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CN117088948B - 辣椒疫霉调控游动孢子发育相关蛋白及其编码基因与应用 - Google Patents

辣椒疫霉调控游动孢子发育相关蛋白及其编码基因与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种来自疫霉菌(Phytophthora spp.)的含有Afil和SPA结构域的游动孢子发育调控蛋白MesA及其编码基因与应用。其中辣椒疫霉(Phytophthora capsici)的生长发育调控蛋白PcMesA具有SEQ ID No.2所示的氨基酸序列，其编码基因具有SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。本发明MesA蛋白的主要作用是疫霉菌游动孢子形成所必须的，MesA蛋白缺失后疫霉菌孢子囊不能分化形成正常的游动孢子。本发明的基因在控制疫霉菌引起的疫病中具有很高的应用价值，基于该蛋白为作用靶标开发的新型杀菌剂对控制疫霉引起的疫病的发生和流行具有重要的实践意义。

Description

辣椒疫霉调控游动孢子发育相关蛋白及其编码基因与应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种辣椒疫霉调控游动孢子发育相关蛋白及其编码基因与应用；特别涉及来自植物病原卵菌中的疫霉属病原菌(Phytophthora spp.)的含有Afil和SPA结构域的调控游动孢子发育MesA及其编码基因与应用。
背景技术
卵菌(Oomycetes)是一类数量庞大的真核生物，目前已知的卵菌数量超过1800种，在世界范围内广泛分布，可引起多种动植物疾病。虽然卵菌和真菌在菌丝形态和营养物质吸收方式等方面相似，但是卵菌和真菌的亲缘关系较远，和硅藻亲缘关系较近，均属于茸鞭生物界。植物病原卵菌占卵菌总数的60％左右，可以分为疫霉属(Phytophthora)、腐霉属(Pythium)、霜霉属(Peronospora)等。其中疫霉属病原(Phytophthora spp.)在农业生产中危害严重，有6种疫霉属病原菌被列为世界十大重要植物病原卵菌，包括致病疫霉(Phytophthorainfestans)、大豆疫霉(Phytophthora sojea)和辣椒疫霉(Phytophthoracapsici)等。其辣椒疫霉(Phytophthoracapsici)寄主广泛，可侵染包括茄科中的辣椒、烟草以及豆科、葫芦科等26科70多种蔬菜作物。辣椒疫霉在苗期至果期均会引起植株的病害，并导致作物的根茎部、果实的腐烂，严重时导致植株萎蔫甚至猝倒，对作物产量和品质的影响极大，造成严重的经济损失。
辣椒疫霉的生活史包括有性阶段和无性阶段，有性阶段通过异宗配合产生卵孢子；无性阶段则是通过成熟的孢子囊在低温潮湿的条件下从孔口释放游动孢子，游动孢子到达寄主表面形成休止孢，条件适宜下萌发成菌丝直接侵入或者通过伤口或孔口侵染植物，这是主要的侵染来源。孢子囊和游动孢子随风雨和灌溉水进行远程传播，是造成植物疫病爆发的主要原因。因此，抑制游动孢子的产生可进一步抑制病原菌的侵染和致病力以达到切断病害循环、控制辣椒疫霉引起的植物疫病的流行。
MesA蛋白是一类在病原菌中保守存在的极性轴稳定相关蛋白，其在玉米黑粉菌(Ustilagomaydis)、禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)和构巢曲霉(Aspergillusnidulans)的菌丝正常形态维持和侵染致病方面发挥重要作用。MesA同源蛋白在卵菌中普遍存在，但其生物学功能尚未见报道。
发明内容
发明人前期研究发现，辣椒疫霉的MesA蛋白虽和丝状菌丝的MesA蛋白均具有Afil(Avl9 superfamily)和SPA(stabilization ofpolarity axis)结构域，但是蛋白同源性均小于25％，这表明卵菌MesA蛋白可能具有区别于真菌MesA蛋白的功能特征。进一步生物信息学分析发现，辣椒疫霉MesA蛋白和其他卵菌MesA蛋白同源性很高，均在60％以上。系统发育进化关系分析发现疫霉属MesA蛋白的亲缘关系更近，辣椒疫霉MesA与其蛋白同源性均在70％以上，其中与橡树疫霉(Phytophthora ramorum)MesA蛋白同源性为91.11％。综上所述，MesA蛋白在卵菌尤其是疫霉菌中具有较高的同源性。
