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JP2002537840A - 新規植物遺伝子およびその使用 - Google Patents

新規植物遺伝子およびその使用

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JP2002537840A
JP2002537840A JP2000603383A JP2000603383A JP2002537840A JP 2002537840 A JP2002537840 A JP 2002537840A JP 2000603383 A JP2000603383 A JP 2000603383A JP 2000603383 A JP2000603383 A JP 2000603383A JP 2002537840 A JP2002537840 A JP 2002537840A
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nos
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plant
nucleic acid
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Application number
JP2000603383A
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ジョン・マニュエル・サルメロン
ローラ・ジーン・ウェイズロ
マイケル・ジー・ウィリッツ
テスフェイ・メンギステ
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Original Assignee
Syngenta Participations AG
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Publication date
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Abstract

(57)【要約】 組織的に獲得した耐性（SAR）を導くシグナルトランスダクション・カスケードに関与するArabidopsis NIM 1遺伝子の相同物は、Nicotiana tabacum(タバコ)、Lycopersicon esculentum (トマト)、Brassica napus (脂肪種子)、Arabidopsis thaliana、Beta vulgaris (テンサイ)、Helianthus annuus (ヒマワリ)または Solanum tuberosum (ポット) から単離される。本発明は、さらに、形質転換ベクターおよびSAR遺伝子発現を増加させ、広範囲の疾病耐性を増強させる形質転換植物におけるNIM１相同物を発現するための方法に関する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 （技術分野） 本発明は、組織的に獲得した耐性(SAR)に関する現象を含む植物における広範
囲の疾病耐性に関する。より特別には、本発明は、植物における組織的に獲得し
た耐性を導くシグナルトランスダクション・カスケードを含む、アラビドプシス
（Arabidopsis）NIM1 遺伝子相同物の同定、単離および特性分析に関する。
【０００２】 植物は、ウイルス、 バクテリア、菌類および線虫を含む広範囲の多種の病原
性生物体または生物によって絶え間なく攻撃にさらされている。穀類植物は、遺
伝的に同一の単式農法として栽培するため、特に傷つき易く、疾病が攻撃すると
、損失は深刻となり得る。しかし、ほとんどの植物は、それ自身の病原性生物体
に対して内在的な防御機構を有する。植物病原性への耐性に対する自然の変異体
は、植物品種改良家および病原学者によって同定されており、多くの穀類植物に
おいて生育されている。これらの自然疾病耐性遺伝子は、頻繁に病原体に対する
高レベルの耐性もしくは免疫性を示す。
【０００３】 組織的に獲得した耐性(SAR)は、植物体が病原体から自分自身を防御するため
に使用する複合システムの１つの成分（配列）である（HuntおよびRyals,1996;
Ryals et al.,1996）。米国特許第5,614,395号を参照。 特に、SARは、ウイルス
、 バクテリアおよび菌類を含む広い範囲の感染物に対する病原体誘導性の組織
的耐性であるが故に、植物病原体応答に関する重要な局面である。該SARシグナ
ルトランスダクション経路が遮断される場合、 植物は、疾病を普通に引き起こ
す病原体に対して感染されやすくなり、普通は疾病を引き起こさないであろうあ
る種の病原体に対してもまた感染されやすくもなる(Gaffney et al., 1993; Del
aney et al., 1994; Delaney et al.,1995; Delaney,1997; Bi et al., 1995; M
auch-ManiおよびSlusarenko, 1996)。これらの知見は、SARシグナルトランスダ
クション経路が植物の健康を維持するために必須であることを示す。
【０００４】 概念的には、該SAR応答は、二段階に分けることができる。初期段階では、病
原体感染が認識され、師部（皮部）を通って離れた細胞へ送達（移動）するシグ
ナルが発っせられる。該組織的シグナルは、SAR遺伝子および疾病耐性の双方の
発現に反応する標的細胞によって認識される。SARの維持段階は、数週間から植
物の全生存期間に及び、その間、植物は見かけ上定常状態であり、疾病耐性が維
持される(Ryals et al.,1996)。
【０００５】 サリチル酸 (SA)の蓄積は、SAR シグナルトランスダクションのために必要で
あるように見える。特異的な阻害剤、フェニルアラニンのアンモニア分解酵素の
後生的な抑圧または特異的にSAを分解するサリチレートヒドロキシラーゼの形質
転換発現の処理によってSAを蓄積し得ない植物は、SAR遺伝子発現または疾病耐
性をもまた誘導し得ない(Gaffney et al., 1993; Delaney et al.,1994; Mauch-
ManiおよびSlusarenko, 1996; Maher et al., 1994; Pallas et al., 1996)。SA
が組織的シグナルとして機能するのではないかと示唆されてきたが、最近、これ
は論議がおこっており、確実であると知られていること全ては、SAが蓄積しない
場合には、SARシグナルトランスダクションが遮断されるということである (Pal
las et al., 1996; Shulaev et al., 1995; Vernooij et al., 1994)。
【０００６】 近年、アラビドプシスは、SARの研究に関するモデル系として浮かび上がった(
Uknes et al., 1992; Uknes et al., 1993; Cameron et al., 1994; Mauch-Mani
およびSlusarenko, 1994; DempseyおよびKlessig, 1995)。 SARは、病原体およ
び化学物質、例えばSA、2,6-ジクロロイソニコチン酸(INA)およびベンゾ(1,2,3)
チアジアゾール-7-カルボチオン酸 S-メチルエステル(BTH)の両方によって活性
化されることが示された(Uknes et al., 1992; Vernooij et al., 1995; Lawton
et al., 1996)。INAまたはBTHまたは病原体感染による処理のあと、少なくとも
３つの病原性関連(PR)タンパク質遺伝子、即ち、PR-1、PR-2およびPR-5は、耐性
の発現と同時に互いに調和しあって、誘導される (Uknes et al., 1992,1993)。
最もよく特性分析された種であるタバコにおいて、病原体または免疫化化合物に
よる処理により、少なくとも９セットの遺伝子の発現が誘導される(Ward et al.
, 1991)。形質転換疾病耐性植物は、植物を多様なSAR遺伝子で形質転換すること
によって作られてきた(米国特許第5,614,395号)。
【０００７】 修飾されたSARシグナルトランスダクション示す多くのアラビドプシス変異株
が単離された(Delaney,1997)。最初のこれらの変異株は、いわゆる、Isd (lesio
ns simulating disease)変異株およびacd2 (accelerated cell death)である(Di
etrich et al.,1994; Greenberg et al., 1994)。これら全ての変異株は、それ
らの葉にある程度の自発性ネクローシス損傷形成、SAレベルの上昇、SAR 遺伝子
のためのMARNA蓄積および顕著な疾病耐性の上昇を示す。少なくとも７つの異な
るIsd 変異株が単離され、特性分析された(Dietrich et al., 1994; Weymann et
al., 1995)。他の注目される変異株のクラスは、cim（constitutive immunity）
変異株である(Lawton et al., 1993)。米国特許第5,792,904号および国際PCT出
願 WO 94/16077も参照。Isd変異株類およびacd2のように、cim変異株は、SAおよ
びSAR遺伝子発現および耐性のレベルが上昇しているが、しかしIsdまたはacd2と
は対照的に、それらの葉には検出し得る損傷を示さなかった。cpr1(constitutiv
e expresser of PR genes)は、cim変異株の一つのタイプの可能性がある；しか
し、顕微鏡でないと見えないcprlの葉上にある損傷の存在は除去されているので
、cprlはIsd変異体の一つのタイプであろう(Bowling et al., 1994)。
【０００８】 SARシグナル化において遮断されている変異株もまた単離されている。ndrl(no
n-race-specific disease resistance)は、多様な無毒性遺伝子を含むPseudomon
as syringeおよび通常無毒性遺伝子を含むPeronospora parasiticaの両方を生育
させる変異体である (Century et al.,1995)。明らかに、この変異体は、SARシ
グナル化において初期に遮断される。nprl (nonexpresser of PRgenes)は、INA
処理のあと、SARシグナル化経路の発現を誘導することができない変異体である(
Cao et al., 1994)。eds (enhanced disease susceptibility) 変異株は、低バ
クテリア濃度の接種のあと、バクテリア感染を保持する能力を基にして単離した
(Glazebrook et al., 1996; Parker et al., 1996)。あるeds変異株は、表現
型的にnprlに類似しており、近年、eds5およびeds53がnprlの対立遺伝子である
ことが示された(Glazebrook et al., 1996)。niml（noninducible immunity）は
、INA処理後の P. parasitica (即ち、綿花ウドンコ病の原因となるもの)増殖を
保持する (Delaney et al., 1995; 米国特許第5,792,904) 変異体である。nim 1
は、病原体感染の後、SAを蓄積し得るが、SAR遺伝子発現または疾病耐性を誘導
することができない。この変異体がSA経路下流を遮断することを示唆している。
nim 1は、INAまたはBTH応答に対する能力に障害があり、このことはこれら化学
物質の作用の下流に上記の遮断が存在することを示唆するものであった(Delaney
et aI., 1995; Lawton et al., 1996)。
【０００９】 アラビドプシス対立性遺伝子は単離され、特性分析が行われ、その変異株は、
nim 1およびnprlの各々の表現型の原因であった(Ryals et al, 1997; Cao et al
., 1997)。野生型NIM1 遺伝子産物は、SARおよびアラビドプシスにおける遺伝子
-対-遺伝子疾病耐性の両方を導くシグナルトランスダクション・カスケードに関
与する(Ryals et al., 1997)。Ryalsら（1997）はまたnim 1のさらに５つの対立
遺伝子の単離を報告している。これらの対立遺伝子は、化学的に誘導されたPR-1
遺伝子発現および菌類耐性において、弱く障害された表現型と非常に強く遮断
された表現型を示す。野生型NPR1遺伝子のnprl変異株への形質導入は、PR遺伝子
発現および疾病耐性に関するSAR誘導の応答を修復する変異を相補するだけでは
なく、形質転換植物をSAR誘導がない場合において、P. siringeによる感染に対
してさらに耐性にする(Cao et al.,1997)。WO 98/06748では、アラビドプシス由
来のNPR1単離およびNicotiana glutinosa由来の相同物を記載している。WO 97/4
9822、 WO 98/26082およびWO 98/29537を参照。
【００１０】 植物の遺伝子的形質転換を含む精巧かつ強力な穀物防御方法の多くの研究と使
用にもかかわらず、疾病による損失は、年間数十億ドルになる。そのため、植物
における疾病耐性のための遺伝的機序に関する現在までに蓄積してきた理解を基
にして新規穀物保護方法を開発する必要がある。特に、追加の植物の種からアラ
ビドプシスNIM1 遺伝子相同物の同定、単離および特性分析の必要がある。
【００１１】 本発明を説明する場合、次の用語を用い、下記に示したような定義を意図する
ものである。
【００１２】 関連する/機能的に結合した: ２つのDNA配列が物理的または機能的に関連する
こと。例えば、もし２つの配列が機能的に結合されるかまたは調節DNA配列がコ
ードするもしくは構造DNA配列の発現レベルに影響するように位置しているなら
、プロモーターまたは調節DNA 配列はRNAまたはタンパク質をコードするDNA配列
「と関連」していると云える。
【００１３】 キメラ遺伝子:プロモーターまたは調節DNA 配列が、mRNAをコードするまたは
タンパク質として発現するDNA配列と機能的に結合するまたは関連する組換DNA配
列。例えば、調節DNA配列は関連したDNA 配列の転写または発現を調節し得る。
キメラ遺伝子の調節DNA配列は、天然で見出された関連DNA配列に機能的に結合し
ないのが普通である。
【００１４】 コード配列: RNAに転写される核酸配列、例えば、mRNA、rRNA、tRNA、snRNA
、センスRNAまたはアンチセンスRNAである。次いで、好ましくは、該RNAはタン
パク質を産生するために生物体で翻訳される。
【００１５】 相補性：逆平行の核酸配列における相補的な塩基間の水素結合の形成に対して
互いに対を成し得る逆平行の核酸配列を含む２つの核酸配列を意味する。
【００１６】 発現: 植物における外来遺伝子またはトランスジーンの転写および／または翻
訳を意味する。アンチセンス構築物の場合、例えば、発現は、アンチセンスDNA
のみの翻訳を意味し得る。
【００１７】 発現カセット:適当な宿主細胞で特定のヌクレオチド配列の発現を導き得る核
酸配列であって、停止シグナルに機能的に結合する注目するヌクレオチド配列に
機能的に結合するプロモーターを含む。通常、これは、ヌクレオチド配列の適切
な翻訳のために必要とされる配列を含む。注目のヌクレオチド配列を含む発現カ
セットはキメラであってもよく、その成分の少なくとも１つは、その別の成分の
少なくとも１つに関して異種構造であることを意味する。発現カセットもその１
つであって、これは、天然に存在するが、異種構造的発現のために有用な組換体
で得られる。しかし、通常は、発現カセットは、宿主に関して異種構造であり、
即ち発現カセットの特定の核酸配列は、宿主細胞では天然には存在せず、形質転
換の発生により宿主細胞または宿主細胞の祖先中で導入されたに違いない。発現
カセット中でヌクレオチド配列の発現は、宿主細胞がある特別な外因性刺激に曝
露された場合にのみ転写を開始する構成的プロモーターまたは誘導性プロモータ
ーの制御下に存在することができる。多細胞生物体、例えば植物の場合、そのプ
ロモーターは、特定組織または器官または成長段階に対しての特異的である可能
性がある。
【００１８】 遺伝子: ゲノム内に位置する規定領域であり、前記のコードする核酸配列に加
えて別の、発現の制御を担う、本来調節的である核酸配列を含む規定領域、いわ
ゆる、コードする部分の転写および翻訳領域をいう。一つの遺伝子は、別の5'お
よび 3'非翻訳配列および停止配列を含んでもよい。存在し得るさらなる配列（
要素）は、例えばイントロンである。
【００１９】 異種構造DNA配列:本明細書中で使用する、「異種構造DNA配列」、「外来性DNA
セグメント」もしくは「異種構造核酸」なる用語は、特定の宿主細胞にとって外
来起源から生ずる配列、もしくは、同じ起源からの場合は元の能力で修飾されて
いる配列をそれぞれ意味する。即ち、宿主細胞中の異種構造遺伝子は、特定の宿
主細胞にとっては内在性であるが、例えばDNAシャッフリングの使用によって修
飾される遺伝子を含む。この用語は、天然に存在するDNA配列の非天然性の複合
体コピーをも含む。従って、該用語は、細胞に対して外来性または異種構造性の
または該細胞にとって相同性であるが通常見出されない宿主細胞核酸内に位置す
るDNAセグメントを意味する。外来性DNAセグメントが発現して、外来性のポリペ
プチドが得られる。
【００２０】 相同性DNA配列:導入される宿主細胞に自然に関連するDNA配列。
【００２１】 アイソコード（isocording）: ある核酸配列が、参照核酸配列によってコード
されたポリプチドと同じアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする場合、
その核酸配列は参照核酸配列とアイソコードしている。
【００２２】 単離された（した）:本発明において、単離された核酸分子または単離された
酵素は、人の手による、本来の環境から放れて存在し、従って天然の生成物でな
い核酸分子または酵素である。単離された核酸分子または酵素は、精製形態で存
在してもよく、または非自然環境、例えば組換え体の宿主細胞で存在してもよい
。
【００２３】 最小プロモーター: 不活性であるか、または上流活性化の非存在下にプロモー
ター活性が大きく低下しているプロモーター配列、特にTATA配列である。
【００２４】 本来的な：非形質転換細胞のゲノム中に存在する形質遺伝子を意味する。
【００２５】 自然発祥物（天然に存在する）: 「自然発祥物（天然に存在する）」なる用語
は、人によって人工的に生成されるものとは区別して自然界で見出され得る物質
を説明するのに使用する。例えば、自然発祥物から単離することができかつ研究
室でヒトによって作為的に修飾していない生物体（ウイルスも含む）に存在する
タンパク質またはヌクレオチド配列が、自然発祥物である。
【００２６】 NIM1: Ryals et al.,（1997）によって発表された遺伝子であって、これは、S
AR シグナルトランスダクション・カスケードに関与する。
【００２７】 NIM1: NIM1遺伝子によってコードされたタンパク質。
【００２８】 核酸: 「核酸」なる用語は、一重もしくは二重らせんのいずれかの形をした、
デオキシヌクレオチドまたはリボヌクレオチドおよびその重合体を示す。特別に
制限しないかぎり、該用語は、参照核酸と類似の結合特性を有し、および天然に
存在するヌクレオチドに類似した方法で代謝される天然のヌクレオチドの既知の
アナログを含む核酸を包含する。そうでないように指示していなければ、特定の
核酸配列は、保存的に修飾されたその変異体(例えば、縮重コドンの置換)および
相補的配列さらに明確に示した配列を内在的に含む。具体的には、縮重コドンの
置換は、１以上の選択されたコドンの第三番目の位置が、混合された残基および
／またはデオキシイノシン残基で置換される配列をつくることによって達成され
得る(Batzer et al., 核酸 Res. 19: 5081 (1991); Ohtsuka et al., J. Biol.
