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ES2969956T3 - Lípidos y composiciones lipídicas para el suministro de agentes activos - Google Patents

Lípidos y composiciones lipídicas para el suministro de agentes activos Download PDF

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ES2969956T3
ES2969956T3 ES15775528T ES15775528T ES2969956T3 ES 2969956 T3 ES2969956 T3 ES 2969956T3 ES 15775528 T ES15775528 T ES 15775528T ES 15775528 T ES15775528 T ES 15775528T ES 2969956 T3 ES2969956 T3 ES 2969956T3
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lipid
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methyl
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ES15775528T
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Rohan Eric John Beckwith
Luis Brito
Brian Addison Dechristopher
Gabriel Grant Gamber
Andrew Geall
Thomas Zabawa
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Novartis AG
Original Assignee
Novartis AG
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Abstract

Esta invención proporciona un compuesto de fórmula (I), o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en la que RA, RB, R2 y R4 se definen en el presente documento. Los compuestos de fórmula (I) y sus sales farmacéuticamente aceptables son lípidos catiónicos útiles en la administración de agentes biológicamente activos a células y tejidos. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Lípidos y composiciones lipídicas para el suministro de agentes activos
CAMPO DE LA INVENCIÓN
Esta invención se refiere a los compuestos lipídicos catiónicos y a las composiciones que comprenden dichos compuestos. Esta invención también se refiere a los procesos para la fabricación de tales compuestos y composiciones, y a los métodos y usos de tales compuestos y composiciones, por ejemplo, para suministrar agentes biológicamente activos, tales como agentes de ARN, a las células y tejidos.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
El suministro de agentes biológicamente activos (incluidos los compuestos terapéuticamente relevantes) a los sujetos a menudo se ve obstaculizada por dificultades en los compuestos que llegan a la célula o el tejido objetivo. En particular, el tráfico de muchos agentes biológicamente activos en células vivas está altamente restringido por los complejos sistemas de membrana de las células. Estas restricciones pueden dar como resultado la necesidad de utilizar concentraciones mucho más altas de agentes biológicamente activos de lo que es deseable para lograr un resultado, lo que aumenta el riesgo de efectos tóxicos y efectos secundarios. Una solución a este problema es utilizar moléculas portadoras específicas y composiciones portadoras que permiten la entrada selectiva en la célula. Los portadores de lípidos, los polímeros biodegradables y varios sistemas de conjugados se pueden utilizar para mejorar el suministro de agentes biológicamente activos a las células.
Una clase de agentes biológicamente activos que es particularmente difícil de suministrar a las células es un agente bioterapéutico (incluyendo nucleósidos, nucleótidos, polinucleótidos, ácidos nucleicos y derivados, tales como agentes de ARN). En general, los ácidos nucleicos son estables sólo por una duración limitada en células o plasma. El desarrollo de la interferencia del ARN, terapia de iARN, terapia de ARNm, fármacos de ARN, terapia antisentido, terapia génica y vacunas basadas en ácido nucleico (por ejemplo, vacunas de ARN), entre otras, han aumentado la necesidad de un medio eficaz de introducir agentes activos de ácido nucleico en las células. Por estas razones, las composiciones que pueden estabilizar y suministrar agentes basados en ácido nucleico en las células son de particular interés.
Los enfoques más estudiados para mejorar el transporte de ácidos nucleicos extraños a las células implican el uso de vectores virales o formulaciones con lípidos catiónicos. Los vectores virales se pueden usar para transferir genes de manera eficiente a algunos tipos de células, pero generalmente no se pueden usar para introducir moléculas sintetizadas químicamente en las células.
Un enfoque alternativo es utilizar composiciones de suministro que incorporan lípidos catiónicos que interactúan con un agente biológicamente activo en una parte e interactúan con un sistema de membrana en otra parte. Se informa que tales composiciones proporcionan liposomas, miscelles, lipoplexes o nanopartículas lipídicas, dependiendo de la composición y el método de preparación (para las revisiones, véase Felgner, 1990, Advanced Drug Delivery Reviews, 5, 162-187; Felgner, 1993, J. Liposome Res., 3, 3-16; Gallas, 2013, Chem. Soc. Rev., 42, 7983-7997; Falsini, 2013, J. Med. Chem. dx.doi.org/10.1021/jm400791q; y sus referencias).
Desde la primera descripción de los liposomas en 1965 por Bangham (J. Mol. Biol. 13, 238-252), ha habido un interés sostenido y un esfuerzo en el desarrollo de sistemas de portadores basados en lípidos para el suministro de agentes biológicamente activos (Allen, 2013, Advanced Drug Delivery Reviews, 65, 36-48). El proceso de introducción de ácidos nucleicos funcionales en las células cultivadas mediante el uso de liposomas con carga positiva fue descrito por primera vez por Philip Felgner et al. Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 84, 7413-7417 (1987). El proceso fue posteriormente demostradoin vivopor K. L. Brigham et al., Am. J. Med. Sci., 298, 278-281 (1989). Más recientemente, las formulaciones de nanopartículas lipídicas se han desarrollado con eficacia demostradain vitroein vivo.(Falsini, 2013, J. Med. Chem. dx.doi.org/10.1021/jm400791q; Morrissey, 2005, Nat. Biotech., 23, 1002-1007; Zimmerman, 2006, Nature, 441, 111-114.; Jayaraman, 2012, Angew. Chem. Int. Ed., 51, 8529-8533.)
Las formulaciones lipídicas son portadores atractivos ya que pueden proteger las moléculas biológicas de la degradación mientras mejoran su absorción celular. De las diversas clases de formulaciones lipídicas, las formulaciones que contienen lípidos catiónicos se utilizan comúnmente para suministrar polianiones (por ejemplo, ácidos nucleicos). Tales formulaciones se pueden formar usando lípidos catiónicos solos y, opcionalmente, incluyendo otros lípidos y anfifilos, tales como fosfatidiletanolamina. Es bien sabido en la técnica que tanto la composición de la formulación lipídica como su método de preparación afectan la estructura y el tamaño del agregado resultante (Leung, 2012, J. Phys Chem. C, 116, 18440-18450).
La encapsulación de compuestos aniónicos usando lípidos catiónicos es esencialmente cuantitativa debido a la interacción electrostática. Además, se cree que los lípidos catiónicos interactúan con las membranas celulares con carga negativa que inician el transporte de la membrana celular (Akhtar et al., 1992, Trends Cell Bio., 2, 139; Xu et al., 1996, Biochemistry 35, 5616). Además, se cree que la forma molecular, la conformación y las propiedades de los lípidos catiónicos proporcionan una mayor eficiencia de suministro de los compartimentos endosómicos al citosol (Semple, 2010, Nat. Biotech, 28, 172-176; Zhang, 2011,27, 9473-9483).
EP1927584 divulga un portador que comprende un núcleo de fenilo que tiene un sitio de reacción, A, que es capaz de reaccionar con otro compuesto, y un grupo de cadena larga unida a través de un enlace de oxígeno en cada una de las posicionesortoyparaal sitio de reacción. Los portadores ahí descritos se utilizan para la separación, particularmente en la síntesis de oligopéptidos. Kitada et al (Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 21,2011,4476-4479; Org Lett Vol 14. No. 23. 2012) divulgan las etiquetas hidrófobas, incluyendo el alcohol 2,4-didocosiloxibencílico, y su uso en la síntesis en fase líquida de péptidos.<w>O 2013/086534 divulga compuestos lipídicos catiónicos y composiciones lipídicas que comprenden los mismos, que son útiles en el suministro de agentes biológicamente activos como agentes de ARN a las células y tejidos. Mochizuki et al (Bull. Chem. Soc. Jpn. Vol. 85, No.3, 354-359 (2012)) divulga lípidos aromáticos útiles como reactivos de transfección que llevan una amina primaria, sal de amonio cuaternario, o grupo de cabeza de etilendiamina con diferente longitud de cola de alquilo en posicionesmeta-metaometa-para.
Aunque se ha demostrado que el uso de lípidos catiónicos para el suministro celular de agentes biológicamente activos tiene varias ventajas, todavía hay una necesidad de más lípidos catiónicos que faciliten el suministro sistémico y local de agentes biológicamente activos, tal como el ARNm y los agentes iARN a las células. También hay una necesidad de lípidos catiónicos que, en relación con los lípidos catiónicos que se conocen en la técnica, mejoran el suministro sistémico y local de agentes biológicamente activos a las células. Existe una necesidad adicional de formulaciones lipídicas que tengan características físicas optimizadas para mejorar el suministro sistémico y local de agentes biológicamente activos a órganos específicos y a tumores, especialmente tumores fuera del hígado.
Además, existe la necesidad de más lípidos catiónicos que proporcionen una disminución de la toxicidad (o un mejor índice terapéutico), en relación con los lípidos catiónicos que se conocen en la técnica. Los lípidos catiónicos tradicionales se han empleado para el suministro de ARN y ADN al hígado o tumores, pero sufren de una eficiencia de suministro no óptima junto con toxicidad tisular y orgánica en dosis más altas. Un método para reducir la exposición y aumentar la biocompatabilidad de los lípidos catiónicos es incorporar funcionalidades químicamente o bioquímicamente degradables (tales como éster, amida, acetal, imina, etc.), lo que puede conducir a una mejor depuraciónin vivo(Maier, 2013, 21, 1570-1578).
BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN
La presente invención proporciona un andamio lipídico catiónico que demuestra una mayor eficacia junto con una menor toxicidad (índice terapéutico mejorado) como resultado de niveles de lípidos sostenidos más bajos en los tejidos relaventes, y para aplicaciones de suministro locales (ojo, oído, piel, pulmón); suministro al músculo (i.m.), grasa o células subcutáneas (dosificación s.c.).
En un aspecto, esta invención proporciona un compuesto de fórmula (I):
o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma, en donde RA, RB, R2 y R4 se definen en la presente. Los compuestos de la fórmula (I) y las sales farmacéuticamente aceptables de las mismas son lípidos catiónicos útiles en el suministro de agentes biológicamente activos a las células y tejidos.
En un segundo aspecto, esta invención proporciona una composición lipídica que comprende un compuesto de acuerdo con la fórmula (I) (es decir, una composición lipídica de la invención), o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma. En una realización, la composición lipídica comprende además al menos otro componente lipídico. En otra realización, la composición lipídica comprende además un agente biológicamente activo, opcionalmente en combinación con otros componentes lipídicos. En otra realización, la composición lipídica está en forma de liposoma. En otra realización, la composición lipídica está en forma de nanopartículas lipídicas (LNP, por sus siglas en inglés). En otra realización, la composición lipídica es adecuada para el suministro al hígado. En otra realización, la composición lipídica es adecuada para el suministro a un tumor. En otra realización, la composición lipídica es adecuada para fines de inmunización. En otra realización, la composición lipídica es adecuada para aplicaciones de suministro local (ojo, oído, piel, pulmón); suministro a músculo (i.m.), grasa o células subcutáneas (dosificación s.c.).
En un tercer aspecto, esta invención proporciona una composición farmacéutica (es decir, formulación) que comprende una composición lipídica de la invención, y un portador o excipiente farmacéuticamente aceptable. En una realización, la composición farmacéutica comprende al menos otro componente lipídico en la composición lipídica. En otra realización, la composición lipídica está en forma de liposoma. En otra realización, la composición lipídica está en forma de una nanopartícula lipídica. En otra realización, la composición lipídica es adecuada para el suministro al hígado. En otra realización, la composición lipídica es adecuada para el suministro a un tumor. En otra realización, la composición lipídica es adecuada para aplicaciones de suministro local (ojo, oído, piel, pulmón); suministro a músculo (i.m.), grasa o células subcutáneas (dosificación s.c.). En otra realización el agente biológicamente activo es un ARN o A d N. En otra realización, la composición lipídica es adecuada para propósitos de inmunización, y el agente biológicamente activo es un ARN o ADN que codifica un inmunógeno.
También se describe aquí un método para el tratamiento de una enfermedad o afección que comprende el paso de administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de una composición lipídica de la invención a un paciente que necesita tratamiento de la misma. Como se describe aquí, la enfermedad o afección es tratable mediante la administración de un agente de ARN o ADN. Como se describe en la presente, la composición lipídica es adecuada para propósitos de inmunización, y el agente biológicamente activo es un ARN o ADN que codifica un inmunógeno.
También se describe aquí el uso de una composición lipídica de la invención en el tratamiento de una enfermedad o afección en un paciente. Como se describe aquí, la enfermedad o afección es tratable mediante la administración de un agente de ARN o ADN.
También se describe en la presente un método para inducir una respuesta inmune en un sujeto contra un inmunógeno de interés, que comprende la administración de una cantidad inmunológicamente efectiva de una composición lipídica de la invención al sujeto, en combinación con un ARN o ADN que codifica un inmunógeno.
También se describe en la presente el uso de una composición lipídica de la invención en la inducción de una respuesta inmune en un sujeto contra un inmunógeno de interés. El lípido se utiliza en combinación con un ARN o ADN que codifica un inmunógeno. También se describe en la presente el uso de una composición lipídica de la invención en la fabricación de un medicamento para inducir una respuesta inmune en un sujeto contra un inmunógeno de interés.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
En una primera realización, la invención es un compuesto, o sal del mismo, de fórmula (I):
en donde R<A>es -O-R<3>y R<B>es -CH<2>-O-C(O)-R<1>; R<1>es alquileno C<1-6>-NR'R", alcoxi C<1-6>-NR'R", heterociclilo, heterociclilo-alquilo C<1-8>o heterociclilo-C<1-8>-alcoxilo, cada uno de los cuales puede ser opcionalmente sustituido por 1, 2 o 3 grupos, seleccionados independientemente de halo,
alquilo C<1-8>-y cicloalquilo C<3>-<7>-; R' y R", son cada uno, independientemente, hidrógeno o -alquilo C<1-8>-; R<2>y R<3>son cada uno, independientemente, alquilo C<12-22>, alquenilo C<12-22>,
10 — (alquilo (alquilo C4-??)
(alquilo Ci-s)K 1
O-----(alquilo (alquilo C*-??)
R<4>se selecciona a partir de hidrógeno, halo y alquilo C<1-4>.
En una segunda realización, la invención es el compuesto, o sal del mismo, de acuerdo con la primera realización, en donde el compuesto es de fórmula (II):
En una cuarta realización, la invención es el compuesto, o sal del mismo, de acuerdo con cualquiera de las realizaciones primera a tercera, en donde R<4>es hidrógeno.
En una quinta realización, la invención es el compuesto, o sal del mismo, de acuerdo con cualquiera de las realizaciones primera a cuarta, en donde R<1>se selecciona de:
En una sexta realización, la invención es el compuesto, o sal del mismo, de acuerdo con cualquiera de las realizaciones primera a quinta, en donde R1 es
En una séptima realización, la invención es el compuesto, o sal del mismo, de acuerdo con cualquiera de las realizaciones primera a tercera, en donde R2 se selecciona de:
y
En una octava realización, la invención es el compuesto, o sal del mismo, de acuerdo con cualquiera de las realizaciones primera a séptima, en donde R2 se selecciona de:
En una novena realización, la invención es el compuesto, o sal del mismo, de acuerdo con cualquiera de las realizaciones primera a octava, en donde R3 se selecciona de:
En una décima realización, la invención es el compuesto, o sal del mismo, de acuerdo con cualquiera de las realizaciones primera a novena, en donde R3 se selecciona de:
En otra realización, la invención es el compuesto, o sal del mismo, de acuerdo con cualquiera de las realizaciones primera a décima, en donde R2 y R3 son idénticos.
En una undécima realización, la invención es el compuesto, o sal del mismo, de acuerdo con cualquiera de las realizaciones primeras a décima, en donde el compuesto se selecciona del grupo que consiste en:
2,5-bis((9Z, 12Z)-octadeca-9,12-dien-1-iloxi)bencil 4-(dimetilamino)butanoato
((2-(((4-(dimetilamino)butanoil)oxi)metil)-1,4-fenilen)bis(oxi))bis(octan-8,1-diil) bis(decanoato);
((2-(((3-(dimetilamino)propanoil)oxi)metil)-1,4-fenilen)bis(oxi))bis(octan-8,1-diil) bis(decanoato);
((2-(((1-metilpiperidin-4-carbonil)oxi)metil)-1,4-fenilen)bis(oxi))bis(octan-8,1-diil) bis(decanoato);
((2-((((3-(dimetilamino)propoxi)carbonil)oxi)metil)-1,4-fenilen)bis(oxi))bis(octan-8,1-diil) bis(decanoato);
((2-((((3-(dietilamino)propoxi)carbonil)oxi)metil)-1,4-fenilen)bis(oxi))bis(octan-8,1-diil) bis(decanoato);
3-(dimetilamino)propil 4-metil-2,5-bis((9Z,12Z)-octadeca-9,12-dien-1-iloxi)bencil carbonato;
4-metil-2,5-bis((9Z,12Z)-octadeca-9,12-dien-1-iloxi)bencil 4-(dimetilamino)butanoato; (9Z,9'Z, 12Z, 12'Z)-((2-(((4-(dimetilamino)butanoil)oxi)metil)-1,4-fenilen)bis(oxi))bis(butan-4,1-diil) bis(octadeca-9, 12-dienoato);
4-(dimetilamino)butil 4-metil-2,5-bis((9Z, 12Z)-octadeca-9, 12-dien-1-iloxi)bencil carbonato;
((2-(((1-etilpiperidin-4-carbonil)oxi)metil)-1,4-fenilen)bis(oxi))bis(octan-8,1-diil) bis(decanoato);
((2-(((1-isopropilpiperidin-4-carbonil)oxi)metil)-1,4-fenilen)bis(oxi))bis(octan-8,1-diil) bis(decanoato);
((2-((2-(1-metilpiperidin-4-il)acetoxi)metil)-1,4-fenilen)bis(oxi))bis(octan-8,1 -diil) bis(decanoato);
((2-(((4-(pirrolidin-1-il)butanoil)oxi)metil)-1,4-fenilen)bis(oxi))bis(octan-8,1-diil) bis(decanoato);
2.5- bis((9Z,12Z)-octadeca-9,12-dien-1-iloxi)bencil (3-(dimetilamino)propil) carbonato; (9Z,9'Z, 12Z, 12'Z)-((2-(((4-(dimetilamino)butanoil)oxi)metil)-1,4-fenilen)bis(oxi))bis(etan-2,1-diil) bis(octadeca-9, 12-dienoato);
2.5- bis((9Z,12Z)-octadeca-9,12-dien-1-iloxi)bencil 3-(dimetilamino)propanoato;
2.5- bis((9Z,12Z)-octadeca-9,12-dien-1-iloxi)bencil (3-(dietilamino)propil) carbonato;
((4-(((4-(dimetilamino)butanoil)oxi)metil)-1,3-fenilen)bis(oxi))bis(octan-8,1-diil) bis(decanoato);
((4-(((4-(dietilamino)butanoil)oxi)metil)-1,3-fenilen)bis(oxi))bis(octan-8,1-diil) bis(decanoato);
((2-(((4-(dietilamino)butanoil)oxi)metil)-1,4-fenilen)bis(oxi))bis(pentan-5,1-diil) bis(4,4-bis(octiloxi)butanoato); 8-(4-((5-((4,4-bis(octiloxi)butanoil)oxi)pentil)oxi)-3-(((4-(dimetilamino)butanoil)oxi)metil)fenoxi)octil decanoato; 8-(4-((5-((4,4-bis(octiloxi)butanoil)oxi)pentil)oxi)-2-(((4-(dimetilamino)butanoil)oxi)metil)fenoxi)octil decanoato; ((2-(((4-(dimetilamino)butanoil)oxi)metil)-1,4-fenilen)bis(oxi))bis(propan-3,1-diil) bis(4,4-bis(octiloxi)butanoato); ((4-(((1,4-dimetilpiperidin-4-carbonil)oxi)metil)-1,3-fenilen)bis(oxi))bis(octan-8,1-diil) bis(decanoato);
((2-(((4-(dimetilamino)butanoil)oxi)metil)-1,4-fenilen)bis(oxi))bis(pentan-5,1-diil) bis(4,4-bis(octiloxi)butanoato); ((2-(((1,4-dimetilpiperidin-4-carbonil)oxi)metil)-1,4-fenilen)bis(oxi))bis(pentan-5,1 -diil) bis(4,4-bis(octiloxi)butanoato); y
2,4-bis((9Z,12Z)-octadeca-9,12-dien-1-iloxi)bencil 4-(dimetilamino)butanoato.
En una duodécima realización, la invención es una composición lipídica que comprende un compuesto de acuerdo con cualquiera de las realizaciones primera a undécima, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
En una decimotercera realización, la invención es la composición lipídica de acuerdo con la decimosegunda realización, que comprende además un agente biológicamente activo.
En una decimocuarta realización, la invención es la composición lipídica de acuerdo con la decimotercera realización, en donde el agente biológicamente activo es un ácido nucleico.
En una decimoquinta realización, la invención es la composición lipídica de acuerdo con cualquiera de las realizaciones decimotercera a decimocuarta, en donde el agente biológicamente activo es un ADN, ARNip o ARNm.
En una decimosexta realización, la invención es la composición lipídica de acuerdo con cualquiera de las realizaciones decimotercera a decimoquinta, en donde el agente biológicamente activo es un ARNm.
En una realización decimoséptima, la invención es la composición lipídica de acuerdo con cualquiera de las realizaciones decimotercera a decimoquinta, en donde el agente biológicamente activo es un ARNip.
En una decimoctava realización, la invención es la composición lipídica de acuerdo con cualquiera de las realizaciones duodécima a decimoséptima, que comprende además un lípido auxiliar.
En una decimonovena realización, la invención es la composición lipídica de acuerdo con cualquiera de las realizaciones duodécima a dieciocho, que comprende además un lípido neutro.
En una vigésima realización, la invención es la composición lipídica de acuerdo con cualquiera de las realizaciones duodécima a decimonovena, que comprende además un lípido encubierto.
En una vigésimoprimera realización, la invención es la composición lipídica de acuerdo con cualquiera de las realizaciones duodécima a vigésima, en donde el lípido auxiliar es el colesterol, el lípido neutro es DSPC, y el lípido encubierto es S010, S024, S027, S031, o S033.
En una vigésimo segunda realización, la invención es la composición lipídica de acuerdo con cualquiera de las realizaciones duodécima a veintiuna, en donde la composición lipídica es en forma de una nanopartícula lipídica.
En una vigésimotercera realización, la invención es la composición lipídica de acuerdo con cualquiera de las realizaciones duodécima a vigésimosegunda, teniendo 30-60 % de un compuesto de fórmula (I), 5-10 % de colesterol / 30-60 % DSPC, y .1-5 % S010, S024, S027, S031, o S033
En una vigésimocuarta realización, la invención es la composición lipídica de acuerdo con cualquiera de las realizaciones duodécima a vigésimotercera, en donde el pH de dicha composición lipídica es de 4-8 en el momento de la encapsulación y/o formulación.
En una vigésimoquinta realización, la invención es la composición lipídica de acuerdo con cualquiera de las realizaciones duodécima a vigésimocuarta, en donde el pH de dicha composición lipídica es de 5-7 en el momento de la encapsulación y/o formulación.
En una vigésimosexta realización, la invención es la composición lipídica de acuerdo con cualquiera de las realizaciones duodécima a vigésimoquinta, en donde el pH de dicha composición lipídica es de 5,9-6,5 en el momento de la encapsulación y/o formulación.
En una realización, la invención es la composición lipídica de acuerdo con cualquiera de las realizaciones duodécima a vigésimoquinta, en donde el pH de dicha composición lipídica es de 5,9 en el momento de la encapsulación y/o formulación. En otra realización, la invención es la composición lipídica de acuerdo con cualquiera de las realizaciones duodécima a vigésima quinta, en donde el pH de dicha composición lipídica es de 6,0 en el momento de la encapsulación y/o formulación.
En otra realización, la invención es la composición lipídica de acuerdo con cualquiera de las realizaciones duodécima a vigésima quinta, en donde el pH de dicha composición lipídica es de 6,1 en el momento de la encapsulación y/o formulación.
En otra realización, la invención es la composición lipídica de acuerdo con cualquiera de las realizaciones duodécima a vigésima quinta, en donde el pH de dicha composición lipídica es de 6,2 en el momento de la encapsulación y/o formulación.
En otra realización, la invención es la composición lipídica de acuerdo con cualquiera de las realizaciones duodécima a vigésima quinta, en donde el pH de dicha composición lipídica es de 6,3 en el momento de la encapsulación y/o formulación.
En otra realización, la invención es la composición lipídica de acuerdo con cualquiera de las realizaciones duodécima a vigésima quinta, en donde el pH de dicha composición lipídica es de 6,4 en el momento de la encapsulación y/o formulación.
En otra realización, la invención es la composición lipídica de acuerdo con cualquiera de las realizaciones duodécima a vigésima quinta, en donde el pH de dicha composición lipídica es de 6,5 en el momento de la encapsulación y/o formulación.
En una vigésimoséptima realización, la invención es una composición farmacéutica que comprende una composición lipídica de acuerdo con cualquiera de las realizaciones duodécima a vigésimosexta, y un portador o excipiente farmacéuticamente aceptable.
En una vigésimoctava realización, la invención es un método para el tratamiento de una enfermedad o condición que comprende el paso de administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de composición lipídica de acuerdo con cualquiera de las realizaciones duodécima a vigésimoséptima, a un paciente que necesita tratamiento de la misma. En una vigésimonovena realización, la invención proporciona un liposoma que comprende el compuesto de cualquiera de las realizaciones 1-11, en donde dicho liposoma encapsula una molécula de ARN que codifica un inmunógeno.
En una trigésima realización, la invención proporciona una nanopartícula lipídica (LNP) que comprende el compuesto de cualquiera de las realizaciones 1-11, en donde dicho LNP (i) encapsula una molécula de ARN que codifica un inmunógeno, o (ii) está complejado con una molécula de ARN que codifica un inmunógeno.
En una trigésimoprimera realización, la invención proporciona un liposoma de la realización 29, o la LNP de la realización 30, en donde el liposoma tiene un diámetro en el rango de 80-160 nm.
En una trigésimosegunda realización, la invención proporciona un liposoma o LNP de cualquiera de las realizaciones 29 31, en donde dicho liposoma comprende además un lípido que comprende un grupo de cabeza zwitteriónico.
En una trigésimotercera realización, la invención proporciona un liposoma o LNP de cualquiera de las realizaciones 29 32, en donde dicho liposoma comprende además DlinDMA (1,2-dilinoleiloxi-N,N-dimetil-3-aminopropano), DSPC (1,2-Diastearoil-sn-glicero-3-fosfocolina), un colesterol, un lípido pegilado, o una combinación de los mismos.
En una trigésimocuarta realización, la invención proporciona una composición farmacéutica que comprende el liposoma o LNP de cualquiera de las realizaciones 29-33.
En una trigésimoquinta realización, la invención proporciona una composición farmacéutica que comprende una población de liposomas y una población de moléculas de ARN codificantes de inmunógenos, en donde los liposomas comprenden el compuesto de cualquiera de las realizaciones 1-11, y en donde al menos la mitad de la población de las moléculas de ARN están encapsuladas en liposomas.
En una trigésimo sexta realización, la invención proporciona una composición farmacéutica que comprende una población de nanopartículas (LNP) y una población de moléculas de ARN que codifican inmunógenos, en donde las LNP comprenden el compuesto de cualquiera de las realizaciones 1-11, y en donde al menos la mitad de la población de las moléculas de ARN (i) se encapsulan en LNP; o (ii) se complejan con LNP.
En una trigésimoséptima realización, la invención proporciona una composición farmacéutica de la realización 35 o 36, en donde (i) al menos el 80 % en número de liposomas o LNP tienen diámetros en el rango de 60-180 nm, (ii) el diámetro promedio de la población está en el rango de 60-180 nm, o (iii) los diámetros de los liposomas o LNP tienen un índice de polidispersidad <0,2.
En una trigésimoctava realización, la invención proporciona una composición farmacéutica que comprende (i) un compuesto de acuerdo con cualquiera de las realizaciones 1-11, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo; (ii) una molécula de ARN que codifica un inmunógeno.
En otra realización, la invención proporciona una composición farmacéutica de la realización 38, que comprende además un lípido que comprende un grupo de cabeza zwitteriónico.
En otra realización, la invención proporciona una composición farmacéutica de la realización 38, que comprende además DlinDMA (1,2-dilinoleiloxi-N,N-dimetil-3-aminopropano), DSPC (1,2-Diastearoil-sn-glicero-3-fosfocolina), un colesterol, un lípido pegilado, o una combinación de los mismos.
En una trigésimonovena realización, la invención proporciona un liposoma o LNP de cualquiera de las realizaciones 29 33, o la composición farmacéutica de cualquiera de las realizaciones 34-38, en donde el ARN es un ARN auto-replicante.
En una cuadragésima realización, la invención proporciona un liposoma, LNP, o composición farmacéutica de la realización 39, en donde el ARN auto-replicante codifica una ARN-polimerasa dependiente del ARN.
En una cuadragésimoprimera realización, la invención proporciona un liposoma, LNP, o composición farmacéutica de la realización 39 o 40, en donde el ARN auto-replicante comprende dos marcos de lectura abiertos, el primero de los cuales codifica una replicasa de alfavirus y el segundo de los cuales codifica el inmunógeno.
En una cuadragésimosegunda realización, la invención proporciona un liposoma, LNP, o composición farmacéutica de cualquiera de las realizaciones 39-41 , en donde el ARN auto-replicante es de 9000-12000 nucleótidos de longitud.
En una cuadragésimotercera realización, la invención proporciona un liposoma, LNP, o composición farmacéutica de cualquiera de las realizaciones 29-42, en donde el inmunógeno puede provocar una respuesta inmunein vivocontra una bacteria, un virus, un hongo o un parásito.
En una cuadragésimocuarta realización, la invención proporciona un método para inducir una respuesta inmune en un vertebrado, que comprende la administración a dicho vertebrado de una cantidad efectiva del liposoma, LNP, o composición farmacéutica de cualquiera de las realizaciones 29-43.
Como se utiliza en la presente, el término “alquilo” se refiere a una cadena de hidrocarburos completamente saturada ramificada o no ramificada que tiene el número especificado de átomos de carbono. Por ejemplo, alquilo de C1-6 se refiere a un grupo alquilo que tiene de 1 a 6 átomos de carbono. Por ejemplo, alquilo de C<2-6>se refiere a un grupo alquilo que tiene de 2 a 6 átomos de carbono. Por ejemplo, alquilo de C<1-8>se refiere a un grupo alquilo que tiene de 1 a 8 átomos de carbono. Por ejemplo, alquilo de C<4-22>se refiere a un grupo alquilo que tiene de 4 a 22 átomos de carbono. Por ejemplo, alquilo de C<6-10>se refiere a un grupo alquilo que tiene de 6 a 10 átomos de carbono. Por ejemplo, alquilo de C<12-22>se refiere a un grupo alquilo que tiene de 12 a 22 átomos de carbono. Ejemplos representativos de alquilo incluyen metilo, etilo, n-propilo, iso-propilo, n-butilo, sec-butilo, iso-butilo, terc-butilo, n-pentilo, isopentilo, neopentilo, n-hexilo, 3-metilhexilo, 2,2-dimetilpentilo, 2,3-dimetilpentilo, n-heptilo, n-octilo, n-nonilo, n-decilo, n-undecanilo, n-dodecanilo, n-tridecanilo, 9-metilheptadecanilo, 1-heptildecilo, 2-octildecilo, 6-hexildodecilo, 4-heptilundecilo.
Como se utiliza en la presente, el término “alquileno” se refiere al grupo alquílico divalente tal como se definió anteriormente en la presente. Algunos ejemplos representativos de alquileno son metileno, etileno, n-propileno, isopropileno, n-butileno, sec-butileno, iso-butileno, terc-butileno, n-pentileno, isopentileno, neopentileno, n-hexileno, 3-metilhexileno, 2,2- dimetilpentileno, 2,3-dimetilpentileno, n-heptileno, n-octileno, n-nonileno, n-decileno. Por ejemplo, alquileno C<1-6>se refiere a un grupo de alquileno que tiene de 1 a 6 átomos de carbono.
Como se utiliza en el presente documento, el término “alquenilo” se refiere a una cadena de hidrocarburos ramificados o no ramificados no saturados que tiene el número especificado de átomos de carbono y uno o más enlaces dobles carbonocarbono dentro de la cadena. Por ejemplo, alquenilo C<12-22>se refiere a un grupo alquenilo que tiene de 12 a 22 átomos de carbono con uno o más enlaces dobles carbono-carbono dentro de la cadena. En ciertas realizaciones, los grupos alquenilo tienen un enlace doble carbono-carbono dentro de la cadena. En otras realizaciones, los grupos alquenilo tienen más de un enlace doble carbono-carbono dentro de la cadena. Los grupos alquienilo pueden sustituirse opcionalmente por uno o más sustitutivos, tal como se definen en la fórmula (I). Ejemplos representativos de alquenilo incluyen etilenilo, propenilo, butenilo, pentenilo, hexenilo. Otros ejemplos de alquenilo incluyen: Z-octadec-9-enilo, Z-undec-7-enilo, Z-heptadeca-8-enilo, (9Z,12Z)-octadeca-9,12-dienilo, (8Z,11Z)-heptadeca-8,11-dienilo, (8Z, 11Z, 14Z)-heptadeca-8,11 ,14-trienilo, linolenilo, 2-octildeca-1-enilo, linoleilo y olelilo.
Como se usa en la presente, el término “alcoxi” se refiere a cualquier elemento alquilo unido a través de un puente de oxígeno (es decir, un grupo -O-alquilo C<1-3>en donde alquilo C<1-3>es como se define en la presente). Ejemplos de tales grupos incluyen metoxi, etoxi y propoxi. Por ejemplo, alcoxi C<1-6>se refiere a un grupo de alcoxi que tiene de 1 a 6 átomos de carbono.
Como se usa en la presente, el término “cicloalquilo” se refiere a un anillo de hidrocarburos saturado monocíclico, bicíclico o tricíclico que tiene el número especificado de átomos de carbono. Por ejemplo, cicloalquilo C<3-7>se refiere a un anillo de cicloalquilo que tiene de 3 a 7 átomos de carbono. Los grupos cicloalquilo pueden sustituirse opcionalmente por uno o más sustituyentes, tal como se definen en la fórmula (I).
Ejemplos representativos de cicloalquilo incluyen ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo, ciclohexilo, biciclo[2.1.1]hexilo, biciclo[2.2.1]heptilo, adamantilo.
