CZ20013219A3 - Izolované molekuly nukleové kyseliny, chimérické geny, které je obsahují, a způsob zlepąení odolnosti rostlin k chorobám - Google Patents

Description

Oblast techniky

Předkládaný vynález se týká odolnosti rostlin k širokému spektru chorob, včetně jevu j ako j e systémová získaná rezistence (SAR). Konkrétně se vynález týká identifikace, izolace a charakterizace homologů genu

NIMI z Arabidopsis, který je součástí kaskády signální transdukce vedoucí k systémové získané rezistenci u rostlin.

Dosavadní stav techniky

Rostliny jsou neustále napadány celou řadou patogenních organismů jako jsou viry, bakterie, houby a hlístice (nematoda). Užitkové rostliny jsou zvláště náchylné k infekcím, neboť se obvykle pěstují v geneticky uniformní monokultuře, a když nemoc vypukne, ztráty jsou značné. Avšak většina rostlin má své vlastní přirozené mechanismy obrany proti patogenním organismům. Přirozená variabilita v rezistenci k patogenům byla identifikována rostlinnými šlechtiteli a patology a šlechtěním vnesena do mnohých plodin. Tyto geny přirozené rezistence k chorobám často poskytují vysokou míru rezistence nebo imunity proti patogenům.

Systémová získaná rezistence (SAR) je jednou složkou složité obranného sytému rostlin proti patogenům (Hunt a Ryals,

1996; Ryals et al. , 1996). Viz také Patent U.S. 5,614,395.

• · • · · · · ♦ · * · ···· · ·♦ · ♦ ·

SAR je zvláště důležitým aspektem reakce rostlin na patogen, neboř jde o jev patogenem indukované, systémové rezistence k širokému spektru infekčních agens jako jsou viry, bakterie a houby. Když je dráha signální transdukce SAR zablokována, rostlina se stává citlivou k patogenům, které normálně způsobují nemoc, a stává se citlivou i k některým patogenům, které normálně nemoc nevyvolávají (Gaffney et al., 1993;

Delaney et al. , 1994; Delaney et al., 1995; Delaney, 1997; Bi et al. , 1995; Mauch-Mani a Slusarenko, 1996). Tato pozorování ukazují, že metabolická dráha signální transdukce SAR je kritická pro udržení zdraví rostliny.

Konceptuálně je možné rozdělit odpověď SAR na dvě fáze. V iniciační fázi dojde k rozpoznání patogenu a uvolnění signálu, který je přenášen floemem do vzdálených pletiv. Systémový signál je přijímán cílovými buňkami, které reagují expresí genů SAR a rezistencí k nemoci. Udržovací fáze SAR je to období, dlouhé týdny až po celý život rostliny, ve kterém Je rostlina v kvazi-ustáleném stavu (quasi steady statě) a přitom si udržuje rezistenci k nemoci (Ryals et al., 1996).

Akumulace salicylové kyseliny (SA) je, jak se zdá, nutná pro SAR signální transdukci. Rostliny, které nemohou akumulovat SA, aú už po ošetření specifickým inhibitorem, v důsledku epigenetické represe fenylalaninamoniumlyázy, nebo transgenní exprese salicyláthydroxylázy, která specificky degraduje SA, nemohou indukovat expresi SAR genů ani rezistenci k nemoci (Gaffney et al. , 1993; Delaney et al. , 1994; Mauch-Mani a

Slusarenko, 1996; Maher et al., 1994; Pallas et al., 1996).

Ačkoliv se předpokládalo, že SA by mohla sloužit jako systémový signál, tento názor je nyní značně kontroverzní a jediné, co se ví jistě, je to, že pokud nedochází k akumulaci

SA, pak je signální transdukce SAR blokována (Pallas et al. ,

1996; Shulaev et al., 1995; Vernooij et al. , 1994).

Nedávno se objevil Arabidopsis jakožto modelový systém pro výzkum SAR (Uknes et al., 1992; Uknes et al., 1993; Cameron et al., 1994; Mauch-Mani a Slusarenko, 1994; Dempsey a Klessig,

1995) . Bylo ukázáno, že SAR v Arabidopsis může být aktivován jak patogenem tak i chemickou látkou, jako je např. SA, 2,6-dichloroisonikotinová kyselina (INA) a S-methylester benzo(1,2,3)thiadiazol-7-karbothiové kyseliny (BTH) (Uknes et al., 1992; Vernooij et al., 1995; Lawton et al., 1996). Po ošetření buďto INA nebo BTH nebo po působení patogenní infekce, současně s rozvinutím rezistence jsou koordinované exprimovány alespoň tři geny proteinů souvisejících s patogenezí (PR), a sice PR-1, PR-2 a PR-5 (Uknes et al., 1992, 1993). U tabáku, nejlépe charakterizovaného rostlinného druhu, působení patogenu nebo ošetření chemickou látkou indukuje expresi alespoň devíti souborů genů (Ward et al. , 1991). Transgenní rostliny rezistentní k nemoci byly připraveny transformací rostlin různými geny SAR (U.S. Patent 5,614,395).

Byla izolována řada mutant Arabidopsis s modifikovanou signální transdukcí SAR (Delaney, 1997). Prvním z těchto mutant byly tzv. lsd (lesions simulating disease, léze napodobující nemoc) mutanty a acd2 (accelerated cell death, urychlená buněčná smrt) (Dietrich et al. , 1994; Greenberg et al. , 1994) . U těchto rostlin se do jisté míry projevilo spontánní vytváření nekrotických lézí na listech, zvýšená hladina SA, akumulace mRNA pro geny SAR a významně zvýšená rezistence k chorobám nemoci. Bylo izolováno a charakterizováno alespoň sedm různých lsd mutant (Dietrich et al. , 1994; Weymann et al. , 1995) . Další zajímavou třídu mutant představují mutanty cim

(constitutive immunity. konstitutivní imunita) (Lawton et al.,

1993) . Viz také U.S. Patent 5,792,904 a mezinárodní (PCT) přihláška WO 94/16077. Podobně jako mutanty lsd a acd2, cim mutanty mají zvýšenou hladinu SA, exprese genů SAR a rezistenci, avšak na rozdíl od lsd a acd2, cim mutanty nemají detekovatelné léze na listech. Mutanta cprl (constitutive expression of PR gens, konstitutivní exprese genů PR) může být jeden z typů cim mutanty; avšak vzhledem k přítomnosti mikroskopických lézí na listech nebylo vyloučeno, že se v případě cprl jedná o typ mutanty lsd (Bowling et al.,

1994) .

Byly také izolovány mutanty, které blokují signalizaci SAR. Mutanta ndrl (non-race-spécific disease resistance, rezistence nespecifická k odrůdě) je mutanta, která umožňuje růst jak Pseudomonas syringae obsahujícím různé geny avirulence, tak i normálně avirulentním izolátům Peronospora parasitica (Century et al., 1995). Zjevně je tato mutanta blokována v časné fázi signalizace SAR. Mutanta nprl (nonexpression of PR gens, neexprimující geny PR) je mutanta neschopná po ošetření INA indukovat expresi SAR signální dráhy (Cao et al., 1994). Mutanta eds (^nhanced disease susceptibility, zvýšená citlivost k chorobám) byla izolována na základě její schopnosti podporovat bakteriální infekci po inokulaci bakteriemi o nízké koncentraci (Glazebrook et al., 1996; Parker et al., 1996).

Určité eds mutanty jsou fenotypově velmi podobné nprl, a nedávno bylo ukázáno, že eds5 a eds53 jsou alelami nprl (Glazebrook et al., 1996). Mutanta nimi (noninducible immunity. neindukovatelná imunita) podporuje nárůst infekce

P. parasitica (infekční agens způsobující hniloby rostlin) po ošetření INA (Delaney et al. , 1995; U.S. Patent 5,792,904).

Ačkoliv mutanta nimi může po infekci patogenem akumulovat SA, nemůže indukovat expresi genů SAR ani rezistenci, takže pravděpodobně tato mutace blokuje metabolickou signální dráhu za SA. Mutanta nimi má také narušenou schopnost reagovat na INA nebo BTH, takže zřejmě blok existuje někde za místem působení těchto látek (Delaney et al., 1995; Lawton et al.,

1996) .

Byly izolovány a charakterizovány alelické geny z Arabidopsis, jejichž mutace jsou zodpovědné za fenotypy nimi a nprl (Ryals et al. , 1997; Cao et al. , 1997). Produkt genu NIMI divokého typu se podílí na kaskádě signální transdukce vedoucí jak k SAR tak i k gen-for-gen rezistenci u Arabidopsis (Ryals et al. , 1997). Ryals et al. , 1997 také popsali izolaci pěti dalších alel nimi, které projevují škálu fenotypů od slabě poškozené chemické indukce exprese genu PR-1 a rezistence k houbám až po silné zablokování. Transformace genu NPR1 divokého typu do mutanty nprl nejen že komplementuje mutaci, obnovuje odpovídavost SAR indukce pokud jde o expresi PR genu a rezistenci, ale také zvýší rezistenci transgenních rostlin k P. syringae bez přítomnosti SAR indukce (Cao et al.,

1997) . WO 98/06748 popisuje izolaci NPR1 z Arabidopsis a homologu z Nicotiana glutinosa. Viz také WO 97/49822, WO 98/26082 a WO 98/29537.

I přes obsáhlý výzkum a použití velmi složitých a intenzivních opatření k ochraně rostlin, včetně genetické transformace rostlin, ztráty způsobované chorobami rostlin ročně dosahují miliard dolarů. Tudíž trvá stálá potřeba vyvíjet nové prostředky ochrany rostlin, založené na rostoucích poznatcích genetických základů rezistence rostlin k chorobám.

Konkrétně je potřeba identifikovat, izolovat a charakterizovat z dalších rostlinných druhů homology genu NIMI z Arabidopsis.

Podstata vynálezu

Při popisu předkládaného vynálezu se užívají následující termíny, jejichž význam je vysvětlen v následujících definicích.

Asociovaný/operativně spojený: Týká se dvou sekvencí DNA, které jsou fyzicky nebo funkčně spojeny. Tak např. promotor nebo regulátorová sekvence je asociována se sekvencí DNA, která kóduje RNA nebo protein, když jsou tyto dvě sekvence operativně spojeny, nebo situovány tak, že regulátorová sekvence ovlivňuje expresi kódující nebo strukturní sekvence DNA.

Chimérický gen: Rekombinantní DNA sekvence, ve které je promotor nebo regulátorová sekvence operativně spojena nebo asociována s DNA sekvencí, která kóduje RNA nebo která je exprimována j ako protein, takže regulátorová sekvence je schopna regulovat transkripci nebo expresi asociované sekvence

DNA. Regulátorová

DNA sekvence chimérického genu není normálně operativně spojena s asociovanou DNA sekvencí jak se vyskytuje v přírodě.

Kódující sekvence: sekvence nukleové kyseliny, která je transkribována do RNA jako je mRNA, rRNA, tRNA, snRNA, sense RNA nebo antisense RNA. Výhodně je RNA v organismu translatována do proteinu.

Komplementární: Týká se dvou sekvencí nukleové kyseliny, které obsahují antiparalelní nukleotidové sekvence schopné vzájemného párování vytvářením vodíkových vazeb mezi zbytky komplementárních baží v antiparalelních nukleotidových sekvencích.

Exprese: Týká se transkripce a/ nebo translace endogenního genu nebo transgenu v rostlinách.

V případě antisense konstruktu se termín exprese týká pouze transkripce antisense DNA.

Expresní kazeta: sekvence nukleové kyseliny schopná přímo epxrimovat určitou nukleotidovou sekvenci ve vhodné hostitelské buňce, obsahující promotor operativně spojený s požadovanou nukleot i dovou sekvencí, která je operativně spojena s terminačním signálem. Typicky obsahuje také sekvence nutné pro správnou translaci nukleotidové sekvence. Expresní kazeta obsahuj ící požadovanou nukleotidovou sekvenci může být chimérická, což znamená, že alespoň jedna z jejich složek je heterologní vhledem k alespoň jedné další složce. Expresní kazeta může být shodná s kazetou vyskytující se v přírodě, avšak byla získána v rekombinantní formě a je vhodná pro heterologní expresi.

Typicky je expresní kazeta heterologní vzhledem k hostiteli, v expresní kazetě se tzn. Zvláštní sekvence nukleové kyseliny nevyskytují přirozeně v hostitelské buňce a je třeba je do hostitelské buňky nebo jejího předchůdce vnést procesem transformace. Exprese nukleotidové sekvence v expresní kazetě je řízena konstitutivním promotorem nebo indukovatelným promotorem, který iniciuje transkripci pouze, když j e hostitelská buňka vystavena konkrétnímu vněj Šímu stimulu.

V případě vícebuněčných organismů jako jsou např.

rostliny, může být promotor specifický pro určitou tkáň, orgán nebo vývojové stádium.

Gen: Definovaný úsek, který je lokalizovaný v genomu a obsahuje, kromě již výše zmíněné kódující sekvence nukleové, • · další, hlavně regulační sekvence nukleové kyseliny zodpovědné za řízení exprese, tj . transkripce a translace, kódujícího úseku. Gen také může obsahovat další 5' a 3' netranslatované sekvence a terminační sekvence. Dalšími elementy, které mohou být přítomny, jsou např. introny.

Heterologní DNA sekvence: Termíny heterologní DNA sekvence, exogenní DNA segment nebo heterologní nukleové kyseliny, se týkají sekvence, která pochází ze zdroje cizorodého vzhledem k dané hostitelské buňce, a nebo pokud pocházejí ze stejného zdroje, jsou modifikovány vzhledem k původní formě. Takže k heterologním genům v hostitelské buňce patří gen, který je endogenní vzhledem k dané hostitelské buňce, ale byl modifikován např. užitím metody tzv. DNA shuffling. Termín zahrnuje také vícečetné kopie, nevyskytující se v přírodě, sekvencí DNA, které se jinak v přírodě vyskytují. Termín se týká segmentu DNA, který je cizorodý nebo heterologní vůči buňce, nebo je vůči buňce homologní, avšak je v pozici nukleové kyseliny hostitelské buňky, kde se normálně v přírodním stavu nevyskytuje. Exogenní DNA segmenty jsou exprimovány a poskytují tak exogenní polypeptidy.

Homologní DNA Sekvence: DNA sekvence přirozeně asociovaná s hostitelskou buňkou, do které byla vnesena.

Isokódující: Sekvence nukleové kyseliny je isokódující vzhledem k sekvenci nukleové kyseliny, když sekvence nukleové kyseliny kóduje polypeptid mají stejnou aminokyselinovou sekvenci jako polypeptid kódovaný referenční sekvencí nukleové kyseliny.

Izolovaný: V kontextu předkládaného vynálezu je izolovaná molekula nukleové kyseliny nebo izolovaný enzym taková molekula nukleové kyseliny nebo enzym, které zásahem člověka existují mimo své přirozené prostředí, nejsou tedy přírodním produktem. Izolované molekuly nukleové kyseliny nebo enzymu existují v purifikované formě nebo se vyskytují v prostředí, které není přirozené, např. v rekombinantní hostitelské buňce.

Minimální promotor: promotorové elementy, zvláště TATA element, které jsou inaktivní nebo mají sníženou promotorovou aktivitu v nepřítomnosti upstream aktivace. V přítomnosti vhodného transkripčního faktoru funguje minimální promotor tak, že umožňuje transkripci.

Nativní: týká se genu, který je přítomen v genomu netransformované buňky.

Přirozeně se vyskytující: termín přirozeně se vyskytující se užívá k popisu předmětu, který se nachází v přírodě v odlišném stavu, než když je vyroben člověkem. Tak např. protein nebo nukleotidová sekvence přítomné v organismu (včetně viru), které lze izolovat z přírodního zdroje, který nebyl člověkem záměrně v laboratoři modifikován, se označuje jako přirozeně se vyskytující.

NIMI: Gen popsaný v publikaci Ryals et al., 1997, který se účastní v transdukční kaskádě signální transdukce SAR.

NIMI: Protein kódovaný genem NIMI.

Nukleová kyselina: nukleová kyselina se týká deoxyribonukleotidů nebo ribonukleotidů a jejich polymerů, buďto v jednořetězcové nebo dvouřetězcové formě. Pokud není termín specificky vymezen, zahrnuje nukleové kyseliny obsahující známé analogy přírodních nukleotidů, které jsou metabolizovány podobně jako přirozeně se vyskytující nukleotidy. Pokud není uvedeno jinak, konkrétní sekvence nukleové kyseliny implicitně zahrnuje její konzervativně modifikovanou varantu (např. substituce degenerovaných kodonů) « · • ♦ · · • · · · · · · · · ·· · · · » ·· · * « a komplementární sekvenci a také sekvence zde explicitně uvedené. Specificky substituce degenerovaných kodonů lze dosáhnou přípravou sekvence, kde třetí pozice jedno nebo více (např. všech) kodonů je nehrazena směsí baží nebo deoxyinosinovým zbytkem (Batzer et al., Nucleic Acid Res. 19: 5081 (1991); Ohtsuka et al. , J. Biol. Chem. 260: 2605-2608 (1985); Rossolini et al., Mol. Cell. Probes 8: 91-98 (1994)).

Termíny nukleové kyseliny nebo sekvence nukleové kyseliny se užívají naprosto zaměnitelně s termíny gen, cDNA, nebo mRNA kódovanou genem. V kontextu předkládaného vynálezu molekuly nukleové kyseliny jsou výhodně segmenty DNA.

Nukleotidy jsou označovány podle j ej ich baží následujícími standardními značkami: adenin (A) , cytosin (C) , thymin (T) a guanin (G) .

ORF: Otevřený čtecí rámec (Open

Reading

Frame).

Rostlina: Jakákoliv celá rostlina.

Rostlinná buňka: Strukturní a fyziologická j ednotka rostliny, obsahující protoplast a buněčnou s t ěnu.

Rostlinná buňka je ve formě izolované jediné buňky nebo buňky v kultuře, nebo jako součást vyšší organizované jednotky jako je rostlinné pletivo, orgán nebo celá rostlina.

Rostlinná buněčná kultura: Kultura rostlinných jednotek jako jsou např. protoplasty, buňky, buňky v pletivech, pyl, pylové láčky, vajíčka, embryonální vaky, zygoty a embrya v různých vývojových fázích.

Rostlinný materiál: označuje listy, kořeny, květy nebo části květů, plody, pyl, vaječné buňky, řízky, buňky nebo rostlin.

buněčné kultury nebo jakékoliv jiné části nebo produkty ♦ 9 • 9

9 99

Rostlinný orgán: Odlišitelná a viditelně strukturovaná a diferencovaná část rostliny jako j e např.

kořen, stonek, list, květ, pupen nebo embryo.

Rostlinné pletivo/tkáň:

Skupina rostlinných buněk organizovaných do strukturní funkční jednotky.

Patří sem j akékoliv pletivo v rostlině (in planta) nebo v kultuře (in vitro) .

Tento termín označuje, bez omezení, také celé rostliny, rostlinné orgány, semena rostlin, tkáňové kultury a j akékoliv skupiny rostlinných buněk organizovaných do strukturních a/nebo bez a nebo s uvedeny výše, funkčních jednotek. Tento termín použitý jakýmkoliv specifickým typem pletiva, jak byly nijak nevylučuje kterýkoliv jiný typ pletiva.

Promotor:

netranslatovaná DNA sekvence ležící upstream od kódujícího úseku, která obsahuje vazebné místo pro RNA polymerázu II a iniciuje transkripci DNA. Promotorovy úsek může obsahovat další elementy, které působí jako regulátory genové exprese.

Protoplast:

Rostlinná buňka bez buněčné stěny nebo jen s částí stěny.

purifikovaný, zaměnitelně užíván

Pur i f i kovaný:

Termín

s termínem čistý,	pokud se	týká
označuj e	nukleové	kyseliny	nebo
dalších	buněčných	složek,	se
přírodním	stavu.	Jsou výhodně

nukleové proteiny kterými v suchém mohou být stavu kyseliny nebo pru, v podstatě zbavené jsou asociovány v v homogenním stavu, ačkoliv nebo ve vodném roztoku. Čistota a homogenita se stanovují typicky metodami analytické chemie, j ako j e elektroforéza na polyakrylamidovém gelu nebo je hlavní druhem přítomným v preparátu, je v podstatě čistý.

Purifikovaná nukleová kyselina nebo purifikovaný protein dáváj í vysokovýkonná kapalinová chromatografie (HPLC). Protein, který « · • * • · ·· • · · » · · · ··♦ · · · · • · « · · · · ·· ·

0· · · · · · · · · ·0 · při analýze na elektroforetickém gelu jediný pás. Zvláště to

I znamená, že nukleová kyselina nebo protein mají alespoň 50% čistotu, výhodně 85% a nejvyhodněji 99% čistotu.

Rekombinantní molekula DNA: Kombinace molekul DNA, které jsou spojeny metodami rekombinantní DNA (genového inženýrství).

Regulátorové elementy: Sekvence podílející se na řízení exprese nukleotidové sekvence. Regulátorové elementy obsahují promotor operativně spojený s požadovanou nukleotidovou sekvencí a terminančním signálem. Typicky také obsahují sekvenci potřebnou pro správnou translaci nukleotidové sekvence.

Gen selekčního markéru: gen, jehož exprese v rostlině poskytuje rostlině selektivní výhodu. Selektivní výhoda buňky transformované genem selekčního markéru může spočívat v tom, že má schopnost růst v přítomnosti činidla negativní selekce, jako je např. antibiotikum nebo herbicid, na rozdíl od netransformované buňky. Selektivní výhoda buňky transformované genem selekčního markéru, na rozdíl od netransformované buňky, může spočívat v tom, že má zvýšenou nebo zcela novou schopnost metabolicky využít přidanou látku, jako je např. živina, růstový faktor nebo zdroj energie. Jako selekční markér se také označuje gen nebo kombinace genů, jejichž exprese v rostlině poskytuje buňce výhodu jak pro negativní tak pozitivní selekci.

Významné zvýšení: Zvýšení enzymatické aktivity, které je větší než rozmezí chyby dané měřicí technikou, výhodně jde o dvojnásobné nebo vyšší zvýšení aktivity ve srovnání s aktivitou enzymu divokého typu v přítomnosti inhibitoru, výhodněji pětinásobné nebo vyšší a nejvýhodněji desetinásobné nebo vyšší zvýšení.

• φ * φ • ··· φ ΦΦ φφφ φ φ φ φ · φ φ φφφφ ΦΦ φ ΦΦ

ΦΦ ΦΦ φ· ♦ · ·· φ

Termíny identický nebo procenta identity, v souvislosti se dvěma nebo více sekvencemi nukleové kyseliny proteinovými sekvencemi, se týká dvou nebo více sekvencí nebo subsekvencí, které jsou buďto shodné nebo mají specifické procento shodných zbytků aminokyselin nebo nukleotidů, při vzájemném přiřazení sekvencí tak, aby bylo dosaženo maximální shody při užití některého z algoritmů pro srovnávání sekvencí nebo při vizuálním hodnocení.

V podstatě identický: termín v podstatě identický, v souvislosti se dvěma nebo více sekvencemi nukleové kyseliny proteinovými sekvencemi, se týká dvou nebo více sekvencí nebo subsekvencí, které vykazují alespoň 60%, výhodně 80%, výhodněji 90 až 95% a nejvýhodněji alespoň 99% identitu nukleotidů nebo aminokyselinových zbytků, při vzájemném přiřazení sekvencí tak, aby bylo dosaženo maximální shody při užití některého z algoritmů pro srovnávání sekvencí nebo při vizuálním hodnocení. Výhodně podstatná identita existuje v úseku sekvence dlouhém alespoň 50 zbytků, výhodněji jsou sekvence v podstatě identické v úseku 100 zbytků a nejvýhodněji jsou sekvence v podstatě identické v úseku 150 zbytků. V nejvýhodnějším provedení je kódující sekvence v podstatě identická v celé délce kódujícího úseku. Kromě toho, v podstatě podobné sekvence nukleových kyselin nebo proteinové sekvence vykonávaj í také v podstatě shodné funkce.

Při srovnávání sekvencí typicky jedna sekvence slouží jako referenční sekvence, se kterou se srovnává testovaná sekvence. Pokud se užívají algoritmy pro srovnávání sekvencí, testovaná a referenční sekvence se užijí jako vstup do počítačového programu a vyberou se souřadnice subsekvence, je-li to třeba, a také parametry programu pro srovnávání sekvencí. Programy pro φ φ * * · • · · · · • φ φ φ » φφφ · φφφ φ φ φ · φ φ φ srovnávání sekvencí pak provedou srovnání sekvencí s výpočtem procenta sekvenční identity mezi testovanou a referenční sekvencí, v závislosti na parametrech programu.

Optimální přiřazení sekvencí pro srovnávání lze provádět pomocí algoritmu pro lokální homologii podle Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2: 482 (1981), algoritmu pro přiřazení homologii podle Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48: 443 (1970), metodou vyhledávání podobnosti podle Pearson & Lipman, Proč. Naťl. Acad. Sci. USA 85: 2444 (1988), a počítačovými implementacemi těchto algoritmů (GAP, BESTFIT, FASTA, a TFASTA, které jsou součástí programového balíku Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI) , nebo také vizuálním porovnáním (viz Ausubel et al., infra).

Jedním příkladem algoritmu, který je vhodný ke stanovení procenta sekvenční identity a sekvenční podobnosti je algoritmus BLAST popsaný v Altschul et al., J. Mol. Biol. 215: 403-410 (1990) . Software pro provádění analýzy BLAST je veřejně dostupný prostřednictvím National Center for Biotechnology Information (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Podle tohoto algoritmu se nejdříve identifikují páry sekvencí s nejvyšším skóre (HSP) tak, že identifikuje slova o délce W ve zkoumané sekvenci, která splňují pozitivně oceněnou prahovou hodnotu T při přiřazení se slovem o stejné délce v databázi sekvencí. Hodnota T se označuje jako neighborhood word score threshold (Altschul et al., 1990). Takto nalezená sousední slova slouží jako semena pro iniciaci vyhledávání delších slov, která je obsahují. Nalezená slova jsou pak obousměrně prodlužována podél obou sekvencí,dokud se zvyšuje kumulativní skóre. Kumulativní skóre se počítá, pro nukleotidové sekvence, užitím parametru M (pozitivní skóre pro pár shodujících se zbytků, vždy > 0) a N (negativní skóre pro neshodující se zbytky, vždy < 0) . Pro aminokyselinové sekvence se užívá skórovací matice pro výpočet kumulativního skóre. Prodlužování nalezených slov oběma směry je zastaveno, když kumulativní skóre se zmenší o hodnotu X proti maximální dosažené hodnotě, jeho hodnota je nulová nebo nižší v důsledku akumulace jednoho nebo více přiřazení s negativním skórem a nebo po dosažení konce obou sekvencí. Parametry W, T, a X algoritmu BLAST určují jeho citlivost a rychlost přiřazování. Program pro srovnávání nukleotidových sekvencí BLASTN užívá délku slova (W) 11, expektaci (E) 10, hranice 100, M=5, N=-4 a srovnává oba řetězce. Program pro srovnávání proteinových sekvencí BLASTP užívá jako nastavené parametry délku slova (W) 3, expektaci (E) 10 a skórovací matrici BLOSUM62 (viz Henikoff & Henikoff, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 89: 10915 (1989)).

Kromě výpočtu procenta identity program BLAST provádí také statistickou analýzu podobnosti dvou sekvencí (viz např. Karlin & Altschul, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 90: 5873-5787 (1993)). Jedním kritériem podobnosti, které produkuje algoritmus BLAST, je smallest sum probability, (P(N)), které poskytuje indikaci pravděpodobnosti náhodné shody dvou nukleotidových nebo aminokyselinových sekvencí. Tak např. testovaná sekvence nukleové kyseliny je považována za podobnou referenční sekvenci, jestliže smallest sum probability při srovnání testované a referenční sekvence nukleové kyseliny je menší než 0,1, výhodněji menší než 0,01 a nej výhodně ji menší než 0,001.

Jinou indikací toho, že dvě sekvence nukleové kyseliny jsou v podstatě identické, je to, že tyto dvě molekuly navzájem · · ♦ · * ♦ · · · · « · · · · · · to · · · • ···· · ·· to · * · • ·· · · · ······ to « ···· ·· · ·· >

·· ·· ·· ♦ « *· *·· hybridizují za stringentních podmínek. Termín specificky hybridizovat s se týká vazby, vytvoření duplexu nebo hybridizace molekuly pouze s určitou nukleotidovou sekvencí za stringentních podmínek, pokud je tato sekvence v komplexní směsi (např. celkové buněčné) DNA nebo RNA přítomna . V podstatě se váže znamená komplementární hybridizaci mezi sondou nukleové kyseliny a cílovou sekvencí nukleové kyseliny a zahrnuje drobné neshody (mismatches), které se překonají redukcí stringence hybridizačnich podmínek, aby bylo dosaženo detekce sekvence cílové nukleové kyseliny.

Stringentní hybridizační podmínky a stringentní hybridizační promývací podmínky v kontextu hybridizačnich experimentů v předkládaném vynálezu, jako je Southern a Northern hybridizace, jsou sekvenčně závislé a jsou různé za různých vnějších podmínek. Delší sekvence specificky hybridizují za vyšší teploty. Obsáhlé pokyny pro hybridizace nukleových kyselin lze najít v příručce Tijssen (1993) Laboratory Technigues in Biochemistry a Molecular BiologyHybridization with Nucleic Acid Probes, part I, chapter 2 Overview of principles of hybridization and the stratégy of nucleic acid probe assays Elsevier, New York. Obecně podmínky hybridizace a promývání s vysokou stringencí se volí přibližně o 5 °C nižší než je teplota tání (T_m) specifické sekvence při dané iontové síle a pH. Typicky za stringentních podmínek sonda hybridizuje jen se svou cílovou subsekvencí a s žádnou jinou sekvencí.

T_m je teplota (při definované iontové síle a pH), při které 50 % cílové sekvence hybridizuje s dokonale shodnou sondou. Velmi stringentní podmínky se volí tak, že jsou shodné s T_ra pro danou sondu. Příkladem hybridizace komplementární nukleové

*·	w«
	4	«	•	•	1» ·	•	•	•
•	*	··«	•	•	• ·	•	•
•	•	• ·	• ·	•		• ·	•
•	•	• ·	•	•	•	•	•
	• ·				a·

kyseliny ve stringentních podmínkách, když nukleová kyselina obsahuje více než 100 nukleotidů, na filtru při Southern nebo Northern přenosu, je 50 % formamid s 1 mg heparinu ve 42 C, když se hybridizace provádí přes noc. Příkladem vysoce stringentního promývání je 0,1 5M NaCl při 72 C po 15 minut. Příkladem stringentního promývání je promývání ve 0,2x SSC při 65 C po 15 minut ( pro složení SSC pufru viz Sambrook, infra). Často promývání za vysoce stringentních podmínek předchází promývání za slabě stringentních podmínek, aby bylo odstraněno nespecifické pozadí. Příkladem promývání se střední stringencí pro duplexy např. delší než 100 nukleotidů, je lx SSC při 45 C po 15 minut. Příkladem promývání s nízkou stringencí pro duplexy např. delší než 100 nukleotidů, 4-6x SSC při 40 C poi 15 minut. Pro krátké sondy (např. 10 až 50 nukleotidů) stringentní podmínky znamenají koncentraci solí nižší než l,0M Na, typicky 0,01 to 1,0 M Na (nebo jiné soli) při pH 7,0 až 8,3 a při teplotě nejméně 30 °C. Stringentních podmínek lze také dosáhnout přídavkem destabilizujících činidel jako je např. formamid. Obecně poměr signálu k pozadí velikosti 2 a vyšší při použití nepříbuzné sondy v určitém hybridizačním testu indikuje detekci specifické hybridizace. Nukleové kyseliny, které spolu za stringentních podmínek nehybridizujί, jsou i přesto v podstatě identické, pokud jimi kódované proteiny jsou v podstatě identické. K tomu dochází např. tehdy, když je kopie nukleové kyseliny připravena užitím maximální povolené degenerace genetického kódu.

Následují příklady různých hybridizačních/promývacích podmínek, které je možné užít při klonování homologních nukleotidových sekvencí, které jsou v podstatě identické s referenční sekvencí podle vynálezu: testovaná nukleotidová sekvence výhodně hybridizuje s referenční sekvencí v podmínkách: 7% dodecylsulfát sodný (SDS), 0,5 M NaP0₄, mM EDTA v 50°C, promývání ve 2X SSC, 0,1% SDS při 50°C, výhodněji 7% dodecylsulfát sodný (SDS), 0,5 M NaPO₄, 1 mM EDTA v 50°C s promýváním v IX SSC, 0,1% SDS při 50°C, ještě výhodněji 7% dodecylsulfát sodný (SDS), 0,5 M NaP0₄, 1 mM EDTA v 50°C s promýváním v 0,5X SSC, 0,1% SDS při 50°C, výhodně 7% dodecylsulfát sodný (SDS), 0,5 M NaPO₄, 1 mM EDTA při 50°C s promýváním v 0, IX SSC, 0,1% SDS při 50°C, ještě výhodněji 7% dodecylsulfát sodný (SDS), 0,5 M NaP0₄, 1 mM EDTA při 50°C s promýváním v 0,lX SSC, 0,1% SDS při 65°C.

Další indikací, že dvě sekvence nukleové kyseliny nebo proteinů jsou shodné je to, že protein kódovaný první nukleovou kyselinou je imunologicky zkříženě reaktivní nebo se specificky váže s proteinem kódovaným druhou nukleovou kyselinou. Dva proteiny jsou typicky v podstatě identické, když se liší jen konzervativními substitucemi.

Termín specificky (nebo selektivně) vázat protilátku nebo specificky (nebo selektivně) imunoreaktivní, pokud se týká proteinů nebo peptidu, označuje vazebnou reakci, která je určující pro přítomnost proteinu v přítomnosti heterogenní populace proteinů a dalších biologicky aktivních látek. Takže v podmínkách daného imunotestu se specifické protilátky váží na určitý protein a neváží se ve významném množství na jiné proteiny přítomné v tomtéž vzorku. Specifická vazba k protilátce za takových podmínek vyžaduje selekci protilátek na jejich specifitu pro určitý protein. Tak např. protilátky připravené proti proteinu s aminokyselinovou sekvencí kódovanou kteroukoliv sekvencí nukleové kyseliny podle vynálezu mohou být selektovány tak, že se získají protilátky specificky « ·

imunoreaktivní s daným proteinem a nereagující s žádným jiným proteinem, s výjimkou polymorfních variant. Pro selekci protilátek specificky imunoreaktivních s daným proteinem lze užít celou řadu formátů imunotestů. Tak např. imunotest na pevné fázi ELISA, Western blot nebo imunohistochemické testy se rutinně užívají pro selekci specifických protilátek. Viz Harlow a Lané (1988) Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Publications, New York Harlow a Lané), kde jsou popsány různé formáty imunotestů a podmínky pro stanovení specifické imunoreaktivity. Typická specifická nebo selektivní reakce alespoň dvakrát přesahuje signál odpovídající základní hladině nebo ruchu, výhodněji je vyšší 10 až lOOx.

Konzervativně modifikované variace určité nukleové sekvence kyseliny označují takové sekvence nukleové kyseliny, které kódující identické nebo v podstatě identické sekvence aminokyselin, a nebo pokud jde o sekvence nukleové kyseliny nekódující aminokyselinové sekvence, označuje nutně identické sekvence. Jelikož genetický kód je degenerovaný, velký počet funkčně identických nukleových kyselin může kódovat daný polypeptid. Tak např. kodony CGT, CGC, CGA, CGG, AGA, a AGG všechny kódující aminokyselinu arginin. Takže v každé pozici, kde má být kodon specifický pro arginin, může býk kodon alternativně kterýkoliv z výše uvedených, aniž by došlo ke změně kódovaného proteinu. Takové variace nukleových kyselin se nazývají umlčené variace, což je jeden z druhů konzervativně modifikovaných variací, každá zde popsaná sekvence nukleových kyselin kódující protein současně popisuje každou ze všech možných umlčených variací, pokud není specificky uvedeno jinak.

Odborníkovi je zřejmé, že každý kodon nukleové kyseliny (kromě

ATG, který je normálně jediným kodonem pro methionin) může být • · standardními metodami modifikován, identickou molekulu.

Tudíž každá kyseliny, která kóduje protein, v každé zde popsané sekvenci.

Kromě toho odborníkovi j e substituce, delece nebo adice, odstraňuj í jednu aminokyselinu aminokyselin (typicky méně než 5

%) v kódované sekvenci j sou

přičemž poskytne umlčená variace je implicitně známo, že funkčně nukleové obsažena j ednotlivé které mění, přidávají nebo nebo jen malé procento %, ještě typičtěji méně než 1 konzervativně modifikované variace, kde změna vede podobnou aminokyselinou.

k substituci aminokyseliny chemicky

Tabulky konzervativních substitucí poskytující přehled funkčně podobných aminokyselin jsou odborníkům známy. Každá z pěti následujících skupin aminokyselin obsahuje navzájem zaměnitelné aminokyseliny: Alifatické: Glycin (G) , Alanin (A), Valin (V), Leucin (L) ,

Isoleucin (I); Aromatické: Fenylalanin (F), Tyrosin (Y), Tryptofan (W) ; Obsahující síru: Methionin (Μ) , Cystein (C) ;

Basické: Arginin (R), Lysin (K), Histidin (H); Kyselé: Kyselina asparagová (D), kyselina glutamová (E), Asparagin (Ν), Glutamin (Q) . Viz také Creighton (1984) Proteins, W.H. Freeman and Company. Kromě toho substituce, delece nebo adice, které mění, přidávají nebo odstraňují jednu aminokyselinu nebo jen malé procento aminokyselin v kódované sekvenci jsou také konzervativně modifikované variace.

Termín subsekvence označuje sekvence nukleové kyseliny nebo aminokyselinové sekvence, které jsou částí delší sekvence nukleové kyseliny nebo aminokyselin, resp. proteinu

Nukleové kyseliny jsou prodlužovány (elongace), když jsou inkorporovány další nukleotidy (nebo analogické molekuly).

Obvykle se elongace provádí za pomoci polymerázy (např. DNA polymerázy),např.

''-konec sekvence

Dvě nukleové sekvence v další kyseliny kyseliny polymerázy, která nukleové kyseliny.

každé z generaci • *

připojuje sekvence na kyseliny jsou rekombinovány, těchto dvou nukleových kyselin nukleové kyseliny. Dvě sekvence jsou přímo rekombinovány, když obě molekuly slouží jako substrát rekombinace. Dvě když je obsažena nukleové nukleové sekvence nukleové kyseliny jsou nepřímo rekombinovány, když jsou rekombinovány prostřednictvím meziproduktu, cross-over oligonukleotid. Pro nepřímou skutečným substrátem jen jedna sekvence, j ako j e např.

a v některých případech žádná ze sekvencí není substrátem rekombinace.

Specifická vazebná afinita mezi dvěma molekulami, např. ligandem a receptorem, znamená přednostní vazbu jedné molekuly k druhé molekule ve směsi různých molekul. Vazba molekul je považována za specifickou, jestliže vazebná afinit aje přibližně 1 x 10⁴ M^_1 až 1 x 10⁶ M¹ nebo vyšší.

Termín transformace označuje proces vnesení heterologní DNA do hostitelské buňky nebo organismu.

Termíny transformovaný, transgenní a rekombinantní označují hostitelský organismus jako je např. baktérie nebo rostlina, do kterého byla vnesena heterologní molekula nukleové kyseliny. Molekula nukleové kyseliny je trvale integrovaná do genomu hostitelské buňky nebo je přítomna jako extrachromosomální molekula. Taková extrachromosomální molekula se může sama replikovat (autoreplikující molekula).

Transformované buňky, tkáně nebo rostliny zahrnují nejenom konečný produkt transformace, ale také jejich transgenní potomstvo. Termíny netransformovaný, netransgenní nebo nerekombinantní hostitel označují organismus divokého typu, • · ·

které neobsahují heterologní tj. např. bakterii nebo rostlinu, molekulu nukleové kyseliny.

Předkládaný vynález reaguje na výše zmíněné potřeby tím, že poskytuje několik homologů genu NIMI z Arabidopsis z dalších druhů rostlin. Zejména jde o homology genu NIMI izolované z rostlin jako je Nicotiana tabacum (tabák), Lycopersicon esculentum (rajče), Brassica napus (řepka olejná), Arabidopsis thaliana, Beta vulgaris (cukrová řepa), Helianthus annuus (slunečnice) a Solanum tuberosum (brambor), které kódující proteiny, které se podílejí na kaskádě signální transdukce odpovídající na biologické a chemické induktory, které vedou k systémové získané rezistenci u rostlin.

Takže předkládaný vynález se týká izolované molekuly nukleové kyseliny, která obsahuje nukleotidovou sekvenci, která kóduje sekvenci id. č.

2, 4, 6, 8, 16, 18,

20,

30, 32, 34, 36,

38, 40, 42, 44, 46, 48,

50, 52, 54, 56, 58,

62,

64, 66, 68, 70,

72, nebo 74.

V j iném provedení se vynález týká molekuly nukleové kyseliny, která obsahuje nukleotidovou sekvenci id.

1, 3, 5,

7, 15, 17, 19, 29, 31,

33,

35, 37, 39, 41, 43, 45, 47,

49,

51,

53, 55, 57, 61, 63, 65,

67,

69, 71, nebo 73.

V dalším provedení se vynález týká izolované molekuly nukleové kyseliny obsahující nukleotidovou sekvenci, která obsahuje alespoň 20, 25, 30, 35, 40, 45, nebo 50 (výhodně 20) po sobě jdoucích párů baží se sekvencí identickou s úsekem alespoň 20, 25, 30, 35, 40, 45, nebo 50 (výhodně 20) po sobě jdoucích párů baží v sekvenci id. č. 1, 3, 5, 7, 15, 17, 19,

29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 61,

63, 65, 67, 69, 71, nebo 73.

• · vynález týká nukleotidovou

V ještě dalším provedení se předkládaný izolované molekuly nukleové kyseliny obsahující sekvenci, která může být amplifikována z DNA knihovny z Lycopersicon esculentum užitím polymerázové řetězové reakce (PCR) pomocí sady dvou oligonukleotidovych primerů uvedených zde jako sekvence id. č. 9 a 10, sekvence id. č. 21 a 24, sekvence id. č. 22 a 24, sekvence id. č. 25 a 28, sekvence id. č. 26 a 28 nebo sekvence id. č. 59 a 60.

V dalším provedení se předkládaný vynález týká izolované molekuly nukleové kyseliny obsahující nukleotidovou sekvenci, která může být amplifikována z DNA knihovny z Beta vulgaris užitím polymerázové řetězové reakce (PCR) pomocí sady dvou oligonukleotidovych primerů uvedených zde jako sekvence id. č. 22 a 24 nebo sekvence id. č. 26 a 28.

V ještě dalším provedení se předkládaný vynález týká izolované molekuly nukleové kyseliny obsahující nukleotidovou sekvenci, která může být amplifikována z DNA knihovny z Helianthus annuus užitím polymerázové řetězové reakce (PCR) pomocí sady dvou oligonukleotidových primerů uvedených zde jako sekvence id. č. 26 a 28.

V dalším provedení se předkládaný vynález týká izolované molekuly nukleové kyseliny obsahující nukleotidovou sekvenci, která může být amplifikována z DNA knihovny z Solanum tuberosum užitím polymerázové řetězové reakce (PCR) pomocí sady dvou oligonukleotidových primerů uvedených zde jako sekvence id. č. 21 a 24, sekvence id. č. 21 a 23, sekvence id. č. 22 a 24, sekvence id. č. 25 a 28, nebo sekvence id. č. 26 a 28.

V ještě dalším provedení se předkládaný vynález týká izolované molekuly nukleové kyseliny obsahující nukleotidovou sekvenci, která může být amplifikována z DNA knihovny « « • · « * · · * • · · · · · ·· · z Brassica napus užitím polymerázové řetězové reakce (PCR) pomocí sady dvou oligonukleotidových primerů uvedených zde jako sekvence id. č. 9 a 10 nebo sekvence id. č. 26 a 28.

V dalším provedení se předkládaný vynález týká izolované molekuly nukleové kyseliny obsahující nukleotidovou sekvenci, která může být amplifikována z DNA knihovny z Arabidopsis thaliana užitím polymerázové řetězové reakce (PCR) pomocí sady dvou oligonukleotidových primerů uvedených zde jako sekvence id. č. 13 a 14, sekvence id. č. 21 a 24, nebo sekvence id. č. 22 a 24.

V ještě dalším provedení se předkládaný vynález týká izolované molekuly nukleové kyseliny obsahující nukleotidovou sekvenci, která může být amplifikována z DNA knihovny z Nicotiana tabacum užitím polymerázové řetězové reakce (PCR) pomocí sady dvou oligonukleotidových primerů uvedených zde jako sekvence id. č. 9 a 10, sekvence id. č. 11 a 12, sekvence id. č. 21 a 24, sekvence id. č. 22 a 24, sekvence id. č. 25 a 28, nebo sekvence id. č. 26 a 28.

V dalším provedení se vynález týká izolované molekuly nukleové kyseliny obsahující nukleotidovou sekvenci, která může být amplifikována z DNA knihovny z rostliny užitím polymerázové řetězové reakce (PCR) pomocí sady dvou oligonukleotidových primerů obsahujících prvních 20 nukleotidů

a reverzní	komplement	prvních	20 nukleotidů z následujících
kóduj ících	sekvencí	(CD)	id. č.	1, 3, 5, 7, 15, 17, 19, 29, 31,
33, 35, 37,	39, 41,	43,	45, 47,	49, 51, 53, 55, 57, 61, 63, 65,
67, 69, 71,	nebo 73.

Předkládaný vynález se týká také chimérického genu, který obsahuje promotor aktivní v rostlině operativně spojený s homologní sekvencí NIMI podle předkládaného vynálezu,

rekombinantního vektoru, který obsahuje takový chimérický gen, přičemž tento vektor je schopen trvalé transformace hostitele, a také se týká hostitele trvale transformovaného tímto vektorem. Hostitel je výhodně rostlina patřící do skupiny následujících agronomicky důležitých rostlin: rýže, pšenice, ječmen, žito, kanola, cukrová třtina, kukuřice, brambor, mrkev, topinambur, cukrová řepa, fazol, hrách, čekanka, salát, zelí, květák, brokolice, tuřín, ředkvička, špenát, chřest, cibule, česnek, lilek, paprika, celer, dýně, tykev, okurka, jabloň, hrušeň, kdoule, meloun, švestka, třešeň, broskev, nektarinka, meruňka, jahodník, vinná réva, maliník, ostružiník, ananas, avokádo, papája, mango, banán, sója, tabák, rajče a čirok. Vynález zahrnuje i semena z těchto rostlin.

Dále se předkládaný vynález týká způsobu zvýšení exprese genů SAR v rostlinách, který spočívá v tom, že se v rostlině exprimuje chimérický gen, který obsahuje promotor aktivní v rostlině operativně spojený s kódující sekvencí homologní s NIMI podle vynálezu, přičemž kódovaný protein je v transformované rostlině exprimován ve vyšší hladině než v rostlině divokého typu.

Kromě toho se vynález týká také způsobu zvýšení rezistence rostlin k chorobám tím, že se v rostlině exprimuje chimérický gen, který obsahuje promotor aktivní v rostlině operativně spojený s kódující sekvencí homologní s NIMI podle vynálezu, přičemž kódovaný protein je v transformované rostlině exprimován ve vyšší hladině než v rostlině divokého typu.

Dále se vynález týká PCR primerů vybraných ze skupiny obsahující sekvence id. č. 9 až 14, 21 až 28, 59, a 60.

Předkládaný vynález zahrnuje také způsob izolace homologů NIMI účastnících se v signální transdukci vedoucí k systémové získané rezistenci rostlin, kterýžto způsob obsahuj e amplifikaci molekuly DNA z DNA knihovny z rostliny užitím polymerázové řetězové reakce (PCR) s párem primerů odpovídajících prvním nukleotidům a reverznímu komplementu prvních 20 nukleotidů kóduj ící sekvence (CD) uvedené zde jako sekvence id.

1, 3,

5, 7, 15,

17,

19, 29,

31, 33, 35,

37, 39,

41,

43, 45, 47, 49, 51, 53, 55,

57,

61, 63,

65, 67, 69, nebo

73, a nebo párem primerů uvedeným zde jako sekvence id.

10, sekvence id. č. 11 a

12, sekvence id. č. 13 a 14, sekvence id.

č. 21 a 24, sekvence id.

a 24, sekvence id. č. 21 a

23, sekvence id. č.

a 28, sekvence id. č. 26 a 28, nebo sekvence id.

60. Ve výhodném provedení vynálezu je DNA knihovna z rostliny jako je Nicotiana tabacum (tabák) ,

Lycopersicon

Arabidopsis thaliana, Beta vulgaris (cukrová řepa), Helianthus annuus (slunečnice) a Solanum tuberosum (brambor).

Data z Northern analýz několika NIMI homologů zde popsaných ukazují na konstitutivní expresi nebo indukovatelnost BTH. Homology genu NIMI popsané zde podle predikce kódují proteiny zúčastněné v kaskádě signální transdukce reagující na chemické a biologické induktory, která vede k získané systémové rezistenci rostlin. Předkládaný vynález se také týká transgenní exprese těchto homologů NIMI ke zvýšení exprese genů SAR pro zvýšení rezistence rostlin k chorobám.

Sekvence DNA podle vynálezu mohou být izolovány metodami popsanými v následujících příkladech nebo pomocí polymerázové řetězové reakce (PCR) užitím sekvencí popsaných v seznamu sekvencí pro konstrukci oligonukleotidových primerů. Tak např.

oligonukleotidy mající sekvenci prvních a posledních přibližně až 25 po sobě jdoucích nukleotidů v sekvenci id. č. 7 ♦

• ♦ • ♦ « 9 • * * · · · · • · · ·· ♦ · < ·

7) přímo

Další (např. nukleotidy 1 až 20 a 1742 až 1761 sekvence id mohou být užity pro PCR amplifikaci sekvence id. č.

z cDNA knihovny zdrojové rostliny (Arabidopsis thaliana)

DNA sekvence podle vynálezu mohou být podobně amplifikovány pomocí PCR z knihovny cDNA nebo genomové DNA dané rostliny s využitím konců sekvencí uvedených zde v seznamu sekvencí pro návrh PCR primerů.

Transgenní exprese homologů NIMI podle vynálezu v rostlinách povede k imunitě vůči širokému spektru rostlinných patogenu, ke kterým patří (avšak tento výčet není omezující) viry a viroidy, např. virus mozaiky tabáku nebo okurek, virus skvrnitosti nebo nekrózy, virus vlnitosti listů pelargonie, virus skvrnitosti jetele, virus keřovíté zakrnělosti rajčat a podobné viry, houby, např. oomycéty jako je Phythophthora parasitica a Peronospora tabacina; baktérie jako je např. Pseudomonas syringae a Pseudomonas tabaci; hmyz jako např. mšice, např. Myzus persicae; motýli, např. Heliothus spp., hlístice, např. Meloidogyne incognita. Vektory a metody podle vynálezu jsou užitečné proti řadě patogenních organismů kukuřice, jako jsou např. (přičemž výčet není omezující): plísně jako je např. Scleropthora macrospora, Sclerophthora rayissiae, Sclerospora graminicola, Peronosclerospora sorghi, Peronosclerospora philippinensis, Peronosclerospora sacchari a Peronosclerospora maydis; rzi jako je např. Puccinia sorphi, Puccinia polysora a Physopella zeae; další houby jako je např. Cercospora zeae-maydis, Colléto trichum graminicola, Fusarium monoliforme, Gibberella zeae, Exserohilum turcicum, Kabatiellu zeae, Erysiphe graminis, Septoria a Bipolaris maydis; a baktérie jako je např. Erwinia stewartii.

Způsoby podle vynálezu mohou být užity k přenesení rezistence k chorobám na široké spektrum krytosemenných rostlin, a to jak dvouděložných tak i jednoděložných. Ačkoliv lze rezistenci takto přenést do jakékoliv rostliny z těchto zmíněných široce definovaných skupin, zvláště výhodné jsou agronomicky významné rostliny jako je rýže, pšenice, ječmen, žito, kanola, cukrová třtina, kukuřice, brambor, mrkev, topinambur, cukrová řepa, fazol, hrách, čekanka, salát, zelí, květák, brokolice, tuřín, ředkvička, špenát, chřest, cibule, česnek, lilek, paprika, celer, dýně, tykev, okurka, jabloň, hrušeň, kdoule, meloun, švestka, třešeň, broskev, nektarinka, meruňka, jahodník, vinná réva, maliník, ostružiník, ananas, avokádo, papája, mango, banán, sója, tabák, rajče a čirok. Vynález zahrnuje i semena z těchto rostlin.

Kódující homologní sekvence NIMI podle vynálezu může být vložena do expresní kazety vhodné pro rostliny ke konstrukci chimérického genu podle vynálezu, a sice odborníkovi známými metodami genového inženýrství. Výběr specifických regulátorových sekvencí jako je promotor, signální sekvence, 5' a 3'-netranslatované sekvence a enhancer (zesilovací sekvence), vhodných pro dosažení požadovaného profilu exprese ve zvoleném rostlinném hostiteli, je plně v kompetenci rutinního pracovníka v oboru. Výsledná molekula obsahující jednotlivé elementy spojené ve vhodném čtecím rámci může být vložena do vektoru schopného transformace rostlinné hostitelská buňky.

K příkladům promotorů funkčních v rostlinách nebo rostlinných buňkách (tj . promotorů schopných řídit expresi asociovaných kódujících sekvencí, jako jsou např. homology NIMI, v rostlině) patří ubikvitinový promotor z Arabidopsis a • 9 kukuřice, 19S a 35S promotory z viru mozaiky květáku (CaMV) a CaMV dvojitý promotor, promotory aktinu z rýže, promotor PR-1 z tabáku, Arabidopsis a kukuřice, promotor nopalinsyntázy, promotor malé podjednotky ribulózabisfofátkarboxylázy (ssuRUBISCO) a podobné promotory. Zejména výhodný je ubikvitinový promotor z Arabidopsis. Promotory samotné mohou být všelijak modifikovány, aby se upravila jejich síla s cílem zvýšit expresi asociované kódující sekvence, a sice metodami odborníkovi známými. Výhodné promotory pro použití v předkládaném vynálezu jsou promotory poskytující vysokou hladinu konstitutivní exprese.

Sekvence pro signální nebo tranzitní peptidy mohou být fúzována s kódující sekvencí homologů NIMI v chimérických DNA konstruktech podle vynálezu pro přímý transport exprimovaného proteinu na požadované místo působení. K příkladům signálních peptidů patří přirozené spojené s geny proteinů souvisejícími s patogenezí jako jsou např. PR-1, PR-2, apod., viz např. Payne et al. , 1988. K příkladům tranzitních peptidů patří např. chloroplastové tranzitní peptidy, jaké popsali např. Von Heijne et al. (1991), Mazur et al. (1987), a Vorst et al. (1988); mitochondriální tranzitní peptidy jaké popsali např. Boutry et al. (1987). Patří sem také sekvence vedoucí k lokalizaci kódovaného proteinu do různých buněčných kompartmentů jako je např. vakuola. Viz např. Neuhaus et al. (1991) a Chrispeels (1991).

Chimérické DNA konstrukty podle vynálezu mohou obsahovat vícečetné kopie promotoru nebo vícečetné kopie sekvencí kódujících homolog NIMI podle vynálezu. Kromě toho mohou konstrukty obsahovat ještě sekvence kódující markéry nebo sekvence kódující jiné peptidy, např. signální nebo tranzitní peptidy, vždy ve vhodném čtecím rámci s dalšími funkčními elementy molekuly DNA. Metody přípravy takových konstruktů jsou odborníkovi známy.

K užitečným markérům patří peptidy poskytující rezistenci k herbicidům, antibiotikům nebo léčivům, např. rezistenci k inhibitorům protoporfyrinogenoxidázy, hygromycinu, kanamycinu, G418, gentamycinu, lincomycinu, methotrexatu, glyfosatu, fosfinotricinu apod. Tyto markéry se mohou užít pro selekci buněk transformovaných konstruktem chimérické DNA podle vynálezu od netransformovaných buněk. K dalším užitečným markérům patří peptidové enzymy, které lze snadno detekovat viditelnou reakcí, např. barevnou reakcí, jako je např. luciferáza, β-glukuronidáza a β-galaktosidáza.

Chimérické geny podle vynálezu mohou být vneseny do rostlinných buněk mnoha různými metodami v oboru známými. Odborníkovi je známo, že výběr vhodné metody závisí na typu rostliny (jednoděložná nebo dvouděložná) a/nebo typu organely vybrané poro transformaci (např. jádro, chloroplast, mitochondrie). K vhodným metodám transformace rostlinných buněk patří mikroinjekce (Crossway et al., 1986), elektroporace (Riggs et al., 1986), transformace zprostředkovaná Agrrobacterium (Hinchee et al., 1988; Ishida et al., 1996), přímý transfer genu (Paszkowski et al., 1984; Hayashimoto et al., 1990), balistické urychlování částic pomocí zařízení od firmy Agracetus, lne., Madison, Wisconsin nebo Dupont, lne. , Wilmington, Delaware (také viz např. U.S. Patent 4,945,050; a McCabe et al., 1988). Viz dále Weissinger et al. (1988); Sanford et al. (1987) (cibule); Christou et al. (1988) (sója); McCabe et al. (1988) (sója); Datta et al. (1990) (rýže); Klein et al. (1988) (kukuřice); Klein et al. (1988) (kukuřice); Klein et al. (1988) (kukuřice); Fromm et al. (1990); a Gordon-Kamm et al. (1990) (kukuřice); Svab et al. (1990) (chloroplasty tabáku); Gordon-Kamm et al. (1993) (kukuřice); Shimamoto et al.