Chem. 260: 2605-2608 (1985);Rossolini et al., Mol. Cell. Probes 8: 91-98
(1994))。「核酸」または「核酸配列」なる用語は、遺伝子、遺伝子によってコ
ードされたcDNAおよびmRNAを用いて互換的に使用してもよい。本明細書において
、核酸分子は、好ましくはDNAのセグメントである。ヌクレオチドは、以下の標
準的な略語により、その塩基によって示す: アデニン(A)、シトシン(C)、チミン
(T)およびグアニン(G)。
【００２９】 ORF: 読み取り枠 植物: 丸ごとの植物体
【００３０】 植物細胞: プロトプラストおよび細胞壁からなる植物の構造的および生理学的
単位。 植物細胞は、単離された単細胞または培養細胞の形態または高度に組織
化された単位、例えば植物組織、植物器官または丸ごとの植物体の単位としての
形態であり得る。
【００３１】 植物細胞培養: 植物単位、例えば、様々な成長段階での、プロトプラスト、細
胞培養細胞、 植物組織中の細胞、花粉、 花粉管、 胚珠、胚嚢、接合子および
胚の培養。
【００３２】 植物試料: 葉、茎、根、花または花の一部、 果実、 花粉、卵細胞、接合子、
種子、さし木、細胞または組織培養物または植物のその他の部分または産物。
【００３３】 植物器官: 植物の明確で、視覚的に構築され、分化した部分、例えば根、茎、
葉、蕾または胚。
【００３４】 植物組織:構造的および機能的単位に組織された植物細胞の一群。植物におい
て、または培養中の任意の植物組織が含まれる。この用語は、限定するものであ
はないが、丸ごとの植物体、 植物器官、植物種子、組織培養および構造的およ
び/または機能的単位で組織された植物細胞の全ての群を含む。この用語の使用
は、上記植物組織の全ての特異的な型、と接合するかまたは非存在下で、または
この定義によって含まれる以外のその他の植物組織型を排除することを意図する
ものではない。
【００３５】 プロモーター: RNAポリメラーゼIIに対する結合部位を含み、DNAの転写を開始
するコード領域の上流の非翻訳DNA配列部位。プロモーター領域は、遺伝子発現
の調節配列として作用する別の配列を含んでもよい。
【００３６】 プロトプラスト: 細胞壁がないか細胞壁の一部しかない単離された植物細胞
【００３７】 精製した（された）:「精製した（された）」なる用語は、核酸またはタンパ
ク質に適用された場合に、核酸またはタンパク質は自然状態で関連のある別の細
胞成分を本質的に含まないことを示す。それは、乾燥または水溶液のいずれの形
態でも存在し得るが、均質状態であるのが好ましい。純度および均質度は、通常
、分析化学技術、例えばポリアクリルアミドゲルもしくは高速クロマトグラフィ
ーを用いて測定する。調製物中に存在する主要な種類であるタンパク質は、実質
的に精製されている。タンパク質は、ゲル電気泳動において主要バンドの発生に
よって示す。特に、核酸またはタンパク質は、少なくとも約50％の純度、より好
ましくは少なくとも約85％の純度、最も好ましいのは少なくとも約99％の純度で
あることを意味する。
【００３８】 組換えDNA分子:組換えDNA技術を用いて、一緒に結合したDNA分子の組合せ。
【００３９】 調節配列:ヌクレオチド配列の発現を制御することに関与する配列。プロモー
ターを含む調節配列は、注目されるヌクレオチド配列および停止シグナルに機能
的に結合する。通常、それらは、ヌクレオチド配列の適切な翻訳に必要な配列も
包含する。
【００４０】 選択し得るマーカー遺伝子：植物細胞において発現する遺伝子は、細胞に選択
的な利点を与える。選択し得るマーカー遺伝子を用いて形質転換した細胞に保持
された選択的利点は、形質転換していない細胞の増殖と比べて、負の選択薬物、
例えば抗生物質または除草薬の存在下で成長し得るために存在しうる。形質転換
された細胞に保持された選択的利点は、形質転換していない細胞の増殖と比べて
、栄養、増殖要因もしくはエネルギー源としての添加化合物を利用する増強され
たもしくは新規の許容力によるものであろう。選択マーカー遺伝子は、植物細胞
での発現が負および陽性両方の選択的利点を細胞に与える遺伝子または遺伝子の
組合せを意味する。
【００４１】 顕著な増加: 測定技術における本来的な誤差の限界以上の酵素活性における増
加、好ましくは、増加または阻害剤存在下での野生型の酵素活性よりも約2倍以
上高い、より好ましくは約5倍またはそれ以上、最も好ましくは、約10倍または
それ以上の増加。
【００４２】 ２以上の核酸またはタンパク質配列の関係において、「同一」、または「同一
性」パーセントなる用語は、同一かまたは下記配列の比較アルゴリズムまたは可
視検定の１つを用いて測定して、最大一致とみなされるときに、特定パーセント
の同一のアミノ酸または核酸を持つ２つ以上の配列または部分配列を意味する。
【００４３】 実質的に同一の: ２つの核酸またはタンパク質配列において、「実質的に同一
」なる用語は、下記配列の比較アルゴリズムまたは視覚検定の１つを用いて測定
して比較し、最大一致について比較および整列した場合、少なくとも60％、好ま
しく80％、より好ましくは90−95％、最も好ましくは少なくとも99％の核酸もし
くはアミノ酸残基の同一性を有する２以上の配列または下位配列を示す。好まし
くは、実質的な同一性は、長さにおいて、少なくとも約50残基、より好ましくは
少なくとも100個以上の残基の領域、最も好ましくは少なくとも約100残基以上の
領域が存在する配列の領域にわたって存在し、最も好ましい配列は約150残基以
上の実質的に同一なものである。最も好ましい態様において、該配列はコード配
列の完全長にわたって実質的に同一である。さらに、実質的に同一の核酸または
タンパク質配列は、実質的に同じ機能を持つ。
【００４４】 配列比較について、通常１つの配列は、試験配列を比較するための参照配列と
して機能する。配列の比較アルゴリズムを用いる場合、試験および参照配列は、
コンピューターに入力される。必要であれば下位配列座標軸を表し、配列のアル
ゴリズムプログラムパラメーターを示す。次いで、その配列の比較アルゴリズム
は、提示したプログラムパラメーターに基づいて参照配列と比較した試験配列の
配列同一性％を計算する。
【００４５】 比較のための配列に関する至適整合は、例えばSmith & Waterman, Adv. Appl
Math. 2: 482 (1981)の局部的相同性アルゴリズム、またはNeedleman & Wunsch,
J. Mol. Biol. 48: 443 (1970)の相同性配列アルゴリズム、Pearson & Lipman,
Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85: 2444 (1988)の類似の方法を検索して、これ
らアルゴリズム（GAP、BESTFIT、FASTAおよびTFASTA in the Wisconsin Genetic
s Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, W
I）のコンピューター化した手段によって、または視覚検査によって行い得る(一
般的にはAusubel et al., infra参照)。
【００４６】 配列同一性％および配列相同性を測定するのに適当なアルゴリズムの１つの例
は、BLASTアルゴリズムであり、これは、Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:
403-410 (1990)に、記載されている。 BLAST分析を行うためのソフトウェアは
、National Center for Biotechnology Information (http://www.ncbi.nim.nih
.gov/)から入手し得る。
【００４７】 このアルゴリズムは、データ・ベース配列中で、同一の長さの単語と並べる場
合、幾つかの陽性値の限界スコアＴを一致させるかまたは満足させる、疑いのあ
る配列中の長さＷの短い単語を同定することによって、最初に同定するハイ・ス
コア・シークエンス・ペア (HSPs)を包含する。Tは、近傍の単語スコア限界とし
て示す(Altschul et al., 1990)。これらの開始の近傍単語のヒットは、それら
を含むより長いＨＳＰを見出すための検索を開始するための種として作用する。
続いて、この単語のヒットは、累積配列ヒットが累積配列スコアが増え得る限り
、両方の検索に従って各配列において伸長する。 累積スコアは、ヌクレオチド
配列を用いて計算され、該パラメータＭ（一組の一致する残基に対するリワード
・スコアー；いつも０以上）およびＮ（不一致の残基に対するペナルチィー・ス
コア；いつも０以下）を用いて計算した。アミノ酸配列に対しては、スコア化す
るマトリックスを用いて、累積スコアを計算した。各方向での単語のヒットの伸
長が停止するのは、累積配列スコアが、その最高の達成値からの数量Ｘまで低下
し、累積スコアが１以上の負のスコア残基配列により0または0以下になり、もし
くは何れかの配列の末端に達するする場合である。BLATアルゴリズムパラメータ
Ｗ、TおよびXは、配列の感受性およびスピードを測定する。BLASTNプログラム（
ヌクレオチド配列）は、単語の長さ（W）、10の期待値（E）、100のカットオフ
、 M=5、N=-4、および両ストランドの比較をデフォルトとして使用する。アミノ
酸配列のために、BLASTPプログラムは、単語の長さ（W）3、期待値（E）10、BLO
SUM62スコアマトリックスを（Henikoff & Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. U
SA 89: 10915 (1989)を参照）デフォルトとして使用する。
【００４８】 配列相同性％を計測することに加えて、BLASTアルゴリズムは、２つの配列の
間に類似の統計学的分析を行った(例えば、Karlin & Altschul, Proc. Nat'l. A
cad. Sci. USA 90: 5873-5787 (1993))。BLASTアルゴリズムによって提供された
類似性を１つの測定法は、最小合計の確率（P（N））であって、これは、２つの
核酸またはアミノ酸配列間の一致が偶然生じる確率の指標を示す。例えば、試験
核酸は、試験核酸配列と参照核酸配列との比較において、最小合計確率がする約
0.1以下、好ましくは約0.01以下、最も好ましくは約0.001以下である場合、参照
配列に類似していると考える。
【００４９】 ２つの核酸配列が実質的に同一であるという別の表示は、２つの分子が緊縮性
条件下で互いにハイブリダイズすることである。「に特異的にハイブリダイズす
る」なる文言は、配列が複合体混合物（例えば全細胞性）DNAまたはRNAに存在す
る場合、該配列が緊縮性条件下で分子を特定の核酸配列にのみ、結合、重複もし
くはハイブリダイズすることを示す。 「実質的な結合」は、プローブ核酸およ
び標的核酸との間の相補的ハイブリダイゼーションを示し、所望の標的核酸配列
の検出を達成するためのハイブリダイゼーション媒体の緊縮性を低下させて順応
し得る少しの不一致を包含する。
【００５０】 核酸ハイブリダイゼーション実験、例えばサザンおよびノーザン・ハイブリダ
イゼーションにおいて、「緊縮性ハイブリダイゼーション条件」および「緊縮性
ハイブリダイゼーション洗浄条件」は、異なる環境パラメーターで異なる。長い
配列は、高温で特異的にハイブリダイズする。核酸ハイブリダイゼーションに対
する詳細な指針は、Tijssen(1993) Laboratory Techniques in Biochemistry an
d Molecular Biology-hybridization with nucleic acid Probes Part1 chapter
2"Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic a
cid probe assays" Elsevier, New York. で見出された。一般的には、高緊縮性
ハイブリダイゼーションおよび洗浄条件は、規定したイオン強度およびpＨで特
定配列に対して熱融解点（Ｔm）以下の約５℃が選択される。通常、「緊縮性条
件」下では、プローブは、その標的配列にハイブリダイズするが別の配列にはハ
イブリダイズしない。
【００５１】 Ｔmは、標的配列の50％が完全一致のプローブにハイブリダイズする温度（規
定したイオン強度およびpＨの下)である。非常に緊縮性な条件は、特定のプロー
ブに対するＴmに等しく選択される。サザンもしくはノーザンブロットでのフィ
ルター上の100以上の相補的な残基を有する相補的な核酸のハイブリダイゼーシ
ョンのための緊縮性ハイブリダイゼーション条件の例は、42℃、1ｍｇのヘパリ
ンを有する50％ホルムアミドで、一晩ハイブリダイゼーションを行う。高い緊縮
性洗浄条件の例は、72℃で約15分間、0.15Ｍ NaClである。緊縮性性洗浄条件の
例は、65℃で15分間、0.2×SSC洗浄である（SSC緩衝液の説明についてはSambroo
k,infra 参照）。高い緊縮性洗浄は、バックグラウンドのプローブシグナルを除
去するために低い緊縮性洗浄で行うことがよくある。例えば、100個以上のヌク
レオチドの重複のための実施例の媒質の高い緊縮性洗浄は、１×SSCで45℃で15
分間である。例えば100個以上のヌクレオチドの重複のための実施例の媒質の低
い緊縮性洗浄は、4−6×SSCで40℃で15分間である。短いプローブ（例えば、約1
0〜50個のヌクレオチド）に関して、緊縮条件は、約1.0Ｍ Naイオン以下の塩濃
度を包含するのが一般的であり、通常、pＨ 7.0〜8.3で約0.01〜1.0MNaイオン濃
度（もしくは別の塩）であり、温度は通常少なくとも約30℃である。緊縮条件は
、不安定化剤、例えばホルムアミドの添加によっても達成し得る。一般的には、
特別なハイブリダイゼーションアッセイにおける非関連プローブに対して観察さ
れる２倍以上に（もしくはそれ以上）のノイズ比のシグナルは、特異的なハイブ
リダイゼーションの検出を表す。それらをコードするタンパク質が実質的に同一
であるなら、緊縮条件下で互いにハイブリダイズしない核酸でも、実質的に同一
のものである。これは、例えば、核酸のコピーが遺伝子コードによって許容され
た最大コドン縮重を用いて創造（構築）される場合に生じる。
【００５２】 以下のものは、本発明の参照ヌクレオチド配列と実質的に同一な相同性ヌクレ
オチド配列をクローンするために使用することができる一組のハイブリダイゼー
ション/洗浄条件の例である。参照ヌクレオチド配列は、1 mM EDTA 2X SSCで洗
浄しながら、50℃で、7% 硫酸ドデシルナトリウム (SDS)、0.5 M NaP04中で、よ
り望ましくは7% 硫酸ドデシルナトリウム (SDS)、0.5 M NaP04、1 mM EDTAで、
参照核酸配列にハイブリダイズするのが好ましい。0.5×SSCで洗浄しながら0.1
% SDS、50℃で洗浄し、より好ましくは7% 硫酸ドデシルナトリウム (SDS)、 0.5
M NaP04、1 mM EDTAで、50℃で、0.5X SSCで洗浄しながら、好ましくは、50℃
で0.1 X SSCで洗浄しながら、7% 硫酸ドデシルナトリウム(SDS)、 0.5 M NaP04
、 1 mM EDTAである。50℃で0.1 % SDS、より好ましくは、50℃で、7% 硫酸ドデ
シルナトリウム (SDS)、0.5 M NaP04、1 mM EDTA、65℃で0.1 X SSC、0.1 % SDS
で洗浄する。
【００５３】 ２つの核酸配列またはタンパク質が実質的に同一であるという別の示唆は、最
初の核酸によってコードされたタンパク質が、第２の核酸によってコードするタ
ンパク質と免疫学的に交叉反応もしくは特異的結合するものである。即ち、タン
パク質が、通常、第２のタンパク質と実質的に同一であるのは、例えば、２つの
タンパク質は保存性のある置換によってのみ異なる場合である。
【００５４】 「抗体への特異的な(または選択的に)結合」または「と特異的に(または選択
的に)免疫反応性のある」なる用語は、タンパク質もしくはペプチドに述べる場
合、タンパク質および他の生物製剤の異種構造集団の存在下、タンパク質の存在
のを決定づける結合反応を意味する。即ち、構築した免疫アッセイ条件下、 特
定抗体は、特定のタンパク質に結合し、試料中の別のタンパク質には顕著な量で
は結合しない。そのような条件下で、抗体への特異的な結合は、特定タンパク質
に対してその特異的に選択された抗体を必要としてもよい。例えば、任意の本発
明の核酸配列によってコードされたアミノ酸配列を有するタンパク質から生じる
抗体は、タンパク質と特異的に免疫反応し、多型性変異体を除く別のタンパク質
と特異的に免疫反応しない抗体を得るために選択され得る。 多様な免疫アッセ
イの形式は、特定のタンパク質と特異的に免疫反応性のある抗体を選択するため
に使用することができる。例えば、固体相ELISAイムノアッセイ、ウエスタン・
ブロットまたは免疫組織化学は、タンパク質と特異的に反応するモノクローナル
抗体を選択するために普通に使用される。特異的な免疫活性を測定するために使
用し得る免疫アッセイの形式および条件の説明については、以下を参照されたい
（HarlowおよびLane(1988) Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Ha
rbor Publications, New York "HarlowおよびLane"を参照)。通常、特異的また
は選択的反応は、少なくとも2倍のバックグラウンドシグナルまたはノイズおよ
び、より普通には10〜100倍以上のバックグラウンドである。
【００５５】 特定の核酸配列の「保存的に修飾された変異」は、実質的に同一配列に対して
、同一のまたは実質的に同一アミノ酸配列をコードする核酸配列、またはアミノ
酸配列をコードしない核酸配列を示す。遺伝子コードの縮重のために、多数の機
能的に同一の核酸は、得られるポリペプチドの全てをコードする。例えば、コド
ンCGT、CGC、CGA、CGG、AGAおよびAGGは、全てアミノ酸のアルギニンをコードす
る。従って、アルギニンがコドンによって明記される全ての位置で、このコドン
は、コードされたタンパク質を変えないで、記述された対応コドンのいずれにも
変えることができる。そのような核酸の変異は、「保存的に修飾された変異」の
１種である「サイレント変異（サイレント突然変異）」である。タンパク質をコ
ードする明細書中に記載されたあらゆる核酸配列は、特に記載しなければ、全て
の起こり得るサイレント変異を記載する。当業者には認識されているであろうが
、核酸中の各コドン（通常、メチオニンに対する唯一のコドンであるATGを除く
）を修飾して、標準的技術によって機能的に同一分子を産生することができる。
従って、タンパク質をコードする核酸の「サイレント変異」の各々は、各記載配
列に内在する。
【００５６】 さらに、１つの技術は、コード配列中の１つのアミノ酸または低い割合のアミ
ノ酸を（通常、5%以下、より典型的には1 %以下)、変えるか、添加するか、削除
することである各置換基の削除または添加は、その変化が化学的に類似したアミ
ノ酸によるアミノ酸の置換がおこる場合に「保存的に修飾された変異」であると
認識されるであろう。機能的に類似するアミノ酸を示す保存的置換表は、当業者
には既知である。以下の５つの群は、互いに保存的置換がある各アミノ酸；脂肪
族；グリシン（G）、アラニン（A）、バリン（V）、ロイシン（L）、イソロイシ
ン（I）；芳香族；フェニルアラニン（F）、チロシン（T）、トリプトファン（W
）；硫黄含有；メチオニン（M）、システイン（S）；塩基性；アルギニン（A）
、ロイシン（K）、ヒスチジン（H）；酸性；アスパラギン酸（D）、グルタミン
酸（E）、アスパラギン（N）、グルタミン（Q）を含む。Creighton (1984) Prot
ein、W. H. Freeman and Companyを参照。さらに、コード配列中の１つのアミノ
酸または低い割合のアミノ酸を変えるか、添加するか、削除する各置換、削除ま
たは添加もまた「サイレント変異」である。
【００５７】 「下位配列」とは、各々、核酸またはアミノ酸（例えばタンパク質）さらに長
い配列の一部を含む核酸またはアミノ酸の配列を示す。
【００５８】 核酸は、追加のヌクレオチド（別の類似分子）が核酸中に組み込まれる場合、
「伸長」する。最も一般的に、これは、ポリメラーゼ（例えば、DNAポリメラー
ゼ）例えば、核酸の3’末端で配列を添加するポリメラーゼによって行われる。
【００５９】 ２つの核酸は、各２つの核酸由来の配列が後代の核酸において組合される場合
、「再結合」する。２つの配列は、両方の核酸が再結合のための基質である場合
には「直接的に」再結合する。２つの配列は、該配列が交叉オリゴヌクレオチド
のような介在物を用いて再結合する場合には「間接的再結合」である。間接的再
結合に対して、１つの配列が、再結合のための実際の基質であり、いくつかの例
では配列は再結合のための基質ではない。
【００６０】 ２つの分子間、例えばリガンドとレセプターの「特異的な結合親和性」は、分
子混合物中のもう一方の１分子に関する優先的結合を意味する。分子の結合は、
結合親和性が約１×104Ｍ−１〜約１×104Ｍ−１もしくはそれ以上である場合、
特異的と考え得る。
【００６１】 形質転換；宿主細胞もしくは生物体に異種構造ＤＮＡを導入するための方法。
【００６２】 「形質転換する（される）」「形質転換」および「組換え」なる用語は、異種
構造ＤＮＡが導入された宿主生物体、例えばバクテリアまたは植物を示す。核酸
分子は、宿主ゲノムに安定に導入、もしくは核酸分子が染色体外分子として存在
し得る。 そのような染色体外分子は自己複製である可能性がある。形質転換し
た細胞、組織または植物は、形質転換過程の最終産物だけでなく、それらの形質
転換した後代を含むと解される。「非形質転換した」、「非形質転換」または「
非組換え」宿主は、異種構造核酸分子を含まない野生型生物体、例えばバクテリ
アまたは植物を示す。
【００６３】 本発明は、植物の追加の種からアラビドプシスNIM 1遺伝子相同物を提供する
ことにより、前記の必要性を解決するものである。特に、本発明は、植物中の組
織的に獲得した耐性を導く生物学的および化学的な誘導物質に応答するシグナル
・トランスダクション・カスケードに関与すると考えられるタンパク質をコード
するNIM1 遺伝子のNicotiana tabacum (タバコ)、Lycopersicon esculentum (ト
マト)、 Brassica napus (脂肪種子)、 Arabidopsis thaliana、Beta vulgaris
(シュガー・ビート（テンサイ）)、 Helianthus annuus (ヒマワリ)およびSolan
um tuberosum (ポト) 相同物の単離に関する。