Como se usa en la presente, el término “halo” se refiere al fluoro, cloro, bromo y yodo.
Como se usa en la presente, el término “heterocíclico” se refiere a un anillo monocíclico o bicíclico saturado o insaturado de 4 a 12 miembros que contiene de 1 a 4 heteroátomos. Los sistemas de anillos heterocíclicos no son aromáticos. Los grupos heterocíclicos que contienen más de un heteroátomo pueden contener diferentes heteroátomos. Los grupos heterocíclicos son sistemas de anillo bicíclico monocíclico, espiro o fusionados o puenteados. Algunos ejemplos de grupos heterocíclicos monocíclicos incluyen tetrahidrofuranilo, dihidrofuranilo, 1,4-dioxanilo, morfolinilo, 1,4-ditianilo, azetidinilo, piperazinilo, piperidinilo, 1,3-dioxolanilo, imidazolidinilo, imidazolinilo, pirrolinilo, pirrolidinilo, tetrahidropiranilo, dihidropiranilo, 1,2,3,6-tetrahidropiridinilo, oxatiolanilo, ditiolanilo, 1,3-dioxanilo, 1,3-ditianilo, oxatianilo, tiomorfolinilo, 1,4,7-trioxa-10-azaciclododecanilo, azapanilo. Ejemplos de anillos espiro heterocíclicos incluyen 1,5-dioxa-9-azaspiro[5,5]undecanilo, 1,4-dioxa-8-azaspiro[4,5]decanilo, 2-oxa-7-azaspiro[3,5]nonanilo. Los sistemas de anillos heterocíclicos fusionados tienen de 8 a 11 átomos de anillos e incluyen grupos en los que un anillo heterocíclico se fusiona a un anillo fenilo. Ejemplos de anillos heterocíclicos fusionados incluyen decahidroquinilinilo, (4aS,8aR)-decahidroisoquinolinilo,(4aS,8aS)-decahidroisoquinolinilo, octahidrociclopenta[c]pirrolilo, isoinolinilo, (3aR,7aS)-hexahidro-[1,3]dioxolo[4.5-c]piridinilo, octahidro-1H-pirrolo[3,4-b]piridinilo, tetrahidroisoquinolinilo.
Como se usa en la presente, el término “heterociclilo alquilo C<1-8>” se refiere a un anillo heterocíclico tal como se define anteriormente que está unido al resto de la molécula por un enlace único o por un radical alquilo C<1-8>tal como se definió anteriormente.
Como se usa en la presente, el término “heterociclilo alcoxi C<1-8>” se refiere a un anillo heterocíclico tal como se define anteriormente que está unido al resto de la molécula por un enlace único o por un radical alcoxi C<1-8>tal como se definió anteriormente.
Como se usa en la presente, el término “un isómero óptico” o “un estereoisómero” se refiere a cualquiera de las diversas configuraciones estereoisoméricas que pueden existir para un determinado compuesto de la presente invención e incluye isómeros geométricos. Se entiende que un sustituyente se puede unir a un centro quiral de un átomo de carbono. El término “quiral” se refiere a las moléculas que tienen la propiedad de no superimposabilidad en su compañero especular, mientras que el término “aquiral” se refiere a las moléculas que son superimponibles en su compañero especular. Por lo tanto, la invención incluye enantiómeros, diastereómeros o racematos del compuesto. Los “enantiómeros” son un par de estereoisómeros que son imágenes especulares no superponibles entre sí. Una mezcla 1:1 de un par de enantiómeros es una mezcla “racémica”. El término se utiliza para designar una mezcla racémica cuando sea apropiado. Los “diastereoisómeros” son estereoisómeros que tienen al menos dos átomos asimétricos, pero que no son imágenes especulares el uno del otro. La estereoquímica absoluta se especifica de acuerdo con el sistema Cahn-Ingold-Prelog R-S. Cuando un compuesto es un enantiómero puro, la estereoquímica en cada carbono quiral puede ser especificada por R o S. Los compuestos resueltos cuya configuración absoluta es desconocida pueden ser designados (+) o (-) dependiendo de la dirección (dextrógira o levógira) en que hagan girar la luz polarizada plana a la longitud de onda de la línea D del sodio. Ciertos compuestos descritos en la presente contienen uno o más centros asimétricos o ejes y pueden dar lugar a enantiómeros, diastereómeros y otras formas estereoisoméricas que pueden definirse, en términos de estereoquímica absoluta, como (R)- o (S)-.
Dependiendo de la elección de los materiales y procedimientos de partida, los compuestos pueden estar presentes en forma de uno de los posibles isómeros o como mezclas de los mismos, por ejemplo, como isómeros ópticos puros, o como mezclas de isómeros, tales como mezclas de racematos y diastereoisómeros, dependiendo del número de átomos de carbono asimétricos. La presente invención pretende incluir todos estos posibles isómeros, incluidas las mezclas racémicas, las mezclas diasterioméricas y las formas ópticamente puras. Los isómeros ópticamente activos (R) y (S) pueden prepararse utilizando sintrones quirales o reactivos quirales, o resolverse mediante técnicas convencionales. Si el compuesto contiene un doble enlace, el sustituyente puede tener la configuración E o Z. Si el compuesto contiene un cicloalquilo disustituido, el sustituyente del cicloalquilo puede tener una configuración cis o trans. También se pretende que estén incluidas todas las formas tautoméricas.
Cualquier átomo asimétrico (por ejemplo, carbono o similar) del compuesto o compuestos de la presente invención puede estar presente como racémico o enantiomericamente enriquecido, por ejemplo, la configuración (R)-, (S)- o (R,S)-. En ciertas realizaciones, cada átomo asimétrico tiene un exceso enantiomérico de al menos el 50 %, un exceso enantiomérico de al menos el 60 %, un exceso enantiomérico de al menos el 70 %, un exceso enantiomérico de al menos el 80 %, un exceso enantiomérico de al menos el 90 %, un exceso enantiomérico de al menos el 95 % o un exceso enantiomérico de al menos el 99 % en la configuración (R) o (S). Los sustituyentes en átomos con enlaces dobles insaturados pueden, si es posible, estar presentes en formacis-(Z)- otrans-(E).
En consecuencia, tal como se utiliza en la presente un compuesto de la presente invención puede ser en forma de uno de los posibles isómeros, rotámeros, atropisómeros, tautómeros o mezclas de los mismos, por ejemplo, como isómeros geométricos sustancialmente puros(cisotrans),diastereómeros, isómeros ópticos (antípodas), racematos o mezclas de los mismos.
Cualesquiera mezclas resultantes de isómeros se pueden separar, basándose en las diferencias fisicoquímicas de los constituyentes, en los racematos, diastereómeros, isómeros ópticos o geométricos puros o sustancialmente puros, por ejemplo, mediante cromatografía y/o cristalización fraccionada.
Cualesquiera racematos resultantes de productos finales o intermedios se pueden resolver en los enantiómeros ópticos mediante métodos conocidos, por ejemplo, mediante la separación de las sales diastereoméricas de estos, obtenidas con un ácido o una base con actividad óptica, y liberando el compuesto ácido o básico con actividad óptica. En particular, una fracción básica puede emplearse para resolver los compuestos de la presente invención en sus antípodas ópticas, por ejemplo, por cristalización fraccionada de una sal formada con un ácido ópticamente activo, por ejemplo, ácido tartárico, ácido dibenzoil tartárico, ácido diacetil tartárico, ácido di-O,O'-p-toluoil tartárico, ácido mandélico, ácido málico o ácido alcanfor-10-sulfónico. Los productos racémicos también se pueden resolver mediante cromatografía quiral, por ejemplo, cromatografía líquida de alta presión (HPLC) utilizando un adsorbente quiral.
Como se usa en la presente, los términos “sal” o “sales” se refieren a una adición ácida de un compuesto de la invención. Las “sales” incluyen en particular las “sales farmacéuticamente aceptables”. La expresión “sales farmacéuticamente aceptables” se refiere a sales que retienen la eficacia y propiedades biológicas de los compuestos de esta invención y, que normalmente no son indeseables desde un punto de vista biológico ni de otro tipo. En muchos casos, los compuestos de la presente invención son capaces de formar sales de ácido y/o base en virtud de la presencia de grupos amino y/o carboxilo o grupos similares a estos.
Las sales de adición de ácido farmacéuticamente aceptables se pueden formar con ácidos inorgánicos y ácidos orgánicos, por ejemplo, sales de acetato, aspartato, benzoato, besilato, bromuro/bromhidrato, bicarbonato/carbonato, bisulfato/sulfato, canforsulfonato, cloruro/clorhidrato, clorteofilonato, citrato, etandisulfonato, fumarato, gluceptato, gluconato, glucuronato, hipurato, hidroyoduro/yoduro, isetionato, lactato, lactobionato, laurilsulfato, malato, maleato, malonato, mandelato, mesilato, metilsulfato, naftoato, napsilato, nicotinato, nitrato, octadecanoato, oleato, oxalato, palmitato, pamoato, fosfato/fosfato de hidrógeno/fosfato de dihidrógeno, poligalacturonato, propionato, estearato, succinato, subsalicilato, tartrato, tosilato y trifluoroacetato.
Los ácidos inorgánicos de los que pueden derivarse las sales incluyen, por ejemplo, ácido clorhídrico, ácido bromhídrico, ácido sulfúrico, ácido nítrico, ácido fosfórico.
Los ácidos orgánicos de los que pueden derivarse las sales incluyen, por ejemplo, ácido acético, ácido propiónico, ácido glicólico, ácido oxálico, ácido maleico, ácido malónico, ácido succínico, ácido fumárico, ácido tartárico, ácido cítrico, ácido benzoico, ácido mandélico, ácido metanosulfónico, ácido etanosulfónico, ácido toluenesulfónico, ácido sulfosalicílico. Se pueden formar sales de adición de base farmacéuticamente aceptables con bases inorgánicas y orgánicas.
Las bases inorgánicas a partir de las que se pueden obtener sales incluyen, por ejemplo, sales de amonio y metales de las columnas de I a XII de la tabla periódica. En ciertas realizaciones, las sales se obtienen a partir de sodio, potasio, amonio, calcio, magnesio, hierro, plata, zinc y cobre; las sales particularmente adecuadas incluyen sales de amonio, potasio, sodio, calcio y magnesio.
Las bases orgánicas de las que pueden derivarse las sales incluyen, por ejemplo, aminas primarias, secundarias y terciarias, aminas sustituidas, incluyendo aminas sustituidas de origen natural, aminas cíclicas, resinas básicas de intercambio iónico. Ciertas aminas orgánicas incluyen isopropilamina, benzatina, colinato, dietanolamina, dietilamina, lisina, meglumina, piperazina y trometamina.
Las sales farmacéuticamente aceptables de la presente invención se pueden sintetizar a partir de una parte básica o ácida, por métodos químicos convencionales. Por lo general, tales sales se pueden preparar haciendo reaccionar formas de ácido libre de estos compuestos con una cantidad estequiométrica de la base adecuada (tal como hidróxido, carbonato, bicarbonato de Na, Ca, Mg o K o similares) o haciendo reaccionar formas de base libre de estos compuestos con una cantidad estequiométrica del ácido adecuado. Tales reacciones se llevan a cabo normalmente en agua o en un disolvente orgánico o en una mezcla de los dos. Por lo general, cuando sea factible es deseable el uso de medios no acuosos como éter, acetato de etilo, etanol, isopropanol o acetonitrilo. Se pueden encontrar listas de sales adecuadas adicionales, por ejemplo, en “Remington's Pharmaceutical Sciences”, 20a ed., Mack Publishing Company, Easton, Pa., (1985); y en “Handbook of Pharmaceutical Salts: Properties, Selection, and Use” de Stahl y Wermuth (Wiley-VCH, Weinheim, Alemania, 2002).
Composiciones lipídicas
La presente invención proporciona una composición lipídica que comprende al menos un compuesto de fórmula (I), es decir, una composición lipídica de la invención. En una realización, al menos otro componente lipídico está presente. Tales composiciones también pueden contener un agente biológicamente activo, opcionalmente en combinación con uno o más componentes lipídicos.
Una realización de la presente invención proporciona una composición lipídica que comprende un compuesto de fórmula (I) y otro componente lipídico. Tales otros componentes lipídicos incluyen lípidos catiónicos, lípidos neutros, lípidos aniónicos, lípidos auxiliares y lípidos encubiertos.
Los lípidos catiónicos adecuados para su uso en una composición lipídica de la invención incluyen cloruro de N,N-dioleil-N,N-dimetilamonio (DODAC),
Bromuro de N,N-distearil-N,N-dimetilamonio (DDAB), cloruro de N-(1 -(2,3-dioleoiloxi) propil)-N,N,N-trimetilamonio (DOTAP),
1.2- dioleoil-3-dimetilamonio-propano (DODAP),
cloruro de N-(1-(2,3-dioleiloxi)propil)-N,N,N-trimetilamonio (DOTMA), 1,2-Dioleoilcarbamil -3-Dimetilamoniopropano (DOCDAP),
1.2- Dilineoil-3-dimetilamonio-propano (DLINDAP), dilauril(C120) trimetil amonio propano (DLTAP), Dioctadecilamidoglicil espermina (DOGS), DC-Col,
Dioleoiloxi-N-[2-esperminecarboxamido)etil}-N,N-dimetil-1-propanaminiotrifluoroacetato(DOSPA), 1,2-Dimiristiloxipropil-3-dimetil-bromuro de hidroxietil amonio (DMRIE), 3-Dimetilamino-2-(Colest-5-en -3-betaoxibutan-4-oxi)-1-(cis,cis-9,12 -octadecadienoxi)propano (CLinDMA), N,N-dimetil-2,3-dioleiloxi)propilamina (DODMA),
2-[5'-(chlest-5-en-3[beta]-oxi)-3'-oxapentoxi)-3-dimetil-1-(cis,cis-9',12'-octadecadienoxi)propano (CpLinDMA) y N,N-Dimetil-3,4-dioleiloxibencilamina (DMOBA), y 1,2-N,N'-Dioleilcarbamil-3-dimetilaminopropano (DOcarbDAP). En una realización el lípido catiónico es DOTAP o DLTAP.
Los lípidos neutros adecuados para su uso en una composición lipídica de la invención incluyen, por ejemplo, diversos lípidos neutros, sin carga o zwitteriónicos. Ejemplos de fosfolípidos neutros adecuados para su uso en la presente invención incluyen: 5-heptadecilbenceno-1,3-diol (resorcinol), dipalmitoilfosfatidilcolina (DPPC), distearoilfosfatidilcolina (DSPC), fosfocolina (DOPC), dimiristoilfosfatidilcolina (DMPC), fosfatidilcolina (PLPC), l,2-distearoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DAPC), fosfatidiletanolamina (PE), fosfatidilcolina de huevo (EPC), dilaurilfosfatidilcolina (DLPC), dimiristoilfosfatidilcolina (DMPC), l-miristoil-2-palmitoil fosfatidilcolina (MPPC), l-palmitoil-2-miristoil fosfatidilcolina (PMPC), l-palmitoil-2-estearoil fosfatidilcolina (PSPC), l,2-diaracidoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DBPC), l-estearoil-2-palmitoil fosfatidilcolina (SPPC), l,2-dieicosenoil-sn-glicero -3-fosfocolina (DEPC), palmitoilooil fosfatidilcolina (POPC), lisofosfatidilcolina, dioleoil fosfatidiletanolamina (DOPE), dilinoleoilfosfatidilcolina distearoilfosfatidiletanolamina (DSPE), dimiristoil fosfatidiletanolamina (DMPE), dipalmitoil fosfatidiletanolamina (DPPE), palmitoileoil fosfatidiletanolamina (POPE), lisofosfatidiletanolamina y combinaciones de los mismos. En una realización, el fosfolípido neutro se selecciona del grupo que consiste en distearoilfosfatidilcolina (DSPC) y dimiristoil fosfatidil etanolamina (DMPE).
Los lípidos aniónicos adecuados para su uso en la presente invención incluyen fosfatidilglicerol, cardiolipina, diacilfosfatidilserina, ácido diacilfosfatídico, N-dodecanoil fosfatidil etanoloamina, N-succinil fosfatidiletanolamina, N-glutaril fosfatidiletanolamina colesterol hemisuccinato (CHEMS), y lisilfosfatidilglicerol.
Los lípidos neutros y aniónicos adecuados también incluyen los descritos en US 2009/0048197.
Los lípidos auxiliares son lípidos que mejoran la transfección (por ejemplo, la transfección de la nanopartícula, incluido el agente biológicamente activo) hasta cierto punto. El mecanismo por el cual el lípido auxiliar mejora la transfección puede incluir, por ejemplo, mejorar la estabilidad de las partículas y/o mejorar la fusogenicidad de la membrana. Los lípidos auxiliares incluyen esteroides y resorcinoles de alquilo. Los lípidos auxiliares adecuados para su uso en la presente invención incluyen el colesterol, el 5-heptadecilresorcinol y colesterol hemisuccinato.
Los lípidos encubiertos son lípidos que aumentan el tiempo durante el cual las nanopartículas pueden existirin vivo(por ejemplo, en la sangre). Los lípidos encubiertos adecuados para su uso en una composición lipídica de la invención incluyen lípidos encubiertos que tienen un grupo de cabeza hidrófilo ligado a una parte lipídica. Ejemplos de tales lípidos encubiertos incluyen compuestos de fórmula (XI), como se describe en WO2011/076807,
o una sal o un derivado farmacéuticamente aceptable de los mismos, en donde:
[Z]n es un polímero hidrófilo seleccionado de PEG (poli(óxido de etileno)), o polímeros basados en poli(oxazolina), poli(alcohol vinílico), poli(glicerol), poli(N-vinilpirro-lidona), poli[N-(2-hidroxipropil)metacrilamida], polisacáridos y poli(aminoácidos), o una combinación de cualquiera de los anteriores, en donde el polímero puede ser lineal o ramificado, y en donde cada Z es opcionalmente sustituido independientemente;
en donde Z está polimerizado por n subunidades;
n es un grado promedio númerico de polimerización entre 10 y 200 unidades de Z,
en donde n está optimizado para diferentes tipos de polímeros;
L1 es un enlazador alquileno C<1-10>o heteroalquileno C<1-10>opcionalmente sustituido que incluye cero, uno, dos o más de un éter (por ejemplo, -O-), éster (por ejemplo, -C(O)O-), succinato (por ejemplo, -O(O)C-CH<2>-CH<2>-C(O)O-)), carbamato (por ejemplo, -OC(O)-Nr '-), carbonato (por ejemplo, -OC(O)O-), cetona (por ejemplo, -C-C(O)-C-), carbonilo (por ejemplo, -C(O)-), urea (por ejemplo, -NRC(O)NR'-), amina (por ejemplo, -NR'-), amida (por ejemplo, -C(O)NR'-), imina (por ejemplo, -C(Nr ')-), tioéter (por ejemplo, -S-), xantato (por ejemplo, -OC(S)S-), y fosfodiéster (por ejemplo, -OP(O)<2>O-); cualquiera de los cuales puede estar sustituido por cero, uno o más grupos Z;
en donde R' se selecciona independientemente de -H, -NH-, -NH<2>, -O-, -S-, un fosfato o un alquileno C<1-10>opcionalmente sustituido;
X<1>y X<2>se seleccionan independientemente de un carbono o un heteroátomo seleccionado de -NH-, -O-, -S- o un fosfato;
A<1>y A<2>se seleccionan independientemente de un alquilo C<6-30>, alquenilo C<6-30>, y alquinilo C<6-30>, en donde A<1>y A<2>pueden ser iguales o diferentes,
o en donde A<1>y A<2>junto con el átomo de carbono al que están unidos forman un esteroide opcionalmente sustituido.
Los lípidos encubiertos específicos incluyen los enumerados en la Tabla 1.
Tabla 1. Lípidos encubiertos
Otros lípidos encubiertos adecuados para su uso en una composición lipídica de la presente invención e información sobre la bioquímica de tales lípidos se pueden encontrar en Romberg et al., Pharmaceutical Research, Vol. 25, No. 1, 2008, p.55-71, y Hoekstra et al., Biochimica et Biophysica Acta 1660 (2004) 41-52.
En una realización, el lípido encubierto adecuado comprende un grupo seleccionado de PEG (a veces conocido como poli(óxido de etileno) y polímeros basados en poli(oxazolina), alcohol polivinílico, poli(glicerol), poli(N-vinilpirrolidona), poliaminoácidos y poli[N-(2-hidroxipropil)metacrilamida]. Se divulgan lípidos PEG adicionales adecuados, por ejemplo, en WO 2006/007712.
Los lípidos encubiertos específicos adecuados incluyen conjugados de polietileneglicol-diacilglicerol o polietileneglicoldiacilglicamida (PEG-DAG), incluidos los que comprenden un grupo de dialquilglicerol o dialquilglicamida que tiene una longitud de cadena de alquilo que comprende de aproximadamente C4 a aproximadamente C40 átomos de carbono saturados o insaturados. El grupo dialquilglicerol o dialquilglicamida puede comprender además uno o más grupos alquilo sustituidos. En cualquiera de las realizaciones aquí descritas, el conjugado de PEG puede seleccionarse entre PEG-dilaurilglicerol, PEG-dimirilglicerol (PEG-DMG) (No. de catálogo: GM-020 de NOF, Tokio, Japón), PEG-dipalmitoilglicerol, PEG-disterilglicerol, PEG-dilaurilglicamida, PEG-dimirilglicamida, PEG-dipalmitoilglicamida, y PEG-disterilglicamida, PEG- colesterol (1-[8'-(Colest-5-en-3[beta]-oxi)carboxamido-3',6'-dioxaoctanil] carbamoil-[omega]-metil-poli(etilenglicol), PEG-DMB (3,4-Ditetradecoxilbencil-[omega]-metil-poli(etilenglicol) éter), 1,2-dimiristoil-sn-glicero-3- fosfoetanolamina -N-[metoxi(polietilenglicol)-2000] (No. de catálogo: 880150<p>de Avanti Polar Lipids, Alabaster, Alabama, EE. UU.).
En una realización el lípido encubierto es S010, S024, S027, S031 o S033.
En otra realización el lípido encubierto es S024.
A menos que se indique lo contrario, el término “PEG”, tal como se utiliza en la presente, significa cualquier polietilenglicol u otro polímero de éter de polialquileno. En una realización, PEG es un polímero lineal o ramificado de etilenglicol u óxido de etileno opcionalmente sustituido. En una realización, PEG no está sustituido. En una realización, el PEG está sustituido, por ejemplo, por uno o más grupos alquil, alcaloxi, acilo, hidroxi o arilo. En una realización, el término incluye copolímeros PEG como PEG-poliuretano o PEG-polipropileno (véase, por ejemplo, J. Milton Harris, Poly(ethylene glycol) chemistry: biotechnical and biomedical applications (1992)); en otra realización, el término no incluye copolímeros p Eg . En una realización, el PEG tiene un peso molecular de aproximadamente 130 a aproximadamente 50.000, en una sub-realización de aproximadamente 150 a aproximadamente 30.000, en una sub-realización de aproximadamente 150 a aproximadamente 20.000, en una sub-realización de aproximadamente 150 a aproximadamente 15.000, en una sub realización de aproximadamente 150 a aproximadamente 10.000, en una sub-realización de aproximadamente 150 a aproximadamente 6000, en una sub-realización de aproximadamente 150 a aproximadamente 5000, en una sub realización de aproximadamente 150 a aproximadamente 4000, en una sub-realización de aproximadamente 150 a aproximadamente 3000, en una sub-realización de aproximadamente 300 a aproximadamente 3000, en una sub realización de aproximadamente 1000 a aproximadamente 3000, y en una sub-realización de aproximadamente 1500 a aproximadamente 2500.
En ciertas realizaciones el PEG es un “PEG-2K”, también llamado “PEG 2000”, que tiene un peso molecular promedio de aproximadamente 2000 dalton. PEG-2K se representa en la presente por la siguiente fórmula (Xlla), en donde n es 45, lo que significa que el grado de polimerización promedio numérico comprende aproximadamente 45 subunidades. Sin embargo, se pueden utilizar otras realizaciones de PEG conocidas en la técnica, incluyendo, por ejemplo, aquellas en las que el grado promedio numérico de polimerización comprende aproximadamente 23 subunidades (n = 23) y/o 68 subunidades (n = 68).
Las composiciones lipídicas de la invención también pueden incluir uno o más agentes biológicamente activos incluyendo anticuerpos (por ejemplo, monoclonales, quiméricos, humanizados, nanocuerpos, y fragmentos de los mismos, etc.), colesterol, hormonas, péptidos, proteínas, quimioterapéuticos y otros tipos de agentes antineoplásicos, fármacos de bajo peso molecular, vitaminas, cofactores, nucleósidos, nucleótidos, oligonucleótidos, ácidos nucleicos enzimáticos, ácidos nucleicos antisentido, oligonucleótidos formadores de tríplex, composiciones de ADN o ARN antisentido , composiciones de ADN quimérico:ARN, alozimas, aptámeros, ribozima, señuelos y análogos de los mismos, plásmidos y otros tipos de vectores de expresión, y moléculas de ácido nucleico pequeñas, agentes ARNi, ácido nucleico interferente pequeño (ANip), ácido ribonucleico mensajero (ARN mensajero, ARNm), ARN interferente pequeño (ARNip), ARN bicatenario (ARNbc), micro-ARN (miARN), y moléculas de ARN de horquilla corta (ARNhc), ácido peptidonucleico (APN), un ribonucleótido de ácido nucleico bloqueado (ANB), nucleótido morfolino, ácido treonucleico (<a>T<n>), ácido nucleico glicólico (ANG), sisiRNA (ARN interferente segmentado internamente pequeño), ARNia (ARN interferente asimétrico), y ARNip con 1, 2 o más discordancias entre la cadena sentido y antisentido a células y/o tejidos pertinentes, como en un cultivo celular, sujeto u organismo. Estos compuestos pueden ser purificados o parcialmente purificados, y pueden ser de origen natural o sintéticos, y pueden ser modificados químicamente. En una realización, el agente biológicamente activo es un agente ARNi, ácido nucleico interferente pequeño (ANip), ARN interferente pequeño (ARNip), ARN bicatenario (ARNbc), micro-ARN (miARN) o una molécula de ARN de horquilla corta (ARNhc).
En una realización, el agente biológicamente activo es un agente de iARN útil para mediar la interferencia de ARN (iARN).
En otra realización el agente biológicamente activo es un ARNm. La molécula del ARNm es generalmente de un tamaño que puede ser encapsulada en una nanopartícula lipídica de la invención. Mientras que el tamaño de una molécula de ARNm varía en la naturaleza dependiendo de la identidad de las especies de ARNm que codifican para una proteína en particular, un tamaño promedio para una molécula de ARNm es el tamaño promedio de ARNm es 500-10.000 bases.
En ciertas realizaciones, el agente biológicamente activo es un ARN que codifica un inmunógeno. El ARN que codifica inmunógenos puede ser un ARN auto-replicante.
En ciertas realizaciones, el agente biológicamente activo es el ADN. La molécula de ADN debe ser de un tamaño que pueda ser encapsulada en una nanopartícula lipídica de la invención. Algunas de estas formas más cortas de ADN pueden ser de un tamaño para codificar de manera útil las proteínas. Ejemplos de estas segundas formas de ADN, más cortas y útiles, incluyen plásmidos y otros vectores. Para una descripción más completa, véase Alberts B et al. (2007) Molecular Biology of the Cell, quinta edición, Garland Science.
Diversos métodos para cargar agentes biológicamente activos en composiciones lipídicas, tales como liposomas y nanopartículas lipídicas, están disponibles en la técnica, incluyendo ambos métodos de carga pasiva y activa. El método exacto utilizado puede elegirse en función de múltiples factores que incluyen, por ejemplo, el agente biológicamente activo a cargar, el método de almacenamiento que se utilizará una vez cargado, el tamaño de la partícula resultante, y el régimen de dosificación contemplado. Los métodos incluyen, por ejemplo, la mezcla mecánica del fármaco y los lípidos en el momento en que los liposomas se forman o reconstituyen, disolviendo todos los componentes en un disolvente orgánico y concentrándolos en una película seca, formando un pH o gradiente iónico para atraer el agente activo al interior del liposoma, creando un potencial transmembrana, y carga mediada por ionóforo. Véase, por ejemplo, Publicación PCT Núm. W<o>95/08986, Patente estadounidense Núm. 5,837,282, Patente estadounidense Núm. 5,837,282, y Patente estadounidense Núm. 7,811,602.
Por “nanopartícula lipídica” se entiende una partícula que comprende una pluralidad de (es decir, más de una) moléculas lipídicas físicamente asociadas entre sí por fuerzas intermoleculares. Las nanopartículas lipídicas pueden ser, por ejemplo, microesferas (incluyendo vesículas unilamelares y multlamelares, por ejemplo, liposomas), una fase dispersa en una emulsión, micelas o una fase interna en una suspensión.
Las nanopartículas lipídicas tienen un tamaño de aproximadamente 1 a aproximadamente 2.500 nm, aproximadamente 1 a aproximadamente 1.500 nm, aproximadamente 1 a aproximadamente 1.000 nm, en una sub-realización de aproximadamente 50 a aproximadamente 600 nm, en una sub-realización de aproximadamente 50 a aproximadamente 400 nm, en una sub-realización de aproximadamente 50 a aproximadamente 250 nm, y en una sub-realización de aproximadamente 50 a aproximadamente 150 nm. A menos que se indique lo contrario, todos los tamaños a los que se hace referencia en la presente son los tamaños medios (diámetros) de la nanopartícula completamente formada, medida por la dispersión dinámica de la luz en un Zetasizer Malvern. La muestra de nanopartículas se diluye en disolución salina amortiguada con fosfato (PBS, por sus siglas en inglés) de modo que la tasa de recuento es de aproximadamente 200 -400 kcts. Los datos se presentan como un promedio ponderado de la medida de intensidad.
Una realización de la presente invención proporciona una composición lipídica que comprende un compuesto de fórmula (I) y otro componente lipídico. Otra realización proporciona una composición lipídica que comprende un compuesto de fórmula (I) y un lípido auxiliar, por ejemplo, colesterol. Otra realización proporciona una composición lipídica que comprende un compuesto de fórmula (I), un lípido auxiliar, por ejemplo, colesterol, y un lípido neutro, por ejemplo, DSPc . Otra realización de la presente invención prevé una composición lipídica que comprende un compuesto de fórmula (I), un lípido auxiliar, por ejemplo, colesterol, un lípido neutro, por ejemplo, DSPC, y un lípido encubierto, por ejemplo, S010, S024, S027, S031, o S033. Otra realización de la presente invención prevé una composición lipídica que comprende un compuesto de fórmula (I), un lípido auxiliar, por ejemplo, colesterol, un lípido neutro, por ejemplo, DSPC, un lípido encubierto, por ejemplo, S010, S024, S027, S031, o S033, y un agente biológicamente activo, por ejemplo, un ARN o ADN. Otra realización de la presente invención proporciona una nanopartícula lipídica que comprende un compuesto de la fórmula (I) un lípido auxiliar, por ejemplo, colesterol, un lípido neutro, por ejemplo, DSPC, y un lípido encubierto, por ejemplo, s 010, S024, S027, S031, o S033, y un agente biológicamente activo, por ejemplo, un ARNm, ARNip o ADN.
Las realizaciones de la presente invención también proporcionan composiciones lipídicas descritas de acuerdo con las respectivas relaciones molares de los lípidos componentes en la formulación, en donde una barra (“/”) indica los componentes respectivos, como se indica en la presente.
Otra realización de la presente invención es una composición lipídica que comprende un compuesto de fórmula (I) y un lípido auxiliar, por ejemplo, colesterol, en una relación molar de lípidos de 55-40 de compuesto de fórmula (I) / 55-40 de lípidos auxiliares. Otra realización proporciona una composición lipídica que comprende un compuesto de fórmula (I), un lípido auxiliar, por ejemplo, colesterol, y un lípido neutro, por ejemplo, DPSc en una relación molar de lípidos de 55-40 de compuesto de fórmula (I) / 55-40 de lípidos auxiliares / 15-5 de lípidos neutros. Otra realización proporciona una composición lipídica que comprende un compuesto de fórmula (I), un lípido auxiliar, por ejemplo, colesterol, un lípido neutro, por ejemplo, DSPC, y un lípido encubierto, por ejemplo, S010, S024, S027, S031, o S033, en una relación molar de lípidos de 55-40 de compuesto de fórmula (I) / 55-40 de lípidos auxiliares / 15-5 de lípidos neutros / 10-1 de lípidos encubiertos.
Otra realización de la presente invención es una composición lipídica que comprende un compuesto de fórmula (I) y un lípido auxiliar, por ejemplo, colesterol, en una relación molar de lípidos de 50-40 de compuesto de fórmula (I) / 50-40 de lípidos auxiliares. Otra realización proporciona una composición lipídica que comprende un compuesto de fórmula (I), un lípido auxiliar, por ejemplo, colesterol, y un lípido neutro, por ejemplo, DPSC, en una relación molar de lípidos de 50-40 de compuesto de fórmula (I) / 50-40 de lípidos auxiliares / 15-5 de lípidos neutros. Otra realización proporciona una composición lipídica que comprende un compuesto de fórmula (I), un lípido auxiliar, por ejemplo, colesterol, un lípido neutro, por ejemplo, DSPC, un lípido encubierto, por ejemplo, S010, S024, S027, S031, o S033, en una relación molar de lípidos de 50-40 de compuesto de fórmula (I) / 50-40 de lípidos auxiliares / 15-5 de lípidos neutros / 5-1 de lípidos encubiertos.
Otra realización de la presente invención es una composición lipídica que comprende un compuesto de fórmula (I) y un lípido auxiliar, por ejemplo, colesterol, en una relación molar de lípidos de 47-43 de compuesto de fórmula (I) / 47-43 de lípidos auxiliares. Otra realización proporciona una composición lipídica que comprende un compuesto de fórmula (I), un lípido auxiliar, por ejemplo, colesterol, y un lípido neutro, por ejemplo, DPSC, en una relación molar de lípidos de 47-43 de compuesto de fórmula (I) / 47-43 de lípidos auxiliares / 12-7 de lípidos neutros. Otra realización proporciona una composición lipídica que comprende un compuesto de fórmula (I), un lípido auxiliar, por ejemplo, colesterol, un lípido neutro, por ejemplo, DSPC, un lípido encubierto, por ejemplo, S010, S024, S027, S031, o S033, en una relación molar de lípidos de 47-43 de compuesto de fórmula (I) / 47-43 de lípidos auxiliares / 12-7 de lípidos neutros / 4-1 de lípidos encubiertos.