(1989) (rýže); Christou et al. (1991) (rýže); Datta et al. (1990) (rýže); European Patent Application EP 0 332 581

(Pooideae); Vasil et al.	(1993)	(pšenice); Weeks	et	al.	(1993)
(pšenice) ; Wan et al.	(1994)	(ječmen) ; Jahne	et	al.	(1994)
(ječmen); Umbeck et al.	(1987)	(bavlník) ; Casas	et	al.	(1993)
(čirok); Somers et al.	(1992)	(oves); Torbert	et	al.	(1995)

(oves); Weeks et al., (1993) (pšenice); WO 94/13822 (pšenice); a Nehra et al. (1994) (pšenice). Zvláště výhodné uspořádání pro vnášení rekombinantních molekul DNA do kukuřice bombardováním mikroprojektily lze nalézt v publikacích Koziel et al. (1993); Hill et al. (1995) a Koziel et al. (1996). Další výhodné provedení transformace protoplastů kukuřice je popsáno v Evropském patentu EP 0 292 435.

Jakmile byl jednou chimérický gen obsahující kódující sekvenci homologní s genem NIMI transformován do konkrétního rostlinného druhu, může být dále množen v tomto druhu nebo přenesen do jiné odrůdy téhož biologického druhu, zvláště komerčně výhodné odrůdy, metodami klasického šlechtění. Ke zvláště výhodným rostlinám podle vynálezu patří agronomicky důležité plodiny uvedené výše. Genetické vlastnosti vnesené genetickým inženýrstvím do transgenních semen a rostlin popsaných výše se dále přenášejí pohlavním rozmnožováním a tak mohou být udržovány a rozmnožovány v dalších generacích rostlin.

• · · ··

Příklady provedení vynálezu

Vynález je dále podrobněji doložen následujícími detailními postupy, izolacemi a příklady. Příklady jsou pouze pro ukázku a nijak neomezují rozsah předkládaného vynálezu. Používané standardní techniky rekombinantní DNA a molekulárního klonování jsou v oboru dobře známy a byly popsány v pracích Sambrook, et al. , 1989; T.J. Šilhavý, M.L. Berman, a L.W. Enquist, 1984; a Ausubel, F.M. et al., 1987.

I. Izolace homologů genu NIMI z Arabidopsis

Příklad 1

Izolace homologů NIMI z Nicotiana tabacum

Plazmidová DNA z hromadné excize fágu z cDNA knihovny tabáku byla použita jako templát pro PCR s použitím následujících párů primerů:

5'-AGATTATTGTCAAGTCTAATG-3' (sekvence id. č. 9) +

5'-TTCCATGTACCTTTGCTTC-3' (sekvence id. č. 10), a

5'-GCGGATCCATGGATAATAGTAGG-3' (sekvence id. č. 11) +

5'-GCGGATCCTATTTCCTAAAAGGG-3' (sekvence id. č. 12).

Cyklovací podmínky byly výhodně 94 stupňů (rozuměj °C) po dobu jedné minuty, 40 stupňů po dobu jedné minuty, a 72 stupňů po dobu 1,5 minuty, a reakce byla výhodně prováděna 40 cyklů. PCR produkty byly analyzovány na agarózových gelech, vyříznuty a klonovány do pCRII-TOPO (Invitrogen).

• ·

9 ·· 99 9999

9 9 9 9 99

9 9 99 9 9 9· • · · 9 9 9 99 99

9 9 9 9 99

9 9 9 9 99 9

Kompletní sekvence cDNA tohoto homologu NIMI tabáku je ukázána v sekvenci id. č. 1 a protein kódovaný touto sekvencí cDNA je ukázán v sekvenci id. č. 2. Homolog NIMI tabáku obsahující sekvenci id. č. 1 byl uložen jako pNOV1206 v NRRL (Agricultural Research Service, Patent Culture Collection, Northern Regional Research Center, 1815 North University Street, Peoria, Illinois 61604, U.S.A) 17. srpna, 1998, s přiděleným přístupovým číslem NRRL B-30051.

Příklad 2

Izolace homologu NIMI z Lycopersicon esculentum

Z cDNA knihoven λ ZAPII rajčete byly vystřiženy fagemidy s použitím protokolu od firmy Stratagene. Fagemidy (plazmidy) byly hromadně transformovány do E. coli XLl-Blue v 10 skupinách (pools) po přibližně 80 000 klonech v každé a z těchto skupin byla extrahována DNA. Pomocí PCR byl prováděn screening skupin na výskyt homologů NIMI s použitím následujících primerů: 5'-AGATTATTGTCAAGTCTAATG-3' (sekvence id. č. 9) a 5'-TTCCATGTACCTTTGCTTC-3' (sekvence id. č. 10). Bylo potvrzeno, že sekvence amplifikované z těchto skupin obsahují homology NIMI pomocí klonování PCR amplifikovaného fragmentu DNA a sekvencování. Skupiny byly postupně zmenšovány a skrínovány pomocí PCR s použitím stejných primerů uvedených výše na výskyt homologů NIMI, dokud nebyl získán jeden klon obsahující homolog. V případě, že cDNA klon obsahoval částečný gen bez 5 konce, byla použita metoda 5' RACE (Rapid Amplification of cDNA Ends), aby se získala kompletní sekvence genu.

• ♦ φφ φφ • φ · φ φφφφ φ

φ φ · φ

φ φ

Kompletní sekvence cDNA tohoto homologu NIMI rajčete je ukázána v sekvenci id. č. 3 a protein kódovaný touto sekvencí cDNA je ukázán v sekvenci id. č. 4. Homolog NIMI rajčete obsahující sekvenci id. č. 3 byl uložen jako pNOV12 04 v NRRL (Agricultural Research Service, Patent Culture Collection, Northern Regional Research Center, 1815 North University Street, Peoria, Illinois 61604, U.S.A) 17. srpna, 1998, s přiděleným přístupovým číslem NRRL B-30050.

Příklad 3

Izolace homologu NIMI z Brassica napus

Z cDNA knihoven λ ZAPII Brassica napus byly vystřiženy fagemidy s použitím protokolu od firmy Stratagene. Fagemidy (plazmidy) byly hromadně transformovány do E. coli XLl-Blue v 10 skupinách po přibližně 80 000 klonech v každé a z těchto skupin byla extrahována DNA. Pomocí PCR byl prováděn screening skupin na výskyt homologů NIMI s použitím následujících primerů: 5'-AGATTATTGTCAAGTCTAATG-3' (sekvence id. č. 9) a

5'-TTCCATGTACCTTTGCTTC-3' (sekvence id. č. 10). Bylo potvrzeno, že sekvence amplifikované z těchto skupin obsahují homology NIMI pomocí klonování PCR amplifikovaného fragmentu DNA a sekvencování. Skupiny byly postupně zmenšovány a skrínovány pomocí PCR s použitím stejných primerů uvedených výše na výskyt homologů NIMI, dokud nebyl získán jeden klon obsahující homolog. V případě, že cDNA klon obsahoval částečný gen bez 5 konce, byla použita metoda 5' RACE (Rapid Amplification of cDNA Ends), aby se získala kompletní sekvence genu.

• 4

·♦ • ·4

4444 • 4 ·4

4«4

44 9

Μ «4

4 4 4

9 4 4

Částečná sekvence cDNA tohoto homologu NIMI Brassica napus je ukázána v sekvenci id. č. 5 a protein kódovaný touto sekvencí cDNA je ukázán v sekvenci id. č. 6. Homolog NIMI Brassica napus obsahující sekvenci id. č. 5 byl uložen jako pNOV1203 v NRRL (Agricultural Research Service, Patent Culture Collection, Northern Regional Research Center, 1815 North University Street, Peoria, Illinois 61604, U.S.A) 17. srpna, 1998, s přiděleným přístupovým číslem NRRL B-30049.

Příklad 4

Izolace homologu NIMI z Arabidopsis thaliana

Prohledávání pomocí BLAST s použitím aminokyselinové sekvence NIMI z Arabidopsis nebo rajčete jako sekvence pro vyhledávání detekovalo záznam GenBank B26306, který obsahoval genomovou sekvenci Arabidopsis z bakteriálního umělého chromozomu (BAC, Bacterial Artificial Chromosome)

F18D8.

O části sekvence BAC se předpovídá, že kóduj e protein s významnou podobností (47% totožnost aminokyselin) s NIMI. Pro oblasti sekvence F18D8 byly navrženy následující primery: 5'-TCAAGGCCTTGGATTCAGATG-3' (sekvence id. č. 13) a 5'-ATTAACTGCGCTACGTCCGTC-3^ř (sekvence id. č. 14). Primery byly použity v reakci PCR s DNA z Arabidopsis cDNA knihovny založené na pFL61 jako templátu. Výhodné cyklovací podmínky byly 94 stupňů po dobu 30 sekund, 53 stupňů po dobu 3 0 sekund, 72 stupňů po dobu 30 sekund. Reakce byla výhodně prováděna 40 cyklů. Byl detekován PCR produkt předpokládané velikosti (290 párů baží) a cDNA klon odpovídající primerům F18D8 byl purifikován z cDNA knihovny postupnou purifikací pomocí pasáže zvětšujícího se malého množství knihovny přes E. coli a opakované určení výskytu klonu prostřednictvím PCR. Nakonec byl získán jeden pozitivní klon a sekvencován. Sekvence klonu potvrdila výskyt otevřeného čtecího rámce s významnou homologií s NIMI.

Kompletní cDNA sekvence tohoto homologu NIMI Arabidopsis thaliana je ukázána v sekvenci id. č. 7 a protein kódovaný touto sekvencí cDNA je ukázán v sekvenci id. č. 8. Homolog NIMI Arabidopsis thaliana obsahující sekvenci id. č. 7 byl uložen jako AtNMLc5 v E. coli v NRRL (Agricultural Research Service, Patent Culture Collection, Northern Regional Research Center, 1815 North University Street, Peoria, Illinois 61604, U.S.A) 25. května, 1999, s přiděleným přístupovým číslem NRRL B-30139.

Příklad 5

Návrh degenerovaných primerů

Kromě genu NIMI (Ryals et al., 1997) a genu podobného NIM popsaného výše v příkladu 4 (AtNMLc5 - sekvence id. č. 7), obsahuje Arabidopsis thaliana tři další genomové sekvence podobné NIM (NML): AtNMLc2 (sekvence id. č. 15), AtNMLc4-l (sekvence id. č. 17), a AtNMLc4-2 (sekvence id. č. 19), kde c[#] znamená číslo chromozomu, na kterém je konkrétní gen NML lokalizován. S použitím programu pro mnohonásobné porovnávání sekvencí GCG Seqweb (Pretty, Wisconsin Gentics Computer Group), byly porovnávány sekvence NIMI z Arabidopsis thaliana (Ryals et al., 1997), Nicotiana tabacum (příklad 1 - sekvence id. č. 1) , *· to · · • · ·· ·· • · · • · ··· • · · · • ·· · ·· · · ·· ** • · · · • ·· to ·· · ·· ·· • · · ·· ··· a Lycopersicon esculentum (příklad 2 - sekvence id. č. 3), a také sekvence NML z Arabidopsis thaliana (sekvence id. č. 7, 15, 17, a 19) . Na základě tohoto srovnání se objevily tři oblasti dostatečně konzervativní pro navržení degenerovaných PCR primerů pro PCR amplifikaci homologů NIMI z jiných druhů kulturních rostlin, včetně cukrové řepy, slunečnice, bramboru a kanoly. Primery navržené z těchto konzervativních oblastí jsou uvedeny níže v tabulce 1. Primery NIM 1 (A-D) jsou navrženy s použitím algoritmu LINEUP pouze s geny NIMI z Arabidopsis thaliana (Ryals et al., 1997), Nicotiana tabacum (příklad 1 sekvence id. č. 1), a Lycopersicon esculentum (příklad 2 sekvence id. č. 3). Primery NIM 2(A-D) jsou navrženy s použitím algoritmu LINEUP s těmito třemi sekvencemi navíc ke čtyřem sekvencím NML z Arabidopsis thaliana (sekvence id. č. 7, 15,

17, a 19) . Primery byly výhodně syntetizovány firmou Genosys Biotechnologies, lne. (The Woodlas, Texas). Pozice degenerace jsou označeny v tabulce 1 záznamem více než jedné báze v jednom místě oligonukleotidu. „Orientace označuje, zda je primer namířen ke 3 -konci (downsteram, po směru) nebo k 5 -konci (upstream, v protisměru) cDNA.

Tabulka 1

Degenerované primery

Primer	Sekvence (5' to 3')	sekvence xcl · c ·	Orientace
NIM IA	GAGATTATTGTCAAGTCTAATGTAGATA T T	sekvence id. č. 21	po směru
NIM 1B	ACTGGACTCGGATGATATTGAATTA T T T T G G	sekvence id. č. 22	po směru
NIM IC	TAACTCAACATCATCAGAATCAAATGC T T C G C G	sekvence id. č. 23	v protisměru

φφ ·· ···· φφφ φ · 9 ♦ ·· « · φφφ · · · · ·· * · · φ φ · · ··· · ··

ΦΦΦ· ♦ · 9 99 φφ ΦΦ φφφ» ΦΙ • ♦Φ

NIM ID	GTTGAGCAAGAGCAACTCTATTTTCAAG T C CC G T	sekvence id. č. 24	v protisměru
NIM 2A	TGCATAGAAATAATTGTGAAGTCTAATGTAGA T G TG C G T	sekvence id. č. 25	po směru
NIM 2B	GGCACTGGACTCAGATGATGTTGAACT TTT GT	sekvence id. č. 26	po směru
NIM 2C	AACTCAACATCATCAGAATCCAATGCC GT T G G	sekvence id. č. 27	v protisměru
NIM 2D	AGTTGAGCAAGGCCAACTCGATTTTCAAAAT TCA T GG T	sekvence id. č. 28	v protisměru

Příklad 6

PCR amplifikace DNA fragmentů podobných NIM z druhů kulturních rostlin

DNA fragmenty podobné NIM byly amplifikovány z Arabidopsis, rajčete, tabáku, cukrové řepy, slunečnice, bramboru a kanoly, s použitím buďto genomové DNA nebo cDNA jako templátů. Kombinace použitých primerů, spolu s očekávanou velikostí fragmentů, jsou uvedeny níže v tabulce 2.

Tabulka 2

Kombinace primerů a velikosti DNA fragmentů

Levý Primer	Pravý Primer	Velikost fragmentu (bp)
NIM IA	NIM ID	669
NIM IA	NIM 1C	195
NIM 1B	NIM ID	499
NIM 2A	NIM 2D	676
NIM 2A	NIM 2C	200
NIM 2B	NIM 2D	503

• · • · · · • · · · * »«· · ·

PCR s degenerovanými primery bylo výhodně prováděno s PCR perličkami Ready-To-Go PCR Beads (Amersham, Piscataway, NJ) v přístroji GenAmp PCR Systém 9700 (PE Applied Biosystems, Foster City, CA) . V každé reakci bylo použito 20 až 40 ng genomové DNA nebo 5 až 10 ng cDNA, přičemž každý primer byl v konečné koncentraci 0,8 M. Výhodné parametry cyklování byly tyto: 94°C 1 minutu, 3 cykly [94°C po dobu 30 sekund, 37°C po dobu 30 sekund, 72°C po dobu 2 minut] ; 35 cyklů [94°C po dobu 30 sekund, 60°C po dobu 30 sekund, 72°C po dobu 2 minut] ; 72°C po dobu 7 minut, 4°C do konce. Reakční produkty byly analyzovány na 2% agarózových gelech a byly vyříznuty DNA fragmenty příslušné velikosti. DNA fragmenty byly izolovány z agarózových pásů například s použitím soupravy Genclean III

Kit (BIO 101, lne.,

Carlsbad, CA) a klonovány například s použitím soupravy

TOPO TA Cloning Kit (Invitrogen

Corporation, Carlsbad,

CA) . Plazmidy byly izolovány například s použitím soupravy CONCERT Rapid Plasmid Miniprep Systém (Life Technologies, lne., Rockville, MD) a sekvencovány s pomocí standardních protokolů.

DNA fragmenty podobné NIM byly získány ze všech pokusných rostlinných druhů a v mnoha případech byly izolovány mnohonásobné unikátní sekvence podobné NIM. Tabulka 3 a obrázek 2 uvádějí detailně fragmenty podobné NIM, které byly izolovány.

» 9 • · • 9 • ·«·

Tabulka 3

PCR fragmenty podobné NIM

Druh	Úspěšné primerů	páry	PCR templát	Unikátní klony	Sekvence id. č.
Arabidopsis	1A/1D,	1B/1D	Genomová DNA	j eden
Tabák	1A/1D, 2A/2D,	1B/1D, 2B/2D	cDNA	čtyři	29, 31, 33, a 35
Rajče	1A/1D, 2A/2D,	1B/1D, 2B/2D	Genomová DNA, cDNA	jeden	37
Cukrová řepa	1B/1D,	2B/2D	Genomová DNA, cDNA	jeden	39
Slunečnice	2B/2D		cDNA	dva	41 a 43
Brambor	1A/1D, 1B/1D, 2B/2D	1A/1C, 2A/2D,	cDNA	tři	45, 47, a 49
Kanoia	2B/2D		cDNA	čtyři	51, 53, 55, a 57

Na základě těchto výsledků mohou degenerované PCR primery popsané výše amplifikovat fragmenty podobné NIM z celé řady rostlinných druhů. Konkrétně kombinace primerů NIM 2B/NIM 2D je úspěšná s cDNA jako templát u všech zkoušených druhů. Použití PCR perliček Ready-To-Go PCR Beads je obzvláště výhodné pro získávání produktů. Kromě toho použití cDNA jako templát je výhodné pro všechny vzorky kromě Arabidopsis, rajčete a cukrové řepy, kdy je postačující genomová DNA.

Příklad 7

Další degenerované primery

Nový pár degenerovaných primerů byl navržen na základě porovnání sekvencí ze čtyř tabákových fragmentů (sekvence id.

*·	··				··	•
•	•	•	• ·	•	•	•	•	··
•	•	• ··	• ♦	«	•	•	•	•
•	•	• ·	• · ·		···	• ·	•	•
•	•	• ·	• ·		•	• ·	•
««	• ·	··				·· ·

č. 29, 31, 33, a 35) a sekvence rajčete (sekvence id. č. 37) pro použití při zjišťování, zda rajče také obsahuje stejné sekvence podobné NIM, které nejsou amplifikovány s degenerovanými primery uvedenými v tabulce 1. Primery nevržené z těchto fragmentů jsou uvedeny níže v tabulce 3 a byly výhodně syntetizovány firmou Genosys Biotechnologies, lne. (The Woodlas, Texas). Pozice degenerace jsou označeny v tabulce 3 záznamem více než jedné báze v jednom místě oligonukleotidu. „Orientace označuje, zda je primer namířen ke 3 -konci (po směru) nebo k 5 -konci (v protisměru) cDNA.

Tabulka 4

Další degenerované primery

Primer	Sekvence (5' TO 3')	sekvence id. č.	Orientace
NIM 3A	TAGATGAAGCATACGCTCTCCACTATGCTGT T C T T T	sekvence id. č. 59	po směru
NIM 3B	GGCTCCTTACGCATGGCAGCAACATGAAGGAC T C T TG C	sekvence id. č. 60	v protisměru

PCR s degenerovanými primery bylo prováděno tak, jak je popsáno výše při použití cDNA z rajčete, a potenciální produkty byly klonovány a sekvencovány. Sekvenční analýza odhalila dva druhy fragmentů podobných NIM: první je totožný se sekvencí rajčete uvedené v sekvenci id. č. 37 a druhý je unikátní v rajčeti a z 88 % je totožný se sekvencemi tabáku ukázanou v sekvencích id. č. 31 a 33. Tato nová sekvence rajčete je ukázána v sekvenci id. č. 61.

		·*	··	·· ·
• ·	•	•	•	• ·	• ·	• ·
•	•	·»·	•	•	• ·	• ·	•
• ·	• ·	• ·	•	···	• · ·	•
•	•	• ·	•	•	•	• ·	•
··			··	··	··	···

Příklad 8

Kompletní cDNA podobné NIM

Odpovídající cDNA sekvence v protisměru a po směru od PCR fragmentů podobných NIM jsou výhodně získány pomocí RACE PCR s použitím soupravy SMART RACE cDNA Amplification Kit (Clontech, Palo Alto, CA) . Výhodně přinejmenším u tří nezávislých produktů RACE byly sekvencovány bud' 5 nebo 3 konce, aby se vyloučily chyby PCR. Výsledné kompletní cDNA sekvence pro NIMI homology cukrové řepy, slunečnice B a tabáku B, které odpovídají PCR fragmentům podobným NIM, ukázaným v sekvencích id. č. 39, 43 a 31, jsou předloženy jako sekvence id. č. 63, 65 a 73, v daném pořadí.

cDNA z Arabidopsis thaliana podobné NIM odpovídající NIM podobným genomovým sekvencím AtNMLc2 (sekvence id. č. 15), AtNMLc4-l (sekvence id. č. 17) a AtNMLc4-2 (sekvence id. č. 19) byly výhodně klonovány prostřednictvím RT-PCR. Celková RNA z Arabidopsis thaliana byla reverzně transkribována s použitím oligo dT primerů. Výsledné první vlákno cDNA bylo amplifikováno pomocí PCR s použitím specifických sense a antisense oligonukleotidových primerů navržených na základě 5' a 3' konců kódující oblasti každé genomové sekvence (sekvence id. č. 15, 17, a 19) . PCR fragmenty předpokládaných velikostí byly klonovány do vektoru a sekvencovány, aby se ověřilo, že tyto cDNA klony odpovídají genomovým sekvencím podobným NIM. cDNA sekvence odpovídající NIM podobné genomové sekvenci AtNMLc2 (sekvence id. č. 15) je předložena jako sekvence id. č. 67 a kompletní cDNA sekvence odpovídající NIM podobné genomové sekvenci AtNMLc4-l (sekvence id. č. 17) je předložena jako sekvence id. č. 69 a kompletní cDNA sekvence odpovídající NIM podobné genomové sekvenci AtNMLc4-2 (sekvence id. č. 19) je předložena jako sekvence id. č. 71.

Příklad 9

Northern analýza

Northern data ukazují, že exprese klonu cukrové řepy podobného NIM (sekvence id. č. 39 a 63) se třikrát až sedmkrát zvyšuje po ošetření ΙΟΟμΜ nebo 300μΜ BTH (S-methylester kyseliny benzo(1,2,3)thiadiazol-7-karbothioové). Northern data také ukazují, že exprese klonu slunečnice A podobného NIM (sekvence id. č. 41) je konstitutivní. Kromě toho Northern data ukazují, že exprese klonu slunečnice B podobného NIM (sekvence id. č. 43 a 65) se dvakrát zvyšuje po ošetření ΙΟΟμΜ nebo 300μΜ BTH.

II. Exprese genové sekvence podle vynálezu v rostlinách

Homolog NIMI podle předkládaného vynálezu může být vnesen do rostlinných buněk s použitím obvyklé technologie rekombinantní DNA. Obecně to zahrnuje inzerci kódující sekvence podle vynálezu do expresního systému, pro který je kódující sekvence heterologní (tj. normálně se v něm nevyskytuje) s použitím standardních klonovacích postupů v oboru známých. Vektor obsahuje nezbytné prvky pro transkripci a translaci vložené sekvence kódující protein. Může být použit velký počet • φ

vektorových systémů v oboru známých, jako jsou například plazmidy, bakteriofagové viry a další modifikované viry. Vhodné vektory zahrnují bez omezení virové vektory, jako jsou například systémy vektoru lambdažgtll, ÁgtlO a Charon 4; plazmidové vektory, jako jsou například pBI121, pBR322, pACYC177, PACYC184, pAR series, pKK223-3, pUC8, pUC9, pUC18, pUC19, pLG339, pRK290, pKC37, pKCIOl, pCDNAII, a další podobné systémy. Složky expresního systému mohou být také modifikovány tak, aby se exprese zvýšila. Mohou být použity například zkrácené sekvence, nukleotidové substituce nebo další modifikace. Expresní systémy zde popsané mohou být použity pro transformaci potenciálně každé rostlinné buňky kulturních rostlin za vhodných podmínek. Transformované buňky mohou být regenerovány do celých rostlin, takže homolog NIMI zvyšuje expresi genu SAR a zvyšuje rezistenci na nemoci u transgenních rostlin.

Příklad 10

Konstrukce rostlinných expresních kazet

Kódující sekvence určené pro expresi v transgenních rostlinách jsou nejprve sestaveny v expresních kazetách za vhodným promotorem, který se exprimuje v rostlinách. Expresní kazety mohou také obsahovat jakoukoliv další sekvenci vyžadovanou nebo vybranou pro expresi transgenů. Tyto sekvence zahrnují bez omezení terminátory transkripce, cizorodé sekvence pro zvýšení exprese, jako jsou například introny, životně důležité sekvence a sekvence určené pro cílení genového • · • · • · • · « ·· • · · · · · · · · ·· · · ·· ·· ·’ « produktu do specifických organel a buněčných kompartmentů. Tyto expresní kazety pak mohou být snadno přeneseny do rostlinných transformačních vektorů popsaných níže. Následuje popis různých složek typických expresních kazet.

1. Promotory

Výběr promotoru použitého v expresních kazetách určuje prostorový a časový charakter exprese transgenu v transgenní rostlině. Vybrané promotory exprimují transgeny ve specifických buněčných typech (jako jsou například buňky listové epidermis, mezofylové buňky, buňky kůry kořenu) nebo ve specifických pletivech či orgánech (například kořeny, listy nebo květy) a selekce odráží požadovanou lokalizaci akumulace genového produktu. Nebo může vybraný promotor řídit expresi genu za různých indukujících podmínek. Promotory se liší svou silou, tj . schopností spouštět transkripci. V závislosti na použitém systému hostitelské buňky může být použit jakýkoliv z velkého množství vhodných promotorů, včetně nativního promotoru genu. Následují neomezující příklady promotorů, které mohou být použity v expresních kazetách.

a. Konstitutivní exprese, ubikvitinový promotor:

Ubikvitin je genový produkt, o kterém je známo, že se hromadí v mnoha buněčných typech a jeho promotor byl klonován z několika biologických druhů pro použití v transgenních rostlinách (např. slunečnice - Binet et al., 1991, kukuřice Christensen et al., 1989 a Arabidopsis - Norris et al., 1993).

Promotor ubikvitinu z kukuřice byl vyvinut v transgenních • · jednoděložných systémech a jeho sekvence a vektory konstruované pro transformaci jednoděložných rostlin jsou popsány v patentové publikaci EP 0 342 926 (Lubrizol) . Taylor et al. (1993) popisují vektor (pAHC25), který obsahuje promotor ubikvitinu z kukuřice a první intron a jeho vysokou aktivitu v buněčných suspenzích početných jednoděložných rostlin, když je vnesen prostřednictvím ostřelování (bombardování) mikročásticemi (mikroprojektily). Promotor ubikvitinu z Arabidopsis je obzvláště výhodný pro použití s homology NIMI podle předkládaného vynálezu. Promotor ubikvitinu je vhodný pro genovou expresi v transgenních rostlinách, jak jednoděložných, tak dvouděložných. Vhodné vektory jsou deriváty pAHC25 nebo kteréhokoliv z transformačních vektorů popsaných v této přihlášce, modifikovaného zavedením příslušného promotoru ubikvitinu a/nebo sekvence intronu.

b. Konstitutivní exprese, promotor CaMV 35S:

Konstrukce plazmidu pCGN1761 je popsána v publikované patentové přihlášce EP 0 392 225 (příklad 23) . pCGN1761 obsahuje „dvojitý promotor CaMV 35S a terminátor transkripce tmi s unikátním místem EcoRI mezi promotorem a terminátorem a má kostru typu pUC. Byl konstruován derivát pCGN1761, který má modifikovaný polylinker, který zahrnuje místa Notl a Xhol navíc k již existujícímu místu EcoRI. Tento derivát byl označen pCGN1761ENX. pCGN1761ENX je použitelný pro klonování cDNA sekvence nebo kódující sekvence (včetně mikrobiální ORF sekvence) do svého polylinkeru za účelem jejich exprese pod kontrolou promotoru 35S v transgenních rostlinách. Celá kazeta této konstrukce 35S promotor-kódující sekvence-tmi terminátor

může být vystřižena pomocí míst HindlII, Sphl, Sáli a Xbal 5 k promotoru a míst Xbal, BamHI a BglI 3 k terminátoru pro přenos do transformačních vektorů, jako jsou například ty popsané níže. Kromě toho může být odstraněn fragment s dvojitým promotorem

35S pomocí 5 excize s HindlII, Sphl, Sáli,

Xbal nebo Pstl a 3' excize s jakýmkoliv z restrikčních míst polylinkeru (EcoRI, Notl nebo Xhol) pro nahrazení j iným promotorem.

Je-li žádoucí, mohou být činěny modifikace kolem klonovacích míst pomocí zavedení sekvence, která může zesilovat translaci.

To je užitečné zejména tehdy, když je žádoucí nadměrná exprese. Například pCGN1761ENX může být modifikován optimalizací translačního iniciačního místa, jak j e popsáno v příkladu 37 patentu Spojených Států č. 5 639

949.

c. Konstitutivní exprese, promotor aktinu:

Je známo, že ve většině buněčných typů je exprimováno několik izoforem aktinu, a proto tedy je promotor aktinu dobrou volbou jako konstitutivní promotor. Konkrétně byl klonován a charakterizován promotor genu rýže Actl (McElroy et al., 1990) .

Bylo zjištěno, že fragment obsahuje všechny regulační v protoplastech rýže. Kromě expresní vektory založené na promotoru o velikosti 1,3 kb prvky nezbytné pro expresi toho byly konstruovány četné promotoru Actl specificky pro použití v jednoděložných rostlinách (McElroy et al., 1991). Ty obsahují ActT-intron 1, Adhl 5' hraniční sekvenci a AdhJ-intron 1 (z genu alkoholdehydrogenázy kukuřice) a sekvence z promotoru CaMV 35S. Vektory vykazující nejvyšší expresi byly fúze 35S a intronu Actl nebo 5 hraniční sekvence Actl a intronu Actl.

Optimalizace sekvence kolem iniciačního ATG (z reportérového • φ • φ

• · · ΦΦ • · φ · • φ φ · • φ φ φ genu GUS) také zesílila expresi. Promotorové expresní kazety popsané McElroy et al. (1991) mohou být snadno modifikovány pro genovou expresi a jsou obzvláště výhodné pro použití v jednoděložných příjemcích. Například fragmenty obsahující promotor byly odstraněny z McElroyových konstrukcí a byly použity pro nahrazení dvojitého promotoru 35S v pCGN1761ENX, který je pak použitelný pro inzerci specifické genové sekvence. Fúzní geny takto konstruované mohou pak být přeneseny do příslušných transformačních vektorů. V odlišné publikaci bylo také zjištěno, že promotor Actl rýže se svým prvním intronem také řídí vysokou expresi v kultivovaných buňkách ječmene (Chibbar et al., 1993).

d. Indukovatelná exprese, promotor PR-1:

Dvojitý promotor 35S v pCGN1761ENX může být nahrazen jakýmkoliv jiným promotorem volby, který bude mít za následek vhodně vysoký stupeň exprese. Například jeden z chemicky regulovatelných promotorů popsaných v patentu Spojených Států č. 5 614 395 může nahradit dvojitý promotor 35S. Promotor volby je výhodně vystřižen ze svého zdroje restrikčními enzymy, ale alternativně může být také amplifikován pomocí PCR s použitím primerů, které nesou příslušná terminální restrikční místa. Provádí-li se PCR amplifikace, pak by měl být promotor znovu sekvencován, aby se vyloučily chyby vzniklé amplifikací po klonování amplifikovaného promotoru do cílového vektoru. Chemicky/patogenem regulovatelný promotor PR-la tabáku byl štěpen z plazmidu pCIB1004 (pro konstrukci viz příklad 21 z EP 0 332 104) a přenesen do plazmidu pCGN1761ENX (Uknes et al., 1992). pCIB1004 je štěpen s Ncol a výsledný 3 přesah

linearizovaného fragmentu je zaslepen ošetřením s T4 DNA polymerázou. Fragment je pak štěpen s HindlII a výsledný fragment obsahující promotor PR-la je purifikován přes gel a klonován do pCGN1761ENX, ze kterého byl odstraněn dvojitý promotor 35S. To je provedeno štěpením s Xhol a zaslepením s T4 polymerázou, po čemž následuje štěpení s HindlII a izolace většího fragmentu vektoru obsahujícího terminátor, do kterého je klonován promotorový fragment pCIB1004. To dává vznik derivátu pCGN1761ENX s promotorem PR-la a terminátorem tmi a intervenujícím polylinkerem s unikátními místy EcoRI a Notl. Do tohoto vektoru může být vložena vybraná kódující sekvence a fúzní produkty (tj. promotor-gen-terminátor) mohou být pak přeneseny do jakéhokoliv vybraného transformačního vektoru, včetně těch, co jsou popsány níže. Různé chemické regulátory mohou být použity pro indukci exprese vybrané kódující sekvence v rostlinách transformovaných podle předkládaného vynálezu, včetně benzothiadiazolu, kyseliny isonikotinové a sloučenin kyseliny salicylové popsaných v patentech Spojených Států č. 5 523 311 a 5 614 395.

e. Indukovatelná exprese, promotor indukovatelný ethanolem:

Promotor indukovatelný určitými alkoholy nebo ketony, jako je například ethanol, může být také použit pro vyvolání indukce exprese kódující sekvence podle předkládaného vynálezu. Takový promotor je například promotor genu alcA z Aspergillus nidulans (Caddick et al., 1998). V A. nidulans kóduje gen alcA alkoholdehydrogenázu I, jejíž exprese je regulována prostřednictvím transkripčních faktorů AlcR v přítomnosti chemického induktoru. Pro účely předkládaného vynálezu jsou CAT kódující sekvence v plazmidu palcA:CAT obsahující sekvenci promotoru genu alcA fúzovanou s minimálním promotorem 35S (Caddick et al., 1998) nahrazeny kódující sekvencí podle předkládaného vynálezu za vzniku expresní kazety, která má kódující sekvenci pod kontrolou promotoru genu alcA. To je prováděno s použitím metod v oboru dobře známých.

f. Indukovatelná exprese, promotor indukovatelný glukokortikoidy:

Předpokládá se také indukce exprese homologu NIMI podle předkládaného vynálezu s použitím systémů založených na steroidních hormonech. Například byl použit indukční systém zprostředkovaný glukokortikoidem (Aoyama a Chua, 1997) a genová exprese je indukována aplikací glukokortikoidu, například syntetického glukokortikoidu, výhodně dexametazonu, výhodně v koncentraci pohybující se od 0,lmM do lmM, výhodněji od lOmM do lOOmM. Pro účely předkládaného vynálezu byly sekvence luciferázového genu nahrazeny genovou sekvencí kódující homolog NIMI, za vzniku expresní kazety, která měla genovou sekvenci kódující homolog NIMI pod kontrolou šesti kopií GAL4 v protisměru aktivačních sekvencí fúzovaných k minimálnímu promotoru 35S. To bylo prováděno s použitím metod v oboru dobře známých. Transaktivující faktor obsahuje vazebnou doménu pro GAL4 DNA (Keegan et al., 1986) fúzovanou k transaktivační doméně proteinu viru herpes VP16 (Triezenberg et al., 1988) fúzovanému s hormony vázající doménou glukokortikoidového receptoru laboratorního potkana (Picard et al., 1988). Exprese fúzního proteinu je řízena jakýmkoliv promotorem vhodným pro expresi v rostlinách v oboru známým nebo zde popsaným. Tato • φ expresní kazeta je také obsažena v rostlině obsahující genovou sekvenci kódující homolog NIMI fúzovaný s 6xGAL4/minimálním promotorem. Tudíž tkáňová nebo orgánová specifičnost fúzního proteinu je dosažena zavedením indukovatelné tkáňové nebo orgánové specifičnosti do homologu NIMI.

g. Exprese specifická pro kořen:

Jiným typem genové exprese je kořenová exprese. Vhodný kořenový promotor je popsán de Framond (1991), a také v publikované patentové přihlášce EP 0 452 269. Tento promotor byl přenesen do vhodného vektoru, jako je například pCGN1761ENX, pro inzerci vybraného genu a následoval přenos celé kazety promotor-gen-terminátor do zkoumaného transformačního vektoru.

h. Promotory indukovatelné poraněním:

Promotory indukovatelné poraněním mohou být také vhodné pro genovou expresi. Byly popsány četné promotory tohoto typu (např. Xu et al. , 1993, Logemann et al., 1989, Rohrmeier & Lehle, 1993, Firek et al., 1993, Warner et al., 1993) a všechny jsou vhodné pro použití s předkládaným vynálezem. Logemann et al. popisují 5' protisměrné sekvence genu wunl dvouděložné brambory. Xu et al. prokázali, že poraněním indukovatelný promotor z dvouděložné rostliny - bramboru (pin2) je aktivní i v jednoděložné rostlině - rýži. Kromě toho Rohrmeier & Lehle popsali klonování Wipl cDNA z kukuřice, která je indukována poraněním a která může být použita pro izolaci analogického promotoru s použitím standardních technik. Podobně Firek et al.

a Warner et al. popsali gen indukovaný poraněním z jednoděložného Asparagus officinalis, který je exprimován lokálně v místě poranění a místech invaze patogenu. S použitím klonovacích technik v oboru známých mohou být tyto promotory přeneseny do vhodných vektorů, fúzované ke genům, kterých se tento vynález týká a použity k expresi těchto genů v místech poranění rostlin.

i. Exprese preferující dřeň:

Patentová přihláška WO 93/07278 popisuje izolaci genu trpA kukuřice, který je přednostně exprimován v buňkách dřeně. Jsou popsány genová sekvence a promotor v rozsahu do -1726 bp od začátku transkripce. S použitím standardních technik molekulární biologie může být tento promotor nebo jeho části přenesen do vektoru, jako je například pCGN1761, kde může nahradit promotor 35S a může být použit pro řízení exprese cizorodého genu způsobem, který preferuje dřeň. Ve skutečnosti mohou být fragmenty obsahující promotor preferující dřeň nebo jeho části přeneseny do jakéhokoliv vektoru a modifikovány pro použití v transgenních rostlinách.

j. Exprese specifická pro list:

Gen kukuřice kódující fosfoenolkarboxylázu (PEPC) byl popsán autory Hudspeth & Grula (1989). S použitím standardních technik molekulové biologie může být promotor pro tento gen použit pro řízení exprese jakéhokoliv genu specificky pro list v transgenních rostlinách.

• Φ φ· «· φ · · · ♦ • · · · ♦ · ♦ ♦ 1 ♦♦ « · φΦΦ ···· 9 9 · : :: : ·: : ··: ·: : :

Φ φ φφ φφ ♦ * ♦· ΦΦ·

k. Exprese specifická pro pyl :

WO 93/07278 popisuje izolaci genu proteinkinázy závislé na kalciu (CDPK) kukuřice, který je exprimován v buňkách pylu. Genová sekvence a promotor zasahují k 1400 bp od začátku transkripce. S použitím standardních technik molekulové biologie může být tento promotor nebo jeho části přenesen do vektoru, jako je například pCGN1761, kde může nahradit promotor 35S a může být použit pro řízení exprese homologu NIMI podle předkládaného vynálezu specificky pro pyl.

2. Terminátory transkripce

Pro použití v expresních kazetách je k dispozici celá řada terminátorů transkripce. Ty jsou zodpovědné za ukončení transkripce za transgenem a jeho správnou polyadenylaci. Vhodné transkripční terminátory jsou ty, o kterých je známo, že působí v rostlinách a zahrnují terminátor CaMV 35S, terminátor tmi, terminátor nopalinsyntázy a terminátor rbcS E9 hrachu. Tyto mohou být použity jak v jednoděložných, tak v dvouděložných rostlinách. Kromě toho může být použit nativní terminátor transkripce genu.

3. Sekvence pro zesílení nebo regulaci exprese

Bylo zjištěno, že četné sekvence zesilují genovou expresi zevnitř z transkripční jednotky a tyto sekvence mohou být použity ve spojení s geny této sekvence, aby se zvýšila jejich exprese v transgenních rostlinách.

• ·

Bylo prokázáno, že různé intronové sekvence zesilují expresi, obzvláště v jednoděložných rostlinách. Například bylo zjištěno, že introny genu Adhl kukuřice významně zvyšují expresi genu divokého typu pod jeho analogickým promotorem, když jsou zavedeny do buněk kukuřice. Bylo zjištěno, že intron 1 byl obzvláště účinný a zesiloval expresi ve fúzních konstruktech s genem chloramfenikolacetyltransferázy (Callis et al. , 1987) . Ve stejném pokusném systémů měl intron z genu bronzel kukuřice podobný účinek na zvýšení exprese. Intronové sekvence byly rutinně začleňovány do rostlinných transformačních vektorů, typicky do netranslatované vedoucí oblasti.

Je známo, že celá řada netranslatovaných vedoucích sekvencí pocházejících z virů také zvyšuje expresi a je účinná zejména ve dvouděložných rostlinách. Bylo prokázáno, že specificky vedoucí sekvence viru mozaiky tabáku (TMV, W-sekvence), virus chlorotické skvrnitosti kukuřice (MCMV) a virus mozaiky vojtěšky (AMV) jsou účinné při zesilování exprese (e.gr. Gallie et al., 1987, Skuzeski et al., 1990).

4. Cílení genového produktu v buňce

Je známo, že v rostlinách existují různé mechanismy pro cílení genových produktů a sekvence řídící působení těchto mechanismů byly do určité míry charakterizovány. Například cílení genových produktů do chloroplastu je řízeno signální sekvencí, která byla nalezena na aminokoncové části různých proteinů, které jsou štěpeny během importu do chloroplastů za vzniku zralého proteinu (např. Comai et al., 1988). Tyto signální sekvence mohou být fúzovány s produkty heterologních • · «· ·· · · • · · · · ♦ ·

·· genů, aby se uskutečnil import heterologních produktů do chloroplastu (van den Broeck, et al., 1985). DNA kódující příslušnou signální sekvenci může být izolována z 5 konce cDNA kódujících protein RUBISCO, protein CAB, enzym EPSP syntázu, protein GS2 a mnoho dalších proteinů, o kterých je známo, že jsou lokalizovány v chloroplastu. (Viz také část nazvanou Expression With Chloroplast Targeting v příkladu 37 patentu Spojených Států č. 5 639 949).

Jiné genové produkty jsou lokalizovány do dalších organel, jako jsou například mitochondrie a peroxisomy (např. Unger et al., 1989). cDNA kódující tyto produkty může být také manipulována tak, aby se uskutečnilo cílení produktů heterologního genu do těchto organel. Příklady těchto sekvencí jsou ATPázy kódované v jádru a specifické izoformy aspartátaminotransferázy pro mitochondrie. Cílení hlavních částí buněčných proteinů bylo popsáno autory Rogers et al. (1985) .

Kromě toho byly charakterizovány sekvence, které způsobují cílení genových produktů do jiných buněčných kompartmentů. Aminokoncové sekvence jsou zodpovědné za cílení do ER, apoplastu a extracelulární sekreci z aleuronových buněk (Koehler & Ho, 1990). Navíc aminokoncové sekvence ve spojení s karboxykoncovou sekvencí jsou zodpovědné za cílení genových produktů do vakuol (Shinshi et al., 1990).

Fúzí vhodných cílících sekvencí popsaných výše se zkoumanými transgenními sekvencemi je možné namířit transgenní produkt do jakékoliv organely nebo buněčného kompartmentů.

Například pro cílení chloroplastů je do rámce k aminokoncovému

ATG transgenu fúzovaná chloroplastová signální sekvence z genu

RUBISCO, genu CAB, gen EPSP syntázy nebo genu GS2. Vybraná

4 signální sekvence by měla zahrnovat známé štěpné místo a konstruovaná fúze by měla brát do úvahy všechny aminokyseliny po štěpném místu, které jsou nezbytné pro štěpení. V některých případech může být tento požadavek splněn přidáním malého počtu aminokyselin mezi štěpné místo a ATG transgenu nebo, jako alternativa, náhradou některých aminokyselin v sekvenci transgenu. Fúze konstruované pro import do chloroplastu mohou být testovány na účinnost absorpce do chloroplastů prostřednictvím in vitro translace in vitro transkribovaných konstruktů, po kterých následuje stanovení in vitro absorpce chloroplastů s použitím technik popsaných autory Bartlett et al. (1982) a Wasmann et al. (1986). Tyto techniky jsou v oboru dobře známy a jsou stejně vhodné pro mitochondrie a peroxisomy.

Výše popsané mechanismy pro buněčné cílení mohou být používány nejenom ve spojení s jejich analogickými promotory, ale také ve spojení s heterologními promotory tak, aby se uskutečnilo cílení specifické buňky za transkripční regulace promotoru, který má odlišný typ exprese než promotor, ze kterého cílící signál pochází.

Příklad 11

Konstrukce rostlinných transformačních vektorů

Odborníkovi v oboru transformace rostlin jsou známy četné transformační vektory vhodné pro transformaci rostlin a geny souvisící s tímto vynálezem mohou být použity ve spojení s každým z těchto vektorů. Výběr vektoru závisí na výhodné transformační technice a cílové odrůdě pro transformaci. Pro • · určité cílové odrůdy mohou být výhodné odlišné antibiotické nebo herbicidní markéry selekce. Selekční markéry používané rutinně v transformaci zahrnují gen nptll, který propůjčuje rezistenci na kanamycin a příbuzná antibiotika (Messing & Vierra, 1982, Bevan et al., 1983), gen bar, který propůjčuje rezistenci na herbicid fosfinotricin (White et al., 1990, Spencer et al., 1990), gen hph, který propůjčuje rezistenci na antibiotikum hygromycin (Blochinger & Diggelmann) a gen dhfr, který propůjčuje rezistenci na metotrexát (Bourouis et al., 1983) a gen EPSPS, který propůjčuje rezistenci na glyfosát (patent Spojených Států č. 4 940 935 a 5 188 642).

1. Vektory vhodné pro transformaci zprostředkovanou

Agrobacterium

Pro transformaci s použitím Agrobacterium tumefaciens existuje řada vhodných vektorů. Typicky nesou alespoň jednu hraniční sekvenci T-DNA a patří sem vektory, jako je například pBIN19 (Bevan, Nucl. Acids Res. , 1984) a pXYZ. Níže je popsána konstrukce dvou typických vektorů vhodných pro transformaci zprostředkovanou Agrobacterium.

a. PCIB200 a pCIB2001;

Binární vektory pcIB200 a pCIB2001 jsou používány pro konstrukci rekombinantních vektorů pro použití s Agrobacterium a jsou konstruovány takto: pTJS75kan je vytvořen štěpením pTJS75 pomocí Narl (Schmidhauser & Helinski, 1985), což umožňuje excizi genu nesoucího rezistenci na tetracyklin, a pak následuje inzerce fragmentu AccI z pUC4K nesoucího NPTII • · • ··· • · · · · · φ φφφ · φ · · φφφφ φφ φ φφφ φφ φφ φφ ·· ·· ··· (Messing & Vierra, 1982, Bevan et al., 1983, McBride et al.,

1990) . Spojovací sekvence Xhol jsou ligovány k fragmentu EcoRV z PCIB7, který obsahuje levou a pravou hranici T-DNA, rostlinný selektovatelný chimérický gen nos/nptll a polylinker pUC (Rothstein et al., 1987) a fragment štěpený Xhol jsou klonovány do pTJS75kan štěpeného Sáli za vzniku pCIB200 (viz také EP 0 332 104, příklad 19) . pCIB200 obsahuje následující unikátní restrikční místa v polylinkeru: EcoRI, Sstl, KpnI, BglII, Xbal, a Sáli. pCIB2001 je derivát pCIB200 vytvořený inzercí dalších restrikčních míst do polylinkeru. Unikátní restrikční místa v polylinkeru pCIB2001 jsou EcoRI, Sstl, KpnI, BglII, Xbal, Sáli, Mini, Bell, AvrlI, Apal, Hpal, a Stul. pCIB2001, kromě toho, že obsahuje tato unikátní restrikční místa, má také kanamycinovou selekci pro rostliny a bakterie, pravou a levou hranici T-DNA pro transformaci zprostředkovanou Agrobacterium, funkci trfA pocházející z RK2 pro mobilizaci mezi E. coli a jinými příjemci a funkce OriT a OriV také z RK2. Polylinker pCIB2001 je vhodný pro klonování rostlinných expresních kazet obsahujících své vlastní regulační signály.

b. pCIBlO a jeho deriváty s hygromycinovou selekcí:

Binární vektor pCIBlO obsahuje gen kódující kanamycinovou rezistenci pro selekci v rostlinách a pravou a levou hraniční sekvenci T-DNA a zahrnuje sekvence z plazmidu pRK252 s velkou řadou příjemců, což mu umožňuje replikaci jak v E. coli, tak v Agrobacterium. Jeho konstrukce je popsána autory Rothstein et al., 1987. Byly konstruovány různé deriváty pCIBlO, které obsahují gen pro hygromycin B fosfotransferázu popsaný autory Gritz et al., 1983. Tyto deriváty umožňují selekci transgenních rostlinných buněk pouze s hygromycinem (pCIB743), nebo hygromycinem a kanamycinem (pCIB715, pCIB717).

2. Vektory vhodné pro jinou transformaci než zprostředkovanou

Agrobacterium

Transformace bez použití Agrobacterium tumefaciens obchází požadavek na přítomnost sekvence T-DNA ve vybraném transformačním vektoru a kromě vektorů popsaných výše, které TDNA sekvence obsahují, mohou být tedy použity také vektory, které tyto sekvence postrádají. Transformační techniky, které se neopírají o Agrobacterium, zahrnují transformaci prostřednictvím ostřelování mikročásticemi, absorpci protoplasty (např. PEG a elektroporace) a mikroinjekce. Výběr vektorů závisí převážně na selekci výhodné pro transformovanou odrůdu. Dále je popsána konstrukce typických vektorů vhodných pro transformaci nezprostředkovanou Agrobacterium.

a. pCIB3064:

pCIB3064 je vektor založený na pUC vhodný pro přímé techniky genového přenosu v kombinaci se selekcí pomocí herbicidu Basta (nebo fosfinotricinu). Plazmid pCIB246 obsahuje promotor CaMV 35S ve funkční fúzi s genem GUS E. coli a terminátor transkripce CaMV 35S a je popsán v publikované PCT přihlášce WO 93/07278. Promotor 35S tohoto vektoru obsahuje dvě ATG sekvence 5' od místa startu. Tato místa jsou mutována s použitím standardní PCR techniky tak, aby se odstranily sekvence ATG a vznikla restrikční místa SspI a PvuII. Nová restrikční místa jsou 96 a 37 bp vzdálená od unikátního místa • * • toto · · · ·····« · to • « · · ·· · ·· · ·· ·· ·· to· ♦ · ···

Sáli a vzdálená 101 a 42 bp od aktuálního místa startu. Výsledný derivát pCIB246 je označen pCIB3025. Gen GUS je pak vystřižen z pCIB3025 štěpením se Sáli a Sací, jeho konce zaslepeny a je opět ligován za vzniku plazmidu pCIB3060. Plazmid pJIT82 byl získán od John Innes Centre, Norwich a Smál fragment o velikosti 400 bp obsahující gen bar ze Streptomyces viridochromogens je vystřižen a vložen do místa Hpal z pCIB3060 (Thompson et al., 1987). Takto vznikl pCIB3064, který obsahuje gen bar pod řízením promotoru CaMV 35S a terminátor pro selekci herbicidem, gen pro ampicilinovou rezistenci (pro selekci v E. coli) a polylinker s unikátními místy Sphl, Pstl, HindlII a BamHI. Tento vektor je vhodný pro klonování rostlinných expresních kazet obsahujících své vlastní regulační signály.

b. pSOG19 a pSOG35:

pSOG35 je transformační vektor, který používá gen dihydrofolátreduktázy (DFR) z E. coli jako markér selekce propůjčující rezistenci na metotrexát.

Je použita PCR pro amplifikaci promotoru 35S (-800 bp) , intronu 6 z genu Adhl (-550 bp) kukuřice a 18 bp z GUS netranslatované vedoucí sekvence z pSOGlO. Fragment o velikosti 250 bp kódující gen dihydrofolátreduktázy typu II z E. coli je také amplifikován prostřednictvím PCR a tyto dva PCR fragmenty jsou spojeny se

Sacl-Pstl fragmentem z pB1221 (Clontech), který obsahuje kostru vektoru pUC19 a terminátor nopalinsyntázy.

Náhrada vedoucí sekvence GUS v pSOG19 vedoucí sekvencí viru chlorotické skvrnitosti kukuřice (MCMV) vytvoří vektor pSOG35. pSOG19 a pSOG35 nesou gen pUC pro ampicilinovou rezistenci a mají místa «· ·« «* ·♦ • · · ·♦·♦ · » · • · · · · · · • · ♦ · « · · ·· • 4 ·· ·« ♦· »^e *

HindlII, Sphl, Pstl a

EcoRI použitelná pro klonování cizorodých látek.

Příklad 12

Transformace

Jakmile je jednou expresního systému, požadovaná genová sekvence zaklonována do může být transformována (tj. vnesena transformací) do rostlinné buňky. Způsoby transformace a regenerace rostlin jsou v oboru známy. Například byly používány Ti plazmidové vektory pro dodávání cizorodé DNA, jakož i přímá absorpce DNA, lipozomy, elektroporace, mikroinjekce a mikročástice/mikroprojektily. Dále mohou být pro transformaci rostlinných buněk použity bakterie rodu Agrobacterium. Níže jsou uvedeny popisy reprezentativních technik pro transformaci jak dvouděložných, tak jednoděložných rostlin.

1. Transformace dvouděložných rostlin

Transformační techniky pro dvouděložné rostliny jsou v oboru dobře známy a zahrnuj í techniky založené na

Agrobacterium a techniky, které Agrobacterium nevyžadují.

Techniky nezprostředkované genetického materiálu přímo

Agrobacterium vyžadují absorpci protoplasty nebo buňkami. To se může provádět absorpcí zprostředkovanou PEG nebo elektroporací, aplikací zprostředkovanou bombardováním částicemi nebo mikroinjekcí. Příklady těchto technik jsou popsány autory

Paszkowski et al., 1984, Potrykus et al., 1985, Reich et al., *· «· ·· ·· ·· · .·· · · · · · · ·· • · *·· » » · · · ♦ » • 0 0 <00 0 000 «00 0

0 0 0 00 0 ΦΦ0 ·· 9 9 99 00 ·· 0*0

1986 a Klein et al., 1987. Transformované buňky jsou pokaždé regenerovány pomocí standardních technik v oboru známých.

Transformace zprostředkovaná Agrobacterium je výhodná technika pro transformaci dvouděložných rostlin díky vysoké účinnosti transformace a široké využitelnosti u mnoha různých druhů. Transformace zprostředkovaná Agrobacterium typicky zahrnuje přenos binárního vektoru nesoucího zkoumanou cizorodou DNA (např. pCIB200 nebo pCIB2001) do vhodného kmene Agrobacterium, což může záviset na komplementu genů vir nesených hostitelským kmenem Agrobacterium buď ve společně rezidentním Ti plazmidu nebo chromozomálně (např. kmen CIB542 pro pCIB200 a pCIB2001 (Uknes et al., 1993). Přenos rekombinantního binárního vektoru do Agrobacterium je prováděn prostřednictvím triparentálního páření s použitím E. coli nesoucích rekombinantní binární vektor, pomocný kmen E. coli, který nese plazmid, jako je například pRK2013, a který je schopný mobilizovat rekombinantní binární vektor do cílového kmene Agrobacterium. Nebo může být rekombinantní binární vektor přenesen do Agrobacterium prostřednictvím DNA transformace (Hofgen & Willmitzer, 1988).

Transformace cílových rostlinných odrůd pomocí rekombinantního Agrobacterium obvykle zahrnuje společnou kultivaci Agrobacterium s rostlinnými explantáty a postupuje se podle protokolů, které jsou v oboru známé. Transformovaná tkáň je regenerována na selektovatelném médiu a nese markér rezistence na antibiotika nebo herbicid, který se vyskytuje mezi T-DNA hranicemi binárního plazmidu.

Další přístup k transformaci rostlinných buněk genem zahrnuje vstřelování inertních nebo biologicky aktivních částic do rostlinných pletiv a buněk. Tato technika je popsána

«·		•v				•
• ·	•	•	»	• ·	•	•	··
•	•	···	•	•	• ·	• ·	•
•	•	• «	• ·	•	··· ·	• ·	•
Φ	•	• ·	•	•	•	•	•	•
«·				*·	a»·	* · ·

v patentech Spojených Států č. 4 945 050, 5 036 006 a 5 100 792. Obecně tento postup zahrnuje vstřelování inertních nebo biologicky aktivních částic do buněk v podmínkách umožňujících penetraci vnějšího povrchu buňky a poskytujících inkorporaci do jejího vnitřku. Když jsou použity inertní částice, může být vektor vnesen do buňky tím, že se na částice nanese vektor obsahující požadovaný gen. Nebo může být cílová buňka v prostředí obsahujícím vektor, takže vektor je vnesen do buňky průchodem částice. Biologicky aktivní částice (např. suché kvasinky, suché bakterie nebo bakteriofág, obsahující DNA, mohou být také vstřelovány do rostlinného pletiva nebo buněk.

2. Transformace jednoděložných rostlin

Transformace většiny jednoděložných druhů se nyní stala rutinní. Výhodné techniky zahrnují přímý přenos genu do protoplastů s použitím PEG nebo elektroporace a ostřelování kalusového pletiva mikročásticemi. Transformace mohou být prováděny jedním druhem DNA nebo několika druhy DNA (tj . společná transformace - kotransformace) a obě tyto techniky jsou vhodné pro použití v předkládaném vynálezu. Kotransformace může mít výhodu v tom, že obchází konstrukci kompletního vektoru a že vznikají transgenní rostliny bez spojení lokusů zkoumaného genu a markéru pro selekci, což umožňuje odstranění markéru pro selekci v dalších generacích, je-li toto shledáno žádoucím. Ale nevýhodou použití kotransformace je to, že frekvence, se kterou jsou jednotlivé druhy DNA integrovány do genomu, je menší než 100 % (Schocher et al., 1986).