【００６４】 そのために、本発明は、配列番号: 2、4、6、8、16、18、20、30、32、34、36
、38、 40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、62、64、66、68、70、72ま
たは74をコードするヌクレオチド配列を含む単離した核酸分子を指向する。
【００６５】 別の態様において、本発明は、配列番号: 1、3、5、7、15、17、19、29、31、
33、35、37、39、41、43、45、 47、49、51、53、55、57、61、63、65、67、69
、71または73を含む単離した核酸分子である。
【００６６】 さらなる態様において、本発明は、配列番号: 1、3、5、7、15、 17、19、29
、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、61、63、65、67
、69、71または73の連続する少なくとも20、25、 30、35、40、45または50(好ま
しくは20)個の塩基対部分と、配列において同一の少なくとも20、25、30、35、4
0、45または50 (好ましくは20)の連続した塩基対部分を含むヌクレオチド配列を
含有する単離した核酸分子を指向している。
【００６７】 また別の態様において、本発明は、配列番号:9および10、配列番号: 21および
24、配列番号: 22および24、配列番号:25および28、配列番号:26および28または
配列番号:59および60に記載の一組のプライマーによるポリメラーゼ連鎖反応を
用いてLycopersicon esculentum DNAライブラリィーから増幅し得るヌクレオチ
ド配列を含む単離した核酸分子を指向する。
【００６８】 さらに別の態様において、本発明は、配列番号: 22および24または配列番号:
26および28のに記載の一組のプライマーによるポリメラーゼ連鎖反応を用いてBe
ta vulgaris DNA ライブラリィーから増幅し得るヌクレオチド配列を含む単離し
た核酸分子を指向する。
【００６９】 さらなる態様において、本発明は、配列番号:26および28の一組のプライマー
によりポリメラーゼ連鎖反応を用いてHelianthus annuus DNAから増幅し得るヌ
クレオチド配列を含む単離した核酸分子を指向する。
【００７０】 別の態様において、本発明は、配列番号: 21および24、配列番号: 21および23
、 配列番号: 22および24、 配列番号: 25および28、または配列番号: 26および
28の一組のプライマーによるポリメラーゼ連鎖反応を用いてSolanum tuberosum
DNAライブラリィから増幅し得るヌクレオチド配列を含む単離した核酸分子を指
向する。
【００７１】 さらなる態様において、本発明は、配列番号：9および10または配列番号: 26
および28の一組のプライマーによるポリメラーゼ連鎖反応を用いてBrassica nap
us DNAライブラリィから増幅し得るヌクレオチド配列を含む単離した核酸分子を
指向する。
【００７２】 別の態様において、本発明は、記載の配列番号: 13および14、 配列番号: 21
および24、または配列番号: 22および24の一組のプライマーによりポリメラーゼ
連鎖反応を用いてArabidopsis thaliana DNAライブラリィから増幅し得るヌクレ
オチド配列を含む単離した核酸分子を指向する。
【００７３】 さらなる態様において、本発明は、配列番号: 9および10、 配列番号: 11およ
び12、 配列番号: 21および24、配列番号:22および24、 配列番号: 25および28
、または配列番号: 26および28に記載した一組のプライマーによるポリメラーゼ
連鎖反応を用いるNicotiana tabacum DNAライブラリィから増幅し得るヌクレオ
チド配列を含む単離した核酸分子を指向する。
【００７４】 さらなる態様において、配列番号: 1、3、5、7、15、17、19、29、31、33、35
、37、39、41、43、45、47、49、51、53、 55、57、61、63、65、67、69、71ま
たは73のコード配列(CDS)の最初の20個のヌクレオチドと終りの20個のヌクレオ
チドの逆の相補物を含む一組のプライマーによるポリメラーゼ連鎖反応を用いて
植物DNAライブラリィから増幅し得るヌクレオチド配列を含む単離した核酸分子
を指向する。
【００７５】 本発明は、本発明のNIM1相同物のコード配列に機能的に結合した植物中におい
て活性なプロモーターを含むキメラ遺伝子、そのようなキメラ遺伝子を含む組換
えベクター、その中で宿主細胞中に安定に導入され得るベクター、さらにそのよ
うなベクターで形質転換した安定な宿主を包含する。 好ましくは、宿主は、下
記の農業的に重要な穀類植物の中の１つ；コメ、小麦、大麦、ライ麦、キャノー
ラ、シュガーコーン、コーン、ポテト、ニンジン、サツマイモ、シュガー・ビー
ト（テンサイ）、インゲンマメ、エンドウ、チコリ、レタス、キャベツ、カリフ
ラワー、ブロッコリー、カブ、ラディッシュ、ホウレンソウ、アスパラガス、オ
ニオン、ニンニク、ナス、コショウ、セロリー、カボチャ、ペポカボチャ、キュ
ウリ、リンゴ、洋ナシ、マルメロ、スモモ、チェリー、ピーチ、ネクタリン、ア
プリコット、イチゴ、ブドウ、キイチゴ、ブラックベリー、パイナップル、アボ
ガド、パパイア、マンゴ、バナナ、ダイズ、タバコ、トマト、モロコシ属類およ
びサトウキビのような植物を包含する。本発明は、本発明の植物由来の種も包含
する。
【００７６】 さらに、本発明は、本発明のNIM 1相同物のコード配列に機能的に結合する、
植物においてそれ自身プロモーター活性を含むキメラ遺伝子を発現することによ
って、植物におけるSAR遺伝子発現を増加する方法を指向する。コードされたタ
ンパク質を野生型の植物以上に高いレベルで形質転換植物中で発現する。
【００７７】 さらに、本発明は、本発明のNIM 1相同物のコード配列に機能的に結合する、
植物においてそれ自身プロモーター活性を含むキメラ遺伝子を発現することによ
って、植物における疾病耐性を保持する方法を指向する。コードされたタンパク
質は野生型の植物以上に高いレベルで形質転換された植物中で発現する。
【００７８】 さらに、本発明は、配列番号: 9-14、21-28、59および60からなる群から選択
されたPCRプライマーを指向する。
【００７９】 本発明は、配列番号: 1、3、5、7、15、17、19、29、31、33、35、37、39、41
、43、45、47、49、51、53、55、57、61、63、 65、67、69、71または73のコー
ド配列（ＣＤＳ）の最初の２０つのヌクレオチドおよび終りの２０つのヌクレオ
チドの逆相補物に対応する一組のプライマー、もしくは下記の配列番号: 9およ
び10、 配列番号: 11および12、 配列番号: 13および14、 配列番号: 21および2
4、 配列番号: 22および24、配列番号: 21および23、 配列番号: 25および28、
配列番号: 26および28、または配列番号: 59および60として記載した一組のプラ
イマーによるポリメラーゼ連鎖反応を用いるNicotiana tabacum DNAライブラリ
ィから増幅することからなる、植物における組織的耐性を導き得るシグナル・ト
ランス・ダクション・カスケードに関するNIM１相同物を単離するための方法。
好ましい態様において、植物DNAライブラリィは、Nicotiana tabacum (タバコ)
、Lycopersicon esculentum (トマト)、 Brassica napus (脂肪種子)、Arabidop
sis thaliana、Beta vulgaris (サトウキビ)、 Helianthus annuus (ヒマワリ)
またはSolanum tuberosum (ポット)である。
【００８０】 本明細書に記載のNIM1相同物の幾つかのノーザンのデータから、構成的発現ま
たはBTH誘導性が示された。明細書中に記載のNIM1 遺伝子の相同物は、生物学的
および化学的誘導物質に応答するシグナルトランスダクション・カスケードに関
与するタンパク質をコードすることを示唆し、これは植物において組織的に獲得
した耐性を示す。また、本発明は、SAR 遺伝子発現を増強するおよび疾病耐性を
強めるために、植物においてそのようなNIM1 相同物の形質転換性発現に関する
。
【００８１】 本発明のDNA 配列は、以下の実施例に記載された技術を用いて、またはPCRプ
ライマーを構築するための塩基として挙げた配列に示した配列を用いるPCRによ
って単離し得る。例えば、最初および最後の約20-25個の配列番号: 7の連続した
ヌクレオチド (例えば、ヌクレオチド1-20、配列番号: 7の1742-1761)配列を有
するオリゴヌクレオチドは、供給植物(Arabidopsis thaliana)からのcDNA ライ
ブラリィから直接的にcDNA 配列 (配列番号: 7)を増幅するためのＰＣＲプライ
マーとして使用し得る。本発明の別のDNA 配列は、同様に、PCRプライマーのた
めの塩基として挙げた配列に記載したDNAの末端を用いる各植物のcDNAまたはゲ
ノムDNAライブラリィから、PCRによって増幅することが可能である。
【００８２】 植物において本発明の NIM1 相同物の形質転換発現は、植物病原体に対する広
範な免疫性をもたらすと考える。この病原体にはウイルスまたは病原体に限定す
るものではないが、例えばタバコまたはキュウリモザイクウイルス、リングスポ
ットウイルスまたはネクローシスウイルス(necrosis virus)、ペラゴニウム葉巻
ウイルス、アカクローバーまだらウイルス、トマトブッシースタントウイルス、
その他のウイルス；菌類、例えばoomycetes、例えばPhythophthora parasitica
およびPeronospora tabacina;バクテリア、例えばPseudomonas syringeおよびPs
eudomonas tabac；aphidsのような昆虫、例えば Myzus persicae;および鱗翅類
、例えば、Heliothus spp;および線虫、例えば、Meloidogyne incognitaが含ま
れる。本発明のベクターおよび方法は、綿毛ウドンコ病に限定しないが、マメ植
物、例えばScleropthora macrospora、 Sclerophthora rayissiae、 Sclerospor
a graminicola、Peronosclerospora sorghi、 Peronosclerospora philippinens
is、 Peronosclerospora sacchariおよびPeronosclerospora maydis; rusts suc
h as Puccinia sorphi、Puccinia polysoraおよびPhysopella zeae; 他の菌類、
例えばCercospora zeae-maydis、Colletotrichum graminicola、 Fusarium mono
liforme、 Gibberella zeae、 Exserohilum turcicum、 Kabatiellu zeae、 Ery
siphe graminis、 SeptoriaおよびBipolaris maydis;およびバクテリア例えばEr
winia stewartaiを包含する多くの植物体の疾病に対して有用である。
【００８３】 本発明の方法は、裸子植物、単子葉植物および双子葉植物を含む多種の植物に
疾病耐性を与えるのに使用することができる。しかし、疾病耐性は、これら広い
分類の中に含まれる全ての植物に与えることができるが、特に農業的に重要な穀
類植物、例えば、コメ、小麦、 大麦、ライ麦、 コメ、小麦、大麦、ライ麦、脂
肪種子、コーン、ポテト、ニンジン、サツマイモ、シュガー・ビート（テンサイ
）、インゲンマメ、エンドウ、チコリ、レタス、キャベツ、カリフラワー、ブロ
ッコリー、カブラ、ラディッシュ、ホウレンソウ、アスパラガス、タマネギ、ニ
ンニク、ナス、コショウ、セロリー、ニンジン、カボチャ、ペポカボチャ、ズッ
キーニ、キュウリ、リンゴ、洋ナシ、マルメロ、メロン、プラム、チェリー、ピ
ーチ、ネクタリン、アプリコット、イチゴ、ブドウ、キイチゴ、ブラックベリー
、パイナップル、アボガド、パパイア、マンゴ、バナナ、ダイズ、タバコ、トマ
ト、モロコシ属類およびサトウキビのような植物において有用である。
【００８４】 本発明の配列をコードするNIM1相同物を、標準的な遺伝子工学技術を用いて本
発明に関するキメラ遺伝子を作るために植物用に設計した発現カセットに導入す
ることも可能である。特異的な調節配列、例えばプロモーター、シグナル配列、
5'および3'非翻訳配列および選択した植物宿主における所望のパターンおよび発
現レベルに達するために適当なエンハンサーの選択は、当業者の技術範囲内であ
る。適当な読み枠に結合した個々の配列を含む得られた分子を、宿主植物細胞中
で形質転換し得るベクターに導入してもよい。
【００８５】 植物または植物細胞において機能し得るプロモーターの例(即ち、関連するコ
ード配列の発現を起動し得る、例えば植物細胞におけるNIM1 相同物に対してコ
ードするもの)は、アラビドプシスおよびトウモロコシ・ユビキチンプロモータ
ー;カリフラワー・モザイク・ウイルス (CaMV)19Sまたは35S プロモーターおよ
びCaMVダブル・プロモーター; 米・アクチンプロモーター; タバコ、アラビドプ
シス、またはトウモロコシ由来のPR-1 プロモーター; オパリンシンターゼ・プ
ロモーター; リブロースビスホスフェートカルボキシラーゼ(ssuRUBISCO)のスモ
ールサブユニットのプロモーターおよびその他のプロモーターを包含する。特に
好ましいのは、アラビドプシス・ユビキチンプロモーターである。該プロモータ
ー、それ自身は、技術承認された方法に関連する関連コード配列の発現を増加す
るために、プロモーター強度を操作するために修飾することも可能である。本発
明で使用するための好ましいプロモーターは、高いレベルの構成的発現を与える
ものである。
【００８６】 シグナルペプチドまたはトランジットペプチドを、所望の作用部位に発現タン
パク質の移送を指向するために本発明のキメラDNA構築物中のNIM1相同物コード
配列に融合してもよい。シグナルペプチドの例は、植物病原遺伝子関連タンパク
質、例えばPR-1、PR-2および同様のものに、本来的に結合したものを包含する（
例えば、Payne et al., 1988を参照）。トランジットペプチドは、クロロプラス
ト・トランジットペプチド、例えば、Von Heijne et aL (1991)、Mazur et al.(
1987)およびVorst et al.(1988) に記載されたようなもの;およびミトコンドリ
ア・トランジットペプチド、例えばBoutry et al.(1987)に記載されたようなも
のを包含する。また、様々な細胞性区画、例えば液胞へのコードされたタンパク
質の局在化を生じるような配列も包含する。例えば、Neuhaus et al. (1991)お
よびChrispeels (1991)を参照。
【００８７】 本発明のキメラDNA構築物は、多数のプロモーターの複製または多数の本発明
のNIM1相同物コード配列の複製を包含してもよい。さらに、構築物は、マーカー
に対するコード配列、およびDNA分子において別の機能的配列を有する適当な読
み取り枠において各々の、シグナルペプチドまたはトランジットペプチドのよう
な他のペプチドに対するコード配列を包含することができる。そのような構築物
の調製は、当業者の通常の技術範囲内である。
【００８８】 有用なマーカーは、除草剤、抗生物質または薬物の耐性を提供するペプチドを
包含する。例えば、プロトポルフィリノーゲンオキシダーゼ（protoporphyrinog
en）阻害剤、ヒグロマイシン、 カナマイシン、 G418、ゲンタマイシン、リノコ
マイシン、メトトレキサート、 グリホセート、ホスフィノスリシン（phosphino
thricin）またはその類似物に対する耐性である。これらのマーカーは、 非形質
転換細胞からの本発明のキメラDNA構築物で形質転換した細胞を選択するのに使
用し得る。他の有用なマーカーは、視覚的な反応、例えば、顕色反応、例えばル
シフェラーゼ、β-グルクロニダーゼまたはβ-ガラクトシダーゼによって簡単に
検出できるペプチド性酵素である。
【００８９】 明細書中に記載されたような植物の発現に対して構築したキメラ遺伝子は、多
くの技術的に承認された方法で植物細胞に導入することができる。当業者は承知
しているように、その方法の選択は、形質転換を標的とした植物の型 (即ち、単
子葉植物または双子葉植物) および/または器官(即ち、細胞核、クロロプラスト
、ミトコンドリア)に依存する。
【００９０】 植物細胞を形質転換する適当な方法は、マイクロインジェクション(Crossway
et al., 1986)、エレクトロポーレーション(Riggs et al., 1986)、アグロバク
テリウム媒介性形質転換(Hinchee et al., 1988; Ishida et al., 1996)、直接
遺伝子形質転換(Paszkowski et al., 1984; Hayashimoto et al., 1990)および
アグラセタス社（Agracetus Inc., Maison、Wisconsin）およびデュポン社（Dup
ont、Inc., Wilmington、Delaware）販売の装置を用いるバリスティック・パー
ティクル・アクセレーション（ballistic particle acceleration）(参照、例え
ば、U. S. Patent 4,945,050;およびMcCabe et al., 1988)である。また、Weiss
inger et al.(1988); Sanford et al. (1987)(タマネギ); Christou et au (198
8) (大豆); McCabe et al., (1988）(大豆）；Datt et al. (1990) (米); Klein
et al., (1988) (トウモロコシ); Klein et au (1988) (トウモロコシ); Klein
et al.,(1988) (トウモロコシ); Fromm et al. (1990);およびGordon-Kamm et
al. (1990) (トウモロコシ); Svab et al) (1990) (タバコクロロプラスト); Go
rdon-Kamm et au (1993) (トウモロコシ); Shimamoto et al. (1989) (米);Chri
stou et al. (1991) (米); Datta et al. (1990) (米); European Patent Appli
cation EP 0 332 581 (orchardgrassおよびother Pooideae); Vasil et al. (19
93) (小麦); Weeks et al. (1993) (小麦); Wan et al. (1994) (大麦); Jahne
et al. (1994) (大麦); Umbeck et al. (1987) (綿花); Casas et al. (1993) (
モロコシ類); Somers et al. (1992) (カラスムギ); Torbert et al. (1995) (
カラスムギ); Weeks et al., (1993) (小麦); WO 94/13822 (小麦);およびNehr
a et al) (1994) (小麦)を参照。マイクロインジェクション・ボンバードによる
トウモロコシへの組換体DNA分子を導入するための特に好ましい一組の態様は、K
oziel et al.(1993);Hill et al. (1995)およびKoziel et al. (1996)に記載さ
れている。追加の好ましい態様は、EP 0 292 435に記載のトウモロコシのための
プロトプラスト形質転換方法である。
【００９１】 NIM1相同物のコード配列を含むキメラ遺伝子は、特定の植物種へ形質転換され
、通常の生育技術を用いて、同種において遺伝されるか、同種の変異体、特に市
販の変異体に伝播され得る。本発明の特に好ましい植物は、上記の農業的に重要
な穀物植物を包含する。上記記載の形質転換種子および植物中に執り込まれたの
遺伝特性は、有性生殖によって受け継がれ、後代植物に維持および伝播され得る
。
【００９２】 実施例 本発明は、以下の詳細な方法、調製物および実施例によってさらに詳細に説明
するものである。実施例は、説明のためにのみ存在し、本発明の範囲を制限する
ために構成するものではない。本明細書で使用した標準的な組換えDNAおよび分
子クローニング技術は、当業者には既知であり、Sambrook、et al., 1989;T.J.S
ilhavy、M. L. BermanおよびL. W. Enquis 1984;およびAusubel, F. M. et al.,
1987らによって開示されている。
【００９３】 I. アラビドプシスNIM1 遺伝子の相同物の単離 実施例 1: Nicotiana tabacum由来のNIM1相同物の単離 タバコのcDNAライブラリィ由来のファージの大量の摘出物からプラスミドDNA
を、以下のプライマーの組を用いてPCR用の鋳型として使用する: 5'-AGATTATTGT
CAAGTCTAATG-3' (配列番号:9) ＋ 5'-TTCCATGTACCTTTGCTTC-3'(配列番号:10)、
および5'-GCGGATCCATGGATAATAGTAGG-3'(配列番号：11）＋5'-GCGGATCCTATTTCCTA
AAAGGG-3'(配列番号:12)。 サイクル条件は、94 ℃で１分間、40℃で１分間およ
び1.5分間で72℃であり、反応は40サイクル実施するのが好ましい。PCR産物を、
アガロースゲルに流し、切取り、pCRII-TOPO (Invitrogen)でクローン化した。
【００９４】 タバコ NIM1相同物の完全長cDNA配列は、配列番号:1に示した。このcDNA 配列
によってコードされるタンパク質は、配列番号:2に示した。配列番号:1を含むタ
バコ NIM1相同物は、NRRL (Agricultural Research Service、 Patent Culture
Collection、 Northern Regional Research Center、 1815 North University S
treet、 Peoria、 Illinois 61604、U. S. A)によって、1998年8月17日にpNOV12
06として寄託され、受託番号がNRRL B-30051である。
【００９５】 実施例 2: Lycopersicon esculentum 由来のNIM1相同物の単離 ファージミドを、Stratageneのプロトコールを用いて、トマトのλZAPIIcDNAラ
イブラリィから切り出した。ファージミド(プラスミド)を、約80,000クローンの