Otra realización de la presente invención es una composición lipídica que comprende un compuesto de fórmula (I) y un lípido auxiliar, por ejemplo, colesterol, en una relación molar de lípidos de aproximadamente 45 de compuesto de fórmula (I) / aproximadamente 44 de lípidos auxiliars. Otra realización proporciona una composición lipídica que comprende un compuesto de fórmula (I), un lípido auxiliar, por ejemplo, colesterol, y un lípido neutro, por ejemplo, DPS<c>en una relación molar de lípidos de aproximadamente 45 de compuesto de fórmula (I) / aproximadamente 44 de lípidos auxiliars / aproximadamente 9 de lípidos neutros. Otra realización proporciona una composición lipídica que comprende un compuesto de fórmula (I), un lípido auxiliar, por ejemplo, colesterol, un lípido neutro, por ejemplo, DSPC, un lípido encubierto, por ejemplo, S010, S024, S027, S031, o S033 en una relación molar de lípidos de aproximadamente 45 de compuestos de fórmula (I) / aproximadamente 44 de lípidos auxiliars / aproximadamente 9 de lípidos neutros / aproximadamente 2 de lípidos encubiertos, por ejemplo, S010, S024, S027, S031, o S033.
Los compuestos preferidos de la fórmula (I) para su uso en las composiciones lipídicas anteriores se dan en los Ejemplos 1-36. Los compuestos especialmente preferidos se dan en los Ejemplos 1 y 80. Los agentes biológicamente activos preferidos son ARN y ADN
Las composiciones lipídicas de la presente invención pueden ser optimizadas aún más por uno experto en la técnica combinando lípidos catiónicos con el rango de pKa deseado, lípidos encubiertos, lípidos auxiliares, y lípidos neutros en formulaciones, incluyendo, por ejemplo, formulaciones de liposomas, formulaciones de nanopartículas lipídicas (LNP) para el suministro a células y tejidos específicosin vivo.En una realización, se obtiene una mayor optimización ajustando la relación molar de lípidos entre estos diversos tipos de lípidos. En una realización, se obtiene una mayor optimización ajustando uno o más de: el tamaño de partícula deseado, la relación N/P, los métodos de formulación y/o el régimen de dosificación (por ejemplo, el número de dosis administradas a lo largo del tiempo, la dosis real en mg/kg, el tiempo de las dosis, las combinaciones con otros tratamientos, etc.). Las diversas técnicas de optimización conocidas por los expertos en la técnica perteneciente a las realizaciones enumeradas anteriormente se consideran como parte de esta invención.
Métodos generales para peparar nanopartículas lipídicas
Los siguientes métodos se pueden utilizar para hacer nanopartículas lipídicas de la invención. Para lograr la reducción de tamaño y/o aumentar la homogeneidad de tamaño en las partículas, un experto en la técnica puede utilizar los pasos del método que se indican a continuación, experimentando con diferentes combinaciones. Además, un experto podría emplear sonicación, filtración u otras técnicas de dimensionamiento que se utilizan en formulaciones liposomales.
El proceso para preparar una composición de la invención típicamente consiste en proporcionar una disolución acuosa, como una disolución amortiguadora de citrato, que comprende un agente biológicamente activo en un primer depósito, proporcionando un segundo depósito que comprende una disolución orgánica, como un alcohol orgánico, por ejemplo, etanol, de los lípidos y luego mezclar la disolución acuosa con la disolución lipídica orgánica. El primer depósito está opcionalmente en comunicación fluida con el segundo depósito. El paso de mezclado es seguido opcionalmente por un paso de incubación, un paso de filtración o diálisis, y un paso de dilución y/o concentración. El paso de incubación consiste en permitir que la disolución del paso de mezclado permanezca en un recipiente durante aproximadamente 0 a aproximadamente 100 horas (preferiblemente entre 0 y aproximadamente 24 horas) a aproximadamente temperatura ambiente y opcionalmente protegido de la luz. En una realización, un paso de dilución sigue el paso de incubación. El paso de dilución puede implicar la dilución con disolución amortiguadora acuosa (por ejemplo, disolución amortiguadora de citrato o agua pura), por ejemplo, utilizando un aparato de bombeo (por ejemplo, una bomba peristáltica). El paso de filtración es ultrafiltración o diálisis. La ultrafiltración comprende la concentración de la disolución diluida seguida de la diafiltración, por ejemplo, utilizando un sistema de bombeo adecuado (por ejemplo, un aparato de bombeo, tal como una bomba peristáltica o equivalente) junto con una membrana de ultrafiltración adecuada (por ejemplo, cartuchos de fibra hueca GE o equivalentes). La diálisis comprende el intercambio de disolventes (disolución amortiguadora) a través de una membrana adecuada (por ejemplo, membrana SnakeSkin 10.000 mwc).
En una realización, el paso de mezclado proporciona una fase única transparente.
En una realización, después del paso de mezclado, el disolvente orgánico se retira para proporcionar una suspensión de partículas, en donde el agente biológicamente activo es encapsulado por los lípidos.
La selección de un disolvente orgánico normalmente implicará la consideración de la polaridad del disolvente y la facilidad con la que el disolvente puede ser eliminado en las etapas posteriores de la formación de partículas. El disolvente orgánico, que también se utiliza como agente solubilizante, está preferiblemente en una cantidad suficiente para proporcionar una mezcla transparente de una sola fase de agentes biológicamente activos y lípidos. El disolvente orgánico puede seleccionarse de uno o más (por ejemplo, dos) de cloroformo, diclorometano, dietiléter, ciclohexano, ciclopentano, benceno, tolueno, metanol y otros alcoholes alifáticos (por ejemplo, C1 a C8), tales como etanol, propanol, isopropanol, butanol, terc-butanol, isobutanol, pentanol y hexanol.
El paso de mezclado puede realizarse por cualquier número de métodos, por ejemplo, por medios mecánicos, tal como un mezclador de vórtice.
Los métodos utilizados para eliminar el disolvente orgánico normalmente implicarán diafilitración o diálisis, o evaporación a presiones reducidas, o soplar una corriente de gas inerte (por ejemplo, nitrógeno o argón) a través de la mezcla.
En otras realizaciones, el método comprende además la adición de policationes no lipídicos que son útiles para efectuar la transformación de las células utilizando las composiciones actuales. Los ejemplos de policationes no lipídicos adecuados incluyen, pero no se limitan a, el bromuro de hexadimetrina (vendido bajo el nombre de marca POLYBRENE(R), de Aldrich Chemical Co., Milwaukee, Wis., EE. UU.) u otras sales de hexadimetrina. Otros policationes adecuados incluyen, por ejemplo, sales de poli-L-ornitina, poli-L-arginina, poli-L-lisina, poli-D-lisina, polialilamina y polietilenimina.
En ciertas realizaciones, la formación de las nanopartículas lipídicas se puede llevar a cabo ya sea en un sistema monofásico (por ejemplo, una monofase Bligh y Dyer, o una mezcla similar de disolventes acuosos y orgánicos) o en un sistema bifásico con una mezcla adecuada.
La nanopartícula lipídica puede formarse en un sistema monofásico o bifásico. En un sistema monofásico, los lípidos catiónicos y el agente biológicamente activo se disuelven en un volumen de la mezcla monofásica. La combinación de las dos disoluciones proporciona una única mezcla en la que se forman los complejos. En un sistema bifásico, los lípidos catiónicos se unen al agente biológicamente activo (que está presente en la fase acuosa) y lo “jalan” a la fase orgánica. En una realización, las nanopartículas lipídicas se preparan mediante un método que comprende: (a) poner en contacto el agente biológicamente activo con una disolución compuesta de lípidos no catiónicos y un detergente para formar una mezcla compuesto-lípidos; (b) poner en contacto los lípidos catiónicos con la mezcla compuesto-lípidos para neutralizar una parte de la carga negativa del agente biológicamente activo y formar una mezcla neutralizada de carga de agente biológicamente activo y lípidos; y (c) eliminar el detergente de la mezcla neutralizada de carga.
En un grupo de realizaciones, la solución de lípidos neutros y detergente es una disolución acuosa. Poner en contacto el agente biológicamente activo con la disolución de lípidos neutros y el detergente se logra típicamente mezclando una primera disolución del agente biológicamente activo y una segunda disolución de los lípidos y detergente. Preferiblemente, la disolución de agente biológicamente activo es también una disolución de detergente. La cantidad de lípidos neutros que se utiliza en el presente método se determina típicamente en función de la cantidad de lípidos catiónicos utilizados, y es típicamente de aproximadamente 0,2 a 5 veces la cantidad de lípidos catiónicos, preferiblemente de aproximadamente 0,5 a aproximadamente 2 veces la cantidad de lípidos catiónicos utilizados.
La mezcla de agente biológicamente activo-lípidos así formada se pone en contacto con lípidos catiónicos para neutralizar una parte de la carga negativa que está asociada con la molécula de interés (u otros materiales polianiónicos) presente. La cantidad de lípidos catiónicos utilizados es típicamente 3-8 veces más que la relación molar calculada de carga negativa (fosfatos).
Los métodos utilizados para eliminar el detergente generalmente implican diálisis. Cuando hay disolventes orgánicos, la eliminación se realiza normalmente por diafiltración o evaporación a presiones reducidas, o soplando una corriente de gas inerte (por ejemplo, nitrógeno o argón) en la mezcla.
En la presente se divulga un aparato para hacer una composición de la presente invención. El aparato incluye típicamente un primer depósito para contener una disolución acuosa que comprende un agente biológicamente activo y un segundo depósito para contener una solución lipídica orgánica. El aparato también incluye típicamente un mecanismo de bomba configurado para bombear las disoluciones acuosas y de lípidos orgánicos en una región de mezclado o cámara de mezclado a velocidades de flujo sustancialmente iguales. En una realización, la región de mezclado o la cámara de mezclado comprende un acoplamiento en T o su equivalente, lo que permite que los flujos de fluidos acuosos y orgánicos se combinen como entrada en el conector T y las disoluciones combinadas acuosas y orgánicas resultantes salgan del conector T a un depósito de recolección o equivalente del mismo.
Métodos para el suministro de agentes biológicamente activos y el tratamiento de la enfermedad
Los lípidos catiónicos de la fórmula (I) y sus compuestos lipídicos son útiles en composiciones farmacéuticas o formulaciones utilizadas para el suministro de agentes biológicamente activos. Las formulaciones que contienen lípidos catiónicos de la fórmula (I) o composiciones lipídicas de la misma pueden estar en diversas formas, incluyendo agentes de distribución de formación de partículas, incluyendo micropartículas, nanopartículas y agentes de transfección que son útiles para el suministro de diversas moléculas a las células. Las formulaciones específicas son eficaces para transfectar o administrar agentes biológicamente activos, tales como anticuerpos (por ejemplo, monoclonales, quiméricos, humanizados, nanocuerpos, y fragmentos de los mismos, etc.), colesterol, hormonas, péptidos, proteínas, quimioterapéuticos y otros tipos de agentes antineoplásicos, fármacos de bajo peso molecular, vitaminas, cofactores, nucleósidos, nucleótidos, oligonucleótidos, polinucleótidos (por ejemplo, ARN o ADN), ácidos nucleicos enzimáticos, ácidos nucleicos antisentido, oligonucleótidos formadores de tríplex, composiciones de ADN o ARN antisentido , composiciones de ADN quimérico:ARN, alozimas, aptámeros, ribozima, señuelos y análogos de los mismos, plásmidos y otros tipos de vectores de expresión, y moléculas de ácido nucleico pequeñas, ARNm, agentes ARNi, ácido nucleico interferente pequeño (ANip), ARN interferente pequeño (ARNip), ARN bicatenario (ARNbc), micro-ARN (miARN), y moléculas de ARN de horquilla corta (ARNhc), ácido peptidonucleico (APN), un ribonucleótido de ácido nucleico bloqueado (ANB), nucleótido morfolino, ácido treonucleico (ATN), ácido nucleico glicólico (ANG), sisiRNA (ARN interferente segmentado internamente pequeño), aiRNA (ARN interferente asimétrico), y ARNip con 1, 2 o más discordancias entre la cadena sentido y antisentido a células y/o tejidos pertinentes, como en un cultivo celular, sujeto u organismo. La lista anterior de agentes biológicamente activos es solo ejemplar, y no pretende ser limitativa. Estos compuestos pueden ser purificados o parcialmente purificados, y pueden ser de origen natural o sintéticos, y pueden ser modificados químicamente.
Tales formulaciones que contienen agentes biológicamente activos son útiles, por ejemplo, para proporcionar composiciones para prevenir, inhibir o tratar enfermedades, afecciones o rasgos en una célula, sujeto u organismo. Las enfermedades, afecciones o rasgos incluyen enfermedades proliferativas, incluyendo cáncer, enfermedad inflamatoria, rechazo de trasplante y/o tejidos, enfermedades o afecciones autoinmunes, enfermedades relacionadas con la edad, enfermedades neurológicas o neurodegenerativas, enfermedades respiratorias, enfermedades cardiovasculares, enfermedades oculares, enfermedades metabólicas, enfermedad dermatológica, enfermedad auditiva, enfermedad hepática, enfermedad renal o renal, etc.
La cantidad de agente activo administrado por dosis es una cantidad por encima de la dosis terapéutica mínima, pero por debajo de una dosis tóxica. La cantidad real por dosis puede ser determinada por un médico dependiendo de una serie de factores, tales como la historia clínica del paciente, el uso de otras terapias, el agente biológicamente activo que se proporcionará, y la naturaleza de la enfermedad. La cantidad de agente biológicamente activo administrado puede ajustarse durante todo el tratamiento, dependiendo de la respuesta del paciente al tratamiento y de la presencia o gravedad de cualquier efecto secundario asociado al tratamiento. Las dosis ejemplares y el tratamiento para los compuestos que han sido aprobados por una agencia reguladora apropiada son conocidos y disponibles para los expertos en la técnica. Véase, por ejemplo, Physician's Desk Reference, 64° ed., Physician's Desk Reference Inc. (2010), Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Philadelphia, Pa. (1985), y Remington The Science and Practice of Pharmacy, 21° ed., Lippincott Williams & Williams Publishers (2005).
En una realización, se administra una dosis única de un agente biológicamente activo a un paciente que lo necesite. En una realización, se administran dosis múltiples, en donde las dosis múltiples pueden administrarse simultáneamente, secuencialmente o alternativamente. En una realización, la misma formulación se administra en dosis múltiples. En una realización, las formulaciones difieren en dosis múltiples. En diversas realizaciones, las dosis pueden administrarse una vez al día, o durante uno, dos, tres, cuatro o más días consecutivos. En una realización, las dosis se administran una vez a la semana. En una realización, las dosis se administran una vez cada dos semanas. En una realización, los pacientes reciben al menos dos cursos de un régimen de tratamiento, y potencialmente más, dependiendo de la respuesta del paciente al tratamiento. En los regímenes de un solo agente, los ciclos totales de tratamiento son determinados por el paciente y el médico en función de las respuestas observadas y la toxicidad. Los regímenes de dosificación anteriores deben considerarse como ejemplos no limitativos. Otros regímenes de dosificación se contemplan como dentro del alcance de la invención, y dependen del efecto terapéutico deseado.
También se describe aquí un método para el tratamiento de una enfermedad o afección que comprende el paso de administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de una composición lipídica de la invención a un paciente que necesita tratamiento de la misma. En una realización, la enfermedad o afección se puede tratar mediante la administración de un agente ARN, como un agente de ARNip o ARNm.
También se describe aquí el uso de una composición lipídica de la invención en el tratamiento de una enfermedad o afección en un paciente. En una realización, la enfermedad o afección es tratable mediante la administración de un agente de ARNip o ARNm.
La cantidad total de lípidos en la composición que se administra es, en una realización, de aproximadamente 5 a aproximadamente 30 mg de lípidos por mg de agente biológicamente activo (por ejemplo, ARNm, ARNip, replicón de ARN, etc.), en otra realización de aproximadamente 5 a aproximadamente 25 mg de lípidos por mg de agente biológicamente activo (por ejemplo, ARNm, ARNip, replicón de ARN, etc.), en otra realización de aproximadamente 7 a aproximadamente 25 mg de lípido por mg de agente biológicamente activo (por ejemplo, ARNm, ARNip o replicón de ARN, etc.) y en una realización de aproximadamente 7 a aproximadamente 15 mg de lípido por mg de agente biológicamente activo (por ejemplo, ARNm, ARNip o replicón de a Rn , etc.).
Como se usa en la presente, el “tratamiento” incluye el tratamiento meliorativo, curativo y profiláctico. Como se usa en la presente, un “paciente” significa un animal, preferiblemente un mamífero, preferiblemente un humano, que necesita tratamiento.
El término “cantidad terapéuticamente efectiva” se refiere a la cantidad del compuesto de la invención y el agente biológicamente activo (por ejemplo, el compuesto terapéutico) necesario para tratar o mejorar una enfermedad o afección objetivo.
El término “cantidad inmunológicamente efectiva” se refiere a la cantidad del compuesto de la invención y de ARN que codifica un inmunógeno necesario para provocar una respuesta inmunitaria que reconoce al inmunógeno (por ejemplo, en el contexto de un patógeno). El término “ inmunógeno” se refiere a cualquier sustancia u organismo que provoque una respuesta inmune cuando se introduce en el cuerpo.
Por “enfermedad proliferativa”, como se usa en la presente, se entiende cualquier enfermedad, condición, rasgo, genotipo o fenotipo caracterizado por crecimiento o replicación celular no regulada como se conoce en la técnica. En una realización, la enfermedad proliferativa es cáncer. En una realización, la enfermedad proliferativa es un tumor. En una realización, la enfermedad proliferativa incluye, por ejemplo, tumores líquidos como, por ejemplo, leucemias, Por ejemplo, leucemia mielógena aguda (LMA), leucemia mielógena crónica (LMC), leucemia linfocítica aguda (LLA), mieloma múltiple, y leucemia linfocítica crónica; y tumores sólidos, por ejemplo, cánceres relacionados con el SIDA, como el sarcoma de Kaposi; cánceres de mama; cánceres óseos; cánceres cerebrales; cánceres de cabeza y cuello, linfoma no Hodgkins, adenoma, carcinoma de células escamosas, carcinoma laríngeo, cáncer de vesícula biliar y vías biliares, cáncer de retina, cánceres de esófago, cánceres gastrointestinales, cáncer de ovario, cáncer de útero, cáncer de tiroides, cáncer de testículo, cáncer de endometrio, melanoma, cáncer colorrectal, cáncer de pulmón, cáncer de vejiga, cáncer de próstata, cáncer de pulmón (incluido el carcinoma pulmonar no microcítico), cáncer de páncreas, sarcomas, tumor de Wilms, cáncer de cuello de útero, cáncer de cabeza y cuello, cánceres de piel, carcinoma nasofaríngeo, liposarcoma, carcinoma epitelial, carcinoma de células renales, adeno carcinoma de vesícula biliar, sarcoma endometrial, cánceres multirresistentes. En una realización, la enfermedad proliferativa incluye neovascularización asociada con angiogénesis tumoral, degeneración macular (por ejemplo, degeneración macular relacionada con la edad húmeda/seca), neovascularización corneal, retinopatía diabética, glaucoma neovascular, degeneración miope. En una realización, la enfermedad proliferativa incluye reestenosis y enfermedad renal poliquística.
Por “enfermedad autoinmune”, como se usa en la presente, se entiende cualquier enfermedad, condición, rasgo, genotipo o fenotipo caracterizado por autoinmunidad como se conoce en la técnica. Las enfermedades autoinmunes incluyen, por ejemplo, esclerosis múltiple, diabetes mellitus, lupus, esclerodermias, fibromialgia, rechazo del trasplante (por ejemplo, prevención del rechazo del aloinjerto), anemia perniciosa, artritis reumatoide, lupus eritematoso sistémico, dermatomiositis, miastenia grave, lupus eritematoso, esclerosis múltiple y enfermedad de Grave.
Por “enfermedad infecciosa” se entiende cualquier enfermedad, trastorno o afección asociada con un agente infeccioso, tal como un virus, bacterias, hongos, priones o parásitos. La invención se puede utilizar para inmunizar contra patógenos que causan enfermedades infecciosas. A continuación, se dan ejemplos de estos patógenos.
Por “enfermedad neurológica” se entiende cualquier enfermedad, trastorno o afección que afecte el sistema nervioso central o periférico. Las enfermedades neurológicas incluyen enfermedades o trastornos del sistema nervioso periférico o central, incluyendo, por ejemplo, enfermedad de Alzheimer, aneurisma, lesión cerebral, síndrome del túnel carpiano, aneurisma cerebral, dolor crónico, enfermedad de Creutzfeldt-Jakob, epilepsia, enfermedad de Huntington, meningitis, trastornos convulsivos y otras enfermedades, trastornos y síndromes neurológicos.
Por “enfermedad respiratoria” se entiende cualquier enfermedad o condición que afecte las vías respiratorias. Las enfermedades respiratorias incluyen, por ejemplo, asma, enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC), rinitis alérgica, sinusitis, alergias, dificultad respiratoria, síndrome de dificultad respiratoria, fibrosis quística, hipertensión pulmonar o vasoconstricción, y enfisema.
Por “enfermedad cardiovascular” se entiende cualquier enfermedad o afección que afecta el corazón y la vasculatura. Las enfermedades cardiovasculares incluyen, por ejemplo, enfermedad coronaria (EC), enfermedad cerebrovascular (ECV), estenosis aórtica, enfermedad vascular periférica, infarto de miocardio (ataque al corazón), arritmia, isquemia e insuficiencia cardíaca congestiva.
Por “enfermedad ocular”, como se usa en la presente, se entiende cualquier enfermedad, condición, rasgo, genotipo o fenotipo del ojo y estructuras relacionadas. Las enfermedades oculares incluyen, por ejemplo, edema macular cistoide, retinopatía diabética, degeneración reticular, oclusión de la vena retiniana, oclusión de la arteria retiniana, degeneración macular (por ejemplo, degeneración macular asociada a la edad, como DMAE húmeda o DMAE seca), toxoplasmosis, retinitis pigmentosa, laceración conjuntival, laceración corneal, glaucoma.
Por “enfermedad metabólica” se entiende cualquier enfermedad o afección que afecta las vías metabólicas. La enfermedad metabólica puede causar un proceso metabólico anormal, ya sea congénita debido a una anomalía enzimática hereditaria (errores congénitos del metabolismo) o adquirida debido a una enfermedad de un órgano endocrino o falla de un órgano metabólicamente importante, como el hígado. En una realización, la enfermedad metabólica incluye obesidad, resistencia a la insulina y diabetes (por ejemplo, diabetes tipo I y/o tipo II).
Por “enfermedad dermatológica” se entiende cualquier enfermedad o condición de la piel, dermis, o cualquier subestructura en ella, como un cabello, un folículo, etc. Las enfermedades dermatológicas, trastornos, condiciones y rasgos pueden incluir psoriasis, dermatitis ectópica, cánceres de piel, como melanoma y carcinoma basocelular, pérdida de cabello, eliminación de cabello y alteraciones en la pigmentación.
Por “enfermedad auditiva” se entiende cualquier enfermedad o condición del sistema auditivo, incluyendo el oído, como el oído interno, el oído medio, el oído externo, el nervio auditivo, y cualquier subestructura en el mismo. Las enfermedades, trastornos, aafecciones y rasgos auditivos pueden incluir pérdida de audición, sordera, tinnitus, vértigo, trastornos del equilibrio y del movimiento.
Por “enfermedad regenerativa” se entenderá cualquier enfermedad o afección en la que la generación o regeneración insuficientes de células o tejidosin vivooin vitroimpida el establecimiento o la restauración de una función orgánica adecuada antes o después de la lesión, impida o retrase la cicatrización de heridas o la resolución de lesiones ulcerosas, acelere el envejecimiento; o prevenga la terapia eficaz basada en células. El término “ácido ribonucleico mensajero” (ARN mensajero, ARNm) se refiere a una molécula de ácido ribonucleico (ARN) que interviene en la transferencia de información genética a los ribosomas en el citoplasma, donde actúa como un molde para la síntesis de proteínas. Se sintetiza a partir de un molde de ADN durante el proceso de transcripción. Véase, The American Heritage® Dictionary of the English Language, Cuarta edición (actualizado el 2009). Houghton Mifflin Company.
Un plásmido es una pequeña molécula de ADN que está físicamente separada del ADN cromosómico dentro de una célula y puede replicarse independientemente de él. Los tamaños del plásmido pueden variar de 1 a más de 25 pares de kilobases. Un plásmido recombinante puede prepararse de manera recombinante para tener un tamaño que puede ser encapsulado en una nanopartícula lipídica de la invención.
Un vector es una molécula de ADN utilizada como un vehículo para transportar artificialmente material genético de una célula o de una reacción bioquímicain vitroa otra célula, en donde el ADN puede ser replicado y/o expresado. Un vector que contiene ADN extraño se denomina recombinante. Entre los tipos de vectores útiles están los plásmidos y los vectores virales.
Los vectores virales son generalmente virus recombinantes que portan ADN o ARN viral modificado que se ha vuelto no infeccioso, pero que todavía contienen promotores virales y también el transgén, permitiendo así la traducción del transgén a través de un promotor viral. Un vector viral puede prepararse de manera recombinante para tener un tamaño que puede ser encapsulado en una nanopartícula lipídica de la invención.
El término “ácido nucleico interferente pequeño” (ANip), tal como se utiliza en la presente, se refiere a cualquier molécula de ácido nucleico capaz de inhibir o regular la expresión génica o la replicación viral mediando la interferencia de ARN (iARN) o silenciando genes de una manera específica de la secuencia. Incluye ARN interferente pequeño (ARNip), microARN (miARN), oligonucleótidos interferentes pequeños y moléculas de ácido nucleico interferente pequeño modificadas químicamente. Los ARNip son responsables de la interferencia del ARN, el proceso de silenciamiento genético post-transcripcional específico de la secuencia en animales y plantas. Los ARNip son generados por la escisión de ribonucleasa III a partir de ARN de doble cadena (ARN bicatenario, ARNbc) más largo que son homólogos o específicos al objetivo del gen silenciado.
El término “interferencia de ARN” (iARN) es una técnica de silenciamiento genético post-transcripcional dirigida que utiliza un agente iARN para degradar el ARN mensajero (ARNm) que contiene una secuencia que es igual o muy similar al agente iARN. Véase: Zamore y Haley, 2005, Science, 309, 1519-1524; Zamore et al., 2000, Cell, 101, 25-33; Elbashir et al., 2001, Nature, 411, 494-498; y Kreutzer et al., Publicación PCT WO 00/44895; Fire, Publicación PCT WO 99/32619; Mello y Fire, Publicación PCT WO 01/29058.
Como se usa en la presente, iARN es equivalente a otros términos usados para describir la interferencia específica del ARN de la secuencia, tales como silenciamiento del gen post transcripcional, inhibición traslacional, inhibición transcripcional, o epigenética. Por ejemplo, las formulaciones que contienen lípidos de la invención se pueden utilizar junto con moléculas ANip para silenciar epigenéticamente genes tanto a nivel post-transcripcional como a nivel pretranscripcional. En un ejemplo no limitativo, la modulación de la expresión génica por moléculas de ANip puede resultar de la división mediada por ANip del ARN (ya sea ARN codificante o no codificante) a través de RISC, o alternativamente, inhibición traslacional como se conoce en la técnica En otra realización, la modulación de la expresión génica por ANip puede resultar de la inhibición transcripcional como se informa, por ejemplo, en Janowski et al., 2005, Nature Chemical Biology, 1, 216-222.
El término “inhibidor de iARN” es cualquier molécula que puede modular (por ejemplo, reducir o inhibir) la función o actividad de interferencia del ARN en una célula o paciente. Un inhibidor de iARN puede regular, reducir o inhibir la iARN (por ejemplo, escisión mediada por iARN de un polinucleótido objetivo, inhibición traslacional o silenciamiento transcripcional) mediante la interacción con o interfiriendo con la función de cualquier componente de la vía iARN, incluyendo componentes proteicos como RISC, o componentes de ácido nucleico como miARN o ARNip. Un inhibidor de iARN puede ser una molécula de ANip, una molécula antisensorial, un aptámero o una molécula pequeña que interactúa o interfiere con la función de RISC, un miARN, un ARNip o cualquier otro componente de la vía de iARN en una célula o paciente. Al inhibir el iARN (por ejemplo, la escisión mediada por el iARN de un polinucleótido objetivo, la inhibición traslacional o el silenciamiento transcripcional), se puede usar un inhibidor del iARN para modular (por ejemplo, regular al alza o regular a la baja) la expresión de un gen objetivo. En una realización, un inhibidor de ARN se utiliza para regular la expresión génica interfiriendo con (por ejemplo, reduciendo o previniendo) la regulación descendente endógena o la inhibición de la expresión génica a través de la inhibición traslacional, silenciamiento transcripcional o escisión mediada por RISC de un polinucleótido (por ejemplo, ARNm). Al interferir con los mecanismos de represión endógena, silenciamiento o inhibición de la expresión génica, los inhibidores de iARN de la invención pueden utilizarse para regular la expresión génica para el tratamiento de enfermedades o afecciones resultantes de una pérdida de función. El término “ inhibidor de iARN” se usa indistintamente con el término “ANip” en varias realizaciones en la presente.
El término “ácido nucleico enzimático”, como se usa en la presente, se refiere a una molécula de ácido nucleico que tiene complementariedad en una región de unión de sustrato a un objetivo genético especificado, y también tiene una actividad enzimática que actúa para separar específicamente un ARN objetivo, inactivando así la molécula de ARN objetivo. Las regiones complementarias permiten hibridación suficiente de la molécula de ácido nucleico enzimático al ARN objetivo y así permiten la escisión. Se prefiere una complementariedad del 100 %, pero la complementariedad tan baja como el 50 75 % también puede ser útil en esta invención (véase, por ejemplo, Werner y Uhlenbeck, 1995, Nucleic Acids Research, 23, 2092-2096; Hammann et al., 1999, Antisense and Nucleic Acid Drug Dev., 9, 25-31). Los ácidos nucleicos se pueden modificar en los grupos base, azúcar y/o fosfato. El término ácido nucleico enzimático se utiliza indistintamente con frases como ribozimas, a Rn catalítico, ARN enzimático, ADN catalítico, aptazima o ribozima de unión a aptámero, ribozima regulable, oligonucleótidos catalíticos, nucleozima, ADNzima, enzima de ARN, endoribonucleasa, endonucleasa, minizima, leadzima, oligozima o enzima de ADN. Todas estas terminologías describen moléculas de ácido nucleico con actividad enzimática. Las características clave de una molécula de ácido nucleico enzimático son que tiene un sitio de unión de sustrato específico que es complementario a una o más de las regiones de ácido nucleico objetivo, y que tiene secuencias de nucleótidos dentro o alrededor de ese sitio de unión del sustrato que imparten una actividad de escisión y/o ligadura de ácido nucleico a la molécula (véase, por ejemplo, Cech et al., patente de EE. UU. 4,987,071; Cech et al., 1988, 260 JAMA 3030). Los ribozimas y las moléculas de ácido nucleico enzimático de la invención pueden modificarse químicamente, por ejemplo, como se describe en la técnica y en otras partes de la presente.
El término “ácido nucleico antisentido”, como se usa en la presente, se refiere a una molécula de ácido nucleico no enzimático que se une al ARN objetivo por medio de ARN-ARN o ARN-ADN o ARN-APN (ácido nucleico proteico; Egholm et al., 1993 Nature 365, 566) interactúa y altera la actividad del ARN objetivo (para una revisión, véase Stein y Cheng, 1993 Science 261, 1004 y Woolf et al., patente de EE. UU. 5,849,902). El ADN antisentido puede sintetizarse químicamente o expresarse mediante el uso de un vector de expresión de ADN moncatenario o equivalente al mismo. Las moléculas antisentido de la invención pueden modificarse químicamente, por ejemplo, como se describe en la técnica.
El término “región activadora de la RNasa H”, como se usa en la presente, se refiere a una región (generalmente mayor o igual a 4-25 nucleótidos de longitud, preferiblemente de 5-11 nucleótidos de longitud) de una molécula de ácido nucleico capaz de unirse a un ARN objetivo para formar un complejo no covalente reconocido por la enzima RNasa H celular (véase, por ejemplo, Arrow et al., patente de EE. UU. 5,849,902; Arrow et al., patente de EE. UU. 5,989,912). La enzima RNasa H se une al complejo de ARN molecular del ácido nucleico y escinde la secuencia de ARN objetivo.
El término “quimera antisentido 2-5A” como se utiliza en la presente, se refiere a un oligonucleótido antisentido que contiene un residuo de adenilato 5'-fosforilado 2'-5'-ligado. Estas quimeras se unen al ARN objetivo de una manera específica de secuencia y activan una ribonucleasa celular dependiente de 2-5A que, a su vez, escinde el ARN objetivo (Torrence et al., 1993 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 1300; Silverman et al., 2000, Methods Enzymol., 313, 522-533; Player and Torrence, 1998, Pharmacol. Ther., 78, 55-113). Las moléculas quiméricas antisentido 2-5A pueden modificarse químicamente, por ejemplo, como se describe en la técnica.
El término “triplex formando oligonucleótidos”, como se usa en la presente, se refiere a un oligonucleótido que puede unirse a un a Dn de doble cadena de una manera específica de secuencia para formar una hélice de triple cadena. Se ha demostrado que la formación de esta estructura de triple hélice inhibe la transcripción del gen objetivo (Duval-Valentin et al., 1992 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 504; Fox, 2000, Curr. Med. Chem., 7, 17-37; Praseuth et. al., 2000, Biochim. Biophys. Acta, 1489, 181-206). Los oligonucleótidos formadores de tríplex de la invención se pueden modificar químicamente, por ejemplo, como se describe en la técnica.
El término “ARN señuelo”, como se usa en la presente, se refiere a una molécula de ARN o aptámero que está diseñado para unirse preferentemente a un ligando predeterminado. Tal unión puede causar la inhibición o activación de una molécula objetivo. El ARN señuelo o aptámero puede competir con un objetivo de unión natural para la unión de un ligando específico. Del mismo modo, un ARN señuelo puede ser diseñado para unirse a un receptor y bloquear la unión de una molécula efectora, o puede ser diseñado para unirse al receptor de interés y prevenir la interacción con el receptor. Las moléculas señuelo de la invención se pueden modificar químicamente, por ejemplo, como se describe en la técnica.
