JP2002528109A - マルチドメインポリヌクレオチド分子センサ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 シグナル剤に応答性のマルチドメインポリヌクレオチドが、デザインされ、部分的に又は完全にオーバーラップしていてもよいし、オーバーラップしていなくてもよい、少なくとも３つのドメインを有するように構築されている：アクチュエータ（触媒的又はレポーター）ドメイン、架橋ドメイン及びレセプタドメイン。典型的な実施形態においては、化学的リガンド等のシグナル剤は、レセプタドメインと相互作用し、それがコンホメーションを変化させるか、又は他の方法で架橋ドメインに影響を与えて、その結果アクチュエータドメインの活性、触媒又はレポーター機能が刺激されるか又は抑制される。或るリボザイムの実施形態において、例えば、レセプタドメインへのリガンドの架橋が、架橋内にコンホメーション変化を引き起こすように機能する、新規な構造架橋によって予め存在している触媒ドメインとレセプタドメインとを結合させることによって、ＲＮＡから構成されるリガンド特異性分子センサが生じさせられ、この構造認識は、隣接するリボザイムの活性を表わす。他のマルチドメインポリヌクレオチドをアロステリックにセレクションするための方法は、架橋又は他のシグナル応答及び／又はレポーター活性を最適にするために、ドメインを混合し、適合させることを含むのが典型的である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】

本発明は、特別なクラスのアロステリックポリヌクレオチト゛、及び、比較的容 易にかつ効率的に、高い特異性のポリヌクレオチドセンサを生じさせるための方
法に関するものである。

【０００２】

【発明の背景、従来の技術】

生物ポリマーのフォールディング及び機能を口述する分子力の専門技術によっ
て、分子技術者が酵素のデザイン（現在までのところ進化のランダム方法によっ
て大部分が扱われている仕事）に参加するのが可能であろう。この能力を獲得す
ることに対する報酬は、医学、産業及びバイオテクノロジーの多くの用途では、
正確にぴったり合う触媒機能を有する高スピードの酵素が要求されていると、実
質的に考えられている。「モジュールの合理的なデザイン」は、存在しているタ
ンパク質（例えば１〜４）及びＲＮＡ酵素（５〜９）での、更なる化学的及び動
的複雑さを参照するための効果的な手段であることが証明されている。この工学
技術戦略は、多くのタンパク質（１０）及びＲＮＡサブドメイン（１１〜１３）
のモジュールの性質を利用するものであり、それは思慮分別をもって組み込まれ
て、新しい多機能構築物を形成し得る。新規な触媒的なＲＮＡモチーフ（１４、
１５）及び新規なリガンドが結合しているモチーフ（１６、１７）の近年の発見
は、リボザイム工学技術に対する機会をかなり広げた。

【０００３】 モジュールの合理的なデザインは、ＡＴＰ（５、８）及びフラビンモノヌクレ
オチド（ＦＭＮ）（９）等の特異的な小さい有機分子の結合によって活性化又は
失活させられる、幾つかの人工的なリボザイムを生じさせるのに使用されている
。これらのアロステリックリボザイムのそれぞれは、２つの独立した構造ドメイ
ンから構成される：一方はＲＮＡを分割するリボザイムであり、他方は特異的な
リガンドに対するレセプタ（又は「アプタマー」）である。末端が「適応性結合
」であるリガンド（２２〜２５）を導入することで、アプタマードメインに生じ
るコンホメーションの変化により、リボザイムのフォールディング（７、８）に
結局影響する幾つかの異なる機構によって、隣接する触媒的ドメインの動的調節
が引き起こされ得る。

【０００４】 幾つかのグループの研究者達は、リボザイム又は他の核酸が、アッセイ等で使
用され得るかもしれないと示唆している。例えば、特異的な核酸のターゲット分
子の存在下で、非相補的な標識核酸の共ターゲットマーカーの分割及び解放に触
媒作用を及ぼすリボザイムを使用する診断が、開示されている（４３）。特異的
なタンパク質又は核酸のコファクタなしでは触媒活性を持たず、同じ巨大分子の
コファクタの存在下でのみ触媒活性の特色をなす核酸分子が、治療の初期に有用
であると開示されている（４４）。化学的エフェクタ及び／又は物理的シグナル
で、ポリヌクレオチドの機能又は立体配座を修飾する生物反応性のアロステリッ
クポリヌクレオチドが、診断及び触媒の目的のためのバイオセンサ及び／又は酵
素のために開示されている（４５）。

【０００５】 現在までに報告されているほぼ全ての例において、アロステリックリボザイム
は、リボザイムドメインと、予め存在しているリガンドが結合しているドメイン
（又は「アプタマー」）を結合させることによって生じさせられ、選択的なリガ
ンド−応答性の構築物を製造している（９、６５）。これらの方法では、予め存
在しているリボザイム及びリガンドが結合している構造を使用することを必要と
するので、現在利用可能なＲＮＡドメインの数が限定されていることで、アロス
テリックリボザイム工学技術の用途の広さが制限されている。その上、単独又は
ｉｎ ｖｉｔｒｏセレクション技術と組み合わせたモジュールの合理的なデザイ
ンは、予め存在しているアプタマー及びリボザイムモチーフからアロステリック
な触媒を製造するのに成功しているものの、その方法は遅くまた単調で退屈であ
り得る。特定された結合又は触媒特性を有する核酸を同定するために必要な、多
くのこれまでに記載されている手順では、結合、分配及び増幅の段階的な相互作
用が必要である（４６〜５３）。更には、モジュールの合理的なデザインしか使
用しないことによって、アプタマーモチーフが存在しないエフェクタによって制
御されるアロステリックリボザイムの開発が妨げられている。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】

正確なポリヌクレオチド分子センサを素早く生成させるための効果的な戦略を
与えるために、モジュールの合理的なデザイン、ｉｎ ｖｉｖｏセレクション、
及び、アロステリックセレクションからなる組み合わされた適用を使用すること
が、本発明の目的である。 新規なセンサとして、また遺伝子発現調節及び／又は報告のためのｉｎ ｖｉ
ｖｏ遺伝子制御因子として、ポリヌクレオチドを使用する特異的な方法を提供す
ることが、本発明の他の目的である。 様々な臨床、産業、農業及び環境分析においいて使用するための、ポリヌクレ
オチド検出因子を提供することが、本発明の更なる目的である。

【０００７】

【課題を解決するための手段】

これらの及び多の目的は、本発明によって成し遂げられるが、それは、アクチ
ュエータドメイン、レセプタドメイン、及び、架橋ドメインからなり、レセプタ
ドメインにリガンドを結合させる等のシグナルの結果によって、アクチュエータ
ドメインの触媒活性及び／又はリポーター活性を次いで調節する、架橋ドメイン
中にコンホメーション変化を引き起こす精製された機能性ポリヌクレオチドを提
供する。ドメインは、部分的に又は完全にオーバーラップしていてもよいし、オ
ーバーラップしていなくてもよく、その結果１又はそれ以上のドメインの機能は
、同じポリヌクレオチド配列によって部分的エンコードされ得る。ポリヌクレオ
チドは、ＲＮＡ及び／又はＲＮＡ類似体、若しくは、ＤＮＡ及び／又はＤＮＡ類
似体からなり得る；３部からなるリボザイムが実施例に説明されている。

【０００８】 アロステリックなセレクションを使用する、マルチドメインポリヌクレオチド
センサのためのスクリーニング法もまた、提供される。典型的な方法では、マル
チドメインのアロステリックなポリヌクレオチドの構造成分は、ランダムな配列
のドメインで置きかえられ、ｉｎ ｖｉｔｒｏセレクションを使用して、新規な
レセプタドメイン又は更に新規なアクチュエータドメインを発生させる。簡単に
言うと、例示的な方法を使用して、ポリヌクレオチドのリガンドが結合している
領域のランダム化によって、新規な構造的に異なるポリヌクレオチドを発生させ
、それは次いで他のリガンドと相互作用させられるためにスクリーニングされ得
る。

【０００９】 本発明のポリヌクレオチドセンサは、限定されるものではないが、有機及び／
又は無機化合物、金属イオン、医薬、微生物又は細胞の代謝産物、血液又は尿の
成分、他の体液の成分、及び、巨大分子等の、様々なリガンドを質的に又は量的
に測定するために使用される。このセンサはまた、温度、光、音、衝撃、ｐＨ及
びイオン状態等の電磁気的シグナル及び／又は物理的シグナルに応答するように
使用され得る。センサは、幾つかの実施形態においては固体担体に付着させられ
ている。検出因子として本発明のマルチドメインポリヌクレオチドを有するバイ
オセンサもまた、提供される。

【００１０】 本発明のポリヌクレオチドセンサはまた、非侵襲性の診断及び遺伝子治療戦略
を含む、リガンド又はシグナルに応答して、遺伝子の発現を調節又は報告する、
遺伝子制御因子として、ｉｎ ｖｉｖｏ使用され得る。この見地においては、本
発明の方法は、細胞の遺伝的分子に本発明のポリヌクレオチドを実施可能的に結
合させることによる、細胞内の遺伝子の発現を調節するための方法を包含し、そ
の結果遺伝子によってエンコードされる生物学的又は表現型の活性は、アクチュ
エータドメインの活性の調節に従って調節される。ＲＮＡを使用する遺伝子の発
現を含む実施形態において、マルチドメインポリヌクレオチドセンサは、ｍＲＮ
Ａのコーディング領域、又は非常に近接した領域、また５’−先導領域又は３’
−末端領域に組み込まれ得る。ＤＮＡの実施形態において、ポリヌクレオチドセ
ンサは、シグナル遺伝子を破壊し、また遺伝子を発現する領域に組み込まれ得る
。

【００１１】 本発明のリガンド応答性で他のマルチドメインセンサを生じさせる方法もまた
、モジュールの合理的なデザイン戦略を使用する、新規なアロステリックな分子
の発生によって提供される。典型的な実施形態においては、アロステリックリボ
ザイムの必要な構造成分は、ｉｎ ｖｉｔｒｏセレクションを使用してスクリー
ニングされ得る、新規なエフェクタと結合している部位又は新規なエフェクタに
よって調節される触媒ドメインを有するポリヌクレオチドを製造するために、ラ
ンダムな配列のドメインで置き換えられる。簡単に言うと、一つの実施形態にお
いて、例えば、アロステリックリボザイムのリガンドが結合している領域のラン
ダム化によって、新規な構造の変化、並びに、リガンドの結合に応答する及び／
又は報告する際のそれらの効率のためにスクリーンされる、構造的に平行なポリ
ヌクレオチドのファミリーが生じる。このアロステリックなセレクション戦略を
使用することによって、非常に様々なエフェクタ分子に対して特異性を有する新
規なアロステリックリボザイムが生じる。 本発明のマルチドメインポリヌクレオチドセンサを使用する方法は、レセプタ
ドメインに結合する化学的リガンド等のシグナル剤の存在又は不存在に応答する
、ポリヌクレオチドを調製する方法と同様に、相応じて提供される。検出因子と
して、本発明のマルチドメインポリヌクレオチドを有する分析センサもまた提供
される。

【００１２】

【発明の実施の態様】

本発明は、ポリヌクレオチドアクチュエータドメイン及びレセプタドメイン、
並びに、この二つの間の連結をする、架橋ドメインを組み合わせることによって
、正確なポリヌクレオチドセンサを与えることを見出したことに基づいている。
ドメインを混ぜて調和させる、モジュールの合理的なデザイン戦略を使用するこ
とによって、マルチドメインポリヌクレオチドは、多数の構造的に平行なセンサ
を生じさせるように修飾され、次いで最適な結合及び／又はレポート活性を示す
センサを同定するためにスクリーニングされる。

【００１３】 本発明の実施の際には、アクチュエータドメイン、レセプタドメイン、及び、
架橋ドメインからなる、精製された機能性ポリヌクレオチドが、レセプタドメイ
ンへのリガンドの結合等のシグナル剤によって、アクチュエータドメインの活性
を調節する架橋ドメイン中にコンホメーション変化を引き起こす様に、生成させ
られるか又は選択される。全体の構造は、シグナル剤がレセプタドメインとの相
互作用によってレポータードメインを部分的に又は完全に「オン」又は「オフ」
とする、分子スイッチとして機能し、次いで架橋ドメインによって連結する。工
作されたセンサにおける分子架橋は、受動的ではないが、それよりも触媒アクチ
ュエータ又はレポーターアクチュエータの作用を活性化、加速、減速又は引き起
こす、機能性連結モジュールである。実際、下記により詳細に議論されるであろ
う通り、本発明は、レセプタドメインがリガンド又は物理的シグナルによって作
用させられる場合に、配列がアクチュエータドメインの活性を調節する様に、ポ
リヌクレオチド内のレセプタドメインとアクチュエータドメインを架橋する連結
モジュール配列をポリヌクレオチドに挿入することによって、ポリヌクレオチド
にアロステリック特性を与えるか又は高めるための方法を包含する。幾つかの実
施形態においては、異なる連結モジュールが、反応速度の運動論を変える等の触
媒又はレポーターアクチュエータの特性を修飾するために、更に使用される。他
の実施形態においては、架橋ドメインは、異なる構造全体としてはもはや存在し
ない様に、レセプタ又はレポータードメインをオーバーラップさせ得る。本発明
の新規なアロステリックポリヌクレオチドは、アクチュエータドメイン又はレセ
プタドメインを変えて、最適な検出活性及び／又はレポート活性を有するセンサ
を同定するために、その様に生成させられたセンサをスクリーニングすることに
よる、モジュールの合理的なデザイン戦略を使用して、生成させられる。この方
法を使用する幾つかの新規なＲＮＡセンサの生成が、下記実施例３に説明されて
いる。

【００１４】 他の更なるドメインはまた、例えばセンサによって試験される混合物中の多成
分の測定又は検出のための複数のレセプタドメイン等の、構築物の一部であって
もよい。２又はそれ以上のドメインは、部分的に又は完全にオーバーラップして
いてもよいし、オーバーラップしていなくてもよい、即ち部分的にオーバーラッ
プしている配列及びオーバーラップしていない配列の両方を含有していてもよい
。この様に、本明細書中で使用される通り、「ドメイン」は機能的な意味であり
、物理的な意味ではなく、本発明のセンサは、直接的に又は間接的に共に結合し
た少なくとも３つの異なる配列の異なる組み合わせから構成される必要もないが
、その代わりにドメイン中の塩基の幾つか又は全てが、互いにオーバーラップし
ている配列から構成され得る。

【００１５】 本発明のマルチドメインポリヌクレオチド分子センサは、ＲＮＡ、ＲＮＡ類似
体、ＤＮＡ、ＤＮＡ類似体、又は、それらの混合物であり得る。類似体としては
、化学的に変性させられた塩基及び珍しい自然塩基等が挙げられ、限定されるも
のではないが、４−アセチルシチジン、５−（カルボキシヒドロキシメチル）ウ
リジン、２’−Ｏ−メチルシチジン、５’−カルボキシメチルアミノメチル−２
−チオリジン、５−カルボキシメチルアミノメチルウリジン、ジヒドロウリジン
、２’−Ｏ−メチルシュードウリジン、β−Ｄ−ガラクトシルキューオシン、２
’−Ｏ−メチルグアノシン、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデノシン、１−
メチルアデノシン、１−メチル−シュードウリジン、１−メチルグアノシン、１
−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアノシン、２−メチルグアノシン、２−
メチルアデノシン、３−メチルシチジン、５−メチルシチジン、Ｎ６−メチルア
デノシン、７−メチルグアノシン、５−メチルアミノメチルウリジン、５−メト
キシ−アミノメチル−２−チオウリジン、β−Ｄ−マンノシルキューオシン、５
−メトキシカルボニルメチルウリジン、５−メチルオキシウリジン、２−メチル
チオ−Ｎ６−イソペンテニルアデノシン、Ｎ（（９−β−Ｄ−リボ−フラノシル
−２−メチルチオプリン−６−イル）カルバモイル）トレオニン、Ｎ−（（９−
β−Ｄ−リボフラノシル−プリン−６−イル）Ｎ−メチル−カルバモイル）トレ
オニン、ウリジン−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウリジン−５−オキシ酢酸
、ワイブトキソシン、シュードウリジン、キューオシン、２−チオシチジン、５
−メチル−２−チオウリジン、２−チオウリジン、４−チオウリジン、５−メチ
ルウリジン、Ｎ−（（９−β−Ｄ−リボフラノシルプリン−６−イル）カルバモ
イル）トレオニン、２’−Ｏ−メチル−５−メチルウリジン、２’−Ｏ−メチル
ウリジン、ワイブトシン、及び、３−（３−アミノ−３−カルボキシプロピル）
ウリジンである。標準的な手段を使用してセンサを調製している間又は後に修飾
されたポリヌクレオチドも、更に本発明に包含される。