各々の10プールでE coli XL1-Blueにマス形質転換し、DNAをこれらのプールから
抽出した。このプールは、以下のプライマー： 5'-AGATTATTGTCAAGTCTAATG-3'(
配列番号: 9)および5'-TTCCATGTACCTTTGCTTC-3'(配列番号: 10)を用いるPCRによ
ってNIM1 相同物の存在のためにPCRによってスクリーンした。
【００９６】 プールから増幅した配列は、PCR増幅したDNA断片をクローニングし、配列決定
することによってNIM1相同物を含有することが確認された。相同物を含む単一ク
ローンが得られるまで、プールを逐次小さくし、NIM1 相同物の存在のために上
記した同じプライマーを用いるPCRによってスクリーンした。最後に、5'末端を
欠失した部分的遺伝子を含むcDNAクローンは、5'RACE (Rapid Amplification fo
cDNA Ends)を使用して、遺伝子の完全長配列を得た。
【００９７】 トマトNIM1相同物の完全長cDNA配列は、配列番号：3に示し、このcDNA配列に
よってコードされたタンパク質は、配列番号:4に示した。配列番号: 3を含有す
るトマトのNIM1相同物は、pNOV1204として、NRRL (Agricultural Research Serv
ice、 Patent Culture Collection、 Northern Regional Research Center、181
5 North University Street、Peoria、Illinois 61604、U.S.A)によって、1998
年、8月17日の寄託されており、受託番号がNRRL B-30050である。
【００９８】 実施例 3: Brassica napus由来のNIM1相同物の単離 ファージミドを、Stratageneのプロトコールを用いて、Brassica napusのX ZA
PllcDNAライブラリィから切り出した。ファージミド(プラスミド)を、約80,000
クローンの各々の10プールでE coli XL1-Blueにマス形質転換し、DNAをこれらの
プールから抽出した。該プールを、以下のプライマー: 5'-AGATTATTGTCAAGTCTAA
TG-3' (配列番号:9)および5'−TTCCATGTACCTTTGCTTC-3' (配列番号:10) を用い
るPCRによってNIM1相同物の存在のためにPCRによってスクリーンした。
【００９９】 プールから増幅した配列は、PCR増幅したDNA断片をクローニングし、配列決定
することによってNIM1相同物を含有することが確認された。相同物を含む単一ク
ローンが得られるまで、プールを逐次小さくし、NIM1 相同物の存在のために上
記した同じプライマーを用いるPCRによってスクリーンした。最後に、5'末端を
欠失した部分的遺伝子を含むcDNAクローンにおいて、5'RACE (Rapid Amplificat
ion fo cDNA Ends)を使用して遺伝子の完全長配列を得た。
【０１００】 Brassica napusのNIM1相同物の部分遺伝子は、配列番号: 5に示し、このcDNA
配列によってコードされたタンパク質は、配列番号: 6に示した。配列番号: 5を
含有するBrassica napus NIM1相同物は、pNOV1203として、NRRL (Agricultural
Research Service、 Patent Culture Collection、Northern Regional Research
Center、1815 North University Street、Peoria、Illinois 61604、U.S.A) よ
って、1998年、8月17日の寄託されており、受託番号がNRRL B-30049である。
【０１０１】 実施例 4: Arabidopsis thalianaNIM1相同物の単離 アラビドプシスまたはトマトNIM1アミノ酸配列を用いるBLASTの検査から、バ
クテリア人工クロモソーム (BAC) F18D8由来のアラビドプシスゲノム配列を含む
GenBank登録B26306を検出した。 BAC 配列の部分が、NIM1に顕著に類似したタン
パク質(47% アミノ酸同一性)をコードすると予測される。以下のプライマーを、
F18D8 配列の領域に対して設計する: 5'−TCAAGGCCTTGGATTCAGATG-3' (配列番
号:13)および5'−ATTAACTGCGCTACGTCCGTC-3'(配列番号:14)。
【０１０２】 プライマーは、鋳型としてpFL61依存性アラビドプシスcDNAライブラリィ由来
のDNAによるPCR反応に用いた。好ましいサイクル条件は、94℃で30秒、53℃で30
秒、 72℃で30秒である。該反応は、40サイクル行うのが好ましい。 予想したサ
イズ(290塩基対)のPCR産物を検出し、F18D8 プライマーに一致するcDNAクローン
を、連続的精製法でcDNAライブラリィから精製する。この方法では、ライブラリ
ィの増加少量をE. coliに通し、PCRによるクローンの存在下に再検出する。最後
に、シングル陽性クローンを得、配列決定した。クローンの配列により、NIM1に
対する顕著相同性を有するオープンリーディングフレームの存在を確認する。
【０１０３】 該Arabidopsis thalianaのNIM1相同物の完全長cDNA配列は、配列番号: 7に示
し、このcDNA配列によってコードされたタンパク質は、配列番号: 8に示した。
配列番号: 7を含有するArabidopsis thaliana NIM1相同物は、E. coliにおいてA
tNMLc5として、NRRL (Agricultural Research Service、 Patent Culture Colle
ction、 Northern Regional Research Center、1815 North University Street
、Peoria、Illinois 61604、U.S.A) よって、1999年、5月25日に寄託されており
、受託番号がNRRL B30139である。
【０１０４】 実施例 5: 縮重プライマーの設計 実施例 4 (AtNMLc5-配列番号: 7)に上記したNIM1遺伝子(Ryals et al.,1997)
およびNIM−様遺伝子に加えて、Arabidopsis thalianaは、３つの別のNIM-様(NM
L)ゲノム配列:AtNMLc2 (配列番号:15) AtNMLc4-1 (配列番号: 17)およびAtNMLc4
-2 (配列番号:19)を含む。c[＃］は特定のNML 遺伝子が位置するクロモソームの
数を示す。GCG Seqwebの多重配列のアライメント・プログラム(Pretty, Wiscons
in Genetics Computer Group)を用いて、Arabidopsis thaliana (Ryals et al.,
1997)、 Nicotiana tabacum (実施例 1-配列番号: 1)、およびLycopersicon e
sculentum (実施例 2−配列番号: 3)由来のNIM1配列、加えて Arabidopsis thal
iana (配列番号: 7、15、17、および19)由来のNML 配列を位置調整する。 この
アライメントを基に、３つの領域は、ヒマワリ、ポテト、キャノーラを含む他の
穀物種由来のNIM１相同物のPCR増幅のための縮重PCRプライマーを設計するため
に十分な保存を生じる。これらの保存領域から設計したプライマーを、表１に示
す。NIM 1(A-D)プライマーは、Arabidopsis thaliana (Ryals et al., 1997)、N
icotiana tabacum (実施例 1-配列番号: 1)およびLycopersicon esculentum (実
施例 2-配列番号:3)由来のNIM1 遺伝子のみの構成を用いて設計する。NIM 2 (A-
D) プライマーは、これら３つのプライマーに加えてArabidopsis thaliana(配列
番号: 7、15、17および19)由来の４つのNML 配列を示す。プライマーは、Genosy
s Biotechnologies,Inc. (The Woodlands,Texas)によって合成されるのが好まし
い。縮重の位置を、オリゴヌクレオチド中のシングル部位で１以上の塩基の表記
によって表１に示した。「配向性」は、プライマーがcDNAの3'末端(下流)方向ま
たは5'末端(上流)方向のいずれに向いているかどうかを示す。
【０１０５】 表１: 縮重プライマー
【表１】
【０１０６】 実施例 6: 穀物種由来のNlM4-様DNA断片のPCR増幅 NIM-様 DNA断片は、アラビドプシス、トマト、タバコ、テンサイ、ヒマワリ、
ポテトおよびキャノーラから、鋳型としてゲノムDNAまたはcDNAのいずれかを使
用して増幅した。期待された断片サイズと共に使用したプライマー組合せ物を、
下記表９に記載する。
【０１０７】 表２:プライマー組み合わせ物およびDNA断片サイズ
【表２】
【０１０８】 縮重プライマーPCRは、GeneAmp PCR システム 9700 (PE Applied Biosystems,
Foster City、 CA) において、即時使用し得るPCRビーズ(Amersham、 Piscataw
ay、 NJ)を用いて行った。20〜40ngのゲノムDNAまたは5〜10 ngのcDNA、終濃度0
.8 μMの各プライマーで各反応に用いた。好ましいサイクルパラメーターは以下
である： 94℃で1分間; ３サイクル[94℃で30秒間;37℃で30秒間; 72℃で2分間
］; 35サイクル[94℃で30秒間; 60℃で30秒間; 72℃で2分間]; 72℃で7分間; 4
℃で保つものである。反応産物を2%アガロースゲルで分析し、適当なサイズのDN
A 断片を切り取った。DNA 断片を、例えば、Geneclean III Kit (BIO 101,Inc.,
Carlsbad, CA)を用いるアガローズゲルから単離する。例えば、TOPO TA クロー
ニング・キット(Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA)を用いてクローン化し
た。プラスミドは、例えば、CONCERT ラピッド・プラスミド・ミニプレップ・シ
ステム（CONCERT Rapid plasmid Miniprep System）[Life Technologies, Inc.,
Rockville、MD]を用いて単離し、標準プロトコールにより配列決定する。
【０１０９】 NlM−様DNA 断片を、試みた全ての植物種から得る。多くのケースの複合体に
おいて、唯一のNIM-様 配列を得た。表3および図2は、単離したNlH-様断片を詳
細に示す。 表3: NlH−様PCR断片
【表３】
【０１１０】 これらの結果に基づいて、上記記載の縮重プライマーPCRは、広範囲の植物種
由来のNlM−様断片を増幅し得る。特に、NIM 2B/NIM 2Dのプライマー組合せで、
試みた全ての植物種から鋳型としてcDNAを用いて成功した。即時使用のPCRビー
ズの使用は、産物を得るために特に好ましい。さらに、ゲノムDNAが充分である
場合、アラビドプシス、トマトおよびテンサイ以外の全ての試料に対して、鋳型
としてcDNAを用いるのが好ましい。
【０１１１】 実施例 7: 追加の縮重プライマー 縮重プライマーの新しい一組を、トマトも表１に挙げた縮重プライマーを用い
て増幅しない類似のNIM−様配列を含有するかどうかの測定に使用するために、
４つのタバコの断片(配列番号: 29、31、33および35)およびトマトの配列 (配列
番号:37)の配列アラインメントを基に設計する。これらの断片から設計したプラ
イマーを表３に記載する。Genosys Biotechnologies, Inc. (The Woodlands, Te
xas)によって合成するのが好ましい。縮重部位は、オリゴヌクレオチド中のシン
グル部位で１以上の塩基の表記によって、表3に示す。「配向性」は、プライマ
ーがcDNAの3'末端(下流)方向または5'末端(上流)方向のいずれに向いているかを
示す。
【０１１２】 表 4: 追加の縮重プライマー
【表４】
【０１１３】 縮重プライマーPCRを、トマトのcDNAを用いて上記のように行い、潜在性産物
をクローン化し、配列を決定した。 配列分析は、２つのNlM-様断片の分類を明
かにする。1番目は、配列番号: 37に示したトマトの配列と同一であり、２番目
は、トマトにおいて固有であり、配列番号: 31および33に示したようなタバコの
配列と88%の同一性であった。この新しいトマトの配列の該配列を、配列番号: 6
1として示した。
【０１１４】 実施例 8:完全長NIM-様cDNA NIM-様PCR 断片由来の対応するcDNA 配列の上流および下流は、SMART RACE cD
NA増幅キット(Clontech, Palo Alto, CA)を用いるRACE PCRによって得るのが好
ましい。好ましくは、少なくとも３つの独立したRACE産物を、PCRエラーを除去
するために各5'-または3'-末端に対して配列決定を行った。配列番号: 39、43お
よび31に示したNIM−様PCR断片に一致する、テンサイ、ヒマワリBおよびタバコ
B NIM1 相同物に対応する得られる完全長cDNA配列を、各配列番号:63、65および
73として示した。
【０１１５】 NIM-様ゲノム配列のAtNMLc2 (配列番号: 15)、AtNMLc4-1 (配列番号: 17)およ
びAtNMLc4-2 (配列番号:19) に対応するNIM-様のArabidopsis thaliana cDNAの
ものは、RT-PCRでクローン化するのが好ましい。Arabidopsis thaliana由来の全
RNAは、オリゴdTプライマーを用いて逆転写する。得られる1番目の鎖cDNAを、各
ゲノム配列(配列番号: 15、17および19)のコード領域の５'末端および３'末端を
基にして設計した特異的なセンス・およびアンチセンス・オリゴヌクレオチドプ
ライマーを用いるPCRによって増幅する。予想したサイズのPCR断片を、ベクター
中でクローン化し、配列決定し、これらのcDNAクローンがNIM-様ゲノム配列に一
致することを確認する。NIM-様ゲノム配列 AtNMLc2 (配列番号: 15)と一致するc
DNA 配列は、配列番号:67として示す；NIM-様ゲノム配列 AtNMLc4-2 (配列番号:
17)に一致する完全長cDNA 配列は配列番号: 69として示す; NIM-様ゲノム配列 A
tNMLc4-2 (配列番号:19)に一致する完全長cDNA 配列は配列番号：71として示す
。
【０１１６】 実施例 9:ノーザン・ブロット ノーザンのデータによると、テンサイのNIM-様クローン(配列番号: 39および6
3)の発現が、100 μMまたは300μMのBTH (ベンゾ(1,2,3)チアジアゾール−カル
ボチオイック酸 S-メチルエステル)処置後、3〜7倍に増加すること。また、ノー
ザンのデータから、ヒマワリ Aの NIM-様 クローン(配列番号: 41)の発現は構成
的である。さらに、ノーザンのデータによると、ヒマワリ Bの NIM-様 クローン
(配列番号: 43および65)の発現が、100μMまたは300μM BTH処理の後、2倍増加
する。
【０１１７】 II．植物における本発明の遺伝子配列の発現 本発明のNIM1相同物は、慣習的な組換DNA技術を用いて植物細胞に導入され得
る。一般的に、これは、当分野で既知の標準的なクローニング方法を用いて、コ
ード配列が異種構造（即ち、通常存在しない）である発現系に本発明のコード配
列を挿入することに含む。該ベクターは、挿入したタンパク質をコードする配列
の転写および翻訳に必要な配列を包含する。当分野において既知の多数のベクタ
ー系を用いてもよく、例えば、プラスミド、バクテリオファージ、ウイルスおよ
び他の修飾ウイルスである。適当なベクターは、制限するものではないが、ウイ
ルス性ベクター、例えばラムダベクター系のλgtl121、λgtl0およびCharon 4;
プラスミドベクター例えば、pBl121、pBR322、 pACYC 177、pACYC 184、pAR系、
pKK223-3、pUC8、pUC9、pUC18、pUC19、pLG339、pRK290、pKC37、pKC101、 pCD
NAII;およびその他の類似の系を包含する。発現系の成分は、発現を増加するた
めに修飾されていてもよい。例えば、短く切り取った配列、ヌクレオチドの置換
または別の修飾を行ってもよい。本明細書に記載の発現系は、実際に、適当な条
件下で任意の穀物植物を形質転換するために使用し得る。形質転換した細胞を、
形質転換遺伝子植物においてNIM1 相同物がSAR 遺伝子発現を増加させ疾病耐性
を強めるように、全植物中に再生することができる。
【０１１８】 実施例 10: 植物の発現カセットの構築 形質転換植物における発現を意図するコード配列は、植物で発現し得る適当な
プロモーターの後の発現カセットに最初に集約される。発現カセットもまた、ト
ランスジーンの発現のために必要なまたは選択された任意の別の配列を包含する
ことができる。そのような配列は、制限するものではないが、転写ターミネータ
ー、発現を増強する外来配列、例えばイントロン、バイタル（Vital）配列、特
異的な器官および細胞区画に遺伝子産物を標的とすることを意図する配列を包含
する。これらの発現カセットを、下記の植物形質転換ベクターに容易に導入し得
る。以下は、典型的な発現カセットの多様な成分を説明である。
【０１１９】 １．プロモーター 発現カセットで使用したプロモーターの選択は、形質転換植物中のトランスジ
ーンの空間的かつ時間的な発現パターンを決定する。選択したプロモーターは、
特定細胞型中（例えば、植物表皮細胞、葉肉細胞、根皮層細胞）または特定組織
や器官（例えば、根、葉または花）においてトランスジーンを発現する。その選
択は遺伝子産物の蓄積に関する所望の位置が反映する。一方、選択されたプロモ
ーターは、多様な誘導条件の下で遺伝子の発現を進め得る。プロモーターは、そ
の強度、即ち転写を促進する能力を変える。 利用した宿主細胞系によって、そ
の遺伝子本来のプロモーターを包含する、多くの適切なプロモーターの中の１つ
を用い得る。以下は、発現カセットで使用し得るプロモーターの非制限的な例で
ある。
【０１２０】 a.構成的発現、ユビキチンプロモーター: ユビキチンは、多くの細胞型で蓄積することが知られた遺伝子産物であり、そ
のプロモーターは、形質転換植物(例えば、ヒマワリ Binet et a1., 1991; トウ
モロコシ-Christensen et al., 1989;およびアラビドプシス-Norris et al., 19
93）で使用するために幾つかの種から単離された。トウモロコシのユビキチンプ
ロモーターは、形質転換単子葉植物系で開発され、単子葉植物の形質転換のため
に構築されたその配列およびベクターは、特許出願公開 EP 0 342 926 (to Lubr
izol)に開示されている。Taylor et al.(1993)は、トウモロコシユビキチンプロ
モーターおよび第一のイントロンを含むベクター (pAHC25)、およびマイクロプ
ロジェクト・衝撃法によって導入される場合の非常に多くの単子葉植物の細胞懸
濁液中でのその高い活性を記載する。アラビドプシスのユビキチンプロモーター
は、本発明のNIM1相同物と共に使用するのに特に好ましい。ユビキチンプロモー
ターは、単子葉植物および双子葉植物両方の形質転換植物における遺伝子発現に
適当である。適当なベクターは、pAHC25またはこの出願で記載された形質転換ベ
クターの全ての誘導体であり、適当なユビキチンプロモーターおよび／またはイ
ントロン配列の両方の導入によって修飾される。
【０１２１】 b.構成的発現、CaMV 35Sプロモーター: プラスミドpCGN1761の構築は、特許出願公開 EP 0 392 225 (実施例 23)に記
載されている。pCGN1761は、「２つの」CaMV 35S プロモーターおよびプロモー
ターおよびターミネーターの間の独特なEcoRl部位を有するtml 転写ターミネー
ターを包含し、ｐUC型の骨格を持つ。NotlおよびXhol 部位に加えて存在するEco
R１部位を含み修飾ポリリンカーを有するpCGN1761の誘導体を構築する。該誘導
体はpCGN1761 ENXを構築した。pCGN1761 ENXは、トランスジーン植物における35
Sプロモーターの制御下でその発現の目的のためにポリリンカー内にcDNA 配列ま
たはコード配列（細菌のORF 配列を含む)のクローニングに有用である。そのよ
うな構築物の完全な35Sプロモーター・コード配列−tmlターミネーター・カセッ
トを、下記に記載したような形質転換ベクターに移すために、プロモーターに対
してHindIII、SphI、SallおよびXbal部位5'およびターミネーターに対してXbal
、BamHIおよびBgII部位3'で切り出すことができる。さらに、２つの35Sプロモー
ター断片は、別のプロモーターで置換するために、HindIII、SphI、Sall、Xbal
もしくはPstlで5'切出し、およびポリリンカー制限部位（EcoRI、NotlまたはXho
l）の何れかで3'切出しによって、除去し得る。所望であれば、クローニング部
位の周辺の修飾は、翻訳を増強し得る配列の導入によって行い得る。特に、重複
発現を必要とする場合に有用である。例えば、pCGN1761 ENXは、U.S.特許No.5,6
39,949の実施例37で記載されるような翻訳開始部位の至適化によって修飾され得
る。
【０１２２】 ｃ.構成的発現、アクチンプロモーター アクチンの幾つかのアイソホームは、殆どの細胞型で発現することが知られ、
従って、アクチンプロモーターは構造プロモーターに対する良い選択である。特
に、コメActl遺伝子由来のプロモーターは、複製され、特性分析されてきた（Mc
Elroy et al., 1990）。プロモーターの1.3 kb断片は、コメプロトプラストで発
現するために必要とされる全ての調節配列を含有することが見出された。さらに
、Actlプロモーターを基にした非常に多くの発現ベクターを、単子葉植物で使用
するために特異的に構築された（McElroy et al. (1991)）。これらは、Actl-イ
ントロン1、Adhl5'フランキング配列およびAdhl-イントロン1(トウモロコシのア
ルコールデヒドロゲナーゼ由来)およびCaMV 35Sプロモーター由来の配列を導入
される。非常に高い発現を示すベクターは、35SおよびActlイントロンまたはAct
l 5'フランキング配列およびActlイントロンの融合であった。開始ATG（GUSレポ
ーター遺伝子の）周辺配列の至適化によっても発現が増強する。McElroy et al. (1991)によって記載されたプロモーター発現カセットは、遺伝子発現のために
容易に修飾することができ、そして単子葉植物宿主で使用するのに特に適当であ