基于此，通过发明人的研究发现，辣椒疫霉中存在含有MesA蛋白保守结构域Afil和SPA的PcMesA。该蛋白调控游动孢子的形成，因此，可以通过控制游动孢子发育蛋白PcMesA来阻断卵菌的正常侵染，达到控制(抑制或阻断)卵菌引起的病害大规模的传播和流行。
因此，本发明提供了一种疫霉病菌中含有Afil和SPA结构域的游动孢子发育调控蛋白，名称为MesA，为如下A1)或A2)或A3)或A4)：
A1)氨基酸序列是如SEQ ID NO.2所示的蛋白质；
A2)在如SEQ ID NO.2所示的蛋白质的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白质；
A3)将如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的如SEQ ID NO.2所示的蛋白衍生的蛋白质；
A4)与如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列相似性在60％以上，优选在70％以上，更优选在90％以上且具有与如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列相同功能的氨基酸序列。
为了使A1)中的蛋白方便纯化，也可以在如SEQ ID No.2所示的蛋白质的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白质；所述标签可以为Poly-Arg(RRRRR)、Poly-His(HHHHHH)、FLAG(DYKDDDDK)、Strep-tag II(WSHPQFEK)、c-myc(EQKLISEEDL)等标签。
上述A1)-A4)中的生长发育调控蛋白一般来源于自然界中疫霉菌中，即一般来讲，其为天然产物，也可以人工表达或者合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述A2)-A4)中蛋白质的编码基因可通过将序列表中SEQ ID NO.2所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个核苷酸对的错义突变，和/或在其5’端和/或3’端连上述标签的编码序列得到。其中，其中，辣椒疫霉(Phytophthora capisici)PcMesA的序列如SEQ ID NO.2所示,序列表中SEQ ID NO.2(MesA)由560个氨基酸残基组成。
本发明目的之二是提供编码所述含有Afil和SPA结构域的MesA蛋白的核酸分子。所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA、hnRNA或tRNA等。
其中，上述MesA蛋白的编码基因为如下B1)或B2)或B3)：
B1)序列表中SEQ ID NO.1所述的核苷酸序列所示的DNA分子；
B2)与B1)所示的核苷酸序列的具有60％以上或70％以上或90％以上同一性，且编码上述PcMesA蛋白的cDNA分子或DNA分子；
B3)在严格条件下与B1)或B2)限定的核苷酸序列杂交，且编码上述PcMesA蛋白的cDNA分子或DNA分子。
在本发明中，致病调控蛋白的DNA序列(编码基因和cDNA)可以具体地如SEQ IDNo.1所示，序列表中SEQ ID NO.1由2028个核苷酸组成，自序列1的5’端第1-2028位核苷酸为编码序列，编码序列表中SEQ ID NO.2所示的蛋白质(PcMesA)。
本发明之三提供了如上任意一种DNA序列转录得到的RNA序列，优选的，所述RNA分子的序列为如下C1)或C2)：
C1)如SEQ ID NO.1所示的DNA序列转录的RNA序列的相似性在60％以上，进一步优选在70％以上，更优选在90％以上且具有与如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.1所示的DNA序列转录的RNA序列相同功能的RNA序列；
C2)最优选RNA序列为如SEQ ID NO.1所示的DNA序列转录的RNA序列。
本发明之四提供与上述的生长发育调控蛋白、编码基因或上述RNA分子相关的生物材料，为下述D1)至D10)中的任一种：
D1)含有所述编码基因的表达盒；
D2)含有所述编码基因的重组载体、或含有D1)所述表达盒的重组载体；
D3)含有所述编码基因的重组微生物、或含有D1)所述表达盒的重组微生物、或含有D2)所述重组载体的重组微生物；
D4)含有所述编码基因的转基因植物细胞系、或含有D1)所述表达盒的转基因植物细胞系；
