるWO94/19454号に開
示されるpSJ1678であった。遺伝子銀行ベクターpSJ1678は、引用により本明細書に組み込まれるWO94/1945
4号に開示される。

【００５２】モデル洗浄剤： A/P（Asia/Pacific）モデル洗浄剤は次の組成を有する：20％のSTPP（トリポ
リリン酸ナトリウム）、25％のNa₂SO₄、15％のNa₂CO₃、20％のLAS（線状アルキ
ルベンゼンスルホネート、Nansa 80S）、５％のC₁₂−C₁₅のアルコールエトキシ
レート（Dobanol25−７）、５％のNa₂Si₂O₅, 0.3%のNaCl。

【００５３】例１．E.コリ中へのα−アミラーゼのクローニング DNAを、Pitcher, D.G., Saunders, N, A., and Owen, R. J. (1989) Lett. Ap
pl. Microbiol. 8, 157-156の方法により、バチルスsp. NCIMB40916から単離し
た。染色体DNAを、制限酵素Sau3AIにより部分的に消化した。そのフラグメント
を、図４に示されるように、クローニングベクターpSJ1678のBamHI部位中にクロ
ーン化し、そしてE.コリSJ2を形質転換し、それにより、バチルスsp. NCIMB4091
6の遺伝子ライブラリーを創造した。

【００５４】この遺伝子ライブラリーを、α−アミラーゼ活性についてスクリーンし、そし
てα−アミラーゼ活性を示す株を、E.コリ株NN049489と命名し、これは、本発明
のα−アミラーゼを含んで成る。この株を寄託し、そして受託番号DSM13001を得
た。α−アミラーゼをコードするpJA368と称するプラスミドを有するE.コリ株NN
049489を、DNA配列決定のために使用した。

【００５５】例２．DNA及びα−アミラーゼの配列決定プラスミドpJA386においてクローン化されたα−アミラーゼ遺伝子を、Taqデ
オキシ末端サイクル配列決定キット（Perkin Elmer, USA）、螢光ラベルされた
ターミネーター及びプライマーとしての適切なオリゴヌクレオチドを用いて、プ
ライマーウォーキングによるDNA配列決定により特徴づけた。配列データの分析を、Devereuxなど. (1984) Nucleic Acids Res. 12, 387-39
5に従って行った。その配列は、配列番号１に示されるDNA配列に対応する。α−
アミラーゼ、例えばシグナルペプチド及び成熟α−アミラーゼの予測されるタン
パク質配列は、配列番号２で提供される。推定されるN−末端配列は、タンパク
質のN−末端での34個のアミノ酸を配列決定することによって確かめられた。

【００５６】例３．α−アミラーゼの生成プラスミドpJA386を有するE.コリNN049489（DSM13001）を、10μg/mlのクロラ
ムフェニコールを含むLB−ブイヨンにおいて、37℃で250rpmで一晩にわたって培
養した。細胞を、6000rpmでの15分間の遠心分離により、2.7Lの培養ブイヨンか
ら収穫した。細胞内に位置するアミラーゼを、次の浸透ショック法を用いること
によって細胞から開放した：

【００５７】１）細胞を再懸濁し、そして10mMのトリス−HCl、pH7.0（EKV−緩衝液）500
mlにより洗浄し、続いて遠心分離した。２）細胞を、20％のスクロース、30mMのトリス−HCl、pH8、1mMのEDTAの溶
液75mlに懸濁し、そしてリゾチームを添加し、5mg/mlの濃度にした。３）その溶液を、氷上で15分間インキュベートし、続いて遠心分離した。ア
ミラーゼの大部分は現在、上清液に含まれた。上清液を、１回の緩衝液交換を伴って、10LのEKV−緩衝液に対して一晩透析し
、高濃度のスクロースを低めた。その溶液を、0.45μmの膜真空フィルターを通
して濾過した。