• ·

• · • · • · • · • ·

Patentové přihlášky EP 0 292 435, EP 0 392 225 a WO 93/07278 popisují techniky přípravy kalusu a protoplastů z vybrané inbrední linie kukuřice, transformaci protoplastů s použitím PEG nebo elektroporace a regeneraci rostlin kukuřice z transformovaných protoplastů. Gordon-Kamm et al. (1990) a Fromm et al. (1990) publikovali techniky transformace linie A188 pocházející z kukuřice s použitím bombardování částicemi. Navíc WO 93/07278 a Koziel et al. (1993) popisují techniky pro transformaci vybraných inbredních linií kukuřice pomocí bombardování částicemi. Tato technika používá nezralá embrya kukuřice dlouhá 1,5-2,5 mm vyjmutá z klasu kukuřice 14 až 15 dnů po opylení a zařízení PDS-lOOOHe Biolistics pro ostřelování.

Transformace rýže může být také prováděna přímými technikami genového přenosu používajícími protoplasty nebo ostřelování částicemi. Transformace zprostředkovaná protoplasty byla popsána pro typy Japonica a Indica (Zhang et al. , 1988,

Shimamoto et al., 1989, Datta et al., 1990). Oba typy jsou také rutinně transformovatelné s použitím bombardování částicemi (Christou et al., 1991). Kromě toho WO 93/21335 popisuje techniky pro transformaci rýže prostřednictvím elektroporace.

Patentová přihláška EP 0 332 581 popisuje techniky generace, transformace a regenerace protoplastů Pooideae. Tato technika umožňuje transformaci Dactylis a pšenice. Navíc transformace pšenice byla popsána autory Vasil et al. (1992) při použití bombardování částicemi do buněk typu C dlouhodobě regenerovatelného kalusu, a také autory Vasil et al. (1993) a

Weeks et al. (1993) s použitím ostřelování částicemi nezralých embryí a kalusů pocházejících z nezralých embryí. Ale výhodná technika pro transformaci pšenice zahrnuje transformaci pšenice • · • ·

pomocí bombardování částicemi nezralých embryí a před podáváním genu zahrnuje krok inkubace na vysoké koncentraci sacharózy nebo maltózy. Před vlastním ostřelovánm libovolný počet embryí (délky 0,75-1 mm) byl umístěn na MS médium se 3% sacharózou (Murashiga & Skoog, 1962) a 3 mg/1 2,4-D pro indukci somatických embryí, která probíhala ve tmě. Ve zvolený den ostřelován byla embrya odstraněna z indukčního média a umístěna na osmotikum (tj . indukční médium se sacharžou nebo maltózou přidanou na požadovanou ponechána 2-3 hodiny, ostřelována. Typické je koncentraci, obvykle 15%).

aby proběhla plazmolýza, embryí na cílové misce,

Embrya byla pak když byla počet není kritický.

Vhodný plazmid nesoucí gen (jako pCIB3064 nebo pSG35) byl precipitován na zlatých např.

čisticích je velikosti řádu mikrometrů, a sice standardním způsobem. Každá miska s embryi byla ostřelována užitím heliového zařízení DuPont Biolistics® s tlakem výstřelu přibližně 68954 kPa (1000 psi) a mřížkou 80 mesh. Po ostřelování byla embrya umístěna zpět do tmy pro zotavení na 24 hodin (stále na osmotiku). Po 24 hodinách byla embrya odebrána z osmotika a umístěna zpět na indukční médium, kde zůstala asi měsíc do regenerace. Asi po měsíci byly explantáty embryí, které vyvinuly embryogenní kalusy, přeneseny na regenerační médium (MS + 1 mg/1 NAA, 5 mg/1 GA) , obsahující dále vhodné selekční činidlo (10 mg/1

Basta v případě pCIB3064 a 2 mg/1 methotrexatu v případě pSOG35). Po přibližně jednom měsíci byly vyvíjející se nadzemní části přeneseny do větších sterilních kontejnerů známých pod označením GA7s obsahujících médium 1/2 MS, 2% sacharózu a selekční činidla jak bylo uvedeno výše.

Transformace jednoděložných rostlin prostřednictvím

Agrobacterium byla již jinde popsána, viz např. WO 94/00977 a

U.S. Patent 5,591,616.

III. Šlechtění a produkce semen

Příklad 13

Šlechtění

Rostliny získané transformací s genem podle vynálezu mohou být rostliny prakticky jakéhokoliv biologického druhu, a to jak dvouděložné, tak i jednoděložné, avšak rostliny užívané při způsobech podle vynálezu jsou výhodně rostliny vybrané ze seznamu agronomicky důležitých plodin uvedeném výše. Exprese genu podle vynálezu v kombinaci s dalšími vlastnostmi důležitými pro produkci a kvalitu mohou být vneseny do rostlinných linií prostřednictvím šlechtění. Metody šlechtění jsou odborníkům známy, viz např. Welsh J. R. (1981); Wood D. R. (Ed.) (1983); Mayo 0. (1987); Singh, D.P. (1986); a Wricke a

Weber (1986) .

Genetické vlastnosti vnesené do transgenních semen a rostlin popsaných výše jsou přenášeny pohlavním rozmnožováním nebo vegetativním růstem a mohou tak být udržována a rozmnožovány v dalších generacích rostlin. Obecně takové udržování a rozmnožování užívá metody zemědělství vhodné pro specifické účely jako je kultivace půdy, setí nebo sklízení. Lze také užít speciální metody jako je hydroponie nebo pěstování ve sklenících. Jelikož jsou rostoucí plodiny náchylné

k napadení a poškození hmyzem nebo infekcemi, a také kompeticí s plevely, je třeba podniknout opatření proti plevelům, chorobám, hmyzu, nematodám, a dalším škůdcům, ke zlepšení výnosů. Mohou tom být jak mechanická patření, jako je kultivace půdy bránami nebo odstraňování plevelů nebo nemocných rostlin, tak i použití agrochemikálií jako jsou herbicidy, fungicidy, gametocidy, nematicidy, růstové regulátory, agens pro dozrávání a insekticidy.

Výhodné genetické vlastnosti transgenních rostlin a semen podle vynálezu mohou být dále využity při šlechtění s cílem získat rostliny se zlepšenými vlastnostmi jako je např. tolerance ke škůdcům, herbicidům nebo stresu, zlepšená nutriční hodnota, zvýšený výnos, nebo zlepšená struktura umožňující snížit ztráty vzniklé v důsledku polehávání nebo rozdrcení. Jednotlivé kroky šlechtitelského procesu jsou charakterizovány dobře definovanými lidskými zásahy jako je výběr linií ke křížení, řízení opylení rodičovských linií nebo výběr potomstva. V závislosti na požadovaných vlastnostech se provádějí různá šlechtitelská opatření. Odpovídající techniky jsou v oboru dobře známy a neomezují se pouze na hybridizaci, inbreeding, zpětné křížení, víceliniové křížení, křížení variet, mezidruhovou hybridizaci, aneuploidní techniky apod. Takže transgenní semena a rostliny podle předkládaného vynálezu se mohou použít pro šlechtění zlepšených linií rostlin, které např. zvyšují účinnost konvenčních metod jako je ošetření herbicidy nebo pesticidy, nebo se díky svým modifikovaných genetickým vlastnostem obejdou bez těchto metod. Alternativně je možné získat nové plodiny se zlepšenou tolerancí ke stresu, které díky jejich optimalizované genetické výbavě poskytují

• · produkty v lepší kvalitě než produkty rostlin, které nejsou schopné tolerovat srovnatelně nepříznivé vývojové podmínky.

Příklad 14

Produkce semen

V semenářství jsou kvalita klíčení a uniformita osiva nezbytnými charakteristikami produktu, zatímco kvalita klíčení a uniformita semen sklízených a prodávaných farmáři nejsou tak důležité. Jelikož je obtížné udržovat plodinu v čistém stavu bez příměsi semen jiné plodiny nebo plevelu, kontrolovat nemoci přenášené semeny, a produkovat osivo s dobrou kvalitou klíčení, značně obsáhlé a dobře definované techniky výroby osiva byly vyvinuty producenty osiva, kteří mají zkušenosti s pěstováním, udržováním a prodejem čistého osiva. Je běžnou praxí, že farmář kupuje certifikované osivo odpovídající kvalitativním standardům, místo aby používal osivo z vlastní úrody. Materiál používaný jako osivo je obvykle ošetřen ochrannou vrstvou obsahující herbicidy, insekticidy, fungicidy, baktericidy, nematicidy, moluscicidy nebo jejich různé směsi. Obvykle užívané ochranné vrstvy obsahují sloučeniny jako kaptan, karboxin, thiram (TMTD®) , metalaxyl (Apron®) a pirimifosmetyl (Actellic®) . Pokud je to potřeba, tyto sloučeniny tvoří prostředek společně s dalšími pomocnými látkami, nosiči, surfaktanty nebo adjuvans usnadňujícími aplikaci, což běžně užívá v oboru prostředků pro ochranu před poškozením bakteriálními, houbovými nebo živočišnými škůdci. Ochranná vrstva se může aplikovat impregnací osiva tekutým prostředkem

nebo kombinovanou aplikací kapalného a suchého prostředku. Jiné způsoby aplikace lze také použít, např. přímé ošetření pupenů nebo plodů.

Další aspekt předkládaného vynálezu se týká nových metod v zemědělství, které byly např. zmíněny výše, kdy se užívají transgenní rostliny, transgenní rostlinný materiál nebo transgenní semena podle vynálezu.

Semena se uchovávají v pytli/sáčku, kontejneru nebo nádobě, které jsou z vhodných obalových materiálů a mohou být uzavřeny. Pytel, kontejner nebo nádoba jsou vyrobeny buďto pro krátkodobé nebo i dlouhodobé uskladnění semen nebo pro oba účely. K příkladům vhodných balicích materiálů patří papír, např. lepenka, tuhý nebo ohebný plast nebo jiné polymemí materiály, kov a sklo. Výhodně je pytel, kontejner nebo nádoba z více vrstev obalového materiálu stejného nebo odlišného druhu. V jednom výhodném provedení je pytel, kontejner nebo nádoba vyrobena tak, že vylučuje nebo alespoň omezuje vodu a vlhkost obsaženou v semenech. V jednom výhodném provedení je pytel, kontejner nebo nádoba uzavřena, např. tepelně zatavena, aby se zabránilo vniknutí vlhkosti. V jiném provedení se mezi vrstvy obalového materiálu vkládá materiál absorbující vodu. V ještě dalším provedení pytel, kontejner nebo nádoba, nebo obalový materiál, ze kterého jsou vyrobeny, jsou ošetřeny tak, aby se omezily, potlačily nebo zcela eliminovaly nemoci, kontaminace nebo jiné nepříznivé účinky při skladování a transportu semen. Takovým ošetřením je např. sterilizace, např. chemickými prostředky nebo ozařováním. Vynález se dále týká obchodního sáčku, který obsahuje semena transgenních rostlin obsahujících gen podle vynálezu, který je v transgenních rostlinách exprimovaný ve vyšší hladině než v rostlinách ♦ · • ♦ • · ·· divokého typu, společně s vhodným nosičem, s instrukcemi pro použití k získání rostlin s rezistencí k širokému spektru chorob.

IV. Hodnocení rezistence k chorobám

Hodnocení rezistence k chorobám bylo provedeno metodami, které jsou odborníkům známé, např. jak je popsali Uknes et al. (1993); Gorlach et al. (1996); Alexaer et al. (1993). Na ukázku je několik testů rezistence pospáno v následujících příkladech.

Příklad 15

Test rezistence k Phytophthora parasitica (černá hniloba stonku)

Testy rezistence k Phytophthora parasitica, která způsobuje černou hnilobu stonku, se provádějí na 6 týdnů starých rostlinách pěstovaných jak popsal Alexander et al. (1993). Rostliny jsou zality a po odtsranění přebytečné vody jsou inokulovány aplikací 10 ml suspenze sporangií (300 sporangií/ml) do půdy. Inokulované rostliny jsou pak udržovány ve skleníku při teplotě 23-25°C ve dne a 20-22°C v noci. V testu byl užit následující index vadnutí: 0 = bez symptomů, 1 = slabé příznaky vadnutí s redukovaným turgorem, 2 = jasné příznaky vadnutí, ale bez hniloby nebo krnění, 3 = jasné příznaky vadnutí s krněním, ale bez zjevné hniloby stonku, 4 = silné vadnutí s viditelnou hnilobou stonku a slabým poškozením • · · · · · · • · · · · · kořenového systému, 5 = stejně jako u stupně 4, navíc se rostliny blíží uhynutí a mají silně redukovaný kořenový systém. Všechny rostliny jsou skórovány slepě v pokusu s náhodným uspořádáním.

Příklad 16

Test rezistence k Pseudomonas syringae

Pseudomonas syringae pv. Tabaci, kmen #551, byl injikován do dvou spodních listů 6-7 týdnů starých rostlin v koncentraci 10⁶ nebo 3 x 10⁶/ml v H₂0. V každém časovém bodě bylo hodnoceno šest jednotlivých rostlin. Rostliny infikované Pseudomonas tabaci byly hodnoceny podle pětibodové škály, kdy 5 = 100 % odumřelé pletivo a 0 = bez symptomů. Pro vyhodnocení každé skupiny byl použit T-test (LSD) a skupiny jsou hodnoceny průměrnou hodnotou skóre. Hodnoty označené stejným písmenem v určitém dnu nejsou statisticky významně odlišné.

Příklad 17

Test rezistence k Cercospora nicotianae

Suspenze spór Cercospora nicotianae (ATCC #18366) (100 000

- 150 000 spór/ml) byla rozprášena bezprostředně na povrch listů. Rostliny pak byly udržovány 5 dnů ve 100% vzdušné vlhkosti. Pak byly rostliny mlženy 5-10x denně. V každém časovém bodě bylo hodnoceno šest rostlin. Infekce Cercospora • · ♦ φ φ φ • · φφ • φφ φφφ φ φφφφφ φ • ΦΦΦ φφ φ · · φφ «φ φφ φ· ·* · nicotianae byla vyhodnocována v % listové plochy vykazující symptomy choroby. Pro vyhodnocení každé skupiny byl použit Ttest (LSD) a skupiny jsou hodnoceny průměrnou hodnotou skóre. Hodnoty označené stejným písmenem v určitém dnu nejsou statisticky významně odlišné.

Příklad 18

Test rezistence k Peronospora parasitica

Testy rezistence k Peronospora parasitica se provádějí postupem popsaným v Uknes et al. (1993) . Rostliny byly inokulovány kompatibilním izolátem P. parasitica rozprášením suspenze konidií (přibližně 5 x 10⁴ spór/ml). Inokulované rostliny byly byly inkubovány ve vlhkém prostředí při 17° C v růstové komoře s režimem 14 hodin den/10 hodin noc. Rostliny byly vyšetřeny po 3 až 14 dnech, výhodně 7 až 12 dnech po inokulaci na přítomnost konidioforů. Kromě toho bylo z každé skupiny náhodně vybráno několik rostlin, které byly obarveny laktofenol-trypanovou modří (Keogh et al. , 1980) pro mikroskopické vyšetření.

Všechna výše popsaná provedení vynálezu mají ilustrativní význam. Odborník snadno nahlédne, že vynález připouští různé modifikace a variace. Tyto zřejmé variace však spadají do rozsahu popsaného vynálezu definovaného patentovými nároky.

φ φ • · • · φφ

STRUČNÝ POPIS SEKVENCÍ V SEZNAMU SEKVENCÍ

Sekvence id. č. 1 - Kompletní cDNA sekvence homologu NIMI z Nicotiana tabacum.

Sekvence id. č. 2 - Proteinová sekvence homologu NIMI z Nicotiana tabacum kódovaného sekvencí id. č. 1.

Sekvence id. č. 3 - Kompletní cDNA sekvence NIMI homologu z Lycopersicon esculentum.

Sekvence id. č. 4 - Proteinová sekvence homologu NIMI z Lycopersicon esculentum kódovaného sekvencí id. č. 3.

Sekvence id. č. 5 - Částečná cDNA sekvence homologu NIMI z Brassica napus.

Sekvence id. č. 6 - Částečná proteinová sekvence homologu NIMI

Brassica napus kódovaného sekvencí id. č. 5.

Sekvence id. č. 7 - Kompletní cDNA sekvence homologu NIMI (AtNMLc5) z Arabidopsis thaliana.

Sekvence id. č. 8 - Kompletní proteinová sekvence Arabidopsis thaliana homologu NIMI AtNMLc5 kódovaného sekvencí id. č. 7.

Sekvence id. č. :9-14 - Oligonukleotidové primery použité v příkladech 1-4.

Sekvence id. č. 15 - Genomová DNA sekvence homologu NIMI (AtNMLc2) z Arabidopsis thaliana.

Sekvence id. č. 16 - Proteinová sekvence Arabidopsis thaliana homologu NIMI AtNMLc2 kódovaného sekvencí id. č. 15.

Sekvence id. č. 17 - Genomová DNA sekvence homologu NIMI (AtNMLc4-l) z Arabidopsis thaliana.

Sekvence id. č. 18 - Proteinová sekvence Arabidopsis thaliana homologu NIMI AtNMLc4-l kódovaného sekvencí id. č. 17.

Sekvence id. č. 19 - Genomová DNA sekvence homologu NIMI (AtNMLc4-2) z Arabidopsis thaliana.

* ♦

Sekvence id. č. 20 - Proteinová sekvence Arabidopsis thaliana homologu NIMI AtNMLc4-2 kódovaného sekvencí id. č. 19.

Sekvence	id.	v c.	21	- PCR	primer	NIM	IA.
Sekvence	id.	č.	22	- PCR	primer	NIM	1B.
Sekvence	id.	č.	23	- PCR	primer	NIM	IC.
Sekvence	id.	v c.	24	- PCR	primer	NIM	ID.
Sekvence	id.	sz c.	25	- PCR	primer	NIM	2A.
Sekvence	id.	č.	26	- PCR	primer	NIM	2B.
Sekvence	id.	č.	27	- PCR	primer	NIM	2C.
Sekvence	id.	SZ c.	28	- PCR	primer	NIM	2D.

Sekvence id. č. 29 - DNA fragment podobný NIM o velikosti

659 bp amplifikovaný z Nicotiana tabacum (tabák A) , což je kanonická sekvence 36 sekvencí a sekvence je ze 67 % totožná se sekvencí genu NIMI z Arabidopsis thaliana.

Sekvence id. č. 30 - Proteinová sekvence kódovaná sekvencí id. č. 29.

Sekvence id. č. 31 - DNA fragment podobný NIM o velikosti

498 bp amplifikovaný z Nicotiana tabacum (tabák B) , což je kanonická sekvence 2 sekvencí a sekvence je ze 62 % totožná se sekvencí genu NIMI z Arabidopsis thaliana.

Sekvence id. č. 32 - Proteinová sekvence kódovaná sekvencí id.

c. 31.

Sekvence id. č. 33 - DNA fragment podobný NIM o velikosti

498 bp amplifikovaný z Nicotiana tabacum (tabák C) , což je kanonická sekvence 3 sekvencí a sekvence je ze 63 % totožná se sekvencí genu NIMI z Arabidopsis thaliana.

Sekvence id. č. 34 - Proteinová sekvence kódovaná sekvencí id. č. 33.

Sekvence id. č. 35 - DNA fragment podobný NIM o velikosti

399 bp amplifikovaný z Nicotiana tabacum (tabák D) , jehož sekvence je z 59 % totožná se sekvencí genu NIMI z Arabidopsis thaliana.

Sekvence id. č. 36 - Proteinová sekvence kódovaná sekvencí id. č. 35.

Sekvence id. č. 3 7 - DNA fragment podobný NIM o velikosti

498 bp amplifikovaný z Lycopersicon esculentum (rajče A) , což je kanonická sekvence 8 sekvencí a sekvence je ze 67 % totožná se sekvencí genu NIMI z Arabidopsis thaliana.

Sekvence id. č. 38 - Proteinová sekvence kódovaná sekvencí id. č. 37.

Sekvence id. č. 3 9 - DNA fragment podobný NIM o velikosti

498 bp amplifikovaný z Beta vulgaris (cukrová řepa) , což je kanonická sekvence 24 sekvencí a sekvence je ze 66 % totožná se sekvencí genu NIMI z Arabidopsis thaliana.

Sekvence id. č. 40 - Proteinová sekvence kódovaná sekvencí id. č. 39.

Sekvence id. č. 41 - DNA fragment podobný NIM o velikosti

498 bp amplifikovaný z Helianthus annuus (slunečnice A), což je kanonická sekvence 9 sekvencí a sekvence je ze 61 % totožná se sekvencí genu NIMI z Arabidopsis thaliana.

Sekvence id. č. 42 - Proteinová sekvence kódovaná sekvencí id. č. 41.

Sekvence id. č. 43 - DNA fragment podobný NIM o velikosti

498 bp amplifikovaný z Helianthus annuus (slunečnice B), což je kanonická sekvence 10 sekvencí a sekvence je z 59 % totožná se sekvencí genu NIMI z Arabidopsis thaliana.

Sekvence id. č. 44 - Proteinová sekvence kódovaná sekvencí id. č. 43.

Sekvence id. č. 45 - DNA fragment podobný NIM o velikosti

653 bp amplifikovaný ze Solanum tuberosum (brambora A) , což je kanonická sekvence 15 sekvencí a sekvence je ze 68 % totožná se sekvencí genu NIMI z Arabidopsis thaliana.

Sekvence id. č. 46 - Proteinová sekvence kódovaná sekvencí id. Č. 45.

Sekvence id. č. 47 - DNA fragment podobný NIM o velikosti

498 bp amplifikovaný ze Solanum tuberosum (brambora Β), což je kanonická sekvence 3 sekvencí a sekvence je ze 61 % totožná se sekvencí genu NIMI z Arabidopsis thaliana.

Sekvence id. č. 48 - Proteinová sekvence kódovaná sekvencí id. č. 47.

Sekvence id. č. 49 - DNA fragment podobný NIM o velikosti

477 bp amplifikovaný ze Solanum tuberosum (brambora C), což je kanonická sekvence 2 sekvencí a sekvence je ze 62 % totožná se sekvencí genu NIMI z Arabidopsis thaliana.

Sekvence id. č. 50 - Proteinová sekvence kódovaná sekvencí id. č. 49.

Sekvence id. č. 51 - DNA fragment podobný NIM o velikosti

501 bp amplifikovaný z Brassica napus (kanola A) , což je kanonická sekvence 5 sekvencí a sekvence je z 59 % totožná se sekvencí genu NIMI z Arabidopsis thaliana.

Sekvence id. č. 52 - Proteinová sekvence kódovaná sekvencí id. č. 51.

Sekvence id. Č. 53 - DNA fragment podobný NIM o velikosti

501 bp amplifikovaný z Brassica napus (kanola Β), což je kanonická sekvence 5 sekvencí a sekvence je z 58 % totožná se sekvencí genu NIMI z Arabidopsis thaliana.

Sekvence id. č. 54 - Proteinová sekvence kódovaná sekvencí id. č. 53.

Sekvence id. č. 55 - DNA fragment podobný NIM o velikosti

498 bp amplifikovaný z Brassica napus (kanola C), jehož • · ·· sekvence je z 56 % totožná se sekvencí genu NIMI z Arabidopsis thaliana.

Sekvence id. č. 56 - Proteinová sekvence kódovaná sekvencí id. č. 55.

Sekvence id. č. 57 - DNA fragment podobný NIM o velikosti

498 bp amplifikovaný z Brassica napus (kanola D), jehož sekvence je ze 73 % totožná se sekvencí genu NIMI z Arabidopsis

thaliana.
Sekvence	id. č.	58 - Proteinová sekvence kódovaná	sekvencí id.
č. 57.
Sekvence	id. č.	59 - PCR primer NIM 3A.
Sekvence	id. č.	60 - PCR primer NIM 3B.
Sekvence	id. č	61 - DNA fragment podobný NIM	o velikosti

148 bp amplifikovaný z Lycopersicon esculentum (rajče B) , což je kanonická sekvence 3 sekvencí a sekvence je ze 72 % totožná se sekvencí genu NIMI z Arabidopsis thaliana.

Sekvence id. č. 62 - Proteinová sekvence kódovaná sekvencí id. č. 61.

Sekvence id. č. 63 - Kompletní cDNA sekvence homologu NIMI z Beta vulgaris (cukrová řepa), která odpovídá PCR fragmentu ze sekvence id. č. 39.

Sekvence id. č. 64 - Proteinová sekvence homologu NIMI z cukrové řepy kódovaná sekvencí id. č. 62.

Sekvence id. č. 65 - Kompletní cDNA sekvence homologu NIMI z Helianthus annuus (slunečnice B) , která odpovídá PCR fragmentu ze sekvence id. č. 43.

Sekvence id. č. 66 - Proteinová sekvence Helianthus annuus homologu NIMI kódovaná sekvencí id. č. 65.

• 0 • ·

Sekvence id. č. 67 - cDNA sekvence odpovídající NIM podobné genomové sekvenci AtNMLc2 z Arabídopsis thaliana (sekvence id.

č. 15) .

Sekvence id. č. 68 - Proteinová sekvence kódovaná sekvencí id. Č. 67.

Sekvence id. č. 69 - cDNA sekvence odpovídající NIM podobné genomové sekvenci AtNMLc4-l z Arabídopsis thaliana (sekvence id. č. 17).

Sekvence id. č. 70 - Proteinová sekvence kódovaná sekvencí id. č. 69.

Sekvence id. č. 71 - cDNA sekvence odpovídající NIM podobné genomové sekvenci AtNMLc4-2 z Arabídopsis thaliana (sekvence id. č. 19).

Sekvence id. č. 72 - Proteinová sekvence kódovaná sekvencí id. č. 71.

Sekvence id. č. 73 - Kompletní cDNA sekvence homologu NIMI z Nicotiana tabacum (tabák Β), která odpovídá PCR fragmentu ze sekvence id. č. 31.

Sekvence id. č. 74 - Proteinová sekvence homologu NIMI z Nicotiana tabacum kódovaná sekvencí id. č. 73.

ULOŽENÍ VZORKŮ

Dále uvedený biologický materiál byl uložen ve sbírce patentovaných kultur v Agricultural Research Service (NRRL),

1815 North University Street, Peoria, Illinois 61604, USA, podle Budapešťské smlouvy o ukládání mikroorganismů pro potřeby patentového řízení. Všechna omezení dostupnosti vzorků pro veřejnost budou zrušena po udělení patentu.

• ·

Klon Přístup. Číslo Datum uložení

pNOV1203	NRRL	B-30049	17.	Srpen	1998
pNOV1204	NRRL	B-30050	17.	Srpen	1998
pNOV1206	NRRL	B-30051	17.	Srpen	1998
AtNMLc5	NRRL	Β-3Ό139	25.	Květen	1999

SEZNAM CITOVANÝCH PUBLIKACÍ

Publikace v následujícím seznamu představují stav techniky. Každá z těchto publikací je formou odkazu plně zahrnuta v předkládané přihlášce.

U.S.	Patent	Č. 4,940,935
U.S.	Patent	Č. 4,945,050
U.S.	Patent	Č. 5,036,006
U.S.	Patent	Č. 5,100,792
U.S.	Patent	Č. 5,188,642
U.S.	Patent	Č. 5,523,311
U.S.	Patent	Č. 5,591,616
U.S.	Patent	Č. 5,614,395
U.S.	Patent	Č. 5,639,949
U.S.	Patent	Č. 5,792,904
EP 0	292 435
EP 0	332 104
EP 0	332 581
EP 0	342 926
EP 0	392 225
EP 0	452 269
Mezinárodní	PCT přihláška	WO	93/07278
Mezinárodní	PCT přihláška	WO	93/21335
Mezinárodní	PCT přihláška	WO	94/00977
Mezinárodní	PCT přihláška	WO	94/13822
Mezinárodní	PCT přihláška	WO	94/16077
Mezinárodní	PCT přihláška	WO	97/49822
Mezinárodní	PCT přihláška	WO	98/06748
Mezinárodní	PCT přihláška	WO	98/26082
Mezinárodní	PCT přihláška	WO	98/29537

Alexaer et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 90: 7327-7331 (1993)

Aoyama a Chua, The Plant Journal 11: 605-612 (1997)

Ausubel, F.M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, pub. by Greene Publishing Assoc. a Wiley-Interscience (1987)

Bartlett et al., In: Edelmann et al. (Eds.) Methods in Chloroplast Molecular Biology, Elsevier pp 1081-1091 (1982)

Bevan et al., Nátuře 304:184-187 (1983)

Bevan, Nud. Acids Res. (1984)

Bi et al., Plant J. 8: 235-245 (1995)

Binet et al. Plant Science 79: 87-94 (1991)

Blochinger & Diggelmann, Mol Cell. Biol. 4: 2929-2931

Bourouis et al. , EMBO J. 2(7.): 1099-1104 (1983)

Boutry et al., Nátuře 328:340-342 (1987)

Caddick et al., Nat. Biotechnol 16:177-180 (1998)

Callis et al., Gens Develop. 1: 1183-1200 (1987)

Cameron et al., Plant J. 5: 715-725 (1994)

Cao et al., Plant Cell 6, 1583-1592 (1994)

Cao et al., Cell 88: 57-63 (1997)

Casas et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 90: 11212-11216 (1993)

Century et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 92: 6597-6601 (1995)

Chibbar et al., Plant Cell Rep. 12: 506-509 (1993)

Chrispeels, Ann. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 42: 21-53 (1991)

Christou et al., Plant Physiol. 87:671-674 (1988)

Christou et al., Biotechnology 9: 957-962 (1991)

Christensen et al., Plant Molec. Biol. 12: 619-632 (1989)

Comai et al., J. Biol. Chem. 263: 15104-15109 (1988)

Crossway et al., BioTechniques 4:320-334 (1986)

Datta et al., Biotechnology 8: 736-740 (1990) de Framond, FEBS 290: 103-106 (1991)

Delaney et al., Science 266: 1247-1250 (1994)

Delaney et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 92: 6602-6606 (1995)

Dempsey a Klessig, Bulletin de L'Institut Pasteur 93: 167-186 (1995)

Dietrich et al., Cell 77: 565-577 (1994)

Firek et al., Plant Molec. Biol. 22: 129-142 (1993)

Fromm et al., Biotechnology 8: 833-839 (1990)

Gaffney et al., Science 261: 754-756 (1993)

Gallie et al., Nud. Acids Res. 15: 8693-8711 (1987)

Glazebrook et al., Gentics 143: 973-982 (1996)

Gordon-Kamm et al., Plant Cell 2: 603-618 (1990)

Gordon-Kamm et al, in Transgenic Plants, vol. 2., pp,21-33, pub. by Academie Press (1993)

Górlach et al., Plant Cell 8:629-643 (1996) • 44 «4 »· <1 14 ··

4 4 · » · · 4 4 · »· · · · * ·4 • 4 4 · 4 4 4 444444

9 4, · 4· 4»4 • 4 44 44 44»· (1990) (1988) (1989)

Greenberg et al., Cell 77: 551-563 (1994) Gritz et al., Gen 25: 179-188 (1983)

Hayashimoto et al., Plant Physiol. 93: 857-863

Hill et al., Euphytica 85:119-123 (1995)

Hinchee et al., Biotechnology 6:915-921 (1988)

Hofgen & Willmitzer, Nucl. Acids Res. 16: 9877

Hudspeth & Grula, Plant Molec. Biol 12: 579-589

Hunt a Ryals, Crit. Rev. in Plant Sci. 15: 583-606 (1996)

Innis et al., PCR Protocols, a Guide to Methods a Applications eds., Academie Press (1990)

Ishida et al., Nátuře Biotechnology 14: 745-750 (1996)

Jahne et al., Theor. Appl. Gent. 89: 525-533 (1994)

Keegan et al., Science 231: 699-704 (1986)

Keogh

Klein

Klein

Klein

Klein

Koziel et al.,

Koziel et al.,

792:164-171

Lawton et al., resistance

B. Fritig

et	al.,	Trans. Br. Mycol.	Soc. 74	: 329-333	(1980)
et	al. ,	Nátuře 327: 70-73	(1987)
et	al. ,	Proč. Nati. Acad.	Sci. USA 85:4305	-4309 (1988)
et	al.,	Bio/Technology 6:	559-563	(1988)
et	al.,	Plant Physiol. 91	:440-444	(1988)

194-200 (1993)

New York biology

Academy of Sciences of systemic aquired Responses in Plants, M. Legra, eds (Dordrecht, The Netherlas:

Biotechnology 11: Annals of the (1996)

The molecular in Mechanisms of Defence a

Kluwer Academie Publishers), pp. 422-432 (1993) Lawton et al., Plant J. 10: 71-82 (1996) Logemann et al., Plant Cell 1: 151-158 (1989) Maher et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 91: 7802-7806 Mauch-Mani a Slusarenko, Mol. Plant-Microbe Interact.

383 (1994)

Mauch-Mani a Slusarenko, Plant Cell 8: 203-212 (1996) Mayo O., The Theory of Plant Breeding, Second

Clarendon Press, Oxford (1987)

Mazur et al., Plant Physiol. 85: 1110 (1987) McBride et al., Plant Molecular Biology 14: 266-276 (1990) McCabe et al., Biotechnology 6:923-926 (1988) McElroy et al., Plant Cell 2: 163-171 (1990) McElroy et al., Mol. Gen. Gent. 231: 150-160 (1991) Messing & Vierra, Gen 19: 259-268 (1982)

Murashiga & Skoog, Physiologia Plantarum 15: 473-497 (1962)

Nehra et al., The Plant Journal 5: 285-297 (1994)

Neuhaus et al., Proč. Nati. Acad.

(1991)

Norris et al., Plant Mol. Biol. 21:

Pallas et al., Plant J. 10: 281-293 (1994)

7: 378Edition,

Sci. USA 88: 10362-10366

895-906 (1993) (1996)

<··	• 4		*<·	44	•
•	♦	•	• 4	•	4	4	4	··
•	•	···	• ·	•	4	4	4	•
•	•	• ·	• · ·	···	4 4	4	4
4 · *·	• ·	• · ··	•	4 4	4 444

Parker et al., Plant Cell 8: 2033-2046 (1996)

Paszkowski et al., EMBO J. 3: 2717-2722 (1984)

Payne et al., Plant Mol. Biol. 11:89-94 (1988)

Picard et al. , Cell 54: 1073-1080 (1988)

Potrykus et al., Mol. Gen. Gent. 199: 169-177 (1985)

Reich et al., Biotechnology 4: 1001-1004 (1986)

Riggs et al, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 83:5602-5606 (1986)

Rogers et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 82: 6512-6516 (1985) Rohrmeier & Lehle, Plant Molec. Biol. 22: 783-792 (1993) Rothstein et al., Gen 53: 153-161 (1987)

Ryals et al., Plant Cell 8: 1809-1819 (1996)

Ryals et al., Plant Cell 9: 425-439 (1997)

Sambrook et al. , Molecular Cloning, eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)

Sanford et al., Particulate Science a Technology 5:27-37 (1987) Schmidhauser & Helinski, J. Bacteriol. 164: 446-455 (1985) Schocher et al., Biotechnology 4: 1093-1096 (1986)

Shimamoto et al., Nátuře 338: 274-277 (1989)

Shinshi et al., Plant Molec. Biol. 14: 357-368 (1990)

Shulaev et al. , Plant Cell 7: 1691-1701 (1995)

Šilhavý, et al. , Experimente with Gen Fusions, eds., Cold

Spring Harbor Laboratory Press (1984)

Singh, D.P., Breeding for Resistance to Diseases a Insect Pests, Springer-Verlag, NY (1986)

Skuzeski et al., Plant Molec. Biol. 15: 65-79 (1990)

Somers et al., Bio/Technology 10: 1589-1594 (1992)

Spencer et al., Theor. Appl. Gent. 79: 625-631 (1990)

Stanford et al., Mol. Gen. Gent. 215: 200-208 (1989)

Svab et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 87:8526-8530 (1990)

Taylor et al., Plant Cell Rep. 12: 491-495 (1993)

Thompson et al. EMBO J. 6: 2519-2523 (1987)

Torbert et al., Plant Cell Reports 14: 635-640 (1995) Triezenberg et al., Gens Devel. 2: 718-729 (1988)

Uknes et al., Plant Cell 4: 645-656 (1992)

Uknes et al. Plant Cell 5: 159-169 (1993)

Uknes et al., Molecular Plant Microbe Interactions 6: 680-685 (1993)

Uknes et al., Mol. Plant-Microbe Interact. 6: 692-698 (1993)

Umbeck et al., Bio/Technology 5: 263-266 (1987)

Unger et al., Plant Molec. Biol. 13: 411-418 (1989) van den Broeck, et al., Nátuře 313: 358-363 (1985)

Vasil et al., Biotechnology 10: 667-674 (1992)

Vasil et al., Biotechnology 11: 1553-1558 (1993)

Vernooij et al., Plant Cell 6: 959-965 (1994)

Vernooij et al., Mol. Plant-Microbe Interact. 8: 228-234 (1995) • · • «

Von Heijne et al., Plant Mol. Biol. Rep. 9:104-126 (1991) Vorst et al., Gen 65: 59 (1988)

Wan et al., Plant Physiol. 104: 37-48 (1994)

Ward et al., Plant Cell 3: 1085-1094 (1991)

Warner et al., Plant J. 3:

Wasmann et al., Mol. Gen. Gent. 205: 446-453 (1986)

Weeks et al., Plant Physiol. 102: 1077-1084 (1993) Weissinger et al., Annual Rev. Gent. 22:421-477 (1988) Welsh J. R.,

191-201 (1993)

Fundamentals of Plant Gentics a Breeding, John Wiley & Sons, NY (1981)

Weymann et al., Plant Cell 7: 2013-2022 (1995)

White et al., Nucl. Acids Res. 18: 1062 (1990) Wood D. R. (Ed.) Crop Breeding,

Madison, Wisconsin (1983) Wricke a Weber, Quantitative

Breeding, Walter de Gruyter

Xu et al., Plant Molec. Biol. 22: 573-588 (1993)

Zhang et al., Plant Cell Rep. 7: 379-384 (1988)

Američan Society of Agronomy

Gentics a Selection Plant a Co., Berlin (1986)

• · · · ·

SEZNAM SEKVENCÍ <160> 74 <170> Patentln Ver. 2,1 <210> 1 <211> 1767 <212> DNA <213> Nicotiana tabacum <220>

