JP2005533862A - 調節されたアプタマー治療剤 - Google Patents

Abstract

糖尿病および他の疾患の処置のための物質およびその使用方法が提示される。糖尿病疾患の構成要素に特異性を有する、調節されたアプタマー治療剤組成物を含む治療用組成物が、これらの治療用組成物の投与方法と共に提示される。１つの実施形態において、本発明は、第２のリガンドを認識する第２の結合ドメインに結合された第１のリガンドを認識する第１の結合ドメインを含むアプタマーを提供し、この第２の結合ドメインによる第２のリガンドの結合は、第１の結合ドメインによる第１のリガンドの結合により調節される。１つの局面において、上記第１のリガンド結合ドメインは、アロステリックエフェクター分子と特異的に相互作用し、上記第２のリガンド結合ドメインは、このアロステリックエフェクター分子の薬物標的と特異的に相互作用する。

Description

（発明の分野）
本発明は、一般に、核酸の分野に関し、より具体的には、本発明の調節されたアプタマー組成物を使用して疾患を処置するための組成物および方法に関する。

（発明の背景）
アプタマーは、古典的なＷａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ塩基対形成以外の相互作用を介して、分子に対する特異的な結合親和性を有する核酸分子である。

アプタマーは、ファージディスプレイにより作製されたペプチドまたはモノクローナル抗体（ＭＡｂ）と同様に、選択された標的に特異的に結合し得、結合を介して、その標的の機能する能力をブロックする。ランダム配列オリゴヌクレオチドのプールから、インビトロ選択プロセス（図１）により作製されたアプタマーは、１００を超えるタンパク質（増殖因子、転写因子、酵素、免疫グロブリンおよびレセプターが挙げられる）について作製されている。代表的なアプタマーは、１０〜１５ｋＤのサイズ（３０〜４５ヌクレオチド）であり、ナノモル濃度未満の親和性でその標的に結合し、密接に関連する標的に対して識別する（例えば、代表的には、同じ遺伝子ファミリー由来の他のタンパク質には結合しない）。一連の構造研究は、アプタマーが、抗体抗原複合体において、親和性および特異性を駆動する、同じ型の結合相互作用（水素結合、静電相補性、疎水性接触、立体障害など）を使用することが可能である。

アプタマーは、治療剤としての使用のために所望の多数の特徴を有し、これらとしては、高い特異性および親和性、生物学的効力および優れた薬物動態学的特性が挙げられる。さらに、これらは、例えば、抗体および他のタンパク質の生物学にわたって、特異的な競合上の優位性を提供する。

１）速度および制御。アプタマーは、全体的にインビトロプロセスによって生成される。インビトロ選択は、アプタマーの特異性および親和性を厳密に制御させ、かつ、毒性標的および非免疫原性標的の両方に対する手がかりの生成を可能にする。

２）毒性および免疫原性。分類としてアプタマーは、毒性または免疫原性をほとんど示さないか、または全く示さない。高いレベルのアプタマーでのラットまたはマーモットの慢性投薬（毎日１０ｍｇ／ｋｇを９０日間）において、任意の臨床的測定、細胞測定または生化学的測定によって毒性が観察されない。多くのモノクローナル抗体の効率は、抗体自体に対する免疫応答によりかなり制限され得るが、抗体をアプタマーに対して誘発することが非常に困難である（これは、おそらくアプタマーがＭＨＣを介してＴ細胞により提示され得ないから、および、免疫応答が一般に、核酸フラグメントを認識しないように慣らされているからである）。

３）投与。全ての現在認可された抗体治療は、静脈内注入（代表的には２〜４時間にわたる）により投与されるが、アプタマーは、皮下注射により投与され得る。この差は、主に、比較的低い溶解度に起因し、従って、多い量が、たいていの治療用ＭＡｂのために必須となる。良好な溶解度（＞１５０ｍｇ／ｍｌ）および比較的低い分子量（アプタマー：１０〜５０ｋＤ；抗体：１５０ｋＤ）を有するので、アプタマーの毎週の用量は、０．５ｍｌ未満の容量で注射により送達され得る。皮下投与を介するアプタマーのバイオアベイラビリティは、サルの研究において＞８０％である（Ｔｕｃｋｅｒ，１９９９）。

４）拡張性およびコスト。アプタマーは、化学合成され、結果として、製品需要を満たすように、必要に応じて容易に拡張され得る。拡張生産における問題は、いくつかの生物製剤（例えば、Ｅｂｒｅｌ、Ｒｅｍｉｃａｄｅ）のアベイラビリティを現在制限していることであり、大規模タンパク質生成プラントの資本コストは巨額（例えば、＄５００ ＭＭ、Ｉｍｍｕｎｅｘ）であり、単一の大規模合成装置は、上向きで年間１００ｋｇのオリゴヌクレオチドを生成し得、比較的ささやかな初期投資（例えば、＜＄１０ ＭＭ，Ａｖｅｃｉａ）を必要とする。ｋｇ規模のアプタマー合成についての、現在の製造原価は、＄５００／ｇと見積もられ、非常に最適化された抗体についての製造原価に匹敵する。プロセス開発における持続的な改善により、５年のうちに、＜１００＄／ｇまで製造原価を低下させることが期待される。

５）安定性。アプタマーは、化学的に頑強である。アプタマーは本質的に、熱、変性剤などへの曝露後に、活性を回復するように、適合されており、凍結乾燥粉末として、室温で長期間（１年以上）保存され得る。対照的に、抗体は、冷蔵保存されなければならない。

（糖尿病の治療剤）
糖尿病は、血流中のグルコースの異常な調節に関する疾患である。インシュリンレセプター（ＩＲ）は、表面レセプターであり、ジスルフィド結合により連結された２つのα鎖と２つの膜貫通β鎖の四量体である。インシュリンにより活性化されるインシュリンレセプターは、チロシンキナーゼレセプターである。その活性化は、グルコースの貯蔵の増加をもたらし、循環への肝臓グルコース放出の付随する減少を伴う。インシュリンレセプターは、そのチロシン残基上のタンパク質をリン酸化することによって、細胞応答を誘導する。ＩＲは、細胞質においていくつかのタンパク質をリン酸化することが知られており、これらとしては、インシュリンレセプター基質（ＩＲＳ）およびＳｈｃが挙げられる。ホスファチジルイノシトール３−キナーゼ（ＰＫＩ３）は、ＩＲＳを結合することによって活性化され、ＩＲをカップリングしてグルコースを取込むのに重要な１つのシグナル伝達系分子である。ＰＫＩ３は、ＩＲによってグルコース取込みを媒介し、そして、ＰＩ（３，４）Ｐ_２およびＰＩ（３，４，５）Ｐ_３を作製することによって、種々の他の細胞性応答を媒介する。次いで、ＰＩ（３，４）Ｐ_２およびＰＩ（３，４，５）Ｐ_３は、二次メッセンジャーとして直接機能して、シグナル伝達系分子中のプレクストリン（ｐｌｅｃｋｓｔｒｉｎ）ホモロジー（ＰＨ）ドメインを結合することによって、下流のこれらのシグナル伝達分子を活性化する。

インシュリンの主要な機能は、多数の高血糖生成ホルモンの協調した作用に対抗し、低い血中グルコースレベルを維持することである。複数の高血糖ホルモンが存在するので、インシュリンに関連する望ましくない障害は、一般に重篤な高血糖になり、寿命が短くなる。インシュリンは、ランゲルハンス島のβ細胞においてプレプロホルモンとして合成される。そのシグナルペプチドは、小胞体の槽で取り除かれ、ゴルジ体において分泌小胞にパッケージ化され、そのネイティブな構造に折りたたまれ、２つのジスルフィド結合の形成により、この立体配置に固定される。特異的なプロテアーゼ活性が、分子の中心を３つに切断し、アミノ末端Ｂペプチドをカルボキシ末端Ａペプチドにジスルフィド結合されたままにして、Ｃペプチドとして解離する。β細胞からのインシュリン分泌は、主に、血漿中グルコースレベルによって調節されるが、グルコースのシグナルが伝達される正確な気候は不明瞭なままである。１つの可能性は、膵臓β細胞によるグルコースの取込みの増加が、代謝において付随する増加をもたらすというものである。代謝の増加は、ＡＴＰ／ＡＤＰ比の上昇をもたらす。このことは、次いで、ＡＴＰ感受性Ｋ^＋チャネルの阻害をもたらす。最終的な結果は、Ｃａ^２＋流入およびインシュリン分泌をもたらす細胞の脱重合である。複数の他のホルモン（成長ホルモン、胎盤ラクトゲンおよびプロゲスチンが挙げられる）の慢性的な増加は、おそらくは、プレプロインシュリンｍＲＮＡおよび増加したプレプロホルモンのプロセシングに関与する酵素の増加によるインシュリン分泌をアップレギュレートする。対照的に、エピネフリンは、ｃＡＭＰ共役調節経路によりインシュリン分泌を消失する。さらに、エピネフリンは、肝臓および末梢組織においてインシュリンの作用に対抗し、ここで、エピネフリンは、グルカゴンの作用と同じように、βアドレナリン作動性レセプターに結合し、アデニル酸回路活性を誘導し、ｃＡＭＰを増加させ、そして、ＰＫＡを活性化する。後者の現象は、グリコーゲン分解および糖新生を誘導し、この両者が、高血糖性であり、従って、血中グルコースレベルに対するインシュリンの作用に対抗する。さらに、エピネフリンは、αアドレナリン作動性レセプターとの相互作用を介して、グルコースの恒常性に影響を与える。膵臓により分泌されるインシュリンは、肝臓への門脈を介して直接注入され、肝臓で、インシュリンは、顕著な代謝効果を発揮する。これらの効果は、細胞表面レセプターのクラスに属するインシュリンレセプターの活性化の応答であり、内因性のチロシンキナーゼ活性を示す。肝臓のグルコース恒常性に関して、インシュリンレセプター活性化の効果は、グルコースの貯蔵の増加をもたらす、特異的なリン酸化事象であり、循環への肝臓グルコース放出の付随する減少を伴う。

多くの他の組織において、インシュリンは、原形質膜グルコーストランスポーターの数を減少させるが、肝臓において、グルコースの取込みは、酵素グルコキナーゼ、ホスホフルクトキナーゼ−１（ＰＦＫ−１）およびピルビン酸キナーゼ（ＰＫ）（解糖の重要な調節酵素）の増加した活性に起因して、劇的に増加する。後者の効果は、ホスホジエステラーゼのインシュリン依存性の活性化によって誘導され、ＰＫＡ活性の減少ならびに、ピルビン酸キナーゼおよびホスホフルクトキナーゼ−２（ＰＦＫ−２）のリン酸化の消失を伴う。ピルビン酸キナーゼの脱リン酸化は、その活性を増加する一方で、ＰＦＫ−２の脱リン酸化は、これをキナーゼとして活性にする。ＰＦＫ−２のキナーゼ活性は、フルクトースホスファターゼをフルクトース−２，６−ビスホスファターゼ（Ｆ２，６ＢＰ）に変換する。Ｆ２，６ＢＰは、解糖の速度制限酵素であるＰＦＫ−１の強力なアロステリックアクチベーターであり、かつ、糖新生酵素のインヒビターであるフルクトース−１，６−ビスホスファターゼである。さらに、解糖酵素のリン酸化形態に特異的なホスファターゼは、インシュリンの影響下で活性を増加させる。全てのこれらの現象は、解糖酵素のその活性化形態への変換を生じ、結果として、解糖がかなり増加する。さらに、グルコースホスファターゼ活性は、ダウンレギュレートされる。最終的な効果は、肝細胞のグルコースおよびそのリン酸化誘導体の含量の増加であり、血中グルコースの消失を伴う。後者の現象に加えて、ｃＡＭＰの消失およびホスファターゼ活性の上昇が、グリコーゲンホスファターゼのその不活性化形態への変換およびグリコーゲンシンターゼのその活性化形態への変換と合わせられ、その結果、グルコースが解糖生成物へと送られるだけでなく、グリコーゲン含量もまた増加する。