【００１６】 上記に要約される通り、本発明のポリヌクレオチドセンサは、デザインされ、
独立して又は共に構築されて、レセプタドメインへのリガンド及び／又はシグナ
ルの結合によって、アクチュエータドメインの活性を調節する架橋ドメイン中に
コンホメーション変化を引き起こす様に、架橋ドメインと連結した、アクチュエ
ータドメイン及びレセプタドメインを構成する。それらは、リガンド及び／又は
シグナルに対して応答性であるので、本発明のマルチドメインポリヌクレオチド
は、様々な用途、特には臨床、産業、農業及び環境分析における検出因子として
、及び、遺伝子発現のための遺伝子制御又は報告因子としての用途を有する。

【００１７】 本発明のセンサは、溶液状、又は、懸濁液状、又は、固体担体に付着して使用
され得る。単独又は分析キット又はプローブの成分として、ポリヌクレオチドと
試料を接触させることによって、試料中のリガンド又はシグナルの存在又は不存
在を検出するために、ポリヌクレオチドは使用される。これらの方法の典型的な
実施の際には、試料は、アクチュエータドメインによって生成させられる触媒効
果又はレポーター効果を観察するのに十分な条件下である時間、ポリヌクレオチ
ド又は検出因子としてポリヌクレオチドからなる装置を用いて培養する。これは
、ポリヌクレオチドの自己分解又は結そくの測定及び／又は観察；放射性、蛍光
性、又は、発色団のタグの結合；モノクロナール又は融合ファージ抗体の結合；
若しくは、成分濃度、分光光度特性又は電気特性の変化等の、当業者に知られて
いるいずれかの方法を使用して監視される。電位差計の電極、ＦＥＴｓ、様々な
プローブ、レドックス規定能等を使用する現在のバイオセンサ技術が、アクチュ
エータドメインによって開始させられるポリヌクレオチドの機能又は立体配座に
おける変化の測定に、本発明の新規なポリヌクレオチドセンサと組み合わせて使
用するのに適合し得ることが、本発明の利点である。

【００１８】 本発明のセンサは、化合物又は他のリガンドの存在又は不存在、並びに、その
濃度を検出するのに使用され得る。センサは、限定されるものではないが、全て
のタイプの有機及び無機化合物、金属イオン、鉱物、巨大分子、ポリマー、油、
微生物又は細胞の代謝産物、血液又は尿の成分、生物試料から得られる他の体液
、農薬、除草薬、毒素、生物ではない物質、及び、これらのいずれかの組み合わ
せ等のいずれのタイプのリガンドをも検出するように工作され得る。有機化合物
としては、アミノ酸、ペプチド、ポリペプチド、核酸、ヌクレオシド、ヌクレオ
チド、糖、炭水化物、ポリマー及び脂質等の、上記に述べたものに加えて様々な
生化学製品が挙げられる。１又はそれ以上のリガンドは、幾つかの実施形態にお
いて同じセンサによって感知され得る。

【００１９】 この様に、本発明のセンサは、グルコース、電解質、代謝産物及びガス等の血
液成分の測定；血清分析測定；バクテリア及びウイルス分析；医薬及び薬の分析
：薬のデザイン；細胞認識／組識適合性；細胞癒着研究；バクテリア及びウイル
ス分析；ＤＮＡプローブのデザイン；遺伝子の同定；及びホルモンレセプタ結合
等の、臨床診断並びに医学及び獣医学の広い用途を有する。産業用途としては、
ビタミン及び他の成分、トキシン及び食品中の微生物の検出；計量棒試験等の軍
事用途；産業排出物制御；公害制御及び監視；遠隔検出；プロセス制御；分離化
学；及びバイオコンピューティング等が挙げられる。農業用途としては、農場及
び庭園分析、及び遺伝子制御の評価、及び遺伝子導入植物及び動物における、化
合物特には低分子化合物の影響（ｉｎ ｖｉｖｏ測定を含む）等が挙げられる。
複数のセンサが、図１６に描かれる様な単一の検出因子又はチップ上に置かれて
、複数のリガンド及び他のシグナル剤を検出し得る。

【００２０】 代わりの実施形態において、又は、リガンド検出と組み合わせて、本発明のマ
ルチドメインポリヌクレオチドセンサは、限定されるものではないが、図１１に
描かれる閉じ込められたエフェクタのＵＶ照射等の照射、温度変化、ｐＨ、イオ
ン濃度、衝撃、音、及びそれらの組み合わせ等の、分子コンホメーション、物理
的シグナル、電磁気的シグナルにおける変化、及び、それらの組み合わせによっ
て測定可能な、エネルギーの受容における如何なる変化にも応答するように作成
され得る。

【００２１】 リガンド又はシグナルによる刺激の際に、アクチュエータドメインは、その触
媒機能又はレポーター機能を修飾する。ポリヌクレオチドの立体配座又は機能に
おける変化の観察が、これを測定するために使用され得る。多くの実施形態にお
いて、標準的なアッセイを使用して、ポリヌクレオチドの自己分解又は結そく、
基質の分解若しくは触媒反応生成物の生成の測定及び／又は観察等の、化学反応
の観察がなされる。換言すると、放射性、蛍光性又は発色団のタグを単に結合す
ること、モノクロナール又は融合ファージ抗体を結合すること、又はタグのつい
た抗体を結合することが、観察される。この代わりに、成分濃度、温度、ｐＨ、
様相、分光光度特性又は電気特性等における変化が、観察され得る。

【００２２】 上記に述べられている通り、本発明は相応じて、リガンド及び／又はシグナル
に応答性の、本発明のポリヌクレオチドセンサと試料を接触させることによって
、１又はそれ以上のリガンド及び／又はシグナルを検出する方法を提供する。固
体担体についた多くのケースでは、１つ以上のリガンド及び／又はシグナルに応
答性のセンサの使用、異なるリガンド及び／又はシグナルにそれぞれ応答する複
数のセンサのアレーの直列使用、及び、１つ以上のリガンド及び／又はシグナル
に応答性のセンサと複数のセンサの直列使用が、本発明に包含される。

【００２３】 本発明のマルチドメインポリヌクレオチドセンサはまた、ｉｎ ｖｉｖｏでの
遺伝子の発現の制御及び／又は報告のために使用され得る。例えば、新規なアロ
ステリックな結合特異性及び精巧な動的特性を示すリボザイムは、アロステリッ
クなセレクションを使用して生成させられ、生物学的に重要な触媒性能のレベル
を有する細胞の内側で機能させられる。これらの実施形態において、有機物の細
胞内の遺伝子発現の調節又は報告は、遺伝子によってエンコードされた生物学的
活性又は表現型の活性が、アクチュエータドメインの活性の調節に従って、調節
される様に、細胞内の遺伝子分子にセンサを実施可能に結合させることによって
達成される。ＲＮＡセンサは、そのセンサがそのセンサの対応するリガンド及び
／又はシグナルの存在下で、遺伝子翻訳の発現を刺激し、終了させ、又は調節す
るように機能する限りは、興味のある遺伝子をエンコードする、ｍＲＮＡのコー
ディング領域、又はそれに非常に近接した領域、若しくは５’−先導領域又は３
’−末端領域のいずれかの場所に組み込まれ得る。同様に、ＤＮＡセンサは、そ
のセンサがそのセンサの対応するリガンド及び／又はシグナルの存在下で、遺伝
子翻訳の発現を刺激し、終了させ、又は調節するように機能する限りは、遺伝子
の自己破壊をエンコードする領域、遺伝子の発現の上流の領域、並びに、遺伝子
のコーディング領域等の、興味のある遺伝子又はそれを調節する遺伝子のいずれ
かの場所に組み込まれ得る。

【００２４】 センサは、細胞に異質の遺伝子を導入する標準的な方法を使用して、遺伝子発
現の制御及び／又は報告のために遺伝的分子の中に挿入される。方法論は、興味
のある遺伝子に依存するが、典型的にはプラスミド；ヘルペス、アデノ、アデノ
随伴、ワクシニア、レトロウィルス及び他の挿入ベクターウイルス及びリポソー
ムを使用する、細胞のトランスフェクション、細胞のトランスフォーメーション
、又は、トランスダクション等が挙げられる。一般的ではないが、細胞の遺伝物
質の分解、続く結そくによるむき出しのＲＮＡ（又はＤＮＡ）の挿入もまた、使
用し得る。

【００２５】 遺伝子の発現は、微生物、植物及び動物を含む如何なるタイプの有機物におい
ても、調節されるか又は報告され得る。遺伝子の調節は、標準的な方法を使用し
て、適当なリガンド及び／又はシグナルを、遺伝分子についたセンサを有する細
胞に投与することによって達成される。例えば、微生物へのリガンドの投与は、
典型的には媒体中にリガンドを添加するか又はそれを除去することによって、又
はバクテリア、イースト又は糸状菌を撒き散らすことによって簡単に達成される
。リガンドは、植物それ自身にスプレー又は注入することによって、又は、それ
を土壌に塗工及び／又は水と共に塗工することによって、植物に投与され得る。
リガンドは、経口的に、局所的に、静脈血管内に及び、腹膜内に、典型的には製
薬的に許容可能な担体と組み合わせて、動物に投与され得る。遺伝子発現の報告
は相応じて、リガンドに結合するレセプタを測定することによって決められ、有
機物に投与されるか又は有機物によって製造される、興味のある、ほぼ全ての生
物学的な又は製薬的な化合物の非侵襲性の診断に使用され得る。この文脈では、
本発明のマルチドメインポリヌクレオチドは、非侵襲性の診断において、並びに
、治療のリボザイムの制御のための両方に有用である。

【００２６】 本発明は相応じて、レセプタドメイン及び／又はシグナルへのリガンドの結合
によって、アクチュエータドメインの活性を調節する架橋ドメイン中にコンホメ
ーション変化を引き起こす様に、アクチュエータドメイン、レセプタドメイン、
及び、架橋ドメインを共に結合させることからなる、化学的エフェクタ又は他の
リガンド、物理的シグナル、電磁気的シグナル又はそれらの組み合わせの存在又
は不存在に応答する、ポリヌクレオチドを調製するための方法を提供する。他の
センサは、異なるセンサからのドメインを混合し適合させることによって、開発
され得る。

【００２７】 本発明の幾つかのセンサは、アロステリックなセレクションによって開発され
る。アロステリックなセレクションは、アプタマーがこれまでに同定されていな
いリガンドによって制御される、アロステリックな核酸酵素の開発のための、ｉ
ｎ ｖｉｔｒｏセレクション技術である。この能力において、アロステリックな
セレクションはまた、結合されたターゲットリガンドよりもアプタマーの生成へ
の新規な研究手法を表わす。この目的のために、ランダムな配列のライブラリー
は、図１及び８に描かれているハンマーヘッド型リボザイム等の、触媒核酸モチ
ーフに典型的には付けられる。ランダムなドメインは、リボザイムに直接付けら
れ得るか（図１Ａ）、又は存在する「連結モジュール」によって付けられ得る（
図１Ｂ及び８）。後者の場合では、連結モジュールは、ターゲットリガンドの不
存在下で、リボザイムドメイン内で自己分解を抑制すると考えられる。この方法
では、ランダム領域から誘導される独特の配列に結合するリガンドが、リボザイ
ムの分解に助けとなるコンホメーション変化を引き起こす場合には、ターゲット
リガンドの存在下での自己分解に対するｉｎ ｖｉｔｒｏセレクションにより、
新規なアプタマー及びアロステリックリボザイムが生じるであろう。

【００２８】 このセレクション戦略を使用して、第二のメッセンジャーであるｃＧＭＰ及び
ｃＡＭＰを含む４つの天然の３’，５’−サイクリックモノヌクレオチドが、実
施例３のハンマーヘッド型リボザイムによって標的にされた。分子のこの収集に
よって、生物学的に重要であり、ＲＮＡの構造形成及び分子認識能力に挑戦する
異なる一組のターゲットが与えられる。それらの対応するエフェクタ化合物を用
いて培養した時のみ、素早く自己分解するリボザイムが同定された。代表的なＲ
ＮＡは、ｃＧＭＰ又はｃＡＭＰの存在下で、５０００−フォールド活性化を示し
、従って正確な分子認識特性を示し、変えられていないリボザイムによって示さ
れる触媒速度に合致する触媒速度で作用する。これらの発見によって、莫大な数
の動的構造特性を有するリガンド応答性リボザイムが、大規模で平行な方法で生
じさせられ得ることが示される。その上、最適化されたアロステリックリボザイ
ムによって、細胞のＲＮＡのプログラムに組み込まれた破壊に対して、化学試薬
又は遺伝制御因子としての特に選択的なセンサが提供される。

【００２９】 小さいリガンドに対するアプタマーのアロステリックなセレクションは、アプ
タマーのセレクションに対する従来のアフィニティークロマトグラフィー法と比
較して、２つの顕著な利点を有する。第一に、多くのリガンドに対するアプタマ
ーが、アフィニティークロマトグラフィーによって与えられる骨の折れる単一の
リガンド−単一のアプタマーセレクション戦略よりもむしろ、一度のセレクショ
ンで生じさせられ得る。第二に、アプタマーが固体担体上に共有結合的に修飾さ
れ、固定化されるリガンドよりもむしろ、溶液中の遊離のリガンドを結合するよ
うに選択される。この見地によって、全体のリガンドに完全に近づく可能性のあ
るアプタマーが与えられる。この研究手法を使用して、如何なるエフェクタ−リ
ボザイムの対をも開発し得ることが、考えられる。それ故に、核酸の開発のこの
独自の方法は、小さい有機化合物、ペプチド又はタンパク質、又は他の核酸等の
様々なリガンドと相互作用する核酸の開発に使用され得る。結合しているリガン
ドに加えて、アロステリックなセレクションによって、ｐＨ、温度、イオン状態
又は光等の様々な物理的現象を検出し得る、核酸モチーフを開発する手段をも与
えられる。

【００３０】 如何なる理論にも束縛されることを望むものではないが、架橋ドメインによっ
て与えられる連結モジュール機能は、下記実施例１に記載される「スリップ構造
」相互変換等の機構の１つ又は組み合わせによって、本発明のセンサ内で達成さ
れると考えられる。制御はまた、小さい化合物の結合等の立体相互作用、エフェ
クタの存在下又は不存在下でのアンフォールディング又はミスフォールディング
等の構造安定化、簡単な核酸塩基対に基づくアンチセンス効果及び／又は第四級
構造を使用して達成され得る。如何なるタイプのリガンド結合の中継、若しくは
、レセプタドメインによって感知される物理的又は電磁気的効果は、架橋ドメイ
ンによってアクチュエータ（レポーター又は触媒）ドメインに情報を移すために
使用され得る。

【００３１】 センサとしてポリヌクレオチドを使用することによって、多くの市販の方法及
び工業的方法におけるタンパク質をベースとする酵素と比べて利点が与えられる
ことが、本発明の利点である。タンパク質の安定性、供給、基質特異性、及び、
変えられない反応条件等の問題全てが、天然の生物触媒を実用的に実行すること
を制限している。ＤＮＡは、決められた反応条件下でセンサとして働くように工
作され得る。その上、ＤＮＡから造られたセンサは、非常により安定であると考
えられ、自動化されたオリゴヌクレオチド合成によって容易に製造され得る。加
えて、ＤＮＡ及びＲＮＡセンサの両方ともが、固体担体上で機能する能力のため
に選択され得り、固定化される場合にそれらの活性は保持されると考えられる。