D5)含有所述编码基因的转基因植物组织、或含有D2)所述表达盒的转基因植物组织；
D6)含有所述编码基因的转基因植物器官、或含有D2)所述表达盒的转基因植物器官；
D7)抑制所述编码基因表达的核酸分子；优选的，所述核酸分子为敲除所述编码基因的核酸分子，或者沉默所述编码基因的核酸分子，也可以为编码表达靶向待敲除目的基因的sgRNA片段，如靶向于PcMesA基因的sgRNA序列(编码序列)AACATCCCACCATTCCCTCT；
D8)含有或表达D7)所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因植物细胞系，重组载体可以包括基于CRISPR/Cas9的基因敲除法是将目的基因的Donor载体和sgRNA及Cas9蛋白表达质粒；所述Donor载体为含有依次连接的待敲除目的基因上游800-1500bp的序列、Donor DNA序列(可以为NPTII或GFP或RFP等基因序列)和待敲除目的基因的下游800-1500bp的序列的重组载体。sgRNA及Cas9蛋白共表达质粒为编码表达靶向待敲除目的基因的sgRNA片段和表达Cas9蛋白的DNA序列的载体，其中，所述待敲除目的基因为PcMesA基因，靶向于PcMesA基因的sgRNA序列(编码序列)为AACATCCCACCATTCCCTCT。优选的，所述sgRNA及Cas9共表达质粒是以pYF515载体为出发载体，将PcMesA基因的sgRNA退火得到的双链sgRNA编码序列，插入pYF515载体的Nhe I和Bsa I酶识别位点之间，得到sgRNA及Cas9共表达质粒；
D9)抑制所述RNA分子翻译的核酸分子；
D10)含有或表达D9)所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因植物细胞系。
本发明目的之五是提供辣椒疫霉PcMesA蛋白及编码PcMesA蛋白的核酸分子或含有编码PcMesA蛋白的核酸分子的生物材料的应用。
所述应用为下述1)-5)中任一种或几种：
1)在调控(提高或降低)卵菌游动孢子产量中的应用；
2)在调控(提高或降低)卵菌侵染寄主能力中的应用；
3)在抑制和/或杀灭卵菌中的应用。
优选的，其中，所述应用中，包括通过抑制序列1所述的编码基因中的转录或使其灭活，或抑制所述的RNA分子的翻译，或抑制和/或灭活序列2所述的PcMesA蛋白的活性来实现1)-3)所述的应用。
所述应用中，通过抑制如上述的编码基因的转录，或抑制上述的RNA序列的翻译，或抑制和/或失活上述PcMesA蛋白的活性来影响卵菌游动孢子产生和调控侵染寄主能力。
本发明的目的之六为提供所述序列表中SEQ ID NO.2所示的PcMesA蛋白、所述序列表中SEQ ID NO.1所示的编码基因或上述RNA分子或上述生物材料或如权利要求5所述的蛋白或者DNA在作为抑菌或杀菌剂靶标筛选卵菌抑菌和/或杀菌剂中的应用；所述抑菌或杀菌剂可通过抑制或者灭活卵菌SEQ ID NO.2所示的PcMesA蛋白抑制游动孢子的产生，从而能够抑制或杀灭卵菌。优选的，所述致病调控蛋白的cDNA序列为如SEQ ID No.1所示的DNA序列。优选的，所述方法用于抑制和/或杀灭卵菌引起的生产上的卵菌病害。
所述卵菌优选为疫霉，更优选为辣椒疫霉病菌(Phytophthora capsici)。
本发明目的之七是提供一种筛选或辅助筛选卵菌(如疫霉，特别是辣椒疫霉)抑菌和/或杀菌剂的方法，所述方法包括将待检测物应用于所述卵菌，当所述待检测物能够抑制如上DNA序列的转录，或抑制如上RNA序列的翻译，或抑制和/或失活如上所示MesA蛋白的活性，则所述待测物质为候选的植物卵菌抑菌和/或杀菌剂。
本发明目的之八是提供一种降低卵菌活性的方法，包括下述步骤：抑制如上述的编码基因的转录，或抑制所述的RNA分子的翻译，或抑制和/或失活如上所述的MesA蛋白的活性；
本发明还提供降低卵菌侵染寄主能力的方法，是通过所述的抑制卵菌(如疫霉，特别是辣椒疫霉)游动孢子的产生来降低卵菌侵染寄主能力。
上述方法中，通过敲除如上任意一种DNA序列，抑制卵菌游动孢子的产生。所述卵菌优选为疫霉，更优选为辣椒疫霉病菌(Phytophthora capsici)，如辣椒疫霉病菌BYA5菌株。
本发明的一个实施方式中，其中上述基因敲除和回补的方法采用基于CRISPR/Cas9的基因敲除法。
具体的，基于CRISPR/Cas9的基因敲除和回补法是将目的基因的Donor载体和sgRNA及Cas9共表达质粒转染卵菌筛选得到所述目的敲除蛋白灭活的重组菌。