インシュリン治療は、１型糖尿病患者のための唯一の処置である。時折、２型糖尿病患者もまたインシュリンで処置される。２型糖尿病患者は、通常、標的血中グルコース値を達成するために、より多い用量のインシュリンを必要とする。現在、２つのインシュリン送達方法が米国において利用可能である；複数回の毎日のインシュリン注射およびインシュリンポンプ。鼻腔インシュリン療法が、現在臨床治験を受けており、一般的な使用については、ＦＤＡによってまだ認可されていない。今日米国において販売されている全てのインシュリンは、Ｕ−１００力価（流体１ｃｃあたり１００単位のインシュリン）である。他国では、他の希釈物が存在する。投薬は、少なくとも食事と共に１日３回である。

インシュリンは、原形質膜レセプターに結合することによって、その細胞内効果を生じる。これは、全ての細胞において同じである。このレセプターは、ジスルフィド結合された糖タンパク質である。インシュリンの１つの機能（シグナル伝達におけるその役割は除く）は、原形質膜におけるグルコース輸送分子の数を増やすことによって、肝外組織中のグルコース輸送を増やすことである。グルコーストランスポーターは、代謝回転の連続状態にある。トランスポーターの原形質膜含量における増加は、新しいトランスポーターの原形質膜への補充速度の増加から生じ、細胞質に局在化する予備成形されたトランスポーターの特別なプールに由来する。グルコース代謝の調節におけるその役割に加えて、インシュリンは、脂質生合成を刺激し、脂肪分解を減少し、細胞内へのアミノ酸輸送を増加させる。インシュリンはまた、転写を調節し、多数のｍＲＮＡの細胞含量を変更する。インシュリンは、増殖、ＤＮＡ合成および細胞複製を刺激し、これらはＩＧＦおよびリラクシンと共通する効果である。

インシュリン送達の最も一般的な方法は、皮下注射である。別の方法は、インシュリンポンプである。インシュリンポンプの最大の利点は、食事のタイミングのより大きい柔軟性であり、患者は、インシュリン注射療法の場合のよいに、特定の時間に食べる必要はない。食事は、低血糖の恐れを伴うことなく抜かすことができる。インシュリンポンプ送達の不都合は、針の部位における皮膚感染の危険性であり、インシュリン送達は、重篤な高血糖（高い血中グルコース）およびさらに糖尿病性ケトアシドーシス（生命を脅かす状態）を生じ得る、機構的問題と、表面的な問題に起因して中断され得る。

１型糖尿病を処置するためのインシュリン治療の利点にも関わらず、インシュリン治療剤の有効血漿レベルの調節に関する問題が存在する。それゆえ、インビボで、インシュリン治療剤を効率的に調節する治療剤の必要性が存在する。

（発明の要旨）
本発明は、例えば、特定の疾患を処置するために使用され得る、調節されたアプタマーを提供する。より具体的には、本発明は、アプタマーを提供し、このアプタマーの第２のリガンドへの結合は、第１のリガンド（またはエフェクター）への結合によって調節（すなわち、活性化または抑制）される。

１つの実施形態において、本発明は、治療用アプタマーを提供し、その結合活性は、例えば、疾患マーカーとして機能する第１のリガンドにより制御される。第１のリガンドは、治療用アプタマーの結合活性を活性化する。

１つの実施形態において、本発明は、治療用アプタマーを提供し、その結合活性は、例えば、疾患マーカーとして機能する第１のリガンドにより制御される。第１のリガンドは、治療用アプタマーの結合活性を抑制する。

１つの実施形態において、本発明は、グルコースに結合した後にだけインシュリンレセプターに結合する（従って、細胞によるグルコース取込みを開始する）治療用アプタマーを提供する。

（発明の詳細な説明）
（定義）
本明細書中で定義される場合、アプタマーは、非Ｗａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ塩基対形成による、所望の標的化合物または分子または核酸標的に対して特異的な結合特性を有する、核酸リガンドである。

本明細書中で定義される場合、調節されたアプタマーは、その結合活性（または生物学的活性）が、例えば、疾患マーカーとして機能するエフェクターリガンドによって、アロステリックに制御されるアプタマーである。エフェクターリガンドは、アプタマーの結合活性（または生物学的活性）を活性化または抑制し得る。

本明細書中で定義される場合、アゴニスト−アプタマーは、標的に結合した場合に、標的の活性を活性化するアプタマーである。

本明細書中で定義される場合、アンタゴニスト−アプタマーは、標的に結合した場合に、標的の活性を不活性化するアプタマーである。

目的の標的に対するアプタマーを作製するための適切な方法は、図１に示される、「Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ Ｌｉｇａｎｄｓ ｂｙ ＥＸｐｏｎｅｎｔｉａｌ Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ」（「ＳＥＬＥＸ^ＴＭ」）との表題のプロセスを用いることである。ＳＥＬＥＸ^ＴＭプロセスは、標的分子に対する高度に特異的な結合を有する核酸分子のインビトロ進化のための方法であり、例えば、米国特許出願番号０７／５３６，４２８（１９９０年６月１１日出願、現在は放棄されている）、米国特許第５，４７５，０９６号（発明の名称「Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｌｉｇａｎｄｓ」）および米国特許第５，２７０，１６３号（また、ＷＯ９１／１９８１３も参照のこと）（発明の名称「Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｌｉｇａｎｄｓ」）に記載されている。各ＳＥＬＥＸ^ＴＭが同定した核酸リガンドは、所定の標的化合物または分子の特異的リガンドである。ＳＥＬＥＸ^ＴＭプロセスは、核酸が、種々の二次元構造および三次元構造を形成するために十分な能力を有し、単量体であっても、多量体であっても、実質的にいかなる化合物とも（特異的な結合対を形成する）リガンドとして機能するために、その単量体内に利用可能な十分な化学的汎用性を有するという独特な見識に基づく。任意のサイズまたは組成の分子が、標的として機能し得る。高親和性結合の用途に適用されるＳＥＬＥＸ^ＴＭ方法は、候補オリゴヌクレオチドの混合物からの選択と、同じ一般的な選択スキームを使用する、結合、群分離および増幅の段階的な相互作用を含み、結合親和性および選択性の実質的にいかなる所望の基準も達成する。好ましくは、ランダム化配列のセグメントを含む核酸の混合物から出発して、ＳＥＬＥＸ^ＴＭ方法は、結合に好ましい条件下で混合物を標的と接触させる工程、標的分子に特異的に結合する核酸分子から結合していないの核酸分子を群分離する工程、核酸−標的複合体を解離する工程、核酸−標的複合体から解離された核酸を増幅して、核酸のリガンド富化混合物を得る工程、次いで、標的分子に対する特異的な高親和性核酸リガンドを得るのに所望される程度のサイクル数を介して、結合、群分離、解離および増幅の工程を繰り返す工程を包含する。

指数関数的な富化によるリガンドの体系的な進化、「ＳＥＬＥＸ^ＴＭ」は、例えば、米国特許第５，４７５，０９６号および同第５，２７０，１６３号ならびにＰＣＴ／ＵＳ９１／０４０７８（これらの各々は、本明細書中に参考として具体的に援用される）に記載されるように、任意の所望の標的のための核酸リガンドを作製するための方法である。

ＳＥＬＥＸ^ＴＭ技術は、核酸が、種々の二次元構造および三次元構造を形成するために十分な能力を有し、そして、サイズが大きくても小さくても、実質的にいかなる化合物ともリガンドとして機能（すなわち、特異的結合対を形成する）ように、その単量体内に、利用可能な十分な化学的汎用性を有するという事実に基づく。

この方法は、候補の混合物からの選択と、同じ一般的な選択スキームを使用して、構造的改善の段階的な相互作用を含み、結合親和性および選択性の実質的にいかなる所望の基準を達成する。好ましくは、ランダム化された配列のセグメントを含む、核酸の混合物から出発し、ＳＥＬＥＸ^ＴＭ方法は、結合に好ましい条件下で、混合物を標的に接触させる工程、標的分子に結合した核酸分子から結合していない核酸を群分離する工程、核酸−標的対を解離する工程、核酸−標的ついから解離された核酸を増幅して、核酸のリガンド富化混合物を得る工程、次いで、所望するだけのサイクルを介して、結合、群分離、解離および増幅の工程を繰り返す工程を包含する。

多数の可能性のある配列および構造を含む核酸混合物内において、所定の標的に対して、広範囲の結合親和性が存在する。例えば、２０ヌクレオチドのランダム化セグメントを含む核酸混合物は、４^２０の候補の可能性を有し得る。標的に対する高親和性定数を有するものは、標的に結合する可能性が最も高い。群分離、解離および増幅の後、第２の核酸混合物を作製し、より高い結合親和性の候補について富化する。選択の追加のラウンドは、得られる核酸混合物が主に１つのみまたは２〜３の配列から構成されるようになるまで、最適なリガンドを漸次的に追い求める。次いで、これらがクローニングされ、配列決定され、そして、純粋なリガンドとして、結合親和性について個々に試験され得る。

選択および増幅のサイクルは、所望の目標が達成されるまで繰り返される。多くの一般的な場合において、選択／増幅は、サイクルの反復において結合強度に有意な改善が達成されなくなるまで継続される。この方法は、約１０^１８個程度の核酸種のサンプルに対して使用され得る。試験混合物の核酸は、好ましくは、ランダム化された配列位置ならびに十分な増幅のために必須の保存された配列を含む。核酸配列改変体は、多数の方法（ランダム化された核酸配列の合成およびランダムに切断された細胞核酸のサイズ選択を含む）で産生され得る。利用可能な配列部分は、完全または部分的にランダムな配列を含み得；この配列部分はまた、ランダム化された配列を組み込まれた保存的配列の一部分を含み得る。試験核酸における配列改変は、選択／増幅相互作用の前またはその間に、変異誘発によって導入または増加され得る。

ＳＥＬＥＸ^ＴＭの１つの実施形態において、選択プロセスは、選択された標的に最も強力に結合するこれらの核酸リガンドを単離する際に非常に効率的であるので、１サイクルのみの選択および増幅を必要とする。このような効率的な選択は、例えば、クロマトグラフ型のプロセス（核酸の標的に会合する能力が、カラムが最も高親和性の核酸リガンドの分離および単離を十分に可能にする様式で、カラムの操作と結び付けられる）において生じ得る。

多くの場合において、単一の核酸リガンドが同定されるまで、反復性のＳＥＬＥＸ^ＴＭ工程を実施することは必ずしも望ましくない。標的特異的な核酸リガンド溶液は、多数の保存的配列と、核酸リガンドの標的への親和性に有意に影響を及ぼすことなく置換または追加され得る多数の配列とを有する、核酸構造または核酸モチーフのファミリーを含み得る。完了する前にＳＥＬＥＸ^ＴＭプロセスを終了させることによって、核酸リガンド溶液ファミリーの多数のメンバーの配列を決定することが可能である。