【００３２】 述べられた通り、本発明は更に、アッセイ、診断、触媒プロセス等の固体担体
に付いたマルチドメインポリヌクレオチド分子センサを使用することも包含する
。新規なＲＮＡ又はＤＮＡ酵素を固定化することにより、個々の試料を試験する
ための、又は、生理学的及び非生理学的な両条件下で、連続流動反応器中におい
て、リガンド又は化学的形質変換の効率的な検出のために、コーティングされた
表面の新規な形体が提供される。新規なセンサの工作は、使用者が決めた条件下
で、或るリガンド又はシグナルへ効率的に応答するようにそれぞれあつらえられ
得る。ＤＮＡホスホジエステル結合の安定性が高いために、マルチドメインＤＮ
Ａセンサでコーティングされる場合にこの様な表面は、タンパク質酵素又はリボ
ザイムでコーティングされ得る同様の表面よりも非常に長く活性を残すと考えら
れる。

【００３３】 様々な異なるクロマトグラフィー樹脂及びカップリング法が、担体上に本発明
のセンサを固定するのに使用され得る。例えば、これまでに記載される通り（４
５）、ビオチンに対するストレプタビジンの強い結合親和力を利用する簡単な非
共有結合法が、使用され得る。他の実施形態では、センサはマトリックスへの共
有結合によってカラムの担体に結合され得り、それによって寿命の長いバイオセ
ンサを生じ得る。温度、試料調製、センサの大きさ及び感度等のその系の様々な
パラメーターが、最適な感知特性を与えるために調整され得る。事実、これらの
パラメーターは、固定化されたセンサによって示される動的特性又は他の特性に
基づいて存在し得る。

【００３４】 結論として、酵素工学への合理的な組み合わせられた研究手法（４１）を同時
に使用することによって、新規なリボザイム及び他のセンサをデザインするのに
強力な研究手法が与えられる。下記に説明される通り、幾つかの実施形態では、
ポリヌクレオチド工学のこの戦略を使用して生じさせられた３部からなるリボザ
イム構築物は、様々な小さい有機化合物に対して非常に特異的なセンサとして機
能する。これらの構築物の臨界的な成分は、リガンド−応答性の架橋因子である
。これらの動的構造ドメインは、３部からなる構築物の情況内でドメインを単に
交換することによって、すぐに工学者が新規なＲＮＡ分子センサを使用し得る、
単純な連結モジュールとして働く。加えて、構築物のレセプタドメインに突然変
異を導入することにより、触媒又は他のレポーター活性の調節に基づいて、新規
なリガンドが結合しているドメインをｉｎ ｖｉｔｒｏセレクションするのを可
能にされるべきである。同様の方法で、新規な正確なバイオセンサとして働く、
又は多くの異なる種類のエフェクタ分子の存在に応答する遺伝子発現を調節する
遺伝子制御因子又はレポーター因子としてｉｎ ｖｉｖｏで機能する、新規なＲ
ＮＡ分子センサが、製造され得る。

【００３５】

【実施例】

下記の実施例は、本発明を更に記載して、説明するために提示されており、如
何なる点にも限定されると取られるべきではない。実施例１．工学的に正確なＲＮＡ分子センサ ＲＮＡから構成されるリガンドに特異的な分子センサを、新規な構造架橋によ
って予め存在している触媒ドメイン及びレセプタドメインを結合させることによ
って、生じさせた（６５）。レセプタへのリガンドの結合によって、架橋内にコ
ンホメーション変化が引き起こされ、この構造改造は隣接するリボザイムの活性
を命令する。これらの３部からなる構築物のモジュールの性質により、それらの
対応するリガンドの存在下でのみ引き起こされる正確なＲＮＡ分子センサを素早
く構築するのが可能になる。

【００３６】 物質及び方法オリゴヌクレオチド 合成ＤＮＡ及び１４−ヌクレオチド基質ＲＮＡを、標準的な固相法によって調
製し、これまでに記載される通りに（４）、（８Ｍ尿素）ポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動（ＰＡＧＥ）を変性させることによって精製した。ＲＮＡ基質を、Ｔ
４ポリヌクレオチドキナーゼ及び（γ−^３２Ｐ）−ＡＴＰを用いて５’−^３２Ｐ
−標識し、ＰＡＧＥによって再精製した。Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼを使用する
ｉｎ ｖｉｖｏ転写のための二本鎖のＤＮＡ鋳型を、所望のＲＮＡに相補性のＤ
ＮＡ鋳型上で、プライマＡ（５’−ＴＡ−ＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧ
ＧＣＧＡＣＣＣＴＧＡＴＧＡＧ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２）を延ばすことによ
って生成させた。伸長反応は、これまでに記載されている通り逆転写酵素（ＲＴ
）を用いて行った（７）。

【００３７】Ｉｎ Ｖｉｔｒｏセレクション アロステリック活性化のためのセレクションを、２３℃２０時間、１０μＬの
反応緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（２３℃でのｐＨ７．５）及び２０ｍ
Ｍ ＭｇＣｌ_２）中で、ＦＭＮを用いず、自己分解のためにそれぞれの連続した
集団（１μＭ、内部が^３２Ｐ−標識されたＲＮＡ；参照５）をまず初めに予備選
択することによって行なわれた。Ｇ４−Ｇ６のための予備選択は、変性させるた
めに６５℃まで１分間加熱することによって、５時間の間隔で時々中断し、ミス
フォールドした分子を再度フォールドさせた。分解していないＲＮＡを、（８Ｍ
尿素）１０％（ＰＡＧＥ）を変性させることによって精製し、除去されたゲルか
ら溶出させ、エタノールを用いて沈殿させた。得られたＲＮＡを、指示された時
間、２００μＭのＦＭＮの存在下で、反応緩衝液中で培養することによって選択
した。選択的な−増幅方法の続く繰り返しの間の正のセレクションに対する反応
時間は、自己分解の最も早い速度を有するアロステリックリボザイムに有利であ
るために、減少させられた。１０％ＰＡＧＥによって分離された生成物を、模写
し、ＰｈｏｓｐｈｏｒＩｍａｇｅｒ及びＩｍａｇｅＱｕａｎｔソフトウェア（Ｍ
ｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ社製）を使用して、定量した。ＦＭＮの存
在下で生成させられた５’−分解フラグメントを、上記に記載される通りに単離
し、ＲＴ−ＰＣＲ（プライマＡ及びプライマＢ：５’−ＧＧＧＣＡＡＣＣＴＡＣ
ＧＧＣＴＴＴＣＡＣＣＧＴＴＴＣＧ（５，９、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３））に
よって増幅し、得られた二本鎖ＤＮＡを、次ぎのＲＮＡ集団を生成させるために
ｉｎ ｖｉｔｒｏ（５）で転写した。ＦＭＮ抑制のためのセレクションを、ＦＭ
Ｎを転写及び予備選択の両方で含有させた以外は、同様の方法で行ったが、セレ
クション反応では除外した。両セレクションのＧ６集団からの個々の分子を、ク
ローンニングによって（ＴＡクローンニングキット、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製
）単離し、シークエンシングによって分析した（ＴｈｅｒｍａｌＳｅｑｕｅｎａ
ｓｅキット、Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）。

【００３８】アロステリックリボザイムのアッセイ 内部が^３２Ｐ−標識された自己分解するリボザイム（１００〜５００ｎＭ）、
及び、２００μＭのＦＭＮ、１ｍＭのテオフィリン、又は、１ｍＭのＡＴＰのい
ずれかを含有する反応を、反応緩衝液を添加することによって開始させ、定期的
にサンプリングしながら幾つかの半減期を通って培養した。生成物をＰＡＧＥを
変性させることによって分離し、収率を上記に記載される通りに定量した。速度
定数を、時間に対して分解していないＲＮＡのフラクションの自然対数をプロッ
トし、得られた線の負の傾きを確定させることによって導いた。与えられたそれ
ぞれの速度定数値は、３種類の複製アッセイの最低の平均であり、それぞれは２
未満のフォールドで異なっていた。クラスＩ誘導因子及びクラスＩＩ抑制因子を
有するリボザイムを、詳細な分析のために任意に選択した。

【００３９】 ２分子からなるアッセイを、５’−^３２Ｐ−標識された基質のトレース量（〜
５ｎＭ）に対して過剰のリボザイム（５００ｎＭ）を用いて、単一の代謝ラウン
ド条件下で行った。反応を、１０分間２３℃で反応緩衝液中で別々に予備培養し
た、リボザイム及び基質を混合することによって開始させた。動的パラメーター
を、上記に記載される通り生成させた。生成物の収率を、修飾されていないハン
マーヘッド型リボザイムを用いた徹底的な培養後に分解しないで残っている基質
の量に対して、補正した（５）。与えられたそれぞれの速度定数に対する値は、
２未満のフォールドで異なる、２種類の複製アッセイの最低の平均である。

【００４０】 結果及び考察アロステリックリボザイムのＩｎ Ｖｉｔｒｏセレクション 別々のＦＭＮが結合しているアプタマー（２６）及びランダム配列の架橋によ
って結合しているハンマーヘッド型リボザイム（２７、２８）ドメインからなる
、＞６５０００の異なるＲＮＡの集団を、生じさせた（図２Ａ）。架橋は、ハン
マーヘッドモチーフ、即ちリボザイム活性（２９、３０）の臨界的決定基である
構造因子の、天然の「ステムＩＩ」部分の大部分を置き換える。得られた３部か
らなる構築物内のランダム化されたドメインは、近接するアプタマードメイン中
のＦＭＮ結合に応答するであろう代わりのステムＩＩ因子をサンプリングし、隣
接するリボザイムドメイン上で正又は負のいずれか一方のアロステリックな制御
を与えるであろう。２つの同じＲＮＡプール（それぞれ〜６×１０^１２分子）を
、ＦＭＮ依存性のアロステリックな誘導（図２Ｂ）又はアロステリックな抑制（
図２Ｃ）のいずれか一方のためにｉｎ ｖｉｔｒｏセレクションさせた。リボザ
イムのアロステリックな誘導を支配する架橋を単離するために、ＦＭＮの不存在
下での自己分解のための「負のセレクション」を、第一のプールに適用した。こ
の反応の間に分解せずに残ったＲＮＡを単離し、ＦＭＮの存在下での自己分解の
ための「正のセレクション」を続いて受けさせた。この方法は、ＦＭＮが検出さ
れる場合にのみ活性化するリボザイムの単離に有利であると考えられる。対照的
に、第二のプールを、ＦＭＮの存在下で、転写及び予備セレクションの両方を行
った。次いで、残存しているＲＮＡ前駆体を、リガンドの不存在下で正のセレク
ションを受けさせたが、それはリボザイムにアロステリックな抑制を行うように
命令する架橋を単離するのに有利である。

【００４１】 ６ラウンドのセレクション（Ｇ６）後に単離された両方のＲＮＡ集団は、ＦＭ
Ｎに対して高い感度を示し、これは組み合わせた工学手法が、非常に特異的な分
子スイッチとして機能するリボザイムを生じさせるための効果的な手段であるこ
とを示している。ｉｎ ｖｉｔｒｏセレクション法は、複製を許容する反応条件
下での幾つかの他の手段によって分解する、新規なＲＮＡ構造を製造し得る。例
えば、ＦＭＮに見出されるイソアロキサジン環等は、ＲＮＡ分子（３１）の光分
解を促進させることが示されており、新規なＦＭＮ依存性のリボザイムに対する
コファクタとして考えられるところでは働き得る。しかしながら、セレクション
によって単離されたＲＮＡは、ＲＮＡ分解フラグメントのゲル移動度によって決
定される通り、それぞれの構築物に組み込まれた、元のハンマーヘッド型リボザ
イムドメインによってのみ媒介される反応で分解すると思われる。

【００４２】単離された架橋因子の配列及び機能特性 両方のセレクションからのＧ６集団を、クローン化し、配列させ、アロステリ
ックな機能のためにアッセイした（図３）。「誘導因子」Ｉ〜ＶＩＩＩとして示
される、架橋の８つの異なるクラスを、ＦＭＮで誘導し得るＲＮＡ集団内で同定
した。これらの異なるクラスの誘導因子を有するリボザイムは、リガンドの不存
在下（Ｋ_obs−）又は存在下（Ｋ_obs＋）で、自己分解に対して独自の速度定数を
示す（図２Ａ）。殆どのクラスは、１００フォールドより大きいアロステリック
活性を示したが（Ｋ_obs ^＋／Ｋ_obs ⁻）（図２Ｂ）、クラスＩ、ＩＩＩ及びＶＩＩ
は〜２７０フォールドのＦＭＮ依存性速度増加を示した。このアロステリックな
誘導は、幾つかの天然のアロステリックタンパク質酵素で見られる動的調節と大
きさが同様である（３２）。更には、ほぼ全てのクラスで得られるＫ_obs＋値は
、修飾されていないハンマーヘッド型リボザイムに対して測定さた最大のＫ_obs
（１．１分^−１）に近づく（図３Ａ）。

【００４３】 同様に、５つの異なるクラスの架橋を、同定し、「抑制因子」Ｉ〜Ｖとして示
した（図３Ｃ）。ｉｎ ｖｉｔｒｏセレクションへ中程度の応答を示したＦＭＮ
で誘導し得る集団とは異なり、リボザイムの機能のリガンド依存性抑制は、この
平行なセレクションのＧ３までは検出されなかった。面白いことに、５つのクラ
スのそれぞれは、ランダム化された架橋ドメイン内に１−又は２−ヌクレオチド
欠失を有しており、これは元のＲＮＡプールからなる配列変異体のいずれも、ア
ロステリックな抑制を与え得る充分なリガンド応答性因子を形成しなかったこと
を示唆している。ＦＭＮで抑制されたＲＮＡ集団をもたらすのが比較的遅いこと
は、必要なために、架橋ドメイン内に特異的なヌクレオチドの欠失が創発し得る
（選択的な増幅法の間に頻繁に欠失が生じることに依存して起こる）。抑制因子
の配列が非常に均一であるという事実は、この仮定に一致し、これは単一の応答
性の架橋ドメインの創発及び多様化が、試験された全てのクラスに生じ得ること
を示している。５つのクラス全てが、ＦＭＮの存在下で実質的にアロステリック
な抑制（２００〜６００フォールド）を示す（図３Ｄ）。

【００４４】 セレクションによって単離された架橋因子の多くは、修飾されていないハンマ
ーヘッド型リボザイムＨ１で測定された値よりも少なくとも１０−フォールド低
い、最高の速度増加を示す（図３）。ＲＮＡ分解に対して最も大きい速度定数を
示すアロステリックリボザイムは、クラスＩＩ誘導因子（Ｋ_obs＋＝０．２５分
^−１）又はクラスＩＩ抑制因子（Ｋ_obs−＝０．４５分^−１）を有する。これら
の２種類のリボザイムに対する最高の速度定数は、それぞＨ１より遅い僅か４−
フォールド及び２−フォールドである。同様のｉｎ ｖｉｔｒｏセレクション法
を使用して、ＦＭＮに対して感度の高いＲＮＡに対して記載されるのと同様の、
３部からなる立体配座を使用するテオフィリン依存性リボザイムの集団が単離さ
れた。この集団からの個々のテオフィリンに対して感度の高いリボザイムは、１
分^−１を超える速度定数を示し、それによってアロステリックなハンマーヘッド
型リボザイムは実際に、修飾されていないリボザイムと同じくらい効率的に機能
するように作られ得ることが確認された。