る。例えば、プロモーター含有断片をMcElroy構築物から除き、pCGN1761 ENX中
の２つの35Sプロモーターを置換し、その後に特定遺伝子配列の挿入に利用する
ために使用しうる。即ち、構築した融合遺伝子は、適当な形質転換ベクターに移
入され得る。別の報告では、その第一のイントロンを有するコメActlプロモータ
ーは、培養した小麦細胞で高い発現を示すことが判った (Chibbar et al., 1993
)。
【０１２３】 d. 誘導性発現、PR-1プロモーター pCGN1761 ENXでの２つの35Sプロモーターを、高い発現レベルを生じる別のプ
ロモーターで置換することができる。実施例の方法によって、U. S.特許番号 5,
614.395に記載された化学的に調節し得るものの１つは、２つの35S プロモータ
ーで置換することができる。プロモーターの選択は、制限酵素によって、その供
給源から切り出すのが好ましいが、適切な末端制限部位を持つプライマーを用い
るPCR増幅することも可能である。PCR-増幅を行うなら、プロモーターは、標的
ベクター内で増幅したプロモーターのクローニングの後、増幅エラーに対して調
べるために、再び配列決定するべきである。化学的/病原体調節可能なタバコPR-
１aプロモーターを、プラスミド pCIB1004 から分離し(構造のために、EP 0 332
104の実施例21を参照)、プラスミド pCGN1761ENX (Uknes et al., 1992)に形質
転換した。pCIB1004を、Ncolを用いて切断し、得られた線状断片の3'オーバーハ
ングを、T4 DNAポリメラーゼを用いる処理によって平滑にした。 次いで、該断
片をHindlllで切断し、得られたPR-１a プロモーター含有断片を、ゲルで精製し
、２つの35S プロモーターを除いたpCGN1761ENXで単離した。 これは、Xholを用
いる切断、T4 ポリメラーゼによる平滑化（blunting）、その後のHindlIlでの切
断、単離したpCIB1004プロモーター断片を含む大きなベクター・ターミネーター
の単離によって行った。これによって、Pur-１aプロモーターおよびtml ターミ
ネーターおよびEcoRlおよびNotl部位を持つ介在ポリリンカーを有するpCGN1761E
NX誘導体を生じた。選択されたコード配列を、このベクターに挿入することがで
き、該融合産物（即ち、プロモーター−遺伝子−ターミネーター）は下記に示し
たものを連続的に形質転換し得る。包含する全ての連続的に選択された形質転換
ベクターに移すことができる。U.S.特許番号5,523,311および5,614,395に記載の
ベンゾチアジアゾール、イソニコチン酸、およびサリチル酸化合物を含む多様な
化学的調節剤を用いて、本発明の形質転換植物において選択したコード配列の発
現を誘導することができる。
【０１２４】 e. 誘導性発現、エタノール誘導性プロモーター ある種のアルコールまたはケトン、例えばエタノールによって誘導し得るプロ
モーターは、本発明のコード配列の誘導性発現を与えるために使用してもよい。
そのようなプロモーターは、例えば、Aspergillus nidulans 由来のalcA 遺伝子
プロモーターである(Caddick et al.,1998)。 A. nidulansにおいて、alcA 遺伝
子は、アルコールデヒドロゲナーゼＩをコードし、この発現は化学的誘導物質の
存在下でAlcR転写因子によって調節される。本発明の目的のために、プラスミド
palcA中のCATコード配列:最小の35S プロモーターと融合したalcA遺伝子プロモ
ーター配列を含むCAT (Caddick et al., 1998)は、alcA 遺伝子プロモーター制
御下にコード配列を持つ発現カセットを形成する本発明のコード配列によって置
換される。 これは、当業者には既知の方法で行われる。
【０１２５】 f. 誘導性発現、グルココルチコイド−誘導性プロモーター ステロイドホルモンを基にした系を使用する本発明のNIM1相同物発現の誘導も
、考えられる。例えば、グルココルチコイドを介在した誘導系を用い(Aoyama an
d Chua,1997)、遺伝子発現を、グルココルチコイドの適用、例えば、合成グルコ
コルチコイド、好ましくはデキサメタゾンを、好ましくは０.１mM〜１mMの濃度
、より好ましくは10mM〜100mMの濃度で誘導した。本発明の目的のために、ルシ
フェラーゼ遺伝子配列を、最小の35Sプロモーターと融合したGAL4上流活性化配
列の６つの複製物の制御下で、NIM1相同物をコードする遺伝子配列を持つ発現カ
セットを形成するために、NIM1相同物をコードする遺伝子配列によって置換する
。これは、当業者には周知の方法で行われる。トランス・アクト・ファクターは
、ラットのグルココルチコイド受容体のホルモン結合ドメイン(Picard et al.,
1988)に融合したヘルペスウイルスタンパク質VP16(Triezenberg et al., 1988)
のトランス活性化ドメインと融合したGAL4DNA結合ドメインを包含する(Keegan e
t al.,1986)。融合タンパク質の発現は、当分野で既知の植物もしくは本明細書
中に記載した植物中の発現に適する全てのプロモーターによって制御される。こ
の発現カセットは、6xGAL4/最小のプロモーターに融合したNIM1相同物をコード
する遺伝子配列を含む植物中に含まれる。即ち、融合タンパク質の組織または器
官特異性が達成され、誘導可能なNIM 1 相同物の組織または器官特異性が得られ
る。
【０１２６】 g．根特異的発現 遺伝子発現の別のパターンは、根での発現である。適当な根のプロモータは、
Framond (1991)、特許公開出願EP 0 452 269においても記載されている。このプ
ロモーターを、選択遺伝子の挿入のために適当なベクター、例えばpCGN1761 ENX
に導入し、続いて完全なプロモーター−遺伝子−ターミネーター・カセットを注
目の形質転換ベクターに導入する。
【０１２７】 h. 損傷誘導性プロモーター 損傷誘導性プロモーターは、遺伝子発現のために適当である。Numerus such
そのような多くのプロモーターは、下記のように記載されており(例えば、Xu et
al.,1993); Logemann et al., 1989; Rohrmeier & Lehle、1993; Firek et al.
, 1993; Warner et al.,1993)、全てのものは、本発明で使用するのに適当であ
る。Logemann らは、単子葉植物ポテト wun1 遺伝子の5'上流配列を記載した。X
u らは、単子葉植物ポテト由来の損傷誘導性プロモーター（pin2)が、単子葉植
物のコメにおいて活性である。さらに、Rohrmeier & Lehleは、誘導した損傷と
トウモロコシのWipI cDNAのクローニングについて記載し、これは標準的技術を
用いる同種のプロモーターを単離するのに使用し得る。同様に、Firek et al. a
nd Warner et al.は、局所損傷部位および病原体進入部位で発現する、単子葉植
物Asparagus officinalis由来の損傷誘導性遺伝子を記載する。クローニング技
術は、当業者には周知であり、これらプロモーターを適当なベクターに導入し、
この発明に関する遺伝子と結合し、植物損傷部位でこれらの遺伝子を発現するた
めに使用することが可能である。
【０１２８】 i. 柔組織（髄）−好ましい発現 特許出願WO 93/07278は、柔組織細胞で優先的に発現するトウモロコシtrpA遺
伝子の単離を記載する。転写開始点から1726塩基まで伸長する該遺伝子配列およ
びプロモーターを提示した。標準的な分子生物工学技術を使用して、このプロモ
ーターまたはその一部を、35Sプロモーターを置換し、柔組織（髄）−好ましい
方法で外来遺伝子の発現を駆動するために使用することができるベクター、例え
ばpCGN1761に形質導入することができる。実際、柔組織（髄）−好ましいプロモ
ーターを含む断片を、全てのベクターに形質転換し、形質転換植物で利用するた
めに修飾され得る。
【０１２９】 ｊ. 葉特異的発現 ホスホエノールカルボキシラーゼ（PEPC）をコードするトウモロコシ遺伝子
が、Hudspeth & Grula (1989)によって記載されている。標準的分子生物工学技
術を用いて、この遺伝子に対するプロモーターを使用して、形質転換植物におい
て葉特異的な方法で全ての遺伝子の発現を駆動させる。
【０１３０】 k. 花粉特異的な発現 WO 93/07278 は、花粉細胞で発現するトウモロコシのカルシウム依存性のタン
パク質キナーゼ (CDPK) 遺伝子の単離を記載している。該遺伝子配列およびプロ
モーターは、転写開始点から1400塩基まで伸長する。標準的分子生物工学技術を
用いて、プロモーターまたはその一部を、35S プロモーターに置換し、花粉特異
的方法において本発明のNIM１相同物の発現を駆動するために使用することがで
きる。
【０１３１】 2. 転写ターミネーター 多様な転写ターミネーターは、発現カセットで使用するために利用できる。こ
れらは、トランスジーンを超える翻訳の停止とその正確なポリアデニル化に関与
する。適当な転写ターミネーターは、植物における機能に既知のものであり、Ca
MV 35S ターミネーター、tmlターミネーター、 オパリン合成ターミネーターお
よびエンドウのrbcS E9 ターミネーターを包含する。これらは、単子葉植物およ
び双子葉植物の両方で使用し得る。さらに、遺伝子のネガティブ転写ターミネー
ターを使用してもよい。
【０１３２】 3. 発現の増加または調節のための配列 多くの配列は、転写ユニット内からの遺伝子発現を増加することが判っており
、これらの配列は、形質転換植物でそれらの発現を増加するために本発明の遺伝
子と共に使用することも可能である。 多様なイントロン配列は、特に単子葉植物細胞において、発現を増加すること
が示されている。例えば、トウモロコシAdhl 遺伝子のイントロンは、トウモロ
コシ細胞中に導入する場合、その同種のプロモーターの下で、野生型遺伝子の発
現を顕著に増加する。イントロン1は、クロラムフェニコール・アセチルトラン
スフェラーゼ遺伝子との融合構築体において、発現を増加させ、特に有効である
ことが判った(Callis et al., 1987)。同じ実験系において、トウモロコシのbro
nze 1 遺伝子由来のイントロンは、発現を増加する点で、類似の効果を示した。
イントロン配列は、植物の形質転換ベクター、一般的には非翻訳リーダー内に普
通に組み込まれる。
【０１３３】 ウイルスから誘導された多くの非翻訳リーダー配列は、発現を増加することが
知られ、これらは、特に双子葉植物細胞において有効である。特に、タバコモザ
イクウイルス(Tabako Tobacco Mosaic Virus)(TMV,「W-配列」)、トウモロコシ
白化斑点ウイルス（Maize Chlorotic Mott Virus）(MCMV)、アルファルファモザ
イクウイルス（Alfalfa Mosaic Virus）(AMV)が、発現を増加する点で有効であ
ることを示した (例えば、Gallie et al., 1987; Skuzeski et al., 1990)。
【０１３４】 4. 細胞内の遺伝子産物の標的化 遺伝子産物を標的化するための多様な機構が、植物およびこれら機構の機能化
を制御する配列に存在することが知られている。例えば、クロロプラストへの遺
伝子産物の標的化は、クロロプラスト取り込み中に切断され、成熟したタンパク
質を生成する、多様なタンパク質のアミノ酸末端に見出されているシグナル配列
によって制御される(例えば、Comai et al., 1988)。これらのシグナル配列は、
外来遺伝子産物に融合し、クロロプラスト内の外来産物の輸入を有効にし得る (
van den Broeck、 et al., 1985)。適当なシグナル配列に対してコードするDNA
を、クロロプラストに局在すると知られているRUBISCO タンパク質、CAB タンパ
ク質、EPSP合成酵素、GS2 タンパク質および多くの他のタンパク質をコードする
cDNAsの5'末端から単離することができる（U.S特許番号5,639,949の実施例37の
「Expression With Chloroplast Targeting」の題名の章を参照）。
【０１３５】 他の遺伝子産物は、ミトコンドリアおよびペルオキシソームのような別の器官
に局在化する(例えば、Unger et al.,1989)。これらの産物をコードするcDNAは
、これらの器官に外来遺伝子産物を標的化することを有効に操作することができ
る。そのような配列の例は、核コードATPaseおよびミトコンドアに対して特異的
なアスパルテートアミノトランスフェラーゼ・アイソホームである。細胞性のタ
ンパク質の標的化が、Rogers et al.(1985)によって記載されている。
【０１３６】 さらに、他の細胞区画に遺伝子産物の標的化を発生させる配列が特性分析され
た。アミノ末端配列は、ER、アポプラスト、アリューロン由来の細胞外分泌顆粒
の標的化に関与する(Koehler & Ho, 1990)。さらに、カルボキシ末端配列との結
合におけるアミノ末端配列は、遺伝産物の液胞の標的化に関与する (Shinshi et
al., 1990)。
【０１３７】 注目のトランスジーン配列への上記記載の適切な標的化配列の融合体によって
、いずれかの器官または細胞区画にトランスジーン産物を指向することが可能で
ある。クロロプラストの標的化に対して、例えば、RUBISCO 遺伝子、CAB 遺伝子
、EPSPシンターゼ遺伝子またはGS2 遺伝子由来のクロロプラストシグナル配列は
、トランスジーンのアミノ酸末端のATGにフレームで融合する。選択されたシグ
ナル配列は既知の切断部位を包含するべきであり、構築された融合物を切断に必
要な切断部位の後ろの任意のアミノ酸を説明すべきである。幾つかの場合におい
て、この要件は、切断部位とトランスジーンATG間の少数のアミノ酸の添加、も
しくはトランシジーン配列内の幾つのアミノ酸の置換によって満たされることも
できる。クロロプラストの輸入のために構築した融合体を、Bartlett et al. (1
982)およびWasmann et al.(1986)によって記載された技術を用いるクロロプラス
トの取り込みに従って、インビトロでの転写した構築物によるインビトロでの翻
訳によるクロロプラストの取り込みに対する効率を試験した。これらの構築技術
は、当分野では既知であり、同じようにミトコンドリアとペルオキシソームに適
用し得る。
【０１３８】 細胞性標的化に対する上記の記載の機構は、標的化シグナル誘導体からのプロ
モーターの発現パターンと異なるパターンを持つプロモーターの翻訳調節特異的
な細胞標的化の行き先のために、それら同種のプロモーターとの結合においてだ
けでなく、外来性プロモーターとの結合においても利用することができる。
【０１３９】 実施例 11:植物形質転換ベクターの構築 植物の形質転換に利用し得る多くの形質転換ベクターは、植物遺伝子工学にお
いて通常の技術を持った技術者には既知であり、本発明に適切な遺伝子は、その
ようなベクターの全てと結合して使用することができる。ベクターの選択は、好
ましい形質転換技術および形質転換為の標的種に依存する。ある標的とする種に
関して、異なる抗生物質または除草剤の選択マーカーが好まれる。形質転換の際
に普通に使用される選択マーカーは、カナマイシンおよび関連した抗生物質への
耐性を与えるnptll遺伝子(Messing & Vierra, 1982; Bevan et al., 1983)、除
草剤のホスヒノスリシン（phosphinothricin）への耐性を与えるbar 遺伝子 (Wh
ite et al., 1990; Spencer et al., 1990)、抗生物質ヒグロマイシンへの耐性
を与えるhph 遺伝子(Blochinger & Diggelmann)およびメタトレキセート（metha
trexate）への耐性を与えるdhfr 遺伝子 (Bourouis et al., 1983)およびグリホ
セート（glyphosate）への耐性を与えるEPSPS 遺伝子 (U. S. 特許出願番号. 4,
940,935および5,188,642)を包含する。
【０１４０】 １．アグロバクテリウムの形質転換に適当なベクター 多くのベクターは、Agrobacterium tumefaciensを用いる形質転換に利用され
る。通常、これらは少なくとも１つのT-DNAボーダー配列を運搬し、pBINl9 (Bev
an, Nucl. Acids Res. (1984))およびpXYZのようなベクターを含む。 下記に、
アグロバクテリウムの形質転換のために適当な２つの典型的なベクターの構築を
記載する。
【０１４１】 ａ. pCIB200およびpCIB2001: バイナリーベクターpcIB200およびpCIB2001を、アグロバクテリウムで使用す
るための組替え体ベクターの構築に使用し、以下の方法で構築された。pTJS75ka
nを、テトラサイクリン耐性遺伝子の切断をおこす、pTJS75のNarl消化（分解）(
Schmidhauser & Helinski, 1985)し、その後にNPTIIを持つpUC4K由来のAccl断片
の挿入して (Messing & Vierra, 1982; Bevan et al., 1983; McBride et al.,
1990) 作成した。Xholリンカーは、左と右のT-DNAボーダー、植物選択性nos/npt
llキメラ遺伝子およびpUCポリリンカーを含むPCIB7のEcoRV断片に結合し(Rothst
ein et al., 1987)、Xhol消化断片を、pCIB200を作成するためにSallで消化した
pTJS75kan中で複製した (参照、EP 0 332 104, 実施例 19)。pCIB200は、下記の
固有のポリリンカー制限部位を含む： EcoRI、Sstl、Kpnl、Bill、XbalおよびSa
ll。pCIB2001は、さらに制限部位のポリリンカー中への挿入によって構築される
pCIB200の誘導体である。pCIB2001のポリリンカー内の固有の制限部位は、EcoRl
、Sstl、Kpnl、Bglll、Xbal、Sall、Mlul、Bcll、Avrll、Apal、HpalおよびStul
である。さらに、これらの固有の制限部位を含有するpCIB2001は、植物およびバ
クテリアのカナマイシン選択性、アグロバクテリウム介在形質転換のための左と
右のT-DNAボーダー、E. coliおよび他の宿主間の起動に関するRK2-誘導したtrfA
機能およびRK2由来のOriTおよびOriV機能を持つ。pCIB2001ポリリンカーは、そ
れ自身の調節シグナルを含有する植物発現カセットのクローニングに適当である
。
【０１４２】 b. そのpCIB10およびヒグロマイシン選択誘導体: ２つのベクターpCIB10は、植物での選択のためのカナマイシン耐性およびT-DN
Aの右および左のボーダー配列をコードする遺伝子を包含し、E.coliおよびアグ
ロバクテリウムの両方で複製し得る広い宿主範囲のプラスミドpRK252由来の配列
を組み込む。その構築物は、Rothstein et al.(1987)によって記載された。Grit
z et al.,（1983）記載のヒグロマイシンB ホスホトランスフェラーゼに対する
遺伝子を組み込んだpCIB10の様々な誘導体を構築する。これらの誘導体は、ヒグ
ロマイシン単独(pCIB743)またはヒグロマイシンおよびカナマイシン(pCIB715、p
CIB717)に対する形質転換細胞の選択を可能にする。
【０１４３】 2. 非アグロバクテリウム形質転換に好適なベクター Agrobacterium tumefaciensを使用しない形質転換は、選択された形質転換ベ
クターにおけるT-DNA配列の必要性を回避でき、したがってこれらの配列を欠く
ベクターを、T-DNA配列を含む上記のようなベクターに加えて利用することがで
きる。アグロバクテリウムに依拠しない形質転換技術には、粒子衝突、プロトプ
ラスト取り込み（例えば、PEGおよび電気穿孔）およびマイクロ注入による形質
転換が包含される。ベクターの選択は、大抵、形質転換される種の好ましい選択
に依存する。以下に、非アグロバクテリウム形質転換にとって好適な典型的ベク
ターの組み立てを記載する。
【０１４４】 ａ．pCIB3064： pCIB3064は、除草剤basta（またはホスフィノトリシン）による選択と組み合
わせた直接遺伝子誘導技術にとって好適な、pUCより誘導されるベクターである
。プラスミドpCIB246は、E.coli GUS遺伝子との人為的融合物中のCaMV 35Sプロ
モーターおよびCaMV 35S転写ターミネーターを含んでおり、PCT公開された出願W
O93/07278に記載されている。このベクターの35Sプロモーターは開始部位の5'に
2個のATG配列を含んでいる。これらの部位を、ATGを除去して制限部位SspIおよ
びPvuIIを作り出すといったように、標準PCR技術を用いて突然変異させる。新た
な制限部位は、ユニークなSalI部位から96および37bp離れており、そして実際の
開始部位から101および42bp離れている。得られたpCIB246の誘導体をpCIB3025と
命名する。次にGUS遺伝子をSalIおよびSacIで消化することによりpCIB3025から
切り取り、末端を平滑化し、再ライゲーションしてプラスミドpCIB3060を作製す
る。プラスミドpJIT82はJohn Innes Centre, Norwichより入手し、Streptomyces
viridochromogenes由来のbar遺伝子を含む400bp SmaIフラグメントを切り取り
、pCIB3060のHpaI部位内に挿入する(Thompson等、1987)。このことによりpCIB30
64が作製され、このpCIB3064は、除草剤選択のための、CaMV 35Sプロモーターお
よびターミネーターの調節下のbar遺伝子、アンピシリン耐性のための遺伝子（E
.coli中での選択のため）、ならびにユニーク部位SphI、PstI、HindIII、および
BamHIを有するポリリンカーを含んでいる。このベクターは、それら自身の調節
シグナルを含む植物発現カセットのクローニングに好適である。
【０１４５】 b. pSOG19およびpSOG35: pSOG35は、E.coli遺伝子のジヒドロ葉酸レダクターゼ（DFR）をメソトレキサ
ートに対する耐性を付与する選択マーカーとして利用する、形質転換ベクターで
ある。PCRを使用して、35Sプロモーター（-800bp）トウモロコシAdh1遺伝子由来
のイントロン6（-550bp）およびpSOG10由来の18bpのGUS非翻訳リーダー配列を増
幅する。E.coliジヒドロ葉酸レダクターゼII型遺伝子をコードしている250bpフ
ラグメントもまたPCRによって増幅し、これら二つのPCRフラグメントを、pUC19