所述敲除相关载体，其中Donor载体为含有依次连接的待敲除目的基因上游800-1500bp的序列、Donor DNA序列(可以为NPTII或GFP或RFP等基因序列)和待敲除目的基因的下游800-1500bp的序列的重组载体；所述回补相关载体，其中Donor载体为依次含有敲除目的基因上游800-1500bp的序列、DonorDNA(PcMesA基因序列)和敲除目的基金的下游800-1500bp的序列的重组载体。
sgRNA及Cas9蛋白共表达质粒为编码表达靶向待敲除目的基因的sgRNA片段和表达Cas9蛋白的DNA序列的载体，其中，所述待敲除目的基因为PCMesA基因及GFP基因，靶向于PcMesA基因的sgRNA序列(编码序列)为AACATCCCACCATTCCCTCT，靶向GFP基因的sgRNA序列(编码序列)为CCACGGAACAGGGAGCTTTC。
优选的，所述sgRNA及Cas9共表达质粒是以pYF515载体为出发载体，分别将PcMesA基因和GFP基因的sgRNA退火得到的双链sgRNA编码序列，插入pYF515载体的Nhe I和Bsa I酶识别位点之间，得到sgRNA及Cas9共表达质粒。
上述应用中，所述PcMesA表达和/或活性的物质为抑制PcMesA表达和/或抑制其编码基因的转录和/或抑制PcMesA的编码基因转录得到的RNA分子的翻译的物质。
试验证明，本发明所提供的MesA蛋白在疫霉菌的游动孢子发育过程中起作用。利用PEG-CaCl2介导的原生质体转化技术并结合CRISPR/Cas9基因编辑技术获得的敲除突变体，其游动孢子生长发育较野生型亲本菌株而言有明显变化，主要包括：MesA蛋白缺失后孢子囊内容物不能正常分裂，不能形成正常形态的游动孢子。因此，疫霉菌游动孢子发育调控蛋白MesA在疫霉菌无性繁殖过程可发挥重要作用，进而切断病害循环影响卵菌对植物的侵染。本发明为进一步探究疫霉属病菌乃至卵菌的游动孢子形成过程及致病机制提供了技术支持，并为卵菌引起的植物疫病防治及新型杀菌剂的研发提供了技术基础。
附图说明
图1为辣椒疫霉PcMesA结构域示意图，包含Afil和SPA结构域。
图2为不同物种MesA蛋白的聚类分析。(注：分支线上的数字代表进化分支长度，分支长度越短代表差异越小，进化距离越近)。
图3为野生型辣椒疫霉菌株BYA5(WT)、PcMesA基因敲除突变体ΔMesA-T1、ΔMesA-T2和PcMesA基因敲除回补菌株ΔMesA-T1::MesA的菌丝生长速率、孢子囊数量及菌丝侵染烟草叶片致病力症状、孢子囊和游动孢子形态。其中图3中A为病原菌形态特征或者侵染症状；图3中B为数据统计柱状图。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
辣椒疫霉野生型菌株BYA5由中国农业大学植物保护学院种子病理与杀菌剂药理实验室保存，在文献“Wang,W.,et al.,PcMuORP1,an Oxathiapiprolin-Resistance Gene,Functions as aNovel Selection Marker for Phytophthora Transformation andCRISPR/Cas9 Mediated Genome Editing.Frontiers in Microbiology,2019.10.”中公开过，公众可从中国农业大学获得。
本研究所用培养基及试剂配方：
常用V8培养基：340mL V8，4.76g CaCO3，去离子水定容至3.4L，再加入51g琼脂制备成固体培养基，121℃高压湿热灭菌20min。
PM培养基(Pea Mannitol)：1L去离子水中加入125g豌豆以121℃灭菌20min后用纱布滤得豌豆汤，向其中加入Mannitol 91.1g，CaCO32 g，CaCl21 g，蒸馏水定容至1L，固体培养基则再加入15g琼脂粉，121℃灭菌20min。
敲除转化试验所用培养基如下：
NPB培养基(Nutrient pea broth)：1L去离子水中加入125g豌豆以121℃灭菌20min后用纱布滤得豌豆汤，向其中加入Yeast Extract 2.0g、Glucose 5.0g、Mannitol5.0g、Sorbitol 5.0g、CaCO32.0 g、CaCl20.1 g、MgSO40.5g、MgSO40.5 g、KNO33.0 g、K2HPO41.0 g、KH2PO41.0 g，用去离子水定容至1L。若配制固体培养基则再加入琼脂粉15g，121℃灭菌20min。灭菌后加入0.22μM过滤器过滤后的Vitamin stock 2mL(Folic acid 6.7×10-7g/mL；Pyridoxine-HCl 6.0×10-4g/mL；Biotin 6.7×10-7g/mL；Thiamine-HCl1.3×10-3g/mL；L-inositol 4.0×10-5g/mL；Nicotinic acid 4.0×10-5g/mL；Riboflavin 5.0×10-5g/mL)和Vitamin stock 2mL(FeC6H5O7·3H2O 5.4×10-4g/mL；Na2MoO4·H2O 3.0×10- 5g/mL；ZnSO4·7H2O 3.8×10-4g/mL；