【００４５】活性なリボザイム構造と不活性なリボザイム構造との間の速い相互変換 クラスＩ誘導因子を有するリボザイムに対して不活性な状態（図４Ａ）は、Ｆ
ＭＮの不存在下で長時間維持され、１時間当り僅か〜１％の自己分解を生じる（
図４Ｃ）。しかしながら、自己分解は、触媒速度に約２７０−フォールドの増加
をもたらすこのケースでは、リガンド（図４Ｃ；挿入図）の付加に対して殆ど瞬
間的に引き起こされる。多分、ＦＭＮの不存在下で誘導因子によって維持される
「オフ」状態は、リボザイムの活性に必要な安定なステムＩＩ構造を形成する能
力を欠くものである。この代わりに、それぞれの因子は、この必須なステムの形
成を妨げる異なる構造を形成する。ＦＭＮの結合は、誘導因子をリボザイムの機
能と適合し得る構造に素早く変換するアプタマー内に、コンホメーション変化を
誘発させることによって、「オン」状態を確定する。対照的に、クラスＩＩ因子
を有するリボザイム（図４Ｂ）は、ＦＭＮの不存在下で素早く自己分解するが、
リガンドの付加で不活性な状態に素早く変換する（図４Ｄ；挿入図）。ここで、
抑制因子は、ＦＭＮを結合し、リボザイムの機能を妨げる特異的な架橋構造を安
定化させることによって、「オフ」状態を維持する。リガンドの解放によって、
架橋の構造の再編成が生じ、隣接するリボザイムの「オン」状態を確定する。し
かしながら、ＦＭＮが存在する場合、どの構造状態がクラスＩＩ抑制因子で見ら
れる分解の速度が遅い原因であるのかははっきりしないままである。ＦＭＮ−リ
ボザイム錯体が、弱く活性なままであるのかどうか、又は、平衡結合条件下での
み存在する少数のＦＭＮを持たないＲＮＡが、観察されるＲＮＡ分解速度に寄与
しているのかどうかを決定するのには、更なる実験が必要である。

【００４６】アロステリック機能の機構 素早いリガンド依存性活性化又はリボザイム機能の抑制は、活性を調節するの
に必要とされるコンホメーション変化が、リガンドの結合に対して高い応答性で
あるに違いないことを示している。幾つかの因子では、このアロステリックなト
ランジッションは、それぞれの架橋ドメイン内に局在化した塩基対の変化によっ
て達成され、リガンド−アプタマー錯体形成からもたらされる結合エネルギーは
、構造の立体配座にこのシフトを生じさせるのに使用されると思われる。

【００４７】 アロステリックな誘導及び抑制の両方に対して提案された機構の臨界的成分は
、架橋のすぐ側のアプタマードメイン内に位置する、単一の切り取られたＡ・Ｇ
塩基対であり、これはＦＭＮが結合される場合にのみ形成する（３３、３４）。
クラスＩ誘導因子では、ＦＭＮの存在により架橋内の塩基対に対して特異的な登
録を順に確定する、Ａ・Ｇ塩基対を安定化する（図５Ａ）。このＦＭＮ依存性の
構造的な束縛がないと、架橋中の塩基対が、Ａ・Ｇ相互作用に対して１つの塩基
対を滑らし得り、それによってリボザイム機能に必要とされるＧ−Ｃ塩基対に置
き換わってしまう。この不活性なコンホメーションは、単一のヌクレオチドが架
橋の上側の鎖から隆起しない場合には、維持されるであろう。対称的な内部の隆
起は、非対称又は単一のヌクレオチドの隆起よりもより安定であることが知られ
ている（３５）。それ故に、切り取られたＡ・Ｇ塩基対によって決められた登録
は、対称的な内部隆起の存在が連続的に積み重ねられたステムＩＩドメインに有
利である場合に、架橋因子に沿って忠実に遺伝させられ得る。面白いことに、全
ての抑制モジュールは、それらの機能に必須であると思われる欠失を得た。この
ケースでは、ＦＭＮが結合した場合には、連続的に積み重ねられた架橋がリボザ
イムの臨界的なＧ−Ｃ塩基対を分裂させるので、これは、スリップ−構造機構と
よく対応するのに対して、ＦＭＮが存在しないと適当なリボザイムのフォールデ
ィングを許すであろう（図５Ｂ）。

【００４８】 アロステリックな調節に対するこの「スリップ構造」機構を更に調査するため
に、幾つかのリボザイム構築物を、ＦＭＮが結合しているドメインの代わりに安
定なステム−ループ構造を使用して、生じさせた（図５Ｃ）。その占領された状
態において、ＦＭＮアプタマーは、小型のほぼＡ−形のＲＮＡ構造を形成する（
３４）。それ故に、試験構築物に組み込まれたステム−ループ構造は、ＦＭＮが
結合したアプタマーを刺激して、リボザイムの機能を誘導するか又は抑制するか
のいずれかに必要であると推定されているスリップ構造を実施すべきである。例
えば、構築物Ｉ−１は、切り取られたＡ・Ｇ対の形成を実施することによって、
ＦＭＮに結合したクラスＩ誘導因子の構造を刺激するようにデザインされている
。事実、ＦＭＮの不存在下のＩ−１に対するＫ_obsは、親のアロステリックリボ
ザイムのＦＭＮで誘導される形体に対する速度定数と同じである（表１）。２つ
の更なる構築物（Ｉ−２及びＩ−３）を、対抗する「スリップした」異説を段々
とより強い塩基対を用いて実施する場合の、速度定数を測定するために使用した
。構築物Ｉ−２は、不活性なコンホメーションに有利であるべきである構造によ
って、アプタマーが置換される場合には、顕著には抑制されない。この情況では
多分、適当なリボザイムフォールディングを元に戻すであろう、架橋の上側の鎖
に沿う単一の隆起したヌクレオチドが生じ得る。しかしながら、アロステリック
な機能に対して提案されている機構と一致して、構築物Ｉ−３を形成する架橋中
に更なる塩基対を導入することによって、可能性のある隆起の形成が妨げられる
場合には、隣接するリボザイムの活性は実質的に減少させられる。

【００４９】 スリップ−構造機構に対する更なる証拠は、クラスＩＩ抑制因子を調べること
によって与えられた。ここで、ＦＭＮの結合は、活性なリボザイムのコンホメー
ションの形成を妨げる塩基対のパターンを実施する（図５Ｄ）。ＦＭＮがないと
、Ａ・Ｇ塩基対の損失は、残っている塩基対が一つのヌクレオチドによって滑る
のを可能にし、それによって活性なリボザイムのコンホメーションを形成し得る
。二つの異なる塩基対の配座異性体を実施するステム−ループ構造でデザインさ
れている、構築物ＩＩ−１及びＩＩ−２は、親のアロステリックリボザイムの活
性な状態及び不活性な状態のそれぞれに対する値とほぼ対応する速度定数を示す
（表１）。全ての実施例において、架橋因子は、ステム構造を多分不安定にし、
異なる構造状態の間に素早く相互転換を与える、対となっていない塩基を含有す
る。同様のＲＮＡスイッチ機構は、１６ＳリボソームＲＮＡの構造及び機能にお
いて重要な役割を果たし得り（３５、３６）、アロステリックな機能に対してこ
の機構を示す発見は、先例がないはずがないであろう。アロステリックな機能に
対する代わりの機構が、実施され得るが、これらの著しい相関関係全ては、提案
されているスリップ−構造機構と一致する。残っているクラスの架橋因子を用い
る同様の研究により、この機構もより一般的に生じるかどうかが明らかになるで
あろう。

【００５０】新規なリガンド特異性を有する工学技術のアロステリックリボザイム リガンド−アプタマー錯体からもたらされる結合エネルギーが、２つのスリッ
プ−構造コンホメーションの間の熱力学的バランスをシフトさせるのに使用され
る場合、次いでそれぞれの架橋は、アプタマーの配列及びリガンド特異性と無関
係の方法で、隣接するアプタマードメインの占領状態の属のレポーターとして作
用し得る。この可能性を調べるために、ＦＭＮアプタマーをＦＭＮに感度の高い
リボザイムのクラスＩ誘導因子から取り除いて、テオフィリンを結合するアプタ
マー（３７）又はＡＴＰを結合するアプタマー（３８）のいずれか一方で置換し
た（図６Ａ）。それぞれのケースにおいて、リガンドの結合は、付いているアプ
タマーの末端のヌクレオチドの塩基対を安定化させることが知られている（３３
、３８、３９）。それ故に、アプタマーによるリガンドの環境順応を助ける結合
によって、クラスＩ機能に必要なアロステリックなトランジッションが引き起こ
され得る。実際、それぞれのリボザイム構築物は、それと同じ性質のリガンドの
存在下でのみ自己分解する（図６Ｂ）。動的分析（図６Ｃ及び６Ｄ）は、ＦＭＮ
で誘導され得るリボザイムの活性はＦＭＮの存在下では２７０−フォールド増加
するのに対して、テオフィリン−及びＡＴＰ−で誘導され得るリボザイムは、そ
れらの対応するリガンドによってのみそれぞれ１１０−フォールド及び４０−フ
ォールド活性化されることを示している。これらの発見は、リボザイムの活性の
調節という仕事は主に架橋因子に基づいており、それは隣接するリボザイムドメ
インへのアプタマーの結合状態に関する情報を中継することを示している。

【００５１】 クラスＩ誘導因子は、幾つかの関連していないエフェクタ分子に応答するよう
に工作され得るが、この特徴は一般には適用可能ではない。例えば、クラスＩ誘
導因子へアルギニン（４０）のためのアプタマーを付けることによって、重要な
アロステリックな効果を生み出し損ねた。試験された３つの他のクラスの内の２
つの誘導因子はまた（クラスＶＩ及びＶＩＩ）、テオフィリンアプタマーを有す
るように工作された場合に、モジュール方式を示す。しかしながら、クラスＩＩ
Ｉ誘導因子及びクラスＩＩ抑制因子は、同じアプタマーに同様に付いた場合に、
エフェクタの付加に応答を示さなかった。これらの発見は、このモジュール研究
手法を使用するアロステリックリボザイムのデザインが上手くいくには、アプタ
マー及び架橋ドメインの適合し得る「マッチした対」の融合が必要であることを
示している。

【００５２】 表１．これらの状態を擬態するようにデザインされた構築物と比較した、クラス
Ｉ（誘導）及びクラスＩＩ（抑制）リボザイムの「オン」及び「オフ」状態に対
する触媒速度定数

【表１】

【００５３】実施例２ テオフィリンに感度の高いアロステリックなハンマーヘッド型リボザイムのｉｎ
ｖｉｔｒｏセレクション 連結モジュールの開発法が如何なる数のアプタマー−リボザイムの組み合わせ
に対しても適用可能であるかどうかを調査するために、テオフィリンの結合によ
って活性化されたアロステリックなハンマーヘッド型リボザイムに対してｉｎ
ｖｉｔｒｏセレクションを行った。このセレクションは、組み合わせたモジュー
ルの合理的なデザイン及びｉｎ ｖｉｔｒｏセレクション法を有効にするためだ
けでなく、核酸のアロステリック性の限界に挑戦する新規な連結モジュールを開
発するために探し出された。アロステリックなテオフィリンに感度の高いリボザ
イムの開発のための初期の集団は、ＦＭＮに感度の高い触媒を生じさせるのにこ
れまでに示した集団と概念的に同じである。しかしながら、テオフィリンアプタ
マーは、５＋５又は合計で１０のヌクレオチドの位置からなる、ランダム−配列
領域からハンマーヘッド型リボザイムのステムＩＩに付いていた（図７Ａ）。テ
オフィリンで活性化されたリボザイムのｉｎ ｖｉｔｒｏセレクション及び増幅
の８ラウンドから得られるＲＮＡ集団は、テオフィリンの不存在に対するテオフ
ィリンの存在下での自己分解反応に触媒作用を及ぼす顕著な能力を示す（Ｇ８、
図７Ｂ）。全体としての集団は、修飾されていないハンマーヘッド型リボザイム
（〜分^−１）に対して観察された速度定数と本質的に同じである、リガンドの存
在下で観察された速度定数（Ｋ_obs＋）を示す。最終の集団からの幾つかの個体
が、単離され、更にリガンドで活性化された触媒作用に対する連結モジュールの
配列及び動的パラメーターを確定するために特徴付けられた（表２）。

【００５４】 表２．ｉｎ ｖｉｔｒｏセレクションによって単離されたテオフィリンに感度の
高いアロステリックなハンマーヘッド型リボザイムの連結モジュールの配列及び
動的パラメーター

【表２】

【００５５】 多くの単離されたものは、１分^−１に近づく又は超えるテオフィリン依存性の
速度定数を達成することが示された。尚、アロステリック活性化は、数百フォー
ルド〜数千フォールドの範囲であった。この方法では、テオフィリンに感度の高
いアロステリックなハンマーヘッド型リボザイムに対するセレクションは、リボ
ザイムのモチーフの触媒効率を妥協することなく、機能的に優れた触媒を与えた
。この様に、リガンドに感度の高いアロステリックリボザイムの開発のために、
組み合わせたモジュールの合理的なデザイン及びｉｎ ｖｉｔｒｏセレクション
技術を使用することは、新規なアロステリックな触媒の開発に広く適応可能であ
り得る。

【００５６】実施例３ ｃＧＭＰ及びｃＡＭＰメッセンジャーに応答するリボザイムのアロステリックセ
レクション 実施例１は３つのドメインの構築物を使用して、一連のアロステリックリボザ
イムの生成を説明した（図１及び８）。同定された幾つかの架橋ドメインに対し
て、実験の過程の間、様々なリガンド特異性を有する異なるアプタマードメイン
で、元のアプタマードメインを置換することによって、対応するエフェクタ依存
性を有する新規なアロステリックリボザイムが製造されるのが観察された。換言
すると、図８に示されている、或る架橋ドメイン又はクラスＩ連結モジュール（
ｃｍ＋ＦＭＮ１）等の連結モジュールは、特定のリガンド特異性に係わらず、異
なる付いているアプタマーの占領状態の属のレポーターとして働くと思われる。
この例は、それらが思慮分別をもって３部からなるＲＮＡ構築物のエフェクタ結
合部位に組み込まれる場合、発見されていないアプタマーがリボザイムの機能を
引き起こし得るかどうかを調査することが行われる更なる研究を報告している。
全エフェクタが結合している部位が、ランダムな配列からなる２５−ヌクレオチ
ドドメインで置き換えられる、新規な構築物が生じさせられた（図８）。このＲ
ＮＡ構築物の構成は、選択的な増幅法、本明細書中の用語「アロステリックセレ
クション」を使用して、新規なエフェクタ特異性を有するアロステリックリボザ
イムの単離を促進させた（図９Ａ）。このプロセスは、エフェクタの不存在下で
不活性なままで残っているが、エフェクタの添加で活性化される、これらのリボ
ザイムに対するＲＮＡ集団の濃縮に有利である（７３）。

【００５７】 物質及び方法ＲＮＡプールの調製 図１Ｂに記載したＲＮＡプールに対するＤＮＡの鋳型及びＲＴ−ＰＣＲに使用
したオリゴヌクレオチドを、自動化されたＤＮＡ合成によって調製した（Ｋｅｃ
ｋ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、
イェール大学）。全てのＤＮＡを、使用する前に、（８Ｍ尿素）ポリアクリルア
ミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）を変性させることによって精製した。ＤＮＡ鋳型
５’−ＧＧＧＣＡＡＣＣＴＡＣＧＧＣＴＴＴＣＡＣＣＧＴ−ＴＴＣＧＡＣＧＴ（
Ｎ_２５）ＡＡＧＧＣＴＣＡＴＣＡＧＧＧＴＣＧＣＣ（４．１５ｎｍｏｌ、ＳＥＱ
ＩＤ ＮＯ：３２＋ＡＣＧＴ及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４）を、「プライマ
２」（５’−ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＧＡＣＣＣＴＧＡＴ
ＧＡＧ、８．３ｎｍｏｌ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２）の存在下で延ばすことに
よって、二本鎖にした。尚それは、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ（Ｔ７ ＲＮＡＰ）
に対してプロモーターを導入する。ＤＮＡ伸長反応（３００μｌ）は、製造指示
に従って、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩ逆転写酵素（ＲＴ、ＧｉｂｃｏＢＲＬ）
を使用して行った。