種々の核酸の一次構造、二次構造および三次構造が存在することが知られている。非Ｗａｔｏｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ型の相互作用に関与することが最も一般的に示されている構造またはモチーフは、ヘアピンループ、対称および非対称の隆起であり、偽性ノットおよびこれらの無数の組み合わせであると言われている。このようなモチーフのほとんど全ての公知の場合は、たった３０ヌクレオチドの核酸配列で形成され得ることが示唆される。この理由から、隣接するランダム化セグメントを用いるＳＥＬＥＸ手順が、約２０〜５０の間のヌクレオチドのランダム化セグメントを含む核酸配列を用いて開始されることが、しばしば好ましい。

基本的なＳＥＬＥＸ^ＴＭ方法は、多数の特異的な目的を達成するために改変されている。例えば、米国特許第５，７０７，７９６号は、特異的な構造特性（例えば、湾曲したＤＮＡ）を有する核酸分子を選択するためのゲル電気泳動と組み合わせたＳＥＬＥＸ^ＴＭの使用を記載する。米国特許第５，７６３，１７７号は、標的分子に結合し、そして／または光架橋し、そして／または光不活性化し得る光反応性基を含有する核酸リガンドを選択するためのＳＥＬＥＸ^ＴＭベースの方法を記載する。米国特許第５，５６７，５８８号および米国特許出願番号０８／７９２，０７５（１９９７年１月３１日出願、発明の名称「Ｆｌｏｗ Ｃｅｌｌ ＳＥＬＥＸ」）は、標的分子に対して高い親和性を持つオリゴヌクレオチドと低い親和性を持つオリゴヌクレオチドとを非常に効率的に分割することを達成する、ＳＥＬＥＸ^ＴＭベースの方法を記載する。米国特許第５，４９６，９３８号は、ＳＥＬＥＸ^ＴＭプロセスが実施された後に、改善された核酸リガンドを得るための方法を記載する。米国特許第５，７０５，３３７号は、その標的に対するリガンドの共有結合のための方法を記載する。これらの特許および出願の各々は、本明細書中に参考として具体的に援用される。

ＳＥＬＥＸ^ＴＭはまた、標的分子上の１つ以上の部位に結合する核酸リガンドを得るために、そして、標的上の特異的な部位に結合する非核酸種を含む核酸リガンドを得るために使用され得る。ＳＥＬＥＸ^ＴＭは、任意の想定され得る標的（タンパク質（核酸結合タンパク質、そして、その生物学的機能の部分として核酸に結合することが知られていないタンパク質の両方を含む）補因子を含む高分子および低分子ならびに他の低分子が挙げられる）に結合する核酸リガンドを単離および同定するための手段を提供する。ＳＥＬＥＸ^ＴＭによって同定された、カフェインおよびその密接に関連するアナログであるテオフィリンに対して高い親和性で結合し得る核酸配列の議論については、米国特許第５，５８０，７３７を参照のこと。

カウンター−ＳＥＬＥＸ^ＴＭは、１つ以上の非標的分子への交差反応性を有する核酸リガンド配列を排除することによって、標的分子に対する核酸リガンドの特異性を改善するための方法である。カウンター−ＳＥＬＥＸ^ＴＭは、以下の工程から構成される：ａ）核酸の候補混合物を調製する工程；ｂ）候補混合物を標的に接触させ、候補混合物と比較して、標的に対して増加した親和性を有する核酸が、候補混合物の残りから分離され得る、工程；ｃ）候補混合物の残りから増加した親和性の核酸を分離する工程；ｄ）増加した親和性の核酸を１つ以上の非標的分子と接触させ、その結果、非標的核酸分子に対して特異的な親和性を有する核酸リガンドが除去される、工程；ならびにｅ）標的分子に対して特異的な親和性を有する核酸を増幅して、標的分子に結合するために、比較的高い親和性と特異性とを有する核酸配列を富化された核酸の混合物を得る工程。

例えば、ランダム化配列を含むオリゴヌクレオチド分子の異種集団が作製および選択されて、標的分子に対して選択的な結合親和性を有する核酸分子を同定する（米国特許第５，４７５，０９６号；同第５，４７６，７６６号；および同第５，４９６，９３８号）（これらの各々は、本明細書中に参考として援用される）。いくつかの例において、１００％のランダムオリゴヌクレオチドの集団がスクリーニングされる。他の例において、この集団の各オリゴヌクレオチドは、ランダム配列と、その５’末端および／または３’末端に少なくとも１つの固定された配列とを含む。オリゴヌクレオチドは、ＲＮＡ、ＤＮＡまたは混合ＲＮＡ／ＤＮＡであり得、また、改変されたか、もしくは、非天然のヌクレオチドもしくはヌクレオチドアナログを含み得る（米国特許第５，９５８，６９１号；同第５，６６０，９８５号；同第５，９５８，６９１号；同第５，６９８，６８７号；同第５，８１７，６３５号；および同第５，６７２，６９５号、ＰＣＴ公報ＷＯ ９２／０７０６５）。

オリゴヌクレオチドのランダム配列部分は、オリゴヌクレオチド集団の全ての分子により共有される配列を含む、少なくとも１つの固定された配列が隣接する。固定された配列としては、ＰＣＲプライマーのためのハイブリダイゼーション部位、ＲＮＡポリメラーゼのためのプロモーター配列（例えば、Ｔ３、Ｔ４、Ｔ７、ＳＰ６など）、制限部位、またはホモ重合体配列（例えば、ポリＡまたはポリＴ路）、触媒的コア（以下にさらに記載される）、親和性カラムに対して選択的に結合するための部位、ならびに、目的のオリゴヌクレオチドのクローニングおよび／または配列決定を促進するための他の配列のような配列が挙げられる。

１つの実施形態において、オリゴヌクレオチドのランダム配列部分は、約１５〜７０（例えば約３０〜４０）ヌクレオチド長であり、リボヌクレオチドおよび／またはデオキシリボヌクレオチドを含み得る。ランダムオリゴヌクレオチドは、当該分野で周知の固層オリゴヌクレオチド合成技術を使用して、ホスホジエステル結合したヌクレオチドから合成され得る（Ｆｒｏｅｈｌｅｒら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１４：５３９９−５４６７（１９８６）；Ｆｒｏｅｈｌｅｒら、Ｔｅｔ．Ｌｅｔｔ．２７：５５７５−５５７８ １２（１９８６））。オリゴヌクレオチドはまた、溶液相法（例えば、トリエステル合成法（Ｓｏｏｄら，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．４：２５５７（１９７７）；Ｈｉｒｏｓｅら，Ｔｅｔ．Ｌｅｔｔ．，２８：２４４９（１９７８）））を使用して合成され得る。自動化ＤＮＡ合成装置上で実施される代表的な合成により、１０^１５〜１０^１７の分子を得る。配列設計におけるランダム配列の十分に広い領域が、合成された分子の各々が、独特の配列を表す可能性があるという可能性を増加する。

ランダム化された配列を合成するために、４つ全てのヌクレオチドの混合物が、合成プロセスの間に各ヌクレオチド添加工程において添加され、ヌクレオチドのランダムな組み込みを可能にする。１つの実施形態において、ランダムオリゴヌクレオチドは、完全にランダムな配列を含むが、他の実施形態において、ランダムオリゴヌクレオチドは、非ランダムまたは部分的にランダムな配列のストレッチを含み得る。部分的にランダムな配列は、各添加工程において、４つのヌクレオチドを異なるモル比で添加することによって作製され得る。

ＳＥＬＥＸ方法は、リガンド上に改善された特性（例えば、改善されたインビボ安定性または改善された送達特性）を付与する修飾ヌクレオチドを含有する高親和性核酸リガンドの同定を包含する。このような修飾の例としては、リボースおよび／またはリン酸および／または塩基部分での化学的置換が挙げられる。ＳＥＬＥＸで同定された、修飾ヌクレオチドを含有する核酸リガンドは、米国特許第５，６６０，９８５号に記載されており、この特許は、ピリミジンの５’および２’位置において化学的に修飾されたヌクレオチド誘導体を含有するオリゴヌクレオチドを記載する。米国特許第５，７５６，７０３号は、種々の２’修飾ピリミジンを含有するオリゴヌクレオチドを記載する。米国特許第５，５８０，７３７号は、２’−アミノ（２’−ＮＨ_２）、２’−フルオロ（２’−Ｆ）、および／または２’−Ｏ−メチル（２’−ＯＭｅ）置換基で修飾された１つ以上のヌクレオチドを含有する高特異性核酸リガンドを記載する。

ＳＥＬＥＸ方法は、米国特許第５，６３７，４５９号および米国特許第５，６８３，８６７号に記載されるように、選択されたオリゴヌクレオチドを他の選択されたオリゴヌクレオチドおよび非オリゴヌクレオチドの機能単位と合わせる工程を包含する。ＳＥＬＥＸ方法はさらに、米国特許第６，０１１，０２０号に記載されるように、選択された核酸リガンドを、診断用または治療用複合体中の親油性または非免疫原性の高分子量化合物と合わせる工程を包含する。診断用または治療用複合物中の親油性化合物と結合されるＶＥＧＦ核酸リガンド（例えば、ジアシルグリセロールまたはジアルキルグリコール）が、米国特許第５，８５９，２２８号に記載される。

親油性化合物（例えば、グリセロール脂質）または非免疫原性高分子量化合物（例えば、ポリアルキレングリコール）と結合されるＶＥＧＦ核酸リガンドは、米国特許第６，０５１，６９８号にさらに記載される。非免疫原性の高分子量化合物または親油性化合物と結合されるＶＥＧＦ核酸リガンドはさらに、ＰＣＴ公開番号ＷＯ ９８／１８４８０に記載される。これらの特許および特許出願は、形状および他の特性のアレイの広範な組み合わせ、ならびに、他の分子の所望の特性を有するオリゴヌクレオチドの効率的な増幅および複製特性を可能にする。上記の参考文献の各々（これらは、基本的なＳＥＬＥＸ手順の改変を記載する）は、その全体が参考として具体的に援用される。

ＳＥＬＥＸ方法による、小さな可撓性特性に対する核酸リガンドの同定が探索されている。低分子ペプチドは、可撓性構造を有し、通常は、多数の配座異性体が平衡した状態で溶液中に存在し、従って、最初は、結合親和性が可撓性ペプチドを結合する際に失われるその立体構造エントロピーによって制限され得ると考えられた。しかし、溶液中の低分子ペプチドに対する核酸リガンドの同定の可能性が、米国特許第５，６４８，２１４号に示された。この特許において、サブスタンスＰに対する高親和性ＲＮＡ核酸リガンド（１１アミノ酸ペプチド）が同定された。この参考文献は、その全体が参考として具体的に援用される。

ヌクレアーゼおよび加水分解に対して抵抗性であるオリゴヌクレオチド集団を作製するために、修飾オリゴヌクレオチドが使用され得、これらとしては、１つ以上の置換ヌクレオチド間結合、改変糖、改変塩基、またはこれらの組み合わせが挙げられ得る。１つの実施形態において、Ｐ（Ｏ）Ｏ基がＰ（Ｏ）Ｓ（「チオエート」）、Ｐ（Ｓ）Ｓ（「ジチオエート」）、Ｐ（Ｏ）ＮＲ_２（「アミデート」）、Ｐ（Ｏ）Ｒ、Ｐ（Ｏ）ＯＲ’、ＣＯもしくはＣＨ_２（「ホルムアセタール」）、または３’−アミン（ＮＨ−ＣＨ_２−ＣＨ_２−）により置換されたオリゴヌクレオチドが提供され、各ＲまたはＲ’は独立してＨまたは置換もしくは非置換アルキルである。結合基は、−Ｎ−結合または−Ｓ−結合を介して近接するヌクレオチドに結合され得る。オリゴヌクレオチド中の全ての結合が同一である必要はない。