El término “ADN de cadena única” (ADN monocatenario, ADNmc), como se usa en la presente, se refiere a una molécula de ácido desoxirribonucleico de origen natural o sintético que comprende una sola cadena lineal, por ejemplo, un ADNmc puede ser una secuencia de genes sensoriales o antisensoriales o EST (etiqueta de secuencia expresada).
El término “alozima”, como se usa en la presente, se refiere a una molécula de ácido nucleico enzimático alostérico, incluyendo por ejemplo, patentes de EE. Uu . Núms. 5,834,186, 5,741,679, 5,589,332, 5,871,914, y Publicaciones PCT Núms. WO 00/24931, WO 00/26226, WO 98/27104, y WO 99/29842.
El término “aptámero”, como se usa en la presente, se refiere a una composición de polinucleótidos que se une específicamente a una molécula objetivo, en donde el polinucleótido tiene una secuencia que difiere de una secuencia normalmente reconocida por la molécula objetivo en una célula. Alternativamente, un aptámero puede ser una molécula de ácido nucleico que se une a una molécula objetivo, en donde la molécula objetivo no se une naturalmente a un ácido nucleico. La molécula objetivo puede ser cualquier molécula de interés. Las moléculas de aptámero de la invención se pueden modificar químicamente, por ejemplo, como se describe en la técnica.
Formulación de composiciones lipídicas
Para uso farmacéutico, las composiciones lipídicas de la invención pueden administrarse por vía enteral o parenteral, incluyendo administración intravenosa, intramuscular, subcutánea, transdérmica, aérea (aerosol), oral, intranasal, rectal, vaginal, bucal, nasofaríngea, gastrointestinal o sublingual. La administración puede ser sistémica o tópica. La administración tópica puede implicar, por ejemplo, cateterismo, implantación, bombeo osmótico, inyección directa, aplicación dérmica/transdérmica, colocación de stent, gotas para los oídos/ojos o administración por vena porta. Los compuestos de la fórmula (I) deben ser evaluados por sus propiedades biofarmacéuticas, tales como solubilidad y estabilidad de la disolución (a través del pH), permeabilidad, etc., con el fin de seleccionar la forma de dosificación y la vía de administración más adecuados para el tratamiento de la indicación propuesta.
Las composiciones de la invención generalmente, pero no necesariamente, se administrarán como una formulación en asociación con uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables. El término “excipiente” incluye cualquier ingrediente que no sea el compuesto o compuestos de la invención, el otro componente o componentes lipídicos, y el agente biológicamente activo. Un excipiente puede impartir una característica funcional (por ejemplo, control de la tasa de liberación de fármacos) y/o no funcional (por ejemplo, auxiliar para el procesamiento o diluyente) a las formulaciones. La elección del excipiente dependerá en gran medida de factores como el modo particular de administración, el efecto del excipiente sobre la solubilidad y la estabilidad, y la naturaleza de la forma de dosificación.
Los excipientes farmacéuticamente aceptables típicos incluyen:
• diluyentes, por ejemplo, lactosa, dextrosa, sacarosa, manitol, sorbitol, celulosa y/o glicina;
• lubricantes, por ejemplo, sílice, talco, ácido esteárico, su sal de magnesio o calcio y/o polietileneglicol;
• aglutinantes, por ejemplo, silicato de aluminio de magnesio, pasta de almidón, gelatina, tragacanto, metilcelulosa, carboximetilcelulosa sódica y/o polivinilpirrolidona;
• desintegrantes, por ejemplo, almidones, agar, ácido algínico o su sal de sodio, o mezclas efervescentes; y/o
• absorbentes, colorantes, saborizantes y/o edulcorantes.
El excipiente puede ser un portador de disolución acuosa que puede contener opcionalmente una disolución amortiguadora (por ejemplo, una disolución amortiguadora de PBS) y/o un azúcar.
Una discusión exhaustiva de excipientes farmacéuticamente aceptables está disponible en Gennaro, Remington: The Science and Practice of Pharmacy 2000, 20° edición (ISBN: 0683306472).
Las composiciones de la invención pueden administrarse oralmente. La administración oral puede implicar la deglución, de modo que el compuesto entra en el tracto gastrointestinal, y/o la administración bucal, lingual o sublingual mediante la cual el compuesto entra en el torrente sanguíneo directamente desde la boca.
Las composiciones de la invención pueden administrarse parenteralmente. Los compuestos y composiciones de la invención pueden administrarse directamente en el torrente sanguíneo, en el tejido subcutáneo, en el músculo o en un órgano interno. Los medios adecuados para la administración incluyen la vía intravenosa, intraarterial, intratecal, intraventricular, intrauretral, intrasternal, intracraneal, intramuscular, intranovial y subcutánea. Los dispositivos adecuados para la administración incluyen inyectores de agujas (incluyendo microagujas), inyectores sin agujas y técnicas de infusión.
Las formulaciones parenterales suelen ser disoluciones acuosas o oleosas. Cuando la disolución es acuosa, excipientes como azúcares (incluyendo, pero sin limitarse a, glucosa manitol, sorbitol, etc.), sales, hidratos de carbono y agentes amortiguadores (preferiblemente a un pH de 3 a 9), pero, para algunas aplicaciones, pueden formularse más adecuadamente como una disolución estéril no acuosa o como una forma seca para usarse junto con un vehículo adecuado, como el agua estéril y libre de pirógenos (WFI).
Las formulaciones parenterales pueden incluir implantes derivados de polímeros degradables, tales como poliésteres (es decir, ácido poliláctico, polilactida, polilactida-co-glicolida, policapro-lactona, polihidroxibutirato), poliortoésteres y polianhídridos. Estas formulaciones pueden administrarse mediante incisión quirúrgica en el tejido subcutáneo, tejido muscular o directamente en órganos específicos.
La preparación de formulaciones parenterales en condiciones estériles, por ejemplo, por liofilización, puede lograrse fácilmente utilizando técnicas farmacéuticas estándar bien conocidas por un experto en la técnica.
La solubilidad de los compuestos y composiciones utilizados en la preparación de disoluciones parenterales puede aumentarse mediante el uso de técnicas de formulación adecuadas, como la incorporación de co-disolventes y/o agentes que mejoran la solubilidad, como tensoactivos, estructuras micelares y ciclodextrinas.
Las composiciones de la invención pueden administrarse intranasalmente o por inhalación, típicamente en forma de polvo seco (ya sea solo, como una mezcla, por ejemplo, en una mezcla seca con lactosa, o como una partícula de componentes mixtos, por ejemplo, mezclada con fosfolípidos, tal como fosfatidilcolina) desde un inhalador de polvo seco, como un aerosol desde un recipiente presurizado, bomba, pulverizador, atomizador (preferiblemente un atomizador que utiliza electrohidrodinámica para producir una niebla fina), o nebulizador, con o sin el uso de un propelente adecuado, como 1,1,1,2-tetrafluoroetano o 1,1,1,2,3,3,3-heptafluoropropano, o como gotas nasales. Para uso intranasal, el polvo puede comprender un agente bioadhesivo, por ejemplo, quitosano o ciclodextrina.
El recipiente, bomba, pulverización, atomizador o nebulizador presurizados contiene una disolución o suspensión del compuesto o compuestos de la invención que comprende, por ejemplo, etanol, etanol acuoso o un agente alternativo adecuado para dispersar, solubilizar, o extender la liberación de las composiciones de la invención, un propelente como disolvente y un tensoactivo opcional, como el trioleato de sorbitán, el ácido oleico o un ácido oligoláctico.
Antes de su uso en polvo seco o formulación en suspensión, la composición se microniza a un tamaño adecuado para su suministro por inhalación (normalmente menos de 5 micras). Esto puede lograrse mediante cualquier método de conminución apropiado, tales como molienda por chorro en espiral, molienda por chorro en lecho fluido, tratamiento con fluidos supercríticos para formar nanopartículas, homogeneización a alta presión o secado por pulverización.
Las cápsulas (hechas, por ejemplo, de gelatina o hidroxipropilmetilcelulosa), ampollas y cartuchos para su uso en un inhalador o insuflador pueden formularse para contener una mezcla en polvo del compuesto o la composición de la invención, una base en polvo adecuada, tal como la lactosa o el almidón, y un modificador del funcionamiento como /-leucina, manitol, o estearato de magnesio. La lactosa puede ser anhidra o en forma de monohidrato, preferiblemente este último. Otros excipientes adecuados incluyen dextrano, glucosa, maltosa, sorbitol, xilitol, fructosa, sacarosa y trehalosa.
Las formulaciones para la administración inhalada/intranasal pueden formularse para ser de liberación inmediata y/o modificada utilizando, por ejemplo, PGLA. Las formulaciones de liberación modificada incluyen liberación retrasada, sostenida, pulsada, controlada, dirigida y programada.
Las formulaciones adecuadas para la aplicación transdérmica incluyen una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto o una composición de la invención con portador. Los portadores ventajosos incluyen disolventes farmacológicamente aceptables absorbibles para ayudar a pasar a través de la piel del huésped. Característicamente, los dispositivos transdérmicos se presentan en forma de venda que comprende un elemento de apoyo, un depósito que contiene el compuesto opcionalmente con portadores, opcionalmente una barrera de control de velocidad para suministrar el compuesto a la piel del huésped a una velocidad controlada y predeterminada durante un período prolongado de tiempo, y medios para asegurar el dispositivo a la piel.
Las composiciones lipídicas de la invención se administran de varias maneras, incluyendo parenteral, intravenosa, sistémica, local, oral, intratumoral, intramuscular, subcutánea, intraperitoneal, inhalación, o cualquier otro método de suministro. En una realización, las composiciones se administran parenteralmente, es decir, intraarticularmente, intravenosa, intraperitonealmente, por vía subcutánea o intramuscular. En una realización específica, las composiciones liposomales se administran por infusión intravenosa o intraperitonealmente por inyección en bolo.
Las composiciones lipídicas de la invención se pueden formular como composiciones farmacéuticas adecuadas para el suministro a un sujeto. Las composiciones farmacéuticas de la invención a menudo comprenderán además una o más disoluciones amortiguadoras (por ejemplo, disolución salina amortiguada neutra o solución salina amortiguada con fosfato), carbohidratos (por ejemplo, glucosa, manosa, sacarosa, dextrosa o dextranos), manitol, proteínas, polipéptidos o aminoácidos, tales como glicina, antioxidantes, bacteriostatos, quelantes, tales como EDTA o glutatión, adyuvantes (por ejemplo, hidróxido de aluminio), solutos que hacen que la formulación sea isotónica, hipotónica o débilmente hipertónica con la sangre de un receptor, agentes suspensores, agentes espesantes y/o conservantes. Alternativamente, las composiciones de la presente invención pueden formularse como un liofilizado.
Se pueden encontrar formulaciones adecuadas para su uso en la presente invención, por ejemplo, en Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Philadelphia, Pa., 17.sup.th Ed. (1985). A menudo, las composiciones comprenderán una disolución de las nanopartículas lipídicas suspendidas en un portador aceptable, tal como un portador acuoso.
En una realización, esta invención proporciona una composición farmacéutica (es decir, formulación) que comprende una composición lipídica de la invención, y un portador o excipiente farmacéuticamente aceptable. En otra realización, al menos otro componente lipídico está presente en la composición lipídica. En otra realización, la composición lipídica está en forma de liposoma. En otra realización, la composición lipídica está en forma de una nanopartícula lipídica. En otra realización, la composición lipídica es adecuada para el suministro al hígado. En otra realización, la composición lipídica es adecuada para el suministro a un tumor. En otra realización, la composición lipídica es adecuada para aplicaciones de suministro local (ojo, oído, piel, pulmón); suministro a músculo (i.m.), grasa o células subcutáneas (dosificación s.c.). En otra realización, el agente biológicamente activo es un ARN o ADN.
Para fines de inmunización, una composición generalmente se preparará como un agente inyectable y se administrará por inyección (por ejemplo, por inyección intramuscular).
La invención también proporciona un dispositivo de suministro (por ejemplo, jeringa, nebulizador, pulverizador, inhalador, parche dérmico, etc.) que contiene una composición de la invención. Este dispositivo se puede utilizar para administrar una composición farmacéutica a un sujeto, por ejemplo, a un vertebrado (por ejemplo, un mamífero, como un humano) para la inmunización.
Células y órganos a los que se dirige la invención
Los compuestos, composiciones, métodos y usos de la invención se pueden utilizar para suministrar un agente biológicamente activo a uno o más de los siguientes en un paciente:
el hígado o las células hepáticas (por ejemplo, hepatocitos);
un riñón o células renales;
un tumor o células tumorales;
el SNC o células del SNC (Sistema Nervioso Central, por ejemplo, cerebro y/o médula espinal);
el SNP o células del SNP (Sistema Nervioso Periférico);
un pulmón o células pulmonares;
la vasculatura o células vasculares;
la piel o células de la piel (por ejemplo, células de la dermis y/o células foliculares);
un ojo o células oculares (por ejemplo, mácula, fóvea, córnea, retina), y
un oído o células del oído (por ejemplo, células del oído interno, oído medio y/u oído externo).
Los compuestos, composiciones, métodos y usos de la invención también se pueden utilizar para suministrar un agente biológicamente activo (por ejemplo, ARN que codifica un inmunógeno) a las células del sistema inmunitario.
En una realización, los compuestos, composiciones, métodos y usos de la invención son para suministrar un agente biológicamente activo a las células hepáticas (por ejemplo, hepatocitos). En una realización, los compuestos, composiciones, métodos y usos de la invención son para administrar un agente biológicamente activo a un tumor o a células tumorales (por ejemplo, un tumor primario o células cancerosas metastásicas). En otra realización, los compuestos, las composiciones, los métodos y los usos son para suministrar un agente biológicamente activo al adiposo de la piel, músculo y ganglios linfáticos (es decir, dosificación sc).
Para el suministro de un agente biológicamente activo al hígado o a las células hepáticas, en una realización se pone en contacto una composición de la invención con las células hepáticas o hepáticas del paciente, como se conoce generalmente en la técnica, por ejemplo, a través de la administración parental (por ejemplo, administración intravenosa, intramuscular, subcutánea) o administración local (por ejemplo, inyección directa, inyección de venas portales, cateterismo, stent), para facilitar el suministro.
Para el suministro de un agente biológicamente activo al riñón o a las células renales, en una realización se pone en contacto una composición de la invención con las células renales o renales del paciente, como se conoce generalmente en la técnica, por ejemplo, a través de la administración parental (por ejemplo, administración intravenosa, intramuscular, subcutánea) o vlocal (por ejemplo, inyección directa, cateterismo, stent), para facilitar el suministro.
Para el suministro de un agente biológicamente activo a un tumor o células tumorales, en una realización se pone en contacto una composición de la invención con el tumor o las células tumorales del paciente, como se conoce generalmente en la técnica, por ejemplo, a través de la administración parental (por ejemplo, administración intravenosa, intramuscular, subcutánea) o administración local (por ejemplo, inyección directa, cateterismo, stent), para facilitar el suministro.
Para el suministro de un agente biológicamente activo al SNC o a las células del SNC (por ejemplo, células cerebrales y/o células de la médula espinal), en una realización se pone en contacto una composición de la invención con el SNC o las células del SNC (por ejemplo, células cerebrales y/o células de la médula espinal). del paciente como se conoce generalmente en la técnica, por ejemplo, mediante la administración parental (por ejemplo, administración intravenosa, intramuscular, subcutánea) o administración local (por ejemplo, inyección directa, cateterismo, stent, administración por bomba osmótica (por ejemplo, intratecal o ventricular), para facilitar el suministro.
Para el suministro de un agente biológicamente activo al SNP o células del SNP, en una realización se contacta una composición de la invención con el SNP o células del SNP del paciente, como se conoce generalmente en la técnica, por ejemplo, mediante la administración parental (por ejemplo, administración intravenosa, intramuscular, subcutánea) o administración local (por ejemplo, inyección directa), para facilitar el suministro.
Para el suministro de un agente biológicamente activo a un pulmón o células pulmonares, en una realización se pone en contactaouna composición de la invención con las células pulmonares o pulmonares del paciente, como se conoce generalmente en la técnica, por ejemplo, a través de la administración parental (por ejemplo, administración intravenosa, intramuscular, subcutánea) o administración local (por ejemplo, administración pulmonar directamente a los tejidos y células pulmonares), para facilitar el suministro.
Para el suministro de un agente biológicamente activo a la vasculatura o a las células vasculares, en una realización se pone en contacto una composición de la invención con la vasculatura o las células vasculares del paciente, como se conoce generalmente en la técnica, por ejemplo, a través de la administración parental (por ejemplo, administración intravenosa, intramuscular, subcutánea) o la administración local (por ejemplo, sujeción, cateterización, colocación de stents), para facilitar el suministro.
Para el suministro de un agente biológicamente activo a la piel o a las células de la piel (por ejemplo, las células de la dermis y/o las células foliculares), en una realización se pone en contacto una composición de la invención con la piel o las células de la piel (por ejemplo, las células de la dermis y/o las células foliculares) del paciente como se conoce generalmente en la técnica, por ejemplo, mediante la administración parental (por ejemplo, administración intravenosa, intramuscular, subcutánesa) o administración local (por ejemplo, aplicación cutánea directa, iontoforesis), para facilitar el suministro.
Para el suministro de un agente biológicamente activo a un ojo o células oculares (por ejemplo, mácula, fóvea, córnea, retina), en una realización se pone en contacto una composición de la invención con las células oculares (por ejemplo, mácula, fóvea, córnea, retina) del paciente, como se conoce generalmente en la técnica, por ejemplo, a través de la administración parental (por ejemplo, administración intravenosa, intramuscular, subcutánea) o administración local (por ejemplo, inyección directa, inyección intraocular, inyección periocular, subretinal, iontoforesis, uso de gotas, implantes), para facilitar el suministro.
Para el suministro de un agente biológicamente activo a un oído o células del oído (por ejemplo, células del oído interno, oído medio y/o oído externo), en una realización la composición de la invención se pone en contacto con el oído o las células del oído (por ejemplo, células del oído interno, oído medio y/o oído externo del paciente, como se conoce generalmente en la técnica, por ejemplo, a través de la administración parental (por ejemplo, administración intravenosa, intramuscular, subcutánea) o administración local (por ejemplo, inyección directa), para facilitar el suministro.
Para el suministro de un agente biológicamente activo (por ejemplo, ARN que codifica un inmunógeno) a las células del sistema inmunológico (por ejemplo, células presentadoras de antígeno, incluidas las células presentadoras de antígeno profesionales), en una realización, la composición de la invención se suministra por vía intramuscular, después de lo cual las células inmunes pueden infiltrarse en el lugar de suministro y procesar el ARN suministrado. Estas células inmunitarias pueden incluir macrófagos (por ejemplo, macrófagos derivados de la médula ósea), células dendríticas (por ejemplo, células dendríticas plasmocitoides derivadas de la médula ósea y/o células dendríticas mieloides derivadas de la médula ósea), monocitos (por ejemplo, monocitos de sangre periférica humana), etc. (por ejemplo, véase WO2012/006372).
Inmunización de acuerdo con la invención
Con fines de inmunización, la invención implica el suministro de un ARN que codifica un inmunógeno. El inmunógeno provoca una respuesta inmunitaria que reconoce al inmunógeno, y, por lo tanto, se puede utilizar para proporcionar inmunidad contra un patógeno, contra un alérgeno, o contra un antígeno tumoral. Se prefiere la inmunización contra enfermedades y/o infecciones causadas por un patógeno.
El ARN se suministra con una composición lipídica de la invención (por ejemplo, formulada como un liposoma o LNP). Típicamente, la invención utiliza liposomas dentro de los cuales se encapsula el ARN codificante de inmunógenos. La encapsulación dentro de los liposomas puede proteger el ARN de la digestión de la RNasa. La eficiencia de encapsulación no tiene que ser del 100 %. La presencia de moléculas de ARN externas (por ejemplo, en la superficie exterior del liposoma) o moléculas de ARN “desnudas” (moléculas de ARN no asociadas con un liposoma) es aceptable. Preferiblemente, para una composición que comprende una población de liposomas y una población de moléculas de ARN, al menos la mitad de la población de moléculas de ARN (por ejemplo, al menos 50 %, al menos 55 %, al menos 60 %, al menos 65 %, al menos 70 %, al menos 75 %, al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 %, o al menos 95 % de las moléculas de ARN) están encapsuladas en liposomas.
Las moléculas de ARN también pueden ser complejadas con LNP. Por ejemplo, no es necesario que los lípidos formen liposomas (con núcleo acuoso) solamente. Algunas nanopartículas lipídicas pueden comprender un núcleo lipídico (por ejemplo, la composición puede comprender una mezcla de liposomas y nanopartículas con un núcleo lipídico). En tales casos, las moléculas de ARN pueden ser encapsuladas por LNP que tienen un núcleo acuoso, y complejadas con las LNP que tienen un núcleo lipídico mediante interacciones no covalentes (por ejemplo, interacciones iónicas entre ARN con carga negativa y lípidos catiónicos). La encapsulación y la complejación con LNP pueden proteger el ARN de la digestión de la RNasa. La eficiencia de encapsulación/complejación no tiene que ser del 100 %. La presencia de moléculas de ARN “desnudas” (moléculas de ARN no asociadas con un liposoma) es aceptable. Preferiblemente, para una composición que comprende una población de LNP y una población de moléculas de ARN, al menos la mitad de la población de moléculas de ARN (por ejemplo, al menos 50 %, al menos 55 %, al menos 60 %, al menos 65 %, al menos 70 %, al menos 75 %, al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 %, o al menos 95 % de las moléculas de ARN) están encapsuladas en LNP, o complejadas con LNP.
Liposomas y LNP
Los liposomas generalmente se dividen en tres grupos: vesículas multilamelares (MLV, por sus siglas en inglés); vesículas unilamelares pequeñas (SUV, por sus siglas en inglés); y vesículas unilamelares grandes (LUV, por sus siglas en inglés). Las MLV tienen múltiples bicapas en cada vesícula, formando varios compartimentos acuosos separados. Las SUV y LUV tienen una sola bicapa que encapsula un núcleo acuoso; las SUV típicamente tienen un diámetro <50 nm, y las LUV tienen un diámetro >50 nm. Para el suministro de ARN codificante de inmunógenos, el rango de diámetros preferido está en el rango de 60-180 nm, y más preferiblemente en el rango de 80-160 nm.
La composición lipídica también puede ser LNP. La composición puede comprender una mezcla de nanopartículas que tienen un núcleo acuoso y nanopartículas que tienen un núcleo lipídico. Para el suministro de ARN codificante de inmunógenos, el rango de diámetros preferido está en el rango de 60-180 nm, y más preferiblemente en el rango de 80 160 nm.
Un liposoma o LNP puede ser parte de una composición que comprende una población de liposomas o LNP, y los liposomas o LNP dentro de la población pueden tener un rango de diámetros. Para una composición que comprende una población de liposomas o LNP con diferentes diámetros, se prefiere que (i) al menos el 80 % en número de liposomas o LNP tengan diámetros en el rango de 60-180 nm, y preferiblemente en el rango de 80-160 nm, (ii) el diámetro promedio (por intensidad, por ejemplo, Z promedio) de la población está idealmente en el rango de 60-180 nm, y preferiblemente en el rango de 80-160 nm; y/o (iii) los diámetros dentro de la pluralidad tienen un índice de polidispersión <0,2.
Para obtener liposomas o LNP con el diámetro o diámetros deseados, el mezclado se puede realizar mediante un proceso en el que dos corrientes de alimentación de disolución acuosa de ARN se combinan en una sola zona de mezclado con una corriente de una disolución lipídica etanólica, todos con la misma tasa de flujo, por ejemplo, en un canal microfluídico.
Las mezclas útiles de lípidos, para la formación de composiciones lipídicas (por ejemplo, liposomas o LNP) para usos de inmunización, comprenden: un lípido de fórmula (I); colesterol; y un lípido PEGilado, como PEG-DMG, es decir, 1 ,2-dimiristoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-[metoxi(polietilenglicol) conjugado con PEG. Esta mezcla también puede incluir un lípido zwitteriónico neutro, como DSPC (1,2-Diastearoil-sn-glicero-3-fosfocolina) o DPyPE. Estas (y otras) mezclas se utilizan en los ejemplos.
Moléculas de ARN
Después de la administraciónin vivode una composición de inmunización, el ARN suministrado se libera y se traduce dentro de una célula para proporcionar el inmunógenoin situ.En ciertas realizaciones, el ARN tiene una cadena positiva (“+”), por lo que puede ser traducido por las células sin necesidad de ningún paso de replicación interviniente, como la transcripción inversa. También puede unirse a los receptores TLR7 expresados por las células inmunes, iniciando así un efecto adyuvante.
En ciertas realizaciones, el ARN es un ARN auto-replicante. Una molécula de ARN auto-replicante (replicón) puede, cuando se suministra a una célula de vertebrado, incluso sin proteínas, conducir a la producción de múltiples ARN hijos por transcripción de sí misma (a través de una copia antisentido que genera a partir de sí misma). Una molécula de ARN auto-replicante es, por lo tanto, típicamente una molécula de cadena que puede ser traducida directamente después de el suministro a una célula, y esta traducción proporciona una ARN polimerasa dependiente de ARN que luego produce transcripciones sentido y antisentido del ARN suministrado. Por lo tanto, el ARN suministrado conduce a la producción de múltiples ARN hijos. Estos ARN hijos, así como transcripciones subgenómicas colineales, pueden traducirse para proporcionar la expresiónin situde un inmunógeno codificado, o pueden transcribirse para proporcionar transcripciones adicionales con el mismo sentido que el ARN suministrado que se traducen para proporcionar la expresiónin situdel inmunógeno. El resultado general de esta secuencia de transcripciones es la amplificación en el número de ARN de replicón introducidos y así el inmunógeno codificado se convierte en un producto polipéptido importante de la célula huésped.
Un sistema adecuado para lograr la auto-replicación es utilizar un replicón de ARN basado en alfavirus. Estos replicones de cadena (+) se traducen después de el suministro a una célula para dar una replicasa (o replicasa-transcriptasa). La replicasa se traduce como una poliproteína que se divide automáticamente para proporcionar un complejo de replicación que crea copias genómicas (-) del ARN suministrado de cadena (+). Estas transcripciones de cadena (-) pueden ser transcritas para dar copias adicionales del ARN padre de cadena (+) y también para dar una transcripción subgenómica que codifica el inmunógeno. La traducción de la transcripción subgenómica conduce así a la expresiónin situdel inmunógeno por la célula infectada. Las replicones de alfavirus adecuados pueden usar una replicasa de un virus sindbis, un virus del bosque semliki, un virus de encefalitis equina oriental, un virus de encefalitis equina venezolana, etc. Se pueden utilizar secuencias de virus mutantes o de tipo silvestre, por ejemplo, el mutante atenuado TC83 de VEEV se ha utilizado en replicones.
Una molécula de ARN auto-replicante preferida codifica (i) una ARN polimerasa dependiente de ARN que puede transcribir ARN de la molécula de ARN auto-replicante y (ii) un inmunógeno. La polimerasa puede ser una replicasa de alfavirus, por ejemplo, que comprende una o más proteínas de alfavirus nsP1, nsP2, nsP3 y nsP4.
Mientras que los genomas naturales del alfavirus codifican las proteínas estructurales del virión además de la poliproteína replicasa no estructural, se prefiere que una molécula de ARN auto-replicante de la invención no codifique las proteínas estructurales del alfavirus. Por lo tanto, un ARN auto-replicante preferido puede conducir a la producción de copias genómicas de ARN de sí mismo en una célula, pero no a la producción de viriones que contienen ARN. La incapacidad de producir estos viriones significa que, a diferencia de un alfavirus de tipo silvestre, la molécula de ARN auto-replicante no puede perpetuarse en forma infecciosa. Las proteínas estructurales del alfavirus que son necesarias para la perpetuación en los virus de tipo silvestre están ausentes de los ARN auto-replicantes de la invención y su lugar es tomado por el gen o genes que codifican el inmunógeno de interés, de tal manera que la transcripción subgenómica codifica el inmunógeno en lugar de las proteínas estructurales del virión de alfavirus.
Por lo tanto, una molécula de ARN auto-replicante útil con la invención puede tener dos marcos de lectura abiertos. El primer marco de lectura abierto (5') codifica una replicasa; el segundo marco de lectura abierto (3') codifica un inmunógeno. En algunas realizaciones, el ARN puede tener marcos de lectura abiertos adicionales (por ejemplo, cadena abajo), por ejemplo, para codificar más inmunógenos (véase a continuación) o para codificar polipéptidos accesorios.
Una molécula de ARN auto-replicante puede tener una secuencia 5' que es compatible con la replicasa codificada.
Las moléculas de ARN auto-replicantes pueden tener varias longitudes, pero típicamente tienen una longitud de 5000 25000 nucleótidos, por ejemplo, 8000-15000 nucleótidos, o 9000-12000 nucleótidos. Por lo tanto, el ARN es más largo de lo que se ve en el suministro de ARNip.
Una molécula de ARN puede tener una caperuza 5' (por ejemplo, una 7-metilguanosina). Esta caperuza puede mejorar la traducciónin vivodel ARN.
El nucleótido 5' de una molécula de ARN útil con la invención puede tener un grupo de trifosfato 5'. En un ARN protegido con caperuza, puede estar ligado a una 7-metilguanosina a través de un puente de 5'-a-5'. Un trifosfato 5' puede mejorar la unión RIG-I y, por lo tanto, promover efectos adyuvantes.
Una molécula de ARN puede tener una cola de poli A 3'. También puede incluir una secuencia de reconocimiento de polimerasa A (por ejemplo, AAUAAA) cerca de su extremo 3'.
Una molécula de ARN útil con la invención para propósitos de inmunización típicamente será de cadena única. Los ARN de cadena única generalmente pueden iniciar un efecto adyuvante mediante la unión a TLR7, TLR8, ARN helicasas y/o PKR. El ARN suministrado en forma de doble cadena (ARNbc) puede unirse a TLR3, y este receptor también puede ser activado por ARNbc que se forma ya sea durante la replicación de un ARN de una sola cadena o dentro de la estructura secundaria de un ARN de cadena única.
Las moléculas de ARN para propósitos de inmunización pueden ser preparadas convenientemente por transcripciónin vitro(IVT). La IVT puede usar un molde (ADNc) creada y propagada en forma de plásmido en bacterias, o creada sintéticamente (por ejemplo, mediante métodos de ingeniería de síntesis génica y/o reacción de cadena de polimerasa (PCR)). Por ejemplo, una ARN polimerasa dependiente del ADN (como las ARN polimerasas de bacteriófago T7, T3 o SP6) se puede utilizar para transcribir el ARN de un molde de ADN. Las reacciones apropiadas de adición de poli A y protección con caperuza pueden usarse según sea necesario (aunque el poli A del replicón generalmente está codificado dentro de la plantilla de ADN). Estas ARN polimerasas pueden tener requisitos estrictos para el (los) nucleótido(s) 5' transcrito(s), y en algunas realizaciones estos requisitos deben ser emparejados con los requisitos de la replicasa codificada, para asegurar que el ARN transcrito IVT puede funcionar eficientemente como un sustrato para su replicasa autocodificada.
Como se discutió en WO2011/005799, el ARN auto-replicante puede incluir (además de cualquier estructura de caperuza 5') uno o más nucleótidos que tengan una nucleobase modificada. Por ejemplo, un ARN auto-replicante puede incluir una o más nucleobasas de pirimidina modificadas, como pseudouridina y/o 5 residuos de metilcitosina. En algunas realizaciones, sin embargo, el ARN no incluye nucleobasas modificadas, y puede incluir nucleótidos modificados, es decir, todos los nucleótidos en el ARN son ribonucleótidos estándar A, C, G y U (excepto cualquier estructura de caperuza 5', que puede incluir una metilguanosina 7'). En otras realizaciones, el a Rn puede incluir una caperuza 5' que comprende una metilguanosina 7', y los primeros 1, 2 o 3 ribonucleótidos 5' pueden ser metilados en la posición 2' de la ribosa.
Un ARN usado con la invención para propósitos de inmunización idealmente incluye solamente enlaces de fosfodiéster entre nucleósidos, pero en algunas realizaciones puede contener enlaces de fosforamidato, fosforotioato, y/o metilfosfonato.
Inmunógenos
Las moléculas de ARN utilizadas con la invención para fines de inmunización codifican un inmunógeno polipeptídico. Después de la administración, el ARN se traducein vivoy el inmunógeno puede provocar una respuesta inmune en el receptor. El inmunógeno puede provocar una respuesta inmunitaria contra un patógeno (por ejemplo, una bacteria, un virus, un hongo o un parásito) pero, en algunas realizaciones, provoca una respuesta inmunitaria contra un alérgeno o un antígeno tumoral. La respuesta inmunitaria puede comprender una respuesta de anticuerpos (generalmente incluyendo IgG) y/o una respuesta inmunitaria mediada por células. El inmunógeno polipéptido normalmente provocará una respuesta inmunitaria que reconoce el correspondiente polipéptido patógeno (o alérgeno o tumor), pero en algunas realizaciones el polipéptido puede actuar como un mimótopo para provocar una respuesta inmunitaria que reconoce un sacárido. El inmunógeno será típicamente un polipéptido de superficie, por ejemplo, una adhesina, una hemaglutinina, una glicoproteína envolvente, una glicoproteína de espiga, etc.
La molécula de ARN puede codificar un único inmunógeno polipeptídico o múltiples polipéptidos. Los inmunógenos múltiples se pueden presentar como un único inmunógeno polipeptídico (polipéptido de fusión) o como polipéptidos separados. Si los inmunógenos se expresan como polipéptidos separados de un replicón, uno o más de estos pueden estar provistos de un IRES cadena arriba o un elemento promotor viral adicional. Alternativamente, múltiples inmunógenos pueden expresarse a partir de una poliproteína que codifica inmunógenos individuales fusionados con una proteasa autocatalítica corta (por ejemplo, proteína 2A del virus de la fiebre aftosa), o como inteínas.
En algunas realizaciones el inmunógeno provoca una respuesta inmune contra una de estas bacterias:
Neisseria meningitidis:los inmunógenos útiles incluyen proteínas de membrana, tales como adhesinas, autotransportadores, toxinas, proteínas de adquisición de hierro y proteína de unión al factor H. Una combinación de tres polipéptidos útiles se divulga en Giuliani et al. (2006) Proc Natl Acad Sci USA 103(29): 10834-9.