【００５８】 得られた二本鎖のＤＮＡを、エタノールを用いて沈殿させることによって回収
し、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（２３℃でのｐＨ７．５）５０ｍＭ、ＭｇＣｌ_２１５ｍＭ
、ジチオトレイトール５ｍＭ、スパミジン２ｍＭ、４つのｄＮＴＰそれぞれ２ｍ
Ｍ、Ｃｉ（−^３２Ｐ）ＵＴＰ２００μ及びＴ７ ＲＮＡＰ６００００Ｕを含有す
る、２ｍｌの転写混合物中で再懸濁させた。転写混合物を、３７℃で１時間培養
し、得られた分解していない前駆体ＲＮＡ（内部が−^３２Ｐ標識されている）を
、１０％ＰＡＧＥを変性させることによって単離した。ＰＡＧＥの精製によって
、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写反応の間に自己分解を起こすリボザイムが除去されるこ
とに注目しなさい。これは、エフェクタによって活性化されることなく機能する
リボザイムを単離するのには有利ではない、更なる負のセレクション工程を本質
的に導びく。その上、この工程は、故意のｃＮＭＰターゲットエフェクタとｉｎ
ｖｉｔｒｏ転写に必要とされるＮＴＰとの間で区別できないアロステリックリ
ボザイムの単離には有利ではない。

【００５９】アロステリックセレクション ｃＮＭＰ（シグマ社製）に応答するアロステリックリボザイムに対するｉｎ
ｖｉｔｒｏセレクションを、負のセレクションと正のセレクションを繰り返すラ
ウンドを使用して行った。負のセレクションの第一のラウンドでは、ＲＮＡ前駆
体（９．３ｎｍｏｌ、５．６×１０^１５分子）の初期プールを、４つのｃＮＭＰ
の不存在下で、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）５０ｍＭ及びＭｇＣｌ_２２０ｍ
Ｍを含有する反応混合物（９３０μｌ）中、２３℃で５時間培養した。この培養
の間に分解に抵抗する前駆体ＲＮＡを、１０％ＰＡＧＥを変性させることによっ
て単離した。次いで、精製された前駆体ＲＮＡを、４つのｃＮＭＰをそれぞれ５
００μＭ含有する同じ反応緩衝液（９３０μｌ）中、２３℃で３０分、正のセレ
クションの第一のラウンドを受けさせた。この段階で、分解した生成物を、１０
％ＰＡＧＥを変性させることによって精製し、５’分解フラグメントを破砕−浸
漬溶出（ｃｒｕｓｈ−ｓｏａｋ ｅｌｕｔｉｏｎ）によってゲルから回収し、逆
転写、次いでＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）によって増幅させた。逆転写は、製造指示
ｃＤＮＡに従ってＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩ ＲＴを使用し、プライマ１（５
’−ＧＧＧＣＡＡＣＣＴＡＣＧＧＣＴＴＴＣＡＣＣＧＴＴＴＣＧ、ＳＥＱ ＩＤ
ＮＯ：３３）を使用して、反応緩衝液（合計で４００μｌ）中で行った。次に
、プライマ１及び２（それぞれ５００ｐｍｏｌ）を使用して、得られたｃＤＮＡ
のＰＣＲ増幅を、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（２３℃でのｐＨ８．３）１０ｍＭ、ＫＣｌ
５０ｍＭ、ＭｇＣｌ_２ １．５ｍＭ、０．０１％ ゼラチン、ｄＮＴＰをそれ
ぞれ０．２ｍＭ、及び、Ｔａｑ ポリメラーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）５０Ｕを
含有する、反応混合物（合計で２ｍｌ）中で行った。反応を、９４℃で３０秒、
５５℃で３０秒、及び、７２℃で６０秒の所望の数の繰り返しで、熱循環させた
。

【００６０】 選択的な増幅の更なるラウンドを、エフェクタに感度の高いリボザイム機能を
検出するまで、１５分の正のセレクション反応を使用して、同様の方法で繰り返
した。続くセレクションのラウンドは、少な目のＲＮＡプールを使用し、それに
応じて大きさの小さくなった反応サイズで、上記に記載される通り行なわれた、
負のセレクション及び正のセレクションの両方を含んでいた。最初の５ラウンド
のセレクションでは、１０倍のｃＮＭＰの原料混合物を、反応緩衝液の残ってい
る成分を添加する前に、ＲＮＡプールに添加した。続くラウンドでは、ｃＮＭＰ
混合物を、反応緩衝液の後に添加して、酸に感度の高いリボザイムの単離を妨げ
た。加えて、ゆっくりと分解するか、又は、リフォールディングの際に活性なコ
ンホメーションと不活性なコンホメーションとの間に分配する、リボザイムに対
してより攻撃的にセレクションするために、負のセレクションを変えた。ゆっく
りと分解するリボザイムには有利ではないために、負のセレクション時間を、５
時間から最高で４８時間まで延ばし、複数の負のセレクション工程を、正のセレ
クションを行う前に時々使用した。リボザイムをミスフォールディングするのに
有利ではないために、周期的な熱循環を、これまでに記載される通り（６５）使
用するか、若しくは尿素又は穏やかなアルカリを使用する化学的変性を、変性、
復元、及び、自己分解の複数のサイクルを誘発させるために、負のセレクション
の期間、反復法で使用した。面白いことに、残存に対してミスホールディング戦
略を使用するリボザイムはまた、熱及び尿素で媒介される変性に頼る負のセレク
ション戦略を阻止した（未発表の観察）。それ故に、アルカリ変性を使用するこ
とは、負のセレクションに最も効果的であることが判った。

【００６１】アロステリックリボザイムのキャラクタリゼーション ｃＮＭＰ依存性の自己分解を示すＲＮＡ集団を、クローン化し（ＴＯＰＯ Ｔ
Ａ クローンニングキット、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）、配列させ（Ｔｈｅｒ
ｏｍｏ Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔ、Ｕ
ＳＢ社製）、更にリボザイムの速度論のエフェクタで媒介される調節を確定する
ことによって分析した。個々のアロステリックリボザイムのクローンに対する二
本鎖のＤＮＡ鋳型を、プライマ１及び２を使用する、プラスミドＤＮＡのＰＣＲ
増幅によってか、又は、適当な合成ＤＮＡ鋳型の調製によってのいずれか一方に
よって調製した。内部が^３２Ｐ−標識されたＲＮＡを、上記に記載される通り、
ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写によって調製した。

【００６２】 ＲＮＡの自己分解に対する初期速度定数を、それぞれの実験に対して指示され
た通り、ｃＮＭＰエフェクタを異なる濃度含有するセレクション緩衝液中で、内
部が^３２Ｐ−標識されたＲＮＡ前駆体をトレース量（〜１００ｎＭ）培養するこ
とによって確定した。反応を、更にＥＤＴＡを含有する２×ＰＡＧＥ装荷緩衝液
を添加することによって終了させて。Ｍｇ^２＋コファクタを封鎖した（６５）。
それぞれのクローンに対して、時間に対する分解した（＜２０％処理された）前
駆体のフラクションのプロットは、直線を与えた。尚、その傾きは、使用した特
定の反応条件下でのリボザイムに対する初期速度定数を表わす。全てのケースに
おいて、二重の実験で、５０％未満で変えられた速度定数が与えられた。

【００６３】 閉じ込められたｃＡＭＰ類似体、アデノシン３’，５’−サイクリック一リン
酸、Ｐ１−（２−ニトロフェニル）エチルエステル（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ社製
）を、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中で再懸濁させて、１００×原料溶液
（２００ｍＭ）を生じさせた。溶解させた類似体を、リボザイム反応に送達して
、最終濃度２ｍＭを生じさせ、得られた反応混合物に、ＤＭＳＯを追加して、そ
れが沈殿するのを防止するための最終濃度５％を得た。ＤＭＳＯのこの濃度は、
クローンｃＡＭＰ−３の機能には影響を与えなかった。ポリカーボネート製のマ
イクロリットル板（ＵＳＡ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）に含有された試料のＵ
Ｖ照射を、３１２ｎｍに中心のある光を生じさせる、ＵＶ徹照装置（Ｓｐｅｃｔ
ｒｏｌｉｎｅ ＴＶＣ−３１２Ａ型）を使用して行った。これらの条件下では、
類似体の８０％以上が、ｃＡＭＰに転換される。

【００６４】 ｃＡＭＰ消耗反応を、それぞれの反応に指示される通り、ｃＡＭＰ（５００μ
Ｍ）、３’，５’−サイクリックヌクレオチドホスホジエステラーゼ（牛の脳か
ら不足した活性化剤、シグマ社製）及びカルモジュリン（３’，５’−サイクリ
ックヌクレオチドホスホジエステラーゼ活性化剤、シグマ社製）を送達すること
によって調製した。凍結乾燥したホスホジエステラーゼ及びカルモジュリン試料
を、ＭＥＳ（２３℃でのｐＨ６．５）５０ｍＭ、ＮａＣｌ １００ｍＭ及び６０
％のグリセロールを含有する緩衝液中で、別々に再懸濁させた。ホスホジエステ
ラーゼを、最終濃度５×１０^−４Ｕμｌ^−１まで指示された通り送達させ、カル
モジュリンを、最終濃度１．５Ｕμｌ^−１まで指示された通り送達させた。ｃＡ
ＭＰ消耗研究のための反応は、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（２３℃でのｐＨ７．５）５０
ｍＭ、ＭｇＣｌ_２２０ｍＭ、ＣａＣｌ_２３０μＭ、及び、２．７％のグリセロー
ルを含有していた。トレース量の内部が^３２Ｐ−標識されたｃＡＭＰ−１ ＲＮ
Ａを、即座に添加するか（予備培養なしで）、若しくは、３０℃で行なわれた４
０分又は８０分の予備培養後に添加した。

【００６５】 結果及び考察 構築物のランダム配列ドメイン内のほぼ全ての可能性のある配列変異体を表わ
す１０^１５ＲＮＡ分子のプールで始めて、連続して負のセレクション及び正のセ
レクションを、可能性のあるエフェクタ分子として、４つの天然の３’，５’−
サイクリックモノヌクレオチド（ｃＮＭＰ；それぞれ５００μＭ）からなる混合
物を使用して行った。それぞれのＲＮＡの集団を、ｃＮＭＰ混合物の不存在下で
ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写によって調製し、完全な長さの前駆体ＲＮＡを、１０％の
ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）を変性させることによって精製し
た。単離されたＲＮＡ前駆体を、長期間、異なった複製を許容する反応条件（反
応緩衝液：Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、２３℃でのｐＨ７．５、２０ｍＭ、及び、Ｍｇ^{２ ＋} ２０ｍＭ）下で、エフェクタ混合物の不存在下で培養した。この負のセレクシ
ョン反応からの分解していない前駆体を、再度ＰＡＧＥによって単離し、ｃＮＭ
Ｐ混合物を含有する複製を許容する反応要件下で簡単に培養することによって、
正のセレクションを受けさせた。得られた５’−分解生成物を、ＰＡＧＥによっ
て精製し、逆転写、続くポリメラーゼ鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）によって増幅させ
た。この選択的−増幅法は、４つのｃＮＭＰのいずれかに応答するアロステリッ
クリボザイムの濃縮に有利であるので、繰り返した。

【００６６】酸に感度が高く、かつエフェクタ依存性のリボザイム 選択的−増幅の僅か６ラウンド（Ｇ６）の後、ＲＮＡプールは、ｃＮＭＰ混合
物の添加に対して顕著な正の応答を示した（図９ｂ）。しかしながら、更なる実
験で、Ｇ６ ＲＮＡ集団は、ｃＮＭＰのいずれに対しても特異的には認識しない
が、簡単な酸処理によって機能するように誘発されるリボザイムによって支配さ
れていることが判った。最初の６ラウンドのセレクションでは、反応緩衝液の添
加直前にｃＮＭＰからなる酸性の混合物を添加することによって、ＲＮＡ混合物
のｐＨは故意ではなく下がった。酸性化を防ぐために、正のセレクションに使用
されたＲＮＡプールを、反応を開始させるために使用したｃＮＭＰ混合物及び２
０ｍＭのＭｇ^２＋の添加前に、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（２３℃でのｐＨ７．５）５０
ｍＭを用いて緩衝させた。

【００６７】 利己的ＲＮＡ分子の２つの更なるクラスもまた、セレクションの初期段階で明
らかになった。利己的リボザイムの１つのクラスによって、負のセレクション工
程及び正のセレクション工程の両方で実質的に触媒速度を低下させながら、ＲＮ
Ａの分解反応が促進させられる。他のクラスは、正確に折りたたまれた状態及び
ミスフォールドされた状態に分配する。両方のケースにおいて、リボザイムは、
負のセレクション反応の間完全には利己処理されず、それ故にエフェクタに対し
て応答せずに、選択的−増幅法によって濃縮される。これらの２つのタイプの利
己的ＲＮＡは、正のセレクション反応で観察されるＲＮＡの触媒作用が高いバッ
クグラウンドレベルであることに起因し、これはアロステリックなセレクション
法の効率を最適ではなくした。

【００６８】 幸いにも、エフェクタ分子を認識することによって特異的に活性化するリボザ
イムは、上記に記載されるエフェクタ依存性の戦略を使用するリボザイムに対し
て、重要な選択的利点を獲得する。負のセレクション反応に対して長い培養時間
を使用すると、よりゆっくりと分解するリボザイムを更に不利した。しかしなが
ら、ミスフォールディング戦略を使用して生き残るリボザイムは、除去するのが
より困難であった。多分、これらの分子の或る部分は、それぞれの変性の発生後
に、活性なコンホメーション状態と不活性なコンホメーション状態とに分ける。
それ故に、その集団の一部分のみが、負のセレクションの間に分解する。ＰＡＧ
Ｅを変性することによって分解していない前駆体を精製する際に、ＲＮＡは再び
折り重なり、２つのコンホメーション状態の間に分配する他の機会を有する。こ
れによって、集団の重要な部分が続く正のセレクション反応の間に分解するのが
可能になる。この戦略を使用するリボザイムを不利にするために、多ラウンドの
負のセレクション及び精製を行った。この代わりに、負のセレクション反応を、
熱変性工程又は化学変性工程で散在させて、それぞれＲＮＡを分解し再度折りた
たませた（上記の物質及び方法参照）。

【００６９】ｃＮＭＰ依存性のハンマーヘッド型リボザイムの単離 ｃＮＭＰ混合物への測定可能な応答を、合計で１４ラウンド後にセレクション
されたＲＮＡ集団によって再度示された（図９Ｂ）。Ｇ１６ＲＮＡプールを、ｃ
ＧＭＰの添加によって特異的に活性化されるアロステリックリボザイムによって
支配されているかを観察した。それ故に、エフェクタとしてｃＧＭＰのみを使用
して、更に２ラウンドのセレクションを行った。Ｇ１８’ＲＮＡと名づけられた
、得られた集団は、ｃＧＭＰの添加に非常に応答性である（図９Ｃ）。

【００７０】 残っているｃＮＭＰに応答するリボザイムを回収するために、ｃＧＭＰをＧ１
７の負のセレクション反応に添加し、正のセレクション反応で残っている３つの
エフェクタを供給した。Ｇ１９によって、ＲＮＡプールはもはやｃＧＭＰには応
答しないが、ｃＣＭＰに対して特異性を示す。それ故に、エフェクタとしてｃＣ
ＭＰのみを使用して更なるラウンドのセレクションを行って、Ｇ２０’ＲＮＡを
製造した。このＲＮＡ集団はｃＣＭＰの存在下で優先的に分解する（図９Ｃ）。

【００７１】 この戦略の繰り返しにおいて、正のセレクションにｃＡＭＰ及びｃＵＭＰを供
給している間、両ｃＧＭＰ及びｃＣＭＰが、Ｇ２０で始まる負のセレクションに
含まれていた。この方法によって、ｃＡＭＰに正的にここで応答するＧ２２で、
ＲＮＡの集団が生じた。ｃＡＭＰのみを使用する更なるラウンドのセレクション
によって、Ｇ２３’ＲＮＡ、即ちこのエフェクタによって独占的にアロステリッ
ク活性化を示す集団が生じた（図９Ｃ）。しかしながら、正のセレクション反応
においてｃＵＭＰのみを使用して、更に６ラウンドのセレクションを行った後は
、このエフェクタによるＲＮＡ分解において特異的な増加は、観察されなかった
。この発見によって、ｃＵＭＰに特異的なリボザイムは、初期集団には存在して
いなかったこと、及び、このエフェクタ特異性を有するリボザイムは、選択的−
増幅法の間に得られる突然変異の結果として、偶然には発生しなかったことが示
された。