MgSO4·H2O 3.8×10-5g/mL；H3BO32.5×10-5g/mL；CuSO4·5H2O 7.5×10-4g/mL)
敲除转化试验试剂配制如下：
酶解液：现用现配，裂解酶(Lysing Enzymes from Trichoderma harzianum,L1412,Sigam)0.12g,纤维素酶(yakult R10)0.12g，0.8M Mannitol 10mL，超纯水8mL，0.5MKCl 800μL，0.5M MES(pH 5.7)800μL，0.5M CaCl2400μL，0.22μM滤膜过滤灭菌。
W5溶液：KCl 0.1g，CaCl2·2H2O 4.6g，NaCl 2.25g，Glucose 7.8g，超纯水溶解定容至250mL，0.22μm滤膜过滤灭菌。
PEG-CaCl2溶液(40％w/v)：现用现配，6g PEG4000，0.8M Mannitol3.75mL，超纯水3mL，0.5M CaCl23 mL，0.22μm滤膜过滤灭菌。
MMG溶液(250mL)：Mannitol 18.22g，0.5M MES(pH 5.7)2.0mL，MgCl2·6H2O0.76g，超纯水定容至250mL，0.22μm滤膜过滤灭菌。
实施例1、辣椒疫霉中生长发育调控蛋白PcMesA及其编码基因的获得及PcMesA蛋白与植物病原菌中MesA蛋白的同源性比较
本实施例中辣椒疫霉游动孢子发育调控蛋白PcMesA及其编码基因(或cDNA)可以辣椒疫霉菌株BYA5的DNA(或cDNA)为模板，通过表1所列引物扩增获得。其中，DNA或RNA提取的材料可以为辣椒疫霉菌株BYA5的菌丝体。其中，以辣椒疫霉菌株BYA5的DNA为模板用PcMesA-F和PcMesA-R扩增得到PcMesA的编码基因PcMesA，如序列表中SEQ ID NO.1所示，SEQ ID NO.1由2028个核苷酸组成，自SEQ ID NO.1的5’端第1-2028位核苷酸为编码序列，编码序列表中SEQ ID NO.2所示的蛋白质(PcMesA)，如图1所示，该蛋白包含Afi1结构域和SPA结构域，其中，Afi1结构域的序列为自SEQ ID NO.2的氨基端第13-111位氨基酸残基序列，SPA结构域的序列为自SEQ ID No.2的氨基端第242-364位氨基酸残基序列。以辣椒疫霉菌株BYA5的cDNA为模板用PcMesA-F和PcMesA-R扩增得到PcMesA的cDNA，其序列与编码基因序列相同，如SEQ ID NO.1所示。上述蛋白或基因也可以人工合成。
表1.PcMesA全长编码基因扩增引物
聚类分析及同源性比较说明，辣椒疫霉的MesA蛋白虽和丝状菌丝的MesA蛋白均具有Afil(Avl9 superfamily)和SPA(stabilization ofpolarity axis)结构域，但是如表2所示PcMesA蛋白和卵菌中MesA蛋白同源性均小于25％，这表明卵菌MesA蛋白可能具有区别于真菌MesA蛋白的功能特征。进一步生物信息学分析发现，如表3所示辣椒疫霉MesA蛋白和其他卵菌MesA蛋白同源性很高，均在60％以上。系统发育进化关系分析如图2所示，发现疫霉属MesA蛋白的亲缘关系更近。辣椒疫霉MesA与其蛋白同源性均在70％以上，其中与橡树疫霉(Phytophthora ramorum)MesA蛋白同源性为91.11％。综上所述，MesA蛋白在卵菌尤其是疫霉菌中具有较高的同源性。
表2.PcMesA蛋白和真菌中MesA蛋白同源性比较
表3.PcMesA蛋白和卵菌中MesA蛋白同源性比较
实施例2、辣椒疫霉PcMesA基因敲除及回补载体的构建