【００５８】酵素溶液を、EKV−緩衝液（pH７）により前もって平衡化されたPharmacia Q S
epharose カラムFF上に適用し、そしてカラムをEKV−緩衝液により洗浄した。結
合されたタンパク質を、0−500mMの線状NaClのグラジエントを用いて、10カラム
体積により溶離した。アミラーゼ含有画分プールし、そしてEKV−緩衝液に対し
て一晩、透析した。次に、その溶液を、EKV−緩衝液（pH8）により前もって平衡化されたQ Sephar
ose カラムFF上に適用し、カラムをEKV−緩衝液により洗浄し、そしてアミラー
ゼを、0−500mMの線状NaClグラジエントを用いて、10カラム体積により溶離した
。アミラーゼ含有画分をプールした。

【００５９】１Mの硫酸アンモニウムを含むEKV−緩衝液（pH8）により前もって平衡化され
たPhenyl Superose カラムを、１Mの濃度まで硫酸アンモニウムを添加された酵
素溶液により充填した。結合されなかった材料を、硫酸アンモニウム緩衝液によ
り洗浄し、そしてカラムを、1−0Mの硫酸アンモニウムの線状NaClグラジエント
を用いて、20カラム体積により溶離した。アミラーゼ含有画分をプールした。精製されたアミラーゼをSDS−PAGEにより分析し、そしてクーマシーブルによ
る染色後、わずか１つのバンドを得た。

【００６０】例４．洗浄試験洗浄性能を、本発明のα−アミラーゼを含む洗浄剤溶液により25℃で15分間、
汚れた試験スワッチを洗浄することによって評価した。使用される洗浄剤は、10.5のpHを有する3g/lでの上記A/Pモデル洗浄剤、又は
約9.7のpHを有する3g/lでのMalaysiaからの市販の洗浄剤（ColgateからのFAB To
tal）であった。例３の精製されたアミラーゼを、下記に示される濃度で洗浄溶
液に添加した。試験スワッチを、オレンジ−米澱粉により汚した（CFT, Center
for Test Material, Holland から入手できるCS−28スワッチ）。洗浄の後、スワッチを、460mmでの規約反射率を測定することによって評価し
た。結果は、ΔR＝α−アミラーゼにより洗浄されたスワッチの規約反射率−α
−アミラーゼを有さない同じ条件下で洗浄されたスワッチの規約反射率として表
した。

【００６１】

【表１】それらの結果は図５及び６に示される。結果は、本発明のα−アミラーゼが高
いアルカリ性pH両洗浄剤において効果的であることを示す。

【配列表】

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、２種の従来技術のアミラーゼ（AP722及びTermamyl）に比較して、NCI
MB40916からのアミラーゼのpH活性プロフィールを示す。

【図２】図２は、NCIMB40916からのアミラーゼの温度活性プロフィールを示す。

【図３】図３は、種々の温度でのインキュベーションの後、NCIMB40916からのアミラー
ゼの安定性を示す。

【図４】図４は、例１に記載されるクローニングベクターpSJ1678を示す。

【図５】図５は、例４に記載される洗浄試験の結果を示す。

【図６】図６は、例４に記載される洗浄試験の結果を示す。

【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書

【提出日】平成１３年１０月３日（２００１．１０．３）

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】特許請求の範囲

【補正方法】変更

【補正の内容】

【特許請求の範囲】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｒ 1:19）Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:07） (Ｃ１２Ｎ 9/28 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 9/28 Ｃ１２Ｒ 1:07） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＢＺ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者アンデルセン，イェンストエーネデンマーク国，デーコー−2850 ネルム，スキュッテビエルウ 85 Ｆターム(参考） 4B024 AA03 BA13 CA03 DA06 DA07 EA04 GA11 HA01 4B050 CC01 CC04 DD02 LL04 4B065 AA15X AA15Y AA26X AB01 AC14 BA02 CA32 CA57 4H003 AA01 EC01 FA28