【００７２】ｃＧＭＰ、ｃＣＭＰ及びｃＡＭＰを用いるリボザイムの動的調節 Ｇ１８’、Ｇ２０’及びＧ２３’集団からのクローンを、選択されたＲＮＡの
機能を更にキャラクタライズするために配列させた。Ｇ１８集団から検査された
１２のクローンの内、８つは元のランダム−配列ドメイン内にかなりの構造分散
性を示す（図１０Ａ）。面白いことに、全ての個体は、連結モジュールを定義す
る領域内に少なくとも１つの突然変異を維持し、１つのクローンを除く全てがラ
ンダム−配列ドメイン内に欠失を有する。この発見によって、元のプールは、ア
ロステリック機能のためにＲＮＡ構築物のデザインを偏らせる我々の努力にも係
わらず、ｃＮＭＰターゲットに対してアロステリックリボザイムの重要な表示を
与えないであろうことが示される。

【００７３】 クローンｃＧＭＰ−１〜ｃＧＭＰ−４を、触媒活性のために試験し、それぞれ
は、特有の特徴を有するｃＧＭＰの添加に対して正的に応答する（図１０Ｂ）。
エフェクタの不存在下及び存在下で測定されたハンマーヘッド型分解の初期速度
の比較によって（非直線的な速度論に構わず）、ｃＧＭＰ−１はアロステリック
セレクションに使用される条件下で〜５１０フォールドまで活性化されることが
明らかである（図１０Ｃ）。残りの３つのクローンは余り大きくは活性化されな
いが、しかしながら、それぞれはｃＧＭＰで選択的な活性化を示し、残っている
非コグネイトエフェクタ分子では交差反応性を示さない。

【００７４】 同様に、Ｇ２０’及びＧ２３’集団からの個々のクローンは、それぞれｃＣＭ
Ｐ及びｃＡＭＰエフェクタで特異的な活性化を示す。ｃＧＭＰに特異性のＲＮＡ
で観察される通り、単離されたＧ２０’ＲＮＡの配列によって、セレクション法
の過程で顕著な突然変異又は欠失が得られることが明らかになり、それはこれら
の変化はアロステリック機能を生じさせるのに必要であり得ることを示している
（図１０Ｄ）。Ｇ２０’から配列させられた７つ全てのクローンの触媒性能を調
べたが、ｃＣＭＰ−１及びｃＣＭＰ−２のみが、その対応するエフェクタによっ
て活性化されることが観察された（図１０Ｅ及び１０Ｆ）。残りのクローンは、
いずれのエフェクタの存在にも係わらず、弱い触媒活性を表わすが、これはこれ
らのＲＮＡがアロステリック活性化戦略を利用しなくても、セレクション法にお
いてこの段階まで生き残ることを示すものである。

【００７５】 ８つの別個の個体もまた、Ｇ２３’集団から配列させられた１３のクローンの
中で同定された（図１０Ｇ）。また、そのクローンは、ランダム−配列ドメイン
内の元の連結モジュール又は欠失内で突然変異という重要な取得を経験した。Ｇ
２３’集団から調べられた５つのクローンのそれぞれは、ｃＡＭＰの存在に対し
て正的に応答する（図１０Ｈ）。その上、クローンｃＡＭＰ−１〜ｃＡＭＰ−４
は、前のアロステリック構築物で観察されたアロステリック反応速度論と同様の
アロステリック反応速度論を示す（図１０Ｉ）。ｃＵＭＰ依存性リボザイムはこ
のＲＮＡ集団から単離されたが、配列の分散性及び回収されたアロステリックリ
ボザイムの動的特徴によって、重要な可能性が、新規なエフェクタで調節された
ＲＮＡの発生に対して存在することが示される。

【００７６】エフェクタ結合部位による分子認識 代表的なｃＧＭＰ−、ｃＣＭＰ−及びｃＡＭＰ−依存性リボザイムがそれらの
対応するエフェクタの原子構造を直接認識するか否か、又は、それらが反応混合
物に故意でなく導入され得る幾つかの他の物理化学的シグナル剤に応答するか否
かが、主な関心である。ＲＮＡ集団を支配する第一のリボザイムは４つのｃＮＭ
Ｐのいずれにも特異的には応答しないという観察によって、アロステリック活性
化に対する代わりのエフェクタに優先権が与えられるが、反応混合物の酸性化に
対しては感度が高い。リボザイムの活性化の機構はｃＮＭＰの直接的な分子認識
によって媒介されるかどうかを決めるために、アデノシン３’，５’−サイクリ
ック一リン酸、Ｐ１−（２−ニトロフェニル）エチルエステル、ｃＡＭＰの「閉
じ込められた」形体を使用した（図１１Ａ）。閉じ込められたｃＡＭＰは、Ｎｅ
ｒｂｏｎｎｅ等（６７）によって報告されているのと同様のｃＡＭＰのトリエス
テル類似体であり、紫外線光を用いる照射により、加えられたホスホエステル結
合の分解によって解放される。この閉じ込められたエフェクタによって、個々の
ｃＡＭＰ依存性のクローンが、照射によってエフェクタを解放する際に活性化さ
れ得るかどうかを試験するための手段が与えられる。

【００７７】 ｃＡＭＰ依存性のクローンであるｃＡＭＰ−１、ｃＡＭＰ−２及びｃＡＭＰ−
４（図１０Ｉ）はそれぞれ、閉じ込められたエフェクタで示される場合に分解す
るが（データーは図示せず）、これはこれらのＲＮＡのアロステリックな結合部
位は、ｃＡＭＰのこの類似体に存在する化学的変質に適応することを示唆するも
のである。対照的に、ｃＡＭＰ−３クローンは、それが５００μＭの閉じ込めら
れたｃＡＭＰを用いて培養されようが、エフェクタの不存在下でそれが培養され
ようが、同じ速度定数を示す（図１１Ｂ）。多分、ｃＡＭＰ−３のアロステリッ
クな結合部位は、閉じ込められたｃＡＭＰ化合物が隣接するリボザイムを結合し
活性化させる余地を与えない。しかしながら、ｃＡＭＰ−３ ＲＮＡ及び閉じ込
められたｃＡＭＰを含有する混合物を、〜３１２ｎｍに中心のある長波長のＵＶ
光を用いて短い照射をすることによって、リボザイムの機能の顕著な活性化が生
じる。ＵＶで誘導されるその場でのｃＡＭＰの製造によってリボザイムの活性化
が引き起こされるという発見は、ｃＡＭＰがこの特定のアロステリックリボザイ
ムによってエフェクタとして直接的に認識される機構と一致している。

【００７８】 ＲＮＡによるｃＮＭＰエフェクタの分子認識はアロステリックリボザイムの機
能を媒介するかどうかを更に調べるために、ｃＡＭＰが反応混合物からその場で
消耗されるアッセイが確立された（図１２）。その場でのｃＡＭＰの消耗は、サ
イクリックヌクレオチドホスホジエステラーゼ（６８）及びその活性化剤である
カルモジュリンを使用することによって達成された。これらのタンパク質は、独
立して培養される場合にはエフェクタを消耗しないが、組み合わせると、それら
は３’，５’−サイクリックＡＭＰを効率的に加水分解して５’−ＡＭＰを生じ
させる。アッセイ条件下では、１０％未満のｃＡＭＰがホスホジエステラーゼ単
独の存在下での４０分の予備培養の間に破壊されるが、カルモジュリン、即ちサ
イクリックヌクレオチドホスホジエステラーゼ活性の活性化剤を含有する同様の
反応では９０％以上が破壊される。

【００７９】 アロステリックリボザイム ｃＡＭＰ−１は、エフェクタとして５’−ＡＭＰ
に適応しない（図１３参照）。結果として、ｃＡＭＰがホスホジエステラーゼ／
カルモジュリン錯体の触媒作用によって初めに消耗される場合には、このリボザ
イムは活性化されるべきではない。予期される通り、我々はホスホジエステラー
ゼもカルモジュリンも単独ではｃＡＭＰ−１ ＲＮＡのアロステリック活性化を
抑制しないことを見出す（図１２Ａ、線５及び６）。対照的に、アロステリック
リボザイムは、ホスホジエステラーゼ及びカルモジュリンの両方を用いて予備培
養されたｃＡＭＰを含有する反応混合物に添加される場合には、顕著には活性化
されない（図１２Ａ、線７）。その上、線７で使用されたのと当量の反応混合物
中のｃＡＭＰ−１リボザイムは、第二の等分部分のｃＡＭＰの添加によって活性
化され得ることが観察された（図１２Ｂ）。これは両方のタンパク質因子での予
備培養によってリボザイムの活性化の損失が、ｃＡＭＰエフェクタの消耗によっ
て引き起こされ、タンパク質錯体に固有の抑制効果によるものではないことを示
している。ｃＡＭＰのその場での製造又は消耗のいずれかを含む、上記に記載さ
れる両研究によって、アロステリックセレクションによって単離された多くのリ
ボザイムの内の少なくとも幾つかは、それらの対応するｃＮＭＰエフェクタ分子
を直接的に認識するという証拠が与えられる。

【００８０】アロステリックな結合部位による分子識別 分子認識決定基の予備的調査を、代表的なクローンであるｃＧＭＰ−１、ｃＣ
ＭＰ−１及びｃＡＭＰ−１を使用して行った。それぞれのケースで、ＲＮＡはそ
れらの対応するエフェクタの非常に関連する類似体に対して顕著な認識を示す（
図１３）。例えば、ｃＧＭＰ−１ ＲＮＡは、３’−ＧＭＰ及び５’−ＧＭＰ、
即ちｃＧＭＰの加水分解された類似体に対して顕著な識別を示す。同様に、ｃＣ
ＭＰ−１及びｃＡＭＰ−１クローンもまた、それらの対応するｃＮＭＰエフェク
タのサイクリックホスホジエステル構造が、５’Ｏ−Ｐ又は３’Ｏ−Ｐ結合の加
水分解によって開環されるかどうかを認識するこの同じ能力を示す。

【００８１】 これらのアロステリックリボザイムに対する分子認識の決定基をよりはっきり
と決めるためには、更なる実験が必要であるが、それぞれのケースでは開かれた
−環類似体に対する識別は、立体的な相互作用により得ると思われる。対応する
ｃＮＭＰのヌクレオシド及びデオキシヌクレオシド類似体と共に供給されると、
全ての３種類のクローンは少なくとも部分的に活性を残すという観察によって、
リン酸部位はアロステリック活性化に絶対的には必要ではないことが示されてい
る。対照的に、それぞれのエフェクタのヌクレオシド塩基上の多くの官能基の変
性が、アロステリックリボザイムの機能に悪影響を与える（図１３）。それ故に
、ｃＮＭＰエフェクタの塩基部位は、異なるエフェクタ−結合ドメインによる分
子認識に対しては必須であると思われる。

【００８２】ｃＮＭＰ依存性リボザイムの速い活性化 現在までに引き起こされた低分子依存性アロステリックリボザイムの共通する
特徴は、エフェクタの添加によってリボザイムの機能の速い活性化又は失活であ
る（５、７、６５）。速いアロステリックな応答は、実際の用途を見出すべきで
ある、ＲＮＡ分子スイッチに非常に望まれ得る動的特徴である。それ故に、３つ
の代表的なクローンであるｃＧＭＰ−１、ｃＣＭＰ−１及びｃＡＭＰ−１に対す
る活性化の速度論を調べた。それぞれのケースで、リボザイムは、それらの対応
するエフェクタ分子を導入して数秒後以内に活性化されると思われる（図１４）
。リボザイム機能の速い活性化は、適当なシグナル剤の導入によってのいみ、活
性なエフェクタ結合及びリボザイムのコンホメーションを素早く形成する、動的
なＲＮＡ構造を示す。

【００８３】 上記に記載されるクローンのそれぞれは、少なくとも１つの半減期の間直線的
な分解速度論を維持するが（図１４）、これは適当なエフェクタの添加によって
、個々のクローンのＲＮＡの５０％以上が活性化されることを示している。しか
しながら、幾つかの個体に対する自己分解は、僅かな短い反応時間の後に安定期
に到達する。これは重大なミスフォールディングの問題を示し得るものである。
アロステリック活性化の際、調べられた殆どのクローンは、触媒作用の停止前に
２０％〜９０％進行している。

【００８４】結合親和力及び動的範囲 それぞれのアロステリックリボザイムのエフェクタが結合している部位は、Ｒ
ＮＡ−リガンドの相互作用に対する解離定数（ＫＤ）によって記載され得る、別
個の親和力を有するそのリガンドを結合すると考えられる。エフェクタが結合し
ている部位の占有が、特定のアロステリックリボザイムに対する活性化のレベル
と本当に相関関係がある場合、次いでエフェクタの濃度に対する触媒作用速度の
依存性を調べることによって、エフェクタの結合に対する明らかなＫＤが、この
相互作用に対して確定され得る。

【００８５】 この研究で単離されたアロステリックリボザイムによって示される、結合親和
力を包括的に分析するために、図１１〜１３に記載される１０個全てのアロステ
リックリボザイムのエフェクタ濃度−依存性の活性を測定した。明らかなＫＤ値
を、最大値の半分（１／２Ｋ_ｍａｘ）である速度定数を生み出す、エフェクタ濃
度を確定することによって測定した。全てのケースで、明らかなＫＤは、ｉｎ
ｖｉｔｒｏセレクションの間に使用されたそれぞれのエフェクタの濃度の付近で
ある（図１５）。これらの定数は〜２００μＭ（ｃＧＭＰ−３）から〜４ｍＭ（
ｃＣＭＰ−１）の範囲である。比較によって、ＳＥＬＥＸ法（１６、４６〜５３
）によって単離された殆どのリガンドが結合しているＲＮＡはより高い親和力で
結合するが、これはより低いエフェクタ濃度に対するこれらのアロステリックリ
ボザイムの感度の向上が達成され得たことを示すものである。

【００８６】 それぞれのアロステリックリボザイムに対する明らかなＫＤを定義するために
使用されたプロット（図１１）はまた、異なる濃度のエフェクタに対して示され
る速度定数の範囲を明らかにする。アロステリックな応答に対するこの「動的範
囲」は、異なるクローン間で非常に変わり易いが、これはアロステリックリボザ
イムによって示され得る機能の特徴の分散性が実質的であることを示唆するもの
である。予備的な分析から予期される通り（図１０Ｂ）、ｃＧＭＰ−３リボザイ
ムは、ｃＧＭＰに対して劣った速度増加又は「アロステリックな応答」を有する
。結果として、この個体は、１未満のオーダーの大きさの全体的な動的範囲を示
す。対照的に、最も優れた動的範囲を示すクローンは、ｃＧＭＰ−１であり、そ
れは１μＭから１ｍＭまでその速度定数の対数における直線的な増加を維持する
。ｉｎ ｖｉｔｒｏセレクション条件下でのｃＧＭＰ−１に対する速度定数の増
加は、〜５００フォールドであるが、ｃＧＭＰとエフェクタが結合している部位
が飽和した際の全体の速度の増加は、約５０００フォールドである。これは３オ
ーダーより大きい大きさのｃＧＭＰ−１に対する動的範囲に対応する。

【００８７】工学新規なＲＮＡ分子センサ この研究に使用されたアロステリックセレクション戦略（図９Ａ）によって、
分子スイッチとして機能する新規なマルチドメインＲＮＡの単離のための、また
新規なリガンドが結合しているＲＮＡ構造の単離のための、代わりの手法が与え
られる。特定のｃＮＭＰターゲットに応答する多くのアロステリックリボザイム
を同時に単離することが、本明細書中に報告されている。同様に、アロステリッ
クセレクションは、正のセレクション反応における候補のエフェクタ分子として
、金属イオン又は金属錯体からなる混合物を使用することによって、又は、数百
もの有機化合物、タンパク質又は核酸を含有する錯体混合物を使用することによ
って、大量で並列な規模で分子センサを単離するのに使用され得る。実際、ＲＮ
Ａ構造のフォールディングに影響を与え得るいずれかの物理化学的衝撃が、アロ
ステリックリボザイムの機能に対するシグナル剤であり得る。