さらなる実施形態において、オリゴヌクレオチドは、修飾糖基を含み、例えば、１つ以上のヒドロキシル基が、ハロゲン、脂肪族基で置換されるか、または、エステルもしくはアミンとして官能化される。１つの実施形態において、フラノース残基の２’位が、Ｏ−メチル、Ｏ−アルキル、Ｏ−アリル、Ｓ−アルキル、Ｓ−アリルまたはハロ基のいずれかにより置換される。２’−修飾糖の合成方法は、Ｓｐｒｏａｔら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１９：７３３−７３８（１９９１）；Ｃｏｔｔｏｎら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１９：２６２９−２６３５（１９９１）；およびＨｏｂｂｓら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １２：５１３８−５１４５（１９７３）に記載される。２−フルオロ−リボヌクレオチドオリゴマー分子の使用は、置換されていないリボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドを使用して作製されたものよりも１０倍〜１００倍、標的分子についての核酸センサー分子の感受性を増加させ得（Ｐａｇｒａｔｉｓら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１５：６８−７３（１９９７））、標的分子とのさらなる結合相互作用を提供し、かつ、核酸センサー分子の二次構造の安定性を増加する（Ｋｒａｕｓら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １６０：５２０９−５２１２（１９９８）；Ｐｉｅｋｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５３：３１４−３１７（１９９１）；Ｌｉｎら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２２：５５２９−５２３４（１９９４）；Ｊｅｌｌｉｎｅｋら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３４：１１３６３−１１３７２（１９９５）；Ｐａｇｒａｔｉｓら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １５：６８−７３（１９９７））。

核酸アプタマー分子は一般に、５〜２０サイクルの手順で選択される。１つの実施形態において、異質性は、最初の選択段階においてのみ導入され、複製手順の間では生じない。

ＤＮＡ配列の出発ライブラリーは、ＤＮＡ合成装置での自動化化学合成により作製される。この配列ライブラリーは、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼを使用してインビトロでＲＮＡへと転写され、精製される。１つの実施形態において、５’固定：ランダム：３’固定の配列が、３０〜５０のヌクレオチドを有するランダム配列により分離される。

（調節されたアプタマーを作製する方法）
特異的分子エフェクター（「エフェクター（ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔｏｒ）」）の存在下で、特異的分子標的（「標的（ｔｈｅ ｔａｒｇｅｔ）」）に結合するアプタマーの単離のための選択方法が記載される。

（方法（１）：未処理の配列プールからの選択）
リガンドで調節されたアプタマーについての選択は、さらなる血清安定性のために２’−フルオロピリミジンを含有する核酸プールを用いて実施される。以下の配列：
５’−ＧＣＣＴＧＴＴＧＴＧＡＧＣＣＴＣＣＴＧＴＣＧＡＡ−（Ｎ_４０）−ＴＴＧＡＧＣＧＴＴＴＡＴＴＣＴＴＧＴＣＴＣＣＣＴＡＴＡＧＴＧＡＧＴＣＧＴＡＴＴＡ−３’を有するＤＮＡテンプレートを、ＡＢＩ ＥＸＰＥＣＴＥＤＩＴＥ^ＴＭＤＮＡ合成装置を使用して合成し、標準的な方法により精製する（Ｎ_４０は、各アプタマー内に固有に形成された４０ヌクレオチドのランダム配列を示す）。テンプレートプール由来の固有の配列を有する約１０^１５のＤＮＡ分子が、プライマーＹＷ．４２．３０．Ａ（５’−ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＧＡＣＡＡＧＡＡＴＡＡＡＣＧＣＴＣＡＡ−３’）およびＹＷ．４２．３０Ｂ（５’−ＧＣＣＴＧＴＴＧＴＧＡＧＣＣＴＣＣＴＧＴＣＧＡＡ−３’）を使用してＰＣＲ増幅され得る。増幅されたプールＰＣＲ産物を、エタノール沈殿し、水中に再懸濁し、そして、Ｎａｐ−５カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）で脱塩する。プールＰＣＲ増幅からの約４×１０^１５のＤＮＡ分子を、変異体Ｙ６３９Ｆ Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼを使用してインビトロで転写し、この変異体は、２’−フルオロピリミジン（Ｓｏｕｓａ，１９９９）および２’−フルオロピリミジンおよび２’−ＯＨプリンＮＴＰを受容して、対応する配列を有する約３×１０^１６のＲＮＡ分子を得る。約１００μｌの合計容量中１０^１４〜１０^１５のランダム配列から構成される安定化された２’−フルオロ−ピリミジンプールを、中和アビジンコーティングプレート（Ｐｉｅｒｃｅ）に固定化したビオチン化標的またはプレートに固定化された接着性標的発現細胞のいずれかと接触させる。ポジティブおよびネガティブの選択工程のために使用される代表的な結合緩衝液は、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ ７．４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ_２、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＤＴＴおよび０．１ｍｇ／ｍｌ ｔＲＮＡ（４ｍＭ）を含有する。室温で１０分間のネガティブインキュベーション工程の後、標的のみに結合するＲＮＡをこのネガティブ選択工程において取り除く。次いで、結合していないＲＮＡを含有する溶液を、固定化標的を含有する別の同一のウェルに移し、この溶液にエフェクターを添加する。添加されるエフェクターの濃度は、最終的に、最も適切な濃度においてエフェクターに応答する分子を富化するように調節され得る。最初に、エフェクターは、飽和濃度で提供され（代表的には、グルコースのような低分子エフェクターについてはミリモル濃度、タンパク質エフェクターについてはマイクロモル濃度）、エフェクター依存性の任意の尺度を有する分子が単離されることを確認する。選択の連続したラウンドにおいて、エフェクターの濃度は減少され、最もエフェクター依存性の分子を優先的に単離し得る。１時間の平衡時間の後、ウェルを過剰量の結合緩衝液でリンスする（代表的には、３０秒間振盪しながら、機械式プレート洗浄機にて１２０μｌの１×ＡＳＢで４回洗浄する）。５０μｌのＲＴミックス（ＲＴプライマー、４μＭ；５×「サーモ緩衝液」、１×；ＤＴＴ、１００ｍＭ；混合ｄＮＴＰ、各０．２ｍＭ；バナジン酸ヌクレオチドインヒビター２００μＭ；ｔＲＮＡ １０μｇ／ｍｌ；０．５μｌ Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｔｈｅｒｍｏｓｃｒｉｐｔ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ；水で５０μｌにする）を選択ウェルに添加し、ウェル上をテープで覆って６５℃にて３０分間インキュベートし、蒸発を減らす。

ＲＴ反応物を、１００μｌのＰＣＲ反応物（５’プライマー、１μＭ；３’プライマー、１μＭ；１０×Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製のＰＣＲ緩衝液（Ｍｇなし）、１×；ｄＮＴＰ、各０．２ｍＭ；ＭｇＣｌ_２、３ｍＭ；１μｌ Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｔａｑ；１０μｌのインキュベーションしたＲＴ反応物を含有し、水で１００μｌにした）へと１０倍希釈し、以下のスケジュールで熱サイクルする：９４℃、１分；６２℃、１分；７２℃、３分。１０サイクルにて、ＰＣＲ反応物をアガロースゲルによりアッセイし、次いで、明確な増幅バンドがエチジウムブロマイド染色により見られるまで、連続の５サイクル毎にアッセイする。完全なＰＣＲ反応物を、Ｃｅｎｔｒｉ−ｓｅｐカラムを使用して精製し、５０μｌ転写反応物（４×ＴＫ 転写緩衝液、１×；ＭｇＣｌ_２、２５ｍＭ；ＮＴＰ 各５ｍＭ；ＮＥＢ Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ ２μｌ；水５０μｌまで）へと１０倍希釈する。転写反応物を３７℃にて一晩インキュベートし、得られた転写産物を、変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動（１０％ゲル）により精製する。

ポジティブ選択およびネガティブ選択の両方を切り抜ける分子の分画が、元々のナイーブプール分画よりも優位に増加するまで（代表的には、インプットの１０％未満）、全選択プロセスを繰り返す。代表的には、富化には、１０サイクル未満の選択が必要とされる。富化されたプール内の個々の分子を単離視、ＴＯＰＯ ＴＡクローニングシステム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用してプール化されたテンプレートＤＮＡをサブクローニングすることによって特徴付ける。個々のクローンを配列決定し、エフェクター依存性の結合について、固有のクローンをスクリーニングする。

（方法（２）：標的結合についての前選択、次いで、エフェクター依存性選択）
選択方法（１）は、標的とエフェクター結合特性の両方を有する分子が出発プール中に存在する可能性が低い場合に、以下のように改変され得る。標的結合およびエフェクター依存性の両方について最初に選択する代わりに、インビトロ選択を使用して、標的について高親和性を有する分子を単離し得る。必要に応じた誘導体化工程（標的結合配列の選択されたプールが、部分的にランダム化されている）の後に、エフェクター依存性の選択が適用され得る。標的特異的なアプタマーを単離するために、以下の改変を伴う以前に記載された選択方法が適用される：（１）標的をネガティブ選択工程から取り除く、そして（２）エフェクターをポジティブ選択工程から取り除く。５〜１５ラウンドの選択により、代表的に、１〜１０００の固有の配列を含む標的結合種が得られる。個々のクローンを、標的に特異的に結合する能力についてスクリーニングする。

エフェクター依存性の標的結合活性の増加した可能性を有する配列の多様化プールは、以下を含む多数の手段により作製され得る：
（１）配列の富化された標的結合プールの変異原性ＰＣＲ増幅。
（２）標的結合プールから単離された個々のクローン配列のドープ再合成（高親和性および選択的結合を有するクローンを選択する）。この場合、変異は、各位置または配列の特定の領域内において１０〜３０％の可能性で配列にわたってランダムに導入される。
（３）標的結合プールから単離され、ランダム配列ドメインで挟まれた個々のクローン配列の機能的に重要なサブドメインの再合成。一旦個々のアプタマーが元々のプールから同定されると、生化学活性に必要とされる最低限の配列要素が２つの平行したアプローチにより同定され得る：（１）制限アルカリ加水分解による切断分析、および（２）ドープ再選択（ＦｉｔｚｗａｔｅｒおよびＰｏｌｉｓｋｙ、１９９６において総説される方法）。最低限のアプタマー要素を決定することを補助するのに加えて、ドープ再選択により導入される配列改変が、改善した親和性または生化学的活性を有する元々のクローンの変異体を提供し得る。多様化したプールは、以前に記載されたような、エフェクター依存性の標的結合についての選択に供される。