<221> CDS <222> (1) .. (1764) <223> cDNA sekvence plné délky, tabák <400> 1

atg gat

aat Asn

agt Ser

agg Arg 5

act gcg ttt

tet gat Ser Asp 10

tcg aat Ser Asn

gac atc

agc gga

48

Met 1

Asp

Thr

Ala Phe

Asp

Ile

Ser 15

Gly

agc

agt

agt

ata

tgc

tgc

atc

ggc

ggc

ggc

atg

act

gaa

ttt

ttc

tcg

96

Ser

Ser

Ser

Ile

Cys

Cys

Ile

Gly

Gly

Gly

Met

Thr

Glu

Phe

Phe

Ser

20

25

30

ccg

gag

act

tcg

ccg

gcg

gag

atc

act

tea

ctg

aaa

ege

cta

tcg

gaa

144

Pro

Glu

Thr

Ser

Pro

Ala

Glu

Ile

Thr

Ser

Leu

Lys

Arg

Leu

Ser

Glu

35

40

45

aca

ctg

gaa

tet

atc

ttc

gat

gcg

tet

ttg

ccg

gag

ttt

gac

tac

ttc

192

Thr

Leu

Glu

Ser

Ile

Phe

Asp

Ala

Ser

Leu

Pro

Glu

Phe

Asp

Tyr

Phe

50

55

60

gcc

gac

gct

aag

ctt

gtg

gtt

tcc

ggc

ccg

tgt

aag

gaa

att

ccg

gtg

240

Ala

Asp

Ala

Lys

Leu

Val

Val

Ser

Gly

Pro

Cys

Lys

Glu

Ile

Pro

Val

65

70

75

80

cac

cgg

tgc

att

ttg

tcg

gcg

agg

agt

ccg

ttc

ttt

aag

aat

ttg

ttc

288

His

Arg

Cys

Ile

Leu

Ser

Ala

Arg

Ser

Pro

Phe

Phe

Lys

Asn

Leu

Phe

85

90

95

tgc

ggt

aaa

aag

gag

aag

aat

agt

agt

aag

gtg

gaa

ttg

aag

gag

gtg

336

Cys

Gly

Lys

Lys

Glu

Lys

Asn

Ser

Ser

Lys

Val

Glu

Leu

Lys

Glu

Val

100

105

110

atg

aaa

gag

cat

gag

gtg

agc

tat

gat

gct

gta

atg

agt

gta

ttg

gct

384

Met

Lys

Glu

His

Glu

Val

Ser

Tyr

Asp

Ala

Val

Met

Ser

Val

Leu

Ala

115

120

125

tat

ttg

tat

agt

ggt

aaa

gtt

agg

cct

tea

cct

aaa

gat

gtg

tgt

gtt

432

Tyr

Leu

Tyr

Ser

Gly

Lys

Val

Arg

Pro

Ser

Pro

Lys

Asp

Val

Cys

Val

130

135

140

tgt gtg gac

aat gac Asn Asp

tgc Cys 150

tet Ser

cat gtg gct His Val Ala

tgt agg cca

gct gtg

gca Ala 160

480

Cys 145

Val Asp

Cys 155

Arg

Pro

Ala

Val

ttc

ctg

gtt

gag

gtt

ttg

tac

aca

tea

ttt

acc

ttt

cag

atc

tet

gaa

528

Phe

Leu

Val

Glu

Val

Leu

Tyr

Thr

Ser

Phe

Thr

Phe

Gin

Ile

Ser

Glu

165

170

175

ttg

gtt

gac

aag

ttt

cag

aga

cac

cta

ctg

gat

att

ctt

gac

aaa

act

576

Leu

Val

Asp

Lys

Phe

Gin

Arg

His

Leu

Leu

Asp

Ile

Leu

Asp

Lys

Thr

180

185

190

gca

gca

gac

gat

gta

atg

atg

gtt

tta

tet

gtt

gca

aac

att

tgt

ggt

624

Ala

Ala

Asp

Asp

Val

Met

Met

Val

Leu

Ser

Val

Ala

Asn

Ile

Cys

Gly

195

200

205

aaa

gca

tgc

gag

aga

ttg

ctt

tea

agc

tgc

att

gag

att

att

gtc

aag

672

Lys

Ala

Cys

Glu

Arg

Leu

Leu

Ser

Ser

Cys

Ile

Glu

Ile

Ile

Val

Lys

210

215

220

tet

aat

gtt

gat

atc

ata

acc

ctt

gat

aaa

gcc

ttg

cct

cat

gac

att

720

Ser

Asn

Val

Asp

Ile

Ile

Thr

Leu

Asp

Lys

Ala

Leu

Pro

His

Asp

Ile

225

230

235

240

gta

aaa

caa

att

act

gat

tea

ega

gcg

gaa

ctt

ggt

cta

caa

ggg

cct

768

Val

Lys

Gin

Ile

Thr

Asp

Ser

Arg

Ala

Glu

Leu

Gly

Leu

Gin

Gly

Pro

245

250

255

gaa

agc

aac

ggt

ttt

cct

gat

aaa

cat

gtt

aag

agg

ata

cat

agg

gca

816

Glu

Ser

Asn

Gly

Phe

Pro

Asp

Lys

His

Val

Lys

Arg

Ile

His

Arg

Ala

260

265

270

ttg

gat

tet

gat

gat

gtt

gaa

tta

cta

caa

atg

ttg

cta

aga

gag

ggg

864

Leu

Asp

Ser

Asp

Asp

Val

Glu

Leu

Leu

Gin

Met

Leu

Leu

Arg

Glu

Gly

275

280

285

cat

act

acc

cta

gat

gat

gca

tat

gct

ctc

cat

tat

gct

gta

gcg

tat

912

His

Thr

Thr

Leu

Asp

Asp

Ala

Tyr

Ala

Leu

His

Tyr

Ala

Val

Ala

Tyr

290

295

300

tgc

gat

gca

aag

act

aca

gca

gaa

ctt

cta

gat

ctt

gca

ctt

gct

gat

960

Cys

Asp

Ala

Lys

Thr

Thr

Ala

Glu

Leu

Leu

Asp

Leu

Ala

Leu

Ala

Asp

305

310

315

320

att

aat

cat

caa

aat

tea

agg

gga

tac

acg

gtg

ctg

cat

gtt

gca

gcc

1008

Ile

Asn

His

Gin

Asn

Ser

Arg

Gly

Tyr

Thr

Val

Leu

His

Val

Ala

Ala

325

330

335

atg

agg

aaa

gag

cct

aaa

att

gta

gtg

tcc

ctt

tta

acc

aaa

gga

gct

1056

Met

Arg

Lys

Glu

Pro

Lys

Ile

Val

Val

Ser

Leu

Leu

Thr

Lys

Gly

Ala

340

345

350

« · • ·

aga cct

tet gat Ser Asp 355

ctg aca tcc

gat gga aga

aaa gca ctt

caa Gin

atc Ile

gcc Ala

1104

Arg

Pro

Leu

Thr Ser

Asp Gly 360

Arg

Lys

Ala

Leu 365

aag

agg

ctc

act

agg

ctt

gtg

gat

ttc

agt

aag

tet

ccg

gag

gaa

gga

1152

Lys

Arg

Leu

Thr

Arg

Leu

Val

Asp

Phe

Ser

Lys

Ser

Pro

Glu

Glu

Gly

370

375

380

aaa

tet

gct

tcg

aat

gat

cgg

tta

tgc

att

gag

att

ctg

gag

caa

gca

1200

Lys

Ser

Ala

Ser

Asn

Asp

Arg

Leu

Cys

Ile

Glu

Ile

Leu

Glu

Gin

Ala

385

390

395

400

gaa

aga

aga

gac

cct

ctg

cta

gga

gaa

gct

tet

gta

tet

ctt

gct

atg

1248

Glu

Arg

Arg

Asp

Pro

Leu

Leu

Gly

Glu

Ala

Ser

Val

Ser

Leu

Ala

Met

405

410

415

gca

ggc

gat

gat

ttg

cgt

atg

aag

ctg

tta

tac

ctt

gaa

aat

aga

gtt

1296

Ala

Gly

Asp

Asp

Leu

Arg

Met

Lys

Leu

Leu

Tyr

Leu

Glu

Asn

Arg

Val

420

425

430

ggc

ctg

gct

aaa

ctc

ctt

ttt

cca

atg

gaa

gct

aaa

gtt

gca

atg

gac

1344

Gly

Leu

Ala

Lys

Leu

Leu

Phe

Pro

Met

Glu

Ala

Lys

Val

Ala

Met

Asp

435

440

445

att

gct

caa

gtt

gat

ggc

act

tet

gag

ttc

cca

ctg

gct

age

atc

ggc

1392

Ile

Ala

Gin

Val

Asp

Gly

Thr

Ser

Glu

Phe

Pro

Leu

Ala

Ser

Ile

Gly

450

455

460

aaa

aag

atg

gct

aat

gca

cag

agg

aca

aca

gta

gat

ttg

aac

gag

gct

1440

Lys

Lys

Met

Ala

Asn

Ala

Gin

Arg

Thr

Thr

Val

Asp

Leu

Asn

Glu

Ala

465

470

475

480

cct

ttc

aag

ata

aaa

gag

gag

cac

ttg

aat

cgg

ctt

aga

gca

ctc

tet

1488

Pro

Phe

Lys

Ile

Lys

Glu

Glu

His

Leu

Asn

Arg

Leu

Arg

Ala

Leu

Ser

485

490

495

aga

act

gta

gaa

ctt

gga

aaa

ege

ttc

ttt

cca

cgt

tgt

tca

gaa

gtt

1536

Arg

Thr

Val

Glu

Leu

Gly

Lys

Arg

Phe

Phe

Pro

Arg

Cys

Ser

Glu

Val

500

505

510

cta

aat

aag

atc

atg

gat

gct

gat

gac

ttg

tet

gag

ata

gct

tac

atg

1584

Leu

Asn

Lys

Ile

Met

Asp

Ala

Asp

Asp

Leu

Ser

Glu

Ile

Ala

Tyr

Met

515

520

525

ggg

aat

gat

acg

gca

gaa

gag

cgt

caa

ctg

aag

aag

caa

agg

tac

atg

1632

Gly

Asn

Asp

Thr

Ala

Glu

Glu

Arg

Gin

Leu

Lys

Lys

Gin

Arg

Tyr

Met

530

535

540

gaa

ctt

caa

gaa

att

ctg

act

aaa

gca

ttc

act

gag

gat

aaa

gaa

gaa

1680

Glu

Leu

Gin

Glu

Ile

Leu

Thr

Lys

Ala

Phe

Thr

Glu

Asp

Lys

Glu

Glu

545

550

555

560

• · · • · · · ·

tat Tyr

gat Asp

aag Lys

act Thr

aac Asn 565

aac Asn

atc Ile

tcc Ser

tca Ser

tet Ser 570

tgt Cys

tcc Ser

tet Ser

aca Thr

tet Ser 575

aag Lys

1728

gga

gta

gat

aag

ccc

aat

aag

ctc

cct

ttt

agg

aaa

tag

1767

Gly

Val

Asp

Lys

Pro

Asn

Lys

Leu

Pro

Phe

Arg

Lys

580 585 <210> 2 <211> 588 <212> PRT <213> Nicotiana tabacum

<400> 2

Arg 5

Thr

Ala Phe

Ser

Asp 10

Ser

Asn

Asp

Ile

Ser Gly 15

Met 1

Asp

Asn Ser

Ser

Ser

Ser

Ile

Cys

Cys

Ile

Gly

Gly

Gly

Met

Thr

Glu

Phe

Phe

Ser

20

25

30

Pro

Glu

Thr

Ser

Pro

Ala

Glu

Ile

Thr

Ser

Leu

Lys

Arg

Leu

Ser

Glu

35

40

45

Thr

Leu

Glu

Ser

Ile

Phe

Asp

Ala

Ser

Leu

Pro

Glu

Phe

Asp

Tyr

Phe

50

55

60

Ala

Asp

Ala

Lys

Leu

Val

Val

Ser

Gly

Pro

Cys

Lys

Glu

Ile

Pro

Val

65

70

75

80

His

Arg

Cys

Ile

Leu

Ser

Ala

Arg

Ser

Pro

Phe

Phe

Lys

Asn

Leu

Phe

85

90

95

Cys

Gly

Lys

Lys

Glu

Lys

Asn

Ser

Ser

Lys

Val

Glu

Leu

Lys

Glu

Val

100

105

110

Met

Lys

Glu

His

Glu

Val

Ser

Tyr

Asp

Ala

Val

Met

Ser

Val

Leu

Ala

115

120

125

Tyr

Leu

Tyr

Ser

Gly

Lys

Val

Arg

Pro

Ser

Pro

Lys

Asp

Val

Cys

Val

130

135

140

Cys

Val

Asp

Asn

Asp

Cys

Ser

His

Val

Ala

Cys

Arg

Pro

Ala

Val

Ala

145

150

155

160

Phe

Leu

Val

Glu

Val

Leu

Tyr

Thr

Ser

Phe

Thr

Phe

Gin

Ile

Ser

Glu

165

170

175

Leu

Val

Asp

Lys

Phe

Gin

Arg

His

Leu

Leu

Asp

Ile

Leu

Asp

Lys

Thr

180

185

190

Ala

Ala

Asp

Asp

Val

Met

Met

Val

Leu

Ser

Val

Ala

Asn

Ile

Cys

Gly

195

200

205

φ φ φ φ · · φ «·· • φ φ · · · · φ · φ φ • ·· «φφ φ φ φ φ · · φ

Lys Ala

Cys

Glu Arg Leu

Leu 215

Ser Ser

Cys

Ile Glu 220

Ile

Ile

Val

Lys

210

Ser

Asn

Val

Asp

Ile

Ile

Thr

Leu

Asp

Lys

Ala

Leu

Pro

His

Asp

Ile

225

230

235

240

Val

Lys

Gin

Ile

Thr

Asp

Ser

Arg

Ala

Glu

Leu

Gly

Leu

Gin

Gly

Pro

245

250

255

Glu

Ser

Asn

Gly

Phe

Pro

Asp

Lys

His

Val

Lys

Arg

Ile

His

Arg

Ala

260

265

270

Leu

Asp

Ser

Asp

Asp

Val

Glu

Leu

Leu

Gin

Met

Leu

Leu

Arg

Glu

Gly

275

280

285

His

Thr

Thr

Leu

Asp

Asp

Ala

Tyr

Ala

Leu

His

Tyr

Ala

Val

Ala

Tyr

290

295

300

Cys

Asp

Ala

Lys

Thr

Thr

Ala

Glu

Leu

Leu

Asp

Leu

Ala

Leu

Ala

Asp

305

310

315

320

Ile

Asn

His

Gin

Asn

Ser

Arg

Gly

Tyr

Thr

Val

Leu

His

Val

Ala

Ala

325

330

335

Met

Arg

Lys

Glu

Pro

Lys

Ile

Val

Val

Ser

Leu

Leu

Thr

Lys

Gly

Ala

340

345

350

Arg

Pro

Ser

Asp

Leu

Thr

Ser

Asp

Giy

Arg

Lys

Ala

Leu

Gin

Ile

Ala

355

360

365

Lys

Arg

Leu

Thr

Arg

Leu

Val

Asp

Phe

Ser

Lys

Ser

Pro

Glu

Glu

Gly

370

375

380

Lys

Ser

Ala

Ser

Asn

Asp

Arg

Leu

Cys

Ile

Glu

Ile

Leu

Glu

Gin

Ala

385

390

395

400

Glu

Arg

Arg

Asp

Pro

Leu

Leu

Gly

Glu

Ala

Ser

Val

Ser

Leu

Ala

Met

405

410

415

Ala

Gly

Asp

Asp

Leu

Arg

Met

Lys

Leu

Leu

Tyr

Leu

Glu

Asn

Arg

Val

420

425

430

Gly

Leu

Ala

Lys

Leu

Leu

Phe

Pro

Met

Glu

Ala

Lys

Val

Ala

Met

Asp

435

440

445

Ile

Ala

Gin

Val

Asp

Gly

Thr

Ser

Glu

Phe

Pro

Leu

Ala

Ser

Ile

Gly

450

455

460

Lys

Lys

Met

Ala

Asn

Ala

Gin

Arg

Thr

Thr

Val

Asp

Leu

Asn

Glu

Ala

465

470

475

480

Pro

Phe

Lys

Ile

Lys

Glu

Glu

His

Leu

Asn

Arg

Leu

Arg

Ala

Leu

Ser

485

490

495

• Φ

Φ Φ • 9

Φ Φ Φ Φ

Arg

Thr Val

Glu 500

Leu Gly

Lys Arg

Phe 505

Phe

Pro

Arg

Cys

Ser 510

Glu

Val

Leu

Asn

Lys

Ile

Met

Asp

Ala

Asp

Asp

Leu

Ser

Glu

Ile

Ala

Tyr

Met

515

520

525

Gly

Asn

Asp

Thr

Ala

Glu

Glu

Arg

Gin

Leu

Lys

Lys

Gin

Arg

Tyr

Met

530

535

540

Glu

Leu

Gin

Glu

Ile

Leu

Thr

Lys

Ala

Phe

Thr

Glu

Asp

Lys

Glu

Glu

545

550

555

560

Tyr

Asp

Lys

Thr

Asn

Asn

Ile

Ser

Ser

Ser

Cys

Ser

Ser

Thr

Ser

Lys

565

570

575

Gly

Val

Asp

Lys

Pro

Asn

Lys

Leu

Pro

Phe

Arg

Lys

580

585

<210> 3 <211> 1731 <212> DNA <213> bycopersicon esculentum <220>

<221> CDS <222> (1) . . (1728) <223> cDNA sekvence plné délky, rajče <400> 3

atg Met 1

gat Asp

agt Ser

aga Arg

act Thr 5

gct Ala

ttt Phe

tcg gat Ser Asp

tcc Ser 10

aat gat Asn Asp

att Ile

agt gga Ser Gly 15

agc Ser

48

agt

agt

ata

tgc

tgc

atg

aac

gaa

tcg

gaa

act

tea

ctg

gca

gac

gtc

96

Ser

Ser

Ile

Cys

Cys

Met

Asn

Glu

Ser

Glu

Thr

Ser

Leu

Ala

Asp

Val

20

25

30

aat

tcc

ctc

aaa

cgt

cta

tea

gaa

aca

cta

gag

tet

atc

ttc

gat

gcg

144

Asn

Ser

Leu

Lys

Arg

Leu

Ser

Glu

Thr

Leu

Glu

Ser

Ile

Phe

Asp

Ala

35

40

45

tet

gcg

ccg

gat

ttc

gac

ttc

ttc

gct

gat

gct

aag

ctt

ctg

gct

cca

192

Ser

Ala

Pro

Asp

Phe

Asp

Phe

Phe

Ala

Asp

Ala

Lys

Leu

Leu

Ala

Pro

50

55

60

ggc

ggt

aag

gaa

att

ccg

gtg

cat

cgg

tgc

att

ttg

tcg

gcg

agg

agt

240

Gly

Gly

Lys

Glu

Ile

Pro

Val

His

Arg

Cys

Ile

Leu

Ser

Ala

Arg

Ser

65

70

75

80

cct

ttt

ttt

aag

aat

gta

ttc

tgt

ggg

aaa

gat

agc

agc

acg

aag

ctg

288

Pro

Phe

Phe

Lys

Asn

Val

Phe

Cys

Gly

Lys

Asp

Ser

Ser

Thr

Lys

Leu

85

90

95

gaa ctc aaa gag

ctg atg aaa gag tat gag gtg

agt Ser

ttt Phe

gat Asp 110

gcc Ala

gtg Val

336

Glu

Leu

Lys

Glu 100

Leu

Met Lys

Glu

Tyr 105

Glu

Val

gtc

agt

gtg

ctc

gcc

tat

ttg

tat

agt

gga

aaa

gtt

agg

cct

gca

tet

384

Val

Ser

Val

Leu

Ala

Tyr

Leu

Tyr

Ser

Gly

Lys

Val

Arg

Pro

Ala

Ser

115

120

125

aaa

gat

gtg

tgt

gtt

tgt

gtg

gac

aat

gag

tgc

ttg

cat

gta

gct

tgt

432

Lys

Asp

Val

Cys

Val

Cys

Val

Asp

Asn

Glu

Cys

Leu

His

Val

Ala

Cys

130

135

140

agg

cca

gct

gtg

gcc

ttc

atg

gtt

cag

gtt

ttg

tac

gca

tcc

ttt

acc

480

Arg

Pro

Ala

Val

Ala

Phe

Met

Val

Gin

Val

Leu

Tyr

Ala

Ser

Phe

Thr

145

150

155

160

ttt

cag

atc

tet

caa

ttg

gtc

gac

aag

ttt

cag

aga

cac

cta

ttg

gat

528

Phe

Gin

Ile

Ser

Gin

Leu

Val

Asp

Lys

Phe

Gin

Arg

His

Leu

Leu

Asp

165

170

175

att

ctt

gac

aaa

gct

gta

gca

gat

gat

gta

atg

atg

gtt

tta

tcc

gtt

576

Ile

Leu

Asp

Lys

Ala

Val

Ala

Asp

Asp

Val

Met

Met

Val

Leu

Ser

Val

180

185

190

gca

aac

att

tgc

ggt

aaa

gca

tgt

gaa

aga

tta

ctt

tca

aga

tgc

att

624

Ala

Asn

Ile

Cys

Gly

Lys

Ala

Cys

Glu

Arg

Leu

Leu

Ser

Arg

Cys

Ile

195

200

205

gat

att

att

gtc

aag

tet

aat

gtt

gat

atc

ata

acc

ctt

gat

aag

tcc

672

Asp

Ile

Ile

Val

Lys

Ser

Asn

Val

Asp

Ile

Ile

Thr

Leu

Asp

Lys

Ser

210

215

220

ttg

cct

cat

gac

att

gta

aaa

caa

atc

act

gat

tca

cgt

gct

gaa

ctt

720

Leu

Pro

His

Asp

Ile

Val

Lys

Gin

Ile

Thr

Asp

Ser

Arg

Ala

Glu

Leu

225

230

235

240

ggt

ctg

caa

ggg

cct

gaa

agc

aat

ggt

ttt

cct

gat

aaa

cat

gtt

aag

768

Gly

Leu

Gin

Gly

Pro

Glu

Ser

Asn

Gly

Phe

Pro

Asp

Lys

His

Val

Lys

245

250

255

agg

ata

cat

aga

gca

ttg

gac

tet

gat

gat

gtt

gaa

tta

cta

agg

atg

816

Arg

Ile

His

Arg

Ala

Leu

Asp

Ser

Asp

Asp

Val

Glu

Leu

Leu

Arg

Met

260

265

270

ttg

ctt

aaa

gag

ggg

cat

act

act

ctt

gat

gat

gca

tat

gct

ctc

cac

864

Leu

Leu

Lys

Glu

Gly

His

Thr

Thr

Leu

Asp

Asp

Ala

Tyr

Ala

Leu

His

275

280

285

tat

gct

gta

gca

tat

tgc

gat

gca

aag

act

aca

gca

gaa

ctt

tta

gat

912

Tyr

Ala

Val

Ala

Tyr

Cys

Asp

Ala

Lys

Thr

Thr

Ala

Glu

Leu

Leu

Asp

290

295

300

φφφφ

ctt Leu 305

tea Ser

ctt Leu

get Ala

gat Asp

gtt Val 310

aat Asn

cat His

caa Gin

aat Asn

cct Pro 315

aga Arg

gga Gly

cac His

acg Thr

gta Val 320

960

ctt

cat

gtt

get

gcc

atg

agg

aaa

gaa

cct

aaa

att

ata

gtg

tcc

ctt

1008

Leu

His

Val

Ala

Ala

Met

Arg

Lys

Glu

Pro

Lys

Ile

Ile

Val

Ser

Leu

325

330

335

tta

acc

aaa

gga

get

aga

cct

tet

gat

ctg

aca

tcc

gat

ggc

aaa

aaa

1056

Leu

Thr

Lys

Gly

Ala

Arg

Pro

Ser

Asp

Leu

Thr

Ser

Asp

Gly

Lys

Lys

340

345

350

gca

ctt

caa

att

get

aag

agg

ctc

act

agg

ctt

gta

gat

ttt

acc

aag

1104

Ala

Leu

Gin

Ile

Ala

Lys

Arg

Leu

Thr

Arg

Leu

Val

Asp

Phe

Thr

Lys

355

360

365

tet

aca

gag

gaa

gga

aaa

tet

get

cca

aag

gat

cgg

tta

tgc

att

gag

1152

Ser

Thr

Glu

Glu

Gly

Lys

Ser

Ala

Pro

Lys

Asp

Arg

Leu

Cys

Ile

Glu

370

375

380

att

ctg

gag

caa

gca

gaa

aga

aga

gat

cca

cta

cta

gga

gaa

get

tea

1200

Ile

Leu

Glu

Gin

Ala

Glu

Arg

Arg

Asp

Pro

Leu

Leu

Gly

Glu

Ala

Ser

385

390

395

400

tta

tet

ctt

get

atg

gca

ggc

gat

gat

ttg

cgt

atg

aag

ctg

tta

tac

1248

Leu

Ser

Leu

Ala

Met

Ala

Gly

Asp

Asp

Leu

Arg

Met

Lys

Leu

Leu

Tyr

405

410

415

ctt

gaa

aat

aga

gtt

ggt

ctg

get

aaa

ctc

ctt

ttt

ccc

atg

gaa

gca

1296

Leu

Glu

Asn

Arg

Val

Gly

Leu

Ala

Lys

Leu

Leu

Phe

Pro

Met

Glu

Ala

420

425

430

aaa

gtt

gca

atg

gac

att

gca

caa

gtt

gat

ggc

acg

tet

gaa

tta

ccc

1344

Lys

Val

Ala

Met

Asp

Ile

Ala

Gin

Val

Asp

Gly

Thr

Ser

Glu

Leu

Pro

435

440

445

ctg

get

agc

atg

agg

aag

aag

ata

get

gat

gca

cag

agg

aca

aca

gtg

1392

Leu

Ala

Ser

Met

Arg

Lys

Lys

Ile

Ala

Asp

Ala

Gin

Arg

Thr

Thr

Val

450

455

460

gat

ttg

aac

gag

get

cct

ttc

aag

atg

aaa

gag

gag

cac

ttg

aat

cgg

1440

Asp

Leu

Asn

Glu

Ala

Pro

Phe

Lys

Met

Lys

Glu

Glu

His

Leu

Asn

Arg

465

470

475

480

ctt

agg

get

ctc

tet

aga

act

gtg

gaa

ctt

gga

aaa

cgg

ttc

ttt

cca

1488

Leu

Arg

Ala

Leu

Ser

Arg

Thr

Val

Glu

Leu

Gly

Lys

Arg

Phe

Phe

Pro

485

490

495

cgt

tgt

tea

gaa

gtt

cta

aat

aag

atc

atg

gat

get

gat

gac

ttg

tet

1536

Arg

Cys

Ser

Glu

Val

Leu

Asn

Lys

Ile

Met

Asp

Ala

Asp

Asp

Leu

Ser

500

505

510

gag ata

get Ala 515

tac Tyr

atg Met

ggg aat

gat Asp 520

aca gta

gaa gag cgt

caa Gin

ctg aag

1584

Glu

Ile

Gly

Asn

Thr

Val

Glu

Glu

Arg 525

Leu

Lys

aag

caa

agg

tac

atg

gaa

ctt

caa

gaa

att

ttg

tet

aaa

gca

ttc

acg

1632

Lys

Gin

Arg

Tyr

Met

Glu

Leu

Gin

Glu

Ile

Leu

Ser

Lys

Ala

Phe

Thr

530

535

540

gag

gat

aaa

gaa

gaa

ttt

get

aag

act

aac

atg

tec

tea

tet

tgt

tcc

1680

Glu

Asp

Lys

Glu

Glu

Phe

Ala

Lys

Thr

Asn

Met

Ser

Ser

Ser

Cys

Ser

545

550

555

560

tet

aca

tet

aag

gga

gta

gat

aag

ccc

aat

aat

ctc

cca

ttt

agg

aaa

1728

Ser

Thr

Ser

Lys

Gly

Val

Asp

Lys

Pro

Asn

Asn

Leu

Pro

Phe

Arg

Lys

565

570

575

tag

1731 <210> 4 <211> 576 <212> PRT <213> Lycopersicon esculentum

<400> 4

Ser Asp Ser Asn Asp 10

Ile

Ser

Gly 15

Ser

Met 1

Asp

Ser

Arg

Thr 5

Ala

Phe

Ser

Ser

Ile

Cys

Cys

Met

Asn

Glu

Ser

Glu

Thr

Ser

Leu

Ala

Asp

Val

20

25

30

Asn

Ser

Leu

Lys

Arg

Leu

Ser

Glu

Thr

Leu

Glu

Ser

Ile

Phe

Asp

Ala

35

40

45

Ser

Ala

Pro

Asp

Phe

Asp

Phe

Phe

Ala

Asp

Ala

Lys

Leu

Leu

Ala

Pro

50

55

60

Gly

Gly

Lys

Glu

Ile

Pro

Val

His

Arg

Cys

Ile

Leu

Ser

Ala

Arg

Ser

65

70

75

80

Pro

Phe

Phe

Lys

Asn

Val

Phe

Cys

Gly

Lys

Asp

Ser

Ser

Thr

Lys

Leu

85

90

95

Glu

Leu

Lys

Glu

Leu

Met

Lys

Glu

Tyr

Glu

Val

Ser

Phe

Asp

Ala

Val

100

105

110

Val

Ser

Val

Leu

Ala

Tyr

Leu

Tyr

Ser

Gly

Lys

Val

Arg

Pro

Ala

Ser

115

120

125

Lys

Asp

Val

Cys

Val

Cys

Val

Asp

Asn

Glu

Cys

Leu

His

Val

Ala

Cys

130

135

140

Arg

Pro

Ala

Val

Ala

Phe

Met

Val

Gin

Val

Leu

Tyr

Ala

Ser

Phe

Thr

145

150

155

160

Phe

Gin

Ile

Ser

Gin 165

Leu Val Asp Lys

Phe 170

Gin Arg

His

Leu

Leu 175

Asp

Ile

Leu

Asp

Lys

Ala

Val

Ala

Asp

Asp

Val

Met

Met

Val

Leu

Ser

Val

180

185

190

Ala

Asn

Ile

Cys

Gly

Lys

Ala

Cys

Glu

Arg

Leu

Leu

Ser

Arg

Cys

Ile

195

200

205

Asp

Ile

Ile

Val

Lys

Ser

Asn

Val

Asp

Ile

Ile

Thr

Leu

Asp

Lys

Ser

210

215

220

Leu

Pro

His

Asp

Ile

Val

Lys

Gin

Ile

Thr

Asp

Ser

Arg

Ala

Glu

Leu

225

230

235

240

Gly

Leu

Gin

Gly

Pro

Glu

Ser

Asn

Gly

Phe

Pro

Asp

Lys

His

Val

Lys

245

250

255

Arg

Ile

His

Arg

Ala

Leu

Asp

Ser

Asp

Asp

Val

Glu

Leu

Leu

Arg

Met

260

265

270

Leu

Leu

Lys

Glu

Gly

His

Thr

Thr

Leu

Asp

Asp

Ala

Tyr

Ala

Leu

His

275

280

285

Tyr

Ala

Val

Ala

Tyr

Cys

Asp

Ala

Lys

Thr

Thr

Ala

Glu

Leu

Leu

Asp

290

295

300

Leu

Ser

Leu

Ala

Asp

Val

Asn

His

Gin

Asn

Pro

Arg

Gly

His

Thr

Val

305

310

315

320

Leu

His

Val

Ala

Ala

Met

Arg

Lys

Glu

Pro

Lys

Ile

Ile

Val

Ser

Leu

325

330

335

Leu

Thr

Lys

Gly

Ala

Arg

Pro

Ser

Asp

Leu

Thr

Ser

Asp

Gly

Lys

Lys

340

345

350

Ala

Leu

Gin

Ile

Ala

Lys

Arg

Leu

Thr

Arg

Leu

Val

Asp

Phe

Thr

Lys

355

360

365

Ser

Thr

Glu

Glu

Gly

Lys

Ser

Ala

Pro

Lys

Asp

Arg

Leu

Cys

Ile

Glu

370

375

380

Ile

Leu

Glu

Gin

Ala

Glu

Arg

Arg

Asp

Pro

Leu

Leu

Gly

Glu

Ala

Ser

385

390

395

400

Leu

Ser

Leu

Ala

Met

Ala

Gly

Asp

Asp

Leu

Arg

Met

Lys

Leu

Leu

Tyr

405

410

415

Leu

Glu

Asn

Arg

Val

Gly

Leu

Ala

Lys

Leu

Leu

Phe

Pro

Met

Glu

Ala

420

425

430

Lys

Val

Ala

Met

Asp

Ile

Ala

Gin

Val

Asp

Gly

Thr

Ser

Glu

Leu

Pro

435

440

445

·

Leu Ala 450

Ser Met

Arg Lys

Lys 455

Ile Ala Asp

Ala Gin Arg 460

Thr

Thr

Val

Asp

Leu

Asn

Glu

Ala

Pro

Phe

Lys

Met

Lys

Glu

Glu

His

Leu

Asn

Arg

465

470

475

480

Leu

Arg

Ala

Leu

Ser

Arg

Thr

Val

Glu

Leu

Gly

Lys

Arg

Phe

Phe

Pro

485

490

495

Arg

Cys

Ser

Glu

Val

Leu

Asn

Lys

Ile

Met

Asp

Ala

Asp

Asp

Leu

Ser

500

505

510

Glu

Ile

Ala

Tyr

Met

Gly

Asn

Asp

Thr

Val

Glu

Glu

Arg

Gin

Leu

Lys

515

520

525

Lys

Gin

Arg

Tyr

Met

Glu

Leu

Gin

Glu

Ile

Leu

Ser

Lys

Ala

Phe

Thr

530

535

540

Glu

Asp

Lys

Glu

Glu

Phe

Ala

Lys

Thr

Asn

Met

Ser

Ser

Ser

Cys

Ser

545

550

555

560

Ser

Thr

Ser

Lys

Gly

Val

Asp

Lys

Pro

Asn

Asn

Leu

Pro

Phe

Arg

Lys

565

570

575

<210> 5 <211> 1740 <212> DNA <213> Brassica napus <220>

<221> CDS <222> (1) .. (1737) <223> cDNA sekvence z kanoly <400> 5

atg gag

acc Thr

att Ile

gct Ala 5

rga Xaa

ttt Phe

gat Asp

gat Asp

ttc Phe 10

tat Tyr

gag Glu

atc Ile

agc Ser

agc Ser 15

act Thr

48

Met 1

Glu

agc

ttc

cyc

gcc

gca

ccg

gcg

cca

acc

gat

aac

tcc

gga

tca

tcc

acc

96

Ser

Phe

Xaa

Ala

Ala

Pro

Ala

Pro

Thr

Asp

Asn

Ser

Gly

Ser

Ser

Thr

20

25

30

gtc

twc

ccg

acg

gag

ctt

ytc

acc

aga

ccc

gag

gta

tcc

gcg

ttt

caa

144

Val

Xaa

Pro

Thr

Glu

Leu

Xaa

Thr

Arg

Pro

Glu

Val

Ser

Ala

Phe

Gin

35

40

45

ctc

ctc

tcc

aac

agc

ctc

gag

tcc

gtc

ttc

gac

tcg

ccg

gaa

gcg

ttc

192

Leu

Leu

Ser

Asn

Ser

Leu

Glu

Ser

Val

Phe

Asp

Ser

Pro

Glu

Ala

Phe

50

55

60

• · ·· ·· ·· ·♦ • · · · · · · • · · ·· · * · · • · · · · · · · · · #····· · · · · ·· ·· ·· ·· ···

tac Tyr 65

agc gac gcc

aag ctt

gtt Val

ctc Leu

tcc gac

gac Asp 75

aag Lys

gaa gta

tcc Ser

ttc Phe 80

240

Ser Asp

Ala

Lys

Leu 70

Ser

Asp

Glu

Val

cac

cgt

tgc

att

ctc

tcg

gcg

aga

agc

ctc

ttc

ttc

aag

gcc

gct

ttg

288

His

Arg

Cys

Ile

Leu

Ser

Ala

Arg

Ser

Leu

Phe

Phe

Lys

Ala

Ala

Leu

85

90

95

rca

gcc

gcc

gag

aag

gtg

cag

aag

tcc

acc

ccc

gtg

aag

ctc

gag

ctg

336

Xaa

Ala

Ala

Glu

Lys

Val

Gin

Lys

Ser

Thr

Pro

Val

Lys

Leu

Glu

Leu

100

105

110

aag

aca

ctc

gcg

gcg

gaa

tac

gac

gtc

ggg

ttc

gat

tet

gtg

gtg

gct

384

Lys

Thr

Leu

Ala

Ala

Glu

Tyr

Asp

Val

Gly

Phe

Asp

Ser

Val

Val

Ala

115

120

125

gtt

ctg

gcg

tac

gtt

tac

agc

ggc

aga

gtg

agg

ccg

cct

ccg

aag

gga

432

Val

Leu

Ala

Tyr

Val

Tyr

Ser

Gly

Arg

Val

Arg

Pro

Pro

Pro

Lys

Gly

130

135

140

gtt

tet

gaa

tgc

gca

gac

gak

agc

tgc

tgc

cac

gtg

gcg

tgc

cgt

ccg

480

Val

Ser

Glu

Cys

Ala

Asp

Xaa

Ser

Cys

Cys

His

Val

Ala

Cys

Arg

Pro

145

150

155

160

gct

gtg

gat

ttc

atg

gtg

gag

gtt

ctc

tac

ttg

gct

ttc

gtc

ttc

cag

528

Ala

Val

Asp

Phe

Met

Val

Glu

Val

Leu

Tyr

Leu

Ala

Phe

Val

Phe

Gin

165

170

175

att

cag

gaa

ctg

gtt

acc

atg

tat

cag

agg

cat

tta

ctg

gat

gtt

gta

576

Ile

Gin

Glu

Leu

Val

Thr

Met

Tyr

Gin

Arg

His

Leu

Leu

Asp

Val

Val

180

185

190

gac

aaa

gtt

awc

ata

gaa

gac

act

ttg

gtc

gtc

ctc

aag

ctt

gct

aac

624

Asp

Lys

Val

Xaa

Ile

Glu

Asp

Thr

Leu

Val

Val

Leu

Lys

Leu

Ala

Asn

195

200

205

atc

tgc

ggt

aaa

gcg

tgc

aag

aag

cta

ttc

gat

aag

tgc

aga

gag

atc

672

Ile

Cys

Gly

Lys

Ala

Cys

Lys

Lys

Leu

Phe

Asp

Lys

Cys

Arg

Glu

Ile

210

215

220

att

gtc

aag

tet

aac

gtg

gat

gtt

gtt

act

cta

aag

aag

tea

ttg

cct

720

Ile

Val

Lys

Ser

Asn

Val

Asp

Val

Val

Thr

Leu

Lys

Lys

Ser

Leu

Pro

225

230

235

240

gag

rac

att

gcc

aag

caa

gta

atc

gat

atc

ege

aaa

gag

ctc

ggc

ttg

768

Glu

Xaa

Ile

Ala

Lys

Gin

Val

Ile

Asp

Ile

Arg

Lys

Glu

Leu

Gly

Leu

245

250

255

gag

gta

gct

gaa

cca

gag

aaa

cat

gtc

tcc

aac

ata

cac

aag

gcg

ctt

816

Glu

Val

Ala

Glu

Pro

Glu

Lys

His

Val

Ser

Asn

Ile

His

Lys

Ala

Leu

260

265

270

• ·

gag tca gac

gat Asp

ctt Leu

gac Asp

ctt Leu

gtc gtt

atg Met

ctt Leu

ttg Leu

aaa gag

ggc Gly

cac His

864

Glu Ser

Asp 275

Val 280

Val

Lys 285

Glu

acg

aat

cta

gac

gaa

gcg

tat

gct

ctc

cat

ttt

gct

gtt

gcg

tat

tgc

912

Thr

Asn

Leu

Asp

Glu

Ala

Tyr

Ala

Leu

His

Phe

Ala

Val

Ala

Tyr

Cys

290

295

300

gat

gag

aag

aca

gcg

agg

aat

ctc

ctg

gaa

ctg

ggg

ttt

gcg

gat

gtc

960

Asp

Glu

Lys

Thr

Ala

Arg

Asn

Leu

Leu

Glu

Leu

Gly

Phe

Ala

Asp

Val

305

310

315

320

aac

cgg

aga

aac

ccg

aga

ggg

tac

acg

gta

att

cac

gtc

gct

gcg

atg

1008

Asn

Arg

Arg

Asn

Pro

Arg

Gly

Tyr

Thr

Val

Ile

His

Val

Ala

Ala

Met

325

330

335

agg

aaa

gag

ccg

aca

ctg

ata

gca

ttg

ttg

ttg

acg

aaa

ggg

gct

aat

1056

Arg

Lys

Glu

Pro

Thr

Leu

Ile

Ala

Leu

Leu

Leu

Thr

Lys

Gly

Ala

Asn

340

345

350

gca

tta

gaa

atg

tet

ttg

gac

ggg

aga

act

gct

ctg

ttg

atc

gcg

aaa

1104

Ala

Leu

Glu

Met

Ser

Leu

Asp

Gly

Arg

Thr

Ala

Leu

Leu

Ile

Ala

Lys

355

360

365

caa

gtc

act

aag

gcg

gcc

gag

tgt

tgt

att

ctg

gag

aaa

ggg

aag

tta

1152

Gin

Val

Thr

Lys

Ala

Ala

Glu

Cys

Cys

Ile

Leu

Glu

Lys

Gly

Lys

Leu

370

375

380

gct

gcc

aaa

ggc

gga

gta

tgt

gta

gag

ata

ctc

aag

caa

cca

gac

aac

1200

Ala

Ala

Lys

Gly

Gly

Val

Cys

Val

Glu

Ile

Leu

Lys

Gin

Pro

Asp

Asn

385

390

395

400

aca

ega

gaa

cca

ttt

cct

gaa

gat

gtt

tet

ccc

tcc

ctt

gca

gtg

gct

1248

Thr

Arg

Glu

Pro

Phe

Pro

Glu

Asp

Val

Ser

Pro

Ser

Leu

Ala

Val

Ala

405

410

415

gct

gat

caa

ttc

aag

ata

agg

ttg

att

gat

ctt

gaa

aac

aga

gtt

caa

1296

Ala

Asp

Gin

Phe

Lys

Ile

Arg

Leu

Ile

Asp

Leu

Glu

Asn

Arg

Val

Gin

420

425

430

atg

gct

ega

tgt

ctc

tat

cca

atg

gaa

gca

caa

gtt

gca

atg

gat

ttc

1344

Met

Ala

Arg

Cys

Leu

Tyr

Pro

Met

Glu

Ala

Gin

Val

Ala

Met

Asp

Phe

435

440

445

gcc

ega

atg

aag

gga

aca

ege

gag

ttt

gtc

gtg

acg

aca

gca

act

gac

1392

Ala

Arg

Met

Lys

Gly

Thr

Arg

Glu

Phe

Val

Val

Thr

Thr

Ala

Thr

Asp

450

455

460

cta

cac

atg

gaa

cct

ttc

aag

ttc

gta

gaa

atg

cat

cag

agt

aga

cta

1440

Leu

His

Met

Glu

Pro

Phe

Lys

Phe

Val

Glu

Met

His

Gin

Ser

Arg

Leu

465

470

475

480

• ·

aca Thr

gcg Ala

ctt Leu

tet Ser

aaa Lys 485

act Thr

gtg gaa

ttc Phe

ggg aaa

ege Arg

ttc Phe

ttc Phe

cca Pro 495

ege Arg

1488

Val

Glu

Gly 490

Lys

tgt

tcg

aaa

gtg

ctc

gat

gat

att

gtg

gac

tet

gag

gac

ttg

act

ata

1536

Cys

Ser

Lys

Val

Leu

Asp

Asp

Ile

Val

Asp

Ser

Glu

Asp

Leu

Thr

Ile

500

505

510

ctg

gct

ctc

gta

gaa

gaa

gac

act

cct

gag

caa

ega

caa

caa

aag

agg

1584

Leu

Ala

Leu

Val

Glu

Glu

Asp

Thr

Pro

Glu

Gin

Arg

Gin

Gin

Lys

Arg

515

520

525

cag

agg

ttc

atg

gaa

ata

cag

gag

att

gtt

caa

atg

gcg

ttt

agt

aaa

1632

Gin

Arg

Phe

Met

Glu

Ile

Gin

Glu

Ile

Val

Gin

Met

Ala

Phe

Ser

Lys

530

535

540

gac

aag

gag

gat

ctt

gga

aag

tcg

tet

ctc

tea

gct

tcg

tet

tet

tcc

1680

Asp

Lys

Glu

Asp

Leu

Gly

Lys

Ser

Ser

Leu

Ser

Ala

Ser

Ser

Ser

Ser

545

550

555

560

aca

tcc

aaa

tta

act

ggt

aaa

aag

agg

tet

att

gct

aaa

ccc

tet

cac

1728

Thr

Ser

Lys

Leu

Thr

Gly

Lys

Lys

Arg

Ser

Ile

Ala

Lys

Pro

Ser

His

565

570

575

cgg

cgt

cgg

tga

1740

Arg

Arg

Arg

<210> 6 <211> 579 <212> PRT <213 > Brassica napus <400> 6

Met Glu 1

Thr

Ile

Ala Xaa Phe Asp Asp Phe

Tyr

Glu

Ile Ser

Ser 15

Thr

5

10

Ser

Phe

Xaa

Ala

Ala

Pro

Ala

Pro

Thr

Asp

Asn

Ser

Gly

Ser

Ser

Thr

20

25

30

Val

Xaa

Pro

Thr

Glu

Leu

Xaa

Thr

Arg

Pro

Glu

Val

Ser

Ala

Phe

Gin

35

40

45

Leu

Leu

Ser

Asn

Ser

Leu

Glu

Ser

Val

Phe

Asp

Ser

Pro

Glu

Ala

Phe

50

55

60

Tyr

Ser

Asp

Ala

Lys

Leu

Val

Leu

Ser

Asp

Asp

Lys

Glu

Val

Ser

Phe

65

70

75

80

His

Arg

Cys

Ile

Leu

Ser

Ala

Arg

Ser

Leu

Phe

Phe

Lys

Ala

Ala

Leu

85

90

95

Xaa

Ala

Ala

Glu

Lys

Val

Gin

Lys

Ser

Thr

Pro

Val

Lys

Leu

Glu

Leu

100

105

110

»· φφ φφ ·♦ ·· • · φ · · · *φ · • · φ ·· · · · φφ · • et · · · ······· φφφφ φ φ ♦·« φφ φφ φφ Φ·φφ

Lys Thr Leu Ala

Ala

Glu

Tyr

Asp Val Gly Phe Asp Ser

Val

Val

Ala

115

120

125

Val

Leu

Ala

Tyr

Val

Tyr

Ser

Gly

Arg

Val

Arg

Pro

Pro

Pro

Lys

Gly

130

135

140

Val

Ser

Glu

Cys

Ala

Asp

Xaa

Ser

Cys

Cys

His

Val

Ala

Cys

Arg

Pro

145

150

155

160

Ala

Val

Asp

Phe

Met

Val

Glu

Val

Leu

Tyr

Leu

Ala

Phe

Val

Phe

Gin

165

170

175

Ile

Gin

Glu

Leu

Val

Thr

Met

Tyr

Gin

Arg

His

Leu

Leu

Asp

Val

Val

180

185

190

Asp

Lys

Val

Xaa

Ile

Glu

Asp

Thr

Leu

Val

Val

Leu

Lys

Leu

Ala

Asn

195

200

205

Ile

Cys

Gly

Lys

Ala

Cys

Lys

Lys

Leu

Phe

Asp

Lys

Cys

Arg

Glu

Ile

210

215

220

Ile

Val

Lys

Ser

Asn

Val

Asp

Val

Val

Thr

Leu

Lys

Lys

Ser

Leu

Pro

225

230

235

240

Glu

Xaa

Ile

Ala

Lys

Gin

Val

Ile

Asp

Ile

Arg

Lys

Glu

Leu

Gly

Leu

245

250

255

Glu

Val

Ala

Glu

Pro

Glu

Lys

His

Val

Ser

Asn

Ile

His

Lys

Ala

Leu

260 265 270

Glu Ser Asp Asp Leu Asp Leu Val Val Met Leu Leu Lys Glu Gly His

275 280285

Thr Asn

Leu

Asp Glu Ala

Tyr Ala 295

Leu His

Phe Ala 300

Val

Ala

Tyr Cys

290

Asp

Glu

Lys

Thr

Ala

Arg

Asn

Leu

Leu

Glu

Leu

Gly

Phe

Ala

Asp

Val

305

310

315

320

Asn

Arg

Arg

Asn

Pro

Arg

Gly

Tyr

Thr

Val

Ile

His

Val

Ala

Ala

Met

325

330

335

Arg

Lys

Glu

Pro

Thr

Leu

Ile

Ala

Leu

Leu

Leu

Thr

Lys

Gly

Ala

Asn

340

345

350

Ala

Leu

Glu

Met

Ser

Leu

Asp

Gly

Arg

Thr

Ala

Leu

Leu

Ile

Ala

Lys

355

360

365

Gin

Val

Thr

Lys

Ala

Ala

Glu

Cys

Cys

Ile

Leu

Glu

Lys

Gly

Lys

Leu

370

375

380

Ala

Ala

Lys

Gly

Gly

Val

Cys

Val

Glu

Ile

Leu

Lys

Gin

Pro

Asp

Asn

385

390

395

400

	»♦	·«		9*
• ·	4	•	•	• a	a a
• ·	• 4*	«	•	a a	•	a
• ·	• 4	A ·	•		• »	a
• ·	• ·	4	a	•	a a
··	* ·		··	99	··

Thr

Arg Glu

Pro Phe 405

Pro

Glu

Asp

Val

Ser Pro 410

Ser Leu

Ala

Val 415

Ala

Ala

Asp

Gin

Phe

Lys

Ile

Arg

Leu

Ile

Asp

Leu

Glu

Asn

Arg

Val

Gin

420

425

430

Met

Ala

Arg

Cys

Leu

Tyr

Pro

Met

Glu

Ala

Gin

Val

Ala

Met

Asp

Phe

435

440

445

Ala

Arg

Met

Lys

Gly

Thr

Arg

Glu

Phe

Val

Val

Thr

Thr

Ala

Thr

Asp

450

455

460

Leu

His

Met

Glu

Pro

Phe

Lys

Phe

Val

Glu

Met

His

Gin

Ser

Arg

Leu

465

470

475

480

Thr

Ala

Leu

Ser

Lys

Thr

Val

Glu

Phe

Gly

Lys

Arg

Phe

Phe

Pro

Arg

485

490

495

Cys

Ser

Lys

Val

Leu

Asp

Asp

Ile

Val

Asp

Ser

Glu

Asp

Leu

Thr

Ile

500

505

510

Leu

Ala

Leu

Val

Glu

Glu

Asp

Thr

Pro

Glu

Gin

Arg

Gin

Gin

Lys

Arg

515

520

525

Gin

Arg

Phe

Met

Glu

Ile

Gin

Glu

Ile

Val

Gin

Met

Ala

Phe

Ser

Lys

530

535

540

Asp

Lys

Glu

Asp

Leu

Gly

Lys

Ser

Ser

Leu

Ser

Ala

Ser

Ser

Ser

Ser

545

550

555

560

Thr

Ser

Lys

Leu

Thr

Gly

Lys

Lys

Arg

Ser

Ile

Ala

Lys

Pro

Ser

His

565

570

575

Arg Arg Arg <210> 7 <211> 1761 <212> DNA <213> Arabidopsis thaliana <220>

<221> CDS <222> (1) . . (1758) <223> AtNMLc5 cDNA sekvence <400> 7 atg gct act ttg act gag cca tca tca tet ttg agt ttc aca tet tet Met Ala Thr Leu Thr Glu Pro Ser Ser Ser Leu Ser Phe Thr Ser Ser 15 10 15

0 ·	00	• 0	00	00	0
•	0	0	0	•	0 0	0 0	«0
0	0	00«	• ·	0 0	0 0	0
0 ·	0 0	0 0	0	«00	• 0	0	0
•	0	0 0	0	0	0	0	0	0
00	• 0	00	0»	«*0	000

100

cat His

ttc Phe

tet Ser

tat Tyr 20

ggt Gly

tet Ser

att ggg

tcc Ser 25

aat Asn

cac His

ttc Phe

tea tea agc

tea Ser

96

Ile

Gly

Ser

Ser 30

Ser

gct

tet

aat

cct

gaa

gtt

gtt

agt

cta

acc

aaa

ctc

agc

tcc

aat

ctt

144

Ala

Ser

Asn

Pro

Glu

Val

Val

Ser

Leu

Thr

Lys

Leu

Ser

Ser

Asn

Leu

35

40

45

gag

cag

ctt

ctt

agt

aat

tea

gat

tgt

gat

tac

agt

gat

gca

gag

atc

192

Glu

Gin

Leu

Leu

Ser

Asn

Ser

Asp

Cys

Asp

Tyr

Ser

Asp

Ala

Glu

Ile

50

55

60

att

gtt

gat

ggt

gtt

cca

gtt

ggt

gtt

cat

aga

tgc

att

tta

gct

gca

240

Ile

Val

Asp

Gly

Val

Pro

Val

Gly

Val

His

Arg

Cys

Ile

Leu

Ala

Ala

65

70

75

80

aga

agt

aag

ttt

ttc

caa

gat

ttg

ttt

aag

aaa

gaa

aag

aaa

att

tcg

288

Arg

Ser

Lys

Phe

Phe

Gin

Asp

Leu

Phe

Lys

Lys

Glu

Lys

Lys

Ile

Ser

85

90

95

aaa

act

gag

aaa

cca

aag

tat

cag

ttg

aga

gag

atg

tta

cct

tat

gga

336

Lys

Thr

Glu

Lys

Pro

Lys

Tyr

Gin

Leu

Arg

Glu

Met

Leu

Pro

Tyr

Gly

100

105

110

gct

gtt

gct

cat

gaa

gct

ttc

ttg

tat

ttc

ttg

agt

tat

ata

tat

act

384

Ala

Val

Ala

His

Glu

Ala

Phe

Leu

Tyr

Phe

Leu

Ser

Tyr

Ile

Tyr

Thr

115

120

125

ggg

aga

tta

aag

cct

ttt

cca

ttg

gag

gtt

tcg

act

tgt

gtt

gat

cca

432

Gly

Arg

Leu

Lys

Pro

Phe

Pro

Leu

Glu

Val

Ser

Thr

Cys

Val

Asp

Pro

130

135

140

gtt

tgt

tet

cat

gat

tgt

tgt

ega

cct

gcc

att

gat

ttt

gtt

gtt

caa

480

Val

Cys

Ser

His

Asp

Cys

Cys

Arg

Pro

Ala

Ile

Asp

Phe

Val

Val

Gin

145

150

155

160

ttg

atg

tat

gct

tcc

tet

gtt

ctc

caa

gtg

cct

gag

cta

gtt

tea

tet

528

Leu

Met

Tyr

Ala

Ser

Ser

Val

Leu

Gin

Val

Pro

Glu

Leu

Val

Ser

Ser

165

170

175

ttt

cag

cgg

cgg

ctt

tgt

aac

ttt

gtg

gag

aag

acc

ctt

gtt

gag

aat

576

Phe

Gin

Arg

Arg

Leu

Cys

Asn

Phe

Val

Glu

Lys

Thr

Leu

Val

Glu

Asn

180

185

190

gtt

ctt

ccc

att

ctt

atg

gtt

gct

ttc

aat

tgt

aag

ttg

act

cag

ctt

624

Val

Leu

Pro

Ile

Leu

Met

Val

Ala

Phe

Asn

Cys

Lys

Leu

Thr

Gin

Leu

195

200

205

ctt

gat

cag

tgt

att

gag

aga

gtg

gcg

agg

tea

gat

ctt

tac

agg

ttc

672

Leu

Asp

Gin

Cys

Ile

Glu

Arg

Val

Ala

Arg

Ser

Asp

Leu

Tyr

Arg

Phe

210

215

220

101

tgt Cys 225

att Ile

gaa Glu

aag gaa gtt

cct Pro

ccc Pro

gaa Glu

gta gca

gag Glu

aag Lys

att Ile

aaa Lys

cag Gin 240

720

Lys

Glu

Val 230

Val

Ala 235

ctt

ega

ctt

ata

tcc

ccg

caa

gac

gaa

gaa

acc

agt

ccc

aag

att

tcg

768

Leu

Arg

Leu

Ile

Ser

Pro

Gin

Asp

Glu

Glu

Thr

Ser

Pro

Lys

Ile

Ser

245

250

255

gag

aaa

ttg

ctt

gaa

aga

atc

ggt

aaa

att

ctc

aag

gcc

ttg

gat

tea

816

Glu

Lys

Leu

Leu

Glu

Arg

Ile

Gly

Lys

Ile

Leu

Lys

Ala

Leu

Asp

Ser

260

265

270

gat

gat

gtt

gag

ctt

gtg

aag

ctt

ctt

ttg

act

gag

tea

gat

atc

act

864

Asp

Asp

Val

Glu

Leu

Val

Lys

Leu

Leu

Leu

Thr

Glu

Ser

Asp

Ile

Thr

275

280

285

cta

gat

caa

gcc

aat

ggt

ctg

cat

tat

tet

gtt

gtg

tat

agt

gat

ccg

912

Leu

Asp

Gin

Ala

Asn

Gly

Leu

His

Tyr

Ser

Val

Val

Tyr

Ser

Asp

Pro

290

295

300

aaa

gtt

gtt

gcc

gag

att

ctt

get

ctg

gat

atg

ggt

gat

gtg

aac

tac

960

Lys

Val

Val

Ala

Glu

Ile

Leu

Ala

Leu

Asp

Met

Gly

Asp

Val

Asn

Tyr

305

310

315

320

agg

aat

tcc

cgg

ggt

tac

acg

gtt

ctt

cat

ttt

get

gcg

atg

cgt

aga

1008

Arg

Asn

Ser

Arg

Gly

Tyr

Thr

Val

Leu

His

Phe

Ala

Ala

Met

Arg

Arg

325

330

335

gag

cca

tcg

atc

att

ata

tcg

ctt

atc

gat

aaa

ggc

gcc

aat

gca

tet

1056

Glu

Pro

Ser

Ile

Ile

Ile

Ser

Leu

Ile

Asp

Lys

Gly

Ala

Asn

Ala

Ser

340

345

350

gag

ttt

aca

tet

gac

gga

ege

agc

gca

gtt

aat

ata

ttg

aga

aga

ctg

1104

Glu

Phe

Thr

Ser

Asp

Gly

Arg

Ser

Ala

Val

Asn

Ile

Leu

Arg

Arg

Leu

355

360

365

aca

aat

cca

aag

gat

tat

cat

acc

aaa

aca

gca

aaa

ggg

cgt

gaa

tet

1152

Thr

Asn

Pro

Lys

Asp

Tyr

His

Thr

Lys

Thr

Ala

Lys

Gly

Arg

Glu

Ser

370

375

380

agt

aag

gcc

agg

cta

tgc

atc

gat

ata

ttg

gaa

aga

gaa

atc

agg

aag

1200

Ser

Lys

Ala

Arg

Leu

Cys

Ile

Asp

Ile

Leu

Glu

Arg

Glu

Ile

Arg

Lys

385

390

395

400

aac

ccc

atg

gtt

cta

gat

aca

cca

atg

tgt

tcc

att

tet

atg

cct

gaa

1248

Asn

Pro

Met

Val

Leu

Asp

Thr

Pro

Met

Cys

Ser

Ile

Ser

Met

Pro

Glu

405

410

415

gat

ctc

cag

atg

aga

ctg

ttg

tac

cta

gaa

aag

aga

gtg

ggt

ctt

get

1296

Asp

Leu

Gin

Met

Arg

Leu

Leu

Tyr

Leu

Glu

Lys

Arg

Val

Gly

Leu

Ala

420

425

430

cag

ttg

ttc

ttt

cca

acg

gaa

get

aaa

gtg

get

atg

gac

att

ggt

aac

1344

Gin

Leu

Phe

Phe

Pro

Thr

Glu

Ala

Lys

Val

Ala

Met

Asp

Ile

Gly

Asn

435

440

445

• ·

102

gta Val

gaa ggt Glu Gly 450

aca Thr

agt Ser

gag Glu

ttc Phe 455

aca Thr

ggg Gly

ttg Leu

tea Ser

cct Pro 460

cct Pro

tea Ser

agt Ser

ggg Gly

1392

tta

acc

gga

aac

ttg

agt

cag

gtt

gat

tta

aac

gaa

act

cct

cat

atg

1440

Leu

Thr

Gly

Asn

Leu

Ser

Gin

Val

Asp

Leu

Asn

Glu

Thr

Pro

His

Met

465

470

475

480

caa

acc

caa

aga

ctt

ctt

act

cgt

atg

gtg

gct

cta

atg

aaa

aca

gtt

1488

Gin

Thr

Gin

Arg

Leu

Leu

Thr

Arg

Met

Val

Ala

Leu

Met

Lys

Thr

Val

485

490

495

gag

act

ggt

ega

agg

ttt

ttt

cca

tat

ggt

tea

gag

gtt

cta

gat

aag

1536

Glu

Thr

Gly

Arg

Arg

Phe

Phe

Pro

Tyr

Gly

Ser

Glu

Val

Leu

Asp

Lys

500

505

510

tac

atg

gct

gag

tat

ata

gac

gac

gac

atc

ctc

gac

gat

ttc

cat

ttt

1584

Tyr

Met

Ala

Glu

Tyr

Ile

Asp

Asp

Asp

Ile

Leu

Asp

Asp

Phe

His

Phe

515

520

525

gag

aag

gga

tet

aca

cat

gaa

aga

aga

ttg

aaa

aga

atg

aga

tat

aga

1632

Glu

Lys

Gly

Ser

Thr

His

Glu

Arg

Arg

Leu

Lys

Arg

Met

Arg

Tyr

Arg

530

535

540

gag

ctt

aag

gat

gat

gtc

caa

aag

gca

tat

age

aaa

gac

aaa

gag

tet

1680

Glu

Leu

Lys

Asp

Asp

Val

Gin

Lys

Ala

Tyr

Ser

Lys

Asp

Lys

Glu

Ser

545

550

555

560

aag

att

gcg

cgg

tet

tgt

ctt

tet

gct

tea

tet

tet

cct

tet

tet

tet

1728

Lys

Ile

Ala

Arg

Ser

Cys

Leu

Ser

Ala

Ser

Ser

Ser

Pro

Ser

Ser

Ser

565

570

575

tcc

ata

aga

gat

gat

ctg

cac

aac

aca

aca

tga

1761

Ser

Ile

Arg

Asp

Asp

Leu

His

Asn

Thr

Thr

580

585

<210> 8 <211> 586 <212> PRT <213> Arabidopsis thaliana <400> 8

Met 1

Ala

Thr

Leu

Thr 5

Glu

Pro

Ser

Ser

Ser 10

Leu

Ser

Phe

Thr

Ser 15

Ser

His

Phe

Ser

Tyr 20

Gly

Ser

Ile

Gly

Ser 25

Asn

His

Phe

Ser

Ser 30

Ser

Ser

Ala

Ser

Asn

Pro

Glu

Val

Val

Ser

Leu

Thr

Lys

Leu

Ser

Ser

Asn

Leu

40 45

Glu Gin Leu Leu Ser Asn Ser Asp Cys Asp Tyr Ser Asp Ala Glu Ile

55 60

103

Ile 65

Val

Asp Gly

Val

Pro Val Gly Val His Arg Cys

Ile

Leu

Ala

Ala 80

70

75

Arg

Ser

Lys

Phe

Phe

Gin

Asp

Leu

Phe

Lys

Lys

Glu

Lys

Lys

Ile

Ser

85

90

95

Lys

Thr

Glu

Lys

Pro

Lys

Tyr

Gin

Leu

Arg

Glu

Met

Leu

Pro

Tyr

Gly

100

105

110

Ala

Val

Ala

His

Glu

Ala

Phe

Leu

Tyr

Phe

Leu

Ser

Tyr

Ile

Tyr

Thr

115

120

125

Gly

Arg

Leu

Lys

Pro

Phe

Pro

Leu

Glu

Val

Ser

Thr

Cys

Val

Asp

Pro

130

135

140

Val

Cys

Ser

His

Asp

Cys

Cys

Arg

Pro

Ala

Ile

Asp

Phe

Val

Val

Gin

145

150

155

160

Leu

Met

Tyr

Ala

Ser

Ser

Val

Leu

Gin

Val

Pro

Glu

Leu

Val

Ser

Ser

165

170

175

Phe

Gin

Arg

Arg

Leu

Cys

Asn

Phe

Val

Glu

Lys

Thr

Leu

Val

Glu

Asn

180

185

190

Val

Leu

Pro

Ile

Leu

Met

Val

Ala

Phe

Asn

Cys

Lys

Leu

Thr

Gin

Leu

195

200

205

Leu

Asp

Gin

Cys

Ile

Glu

Arg

Val

Ala

Arg

Ser

Asp

Leu

Tyr

Arg

Phe

210

215

220

Cys

Ile

Glu

Lys

Glu

Val

Pro

Pro

Glu

Val

Ala

Glu

Lys

Ile

Lys

Gin

225

230

235

240

Leu

Arg

Leu

Ile

Ser

Pro

Gin

Asp

Glu

Glu

Thr

Ser

Pro

Lys

Ile

Ser

245

250

255

Glu

Lys

Leu

Leu

Glu

Arg

Ile

Gly

Lys

Ile

Leu

Lys

Ala

Leu

Asp

Ser

260

265

270

Asp

Asp

Val

Glu

Leu

Val

Lys

Leu

Leu

Leu

Thr

Glu

Ser

Asp

Ile

Thr

275

280

285

Leu

Asp

Gin

Ala

Asn

Gly

Leu

His

Tyr

Ser

Val

Val

Tyr

Ser

Asp

Pro

290

295

300

Lys

Val

Val

Ala

Glu

Ile

Leu

Ala

Leu

Asp

Met

Gly

Asp

Val

Asn

Tyr

305

310

315

320

Arg

Asn

Ser

Arg

Gly

Tyr

Thr

Val

Leu

His

Phe

Ala

Ala

Met

Arg

Arg

325

330

335

Glu

Pro

Ser

Ile

Ile

Ile

Ser

Leu

Ile

Asp

Lys

Gly

Ala

Asn

Ala

Ser

340

345

350

104

Glu Phe Thr Ser

Asp

Gly

Arg Ser Ala Val 360

Asn

Ile

Leu 365

Arg

Arg

Leu

355

Thr

Asn

Pro

Lys

Asp

Tyr

His

Thr

Lys

Thr

Ala

Lys

Gly

Arg

Glu

Ser

370

375

380

Ser

Lys

Ala

Arg

Leu

Cys

Ile

Asp

Ile

Leu

Glu

Arg

Glu

Ile

Arg

Lys

385

390

395

400

Asn

Pro

Met

Val

Leu

Asp

Thr

Pro

Met

Cys

Ser

Ile

Ser

Met

Pro

Glu

405

410

415

Asp

Leu

Gin

Met

Arg

Leu

Leu

Tyr

Leu

Glu

Lys

Arg

Val

Gly

Leu

Ala

420

425

430

Gin

Leu

Phe

Phe

Pro

Thr

Glu

Ala

Lys

Val

Ala

Met

Asp

Ile

Gly

Asn

435

440

445

Val

Glu

Gly

Thr

Ser

Glu

Phe

Thr

Gly

Leu

Ser

Pro

Pro

Ser

Ser

Gly

450

455

460

Leu

Thr

Gly

Asn

Leu

Ser

Gin

Val

Asp

Leu

Asn

Glu

Thr

Pro

His

Met

465

470

475

480

Gin

Thr

Gin

Arg

Leu

Leu

Thr

Arg

Met

Val

Ala

Leu

Met

Lys

Thr

Val

485

490

495

Glu

Thr

Gly

Arg

Arg

Phe

Phe

Pro

Tyr

Gly

Ser

Glu

Val

Leu

Asp

Lys

500

505

510

Tyr

Met

Ala

Glu

Tyr

Ile

Asp

Asp

Asp

Ile

Leu

Asp

Asp

Phe

His

Phe

515

520

525

Glu

Lys

Gly

Ser

Thr

His

Glu

Arg

Arg

Leu

Lys

Arg

Met

Arg

Tyr

Arg

530

535

540

Glu

Leu

Lys

Asp

Asp

Val

Gin

Lys

Ala

Tyr

Ser

Lys

Asp

Lys

Glu

Ser

545

550

555

560

Lys

Ile

Ala

Arg

Ser

Cys

Leu

Ser

Ala

Ser

Ser

Ser

Pro

Ser

Ser

Ser

565

570

575

Ser

Ile

Arg

Asp

Asp

Leu

His

Asn

Thr

Thr

580

585

<210> 9 <211> 21 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>

105 <223> Popis umělé sekvence: PCR Primer <400> 9 agattattgt caagtctaat g <210> 10 <211> 19 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>

<223> Popis umělé sekvence: PCR Primer <400> 10 ttccatgtac ctttgcttc <210> 11 <211> 23 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>

<223> Popis umělé sekvence: PCR Primer <400> 11 gcggatccat ggataatagt agg 23

<210> 12 <211> 23 <212> DNA <213> Umělá sekvence

<220>

<223> Popis umělé sekvence: PCR Primer

<400> 12

gcggatccta tttcctaaaa ggg

<210> 13 <211> 21 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>

<223> Popis umělé sekvence: PCR Primer <400> 13 tcaaggcctt ggattcagat g

106 <210> 14 <211> 21 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>

<223> Popis umělé sekvence: PCR Primer <400> 14 attaactgcg ctacgtccgt c <210> 15 <211> 1477 <212> DNA <213> Arabidopsis thaliana <220>