【００８８】ＲＮＡの構造及び機能分散性 天然のリボザイムの限定された機能と対照的に、タンパク質酵素は、並外れた
精度でかつ桁外れの速度増加で、おびただしいアレイの化学的形質変換に触媒作
用を及ぼす。或る例においてエフェクタ依存性のアロステリックな調節を与える
コンホメーション変化が、タンパク質酵素の異なった生化学的機能に含まれる（
２１）。それらのタンパク質相対物とは異なり、天然のリボザイムは触媒活性の
アロステリックな調節を行うことは知られていない。しかしながら、この研究及
び幾つかのこれまでの研究（５、６、８、９、６１〜６３、６５、６６）の結果
によって、核酸は、様々なエフェクタ化合物に対する応答で触媒活性を調節する
ことが極めて可能であるという証拠が与えられている。これらの発見は、ＲＮＡ
が錯体の触媒機能に対して重要であるのに利用されていない可能性を有し得ると
いうこれまでの示唆（５７〜６０）と一致している。多分、核酸の本当の触媒的
可能性は、独自の生化学的な用途を可能にする合成リボザイムの構築に利用され
得る。

【００８９】 この研究に記載されているアロステリックリボザイムはそれらのアロステリッ
クな応答及び触媒機能を最適にするためにいずれの努力をも受けなかったことに
注目するのが重要である。それらの動的特徴にも係わらず、初めに成功が立証さ
れたアロステリックリボザイムの特性の意味を与えるために、この初期のｉｎ
ｖｉｔｒｏセレクション法によって生じさせられた代表的なクローンが示されて
いる。殆どのケースにおいてそれらのエフェクタ結合親和力及び触媒作用速度が
殆どの用途に供するのにほぼおそらく不充分であるので、この実施例に記載され
るリボザイムは、基本型であると考えられるべきである。多分、アロステリック
なセレクションによって単離されたアロステリックリボザイムの個々のクラスは
、この研究に使用されるものと同様に、同様のｉｎ ｖｉｔｒｏセレクション戦
略を用いて、更に最適化が吟味できるであろう。これによって、様々な用途に対
する効率的な分子センサとしてそれらの開発が結局可能であろう。

【００９０】遺伝子の発現を制御するための含意 遺伝子の発現を正確に制御することは、全ての細胞の通常の機能にとって非常
に重要である。同様に、正確な時間又は空間的コマンドで支配される遺伝子の発
現を意図的に操作することは、分子レベルで生物学的系を制御するのを望む人に
とっては非常に興味深いものである。考えられるところでは、遺伝子発現の調節
は、ＤＮＡからＲＮＡへ、またＲＮＡから最終のタンパク質生成物への情報伝達
の過程のいずれかの段階で生じ得る。実際、遺伝子の入手性のレベルを調節する
ために、また転写後に生じる分子の進行を調節するために使用される、豊富な戦
略を、天然の系は発展させた（６９）。多くのこれらの機構は、遺伝子の発現を
制御するために使用され得る低分子調節剤の開発のためのターゲットになった（
７０）。

【００９１】 幾つかの、細胞の遺伝的制御機構は、ＲＮＡのレベルで発揮されている。例え
ば、天然のアンチセンス相互作用及びＲＮＡ安定性の調節は、遺伝子発現に影響
を与えるのが知られている２つの機構である。アンチセンスオリゴヌクレオチド
及びリボザイムは、これらの２つの機構を利用することによって特異的な遺伝子
の発現に意図的に影響を与えるために研究者によって、広く使用されている。こ
れらの研究手法は、ＲＮＡのターゲットに近づくのを立体的に阻止することによ
ってか、又は破壊のためにＲＮＡをターゲットすることによってのいずれか一方
によって、ＲＮＡ機能を調節する。近年、ｍＲＮＡの翻訳は、アプタマーと或る
染料化合物との間の特異的な相互作用を利用することによって阻止され得ること
が示された（７１）。特に、ヘキスト染料Ｈ３３２５８及びＨ３３３４２を選択
的に結合するＲＮＡアプタマーが、ｍＲＮＡに組み込まれて、その結果これらの
リガンドが細胞に導入される際に遺伝子発現が選択的に阻止された。同様に、ア
ロステリックリボザイムは、ｍＲＮＡに融合させられ得り、その結果対応するエ
フェクタ分子が細胞に導入される際に、リボザイムドメインがその触媒活性を調
節する。それ故に、アロステリックエフェクタ分子が、ｍＲＮＡの安定性を調節
するために使用され得り、従ってターゲット遺伝子の発現に影響を与え得る。

【００９２】 本明細書に記載されるアロステリックセレクションのプロトコルによって、数
百又は更に数千もの化合物のいずれにも応答する新規なアロステリックリボザイ
ムを同時にセレクションするのが可能になる。これによって、ハンマーヘッド型
等の自己分解するリボザイムが、広範囲のエフェクタの刺激に応答するようにさ
せられ得るかどうか、及び、得られるアロステリックな構築物が新規な遺伝子制
御因子としてｍＲＮＡで組み込まれ得るかどうかを試験するための手段が与えら
れる。これが実行可能であると証明されると、次いでほぼいかなる天然又は生物
学的に利用可能な化合物も、遺伝的に形質転換を起こした有機物における、遺伝
子の発現を意図的に制御するための候補である。

【００９３】 上記説明は、本発明をどのように実施するかを、当業者に教示する目的のため
のものであり、詳細な説明を読んだ際に当業者に明らかになるであろう、全ての
それらの明らかな修正及び変形を詳述するのを意図するものではない。しかしな
がら、全てのこの様な明らかな修正及び変形は、特許請求の範囲に定義される本
発明の概念に含まれることを意図している。特許請求の範囲は、文脈が特にその
正反対のことを示さない限りは、そこで意図されている目的と合致するのに有効
な、如何なる結論においても請求された成分及び工程を含むことが意図されてい
る。 文献：

【００９４】

【表３】

【００９５】

【表４】

【００９６】

【表５】

【００９７】

【表６】

【００９８】

【表７】

【配列表】

【図面の簡単な説明】

【図１】 図１は、アプタマードメイン及びアロステリックなハンマーヘッド型リボザイ
ムのアロステリックセレクションのための、初期集団のデザインを示す（ＳＥＱ
ＩＤ ＮＯ １及び２）。ｘヌクレオチド（ｘは如何なる長さでもよい）であ
るランダム配列の領域が、触媒的な核酸モチーフに直接ついている（Ａ）か、又
は、クラスＩの誘導モジュールなどの存在している連結モジュールによってつい
ている（Ｂ）。Ｎは、いずれかのヌクレオチドのアイデンティティーを表わし、
矢印はハンマーヘッド型リボザイムドメイン中の分解部位を示している。代わり
の実施形態においては（図示せず）、他のリボザイム及びデオキシリボザイムモ
チーフが使用される。

【図２】 図２は、ＦＭＮに感度の高いアロステリックリボザイムのための、組み合わさ
れたモジュールの合理的なデザイン、及び、ｉｎ ｖｉｖｏセレクションを説明
する。（Ａ）８つのヌクレオチド（Ｎ）からなるランダム配列の架橋によって、
ＦＭＮに結合しているアプタマー（箱の中、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）に結合し
ている、ハンマーヘッド型リボザイムからなる３部の構築物。修飾されていない
リボザイムを形成する３つのステムが、Ｉ、ＩＩ及びＩＩＩで示されており、Ｒ
ＮＡの分解部位は、矢印で示されている。ランダム化されている架橋は、リボザ
イムのステムＩＩの部分的な置換として、及び、アプタマーのためのフランキン
グステムとしての両方として働く。触媒核のすぐ隣のＧ−Ｃ塩基対は、触媒活性
を最大にするために、ハンマーヘッド型リボザイムに必要とされる（９、４２）
。ＦＭＮで誘導され得るアロステリックリボザイム（Ｂ）及びＦＭＮで抑制され
るアロステリックリボザイム（Ｃ）に対するセレクションによって、ＦＭＮの存
在に対してそれぞれ、正又は負のいずれか一方で応答するＲＮＡ集団が生じた。
初期のＲＮＡプール（Ｇ０）及び連続するＲＮＡ集団（Ｇ１からＧ６）が、同定
される。

【図３】 図３は、個々のアロステリックリボザイムに対する架橋配列及び動的パラメー
ターを示す。（Ａ）Ｇ６から単離された８つのクラスの誘導因子に対する、配列
及び対応するリボザイムの速度定数。ＦＭＮの不存在下（白丸）又は存在下（黒
丸）での、自己分解に対する観察された速度定数の対数が、それぞれのクラスに
対してプロットされている。それぞれの架橋に対して描かれている塩基対の図式
は、ステムＩＩに残っているＧ−Ｃ塩基対に対して塩基対シフトが生じなかった
と仮定することによって生じた。ミスフォールディングが２０％以上であること
を示すクラス（＊）、及び、アプタマードメインのステム−ループ領域に異質の
突然変異が存在するクラス（＋）が示されている。Ｈ１は、最大の触媒活性を示
し、かつＦＭＮの存在によって影響を受けないままである、修飾されていないハ
ンマーヘッド型リボザイム（４、７、８）である。（Ｂ）ＦＭＮで誘導され得る
リボザイムのそれぞれのクラスに対してリガンドの存在下で達成される触媒活性
（Ｋ_obs ^＋／Ｋ_obs ⁻）のフォールド−活性化。（Ｃ）Ｇ６から単離された５つの
クラスの誘導因子に対する、配列及び対応するリボザイムの速度定数。ヌクレオ
チドの欠失は、ダッシュ記号として表わされている。（Ｄ）ＦＭＮで抑制される
リボザイムのそれぞれのクラスに対してリガンドの存在下で達成される触媒活性
（Ｋ_obs−／Ｋ_obs＋）のフォールド−抑制。

【図４】 図４は、アロステリックリボザイムの速いリガンド依存性の調節を説明する。
クラスＩ誘導因子（Ａ）又はクラスＩＩ抑制因子（Ｂ）のいずれかを有する、３
部からなるリボザイム構築物が示されている。アプタマー及びリボザイムドメイ
ンに対する配列は、図２に示されている。ＦＭＮの存在下又は不存在下のこれら
のリボザイムの性能は、プロット（Ｃ）及び（Ｄ）から明らかであり、それはＦ
ＭＮ付加に対する時間、対、分解しないで残っているフラクションリボザイムの
自然対数を示している。挿入されたプロットは、ＦＭＮ付加へのリボザイムの応
答の広げられた視野を与える。

【図５】 図５は、クラスＩ誘導因子（Ａ）によって媒介されるアロステリックな調節の
ために提案された「スリップ−構造」を示すものであり、クラスＩＩ誘導因子（
Ｂ）が説明されている。ＦＭＮで調節されたリボザイムのリガンドが結合した部
位及びリガンドが結合していない部位の、提案されたステムＩＩの第二の構造が
示されている。それぞれアプタマー及びリボザイムドメインからなる、左側−及
び右側−フランキング配列は、描かれていない。アスタリスクは、触媒を担持す
るために対にならなくてはならないハンマーヘッド型リボザイムのＧ及びＣ残さ
、並びに、リガンドが結合する際に対になるＦＭＮアプタマーのＡ及びＧ残さを
表わす。また、クラスＩ誘導モジュール（Ｃ；Ｉ−１からＩ−３、ＳＥＱ ＩＤ
ＮＯ ４〜６）又はクラスＩＩ抑制モジュール（Ｄ；ＩＩ−１及びＩＩ−２、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ７）のために提案された、活性又は不活性なスリップ構造
を擬態するためにデザインされたステムＩＩ因子を含有する２分子リボザイム構
築物も示されている。太線は、架橋因子を形成するヌクレオチドを同定するもの
である。所望の塩基対コンホメーションを補強するためにＩ−３内に造られた突
然変異を、囲んである。

【図６】 図６は、クラスＩ誘導因子のモジュール特性を説明する。（Ａ）ＦＭＮ、テオ
フィリン、又は、ＡＴＰアプタマー（それぞれ、構築物Ｉ（ｆ）、Ｉ（ｔ）及び
Ｉ（ａ））のいずれかを含有するアロステリックリボザイム構築物の配列及び第
二の構造。それぞれのアプタマー（アスタリスクによって表わされている）の末
端のＡ・Ｇ又はＧ−Ｃ塩基対は、リガンドの結合によって安定化させられた相互
作用である。（Ｂ）リガンドで誘導されるリボザイムの自己分解の特異性の質的
評価。内部が^３２Ｐ−標識された構築物を、ＦＭＮ（Ｆ；２００μＭ）、テオフ
ィリン（Ｔ；１ｍＭ）、又は、ＡＴＰ（Ａ；１ｍＭ）の不存在下（−）又は存在
下で、１５分間２３℃で培養した。（Ｃ）それぞれ、それと同じ性質のリガンド
の不存在下又は存在下で、それぞれのアロステリックリボザイム構築物に対して
測定された、動的パラメーターＫ_obs ⁻（白丸）及びＫ_obs ^＋（黒丸）。（Ｄ）リ
ボザイム機能のアロステック活性化が、それぞれの構築物に対して述べられる。

【図７】 （Ａ）テオフィリンに感度の高いアロステリックなハンマーヘッド型リボザイ
ムのｉｎ ｖｉｔｒｏセレクションに対する初期集団（Ｇ０）。テオフィリンア
プタマー（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８）は、１０のヌクレオチドからなるランダム
配列領域を通ってハンマーヘッド型リボザイムのステムＩＩに付けられている。
Ｎは、いずれかのヌクレオチドのアイデンティティを表わす。自己分解の部位は
、矢印によって示されている。（Ｂ）テオフィリンで活性化されたアロステリッ
クなハンマーヘッド型リボザイムのｉｎ ｖｉｔｒｏセレクション及び増幅。テ
オフィリンの不存在下（白抜きの棒）又はテオフィリンの存在下（黒塗りの棒）
で分解するそれぞれの集団のフラクションが、左軸に示されているのに対して、
対応する自己分解に対する速度定数が、右軸に示されている。

【図８】 図８は、図１に示されているのと同様のアロステリックリボザイム構造に対す
る３部からなるデザインを説明する。（Ａ）ＦＭＮに感度の高いアロステリック
リボザイム（６６）に対する配列及び第二の構造。この構築物において、ｃｍ＋
ＦＭＮ１連結モジュール（箱の中）は、リボザイムとアプタマードメインとを分
けている。この連結モジュール（ｃｍ）は、フラビンモノヌクレオチド（ＦＭＮ
）の存在下でアロステリック活性化（＋）を行うためにこれまでに同定された第
１の配列クラス（１）である。ハンマーヘッド型リボザイムの活性（Ｉ、ＩＩ及
びＩＩＩ）に必要とされる塩基対の因子は、Ｈｅｒｔｅｌ等（７２）に従って、
標識付けられる。矢印は、ハンマーヘッドで媒介される分解の部位を同定する。
（Ｂ）ｉｎ ｖｉｔｒｏセレクションを開始させるためのプールとして使用され
るランダム化されたアプタマードメインを有する３部からなる構築物。Ｎ_２５は
、ランダムな塩基アイデンティティを有する２５のヌクレオチドを表わす。