Streptococcus pneumoniae:los inmunógenos polipéptidos útiles se divulgan en WO2009/016515. Estos incluyen la subunidad RrgB pilus, el precursor de la beta-N-acetil-hexosaminidasa (spr0057), spr0096, la proteína de estrés general GSP-781 (spr2021, SP2216), la serina/treonina cinasa StkP (SP1732) y la adhesina neumocócica de superficie PsaA.
Streptococcus pyogenes:los inmunógenos útiles incluyen los polipéptidos divulgados en WO02/34771 y WO2005/032582.
Moraxella catarrhalis.
Bordetella pertussis:Los inmunógenos útiles para la tosferina incluyen la toxina o toxoide para la tosferina (PT), hemaglutinina filamentosa (FHA), pertactina y aglutinógenos 2 y 3.
Staphylococcus aureus:Los inmunógenos útiles incluyen los polipéptidos divulgados en WO2010/119343, como una hemolisina, esxA, esxB, proteína de unión a ferricromo (sta006) y/o la lipoproteína sta011.
Clostridium tetani:el inmunógeno típico es el toxoide tetánico.
Cornynebacterium diphtheriae:el inmunógeno típico es el toxoide diftérico.
Haemophilus influenzae:Los inmunógenos útiles incluyen los polipéptidos divulgados en WO2006/110413 y WO2005/111066.
Pseudomonas aeruginosa
Streptococcus agalactiae:los inmunógenos útiles incluyen los polipéptidos divulgados en WO02/34771.
Chlamydia trachomatis:Los inmunógenos útiles incluyen PepA, LcrE, ArtJ, DnaK, CT398, OmpH-like, L7/L12, OmcA, AtoS, CT547, Eno, HtrA y MurG (por ejemplo, según se divulga en WO2005/002619). LcrE (W 02006/138004) y HtrA (WO2009/109860) son dos inmunógenos preferidos.
Chlamydia pneumoniae: Los inmunógenos útiles incluyen los polipéptidos divulgados en WO02/02606.
Helicobacterpylori:Los inmunógenos útiles incluyen CagA, VacA, NAP, y/o ureasa (WO03/018054).
Escherichia coli:Los inmunógenos útiles incluyen inmunógenos derivados deE. colienterotoxigénica (ETEC),E. colienteroagregativa (EAggEC),E. colide adherencia difusa (DAEC),E. colienteropatógena (EPEC),E. colipatógena extraintestinal (ExPEC) y/oE. colienterohemorrágica (EHEC). Las cepas de ExPEC incluyenE.coliuropatógena (UPEC) yE.coliasociada a meningitis/sepsis (MNEC). Los inmunógenos UPEC útiles se divulgan en WO2006/091517 y WO2008/020330. Los inmunógenos MNEC útiles se divulgan en WO2006/089264. Un inmunógeno útil para varios tipos deE. colies AcfD (WO2009/104092).
Bacillus anthracis
Yersinia pestis:Los inmunógenos útiles incluyen los divulgados en WO2007/049155 y WO2009/031043.
Staphylococcus epidermis
Clostridium perfringensoClostridium botulinums
Legionella pneumophila
Coxiella bumetii
Brucella,tal como B.abortus, B.canis, B.melitensis, B.neotomae, B.ovis, B.suis, B.pinnipediae.
Francisella,tal comoF.novicida, F.philomiragia, F.tularensis.
Neisseria gonorrhoeae
Treponema pallidum
Haemophilus ducreyi
Enterococcus faecalisoEnterococcus faecium
Staphylococcus saprophyticus
Yersinia enterocolitica
Mycobacterium tuberculosis
Rickettsia
Listeria monocytogenes
Vibrio cholerae
Salmonella typhi
Borrelia burgdorferi
Porphyromonas gingivalis
Klebsiella
En algunas realizaciones, el inmunógeno provoca una respuesta inmune contra uno de estos virus:
Ortomixovirus: Los inmunógenos útiles pueden ser de un virus de la influenza A, B o C, tal como la hemaglutinina, la neuraminidasa o las proteínas de matriz M2. Cuando el inmunógeno es un virus de la influenza A, la hemaglutinina puede ser de cualquier subtipo, por ejemplo, H1, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15 o H16. Virus Paramyxoviridae: los inmunógenos incluyen los derivados de neumovirus (por ejemplo, virus sincitial respiratorio, RSV, por sus siglas en inglés), Rubulavirus (por ejemplo, virus de las paperas), Paramixovirus (por ejemplo, virus de la parainfluenza), Metapneumovirus y Morbillivirus (por ejemplo, virus del sarampión).
Poxviridae: los inmunógenos incluyen aquellos derivados del Orthopoxvirus, tales comoVariola vera,incluyendo Variola mayor y Variola menor.
Picornavirus: los inmunógenos incluyen aquellos derivados de picornavirus, tales como los enterovirus, rinovirus, heparnavirus, cardiovirus y aftovirus. En una realización, el enterovirus es un poliovirus, por ejemplo, un poliovirus tipo 1, tipo 2 y/o tipo 3. En otra realización, el enterovirus es un enterovirus EV71. En otra realización, el enterovirus es un virus coxsackie A o B.
Bunyavirus: los inmunógenos incluyen aquellos derivados de un Orthobunyavirus, tales como el virus de la encefalitis de California, un flebovirus, tal como el virus de la fiebre del Valle del Rift, o un nairovirus, tal como el virus de la fiebre hemorrágica de Crimea-Congo.
Heparnavirus: los inmunógenos incluyen aquellos derivados de un Heparnavirus, tal como el virus de la hepatitis A (VHA). Filovirus: los inmunógenos incluyen los derivados de un filovirus, tal como un virus del Ébola (incluyendo un virus del Zaire, Costa de Marfil, Reston o Sudán) o un virus de Marburgo.
Togavirus: los inmunógenos incluyen aquellos derivados de un Togavirus, tal como un Rubivirus, un Alfavirus o un Arterivirus. Esto incluye el virus de la rubéola.
Flavivirus: los inmunógenos incluyen los derivados de un Flavivirus, tal como el virus de la encefalitis transmitida por garrapatas (TBE, por sus siglas en inglés), el virus del dengue (tipos 1, 2, 3 o 4), el virus de la fiebre amarilla, el virus de la encefalitis japonesa, el virus del bosque de Kyasanur, el virus de la encefalitis del Nilo occidental, el virus de la encefalitis de Louis, virus de la encefalitis rusa de primavera-verano, virus de la encefalitis de Powassan.
Pestivirus: los inmunógenos incluyen aquellos derivados de un Pestivirus, como la Diarrea Viral Bovina (DVB), la Peste Porcina Clásica (PPC) o la Enfermedad Fronteriza (BDV, por sus siglas en inglés).
Hepadnavirus: los inmunógenos incluyen aquellos derivados de un Hepadnavirus, como el virus de la hepatitis B. Una composición puede incluir el antígeno de superficie del virus de la hepatitis B (HBsAg).
Otros virus de la hepatitis: Una composición puede incluir un inmunógeno de un virus de la hepatitis C, el virus de la hepatitis delta, el virus de la hepatitis E o el virus de la hepatitis G.
Rhabdovirus: los inmunógenos incluyen aquellos derivados de un Rhabdovirus, tal como un Lisavirus (por ejemplo, un virus de la rabia) y Vesiculovirus (VSV).
Caliciviridae: los inmunógenos incluyen los derivados de Calciviridae, como el virus Norwalk (Norovirus), y los virus similares a Norwalk, como el virus Hawaii y el virus Snow Mountain.
Coronavirus: los inmunógenos incluyen aquellos derivados de un coronavirus del SARS, bronquitis infecciosa aviar (BIA), virus de la hepatitis del ratón (MHV, por sus siglas en inglés) y virus de la gastroenteritis transmisible porcina (TGEV, por sus siglas en inglés). El inmunógeno del coronavirus puede ser un polipéptido de espiga
Retrovirus: los inmunógenos incluyen los derivados de un Oncovirus, un lentivirus (por ejemplo, VIH-1 o VIH-2) o un Spumavirus.
Reovirus: los inmunógenos incluyen aquellos derivados de un Orthoreovirus, un Rotavirus, un Orbivirus o un Coltivirus.
Parvovirus: los inmunógenos incluyen los derivados del Parvovirus B19.
Herpesvirus: los inmunógenos incluyen los derivados de un herpesvirus humano, tales como, únicamente a modo de ejemplo, los virus del herpes simple (VHS) (por ejemplo, los tipos 1 y 2 del VHS), el virus de la varicela-zoster (VZV, por sus siglas en inglés), el virus de Epstein-Barr (VEB), el citomegalovirus (CMV),
El Herpesvirus humano 6 (HHV6), el Herpesvirus humano 7 (HHV7) y el Herpesvirus humano 8 (HHV8).
Papovavirus: los inmunógenos incluyen los derivados de papilomavirus y poliomavirus. El virus del papiloma (humano) puede ser del serotipo 1, 2, 4, 5, 6, 8, 11, 13, 16, 18, 31, 33, 35, 39, 41, 42, 47, 51, 57, 58, 63 o 65, por ejemplo, de uno o más de los serotipos 6, 11, 16 y/o 18.
Adenovirus: los inmunógenos incluyen los derivados del serotipo 36 (Ad-36).
En algunas realizaciones, el inmunógeno provoca una respuesta inmune contra un virus que infecta a los peces, tales como: virus infeccioso de la anemia del salmón (ISAV), virus de la enfermedad pancreática del salmón (SPDV), virus infeccioso de la necrosis pancreática (IPNV), virus del bagre de canal (CCV), virus de la enfermedad de linfocistis de los peces (FLDV), virus infeccioso de la necrosis hematopoyética (IHNV), herpesvirus de la carpa koi, virus similar al picorna del salmón (también conocido como virus similar al picorna del salmón del atlántico), virus del salmón sin litoral (LSV), rotavirus del salmón atlántico (ASR), virus de la enfermedad de la fresa de la trucha (TSD), virus tumoral del salmón coho (CSTV) o virus de la septicemia hemorrágica viral (VHSV).
Los inmunógenos fúngicos pueden derivarse de Dermatophytres, incluyendo:Epidermophyton floccusum, Microsporum audouini, Microsporum canis, Microsporum distortum, Microsporum equinum, Microsporum gypsum, Microsporum nanum, Trichophyton concentricum, Trichophyton equinum, Trichophyton gallinae, Trichophyton gypseum, Trichophyton megnini, Trichophyton mentagrophytes, Trichophyton quinckeanum, Trichophyton rubrum, Trichophyton schoenleini, Trichophyton tonsurans, Trichophyton verrucosum, T. verrucosum var. album, var. discoides, var. ochraceum, Trichophyton violaceum,y/oTrichophyton faviforme;o deAspergillus fumigatus, Aspergillus flavus, Aspergillus niger, Aspergillus nidulans, Aspergillus terreus, Aspergillus sydowi, Aspergillus flavatus, Aspergillus glaucus, Blastoschizomyces capitatus, Candida albicans, Candida enolase, Candida tropicalis, Candida glabrata, Candida krusei, Candida parapsilosis, Candida stellatoidea, Candida kusei, Candida parakwsei, Candida lusitaniae, Candida pseudotropicalis, Candida guilliermondi, Cladosporium carrionii, Coccidioides immitis, Blastomyces dermatidis, Cryptococcus neoformans, Geotrichum clavatum, Histoplasma capsulatum, Klebsiella pneumoniae, Microsporidia, Encephalitozoon spp., Septata intestinalisyEnterocytozoon bieneusi;los menos comunes sonBrachiola spp, Microsporidium spp., Nosema spp., Pleistophora spp., Trachipleistophora spp., Vittaforma spp., Paracoccidioides brasiliensis, Pneumocystis carinii, Pythiumn insidiosum, Pityrosporum ovale, Sacharomyces cerevisae, Saccharomyces boulardii, Saccharomyces pombe, Scedosporium apiosperum, Sporothrix schenckii, Trichosporon beigelii, Toxoplasma gondii, Penicillium marneffei, Malassezia spp., Fonsecaea spp., Wangiella spp., Sporothrix spp., Basidiobolus spp., Conidiobolus spp., Rhizopus spp, Mucor spp, Absidia spp, Mortierella spp, Cunninghamella spp, Saksenaea spp., Alternaría spp, Curvularia spp, Helminthosporium spp, Fusarium spp, Aspergillus spp, Penicillium spp, Monolinia spp, Rhizoctonia spp, Paecilomyces spp, Pithomyces spp,yCladosporium spp.
En algunas realizaciones el inmunógeno provoca una respuesta inmune contra un parásito del géneroPlasmodium,comoP. falciparum, P. vivax, P. malariaeoP. ovale.Por lo tanto, la invención puede utilizarse para la inmunización contra la malaria. En algunas realizaciones, el inmunógeno provoca una respuesta inmune contra un parásito de la familiaCaligidae,particularmente aquellos de los génerosLepeophtheirusyCaligus,por ejemplo, piojos de mar, comoLepeophtheirus salmonisoCaligus rogercresseyi.
En algunas realizaciones, el inmunógeno provoca una respuesta inmunitaria contra: alérgenos de polen (alérgenos de polen de árboles, hierbas, malezas y pasto); alérgenos de insectos o arácnidos (alérgenos de inhalantes, saliva y veneno, por ejemplo. alérgenos de ácaros, alérgenos de cucarachas y mosquitos, alérgenos de veneno de himenoptera); alérgenos de pelo animal y caspa (por ejemplo, de perro, gato, caballo, rata, ratón, etc.); y alérgenos alimentarios (por ejemplo, una gliadina). Los alérgenos polínicos importantes de árboles, gramíneas y hierbas son los procedentes de los órdenes taxonómicos Fagales, Oleales, Pinales y platanaceae, incluido el abedul(Betula),aliso(Alnus),avellano(Corylus),carpe(Carpinus)y oliva (Olea), cedro(CryptomeriayJuniperus),platanero(Platanus),el orden de las Poales que incluye las gramíneas de los génerosLolium, Phleum, Poa, Cynodon, Dactylis, Holcus, Phalaris, Secale,ySorghum,los órdenes deAsteralesyUrticales,incluidas las hierbas de los génerosAmbrosia, Artemisia,yParietaria.Otros alérgenos de inhalación importantes son los de los ácaros del polvo doméstico del géneroDermatophagoidesyEuroglyphus,ácaros de almacenamiento, por ejemplo,Lepidoglyphys, GlycyphagusyTyrophagus,los de cucarachas, mosquitos y pulgas, por ejemplo,Blatella, Periplaneta, ChironomusyCtenocefalides,y los de mamíferos como el gato, el perro y el caballo, alérgenos de veneno, incluidos los originados de insectos que pican o muerden, tales como los del orden taxonómico deHymenoptera,incluidas las abejas(Apidae),avispas(Vespidea),y hormigas(Formicoidae).
En algunas realizaciones el inmunógeno es un antígeno tumoral seleccionado de: (a) antígenos testiculares del cáncer, tales como NY-ESO-1, SSX2, SCP1 así como polipéptidos de la familia RAGE, B<a>GE, GAGE y MAGE, por ejemplo, GAGE-1, GAGE-2, MAGE-1, MAGE-2, MAGE-3, MAGE-4, MAGE-5, MAGE-6, y MAGE-12 (que pueden utilizarse, por ejemplo, para abordar los tumores de melanoma, pulmón, cabeza y cuello, CPNM, mama, gastrointestinal y vejiga; (b) antígenos mutados, por ejemplo, p53 (asociado a diversos tumores sólidos, por ejemplo, cáncer colorrectal, de pulmón, de cabeza y cuello), p21/Ras (asociado a, por ejemplo, melanoma, cáncer de páncreas y cáncer colorrectal), CDK4 (asociado a, por ejemplo, melanoma), MUM1 (asociado a, por ejemplo, melanoma), caspasa-8 (asociada a, por ejemplo, cáncer de cabeza y cuello), CIA 0205 (asociado a, por ejemplo, cáncer de vejiga), HLA-A2-R1701, beta catenina (asociada a, por ejemplo, melanoma), TCR (asociado a, por ejemplo, linfoma no Hodgkin de células T), BCR-abl (asociado a, por ejemplo, leucemia mielógena crónica), triosafosfato isomerasa, KIA 0205, CDC-27, y LDLR-FUT; (c) antígenos sobreexpresados, por ejemplo, Galectina 4 (asociada a, por ejemplo, cáncer colorrectal), Galectina 9 (asociada a, por ejemplo, enfermedad de Hodgkin), proteinasa 3 (asociada a, por ejemplo, leucemia mielógena crónica), WT 1 (asociado a, por ejemplo, diversas leucemias), anhidrasa carbónica (asociada a, por ejemplo, cáncer renal), aldolasa A (asociada a, por ejemplo, cáncer de pulmón), PRAME (asociado a, por ejemplo, melanoma), HER-2/neu (asociado a, por ejemplo, cáncer de mama, colon, pulmón y ovario), mamaglobina, alfa-fetoproteína (asociada a, por ejemplo, hepatoma), KSA (asociado a, por ejemplo, cáncer colorrectal), gastrina (asociada a, por ejemplo, cáncer de páncreas y gástrico), proteína catalítica de la telomerasa, MUC-1 (asociado a, por ejemplo, cáncer de mama y ovario), G-250 (asociado a, por ejemplo, carcinoma de células renales), p53 (asociado a, por ejemplo, cáncer de mama, de colon), y antígeno carcinoembrionario (asociado a, por ejemplo, cáncer de mama, cáncer de pulmón, y cánceres del tracto gastrointestinal, tal como cáncer colorrectal); d) antígenos compartidos, por ejemplo, antígenos de diferenciación melanoma-melanocito, tales como MART-1/Melan A, gp100, MC1R, receptor de la hormona estimulante de melanocitos, tirosinasa, proteína relacionada con la tirosinasa-1/TRP1 y proteína relacionada con la tirosinasa-2/TRP2 (asociada a, por ejemplo, melanoma); (e) antígenos asociados a la próstata, tales como PAP, PSA, PSMA, PSH-P1, PSM-P1, PSM-P2, asociados a, por ejemplo, cáncer de próstata; (f) idiotipos de inmunoglobulina (asociados a mieloma y a linfomas de células B, por ejemplo). En ciertas realizaciones, los inmunógenos tumorales incluyen p15, Hom/Mel-40, H-Ras, E2A-PRL, H4-RET,<i>G<h>-IGK, MYL-RAR, antígenos del virus de Epstein Barr, EBNA, antígenos del virus del papiloma humano (VPH), incluyendo E6 y E7, antígenos del virus de la hepatitis B y C, antígenos del virus linfotrópico de células T humanas, TSP-180, p185erbB2, p180erbB-3, c-met, mn-23H1, TAG-72-4, CA 19-9, CA 72-4, CAM 17.1, NuMa, K-ras, p16, TAGE, PSCA, CT7, 43-9F, 5T4, 791 Tgp72, beta-HCG, BCA225, BTAA, CA 125, CA 15-3 (CA 27.29\BCAA), CA 195, CA 242, CA-50, CAM43, CD68\KP1 , CO-029, FGF-5, Ga733 (EpCAM), HTgp-175, M344, MA-50, MG7-Ag, MOV18, NB/70K, NY-CO-1 , RCAS1 , SDCCAG16, TA-90 (proteína de unión a Mac-2/proteína asociada a la ciclofilina C), TAAL6, TAG72, TLP, TPS.
Composiciones farmacéuticas
Una composición farmacéutica de la invención, particularmente una útil para la inmunización, puede incluir uno o más inmunopotenciadores de moléculas pequeñas. Por ejemplo, la composición puede incluir un agonista TLR2 (por ejemplo, Pam3CSK4), un agonista de TLR4 (por ejemplo, un aminoalquil glucosaminida fosfato, como E6020), un agonista TLR7 (por ejemplo, Imiquimod), un agonista TLR8 (por ejemplo, resiquimod) y/o un agonista TLR9 (por ejemplo, IC31). Cualquier agonista de este tipo idealmente tiene un peso molecular de <2000 Da. Tales agonistas pueden, en algunas realizaciones, ser encapsulados con el ARN dentro de los liposomas, o encapsulados o complejados con LNP, pero en otras realizaciones son no encapsulados o no complejados.
Las composiciones farmacéuticas de la invención pueden tener una osmolalidad de entre 200 mOsm/kg y 400 mOsm/kg, por ejemplo, entre 240-360 mOsm/kg, o entre 290-310 mOsm/kg. Las composiciones farmacéuticas de la invención pueden incluir uno o más conservantes, como tiomersal o 2-fenoxietanol. Se prefieren las composiciones libres de mercurio, y se pueden preparar vacunas libres de conservantes.
Las composiciones comprenden una cantidad inmunológicamente efectiva de composiciones lipídicas descritas en la presente (por ejemplo, liposomas y LNP), así como cualquier otro componente, según sea necesario. La cantidad inmunológicamente efectiva se refiere a la cantidad administrada a un individuo, ya sea en una sola dosis o como parte de una serie, es eficaz para el tratamiento (por ejemplo, respuesta inmune profiláctica contra un patógeno). Esta cantidad varía en función de la salud y el estado físico del individuo a tratar, la edad, el grupo taxonómico del individuo a tratar (e.primates no humanos, primates, etc.), la capacidad del sistema inmune del individuo para sintetizar anticuerpos, el grado de protección deseado, la formulación de la vacuna, la evaluación del médico tratante de la situación médica, y otros factores relevantes. Se espera que la cantidad se encuentre en un rango relativamente amplio que se puede determinar a través de ensayos de rutina. Las composiciones de la invención se expresarán generalmente en términos de la cantidad de ARN por dosis. Una dosis preferida tiene <100 pg de ARN (por ejemplo, a partir de 10-100 pg, tal como aproximadamente 10 pg, 25 pg, 50 pg, 75 pg o 100 pg), pero la expresión puede observarse en niveles mucho más bajos, por ejemplo, <1 pg/dosis, <100 ng/dosis, <10 ng/dosis, <1 ng/dosis, etc.
La invención también proporciona un dispositivo de suministro (por ejemplo, jeringa, nebulizador, pulverizador, inhalador, parche dérmico,etc.) que contiene una composición farmacéutica de la invención. Este dispositivo se puede utilizar para administrar la composición a un sujeto vertebrado.
Los liposomas o LNP de la invención no comprenden ribosomas.
Métodos de tratamiento y usos médicos
El ARN formulado por liposomas o LNP y las composiciones farmacéuticas descritas en la presente son para usoin vivopara inducir una respuesta inmune contra un inmunógeno de interés.
La invención proporciona un método para inducir una respuesta inmune en un vertebrado que comprende la administración de una cantidad efectiva de ARN formulado por liposomas o LNP, o composición farmacéutica, como se describe en la presente. La respuesta inmune es preferiblemente protectora, y preferiblemente involucra anticuerpos y/o inmunidad mediada por células. Las composiciones se pueden utilizar tanto con fines de cebado como de refuerzo. Alternativamente, un programa de inmunización cebador-refuerzo puede ser una mezcla de ARN y el antígeno polipéptido correspondiente (por ejemplo, cebador de ARN, refuerzo de proteínas).
La invención también proporciona un liposoma, LNP, o composición farmacéutica para su uso en la inducción de una respuesta inmune en un vertebrado.
La invención también proporciona el uso de un liposoma, LNP, o composición farmacéutica en la fabricación de un medicamento para inducir una respuesta inmune en un vertebrado.
Al inducir una respuesta inmune en el vertebrado por estos usos y métodos, el vertebrado puede ser protegido contra diversas enfermedades y/o infecciones, por ejemplo, contra las enfermedades bacterianas y/o virales como se discutió anteriormente. Los liposomas, las LNP y las composiciones son inmunogénicos, y son más preferiblemente composiciones de vacunas. Las vacunas de acuerdo con la invención pueden ser profilácticas (por ejemplo,para prevenir la infección) o terapéutica (por ejemplo, para tratar la infección), pero por lo general será profiláctico.
El vertebrado es preferiblemente un mamífero, tal como un humano o un mamífero veterinario grande (por ejemplo, caballos, bovinos, ciervos, cabras, cerdos). Como se usa en la presente, “mamífero grande” se refiere a los mamíferos que tienen un peso adulto típico o promedio de al menos 5 kg, preferiblemente al menos 7 kg. Tales mamíferos grandes pueden incluir, por ejemplo, humanos, primates no humanos, perros, cerdos, ganado vacuno, ciervos, cabras, y pretende excluir mamíferos pequeños, como ratones, ratas, cobayas y otros roedores.
Cuando la vacuna es para uso profiláctico, el ser humano es preferiblemente un niño (por ejemplo, un niño pequeño o un bebé) o un adolescente; cuando la vacuna es para uso terapéutico, el ser humano es preferiblemente un adolescente o un adulto. Una vacuna destinada a los niños también se puede administrar a los adultos, por ejemplo, para evaluar la seguridad, dosificación, inmunogenicidad, etc.
Las vacunas preparadas de acuerdo con la invención pueden usarse para tratar tanto a niños como a adultos. Por lo tanto, un paciente humano puede tener menos de 1 año de edad, menos de 5 años de edad, 1-5 años de edad, 5-15 años de edad, 15-55 años de edad, o al menos 55 años de edad. Los pacientes preferidos para recibir las vacunas son los ancianos (por ejemplo, >50 años, >60 años, y preferiblemente >65 años), los jóvenes (por ejemplo, <5 años), pacientes hospitalizados, trabajadores sanitarios, personal militar, mujeres embarazadas, enfermos crónicos o pacientes inmunodeficientes. Sin embargo, las vacunas no son adecuadas únicamente para estos grupos y pueden usarse de manera más general en una población. Las composiciones de la invención generalmente se administrarán directamente a un paciente. El suministro directo puede realizarse mediante inyección parenteral (por ejemplo, subcutánea, intraperitoneal, intravenosa, intramuscular, intradérmica, o al espacio intersticial de un tejido; la inyección intraglosal no se usa típicamente para propósitos de inmunización. Las vías alternativas de suministro incluyen administración rectal, oral (por ejemplo, comprimido, pulverización), bucal, sublingual, vaginal, tópica, transdérmica o transcutánea, intranasal, ocular, aural, pulmonar u otra administración mucosa. La administración intradérmica e intramuscular son dos vías preferidas. La inyección puede ser a través de una aguja (por ejemplo. una aguja hipodérmica), pero la inyección sin aguja puede ser utilizada alternativamente. Una dosis intramuscular típica es de 0,5 ml.
La invención puede utilizarse para inducir inmunidad sistémica y/o mucosa, preferiblemente para obtener una inmunidad sistémica y/o mucosa mejorada.
La dosificación puede ser por un programa de dosis única o un programa de dosis múltiples. Se pueden usar dosis múltiples en un programa de inmunización primaria y/o en un programa de inmunización de refuerzo. En un programa de dosis múltiples, las diversas dosis pueden administrarse por la misma o diferentes vías, por ejemplo, un cebado parenteral y un refuerzo mucoso, un cebado mucoso y un refuerzo parenteral, etc. Las dosis múltiples se administrarán típicamente por lo menos con 1 semana de diferencia (por ejemplo, aproximadamente 2 semanas, aproximadamente 3 semanas, aproximadamente 4 semanas, aproximadamente 6 semanas, aproximadamente 8 semanas, aproximadamente 10 semanas, aproximadamente 12 semanas, aproximadamente 16 semanas, etc.). En una realización, se pueden administrar dosis múltiples aproximadamente 6 semanas, 10 semanas y 14 semanas después del nacimiento, por ejemplo, a una edad de 6 semanas, 10 semanas y 14 semanas, como se utiliza a menudo en el Programa Ampliado de Inmunizaciones (PAI) de la Organización Mundial de la Salud. En una realización alternativa, se administran dos dosis primarias con una separación de dos meses, por ejemplo, con una separación de 7, 8 o 9 semanas, seguidas de una o más dosis de refuerzo con una separación de 6 meses a 1 año después de la segunda dosis primaria, por ejemplo, aproximadamente 6, 8, 10 o 12 meses después de la segunda dosis primaria. En una realización posterior, se administran tres dosis primarias con una separación de aproximadamente dos meses, por ejemplo, con una separación de 7, 8 o 9 semanas, seguidas de una o más dosis de refuerzo de aproximadamente 6 meses a 1 año después de la tercera dosis primaria, por ejemplo, aproximadamente de 6, 8, 10, o 12 meses después de la tercera dosis primaria.
EJEMPLOS
Lípidos catiónicos de la Fórmula (I)
Se pretende que los siguientes ejemplos ilustren la invención y no se deben interpretar como que sean limitaciones de esta. Las temperaturas se proporcionan en grados centígrados. Si no se menciona lo contrario, todas las concentraciones evaporativas se realizan bajo presión reducida, preferiblemente entre aproximadamente 15 mm Hg y 100 mm Hg (= 2 13.3 kPa [20-133 mbar]). La estructura de los productos finales, los Intermediarios y los materiales de partida se confirma mediante métodos analíticos estándar, por ejemplo, microanálisis o características espectroscópicas, por ejemplo, MS, IR o RMN. Las abreviaturas utilizadas son las convencionales en la técnica, algunas de las cuales se definen a continuación. La purificación de la columna ultrarrápida se lleva a cabo preferiblemente en gel de sílice utilizando un eluyente apropiado de composición isocrática o gradiente.
El análisis de HPLC se realiza en una columna de Waters Atlantis dC18 (4,6 x 150 mm, 3 mm), con elución de gradiente (0 % a 95 % de acetonitrilo en agua modificado con 0,1 % v/v de ácido trifluoroacético durante 20 min y una tasa de flujo de 1,4 mL/min), a menos que se describa lo contrario.
Se registraron espectros de 1H RMN en un espectrómetro Bruker Avance II de 400 MHz. Todos los cambios químicos se reportan en partes por millón (6) en relación con el tetrametilsilano. Las siguientes abreviaturas se utilizan para denotar patrones de señal: S = singlete, d = doblete, t = triplete, q = cuarteto, m = multiplete, br = amplio. Los datos de ES-MS se registraron utilizando un espectrómetro de masas Waters LTC Premier con una fuente de ionización de electrospray dual en un cromatógrafo líquido Agilent 1100. La sulfadimetoxina [Sigma, m/z = 311,0814 (M+1)] se utilizó como referencia adquirida a través del canal LockSpray™ cada tercer escaneo. Se ha comprobado que la precisión de masa del sistema es < 5 ppm.
Abreviaturas:
AcOH
ácido acético
Aq
acuoso
Ar
arilo
Atm
atmósfera
BOC
ferc-Butil-carbonato
br.s., bs
singlete amplio
°C
Celsius
CD2Cl2
diclorometano deuterado
CDCl3
cloroformo deuterado
CH2CI2, DCM
diclorometano
CH3CN, MeCN
acetonitrilo
d
doblete
dd
doblete de dobletes
ddd
doblete de dobletes de dobletes
DIEA, DIPEA
W-etildiisopropilamina
DME
1,4-dimetoxietano
DMF
W,W-dimetilformamida
DMAP
dimetil aminopiridina
DMSO
sulfóxido de dimetilo
dt
doblete de tripletes
EDC
1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida
EtOAc
acetato de etilo
EtOH
etanol
FCC
cromatografía de columna ultrarrápida
G
calibre
h
hora
HBTU
(2-(1 H-benzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametiluronio hexafluorofosfato HCl
ácido clorhídrico
HMPA
hexametilfosforamida
HPLC
cromatografía líquida de alta presión
HT
alto rendimiento
IBX
Ácido 2-yodoxibenzoico
/-PrOH
alcohol isopropílico
H2O
agua
K
kelvin
KOH
hidróxido de potasio
LC
cromatografía líquida
M
molar
m
multiplete, masa
MeOH
metanol
MgSO4
sulfato de magnesio
MHz
megahercios
ml, mL
mililitro
mm
milímetro
mmol
millimol
min.
minuto
ARNm
ácido ribonucleico mensajero
MS
espectroscopia de masas
mw
microondas
NaH
hidruro de sodio
NaHMDS
hexametildisilazano de sodio
NaOEt
etóxido de sodio
NaOH
hidróxido de sodio
Na2SO4
sulfato de sodio
NEt3
trietilamina
ng
nanograma
NH3
amoníaco
RMN
resonancia magnética nuclear
quint.
quintuplete
Pd/C
paladio sobre carbono
ppt
precipitado
rbf
matraz de fondo redondo
Rf
factor de retraso
rt
temperatura ambiente
Rt
Tiempo de retención
s
singulete
sat.
saturado
ARNip
ácido ribonucleico interferente pequeño
SM
material de partida
t
triplete
TFA
ácido trifluoroacético
THF
tetrahidrofurano
TLC
cromatografía de capa delgada
UPLC
cromatografía líquida de ultra alto rendimiento
wt
en peso
H9
micrograma
Mi
microlitro
Todos ios compuestos se nombran usando AutoNom.
Especificidad de LC:
Método LC 1: Los tiempos de retención (Rt) se obtuvieron en un sistema Waters Acquity SDS con una columna Inersil C8 3,0 pm 3,0*53 mm. Se aplicó un gradiente de H2O (+0,1 % ácido fórmico) / CH3CN (+0,1 % ácido fórmico) 40/60 a 5/95 durante 1,0 min., luego se mantuvo durante 2,1 min. (1,0 mL/min. como flujo de disolvente) a una temperatura de horno de 50 °C.
Método LC 2: Los tiempos de retención (Rt) se obtuvieron en un sistema Waters Acquity SDS con una columna Acquity BEH 1,7 pm 2,1*50 mm. Se aplicó un gradiente de H2O (+0,1 % ácido fórmico) / CH3CN (+0,1 % ácido fórmico) 45/55 a 1/99 durante 1,4 min., luego se mantuvo durante 3,6 min. (1,0 mL/min. como flujo de disolvente) a una temperatura de horno de 50 °C.
Método LC 3: Los tiempos de retención (Rt) se obtuvieron en un sistema Waters Acquity SDS con una columna Acquity BEH 1,7 pm 2,1*50 mm. Se aplicó un gradiente de H2O (+0,1 % ácido fórmico) / CH3CN (+0,1 % ácido fórmico) 45/55 a 1/99 durante 0,7 min., luego se mantuvo durante 1,3 min. (1,0 mL/min. como flujo de disolvente) a una temperatura de horno de 50 °C.