（方法（３）：エフェクター結合についての前選択、次いで、エフェクター依存性の標的結合選択）
選択方法（１）は、標的およびエフェクター結合特性の両方を有する分子が、出発プールに存在する可能性が低い場合に、以下のように改変され得る。標的結合およびエフェクター依存性の両方について最初に選択する代わりに、インビトロ選択を使用して、エフェクターに対して高親和性を有する分子を単離し得る。必要に応じた多様化工程（エフェクター結合配列の選択されたプールが部分的にランダム化される）の後、エフェクター依存性の標的結合選択が以前に記載されるように適用され得る。エフェクター特異的なアプタマーを単離するために、第１の選択方法が以下の改変を伴って適用される：（１）ネガティブ選択工程から標的が取り除かれ、そして（２）ポジティブ選択工程から標的が取り除かれ、代わりに、エフェクターが捕捉固体支持体に固定化される。グルコースのような低分子エフェクターの場合は、１〜５ｍＭの固定化エフェクターを有する２００μｌのアガロースビーズカラムを使用する、従来の親和性クロマトグラフィーが好ましい固定化様式である。代表的に、５〜１５ラウンドの選択により、１〜１０００の固有の配列を含むエフェクター結合種のプールを得る。個々のクローンは、エフェクターに特異的に結合する能力についてスクリーニングされる。

エフェクター結合分子の配列多様化プールは、以下の方法のうちの１つにより作製され得る：
（１）配列の富化されたエフェクター結合プールの変異原性ＰＣＲ増幅。
（２）エフェクター結合プールから単離された個々のクローン配列のドープ再合成（高親和性および特異的な結合を有するクローンを選択する）。この場合、変異は、配列の各位置または特定の領域において１０〜３０％の可能性で配列にわたってランダムに導入される。
（３）エフェクター結合プールから単離され、ランダム配列ドメインにより挟まれた個々のクローン配列の機能的に重要なサブドメインの再合成。エフェクター結合配列の機能的に重要なサブドメインは、元々のクローンの切断により定義され得、その後、エフェクター結合についてアッセイされる。

多様化されたプールは、選択方法（１）に記載されるように、エフェクター依存性の標的結合についての選択に供される。

（方法（４）：エフェクター結合および標的結合モチーフについての前選択、次いで、エフェクター依存性の標的結合選択）
選択方法（１）は、標的およびエフェクター結合特性の両方を有する分子が出発プールに存在する可能性が低い場合に、以下のように改変され得る。標的結合およびエフェクター依存性の両方について最初に選択する代わりに、インビトロ選択を使用して、分子の２つの別々のプールを単離し得、このうち一方はエフェクターに対して高親和性を有し、他方は標的に対して高親和性を有する。２つのプール内のサブドメインは、各分子が１コピーのエフェクター結合モチーフと１コピーの標的結合モチーフを含む、分子のキメラプールを作製するように操作され得る。このキメラプールは、次いで、以前に記載されたように、エフェクター依存性の標的結合の選択に供される。

標的特異的なアプタマーを単離するために、以下の改変を伴った選択方法（１）が適用される：（１）ネガティブ選択工程から標的が取り除かれ、そして（２）ポジティブ選択工程からエフェクターが取り除かれる。エフェクター特異的なアプタマーを単離するために、以下の改変を伴った選択方法（１）が適用される：（１）ネガティブ選択工程から標的が取り除かれ、そして（２）ポジティブ選択工程から標的が取り除かれ、かつ、その代わりに、エフェクターが捕捉固体支持体に固定化される。グルコースのような低分子の場合、１〜５ｍＭの固定化されたエフェクターを有する２００μｌのアガロースビーズカラムを使用する従来の親和性クロマトグラフィーが好ましい固定化様式である。

好ましい実施形態において、標的特異的プールおよびエフェクター特異的プールの各々由来の高親和性クローンの機能的サブドメインを使用して、エフェクター依存性選択についてのキメラプールを作製する。機能的サブドメインは、以前に記載されたように同定され得る（選択方法（２））。キメラプールは、介入されたランダム配列と共に機能的モチーフ直鎖状に連結することによって作製され得る。あるいは、このモチーフは、エフェクター依存性リボザイムについて以前に記載されたように、連結ヘリックスをカップリングすることによって二次構造レベルで合わせられ得る（Ｓｏｕｋｕｐ，Ｇ．およびＢｒｅａｋｅｒ，Ｒ．（１９９９） Ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ ａｌｌｏｓｔｅｒｉｃ ｈａｍｍｅｒｈｅａｄ ｒｉｂｏｚｙｍｅｓ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｂｙ ｌｉｇａｎｄ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｓｔａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ Ｆｏｌｄ Ｄｅｓ ７（７）：７８３−９１）。

（インシュリン様生物活性を有するグルコース調節性のアプタマー）インシュリンを機能的に置き換え得る自己調節型アプタマーは、以下の方法により作製され得る。

（工程１．インシュリンレセプター（ＩＲ）結合活性）
核酸分子のプールを、選択方法（２）を使用して、インシュリンレセプターの細胞外部分へ結合する能力について選択する。以前の研究は、インシュリンの効果を模倣し得るＩＲ特異的抗体に対するエピトープを同定した（Ｓｔｅｅｌｅ−Ｐｅｒｋｉｎｓ，Ｇ．およびＲｏｔｈ，Ｒ．Ａ．（１９９０）Ｉｎｓｕｌｉｎ−ｍｉｍｅｔｉｃ ａｎｔｉ ｉｎｓｕｌｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｓｔｉｍｕｌａｔｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｋｉｎａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｉｎ ｉｎｔａｃｔ ｃｅｌｌｓ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５（１６）：９４５８−９４６３）。これらのエピトープを含むタンパク質フラグメントは、インシュリン模倣活性を有するアプタマーの単離のための適切な出発部分である。ＩＲ特異的アプタマーの改変された単量体および二量体形態は、ＩＲの内因性のレセプターキナーゼ活性を刺激し、従って、内因性のアゴニスト活性を有する分子を同定する能力についてアッセイされ得る。

（工程２．グルコース調節）
インシュリン様活性を有するアプタマーの最低限の機能的ドメインを使用して、ランダム配列ドメイン（例えば、Ｎ_２０）を直鎖状に連結し、定常配列プライマーにより挟まれた、潜在的なグルコース依存性分子のプールを構築して、その後の選択を容易にし得る。エフェクターとして高い初期濃度（例えば、１００ｍＭ）のグルコースを用いる選択方法（２）の適用により、グルコース調節性インシュリン模倣アプタマーを得る。

（薬学的組成物）
本発明はまた、調節されたアプタマー分子を含有する薬学的組成物を含む。いくつかの実施形態において、この組成物は、内在的使用に適しており、これらは、治療有効量本発明の薬理学的に活性な化合物を、単独でか、または、１つ以上の薬学的に受容可能なキャリアと組み合わせて含む。この化合物は、毒性が存在する場合、非常に低い量で特に有用である。

実施の際、化合物またはその薬学的に受容可能な塩は、所望の細胞の溶解を誘導するのに十分な量で投与される。

例えば、錠剤またはカプセル（例えば、ゼラチンカプセル）の形態での経口投与のために、活性薬物成分は、経口、非毒性の薬学的に受容可能な不活性キャリア（例えば、エタノール、グリセロール、水など）と合わされ得る。さらに、所望される場合または必要な場合、適切な結合剤、潤滑剤、崩壊剤および着色剤がまた、混合物中に組み込まれ得る。適切な結合剤としては、デンプン、ケイ酸アルミニウムマグネシウム、デンプンペースト、ゼラチン、メチルセルロース、ナトリウムカルボキシメチルセルロースおよび／またはポリビニルピロリドン、天然糖（例えば、グルコースまたはβ−ラクトース、コーン甘味料（ｃｏｒｎ ｓｗｅｅｔｅｎｅｒ））、天然および合成ガム（例えば、アラビアゴム、トラガントまたはアルギン酸ナトリウム）、ポリエチレングリコール、蝋などが挙げられる。これらの投薬形態において使用される潤滑剤としては、オレイン酸ナトリウム、ステアリン酸ナトリウム、ステアリン酸マグネシウム、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、珪素、滑石、ステアリン酸、そのマグネシウム塩もしくはカルシウム塩および／またはポリエチレングリコールなどが挙げられる。崩壊剤としては、デンプン、メチルセルロース、寒天、ベントナイト、キサンタンガムデンプン、寒天、アルギン酸もしくはそのナトリウム塩、または、発泡性混合物などが挙げられるがこれらに限定されない。希釈剤としては、例えば、ラクトース、デキストロース、スクロース、マンニトール、ソルビトール、セルロースおよび／またはグリシンが挙げられる。

注射可能な組成物は、好ましくは、等張の水溶液または水性懸濁液であり、坐剤は、有利には、脂肪エマルジョンまたは懸濁液から調製される。この組成物は、滅菌であり得、そして／または、保存剤、安定化剤、湿潤剤もしくは乳化剤、溶解促進剤、浸透圧を調節するための塩および／または緩衝液のようなアジュバントを含み得る。さらに、これらはまた、他の治療的に価値のある物質を含み得る。この組成物は、それぞれ、従来の混合法、造粒法またはコーティング法に従って調製され、約０．１〜７５％、好ましくは約１〜５．０％の活性成分を含む。

本発明の化合物はまた、時限放出および持続放出の錠剤またはカプセル、丸剤、散剤、顆粒、エリキシル剤、チンキ、懸濁液、シロップおよびエマルジョンとしてのこのような経口投薬形態で投与され得る。

液体（特に、注射可能な組成物）は、例えば、溶解、分散などによって調製され得る。活性化合物は、例えば、水、生理食塩水、水性デキストロース、グリセロール、エタノールなどの薬学的に純粋な溶媒中に溶解されるかこのような溶媒と混合され、それによって、注射可能な溶液または懸濁液を形成する。さらに、注射前に液体に溶解するために適切な固体形態が処方され得る。注射可能な組成物は、好ましくは、水性等張溶液または懸濁液である。この組成物は、滅菌され得、そして／または保存剤、安定化剤、湿潤剤または乳化剤、溶解促進剤、浸透圧を調節するための塩、ならびに／もしくは緩衝液のようなアジュバントを含み得る。さらに、これらはまた、他の治療的に価値のある物質を含み得る。

本発明の化合物は、静脈内（大量および注入の両方）、腹腔内、皮下または筋肉内形態で投与され得、使用する全ての形態は薬学分野の当業者に周知である。注射用剤は、液体溶液または懸濁液のいずれかとして従来の形態で調製され得る。特に、本発明の材料は、以下に記載される方法を用いて眼窩に送達され得る。さらに、本発明の材料は、以下に記載されるように、当該分野で公知の様式で被験体に投与され得る。

非経口注射投与は、一般に、皮下、筋肉内または静脈内の注射および注入のために使用される。さらに、非経口投与のための１つのアプローチは、米国特許第３，７１０，７９５号（本明細書中に参考として援用される）に従って遅速放出または持続性放出系の移植物を使用し、これは、一定レベルの投薬量が維持されることを保証する。

さらに、本発明の好ましい化合物は、適切な鼻腔内ビヒクルの局所使用を介する鼻腔内形態でか、または、当業者に周知の経皮皮膚パッチの形態を使用する経皮経路を介して投与され得る。経皮送達系の形態で投与されるために、投薬投与は当然、投薬レジメンの間中、断続的ではなく連続的である。他の好ましい局所調製物としては、クリーム、軟膏、ローソン、エアロゾルスプレーおよびゲルが挙げられ、活性成分の濃度は、０．１％〜１５％（ｗ／ｗまたはｗ／ｖ）の範囲である。