【図９】 図９は、新規なエフェクタ特異性を有するＲＮＡセンサのアロステリックなセ
レクション図式及び単離を示す。（Ａ）前駆体ＲＮＡは、エフェクタの不存在下
で負のセレクションを受ける（１）。分解していないＲＮＡは、ＰＡＧＥによっ
て単離され、４つのｃＮＭＰｓの混合物の存在下で正のセレクションを受ける。
分解させられたＲＮＡは、二本鎖のＤＮＡ鋳型を生じさせるために、ＲＴ−ＰＣ
Ｒによって増幅させられる（ＩＩ）。得られるＤＮＡは、負のセレクション及び
正のセレクションの次のラウンドを受ける（ＩＶ）、ＲＮＡ分子の新規な集団を
生じさせるために、バクテリオファージＴ７ＲＮＡポリメラーゼ（Ｔ７ ＲＮＡ
Ｐ）を使用して転写させられる（ＩＩＩ）。（Ｖ）セレクションの所望のラウン
ドからの二本鎖のＤＮＡは、クローンとして発生させられ、更なる分析のために
配列させられる。箱内のＴ７は、Ｔ７ＲＮＡＰに対する二本鎖のプロモーター配
列を表わす。（Ｂ）ｉｎ ｖｉｔｒｏセレクションの過程のリガンド特異性のア
ロステリックリボザイムの非常事態は、セレクションのそれぞれのラウンド（Ｇ
１からＧ２８）に対する分解収率（エフェクタの不存在に対する存在）の割合を
プロットすることによって反映される。セレクションの間に出現するリガンドに
感度の高い集団の特異性は、棒で表わされている。アスタリスクは、正のセレク
ション反応を開始する前にＲＮＡ試料を酸性化するのを避けるための、セレクシ
ョンプロトコルにおける変化を表わす。短剣符は、その前のラウンドにおいてエ
フェクタとして機能するｃＮＭＰが、続くラウンドにおける負のセレクション反
応に加えられる、セレクションのラウンドを同定する。線は、１の分解比を示す
ものであり、それは全体としてその集団の分解活性が、エフェクタ混合物を好ま
ないことが示された場合の期待値を表わす。（Ｃ）ｃＮＭＰｓによるＲＮＡの分
解の選択的活性化。集団Ｇ１８’、Ｇ２０’及びＧ２３’を表わす内部が^３２Ｐ
−標識されたＲＮＡのトレース量を、エフェクタの不存在下（−）又は５００（
指示される通りの、３’，５’−環状モノヌクレオチドＡ、Ｇ、Ｃ及びＵのＭ）
の存在下で、ｉｎ ｖｉｔｒｏセレクションに使用された反応緩衝液中（５０ｍ
Ｍ、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、２３℃、及び、２０ｍＭ ＭｇＣｌ_２）で
、１５分間培養した。反応生成物は、１０％ＰＡＧＥを変性させることによって
分離させられ、ＰｈｏｓｐｈｏｒＩｍａｇｅｒ及びＩｍａｇｅＱｕａｎｔ ソフ
トウェア（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ社製）を使用して、バンドを
明視化し、定量した。白抜き矢印及び黒塗り矢印は、それぞれ前駆体及び５’分
解生成物を同定する。３’分解生成物は、顕著に大き目のＲＮＡ及び５’−分解
フラグメントより大きい電気泳動移動度を有し、それ故に画像上に存在しない。

【図１０】 図１０は、ｃＮＭＰｓによるハンマーヘッド型リボザイムのアロステリックな
調節を示す。（Ａ）Ｇ１８’ＲＮＡ集団（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ９〜１６）から単
離された８つの異なるクローンに対する、元の連結モジュールドメイン（箱内）
及び元のランダム配列のドメイン（Ｎ_２５）の配列。Ｎ_２５ドメイン内のダッシ
ュは、この領域内のどこかに生じたヌクレオチドの欠失を表わす。括弧内の数は
、同じ配列を有する同じクローンの数を報告するものである。全ての単離された
ものは、エフェクタ応答性のアロステリック機能（＋）を有するものとして同定
され、エフェクタの添加に応答しないことを示す（−）か、又はアロステリック
機能が測定されなかった（ＮＤ）。ほぼ全ての場合において、連結モジュールド
メインは最低１つの突然変異を得たことに注意しなさい。（Ｂ）Ｇ１８’ＲＮＡ
集団から単離された個々のアロステリックリボザイムのリガンド依存性分解。Ｒ
ＮＡ前駆体（白抜きの矢印）は、それが存在しないのと比べて、５００μＭのｃ
ＧＭＰの存在下で、より多めの量の５’−分解生成物（黒塗りの矢印）を製造す
る。このアッセイは、ｉｎ ｖｉｔｒｏセレクション条件下で行なわれ、結果と
して、エフェクタの不存在に対するエフェクタの存在下での生成物の収率は、選
択的な−増幅過程の間それぞれのリボザイムが維持する利点を表わす。反応生成
物は、分離され、図９Ｃへの上記凡例に記載される通り明視化された。（Ｃ）５
００μＭのエフェクタの存在下（Ｋ_obs＋、黒丸）又は不存在下（Ｋ_obs−、白丸
）での、Ｂに表わされたクローンに対する初期速度定数が、対数目盛り上に表わ
されている。これらの速度定数は、ｉｎ ｖｉｔｒｏセレクション条件下での５
−〜５１０−フォールドの範囲に渡る「オン／オフ」比を明らかにする。（Ｄ〜
Ｆ）ｃＣＭＰ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ１７〜２３）によるＧ２０’ハンマーヘッド
型リボザイムのアロステリックな調節。（Ｇ〜Ｉ）ｃＡＭＰ（ＳＥＱ ＩＤ Ｎ
Ｏ２４〜３１）によるＧ２３’ハンマーヘッド型リボザイムのアロステリックな
調節。ｃＣＭＰ−及びｃＡＭＰ−依存性リボザイムの分析の詳細は、Ａ〜Ｃに記
載される通りである。

【図１１】 図１１は、ｃＡＭＰ−３ ＲＮＡによるｃＡＭＰの分子認識に関連する情報を
表わす。（Ａ）閉じ込められたｃＡＭＰ類似体アデノシン３’，５’−サイクリ
ック一リン酸、即ちＰ’−（２−ニトロフェニル）エチルエステルは、長波長の
ＵＶ光を用いる簡単な照射によって３’，５’−ｃＡＭＰに変換される。（Ｂ）
閉じ込められていないｃＡＭＰによるｃＡＭＯ−３ ＲＮＡのアロステリック活
性化。プロットは２ｍＭの閉じ込められたｃＡＭＰの存在下（四角及び丸）又は
不存在下（三角）で、異なる培養時間で分解しないまま残っている前駆体ＲＮＡ
のフラクションの自然対数を表わす。影のついた記号及び黒塗りの記号は、それ
ぞれＵＶ照射の間又は後に集められたデーターを表わす。照射された混合物は、
ｔ＝３．５〜４．５分の間（破線）に露光された。リボザイムは、ｃＡＭＰの存
在下で照射された場合（黒塗りの記号）にのみ活性化される。

【図１２】 図１２は、ｃＡＭＰ−１ ＲＮＡによるｃＡＭＰの分子認識に関連するデータ
ーを与えるものである。（Ａ）ｃＡＭＰ−１アロステリックリボザイムの添加前
の反応緩衝液からのｃＡＭＰのその場での消耗の影響を、３’，５’−サイクリ
ックヌクレオチドホスホジエステラーゼ及びカルモジュリンを使用して測定した
。前駆体ＲＮＡ（白い矢印）は、ｃＡＭＰを含有する反応混合物中で培養された
場合（＋、レーン３及び４）、又は、ｃＡＭＰを含有し、かつホスホジエステラ
ーゼ（ｐｈｏ）又はカルモジュリン（ｃａｌ）のいずれかを含有する反応混合物
中で培養された場合（それぞれ、レーン５及び６）に、活性化する。混合された
場合、ホスホジエステラーゼ及びその活性化剤であるカルモジュリンは、ｃＡＭ
Ｐの９０％を超える加水分解を促進させて、３０℃での４０分の予備培養（ｐｒ
ｅｉｎｃ）の間に５’−ＡＭＰを生じる。ｃＡＭＰ−１ＲＮＡ、エフェクタ（下
記図１３参照）として５’−ＡＭＰを適合しない、ｃＡＭＰ−１ ＲＮＡは、こ
れらの条件下ではもはや活性化されない（レーン７）。反応生成物は分離され、
図９Ｃへの凡例に記載される通り明視化された。（Ｂ）ｃＡＭＰの元の試料の徹
底的な消耗の後、５００μＭまで（矢印によって表わされる）ｃＡＭＰを添加す
ることによる、ｃＡＭＰ−１活性化を表わすプロット。この反応はＡのレーン７
にあらわされる反応の導関数であるが、ホスホジエステラーゼ／カルモジュリン
混合物を使用した８０分の予備培養が、ｃＡＭＰの初期入力をより完全に消耗す
るために使用された場合である。黒丸及び白丸は、それぞれｃＡＭＰの第二の部
分を添加する前及び後に収集されたデーター点である。

【図１３】 図１３は、ｃＮＭＰ依存性のアロステリックリボザイムによる選択的な分子認
識のパターンを示す。３つのアロステリックリボザイムｃＧＭＰ−１、ｃＣＭＰ
−１及びｃＡＭＰ−１のそれぞれを、エフェクタの不存在下（−）、それと同じ
性質のｃＮＭＰエフェクタ５００μＭの存在下、又は、異なるエフェクタの類似
体のパネルを用いて同様に、ｉｎ ｖｉｔｒｏセレクション条件下で、１５分間
培養した。内部が^３２Ｐ−標識された前駆体ＲＮＡ及び得られる５’−分解フラ
グメントは、それぞれ白い矢印及び黒い矢印によって同定されている。Ｇ、Ｃ及
びＡは、ヌクレオシド グアノシン、シチジン、及び、アデノシンをそれぞれ表
わす。ｃＩＭＰはイノシン３’，５’−サイクリック一リン酸を表わす。反応生
成物は分離され、図９Ｃへの凡例に記載される通り明視化された。

【図１４】 図１４は、アロステリックリボザイムの速いエフェクタで媒介される活性化を
示す。示される通りに内部が^３２Ｐ−標識された前駆体ＲＮＡを含有する反応を
、エフェクタの不存在下で短時間培養し、次いでそれらの対応するエフェクタ５
ｍＭを添加し（破線）、反応を続けた。ｘ−軸は、エフェクタの添加に対する時
間を表わす。前駆体（白い矢印）及び得られる５’−分解フラグメント（黒い矢
印）は分離され、図９Ｃへの凡例に記載される通り明視化され、定量された。残
っている前駆体のフラクションの自然対数は、エフェクタの添加の前（白丸）又
は後（黒丸）に生じたそれぞれのデーター点に対してプロットされている。尚、
傾きの変化は、それぞれのリボザイムのアロステリックな応答を表わす。

【図１５】 図１５は、様々なアロステリックリボザイムに対するエフェクタの結合親和力
及び動的範囲をグラフにしたものである。エフェクタ濃度の対数に対する、リボ
ザイムの分解に対する速度定数の対数を、図１０に示される１０のクローンのそ
れぞれに対してプロットする。それぞれのクローンに対する明らかなＫＤに対す
る最小限可能な値は、それぞれのプロット（１０ｍＭのエフェクタでのＫ_obsは
Ｋ_ｍａｘを表わすと仮定した）のｘ−軸上の影のついた矢印の位置によって表わ
されている。エフェクタの濃度が段々に増加することにほぼよってもたらされる
、速度定数の差異は、それぞれのクローンに対する動的範囲を表わす。例えば、
ｃＡＭＰ−１に対するｌｏｇＫ_obsは、エフェクタの不存在下（図３Ｉ）で−３
からエフェクタの飽和の際の−０．５まで増加する。エフェクタの異なる濃度に
よってほぼもたらされる速度定数の変化は、〜３００フォールドのｃＡＭＰ−１
に対する動的範囲に対応する。破線は、ｉｎ ｖｉｔｒｏセレクションの間に使
用されるエフェクタ（５００μＭ）の濃度を表わす。

【図１６】 図１６は、グリッドアッセイにおける本発明の非常に選択的なマルチドメイン
ポリヌクレオチドを用いて調製された反応性ＤＮＡバイオチップを表わす。示さ
れるセンサは、標準の核酸固定化技術を使用して、表面上に異なるリガンドに高
感度なセンサを配列することによる、示される通りのチップに適用させられ、そ
のチップは、様々な電位のエフェクタ分子を含有する試料に晒される。Ｂ１９、
Ｃ３、Ｇ５、Ｇ９、Ｐ１５及びＳ２を表わしたセンサに応答する化合物は、しき
いレベル以上の濃度で存在していることが判った。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｇ０１Ｎ 33/566 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＡＵ，ＣＡ，Ｊ Ｐ，ＵＳ Ｆターム(参考） 2G045 AA40 DA12 DA13 DA14 FB02 4B024 AA11 AA19 BA07 CA04 CA11 GA30 HA14 HA19 4B033 NA01 NA22 NB12 ND03 ND08 NG09 4B050 CC03 CC04 DD20 LL03 4B063 QA01 QA13 QQ42 QQ52 QR01 QR32 QR55 QR62 QS02 QS34

Claims (20)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 アクチュエータドメイン、レセプタドメイン、及び、架橋ド
   メインからなる、精製された機能性ポリヌクレオチドであって、シグナル剤を有
   するレセプタドメインの相互作用によって、アクチュエータドメインの活性を調
   節する架橋ドメイン中にコンホメーション変化を引き起こすことを特徴とする、
   前記ポリヌクレオチド。
2. 【請求項２】 シグナル剤が、該レセプタドメインに結合するリガンドであ
   る、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
3. 【請求項３】 アクチュエータドメインの活性が、触媒的である、請求項１
   に記載のポリヌクレオチド。
4. 【請求項４】 少なくとも２つのドメインが、オーバーラップしていない、
   請求項１に記載のポリヌクレオチド。
5. 【請求項５】 少なくとも２つのドメインが、部分的に又は完全にオーバー
   ラップしている、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
6. 【請求項６】 ＲＮＡである、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
7. 【請求項７】 ハンマーヘッド型リボザイムである、請求項６に記載のポリ
   ヌクレオチド。
8. 【請求項８】 ＤＮＡである、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
9. 【請求項９】 アクチュエータドメインが、レセプタドメインへの化学物質
   の結合によって引き起こされる触媒活性を示す、請求項１に記載のポリヌクレオ
   チド。
10. 【請求項１０】 請求項１、２、３、４、５、６、７、８又は９に記載のポ
    リヌクレオチドからなるバイオセンサ。
11. 【請求項１１】 ポリヌクレオチドが、固体担体に付着している、請求項１
    ０に記載のバイオセンサ。
12. 【請求項１２】 請求項１、２、３、４、５、６、７、８又は９に記載のポ
    リヌクレオチドと、試料を接触させることからなる、試料中のリガンドの存在又
    は不存在、若しくは、その濃度を検出するための方法。
13. 【請求項１３】 化学反応を観察するこによって、リガンドの存在又は不存
    在、若しくは、その濃度が測定される、請求項１２に記載の方法。
14. 【請求項１４】 ポリヌクレオチドの立体配置又は機能の変化を観察するこ
    によって、リガンドの存在又は不存在、若しくは、その濃度が検出される、請求
    項１２に記載の方法。
15. 【請求項１５】 シグナル剤の存在又は不存在に応答するポリヌクレオチド
    の調製方法であって、レセプタドメインとシグナル剤の相互作用によって、アク
    チュエータドメインの活性を調節する架橋ドメイン中にコンホメーション変化を
    引き起こすように、ポリヌクレオチドアクチュエータドメイン、レセプタドメイ
    ン、及び、架橋ドメインを共に結合させることを特徴とする、前記方法。
16. 【請求項１６】 レセプタドメインが、リガンドが結合している部位を有し
    、かつ、リガンドの結合によって、アクチュエータドメインの触媒活性を刺激す
    る架橋ドメイン中にコンホメーション変化が引き起こされる、請求項１５に記載
    の方法。
17. 【請求項１７】 アクチュエータドメイン、レセプタドメイン、及び、架橋
    ドメインを有し、かつ、試料中のシグナル剤に応答性のポリヌクレオチドのスク
    リーニング法であって、ランダムな配列を有するレセプタドメインに、定められ
    た特性を有する対応するアクチュエータドメインの活性を調節する、定められた
    特性を有する架橋ドメインを結合させ、かつ、その様に構築されたポリヌクレオ
    チドと共に試料を培養して、アクチュエータドメインの活性の調節を観察するこ
    とによって、該シグナル剤に応答性であるポリヌクレオチドを同定することを特
    徴とする、前記方法。
18. 【請求項１８】 レセプタドメインが、リガンドが結合している部位を有し
    、かつ、リガンドの結合によって、アクチュエータドメインの触媒活性を刺激す
    る架橋ドメイン中にコンホメーション変化が引き起こされる、請求項１７に記載
    の方法。
19. 【請求項１９】 請求項１５、１６、１７又は１８のいずれか一項に記載の
    ＲＮＡセンサの調製方法。
20. 【請求項２０】 請求項１５、１６、１７又は１８のいずれか一項に記載の
    ＤＮＡセンサの調製方法。