Método LC 4: Los tiempos de retención (Rt) se obtuvieron en un sistema Waters Acquity SDS con una columna Acquity BEH 1,7 pm 2,1*50 mm. Se aplicó un gradiente de H2O (+0,1 % ácido fórmico) / CH3CN (+0,1 % ácido fórmico) 45/55 a 0.1/99.9 durante 3,6 min., luego se mantuvo durante 1,4 min. (1,0 mL/min. como flujo de disolvente) a una temperatura de horno de 50 °C.
Método LC 5: Los tiempos de retención (Rt) se obtuvieron en un sistema Waters Acquity SDS con una columna ACQUITY UPLC BEH C18 130Á 1,7 pm 2,1 mm * 50 mm. Se aplicó un gradiente de H2O (+0,1 % ácido fórmico) / CH3CN (+0,1 % ácido fórmico) 60/40 a 2/98 durante 3,40 min., luego se mantuvo durante 1,40 min. (1,0 mL/min. como flujo de disolvente) a una temperatura de horno de 50 °C.
Método LC 6: Los tiempos de retención (Rt) se obtuvieron en un sistema Waters Acquity SDS con una columna Acquity BEH 1,7 pm 2,1*50 mm. Se aplicó un gradiente de H2O (+0,1 % de ácido fórmico) / CH3CN (+0,1 % de ácido fórmico) 45/55 a 1/99 durante 1,4 min, seguido de un aumento a 0/100 en 3,75 min y una disminución a 45/55 en 0,04 min (1,0 mL/min como flujo de disolvente) a una temperatura de horno de 50 °C.
Estrategia sintética
Síntesis del Ejemplo 1: 2,5-bis((9Z,12Z)-octadeca-9,12-dien-1-iloxi)bencil 4-(dimetilamino)butanoato
Intermediario 1a: 2,5-bis((9Z,12Z)-octadeca-9,12-dien-1-iloxi)benzaldehído
A una disolución de 2,5-dihidroxibenzaldehído (0,551 g, 3,99 mmol) en DMF (35 mL) se añadió (9Z,12Z)-octadeca-9,12-dienil metanosulfonato (2,75 g, 7,98 mmol) seguido de K2CO3 (4,41 g, 31,9 mmol) y se calentó a 80 °C durante 16 h. La reacción se diluyó con 100 ml de acetato de etilo y 100 ml de agua. Se separó la capa orgánica, se lavó con 2x50 ml de agua, se secó sobre Na2SO4 y se concentró bajo presión reducida para dar el producto bruto. El producto bruto fue purificado por cromatografía de gel de sílice eluyendo con 10-90 % de acetato de etilo: heptano para proporcionar el producto deseado como aceite incoloro (1,3 g, 26 % de rendimiento). 1H RMN (400 MHz, CDCh) ó: 10,48 (s, 1<h>), 7,31 (d,J= 3,5 Hz, 1H), 7,12 (dd,J= 9,0, 3,5 Hz, 1H), 6,93 (d,J= 9,0 Hz, 1H), 5,29 - 5,46 (m, 8H), 4,03 (t,J= 6,5 Hz, 2H), 3,94 (t,J= 6,5 Hz, 2H), 2,78 (t,J= 6,3 Hz, 4H), 2,01 - 2,13 (m, 8H), 1,72 - 1,87 (m, 4H), 1,46 (dt,J= 14,1 , 7,0 Hz, 4H), 1,24 -1,41 (m, 28H), 0,89 (t,J= 7,0 Hz, 6H). 13C RMN (400 MHz, CDCls) 5: 189,7, 156,3, 153,0, 130,2, 130,1, 130,0, 128,0, 128,0, 127,9, 127,9, 125,0, 124,1, 114,3, 110,7, 69,1,68,6, 31,5, 29,6, 29,4, 29,3, 29,2, 29,2, 27,2, 26,0, 26,0, 25,6, 22,6, 14,1.
Intermediario 1b: (2,5-bis((9Z,12Z)-octadeca-9,12-dien-1-iloxi)fenil)metanol
A una disolución de Intermediario 1a (1,165 g, 1,835 mmol) en THF (10 ml) y metanol (5 ml) se añadió NaBH4 (0,090 g, 2,385 mmol) y se agitó durante 16 h a temperatura ambiente. La reacción se diluyó con 100 ml de acetato de etilo y 100 ml de agua. Se separó la capa orgánica, se lavó con 2x50 ml de agua, se secó sobre Na2SO4 y se concentró bajo presión reducida para dar el producto bruto. El producto bruto fue purificado por cromatografía de gel de sílice eluyendo con 10 90 % de acetato de etilo: heptano para proporcionar el producto deseado como aceite incoloro (0,75 g, 64 % de rendimiento). 1 H RMN (400 MHz, CDCh) 5: 6,86 (d,J= 2,0 Hz, 1H), 6,76 - 6,80 (m, 2H), 5,27 - 5,48 (m, 8H), 4,66 (s, 2H), 3,96 (t,J= 6,5 Hz, 2H), 3,91 (t,J= 6,8 Hz, 2H), 2,79 (t,J= 6,5 Hz, 4H), 2,06 (c,J= 6,9 Hz, 8H), 1,77 (dquin,J= 14,2, 7,0 Hz, 4H), 1,41 - 1,54 (m,J= 7,5, 5,5 Hz, 4H), 1,23- 1,41 (m, 28H), 0,90 (t,J= 7,0 Hz, 6H). 13C RMN (400 MHz, CDCh) 5: 153,0, 150,9, 130,2, 130,1, 130,1, 130,1, 128,0, 128,0, 127,9, 115,4, 113,7, 112,0, 68,6, 68,5, 62,5, 31,5, 29,6, 29,5, 29,4, 29,3, 29,2, 27,2, 27,2, 26,1,26,0, 25,6, 22,6, 14,1.
Ejemplo 1: 2,5-bis((9Z,12Z)-octadeca-9,12-dien-1-iloxi)bencil 4-(dimetilamino)butanoato
A una disolución de ácido 4-(dimetilamino)butanoico (26,3 mg, 0,157 mmol) en DCM (25 ml) se añadió EDC.HCl (45,1 mg, 0,235 mmol) y DMAP (1,918 mg, 0,016 mmol) seguido de NEt3 (0,087 ml, 0,628 mmol) y se agitó durante 30 minutos a temperatura ambiente. A la mezcla se le añadióIntermediario 1b(100 mg, 0,157 mmol) y se agitó durante 16 h. La reacción se diluyó con 100 ml de diclorometano y 100 ml de agua. Se separó la capa orgánica, se lavó con 2x50 ml de agua, se secó sobre MgSO4 y se concentró bajo presión reducida para dar el producto bruto. El producto crudo fue purificado por cromatografía de gel de sílice en el sistema de purificación Biotage, eluyendo con 10-90 % de acetato de etilo: heptano para proporcionar el producto deseado como aceite incoloro (84 mg, 71 % de rendimiento). 1H RMN (400 MHz, DICLOROMETANO-d2) 5: 6,90 (d,J= 2,5 Hz, 1H), 6,78 - 6,85 (m, 2H), 5,28 - 5,54 (m, 8H), 5,14 (s, 2H), 3,85 - 4,01 (m, 4H), 2,82 (t,J= 6,5 Hz, 4H), 2,42 (t,J= 7,3 Hz, 2H), 2,30 (t,J= 7,0 Hz, 2H), 2,21 (s, 6H), 2,01 - 2,15 (m, 8H), 1,69 -1,88 (m, 6H), 1,44 -1,57 (m, 4H), 1,26 - 1,44 (m, 28H), 0,93 (t,J= 7,0 Hz, 6H). 13C RMN (400 MHz, DICLOROMETANO-d2) 5: 173,8, 153,4, 151,4, 130,6, 130,6, 128,5, 128,4, 126,3, 116,4, 114,6, 113,0, 69,4, 69,0, 61,9, 59,2, 45,7, 32,5, 32,1 , 30,2, 30,1,30,0, 30,0, 29,9, 29,8, 29,8, 27,7, 27,7, 26,6, 26,6, 26,1,23,5, 23,1, 14,4.
El siguiente ejemplo se puede preparar utilizando métodos de acoplamiento similares a los empleados para la síntesis delEjemplo 1.
Ejemplo 2: 2,5-bis((9Z,12Z)-octadeca-9,12-dien-1-iloxi)bencil 3-(dimetilamino)propanoato
El producto deseado se aisló como aceite incoloro (120 mg, 69 % de rendimiento). 1H RMN (400MHz, DICLOROMETANO-d2) 5: 6,92 (d,J= 2,5 Hz, 1H), 6,81 - 6,84 (m, 2H), 5,32 - 5,48 (m, 9H), 5,15 (s, 2H), 3,84 - 4,03 (m, 4H), 2,82 (t,J= 6,5 Hz, 4H), 2,61 - 2,70 (m, 2H), 2,50 - 2,61 (m, 2H), 2,25 (s, 6H), 2,09 (c,J= 6,9 Hz, 7H), 1,72 - 1,84 (m, 4H), 1,44 - 1,56 (m, 4H), 1,26 - 1,44 (m, 28H), 0,93 (t,J= 7,0 Hz, 6H). 13C RMN (400MHz, DICLOROMETANO-d2) 5: 172,8, 153,5, 151,4, 130,6, 130,6, 128,5, 128,4, 126,2, 116,3, 114,6, 113,0, 69,4, 69,0, 62,0, 55,4, 45,6, 33,6, 32,1,30,2, 30,2, 30,1,30,0, 29,9, 29,9, 29,8, 29,8, 27,7, 27,7, 26,6, 26,6, 26,1 , 23,1, 14,4.
R es un alquileno-amina, heterociclilo o heterociclilo-alquilo opcionalmente sustituido
Síntesis del Ejemplo 3: 2,5-bis((9Z,12Z)-octadeca-9,12-dieniloxi)bencil 3-(dimetilamino)propil carbonato
A una disolución deIntermediario 1b(150 mg, 0,235 mmol) en CDCh seco (2 ml) se añadió para-nitrofenilcloroformato (61,7 mg, 0,306 mmol) seguido de piridina (23,1 pL, 0,286 mmol). La reacción se agitó a 50 °C. Después de 4 h, la reacción se concentró bajo presión reducida y se volvió a disolver en 2 mL de DCM. Se añadió N,N-dimetilaminopropanol (121 mg, 1,18 mmol) seguido de DMAP (5,75 mg, 0,047 mmol). La reacción se agitó a temperatura ambiente. Después de 18 h, la reacción se inactivó con 2 mL de agua y se extrajo en 3x5 mL de DCM adicionales. Las capas orgánicas combinadas se concentraron bajo presión reducida y se purificaron mediante cromatografía de gel de sílice en el sistema de purificación ISCO, eluyendo con MeOH/DCM (0 a 3 %) para proporcionar 141,3 mg (78 %) del producto deseado como un aceite transparente. 1H RMN (400 MHz, CLOROFORMO-d) 5: 6,95 (d,J= 2,0 Hz, 1H), 6,78 - 6,83 (m, 2H), 5,29 - 5,48 (m, 8H), 5,22 (s, 2H), 4,24 (t,J= 6,6 Hz, 2H), 3,94 (dt,J= 9,6, 6,6 Hz, 4H), 2,81 (t,J= 6,3 Hz, 4H), 2,38 (t,J= 7,3 Hz, 2H), 2,24 (s, 6H), 2,08 (c,J= 6,6 Hz, 8H), 1,87 (quin,J= 6,9 Hz, 2H), 1,78 (m, 4H), 1,28 - 1,52 (m, 32H), 0,92 (t,J= 6,6 Hz, 6H). MS (m+1 ) = 766,5, Rt = 1,22 min (LC Método 1).
El siguiente ejemplo se puede preparar utilizando métodos de acoplamiento similares a los empleados para la síntesis delEjemplo 3
Ejemplo 4: 2,5-bis((9Z,12Z)-octadeca-9,12-dieniloxi)bencil 3-(dietilamino)propil carbonato
1 H RMN (400 MHz, CLOROFORMO-d) 5: 6,95 (d,J= 2,0 Hz, 1H), 6,77 - 6,84 (m, 2H), 5,30 - 5,48 (m, 8H), 5,22 (s, 2H), 4,24 (t,J= 6,6 Hz, 2H), 3,94 (dt,J= 9,1 , 6,6 Hz, 4H), 2,81 (t,J= 6,3 Hz, 4H), 2,53 (c,J= 7,1 Hz, 6H), 2,08 (c,J= 6,6 Hz, 8H), 1,71 - 1,91 (m, 6H), 1,44 - 1,53 (m, 4H), 1,26 - 1,44 (m, 28H), 1,03 (t,J= 7,1 Hz, 6H), 0,92 (t,J= 7,1 Hz, 6H). MS (m+1 ) = 794,5, Rt = 1.38 min (LC Método 1 ).
E squem a 3:
Síntesis del Ejemplo 5: 2,5-bis((9Z,12Z)-octadeca-9,12-dien-1-iloxi)bencil 4-(dimetilamino)butanoato
Intermediario 5a: 2,5-bis((8-hidroxioctil)oxi)benzaldehído
A una disolución de 2,5-dihidroxibenzaldehído (1 g, 7,24 mmol) en DMF (15 mL) se añadió 8-bromooctan-1-ol (3,03 g, 14,48 mmol), K2CO3 (5,00 g, 36,2 mmol) y KI (0,012 g, 0,072 mmol) y se calentó a 80 °C durante 16 h. La reacción se diluyó con 100 ml de acetato de etilo y 100 ml de agua. Se separó la capa orgánica, se lavó con 2x50 ml de agua, se secó sobre Na2SO4 y se concentró bajo presión reducida para dar el producto bruto. El producto bruto fue purificado por cromatografía prep-HPLC eluyendo con 10-90 % de acetonitrilo : agua y 0,1 % de TFA para proporcionar el producto deseado (550 mg, 19 % de rendimiento). 1H RMN (400 MHz, CLOROFORMO-d) 5: 10,47 (s, 1H), 7,31 (d,J= 3,0 Hz, 1H), 7,11 (dd,J= 9,0, 3,3 Hz, 1H), 6,92 (d,J= 9,0 Hz, 1H), 4,03 (t,J= 6,4 Hz, 2H), 3,94 (t,J= 6,5 Hz, 2H), 3,65 (t,J= 6,7 Hz, 4H), 1,69-1,79 (m, 4H), 1,52-1,65 (m, 4H), 1,43-1,50 (m, 4H), 1,30-1,40 (m, 12H). 13C RMN (400 MHz, CLOROFORMO-d) 5: 189,9, 156,3, 152,9, 124,9, 124,2, 114,3, 110,7, 69,1,68,6, 63,0, 63,0, 32,7, 32,7, 29,3, 29,1,26,0, 25,9, 25,6.
Intermediario 5b: ((2-formil-1,4-fenilen)bis(oxi))bis(octan-8,1-diil) bis(decanoato)
A una disolución deIntermediario 5a(455 mg, 1,153 mmol) en DCM (11,5 mL) se añadió cloruro de decanoilo (484 mg, 2,54 mmol) seguido de la adición de DiEA (1,01 mL, 5,77 mmol) a temperatura ambiente y se agitó durante 16 h. La reacción se dillutó con 100 ml de diclorometano y 100 ml de agua. Se separó la capa orgánica, se lavó con 50 ml de agua, se secó sobre MgSO4 y se concentró bajo presión reducida para dar el producto bruto. El producto bruto fue purificado por cromatografía de gel de sílice en el sistema de purificación ISCO eluyendo con 10-90 % de acetato de etilo: heptano para proporcionar el producto deseado (591 mg, 73 % de rendimiento). 1H RMN (400 MHz, CLOROFORMO-d) 5 10,47 (s, 1H), 7,31 (d,J= 3,3 Hz, 1H), 7,12 (dd,J= 9,0, 3,3 Hz, 1H) 6,93 (d,J= 9,0 Hz, 1H), 3,99-4,12 (m, 6H), 3,94 (t,J= 6,5 Hz, 2H), 2,30 (t, J, = 7,5 Hz, 4H), 1,72-1,95 (m, 4H) 1,11-1,54 (m, 48H), 0,81-0,96 (m, 6H). 13C RMN (400 MHz, CLOROFORMO-d) 5: 189,8, 179,0, 174,1, 156,3, 152,9, 125,0, 124,2, 114,3, 69,1,68,6, 64,3, 34,4, 31,8, 29,5, 29,4, 29,4, 29,2, 29,2, 28,6, 26,0, 25,9, 25,9, 25,0, 24,7, 22,7, 14,1.
Intermediario 5c: ((2-(hidroximetil)-1 ,4-fenilen)bis(oxi))bis(octan-8,1-diil) bis(decanoato)
A una disolución deIntermediario 5b(590 mg, 0,839 mmol) en tetrahidrofurano (4,2 mL) y metanol (4,2 mL) se añadió borohidruro de sodio (31,7 mg, 0,839 mmol) a 0 °C y se agitó durante 1 h. La reacción se diluyó con 100 ml de acetato de etilo y 50 ml de agua. Se separó la capa orgánica, se lavó con 50 ml de agua, se secó sobre Na2SO4 y se concentró bajo presión reducida para dar el producto bruto. El producto bruto fue purificado por cromatografía de gel de sílice en el sistema de purificación ISCO eluyendo con 10-90 % de acetato de etilo: heptano para proporcionar el producto deseado (450 mg, 76 % de rendimiento). 1H RMN (400 MHz, CLOROFORMO-d) 5: 6,87 (d, J=2,5 Hz, 1H), 6,76-6,79 (m, 2H), 4,66 (s, 2H), 4,06 (t, J=6,8 Hz, 4H), 3,96 (t, J=6,5 Hz, 2H), 3,91 (t, J=6,5 Hz, 2H), 2,30 (t, J=7,5 Hz, 4H), 1,70-1,86 (m, 4H), 1.62 (t, J=7,0 Hz, 8H), 1,41-1,52 (m, 4H), 1,14-1,40 (m, 36H), 0,80-0,95 (m, 6H). 13C RMN (400 MHz, CLOROFORMO-d) 5: 174,1 , 153,0, 150,9, 130,1, 115,3, 113,7, 112,0, 68,5, 68,4, 64,3, 64,3, 62,4, 34,4, 31,8, 29,4, 29,4, 29,3, 29,3, 29,2, 29,1,28,6, 26,1,26,0, 25,8, 25,0, 24,7, 22,7, 14,1.
Ejemplo 5: ((2-(((3-(dimetilamino)propanoil)oxi)metil)-1,4-fenilen)bis(oxi))bis(octan-8,1-diil) bis(decanoato
Mezcla deIntermediario 5c(65 mg, 0,092 mmol), ácido 3-(dimetilamino)propanoico (16 mg, 0,138 mmol), EDC.HCl (35 mg, 0,184 mmol) y DIEA (32,2 pl, 0,184 mmol) en Dc M (Volumen: 922 pl) se agitó a 0 °C durante 16 h mientras se dejaba calentar a temperatura ambiente. La reacción se diluyó con 20 ml de diclorometano y 20 ml de agua. Se separó la capa orgánica, se lavó con 2x20 ml de agua, se secó sobre MgSÜ4 y se concentró bajo presión reducida para dar el producto bruto. El producto bruto fue purificado por cromatografía de gel de sílice en el sistema de purificación ISCÜ eluyendo con 10-90 % de acetato de etilo: feptano para proporcionar el producto deseado como un aceite incoloro (40 mg, 51 % de rendimiento). 1H RMN (400 MHz, CLÜRÜFÜRMÜ-d) 5: 6,91 (s, 1H), 6,79 (d,J= 1,5 Hz, 2H), 5,17 (s, 2H), 4,06 (t,J= 6,7 Hz, 4H), 3,91 (c,J= 6,8 Hz, 4H), 2,61-2,73 (m, 2H), 2,50-2,60 (m, 2H), 2,30 (t,J= 7,5 Hz, 4H), 2,26 (s, 6H), 1,70-1,83 (m, 4H), 1,52-1,69 (m, 8H), 1,42-1,48 (m, 4H), 1,18-1,35 (m, 36H), 0,79-0,95 (m, 6H). 13C RMN (400 MHz, CLÜRÜFÜRMÜ-d) 5: 174,0, 172,3, 152,8, 150,9, 125,4, 116,0, 114,3, 112,5, 68,8, 68,5, 64,3, 61,7, 54,7, 45,2, 34,4, 32,9, 31,8, 29,4, 29,3, 29,3, 29,2, 29,2, 29,1 , 28,6, 26,0, 26,0, 25,9, 25,9, 25,0, 22,7, 14,1.
Los siguientes ejemplos se pueden preparar utilizando métodos de acoplamiento similares a los empleados para la síntesis delEjemplo 5.
Ejemplo 6: ((2-(((1-metilpiperidin-4-carbonil)oxi)metil)-1,4-fenilen)bis(oxi))bis(octan-8,1-diil) bis(decanoato)
El producto deseado se aisló como aceite incoloro (72 mg, 77 % de rendimiento). 1H RMN (400 MHz, CLÜRÜFÜRMÜ-d) 5: 6,87 (s, 1H), 6,78 (s, 2H), 5,14 (s, 2H), 4,06 (t,J= 6,7 Hz, 4H), 3,90 (c,J= 6,3 Hz, 4H), 2,85 (d,J= 11,3 Hz, 2H), 2,19 2,44 (m, 8H), 2,03-2,15 (m, 2H), 1,99 (d,J= 11,8 Hz, 2H), 1,81-1,91 (m, 2H), 1,70-1,80 (m, 4H), 1,58-1,66 (m, 8H), 1,40 1,52 (m, 4H), 1,14-1,39 (m, 36H), 0,88 (t,J= 6,5 Hz, 6H). 13C RMN (400 MHz, CLÜRÜFÜRMÜ-d) 5: 174,7, 174,0, 152,8, 150,9, 125,5, 115,9, 114,2, 112,4, 68,7, 68,5, 64,3, 61,7, 54,8, 46,2, 34,4, 31,8, 29,7, 29,4, 29,3, 29,2, 29,2, 29,1, 28,6, 28,0, 26,0, 25,9, 25,0, 22,6, 14,1.
Ejemplo 7: ((2-(((4-(dimetilamino)butanoil)oxi)metil)-1 ,4-fenilen)bis(oxi))bis(octan-8,1-diil) bis(decanoato)
El producto deseado se aisló como un aceite incoloro (65 mg, 73 %). 1H RMN (400 MHz, CLOROFORMO-d) 5: 6,87 (s, 1H), 6,78 (d,J= 1,5 Hz, 2H), 5,14 (s, 2H), 4,06 (t,J= 6,7 Hz, 4H), 3,90 (c,J= 6,4 Hz, 4H), 2,92 (d,J= 10,8 Hz, 2H), 2,41 (dt,J= 13,9, 6,8 Hz, 3H), 2,29 (t,J= 7,7 Hz, 4H), 1,98 (d,J =12,0 Hz, 4H), 1,80-1,91 (m, 2H), 1,69-1,80 (m, 4H), 1,53 1,68 (m, 8H), 1,40-1,50 (m, 4H), 1,16-1,39 (m, 36H), 1,10 (t,J= 7,2 Hz, 3H), 0,79-0,94 (m, 6H). 13C RMN (400 MHz, CLOROFORMO-d) 5: 174,8, 174,0, 152,8, 150,8, 125,5, 115,8, 114,1, 112,4, 68,7, 68,5, 64,3, 61,6, 52,5, 34,4, 31 .8, 29,4, 29,3, 29,2, 29,2, 29,2, 29,1,28,6, 28,1,26,0, 26,0, 25,9, 25,8, 25,0, 22,6, 14,1, 11,9.
Ejemplo 9: ((2-(((1-isopropilpiperidin-4-carbonil)oxi)metil)-1,4-fenilen)bis(oxi))bis(octan-8,1-diil) bis(decanoato)
El producto deseado se aisló como un aceite incoloro (50 mg, 56 %). 1H RMN (400 MHz, CLOROFORMO-d) 5: 6,86 (s, 1H), 6,79 (s, 2H), 5,14 (s, 2H), 4,05 (t,J= 6,7 Hz, 4H), 3,85-3,96 (m, 4H), 3,76-3,84 (m, 2H), 3,10-3,18 (m, 2H), 2,74-2,84 (m, 2H), 2,48 (t,J= 6,3 Hz, 2H), 2,29 (t,J= 7,5 Hz, 4H), 1,94-2,19 (m, 6H), 1,74 (quin,J= 6,8 Hz, 4H), 1,61 (d,J= 5,0 Hz, 8H), 1,42 (d,J= 7,3 Hz, 4H), 1,15-1,39 (m, 36H), 0,76-0,94 (m, 6H). 13C RMN (400 MHz, CLOROFORMO-d) 5: 174,2, 174.2, 172,1 , 152,8, 150,9, 124,8, 116,2, 114,6, 112,6, 68,8, 68,5, 64,3, 62,2, 54,4, 53,6, 34,4, 31,8, 30,5, 29,4, 29,3, 29,2, 29.2, 29,1,28,5, 25,9, 25,8, 25,8, 25,0, 23,2, 22,6, 20,7, 14,1.
Ejemplo 11: ((2-((2-(1-metilpiperidin-4-il)acetoxi)metil)-1,4-fenilen)bis(oxi))bis(octan-8,1-diil) bis(decanoato)
n ess e emp o : - - me am no propox car on ox me - , - en en s ox s oc an- , -bis(decanoato)
A una disolución deIntermediario 5c(83 mg, 0,118 mmol) en DCM (0,5 mL) se añadió 4-nitrofenilcloroformato (35,6 mg, 0,177 mmol) seguido de piridina (38,1 pl, 0,471 mmol) y se agitó durante 16 h a temperatura ambiente. La reacción se concentró bajo presión reducida. El sólido fue disuelto en DCM (0,5 mL) y se añadió 3-(dimetilamino)propan-1-ol (36,4 mg, 0,353 mmol) seguido de DIEA (123 pl, 0,706 mmol) y DmA p (1,438 mg, 0,012 mmol) y se agitó durante 16 h a temperatura ambiente. La reacción se diluyó con 20 ml de diclorometano y 20 ml de agua. Se separó la capa orgánica, se lavó con 2x20 ml de agua, se secó sobre MgSÜ4 y se concentró bajo presión reducida para dar el producto bruto. El producto bruto fue purificado por cromatografía de gel de sílice en el sistema de purificación ISCÜ eluyendo con 10-90 % de acetato de etilo: heptano, pero el producto impuro fue aislado. El producto fue re-purificado por la purificación de cromatografía de fluidos supercríticos eluyendo con metanol y CO2 para proporcionar el producto deseado como un aceite incoloro (30 mg, 29 % de rendimiento). 1H RMN (400 MHz, CLÜRÜFÜRMÜ-d) 5: 6,93 (d,J= 2,3 Hz, 1H), 6,75-6,86 (m, 2H), 5,20 (s, 2H), 4,23 (t,J= 6,4 Hz, 2H), 4,06 (t,J= 6,7 Hz, 4H), 3,83-3,97 (m, 4H), 2,50 (s a., 2H), 2,33 (s, 6H), 2,30 (t,J= 7,7 Hz, 4H), 1,94 (quin,J= 6,7 Hz, 2H), 1,69-1,84 (m, 4H), 1,53-1,69 (m, 8H), 1,40-1,52 (m, 4H), 1,15-1,40 (m, 36H), 0,88 (t,J= 6,8 Hz, 6H). 13C RMN (400 MHz, CLÜRÜFÜRMÜ-d) 5: 174,0, 155,1, 152,8, 150,9, 124,6, 116,0, 114,8, 112,5, 68,7, 68,5, 66,1,65,0, 64,3, 55,9, 45,0, 34,4, 31,8, 29,4, 29,3, 29,3, 29,2, 29,1,28,6, 26,0, 25,9, 25,0, 22,7, 14,1.
El siguiente ejemplo se puede preparar utilizando métodos de acoplamiento similares a los empleados para la síntesis delEjemplo 12.
Ejemplo 13: ((2-((((3-(dietilamino)propoxi)carbonil)oxi)metil)-1,4-fenilen)bis(oxi))bis(octan-8,1-diil) bis(decanoato)
El producto deseado se aisló como un aceite incoloro (35 mg, 27 %). 1H RMN (400 MHz, CLOROFORMO-d) ó: 6,93 (d,J =2,0 Hz, 1H), 6,75-6,84 (m, 2H), 5,20 (s, 2H), 4,22 (t,J= 6,4 Hz, 2H), 4,06 (t,J= 6,8 Hz, 4H), 3,83-3,96 (m, 4H), 2,61 (s a., 6H), 2,30 (t,J= 7,5 Hz, 4H), 1,83-2,03 (m, 2H), 1,76 (dq,J= 13,3, 6,5 Hz, 4H), 1,52-1,68 (m, 8H), 1,40-1,51 (m, 4H), 1,19-1,40 (m, 38H), 1,0-1,12 (m, 4H), 0,88 (t,J= 6,8 Hz, 6H). 13C RMN (400 MHz, CLOROFORMO-d)ó:174,0, 155,2, 152,8, 150,9, 124,7, 116,0, 114,8, 112,5, 68,8, 68,5, 65,0, 64,3, 49,1 , 46,8, 34,4, 31,8, 29,4, 29,3, 29,3, 29,2, 29,1,28,6, 26,0, 25,9, 25,0, 22,7, 14,1.
Síntesis del Ejemplo 14: 3-(dimetilamino)propil 4-metil-2,5-bis((9Z,12Z)-octadeca-9,12-dien-1-iloxi)bencil carbonato
Intermediario 14a: 2,5-dimetoxi-4-metilbenzaldehído
El oxicloruro de fósforo (12,5 mL) se añadió lentamente al 2,5-dimetoxi-tolueno (5 g, 3,3 mmol) en 10 mL de DMF. La reacción se agitó a temperatura ambiente durante 4 h y luego se calentó a 80 °C durante 4 h. A continuación, la reacción se vertió en agua helada y se filtró. El filtrado se recolectó, se secó sobre sulfato de sodio y se concentró bajo presión reducida para proporcionar 5,1 g (85,9 %) del producto deseado como un sólido amarillo pálido. TLC: Rf = 0,4 (EtOAc: Hexano, 1:9), UV activo.
Intermediario 14b: 2,5-dihidroxi-4-metilbenzaldehído
En un matraz de fondo redondo, se disolvió elIntermediario 14a(1,2 g, 6,6 mmol) en 8 mL de DCM. La disolución se enfrió a -78 °C y se añadió borontribromuro 1 M en DCM (33,3 mL, 33,3 mmol) y se agitó a la misma temperatura durante 8 h. La mezcla de reacción se inactivó con 5 ml de agua y se extrajo con acetato de etilo. Las capas orgánicas combinadas se secaron sobre sulfato de sodio y se evaporaron hasta la sequedad para proporcionar 1,0 g (99 %) de material deseado como sólido. TLC: Rf = 0,3 (EtOAc: Hexano, 1:90), UV activo.
Intermediario 14c: 4-metil-2,5-bis((9Z,12Z)-octadeca-9,12-dien-1-iloxi)benzaldehído
ElIntermediario 14cse puede preparar utilizando un método similar al empleado para la síntesis delIntermediario 1aa partir delIntermediario 14b.TLC: Rf = 0,8 (EtOAc:Hexano, 2:8), UV activo.
Intermediario 14d: (4-metil-2,5-bis((9Z,12Z)-octadeca-9,12-dien-1-iloxi)fenil)metanol
En un matraz de fondo redondo, se disolvió elIntermediario 14c(2,8 g, 4,3 mmol) en 25 mL de metanol. El borohidruro de sodio (328 mg, 8,6 mmol) se añadió en porciones a temperatura ambiente y se permitió agitar. Después de 1 hora la reacción se inactivó con 10 mL de agua y se extrajo con acetato de etilo (3X). Las capas orgánicas combinadas se secaron con sulfato de sodio y se concentraron a presión reducida. El residuo bruto fue purificado por gel de sílice utilizando EtOAc/Hexano (30 %) como eluyente para proporcionar 2,3 g (82,1%) del producto deseado. 1H RMN (400 MHz, Cloroformo-d) 5: 6,76 (s, 1H), 6,69 (s, 1H), 5,30-5,39 (m, 8H), 4,63 (d,J= 5,9 Hz, 2H), 3,95 (dd,J= 6,4, 6,3 Hz, 2H), 3,90 (dd,J= 6,4, 6,3 Hz, 2H), 2,76 (dd,J= 6,4, 6,4 Hz, 2H), 2,21 (s, 3H), 2,08 - 2,03 (m, 8H), 1,80 - 1,74 (m, 4H), 1,45 - 1,25 (m, 34H), 0,88 (t,J= 6,4, 6,4 Hz, 6H).
Los siguientes ejemplos se pueden preparar utilizando métodos de acoplamiento similares a los empleados para la síntesis delEjemplo 3a partir delIntermediario 14d.
Ejemplo 14: 3-(dimetilamino)propil 4-metil-2,5-bis((9Z,12Z)-octadeca-9,12-dien-1-iloxi)bencil carbonato
1 H RMN (400 MHz, Cloroformo-d) 5 : 6,81 (s, 1H), 6,72 (s, 1H), 5,47 - 5,28 (m, 8H), 5,15 (s, 2H), 3,93 (c, J = 6,3 Hz, 4H), 2,80 (t, J = 6,5 Hz, 4H), 2,53 (s a, 6H), 2,44 (t, J = 7,2 Hz, 4H), 2,23 (s, 3H), 2,07 (c, J = 7,0 Hz, 8H), 1,98 (s a, 2H), 1,77 (td, J = 8,8, 4,4 Hz, 4H), 1,47 (t, J = 6,9 Hz, 4H), 1,43 - 1,20 (m, 28H), 0,91 (t, J = 6,7 Hz, 6H). MS (m+1) = 765,0, Rt = 1,38 min (LC Método 3)
Síntesis del Ejemplo 17: (9Z,9,Z,12Z,12,Z)-2,2,-(2-((4-(dimetilamino)butanoiloxi)metil)-1,4-fenilen)bis(oxi)bis(etan-2,1-diil) dioctadeca-9,12-dienoato
Intermediario 17a: (9Z,12Z)-3-hidroxipropil octadeca-9,12-dienoato
En un matraz de fondo redondo, el ácido linoleico (3,0 g, 10,7 mmol) se disolvió en glicol (15 ml). Se añadieron HOBT (2,5, 16,1 mmol) y EDC (3,1g, 16,1 mmol) seguidos de TEA (4,5 ml, 32,1 mmol) y DMAP (653 mg, 5,4 mmol), y la reacción se agitó a temperatura ambiente. Después de 18 horas, la reacción se diluyó con DCM y agua. La capa orgánica se separó, se lavó con salmuera y se secó sobre sulfato de sodio, y se concentró bajo presión reducida para proporcionar el producto deseado 2,46 g (67.8 %) como un aceite incoloro. 1H Rm N (400 MHz, Cloroformo-d) 5: 5,41 - 5,23 (m, 4H), 4,18 (t,J= 6,2 Hz, 2H), 3,64 (t,J= 6,1 Hz, 2H), 2,72 (t,J= 6,2 Hz, 2H), 2,25 (t,J= 7,5 Hz, 2H), 2,00 (c,J= 6,7 Hz, 4H), 1,88 - 1.75 (m, 2H), 1,58 (t,J= 7,4 Hz, 2H), 1,39 -1,15 (m, 14H), 0,84 (td,J= 6,9, 3,5 Hz, 3H).