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】ａ）バチルスsp. NCIMB40916により生成されるポリペプチド
、又はｂ）配列番号２の位置１−556に示されるようなアミノ酸配列に有するポリペ
プチド、又はｃ）エスシェリシア・コリDSM13001 (NN049489) に存在するプラスミド中にク
ローン化されたDNA配列のα−アミラーゼコード部分によりコードされるポリペ
プチド、又はｄ）i）前記（ａ）又は（ｂ）に定義されるポリペプチドと少なくとも60％相
同性であるか、又は ii) １又は複数のアミノ酸の置換、欠失及び/又は挿入により前記ポリペ
プチド起因する、前記ポリペプチドの類似体であるα−アミラーゼ。
【請求項２】 37℃で測定される場合、pH7.3での活性よりも少なくとも２
倍高い、pH10.5での活性を有するα−アミラーゼ。
【請求項３】 37℃で測定される場合、pH7.3での活性よりも少なくとも４
倍高い、pH9.5での活性を有するα−アミラーゼ。
【請求項４】 37℃で測定される場合、約9.5の最適pHを有するα−アミラ
ーゼ。
【請求項５】バチルス株、好ましくはバチルスsp. NCIMB40916の株からで
ある請求項１〜４のいずれか１項記載のα−アミラーゼ。
【請求項６】 20％のSTPP、25％のNa₂SO₄、15％のNa₂CO₃、20％のLAS、5％
のC₁₂−C₁₅アルコールエトキシレート、5％のNa₂Si₂O₅、0.3％のNaClを含む、3g
/lの試験洗浄剤の溶液におけるpH10.5で25℃での20分間のインキュベーションの
後、その活性の90％以上を保持し、そして同じ溶液における30℃での20分間のイ
ンキュベーションの後、その活性の90％以下を保持する請求項１〜５のいずれか
１項記載のα−アミラーゼ。
【請求項７】 SDS−PAGEにより決定される場合、約55kDaの分子量を有する
請求項１〜６のいずれか１項記載のα−アミラーゼ。
【請求項８】等電点電気泳動により決定される場合、約５の等電点を有す
る請求項１〜７のいずれか１項記載のα−アミラーゼ。
【請求項９】非ダスト化粒質物又は安定化された液体である洗浄添加剤の
形で存在する請求項１〜８のいずれか１項記載のα−アミラーゼ。
【請求項１０】請求項１〜９のいずれか１項記載のαアミラーゼをコード
する単離されたDNA配列。
【請求項１１】 α−アミラーゼをコードし、そして、ａ）配列番号１の位置94−1764に示されているDNA配列、又はｂ）i)前記DNAと少なくとも60％相同であり、又は ii)少なくとも55℃で前記DNA配列とハイブリダイズする、ａ）において定
義されたDNAの類似体を含んで成る、単離されたDNA配列。
【請求項１２】細菌、好ましくはバチルス、最も好ましくは株NCIMB40916
からである請求項10又は11記載のDNA配列。
【請求項１３】請求項10〜12のいずれか１項記載のDNA配列を含んで成る
組換え発現ベクター。
【請求項１４】請求項10〜12のいずれか１項記載のDNA配列又は請求項13
記載の組換え発現ベクターにより形質転換された細胞。
【請求項１５】原核細胞、特に細菌細胞、又は前記DNA配列が起因する内
因性細胞である請求項14記載の細胞。
【請求項１６】前記細胞が、バチルス又はエスシェリシア、好ましくはE.
コリに属する請求項15記載の細胞。
【請求項１７】請求項14〜16のいずれか１項記載の細胞を、α−アミラー
ゼの生成を可能にする条件下で培養し、そしてその培養物からα−アミラーゼを
回収することを含んで成るα−アミラーゼの生成方法。
【請求項１８】適切な栄養培地においてバチルスのアミラーゼ−生成株を
培養し、そしてその培養培地からα−アミラーゼを回収することを含んで成る請
求項１〜９のいずれか１項記載のα−アミラーゼの生成方法。
【請求項１９】請求項１〜９のいずれか１項記載のα−アミラーゼ及び界
面活性剤を含んで成る洗浄剤組成物。
【請求項２０】水溶液において8.5〜11のpH、好ましくは９〜10.5のpHを
有する請求項19記載の洗浄剤組成物。
【請求項２１】洗濯洗浄剤である請求項19又は20記載の洗浄剤組成物。