固形組成物について、賦形剤としては以下が挙げられる：マンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、滑石、セルロース、グルコース、スクロース、炭酸マグネシウムなどの薬学的グレードが使用され得る。上記で定義された活性化合物がまた、例えば、キャリアとしてポリアルキレングリコール（例えば、プロピレングリコール）を使用して、坐剤として処方され得る。いくつかの実施形態において、坐剤は、脂肪エマルジョンまたは懸濁液から有利に調製される。

本発明の化合物はまた、リポソーム送達系（例えば、小さな単層小胞、大きな単層小胞および多層小胞）の形態で投与され得る。リポソームは、コレステロール、ステアリルアミンまたはホスファチジルコリンを含有する種々のリン脂質から形成され得る。いくつかの実施形態において、脂質成分のフィルムが、米国特許第５，２６２，５６４号に記載されるように、薬物の水溶液で水和されて薬物をカプセル化する脂質層を形成する。例えば、本明細書中に記載されるアプタマー−毒素および／またはリボレセプター分子は、当該分野で公知の方法を使用して構築された親油性化合物または非免疫原性、高分子量化合物との複合体として提供され得る。核酸結合複合体の例は、米国特許第６，０１１，０２０号に提供される。

本発明の化合物はまた、標的化可能な薬物キャリアとして溶解性ポリマーとカップリングされ得る。このようなポリマーとしては、ポリビニルピロリドン、ピランコポリマー、ポリヒドロキシプロピル−メタクリルアミド−フェノール、ポリヒドロキシエチルアスパナミドフェノール、またはパルミトイル残基で置換されたポリエチレンオキシドポリリジンが挙げられ得る。さらに、本発明の化合物は、薬物の制御放出を達成するのに有用な生分解性ポリマーのクラス（例えば、ポリ乳酸、ポリεカプロラクトン、ポリヒドロキシ酪酸、ポリオルトエステル、ポリアセタール、ポリジヒドロピラン、ポリシアノアクリレートおよびヒドロゲルの架橋または両親媒性ブロックコポリマー）とカップリングされ得る。

所望される場合、投与される薬学的組成物はまた、少量の非毒性補助物質（例えば、湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝化剤）および他の物質（例えば、酢酸ナトリウム、オレイン酸トリエタノールアミンなど）を含み得る。

化合物を利用する投薬レジメンは、患者の型、種、年齢、体重、性別および病状；処置される状態の重篤度；投与経路；患者の腎機能および肝機能；ならびに使用される特定の化合物またはその塩を含む種々の因子に従って選択される。当業者である医師または獣医は、状態の進行を予防、対応または停止するのに必要とされる薬物の有効量を容易に決定し、処方し得る。

本発明の経口投薬量は、所定の効果について使用される場合、１日あたり経口で約０．０５〜１０００ｍｇの間の範囲である。組成物は好ましくは、０．５ｍｇ、１．０ｍｇ、２．５ｍｇ、５．０ｍｇ、１０．０ｍｇ、１５．０ｍｇ、２５．０ｍｇ、５０．０ｍｇ、１００．０ｍｇ、２５０．０ｍｇ、５００．０ｍｇおよび１０００．０ｍｇの活性成分を含有する分割錠の形態で提供される。本発明の化合物の有効血漿レベルは、１日あたり０．０２ｍｇ〜５０ｍｇ／体重（ｋｇ）の範囲である。

本発明の化合物は、１日に１回の用量で投与され得るか、または、合計１日投薬量が１日に２回、３回または４回の分割用量で投与され得る。

他に規定されない限り、本明細書中で使用される全ての科学技術用語は、本発明が属する分野の当業者により通常理解されるのと同じ意味を有する。本明細書中に記載される方法と類似または等価な方法および材料が本発明の実施または試験において使用され得るが、適切な方法および材料が上記される。本明細書中で言及される全ての刊行物、特許出願、特許および他の参考文献は、その全体が参考として援用される。矛盾する場合、本明細書（定義を含む）は調整される。さらに、材料、方法および実施例は、単に例示的であり、限定することを意図しない。

（実施例１ リガンドで調節されたＲＮＡアプタマーを用いたタンパク質活性の制御）
本明細書中に記載される本発明の確認は、Ｖｕｙｉｓｉｃｈら、Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．９，９０７−９１３（２００２年８月）に記載される、別のグループによって示されている。

タンパク質の活性を制御することが、インビボでのその機能を定義するために必要である。ＲＮＡアプタマーは、高い親和性および特異性でタンパク質を阻害し得るが、この効果は、容易に可逆的でない。本発明者らは、その標的タンパク質に結合し、阻害するアプタマーを発見するための一般的な方法を記載するが、特定の低分子の添加によりタンパク質−ＲＮＡ複合体が破壊する。ＳＥＬＥＸプロトコールを用いてＲＮＡアプタマーにＤＮＡ修復酵素（ホルムアミドピリミジングリコシラーゼ（Ｆｐｇ））を惹起させ、ネオマイシンを各ラウンドで使用して、Ｆｐｇ−結合ＲＮＡを解離した。本発明者らは、１００ｎＭの濃度でＦｐｇを完全に阻害し得るＲＮＡ分子を同定した。重要なことには、Ｆｐｇ活性は、ネオマイシンの添加により回復される。本発明者らは、これらのリガンドで調節されたアプタマー（ＬＩＲＡ）を、生物学的現象の研究における有用なツールとして想定し、これらの研究においては、分子事象のタイミングが重要である。

タンパク質の活性を制御することが、インビボでその機能を定義するために必要とされる。ＲＮＡアプタマーは、高い親和性および特異性でタンパク質を阻害し得るが、この効果は容易に可逆的でない。本発明者らは、その標的タンパク質に結合し阻害するアプタマーを発見するための一般的な方法を記載するが、特定の低分子の添加によりタンパク質−ＲＮＡ複合体が破壊する。ＳＥＬＥＸプロトコールを用いて、ＲＮＡアプタマーにＤＮＡ修復酵素（ホルムアミドピリミジングリコシラーゼ（Ｆｐｇ））を惹起させ、ネオマイシンを各ラウンドで使用してＦｐｇ結合ＲＮＡを解離した。本発明者らは、１００ｎＭの濃度でＦｐｇを完全に阻害し得るＲＮＡ分子を同定した。重要なことには、Ｆｐｇ活性は、ネオマイシンの添加により回復する。本発明者らは、これらのリガンドで調節されたアプタマー（ＬＩＲＡ）を生物学的現象の研究における有用なツールとして想定し、これらの研究においては、分子事象のタイミングが重要である。

上記のＲＮＡアプタマーアプローチの１つの可能な欠点は、一旦アプタマーが細胞内で発現され、標的タンパク質が阻害されると、活性がもはや正確には制御され得ないことである。事象のタイミングが重要である場合（例えば、細胞周期の間または初期の発生において）、タンパク質活性の厳密な時間的な調節が、特定の場合において望ましくあり得る。（ＭｃＣｏｌｌｕｍ，Ｄ．およびＧｏｕｌｄ，Ｋ．Ｌ．Ｔｒｅｎｄｓ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１１，８９−９５（２００１）；Ａｍｂｒｏｓ，Ｖ．Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｇｅｎｅｔ．Ｄｅｖ．１０，４２８−４３３（２０００）；Ｌｅｅ，Ｒ．Ｃ．およびＡｍｂｒｏｓ，Ｖ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９４，８６２−８６４（２００１））。発現されているが、非機能的（阻害された）遺伝子産物が、次いで、適時、所望の時点で活性化され、これらの場合において役立つ。このような系において、標的タンパク質が阻害され、次いで、タンパク質を活性化し、変化を検出する間に、細胞内活性または細胞内経路をモニタリングし得る。

本発明者らは、この目標が、タンパク質への結合が、それ自体、有機低分子により調節されるＲＮＡアプタマーにより達成され得ると考えた。従って、選択されたＲＮＡは、標的タンパク質に結合し得、かつ標的タンパク質を阻害し得る。所望の時点で、低分子（誘導物質）の添加がＲＮＡ−タンパク質複合体を破壊し、機能的タンパク質を生じる（図１を参照のこと、ＶｕｙｉｓｉｃｈおよびＢｅａｌ，Ｃｈｅｍ．＆Ｂｉｏｌ．９：９０７−９１３（２００２））。本発明者らのアプローチは、ＳＥＬＥＸプロトコールの間の溶出工程において低分子を使用し、標的タンパク質には結合するが、低分子の存在下で標的タンパク質から解離するＲＮＡの増幅をもたらした（図２を参照のこと、ＶｕｙｉｓｉｃｈおよびＢｅａｌ，Ｃｈｅｍ．＆Ｂｉｏｌ．９：９０７−９１３（２００２））。本発明者らは、これらのＲＮＡを「リガンドで調節されたアプタマー」すなわちＬＩＲＡと称する。ＬＩＲＡを使用する系において、阻害が、誘導物質の添加により時間的に制御されるように、機能的タンパク質が、特定の時間にわたって阻害され得る。

リガンドで調節されたインヒビターの所望の特性を考慮する場合、本発明者らは、ＲＮＡの構造が、このような仕事を実施し得るはずであることを理解した。アプタマーの種々のタンパク質に結合する能力に加えて、インビトロで選択されたＲＮＡは、高い親和性および特性で有機低分子を認識し得る（Ｗｉｌｓｏｎ，Ｄ．Ｓ．およびＳｚｏｓｔａｋ，Ｊ．Ｗ．，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６６，６１１−６４７（１９９９）；Ｈｅｒｍａｎｎ，Ｔ．およびＰａｔｅｌ，Ｄ．Ｊ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８７，８２０−８２５（２０００）；Ｊｅｎｉｓｏｎ，Ｒ．Ｄ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６３，１４２５−１４２９（１９９４））。また、その活性が、エフェクターと呼ばれる低分子の存在により調節され得るリボザイムのいくつかの例が存在する（Ｓｏｕｋｕｐ，Ｇ．Ａ．およびＢｒｅａｋｅｒ，Ｒ．Ｒ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９６，３５８４−３５８９（１９９９）；Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ，Ｍ．Ｐ．およびＥｌｌｉｎｇｔｏｎ，Ａ．Ｄ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２８，１７５１−１７５９（２０００）；Ｐｉｇａｎｅａｕ，Ｎ．ら、Ａｎｇｅｗ Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．３９，４３６９−４３７３（２０００）；Ｈａｒｔｉｇ，Ｊ．Ｓ．ら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０，７１７−７２２（２００２））。これらのエフェクターで調節されたリボザイムは、ＳＥＬＥＸを使用して発見され、固定された触媒ドメインおよび公知の低分子結合ドメインが、ランダム化されたＲＮＡ「連絡モジュール」を介して接続される。あるいは、連絡モジュールおよび触媒ドメインは固定され得、低分子結合ドメインがランダム化され得、従って、新しいエフェクター分子について選択され得る（Ｋｏｉｚｕｍｉ，Ｍ．ら、Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．６，１０６２−１０７１（１９９９））。本発明者らのアプローチにおいて、ＬＩＲＡの全てのパーツがランダム化され、本発明者らは、タンパク質標的および低分子の両方に結合し得るアプタマーについて同時に選択する。