Intermediario 17b: (9Z,9,Z,12Z,12,Z)-2,2'-(5-formil-1,3-fenilen)bis(oxi)bis(etane-2,1-diil) dioctadeca-9,12-dienoato
En un matraz de fondo redondo, se disolvieron elIntermediario 17a(1,0 g, 3,08 mmol), 2,5-dihidroxibenzaldehído (213 mg, 1,54 mmol) y trifenil fosfina (0,849 g, 3,24 mmol) en 12,5 ml. THF. D<i>AD (0,849 mL, 3,24 mmol) fue añadido entonces. La reacción se agitó a temperatura ambiente 3 días y se concentró directamente en celita bajo presión reducida antes de la purificación por cromatografía de columna de gel de sílice en un sistema de purificación ISCO, utilizando EtOAc/Heptanos (10 a 20 %) como eluyente para proporcionar 71,4 mg (3,1 %) de producto deseado como un aceite amarillo pálido.
Intermediario 17c: (9Z,9'Z,12Z,12'Z)-2,2'-(hidroximetil)-1,4-fenilen)bis(oxi)bis(etan-2,1 -diil) dioctadeca-9,12-dienoato
En un matraz de fondo redondo, se disolvió elIntermediario 17b(71,4 mg, 0,095 mmol) en 2 mL de etanol bajo nitrógeno. Se añadió borohidruro de sodio (5,39 mg, 0,143 mmol) en porciones y se agitó a temperatura ambiente. Después de 30 minutos, la reacción se inactivó con ácido acético, se diluyó con agua y se extrajo en DCM (3X). Las capas orgánicas se combinaron, se secaron sobre sulfato de sodio y se concentraron bajo presión reducida para proporcionar 57,1 mg (80 %) del producto deseado como un aceite transparente.
Ejemplo 17: (9Z,9'Z,12Z,12'Z)-2,2,-(2-((4-(dimetilamino)butanoiloxi)metil)-1,4-fenilen)bis(oxi)bis(etan-2,1-diil) dioctadeca-9,12-dienoato
En un vial de reacción, se disolvió elIntermediario 17cen DCM. Se añadieron HATU y dimetilamina, seguidos por TEA y DMAP. La reacción se agitó a temperatura ambiente. Después de 18 horas, la reacción se diluyó con DCM y agua. La capa orgánica se separó, se lavó con salmuera y se secó sobre sulfato de sodio, y se concentró bajo presión reducida. El residuo bruto fue purificado mediante HPLC preparativa (modificador TFA). El producto enriquecido con pureza fue purificado por cromatografía de gel de sílice en el sistema de purificación ISCO eluyendo con MeOH/DCM (0 a 10 %). El material recuperado fue purificado nuevamente por cromatografía de gel de sílice en el sistema de purificación ISCO eluyendo con MeOH/DCM (0 % a 3 % y luego a 8 %) para proporcionar 11,6 mg (17,6 %) del producto deseado aislado como un aceite transparente. 1H RMN (400 MHz, Cloroformo-d) 5: 6,94 (s, 1H), 6,83 (d, J = 1,5 Hz, 2H), 5,31-5,45 (m, 8H), 5,17 (s, 2H), 4,40 (t,J= 4,8 Hz, 4H), 4,09-4,23 (m, 4H), 2,79 (t,J= 6,1 Hz, 4H), 2,61 (s, 2H), 2,44-2,51 (m, 2H), 2,30 2,39 (m, 4H), 2,18 (s, 6H), 2,01-2,12 (m, 8H), 1,92 (quin,J= 7,2 Hz, 2H), 1,57-1,73 (m, 6H), 1,23-1,45 (m, 26H), 0,91 (t,J= 6,8 Hz, 6H). MS (m+1) = 866,5, Rt = 1,22 min (LC Método 1 ).
Síntesis del Ejemplo 18: (9Z,9,Z,12Z,12,Z)-2,2,-(2-((4-(dimetilamino)butanoiloxi)metil)-1,4-fenilen)bis(oxi)bis(etan-2,1-diil) dioctadeca-9,12-dienoato
Intermediario 18a: (9Z,12Z)-4-hidroxibutil hexadeca-9,12-dienoato
En un matraz de fondo redondo, una mezcla de ácido linoleico (5,0 g, 17,83 mmol), butanodiol (64,3 g, 713 mmol), EDC (3,42 g, 17,83 mmol), DIPEA (3,11 ml, 17,83 mmol) y DMAP (0,163 g, 1,337 mmol) se agitó a 40 °C durante la noche (alta temperatura necesaria para mantener el butanodiol como líquido). Después de 18 horas, la reacción se enfrió a temperatura ambiente, y se diluyó con DCM y agua. La capa orgánica se separó, se lavó con salmuera, se secó sobre sulfato de sodio, y se concentró bajo presión reducida. La mezcla bruta se cargó en seco sobre celita y se purificó mediante cromatografía de gel de sílice en el sistema de purificación ISCO eluyendo con EtOAc/Heptano (20 % a 50 %) para proporcionar el material deseado 3,37 g (58 %) como un aceite transparente.
Intermediario 18b: (9Z,9'Z,12Z,12,Z)-((2-formil-1,4-fenilen)bis(oxi))bis(butan-4,1-diil) bis(octadeca-9,12-dienoato)
En un matraz de fondo redondo se disolvieron 2,5-dihidroxibenzaldehído (100 mg, 0,724 mmol),Intermediario 18a(517 mg, 1,593 mmol) y PPh3 (399 mg, 1,520 mmol) en 10,5 mL de THF. Se añadió DIAD (0,296 mL, 1,520 mmol) y se permitió que la reacción se agitara a temperatura ambiente. Después de 18 horas la mezcla de reacción bruta se concentró en celita bajo presión reducida para la purificación por cromatografía de gel de sílice en el sistema de purificación ISCO eluyendo con EtOAc/Heptanos (0 a 40 %) para proporcionar 86,4 mg (14,8 %) del producto deseado como un aceite amarillo.
Intermediario 18c: (9Z,9'Z,12Z,12'Z)-((2-(hidroximetil)-1,4-fenilen)bis(oxi))bis(butan-4,1 -diil) bis(octadeca-9,12-dienoato)
En un vial de reacción, se disolvió elIntermediario 18b(86,4 mg, 0,107 mmol) en 0,5 ml. MeOH. Se añadió borohidruro de sodio (4,86 mg, 0,128 mmol) y la reacción se agitó a temperatura ambiente. Después de una hora, la reacción se inactivó mediante la adición de ácido acético y se concentró bajo presión reducida. El material bruto se disolvió nuevamente en DCM, y luego se filtró y concentró bajo presión reducida para proporcionar 85 mg (98 %) de producto deseado como un aceite incoloro.
El siguiente ejemplo se puede preparar utilizando métodos de acoplamiento similares a los empleados para la síntesis delEjemplo 17con elIntermediario 18c.
Ejemplo 18: (9Z,9'Z,12Z,12'Z)-2,2'-(2-((4-(dimetilamino)butanoiloxi)metil)-1,4-fenilen)bis oxi)bis(etan-2,1 -diil) dioctadeca-9,12-dienoato
1H RMN (400 MHz, Cloroformo-d) 5 : 6,88 (t,J= 1,6 Hz, 1 H), 6,77 (d,J= 1,7 Hz, 2H), 5,46 - 5,25 (m, 8H), 5,14 (s, 2H), 4,13 (h,J= 2,4 Hz, 4H), 3,94 (dt,J= 9,2, 5,3 Hz, 4H), 2,77 (t,J= 6,5 Hz, 4H), 2,44 (t,J= 7,3 Hz, 2H), 2,35 (s, 6H), 2,32 2,25 (m, 4H), 2,04 (c,J= 6,9 Hz, 8H), 1,91 (s, 2H), 1,81 (dq,J= 8,3, 5,0, 4,1 Hz, 8H), 1,67 - 1,56 (m, 4H), 1,40 - 1,23 (m, 30H), 0,89 (t,J= 6,7 Hz, 6H). MS (m+1) = 922,9, Rt = 1,29 min (LC Método 3).
Síntesis del Ejemplo 19 (referencia): 2,4-bis((9Z,12Z)-octadeca-9,12-dieniloxi)bencil 4-(dimetilamino)butanoato Intermediario 19a: 2,4-bis((9Z,12Z)-octadeca-9,12-dien-1-iloxi)benzaldehído
Se puede preparar utilizando métodos similares alIntermediario 1autilizando 2,4-dihidroxibenzaldehído como material de partida. TLC: Rf = 0,8 (EtOAc: Hexano, 2:8 ), UV activo.
Intermediario 19b: (2,4-bis((9Z,12Z)-octadeca-9,12-dien-1-iloxi)fenil)metanol
Se puede preparar utilizando métodos similares alIntermediario 1butilizando elIntermediario 19acomo material de partida. TLC: Rf = 0 .5 (EtOAc: Hexano, 2:8), UV activo.
Ejemplo 19: 2,4-bis((9Z,12Z)-octadeca-9,12-dieniloxi)bencil 4-(dimetilamino)butanoato
En un matraz de fondo redondo, se disolvió elIntermediario 19b(2,2 g, 3,5 mmol) en 30 ml. DCM. Se añadió EDCl.HCl (1,98 g, 10,38 mmol) gota a gota seguido de ácido 4-(dimetilamino)butanoico (1,74 g, 10,4 mmol), DIPEA (2,7 g, 20,75 mmol) y DMAP (84 mg, 0,70 mmol), en ese orden. La reacción se agitó 14 h a temperatura ambiente. A continuación, la reacción fue extraída en EtOAc. La capa orgánica se concentró bajo una presión reducida y el residuo bruto se purificó mediante cromatografía de columna de gel de sílice eluyendo con MeOH/DCM (5 %) como gradiente para proporcionar el producto deseado 0,90 g (34,3 %) como un aceite amarillo. 1H RMN (400 MHz, CLOROFORMO-d) 5 : 7,20 (d,J= 8,6 Hz, 1 H), 6,40-6,50 (m, 2H), 5,29-5,47 (m, 8H), 5,12 (s, 2H), 3,96 (td,J= 6,4, 2,8 Hz, 4H), 2,80 (t,J= 6,3 Hz, 4H), 2,32 2,45 (m, 4H), 2,20-2,31 (m, 6H), 2,07 (c,J= 6,6 Hz, 8H), 1,68-1,92 (m, 6H), 1,43-1,57 (m, 4H), 1,19-1,43 (m, 28H), 0,91 (t,J= 7,1 Hz, 6H). MS (m+1) = 750,5, Rt = 1,19 min (LC Método 1 ).
Síntesis del Ejemplo 20: ((2-(((4-(dimetilamino)butanoil)oxi)metil)-1,4-fenilen)bis(oxi))bis(propan-3,1 -diil) bis(4,4-bis(octiloxi)butanoato)
Intermediario 20a: 3-((terc-butildimetilsilil)oxi)propil metanosulfonato
A la solución de 3-((terc-butildimetilsilil)oxi)propan-1-ol (2 g, 10,51 mmol) y trietilamina (2,2 ml, 15,77 mmol) en 30 ml de DCM a 0 °C se añadió lentamente cloruro de metanosulfonilo (1 ml, 12,62 mmol) gota a gota. La mezcla de reacción se dejó agitar a 30 °C durante 30 min. El progreso de la reacción fue monitoreado por TLC. La mezcla de reacción se inactivó con 50 ml de agua y se extrajo con d Cm (2 * 50 ml). Las capas orgánicas combinadas se secaron sobre sulfato de sodio y se evaporaron hasta la sequedad para proporcionar 2,7 g (96 % de rendimiento) de un líquido de color marrón pálido. TLC: EtOAc: Hexanos (2:8): Rf = 0,5.
n erme aro : , - s - erc- u me s ox propox enza e o
A la suspensión de K2CO3 (1,67 g, 12,08 mmol) en 20 ml de DMF se añadió 2,5-dihidroxibenzaldehído (556 mg, 4,02 mmol) eIntermediario 20a(2,7 g, 10,07 mmol), seguido de yoduro de tetrabutil amonio (200 mg, cat.). La mezcla de reacción se calentó a 100 °C durante 3 h. El progreso de la reacción fue monitoreado por<t>L<c>. La mezcla de reacción se inactivó con 50 ml de agua y se extrajo con (3 x 50 ml) de EtOAc. Las capas orgánicas combinadas se lavaron con salmuera, se secaron sobre sulfato de sodio y se evaporaron hasta la sequedad para proporcionar un líquido de color marrón pálido. El producto fue purificado por cromatografía ultrarrápida (gel de sílice (malla 230-400)). El producto se eluyó al 5 % de EtOAc en Hexanos para dar 1,6 g (82 % de rendimiento) de un líquido de color marrón pálido. TLC: EtOAc: Hexanos (2:8): Rf = 0,9.
Intermediario 20c: 2,5-Bis(3-hidroxipropoxi)benzaldehído
A la disolución deIntermediario 20b(500 mg, 1,03 mmol) en 5 ml de THF seco a 0 °C se añadió TBAF 1 M en THF (4,1 ml, 4,14 mmol) y se agitó durante 1 h a la misma temperatura, luego se permitió agitar a 30 °C durante 1 h. El progreso de la reacción fue monitoreado por TLC. La mezcla de reacción se inactivó con 20 ml de agua y se extrajo con EtOAc (3 x 50 ml). Las capas orgánicas combinadas se lavaron con salmuera, se secaron sobre sulfato de sodio y se evaporaron hasta la sequedad para proporcionar 250 mg de un líquido de color amarillo pálido. TLC: EtOAc: Hexanos (2:8): Rf = 0,3.
Intermediario 20d: ((2-Formil-1,4-fenilene)bis(oxi))bis(propan-3,1-diil) bis(4,4-bis(octiloxi)butanoato)
A la solución deIntermediario 20c(250 mg, 0,98 mmol) y ácido 4,4-bis(octiloxi)butanoico (746 mg, 2,16 mmol) en 10 ml de DMF se añadió DIPEA (0,7 ml, 3,92 mmol), DMAP (60 mg, 0,49 mmol) seguido de HATU (930 mg, 2,45 mmol) y se agitó a 30 °C durante 24 h. El progreso de la reacción fue monitoreado por TLC. La mezcla de reacción se inactivó con 50 ml de agua y se extrajo con EtOAc (3 x 50 ml). Las capas orgánicas combinadas se lavaron con salmuera, se secaron sobre sulfato de sodio y se evaporaron hasta la sequedad para proporcionar un líquido de color amarillo pálido. El producto fue purificado por cromatografía ultrarrápida (gel de sílice, malla 230-400). El producto se eluyó al 20 % de EtOAc en Hexanos para dar 500 mg (56 % de rendimiento) de un líquido amarillo pálido. TLC: EtOAc: Hexanos (2:8): Rf = 0,4.
Intermediario 20e: ((2-(hidroximetil)-1 ,4-fenilen)bis(oxi))bis(propan-3,1-diil) bis(4,4-bis(octiloxi)butanoato)
A la disolución deIntermediario 20d(500 mg, 0,551 mmol) en 5,5 ml de metanol y 2 ml de THF se añadió borohidruro de sodio (13 mg, 0,341 mmol) a 0° C y se agitó durante 5 min. El progreso de la reacción fue monitoreado por TLC. La mezcla de reacción se inactivó con 10 ml de agua y se extrajo con EtOAc (3 x 30 ml). Las capas orgánicas combinadas se lavaron con 30 ml de disolución de salmuera, se secaron sobre sulfato de sodio y se evaporaron hasta la sequedad para permitir el producto deseado, 450 mg (89 % de rendimiento) como un líquido incoloro. TLC: EtOAc: Hexanos (2:8): Rf = 0,3.
Ejemplo 20: ((2-(((4-(dimetilamino)butanoil)oxi)metil)-1,4-fenilen)bis(oxi))bis(propan-3,1 -diil) bis(4,4-bis(octiloxi)butanoato)
A la disolución deIntermediario 20e(190 mg, 0,20 mmol), clorhidrato de ácido 4-dimetil amino butanoico (70 mg, 0,41 mmol) y DIPEA (0,12 ml, 0,83 mmol), en DCM (7 ml) se añadió EDC.HCl (80 mg, 0,41 mmol) seguido de d Ma P (51 mg, 0,41 mmol). La reacción se agitó a 30 °C durante 20 h. El progreso de la reacción fue monitoreado por TLC. La mezcla de reacción se inactivó con 20 ml de agua y se extrajo con DCM (3 x 50 ml). Las capas orgánicas combinadas se secaron sobre sulfato de sodio y se evaporaron hasta la sequedad para proporcionar el sólido bruto. El producto fue purificado por cromatografía ultrarrápida (gel de sílice (malla 230-400)). El producto se eluyó al 4 % de metanol en DCM para dar 140 mg (65 % de rendimiento) como un líquido viscoso de color amarillo. 1H RMN (400MHz, CDCb): 5 = 6,89 (s, 1H), 6,77 (s, 2H), 5,13 (s, 2H), 4,48 (t,J= 5,6 Hz, 2H), 4,28 (t,J= 6,4Hz, 4H), 4,00 (c,J= 6,0 Hz, 4H), 3,57 (c,J= 6,8 Hz, 4H), 3,40 (c,J= 6,4 Hz, 4H), 2,43-1,81 (m, 26H), 1,56-1,49 (m, 12H), 1,49-1,26 (m, 34H), 0,87 (t,J= 6,4 Hz, 12H) ppm . MS (m+1) = 1022,5, Rt = 1.17 min (LC Método 4).
Síntesis del Ejemplo 21: ((2-(((4-(dimetilamino)butanoil)oxi)metil)-1,4-fenilen)bis(oxi))bis(pentan-5,1-diil) bis(4,4-bis(octiloxi)butanoato)
Intermediario 21a: 2,5-Bis((5-((terc-butildimetilsilil)oxi)pentil)oxi)benzaldehído
Puede prepararse utilizando un método similar al empleado para la síntesis delintermediario 20ba partir de 2,5 dihidroxibenzaldehído y metanosulfonato de 5-((terc-butildimetilsilil)oxi)pentilo. TLC: EtOAc: Hexanos (2:8): Rf = 0,9.Intermediario 21b: 2,5-Bis((5-hidroxipentil)oxi)benzaldehído
Puede prepararse utilizando un método similar al empleado para la síntesis delIntermediario 20cde 2,5-bis((5-((tercbutildimetilsilil)oxi)pentil)oxi)benzaldehído (Intermediario 21a). TLC: EtOAc: Hexanos (8:2): Rf = 0,1.
Intermediario 21c: ((2-Formil-1,4-fenilene)bis(oxi))bis(pentan-5,1-diil) bis(4,4-bis(octiloxi)butanoato)
Puede prepararse utilizando un método similar al empleado para la síntesis delintermediario 20da partir de 2,5-bis((5-hidroxipentil)oxi)benzaldehído (intermediario 21b) y ácido 4-dimetil amino butanoico. TLC: EtOAc: Hexanos (2:8): Rf = 0,4.
intermediario 21d: ((2-(hidroximetil)-1 ,4-fenilen)bis(oxi))bis(pentan-5,1 diil) bis(4,4-bis(octiloxi)butanoato)
Se puede preparar utilizando un método similar al empleado para la síntesis del Intermediario 20e a partir del Intermediario 21c. TLC: EtOAc: Hexanos (2:8): Rf = 0,3.
Ejemplo 21: ((2-(((4-(dimetilamino)butanoil)oxi)metil)-1,4-fenilen)bis(oxi))bis(pentan-5,1-diil) bis(4,4-bis(octiloxi)butanoato)
A la disolución deIntermediario 21d, clorhidrato de ácido 4-dimetil amino butanoico (104 mg, 0,62 mmol) y DIPEA (0,2 ml, 1,24 mmol) en DCM (10 ml) se añadió EDC.HCl (119 mg, 0,62 mmol), y seguido de DMAP (76 mg, 0,62 mmol). La reacción se agitó a 30 °C durante 16 h. El progreso de la reacción fue monitoreado por TLC. La mezcla de reacción se inactivó con 20 ml de agua y se extrajo con DCM (3 x 50 ml). Las capas orgánicas combinadas se secaron sobre sulfato de sodio y se evaporaron hasta la sequedad para proporcionar un sólido bruto. El producto fue purificado por cromatografía ultrarrápida (gel de sílice (malla 230-400)). El producto se eluyó al 4 % de metanol en DCM para dar 180 mg (54 % de rendimiento) de un líquido viscoso de color amarillo pálido. 1H RMN (400MHz, CDCh): 5 = 6,89 (s, 1H), 6,77 (s, 2h ), 5,13 (s, 2H), 4,49 (t,J= 5,6 Hz, 2H), 4,09 (t,J= 6 Hz, 4H), 3,90 (c,J= 4Hz, 4H), 3,57 (c,J= 6,8 Hz, 4H), 3,41 (c,J= 6,4 Hz, 4H), 2,40-2,22 (m, 8H), 2,00 (s, 6H), 1,95-1,66 (m, 30H), 1,50-1,27 (m, 37H), 0,87 (t,J= 6,4 Hz, 11H) ppm. MS (m+1) = 1078,6, Rt = 1,20 min (LC Método 4).
Síntesis del Ejemplo 22: ((2-(((4-(dietilamino)butanoil)oxi)metil)-1,4-fenilen)bis(oxi))bis(pentan-5,1-diil) bis(4,4-bis(octiloxi)butanoato)
Intermediario 22a: 4-(dietilamino)butanoato de metilo
En un tubo sellado de 500 ml, se tomó 4-bromo butanoato de metilo (30,0 g, 165,7 mmol) en THF seco (200 ml). Se añadió dietilamina (86 ml, 828,7 mmol). La mezcla resultante se agitó durante 16 h a 70 °C y fue monitoreada por TLC. La mezcla de reacción se diluyó con agua (200 ml), y se extrajo con EtOAc (2 x 500 ml). Las capas orgánicas combinadas se lavaron con salmuera (500 ml), se secaron sobre Na2SO4, y se concentraron bajo presión reducida para proporcionar 25 g (87 % de rendimiento) del producto deseado como un líquido marrón pálido. t LC: EtOAc: Hexano (3: 7), Rf = 0,2, tinción de yodo & PMA activa.
Intermediario 22b: 2: ácido 4-(dietilamino)butanoico
En un matraz de fondo redondo, una mezcla deIntermediario 22a(25,0 g, 144,4 mmol) y HCl 6 N (200 ml) se calentó y sometió a reflujo durante 7 h. La reacción fue monitoreada por TLC. La mezcla de reacción se evaporó y secó para proporcionar 26 g (92 % de rendimiento) del producto deseado como un sólido blanco. TLC: metanol: diclorometano (1:9), Rf=0,13,yodoy tinción de PMA activa.
Ejemplo 22: ((2-(((4-(dietilamino)butanoil)oxi)metil)-1,4-fenilen)bis(oxi))bis(pentan-5,1 -diil) bis(4,4-bis(octiloxi)butanoato)
En un matraz de fondo redondo, se tomaron elIntermediario 21d(190 mg, 0,196 mmol),Intermediario 22b(0,581 g, 4,75 mmol) y DIPEA (0,15 ml, 0,784 mmol) en diclorometano (10 ml). Se añadió EDC (75 mg, 0,393 mmol) en una porción, seguido de la adición de DMAP (48 mg, 0,393 mmol). La reacción fue agitada a temperatura ambiente durante 16 h y monitoreada por TLC. La mezcla de reacción se inactivó con 20 ml de agua y se extrajo con DCM (3 x 50 ml). Las capas orgánicas combinadas se secaron sobre sulfato de sodio y se evaporaron hasta la sequedad para permitir el producto bruto sólido. El producto fue purificado por cromatografía ultrarrápida (gel de sílice, malla 230-400) utilizando metanol / diclorometano (4 %) como eluyente para proporcionar 140 mg (64 % de rendimiento) del producto deseado como un líquido viscoso de color amarillo pálido. 1H RMN (400MHz, CDCls): 5 = 0,82 (t,J= 7,10 Hz, 12 H) 0,85 - 1,00 (m, 6 H) 1,09 - 1,32 (m, 40 H) 1,37 - 1,55 (m, 12 H) 1,58 - 1,67 (m, 4 H) 1,67 - 1,78 (m, 6 H) 1,79 - 1.93 (m, 4 H) 2,24 - 2,52 (m, 12 H) 3,33 (dt,J= 9,26, 6,68 Hz, 4 H) 3,50 (dt,J= 9,05,6,72 Hz, 4 H) 3,78 - 3,91 (m, 4 H) 3,95 - 4,07 (m, 4 H) 4,42 (t,J= 5,62 Hz, 2 H) 5,07 (s, 2 H) 6,70 (d,J= 1,71 Hz, 2 H) 6,82 (s, 1 H). MS (m+1) = 1107,9, Rt = 2,98 min (LC Método 5).
Ejemplo 23: ((2-(((1 ,4-Dimetilpiperidin-4-carbonil)oxi)metil)-1,4-fenilen)bis(oxi))bis(pentan-5,1-diil) bis(4,4-bis(octiloxi)butanoato)
A la disolución de ácido 1,4-dimetilpiperidin-4-carboxílico (120 mg, 0,76 mmol) y NEt3 (0,3 mL, 2,03 mmol) en DCM (10 mL) se le añadió cloruro de 2,4,6-triclorobenzilo (185 mg, 0,76 mmol) lentamente a 30 °C y se agitó durante 4 h. Después de este tiempo, se añadieron elIntermediario 21d(490 mg, 0,51 mmol) en DCM (5 mL) y DMAP (124 mg, 1,01 mmol) y la reacción se agitó durante 20 h. El progreso de la reacción fue monitoreado por TLC. La mezcla de reacción se inactivó con H2O (20 mL) y se extrajo con d Cm (3 x 50 mL). Las capas orgánicas combinadas se secaron sobre sulfato de sodio y se evaporaron hasta la sequedad para permitir el producto bruto sólido. El producto fue purificado por cromatografía ultrarrápida (gel de sílice (malla 230-400)). El producto se eluyó al 4 % de metanol en DCM para dar 430 mg (77 % de rendimiento) del compuesto del título como un líquido viscoso de color amarillo pálido. 1H<r>M<n>(400MHz, CD2Cl2): 5 = 6,86 (d,J= 2,3 Hz, 1H), 6,75 -6,83 (m, 2H), 5,12 (s, 2H), 4,45 (t,J= 5,6 Hz, 2H), 4,07 (t,J= 6,7 Hz, 4H), 3,87 - 3,96 (m, 4H), 3,54 (dt,J= 9,3, 6,7 Hz, 4H), 3,38 (dt,J= 9,3, 6,7 Hz, 4H), 2,59 (s a, 2H), 2,35 (t,J= 7,6 Hz, 4H), 2,03 - 2,29 (m, 7H), 1,83 - 1,92 (m, 4H), 1,73 - 1,83 (m, 4H), 1,64 - 1,74 (m, 4H), 1,44 -1,60 (m, 13H), 1,18 - 1,38 (m, 41 H), 1,21 (s, 3H), 0,84 - 0,93 (m, 12H). MS (m+1) = 1105,2, Rt = 1,34 min (LC Método 6).
Síntesis del Ejemplo 24: 8-(4-((5-((4,4-Bis(octiloxi)butanoil)oxi)pentil)oxi)-2-(((4(dimetilamino)butanoil)oxi)metil)fenoxi)octil decanoato
Intermediario 24a: 8-(2-Formil-4-hidroxifenoxi)octil decanoato
Puede prepararse utilizando un método similar al empleado para la síntesis delIntermediario 20ba partir de 2,5-dihidroxibenzaldehído y 8-((metilsulfonilo)oxi)octil decanoato.<t>LC: EtOAc: Hexanos (2:8): Rf = 0,9.
Intermediario 24b: 8-(4-((5-((terc-butildimetilsilil)oxi)pentil)oxi)-2-formilfenoxi)octil decanoato
Puede prepararse utilizando un método similar al empleado para la síntesis delIntermediario 20ba partir del Intermediario24ay 5-((terc-butildimetilsililo)oxi)pentil metanosulfonato. TLC: EtOAc: Hexanos (2:8): Rf = 0,6.
Intermediario 24c: 8-(2-Formil-4-((5-hidroxipentil)oxi)fenoxi)octil decanoato
Se puede preparar utilizando un método similar al empleado para la síntesis delIntermediario 20ca partir delIntermediario 24b.TLC: EtOAc: Hexanos (8:2): Rf = 0,2.
Intermediario 24d: 8-(4-((5-((4,4-Bis(octiloxi)butanoil)oxi)pentil)oxi)-2-formilfenoxi)octil decanoato
Se puede preparar utilizando un método similar al empleado para la síntesis delIntermediario 20da partir delIntermediario 24c.TLC: metanol:DCM (1:9): Rf = 0,5.
Intermediario 24e: 8-(4-((5-((4,4-Bis(octiloxi)butanoil)oxi)pentil)oxi)-2-(hidroximetil)fenoxi)octil decanoato
Se puede preparar utilizando un método similar al empleado para la síntesis delIntermediario 20ea partir delIntermediario 24d.TLC: EtOAc: Hexanos (2:8): Rf = 0,4.
Ejemplo 24: 8-(4-((5-((4,4-Bis(octiloxi)butanoil)oxi)pentil)oxi)-2-(((4(dimetilamino)butanoil)oxi)metil)fenoxi)octil decanoato
A una disolución deIntermediario 24e(1,2 g, 1,43 mmol) en DCM (30 ml) se añadió EDC.HCl (550 mg, 2,87 mmol), DIPEA (0,75 ml, 4,31 mmol), DMAP (175 mg, 1,43 mmol), y ácido N,N-dimetilaminobutírico.HCl (361 mg, 2,15 mmol). La mezcla se agitó durante 18 h a 25°C bajo atmósfera de nitrógeno. El progreso de la reacción fue monitoreado por TLC. La mezcla de reacción se diluyó con agua (200 ml), se extrajo con DCM (2 * 150 ml), se lavaron las capas orgánicas combinadas con salmuera (100 ml), se secaron sobre Na2SO4 y se concentraron bajo presión reducida, para obtener un líquido verde pálido. El producto fue purificado por cromatografía ultrarrápida (gel de sílice, malla 230-400). El producto se eluyó al 5 % de metanol en DCM para dar 550 mg (42 % de rendimiento) de un líquido verde pálido. 1H RMN (400MHz, CDCb): 5 = 6,88 (s, 1H), 6,77 (s, 2H), 5,14 (s, 2H), 4,49 (t,J= 4 Hz, 1 H), 4,11-4,04 (m, 4H), 3,92-3,89 (m, 4H), 3,57 (c,J= 6,8 Hz, 2H), 3,41 (c,J= 6,4 Hz, 2H), 2,40 (c,J= 8 Hz, 4H), 2,30 (m, 4H), 2,17 (s, 6H), 1,95-1,41 (m, 24H), 1,48-1,26 (m, 37H), 0,87 (t,J= 6,4Hz, 8H) ppm. MS (m+1) = 948,4, Rt = 1,10 min (LC Método 4).
Síntesis del Ejemplo 25: 8-(4-((5-((4,4-Bis(octiloxi)butanoil)oxi)pentil)oxi)-3-(((4-(dimetilamino)butanoil)oxi)metil)fenoxi)octil decanoato
Intermediario 25a: 2-((5-((terc-butildimetilsilil)oxi)pentil)oxi)-5-hidroxibenzaldehído
Puede prepararse utilizando un método similar al empleado para la síntesis delintermediario 20ba partir de 2,5-dihidroxibenzaldehído y metanosulfonato de 5-((terc-butildimetilsilil)oxi)pentilo. TLC: EtOAc: Hexanos (2:8): Rf = 0,9.
Intermediario 25b: 8-(3-Formil-4-((5-hidroxipentil)oxi)fenoxi)octil decanoato
A una disolución deIntermediario 25aen DMF (40 ml) se añadieron 8-((metilsulfonil)oxi)octil decanoato (3,3 g, 8,86 mmol) y K2CO3 (1,6 g, 11,81 mmol) seguido de TBAI (500 mg, 0,74 mmol) y se calentó a 100 °C durante 3 h bajo atmósfera de nitrógeno. El progreso de la reacción fue monitoreado por TLC. La mezcla de reacción se diluyó con agua (100 ml), se extrajo con EtOAc (2 * 150 ml), se lavaron las capas orgánicas combinadas con salmuera (200 ml), se secaron sobre Na2SO4 y se concentraron bajo presión reducida, para obtener un líquido marrón pálido. El producto fue purificado por cromatografía ultrarrápida (gel de sílice, malla 100-200). El producto se eluyó al 20 % de EtOAc en Hexanos para dar 1,2 g (41 % de rendimiento) de un sólido blanquecino. TLC: EtOAc: Hexanos (2:8): Rf = 0,6.
Intermediario 25c: 8-(4-((5-((4,4-Bis(octiloxi)butanoil)oxi)pentil)oxi)-3-formilfenoxi)octil decanoato
A una disolución deIntermediario 25b(300 mg, 0,59 mmol) en DCM (20 ml) se añadieron ácido 4,4-bis(octiloxi)butanoico (305 mg, 0,88 mmol), EDC.HCl (227 mg, 1,18 mmol), DIPEA (0,31 ml, 1,77 mmol) seguido de DMAP (72 mg, 0,59 mmol) y se agitó durante 18 h a 25 °C bajo atmósfera de nitrógeno. El progreso de la reacción fue monitoreado por TLC. La mezcla de reacción se diluyó con agua (100 ml), se extrajo con DCM (2 * 50 ml), se lavaron las capas orgánicas combinadas con salmuera (100 ml), se secaron sobre Na2SO4 y se concentraron bajo presión reducida, para obtener un líquido verde pálido. El producto fue purificado por cromatografía ultrarrápida (gel de sílice, malla 230-400). El producto se eluyó al 5 % de metanol en DCM para dar 300 mg (61 % de rendimiento) de líquido verde pálido. TLC: MeOH:DCM (1:9): Rf = 0,5.