<221> CDS <222> (1) .. (1476) <223> AtNMLc2 genomová sekvence <400> 15

atg Met 1

agc Ser

aat Asn

ctt Leu

gaa Glu 5

gaa Glu

tet Ser

ttg Leu

aga Arg

tet Ser 10

cta Leu

tcg Ser

ttg Leu

gat Asp

ttc Phe 15

ctg Leu

48

aac

cta

cta

atc

aac

ggt

caa

get

ttc

tcc

gac

gtg

act

ttc

agc

gtt

96

Asn

Leu

Leu

Ile

Asn

Gly

Gin

Ala

Phe

Ser

Asp

Val

Thr

Phe

Ser

Val

20

25

30

gaa

ggt

cgt

tta

gtc

cac

get

cac

cgt

tgt

atc

ctc

gcc

gca

cgg

agt

144

Glu

Gly

Arg

Leu

Val

His

Ala

His

Arg

Cys

Ile

Leu

Ala

Ala

Arg

Ser

35

40

45

ctt

ttc

ttc

cgc

aaa

ttc

ttt

tgt

ggg

aca

gac

tea

cca

caa

cct

gtc

192

Leu

Phe

Phe

Arg

Lys

Phe

Phe

Cys

Gly

Thr

Asp

Ser

Pro

Gin

Pro

Val

50

55

60

aca

ggt

ata

gac

ccg

acc

caa

cat

ggg

tcc

gta

ccc

get

agc

cca

aca

240

Thr

Gly

Ile

Asp

Pro

Thr

Gin

His

Gly

Ser

Val

Pro

Ala

Ser

Pro

Thr

65

70

75

80

aga

ggc

tcc

acg

gcc

cca

get

gga

att

ata

cca

gtg

aac

tea

gtc

ggt

288

Arg

Gly

Ser

Thr

Ala

Pro

Ala

Gly

Ile

Ile

Pro

Val

Asn

Ser

Val

Gly

85

90

95

tat

gag

gtt

ttt

ctg

ttg

cta

ctt

cag

ttt

ctt

tat

agc

gga

caa

gtc

336

Tyr

Glu

Val

Phe

Leu

Leu

Leu

Leu

Gin

Phe

Leu

Tyr

Ser

Gly

Gin

Val

100

105

110

tcc

atc

gtg

ccg

cag

aaa

cac

gag

cct

aga

cct

aat

tgt

ggc

gag

aga

384

Ser

Ile

Val

Pro

Gin

Lys

His

Glu

Pro

Arg

Pro

Asn

Cys

Gly

Glu

Arg

115

120

125

107

gga Gly

tgt Cys 130

tgg cac

act Thr

cat His

tgc Cys 135

tea gcc gcc gtt

gat Asp 140

ctt Leu

gct Ala

ctt Leu

gat Asp

432

Trp

His

Ser Ala

Ala Val

act

ctc

gcc

gcc

tet

cgt

tac

ttc

ggc

gtc

gag

cag

ctc

gca

ttg

ctc

480

Thr

Leu

Ala

Ala

Ser

Arg

Tyr

Phe

Gly

Val

Glu

Gin

Leu

Ala

Leu

Leu

145

150

155

160

acc

cag

aaa

caa

ttg

gca

agc

atg

gtg

gag

aaa

gcc

tet

atc

gaa

gat

528

Thr

Gin

Lys

Gin

Leu

Ala

Ser

Met

Val

Glu

Lys

Ala

Ser

Ile

Glu

Asp

165

170

175

gtg

atg

aaa

gtt

tta

ata

gca

tea

aga

aag

caa

gac

atg

cat

caa

tta

576

Val

Met

Lys

Val

Leu

Ile

Ala

Ser

Arg

Lys

Gin

Asp

Met

His

Gin

Leu

180

185

190

tgg

acc

acc

tgc

tet

cac

tta

gtt

atg

agc

aat

ctt

gaa

gaa

tet

ttg

624

Trp

Thr

Thr

Cys

Ser

His

Leu

Val

Met

Ser

Asn

Leu

Glu

Glu

Ser

Leu

195

200

205

aga

tet

cta

tcg

ttg

gat

ttc

ctg

aac

cta

cta

atc

aac

ggt

caa

gct

672

Arg

Ser

Leu

Ser

Leu

Asp

Phe

Leu

Asn

Leu

Leu

Ile

Asn

Gly

Gin

Ala

210

215

220

ttc

tcc

gac

gtg

act

ttc

agc

gtt

gaa

ggt

cgt

tta

gtc

cac

gct

cac

720

Phe

Ser

Asp

Val

Thr

Phe

Ser

Val

Glu

Gly

Arg

Leu

Val

His

Ala

His

225

230

235

240

cgt

tgt

atc

ctc

gcc

gca

cgg

agt

ctt

ttc

ttc

ege

aaa

ttc

ttt

tgt

768

Arg

Cys

Ile

Leu

Ala

Ala

Arg

Ser

Leu

Phe

Phe

Arg

Lys

Phe

Phe

Cys

245

250

255

ggg

aca

gac

tea

cca

caa

cct

gtc

aca

ggt

ata

gac

ccg

acc

caa

cat

816

Gly

Thr

Asp

Ser

Pro

Gin

Pro

Val

Thr

Gly

Ile

Asp

Pro

Thr

Gin

His

260

265

270

ggg

tcc

gta

ccc

gct

agc

cca

aca

aga

ggc

tcc

acg

gcc

cca

gct

gga

864

Gly

Ser

Val

Pro

Ala

Ser

Pro

Thr

Arg

Gly

Ser

Thr

Ala

Pro

Ala

Gly

275

280

285

att

ata

cca

gtg

aac

tea

gtc

ggt

tat

gag

gtt

ttt

ctg

ttg

cta

ctt

912

Ile

Ile

Pro

Val

Asn

Ser

Val

Gly

Tyr

Glu

Val

Phe

Leu

Leu

Leu

Leu

290

295

300

cag

ttt

ctt

tat

agc

gga

caa

gtc

tcc

atc

gtg

ccg

cag

aaa

cac

gag

960

Gin

Phe

Leu

Tyr

Ser

Gly

Gin

Val

Ser

Ile

Val

Pro

Gin

Lys

His

Glu

305

310

315

320

cct

aga

cct

aat

tgt

ggc

gag

aga

gga

tgt

tgg

cac

act

cat

tgc

tea

1008

Pro

Arg

Pro

Asn

Cys

Gly

Glu

Arg

Gly

Cys

Trp

His

Thr

His

Cys

Ser

325

330

335

108

gcc Ala

gcc Ala

gtt Val

gat Asp 340

ctt Leu

get Ala

ctt Leu

gat Asp

act Thr 345

ctc Leu

gcc Ala

gcc Ala

tet Ser

cgt Arg 350

tac Tyr

ttc Phe

1056

ggc

gtc

gag

cag

ctc

gca

ttg

ctc

acc

cag

aaa

caa

ttg

gca

agc

atg

1104

Gly

Val

Glu

Gin

Leu

Ala

Leu

Leu

Thr

Gin

Lys

Gin

Leu

Ala

Ser

Met

355

360

365

gtg

gag

aaa

gcc

tet

atc

gaa

gat

gtg

atg

aaa

gtt

tta

ata

gca

tea

1152

Val

Glu

Lys

Ala

Ser

Ile

Glu

Asp

Val

Met

Lys

Val

Leu

Ile

Ala

Ser

370

375

380

aga

aag

caa

gac

atg

cat

caa

tta

tgg

acc

acc

tgc

tet

cac

tta

gtt

1200

Arg

Lys

Gin

Asp

Met

His

Gin

Leu

Trp

Thr

Thr

Cys

Ser

His

Leu

Val

385

390

395

400

atg

agc

aat

ctt

gaa

gaa

tet

ttg

aga

tet

cta

tcg

ttg

gat

ttc

ctg

1248

Met

Ser

Asn

Leu

Glu

Glu

Ser

Leu

Arg

Ser

Leu

Ser

Leu

Asp

Phe

Leu

405

410

415

aac

cta

cta

atc

aac

ggt

caa

get

ttc

tcc

gac

gtg

act

ttc

agc

gtt

1296

Asn

Leu

Leu

Ile

Asn

Gly

Gin

Ala

Phe

Ser

Asp

Val

Thr

Phe

Ser

Val

420

425

430

gaa

ggt

cgt

tta

gtc

cac

get

cac

cgt

tgt

atc

ctc

gcc

gca

cgg

agt

1344

Glu

Gly

Arg

Leu

Val

His

Ala

His

Arg

Cys

Ile

Leu

Ala

Ala

Arg

Ser

435

440

445

ctt

ttc

ttc

cgc

aaa

ttc

ttt

tgt

ggg

aca

gac

tea

cca

caa

cct

gtc

1392

Leu

Phe

Phe

Arg

Lys

Phe

Phe

Cys

Gly

Thr

Asp

Ser

Pro

Gin

Pro

Val

450

455

460

aca

ggt

ata

gac

ccg

acc

caa

cat

ggg

tcc

gta

ccc

get

agc

cca

aca

1440

Thr

Gly

Ile

Asp

Pro

Thr

Gin

His

Gly

Ser

Val

Pro

Ala

Ser

Pro

Thr

465

470

475

480

aga

ggc

tcc

acg

gcc

cca

get

gga

att

ata

cca

gtg

a

1477

Arg

Gly

Ser

Thr

Ala

Pro

Ala

Gly

Ile

Ile

Pro

Val

485

490

<210> 16 <211> 492 <212> PRT <213> Arabidopsis thaliana <400> 16

Met Ser Asn Leu

Asn Leu Leu Ile

Glu Glu Ser

Asn Gly Gin

Leu Arg Ser Leu

Ala Phe Ser Asp

Ser Leu Asp Phe Leu

Val Thr Phe Ser Val • ·

109

Glu Gly Arg 35

Leu Val

His

Ala His Arg Cys 40

Ile Leu

Ala 45

Ala

Arg

Ser

Leu

Phe

Phe

Arg

Lys

Phe

Phe

Cys

Gly

Thr

Asp

Ser

Pro

Gin

Pro

Val

50

55

60

Thr

Gly

Ile

Asp

Pro

Thr

Gin

His

Gly

Ser

Val

Pro

Ala

Ser

Pro

Thr

65

70

75

80

Arg

Gly

Ser

Thr

Ala

Pro

Ala

Gly

Ile

Ile

Pro

Val

Asn

Ser

Val

Gly

85

90

95

Tyr

Glu

Val

Phe

Leu

Leu

Leu

Leu

Gin

Phe

Leu

Tyr

Ser

Gly

Gin

Val

100

105

110

Ser

Ile

Val

Pro

Gin

Lys

His

Glu

Pro

Arg

Pro

Asn

Cys

Gly

Glu

Arg

115

120

125

Gly

Cys

Trp

His

Thr

His

Cys

Ser

Ala

Ala

Val

Asp

Leu

Ala

Leu

Asp

130

135

140

Thr

Leu

Ala

Ala

Ser

Arg

Tyr

Phe

Gly

Val

Glu

Gin

Leu

Ala

Leu

Leu

145

150

155

160

Thr

Gin

Lys

Gin

Leu

Ala

Ser

Met

Val

Glu

Lys

Ala

Ser

Ile

Glu

Asp

165

170

175

Val

Met

Lys

Val

Leu

Ile

Ala

Ser

Arg

Lys

Gin

Asp

Met

His

Gin

Leu

180

185

190

Trp

Thr

Thr

Cys

Ser

His

Leu

Val

Met

Ser

Asn

Leu

Glu

Glu

Ser

Leu

195

200

205

Arg

Ser

Leu

Ser

Leu

Asp

Phe

Leu

Asn

Leu

Leu

Ile

Asn

Gly

Gin

Ala

210

215

220

Phe

Ser

Asp

Val

Thr

Phe

Ser

Val

Glu

Gly

Arg

Leu

Val

His

Ala

His

225

230

235

240

Arg

Cys

Ile

Leu

Ala

Ala

Arg

Ser

Leu

Phe

Phe

Arg

Lys

Phe

Phe

Cys

245

250

255

Gly

Thr

Asp

Ser

Pro

Gin

Pro

Val

Thr

Gly

Ile

Asp

Pro

Thr

Gin

His

260

265

270

Gly

Ser

Val

Pro

Ala

Ser

Pro

Thr

Arg

Gly

Ser

Thr

Ala

Pro

Ala

Gly

275

280

285

Ile

Ile

Pro

Val

Asn

Ser

Val

Gly

Tyr

Glu

Val

Phe

Leu

Leu

Leu

Leu

290

295

300

Gin

Phe

Leu

Tyr

Ser

Gly

Gin

Val

Ser

Ile

Val

Pro

Gin

Lys

His

Glu

305

310

315

320

110

Pro

Arg Pro

Asn Cys 325

Gly

Glu

Arg

Gly Cys 330

Trp

His

Thr

His

Cys 335

Ser

Ala

Ala

Val

Asp

Leu

Ala

Leu

Asp

Thr

Leu

Ala

Ala

Ser

Arg

Tyr

Phe

340

345

350

Gly

Val

Glu

Gin

Leu

Ala

Leu

Leu

Thr

Gin

Lys

Gin

Leu

Ala

Ser

Met

355

360

365

Val

Glu

Lys

Ala

Ser

Ile

Glu

Asp

Val

Met

Lys

Val

Leu

Ile

Ala

Ser

370

375

380

Arg

Lys

Gin

Asp

Met

His

Gin

Leu

Trp

Thr

Thr

Cys

Ser

His

Leu

Val

385

390

395

400

Met

Ser

Asn

Leu

Glu

Glu

Ser

Leu

Arg

Ser

Leu

Ser

Leu

Asp

Phe

Leu

405

410

415

Asn

Leu

Leu

Ile

Asn

Gly

Gin

Ala

Phe

Ser

Asp

Val

Thr

Phe

Ser

Val

420

425

430

Glu

Gly

Arg

Leu

Val

His

Ala

His

Arg

Cys

Ile

Leu

Ala

Ala

Arg

Ser

435

440

445

Leu

Phe

Phe

Arg

Lys

Phe

Phe

Cys

Gly

Thr

Asp

Ser

Pro

Gin

Pro

Val

450

455

460

Thr

Gly

Ile

Asp

Pro

Thr

Gin

His

Gly

Ser

Val

Pro

Ala

Ser

Pro

Thr

465

470

475

480

Arg

Gly

Ser

Thr

Ala

Pro

Ala

Gly

Ile

Ile

Pro

Val

485

490

<210> 17 <211> 1804 <212> DNA <213> Arabidopsis thaliana <220>

<221> CDS <222> (1)..(1803) <223> AtNMLc4-l genomová sekvence <400> 17

atg Met 1

get Ala

gca Ala

act Thr

gca Ala 5

ata Ile

gag Glu

cca Pro

tet Ser

tea Ser 10

tet Ser

ata Ile

agt Ser

ttc Phe

aca Thr 15

tet Ser

48

tet

cac

tta

tea

aac

cct

tet

cct

gtt

gtt

act

act

tat

cac

tea

get

96

Ser

His

Leu

Ser

Asn

Pro

Ser

Pro

Val

Val

Thr

Thr

Tyr

His

Ser

Ala

20

25

30

111

gct Ala

aat Asn

ctt gaa gag

ctc Leu

age Ser

tet Ser 40

aac Asn

ttg Leu

gag Glu

cag Gin

ctt Leu 45

ctc Leu

act Thr

aat Asn

144

Leu 35

Glu

Glu

cca

gat

tgc

gat

tac

act

gac

gca

gag

atc

atc

att

gaa

gaa

gaa

gct

192

Pro

Asp

Cys

Asp

Tyr

Thr

Asp

Ala

Glu

Ile

Ile

Ile

Glu

Glu

Glu

Ala

50

55

60

aac

cct

gtg

agt

gtt

cat

aga

tgt

gtt

tta

gct

gct

agg

age

aag

ttt

240

Asn

Pro

Val

Ser

Val

His

Arg

Cys

Val

Leu

Ala

Ala

Arg

Ser

Lys

Phe

65

70

75

80

ttt

ctt

gat

ctg

ttt

aag

aaa

gat

aaa

gat

agt

agt

gag

aag

aaa

cct

288

Phe

Leu

Asp

Leu

Phe

Lys

Lys

Asp

Lys

Asp

Ser

Ser

Glu

Lys

Lys

Pro

85

90

95

aag

tat

caa

atg

aaa

gat

tta

tta

cca

tat

gga

aat

gtg

gga

cgt

gag

336

Lys

Tyr

Gin

Met

Lys

Asp

Leu

Leu

Pro

Tyr

Gly

Asn

Val

Gly

Arg

Glu

100

105

110

gca

ttt

ctg

cat

ttc

ttg

age

tat

atc

tac

act

ggg

agg

tta

aag

cct

384

Ala

Phe

Leu

His

Phe

Leu

Ser

Tyr

Ile

Tyr

Thr

Gly

Arg

Leu

Lys

Pro

115

120

125

ttt

cct

atc

gag

gtt

tca

act

tgt

gtt

gat

tca

gtt

tgt

gct

cat

gat

432

Phe

Pro

Ile

Glu

Val

Ser

Thr

Cys

Val

Asp

Ser

Val

Cys

Ala

His

Asp

130

135

140

tet

tgt

aaa

ccg

gcc

att

gat

ttt

gct

gtt

gag

ttg

atg

tat

gct

tca

480

Ser

Cys

Lys

Pro

Ala

Ile

Asp

Phe

Ala

Val

Glu

Leu

Met

Tyr

Ala

Ser

145

150

155

160

ttt

gtg

ttc

caa

atc

ccg

gat

ctt

gtt

tcg

tca

ttt

cag

cgg

aag

ctt

528

Phe

Val

Phe

Gin

Ile

Pro

Asp

Leu

Val

Ser

Ser

Phe

Gin

Arg

Lys

Leu

165

170

175

cgt

aac

tat

gtt

gag

aag

tca

cta

gta

gag

aat

gtt

ctt

cct

atc

ctc

576

Arg

Asn

Tyr

Val

Glu

Lys

Ser

Leu

Val

Glu

Asn

Val

Leu

Pro

Ile

Leu

180

185

190

tta

gtt

gcg

ttt

cat

tgt

gat

ttg

aca

cag

ctt

ctt

gat

caa

tgc

att

624

Leu

Val

Ala

Phe

His

Cys

Asp

Leu

Thr

Gin

Leu

Leu

Asp

Gin

Cys

Ile

195

200

205

gag

aga

gtg

gcg

aga

tca

gac

tta

gac

aga

ttc

tgt

atc

gaa

aag

gag

672

Glu

Arg

Val

Ala

Arg

Ser

Asp

Leu

Asp

Arg

Phe

Cys

Ile

Glu

Lys

Glu

210

215

220

ctt

cct

tta

gaa

gta

ttg

gaa

aaa

atc

aaa

cag

ctt

ega

gtt

aag

tcg

720

Leu

Pro

Leu

Glu

Val

Leu

Glu

Lys

Ile

Lys

Gin

Leu

Arg

Val

Lys

Ser

225

230

235

240

• · ··

112

gtg aac

ata ccc gag

gtg gag

gat Asp

aaa Lys

tcg Ser 250

ata gag

aga aca ggg

aaa Lys

768

Val

Asn

Ile

Pro

Glu 245

Val

Glu

Ile

Glu

Arg

Thr

Gly 255

gta

ctc

aag

gca

ttg

gat

tea

gat

gat

gta

gaa

ctc

gtg

aag

ctt

ctt

816

Val

Leu

Lys

Ala

Leu

Asp

Ser

Asp

Asp

Val

Glu

Leu

Val

Lys

Leu

Leu

260

265

270

ttg

act

gag

tea

gat

ata

act

cta

gac

caa

gcc

aat

ggt

cta

cat

tat

864

Leu

Thr

Glu

Ser

Asp

Ile

Thr

Leu

Asp

Gin

Ala

Asn

Gly

Leu

His

Tyr

275

280

285

gca

gtg

gca

tac

agt

gat

ccg

aaa

gtt

gtg

aca

cag

gtt

ctt

gat

cta

912

Ala

Val

Ala

Tyr

Ser

Asp

Pro

Lys

Val

Val

Thr

Gin

Val

Leu

Asp

Leu

290

295

300

gat

atg

gct

gat

gtt

aat

ttc

aga

aat

tcc

agg

ggg

tat

acg

gtt

ctt

960

Asp

Met

Ala

Asp

Val

Asn

Phe

Arg

Asn

Ser

Arg

Gly

Tyr

Thr

Val

Leu

305

310

315

320

cat

att

gct

gct

atg

cgt

aga

gag

cca

aca

att

atc

ata

cca

ctt

att

1008

His

Ile

Ala

Ala

Met

Arg

Arg

Glu

Pro

Thr

Ile

Ile

Ile

Pro

Leu

Ile

325

330

335

caa

aaa

gga

gct

aat

gct

tea

gat

ttc

acg

ttt

gat

gga

ege

agt

gcg

1056

Gin

Lys

Gly

Ala

Asn

Ala

Ser

Asp

Phe

Thr

Phe

Asp

Gly

Arg

Ser

Ala

340

345

350

gta

aat

ata

tgt

agg

aga

ctc

act

agg

ccg

aaa

gat

tat

cat

acc

aaa

1104

Val

Asn

Ile

Cys

Arg

Arg

Leu

Thr

Arg

Pro

Lys

Asp

Tyr

His

Thr

Lys

355

360

365

acc

tea

agg

aaa

gaa

cct

agt

aaa

tac

ege

tta

tgc

atc

gat

atc

ttg

1152

Thr

Ser

Arg

Lys

Glu

Pro

Ser

Lys

Tyr

Arg

Leu

Cys

Ile

Asp

Ile

Leu

370

375

380

gaa

agg

gaa

att

aga

agg

aat

cca

ttg

gtt

agt

ggg

gat

aca

ccc

act

1200

Glu

Arg

Glu

Ile

Arg

Arg

Asn

Pro

Leu

Val

Ser

Gly

Asp

Thr

Pro

Thr

385

390

395

400

tgt

tcc

cat

tcg

atg

ccc

gag

gat

ctc

caa

atg

agg

ttg

tta

tac

tta

1248

Cys

Ser

His

Ser

Met

Pro

Glu

Asp

Leu

Gin

Met

Arg

Leu

Leu

Tyr

Leu

405

410

415

gaa

aag

ega

tgg

gac

ttg

cgt

cag

ttg

ttc

ttc

cca

gca

gaa

gcc

aat

1296

Glu

Lys

Arg

Trp

Asp

Leu

Arg

Gin

Leu

Phe

Phe

Pro

Ala

Glu

Ala

Asn

420

425

430

gtg

gct

atg

gac

gtt

gct

aat

gtt

gaa

ggg

aca

agc

gag

tgc

aca

ggt

1344

Val

Ala

Met

Asp

Val

Ala

Asn

Val

Glu

Gly

Thr

Ser

Glu

Cys

Thr

Gly

435

440

445

ctt

cta

act

cca

cct

cca

tea

aat

gat

aca

act

gaa

aac

ttg

ggt

aaa

1392

Leu

Leu

Thr

Pro

Pro

Pro

Ser

Asn

Asp

Thr

Thr

Glu

Asn

Leu

Gly

Lys

450

455

460

113

gtc Val 465

gat Asp

tta Leu

aat Asn

gaa Glu

acg Thr 470

cct Pro

tat Tyr

gtg Val

caa Gin

acg Thr 475

aaa Lys

aga Arg

atg Met

ctt Leu

aca Thr 480

1440

cgt

atg

aaa

gcc

ctc

atg

aaa

aca

ggt

aaa

age

tta

agg

aaa

tgt

act

1488

Arg

Met

Lys

Ala

Leu

Met

Lys

Thr

Gly

Lys

Ser

Leu

Arg

Lys

Cys

Thr

485

490

495

ttc

aag

ttt

tat

tet

ctg

acc

aca

aga

ttg

act

gat

tcg

aaa

ccg

ttc

1536

Phe

Lys

Phe

Tyr

Ser

Leu

Thr

Thr

Arg

Leu

Thr

Asp

Ser

Lys

Pro

Phe

500

505

510

aac

aac

gca

gtt

gag

aca

ggt

cgg

aga

tac

ttc

cca

tet

tgt

tat

gag

1584

Asn

Asn

Ala

Val

Glu

Thr

Gly

Arg

Arg

Tyr

Phe

Pro

Ser

Cys

Tyr

Glu

515

520

525

gtt

ctg

gat

aag

tac

atg

gat

cag

tat

atg

gac

gaa

gaa

atc

cct

gat

1632

Val

Leu

Asp

Lys

Tyr

Met

Asp

Gin

Tyr

Met

Asp

Glu

Glu

Ile

Pro

Asp

530

535

540

atg

tcg

tat

ccc

gag

aaa

ggc

act

gtg

aaa

gag

aga

aga

cag

aag

agg

1680

Met

Ser

Tyr

Pro

Glu

Lys

Gly

Thr

Val

Lys

Glu

Arg

Arg

Gin

Lys

Arg

545

550

555

560

atg

aga

tat

aac

gag

ctg

aag

aac

gac

gtt

aaa

aaa

gca

tat

age

aaa

1728

Met

Arg

Tyr

Asn

Glu

Leu

Lys

Asn

Asp

Val

Lys

Lys

Ala

Tyr

Ser

Lys

565

570

575

gac

aaa

gtc

gcg

cgg

tet

tgt

ctt

tet

tet

tea

tea

cca

gct

tet

tet

1776

Asp

Lys

Val

Ala

Arg

Ser

Cys

Leu

Ser

Ser

Ser

Ser

Pro

Ala

Ser

Ser

580

585

590

ctt

aga

gaa

gcc

tta

gag

aat

cca

aca

t

1804

Leu

Arg

Glu

Ala

Leu

Glu

Asn

Pro

Thr

595

600

<210> 18 <211> 601 <212> PRT <213> Arabídopsis thaliana <400> 18

Met 1

Ala

Ala

Thr

Ala 5

Ile

Glu

Pro

Ser

Ser 10

Ser

Ile

Ser

Phe

Thr 15

Ser

Ser

His

Leu

Ser 20

Asn

Pro

Ser

Pro

Val 25

Val

Thr

Thr

Tyr

His 30

Ser

Ala

Ala

Asn

Leu

Glu

Glu

Leu

Ser

Ser

Asn

Leu

Glu

Gin

Leu

Leu

Thr

Asn

40 45

Pro Asp Cys Asp Tyr Thr Asp Ala Glu Ile Ile Ile Glu Glu Glu Ala

55 60

114

Asn Pro Val 65

Ser Val

His Arg Cys 70

Val

Leu Ala Ala 75

Arg

Ser

Lys

Phe 80

Phe

Leu

Asp

Leu

Phe

Lys

Lys

Asp

Lys

Asp

Ser

Ser

Glu

Lys

Lys

Pro

85

90

95

Lys

Tyr

Gin

Met

Lys

Asp

Leu

Leu

Pro

Tyr

Gly

Asn

Val

Gly

Arg

Glu

100

105

110

Ala

Phe

Leu

His

Phe

Leu

Ser

Tyr

Ile

Tyr

Thr

Gly

Arg

Leu

Lys

Pro

115

120

125

Phe

Pro

Ile

Glu

Val

Ser

Thr

Cys

Val

Asp

Ser

Val

Cys

Ala

His

Asp

130

135

140

Ser

Cys

Lys

Pro

Ala

Ile

Asp

Phe

Ala

Val

Glu

Leu

Met

Tyr

Ala

Ser

145

150

155

160

Phe

Val

Phe

Gin

Ile

Pro

Asp

Leu

Val

Ser

Ser

Phe

Gin

Arg

Lys

Leu

165

170

175

Arg

Asn

Tyr

Val

Glu

Lys

Ser

Leu

Val

Glu

Asn

Val

Leu

Pro

Ile

Leu

180

185

190

Leu

Val

Ala

Phe

His

Cys

Asp

Leu

Thr

Gin

Leu

Leu

Asp

Gin

Cys

Ile

195

200

205

Glu

Arg

Val

Ala

Arg

Ser

Asp

Leu

Asp

Arg

Phe

Cys

Ile

Glu

Lys

Glu

210

215

220

Leu

Pro

Leu

Glu

Val

Leu

Glu

Lys

Ile

Lys

Gin

Leu

Arg

Val

Lys

Ser

225

230

235

240

Val

Asn

Ile

Pro

Glu

Val

Glu

Asp

Lys

Ser

Ile

Glu

Arg

Thr

Gly

Lys

245

250

255

Val

Leu

Lys

Ala

Leu

Asp

Ser

Asp

Asp

Val

Glu

Leu

Val

Lys

Leu

Leu

260

265

270

Leu

Thr

Glu

Ser

Asp

Ile

Thr

Leu

Asp

Gin

Ala

Asn

Gly

Leu

His

Tyr

275

280

285

Ala

Val

Ala

Tyr

Ser

Asp

Pro

Lys

Val

Val

Thr

Gin

Val

Leu

Asp

Leu

290

295

300

Asp

Met

Ala

Asp

Val

Asn

Phe

Arg

Asn

Ser

Arg

Gly

Tyr

Thr

Val

Leu

305

310

315

320

His

Ile

Ala

Ala

Met

Arg

Arg

Glu

Pro

Thr

Ile

Ile

Ile

Pro

Leu

Ile

325

330

335

Gin

Lys

Gly

Ala

Asn

Ala

Ser

Asp

Phe

Thr

Phe

Asp

Gly

Arg

Ser

Ala

340

345

350

• 1»

115

Val

Asn

Ile 355

Cys

Arg

Arg

Leu Thr 360

Arg Pro

Lys Asp

Tyr 365

His

Thr

Lys

Thr

Ser

Arg

Lys

Glu

Pro

Ser

Lys

Tyr

Arg

Leu

Cys

Ile

Asp

Ile

Leu

370

375

380

Glu

Arg

Glu

Ile

Arg

Arg

Asn

Pro

Leu

Val

Ser

Gly

Asp

Thr

Pro

Thr

385

390

395

400

Cys

Ser

His

Ser

Met

Pro

Glu

Asp

Leu

Gin

Met

Arg

Leu

Leu

Tyr

Leu

405

410

415

Glu

Lys

Arg

Trp

Asp

Leu

Arg

Gin

Leu

Phe

Phe

Pro

Ala

Glu

Ala

Asn

420

425

430

Val

Ala

Met

Asp

Val

Ala

Asn

Val

Glu

Gly

Thr

Ser

Glu

Cys

Thr

Gly

435

440

445

Leu

Leu

Thr

Pro

Pro

Pro

Ser

Asn

Asp

Thr

Thr

Glu

Asn

Leu

Gly

Lys

450

455

460

Val

Asp

Leu

Asn

Glu

Thr

Pro

Tyr

Val

Gin

Thr

Lys

Arg

Met

Leu

Thr

465

470

475

480

Arg

Met

Lys

Ala

Leu

Met

Lys

Thr

Gly

Lys

Ser

Leu

Arg

Lys

Cys

Thr

485

490

495

Phe

Lys

Phe

Tyr

Ser

Leu

Thr

Thr

Arg

Leu

Thr

Asp

Ser

Lys

Pro

Phe

500

505

510

Asn

Asn

Ala

Val

Glu

Thr

Gly

Arg

Arg

Tyr

Phe

Pro

Ser

Cys

Tyr

Glu

515

520

525

Val

Leu

Asp

Lys

Tyr

Met

Asp

Gin

Tyr

Met

Asp

Glu

Glu

Ile

Pro

Asp

530

535

540

Met

Ser

Tyr

Pro

Glu

Lys

Gly

Thr

Val

Lys

Glu

Arg

Arg

Gin

Lys

Atg

545

550

555

560

Met

Arg

Tyr

Asn

Glu

Leu

Lys

Asn

Asp

Val

Lys

Lys

Ala

Tyr

Ser

Lys

565

570

575

Asp

Lys

Val

Ala

Arg

Ser

Cys

Leu

Ser

Ser

Ser

Ser

Pro

Ala

Ser

Ser

580

585

590

Leu

Arg

Glu

Ala

Leu

Glu

Asn

Pro

Thr

595

600

<210> 19 <211> 1803 <212> DNA «· *r φ · · φ φ φ φφ • · · · · ♦ · φ · φφ ··

Φ

4» «· Λ··<

♦ · Φ · ·· • · Φ Φ ··

Φ Φ ΦΦΦ 9 ♦Φ

Φ · · Λ· • Φ Φ·«·

116 <213> Arabidopsis thaliana <220>

<221> CDS <222> (1)..(1803) <223> AtNMLc4-2 genomová sekvence <400> 19

atg Met 1

gcc Ala

acc acc

acc Thr 5

acc Thr

acc Thr

acc Thr

acc Thr

gct aga ttc

tet Ser

gat tca tac

48

Thr

Thr

Ala 10

Arg

Phe

Asp

Ser 15

Tyr

gag

ttc

agc

aac

aca

agc

ggc

aat

agc

ttc

ttc

gcc

gcc

gag

tca

tet

96

Glu

Phe

Ser

Asn

Thr

Ser

Gly

Asn

Ser

Phe

Phe

Ala

Ala

Glu

Ser

Ser

20

25

30

ctt

gat

tat

ccg

acg

gaa

ttt

ctc

acg

cca

ccg

gag

gta

tca

gct

ctt

144

Leu

Asp

Tyr

Pro

Thr

Glu

Phe

Leu

Thr

Pro

Pro

Glu

Val

Ser

Ala

Leu

35

40

45

aaa

ctt

ctg

tet

aac

tgc

ctc

gag

tet

gtt

ttc

gac

tcg

ccg

gag

acg

192

Lys

Leu

Leu

Ser

Asn

Cys

Leu

Glu

Ser

Val

Phe

Asp

Ser

Pro

Glu

Thr

50

55

60

ttc

tac

agc

gat

gct

aag

cta

gtt

ctc

gcc

ggc

ggc

cgg

gaa

gtt

tet

240

Phe

Tyr

Ser

Asp

Ala

Lys

Leu

Val

Leu

Ala

Gly

Gly

Arg

Glu

Val

Ser

65

70

75

80

ttt

cac

cgt

tgt

att

ctt

tcc

gcg

aga

att

cct

gtc

ttc

aaa

agc

gct

288

Phe

His

Arg

Cys

Ile

Leu

Ser

Ala

Arg

Ile

Pro

Val

Phe

Lys

Ser

Ala

85

90

95

tta

gcc

acc

gtg

aag

gaa

caa

aaa

tcc

tcc

acc

acc

gtg

aag

ctc

cag

336

Leu

Ala

Thr

Val

Lys

Glu

Gin

Lys

Ser

Ser

Thr

Thr

Val

Lys

Leu

Gin

100

105

110

ctg

aaa

gag

atc

gcc

aga

gat

tac

gaa

gtc

ggc

ttt

gac

tcg

gtt

gtg

384

Leu

Lys

Glu

Ile

Ala

Arg

Asp

Tyr

Glu

Val

Gly

Phe

Asp

Ser

Val

Val

115

120

125

gcg

gtt

ttg

gcg

tat

gtt

tac

agc

ggc

aga

gtg

agg

tcc

ccg

ccg

aag

432

Ala

Val

Leu

Ala

Tyr

Val

Tyr

Ser

Gly

Arg

Val

Arg

Ser

Pro

Pro

Lys

130

135

140

gga

gct

tet

gct

tgc

gta

gac

gac

gat

tgt

tgc

cac

gtg

gct

tgc

cgg

480

Gly

Ala

Ser

Ala

Cys

Val

Asp

Asp

Asp

Cys

Cys

His

Val

Ala

Cys

Arg

145

150

155

160

tca

aag

gtg

gat

ttc

atg

gtg

gag

gtt

ctt

tat

ctg

tet

ttc

gtt

ttc

528

Ser

Lys

Val

Asp

Phe

Met

Val

Glu

Val

Leu

Tyr

Leu

Ser

Phe

Val

Phe

165

170

175

• · ·· ·· ·· ·· · • · · ···· · · · · • · · · · · ·· · · e · • ·· ··· ······ · · • · · · ·· · · · · • · · · · * ·· ·· · · ·

117

cag att

caa Gin

gaa Glu 180

tta gtt Leu Val

act Thr

ctg tat gag agg cag

ttc Phe

ttg Leu 190

gaa Glu

att Ile

576

Gin

Ile

Leu

Tyr Glu 185

Arg

Gin

gta

gac

aaa

gtt

gta

gtc

gaa

gac

atc

ttg

gtt

ata

ttc

aag

ctt

gat

624

Val

Asp

Lys

Val

Val

Val

Glu

Asp

Ile

Leu

Val

Ile

Phe

Lys

Leu

Asp

195

200

205

act

cta

tgt

ggt

aca

aca

tac

aag

aag

ctt

ttg

gat

aga

tgc

ata

gaa

672

Thr

Leu

Cys

Gly

Thr

Thr

Tyr

Lys

Lys

Leu

Leu

Asp

Arg

Cys

Ile

Glu

210

215

220

att

atc

gtg

aag

tet

gat

ata

gaa

cta

gtt

agt

ctt

gag

aag

tet

tta

720

Ile

Ile

Val

Lys

Ser

Asp

Ile

Glu

Leu

Val

Ser

Leu

Glu

Lys

Ser

Leu

225

230

235

240

cct

caa

cac

att

ttc

aag

caa

atc

ata

gac

atc

ege

gaa

gcg

ctc

tgt

768

Pro

Gin

His

Ile

Phe

Lys

Gin

Ile

Ile

Asp

Ile

Arg

Glu

Ala

Leu

Cys

245

250

255

cta

gag

cca

cct

aaa

cta

gaa

agg

cat

gtc

aag

aac

ata

tac

aag

gcg

816

Leu

Glu

Pro

Pro

Lys

Leu

Glu

Arg

His

Val

Lys

Asn

Ile

Tyr

Lys

Ala

260

265

270

cta

gac

tea

gat

gat

gtt

gag

ctt

gtc

aag

atg

ctt

ttg

cta

gaa

gga

864

Leu

Asp

Ser

Asp

Asp

Val

Glu

Leu

Val

Lys

Met

Leu

Leu

Leu

Glu

Gly

275

280

285

cac

acc

aat

ctc

gat

gag

gcg

tat

gct

ctt

cat

ttt

gct

atc

gct

cac

912

His

Thr

Asn

Leu

Asp

Glu

Ala

Tyr

Ala

Leu

His

Phe

Ala

Ile

Ala

His

290

295

300

tgc

gct

gtg

aag

acc

gcg

tat

gat

ctc

ctc

gag

ctt

gag

ctt

gcg

gat

960

Cys

Ala

Val

Lys

Thr

Ala

Tyr

Asp

Leu

Leu

Glu

Leu

Glu

Leu

Ala

Asp

305

310

315

320

gtt

aac

ctt

aga

aat

ccg

agg

gga

tac

act

gtg

ctt

cat

gtt

gct

gcg

1008

Val

Asn

Leu

Arg

Asn

Pro

Arg

Gly

Tyr

Thr

Val

Leu

His

Val

Ala

Ala

325

330

335

atg

cgg

aag

gag

ccg

aag

ttg

ata

ata

tet

ttg

tta

atg

aaa

ggg

gca

1056

Met

Arg

Lys

Glu

Pro

Lys

Leu

Ile

Ile

Ser

Leu

Leu

Met

Lys

Gly

Ala

340

345

350

aat

att

tta

gac

aca

aca

ttg

gat

ggt

aga

acc

gct

tta

gtg

att

gta

1104

Asn

Ile

Leu

Asp

Thr

Thr

Leu

Asp

Gly

Arg

Thr

Ala

Leu

Val

Ile

Val

355

360

365

aaa

ega

ctc

act

aaa

gcg

gat

gac

tac

aaa

act

agt

acg

gag

gac

ggt

1152

Lys

Arg

Leu

Thr

Lys

Ala

Asp

Asp

Tyr

Lys

Thr

Ser

Thr

Glu

Asp

Gly

370

375

380

• · • ·

118

acg cct

tet Ser

ctg Leu

aaa Lys

ggc Gly 390

gga Gly

tta tgc

ata Ile

gag Glu 395

gta Val

ctt Leu

gag Glu

cat His

gaa Glu 400

1200

Thr 385

Pro

Leu

Cys

caa

aaa

cta

gaa

tat

ttg

tcg

cct

ata

gag

gct

tea

ctt

tet

ctt

cca

1248

Gin

Lys

Leu

Glu

Tyr

Leu

Ser

Pro

Ile

Glu

Ala

Ser

Leu

Ser

Leu

Pro

405

410

415

gta

act

cca

gag

gag

ttg

agg

atg

agg

ttg

ctc

tat

tat

gaa

aac

ega

1296

Val

Thr

Pro

Glu

Glu

Leu

Arg

Met

Arg

Leu

Leu

Tyr'

Tyr

Glu

Asn

Arg

420

425

430

gtt

gca

ctt

gct

ega

ctt

ctc

ttt

cca

gtg

gaa

act

gaa

act

gta

cag

1344

Val

Ala

Leu

Ala

Arg

Leu

Leu

Phe

Pro

Val

Glu

Thr

Glu

Thr

Val

Gin

435

440

445

ggt

att

gcc

aaa

ttg

gag

gaa

aca

tgc

gag

ttt

aca

gct

tet

agt

ctc

1392

Gly

Ile

Ala

Lys

Leu

Glu

Glu

Thr

Cys

Glu

Phe

Thr

Ala

Ser

Ser

Leu

450

455

460

gag

cct

gat

cat

cac

att

ggt

gaa

aag

cgg

aca

tea

cta

gac

cta

aat

1440

Glu

Pro

Asp

His

His

Ile

Gly

Glu

Lys

Arg

Thr

Ser

Leu

Asp

Leu

Asn

465

470

475

480

atg

gcg

ccg

ttc

caa

atc

cat

gag

aag

cat

ttg

agt

aga

cta

aga

gca

1488

Met

Ala

Pro

Phe

Gin

Ile

His

Glu

Lys

His

Leu

Ser

Arg

Leu

Arg

Ala

485

490

495

ctt

tgt

aaa

acc

gtg

gaa

ctg

ggg

aaa

ege

tac

ttc

aaa

ega

tgt

tcg

1536

Leu

Cys

Lys

Thr

Val

Glu

Leu

Gly

Lys

Arg

Tyr

Phe

Lys

Arg

Cys

Ser

500

505

510

ctt

gat

cac

ttt

atg

gat

act

gag

gac

ttg

aat

cat

ctt

gct

agc

gta

1584

Leu

Asp

His

Phe

Met

Asp

Thr

Glu

Asp

Leu

Asn

His

Leu

Ala

Ser

Val

515

520

525

gaa

gaa

gat

act

cct

gag

aaa

cgg

cta

caa

aag

aag

caa

agg

tac

atg

1632

Glu

Glu

Asp

Thr

Pro

Glu

Lys

Arg

Leu

Gin

Lys

Lys

Gin

Arg

Tyr

Met

530

535

540

gaa

cta

caa

gag

act

ctg

atg

aag

acc

ttt

agt

gag

gac

aag

gag

gaa

1680

Glu

Leu

Gin

Glu

Thr

Leu

Met

Lys

Thr

Phe

Ser

Glu

Asp

Lys

Glu

Glu

545

550

555

560

tgt

gga

aag

tet

tcc

aca

ccg

aaa

cca

acc

tet

gcg

gtg

agg

tet

aat

1728

Cys

Gly

Lys

Ser

Ser

Thr

Pro

Lys

Pro

Thr

Ser

Ala

Val

Arg

Ser

Asn

565

570

575

aga

aaa

ctc

tet

cac

cgg

ege

cta

aaa

gtg

gac

aaa

cgg

gat

ttt

ttg

1776

Arg

Lys

Leu

Ser

His

Arg

Arg

Leu

Lys

Val

Asp

Lys

Arg

Asp

Phe

Leu

580

585

590

• ·

119

1803 aaa ega cct tac ggg aac ggg gat taa

Lys Arg Pro Tyr Gly Asn Gly Asp

595 600 <210> 20 <211> 600 <212> PRT <213> Arabidopsis thaliana

<400> 20

Met 1

Ala Thr

Thr

Thr Thr Thr Thr Thr Ala

Arg Phe

Ser

Asp

Ser 15

Tyr

5

10

Glu

Phe

Ser

Asn

Thr

Ser

Gly

Asn

Ser

Phe

Phe

Ala

Ala

Glu

Ser

Ser

20

25

30

Leu

Asp

Tyr

Pro

Thr

Glu

Phe

Leu

Thr

Pro

Pro

Glu

Val

Ser

Ala

Leu

35

40

45

Lys

Leu

Leu

Ser

Asn

Cys

Leu

Glu

Ser

Val

Phe

Asp

Ser

Pro

Glu

Thr

50

55

60

Phe

Tyr

Ser

Asp

Ala

Lys

Leu

Val

Leu

Ala

Gly

Gly

Arg

Glu

Val

Ser

65

70

75

80

Phe

His

Arg

Cys

Ile

Leu

Ser

Ala

Arg

Ile

Pro

Val

Phe

Lys

Ser

Ala

85

90

95

Leu

Ala

Thr

Val

Lys

Glu

Gin

Lys

Ser

Ser

Thr

Thr

Val

Lys

Leu

Gin

100

105

110

Leu

Lys

Glu

Ile

Ala

Arg

Asp

Tyr

Glu

Val

Gly

Phe

Asp

Ser

Val

Val

115

120

125

Ala

Val

Leu

Ala

Tyr

Val

Tyr

Ser

Gly

Arg

Val

Arg

Ser

Pro

Pro

Lys

130

135

140

Gly

Ala

Ser

Ala

Cys

Val

Asp

Asp

Asp

Cys

Cys

His

Val

Ala

Cys

Arg

145

150

155

160

Ser

Lys

Val

Asp

Phe

Met

Val

Glu

Val

Leu

Tyr

Leu

Ser

Phe

Val

Phe

165

170

175

Gin

Ile

Gin

Glu

Leu

Val

Thr

Leu

Tyr

Glu

Arg

Gin

Phe

Leu

Glu

Ile

180

185

190

Val

Asp

Lys

Val

Val

Val

Glu

Asp

Ile

Leu

Val

Ile

Phe

Lys

Leu

Asp

195

200

205

Thr

Leu

Cys

Gly

Thr

Thr

Tyr

Lys

Lys

Leu

Leu

Asp

Arg

Cys

Ile

Glu

210

215

220

Ile 225	Ile	Val	Lys	Ser	Asp 230	Ile	Glu	Leu
Pro	Gin	His	Ile	Phe 245	Lys	Gin	Ile	Ile
Leu	Glu	Pro	Pro 260	Lys	Leu	Glu	Arg	His 265
Leu	Asp	Ser 275	Asp	Asp	Val	Glu	Leu 280	Val
His	Thr 290	Asn	Leu	Asp	Glu	Ala 295	Tyr	Ala
Cys 305	Ala	Val	Lys	Thr	Ala 310	Tyr	Asp	Leu
Val	Asn	Leu	Arg	Asn 325	Pro	Arg	Gly	Tyr
Met	Arg	Lys	Glu 340	Pro	Lys	Leu	Ile	Ile 345
Asn	Ile	Leu 355	Asp	Thr	Thr	Leu	Asp 360	Gly
Lys	Arg 370	Leu	Thr	Lys	Ala	Asp 375	Asp	Tyr
Thr 385	Pro	Ser	Leu	Lys	Gly 390	Gly	Leu	Cys
Gin	Lys	Leu	Glu	Tyr 405	Leu	Ser	Pro	Ile
Val	Thr	Pro	Glu 420	Glu	Leu	Arg	Met	Arg 425
Val	Ala	Leu 435	Ala	Arg	Leu	Leu	Phe 440	Pro
Gly	Ile 450	Ala	Lys	Leu	Glu	Glu 455	Thr	Cys
Glu 465	Pro	Asp	His	His	Ile 470	Gly	Glu	Lys
Met	Ala	Pro	Phe	Gin 485	Ile	His	Glu	Lys
Leu	cys	Lys	Thr 500	Val	Glu	Leu	Gly	Lys 505

				• · « · • · • · • ·	• · * • · · • · • ·	• · · · · · · • ·· · · · · · • · · · · · · ·· ······ · · • · · · ·· ···
120
Val	Ser 235	Leu	Glu	Lys	Ser	Leu 240
Asp 250	Ile	Arg	Glu	Ala	Leu 255	Cys
Val	Lys	Asn	Ile	Tyr 270	Lys	Ala
Lys	Met	Leu	Leu 285	Leu	Glu	Gly
Leu	His	Phe 300	Ala	Ile	Ala	His
Leu	Glu 315	Leu	Glu	Leu	Ala	Asp 320
Thr 330	Val	Leu	His	Val	Ala 335	Ala
Ser	Leu	Leu	Met	Lys 350	Gly	Ala
Arg	Thr	Ala	Leu 365	Val	Ile	Val
Lys	Thr	Ser 380	Thr	Glu	Asp	Gly
Ile	Glu 395	Val	Leu	Glu	His	Glu 400
Glu 410	Ala	Ser	Leu	Ser	Leu 415	Pro
Leu	Leu	Tyr	Tyr	Glu 430	Asn	Arg
Val	Glu	Thr	Glu 445	Thr	Val	Gin
Glu	Phe	Thr 460	Ala	Ser	Ser	Leu
Arg	Thr 475	Ser	Leu	Asp	Leu	Asn 480
His 490	Leu	Ser	Arg	Leu	Arg 495	Ala
Arg	Tyr	Phe	Lys	Arg 510	Cys	Ser

121

Leu

Asp His 515

Phe Met

Asp Thr

Glu Asp Leu Asn His Leu

Ala

Ser

Val

520

525

Glu

Glu

Asp

Thr

Pro

Glu

Lys

Arg

Leu

Gin

Lys

Lys

Gin

Arg

Tyr

Met

530

535

540

Glu

Leu

Gin

Glu

Thr

Leu

Met

Lys

Thr

Phe

Ser

Glu

Asp

Lys

Glu

Glu

545

550

555

560

Cys

Gly

Lys

Ser

Ser

Thr

Pro

Lys

Pro

Thr

Ser

Ala

Val

Arg

Ser

Asn

565

570

575

Arg

Lys

Leu

Ser

His

Arg

Arg

Leu

Lys

Val

Asp

Lys

Arg

Asp

Phe

Leu

580

585

590

Lys

Arg

Pro

Tyr

Gly

Asn

Gly

Asp

595 600 <210> 21 <211> 28 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>

<223> Popis umělé sekvence: PCR primer NIM IA <400> 21 gakattattg tcaagtctaa tgtwgata <210> 22 <211> 25 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>

<223> Popis umělé sekvence: PCR primer NIM 1B <400> 22 aytkgaytck gatgatrttg artta <210> 23 <211> 27 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>

<223 > Popis umělé sekvence: PCR primer NIM IC <400> 23 taaytcaaya tcatcmgart cmartgc • ·

122 <210> 24 <211> 28 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>

<223> Popis umělé sekvence: PCR primer NIM ID <220>

<221> různé <222> (1)..(28) <223> n = a, t, c nebo g <400> 24 gttkagcmag nscaactcta ttttcaag <210> 25 <211> 32 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>

<223> Popis umělé sekvence: PCR primer NIM 2A <400> 25 tgcatwgara twrttgtsaa gtctratgtw ga <210> 26 <211> 27 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>

<223> Popis umělé sekvence: PCR primer NIM 2B <400> 26 ggcaytggay tcwgatgatg ttgaryt <210> 27 <211> 27 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>

<223> Popis umělé sekvence: PCR primer NIM 2C <400> 27 arytcaacat catcwgartc cartgcc

123 <210> 28 <211> 31 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>

<223> Popis umělé sekvence: PCR primer NIM 2D <400> 28 agttkagcma gdccaactck attttcaarr t <210> 29 <211> 659 <212> DNA <213> Nicotiana tabacum <220>

<221> CDS <222> (1)..(657) <223> Tobacco A <400> 29

tgc Cys 1

atg Met

gag att

att Ile 5

gtc aag

tet Ser

aat gtt gat Asn Val Asp 10

atc Ile

ata Ile

acc Thr

ctt Leu 15

gat Asp

48

Glu

Ile

Val

Lys

aag

gcc

ttg

cct

cat

gac

att

gta

aaa

caa

att

acc

gat

tea

ega

gca

96

Lys

Ala

Leu

Pro

His

Asp

Ile

Val

Lys

Gin

Ile

Thr

Asp

Ser

Arg

Ala

20

25

30

gaa

ctt

ggt

cta

caa

ggg

cct

gaa

agc

aat

ggt

ttt

cct

gat

aaa

cat

144

Glu

Leu

Gly

Leu

Gin

Gly

Pro

Glu

Ser

Asn

Gly

Phe

Pro

Asp

Lys

His

35

40

45

gtt

aag

agg

ata

cat

agg

gca

tta

gat

tet

gat

gat

gtt

gaa

tta

ctg

192

Val

Lys

Arg

Ile

His

Arg

Ala

Leu

Asp

Ser

Asp

Asp

Val

Glu

Leu

Leu

50

55

60

cag

atg

ttg

cta

aga

gag

ggg

cat

act

act

cta

gat

gat

gca

tat

get

240

Gin

Met

Leu

Leu

Arg

Glu

Gly

His

Thr

Thr

Leu

Asp

Asp

Ala

Tyr

Ala

65

70

75

80

ctc

cac

tat

get

gta

gca

tat

tgc

gat

gca

aag

act

aca

gca

gaa

ctt

288

Leu

His

Tyr

Ala

Val

Ala

Tyr

Cys

Asp

Ala

Lys

Thr

Thr

Ala

Glu

Leu

85

90

95

cta

gat

ctt

gca

ctt

get

gat

gtt

aat

cat

caa

aat

tea

aga

gga

tac

336

Leu

Asp

Leu

Ala

Leu

Ala

Asp

Val

Asn

His

Gin

Asn

Ser

Arg

Gly

Tyr

100

105

110

124

aca Thr

gtg Val

ctg cat gtt

gca gcc

atg agg aaa gag cct

aaa att

ata Ile

gtg Val

3 84

Leu 115

His

Val

Ala

Ala

Met Arg 120

Lys

Glu

Pro

Lys 125

Ile

tcc

ctt

tta

acc

aaa

gga

gct

aga

cct

tet

gat

ctg

aca

tcc

gat

ggc

432

Ser

Leu

Leu

Thr

Lys

Gly

Ala

Arg

Pro

Ser

Asp

Leu

Thr

Ser

Asp

Gly

130

135

140

aga

aaa

gca

ctt

caa

att

gcc

aag

agg

ctc

act

agg

ctt

gtg

gat

ttc

480

Arg

Lys

Ala

Leu

Gin

Ile

Ala

Lys

Arg

Leu

Thr

Arg

Leu

Val

Asp

Phe

145

150

155

160

agt

aag

tet

cca

gag

gaa

gga

aaa

tet

gct

tcg

aag

gat

cgg

tta

tgc

528

Ser

Lys

Ser

Pro

Glu

Glu

Gly

Lys

Ser

Ala

Ser

Lys

Asp

Arg

Leu

Cys

165

170

175

att

gag

att

ctg

gag

caa

gca

gaa

aga

aga

gat

cca

ctg

cta

gga

gaa

576

Ile

Glu

Ile

Leu

Glu

Gin

Ala

Glu

Arg

Arg

Asp

Pro

Leu

Leu

Gly

Glu

180

185

190

gct

tet

gta

tet

ctt

gct

atg

gcg

ggc

gat

gat

ttg

cgt

atg

aag

ctg

624

Ala

Ser

Val

Ser

Leu

Ala

Met

Ala

Gly

Asp

Asp

Leu

Arg

Met

Lys

Leu

195

200

205

tta

tac

ctt

gaa

aat

aga

gtt

ggc

ctt

gct

caa

ct

659

Leu

Tyr

Leu

Glu

Asn

Arg

Val

Gly

Leu

Ala

Gin

210

215

<210> 30 <211> 219 <212> PRT <213> Nicotiana tabacum

<400> 30

Ile

Ile

Thr

Leu Asp 15

Cys Met 1

Glu

Ile

Ile Val 5

Lys

Ser

Asn

Val 10

Asp

Lys

Ala

Leu

Pro

His

Asp

Ile

Val

Lys

Gin

Ile

Thr

Asp

Ser

Arg

Ala

20

25

30

Glu

Leu

Gly

Leu

Gin

Gly

Pro

Glu

Ser

Asn

Gly

Phe

Pro

Asp

Lys

His

35

40

45

Val

Lys

Arg

Ile

His

Arg

Ala

Leu

Asp

Ser

Asp

Asp

Val

Glu

Leu

Leu

50

55

60

Gin

Met

Leu

Leu

Arg

Glu

Gly

His

Thr

Thr

Leu

Asp

Asp

Ala

Tyr

Ala

65

70

75

80

Leu

His

Tyr

Ala

Val

Ala

Tyr

Cys

Asp

Ala

Lys

Thr

Thr

Ala

Glu

Leu

85

90

95

125

Leu Asp Leu Ala Leu Ala Asp 100

Val

Asn His 105

Gin Asn

Ser

Arg 110

Gly

Tyr

Thr

Val

Leu

His

Val

Ala

Ala

Met

Arg

Lys

Glu

Pro

Lys

Ile

Ile

Val

115

120

125

Ser

Leu

Leu

Thr

Lys

Gly

Ala

Arg

Pro

Ser

Asp

Leu

Thr

Ser

Asp

Gly

130

135

140

Arg

Lys

Ala

Leu

Gin

Ile

Ala

Lys

Arg

Leu

Thr

Arg

Leu

Val

Asp

Phe

145

150

155

160

Ser

Lys

Ser

Pro

Glu

Glu

Gly

Lys

Ser

Ala

Ser

Lys

Asp

Arg

Leu

Cys

165

170

175

Ile

Glu

Ile

Leu

Glu

Gin

Ala

Glu

Arg

Arg

Asp

Pro

Leu

Leu

Gly

Glu

180

185

190

Ala

Ser

Val

Ser

Leu

Ala

Met

Ala

Gly

Asp

Asp

Leu

Arg

Met

Lys

Leu

195

200

205

Leu

Tyr

Leu

Glu

Asn

Arg

Val

Gly

Leu

Ala

Gin

210

215

<210> 31 <211> 498 <212> DNA <213> Nicotiana tabacum <220>

<221> CDS <222> (2)..(496) <223> Tabák Β <400> 31 g gca ctg gat tet gat gat gtt gag ctg gtc aag ctt cta ctc aac gag 49 Ala Leu Asp Ser Asp Asp Val Glu Leu Val Lys Leu Leu Leu Asn Glu

1

5

10

15

tet

gag

ata

agc

tta

gat

gaa

gcc

tac

get

ctt

cat

tat

get

gtt

gca

97

Ser

Glu

Ile

Ser

Leu

Asp

Glu

Ala

Tyr

Ala

Leu

His

Tyr

Ala

Val

Ala

20

25

30

tat

tgt

gat

ccc

aag

gtt

gtg

act

gag

gtt

ctt

gga

ctg

ggt

gtt

get

145

Tyr

Cys

Asp

Pro

Lys

Val

Val

Thr

Glu

Val

Leu

Gly

Leu

Gly

Val

Ala

35

40

45

gat

gtc

aat

cta

cgt

aat

act

ege

ggt

tac

act

gtg

ctt

cac

att

get

193

Asp

Val

Asn

Leu

Arg

Asn

Thr

Arg

Gly

Tyr

Thr

Val

Leu

His

Ile

Ala

55 60

126

gcc atg Ala Met 65

cgt Arg

aag gag

cca gca Pro Ala 70

ata Ile

att gta tcg ctt

ttg Leu

act Thr

aag Lys

gga Gly 80

241

Lys

Glu

Ile

Val

Ser 75

Leu

gct

cat

gtg

tca

gag

att

aca

ttg

gat

ggg

caa

agt

gct

gtt

agt

atc

289

Ala

His

Val

Ser

Glu

Ile

Thr

Leu

Asp

Gly

Gin

Ser

Ala

Val

Ser

Ile

85

90

95

tgt

agg

agg

cta

act

agg

cct

aag

gag

tac

cat

gca

aaa

aca

gaa

caa

337

Cys

Arg

Arg

Leu

Thr

Arg

Pro

Lys

Glu

Tyr

His

Ala

Lys

Thr

Glu

Gin

100

105

110

ggc

cag

gaa

gca

aac

aaa

gat

cgg

gta

tgt

att

gat

gtt

ttg

gag

aga

385

Gly

Gin

Glu

Ala

Asn

Lys

Asp

Arg

Val

Cys

Ile

Asp

Val

Leu

Glu

Arg

115

120

125

gag

atg

cgt

cgc

aac

cca

atg

gct

gga

gat

gca

ttg

ctt

tet

tcc

caa

433

Glu

Met

Arg

Arg

Asn

Pro

Met

Ala

Gly

Asp

Ala

Leu

Leu

Ser

Ser

Gin

130

135

140

atg

ttg

gcc

gat

gat

ctg

cac

atg

aaa

ctg

cac

tat

ttt

gaa

aat

ega

481

Met

Leu

Ala

Asp

Asp

Leu

His

Met

Lys

Leu

His

Tyr

Phe

Glu

Asn

Arg

145

150

155

160

498 gtt gga ctt gct caa ct

Val Gly Leu Ala Gin

165 <210> 32 <211> 165 <212> PRT <213> Nicotiana tabacum

<400> 32

Leu Leu

Leu Asn 15

Glu

Ala 1

Leu Asp

Ser Asp 5

Asp

Val

Glu

Leu Val 10

Lys

Ser

Glu

Ile

Ser

Leu

Asp

Glu

Ala

Tyr

Ala

Leu

His

Tyr

Ala

Val

Ala

20

25

30

Tyr

Cys

Asp

Pro

Lys

Val

Val

Thr

Glu

Val

Leu

Gly

Leu

Gly

Val

Ala

35

40

45

Asp

Val

Asn

Leu

Arg

Asn

Thr

Arg

Gly

Tyr

Thr

Val

Leu

His

Ile

Ala

50

55

60

Ala

Met

Arg

Lys

Glu

Pro

Ala

Ile

Ile

Val

Ser

Leu

Leu

Thr

Lys

Gly

65

70

75

80

Ala

His

Val

Ser

Glu

Ile

Thr

Leu

Asp

Gly

Gin

Ser

Ala

Val

Ser

Ile

85

90

95

v ·

127

Cys

Arg

Arg

Leu 100

Thr

Arg

Pro

Lys

Glu 105

Tyr

His

Ala

Lys

Thr 110

Glu

Gin

Gly

Gin

Glu 115

Ala

Asn

Lys

Asp

Arg 120

Val

Cys

Ile

Asp

Val 125

Leu

Glu

Arg

Glu

Met 130

Arg

Arg

Asn

Pro

Met 135

Ala

Gly

Asp

Ala

Leu 140

Leu

Ser

Ser

Gin

Met 145

Leu

Ala

Asp

Asp

Leu 150

His

Met

Lys

Leu

His 155

Tyr

Phe

Glu

Asn

Arg 160

Val Gly Leu Ala Gin

165 <210> 33 <211> 498 <212> DNA <213> Nicotiana tabacum <220>

<221> CDS <222> (2)..(496) <223> Tabák C <400> 33 g gca ctg gac tcw gat gat gtt gag ttt gtc aag ctt cta ctg agt gag 49 Ala Leu Asp Xaa Asp Asp Val Glu Phe Val Lys Leu Leu Leu Ser Glu 15 10 15

tet Ser

aac Asn

ata agc

tta gat Leu Asp

gaa gcc

tac get

ctt Leu

cat His

tat get gtg gca

97

Ile

Ser 20

Glu

Ala

Tyr 25

Ala

Tyr

Ala 30

Val

Ala

tat

tgt

gat

ccc

aag

gtt

gtg

act

gag

gtt

ctt

gga

ctg

ggt

gtt

gcg

145

Tyr

Cys

Asp

Pro

Lys

Val

Val

Thr

Glu

Val

Leu

Gly

Leu

Gly

Val

Ala

35

40

45

gat

gtc

aac

cta

cgt

aat

act

cgt

ggt

tac

act

gtg

ctt

cac

att

get

193

Asp

Val

Asn

Leu

Arg

Asn

Thr

Arg

Gly

Tyr

Thr

Val

Leu

His

Ile

Ala

50

55

60

tcc

atg

cgt

aag

gag

cca

gca

gta

att

gta

tcg

ctt

ttg

act

aag

gga

241

Ser

Met

Arg

Lys

Glu

Pro

Ala

Val

Ile

Val

Ser

Leu

Leu

Thr

Lys

Gly

65

70

75

80

get

cgt

gca

tea

gag

act

aca

ttg

gat

ggg

cag

agt

get

gtt

agt

atc

289

Ala

Arg

Ala

Ser

Glu

Thr

Thr

Leu

Asp

Gly

Gin

Ser

Ala

Val

Ser

Ile

85

90

95

• · ··♦

128

tgt Cys

agg agg ctg Arg Arg Leu 100

act Thr

agg cct Arg Pro

aag gag tac

cat gca aaa

aca gaa

caa Gin

337

Lys

Glu 105

Tyr

His

Ala

Lys

Thr 110

Glu

ggc

cag

gaa

gca

aac

aaa

gat

cgg

gta

tgt

att

gat

gtt

ttg

gag

aga

385

Gly

Gin

Glu

Ala

Asn

Lys

Asp

Arg

Val

Cys

Ile

Asp

Val

Leu

Glu

Arg

115

120

125

gag

atg

cgt

cgc

aac

cca

atg

get

gga

gat

gca

ttg

ttt

tet

tcc

cca

433

Glu

Met

Arg

Arg

Asn

Pro

Met

Ala

Gly

Asp

Ala

Leu

Phe

Ser

Ser

Pro

130

135

140

atg

ttg

gcc

gat

gat

ctg

cac

atg

aaa

ctg

cac

tac

ctt

gaa

aat

aga

481

Met

Leu

Ala

Asp

Asp

Leu

His

Met

Lys

Leu

His

Tyr

Leu

Glu

Asn

Arg

145

150

155

160

gtt

ggc

ctg

get

caa

ct

498

Val

Gly

Leu

Ala

Gin

165 <210> 34 <211> 165 <212> PRT <213> Nicotiana tabacum

<400> 34

Ala Leu 1

Asp

Xaa Asp Asp 5

Val

Glu

Phe

Val 10

Lys

Leu

Leu

Leu

Ser 15

Glu

Ser

Asn

Ile

Ser

Leu

Asp

Glu

Ala

Tyr

Ala

Leu

His

Tyr

Ala

Val

Ala

20

25

30

Tyr

Cys

Asp

Pro

Lys

Val

Val

Thr

Glu

Val

Leu

Gly

Leu

Gly

Val

Ala

35

40

45

Asp

Val

Asn

Leu

Arg

Asn

Thr

Arg

Gly

Tyr

Thr

Val

Leu

His

Ile

Ala

50

55

60

Ser

Met

Arg

Lys

Glu

Pro

Ala

Val

Ile

Val

Ser

Leu

Leu

Thr

Lys

Gly

65

70

75

80

Ala

Arg

Ala

Ser

Glu

Thr

Thr

Leu

Asp

Gly

Gin

Ser

Ala

Val

Ser

Ile

85

90

95

Cys

Arg

Arg

Leu

Thr

Arg

Pro

Lys

Glu

Tyr

His

Ala

Lys

Thr

Glu

Gin

100

105

110

Gly

Gin

Glu

Ala

Asn

Lys

Asp

Arg

Val

Cys

Ile

Asp

Val

Leu

Glu

Arg

115

120

125

Glu

Met

Arg

Arg

Asn

Pro

Met

Ala

Gly

Asp

Ala

Leu

Phe

Ser

Ser

Pro

130

135

140

129

Met Leu Ala Asp Asp Leu His	Met Lys Leu His 155	Tyr Leu Glu Asn Arg 160
145	150
Val	Gly	Leu	Ala	Gin
				165