ベクターバックボーンおよびノパリンシンターゼターミネーターを含むpB1221（
Clontech）由来のSacI-PstIフラグメントと共に組み立てる。これらのフラグメ
ントの組み立てによりpSOG19が作製され、これは、イントロン6配列と融合した3
5Sプロモーター、GUSリーダー、DHFR遺伝子およびノパリンシンターゼターミネ
ーターを含む。PSOG19のGUSリーダーを、トウモロコシChlorotic Mottleウイル
ス（MCMV）由来のリーダー配列に置き換えると、ベクターpSOG35が生成する。PS
OG19およびpSOG35は、アンピシリン耐性のためのpUC遺伝子を持ち、外来物質の
クローニングに利用可能なHindIII、SphI、PstIおよびEcoRI部位を有する。
【０１４６】 実施例12：形質転換 興味の持たれる遺伝子配列が発現系の中にクローニングされたならば、これを
植物細胞中に導入する。植物の形質転換および再生の方法は当分野でよく知られ
ている。例えば、Tiプラスミドベクター、ならびに直接的DNA取り込み、リポソ
ーム、電気穿孔、マイクロ注入、およびマイクロ発射が、外来DNAの運搬に利用
されてきた。さらに、アグロバクテリウム属の細菌を利用して植物細胞を形質転
換することができる。以下は、双子葉植物および単子葉植物の両者を形質転換す
るための代表的技術の記載である。
【０１４７】 １．双子葉植物の形質転換 双子葉植物の形質転換技術は当分野でよく知られており、アグロバクテリウム
に基づく技術およびアグロバクテリウムを必要としない技術を包含する。非アグ
ロバクテリウム技術は、プロトプラストまたは細胞による外因性遺伝物質の直接
取り込みを含むものである。これは、PEGまたは電気穿孔により仲介される取り
込み、粒子衝突により仲介される運搬、またはマイクロ注入によって達成できる
。これらの技術の例は、Paszkowski等、1984；Potrykus等、1985；Reich等、198
6；およびKlein等、1987により記載されている。それぞれの場合において、形質
転換された細胞は、当分野で既知の標準技術を用いて全植物に再生される。
【０１４８】 アグロバクテリウムにより仲介される形質転換は、その高い形質転換効率およ
び多くの異なる種に対する広範な用途の故に、双子葉植物の形質転換のための好
ましい技術である。アグロバクテリウム形質転換は、典型的には、興味の持たれ
る外来DNAを有するバイナリーベクター(例えばpCIB200またはpCIB2001)を、共存
するTiプラスミド上または染色体上のいずれかに宿主アグロバクテリウム菌株が
持っているvir遺伝子の補完に依拠するかも知れない適当なアグロバクテリウム
菌株に、導入することを含む(例えば、pCIB200およびpCIB2001のための菌株CIB5
42(Uknes等、1993)。アグロバクテリウムへの組換えバイナリーベクターの導入
は、組換えバイナリーベクターを有するE.coli、pRK2013のようなプラスミドを
持ち、組換えバイナリーベクターを標的アグロバクテリウム菌株に移動させるこ
とのできるヘルパーE.coli菌株を使用する、三つの親を結びつける方法によって
達成する。別法として、この組換えバイナリーベクターは、DNA形質転換によっ
てアグロバクテリウムに導入することができる（HofgenおよびWillmitzer、1988
）。
【０１４９】 組換えアグロバクテリウムによる標的植物種の形質転換は、通常、アグロバク
テリウムをその植物由来の外植片と同時培養することを含み、当分野で周知のプ
ロトコルに従うものである。形質転換された組織は、該バイナリープラスミドT-
DNA境界の間に存在する抗生物質または除草剤耐性マーカーを有する選択培地上
で再生する。 或る遺伝子で植物細胞を形質転換するもう一つのアプローチは、不活性または
生物活性の粒子を植物組織および細胞に推進させることを含む。この技術は米国
特許第4945050、5036006、および5100792号に開示されている。一般に、この方
法は、不活性または生物活性粒子を、当該細胞の外表面を貫通させその内部への
取り込みをもたらすのに有効な条件の下で、細胞へと推進させることを含む。不
活性粒子を利用する場合、所望遺伝子を含むベクターで当該粒子を被覆すること
によって、このベクターを細胞内に導入することができる。別法として、ベクタ
ーによって標的細胞を取り巻き、その結果、該粒子の通り跡によってベクターを
細胞内に運び入れることもできる。生物活性粒子(例えば、導入したいDNAをそれ
ぞれ含んでいる乾燥酵母細胞、乾燥細菌またはバクテリオファージ)もまた植物
細胞組織中に推進させることができる。
【０１５０】 1.単子葉植物の形質転換 殆どの単子葉植物種の形質転換もまた、現在では常法となっている。好ましい
技術は、PEGまたは電気穿孔技術を用いるプロトプラスト中への直接的遺伝子導
入、およびカルス組織中への粒子衝突を包含する。形質転換は単一DNA種または
複数のDNA種で（即ち同時形質転換）企図することができ、これらの技術は共に
本発明での使用に好適である。同時形質転換は、完全なベクター組み立てを回避
し、そして、問題の遺伝子および選択マーカーのための連鎖していない座を有す
るトランスジェニック植物を生成させる利点を持ち得、それにより、もしそれが
望ましいとされるならば、以後の世代で選択マーカーを除去することが可能とな
る。しかしながら、同時形質転換を使用することの不利な点は、別々のDNA種が
当該ゲノム中に組み込まれる頻度が１００％未満であることである（Schocher等
、1986）。
【０１５１】 特許出願EP0292435、EP0392225、およびWO93/07278は、選り抜きの近交系トウ
モロコシからのカルスおよびプロトプラストの調製、PEGまたは電気穿孔を用い
るプロトプラストの形質転換、および形質転換されたプロトプラストからのトウ
モロコシ植物の再生のための技術を記載している。Gordon-Kamm等(1990)およびF
romm等(1990)は、粒子衝突を用いるA188より誘導されたトウモロコシ系統の形質
転換のための技術を公表している。さらに、WO93/07278およびKoziel等(1993)は
、粒子衝突による選り抜きの近交系トウモロコシの形質転換の技術を記載してい
る。この技術は、授粉の14-15日後のトウモロコシ雌穂から切り取った1.5-2.5mm
長の未熟なトウモロコシ胚、および衝突のためのPDS-1000He Biolistics装置を
利用するものである。
【０１５２】 コメの形質転換もまた、プロトプラストまたは粒子衝突を利用する直接遺伝子
導入技術によって実施することができる。プロトプラストにより仲介される形質
転換が、Japonica型およびIndica型について記載されている（Zhang等、1988；S
himamoto等、1989；Datta等、1990）。いずれの型も粒子衝突を使用して常法に
より形質転換可能である（Christou等、1991）。さらに、WO93/21335は、電気穿
孔によるコメの形質転換技術を記載している。
【０１５３】 特許出願EP0332581は、Pooideaeプロトプラストの生成、形質転換および再生
のための技術を記載している。これらの技術によりDactylisおよび小麦の形質転
換が可能となる。さらに、C型長期再生可能カルスの細胞への粒子衝突を用いる
小麦の形質転換がVasil等(1992)によって、また、未熟な胚および未熟な胚によ
り誘導されたカルスの粒子衝突を用いる小麦の形質転換がVasil等(1993)により
記載されている。しかしながら小麦の形質転換のための好ましい技術は、未熟な
胚の粒子衝突による小麦の形質転換を含むものであって、遺伝子導入前の高シュ
クロースまたは高マルトース工程のいずれかを包含している。衝突に先立ち、体
細胞胚の誘導のため、3%シュクロース（MurashigaおよびSkoog、1962）および3m
g/Lの2,4-Dを含有するMS培地に任意の数の胚（長さ0.75-1mm）を平板培養し、こ
れを暗所で進める。選択された衝突の日に、胚を誘導培地から取り、浸透調節物
質（即ち、所望濃度、典型的には15%のシュクロースまたはマルトースを含有す
る誘導培地）上に配置する。この胚を2-3時間原形質分離させ、次いで衝突させ
る。標的平板当たり20個の胚が典型的であるが、それが重要という訳ではない。
適当な遺伝子を持つプラスミド（例えばpCIB3064またはpSG35）を、標準法を用
いてマイクロメーターサイズの金粒子上に沈殿させる。各平板の胚を、〜1000ps
iの爆発圧、標準80メッシュスクリーンを用いるDuPont Biolistics(商標)ヘリウ
ム装置で撃つ。衝突後、この胚を暗所に戻し、約24時間回復させる（依然として
浸透調節物質上で）。24時間後、胚を浸透調節物質から取り、誘導培地上に戻し
、ここで再生の前に約1ヶ月間保持する。およそ1ヶ月後、生育しつつある胚形成
性カルスを有する胚の外植体を、適当な選択剤（pCIB3064の場合10mg/L basta、
そしてpSOG35の場合2mg/Lのメソトレキサート）をさらに含有する再生培地（MS
+ 1mg/L NAA、5mg/L GA）に移す。およそ１ヶ月後、生育した苗条を、半分の強
度のMS、2%シュクロース、および同濃度の選択剤を入れた、「GA7」として知ら
れる、より大きな無菌容器に移す。 アグロバクテリウムを使用する単子葉植物の形質転換もまた記載されている。
WO94/00977および米国特許第5591616号を参照されたい。
【０１５４】 III. 育種および種子の生産 実施例13：育種 本発明に係る遺伝子による形質転換によって得られる植物は、単子葉植物およ
び双子葉植物を包含する、多様な植物種のうち任意のものとすることができるが
、本発明方法に使用する植物は、好ましくは上に開示した農業経済学的に重要な
標的作物のリストから選択する。生産および品質にとって重要なその他の性質と
組み合わせた本発明に係る遺伝子の発現は、育種によって植物系統に組み入れる
ことができる。育種のアプローチおよび技術は当分野で知られている。例えば、
Welsh J.R.(1981)；Wood D.R.編(1983)；Mayo O.(1987)；Singh,D.P.(1986)；な
らびにWrickeおよびWeber(1986)を参照されたい。
【０１５５】 上述のトランスジェニック種子および植物中に組み込まれた遺伝的性質は、有
性生殖または植物的成長によって伝えられ、そのようにして子孫植物に維持され
伝搬され得る。一般にこのような維持および伝搬は、耕作、播種または収穫とい
った特定の目的に合致させるために開発した既知の農業上の方法を利用する。専
門化されたプロセス、例えば水耕法または温室テクノロジーもまた適用できる。
生長しつつある作物は、昆虫または感染により惹起される攻撃および損傷に対し
て、また、雑草による競合に対して脆弱であるため、雑草、植物疾病、昆虫、線
虫、およびその他の有害な条件を制御して収量を改善するための手段が採られる
。これらは、土壌の耕作または雑草および感染植物の除去といった機械的手段、
ならびに、除草剤、殺真菌剤、殺配偶子剤、殺線虫剤、成長調節剤、成熟剤およ
び殺虫剤といった農薬の適用を包含する。
【０１５６】 本発明に係るトランスジェニック植物および種子の有利な遺伝的性質は、さら
に植物の育種に使用することができ、それは、害虫、除草剤、またはストレスへ
の耐性、栄養価の改善、収量の増加、または、倒伏もしくは破壊からの損失がよ
り小さくなる、改善された構造、といったような、改善された性質を有する植物
の開発を目的としている。種々の育種工程は、明確な人間の介入、例えば交雑す
べき系統の選択、親系統の授粉の管理、または適当な子孫植物の選択、によって
特徴付けられている。所望の性質に応じて異なった育種手段がとられる。関連技
術は当分野で周知であり、ハイブリダイゼーション、同系交配、戻し交配、多系
統交配、変種融合、種間ハイブリダイゼーション、異数体技術等を包含するが、
これらに限定される訳ではない。ハイブリダイゼーション技術はさらに、機械的
、化学的、または生化学的手段により雄性または雌性不稔植物を得るために植物
を不稔化することを包含する。異なる系統の花粉で雄性の不稔性植物を他家受粉
することにより、雄性不稔性且つ雌性稔性の植物のゲノムが、両親の系統の性質
を均等に取得することが確実となる。したがって、本発明に係るトランスジェニ
ック種子および植物は、例えば除草剤または農薬処理といった常法の有効性を増
大させ、またはそれらの修飾された遺伝的性質の故に当該方法を不要にすること
ができる、改善された植物系統の育種に使用することができる。これとは別に、
改善されたストレス耐性を有する新たな作物を得ることができ、これは、それら
の最適化された遺伝的「装備」のため、同等の有害な生育条件に耐えられなかっ
た生成物よりも良好な品質を有する収穫生成物を産する。
【０１５７】 実施例14：種子の生産 種子の生産において、種子の発芽の優良性および等質性は製品の必須の性質で
あるが、一方、農家が収穫し販売する種子の発芽優良性および等質性は重要では
ない。作物を他の作物および雑草の種子が混入しないように保つこと、種子から
発生する病気を制御すること、そして良好な発芽をする種子を生産することは困
難であるため、かなり大規模且つ明確な種子生産の実践が種子生産者によって展
開されており、彼らは純粋な種子の育成、改良および売買の分野で経験を積んで
いる。したがって、農家は、自身の作物から収穫した種子を使用せずに、明確な
品質基準に合致する保証された種子を購入するのが慣行である。種子として使用
される繁殖材料は、慣例により、除草剤、殺虫剤、殺真菌剤、殺菌剤、殺線虫剤
、ナメクジ駆除剤、またはこれらの混合物を含む保護被覆剤で処理される。常套
的に使用される保護被覆剤は、カプタン、カルボキシン、サイラム(TMTD(商標))
、メタラクシル(Apron(商標))、およびピリミホス−メチル(Actellic(商標))と
いった化合物を含む。所望によりこれらの化合物は、細菌、真菌または動物性病
害虫により引き起こされる損傷に対する防護を提供する製剤の分野で常套的に使
用される、さらなる担体、界面活性剤または適用推進補助剤と共に製剤化する。
この保護被覆剤は、繁殖材料を液体製剤に含浸することにより、または合した湿
潤もしくは乾燥製剤で被覆することにより、適用することができる。芽または果
実への処理といったようなその他の適用法もまた可能である。
【０１５８】 新たな農業方法、例えば、本発明に係るトランスジェニック植物、トランスジ
ェニック植物材料、またはトランスジェニック種子の使用を特徴とする上に例示
の方法を提供することが、本発明のさらなる態様である。
【０１５９】 種子は、袋、コンテナまたは適当な包装材料を含む容器に入れて提供すること
ができ、この袋またはコンテナは種子を入れるために閉鎖することができる。袋
、コンテナまたは容器は、種子の短期または長期いずれかの保存のために、また
はその両方のために設計することができる。適当な包装材料の例は、クラフト紙
のような紙、堅いもしくは柔軟なプラスチックまたはその他のポリマー材料、ガ
ラスまたは金属を包含する。望ましくは、袋、コンテナ、または容器は、同じま
たは異なるタイプの包装材料の複数の層を含んでいる。或る態様において、袋、
コンテナまたは容器は、水および湿気が種子に接触することを排除または限定す
るよう、提供される。一つの例において、袋、コンテナまたは容器は、水または
湿気が入ることを防止するために密閉、例えばヒートシールする。別の態様では
、吸水性物質を包装材料の層の間または近傍に配置する。さらに別の態様では、
袋、コンテナもしくは容器、またはそれを構成する包装材料は、病気、汚染また
は種子の保存もしくは運搬におけるその他の有害な影響を限定し、抑制し、また
は防止するよう処理される。このような処理の一つの例は、例えば化学的手段ま
たは放射線照射による殺菌である。適当な担体と共に、本発明に係る遺伝子を含
むトランスジェニック植物の種子を含む市販用の袋であって、該遺伝子が、その
形質転換植物中で、野生型植物よりも高レベルで発現され、植物に広スペクトル
の疾病耐性を付与するためのそれらの使用のための説明ラベルを共に含む袋が、
本発明に含まれる。
【０１６０】 IV. 疾病耐性の評価 疾病耐性の評価は当分野で既知の方法により実施する。Uknes等(1993)；Gorla
ch等(1996)；Alexander等(1993)を参照されたい。例えば、幾つかの代表的な疾
病耐性の検定を下に記載する。
【０１６１】 実施例15：Phytophthora parasitica(タバコ疫病)耐性検定 タバコ疫病の原因生物であるPhytophthora parasiticaに対する耐性の検定を
、Alexander等(1993)に記載のように生育させた6週齢植物について実施する。植
物は灌水し、よく排水させ、次いで土壌に胞子嚢懸濁液(300胞子嚢/mL)10mLを適
用することにより接種する。接種した植物は、日中温度23-25℃、夜間温度20-22
℃に維持した温室に保持する。検定に使用した凋萎指標は以下の通りである：0=
症状無し；1=症状無し；1=緊張の低下を伴う、若干の凋萎の徴候；2=明らかな凋
萎の症状、但し腐朽または生長阻害無し；3=生長阻害を伴う明らかな凋萎の症状
、但し見たところ茎の腐朽無し；4=視認できる茎の腐朽および根系への若干の損
傷を伴う、甚だしい凋萎；5=4と同じ、但し植物は死または死に近く、根茎の重
篤な減損を伴う。全ての検定は、ランダムなデザインで配列させた植物について
機械的に採点する。
【０１６２】 実施例16：Pseudomonas syringae耐性検定 Pseudomonas syringae pv. tabaci菌株#551を、水中106または3x106/mLの濃度
で、幾つかの6-7週齢植物の下葉2枚に注射する。各々の時点で6体の個別植物を
評価する。Pseudomonas tabaciに感染した植物を、5点の疾病重篤度スケール(5=
100%死亡組織、0=症状無し)で等級付ける。それぞれの日の評価に関してT-検定(
LSD)を実施し、平均の疾病等級値に従ってグループ分けを指示する。その評価日
に同じ文字となる数値は統計学的に有意に相違しない。
【０１６３】 実施例17：Cercospora nicotianae耐性検定 Cercospora nicotianae(ATCC #18366)の胞子懸濁液(mL当たり100000-150000胞
子)を葉の表面にスプレーし、直ちに流去させる。この植物は5日間100%湿度に維
持する。その後この植物に水を5-10回/日霧吹きする。それぞれの時点で６体の
個別植物を評価する。Cercospora nicotianaeを、疾病症状を示す葉の%面積を基
準にして等級付ける。それぞれの日の評価に関してT-検定(LSD)を実施し、平均
の疾病等級値に従ってグループ分けを指示する。その評価日に同じ文字となる数
値は統計学的に有意に相違しない。
【０１６４】 実施例18：Peronospora parasitica耐性検定 Peronospora parasiticaに対する耐性の検定をUknes等(1993)に記載のように
植物に対して実施する。植物に分生子懸濁液(ミリリットル当たりおよそ5x104胞
子)を噴霧することにより、P.parasiticaの和合性単離物を接種する。接種した
植物は、湿潤条件下、17℃の生育室で、昼14時間/夜10時間のサイクルでインキ
ュベートする。植物は、接種後3-14日目、好ましくは7-12日目に、分生子柄の存
在を調べる。さらに、各処理を行った植物の幾つかを無作為に選択し、顕微鏡観
察のためにラクトフェノール−トリパンブルーで染色する(Keogh等、1980)。 上に開示した態様は例示的なものである。本発明の開示は、当業者に本発明の
数多くの変形の入手を提供するであろう。このような自明且つ予見可能な変形の
全ては本請求項に包含されることを意図している。
【０１６５】 配列表中の配列の簡単な説明 配列番号:1− Nicotiana tabacum由来のNIM1相同物の完全長cDNA配列。 配列番号:2−配列番号:1によってコードされたNicotiana tabacumのNIM1相同物
のタンパク質配列。 配列番号:3− Lycopersicon esculentum由来のNIM1相同物の完全長cDNA 配列。 配列番号:4−配列番号:3によってコードされたLycopersicon esculentumのNIM1
相同物のタンパク質配列。 配列番号:5− Brassica napus由来のNIM1相同物の部分的なcDNA配列。 配列番号:6−配列番号:5をコードするBrassica napusのNIM1相同物の部分的なタ
ンパク質配列。 配列番号:7− Arabidopsis thaliana由来のNIM1相同物(AtNMLc5)の完全長cDNA
配列。 配列番号:8− 配列番号:7によってコードされたArabidopsis thalianaのNIM1相
同物AtNMLc5の完全長タンパク質配列。 配列番号:9−実施例 1−4で使用した14−オリゴヌクレオチドプライマ。 配列番号:15− Arabidopsis thaliana由来のNIM1相同物(AtNMLc2)のゲノムDNA配
列。 配列番号:16 −配列番号:15によってコードされたArabidopsis thalianaのNIM1
相同物AtNMLc2のタンパク質配列。 配列番号:17− Arabidopsis thaliana由来のNIM1相同物(AtNMLc4−1)のゲノムDN
A配列。 配列番号:18−配列番号:17によってコードされたArabidopsis thalianaのNIM1相
同物AtNMLc4−1のタンパク質配列。 配列番号:19 −Arabidopsis thaliana由来のNIM1相同物(AtNMLc4−2)のゲノムDN
A配列。 配列番号:20− 配列番号:19によってコードされたArabidopsis thalianaのNIM1
相同物AtNMLc4−2のタンパク質配列。 配列番号:21−PCRプライマ−NIM 1A。 配列番号:22−PCRプライマ−NIM 1B。 配列番号:23−PCRプライマ−NIM 1C。 配列番号:24−PCRプライマ−NIM 1D。 配列番号:25−PCRプライマ−NIM 2A。 配列番号:26−PCRプライマ−NIM 2B。 配列番号:27−PCRプライマ−NIM 2C。 配列番号:28−PCRプライマ−NIM 2D。 配列番号:29−Arabidopsis thaliana NIM1 遺伝子配列と36つの配列の一致およ
び67%の配列が一致するNicotiana tabacum (タバコ A)から増幅した659塩基のNI
M-様DNA断片。 配列番号:30−配列番号:29によってコードされたタンパク質配列。 配列番号:31−Arabidopsis thaliana NIM1 遺伝子配列と2つの配列が一致するお
よび62%の配列が一致するNicotiana tabacum (タバコ B)から増幅した498 塩基