Intermediario 25d: 8-(4-((5-((4,4-Bis(octiloxi)butanoil)oxi)pentil)oxi)-3-(hidroximetil)fenoxi)octil decanoato
Se puede preparar utilizando un método similar al empleado para la síntesis delIntermediario 20ea partir delIntermediario 25c.TLC: EtOAc: Hexanos (2:8): Rf = 0,4.
Ejemplo 25: 8-(4-((5-((4,4-Bis(octiloxi)butanoil)oxi)pentil)oxi)-3-(((4-(dimetilamino)butanoil)oxi)metil)fenoxi)octil decanoato
A una disolución deIntermediario 25d(0,3 g, 0,359 mmol) en DCM (10 ml) se añadió EDC.HCl (137,7 mg, 0,718 mmol), DIPEA (0,18 ml, 1,07 mmol), DMAP (43,8 mg, 1,43 mmol), y ácido N,N-dimetilaminobutírico.HCl (90,3 mg, 0,538 mmol). La mezcla se agitó durante 18 h a 25°C bajo atmósfera de nitrógeno. El progreso de la reacción fue monitoreado por TLC. La mezcla de reacción se diluyó con agua (200 ml), se extrajo con dCm (2 x 150 ml), se lavaron las capas orgánicas combinadas con salmuera (100 ml), se secaron sobre Na2SO4 y se concentraron bajo presión reducida, para obtener un líquido verde pálido. El producto fue purificado por cromatografía ultrarrápida (gel de sílice, malla 230-400). El producto se eluyó al 5 % de metanol en DCM para dar 150 mg (44 % de rendimiento) de un líquido verde pálido. 1H RMN (400MHz, CDCls): 56,89 (s, 1H), 6,77 (s, 2H), 5,14 (s, 2H), 4,48 (t,J= 4 Hz, 1 H), 4,10-4,04 (m, 4H), 3,94-3,87 (m, 4H), 3,55 (c,J= 6,4 Hz, 2H), 3,41 (c,J= 6,8 Hz, 2H), 2,40 (c,J= 7,6 Hz, 4H), 2,29 (m, 4H), 2,21 (s, 6H), 1,95-1,43 (m, 24H), 1,49-1,26 (m, 37H), 0,86 (t,J= 6,4Hz, 8H) ppm. MS (m+1) = 948,4, Rt = 1,09 min (LC Método 4).
Síntesis del Ejemplo 26 (referencia): ((4-(((1,4-Dimetilpiperidin-4-carbonil)oxi)metil)-1,3-fenilen)bis(oxi))bis(octan-8,1-diil) bis(decanoato)
Intermediario 26a: 8-Hydroxioctil decanoato
ElIntermediario 26ase puede preparar utilizando un método similar al empleado para la síntesis delIntermediario 17aa partir de ácido cáprico y 1,8 octano diol. TLC: EtOAc:Hexanos (4:6): Rf = 0,6.
Intermediario 26b: 8-((Metilsulfonil)oxi)octil decanoato
El Intermediario 26b puede prepararse utilizando un método similar al empleado para la síntesis del Intermediario 20a a partir del Intermediario 26a. TLC: EtOAc:Hexanos (2:8): Rf = 0,5.
Intermediario 26c: ((4-formil-1,3-fenilen)bis(oxi))bis(octan-8,1-diil) bis(decanoato)
El Intermediario 26c se puede preparar utilizando un método similar al empleado para la síntesis del Intermediario 20b a partir del Intermediario 26b. T<l>C: EtOAc:Hexanos (2:8): Rf = 0.
Intermediario 26d: ((4-(Hidroximetil)-1,3-fenilen)bis(oxi))bis(octan-8,1-diil) bis(decanoato)
El Intermediario 26d se puede preparar utilizando un método similar al empleado para la síntesis del Intermediario 20e con el Intermediario 26c. TLC: EtOAc:Hexanos (2:8): Rf = 0,4.
Ejemplo 26: ((4-(((1,4-Dimetilpiperidin-4-carbonil)oxi)metil)-1,3-fenilen)bis(oxi))bis(octan-8,1-diil) bis(decanoato)
A una disolución fría de ácido 1,4-dimetilpiperidin-4-carboxílico (167 mg, 1,06 mmol) en DCM (15 ml) se añadió trietilamina (0,40 ml, 2,83 mmol) seguido de cloruro de 2,4,6-trifluorobenzoilo (0,17 ml, 1,06 mmol) y se agitó durante 2 h a 25 °C bajo atmósfera de nitrógeno. Después de lo cual, se añadió el Intermediario 26d (500 mg, 0,70 mmol) en DCM (5 ml), y la mezcla de reacción resultante se agitó durante otras 2 h a 25 °C. El progreso de la reacción fue monitoreado por TLC. La mezcla de reacción se diluyó con agua (100 ml), se extrajo con DCM (2 * 50 ml), se lavaron las capas orgánicas combinadas con salmuera (100 ml), se secaron sobre Na2SO4 y se concentraron bajo presión reducida, para proporcionar un líquido verde pálido. El producto fue purificado por cromatografía ultrarrápida (gel de sílice, malla 230-400). El producto se eluyó al 5 % de metanol en DCM para dar 510 mg (85 % de rendimiento) de un líquido verde pálido. 1H<r>M<n>(400MHz, CDCb): 5 = 7,17 (d,J=8,4 Hz, 1 H), 6,41 (d,J= 6,8 Hz, 2H), 5,07 (s, 2H), 4,03 (t,J= 7,2 Hz, 4H), 3,91 (t,J= 6Hz, 4H), 2,62 (s a, 2H), 2,282-2,231 (m, 7H), 2,18-2,06 (m, 4H), 1,78-1,1 1 (m, 57H), 0,84 (t,J= 6,8 Hz, 6H) ppm. MS (m+1) = 844,3, Rt = 1,02 min (LC Método 4).
El Ejemplo 27 y el Ejemplo 28 se pueden preparar utilizando métodos de acoplamiento similares a los empleados para la síntesis del Ejemplo 26 con la pareja de acoplamiento de ácido carboxílico adecuada:
- - - , - - , -bis(decanoato)
1H RMN (400MHz, CDCls): 5 = 7,17 - 7,24 (m, 1 H), 6,40 - 6,47 (m, 2H), 5,10 (s, 2H), 4,07 (td,J= 6,7, 1,2 Hz, 4H), 3,94 (td,J= 6,5, 1,1 Hz, 4H), 2,33 - 2,87 (s a, 6H), 2,37 (t,J= 7,2 Hz, 2H), 2,30 (t,J= 7,5 Hz, 4H), 1,71 - 1,93 (m, 6H), 1,55 -1,70 (m, 8H), 1,41 - 1,52 (m, 4H), 1,33 - 1,41 (m, 12H), 1,19 - 1,33 (m, 24H), 0,96 - 1,19 (s a, 6H), 0,83 - 0,93 (m, 6H). MS (m+1) = 846,6, Rt = 1,03 min (LC Método 6).
ARNm
Breve descripción del protocolo de transcripción de ARNm
Se construye un molde circular de ADN plasmídico que contiene un casete de transcripción de ARNm que consiste en las siguientes características: un promotor de ARN polimerasa bacteriófago T7 de consenso dependiente de ADN, una región no traducida (UTR) 5’, una secuencia Kozak, y un marco de lectura abierto, una UTR de 3', y una cola de poliadenosina larga de 120 nucleótidos (poliA120). El molde de ADN plasmídico se propaga enE. coli,se aisla y se lineariza por digestión de la enzima de restricción inmediatamente 3’ de la cola de poli120. El ADN del plásmido se combina con ARN polimerasa T7, trifosfatos de ribonucleótido, inhibidor de RNasa, enzima pirofosfatasa, ditiotreitol, espermidina y disolución amortiguadora de reacción enzimática, y se incuba durante 1 hora a 37 °C. La enzima DNasa I se añade para digerir el molde de ADN plásmido y se incuba durante 0,5 horas a 37 °C. El ARNm se aísla por precipitación secuencial con cloruro de litio, lavado del gránulo en etanol al 70 %, resuspensión del gránulo del ARNm en agua, re-precipitación con isopropanol y acetato de sodio, y lavado del gránulo nuevamente en etanol al 70 %. El último gránulo de ARNm se resuspende en agua.
TEV-hLeptina-GAopt-2xhBG-120A (SEQ ID NO:7)
Características de la secuencia:
Virus del grabado del tabaco (TEV, por sus siglas en inglés) UTR 5’: 14-154
Secuencia Kozak óptima: 155-163
Leptina humana que codifica aminoácidos 1-167 de la proteína con # de acceso: NP_000221, secuencia optimizada para codones por GeneArt: 164-664
codones de paradas: 665-670
2 copias de beta-globina humana UTR 3’: 689-954
Cola de poliA de 120 nucleótidos: 961-1080
GGGAGACGCGUGUUAAAUAACAAAUCUCAACACAACAUAUACAAAACAAACGAAUCUCA
AGCAAUCAAGCAUUCUACUUCUAUUGCAGCAAUUUAAAUCAUUUCUUUUAAAGCAAAAG
CAAUUUUCUGAAAAUUUUCACCAUUUACGAACGAUAGCCGCCACCAUGCACUGGGGAA
CCCUGUGCGGAUUCCUGUGGCUGUGGCCCUACCUGUUCUAUGUGCAAGCCGUGCCCA
UCCAGAAGGUGCAGGACGACACCAAGACCCUGAUCAAGACCAUCGUGACCCGGAUCAA
CGACAUCAGCCACACCCAGAGCGUGUCCAGCAAGCAGAAAGUGACCGGCCUGGACUUC
AUCCCCGGCCUGCACCCUAUCCUGACCCUGUCCAAGAUGGACCAGACCCUGGCCGUG
UACCAGCAGAUCCUGACCAGCAUGCCCAGCCGGAACGUGAUCCAGAUCAGCAACGACC
UGGAAAACCUGCGGGACCUGCUGCACGUGCUGGCCUUCAGCAAGAGCUGCCAUCUGC
CUUGGGCCAGCGGCCUGGAAACCCUGGAUUCUCUGGGCGGAGUGCUGGAAGCCAGCG
GCUACUCUACAGAGGUGGUGGCCCUGAGCAGACUGCAGGGCAGCCUGCAGGAUAUGC
UGUGGCAGCUGGAUCUGAGCCCCGGCUGCUAAUAGCGGACCGGCGAUAGAUGAAGCU
CGCUUUCUUGCUGUCCAAUUUCUAUUAAAGGUUCCUUUGUUCCCUAAGUCCAACUACU
AAACUGGGGGAUAUUAUGAAGGGCCUUGAGCAUCUGGAUUCUGCCUAAUAAAAAACAU
UUAUUUUCAUUGCAGCUCGCUUUCUUGCUGUCCAAUUUCUAUUAAAGGUUCCUUUGUU
CCCUAAGUCCAACUACUAAACUGGGGGAUAUUAUGAAGGGCCUUGAGCAUCUGGAUUC
UGCCU AAU AAAAAACAU UUAUUUUCAUU GCGGCCGCAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA
AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA
AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA
Evaluación biológica
Empaque de ARNm
Todos los equipos y suministros desechables están certificados libres de actividad de RNasa por el fabricante o se hacen libres de RNasa mediante el uso del reactivo RNaseZap (LifeTechnologies). El ARNm está encapsulado en una relación molar lipídica catiónica a fosfato de ARNm (N:P) de 4:1. Los lípidos (lípidos catiónicos, DSPC, colesterol, y PEG lipídico o lípidos encubiertos) se disuelven en etanol. Las relaciones molares son 40:10:38:2, respectivamente. La mezcla se somete a sonicación brevemente, luego se agita suavemente durante 5 minutos y luego se mantiene a 37 °C hasta su uso. El ARNm se intercambia en un disolución amortiguadora de citrato pH 5,8 - 6,0 mediante el uso de concentradores centrífugos Amicon Ultra-15, y la concentración final se ajusta a 0,5 mg/ml y se mantiene a 37 °C hasta su uso. Un volumen igual de lípidos en etanol, ARNm en la disolución amortiguadora de citrato y la disolución amortiguadora de citrato sola se extraen en jeringas desechables. Los tubos que conducen de las jeringas que contienen lípidos y ARNm están unidos a la unión T, y los tubos que conducen de la jeringa que contiene la disolución amortiguadora del citrato solamente se emparejan con los tubos que salen de la unión T sobre un recipiente de recolección que contiene una barra de agitación en una placa de agitación activa. Las jeringas se colocan en una bomba de jeringa establecida para expulsar el contenido a una tasa de flujo de 1 ml por minuto.
La bomba se activa, y el ARNm recolectado en nanopartículas lipídicas se transfiere al tubo de diálisis SnakeSkin (10.000 MWCO, Thermo Scientific). El material se dializa contra la disolución salina amortiguada fosfato libre de RNasa y de pirógenos 1x durante la noche a 4 °C.
Empaque de ARNip
Las nanopartículas lipídicas (LNP) se formaron mezclando volúmenes iguales de lípidos disueltos en alcohol con ARNip disuelto en una disolución amortiguadora de citrato por un proceso de chorro de impacto. La disolución lipídica contiene un compuesto lipídico catiónico de la invención, un lípido auxiliar (colesterol), un lípido neutro opcional (DSPC) y un lípido encubierto (S010, S024, S027 o S031) a una concentración de 8-16 mg/ml con un objetivo de 12 mg/ml en un alcohol. La relación de ARNip a lípidos totales es de aproximadamente 0,05 (p/p). Cuando una formulación LNP contiene cuatro componentes lipídicos, las proporciones molares de los lípidos oscilan entre 20 y 70 por ciento molar para el lípido catiónico con un objetivo de 40-60, el porcentaje molar de lípido auxiliar oscila entre 20 y 70, con un objetivo de 30 a 50, el porcentaje molar de lípido neutro oscila entre 0 y 30, el porcentaje molar de lípido PEG tiene un rango de 1 a 6 con un objetivo de 2 a 5. La concentración de disolución de ARNip varía de 0,7 a 1,0 mg/mL con un objetivo de 0,8 a 0,9 mg/mL en un citrato de sodio: disolución amortiguadora de cloruro de sodio pH 4-6, con un objetivo de 4,5-5,5. Las LNP se forman mezclando volúmenes iguales de disolución lipídica en etanol con ARNip disuelto en un disolución amortiguadora de citrato mediante un proceso de chorro impactante a través de un dispositivo de mezcla con ID en el rango de 0,25 a 2,0 mm a una tasa de flujo de 10 a 640 mL/min. La disolución mixta de LNP se mantiene a temperatura ambiente durante 0 24 horas antes de un paso de dilución. La disolución se concentra y diafiltra con una disolución amortiguadora adecuada mediante un proceso de ultrafiltración utilizando membranas con un corte de MW de 30 a 500 KD. El producto final se filtra de manera estéril y se almacena a 4 °C.
Medición de la encapsulación del ARNm
El porcentaje de encapsulación de ARNm en nanopartículas lipídicas se determina utilizando el kit de ensayo de ARN Quant-iT Ribogreen (Life Technologies). La suspensión de LNP-ARNm se prueba en disolución amortiguadora (ARNm fuera de la partícula), y disolución amortiguadora más detergente Triton X-100 (ARNm total). La diferencia calculada es el ARNm dentro de la partícula. Preparar 1000 ng/ml de solución madre a partir del ARN proporcionado en el kit y usar esto para generar una curva estándar (0 ng/ml, 15,63-1000 ng/ml) en TE y TE 0,75 % de Triton X-100. Preparar muestras de LNP-ARNm en disolución amortiguadora TE y disolución amortiguadora TE 0,75 % de Triton X-100 con la dilución adecuada para que la lectura esté en el rango de la curva estándar (400-2.000 veces). En una placa de 384 pozos (Costar no tratada #3573), añadir 0,04 ml de estándar (en duplicado) o muestra (en triplicado) por pozo. Diluir el reactivo Ribogreen 240 veces en la disolución amortiguadora TE y añadir 0,06 ml por pozo. Mezclar el contenido de los pozos y medir la fluorescencia (excitación = 480 nm, emisión = 520 nm). Restar los valores de fondo (sin ARN) de los valores de muestra estándar y de prueba, y determinar las concentraciones de ARN en las muestras utilizando las curvas estándar. Determinar el porcentaje de encapsulación de la muestra dividiendo la diferencia de concentraciones entre la muestra Triton y la muestra en disolución amortiguadora sola por la muestra concentración de Triton.
Datos de encapsulación
T l 2: D n l i nin vi rr ARNm
Datos inmunológicos
1. Materiales y métodos
Replicones de ARN
Se utilizan varios replicones a continuación. En general, estos se basan en un replicón quimérico (VEEV) basado en el virus de la encefalitis equina venezolana (VEEV), que es un genoma híbrido de alfavirus con proteínas no estructurales del VEEV, una señal de empaque del virus Sindbis y una UTR 3' del virus Sindbis. Además, se utilizó un replicón basado en el virus vivo atenuado de la vacuna VEE, TC-83. Las replicones son de aproximadamente 10 kb de largo y tienen una cola de poli-A.
Las replicones de alfavirus de codificación de ADN de plásmido (nombrados: vA375 (TC83R-FLFPD.RSVF-run off) or vA803 [VCR(ro)-X179A(TD)_HA]) actuaron como un molde para la síntesis de ARNin vitro.Las replicones contienen los elementos genéticos de alfavirus necesarios para la replicación del ARN, pero carecen de los productos genéticos de codificación necesarios para el ensamblaje de partículas; las proteínas estructurales son reemplazadas por una proteína de interés (por ejemplo, un inmunógeno, como la proteína RSV F de longitud completa) y, por lo tanto, los replicones son incapaces de inducir la generación de partículas infecciosas. Un promotor T7 bacteriófago cadena arriba del ADNc de alfavirus facilita la síntesis del replicón de ARNin vitro.Después de la linealización del ADN del plásmido con una endonucleasa de restricción adecuada, se sintetizaronin vitrotranscripciones de ejecución utilizando la polimerasa ARN dependiente del bacteriófago T7. Las transcripciones se realizaron durante 2 horas a 37 °C en presencia de 7,5 mm de cada uno de los trifosfatos nucleósidos (ATP, CTP, GTP y UTP) siguiendo las instrucciones proporcionadas por el fabricante (Ambion). Después de la transcripción, el ADN de molde fue digerido con TURBO DNasa (Ambion). El replicón de ARN fue precipitado con LiCI y reconstituido en agua libre de nucleasa. El ARN sin caperuza se protegió con caperuza post-transcripcionalmente con enzima de protección con caperuza de vaccinia (VCE) usando el sistema ScriptCap m7G (Epicentre Biotechnologies) como se describe en el manual del usuario; los replicones protegidos con caperuza de esta manera reciben el prefijo “v”, por ejemplo, vA317 es el replicón A317 protegido con caperuza mediante VCE. El ARN posttranscripcionalmente protegido con caperuza se precipitó con LiCI y se reconstituyó en agua libre de nucleasas. La concentración de las muestras de ARN se determinó mediante la medición de OD260nm; la integridad de las transcripcionesin vitrose confirmó mediante la desnaturalización de la electroforesis en gel de agarosa.
Preparación de LNP basadas en DlinDMA
El ARN fue encapsulado en LNP preparadas esencialmente por los métodos divulgados en Jeffs et al. (2005) Pharmaceutical Research 22 (3):362-372 y Maurer et al. (2001) Biophysical Journal, 80: 2310-2326. Las LNP fueron compuestos de 10 % de DSPC (zwitteriónico), 40 % de lípidos catiónicos, 48 % de colesterol y 2 % de DMG conjugado con PEG (PEG 2 kDa). Estas proporciones se refieren al % de moles en la LNP total.
DSPC (1,2-Diastearoil-sn-Glicero-3-fosfocolina) se adquirió de Genzyme. El colesterol se obtuvo de Sigma-Aldrich. El DMG (1,2-dimiristoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-[metoxi(polietilenglicol), sal de amonio) conjugado con PEG, DOTAP (1,2-dioleoil-3-trimetilamonio-propano, sal de cloruro) y DC-col (clorhidrato de 3p-[N-(N',N'-dimetilaminoetan)-carbamoil]colesterol) eran de Avanti Polar Lipids.
Brevemente, los lípidos fueron disueltos en etanol (2ml), una réplica de ARN fue disuelta en disolución amortiguadora (2 ml, citrato de sodio 100 mM, pH 6) y estos fueron mezclados con 2 ml de disolución amortiguadora seguido de 1 hora de equilibrio. La mezcla se dializó durante la noche contra 1x PBS. El producto resultante contenía liposomas, con una eficiencia de encapsulación de -70-95 %.
Para la inmunización en hurones, se preparó una disolución lipídica recién preparada disolviendo 22,5 mg del Ejemplo 1, 5,9 mg de DSPC, 13,9 mg de colesterol y 4,0 mg de DMPE conjugado con PEG2000 (No. de cat: 880150P, Avanti Polar Lipids, Inc.) en 10 ml de etanol. También se preparó una disolución de trabajo de 10 mL de ARN a una concentración de 0,125 mg/ml en una disolución amortiguadora de citrato de 100 mM (pH 6). Las disoluciones de lípidos y ARN de trabajo se calentaron a 37 °C durante 5 minutos antes de ser cargadas en dos jeringas luer-lok de 10 cc. Posteriormente, las dos jeringas se conectaron a un mezclador Tee (unión ID 500 pm PEEK™) usando tubos FEP (etileno-propileno fluorado; todos los tubos FEP utilizados tenían un diámetro interno de 2 mm y un diámetro exterior de 3 mm; obtenidos de Idex Health Science). La salida de la mezcladora en T también fue un tubo FEP por separado, se cargaron 10 mL de disolución amortiguadora de citrato (pH 6) en una tercera jeringa de 10 cc que se conectó a una pieza separada de tubo. Las tres jeringas fueron cargadas en una bomba de jeringa y se accionaron a 1,0 ml/min. Las salidas de tubos se colocaron para recolectar las mezclas en un vial de vidrio de 20 mL que se agitó suavemente utilizando una barra de agitación. Todos los frascos de vidrio se hornearon a 250 °C durante 12 horas antes del experimento para inactivar completamente cualquier contaminante de RNasa. Al final del mezclado, se sacó la barra de agitación y se permitió que la disolución acuosa/etanol se equilibrara a temperatura ambiente durante 1 hora. Después de la incubación, la disolución acuosa/etanol se cargó en una jeringa, y se mezcló con el mismo volumen de 100 mm de disolución amortiguadora de citrato (pH 6) utilizando el proceso de unión Tee antes mencionado. A continuación, las LNP se concentraron a 20 mL y se dializaron contra 10-15 volúmenes de 1X PBS usando filtración de flujo tangencial antes de recuperar el producto final. El sistema TFF y las membranas de filtración de fibra hueca se adquirieron de Spectrum Labs (Rancho Domínguez) y se utilizaron de acuerdo con los lineamientos del fabricante. Se utilizaron membranas de filtración de fibra hueca de polisulfona con un corte de tamaño de poro de 100 kD y una superficie de 8 cm2. Para experimentosin vitroein vivo,las formulaciones se diluyeron a la concentración de ARN requerida con 1X.
PBS.
Eficiencia de encapsulación de replicones de ARN
El porcentaje de ARN encapsulado y la concentración de ARN fueron determinados por el kit de reactivo de ARN Quantit RiboGreen (Invitrogen), siguiendo las instrucciones del fabricante. El estándar de ARN ribosomal proporcionado en el kit fue utilizado para generar una curva estándar. Las LNP se diluyeron 10x o 100x en una disolución amortiguadora TE 1X (del kit) antes de añadir el tinte. Por separado, las LNP se diluyeron 10x o 100x en un disolución amortiguadora TE 1X que contenía 0,5 % de Triton X antes de la adición del tinte (para interrumpir las LNP y así probar el ARN total). Posteriormente, se añadió una cantidad igual de colorante a cada disolución y luego -180 pL de cada disolución después de que la adición de colorante se cargó por duplicado en una placa de cultivo de tejido de 96 pozos. La fluorescencia (Ex 485 nm, Em 528 nm) se leyó en un lector de microplacas. Todas las formulaciones de LNP fueron dosificadasin vivocon base en la cantidad encapsulada de ARN.
. Caracterización de las formulaciones de nanopartículas lipídicas (LNP)
El diámetro Z promedio de partícula y el índice de polidispersidad se muestran en la Tabla 3:
Tabla 3
3. Inmunogenicidad en modelos de ratón (RSV)
La proteína RSV F autoreplicante vA375 se administró a ratones BALB/c, 8 animales por grupo, mediante vacunas intramusculares bilaterales (50 pL por pierna) los días 0 y 21 con el replicón (1 ng) formulado como LNP con los lípidos descritos a continuación. Todas las LNP analizadas estaban compuestas de 40 % de lípidos catiónicos, 10 % de DSPC, 48 % de colesterol y 2 % de PEG-DMG con cantidades similares de ARN. Todas las LNP se prepararon usando la misma técnica. Las formulaciones de LNP fueron preparadas y almacenadas a 4 °C para las inmunizaciones de cebador y refuerzo.
Se recolectó suero para el análisis de anticuerpos los días 14, 36 y 49.
Como se muestra en la Tabla 4, las formulaciones de LNP probadas generaron respuestas inmunes con tan solo 1 ng de ARN auto-replicante, según lo determinado por el aumento de los títulos de IgG específicos de F.
Tabla 4
4. Inmunogenicidad en modelos de hurón (Influenza)
En este estudio se utilizaron un total de siete grupos experimentales con seis animales por grupo (42 animales); dos dosis de vacuna de cada formulación de ARN (Grupos 2-5), dos grupos vacunados con una vacuna de subunidad de influenza H1N1 no adyuvada (subunidad H1N1) o adyuvada (subunidad MF59/H1N1) disponible comercialmente (Grupos 6 y 7) y un grupo vacunado con simulacro (Grupo 1). Las vacunas de prueba de ARN se derivaron de un plásmido de ADN recombinante (ADNp) que llevaba un genoma de alfavirus en el que los genes estructurales fueron reemplazados por el gen HA de la cepa de influenza A H1N1, Cal07. A continuación, el ARN se formuló en emulsión de aceite en agua catiónica (CNE) o LNP para su suministro a las células huésped mediante inyección intramuscular (IM). Las concentraciones de ARN para cada grupo de estudio de formulación fueron de 15 y 45 mcg para CNE, y de 5 y 15 mcg para LNP. Las vacunas de la subunidad H1N1 se utilizaron en una concentración de proteína de la subunidad HA de 15 mcg. Los animales no vacunados fueron vacunados con un control del vehículo para las vacunas de prueba de ARN. Todas las vacunas de prueba fueron administradas por inyección IM en los días de estudio (DE) 0, seguido de una vacuna de refuerzo en el día de estudio 56 (8 semanas después de la primera inmunización).
En la Tabla 5 se resumen los datos de microneutralización de la influenza, y en la Tabla 6 los títulos de inhibición de la hemagultanina (HAI). La formulación de LNP probada generó respuestas inmunes con tan solo 5 pg de ARN autoamplificante, según lo determinado por el aumento de la neutralización específica de HA y los títulos de HAI.
Tabla 5
En la Tabla 6 se resumen los datos de la influenza HAI basados en el modelo de hurón:
Tabla 6
Apéndice: fosfolípidos útiles para formulaciones de LNP

Claims (15)

  1. REIVINDICACIONES 1. Un compuesto, o sal del mismo, de fórmula (I):
    donde RA es -O-R3 y RB es -CH2-O-C(O)-R1; R1 es alquileno C1-6-NR'R", alcoxi C1-6-NR'R", heterociclilo, heterociclilo-alquilo C1-8 o heterociclilo-C1-8-alcoxilo, cada uno de los cuales puede ser opcionalmente sustituido por 1,2 o 3 grupos, seleccionados independientemente de halo, alquilo C1-8 y cicloalquilo C3-7; R' y R", son cada uno, independientemente, hidrógeno o -alquilo C1-8; R2 y R3 son cada uno, independientemente, alquilo C12-22, alquenilo C12-11,
    R4 se selecciona a partir de hidrógeno, halo y alquilo C1-4.
  2. 2. Un compuesto, o sal del mismo, de conformidad con la reivindicación 1, en donde el compuesto es de fórmula (II):
  3. 3. El compuesto, o sal del mismo, de conformidad con la reivindicación 1, en donde Ri se selecciona de:
  4. 4. El compuesto, o sal del mismo, de conformidad con la reivindicación 1, en donde R2 se selecciona de:
    y
  5. 5. El compuesto, o sal del mismo, de conformidad con la reivindicación 1, en donde R3 se selecciona de:
    y
  6. 6. El compuesto, o sal del mismo, de conformidad con la reivindicación 1, en donde el compuesto se selecciona del grupo que consiste en: 2.5- bis((9Z,12Z)-octadeca-9,12-dien-1-iloxi)bencil 4-(dimetilamino)butanoato; ((2-(((4-(dimetilamino)butanoil)oxi)metil)-1,4-fenilen)bis(oxi))bis(octan-8,1-diil) bis(decanoato); ((2-(((3-(dimetilamino)propanoil)oxi)metil)-1,4-fenilen)bis(oxi))bis(octan-8,1-diil) bis(decanoato); ((2-(((1-metilpiperidin-4-carbonil)oxi)metil)-1,4-fenilen)bis(oxi))bis(octan-8,1-diil) bis(decanoato); ((2-((((3-(dimetilamino)propoxi)carbonil)oxi)metil)-1,4-fenilen)bis(oxi))bis(octan-8,1-diil) bis(decanoato); ((2-((((3-(dietilamino)propoxi)carbonil)oxi)metil)-1,4-fenilen)bis(oxi))bis(octan-8,1-diil) bis(decanoato); 3- (dimetilamino)propil 4-metil-2,5-bis((9Z,12Z)-octadeca-9,12-dien-1-iloxi)bencil carbonato; 4- metil-2,5-bis((9Z,12Z)-octadeca-9,12-dien-1-iloxi)bencil 4-(dimetilamino)butanoato; (9Z,9'Z, 12Z, 12'Z)-((2-(((4-(dimetilamino)butanoil)oxi)metil)-1,4-fenilen)bis(oxi))bis(butan-4,1-diil) bis(octadeca-9,12-dienoato); 4-(dimetilamino)butil 4-metil-2,5-bis((9Z,12Z)-octadeca-9,12-dien-1-iloxi)bencil carbonato; ((2-(((1-etilpiperidin-4-carbonil)oxi)metil)-1,4-fenilen)bis(oxi))bis(octan-8,1-diil) bis(decanoato); ((2-(((1-isopropilpiperidin-4-carbonil)oxi)metil)-1,4-fenilen)bis(oxi))bis(octan-8,1-diil) bis(decanoato); ((2-((2-(1-metilpiperidin-4-il)acetoxi)metil)-1,4-fenilen)bis(oxi))bis(octan-8,1 -diil) bis(decanoato); ((2-(((4-(pirrolidin-1-il)butanoil)oxi)metil)-1,4-fenilen)bis(oxi))bis(octan-8,1-diil) bis(decanoato); 2.5- bis((9Z, 12Z)-octadeca-9,12-dien-1-iloxi)bencil 3-(dimetilamino)propil) carbonato; (9Z,9'Z,12Z,12'Z)-((2-(((4-(dimetilamino)butanoil)oxi)metil)-1,4-fenilen)bis(oxi))bis(etan-2,1-diil) bis(octadeca-9,12-dienoato); 2.5- bis((9Z,12Z)-octadeca-9,12-dien-1-iloxi)bencil 3-(dimetilamino)propanoato; 2.5- bis((9Z, 12Z)-octadeca-9,12-dien-1-iloxi)bencil (3-(dietilamino)propil) carbonato; ((2-(((4-(dietilamino)butanoil)oxi)metil)-1,4-fenilen)bis(oxi))bis(pentan-5,1-diil) bis(4,4-bis(octiloxi)butanoato); 8-(4-((5-((4,4-bis(octiloxi)butanoil)oxi)pentil)oxi)-3-(((4-(dimetilamino)butanoil)oxi)metil)fenoxi)octil decanoato; 8-(4-((5-((4,4-bis(octiloxi)butanoil)oxi)pentil)oxi)-2-(((4-(dimetilamino)butanoil)oxi)metil)fenoxi)octil decanoato; ((2-(((4-(dimetilamino)butanoil)oxi)metil)-1,4-fenilen)bis(oxi))bis(propan-3,1-diil) bis(4,4-bis(octiloxi)butanoato); ((2-(((4-(dimetilamino)butanoil)oxi)metil)-1,4-fenilen)bis(oxi))bis(pentan-5,1-diil) bis(4,4-bis(octiloxi)butanoato); ((2-(((1,4-dimetilpiperidin-4-carbonil)oxi)metil)-1,4-fenilen)bis(oxi))bis(pentan-5,1-diil) bis(4,4-bis(octiloxi)butanoato); y ((2-(((4-(Dimetilamino)butanoil)oxi)metil)-1,4-fenilen)bis(oxi))bis(pentan-5,1-diil) bis(4,4-bis(octiloxi)butanoato)
  7. 7. Una composición lipídica que comprende un compuesto de acuerdo con la reivindicación 1, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
  8. 8. La composición lipídica de conformidad con la reivindicación 7, que comprende además un agente biológicamente activo.
  9. 9. La composición lipídica de conformidad con la reivindicación 8, en donde el agente biológicamente activo es un ADN, ARNip o ARNm.
  10. 10. La composición lipídica de conformidad con la reivindicación 9, que comprende además un lípido auxiliar.
  11. 11. La composición lipídica de conformidad con la reivindicación 10, que comprende además un lípido neutro.
  12. 12. La composición lipídica de conformidad con la reivindicación 11, que comprende además un lípido encubierto.
  13. 13. La composición lipídica de conformidad con la reivindicación 12, en donde el lípido auxiliar es el colesterol, el lípido neutro es DSPC, y el lípido encubierto es S010, S024, S027, S031, o S033.
  14. 14. La composición lipídica de conformidad con la reivindicación 7, en donde la composición lipídica está en forma de una nanopartícula lipídica.
  15. 15. La composición lipídica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 7 a 14 para su uso en medicina.
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