<210> 35 <211> 399 <212> DNA <213> Nicotiana tabacum <220>

<221> CDS <222> (1)..(399) <223> Tabák D <400> 35

act gat

tcg gat Ser Asp

gat Asp 5

gtt gag tta

ctt aag tta

ctt Leu

ctt gaa gag

tet Ser

48

Thr 1

Asp

Val

Glu

Leu

Leu Lys 10

Leu

Leu

Glu

Glu 15

aat

gtc

act

tta

gac

gat

gct

tgt

gct

ctt

cat

tat

gca

gct

gct

tat

96

Asn

Val

Thr

Leu

Asp

Asp

Ala

Cys

Ala

Leu

His

Tyr

Ala

Ala

Ala

Tyr

20

25

30

tgt

aac

tcc

aag

gtt

gtg

aat

gag

gtc

ctc

gag

ctg

gat

tta

gct

gat

144

Cys

Asn

Ser

Lys

Val

Val

Asn

Glu

Val

Leu

Glu

Leu

Asp

Leu

Ala

Asp

35

40

45

gtc

aat

ctt

cag

aac

tcc

ega

gga

tat

aac

gtc

ctt

cac

gtt

gct

gct

192

Val

Asn

Leu

Gin

Asn

Ser

Arg

Gly

Tyr

Asn

Val

Leu

His

Val

Ala

Ala

50

55

60

aga

aga

aag

gag

cca

tea

ata

ata

atg

gga

cta

ctt

gaa

aaa

gga

gca

240

Arg

Arg

Lys

Glu

Pro

Ser

Ile

Ile

Met

Gly

Leu

Leu

Glu

Lys

Gly

Ala

65

70

75

80

tet

ttc

ttg

aat

act

aca

cgg

gat

gga

aac

aca

gca

cta

tet

atc

tgt

288

Ser

Phe

Leu

Asn

Thr

Thr

Arg

Asp

Gly

Asn

Thr

Ala

Leu

Ser

Ile

Cys

85

90

95

cgg

aga

ttg

act

cgg

cca

aag

gat

tat

aat

gag

cca

aca

aag

caa

ggg

336

Arg

Arg

Leu

Thr

Arg

Pro

Lys

Asp

Tyr

Asn

Glu

Pro

Thr

Lys

Gin

Gly

100

105

110

aaa

gaa

act

aat

aag

gac

ege

ata

tgc

att

gat

att

ttg

gag

aga

gag

384

Lys

Glu

Thr

Asn

Lys

Asp

Arg

Ile

Cys

Ile

Asp

Ile

Leu

Glu

Arg

Glu

115

120

125

acg aat agg aat cct

Thr Asn Arg Asn Pro 130

399 ·· ·» ·· ·· *» « ··« ··.« ·«·« • · · ·· · · · · · · · « · · · · · · ·»· · · · « ······ ·«·· ·· ·· «· ·· «· ·.·

130 <210> 36 <211> 133 <212> PRT <213> Nicotiana tabacum <400> 36

Thr 1

Asp

Ser Asp Asp 5

Val

Glu Leu

Leu Lys 10

Leu Leu

Leu

Glu

Glu 15

Ser

Asn

Val

Thr

Leu

Asp

Asp

Ala

Cys

Ala

Leu

His

Tyr

Ala

Ala

Ala

Tyr

20

25

30

Cys

Asn

Ser

Lys

Val

Val

Asn

Glu

Val

Leu

Glu

Leu

Asp

Leu

Ala

Asp

35

40

45

Val

Asn

Leu

Gin

Asn

Ser

Arg

Gly

Tyr

Asn

Val

Leu

His

Val

Ala

Ala

50

55

60

Arg

Arg

Lys

Glu

Pro

Ser

Ile

Ile

Met

Gly

Leu

Leu

Glu

Lys

Gly

Ala

65

70

75

80

Ser

Phe

Leu

Asn

Thr

Thr

Arg

Asp

Gly

Asn

Thr

Ala

Leu

Ser

Ile

Cys

85

90

95

Arg

Arg

Leu

Thr

Arg

Pro

Lys

Asp

Tyr

Asn

Glu

Pro

Thr

Lys

Gin

Gly

100

105

110

Lys

Glu

Thr

Asn

Lys

Asp

Arg

Ile

Cys

Ile

Asp

Ile

Leu

Glu

Arg

Glu

115	120	125
Thr Asn Arg Asn Pro 130

<210> 37 <211> 498 <212> DNA <213> Lycopersicon esculentum

<220>
<221>	CDS
<222>	(2)..(496)
<223>	Rajče A
<400>	37
g gca	ttg gat	tet	gat	gat	gtt	gag	tta	cta	agg	atg	ttg
Ala	Leu Asp	Ser	Asp	Asp	Val	Glu	Leu	Leu	Arg	Met	Leu
1			5					10

ctt aaa gag Leu Lys Glu

* 9	• 9	• 9	9·		•
• 4	•	• 9	• 4	•	•	• 4
• ·	• * ·	• 4	4 4	• ·	4
• 9	• ·	• 4 ·	• •9 4	•	•	4
♦ 4	« ·	• ·	•	4 4	•
• 4	·«	«4		4 4	94

131

ggg cat Gly His

act Thr

act Thr 20

ctt gat

gat Asp

gca tat gct Ala Tyr Ala 25

ctc Leu

cac His

tat Tyr

gct gta

gca Ala

97

Leu

Asp

Ala 30

Val

tat

tgc

gat

gca

aag

act

aca

gca

gaa

ctt

tta

gat

ctt

tca

ctt

gct

145

Tyr

Cys

Asp

Ala

Lys

Thr

Thr

Ala

Glu

Leu

Leu

Asp

Leu

Ser

Leu

Ala

35

40

45

gat

gtt

aat

cat

caa

aat

cct

aga

gga

cac

acg

gta

ctt

cat

gtt

gct

193

Asp

Val

Asn

His

Gin

Asn

Pro

Arg

Gly

His

Thr

Val

Leu

His

Val

Ala

50

55

60

gcc

atg

agg

aaa

gaa

cct

aaa

att

ata

gtg

tcc

ctt

tta

acc

aaa

gga

241

Ala

Met

Arg

Lys

Glu

Pro

Lys

Ile

Ile

Val

Ser

Leu

Leu

Thr

Lys

Gly

65

70

75

80

gct

aga

cct

tet

gat

ctg

aca

tcc

gat

ggc

aaa

aaa

gca

ctt

caa

att

289

Ala

Arg

Pro

Ser

Asp

Leu

Thr

Ser

Asp

Gly

Lys

Lys

Ala

Leu

Gin

Ile

85

90

95

gct

aag

agg

ctc

act

agg

ctt

gta

gat

ttt

acc

aag

tet

aca

gag

gaa

337

Ala

Lys

Arg

Leu

Thr

Arg

Leu

Val

Asp

Phe

Thr

Lys

Ser

Thr

Glu

Glu

100

105

110

gga

aaa

tet

gct

cca

aag

gat

cgg

tta

tgc

att

gag

att

ctg

gag

caa

385

Gly

Lys

Ser

Ala

Pro

Lys

Asp

Arg

Leu

Cys

Ile

Glu

Ile

Leu

Glu

Gin

115

120

125

gca

gaa

aga

aga

gat

cca

cta

cta

gga

gaa

gct

tca

tta

tet

ctt

gct

433

Ala

Glu

Arg

Arg

Asp

Pro

Leu

Leu

Gly

Glu

Ala

Ser

Leu

Ser

Leu

Ala

130

135

140

atg

gca

ggc

gat

gat

ttg

cgt

atg

aag

ctg

tta

tac

ctt

gaa

aat

aga

481

Met

Ala

Gly

Asp

Asp

Leu

Arg

Met

Lys

Leu

Leu

Tyr

Leu

Glu

Asn

Arg

145

150

155

160

gtt

ggc

ctt

gct

aaa

ct

498

Val

Gly

Leu

Ala

Lys

165 <210> 38 <211> 165 <212> PRT <213> Lycopersicon esculentum

<400> 38
Ala Leu Asp	Ser Asp Asp Val	Glu Leu Leu Arg Met	Leu Leu Lys Glu
1	5	10	15

Gly His Thr Thr Leu Asp Asp Ala Tyr Ala Leu His Tyr Ala Val Ala

25 30 *0 *« ♦· ·* ·· · ♦ 0 0 0 0 0 0 φ · ·· • * 0 0» · · '♦ 0 0 · « • ·0 < 0 · 0 000 000 0 0 0 0 0 0 ♦ 0 0 0 0 ♦ · ·· 0* »· 00 »00

132

Tyr Cys Asp

Ala

Lys

Thr Thr Ala 40

Glu Leu

Leu Asp

Leu Ser 45

Leu

Ala

35

Asp

Val

Asn

His

Gin

Asn

Pro

Arg

Gly

His

Thr

Val

Leu

His

Val

Ala

50

55

60

Ala

Met

Arg

Lys

Glu

Pro

Lys

Ile

Ile

Val

Ser

Leu

Leu

Thr

Lys

Gly

65

70

75

80

Ala

Arg

Pro

Ser

Asp

Leu

Thr

Ser

Asp

Gly

Lys

Lys

Ala

Leu

Gin

Ile

85

90

95

Ala

Lys

Arg

Leu

Thr

Arg

Leu

Val

Asp

Phe

Thr

Lys

Ser

Thr

Glu

Glu

100

105

110

Gly

Lys

Ser

Ala

Pro

Lys

Asp

Arg

Leu

Cys

Ile

Glu

Ile

Leu

Glu

Gin

115

120

125

Ala

Glu

Arg

Arg

Asp

Pro

Leu

Leu

Gly

Glu

Ala

Ser

Leu

Ser

Leu

Ala

130

135

140

Met

Ala

Gly

Asp

Asp

Leu

Arg

Met

Lys

Leu

Leu

Tyr

Leu

Glu

Asn

Arg

145

150

155

160

Val Gly Leu Ala Lys

165 <210> 39 <211> 498 <212> DNA <213> Beta vulgaris <220>

<221> CDS <222> (2) . . (496) <223> Cukrová řepa <400> 39 g gca ttg gat tet gat gat gtt gag tta gtc aga atg ctt tta aaa gag 49 Ala Leu Asp Ser Asp Asp Val Glu Leu Val Arg Met Leu Leu Lys Glu 15 10 15

ege Arg

cat aca act

cta Leu

gat Asp

gat gca Asp Ala

tat gcc Tyr Ala 25

ctt Leu

cac His

tat Tyr

gct Ala 30

gtg Val

gca Ala

97

His

Thr Thr 20

cat

tgt

gat

gcc

aag

acc

acc

acg

gag

ctt

ctt

gag

ctt

ggg

ctt

gca

145

His

Cys

Asp

Ala

Lys

Thr

Thr

Thr

Glu

Leu

Leu

Glu

Leu

Gly

Leu

Ala

40 45

133

gat gtt

aat Asn

ctt Leu

aga Arg

aat Asn

cta agg ggt

cac act gtg cta

cat gtg

gca Ala

193

Asp

Val 50

Leu 55

Arg

Gly

His

Thr

Val 60

Leu

His

Val

gcc

atg

aga

aaa

gag

cct

aag

ata

att

gta

tcc

ttg

tta

acc

aag

gga

241

Ala

Met

Arg

Lys

Glu

Pro

Lys

Ile

Ile

Val

Ser

Leu

Leu

Thr

Lys

Gly

65

70

75

80

gcc

cat

ccg

tet

gat

ata

aca

tca

gat

gat

aaa

aaa

gca

ctg

cag

ata

289

Ala

His

Pro

Ser

Asp

Ile

Thr

Ser

Asp

Asp

Lys

Lys

Ala

Leu

Gin

Ile

85

90

95

gca

aag

aga

cta

aca

aaa

gct

gtg

gac

ttc

tat

aaa

act

aca

gaa

caa

337

Ala

Lys

Arg

Leu

Thr

Lys

Ala

Val

Asp

Phe

Tyr

Lys

Thr

Thr

Glu

Gin

100

105

110

gga

aaa

gat

gca

cca

aag

gat

cgg

ttg

tgc

att

gaa

ata

ctg

gag

caa

385

Gly

Lys

Asp

Ala

Pro

Lys

Asp

Arg

Leu

Cys

Ile

Glu

Ile

Leu

Glu

Gin

115

120

125

gct

gaa

aga

aga

gaa

cca

ttg

cta

gga

gaa

ggt

tet

gtt

tet

ctt

gca

433

Ala

Glu

Arg

Arg

Glu

Pro

Leu

Leu

Gly

Glu

Gly

Ser

Val

Ser

Leu

Ala

130

135

140

aag

gca

gga

gat

gat

ctg

cgt

atg

aag

cta

tta

tac

ctt

gaa

aat

ega

481

Lys

Ala

Gly

Asp

Asp

Leu

Arg

Met

Lys

Leu

Leu

Tyr

Leu

Glu

Asn

Arg

145

150

155

160

498 gtt ggc ctt gct caa ct

Val Gly Leu Ala Gin

165 <210> 40 <211> 165 <212> PRT <213> Beta vulgaris

<400> 40 Ala Leu Asp Ser Asp

Asp Val

Glu

Leu

Val Arg Met 10

Leu

Leu

Lys 15

Glu

1

5

Arg

His

Thr

Thr

Leu

Asp

Asp

Ala

Tyr

Ala

Leu

His

Tyr

Ala

Val

Ala

20

25

30

His

Cys

Asp

Ala

Lys

Thr

Thr

Thr

Glu

Leu

Leu

Glu

Leu

Gly

Leu

Ala

35

40

45

Asp

Val

Asn

Leu

Arg

Asn

Leu

Arg

Gly

His

Thr

Val

Leu

His

Val

Ala

50

55

60

Ala

Met

Arg

Lys

Glu

Pro

Lys

Ile

Ile

Val

Ser

Leu

Leu

Thr

Lys

Gly

65

70

75

80

134

Ala	His	Pro	Ser	Asp 85	Ile	Thr	Ser
Ala	Lys	Arg	Leu 100	Thr	Lys	Ala	Val
Gly	Lys	Asp 115	Ala	Pro	Lys	Asp	Arg 120
Ala	Glu 130	Arg	Arg	Glu	Pro	Leu 135	Leu
Lys 145	Ala	Gly	Asp	Asp	Leu 150	Arg	Met
Val	Gly	Leu	Ala	Gin 165

Asp	Asp 90	Lys	Lys	Ala	Leu	Gin 95	Ile
Asp 105	Phe	Tyr	Lys	Thr	Thr 110	Glu	Gin
Leu	Cys	Ile	Glu	Ile 125	Leu	Glu	Gin
Gly	Glu	Gly	Ser 140	Val	Ser	Leu	Ala
Lys	Leu	Leu 155	Tyr	Leu	Glu	Asn	Arg 160

<210> 41 <211> 498 <212> DNA <213> Helianthus annuus <220>

<221> CDS <222> (2)..(496) <223> Slunečnice A <400> 41 g gca ttg gat tet gat gat gtt gag yta gtc aca atg tta tta ega gaa 49 Ala Leu Asp Ser Asp Asp Val Glu Xaa Val Thr Met Leu Leu Arg Glu 15 10 15

ggt Gly

cat His

act Thr

tea tta

gac ggt tet Asp Gly Ser

tgc gct

ctt Leu

cat His

tac Tyr

gct Ala 30

gtt Val

gcg Ala

97

Ser 20

Leu

Cys 25

Ala

tac

gca

gat

gct

aaa

acg

aca

acc

gaa

tta

ctg

gat

tta

gca

ctt

gct

145

Tyr

Ala

Asp

Ala

Lys

Thr

Thr

Thr

Glu

Leu

Leu

Asp

Leu

Ala

Leu

Ala

35

40

45

gac

gta

aat

cat

aaa

aac

tcg

agg

ggt

ttt

acc

gta

ctt

cat

gtt

gcc

193

Asp

Val

Asn

His

Lys

Asn

Ser

Arg

Gly

Phe

Thr

Val

Leu

His

Val

Ala

50

55

60

gct

atg

aga

aaa

gag

ccg

agt

att

atc

gtt

tcg

ctt

ctt

acg

aaa

ggg

241

Ala

Met

Arg

Lys

Glu

Pro

Ser

Ile

Ile

Val

Ser

Leu

Leu

Thr

Lys

Gly

65

70

75

80

gcc

ega

ccc

tcg

gat

ctc

acc

cct

gat

ggg

aga

aaa

gca

cta

cag

att

289

Ala

Arg

Pro

Ser

Asp

Leu

Thr

Pro

Asp

Gly

Arg

Lys

Ala

Leu

Gin

Ile

85

90

95

135

tcg Ser

aag Lys

agg ttg Arg Leu 100

acc Thr

aga gcg gtt gac

tat Tyr

tac Tyr

aag tea

aac gag

gat Asp

337

Arg

Ala

Val

Asp 105

Lys

Ser

Asn 110

Glu

gat

aaa

gag

tea

acg

aaa

ggt

cgt

ttg

tgt

att

gag

ata

ttg

gaa

caa

385

Asp

Lys

Glu

Ser

Thr

Lys

Gly

Arg

Leu

Cys

Xle

Glu

Ile

Leu

Glu

Gin

115

120

125

gcc

gaa

aga

aga

aat

cca

ttg

tta

ggt

gaa

gct

tcg

gct

tet

ctt

gca

433

Ala

Glu

Arg

Arg

Asn

Pro

Leu

Leu

Gly

Glu

Ala

Ser

Ala

Ser

Leu

Ala

130

135

140

atg

gcc

gga

gat

gat

ttg

cgt

gga

aag

ttg

ttg

tac

ctt

gaa

aat

ega

481

Met

Ala

Gly

Asp

Asp

Leu

Arg

Gly

Lys

Leu

Leu

Tyr

Leu

Glu

Asn

Arg

145

150

155

160

498 gtt ggc ctg gct caa ct

Val Gly Leu Ala Gin

165 <210> 42 <211> 165 <212> PRT <213> Helianthus annuus

<400> 42

Xaa

Val Thr Met Leu Leu Arg

Glu

Ala 1

Leu

Asp

Ser

Asp Asp 5

Val

Glu

10

15

Gly

His

Thr

Ser

Leu

Asp

Gly

Ser

Cys

Ala

Leu

His

Tyr

Ala

Val

Ala

20

25

30

Tyr

Ala

Asp

Ala

Lys

Thr

Thr

Thr

Glu

Leu

Leu

Asp

Leu

Ala

Leu

Ala

35

40

45

Asp

Val

Asn

His

Lys

Asn

Ser

Arg

Gly

Phe

Thr

Val

Leu

His

Val

Ala

50

55

60

Ala

Met

Arg

Lys

Glu

Pro

Ser

Ile

Ile

Val

Ser

Leu

Leu

Thr

Lys

Gly

65

70

75

80

Ala

Arg

Pro

Ser

Asp

Leu

Thr

Pro

Asp

Gly

Arg

Lys

Ala

Leu

Gin

Ile

85

90

95

Ser

Lys

Arg

Leu

Thr

Arg

Ala

Val

Asp

Tyr

Tyr

Lys

Ser

Asn

Glu

Asp

100

105

110

Asp

Lys

Glu

Ser

Thr

Lys

Gly

Arg

Leu

Cys

Ile

Glu

Ile

Leu

Glu

Gin

115

120

125

Ala

Glu

Arg

Arg

Asn

Pro

Leu

Leu

Gly

Glu

Ala

Ser

Ala

Ser

Leu

Ala

130

135

140

136

Met Ala Gly Asp Asp Leu Arg Gly Lys Leu Leu Tyr Leu Glu Asn Arg 145 150 155 160

Val Gly Leu Ala Gin

165

<210> 43 <211> 498 <212> DNA <213> Helianthus annuus

<220>

<221> CDS

<222> (2)..(496)

<223> Slunečnice B

<400> 43 g gca ttg gac tet gat gat gtt gag ctt gtg aaa atg att tta gac gaa 49 Ala Leu Asp Ser Asp Asp Val Glu Leu Val Lys Met Ile Leu Asp Glu 15 10 15

tcc Ser

aaa atc

acg tta gat

gaa Glu

gcc Ala

tgc gct

ctt Leu

cat His

tat Tyr

gcg Ala 30

gtc Val

atg Met

97

Lys

Ile

Thr 20

Leu

Asp

Cys 25

Ala

tat

tgt

aat

caa

gaa

gtt

gct

aag

gag

att

ctt

aac

tta

aac

cgt

gcg

145

Tyr

Cys

Asn

Gin

Glu

Val

Ala

Lys

Glu

Ile

Leu

Asn

Leu

Asn

Arg

Ala

35

40

45

gat

gtt

aat

ctt

aga

aac

tca

ega

gat

tac

acc

gtg

ctt

cat

gtt

gct

193

Asp

Val

Asn

Leu

Arg

Asn

Ser

Arg

Asp

Tyr

Thr

Val

Leu

His

Val

Ala

50

55

60

gcc

atg

cgt

aaa

gaa

cca

tca

ctt

att

gtt

tcg

att

cta

age

aaa

ggc

241

Ala

Met

Arg

Lys

Glu

Pro

Ser

Leu

Ile

Val

Ser

Ile

Leu

Ser

Lys

Gly

65

70

75

80

gcg

tgt

gca

tcg

gat

act

act

ttt

gat

gga

caa

agt

gcg

gtt

agt

att

289

Ala

Cys

Ala

Ser

Asp

Thr

Thr

Phe

Asp

Gly

Gin

Ser

Ala

Val

Ser

Ile

85

90

95

tgc

agg

aga

ega

aca

agg

ccc

aag

gat

tat

tat

gtg

aaa

acc

gaa

cac

337

Cys

Arg

Arg

Arg

Thr

Arg

Pro

Lys

Asp

Tyr

Tyr

Val

Lys

Thr

Glu

His

100

105

110

ggg

caa

gaa

aca

aat

aaa

gat

cgt

ata

tgc

atc

gat

gtt

ttg

gag

cgg

385

Gly

Gin

Glu

Thr

Asn

Lys

Asp

Arg

Ile

Cys

Ile

Asp

Val

Leu

Glu

Arg

115

120

125

137

gaa Glu	ata Ile 130	aag Lys	agg Arg	aat Asn	ccg Pro	atg Met 135	ata Ile
gca	gtg	gct	gat	gat	ttg	cat	atg
Ala	Val	Ala	Asp	Asp	Leu	His	Met
145					150
gtt	ggc	ctt	gct	caa	ct
Val	Gly	Leu	Ala	Gin
				165

ggc Gly	gat Asp	gtt Val	tcc gtg tgt	tet Ser	tea Ser	433
Ser 140	Val	Cys
aat	tta	ctc	tac	ttt	gaa	aat	ega	481
Asn	Leu	Leu	Tyr	Phe	Glu	Asn	Arg
		155					160

498 <210> 44 <211> 165 <212> PRT <213> Helianthus annuus <400> 44

Ala Leu Asp 1

Ser Asp 5

Asp Val

Glu

Leu Val 10

Lys

Met

Ile

Leu

Asp 15

Glu

Ser

Lys

Ile

Thr

Leu

Asp

Glu

Ala

Cys

Ala

Leu

His

Tyr

Ala

Val

Met

20

25

30

Tyr

Cys

Asn

Gin

Glu

Val

Ala

Lys

Glu

Ile

Leu

Asn

Leu

Asn

Arg

Ala

35

40

45

Asp

Val

Asn

Leu

Arg

Asn

Ser

Arg

Asp

Tyr

Thr

Val

Leu

His

Val

Ala

50

55

60

Ala

Met

Arg

Lys

Glu

Pro

Ser

Leu

Ile

Val

Ser

Ile

Leu

Ser

Lys

Gly

65

70

75

80

Ala

Cys

Ala

Ser

Asp

Thr

Thr

Phe

Asp

Gly

Gin

Ser

Ala

Val

Ser

Ile

85

90

95

Cys

Arg

Arg

Arg

Thr

Arg

Pro

Lys

Asp

Tyr

Tyr

Val

Lys

Thr

Glu

His

100

105

110

Gly

Gin

Glu

Thr

Asn

Lys

Asp

Arg

Ile

Cys

Ile

Asp

Val

Leu

Glu

Arg

115

120

125

Glu

Ile

Lys

Arg

Asn

Pro

Met

Ile

Gly

Asp

Val

Ser

Val

Cys

Ser

Ser

130

135

140

Ala

Val

Ala

Asp

Asp

Leu

His

Met

Asn

Leu

Leu

Tyr

Phe

Glu

Asn

Arg

145

150

155

160

Val Gly Leu Ala Gin

165

138 <210> 45 <211> 653 <212> DNA <213> Solanum tuberosum <220>

<221> CDS <222> (1)..(651) <223> Brambor Α <400> 45

gak att

att gtc Ile Val

aag Lys 5

tet Ser

aat Asn

gtt Val

gat Asp

atc Ile 10

ata Ile

acc ctt

gat Asp

aag Lys 15

tcc Ser

48

Xaa 1

Ile

Thr

Leu

ttg

cct

cat

gac

atc

gta

aaa

caa

atc

act

gat

tca

cgt

gct

gaa

ctt

96

Leu

Pro

His

Asp

Ile

Val

Lys

Gin

Ile

Thr

Asp

Ser

Arg

Ala

Glu

Leu

20

25

30

ggt

cta

caa

ggg

cct

gaa

agc

aat

ggt

ttt

cct

gat

aaa

cat

gtt

aag

144

Gly

Leu

Gin

Gly

Pro

Glu

Ser

Asn

Gly

Phe

Pro

Asp

Lys

His

Val

Lys

35

40

45

agg

ata

cat

agg

gca

ttg

gac

tet

gat

gat

gtt

gag

tta

cta

agg

atg

192

Arg

Ile

His

Arg

Ala

Leu

Asp

Ser

Asp

Asp

Val

Glu

Leu

Leu

Arg

Met

50

55

60

ttg

ctt

aaa

gaa

ggg

cat

act

act

ctc

gat

gat

gca

tat

gct

ctc

cac

240

Leu

Leu

Lys

Glu

Gly

His

Thr

Thr

Leu

Asp

Asp

Ala

Tyr

Ala

Leu

His

65

70

75

80

tat

gct

gta

gca

tat

tgc

gat

gca

aag

act

aca

gca

gaa

ctt

tta

gat

288

Tyr

Ala

Val

Ala

Tyr

Cys

Asp

Ala

Lys

Thr

Thr

Ala

Glu

Leu

Leu

Asp

85

90

95

ctt

tca

ctt

gct

gat

gtt

aat

cat

caa

aat

cct

aga

gga

tac

acg

gta

336

Leu

Ser

Leu

Ala

Asp

Val

Asn

His

Gin

Asn

Pro

Arg

Gly

Tyr

Thr

Val

100

105

110

ctt

cat

gtt

gct

gcc

atg

agg

aaa

gag

cct

aaa

att

ata

gtg

tcc

ctt

384

Leu

His

Val

Ala

Ala

Met

Arg

Lys

Glu

Pro

Lys

Ile

Ile

Val

Ser

Leu

115

120

125

tta

acc

aaa

gga

gct

aga

cct

tet

gat

ctg

aca

tet

gat

ggc

aaa

aaa

432

Leu

Thr

Lys

Gly

Ala

Arg

Pro

Ser

Asp

Leu

Thr

Ser

Asp

Gly

Lys

Lys

130

135

140

gca

ctt

caa

att

gct

aag

agg

ctc

act

agg

ctt

gtg

gat

ttt

act

aag

480

Ala

Leu

Gin

Ile

Ala

Lys

Arg

Leu

Thr

Arg

Leu

val

Asp

Phe

Thr

Lys

145

150

155

160

tet

aca

gag

gaa

gga

aaa

tet

gct

cca

aaa

gat

cgg

tta

tgc

att

gag

528

Ser

Thr

Glu

Glu

Gly

Lys

Ser

Ala

Pro

Lys

Asp

Arg

Leu

Cys

Ile

Glu

165

170

175

139

att Ile

ctg gag caa gca gaa aga aga

gat Asp 185

cca cta cta gga

gaa Glu 190

get Ala

tea Ser

576

Leu

Glu Gin 180

Ala

Glu

Arg Arg

Pro Leu Leu

Gly

tta

tet

ctt

get

atg

gca

ggc

gat

gat

ttg

cgt

atg

aag

ctg

tta

tac

624

Leu

Ser

Leu

Ala

Met

Ala

Gly

Asp

Asp

Leu

Arg

Met

Lys

Leu

Leu

Tyr

195

200

205

ctt

gaa

aat

ega

gtt

ggc

ctk

get

caa

ct

653

Leu

Glu

Asn

Arg

Val

Gly

Xaa

Ala

Gin

210

215

<210> 46 <211> 217 <212> PRT <213> Solanum tuberosum

<400> 46

Lys 5

Ser Asn

Val

Asp

Ile 10

Ile Thr

Leu Asp

Lys 15

Ser

Xaa 1

Ile

Ile

Val

Leu

Pro

His

Asp

Ile

Val

Lys

Gin

Ile

Thr

Asp

Ser

Arg

Ala

Glu

Leu

20

25

30

Gly

Leu

Gin

Gly

Pro

Glu

Ser

Asn

Gly

Phe

Pro

Asp

Lys

His

Val

Lys

35

40

45

Arg

Ile

His

Arg

Ala

Leu

Asp

Ser

Asp

Asp

Val

Glu

Leu

Leu

Arg

Met

50

55

60

Leu

Leu

Lys

Glu

Gly

His

Thr

Thr

Leu

Asp

Asp

Ala

Tyr

Ala

Leu

His

65

70

75

80

Tyr

Ala

Val

Ala

Tyr

Cys

Asp

Ala

Lys

Thr

Thr

Ala

Glu

Leu

Leu

Asp

85

90

95

Leu

Ser

Leu

Ala

Asp

Val

Asn

His

Gin

Asn

Pro

Arg

Gly

Tyr

Thr

Val

100

105

110

Leu

His

Val

Ala

Ala

Met

Arg

Lys

Glu

Pro

Lys

Ile

Ile

Val

Ser

Leu

115

120

125

Leu

Thr

Lys

Gly

Ala

Arg

Pro

Ser

Asp

Leu

Thr

Ser

Asp

Gly

Lys

Lys

130

135

140

Ala

Leu

Gin

Ile

Ala

Lys

Arg

Leu

Thr

Arg

Leu

Val

Asp

Phe

Thr

Lys

145

150

155

160

Ser

Thr

Glu

Glu

Gly

Lys

Ser

Ala

Pro

Lys

Asp

Arg

Leu

Cys

Ile

Glu

165

170

175

• · * · • · • · « · * · * · ♦ ♦ • « · ·· · ·· · · · • · · ··· · · · · · · · • φ · · ♦ · · · · • · ·· ·· «φ ·· ·

Ile Leu

Leu Ser

Leu Glu

210

Glu Gin

180

Leu Ala

195

Asn Arg

Ala Glu

Met Ala

Val Gly

Arg Arg

Gly Asp

200

Xaa Ala

215

140

Asp Pro

185

Asp Leu

Gin

Leu Leu

Arg Met

Gly Glu

190

Lys Leu

205

Ala Ser

Leu Tyr <210> 47 <211> 498 <212> DNA <213> Solanum tuberosum <220>

<221> CDS

<222>

(2)..(496)

<223>

Brambor

B

<400>

47

g gca

ttg gat

tea

gat

gat

gtt

gag

ttt

gtc

aag

ctt

cta

ctt

aat

gag 4 9

Ala

Leu Asp

Ser

Asp

Asp

Val

Glu

Phe

Val

Lys

Leu

Leu

Leu

Asn

Glu

1

5

10

15

tet gac Ser Asp

ata agt

tta gat Leu Asp

gga gcc Gly Ala

tac get

ctt Leu

cat His

tac Tyr

get Ala 30

gtt Val

gca Ala

97

Ile

Ser 20

Tyr 25

Ala

tat

tgt

gac

ccc

aag

gtt

gtt

act

gag

gtt

ctt

gga

ctg

ggt

gtt

get

145

Tyr

Cys

Asp

Pro

Lys

Val

Val

Thr

Glu

Val

Leu

Gly

Leu

Gly

Val

Ala

35

40

45

aat

gtc

aac

ctt

cgg

aat

aca

cgt

ggt

tac

act

gtg

ctt

cac

att

get

193

Asn

Val

Asn

Leu

Arg

Asn

Thr

Arg

Gly

Tyr

Thr

Val

Leu

His

Ile

Ala

50

55

60

gcc

atg

cgt

aag

gaa

ccc

tea

atc

att

gta

tea

ctt

ttg

act

aag

gga

241

Ala

Met

Arg

Lys

Glu

Pro

Ser

Ile

Ile

Val

Ser

Leu

Leu

Thr

Lys

Gly

65

70

75

80

get

cat

gca

tea

gaa

att

aca

ttg

gat

ggg

cag

agt

get

gtt

ggc

atc

289

Ala

His

Ala

Ser

Glu

Ile

Thr

Leu

Asp

Gly

Gin

Ser

Ala

Val

Gly

Ile

85

90

95

tgt

agg

agg

ctg

agt

agg

cct

aag

gag

tac

cat

gca

aaa

aca

gaa

caa

337

Cys

Arg

Arg

Leu

Ser

Arg

Pro

Lys

Glu

Tyr

His

Ala

Lys

Thr

Glu

Gin

100

105

110

ggc

cag

gaa

gca

aac

aaa

gat

cgg

gta

tgt

att

gat

gtt

ttg

gag

aga

385

Gly

Gin

Glu

Ala

Asn

Lys

Asp

Arg

Val

Cys

Ile

Asp

Val

Leu

Glu

Arg

115

120

125

141

gag Glu	atg Met 130	cgt Arg	cac His	aac Asn	cca Pro	atg Met 135	acc Thr
atg	ttg	gcc	gat	gat	ctg	ccc	atg
Met	Leu	Ala	Asp	Asp	Leu	Pro	Met
145					150
gtt	ggc	ctt	gct	aaa	ct
Val	Gly	Leu	Ala	Lys
				165

gga Gly	gat Asp	gca Ala	tta Leu 140	ttt Phe	tet Ser	tcc Ser	ccc Pro	433
aaa	ctg	ctc	tac	ctt	gaa	aat	ega	481
Lys	Leu	Leu	Tyr	Leu	Glu	Asn	Arg
		155					160

498 <210> 48 <211> 165 <212> PRT <213> Solanum tuberosum <400> 48

Ala 1

Leu

Asp

Ser

Asp Asp Val 5

Glu

Phe

Val Lys 10

Leu

Leu

Leu

Asn 15

Glu

Ser

Asp

Ile

Ser

Leu

Asp

Gly

Ala

Tyr

Ala

Leu

His

Tyr

Ala

Val

Ala

20

25

30

Tyr

Cys

Asp

Pro

Lys

Val

Val

Thr

Glu

Val

Leu

Gly

Leu

Gly

Val

Ala

35

40

45

Asn

Val

Asn

Leu

Arg

Asn

Thr

Arg

Gly

Tyr

Thr

Val

Leu

His

Ile

Ala

50

55

60

Ala

Met

Arg

Lys

Glu

Pro

Ser

Ile

Ile

Val

Ser

Leu

Leu

Thr

Lys

Gly

65

70

75

80

Ala

His

Ala

Ser

Glu

Ile

Thr

Leu

Asp

Gly

Gin

Ser

Ala

Val

Gly

Ile

85

90

95

Cys

Arg

Arg

Leu

Ser

Arg

Pro

Lys

Glu

Tyr

His

Ala

Lys

Thr

Glu

Gin

100

105

110

Gly

Gin

Glu

Ala

Asn

Lys

Asp

Arg

Val

Cys

Ile

Asp

Val

Leu

Glu

Arg

115

120

125

Glu

Met

Arg

His

Asn

Pro

Met

Thr

Gly

Asp

Ala

Leu

Phe

Ser

Ser

Pro

130

135

140

Met

Leu

Ala

Asp

Asp

Leu

Pro

Met

Lys

Leu

Leu

Tyr

Leu

Glu

Asn

Arg

145

150

155

160

Val Gly Leu Ala Lys

165 « ♦ • ·

142 <210> 49 <211> 477 <212> DNA <213> Solanum tuberosum <220>

<221> CDS

<222>

(2) .. (475)

<223>

Brambor

C

<400>

49

g gca

ctg gac

tet

gat

gat

gtt

gag

ttt

gtc

aag

ctt

cta

ctt

aat

gag 49

Ala

Leu Asp

Ser

Asp

Asp

Val

Glu

Phe

Val

Lys

Leu

Leu

Leu

Asn

Glu

1

5

10

15

tet gac

ata agt

tta gat

gga gcc

tac gct Tyr Ala 25

ctt Leu

cat His

tac Tyr

gct Ala 30

gtt gca

97

Ser

Asp

Ile

Ser 20

Leu

Asp

Gly

Ala

Val

Ala

tat

tgt

gac

ccc

aag

gtt

gtt

act

gag

gtt

ctt

gga

ctg

ggt

gtt

gct

145

Tyr

Cys

Asp

Pro

Lys

Val

Val

Thr

Glu

Val

Leu

Gly

Leu

Gly

Val

Ala

35

40

45

aat

gtc

aac

ctt

cgg

aat

aca

cgt

ggt

tac

act

gtg

ctt

cac

att

gct

193

Asn

Val

Asn

Leu

Arg

Asn

Thr

Arg

Gly

Tyr

Thr

Val

Leu

His

Ile

Ala

50

55

60

gcc

atg

cgt

aag

gaa

ccc

tea

atc

att

gta

tea

ctt

ttg

act

aag

gga

241

Ala

Met

Arg

Lys

Glu

Pro

Ser

Ile

Ile

Val

Ser

Leu

Leu

Thr

Lys

Gly

65

70

75

80

gct

cat

gca

tea

gaa

att

aca

ttg

gat

ggg

cag

agt

gct

gtt

agc

atc

289

Ala

His

Ala

Ser

Glu

Ile

Thr

Leu

Asp

Gly

Gin

Ser

Ala

Val

Ser

Ile

85

90

95

tgt

agg

agg

ctg

act

agg

cct

aag

gag

tac

cat

gca

aaa

aca

gaa

caa

337

Cys

Arg

Arg

Leu

Thr

Arg

Pro

Lys

Glu

Tyr

His

Ala

Lys

Thr

Glu

Gin

100

105

110

ggc

cag

gaa

gca

aac

aaa

gat

cgg

gta

tgt

att

gat

gtt

ttg

gag

aga

385

Gly

Gin

Glu

Ala

Asn

Lys

Asp

Arg

Val

Cys

Ile

Asp

Val

Leu

Glu

Arg

115

120

125

gag

atg

cgt

ege

aac

cca

atg

acc

gga

gat

gca

tta

ttt

tet

tcc

ccc

433

Glu

Met

Arg

Arg

Asn

Pro

Met

Thr

Gly

Asp

Ala

Leu

Phe

Ser

Ser

Pro

130

135

140

atg

aaa

cag

ctc

tac

ctt

gaa

aat

aga

gtt

ggc

ctt

gct

aaa

ct

477

Met

Lys

Gin

Leu

Tyr

Leu

Glu

Asn

Arg

Val

Gly

Leu

Ala

Lys

145

150

155

<210> 50 <211> 158 * ·

143 <212> PRT <213> Solanum tuberosum

<400> 50

Asp

Val

Glu

Phe

Val 10

Lys

Leu

Leu Leu

Asn 15

Glu

Ala Leu 1

Asp

Ser Asp 5

Ser

Asp

Ile

Ser

Leu

Asp

Gly

Ala

Tyr

Ala

Leu

His

Tyr

Ala

Val

Ala

20

25

30

Tyr

Cys

Asp

Pro

Lys

Val

Val

Thr

Glu

Val

Leu

Gly

Leu

Gly

Val

Ala

35

40

45

Asn

Val

Asn

Leu

Arg

Asn

Thr

Arg

Gly

Tyr

Thr

Val

Leu

His

Ile

Ala

50

55

60

Ala

Met

Arg

Lys

Glu

Pro

Ser

Ile

Ile

Val

Ser

Leu

Leu

Thr

Lys

Gly

65

70

75

80

Ala

His

Ala

Ser

Glu

Ile

Thr

Leu

Asp

Gly

Gin

Ser

Ala

Val

Ser

Ile

85

90

95

Cys

Arg

Arg

Leu

Thr

Arg

Pro

Lys

Glu

Tyr

His

Ala

Lys

Thr

Glu

Gin

100

105

110

Gly

Gin

Glu

Ala

Asn

Lys

Asp

Arg

Val

Cys

Ile

Asp

Val

Leu

Glu

Arg

115

120

125

Glu

Met

Arg

Arg

Asn

Pro

Met

Thr

Gly

Asp

Ala

Leu

Phe

Ser

Ser

Pro

130

135

140

Met

Lys

Gin

Leu

Tyr

Leu

Glu

Asn

Arg

Val

Gly

Leu

Ala

Lys

145

150

155

<210> 51 <211> 501 <212> DNA <213> Brassica napus <220>

<221> CDS <222> (2)..(499) <223> Kanola A <400> 51 g gca ttg gat tet gat gat gtt gag ttt gtg aag ttg ctt ttg act gag 49 Ala Leu Asp Ser Asp Asp Val Glu Phe Val Lys Leu Leu Leu Thr Glu 15 1015 tea gat atc act cta gat gaa gcc aat ggt ctt cat tac tea gtg gtg97

Ser Asp Ile Thr Leu Asp Glu Ala Asn Gly Leu His Tyr Ser Val Val

2530

144

tat Tyr

agt gat

ccc Pro

aaa Lys

gtt Val

gtt gcc gag

att Ile

ctt Leu

act Thr

ctt Leu 45

gat atg

ggt Gly

145

Ser

Asp 35

Val

Ala Glu 40

Asp

Met

gat

gtc

aac

cac

aga

aac

tea

cgt

ggc

tac

acg

gtt

ctt

cat

ctc

gca

193

Asp

Val

Asn

His

Arg

Asn

Ser

Arg

Gly

Tyr

Thr

Val

Leu

His

Leu

Ala

50

55

60

gcc

atg

ege

aaa

gag

ccg

tcc

atc

atc

ata

tet

ctt

ctc

aag

aga

ggt

241

Ala

Met

Arg

Lys

Glu

Pro

Ser

Ile

Ile

Ile

Ser

Leu

Leu

Lys

Arg

Gly

65

70

75

80

gcc

aat

gcg

tet

ggc

ttc

acg

tgt

gat

gga

ege

agt

gcg

gtt

aat

ata

289

Ala

Asn

Ala

Ser

Gly

Phe

Thr

Cys

Asp

Gly

Arg

Ser

Ala

Val

Asn

Ile

85

90

95

tgt

aga

aga

ttg

aca

act

cca

aag

gat

tat

cat

acg

aaa

aca

gct

gcg

337

Cys

Arg

Arg

Leu

Thr

Thr

Pro

Lys

Asp

Tyr

His

Thr

Lys

Thr

Ala

Ala

100

105

110

aaa

ggg

agg

gaa

gct

agt

aaa

gca

cgg

tta

tgt

ata

gat

ctc

ttg

gaa

385

Lys

Gly

Arg

Glu

Ala

Ser

Lys

Ala

Arg

Leu

Cys

Ile

Asp

Leu

Leu

Glu

115

120

125

aga

gaa

gta

agg

agg

aac

cct

atg

gtt

gtt

gat

tea

cca

atg

tgt

tcc

433

Arg

Glu

Val

Arg

Arg

Asn

Pro

Met

Val

Val

Asp

Ser

Pro

Met

Cys

Ser

130

135

140

ctt

tet

atg

cct

gaa

gat

ctc

caa

atg

aga

ctg

tta

tac

ctt

gaa

aat

481

Leu

Ser

Met

Pro

Glu

Asp

Leu

Gin

Met

Arg

Leu

Leu

Tyr

Leu

Glu

Asn

145

150

155

160

ega

gtt

ggc

ctt

gct

caa

ct

501

Arg

Val

Gly

Leu

Ala

Gin

165 <210> 52 <211> 166 <212> PRT <213> Brassica napus

<400> 52 Ala Leu

Asp

Ser

Asp

Asp

Val

Glu

Phe

Val

Lys

Leu

Leu

Leu

Thr

Glu

1

5

10

15

Ser Asp

Ile

Thr

Leu

Asp

Glu

Ala

Asn

Gly

Leu

His

Tyr

Ser

Val

Val

20

25

30

Tyr Ser Asp Pro Lys Val Val Ala Glu Ile Leu Thr Leu Asp Met Gly

40 45 • ·

145

Asp Val Asn 50

His

Arg

Asn Ser Arg Gly 55

Tyr

Thr

Val 60

Leu

His

Leu

Ala

Ala

Met

Arg

Lys

Glu

Pro

Ser

Ile

Ile

Ile

Ser

Leu

Leu

Lys

Arg

Gly

65

70

75

80

Ala

Asn

Ala

Ser

Gly

Phe

Thr

Cys

Asp

Gly

Arg

Ser

Ala

Val

Asn

Ile

85

90

95

Cys

Arg

Arg

Leu

Thr

Thr

Pro

Lys

Asp

Tyr

His

Thr

Lys

Thr

Ala

Ala

100

105

110

Lys

Gly

Arg

Glu

Ala

Ser

Lys

Ala

Arg

Leu

Cys

Ile

Asp

Leu

Leu

Glu

115

120

125

Arg

Glu

Val

Arg

Arg

Asn

Pro

Met

Val

Val

Asp

Ser

Pro

Met

Cys

Ser

130

135

140

Leu

Ser

Met

Pro

Glu

Asp

Leu

Gin

Met

Arg

Leu

Leu

Tyr

Leu

Glu

Asn

145

150

155

160

Arg

Val

Gly

Leu

Ala

Gin

165 <210> 53 <211> 501 <212> DNA <213> Brassica napus <220>

<221> CDS <222> (2)..(499) <223> Kanola B <400> 53 g gca ttg gat tet gat gat gtt gag ttt gtg aag ctt ctt ttg acc gag 49 Ala Leu Asp Ser Asp Asp Val Glu Phe Val Lys Leu Leu Leu Thr Glu 15 10 15

tca gat

atc Ile

act Thr 20

cta gat gaa gcc

aat Asn 25

ggt Gly

ctt Leu

cat His

tac Tyr

tca gtg Ser Val 30

gtg Val

97

Ser

Asp

Leu

Asp

Glu

Ala

tat

agt

gat

ccc

aaa

gtt

gtt

gcc

gag

att

ctt

act

ctt

gat

atg

ggt

145

Tyr

Ser

Asp

Pro

Lys

Val

Val

Ala

Glu

Ile

Leu

Thr

Leu

Asp

Met

Gly

35

40

45

gat

gtt

aac

cac

aga

aac

tca

cgt

ggc

tac

acg

gtt

ctg

cat

ctc

gca

193

Asp

Val

Asn

His

Arg

Asn

Ser

Arg

Gly

Tyr

Thr

Val

Leu

His

Leu

Ala

50

55

60

	♦ ·	• ·	• ♦	9 9		• 9	•
•	•	•	• ·	9	9	• 9	Φ ♦
•	•	• ··	• ·	9	•	•	•	•
•	♦	• · ·	9 9	9 9	•	• ·	•	•
•	•	• ·	9 9		•	« «	•
	• ·	♦ ·	99	9 9		·♦	Φ · ·

146

gcc Ala 65

atg Met

ege Arg

aaa Lys

gag Glu

ccg Pro 70

tcc Ser

atc Ile

atc Ile

ata Ile

tet Ser 75

ctt Leu

ctc Leu

aag Lys

aaa Lys

ggt Gly 80

241

gcc

aat

gcg

tet

ggc

ttc

acc

tgt

gat

gga

ege

agt

gcg

gtt

aat

ata

289

Ala

Asn

Ala

Ser

Gly

Phe

Thr

Cys

Asp

Gly

Arg

Ser

Ala

Val

Asn

Ile

85

90

95

tgt

aga

aga

ttg

aca

act

cca

aag

gat

tat

cat

act

aaa

aca

gct

gcg

337

Cys

Arg

Arg

Leu

Thr

Thr

Pro

Lys

Asp

Tyr

His

Thr

Lys

Thr

Ala

Ala

100

105

110

aaa

ggg

agg

gaa

gct

agt

aaa

gca

cgg

tta

tgt

ata

gat

ctc

ttg

gaa

385

Lys

Gly

Arg

Glu

Ala

Ser

Lys

Ala

Arg

Leu

Cys

Ile

Asp

Leu

Leu

Glu

115

120

125

aga

gaa

gta

agg

agg

aac

cct

atg

gtt

gtt

gag

tea

cca

atg

tgt

tet

433

Arg

Glu

Val

Arg

Arg

Asn

Pro

Met

Val

Val

Glu

Ser

Pro

Met

Cys

Ser

130

135

140

ctt

tet

atg

cct

gaa

gat

ctc

caa

atg

aga

ctg

tta

tac

ctt

gaa

aat

481

Leu

Ser

Met

Pro

Glu

Asp

Leu

Gin

Met

Arg

Leu

Leu

Tyr

Leu

Glu

Asn

145

150

155

160

ega

gtt

ggc

ctg

gct

caa

ct

501

Arg

Val

Gly

Leu

Ala

Gin

165 <210> 54 <211> 166 <212> PRT <213> Brassica napus

<400> 54

Asp Val

Glu

Phe Val 10

Lys

Leu Leu

Leu

Thr 15

Glu

Ala Leu 1

Asp Ser Asp 5

Ser

Asp

Ile

Thr

Leu

Asp

Glu

Ala

Asn

Gly

Leu

His

Tyr

Ser

Val

Val

20

25

30

Tyr

Ser

Asp

Pro

Lys

Val

Val

Ala

Glu

Ile

Leu

Thr

Leu

Asp

Met

Gly

35

40

45

Asp

Val

Asn

His

Arg

Asn

Ser

Arg

Gly

Tyr

Thr

Val

Leu

His

Leu

Ala

50

55

60

Ala

Met

Arg

Lys

Glu

Pro

Ser

Ile

Ile

Ile

Ser

Leu

Leu

Lys

Lys

Gly

65

70

75

80

Ala Asn Ala Ser Gly Phe Thr Cys Asp Gly Arg Ser Ala Val Asn Ile 85 90 95 ··· · • · · · · · • · · ·· · • ···· ·· · • 9 9 · 9 99

9 9 9 9 9 9 99

9 9 99 9 9 9 9·

147

Cys

Arg

Arg

Leu 100

Thr

Thr

Pro

Lys

Asp 105

Tyr

His

Thr

Lys

Thr 110

Ala

Ala

Lys

Gly

Arg 115

Glu

Ala

Ser

Lys

Ala 120

Arg

Leu

Cys

Ile

Asp 125

Leu

Leu

Glu

Arg

Glu 130

Val

Arg

Arg

Asn

Pro 135

Met

Val

Val

Glu

Ser 140

Pro

Met

Cys

Ser

Leu 145

Ser

Met

Pro

Glu

Asp 150

Leu

Gin

Met

Arg

Leu 155

Leu

Tyr

Leu

Glu

Asn 160

Arg

Val

Gly

Leu

Ala

Gin

165

<210>	55
<211>	498
<212>	DNA
<213>	Brassica napus

<220>

<221> CDS <222> (2)..(496) <223> Kanola C <400> 55 g gca ctg gat tet gat gat gtt gag ctt gtg aag ctt ctt ttg acc gag 49 Ala Leu Asp Ser Asp Asp Val Glu Leu Val Lys Leu Leu Leu Thr Glu 15 10 15

tea Ser

gat Asp

atc Ile

act Thr 20

cta gat

gaa gcc

aat Asn 25

ggt Gly

ctg Leu

cat His

tac Tyr

tea Ser 30

gtg Val

gtg Val

97

Leu

Asp

Glu

Ala

tat

agt

gat

ccc

aaa

gtt

gtt

gca

gag

ata

ctt

gcc

ctt

ggt

tta

ggt

145

Tyr

Ser

Asp

Pro

Lys

Val

Val

Ala

Glu

Ile

Leu

Ala

Leu

Gly

Leu

Gly

35

40

45

gat

gtc

aat

cac

aga

aac

tea

cgt

ggc

tac

tcg

gtt

ctt

cat

ttc

gct

193

Asp

Val

Asn

His

Arg

Asn

Ser

Arg

Gly

Tyr

Ser

Val

Leu

His

Phe

Ala

50

55

60

gcc

atg

cgt

aga

gag

cct

tcc

atc

atc

ata

tet

ctt

ctc

aag

gaa

ggc

241

Ala

Met

Arg

Arg

Glu

Pro

Ser

Ile

Ile

Ile

Ser

Leu

Leu

Lys

Glu

Gly

65

70

75

80

gcc

aat

gcg

tet

agc

ttc

act

ttt

gat

gga

ege

agt

gcg

gtt

aat

ata

289

Ala

Asn

Ala

Ser

Ser

Phe

Thr

Phe

Asp

Gly

Arg

Ser

Ala

Val

Asn

Ile

85

90

95

337

148

tgt Cys

agg aga ctg Arg Arg Leu 100

aca Thr

act Thr

cca aag Pro Lys

gat Asp 105

tat Tyr

cat His

aca aag aca tcc aaa Thr Lys Thr Ser Lys 110

aag

agg

gaa

get

agt

aaa

gca

agg

ctg

tgc

ata

gat

ctc

ttg

gaa

aga

Lys

Arg

Glu

Ala

Ser

Lys

Ala

Arg

Leu

Cys

Ile

Asp

Leu

Leu

Glu

Arg

115

120

125

gag

gtt

agg

agg

aac

cct

atg

Ctt

get

gat

acg

cca

atg

tgt

tea

ctt

Glu

Val

Arg

Arg

Asn

Pro

Met

Leu

Ala

Asp

Thr

Pro

Met

Cys

Ser

Leu

130

135

140

act

atg

cct

gaa

gat

ctc

caa

atg

aga

ctg

tta

tac

ctt

gaa

aat

ega

Thr

Met

Pro

Glu

Asp

Leu

Gin

Met

Arg

Leu

Leu

Tyr

Leu

Glu

Asn

Arg

145

150

155

160

gtt

ggt

ctt

get

aaa

ct

Val

Gly

Leu

Ala

Lys

165

<210> 56

<211> 165

<212> PRT

<213> Brassica napus

<400> 56

Ala

Leu

Asp

Ser

Asp

Asp

Val

Glu

Leu

Val

Lys

Leu

Leu

Leu

Thr

Glu

1

5

10

15

Ser

Asp

Ile

Thr

Leu

Asp

Glu

Ala

Asn

Gly

Leu

His

Tyr

Ser

Val

Val

20

25

30

Tyr

Ser

Asp

Pro

Lys

Val

Val

Ala

Glu

Ile

Leu

Ala

Leu

Gly

Leu

Gly

35

40

45

Asp

Val

Asn

His

Arg

Asn

Ser

Arg

Gly

Tyr

Ser

Val

Leu

His

Phe

Ala

50

55

60

Ala

Met

Arg

Arg

Glu

Pro

Ser

Ile

Ile

Ile

Ser

Leu

Leu

Lys

Glu

Gly

65

70

75

80

Ala

Asn

Ala

Ser

Ser

Phe

Thr

Phe

Asp

Gly

Arg

Ser

Ala

Val

Asn

Ile

85

90

95

Cys

Arg

Arg

Leu

Thr

Thr

Pro

Lys

Asp

Tyr

His

Thr

Lys

Thr

Ser

Lys

100

105

110

Lys

Arg

Glu

Ala

Ser

Lys

Ala

Arg

Leu

Cys

Ile

Asp

Leu

Leu

Glu

Arg

115

120

125

Glu

Val

Arg

Arg

Asn

Pro

Met

Leu

Ala

Asp

Thr

Pro

Met

Cys

Ser

Leu

130

135

140

385

433

481

498

Thr Met Pro Glu Asp Leu Gin Met Arg Leu Leu Tyr Leu Glu Asn Arg

145 150 155 160

• ·	* ·	··		• ·
• ·	•	• ·	• ·	• · ·
•	•	···	• ·	« ·	• ·
• ·	• ·	• · ·	·#♦ ·	• ·
•	•	« ·	• ·	•	• ·
··	♦ ·	• ·	• ·	·« ·