のNIM-様DNA断片。 配列番号:32−配列番号:31によってコードされたタンパク質配列。 配列番号:33−Arabidopsis thaliana NIM1 遺伝子配列と3つの配列が一致するお
よび63%の配列が一致するNicotiana tabacum (タバコ C)から増幅した498 塩基
のNIM-様DNA断片。 配列番号:34−配列番号:33によってコードされたタンパク質配列。 配列番号:35−Arabidopsis thaliana NIM1 遺伝子配列と59%の配列が一致するNi
cotiana tabacum (タバコ D)から増幅した399 塩基のNIM-様DNA断片。 配列番号:36−配列番号:35によってコードされたタンパク質配列。 配列番号:37−35−Arabidopsis thaliana NIM1 遺伝子配列と67%の配列が一致す
るLycopersicon esculentum (トマト A)から増幅した498塩基のNIM-様DNA断片。 配列番号:38−配列番号:37によってコードされたタンパク質配列。 配列番号:39−24 配列のコンセンサスおよびArabidopsis thaliana NIM1 遺伝子
配列と66%の配列同一性を示す、Beta vulgaris (テンサイ)から増幅した498 塩
基のNIM−様 DNA断片。 配列番号:40−配列番号:39によってコードされたタンパク質配列。 配列番号:41− Arabidopsis thaliana NIM1 遺伝子配列と9配列のコンセンサス
および61% 配列同一性を示す、Helianthus annuus(ヒマワリ A)から増幅した498
塩基のNIM−様 DNA断片。 配列番号 :42−配列番号:41によってコードされたタンパク質配列。 配列番号 :43− Arabidopsis thaliana NIM1遺伝子配列と10配列のコンセンサス
および59%の配列同一性を示す、Helianthus annuus(ヒマワリ B)から増幅した
498 塩基の NIM−様DNA断片。 配列番号:44−配列番号:43によってコードされたタンパク質配列。 配列番号:45−Arabidopsis thalianaのNIM1遺伝子配列と、15 配列のコンセンサ
スおよび68%の配列同一性を示す、Solanum tuberosum (ポテトA)から増幅した65
3塩基のNIM−様DNA断片。 配列番号:46−配列番号:45によってコードされたタンパク質配列。 配列番号:47−Arabidopsis thalianaのNIM1遺伝子配列と、3配列のコンセンサス
および61%の配列同一性を示す、Solanum tuberosum (ポテトB)から増幅した498
塩基のNIM−様DNA断片。 配列番号:48−配列番号:47によってコードされたタンパク質配列。 配列番号:49−Arabidopsis thalianaのNIM1遺伝子配列と、2配列のコンセンサス
および62%の配列同一性を示す、Solanum tuberosum (ポテトC)から増幅した477
塩基のNIM−様DNA断片。 配列番号:50−配列番号:49によってコードされたタンパク質配列。 配列番号:51−Arabidopsis thalianaのNIM1遺伝子配列と、5配列のコンセンサス
および59%の配列同一性を示す、Brassica napus (キャノーラ A)から増幅した50
1塩基のNIM−様DNA断片。 配列番号:52− 配列番号:51によってコードされたタンパク質配列。 配列番号:53−Arabidopsis thalianaのNIM1遺伝子配列と、5配列のコンセンサス
および58%の配列同一性を示す、Brassica napus (キャノーラ A)から増幅した50
1塩基のNIM−様DNA断片。 配列番号:54−配列番号:53によってコードされたタンパク質配列。 配列番号:55−Arabidopsis thalianaのNIM1遺伝子配列と、56%の配列同一性を示
す、Brassica napus (キャノーラ C)から増幅した498塩基のNIM−様DNA断片。 配列番号:56−配列番号:55によってコードされたタンパク質配列。 配列番号:57−Arabidopsis thalianaのNIM1遺伝子配列と、73%の配列同一性を示
す、Brassica napus (キャノーラ D)から増幅した498塩基のNIM−様DNA断片。 配列番号:58−配列番号:57によってコードされたタンパク質配列。 配列番号:59−PCRプライマ−NIM 3A。 配列番号:60−PCRプライマ−NIM 3B。 配列番号:61−Arabidopsis thalianaのNIM1遺伝子配列と、3配列のコンセンサス
および72%の配列同一性を示す、Lycopersicon esculentum(トマト B)から増幅し
た148塩基のNIM−様DNA断片。 配列番号:62−配列番号:61によってコードされたタンパク質配列。 配列番号:63−配列番号:39のPCR断片に対応するBeta vulgaris(テンサイ)由来の
NIM1相同物の完全長ｃDNA 配列。 配列番号:64−配列番号：62によってコードされたテンサイNIM1相同物のタンパ
ク質配列。 配列番号:65−配列番号:43のPCR断片に対応するHelianthus annuus(ヒマワリ B)
由来のNIM1相同物の完全長ｃDNA 配列。 配列番号:66−配列番号:65によってコードされたHelianthus annuus NIM1相同物
のタンパク質配列。 配列番号:67− Arabidopsis thalianaのNIM−様ゲノム配列 AtNMLc2 (配列番号:
15)に対応するcDNA 配列。 配列番号:68−配列番号:67によってコードされたタンパク質配列。 配列番号:69 −Arabidopsis thalianaのNIM−様ゲノム配列 AtNMLc4−1 (配列番
号:17)に対応するcDNA 配列。 配列番号:70−配列番号:69によってコードされたタンパク質配列。 配列番号:71 −Arabidopsis thalianaのNIM−様ゲノム配列 AtNMLc4−1 (配列番
号:19)に対応するcDNA 配列。 配列番号:72−配列番号:71によってコードされたタンパク質配列。 配列番号:73−配列番号:31のPCR断片に対応するNicotiana tabacum(タバコ B)由
来のNIM1相同物の完全長cDNA 配列。 配列番号:74−配列番号:73によってコードされたNicotiana tabacumのNIM1相同
物のタンパク質配列。
【０１６６】 寄託 以下の物は、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブタペスト条約
の権限下、the Agricultural Research Service, Patent Culture Collection (
NRRL), 1815 North University Street, Peoria, Illinois 61604, USA、に寄託
されている。寄託物の利用に対する全ての制限は、特許査定に対して除くことは
不可能である。
【０１６７】 クロ−ン 受託番号 寄託日 pNOV1203 NRRL B−30049 1998年8月17日 pNOV1204 NRRL B−30050 1998年8月17日 pNOV1206 NRRL B−30051 1998年8月17日 AtNMLc5 NRRL B−30139 1999年5月25日
【０１６８】 参考文献 本明細書で引用した参考文献は、当分野での現状を表わすものである。 以下
の文献の各々は、出典明示により本明細書の一部とする。 U.S.No. 4,940,935 U.S.No. 4,945,050 U.S.No. 5,036,006 U.S.No. 5,100,792 U.S.No. 5,188,642 U.S.No. 5,523,311 U.S.No. 5,591,616 U.S.No. 5,614,395 U.S.No. 5,639,949 U.S.No. 5,792,904 EP 0 292 435 EP 0 332 104 EP 0 332 581 EP 0 342 926 EP 0 392 225 EP 0 452 269 International PCT Application WO 93/07278 International PCT Application WO 93/21335 International PCT Application WO 94/00977 International PCT Application WO 94/13822 International PCT Application WO 94/16077 International PCT Application WO 97/49822 International PCT Application WO 98/06748 International PCT Application WO 98/26082 International PCT Application WO 98/29537 Alexander et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:7327−7331 (1993) Aoyama and Chua、The Plant Journal 11:605−612 (1997) Ausubel, F. M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, pub. by G
reene Publishing Assoc. and Wiley−Interscience (1987) Bartlett et al., In :Edelmann et al.(Eds.) Methods in Chloroplast Molecu
lar Biology、 Elsevier pp 1081−1091(1982) Bevan et al., Nature 304:184−187(1983) Bevan, Nucl. Acids Res. (1984) Bi et al., Plant J. 8 : 235−245 (1995) Binet et al. Plant Science 79:87−94 (1991) Blochinger & Diggelmann, Mol Cell. Biol. 4:2929−2931 Bourouis et al., EMBO J. 2 (7): 1099−1104 (1983) Boutry et al., Nature 328:340−342 (1987) Caddick et aL, Nat. Biotechnol 16:177−180 (1998) Callis et al., Genes Develop. 1:1183−1200 (1987) Cameron et al., Plant J. 5:715−725 (1994) Cao et al., Plant Cell 6、1583−1592 (1994) Cao et al., Cell 88:57−63 (1997) Casas et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:11212−11216 (1993) Century et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:6597−6601 (1995) Chibbar et al., Plant Cell Rep. 12:506−509 (1993) Chrispeels、 Ann. Rev. Plant Physiol. Plant Mol bol 42:21−53 (1991) Christou et al., Plant Physiol. 87:671−674 (1988) Christou et al., Biotechnology 9 :957−962 (1991) Christensen et al., Plant Molec. Biol. 12:619−632 (1989) Comai et al., J. Biol. Chem. 263:15104−15109 (1988) Crossway et al., BioTechniques 4:320−334 (1986) Datta et al., Biotechnology 8 :736−740 (1990) de Framond、FEBS 290:103−106 (1991) Delaney et al., Science 266:1247−1250 (1994) Delaney et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:6602−6606 (1995) Dempsey and Klessig, Bulletin de L'Institut Pasteur 93:167−186 (1995) Dietrich et al., Cell 77:565−577 (1994) Firek et al., Plant Molec. Biol. 22:129−142 (1993) Fromm et al., Biotechnology 8: 833−839 (1990) Gaffney et al., Science 261: 754−756 (1993) Galle et al., Nucl. Acids Res. 15: 8693−8711 (1987) Glazebrook et al., Genetics 143: 973−982 (1996) Gordon−Kamm et al., Plant Cell 2: 603−618 (1990) Gordon−Kamm et al、 in "Transgenic Plants", vol. 2., pp. 21−33、pub. b
y Academic Press (1993) Goerlach et al., Plant Cell 8:629−643 (1996) Greenberg et al, Cell 77:551−563 (1994) Gritz et al., Gene 25:179−188 (1983) Hayashimoto et al., Plant Physiol. 93:857−863 (1990) Hill et al., Euphytica 85:119−123 (1995) Hinchee et al., Biotechnology 6:915−921 (1988) Hoefgen & Willmitzer, Nucl. Acids Res. 16:9877 (1988) Hudspeth & Grula, Plant Molec. Biol 12:579−589 (1989) Hunt and Ryals, Crit. Rev. in Plant Sci. 15:583−606 (1996) Innis et al., PCR Protocols, a Guide to Methods and Applications eds.,
Academic Press (1990) Ishida et al., Nature Biotechnology 14:745−750 (1996) Jahne et al., Theor. Appel. Genet. 89:525−533 (1994) Keegan et al., Science 231:699−704 (1986) Keogh et al., Trans. Br. Mycol. Soc. 74:329−333(1980) Klein et al., Nature 327:70−73 (1987) Klein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:4305−4309 (1988) Klein et al., Bio/Technology 6:559−563 (1988) Klein et al., Plant Physiol. 91:440−444 (1988) Koziel et al., Biotechnology 11:194−200 (1993) Koziel et al., Annals of the New York Academy of Sciences 792:164−171 (
1996) Lawton et al., "The molecular biology of systemic aquired resistance"in
Mechanisms of Defence Responses in Plants, B. Fritig and M. Legrand, eds
(Dordrecht, The Netherlands :Kluwer Academic Publishers), pp. 422−432
(1993) Lawton et al., Plant J. 10:71−82 (1996) Logemann et al., Plant Cell 1:151−158 (1989) Maher et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:7802−7806 (1994) Mauch−ManiおよびSlusarenko, Mol. Plant−Microbe Interact. 7:378−383 (1
994) Mauch−Mani and Slusarenko, Plant Cell 8:203−212 (1996) Mayo O., The Theory of Plant Breeding, Second Edition, Clarendon Press,
Oxford (1987) Mazur et al., Plant Physiol. 85:1110 (1987) McBride et al., Plant Molecular Biology 14:266−276 (1990) McCabe et al., Biotechnology 6:923−926 (1988) McElroy et al., Plant Cell 2:163−171 (1990) McElroy et al., Mol. Gen. Genet. 231:150−160 (1991) Messing & Vierra, Gene 19:259−268 (1982) Murashiga & Skoog, Physiologia Plantarum 15:473−497 (1962) Nehra et aL、 The Plant Journal 5:285−297 (1994) Neuhaus et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:10362−10366 (1991) Norris et al., Plant Mol bol 21:895−906 (1993) Pallas et al., Plant J. 10:281−293 (1996) Parker et al., Plant Cell 8:2033−2046 (1996) Paszkowski et al., EMBO J. 3:2717−2722 (1984) Payne et al., Plant Mol Biol. 11:89−94 (1988) Picard et al., Cell 54:1073−1080 (1988) Potrykus et al., Mol. Gen. Genet. 199:169−177 (1985) Reich et al., Biotechnology 4:1001−1004 (1986) Riggs et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:5602−5606 (1986) Rogers et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:6512−6516 (1985) Rohrmeier & Lehle, Plant Molec. Biol. 22:783−792 (1993) Rothstein et al., Gene 53:153−161 (1987) Ryals et al., Plant Cell 8:1809−1819 (1996) Ryals et al., Plant Cell 9:425−439 (1997) Sambrook et al., Molecular Cloning, eds., Cold Spring Harbor Laboratory
Press (1989) Sanford et al., Particulate Science and Technology 5:27−37 (1987) Schmidhauser & Helinski, J. Bacteriol. 164:446−455 (1985) Schocher et al., Biotechnology 4:1093−1096 (1986) Shimamoto et al., Nature 338:274−277 (1989) Shinshi et al., Plant Molec. Biol.14:357−368 (1990) Shulaev et al., Plant Cell 7:1691−1701 (1995) Silhavy、et al., Experiments with Gene Fusions, eds., Cold Spring Harbo
r Laboratory Press (1984) Singh、D. P., Breeding for Resistance to Diseases and Insect Pests, Spri