原理実験の最初の証明のために、本発明者らは、核酸を結合するように予め配列されている、標的タンパク質および強力な誘導物質の両方を選択する。標的タンパク質については、本発明者らは、ＤＮＡ修復酵素であるホルムアミドピリミジングリコシラーゼ（Ｆｐｇ）（ＭｕｔＭとしても公知）を使用した（Ｃｈｅｓｔａｎｇａ，Ｃ．Ｊ．およびＬｉｎｄａｈｌ，Ｔ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１０，３６７３−３６８４（１９７９）；Ｂｏｉｔｅｕｘ，Ｓ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５，３９１６−３９２２（１９９０））。この酵素は、ＤＮＡにおける８−オキソ−ｄＧ損傷を認識し、そのＮ−グリコシラーゼおよびＡＰリアーゼ活性を使用して、鎖から酸化されたヌクレオチドを取り除く（Ｄａｖｉｄ，Ｓ．Ｓ．およびＷｉｌｌｉａｍｓ，Ｓ．Ｄ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．９８，１２２１−１２６１（１９９８）；Ｔｃｈｏｕ，Ｊ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８，４６９０−４６９４（１９９１））。低分子についての本発明者らの選択はネオマイシンであり、これは、抗生物質のアミノグリコシド系クラスに属する。これらの分子は、多くの天然に存在するＲＮＡリガンドに結合することが示されている（Ｍｏａｚｅｄ，Ｄ．およびＮｏｌｌｅｒ，Ｈ．Ｆ．Ｎａｔｕｒｅ ３２７，３８９−３９４（１９８７）；Ｙｏｓｈｉｚａｗａ，Ｓ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４１，６２６３−６２７０（２００２）；Ｃａｒｔｅｒ，Ａ．Ｐ．ら、Ｎａｔｕｒｅ ４０７，３４０−３４８（２０００））。さらに、ネオマイシンをＳＥＬＥＸ標的として使用し、ＲＮＡにおける特異的配列モチーフに結合することを示した（Ｗａｌｌｉｓ，Ｍ．Ｇ．ら、Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．２，５４３−５５２（１９９５））。

（結果）
（ＳＥＬＥＸの結果）
組換えＥ．ｃｏｌｉホルムヨードピリミジングリコシラーゼ（Ｆｐｇ）酵素を、本発明者らの最初のタンパク質標的として選択した（Ｃｈｅｓｔａｎｇａ，Ｃ．Ｊ．およびＬｉｎｄａｈｌ，Ｔ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１０，３６７３−３６８４（１９７９）；Ｄａｖｉｄ，Ｓ．Ｓ．およびＷｉｌｌｉａｍｓ，Ｓ．Ｄ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．９８，１２２１−１２６１（１９９８））。この核酸結合タンパク質は、容易に過剰発現され、容易に精製され、そして、活性についての単純で十分に確立されたアッセイがある（Ｂｏｉｔｅｕｘ，Ｓ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５，３９１６−３９２２（１９９０）；Ｌｅｉｐｏｌｄ，Ｍ．Ｄ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３９，１４９８４−１４９９２（２０００）；Ｚｈａｒｋｏｖ，Ｄ．Ｏ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２，５３３５−５３４２（１９９７））。配列ランダム化ＲＮＡライブラリーを、溶液中でＦｐｇと結合させて、その後、濾紙を使用してＦｐｇ結合種から遊離ＲＮＡを分離した。最初の６ラウンドにおいて、非特異的な尿素緩衝液をＦｐｇ結合ＲＮＡの溶出に使用した。第７ラウンド目に、ＲＮＡプールをスプリットし、２つの平行した選択に使用した。Ｎ選択において、溶出工程でネオマイシンを使用した。従って、Ｆｐｇには結合するが、アミノグリコシドの存在下で解離するＲＮＡのみを回収して増幅した。Ｕ選択において、溶出工程で引き続いて尿素を使用し、Ｆｐｇに対して親和性を有する任意のＲＮＡ構造を選択した。

Ｎ選択の間、ラウンドによる進行を、洗浄緩衝液中５ｍＭのネオマイシンで溶出されたＲＮＡと、洗浄緩衝液のみで溶出されたＲＮＡの量の比を算出することによって測定した。この比は、１５ラウンド目に６近くまで上昇した（図３を参照のこと、ＶｕｙｉｓｉｃｈおよびＢｅａｌ，Ｃｈｅｍ．＆Ｂｉｏｌ．９：９０７−９１３（２００２））。１８ラウンド目に、ネオマイシンに対してより感受性であるアプタマーを選択するために、ネオマイシン濃度を１ｍＭまで減少した。この比は、落下したが、急速に回復した（図３を参照のこと、ＶｕｙｉｓｉｃｈおよびＢｅａｌ，Ｃｈｅｍ．＆Ｂｉｏｌ．９：９０７−９１３（２００２））。最後に、最終の４ラウンドにおいて、２００μＭのネオマイシンを使用し、その後、ｃＤＮＡライブラリーをクローン化して、このプール由来のＲＮＡをＮアプタマーと名付けた。

Ｕ選択を合計１４ラウンドにわたって実施し、その後、ライブラリーを、Ｆｐｇを阻害する能力について試験した。単回の回転条件下では、１４ラウンドの後のＵ選択からの１μＭのライブラリーが酵素を完全に阻害したが、同じ濃度の最初のＲＮＡプールは、Ｆｐｇに対して効果を示さなかった。この段階で、本発明者らはｃＤＮＡプールをクローン化し、この選択からのＲＮＡクローンをＵアプタマーと呼ぶ。

本発明者らは、２３回目のＮ選択からのＲＮＡプールの、ネオマイシン存在下でＦｐｇを阻害する能力を試験した。コントロールとして、本発明者らは、１４ラウンドのＵ選択からのＲＮＡプールを使用した。Ｎ選択からのプールは、Ｕ選択プールよりもネオマイシンに対して実際により感受性であり（等級の１オーダーで）、これは、アミノグリコシドの存在下で無理にＦｐｇから解離することはなかった。クローニングの後、本発明者らは、５つのＮアプタマーおよび９つのＵアプタマーを、ネオマイシンの有無でのＦｐｇを阻害する能力について試験した。一般に、Ｎアプタマーは、Ｕ選択アプタマーよりもネオマイシンに対して感受性であった。

（Ｆｐｇに対するアプタマー結合）
本発明者らは、Ｆｐｇに結合し、阻害する能力について、各選択からのいくつかのアプタマーを試験した。これらの結果に基づいて、本発明者らは、同様の親和性でＦｐｇに結合し、同様の阻害活性を保有した２つのクローン（各選択から１つ）を選択した。本発明者らは、これらを、ネオマイシンで調節されるアプタマー（Ｎ１）およびコントロールアプタマー（Ｕ１）と名付けた。定量的フィルター結合アッセイを使用して、Ｋ_Ｄを、Ｎ１について７．５±１．６ｎＭ、Ｕ１について２．７±０．９ｎＭと決定した。本発明者らの定常状態実験は、１００ｎＭの濃度にてＮ１およびＵ１の両方のアプタマーによるＦｐｇ活性の完全な阻害が明らかとなった。

（Ｆｐｇのアプタマー阻害に対するネオマイシンの効果）
本発明者らは、２つの選択されたアプタマーのネオマイシンの存在に対する相対的な応答を決定することを望んだ。反応成分（アプタマー、Ｆｐｇおよびアミノグリコシド系抗生物質）を、一緒にインキュベートし、その後、定常状態条件下で標識化Ｆｐｇ物質を添加した。Ｆｐｇ活性の完全な阻害は、１００ｎＭの濃度で存在するＮ１アプタマーで観察される（図４Ｂ、レーン１を参照のこと、ＶｕｙｉｓｉｃｈおよびＢｅａｌ，Ｃｈｅｍ．＆Ｂｉｏｌ．９：９０７−９１３（２００２））。増加する濃度のネオマイシンを添加するにつれ、Ｆｐｇのアプタマー阻害が軽減する（図４Ｂ、レーン２〜６、ＶｕｙｉｓｉｃｈおよびＢｅａｌ，Ｃｈｅｍ．＆Ｂｉｏｌ．９：９０７−９１３（２００２））。１００μＭのネオマイシンで、Ｆｐｇ活性はその最大に達し、ここで、約２ｎＭの生成物が観察される（レーン０およびレーン６と比較する、図４Ｂ、ＶｕｙｉｓｉｃｈおよびＢｅａｌ、Ｃｈｅｍ．＆Ｂｉｏｌ．９：９０７−９１３（２００２））。Ｎ１と同様の親和性でＦｐｇに結合するコントロールアプタマー（Ｕ１）を使用して酵素を阻害した場合、ネオマイシンレスキューは、観察されなかった（図４Ｃ、ＶｕｙｉｓｉｃｈおよびＢｅａｌ，Ｃｈｅｍ．＆Ｂｉｏｌ．９：９０７−９１３（２００２））。Ｎ１−Ｆｐｇ複合体の分裂がネオマイシンに特異的であるか否かを決定するために、本発明者らは、構造的に類似するアミノグリコシド系のカナマイシンを用いて実験を繰り返した（図４Ｆ、ＶｕｙｉｓｉｃｈおよびＢｅａｌ，Ｃｈｅｍ．＆Ｂｉｏｌ．９：９０７−９１３（２００２））。重要なことには、この関連アミノグリコシドは、これらの条件下でＮ１アプタマーの阻害活性と干渉し得ない（図４Ｄ、ＶｕｙｉｓｉｃｈおよびＢｅａｌ，Ｃｈｅｍ．＆Ｂｉｏｌ．９：９０７−９１３（２００２））。ＶｕｙｉｓｉｃｈおよびＢｅａｌ，Ｃｈｅｍ．＆Ｂｉｏｌ．９：９０７−９１３（２００２）の図４Ｂ〜４Ｄにおける生成物の量（ｎＭ）を定量し、アミノグリコシドの濃度の関数としてプロットした（図４Ｅ、ＶｕｙｉｓｉｃｈおよびＢｅａｌ，Ｃｈｅｍ．＆Ｂｉｏｌ．９：９０７−９１３（２００２））。

（ネオマイシンで調節されたアプタマーの二次構造）
Ｎ１アプタマーについてのｅＤＮＡの配列決定により、本発明者らは、コンピュータプログラムＭＦＯＬＤ（ｈｔｔｐ：／／ｂｉｏｉｎｆｏ．ｍａｔｈ．ｒｐｉ．ｅｄｕ／〜ｍｆｏｌｄ／ｍａ／ｆｏｎｎｌ．ｃｇｉ）を使用して、ＲＮＡの二次構造を予測することが可能となった（図５Ｂ、ＶｕｙｉｓｉｃｈおよびＢｅａｌ，Ｃｈｅｍ．＆Ｂｉｏｌ．９：９０７−９１３（２００２）；Ｍａｔｈｅｗｓ，Ｄ．Ｈ．ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２８８，９１１−９４０（１９９９））。予測モデルを試験するために、本発明者らは、単鎖ＲＮＡおよび二本鎖ＲＮＡに対して特異的なリボヌクレアーゼを使用した。これらの酵素としては、Ｓ１、Ｖ１およびＴ１が挙げられた。ＶｕｙｉｓｉｃｈおよびＢｅａｌ，Ｃｈｅｍ．＆Ｂｉｏｌ．９：９０７−９１３（２００２）の図５Ａは、ネイティブな条件下でのＳ１およびＶ１のリボヌクレアーゼによるＮ１アプタマーの切断を示す。ＲＮＡ上での主要な切断部位を、アプタマーの予測された二次構造上にマッピングする（図５Ｂ、ＶｕｙｉｓｉｃｈおよびＢｅａｌ，Ｃｈｅｍ．＆Ｂｉｏｌ．９：９０７−９１３（２００２））。このマッピングはまた、ネイティブな条件下でのＴ１リボヌクレアーゼ消化の主要な切断部位を含む。これらは、ＶｕｙｉｓｉｃｈおよびＢｅａｌ，Ｃｈｅｍ．＆Ｂｉｏｌ．９：９０７−９１３（２００２）の図６Ａ、レーン４に示される。一般に、異なるリボヌクレアーゼを用いて観察される反応性は、予測された二次構造と一致する。