149

Val Gly Leu Ala Lys

165 <210> 57 <211> 498 <212> DNA <213> Brassica napus <220>

<221> CDS <222> (2)..(496) <223> Kanola D <400> 57 g gca ctg gac tet gat gat gtt gag ctt gtc aag atg ctt ttg aca gaa 49 Ala Leu Asp Ser Asp Asp Val Glu Leu Val Lys Met Leu Leu Thr Glu 15 10 15

gga cac Gly His

acg Thr

agt Ser 20

cta gac gac

gcc Ala

tac Tyr 25

gct Ala

ctt Leu

cac His

tac Tyr

gct Ala 30

gtt Val

gca Ala

97

Leu

Asp

Asp

cat

tcc

gat

gtg

aag

acg

gcc

tet

gat

ctc

ata

gac

ctt

gag

ctt

gcg

145

His

Ser

Asp

Val

Lys

Thr

Ala

Ser

Asp

Leu

Ile

Asp

Leu

Glu

Leu

Ala

35

40

45

gat

gtt

gac

cat

aga

aac

ctg

agg

ggg

tac

acg

gcg

ctt

cac

gtt

gct

193

Asp

Val

Asp

His

Arg

Asn

Leu

Arg

Gly

Tyr

Thr

Ala

Leu

His

Val

Ala

50

55

60

gcg

atg

agg

aac

gag

ccg

aag

ctg

atg

gtt

tat

tta

ttg

act

aaa

ggt

241

Ala

Met

Arg

Asn

Glu

Pro

Lys

Leu

Met

Val

Tyr

Leu

Leu

Thr

Lys

Gly

65

70

75

80

gcg

aat

gcg

tcg

gag

aca

acg

ttt

gac

ggt

aga

acg

gct

ctt

gtg

att

289

Ala

Asn

Ala

Ser

Glu

Thr

Thr

Phe

Asp

Gly

Arg

Thr

Ala

Leu

Val

Ile

85

90

95

gca

aaa

aga

ctc

act

aaa

gct

tet

gag

tat

aat

gct

agt

acg

gag

caa

337

Ala

Lys

Arg

Leu

Thr

Lys

Ala

Ser

Glu

Tyr

Asn

Ala

Ser

Thr

Glu

Gin

100

105

110

ggg

aag

cct

tet

ctg

aaa

gga

ggg

cta

tgc

ata

gag

gta

cta

gag

cat

385

Gly

Lys

Pro

Ser

Leu

Lys

Gly

Gly

Leu

Cys

Ile

Glu

Val

Leu

Glu

His

115

120

125

gcg.

cgg

aaa

cta

ggt

agg

ttg

cct

aga

gat

ggt

tta

cct

tet

ctt

cca

433

Ala

Arg

Lys

Leu

Gly

Arg

Leu

Pro

Arg

Asp

Gly

Leu

Pro

Ser

Leu

Pro

130

135

140

• 9 • · · · ·

150

gct Ala 145

act Thr

cct Pro

gat Asp

gaa Glu

ctg Leu 150

agg atg agg

ttg ctc

tac Tyr

ctt gaa

aat Asn

ega Arg 160

481

Arg

Met

Arg

Leu

Leu 155

Leu

Glu

gtt

ggc

ctg

gct

caa

ct

498

Val

Gly

Leu

Ala

Gin

165 <210> 58 <211> 165 <212> PRT <213> Brassica napus <400> 58

Ala 1

Leu

Asp

Ser

Asp Asp Val 5

Glu Leu

Val 10

Lys Met Leu

Leu

Thr 15

Glu

Gly

His

Thr

Ser

Leu

Asp

Asp

Ala

Tyr

Ala

Leu

His

Tyr

Ala

Val

Ala

20

25

30

His

Ser

Asp

Val

Lys

Thr

Ala

Ser

Asp

Leu

Ile

Asp

Leu

Glu

Leu

Ala

35

40

45

Asp

Val

Asp

His

Arg

Asn

Leu

Arg

Gly

Tyr

Thr

Ala

Leu

His

Val

Ala

50

55

60

Ala

Met

Arg

Asn

Glu

Pro

Lys

Leu

Met

Val

Tyr

Leu

Leu

Thr

Lys

Gly

65

70

75

80

Ala

Asn

Ala

Ser

Glu

Thr

Thr

Phe

Asp

Gly

Arg

Thr

Ala

Leu

Val

Ile

85

90

95

Ala

Lys

Arg

Leu

Thr

Lys

Ala

Ser

Glu

Tyr

Asn

Ala

Ser

Thr

Glu

Gin

100

105

110

Gly

Lys

Pro

Ser

Leu

Lys

Gly

Gly

Leu

Cys

Ile

Glu

Val

Leu

Glu

His

115

12 0

125

Ala

Arg

Lys

Leu

Gly

Arg

Leu

Pro

Arg

Asp

Gly

Leu

Pro

Ser

Leu

Pro

130

135

140

Ala

Thr

Pro

Asp

Glu

Leu

Arg

Met

Arg

Leu

Leu

Tyr

Leu

Glu

Asn

Arg

145

150

155

160

Val Gly Leu Ala Gin

165 <210> 59 <211> 31 <212> DNA

151 <213> Umělá sekvence <220>

<223> Popis umělé sekvence: PCR primer NIM 3A <400> 59 tagatgawgc mtaygctcty caytatgctg t <210> 60 <211> 32 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>

<223> Popis umělé sekvence: PCR primer NIM 3B <400> 60 ggctcyttmc kcatggcagc aayrtgaags ac <210> 61 <211> 148 <212> DNA <213> Lycopersicon esculentum <220>

<221> CDS <222> (4)..(147) <223> Rajče B <400> 61

tag

atg Met 1

atg Met

cat His

atg Met

ctc Leu 5

ttc Phe

att Ile

atg ctg ttg cat

att gtg

acc Thr

cca Pro 15

48

Met Leu

Leu 10

His

Ile

Val

agg

ttg

ttg

ctg

agg

ttc

ttg

gac

tgg

gtg

ttg

cta

atg

tca

acc

ttc

96

Arg

Leu

Leu

Leu

Arg

Phe

Leu

Asp

Trp

Val

Leu

Leu

Met

Ser

Thr

Phe

20

25

30

gga

atg

cac

gtg

gtt

aca

ctg

tcc

ttc

acg

ttg

ctg

cca

tgc

gga

aag

144

Gly

Met

His

Val

Val

Thr

Leu

Ser

Phe

Thr

Leu

Leu

Pro

Cys

Gly

Lys

35

40

45

agc c Ser <210> 62 <211> 48 <212> PRT <213> Lycopersicon esculentum <400> 62

148

152

Met 1

Met

His

Met

Leu 5

Phe

Ile

Met

Leu

Leu 10

His

Ile

Val

Thr

Pro 15

Arg

Leu

Leu

Leu

Arg 20

Phe

Leu

Asp

Trp

Val 25

Leu

Leu

Met

Ser

Thr 30

Phe

Gly

Met

His

Val

Val

Thr

Leu

Ser

Phe

Thr

Leu

Leu

Pro

Cys

Gly

Lys

Ser

40 45 <210> 63 <211> 2296 <212> DNA <213> Beta vulgaris <220>

<221> CDS <222> (113)..(1927) <223> cDNA sekvence plné délky, cukrová řepa <400> 63 cacacacaca cccgacgccg tatgcgtatc cattctctct cctcaacctc cctttgactt 60 cctcttactc caccatcttc aatgtcgtcg atttccaatc tctaacattc ac atg aca 118

Met Thr

acc Thr

acc Thr

tcc Ser 5

aca Thr

aca Thr

atg Met

gtg Val

atc Ile 10

gat Asp

tet Ser

ege Arg

acc Thr

gct Ala 15

ttc Phe

tcc Ser

gat Asp

166

tcc

aac

gac

atc

age

aat

ggc

agt

age

atc

tgc

tgc

gtc

gcc

gca

aca

214

Ser

Asn

Asp

Ile

Ser

Asn

Gly

Ser

Ser

Ile

Cys

Cys

Val

Ala

Ala

Thr

20

25

30

aca

act

aca

aca

aca

acc

gcc

gca

gaa

aac

tet

ctc

tcc

ttt

act

ccc

262

Thr

Thr

Thr

Thr

Thr

Thr

Ala

Ala

Glu

Asn

Ser

Leu

Ser

Phe

Thr

Pro

35

40

45

50

gac

gcc

gcc

gct

ctt

ctc

ege

ctc

tet

gaa

aac

ctc

gac

tcg

ctt

ttc

310

Asp

Ala

Ala

Ala

Leu

Leu

Arg

Leu

Ser

Glu

Asn

Leu

Asp

Ser

Leu

Phe

55

60

65

caa

ccc

tcg

ctt

tet

ctc

tcc

gac

tcc

gac

tet

ttc

gcc

gac

gct

aaa

358

Gin

Pro

Ser

Leu

Ser

Leu

Ser

Asp

Ser

Asp

Ser

Phe

Ala

Asp

Ala

Lys

70

75

80

atc

gtc

gtt

tcc

ggt

gat

tcg

cgt

gaa

gtc

gcc

gtt

cat

cgg

tgt

gtt

406

Ile

Val

Val

Ser

Gly

Asp

Ser

Arg

Glu

Val

Ala

Val

His

Arg

Cys

Val

85

90

95

• W ·· • * · • e ··<

• · · · • · · · ·« ·· ♦ ♦ r··· • · · ·· • · · · ··

9» · t«t · *· • « « ·« ··99

153

ctc tcg tet

cgg age

tcg Ser

ttc Phe 105

ttt Phe

cgg tcc gct

ttt gct Phe Ala 110

tcg Ser

aaa Lys

ega Arg

454

Leu

Ser Ser 100

Arg

Ser

Arg Ser

Ala

gag

aag

gag

aag

gag

agg

gat

aaa

gag

aga

gtg

gtg

aag

ctt

gag

ctt

502

Glu

Lys

Glu

Lys

Glu

Arg

Asp

Lys

Glu

Arg

Val

Val

Lys

Leu

Glu

Leu

115

120

125

130

aag

gat

tta

gct

ggt

gat

ttt

gag

gtt

gga

ttt

gat

tcg

gtt

gtt

gcg

550

Lys

Asp

Leu

Ala

Gly

Asp

Phe

Glu

Val

Gly

Phe

Asp

Ser

Val

Val

Ala

135

140

145

gtt

tta

ggt

tat

ttg

tat

agt

ggc

aaa

gtt

agg

aat

ttg

cct

aga

gga

598

Val

Leu

Gly

Tyr

Leu

Tyr

Ser

Gly

Lys

Val

Arg

Asn

Leu

Pro

Arg

Gly

150

155

160

att

tgt

gtt

tgt

gtt

gat

gag

gat

tgc

tet

cat

gaa

gct

tgt

cgt

cct

646

Ile

Cys

Val

Cys

Val

Asp

Glu

Asp

Cys

Ser

His

Glu

Ala

Cys

Arg

Pro

165

170

175

gct

gtt

gat

ttt

gtt

gtt

gag

gtt

ctc

tat

ttg

tet

cac

aaa

ttc

gag

694

Ala

Val

Asp

Phe

Val

Val

Glu

Val

Leu

Tyr

Leu

Ser

His

Lys

Phe

Glu

180

185

190

att

gtc

gaa

ttg

gtt

tcg

ctt

tat

cag

agg

cac

cta

ctg

gat

att

ctt

742

Ile

Val

Glu

Leu

Val

Ser

Leu

Tyr

Gin

Arg

His

Leu

Leu

Asp

Ile

Leu

195

200

205

210

gac

aag

att

gca

cca

gat

gac

gtt

cta

gta

gtg

tta

tet

gtc

gct

gag

790

Asp

Lys

Ile

Ala

Pro

Asp

Asp

Val

Leu

Val

Val

Leu

Ser

Val

Ala

Glu

215

220

225

atg

tgt

gga

aat

gcg

tgt

gac

gga

ttg

ctg

gca

agg

tgt

att

gac

aag

838

Met

Cys

Gly

Asn

Ala

Cys

Asp

Gly

Leu

Leu

Ala

Arg

Cys

Ile

Asp

Lys

230

235

240

att

gtg

agg

tcc

gat

att

gac

gta

acc

acc

att

gat

aaa

tcc

ttg

ccg

886

Ile

Val

Arg

Ser

Asp

Ile

Asp

Val

Thr

Thr

Ile

Asp

Lys

Ser

Leu

Pro

245

250

255

cag

aat

gtt

gtg

aaa

cag

ata

atc

gac

acg

ega

aag

gaa

ctt

ggg

ttt

934

Gin

Asn

Val

Val

Lys

Gin

Ile

Ile

Asp

Thr

Arg

Lys

Glu

Leu

Gly

Phe

260

265

270

act

gaa

cct

ggg

cgt

gtt

gag

ttt

cct

gat

aag

cat

gtg

aag

aga

ata

982

Thr

Glu

Pro

Gly

Arg

Val

Glu

Phe

Pro

Asp

Lys

His

Val

Lys

Arg

Ile

275

280

285

290

cac

aga

gct

ttg

gaa

tcc

gat

gat

gta

gag

tta

gtc

aga

atg

ctt

tta

1030

His

Arg

Ala

Leu

Glu

Ser

Asp

Asp

Val

Glu

Leu

Val

Arg

Met

Leu

Leu

295

300

305

e·	»·	00	00	00 0
•	•	0	0	0	0 0	0 ·	• 0
• ·	• U	0 0	0 0	0 0	0
• ·	0 0 0	0	0	000 0	0 0	0
•	•	0 0	0 0	0	0 <	0
»<	0»	0»	00	00	000

154

aaa Lys

gag Glu

cgc Arg

cat His 310

aca Thr

act Thr

cta Leu

gat Asp

gat Asp 315

gca Ala

tat Tyr

gcc Ala

ctt Leu

cac His 320

tat Tyr

gct Ala

1078

gtg

gca

cat

tgt

gat

gcc

aag

acc

acc

acg

gag

ctt

ctt

gag

ctt

ggg

1126

Val

Ala

His

Cys

Asp

Ala

Lys

Thr

Thr

Thr

Glu

Leu

Leu

Glu

Leu

Gly

325

33 0

335

ctt

gca

gat

gtt

aat

ctt

aga

aat

cta

agg

ggt

cac

act

gtg

cta

cat

1174

Leu

Ala

Asp

Val

Asn

Leu

Arg

Asn

Leu

Arg

Gly

His

Thr

Val

Leu

His

340

345

350

gtg

gca

gcc

atg

aga

aaa

gag

cct

aag

ata

att

gta

tcc

ttg

tta

acc

1222

Val

Ala

Ala

Met

Arg

Lys

Glu

Pro

Lys

Ile

Ile

Val

Ser

Leu

Leu

Thr

355

360

365

370

aag

gga

gcc

cat

ccg

tet

gat

ata

aca

tea

gat

gat

aaa

aaa

gca

ctg

1270

Lys

Gly

Ala

His

Pro

Ser

Asp

Ile

Thr

Ser

Asp

Asp

Lys

Lys

Ala

Leu

375

380

385

cag

ata

gca

aag

aga

cta

aca

aaa

gct

gtg

gac

ttc

tat

aaa

act

aca

1318

Gin

Ile

Ala

Lys

Arg

Leu

Thr

Lys

Ala

Val

Asp

Phe

Tyr

Lys

Thr

Thr

390

395

400

gaa

caa

gga

aaa

gat

gca

cca

aag

gat

cgg

ttg

tgc

att

gaa

ata

ctg

1366

Glu

Gin

Gly

Lys

Asp

Ala

Pro

Lys

Asp

Arg

Leu

Cys

Ile

Glu

Ile

Leu

405

410

415

gag

caa

gct

gaa

aga

aga

gaa

cca

ttg

cta

gga

gaa

ggt

tet

gtt

tet

1414

Glu

Gin

Ala

Glu

Arg

Arg

Glu

Pro

Leu

Leu

Gly

Glu

Gly

Ser

Val

Ser

420

425

430

ctt

gca

aag

gca

gga

gat

gat

ctg

cgt

atg

aag

cta

tta

tat

ctt

gaa

1462

Leu

Ala

Lys

Ala

Gly

Asp

Asp

Leu

Arg

Met

Lys

Leu

Leu

Tyr

Leu

Glu

435

440

445

450

aat

aga

gtt

gca

ctt

gct

cgg

ttg

ctc

ttt

cca

atg

gaa

gcg

aaa

gtg

1510

Asn

Arg

Val

Ala

Leu

Ala

Arg

Leu

Leu

Phe

Pro

Met

Glu

Ala

Lys

Val

455

460

465

gct

atg

gat

att

gct

caa

gtg

gac

gga

act

tet

gaa

ttc

aca

ttg

tea

1558

Ala

Met

Asp

Ile

Ala

Gin

Val

Asp

Gly

Thr

Ser

Glu

Phe

Thr

Leu

Ser

470

475

480

aag

aat

ata

gct

gat

gca

ega

aga

aat

gcg

gtg

gac

ttg

aat

gag

gct

1606

Lys

Asn

Ile

Ala

Asp

Ala

Arg

Arg

Asn

Ala

Val

Asp

Leu

Asn

Glu

Ala

485

490

495

ccc

ttt

ata

ttg

aaa

gag

gag

cat

ttg

cag

agg

atg

aaa

gca

ctg

tet

1654

Pro

Phe

Ile

Leu

Lys

Glu

Glu

His

Leu

Gin

Arg

Met

Lys

Ala

Leu

Ser

500

505

510

155

aaa act

gtt Val

gag Glu

ctt Leu

ggc Gly 520

aag Lys

cgt Arg

ttc Phe

ttt Phe

cca ege Pro Arg 525

tgc Cys

tcc gat Ser Asp

gtt Val 530

1702

Lys 515

Thr

ctt

aat

aag

att

atg

gac

gcc

gaa

gat

cta

tca

cag

ctt

gca

ttt

tta

1750

Leu

Asn

Lys

Ile

Met

Asp

Ala

Glu

Asp

Leu

Ser

Gin

Leu

Ala

Phe

Leu

535

540

545

gga

aaa

gat

act

cca

gag

gaa

cgg

caa

agg

aag

aga

aaa

ega

tac

ctt

1798

Gly

Lys

Asp

Thr

Pro

Glu

Glu

Arg

Gin

Arg

Lys

Arg

Lys

Arg

Tyr

Leu

550

555

560

gaa

ctg

caa

gac

gct

tta

act

aag

gct

ttt

aca

gag

gac

aaa

gaa

gag

1846

Glu

Leu

Gin

Asp

Ala

Leu

Thr

Lys

Ala

Phe

Thr

Glu

Asp

Lys

Glu

Glu

565

570

575

ttt

gac

cgt

tet

aca

tta

tca

tca

tcg

tcg

tcg

tcg

act

cca

atg

ggg

1894

Phe

Asp

Arg

Ser

Thr

Leu

Ser

Ser

Ser

Ser

Ser

Ser

Thr

Pro

Met

Gly

580

5 85

590

agg

cca

tat

ggt

aag

acc

aat

ttc

aag

agg

taa

ctccttagca gctcaaagtt

1947

Arg

Pro

Tyr

Gly

Lys

Thr

Asn

Phe

Lys

Arg

595

600

605

gcatacgacg	tcacttgtat	aatattcatg	tatatgtatg	aaaatttctt	tttgttctcc	2007
ccttctattg	atggccacgg	tttegatett	tttggtctgt	attataattt	ttgaccgatt	2067
aettgataga	attgtattct	atacatcttt	ataagctcat	agtaacacca	gatttaggta	2127
ctatccgttg	gagacacata	ctcttgtgtg	cgatgatgaa	tcaatcatca	gattacatta	2187
cacgagccat	ttcctgccat	attgtaattc	atgtatcaag	gtacaaataa	atagcgtcgt	2247
ggggttgcac	ctcttgcatt	atcgaaaaaa	aaaaaaaaaa	aaaaaaaaa		2296

<210> 64 <211> 604 <212> PRT <213> Beta vulgaris <400> 64

Met 1

Thr

Thr

Thr

Ser 5

Thr

Thr Met

Val

Ile 10

Asp

Ser

Arg Thr

Ala 15

Phe

Ser

Asp

Ser

Asn

Asp

Ile

Ser

Asn

Gly

Ser

Ser

Ile

Cys

Cys

Val

Ala

20

25

30

Ala

Thr

Thr

Thr

Thr

Thr

Thr

Thr

Ala

Ala

Glu

Asn

Ser

Leu

Ser

Phe

40 45

Thr Pro Asp Ala Ala Ala Leu Leu Arg Leu Ser Glu Asn Leu Asp Ser

55 60 • · • · • · · · · · · · 9 · • · · · · · ♦ · · · · • · · · · · · ··

156

Leu 65

Phe Gin Pro

Ser Leu 70

Ser

Leu

Ser

Asp

Ser 75

Asp Ser Phe

Ala

Asp 80

Ala

Lys

Ile

Val

Val

Ser

Gly

Asp

Ser

Arg

Glu

Val

Ala

Val

His

Arg

85

90

95

Cys

Val

Leu

Ser

Ser

Arg

Ser

Ser

Phe

Phe

Arg

Ser

Ala

Phe

Ala

Ser

100

105

110

Lys

Arg

Glu

Lys

Glu

Lys

Glu

Arg

Asp

Lys

Glu

Arg

Val

Val

Lys

Leu

115

120

125

Glu

Leu

Lys

Asp

Leu

Ala

Gly

Asp

Phe

Glu

Val

Gly

Phe

Asp

Ser

Val

130

135

140

Val

Ala

Val

Leu

Gly

Tyr

Leu

Tyr

Ser

Gly

Lys

Val

Arg

Asn

Leu

Pro

145

150

155

160

Arg

Gly

Ile

Cys

Val

Cys

Val

Asp

Glu

Asp

Cys

Ser

His

Glu

Ala

Cys

165

170

175

Arg

Pro

Ala

Val

Asp

Phe

Val

Val

Glu

Val

Leu

Tyr

Leu

Ser

His

Lys

180

185

190

Phe

Glu

Ile

Val

Glu

Leu

Val

Ser

Leu

Tyr

Gin

Arg

His

Leu

Leu

Asp

195

200

205

Ile

Leu

Asp

Lys

Ile

Ala

Pro

Asp

Asp

Val

Leu

Val

Val

Leu

Ser

Val

210

215

220

Ala

Glu

Met

Cys

Gly

Asn

Ala

Cys

Asp

Gly

Leu

Leu

Ala

Arg

Cys

Ile

225

230

235

240

Asp

Lys

Ile

Val

Arg

Ser

Asp

Ile

Asp

Val

Thr

Thr

Ile

Asp

Lys

Ser

245

250

255

Leu

Pro

Gin

Asn

Val

Val

Lys

Gin

Ile

Ile

Asp

Thr

Arg

Lys

Glu

Leu

260

265

270

Gly

Phe

Thr

Glu

Pro

Gly

Arg

Val

Glu

Phe

Pro

Asp

Lys

His

Val

Lys

275

280

285

Arg

Ile

His

Arg

Ala

Leu

Glu

Ser

Asp

Asp

Val

Glu

Leu

Val

Arg

Met

290

295

300

Leu

Leu

Lys

Glu

Arg

His

Thr

Thr

Leu

Asp

Asp

Ala

Tyr

Ala

Leu

His

305

310

315

320

Tyr

Ala

Val

Ala

His

Cys

Asp

Ala

Lys

Thr

Thr

Thr

Glu

Leu

Leu

Glu

325

330

335

Leu

Gly

Leu

Ala

Asp

Val

Asn

Leu

Arg

Asn

Leu

Arg

Gly

His

Thr

Val

340

345

350

157

Leu His

Val 355

Ala

Ala Met

Arg

Lys Glu 360

Pro

Lys

Ile

Ile 365

Val

Ser

Leu

Leu

Thr

Lys

Gly

Ala

His

Pro

Ser

Asp

Ile

Thr

Ser

Asp

Asp

Lys

Lys

370

375

380

Ala

Leu

Gin

Ile

Ala

Lys

Arg

Leu

Thr

Lys

Ala

Val

Asp

Phe

Tyr

Lys

385

390

395

400

Thr

Thr

Glu

Gin

Gly

Lys

Asp

Ala

Pro

Lys

Asp

Arg

Leu

Cys

Ile

Glu

405

410

415

Ile

Leu

Glu

Gin

Ala

Glu

Arg

Arg

Glu

Pro

Leu

Leu

Gly

Glu

Gly

Ser

420

425

430

Val

Ser

Leu

Ala

Lys

Ala

Gly

Asp

Asp

Leu

Arg

Met

Lys

Leu

Leu

Tyr

435

440

445

Leu

Glu

Asn

Arg

Val

Ala

Leu

Ala

Arg

Leu

Leu

Phe

Pro

Met

Glu

Ala

450

455

460

Lys

Val

Ala

Met

Asp

Ile

Ala

Gin

Val

Asp

Gly

Thr

Ser

Glu

Phe

Thr

465

470

475

480

Leu

Ser

Lys

Asn

Ile

Ala

Asp

Ala

Arg

Arg

Asn

Ala

Val

Asp

Leu

Asn

485

490

495

Glu

Ala

Pro

Phe

Ile

Leu

Lys

Glu

Glu

His

Leu

Gin

Arg

Met

Lys

Ala

500

505

510

Leu

Ser

Lys

Thr

Val

Glu

Leu

Gly

Lys

Arg

Phe

Phe

Pro

Arg

Cys

Ser

515

520

525

Asp

Val

Leu

Asn

Lys

Ile

Met

Asp

Ala

Glu

Asp

Leu

Ser

Gin

Leu

Ala

530

535

540

Phe

Leu

Gly

Lys

Asp

Thr

Pro

Glu

Glu

Arg

Gin

Arg

Lys

Arg

Lys

Arg

545

550

555

560

Tyr

Leu

Glu

Leu

Gin

Asp

Ala

Leu

Thr

Lys

Ala

Phe

Thr

Glu

Asp

Lys

565

570

575

Glu

Glu

Phe

Asp

Arg

Ser

Thr

Leu

Ser

Ser

Ser

Ser

Ser

Ser

Thr

Pro

580

585

590

Met

Gly

Arg

Pro

Tyr

Gly

Lys

Thr

Asn

Phe

Lys

Arg

595 600 <210> 65 <211> 2844 <212> DNA • ·

158 <213> Helianthus annuus <220>

<221> CDS <222> (737) . . (2512) <223> cDNA sekvence plné délky, slunečnice B <400> 65

gacgataaaa	cccctctctc	tttttgctac	caagaacctt	cctactttct	tgcaccaaag	60
tttctttgca	ggttctttga	agcttcttta	tcatcatacg	ttggtttgat	attgtttttg	120
atgcatcttt	tcacatgggt	tttgcttatt	gagtgattat	ctgttgtggg	tatttgatac	180
aaattgaaaa	aaagatgatt	agatttggta	tttagggttt	tggttattga	agattttatt	240
aattagggtt	tgattagggt	ttgattaaga	ttcttgtatt	ggatgggttg	atttagatcc	300
agctgtttgt	gggtttcaaa	tttttgtttt	ggtatttgca	tatctcattc	taatctattc	360
agaggttgag	gttctttagg	tttgactttg	actttgactt	ttgggtactt	tcttgtacat	420
gtataatgtt	tgatttgatc	cattatatgt	gttttgtaat	tgaatcatag	caaattttct	480
tgcctgtata	tatatgtttt	attgaggatt	tggttcaagt	tttgaccttt	ttgggaaaaa	540
aagtcaaaca	catattcttg	ttcatgtagt	tttgcaaatc	aatcatttca	caaatctttc	600
tttatgttgg	gaatccatct	caatcataaa	aaagtttctt	tctttctttg	agttcttgtt	660
agctatgaaa	gtttatgatt	tgtccttttt	gtgataaagt	caaaccccta	atcatcctgg	720

gactttgact aaatcg atg gcg aat tca tcc gaa ccg tca tca tcc ata agc 772 Met Ala Asn Ser Ser Glu Pro Ser Ser Ser Ile Ser 15 10

ttc Phe

acc Thr

tca Ser 15

tet Ser

tca Ser

cac His

ata Ile

tet Ser 20

aac Asn

ggc Gly

gca Ala

act Thr

agc Ser 25

tac Tyr

aac Asn

ata Ile

820

CCC

cca

cca

tca

atc

ccc

gag

cca

cgg

tcg

aat

att

gaa

atc

att

ggc

868

Pro

Pro

Pro

Ser

Ile

Pro

Glu

Pro

Arg

Ser

Asn

Ile

Glu

Ile

Ile

Gly

30

35

40

tta

aat

aga

ctc

agc

aca

aac

cta

gag

aag

ctc

gta

ttc

gat

tca

ggt

916

Leu

Asn

Arg

Leu

Ser

Thr

Asn

Leu

Glu

Lys

Leu

Val

Phe

Asp

Ser

Gly

45

50

55

60

tet

gaa

tet

gat

tgc

aat

tac

agc

gat

gct

gaa

gtt

gtt

gtt

gag

ggt

964

Ser

Glu

Ser

Asp

Cys

Asn

Tyr

Ser

Asp

Ala

Glu

Val

Val

Val

Glu

Gly

65

70

75

159

att Ile

tet Ser

gta ggc

att Ile

cat His

cgg Arg

tgt Cys

att Ile 85

tta gcc Leu Ala

act Thr

aga Arg

agt Ser 90

acg Thr

ttt Phe

1012

Val

Gly 80

ttt

agc

gat

ttg

ttt

aag

aag

aac

aaa

ggt

tgt

gta

gag

aag

gac

agt

1060

Phe

Ser

Asp

Leu

Phe

Lys

Lys

Asn

Lys

Gly

Cys

Val

Glu

Lys

Asp

Ser

95

100

105

aag

ccg

aaa

tat

aac

atg

agt

gat

ttg

ttg

ccg

tat

ggg

agc

gtt

ggg

1108

Lys

Pro

Lys

Tyr

Asn

Met

Ser

Asp

Leu

Leu

Pro

Tyr

Gly

Ser

Val

Gly

110

115

120

tat

gat

gcg

ttt

ctc

gtg

ttt

tta

agc

tat

gtt

tat

act

ggg

aaa

ctg

1156

Tyr

Asp

Ala

Phe

Leu

Val

Phe

Leu

Ser

Tyr

Val

Tyr

Thr

Gly

Lys

Leu

125

130

135

140

aaa

gcg

tet

cct

ccg

gag

gtt

tea

acc

tgc

gtt

gat

gat

ggg

tgt

ctt

1204

Lys

Ala

Ser

Pro

Pro

Glu

Val

Ser

Thr

Cys

Val

Asp

Asp

Gly

Cys

Leu

145

150

155

cat

gat

get

tgt

tgg

cct

get

att

aac

ttt

get

gtt

gag

ttg

act

tat

1252

His

Asp

Ala

Cys

Trp

Pro

Ala

Ile

Asn

Phe

Ala

Val

Glu

Leu

Thr

Tyr

160

165

170

gcg

tet

tcg

gtt

ttt

caa

gtt

ccg

gaa

tta

gtt

tcg

ctt

ttt

cag

cgt

1300

Ala

Ser

Ser

Val

Phe

Gin

Val

Pro

Glu

Leu

Val

Ser

Leu

Phe

Gin

Arg

175

180

185

cgt

ctt

ctc

aac

ttt

gtg

gac

aag

get

ctt

gtt

gaa

gac

gtg

atc

ccg

1348

Arg

Leu

Leu

Asn

Phe

Val

Asp

Lys

Ala

Leu

Val

Glu

Asp

Val

Ile

Pro

190

195

200

atc

ctt

gtt

gtg

gcc

ttt

cac

tgt

cag

ttg

caa

aac

gtc

tta

tet

cgt

1396

Ile

Leu

Val

Val

Ala

Phe

His

Cys

Gin

Leu

Gin

Asn

Val

Leu

Ser

Arg

205

210

215

220

tgc

att

gac

ega

gta

gtt

agg

tea

aag

ctc

gat

act

att

tcc

att

gaa

1444

Cys

Ile

Asp

Arg

Val

Val

Arg

Ser

Lys

Leu

Asp

Thr

Ile

Ser

Ile

Glu

225

230

235

aaa

gag

ctt

cca

ttt

gaa

gtc

acc

caa

atg

atc

aaa

tcc

att

gat

aac

1492

Lys

Glu

Leu

Pro

Phe

Glu

Val

Thr

Gin

Met

Ile

Lys

Ser

Ile

Asp

Asn

240

245

250

atc

atc

caa

gaa

gat

gac

gaa

cat

aca

gtc

gaa

tea

gaa

gtc

gtg

tta

1540

Ile

Ile

Gin

Glu

Asp

Asp

Glu

His

Thr

Val

Glu

Ser

Glu

Val

Val

Leu

255

260

265

cgt

gaa

aag

aga

att

aaa

agc

ata

cac

aaa

gca

tta

gac

tgt

gac

gat

1588

Arg

Glu

Lys

Arg

Ile

Lys

Ser

Ile

His

Lys

Ala

Leu

Asp

Cys

Asp

Asp

270

275

280

• ·

160

gtt Val 285

gag Glu

ctt Leu

gtg Val

aaa Lys

atg Met 290

att Ile

tta Leu

gac gaa

tcc Ser 295

aaa Lys

atc Ile

acg Thr

tta Leu

gat Asp 300

1636

Asp

Glu

gaa

gcc

tgc

gct

ctt

cat

tat

gcg

gtc

atg

tat

tgt

aat

caa

gaa

gtt

1684

Glu

Ala

Cys

Ala

Leu

His

Tyr

Ala

Val

Met

Tyr

Cys

Asn

Gin

Glu

Val

305

310

315

gct

aag

gag

att

ctt

aac

tta

aac

cgt

gcg

gat

gtt

aat

ctt

aga

aac

1732

Ala

Lys

Glu

Ile

Leu

Asn

Leu

Asn

Arg

Ala

Asp

Val

Asn

Leu

Arg

Asn

320

325

330

tca

ega

gat

tac

acc

gtg

ctt

cat

gtt

gct

gcc

atg

cgt

aaa

gaa

cca

1780

Ser

Arg

Asp

Tyr

Thr

Val

Leu

His

Val

Ala

Ala

Met

Arg

Lys

Glu

Pro

335

340

345

tca

ctt

att

gtt

tcg

att

cta

agc

aaa

ggc

gcg

tgt

gca

tcg

gat

act

1828

Ser

Leu

Ile

Val

Ser

Ile

Leu

Ser

Lys

Gly

Ala

Cys

Ala

Ser

Asp

Thr

350

355

360

act

ttt

gat

gga

caa

agt

gcg

gtt

agt

att

tgc

agg

aga

ega

aca

agg

1876

Thr

Phe

Asp

Gly

Gin

Ser

Ala

Val

Ser

Ile

Cys

Arg

Arg

Arg

Thr

Arg

365

370

375

380

ccc

aag

gat

tat

tat

gtg

aaa

acc

gaa

cac

ggg

caa

gaa

aca

aat

aaa

1924

Pro

Lys

Asp

Tyr

Tyr

Val

Lys

Thr

Glu

His

Gly

Gin

Glu

Thr

Asn

Lys

385

390

395

gat

cgt

ata

tgc

atc

gat

gtt

ttg

gag

cgg

gaa

ata

aag

agg

aat

ccg

1972

Asp

Arg

Ile

Cys

Ile

Asp

Val

Leu

Glu

Arg

Glu

Ile

Lys

Arg

Asn

Pro

400

405

410

atg

ata

ggc

gat

gtt

tcc

gtg

tgt

tet

tca

gca

gtg

gct

gat

gat

ttg

2020

Met

Ile

Gly

Asp

Val

Ser

Val

Cys

Ser

Ser

Ala

Val

Ala

Asp

Asp

Leu

415

420

425

cat

atg

aat

tta

ctc

tac

tta

gaa

aac

ega

gtg

gca

ttt

gct

ega

ctg

2068

His

Met

Asn

Leu

Leu

Tyr

Leu

Glu

Asn

Arg

Val

Ala

Phe

Ala

Arg

Leu

430

435

440

tta

ttt

ccg

tca

gaa

gcg

aaa

cta

gca

atg

gaa

att

gcg

cat

gcc

caa

2116

Leu

Phe

Pro

Ser

Glu

Ala

Lys

Leu

Ala

Met

Glu

Ile

Ala

His

Ala

Gin

445

450

455

460

acg

act

gca

cag

tat

ccg

ggt

cta

ttg

gca

tcg

aaa

ggg

tca

aat

ggt

2164

Thr

Thr

Ala

Gin

Tyr

Pro

Gly

Leu

Leu

Ala

Ser

Lys

Gly

Ser

Asn

Gly

465

470

475

aac

tta

agg

gag

atg

gat

ttg

aac

gag

aca

ccg

ttg

gtg

cag

aac

aaa

2212

Asn

Leu

Arg

Glu

Met

Asp

Leu

Asn

Glu

Thr

Pro

Leu

Val

Gin

Asn

Lys

480

485

490

• · * ·

161

aga Arg

ttg Leu

ctt Leu 495

tca Ser

aga Arg

atg gaa gcc

Ctt Leu

tcc Ser

cgg aca gtg

gaa Glu

atg Met

ggt Gly

2260

Met Glu

Ala 500

Arg

Thr

Val 505

agg

ega

tat

ttc

cct

cat

tgt

tca

gag

gtt

ctg

gat

aag

ttc

atg

gag

2308

Arg

Arg

Tyr

Phe

Pro

His

Cys

Ser

Glu

Val

Leu

Asp

Lys

Phe

Met

Glu

510

515

520

gac

gat

cta

cag

gat

ctt

ttt

atc

ctc

gag

aag

ggt

acc

gaa

gaa

gaa

2356

Asp

Asp

Leu

Gin

Asp

Leu

Phe

Ile

Leu

Glu

Lys

Gly

Thr

Glu

Glu

Glu

525

530

535

540

caa

gaa

atc

aaa

agg

acg

ega

ttt

atg

gag

Ctt

aaa

gaa

gat

gtc

caa

2404

Gin

Glu

Ile

Lys

Arg

Thr

Arg

Phe

Met

Glu

Leu

Lys

Glu

Asp

Val

Gin

545

550

555

aga

gcc

ttt

acc

aag

gac

aag

gcc

gag

ctt

cat

ege

ggt

ttg

tcc

tca

2452

Arg

Ala

Phe

Thr

Lys

Asp

Lys

Ala

Glu

Leu

His

Arg

Gly

Leu

Ser

Ser

560

565

570

tca

atg

tac

acc

ccc

aca

gtg

aga

aac

ggg

tca

aag

agt

aaa

gcc

ege

2500

Ser

Met

Tyr

Thr

Pro

Thr

Val

Arg

Asn

Gly

Ser

Lys

Ser

Lys

Ala

Arg

575

580

585

aaa tac tca tga aacccccgtg tttctttgat gatcttttaa cacgctttta 2552

Lys Tyr Ser

590

cgtgcctaat	attagaggca	aaacatatgt	atgaagaaat	aatggtggtg	catgatgatg	2612
tttagggctc	aggtttaggg	tttatatgta	ctaaattttg	tgatttgacg	ctaaaaatgc	2672
tatgttgttt	tttttttttt	ttggataata	tggtgtgaaa	gctaacgcct	tttactagta	2732
gcatgttaat	gtttgtgttt	gaatcatagt	tttttatgca	tgtttgtttt	acttgcacaa	2792
caactaataa	atataatttt	tcataataaa	aaaaaaaaaa	aaaaaaaaaa	aa	2844

<210> 66 <211> 591 <212> PRT <213> Helianthus annuus <400> 66

Met 1

Ala

Asn

Ser

Ser 5

Glu

Pro

Ser

Ser

Ser 10

Ile

Ser

Phe

Thr

Ser 15

Ser

Ser

His

Ile

Ser 20

Asn

Gly

Ala

Thr

Ser 25

Tyr

Asn

Ile

Pro

Pro 30

Pro

Ser

Ile

Pro

Glu

Pro

Arg

Ser

Asn

Ile

Glu

Ile

Ile

Gly

Leu

Asn

Arg

Leu

40 45 ·· ·· 9· ·· ·· ··· ·«·· · · · • · · · · · · · · · · * ·· · · ♦ · ····· · ···· ·· · · · * · ·· ·· · · ·· ·

162

Ser

Thr 50

Asn

Leu Glu Lys

Leu Val 55

Phe

Asp Ser Gly 60

Ser

Glu

Ser

Asp

Cys

Asn

Tyr

Ser

Asp

Ala

Glu

Val

Val

Val

Glu

Gly

Ile

Ser

Val

Gly

65

70

75

80

Ile

His

Arg

Cys

Ile

Leu

Ala

Thr

Arg

Ser

Thr

Phe

Phe

Ser

Asp

Leu

85

90

95

Phe

Lys

Lys

Asn

Lys

Gly

Cys

Val

Glu

Lys

Asp

Ser

Lys

Pro

Lys

Tyr

100

105

110

Asn

Met

Ser

Asp

Leu

Leu

Pro

Tyr

Gly

Ser

Val

Gly

Tyr

Asp

Ala

Phe

115

120

125

Leu

Val

Phe

Leu

Ser

Tyr

Val

Tyr

Thr

Gly

Lys

Leu

Lys

Ala

Ser

Pro

130

135

140

Pro

Glu

Val

Ser

Thr

Cys

Val

Asp

Asp

Gly

Cys

Leu

His

Asp

Ala

Cys

145

150

155

160

Trp

Pro

Ala

Ile

Asn

Phe

Ala

Val

Glu

Leu

Thr

Tyr

Ala

Ser

Ser

Val

165

170

175

Phe

Gin

Val

Pro

Glu

Leu

Val

Ser

Leu

Phe

Gin

Arg

Arg

Leu

Leu

Asn

180

185

190

Phe

Val

Asp

Lys

Ala

Leu

Val

Glu

Asp

Val

Ile

Pro

Ile

Leu

Val

Val

195

200

205

Ala

Phe

His

Cys

Gin

Leu

Gin

Asn

Val

Leu

Ser

Arg

Cys

Ile

Asp

Arg

210

215

220

Val

Val

Arg

Ser

Lys

Leu

Asp

Thr

Ile

Ser

Ile

Glu

Lys

Glu

Leu

Pro

225

230

235

240

Phe

Glu

Val

Thr

Gin

Met

Ile

Lys

Ser

Ile

Asp

Asn

Ile

Ile

Gin

Glu

245

250

255

Asp

Asp

Glu

His

Thr

Val

Glu

Ser

Glu

Val

Val

Leu

Arg

Glu

Lys

Arg

260

265

270

Ile

Lys

Ser

Ile

His

Lys

Ala

Leu

Asp

Cys

Asp

Asp

Val

Glu

Leu

Val

275

280

285

Lys

Met

Ile

Leu

Asp

Glu

Ser

Lys

Ile

Thr

Leu

Asp

Glu

Ala

Cys

Ala

290

295

300

Leu

His

Tyr

Ala

Val

Met

Tyr

Cys

Asn

Gin

Glu

Val

Ala

Lys

Glu

Ile

305

310

315

320

Leu

Asn

Leu

Asn

Arg

Ala

Asp

Val

Asn

Leu

Arg

Asn

Ser

Arg

Asp

Tyr

325

330

335

• ·

163

Thr

Val

Leu

His 340

Val Ala

Ala Met

Arg Lys 345

Glu Pro

Ser

Leu 350

Ile

Val

Ser

Ile

Leu

Ser

Lys

Gly

Ala

Cys

Ala

Ser

Asp

Thr

Thr

Phe

Asp

Gly

355

360

365

Gin

Ser

Ala

Val

Ser

Ile

Cys

Arg

Arg

Arg

Thr

Arg

Pro

Lys

Asp

Tyr

370

375

380

Tyr

Val

Lys

Thr

Glu

His

Gly

Gin

Glu

Thr

Asn

Lys

Asp

Arg

Ile

Cys

385

390

395

400

Ile

Asp

Val

Leu

Glu

Arg

Glu

Ile

Lys

Arg

Asn

Pro

Met

Ile

Gly

Asp

405

410

415

Val

Ser

Val

Cys

Ser

Ser

Ala

Val

Ala

Asp

Asp

Leu

His

Met

Asn

Leu

420

425

430

Leu

Tyr

Leu

Glu

Asn

Arg

Val

Ala

Phe

Ala

Arg

Leu

Leu

Phe

Pro

Ser

435

440

445

Glu

Ala

Lys

Leu

Ala

Met

Glu

Ile

Ala

His

Ala

Gin

Thr

Thr

Ala

Gin

450

455

460

Tyr

Pro

Gly

Leu

Leu

Ala

Ser

Lys

Gly

Ser

Asn

Gly

Asn

Leu

Arg

Glu

465

470

475

480

Met

Asp

Leu

Asn

Glu

Thr

Pro

Leu

Val

Gin

Asn

Lys

Arg

Leu

Leu

Ser

485

490

495

Arg

Met

Glu

Ala

Leu

Ser

Arg

Thr

Val

Glu

Met

Gly

Arg

Arg

Tyr

Phe

500

505

510

Pro

His

Cys

Ser

Glu

Val

Leu

Asp

Lys

Phe

Met

Glu

Asp

Asp

Leu

Gin

515

520

525

Asp

Leu

Phe

Ile

Leu

Glu

Lys

Gly

Thr

Glu

Glu

Glu

Gin

Glu

Ile

Lys

530

535

540

Arg

Thr

Arg

Phe

Met

Glu

Leu

Lys

Glu

Asp

Val

Gin

Arg

Ala

Phe

Thr

545

550

555

560

Lys

Asp

Lys

Ala

Glu

Leu

His

Arg

Gly

Leu

Ser

Ser

Ser

Met

Tyr

Thr

565

570

575

Pro

Thr

Val

Arg

Asn

Gly

Ser

Lys

Ser

Lys

Ala

Arg

Lys

Tyr

Ser

580

585

590

<210> 67 <211> 1477 <212> DNA <213> Arabidopsis thaliana

164 <220>

<221> CDS <222> (1)..(804) <223> AtNMLc2 cDNA sekvence <220>

<221> různé <222> (1)..(1477) <223> n = a, t, c nebo g <400> 67

atg Met 1

agc Ser

aat Asn

ctt gaa

gaa Glu

tet Ser

ttg aga

tet Ser 10

cta tcg ttg

gat Asp

ttc Phe 15

ctg Leu

48

Leu

Glu 5

Leu

Arg

Leu

Ser

Leu

aac

cta

cta

atc

aac

ggt

caa

get

ttc

tcc

gac

gtg

act

ttc

agc

gtt

96

Asn

Leu

Leu

Ile

Asn

Gly

Gin

Ala

Phe

Ser

Asp

Val

Thr

Phe

Ser

Val

20

25

30

gaa

ggt

cgt

tta

gtc

cac

get

cac

cgt

tgt

atc

ctc

gcc

gca

cgg

agg

144

Glu

Gly

Arg

Leu

Val

His

Ala

His

Arg

Cys

Ile

Leu

Ala

Ala

Arg

Arg

35

40

45

ctt

ttc

ttc

cgc

aaa

ttc

ttt

tgt

ggg

aca

gac

tea

cca

caa

cct

gtc

192

Leu

Phe

Phe

Arg

Lys

Phe

Phe

Cys

Gly

Thr

Asp

Ser

Pro

Gin

Pro

Val

50

55

60

aca

ggt

ata

gac

ccg

acc

caa

cat

ggg

tcc

gta

ccc

get

agc

cca

aca

240

Thr

Gly

Ile

Asp

Pro

Thr

Gin

His

Gly

Ser

Val

Pro

Ala

Ser

Pro

Thr

65

70

75

80

aga

ggc

tcc

acg

gcc

cca

get

gga

att

ata

cca

gtg

aac

tea

gtc

ggt

288

Arg

Gly

Ser

Thr

Ala

Pro

Ala

Gly

Ile

Ile

Pro

Val

Asn

Ser

Val

Gly

85

90

95

tat

gag

gtt

ttt

ctg

ttg

cta

ctt

cag

ttt

ctt

tat

agc

gga

caa

gtc

336

Tyr

Glu

Val

Phe

Leu

Leu

Leu

Leu

Gin

Phe

Leu

Tyr

Ser

Gly

Gin

Val

100

105

110

tcc

atc

gtg

ccg

cag

aaa

cac

gag

cct

aga

cct

aat

tgt

ggc

gag

aga

384

Ser

Ile

Val

Pro

Gin

Lys

His

Glu

Pro

Arg

Pro

Asn

Cys

Gly

Glu

Arg

115

120

125

gga

tgt

tgg

cac

act

cat

tgc

tea

gcc

gcc

gtt

gat

ctt

get

ctt

gat

432

Gly

Cys

Trp

His

Thr

His

Cys

Ser

Ala

Ala

Val

Asp

Leu

Ala

Leu

Asp

130

135

140

act

ctc

gcc

gcc

tet

cgt

tac

ttc

ggc

gtc

gag

cag

ctc

gca

ttg

ctc

480

Thr

Leu

Ala

Ala

Ser

Arg

Tyr

Phe

Gly

Val

Glu

Gin

Leu

Ala

Leu

Leu

145

150

155

160

165

acc Thr

cag Gin

aaa Lys

caa Gin

ttg gca Leu Ala 165

agc Ser

atg Met

gtg Val

gag Glu 170

aaa gcc

tet Ser

atc Ile

gaa Glu 175

gat Asp

528

Lys

Ala

gtg

atg

aaa

gtt

tta

ata

gca

tea

aga

aag

caa

gac

atg

cat

caa

tta

576

Val

Met

Lys

Val

Leu

Ile

Ala

Ser

Arg

Lys

Gin

Asp

Met

His

Gin

Leu

180

185

190

tgg

acc

acc

tgc

tet

cac

tta

gtt

gct

aaa

tea

ggt

ctc

cca

cca

gag

624

Trp

Thr

Thr

Cys

Ser

His

Leu

Val

Ala

Lys

Ser

Gly

Leu

Pro

Pro

Glu

195

200

205

att

ctt

gcc

aag

cat

ctc

cct

att

gac

gtc

gtc

acc

aaa

ata

gaa

gag

672

Ile

Leu

Ala

Lys

His

Leu

Pro

Ile

Asp

Val

Val

Thr

Lys

Ile

Glu

Glu

210

215

220

ctt

cgt

ctt

aaa

tet

tet

ata

gct

ege

cgt

tet

cta

atg

cct

cac

aac

720

Leu

Arg

Leu

Lys

Ser

Ser

Ile

Ala

Arg

Arg

Ser

Leu

Met

Pro

His

Asn

225

230

235

240

cac

cac

cat

gat

ctc

agc

ggn

gnt

caa

nac

cta

aag

ntc

aaa

gtt

aga

768

His

His

His

Asp

Leu

Ser

Xaa

Xaa

Gin

Xaa

Leu

Lys

Xaa

Lys

Val

Arg

245

250

255

agg

ttg

agc

ega

Ctt

gga

ttc

ttc

aac

gng

aac

tag

taaagctgat

814

Arg

Leu

Ser

Arg

Leu

Gly

Phe

Phe

Asn

Xaa

Asn

260

265

ggtaatggan	aaggactcca	ttcttgatga	agtcgtaagc	attgcattac	cgcttgttaa	874
aagctgtaga	agagaagttg	tgaagncttt	ngcttgaagc	ttggaagctg	ccgatgtgaa	934
ttatccggcg	ggtccggcaa	ggnaaancac	ctttgcactt	cgcgggntga	gatggtctct	994
ccagacatgg	tggctgttct	gttagcccnc	catgcttgat	cctaatgtga	ggacagttgg	1054
tggaatcacg	cctcttgata	tccttagaac	attaacttcg	gatttcttgt	tcaaggggca	1114
gttcctggat	tgactcacat	tgaaccgaat	aaacttaggc	tttgcctcga	gcttgttcaa	1174
tccgctgcaa	tggtgatatc	tcgagaagaa	ggaaacaata	gcaacaacca	aaacaatgat	1234
aacaataccg	ggatttaccc	tcatatgaat	gaggagcaca	atagtggaag	cagtggaggg	1294
agcaataaca	atttggattc	aagattggtt	tatctcaatc	ttggagcagg	tacgggtcag	1354
atgggtccag	gtegagatea	aggggatgac	cataacagtc	agagggaagg	tatgagtcgg	1414
catcatcatc	atcatcaaga	cccatctaca	atgtatcatc	accatcatca	acatcacttc	1474