nger−Verlag, NY(1986) Skuzeski et al., Plant Molec. Biol. 15:65−79 (1990) Somers et al., Bio/Technology 10:1589−1594 (1992) Spencer et al., Theor. Appl. Genet. 79:625−631 (1990) Stanford et al., Mol. Gen. Genet. 215:200−208 (1989) Svab et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:8526−8530 (1990) Taylor et al., Plant Cell Rep. 12:491−495 (1993) Thompson et al. EMBO J. 6:2519−2523 (1987) Torbert et al., Plant Cell Reports 14:635−640 (1995) Triezenberg et al., Genes Devel. 2:718−729 (1988) Uknes et al., Plant Cell 4:645−656 (1992) Uknes et al. Plant Cell 5:159−169 (1993) Uknes et al., Molecular Plant Microbe Interactions 6:680−685 (1993) Uknes et al., Mol. Plant−Microbe Interact. 6:692−698 (1993) Umbeck et al., Bio/Technology 5:263−266 (1987) Unger et al., Plant Molec. Biol. 13:411−418 (1989) van den Broeck, et al., Nature 313:358−363 (1985) Vasil et al., Biotechnology 10:667−674 (1992) Vasil et al., Biotechnology 11:1553−1558 (1993) Vernooij et al., Plant Cell 6:959−965 (1994) Vernooij et al., Mol. Plant−Microbe Interact. 8:228−234 (1995) Von Heijne et al., Plant Mol Biol. Rep. 9:104−126 (1991) Vorst et al., Gene 65:59 (1988) Wan et al., Plant Physiol. 104:37−48 (1994) Ward et al., Plant Cell 3:1085−1094 (1991) Warner et al., Plant J. 3:191−201 (1993) Wasmann et al., Mol. Gen. Genet. 205:446−453 (1986) Weeks et al., Plant Physiol. 102:1077−1084 (1993) Weissinger et al., Annual Rev. Genet. 22:421−477 (1988) Welsh J. R., Fundamentals of Plant Genetics and Breeding, John Wiley & S
ons, NY (1981) Weymann et al., Plant Cell 7:2013−2022 (1995) White et al., Nucl. Acids Res. 18:1062 (1990) Wood D. R. (Ed.) Crop Breeding, American Society of Agronomy Maison, Wis
consin(1983) WrickeおよびWeber, Quantitative Genetics and Selection Plant Breeding、
Walter de Gruyter and Co., Berlin (1986) Xu et al., Plant Molec. Biol. 22:573−588 (1993) Zhang et al., Plant Cell Rep. 7:379−384 (1988)
【０１６９】
【表５】
【０１７０】
【表６】
【０１７１】
【表７】
【０１７２】
【表８】
【０１７３】
【表９】
【０１７４】
【表１０】
【０１７５】
【表１１】
【０１７６】
【表１２】
【配列表】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ， ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，Ｃ Ｒ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ， ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，Ｋ Ｚ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ， ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，Ｓ Ｋ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 ローラ・ジーン・ウェイズロ アメリカ合衆国27603ノースカロライナ州 ローリー、ウエスト・サウス・ストリート 914番 (72)発明者 マイケル・ジー・ウィリッツ アメリカ合衆国27502ノースカロライナ州 エイペックス、ウィンター・ヒル・ドライ ブ804番 (72)発明者 テスフェイ・メンギステ アメリカ合衆国27713ノースカロライナ州 ダーラム、ペンリス・ドライブ5206番 Ｆターム(参考） 2B030 AA02 AB03 AD05 CA06 CA17 CA19 CD03 CD06 CD09 4B024 AA08 BA80 CA04 DA01 DA05 EA04 FA02 GA11 4B065 AA11X AA89X AA89Y AB01 AC20 CA53

Claims (23)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 （ａ）配列番号：2、4、6、8、16、18、20、30、32、34、36、38、40、42、44、
    46、48、50、52、54、56、58、62、64、66、68、70、72または74をコードするヌ
    クレオチド配列； （ｂ）配列番号：1、3、5、7、15、17、19、29、31、33、35、37、39、41、43、
    45、47、49、51、53、55、57、61、63、65、67、69、71または73； （ｃ）配列番号：1、3、5、7、15、17、19、29、31、33、35、37、39、41、43、
    45、47、49、51、53、55、57、61、63、65、67、69、71または73の少なくとも２
    ０個の連続した塩基対に、配列において同一である少なくとも２０個の連続した
    塩基対の一部を含むヌクレオチド配列； （ｄ）配列番号：9および10、配列番号：21および24、配列番号：22および24、
    配列番号：25および28、配列番号：26および28、または配列番号59および60とし
    て記載した一組のプライマーによるポリメラーゼ連鎖反応を用いてLycopersicon
    esculentum DNAライブラリィから増幅し得るヌクレオチド配列
    ； （ｅ）配列番号：22および24または配列番号26および28として記載した一組のプ
    ライマーによるポリメラーゼ連鎖反応を用いてBeta vulgaris DNAライブラリィ
    から増幅し得るヌクレオチド配列； （ｆ）配列番号：26および28として記載した一組のプライマーによるポリメラー
    ゼ連鎖反応を用いてHelianthus annuus DNAライブラリィから増幅し得るヌクレ
    オチド配列； （ｇ）配列番号：21および24、配列番号：21および23、配列番号：22および24、
    配列番号：25および28または配列番号：26および28として記載した一組のプライ
    マーによるポリメラーゼ連鎖反応を用いてSolanum tuberosum DNAライブラリィ
    から増幅し得るヌクレオチド配列； （ｈ）配列番号：9および10または配列番号：26および28として記載した一組の
    プライマーによるポリメラーゼ連鎖反応を用いてBrassica napus DNAライブラリ
    ィから増幅し得るヌクレオチド配列； （ｉ）配列番号：13および14、配列番号：21および24または配列番号：22および
    24として記載した一組のプライマーによるポリメラーゼ連鎖反応を用いてArabid
    opsis thalianaDNAライブラリィから増幅し得るヌクレオチド配列； （ｊ）配列番号：9および10、配列番号：11および12、配列番号：21および24、
    配列番号：22および24、配列番号：25および28または配列番号：26および28とし
    て記載した一組のプライマーによるポリメラーゼ連鎖反応を用いてNicotiana ta
    bacum DNAライブラリィから増幅し得るヌクレオチド配列；または （ｋ）最初の20個のヌクレオチドおよび配列番号：1、3、5、7、15、17、19、29
    、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、61、63、65、67
    、69、71または73のコード配列（CDS）の少なくとも20個のヌクレオチドの逆の
    相補物を含む一組のプライマーによるポリメラーゼ連鎖反応を用いて植物DNAラ
    イブラリィから増幅し得るヌクレオチド配列； 、を含む単離した核酸分子。
  2. 【請求項２】 配列番号：2、4、6、8、16、18、20、30、32、34、36、38、
    40、42、44、46、 48、50、52、54、56、58、62、64、66、68、70、72または74
    をコードするヌクレオチド配列を含有する、請求項１に記載の単離した核酸分子
    。
  3. 【請求項３】 配列番号：1、3、5、 7、15、17、19、29、31、33、35、37
    、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、61、63、65、67、69、 71または7
    3を含有する、請求項１に記載の単離した核酸分子。
  4. 【請求項４】 配列番号：1、3、5、7、15、17、19、29、31、33、 35、37
    、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、61、63、65、67、69、71または73
    の少なくとも20個の連続した塩基対の一部と、配列において同一である少なくと
    も20個の連続した塩基対の一部からなるヌクレオチド配列を含有する、請求項１
    に記載の単離した核酸分子。
  5. 【請求項５】 配列番号：9 および10、配列番号：21および 24、配列番号
    ：22および24、配列番号：25および28、配列番号：26および28または配列番号：
    59および60として記載した一組のプライマーによるポリメラーゼ連鎖反応を使用
    するLycopersicon esculentum DNAライブラリィから増幅し得るヌクレオチド配
    列を含有する、請求項１に記載の単離した核酸分子。
  6. 【請求項６】 配列番号：22および24または配列番号：26および28として記
    載した一組のプライマーによるポリメラーゼ連鎖反応を使用するBeta vulgaris
    DNAライブラリィから増幅し得るヌクレオチド配列を含有する、請求項１に記載
    の単離した核酸分子。
  7. 【請求項７】 配列番号：26および28として記載した一組のプライマーに
    よるポリメラーゼ連鎖反応を使用するHelianthus annuus DNAライブラリィから
    増幅し得るヌクレオチド配列を含有する、請求項１に記載の単離した核酸分子。
  8. 【請求項８】 配列番号：21および24、配列番号：21および23、配列番号
    ：22および24、配列番号：25および28または 配列番号：26および28として記載
    した一組のプライマーによるポリメラーゼ連鎖反応を用いてSolanum tuberosum
    DNAライブラリィから増幅し得るヌクレオチド配列を含有する、請求項１に記載
    の単離した核酸分子
  9. 【請求項９】 配列番号：9および10または配列番号：26および28として記
    載した一組のプライマーによるポリメラーゼ連鎖反応を使用するBrassica napus
    DNAライブラリィから増幅し得るヌクレオチド配列を含有する、請求項１に記載
    の単離した核酸分子。
  10. 【請求項１０】 配列番号：13および14、配列番号: 21および24または配列
    番号：22および24として記載した一組のプライマーによるポリメラーゼ連鎖反応
    を用いるArabidopsis thaliana DNAライブラリィから増幅し得るヌクレオチド配
    列を含有する、請求項１に記載の単離した核酸分子。
  11. 【請求項１１】 配列番号：9および10、配列番号:11および12、配列番号：
    21および24、配列番号：22および24、配列番号：25および28または配列番号：26
    および28として記載した一組のプライマーによるポリメラーゼ連鎖反応を使用す
    るNicotiana tabacum DNAライブラリィから増幅し得るヌクレオチド配列を含有
    する、請求項１に記載の単離した核酸分子。
  12. 【請求項１２】 最初の20個のヌクレオチドに対応する一組のプライマーお
    よび配列番号：1、3、5、7、15、17、19、29、31、33、35、37、39、41、43、45
    、47、49、51、53、55、57、61、63、65、67、69、71または73のコード配列（Ｃ
    ＤＳ）の少なくとも20個のヌクレオチドの逆の相補物によるポリメラーゼ連鎖反
    応を用いる植物DNAライブラリィから増幅し得るヌクレオチド配列を含有する、
    請求項１に記載の単離した核酸分子。
  13. 【請求項１３】 請求項１〜12のいずれかに記載の核酸分子に機能的に結合
    した植物においてプロモターの活性を含むキメラ遺伝子。
  14. 【請求項１４】 請求項13記載のキメラ遺伝子を含む組換えベクター。
  15. 【請求項１５】 請求項13記載のキメラ遺伝子を含む宿主細胞。
  16. 【請求項１６】 請求項13記載のキメラ遺伝子を含む植物。
  17. 【請求項１７】 下記の植物：コメ、小麦、大麦、ライ麦、コーン、ポテト
    、キャノーラ、ヒマワリ、ニンジン、サツマイモ、テンサイ（シュガー・ビート
    ）、インゲンマメ、エンドウ、チコリ、レタス、キャベツ、カリフラワー、ブロ
    ッコリー、カブラ、ラディッシュ、ホウレンソウ、アスパラガス、オニオン、ニ
    ンニク、ナス、コショウ、セロリー、カボチャ、ペポカボチャ、キュウリ、リン
    ゴ、洋ナシ、マルメロ、メロン、スモモ、チェリー、ピーチ、ネクタリン、アプ
    リコット、イチゴ、ブドウ、キイチゴ、ブラックベリー、パイナップル、アボガ
    ド、パパイア、マンゴ、バナナ、ダイズ、タバコ、トマト、モロコシ属類および
    サトウキビ、から選択された、請求項16記載の植物。
  18. 【請求項１８】 請求項16記載の植物からの種。
  19. 【請求項１９】 該植物において請求項13記載のキメラ遺伝子を発現するこ
    とを含む、該植物においてSAR遺伝子発現を増加する方法。
  20. 【請求項２０】 該植物において請求項13記載のキメラ遺伝子を発現するこ
    とを含む、該植物において疾病耐性を増加する方法。
  21. 【請求項２１】 配列番号：9-14、21-28、59および60からなる群から選択
    されるPCRプライマー。
  22. 【請求項２２】 配列番号：1、3、5、7、15、17、19、29、31、33、 35、3
    7、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、61、63、65、67、69、71または7
    3のコード配列（CDS）の最初の20個のヌクレオチドおよび最後の20個のヌクレオ
    チドの逆相補物に対応する一組のプライマー、または配列番号：9および10、配
    列番号：11および12、配列番号：13および14、配列番号：21および24、配列番号
    ：22および24、配列番号：21および23、配列番号：25および28、配列番号：26お
    よび28または配列番号：59および60に記載の一組のプライマーによる、ポリメラ
    ーゼ連鎖反応を用いる植物DNAライブラリィからDNA分子を増幅することを含む植
    物において、組織的に獲得された耐性を導くシグナルトランスダクション・カス
    ケードに関与するNIM1相同物を単離するための方法。
  23. 【請求項２３】 該植物のDNAライブラリィが、Nicotiana tabacum (タバコ
    )、Lycopersicon esculentum (トマト)、Brassica napus (脂肪種子)、 Arabido
    psis thaliana、 Beta vulgaris (テンサイ)、 Helianthus annuus (sunflower)
    または Solanum tuberosum (ポット) のDNAライブラリィである、請求請22記載
    の方法。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20220065611A (ko) * 2020-11-13 2022-05-20 서울대학교산학협력단 셀룰로오스 합성 유전자 Solyc07g043390이 과발현된 토마토 황화잎말림 바이러스병에 대한 내성이 증진된 형질전환 식물체

Families Citing this family (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100447813B1 (ko) * 2000-12-18 2004-09-08 세미니스코리아주식회사 담배 유래의 Ｔｓｉｐ1 유전자 도입 재조합 벡터 및 그 형질전환균주
KR100423262B1 (ko) * 2000-12-18 2004-03-19 세미니스코리아주식회사 담배 유래의 Ｔｓｉ1 유전자를 도입하여 제조된 형질전환균주
US8777011B2 (en) 2001-12-21 2014-07-15 Novartis Ag Capsule package with moisture barrier
WO2006005004A2 (en) * 2004-06-30 2006-01-12 University Of Florida Research Foundation Inc. Materials and methods for enhancing nitrogen fixation in plants
RU2298326C1 (ru) * 2005-09-20 2007-05-10 ГНУ Всероссийский научно-исследовательский институт табака, махорки и табачных изделий Индуктор устойчивости рассады табака к болезням и способ его применения
RU2349079C1 (ru) * 2007-06-26 2009-03-20 Государственное научное учреждение Северо-Кавказский зональный научно-исследовательский институт садоводства и виноградарства Россельхозакадемии Способ определения устойчивых к коккомикозу форм вишни и черешни
RU2343697C1 (ru) * 2007-07-02 2009-01-20 Государственное научное учреждение Северо-Кавказский зональный научно-исследовательский институт садоводства и виноградарства Россельхозакадемии Способ определения устойчивых к коккомикозу форм вишни и черешни
RU2402607C2 (ru) * 2008-10-21 2010-10-27 Учреждение Российской академии наук Центр "Биоинженерия" РАН Вирусный вектор для продукции рекомбинантных белков в растениях
RU2393226C1 (ru) * 2009-03-16 2010-06-27 Учреждение Российской академии наук Институт цитологии и генетики Сибирского отделения РАН (ИЦиГ СО РАН) РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДА, ОБЕСПЕЧИВАЮЩАЯ ЭКСПРЕССИЮ ГЕНА ЭКСТРАКЛЕТОЧНОЙ РИБОНУКЛЕАЗЫ Zinnia elegans ZRNaseII В ТРАНСГЕННЫХ РАСТЕНИЯХ (ВАРИАНТЫ), И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ВИРУСОУСТОЙЧИВЫХ ФОРМ РАСТЕНИЙ
CN117088948B (zh) * 2023-08-23 2024-05-14 中国农业大学 辣椒疫霉调控游动孢子发育相关蛋白及其编码基因与应用

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2263146A1 (en) * 1996-08-09 1998-02-19 The General Hospital Corporation Acquired resistance npr genes and uses thereof
FR2757875A1 (fr) * 1996-12-13 1998-07-03 Ciba Geigy Ag Procedes d'utilisation du gene nim1 pour conferer aux vegetaux une resistance aux maladies
TR199901491T2 (xx) * 1996-12-27 1999-08-23 Novartis Ag Bitkileri korumak i�in y�ntem.

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20220065611A (ko) * 2020-11-13 2022-05-20 서울대학교산학협력단 셀룰로오스 합성 유전자 Solyc07g043390이 과발현된 토마토 황화잎말림 바이러스병에 대한 내성이 증진된 형질전환 식물체
KR102583332B1 (ko) * 2020-11-13 2023-09-25 서울대학교산학협력단 셀룰로오스 합성 유전자 Solyc07g043390이 과발현된 토마토 황화잎말림 바이러스병에 대한 내성이 증진된 형질전환 식물체

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