本实施例中基于CRISPR/Cas9的基因敲除及回补载体构建方法以及相关载体的序列以及GFP基因序列在文献“Fang,Y.,andTyler,B.M.(2016).Efficient disruption andreplacement ofan effector gene inthe oomycete Phytophthora sojaeusing CRISPR/Cas9.Molecularplantpathology,17(1),127-139.”以及“Fang,Y.,Cui,L.,Gu,B.,Arredondo,F.,and Tyler,B.M.(2017).Efficient genome editing inthe oomycetePhytophthora sojae using CRISPR/Cas9.Curr.Protoc.Microbiol.44,21A.1.1-21A.1.26.”中公开过。本实施例中使用的pBluescript II SK+同源臂载体质粒(Donor载体)，sgRNA及Cas9共表达质粒PYF515均由美国俄勒冈州立大学BrettM.Tyler教授馈赠。
本实例中使用的插入片段PcMuORP1的基因序列在文献“Wang,W.,Xue,Z.,Miao,J.,Cai,M.,Zhang,C.,Li,T.,Zhang,B.,Tyler,B.M.and Liu,X.(2019)PcMuORP1,anOxathiapiprolin-Resistance Gene,Functions as aNovel Selection MarkerforPhytophthoraTransformation and CRISPR/Cas9 Mediated GenomeEditing.Front.Microbiol.10,2402.”中公开过。
本实施方式中所用的敲除相关的Donor载体pBS-GFP-MesA、sgRNA及Cas9共表达质粒pYF515-MesA，以及带有氟噻唑吡乙酮筛选标记的共表达质粒pYF515-PcMuORP1-MesA；回补相关载体有Donor载体pBS-MesA、带有氟噻唑吡乙酮筛选标记的共表达质粒pYF515-PcMuORP1-GFP。具体构建方法如下所述：
本实施方式中所用的Donor载体pBS-GFP-MesA、pBS-MesA；sgRNA及Cas9共表达质粒pYF515-MesA和pYF515-GFP，具体构建方法如下所述：
1)pBS-GFP-MesA的构建：以辣椒疫霉菌株BYA5的DNA为模板，利用TaKaRa-In-Fusion_Tools在线网站(http://www.clontech.com/US/Products/Cloning_and_Competent_Cells/Clonin g_Resources/Online_In-Fusion_Tools)设计引物扩增目的基因PcMesA上游1000bp序列(序列表中序列3所示，经如表2所示pBS-GFP-MesA-F1和pBS-GFP-MesA-R1所示引物扩增获得)、GFP基因序列(序列表中序列5所示，GFP基因是以pTOR骨架质粒为模板用引物序列如表2所示pBS-GFP-MesA-F2和pBS-GFP-MesA-R2扩增获得的片段)、PcMesA下游1000bp序列(序列表中序列4所示经引物序列如表2所示pBS-GFP-MesA-F3和pBS-GFP-MesA-R3的引物扩增获得)，利用HD Cloning Kit将三个扩增片段依次融合连接入克隆载体pBluescript II SK+(EcoRI和BamHI双酶切)，连接产物转入大肠杆菌DH5α感受态细胞中，37℃过夜培养后，挑取单克隆，使用通用引物M13F(序列：
5’-TGTAAAACGACGGCCAGT-3’)/M13R(序列：5’-CAGGAAACAGCTATGACC-3’)扩增、测序验证克隆，将验证正确的含有依次连接的PcMesA上游1000bp序列、GFP基因序列和PcMesA下游1000bp序列的重组表达载体命名为pBS-GFP-MesA。
2)pYF515-MesA的构建：利用sgRNA设计网站EuPaGDT(http://grna.ctegd.uga.edu/)以及RNA结构在线分析工具(http://rna.urmc.rochester.edu/RNAstructureWeb/Servers/Predict1/Predict1.ht mL)，选择特异性靶向PcMesA基因且形成二级结构较弱的sgRNA序列(sgMesA：AACATCCCACCATTCCCTCT，靶向于PcMesA基因的SEQIDNo.1的第1051-1070位核苷酸序列，送至公司合成带有NheI和BsaI酶切位点以及HHribozyme的正反向sgRNA序列引物。用无菌水溶解成100μM溶液。