tag 1477 <210> 68 φ · ·

166 <211> 267 <212> PRT <213> Arabidopsis thaliana

<400> 68

Glu

Ser

Leu Arg Ser Leu 10

Ser

Leu

Asp

Phe 15

Leu

Met 1

Ser

Asn Leu Glu 5

Asn

Leu

Leu

Ile

Asn

Gly

Gin

Ala

Phe

Ser

Asp

Val

Thr

Phe

Ser

Val

20

25

30

Glu

Gly

Arg

Leu

Val

His

Ala

His

Arg

Cys

Ile

Leu

Ala

Ala

Arg

Arg

35

40

45

Leu

Phe

Phe

Arg

Lys

Phe

Phe

Cys

Gly

Thr

Asp

Ser

Pro

Gin

Pro

Val

50

55

60

Thr

Gly

Ile

Asp

Pro

Thr

Gin

His

Gly

Ser

Val

Pro

Ala

Ser

Pro

Thr

65

70

75

80

Arg

Gly

Ser

Thr

Ala

Pro

Ala

Gly

Ile

Ile

Pro

Val

Asn

Ser

Val

Gly

85

90

95

Tyr

Glu

Val

Phe

Leu

Leu

Leu

Leu

Gin

Phe

Leu

Tyr

Ser

Gly

Gin

Val

100

105

110

Ser

Ile

Val

Pro

Gin

Lys

His

Glu

Pro

Arg

Pro

Asn

Cys

Gly

Glu

Arg

115

120

125

Gly

Cys

Trp

His

Thr

His

Cys

Ser

Ala

Ala

Val

Asp

Leu

Ala

Leu

Asp

130

135

140

Thr

Leu

Ala

Ala

Ser

Arg

Tyr

Phe

Gly

Val

Glu

Gin

Leu

Ala

Leu

Leu

145

150

155

160

Thr

Gin

Lys

Gin

Leu

Ala

Ser

Met

Val

Glu

Lys

Ala

Ser

Ile

Glu

Asp

165

170

175

Val

Met

Lys

Val

Leu

Ile

Ala

Ser

Arg

Lys

Gin

Asp

Met

His

Gin

Leu

180

185

190

Trp

Thr

Thr

Cys

Ser

His

Leu

Val

Ala

Lys

Ser

Gly

Leu

Pro

Pro

Glu

195

200

205

Ile

Leu

Ala

Lys

His

Leu

Pro

Ile

Asp

Val

Val

Thr

Lys

Ile

Glu

Glu

210

215

220

Leu

Arg

Leu

Lys

Ser

Ser

Ile

Ala

Arg

Arg

Ser

Leu

Met

Pro

His

Asn

225

230

235

240

His

His

His

Asp

Leu

Ser

Xaa

Xaa

Gin

Xaa

Leu

Lys

Xaa

Lys

Val

Arg

245

250

255

• ·

Arg Leu Ser Arg Leu Gly Phe Phe Asn Xaa Asn

260

265

167 <210> 69 <211> 1725 <212> DNA <213> Arabidopsis thaliana <220>

<221> CDS <222> (1)..(1725) <223> AtNMLc4-l cDNA sekvence <400> 69

atg gct

gca Ala

act Thr

gca Ala 5

ata gag Ile Glu

cca Pro

tet Ser

tea Ser 10

tet Ser

ata Ile

agt Ser

ttc Phe

aca Thr 15

tet Ser

48

Met 1

Ala

tet

cac

tta

tea

aac

cct

tet

cct

gtt

gtt

act

act

tat

cac

tea

gct

96

Ser

His

Leu

Ser

Asn

Pro

Ser

Pro

Val

Val

Thr

Thr

Tyr

His

Ser

Ala

20

25

30

gcc

aat

ctt

gaa

gag

ctc

agc

tet

aac

ttg

gag

cag

ctt

ctc

act

aat

144

Ala

Asn

Leu

Glu

Glu

Leu

Ser

Ser

Asn

Leu

Glu

Gin

Leu

Leu

Thr

Asn

35

40

45

cca

gat

tgc

gat

tac

act

gac

gca

gag

atc

atc

att

gaa

gaa

gaa

gct

192

Pro

Asp

Cys

Asp

Tyr

Thr

Asp

Ala

Glu

Ile

Ile

Ile

Glu

Glu

Glu

Ala

50

55

60

aac

cct

gtg

agt

gtt

cat

aga

tgt

gtt

tta

gct

gct

agg

agc

aag

ttt

240

Asn

Pro

Val

Ser

Val

His

Arg

Cys

Val

Leu

Ala

Ala

Arg

Ser

Lys

Phe

65

70

75

80

ttt

ctt

gat

ctg

ttt

aag

aaa

gat

aaa

gat

agt

agt

gag

aag

aaa

cct

288

Phe

Leu

Asp

Leu

Phe

Lys

Lys

Asp

Lys

Asp

Ser

Ser

Glu

Lys

Lys

Pro

85

90

95

aag

tat

caa

atg

aaa

gat

tta

tta

cca

tat

gga

aat

gtg

gga

cgt

gag

336

Lys

Tyr

Gin

Met

Lys

Asp

Leu

Leu

Pro

Tyr

Gly

Asn

Val

Gly

Arg

Glu

100

105

110

gca

ttt

ctg

cat

ttc

ttg

agc

tat

atc

tac

act

ggg

agg

tta

aag

cct

384

Ala

Phe

Leu

His

Phe

Leu

Ser

Tyr

Ile

Tyr

Thr

Gly

Arg

Leu

Lys

Pro

115

120

125

ttt

cct

atc

gag

gtt

tea

act

tgt

gtt

gat

tea

gtt

tgt

gct

cat

gat

432

Phe

Pro

Ile

Glu

Val

Ser

Thr

Cys

Val

Asp

Ser

Val

Cys

Ala

His

Asp

130

135

140

168

tet Ser 145

tgt Cys

aaa Lys

ccg Pro

gcc Ala

att Ile 150

gat Asp

ttt Phe

get Ala

gtt Val

gag Glu 155

ttg Leu

atg Met

tat Tyr

get Ala

tea Ser 160

480

ttt

gtg

ttc

caa

atc

ccg

gat

ctt

gtt

tcg

tea

ttt

cag

cgg

aag

ctt

528

Phe

Val

Phe

Gin

Ile

Pro

Asp

Leu

Val

Ser

Ser

Phe

Gin

Arg

Lys

Leu

165

170

175

cgt

aac

tat

gtt

gag

aag

tea

cta

gta

gag

aat

gtt

ctt

cct

atc

ctc

576

Arg

Asn

Tyr

Val

Glu

Lys

Ser

Leu

Val

Glu

Asn

Val

Leu

Pro

Ile

Leu

180

185

190

tta

gtt

gcg

ttt

cat

tgt

gat

ttg

aca

cag

ctt

ctt

gat

caa

tgc

att

624

Leu

Val

Ala

Phe

His

Cys

Asp

Leu

Thr

Gin

Leu

Leu

Asp

Gin

Cys

Ile

195

200

205

gag

aga

gtg

gcg

aga

tea

gac

tta

gac

aga

ttc

tgt

atc

gaa

aag

gag

672

Glu

Arg

Val

Ala

Arg

Ser

Asp

Leu

Asp

Arg

Phe

Cys

Ile

Glu

Lys

Glu

210

215

220

ctt

cct

tta

gaa

gta

ttg

gaa

aaa

atc

aaa

cag

ctt

ega

gtt

aag

tcg

720

Leu

Pro

Leu

Glu

Val

Leu

Glu

Lys

Ile

Lys

Gin

Leu

Arg

Val

Lys

Ser

225

230

235

240

gtg

aac

ata

ccc

gag

gtg

gag

gat

aaa

tcg

ata

gag

aga

aca

ggg

aaa

768

Val

Asn

Ile

Pro

Glu

Val

Glu

Asp

Lys

Ser

Ile

Glu

Arg

Thr

Gly

Lys

245

250

255

gta

ctc

aag

gca

ttg

gat

tea

gat

gat

gta

gaa

ctc

gtg

aag

ctt

ctt

816

Val

Leu

Lys

Ala

Leu

Asp

Ser

Asp

Asp

Val

Glu

Leu

Val

Lys

Leu

Leu

260

265

270

ttg

act

gag

tea

gat

ata

act

cta

gac

caa

gcc

aat

ggt

cta

cat

tat

864

Leu

Thr

Glu

Ser

Asp

Ile

Thr

Leu

Asp

Gin

Ala

Asn

Gly

Leu

His

Tyr

275

280

285

gca

gtg

gca

tac

agt

gat

ccg

aaa

gtt

gtg

aca

cag

gtt

ctt

gat

cta

912

Ala

Val

Ala

Tyr

Ser

Asp

Pro

Lys

Val

Val

Thr

Gin

Val

Leu

Asp

Leu

290

295

300

gat

atg

get

gat

gtt

aat

ttc

aga

aat

tcc

agg

ggg

tat

acg

gtt

ctt

960

Asp

Met

Ala

Asp

Val

Asn

Phe

Arg

Asn

Ser

Arg

Gly

Tyr

Thr

Val

Leu

305

310

315

320

cat

att

get

get

atg

cgt

aga

gag

cca

aca

att

atc

ata

cca

ctt

att

1008

His

Ile

Ala

Ala

Met

Arg

Arg

Glu

Pro

Thr

Ile

Ile

Ile

Pro

Leu

Ile

325

330

335

caa

aaa

gga

get

aat

get

tea

gat

ttc

acg

ttt

gat

gga

ege

agt

gcg

1056

Gin

Lys

Gly

Ala

Asn

Ala

Ser

Asp

Phe

Thr

Phe

Asp

Gly

Arg

Ser

Ala

340

345

350

169

gta Val

aat Asn

ata Ile 355

tgt Cys

agg aga Arg Arg

ctc Leu

act Thr 360

agg ccg aaa

gat Asp

tat Tyr 365

cat His

acc Thr

aaa Lys

1104

Arg

Pro

Lys

acc

tea

agg

aaa

gaa

cct

agt

aaa

tac

ege

tta

tgc

atc

gat

atc

ttg

1152

Thr

Ser

Arg

Lys

Glu

Pro

Ser

Lys

Tyr

Arg

Leu

Cys

Ile

Asp

Ile

Leu

370

375

380

gaa

agg

gaa

att

aga

agg

aat

cca

ttg

gtt

agt

ggg

gat

aca

ccc

act

1200

Glu

Arg

Glu

Ile

Arg

Arg

Asn

Pro

Leu

Val

Ser

Gly

Asp

Thr

Pro

Thr

385

390

395

400

tgt

tcc

cat

tcg

atg

ccc

gag

gat

ctc

caa

atg

agg

ttg

tta

tac

tta

1248

Cys

Ser

His

Ser

Met

Pro

Glu

Asp

Leu

Gin

Met

Arg

Leu

Leu

Tyr

Leu

405

410

415

gaa

aag

ega

gtg

gga

ctt

gct

cag

ttg

ttc

ttc

cca

gca

gaa

gcc

aat

1296

Glu

Lys

Arg

Val

Gly

Leu

Ala

Gin

Leu

Phe

Phe

Pro

Ala

Glu

Ala

Asn

420

425

430

gtg

gct

atg

gac

gtt

gct

aat

gtt

gaa

ggg

aca

agc

gag

tgc

aca

ggt

1344

Val

Ala

Met

Asp

Val

Ala

Asn

Val

Glu

Gly

Thr

Ser

Glu

Cys

Thr

Gly

435

440

445

ctt

cta

act

cca

cct

cca

tea

aat

gat

aca

act

gaa

aac

ttg

ggt

aaa

1392

Leu

Leu

Thr

Pro

Pro

Pro

Ser

Asn

Asp

Thr

Thr

Glu

Asn

Leu

Gly

Lys

450

455

460

gtc

gat

tta

aat

gaa

acg

cct

tat

gtg

caa

acg

aaa

aga

atg

ctt

aca

1440

Val

Asp

Leu

Asn

Glu

Thr

Pro

Tyr

Val

Gin

Thr

Lys

Arg

Met

Leu

Thr

465

470

475

480

cgt

atg

aaa

gcc

ctc

atg

aaa

aca

gtt

gag

aca

ggt

cgg

aga

tac

ttc

1488

Arg

Met

Lys

Ala

Leu

Met

Lys

Thr

Val

Glu

Thr

Gly

Arg

Arg

Tyr

Phe

485

490

495

cca

tet

tgt

tat

gag

gtt

ctg

gat

aag

tac

atg

gat

cag

tat

atg

gac

1536

Pro

Ser

Cys

Tyr

Glu

Val

Leu

Asp

Lys

Tyr

Met

Asp

Gin

Tyr

Met

Asp

500

505

510

gaa

gaa

atc

cct

gat

atg

tcg

tat

ccc

gag

aaa

ggc

act

gtg

aaa

gag

1584

Glu

Glu

Ile

Pro

Asp

Met

Ser

Tyr

Pro

Glu

Lys

Gly

Thr

Val

Lys

Glu

515

520

525

aga

aga

cag

aag

agg

atg

aga

tat

aac

gag

ctg

aag

aac

gac

gtt

aaa

1632

Arg

Arg

Gin

Lys

Arg

Met

Arg

Tyr

Asn

Glu

Leu

Lys

Asn

Asp

Val

Lys

530

535

540

aaa

gca

tat

agc

aaa

gac

aaa

gtc

gcg

cgg

tet

tgt

ctt

tet

tet

tea

1680

Lys

Ala

Tyr

Ser

Lys

Asp

Lys

Val

Ala

Arg

Ser

Cys

Leu

Ser

Ser

Ser

545 550 555 560

170 tea cca gct tet Ser Pro Ala Ser gaa gcc tta

Glu Ala Leu

570 tet ctt aga

Ser Leu Arg

565 gag aat cca aca

Glu Asn Pro Thr tga 1725

575 <210> 70 <211> 574 <212> PRT <213> Arabídopsis thaliana <400> 70

Met Ala Ala 1

Thr Ala 5

Ile Glu

Pro

Ser

Ser Ser 10

Ile

Ser

Phe

Thr Ser 15

Ser

His

Leu

Ser

Asn

Pro

Ser

Pro

Val

Val

Thr

Thr

Tyr

His

Ser

Ala

20

25

30

Ala

Asn

Leu

Glu

Glu

Leu

Ser

Ser

Asn

Leu

Glu

Gin

Leu

Leu

Thr

Asn

35

40

45

Pro

Asp

Cys

Asp

Tyr

Thr

Asp

Ala

Glu

Ile

Ile

Ile

Glu

Glu

Glu

Ala

50

55

60

Asn

Pro

Val

Ser

Val

His

Arg

Cys

Val

Leu

Ala

Ala

Arg

Ser

Lys

Phe

65

70

75

80

Phe

Leu

Asp

Leu

Phe

Lys

Lys

Asp

Lys

Asp

Ser

Ser

Glu

Lys

Lys

Pro

85

90

95

Lys

Tyr

Gin

Met

Lys

Asp

Leu

Leu

Pro

Tyr

Gly

Asn

Val

Gly

Arg

Glu

100

105

110

Ala

Phe

Leu

His

Phe

Leu

Ser

Tyr

Ile

Tyr

Thr

Gly

Arg

Leu

Lys

Pro

115

120

125

Phe

Pro

Ile

Glu

Val

Ser

Thr

Cys

Val

Asp

Ser

Val

Cys

Ala

His

Asp

130

135

140

Ser

Cys

Lys

Pro

Ala

Ile

Asp

Phe

Ala

Val

Glu

Leu

Met

Tyr

Ala

Ser

145

150

155

160

Phe

Val

Phe

Gin

Ile

Pro

Asp

Leu

Val

Ser

Ser

Phe

Gin

Arg

Lys

Leu

165

170

175

Arg

Asn

Tyr

Val

Glu

Lys

Ser

Leu

Val

Glu

Asn

Val

Leu

Pro

Ile

Leu

180

185

190

Leu

Val

Ala

Phe

His

Cys

Asp

Leu

Thr

Gin

Leu

Leu

Asp

Gin

Cys

Ile

195

200

205

Glu

Arg

Val

Ala

Arg

Ser

Asp

Leu

Asp

Arg

Phe

Cys

Ile

Glu

Lys

Glu

210

215

220

171

Leu Pro 225

Leu Glu

Val

Leu Glu 230

Lys

Ile Lys

Gin 235

Leu

Arg

Val

Lys

Ser 240

Val

Asn

Ile

Pro

Glu

Val

Glu

Asp

Lys

Ser

Ile

Glu

Arg

Thr

Gly

Lys

245

250

255

Val

Leu

Lys

Ala

Leu

Asp

Ser

Asp

Asp

Val

Glu

Leu

Val

Lys

Leu

Leu

260

265

270

Leu

Thr

Glu

Ser

Asp

Ile

Thr

Leu

Asp

Gin

Ala

Asn

Gly

Leu

His

Tyr

275

280

285

Ala

Val

Ala

Tyr

Ser

Asp

Pro

Lys

Val

Val

Thr

Gin

Val

Leu

Asp

Leu

290

295

300

Asp

Met

Ala

Asp

Val

Asn

Phe

Arg

Asn

Ser

Arg

Gly

Tyr

Thr

Val

Leu

305

310

315

320

His

Ile

Ala

Ala

Met

Arg

Arg

Glu

Pro

Thr

Ile

Ile

Ile

Pro

Leu

Ile

325

330

335

Gin

Lys

Gly

Ala

Asn

Ala

Ser

Asp

Phe

Thr

Phe

Asp

Gly

Arg

Ser

Ala

340

345

350

Val

Asn

Ile

Cys

Arg

Arg

Leu

Thr

Arg

Pro

Lys

Asp

Tyr

His

Thr

Lys

355

360

365

Thr

Ser

Arg

Lys

Glu

Pro

Ser

Lys

Tyr

Arg

Leu

Cys

Ile

Asp

Ile

Leu

370

375

380

Glu

Arg

Glu

Ile

Arg

Arg

Asn

Pro

Leu

Val

Ser

Gly

Asp

Thr

Pro

Thr

385

390

395

400

Cys

Ser

His

Ser

Met

Pro

Glu

Asp

Leu

Gin

Met

Arg

Leu

Leu

Tyr

Leu

405

410

415

Glu

Lys

Arg

Val

Gly

Leu

Ala

Gin

Leu

Phe

Phe

Pro

Ala

Glu

Ala

Asn

420

425

430

Val

Ala

Met

Asp

Val

Ala

Asn

Val

Glu

Gly

Thr

Ser

Glu

Cys

Thr

Gly

435

440

445

Leu

Leu

Thr

Pro

Pro

Pro

Ser

Asn

Asp

Thr

Thr

Glu

Asn

Leu

Giy

Lys

450

455

460

Val

Asp

Leu

Asn

Glu

Thr

Pro

Tyr

Val

Gin

Thr

Lys

Arg

Met

Leu

Thr

465

470

475

480

Arg

Met

Lys

Ala

Leu

Met

Lys

Thr

Val

Glu

Thr

Gly

Arg

Arg

Tyr

Phe

485

490

495

Pro

Ser

Cys

Tyr

Glu

Val

Leu

Asp

Lys

Tyr

Met

Asp

Gin

Tyr

Met

Asp

500

505

510

4«*·* e ·· • ··♦· • · ·· • · ·· ···»

• · • · • · • 6 ·· • · • · ··· d* #*· ··

172

Glu

Glu

Ile 515

Pro

Asp

Met

Ser

Tyr 520

Pro

Glu

Lys

Gly

Thr 525

Val

Lys

Glu

Arg

Arg 530

Gin

Lys

Arg

Met

Arg 535

Tyr

Asn

Glu

Leu

Lys 540

Asn

Asp

Val

Lys

Lys 545

Ala

Tyr

Ser

Lys

Asp 550

Lys

Val

Ala

Arg

Ser 555

Cys

Leu

Ser

Ser

Ser 560

Ser

Pro

Ala

Ser

Ser

Leu

Arg

Glu

Ala

Leu

Glu

Asn

Pro

Thr

565 570 <210> 71 <211> 1818 <212> DNA <213> Arabidopsis thaliana <220>

<221> CDS <222> (13)..(1818) <223> AtNMLc4-2 cDNA sekvence <400> 71 gccgatctcg tg atg atg gcc acc acc acc acc acc acc acc gct aga ttc 51 Met Met Ala Thr Thr Thr Thr Thr Thr Thr Ala Arg Phe 15 10

tet Ser

gat Asp 15

tca Ser

tac Tyr

gag Glu

ttc Phe

age Ser 20

aac Asn

aca Thr

age Ser

ggc Gly

aat Asn 25

age Ser

ttc Phe

ttc Phe

gcc Ala

99

gcc

gag

tca

tet

ctt

gat

tat

ccg

acg

gaa

ttt

ctc

acg

cca

ccg

gag

147

Ala

Glu

Ser

Ser

Leu

Asp

Tyr

Pro

Thr

Glu

Phe

Leu

Thr

Pro

Pro

Glu

30

35

40

45

gta

tca

gct

ctt

aaa

Ctt

ctg

tet

aac

tgc

ctc

gag

tet

gtt

ttc

gac

195

Val

Ser

Ala

Leu

Lys

Leu

Leu

Ser

Asn

Cys

Leu

Glu

Ser

Val

Phe

Asp

50

55

60

tcg

ccg

gag

acg

ttc

tac

age

gat

gct

aag

cta

gtt

ctc

gcc

ggc

ggc

243

Ser

Pro

Glu

Thr

Phe

Tyr

Ser

Asp

Ala

Lys

Leu

Val

Leu

Ala

Gly

Gly

65

70

75

cgg

gaa

gtt

tet

ttt

cac

cgt

tgt

att

ctt

tcc

gcg

aga

att

cct

gtc

291

Arg

Glu

Val

Ser

Phe

His

Arg

Cys

Ile

Leu

Ser

Ala

Arg

Ile

Pro

Val

80

85

90

ttc

aaa

age

gct

tta

gcc

acc

gtg

aag

gaa

caa

aaa

tcc

tcc

acc

acc

339

Phe

Lys

Ser

Ala

Leu

Ala

Thr

Val

Lys

Glu

Gin

Lys

Ser

Ser

Thr

Thr

95

100

105

• ·

173

gtg Val 110

aag Lys

ctc Leu

cag ctg

aaa Lys 115

gag atc gcc

aga Arg

gat Asp 120

tac gaa

gtc Val

ggc Gly

ttt Phe 125

387

Gin

Leu

Glu

Ile

Ala

Tyr

Glu

gac

tcg

gtt

gtg

gcg

gtt

ttg

gcg

tat

gtt

tac

agc

ggc

aga

gtg

agg

435

Asp

Ser

Val

Val

Ala

Val

Leu

Ala

Tyr

Val

Tyr

Ser

Gly

Arg

Val

Arg

130

135

140

tcc

ccg

ccg

aag

gga

get

tet

get

tgc

gta

gac

gac

gat

tgt

tgc

cac

483

Ser

Pro

Pro

Lys

Gly

Ala

Ser

Ala

Cys

Val

Asp

Asp

Asp

Cys

Cys

His

145

150

155

gtg

get

tgc

cgg

tea

aag

gtg

gat

ttc

atg

gtg

gag

gtt

ctt

tat

ctg

531

Val

Ala

Cys

Arg

Ser

Lys

Val

Asp

Phe

Met

Val

Glu

Val

Leu

Tyr

Leu

160

165

170

tet

ttc

gtt

ttc

cag

att

caa

gaa

tta

gtt

act

ctg

tat

gag

agg

cag

579

Ser

Phe

Val

Phe

Gin

Ile

Gin

Glu

Leu

Val

Thr

Leu

Tyr

Glu

Arg

Gin

175

180

185

ttc

ttg

gaa

att

gta

gac

aaa

gtt

gta

gtc

gaa

gac

atc

ttg

gtt

ata

627

Phe

Leu

Glu

Ile

Val

Asp

Lys

Val

Val

Val

Glu

Asp

Ile

Leu

Val

Ile

190

195

200

205

ttc

aag

ctt

gat

act

cta

tgt

ggt

aca

aca

tac

aag

aag

ctt

ttg

gat

675

Phe

Lys

Leu

Asp

Thr

Leu

Cys

Gly

Thr

Thr

Tyr

Lys

Lys

Leu

Leu

Asp

210

215

220

aga

tgc

ata

gaa

att

atc

gtg

aag

tet

gat

ata

gaa

cta

gtt

agt

ctt

723

Arg

Cys

Ile

Glu

Ile

Ile

Val

Lys

Ser

Asp

Ile

Glu

Leu

Val

Ser

Leu

225

230

235

gag

aag

tet

tta

cct

caa

cac

att

ttc

aag

caa

atc

ata

gac

atc

ege

771

Glu

Lys

Ser

Leu

Pro

Gin

His

Ile

Phe

Lys

Gin

Ile

Ile

Asp

Ile

Arg

240

245

250

gaa

gcg

ctc

tgt

cta

gag

cca

cct

aaa

cta

gaa

agg

cat

gtc

aag

aac

819

Glu

Ala

Leu

Cys

Leu

Glu

Pro

Pro

Lys

Leu

Glu

Arg

His

Val

Lys

Asn

255

260

265

ata

tac

aag

gcg

cta

gac

tea

gat

gat

gtt

gag

ctt

gtc

aag

atg

ctt

867

Ile

Tyr

Lys

Ala

Leu

Asp

Ser

Asp

Asp

Val

Glu

Leu

Val

Lys

Met

Leu

270

275

280

285

ttg

cta

gaa

gga

cac

acc

aat

ctc

gat

gag

gcg

tat

get

ctt

cat

ttt

915

Leu

Leu

Glu

Gly

His

Thr

Asn

Leu

Asp

Glu

Ala

Tyr

Ala

Leu

His

Phe

290

295

300

get

atc

get

cac

tgc

get

gtg

aag

acc

gcg

tat

gat

ctc

ctc

gag

ctt

963

Ala

Ile

Ala

His

Cys

Ala

Val

Lys

Thr

Ala

Tyr

Asp

Leu

Leu

Glu

Leu

305

310

315

174

gag ctt

gcg gat

gtt Val

aac Asn

ctt Leu

aga Arg 325

aat Asn

ccg Pro

agg Arg

gga Gly

tac Tyr 330

act Thr

gtg Val

ctt Leu

1011

Glu

Leu

Ala 320

Asp

cat

gtt

gct

gcg

atg

cgg

aag

gag

ccg

aag

ttg

ata

ata

tet

ttg

tta

1059

His

Val

Ala

Ala

Met

Arg

Lys

Glu

Pro

Lys

Leu

Ile

Ile

Ser

Leu

Leu

335

340

345

atg

aaa

ggg

gca

aat

att

tta

gac

aca

aca

ttg

gat

ggt

aga

acc

gct

1107

Met

Lys

Gly

Ala

Asn

Ile

Leu

Asp

Thr

Thr

Leu

Asp

Gly

Arg

Thr

Ala

350

355

360

365

tta

gtg

att

gta

aaa

ega

ctc

act

aaa

gcg

gat

gac

tac

aaa

act

agt

1155

Leu

Val

Ile

Val

Lys

Arg

Leu

Thr

Lys

Ala

Asp

Asp

Tyr

Lys

Thr

Ser

370

375

380

acg

gag

gac

ggt

acg

cct

tet

ctg

aaa

ggc

gga

tta

tgc

ata

gag

gta

1203

Thr

Glu

Asp

Gly

Thr

Pro

Ser

Leu

Lys

Gly

Gly

Leu

Cys

Ile

Glu

Val

385

390

395

ctt

gag

cat

gaa

caa

aaa

cta

gaa

tat

ttg

tcg

cct

ata

gag

gct

tea

1251

Leu

Glu

His

Glu

Gin

Lys

Leu

Glu

Tyr

Leu

Ser

Pro

Ile

Glu

Ala

Ser

400

405

410

ctt

tet

ctt

cca

gta

act

cca

gag

gag

ttg

agg

atg

agg

ttg

ctc

tat

1299

Leu

Ser

Leu

Pro

Val

Thr

Pro

Glu

Glu

Leu

Arg

Met

Arg

Leu

Leu

Tyr

415

420

425

tat

gaa

aac

ega

gtt

gca

ctt

gct

ega

ctt

ctc

ttt

cca

gtg

gaa

act

1347

Tyr

Glu

Asn

Arg

Val

Ala

Leu

Ala

Arg

Leu

Leu

Phe

Pro

Val

Glu

Thr

430

435

440

445

gaa

act

gta

cag

ggt

att

gcc

aaa

ttg

gag

gaa

aca

tgc

gag

ttt

aca

1395

Glu

Thr

Val

Gin

Gly

Ile

Ala

Lys

Leu

Glu

Glu

Thr

Cys

Glu

Phe

Thr

450

455

460

gct

tet

agt

ctc

gag

cct

gat

cat

cac

att

ggt

gaa

aag

cgg

aca

tea

1443

Ala

Ser

Ser

Leu

Glu

Pro

Asp

His

His

Ile

Gly

Glu

Lys

Arg

Thr

Ser

465

470

475

cta

gac

cta

aat

atg

gcg

ccg

ttc

caa

atc

cat

gag

aag

cat

ttg

agt

1491

Leu

Asp

Leu

Asn

Met

Ala

Pro

Phe

Gin

Ile

His

Glu

Lys

His

Leu

Ser

480

485

490

aga

cta

aga

gca

ctt

tgt

aaa

acc

gtg

gaa

ctg

ggg

aaa

ege

tac

ttc

1539

Arg

Leu

Arg

Ala

Leu

Cys

Lys

Thr

Val

Glu

Leu

Gly

Lys

Arg

Tyr

Phe

495

500

505

aaa

ega

tgt

tcg

ctt

gat

cac

ttt

atg

gat

act

gag

gac

ttg

aat

cat

1587

Lys

Arg

Cys

Ser

Leu

Asp

His

Phe

Met

Asp

Thr

Glu

Asp

Leu

Asn

His

510

515

520

525

175

ctt Leu

gct Ala

agc Ser

gta Val

gaa Glu 530

gaa gat

act Thr

cct Pro

gag aaa cgg

cta Leu

caa Gin

aag Lys 540

aag Lys

1635

Glu

Asp

Glu 535

Lys Arg

caa

agg

tac

atg

gaa

cta

caa

gag

act

ctg

atg

aag

acc

ttt

agt

gag

1683

Gin

Arg

Tyr

Met

Glu

Leu

Gin

Glu

Thr

Leu

Met

Lys

Thr

Phe

Ser

Glu

545

550

555

gac

aag

gag

gaa

tgt

gga

aag

tet

tcc

aca

ccg

aaa

cca

acc

tet

gcg

1731

Asp

Lys

Glu

Glu

Cys

Gly

Lys

Ser

Ser

Thr

Pro

Lys

Pro

Thr

Ser

Ala

560

565

570

gtg

agg

tet

aat

aga

aaa

ctc

tet

cac

cgg

ege

cta

aaa

gtg

gac

aaa

1779

Val

Arg

Ser

Asn

Arg

Lys

Leu

Ser

His

Arg

Arg

Leu

Lys

Val

Asp

Lys

575

580

585

cgg

gat

ttt

ttg

aaa

ega

cct

tac

ggg

aac

ggg

gat

taa

1818

Arg

Asp

Phe

Leu

Lys

Arg

Pro

Tyr

Gly

Asn

Gly

Asp

590

595

600

<210> 72 <211> 601 <212> PRT <213> Arabidopsis thaliana

<400> 72

Thr Thr 5

Thr Thr Thr Thr Thr Ala 10

Arg Phe

Ser

Asp 15

Ser

Met 1

Met

Ala

Tyr

Glu

Phe

Ser

Asn

Thr

Ser

Gly

Asn

Ser

Phe

Phe

Ala

Ala

Glu

Ser

20

25

30

Ser

Leu

Asp

Tyr

Pro

Thr

Glu

Phe

Leu

Thr

Pro

Pro

Glu

Val

Ser

Ala

35

40

45

Leu

Lys

Leu

Leu

Ser

Asn

Cys

Leu

Glu

Ser

Val

Phe

Asp

Ser

Pro

Glu

50

55

60

Thr

Phe

Tyr

Ser

Asp

Ala

Lys

Leu

Val

Leu

Ala

Gly

Gly

Arg

Glu

Val

65

70

75

80

Ser

Phe

His

Arg

Cys

Ile

Leu

Ser

Ala

Arg

Ile

Pro

Val

Phe

Lys

Ser

85

90

95

Ala

Leu

Ala

Thr

Val

Lys

Glu

Gin

Lys

Ser

Ser

Thr

Thr

Val

Lys

Leu

100

105

110

Gin

Leu

Lys

Glu

Ile

Ala

Arg

Asp

Tyr

Glu

Val

Gly

Phe

Asp

Ser

Val

115

120

125

Val

Ala

Val

Leu

Ala

Tyr

Val

Tyr

Ser

Gly

Arg

Val

Arg

Ser

Pro

Pro

130

135

140

• ·

176

Lys 145

Gly

Ala Ser

Ala

Cys Val Asp Asp Asp Cys

Cys

His

Val

Ala

Cys 160

150

155

Arg

Ser

Lys

Val

Asp

Phe

Met

Val

Glu

Val

Leu

Tyr

Leu

Ser

Phe

Val

165

170

175

Phe

Gin

Ile

Gin

Glu

Leu

Val

Thr

Leu

Tyr

Glu

Arg

Gin

Phe

Leu

Glu

180

185

190

Ile

Val

Asp

Lys

Val

Val

Val

Glu

Asp

Ile

Leu

Val

Ile

Phe

Lys

Leu

195

200

205

Asp

Thr

Leu

Cys

Gly

Thr

Thr

Tyr

Lys

Lys

Leu

Leu

Asp

Arg

Cys

Ile

210

215

220

Glu

Ile

Ile

Val

Lys

Ser

Asp

Ile

Glu

Leu

Val

Ser

Leu

Glu

Lys

Ser

225

230

235

240

Leu

Pro

Gin

His

Ile

Phe

Lys

Gin

Ile

Ile

Asp

Ile

Arg

Glu

Ala

Leu

245

250

255

Cys

Leu

Glu

Pro

Pro

Lys

Leu

Glu

Arg

His

Val

Lys

Asn

Ile

Tyr

Lys

260

265

270

Ala

Leu

Asp

Ser

Asp

Asp

Val

Glu

Leu

Val

Lys

Met

Leu

Leu

Leu

Glu

275

280

285

Gly

His

Thr

Asn

Leu

Asp

Glu

Ala

Tyr

Ala

Leu

His

Phe

Ala

Ile

Ala

290

295

300

His

Cys

Ala

Val

Lys

Thr

Ala

Tyr

Asp

Leu

Leu

Glu

Leu

Glu

Leu

Ala

305

310

315

320

Asp

Val

Asn

Leu

Arg

Asn

Pro

Arg

Gly

Tyr

Thr

Val

Leu

His

Val

Ala

325

330

335

Ala

Met

Arg

Lys

Glu

Pro

Lys

Leu

Ile

Ile

Ser

Leu

Leu

Met

Lys

Gly

340

345

350

Ala

Asn

Ile

Leu

Asp

Thr

Thr

Leu

Asp

Gly

Arg

Thr

Ala

Leu

Val

Ile

355

360

365

Val

Lys

Arg

Leu

Thr

Lys

Ala

Asp

Asp

Tyr

Lys

Thr

Ser

Thr

Glu

Asp

370

375

380

Gly

Thr

Pro

Ser

Leu

Lys

Gly

Gly

Leu

Cys

Ile

Glu

Val

Leu

Glu

His

385

390

395

400

Glu

Gin

Lys

Leu

Glu

Tyr

Leu

Ser

Pro

Ile

Glu

Ala

Ser

Leu

Ser

Leu

405

410

415

Pro

Val

Thr

Pro

Glu

Glu

Leu

Arg

Met

Arg

Leu

Leu

Tyr

Tyr

Glu

Asn

420

425

430

• ·

177

Arg

Val Ala 435

Leu Ala Arg Leu

Leu Phe 440

Pro

Val Glu Thr 445

Glu

Thr

Val

Gin

Gly

Ile

Ala

Lys

Leu

Glu

Glu

Thr

Cys

Glu

Phe

Thr

Ala

Ser

Ser

450

455

460

Leu

Glu

Pro

Asp

His

His

Ile

Giy

Glu

Lys

Arg

Thr

Ser

Leu

Asp

Leu

465

470

475

480

Asn

Met

Ala

Pro

Phe

Gin

Ile

His

Glu

Lys

His

Leu

Ser

Arg

Leu

Arg

485

490

495

Ala

Leu

Cys

Lys

Thr

Val

Glu

Leu

Gly

Lys

Arg

Tyr

Phe

Lys

Arg

Cys

500

505

510

Ser

Leu

Asp

His

Phe

Met

Asp

Thr

Glu

Asp

Leu

Asn

His

Leu

Ala

Ser

515

520

525

Val

Glu

Glu

Asp

Thr

Pro

Glu

Lys

Arg

Leu

Gin

Lys

Lys

Gin

Arg

Tyr

530

535

540

Met

Glu

Leu

Gin

Glu

Thr

Leu

Met

Lys

Thr

Phe

Ser

Glu

Asp

Lys

Glu

545

550

555

560

Glu

Cys

Gly

Lys

Ser

Ser

Thr

Pro

Lys

Pro

Thr

Ser

Ala

Val

Arg

Ser

565

570

575

Asn

Arg

Lys

Leu

Ser

His

Arg

Arg

Leu

Lys

Val

Asp

Lys

Arg

Asp

Phe

580

585

590

Leu

Lys

Arg

Pro

Tyr

Gly

Asn

Gly

Asp

595

600

<210> 73 <211> 2673 <212> DNA <213> Nicotiana tabacum <220>

<221> CDS <222> (661) . . (1767) <223> cDNA sekvence plné délky, tabák B <220>

<221> různé <222> (1) .. (2673) <223> n = a, t, c nebo g <400> 73 ggatctaacc tcaggaaaaa aaacagtatt tttagcctct gcaattgcaa attttctcgt 120 tcgagcggcc gcccgggcag gtaaactcta acccttttaa tctttttttg gttgcatttc 60 • ·

178

ttttttagcc	gaagtgaatg	ttattccaat	tgggtaagct	gtgatcaagc	agttgaagtt	180
ttttgttgca	aaatttgcca	gttatcttga	ctttttgtga	agttggtaaa	tttttcattt	240
gggtaagttg	tgatcaagca	gttgaagatt	tgcactttgt	attcttactg	tgaaattgca	300
gttttgttga	ttatagatgg	ggtggaattg	ttaatttctt	ctaaagtttt	aaagggttga	360
tttggtttta	cctgaaatag	ggagaatatg	acttgtagtt	ttggaatttg	cttcttttct	420
tggtctgcat	agttgaatgt	tattagaaaa	cttatggaaa	gttttggtca	aacttttgtc	480
ctttgagaag	aatttcttgt	attggtgatt	ggttatggtc	ttggagaggt	tctttttttt	540
tttgcataga	gcctgtgcgg	agaatattat	acatggttaa	aaacattaga	ttttctggac	600
tttgactatc	ttagatgtag	ataaattttg	tatatgtttt	tagaccatta	gaattgggaa	660

atg gct

tgt Cys

tet Ser

gct Ala 5

gaa cca Glu Pro

tca tca Ser Ser

tet Ser 10

ata Ile

agc Ser

ttt Phe

act Thr

tca Ser 15

tet Ser

708

Met 1

Ala

tcc

att

aca

tcg

aat

ggg

tcg

att

ggc

gtt

ggc

caa

aac

act

cat

gct

756

Ser

Ile

Thr

Ser

Asn

Gly

Ser

Ile

Gly

Val

Gly

Gin

Asn

Thr

His

Ala

20

25

30

tat

ggc

ggc

tet

gag

aca

ggg

agt

agt

tat

gaa

atc

atc

agc

ttg

agt

804

Tyr

Gly

Gly

Ser

Glu

Thr

Gly

Ser

Ser

Tyr

Glu

Ile

Ile

Ser

Leu

Ser

35

40

45

aaa

ctc

agt

aac

aat

tta

gag

caa

ctc

ttg

tca

gat

tcc

agc

tet

gat

852

Lys

Leu

Ser

Asn

Asn

Leu

Glu

Gin

Leu

Leu

Ser

Asp

Ser

Ser

Ser

Asp

50

55

60

ttt

act

gat

gct

gag

att

gtt

gtt

gag

ggt

gtt

tca

ctt

ggt

gtt

cac

900

Phe

Thr

Asp

Ala

Glu

Ile

Val

Val

Glu

Gly

Val

Ser

Leu

Gly

Val

His

65

70

75

80

cgt

tgt

ata

tta

gct

gcc

agg

agt

aaa

ttt

ttt

cag

gat

ctt

ttt

agg

94 8

Arg

Cys

Ile

Leu

Ala

Ala

Arg

Ser

Lys

Phe

Phe

Gin

Asp

Leu

Phe

Arg

85

90

95

aaa

gag

aag

gga

agt

tgt

gga

aag

gaa

ggt

aaa

cca

aga

tat

tet

atg

996

Lys

Glu

Lys

Gly

Ser

Cys

Gly

Lys

Glu

Gly

Lys

Pro

Arg

Tyr

Ser

Met

100

105

110

acc

gat

att

ttg

cct

tat

ggt

aag

gtt

gga

tat

gag

gct

ttc

gtt

acc

1044

Thr

Asp

Ile

Leu

Pro

Tyr

Gly

Lys

Val

Gly

Tyr

Glu

Ala

Phe

Val

Thr

115

120

125

ttc

cta

agc

tat

ttg

tac

tca

gga

aaa

ttg

aag

cat

ttc

cct

ccg

gag

1092

Phe

Leu

Ser

Tyr

Leu

Tyr

Ser

Gly

Lys

Leu

Lys

His

Phe

Pro

Pro

Glu

130

135

140

·· ·· ·Φ ·♦ ·· • · · ···· · · · • · · ·· ···· · · • ·· · · · · · · · · · · • · · · ·· · ·· • · ·· ·· ·· · · ·

179

gta Val 145

tea aca

tgt Cys

atg Met

gac Asp 150

act Thr

ata Ile

tgt gct

cat gac

tet Ser

tgc Cys

aga Arg

cca Pro 160

1140

Ser

Thr

Cys

Ala

His 155

Asp

gca

att

aat

ttt

agt

gtg

gag

ttg

atg

tat

gcc

tet

tcc

atg

ttt

cag

1188

Ala

Ile

Asn

Phe

Ser

Val

Glu

Leu

Met

Tyr

Ala

Ser

Ser

Met

Phe

Gin

165

170

175

gtt

cca

gag

cta

gta

tea

ctt

ttc

ctg

aga

ege

ctt

atc

aat

ttt

gtt

1236

Val

Pro

Glu

Leu

Val

Ser

Leu

Phe

Leu

Arg

Arg

Leu

Ile

Asn

Phe

Val

180

185

190

ggg

aag

gct

ctt

gtg

gaa

gat

gtt

atc

cca

ata

ctt

aga

gtt

gct

ttt

1284

Gly

Lys

Ala

Leu

Val

Glu

Asp

Val

Ile

Pro

Ile

Leu

Arg

Val

Ala

Phe

195

200

205

cat

tgc

caa

ttg

age

gag

ctt

ctc

act

cat

tcc

gtt

gat

aga

gta

gca

1332

His

Cys

Gin

Leu

Ser

Glu

Leu

Leu

Thr

His

Ser

Val

Asp

Arg

Val

Ala

210

215

220

ega

tea

gat

ctt

gaa

atc

aca

tgc

att

gag

aaa

gag

gtt

ccc

ttt

gaa

1380

Arg

Ser

Asp

Leu

Glu

Ile

Thr

Cys

Ile

Glu

Lys

Glu

Val

Pro

Phe

Glu

225

230

235

240

gtt

gca

gag

aat

att

aaa

tta

ttg

tgg

ccg

aaa

tgt

cag

gtt

gat

gaa

1428

Val

Ala

Glu

Asn

Ile

Lys

Leu

Leu

Trp

Pro

Lys

Cys

Gin

Val

Asp

Glu

245

250

255

agt

aag

gtt

cta

cct

gtg

gat

ccc

ttg

cat

gaa

aag

aga

aaa

aat

agg

1476

Ser

Lys

Val

Leu

Pro

Val

Asp

Pro

Leu

His

Glu

Lys

Arg

Lys

Asn

Arg

260

265

270

ata

tac

aag

gca

ttg

gat

tcg

gat

gat

gtt

gaa

ctt

gtc

aag

ctt

cta

1524

Ile

Tyr

Lys

Ala

Leu

Asp

Ser

Asp

Asp

Val

Glu

Leu

Val

Lys

Leu

Leu

275

280

285

ctg

agt

gag

tet

aac

ata

age

tta

gat

gaa

gcc

tac

gct

ctt

cat

tat

1572

Leu

Ser

Glu

Ser

Asn

Ile

Ser

Leu

Asp

Glu

Ala.

Tyr

Ala

Leu

His

Tyr

290

295

300

gct

gtg

gca

tat

tgt

gat

ccc

aag

gtt

gtg

act

gag

gtt

ctt

gga

ctg

1620

Ala

Val

Ala

Tyr

Cys

Asp

Pro

Lys

Val

Val

Thr

Glu

Val

Leu

Gly

Leu

305

310

315

320

ggt

gtt

gcg

gat

gtc

aac

cta

cgt

aat

act

cgt

ggt

tac

act

gtg

ctt

1668

Gly

Val

Ala

Asp

Val

Asn

Leu

Arg

Asn

Thr

Arg

Gly

Tyr

Thr

Val

Leu

325

330

335

cac

att

gct

tcc

atg

cgt

aag

gag

cca

gca

gta

att

gta

tcg

ctt

ttg

1716

His

Ile

Ala

Ser

Met

Arg

Lys

Glu

Pro

Ala

Val

Ile

Val

Ser

Leu

Leu

340

345

350

• · • · ggg cag agt gct

Gly Gin Ser Ala

180 act aag gga gct cgt gca tca gag act aca ttg gat Thr Lys Gly Ala Arg Ala Ser Glu Thr Thr Leu Asp

355 360

365

1764 gtt agtatctgta ggaggctgac taggcctaag gagtaccatg caaaaacaga 1817

Val

acaaggccag	gaagcaaaca	aagatcgggt	atgtattgat	gttttggaga	gagagatgcg	1877
tcgcaaccca	atggctggag	atgcattgtt	ttcttcccca	atgttggccg	atgatctgca	1937
catgaaactg	cactacctgg	aaaatagagt	ggcatttgca	cggttactgt	tccctcttga	1997
agccagacta	gccatgcaaa	ttgcaaatgc	tgagactgca	gctgaagtag	cagtccgttt	2057
ggcatctaaa	agtacatctg	ggaacttgag	ggaggttgat	ttgaatgaga	cacccataaa	2117
gcagaaagaa	agacttcttt	caaggatgca	agccctctcg	aagacagttg	aacttggcaa	2177
gcgctatttt	ccacattgct	ctcaagttct	ggacaagttt	atggaggatg	acttacccga	2237
cttaattttc	cttgagatgg	gccctccaga	ggagcaaaag	atcaagagga	agcgatttaa	2297
ggagctcaaa	gatgacgttc	ancgggcatt	taacaaagac	aaagctgaac	ttcattgctc	2357
ccgcttgtcc	tcatcatcat	gttcctcttc	ttttaaagat	ggngcaagtg	tcaaacttag	2417
gaaactatga	gtaaataggg	ttttgtccta	tagtttctct	nccatctcag	ttttgaatgt	2477
aagattaata	gtttttataa	agacttgtct	tgtacancct	tcattagagc	gcctgctttg	2537
tcgctatcca	tttccctatt	cagcttgtta	aacttccatg	tttncagtag	aaagaaattt	2597
gcttaggaac	aagcttttgg	aatagcttat	atggaaaatt	gattgtaaaa	3333333333	2657
aaaaaaaaaa	aaaaaa					2673

<210> 74 <211> 369 <212> PRT <213> Nicotiana tabacum <400> 74

Met 1

Ala Cys

Ser Ala Glu Pro Ser Ser Ser

Ile

Ser Phe Thr Ser 15

Ser

5

10

Ser

Ile

Thr

Ser

Asn

Gly

Ser

Ile

Gly

Val

Gly

Gin

Asn

Thr

His

Ala

20

25

30

Tyr

Gly

Gly

Ser

Glu

Thr

Gly

Ser

Ser

Tyr

Glu

Ile

Ile

Ser

Leu

Ser

40 45

181

Lys

Leu Ser 50

Asn

Asn

Leu

Glu Gin Leu Leu Ser Asp

Ser

Ser

Ser

Asp

55

60

Phe

Thr

Asp

Ala

Glu

Ile

Val

Val

Glu

Gly

Val

Ser

Leu

Gly

Val

His

65

70

75

80

Arg

Cys

Ile

Leu

Ala

Ala

Arg

Ser

Lys

Phe

Phe

Gin

Asp

Leu

Phe

Arg

85

90

95

Lys

Glu

Lys

Gly

Ser

Cys

Gly

Lys

Glu

Gly

Lys

Pro

Arg

Tyr

Ser

Met

100

105

110

Thr

Asp

Ile

Leu

Pro

Tyr

Gly

Lys

Val

Gly

Tyr

Glu

Ala

Phe

Val

Thr

115

120

125

Phe

Leu

Ser

Tyr

Leu

Tyr

Ser

Gly

Lys

Leu

Lys

His

Phe

Pro

Pro

Glu

130

135

140

Val

Ser

Thr

Cys

Met

Asp

Thr

Ile

Cys

Ala

His

Asp

Ser

Cys

Arg

Pro

145

150

155

160

Ala

Ile

Asn

Phe

Ser

Val

Glu

Leu

Met

Tyr

Ala

Ser

Ser

Met

Phe

Gin

165

170

175

Val

Pro

Glu

Leu

Val

Ser

Leu

Phe

Leu

Arg

Arg

Leu

Ile

Asn

Phe

Val

180

185

190

Gly

Lys

Ala

Leu

Val

Glu

Asp

Val

Ile

Pro

Ile

Leu

Arg

Val

Ala

Phe

195

200

205

His

Cys

Gin

Leu

Ser

Glu

Leu

Leu

Thr

His

Ser

Val

Asp

Arg

Val

Ala

210

215

220

Arg

Ser

Asp

Leu

Glu

Ile

Thr

Cys

Ile

Glu

Lys

Glu

Val

Pro

Phe

Glu

225

230

235

240

Val

Ala

Glu

Asn

Ile

Lys

Leu

Leu

Trp

Pro

Lys

Cys

Gin

Val

Asp

Glu

245

250

255

Ser

Lys

Val

Leu

Pro

Val

Asp

Pro

Leu

His

Glu

Lys

Arg

Lys

Asn

Arg

260

265

270

Ile

Tyr

Lys

Ala

Leu

Asp

Ser

Asp

Asp

Val

Glu

Leu

Val

Lys

Leu

Leu

275

280

285

Leu

Ser

Glu

Ser

Asn

Ile

Ser

Leu

Asp

Glu

Ala

Tyr

Ala

Leu

His

Tyr

290

295

300

Ala

Val

Ala

Tyr

Cys

Asp

Pro

Lys

Val

Val

Thr

Glu

Val

Leu

Gly

Leu

305

310

315

320

Gly

Val

Ala

Asp

Val

Asn

Leu

Arg

Asn

Thr

Arg

Gly

Tyr

Thr

Val

Leu

325

330

335

• · ·

182

His

Ile Ala

Ser Met Arg Lys 340

Glu Pro Ala Val 345

Ile Val

Ser Leu Leu 350

Thr

Lys

Gly

Ala

Arg

Ala

Ser

Glu

Thr

Thr

Leu

Asp Gly

Gin

Ser

Ala

355 360 365

Val • · ·· • ·

T\)Urf)n

Claims (21)

1. Molekula izolované nukleové kyseliny obsahující:

(a) nukleotidovou sekvenci, která kóduje sekvenci id. č. 4,

6, 8, 16, 18, 20, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 62, 64, 6 6, 68, 70, 72 nebo 74; (b) sekvenci id, . c • 3, 5, 7, 15, 17, 19, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49 , 51 , 53 , 55, 57, 61, 63 , 65 , 67 , 69, 71

nebo 7 3;

(c) nukleotidovou sekvenci, která obsahuje souvislý úsek alespoň 20 po sobě následujících baží sekvenčně identický s úsekem alespoň 20 po sobě následujících baží sekvence id. č. 3, 5, 7, 15, 17, 19, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 61, 63, 65, 67, 69, 71, nebo 73;

(d) nukleotidovou sekvenci, která se připraví z DNA knihovny Lycopersicon esculentum amplifikací v polymerázové řetězové reakci užitím dvojice primerů uvedených zde jako sekvence id. č. 9 a 10, sekvence id. č. 21 a 24, sekvence id. č. 22 a 24, sekvence id. č. 25 a 28, sekvence id. č. 26 a 28 nebo sekvence id. č. 59 a 60;

(e) nukleotidovou sekvenci, která se připraví z DNA knihovny Beta vulgaris amplifikací v polymerázové řetězové reakci užitím dvojice primerů uvedených zde jako sekvence id. č. 22 a 24 nebo sekvence id. č. 26 a 28;

(f) nukleotidovou sekvenci, která se z DNA knihovny Helianthus annuus připraví amplifikací v polymerázové řetězové reakci užitím dvojice primerů uvedených zde jako sekvence id. č.

2 6· a 28;

(g) nukleotidovou sekvenci, která se připraví z DNA knihovny Solárním tuberosum amplifikací v polymerázové řetězové

184 • ·· · • ··

9 · ··· • ·· • 99

9999

9999

9 99

9 99

9 999

9999 ·· •· •· •· ·· reakci užitím dvojice primerů uvedených zde jako sekvence id.

č. 21 a 24, sekvence id. č. 21 a 23, sekvence id. č. 22 a

24,

č. 26 (h) nukleotidovou sekvenci, která se připraví z

DNA knihovny Brassica napus amplifikací v polymerázové řetězové reakci užitím dvojice primerů uvedených zde jako sekvence id.

č. 9 a

10 nebo sekvence id.

a 28;

nukleotidovou sekvenci, která se připraví z DNA knihovny

Arabidopsis thaliana amplifikací v polymerázové řetězové reakci užitím dvoj ice primerů uvedených zde jako sekvence id. č. 13 a 14, sekvence id. č.

21 a 24 nebo sekvence id. č. 22 a 24;

(j) nukleotidovou sekvenci, která se připraví z DNA knihovny Nicotiana tabacum amplifikací v polymerázové řetězové reakci užitím dvojice primerů uvedených zde jako sekvence id.

9 a 10, sekvence id. č. 11 a 12, sekvence id.

č. 21 a 24, sekvence id. č. 22 a 24, sekvence id.

č. 25 a 28 nebo sekvence id. č. 26 a 28; nebo (k) nukleotidovou sekvenci, která

DNA knihovny amplifikací v polymerázové řetězové reakci užitím dvojice primerů obsahujících prvních 20 nukleotidů a reverzní komplement posledních 20 nukleotidů kódující sekvence id. č. 3,

5,

7,

15,

17, 19, 31, 33, 35, 37,

39, 41, 43, 45, 47, 49, 51,

53,

55, 57, 61, 63, 65, 67, 69, 71 nebo 73.

Izolovaná molekula nukleové kyseliny podle nároku 1 obsahující nukleotidovou sekvenci, které kóduje sekvenci id. č.

4, 6, 8, 16, 18, 20, 32, 34, 36,

38, 40, 42, 44, 46, 48,

50,

52, 54, 56, 58, 62, 64, 66, 68, 70, 72 nebo 74.

φφφ 9 · · · ΦΦΦ • 9 9 99 · ·· · · · φ ·· · · · 0 · 0 · · 0 0 φ φ Φ Φ · Φ · · ·

ΦΦ ·Φ Φ· ·· ·· ·

185

3. Izolovaná molekula nukleové kyseliny podle nároku 1 obsahující sekvenci id. č. 3, 5, 7, 15, 17, 19, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 61, 63, 65, 67, 69, 71 nebo 73.

4. Izolovaná molekula nukleové kyseliny podle nároku 1 obsahující nukleotidovou sekvenci, která obsahuje souvislý úsek alespoň 20 po sobě následujících baží sekvenčně identický s úsekem alespoň 20 po sobě následujících baží sekvence id. č. 3, 5, 7, 15, 17, 19, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49,

51, 53, 55, 57, 61, 63, 65, 67, 69, 71 nebo 73.

5. Izolovaná molekula nukleové kyseliny podle nároku 1 obsahující nukleotidovou sekvenci, která se připraví z DNA knihovny Lycopersicon esculentum amplifikací v polymerázové řetězové reakci užitím dvojice primerů uvedených zde jako sekvence id. č. 9 a 10, sekvence id. č. 21 a 24, sekvence id. č. 22 a 24, sekvence id. č. 25 a 28, sekvence id. č. 26 a 28 nebo sekvence id. č. 59 a 60.

6. Izolovaná molekula nukleové kyseliny podle nároku 1 obsahující nukleotidovou sekvenci, která se připraví z DNA knihovny Beta vulgaris amplifikací v polymerázové řetězové reakci užitím dvojice primerů uvedených zde jako sekvence id. č. 22 a 24 nebo sekvence id. č. 26 a 28.

7. Izolovaná molekula nukleové kyseliny podle nároku 1 obsahující nukleotidovou sekvenci, která se připraví z DNA knihovny Helianthus annuus amplifikací v polymerázové řetězové • 9 ·· • ·

9 9 99

186 reakci užitím dvojice primerů uvedených zde jako sekvence id.

č. 26 a 28.

8. Izolovaná molekula nukleové kyseliny podle nároku 1 obsahující nukleotidovou sekvenci, která se připraví z DNA knihovny Sola.num tuberosum amplifikací v polymerázové řetězové reakci užitím dvojice primerů uvedených zde jako sekvence id. č. 21 a 24, sekvence id. č. 21 a 23, sekvence id. č. 22 a 24, sekvence id. č. 25 a 28 nebo sekvence id. č. 26 a 28.

9. Izolovaná molekula nukleové kyseliny podle nároku 1 obsahující nukleotidovou sekvenci, která se připraví z DNA knihovny Brassica napus amplifikací v polymerázové řetězové reakci užitím dvojice primerů uvedených zde jako sekvence id. č. 9 a 10 nebo sekvence id. č. 26 a 28.

10. Izolovaná molekula nukleové kyseliny podle nároku 1 obsahující nukleotidovou sekvenci, která se připraví z DNA knihovny Arabidopsis thaliana amplifikací v polymerázové řetězové reakci užitím dvojice primerů uvedených zde jako sekvence id. č. 13 a 14, sekvence id. č. 21 a 24 nebo sekvence id. č. 22 a 24.

11. Izolovaná molekula nukleové kyseliny podle nároku 1 obsahující nukleotidovou sekvenci, která se připraví z DNA knihovny Nicotiana tabacum amplifikací v polymerázové řetězové reakci užitím dvojice primerů uvedených zde jako sekvence id. č. 9 a 10, sekvence id. č. 11 a 12, sekvence id. č. 21 a 24, sekvence id. č. 22 a 24, sekvence id. č. 25 a 28 nebo sekvence id. č. 26 a 28.

·· 99 99 99 a · « ··<·· · • · 9 99 9 9 9 9 9 9

9 9 9 9 9 9 9 9 99 9 9 9

9 9 9 9 9 9 9 9 9

99 9· 99 99 99

12. Izolovaná molekula nukleové kyseliny podle nároku 1

187 obsahující nukleotidovou sekvenci, která se připraví z rostlinné DNA knihovny amplifikací v polymerázové řetězové reakci užitím dvojice primerů obsahujících prvních 20 nukleotidů a reverzní komplement posledních 20 nukleotidů kódující sekvence id.

3, 5,

7, 15, 17, 19, 31,

33,

35, 37,

39, 41, 43, 45, 47,

49, 51, 53,

55, 57, 61, 63, 65, 67, 69, 71 nebo 73.

13. Chimérický gen obsahující promotor aktivní v rostlinách operativně spojený s molekulou nukleové kyseliny podle kteréhokoliv z předchozích nároků.

14. Rekombinantní vektor obsahuj ící chimérický gen podle nároku

13 .

15. Hostitelská buňka obsahující chimérický gen podle nároku

16. Rostlina obsahující chimérický gen podle nároku 13.

17. Rostlina podle nároku 16 vybraná ze skupiny obsahující následující rostliny: rýže, pšenice, ječmen, žito, kanola, kukuřice, brambor, mrkev, topinambur, cukrová řepa, fazol, hrách, čekanka, salát, zelí, květák, brokolice, tuřín, ředkvička, špenát, chřest, cibule, česnek, lilek, paprika, celer, dýně, tykev, okurka, jabloň, hrušeň, kdoule, meloun, švestka, třešeň, broskev, nektarinka, meruňka, jahodník, vinná réva, maliník, ostružiník, ananas, avokádo, papá j a, mango,

188 banán, sója, tabák, rajče, čirok a cukrová třtina.

18. Semena rostlin podle nároku 16. 19. Způsob zesílení exprese genů SAR v rostlině vyznač u j í c í se tím, že se v rostlině exprimuje

chimérický gen podle nároku 13.

20. Způsob zvýšení rezistence rostlin vůči chorobám vyznačující se tím, že se v rostlině exprimuje chimérický gen podle nároku 13.

21. Primer pro PCR vybraný ze skupiny obsahující sekvence id. č. 9 až 14, 21 až 28, 59 a 60.

22. Způsob izolace homologů NIMI účastnících se v kaskádě signální transdukce vedoucí k získané systémové rezistenci rostlin vyznačující se tím, že se molekula DNA připraví z rostlinné DNA knihovny amplifikací v polymerázové řetězové reakci užitím dvojice primerů odpovídajícím prvním 20 nukleotidům a reverznímu komplementu posledních 20 nukleotidů kódující sekvence id. č.3, 5, 7, 15, 17, 19, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 61, 63, 65, 67, 69, 71 nebo 73, a nebo dvojice primerů uvedených zde jako sekvence id. č. 9 a 10, sekvence id. č. 11 a 12, sekvence id. č. 13 a 14, sekvence id. č. 21 a 24, sekvence id. č. 22 a 24, sekvence id. č. 21 a 23, sekvence id. č. 25 a 28, sekvence id. č. 26 a 28 nebo sekvence id. č. 59 a 60.

189

23. Způsob podle nároku 22 vyznačující se tím, že rostlinná DNA knihovna je z Nicotiana tabacum (tabák), Lycopersicon esculentum (rajče), Brassica napus (řepka olejná),

Arabidopsis thaliana, Beta vulgaris (řepa cukrová), Helianthus annuus (slunečnice) nebo Solanum tuberosum (brambor).