退火反应合成双链sgRNA序列，反应体系：3μl正义链溶液，3μl反义链溶液，3μl 10×T4 DNA Ligase Buffer(NEB)，4μl0.5M NaCl，21μl超纯无菌水，吸打混匀，100℃反应2min，放至室温自然冷却4h，之后将反应液稀释500倍。再取2μl 10×T4 DNA Ligase Buffer(NEB)，50ng pYF515载体(Nhe I/Bsa I双酶切)，4μl稀释后的双链sgRNA溶液，1μl T4 DNA Ligase，无菌超纯水补齐至20μl，室温反应30min，使用5μl连接产物转入大肠杆菌DH5α感受态细胞中，37℃过夜培养后，使用引物对RPL41_Pseq_F(序列：5’-CAAGCCTCACTTTCTGCTGACTG-3’)/M13F(序列：5’-TGTAAAACGACGGCCAGT-3’)进行菌落PCR验证，并测序验证阳性克隆，将验证正确可表达上述sgRNA的重组载体命名为pYF515-GFP-MesA。
3)pBS-MesA的构建：以辣椒疫霉菌株BYA5的DNA为模板，利用TaKaRa-In-Fusion_Tools在线网站(http://www.clontech.com/US/Products/Cloning_and_Competent_Cells/Clonin g_Resources/Online_In-Fusion_Tools)设计引物扩增目的基因PcMesA上游1000bp序列(序列表中序列3所示，经如表2所示pBS-MesA-F1和pBS-MesA-R1所示引物扩增获得)、PcMesA基因序列(列表中序列1所示，经如表2所示pBS-MesA-F2和pBS-MesA-R2扩增获得的片段)、PcMesA下游1000bp序列(序列表中序列4所示，经引物序列如表2所示pBS-MesA-F3和pBS-MesA-R3的引物扩增获得)，利用HD Cloning Kit将三个扩增片段依次融合连接入克隆载体pBluescript II SK+
(EcoRI和BamHI双酶切)，连接产物转入大肠杆菌DH5α感受态细胞中，37℃过夜培养后，挑取单克隆，使用通用引物M13F(序列：
5’-TGTAAAACGACGGCCAGT-3’)/M13R(序列：5’-CAGGAAACAGCTATGACC-3’)扩增、测序验证克隆，将验证正确的含有依次连接的PcMesA上游1000bp序列、PcMesA基因序列和PcMesA下游1000bp序列的重组表达载体命名为pBS-MesA。
4)pYF515-GFP的构建：利用sgRNA设计网站EuPaGDT(http://grna.ctegd.uga.edu/)以及RNA结构在线分析工具(http://rna.urmc.rochester.edu/RNAstructureWeb/Servers/Predict1/Predict1.ht mL)，选择特异性靶向GFP基因且形成二级结构较弱的sgRNA序列(sgGFP：CCACGGAACAGGGAGCTTTC，靶向于GFP基因的SEQ ID No.5的第152-171位核苷酸序列，送至公司合成带有NheI和BsaI酶切位点以及HH ribozyme的正反向sgRNA序列引物。用无菌水溶解成100μM溶液。退火反应合成双链sgRNA序列，反应体系：3μl正义链溶液，3μl反义链溶液，3μl 10×T4 DNA Ligase Buffer(NEB)，4μl 0.5M NaCl，21μl超纯无菌水，吸打混匀，100℃反应2min，放至室温自然冷却4h，之后将反应液稀释500倍。再取2μl 10×T4 DNA Ligase Buffer(NEB)，50ng pYF515载体(Nhe I/Bsa I双酶切)，4μl稀释后的双链sgRNA溶液，1μl T4 DNA Ligase，无菌超纯水补齐至20μl，室温反应30min，使用5μl连接产物转入大肠杆菌DH5α感受态细胞中，37℃过夜培养后，使用引物对RPL41_Pseq_F(序列：5’-CAAGCCTCACTTTCTGCTGACTG-3’)/M13F(序列：5’-TGTAAAACGACGGCCAGT-3’)进行菌落PCR验证，并测序验证阳性克隆，将验证正确可表达上述sgRNA的重组载体命名为pYF515-GFP-MesA。
表4.用于载体构建的引物序列
实施例3、辣椒疫霉PcMesA基因敲除及回补转化子的获得
采用PEG-CaCl2介导的原生质体转化方法制备PcMesA基因敲除转化子和PcMesA基因回补转化子，卵菌遗传转化的方法在文献“Wang,Z.,Tyler,B.M.,Liu,X.ProtocolofPhytophthoracapsici transformation using the CRISPR-Cas9 system.PlantPathogenic Fungi and Oomycetes.Humana Press,NewYork,NY,2018:265-274.”中公开过。
PcMesA基因敲除转化子的获得具体为将实施例1中获得的敲除基因PcMesA的Donor载体、sgRNA及Cas9共表达质粒(pBS-GFP-MesA和pYF515-MesA)转入辣椒疫霉BYA5的原生质体中，将生长出的转化子经OX抗性的V8固体培养基平板25℃培养筛选，收集疑似转化子的菌丝体，提取DNA进行PCR测序验证，将阳性转化子再提取RNA进行qPCR验证。获得PcMesA敲除转化子(ΔMesA-T1、ΔMesA-T2)。
PcMesA基因回补转化子的获得具体为将实施例1中获得的待敲除基因GFP的Donor载体、sgRNA及Cas9共表达质粒(pBS-MesA和pYF515-GFP)转入辣椒疫霉PcMesA敲除突变体菌株ΔMesA-T1的原生质体中，将生长出的转化子经OX抗性的V8固体培养基平板25℃培养筛选，收集疑似转化子的菌丝体，提取DNA进行PCR测序验证，将阳性转化子再提取RNA进行qPCR验证。获得PcMesA回补敲除转化子(ΔMesA-T1：：MesA)。
实施例4、辣椒疫霉PcMesA敲除及回补转化子的生物学性状分析
一、菌丝生长速率检测
将野生型辣椒疫霉菌株BYA5和实施例3得到的敲除转化子PcMesA敲除转化子(ΔMesA-T1、ΔMesA-T2)与回补转化子(ΔMesA-T1：：MesA)分别接于V8固体培养基(9cm培养皿中倒入15mL培养基)，25℃黑暗条件下培养4d，用十字交叉法测量各菌株的菌落直径，每株菌重复3次。
结果表明，所有测定的PcMesA敲除转化子菌株的菌丝生长速率与野生型辣椒疫霉菌株BYA5相比没有显著差异(图3)。
二、孢子囊数量检测
将野生型辣椒疫霉菌株BYA5和实施例3得到的敲除转化子ΔMesA-T1、ΔMesA-T2和回补转化子ΔMesA-T1::MesA分别接于V8固体培养基(9cm培养皿中倒入15mL培养基)，25℃黑暗条件下培养4d，转入25℃光照条件下培养5d诱导产孢，通过显微镜观察培养皿上孢子囊的形态并统计数量，每株菌重复3次。
结果表明，与野生型辣椒疫霉菌株BYA5相比，实施例3得到的敲除转化子ΔMesA-T1、ΔMesA-T2产生的孢子囊数量和野生型没有显著差异。
三、转化子的离体叶片致病力检测
供试烟草植株品种为本氏烟，种植于育苗盘中，培养基质为草炭土，生长至4～6周备用。将野生型辣椒疫霉菌株BYA5和实施例3得到的敲除转化子ΔMesA-T1、ΔMesA-T2和回补转化子ΔMesA-T1::MesA分别接于V8固体培养基(9cm培养皿中倒入15mL培养基)，25℃黑暗条件下培养4d，在菌落边缘用打孔器打取5mm的菌饼。采集相同叶位的烟草叶片，于叶片靠近叶脉的中央接种一个菌饼，每株菌接种5个叶片，25℃黑暗保湿(RH＝60％-80％)培养4d后，以十字交叉法测量辣椒疫霉侵染辣椒叶片的病斑直径(mm)。结果表明，与野生型辣椒疫霉菌株BYA5相比，实施例3得到的敲除转化子ΔMesA-T1、ΔMesA-T2菌丝致病力和野生型没有显著差异。
四、游动孢子数量检测
将野生型辣椒疫霉菌株BYA5(WT)和实施例3得到的敲除转化子ΔMesA-T1、ΔMesA-T2和回补转化子ΔMesA-T1::MesA分别接种与加有15ml V8固体培养基的无菌培养皿(直径9cm)中央，25℃黑暗条件下培养3天，转入25℃光照条件下培养5天诱导产孢，之后加入10ml去离子水置于4℃条件30min后转入25℃条件30min释放游动孢子，将游动孢子悬浮液涡旋震荡1min使其停止游动，使用血球计数板通过显微镜观察的计数游动孢子的数量，每个菌株设置3次重复。
结果显示，与野生型辣椒疫霉菌株BYA5(WT)和回补转化子ΔMesA-T1::MesA相比，实施例3得到的PcMesA敲除转化子不释放正常形态的游动孢子，说明PcMesA蛋白影响了辣椒疫霉游动孢子的数量。因此，辣椒疫酶游动孢子调控蛋PcMesA是游动孢子发育的关键蛋白，抑制改蛋白的功能就可以控制辣椒疫霉的侵染过程、切断病害循环，控制病害大规模发生。

Claims (1)

1.抑制或灭活如序列2所述的蛋白或者抑制如序列1所示基因的转录或者使其灭活在抑制辣椒疫霉游动孢子的形成或降低辣椒疫霉致病力的应用。
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