（ネオマイシンで調節されたアプタマーに対するＦｐｇおよびネオマイシンのフットプリンティング）
Ｎ１アプタマーに対するＦｐｇおよびネオマイシンについての結合部位を局在化するために、切断保護アッセイ（フットプリンティング）を実施した。本発明者らは、この目的にためにいくつかのリボヌクレアーゼ（Ｓ１、Ｖ１、Ｔ１およびＰ１）を利用し、結果は、リボヌクレアーゼＴ１フットプリンティングにより最良に示され得る（図６、ＶｕｙｉｓｉｃｈおよびＢｅａｌ，Ｃｈｅｍ．＆Ｂｉｏｌ．９：９０７−９１３（２００２））。ＶｕｙｉｓｉｃｈおよびＢｅａｌ，Ｃｈｅｍ．＆Ｂｉｏｌ．９：９０７−９１３（２００２）の図６Ａは、ネオマイシンが添加されるにつれて、Ｇ２７におけるＴ１による切断が減少することを示す（レーン５〜１３）。レーン１４〜１９は、Ｆｐｇの増加する量に対応して、Ｇ２７〜Ｇ３５のＴ１切断の減少を示す。従って、Ｆｐｇおよびネオマイシンは、ＲＮＡ鎖の中央付近のステム構造と一本鎖ループとの間の接点における明らかに重なった部位でＮ１アプタマーと結合する。（図６Ｂ、ＶｕｙｉｓｉｃｈおよびＢｅａｌ，Ｃｈｅｍ．＆Ｂｉｏｌ．９：９０７−９１３（２００２））。Ｔ１切断からの保護が、ネオマイシンによるＲＮＡ結合画分に変換される場合、データは、単一部位結合等式を使用してフィットさせられ得、これは、０．９４±０．０６μＭのＫ_ｄを生じる（図６Ｃ、ＶｕｙｉｓｉｃｈおよびＢｅａｌ，Ｃｈｅｍ．＆Ｂｉｏｌ．９：９０７−９１３（２００２））。

（Ｎ１アプタマーの３’ステム−ループの重要性）
予測された二次構造とＮ１アプタマー上のＦｐｇおよびネオマイシン結合部位の位置から、ＲＮＡの３’ステム−ループ（ヌクレオチド６０〜９１）は、不必要であるようであった。この考えを試験するために、本発明者らは、５’末端由来の５９または６６のヌクレオチドを含むＮ１アプタマーの２つの欠失変異体を調製した。これらのＲＮＡのいずれもが、２００ｎＭの濃度においてＦｐｇを阻害し得なかった。この結果は、３’ステム−ループが、おそらくアプタマーの三次元構造を維持する際に、Ｎ１の阻害効果に重要であることを示す。

（考察）
いくつかの化学遺伝学的方法が、既存の機能的遺伝学アプローチを補足する遺伝子産物の機能を描写するために開発されている（Ｓｐｅｃｈｔ，Ｋ．Ｍ．およびＳｈｏｋａｔ，Ｋ．Ｍ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１４：１５５−１５９（２００２）；Ｖｅｒｄｕｇｏ，Ｄ．Ｅ．ら、Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．４４：２６８３−２６８６（２００１）；Ｓｈｅｎ，Ｋ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６，４７３１１−４７３１９（２００１）；ＭｃＫｅｎｎａ，Ｊ．Ｍ．ら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．４５，２１７３−２１８４（２００２）；Ｎｏｒｍａｎ，Ｔ．Ｃ．ら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１８，７４３０−７４３１（１９９６）；Ｋｕｒｕｖｉｌｌａ，Ｆ．Ｇ．ら、Ｎａｔｕｒｅ ４１６，６５３−６５７（２００２）；Ｂｅｌｓｈａｗ，Ｐ．Ｊ．ら、Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．３４，２１２９−２１３２（１９９５）；Ｆａｒｎｕｌｏｋ，Ｍ．ら、Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．８，９３１−９３９（２００１））。これらの方法のうちの１つは、タンパク質のＲＮＡアプタマーインヒビターの選択に依存し、これは次いで、標的細胞の内側で発現される（Ｆａｒｍｉｌｏｋ，Ｍ．ら、Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．８，９３１−９３９（２００１））。これらのＲＮＡ分子は、遺伝子産物の機能を特異的にブロックし得る。この仕事において、本発明者らは、この考えを構築し、標的タンパク質のインヒビターとしてＲＮＡアプタマーを、そして、この阻害を軽減し得る低分子（誘導物質）を含む、遺伝子産物の活性を時間的に制御するための方法を提示する。

本発明者らは、ＤＮＡ修復タンパク質であるホルムヨードピリミジングリコシラーゼ（Ｆｐｇ）に結合するＲＮＡアプタマーを進化させるために、ＳＥＬＥＸ方法を利用した（Ｗｉｌｓｏｎ，Ｄ．Ｓ．およびＳｚｏｓｔａｋ，Ｊ．Ｗ．，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６６，６１１−６４７（１９９９））。さらに、本発明者らは、選択に、ＲＮＡがアミノグリコシド系抗生物質であるネオマイシンを使用して、フィルター結合タンパク質から溶出する工程を導入した。このことは、本発明者らが、２ｔの基準を満たしたＲＮＡ構造のみを回収および増幅することを可能にした、重要な工程であった：（１）ＲＮＡはＦｐｇに結合しなければならず、かつ（２）Ｆｐｇ結合ＲＮＡは、ネオマイシンの存在下でタンパク質から解離しなければならない。２３ラウンドのＳＥＬＥＸおよび５つのクローンの最初の特徴づけの後、本発明者らはさらに、クローンＮ１（９１マーのＲＮＡアプタマー）の特性をさらに調べた。Ｎ１ ＲＮＡの特徴が偶然の産物でないことを確証するために、本発明者らはまた、高ストリンジェントな、非特異的溶出緩衝液を使用してＦｐｇでの選択を実施した（実験手順を参照のこと）。この選択からのクローンの１つ（Ｕ１と名付けた）は、Ｎ１と同様の親和性でＦｐｇに結合し、Ｎ１との比較のために使用した。

Ｎ１およびＵ１アプタマーは両方ともに、同様に、Ｆｐｇに結合し、Ｆｐｇを阻害するが、２つのアプタマーは、ネオマイシンの存在下で、劇的に異なる阻害活性を示した（図４、ＶｕｙｉｓｉｃｈおよびＢｅａｌ，Ｃｈｅｍ．＆Ｂｉｏｌ．９：９０７−９１３（２００２））。Ｆｐｇ活性の大半が、１００μＭのネオマイシンの存在下でＮ１によりレスキューされたが、同じ濃度のアミノグリコシドは、Ｕ１アプタマーによるＦｐｇ阻害に対して最小限の効果を有するのみであった。さらに、Ｆｐｇ活性の感知できるほどのレスキューは、１００μＭのカナマイシン（構造的にネオマイシンに関連したアミノグリコシド）を用いては観察されなかった。従って、Ｎ１アプタマーの阻害活性からＦｐｇ活性をレスキューするネオマイシンの能力は、進化したＲＮＡアプタマーの構造と選択の間に使用される低分子との両方に依存する。

ネオマイシンがＮ１アプタマーを調節することによる機能を明らかにするために、本発明者らは、二次構造予測、構造解明研究およびこのＲＮＡを用いたフットプリンティングを行った。これらの実験は、可能性のある二次構造ならびにＲＮＡ上のＦｐｇおよびネオマイシンについての同定された結合部位を示唆した。実施した選択が、Ｆｐｇおよびネオマイシンに対する重なった結合部位を有したアプタマーの単離をもたらしたことが明らかであり、これは、ネオマイシンの作用様式が、競合的なものであることを示唆する
（図６、ＶｕｙｉｓｉｃｈおよびＢｅａｌ，Ｃｈｅｍ．＆Ｂｉｏｌ．９：９０７−９１３（２００２））。興味深いことに、ネオマイシン結合部位における配列は、アミノグリコシドに結合する際に以前に関連付けられていた配列と類似する。例えば、５’−ＧＵ−３’工程（Ｇ２７およびＵ２８としてＮ１アプタマー中に存在する）が、近年、アミノグリコシドデオキシストレプトアミン環に結合することが示されている（Ｙｏｓｈｉｚａｗａ，Ｓ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４１，６２６３−６２７０（２００２））。さらに、ネオマイシン結合アプタマーは、突出部に近接したＧリッチな領域を含み、これは、Ｎ１アプタマーの５’末端に類似する（Ｗａｌｌｉｓ，Ｍ．Ｇ．ら、Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．２，５４３−５５２（１９９５））。

ＬＩＲＡ低分子対を発見するために本明細書において開発された方法は、任意の標的タンパク質またはタンパク質ドメインに対して一般的である可能性がある。このようなインヒビター／誘導物質対は、インビボでタンパク質を阻害するために使用され得、次いで、適宜所望の点において阻害を軽減し得る。このことは、分子事象のタイミングが重要である細胞現象の研究（例えば、細胞周期調節、体内時計、または初期発生の間の細胞運命の制御）に有用である。誘導物質としてネオマイシンを含む系は、その毒性に起因して細胞生物学的適用に適さない可能性がある（Ｌｅａｃｈ，Ｂ．Ｅ．ら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．７３、２７９７−２８００（１９５１））。しかし、本発明者らは、原理的な課題のこの証拠が、その役割がほとんど理解されていないタンパク質および細胞浸透性かつ無毒性の低分子を含む適用のための道を開拓すると考える。本明細書中で報告される実施例において、本発明者らは、タンパク質活性におけるスイッチとして低分子の存在を使用することを選択する。原理的には、他の条件もまた選択され得る。例えば、特定の金属イオンの有無において、または、ｐＨの変化によって標的タンパク質から解離するアプタマーが、標的タンパク質が調節され得る他の手段をもたらす（Ｅｌｉｎｇｔｏｎ，Ａ．Ｄ．およびＳｚｏｓｔａｋ，Ｊ．Ｗ．Ｎａｔｕｒｅ ３４６，８１８−８２２（１９９０））。このことは、特定の細胞コンパートメントにおいてのみ、または特定の環境刺激に応答する細胞においてのみ、タンパク質活性を調節するための方法をもたらし得る。

これらの化学遺伝学的適用に加えて、低分子により破壊される新規のタンパク質−ＲＮＡ複合体の開発が、可能性のある阻害機構のよりより理解をもたらす。実際、より多くのＬＩＲＡ／タンパク質／低分子の組み合わせが発見され、構造的、動力学的、および熱力学的に特徴付けられるにつれ、低分子による調節に対して感受性にするタンパク質−ＲＮＡ複合体の特徴を同定するための機会が存在する。この情報は、天然に存在する、機能的に重要なタンパク質−ＲＮＡ複合体の低分子インヒビターの設計に役立つ（Ｈｅｒｍａｎｎ，Ｔ．Ａｎｇｒｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．３９，１８９０−１９０６（２０００））。

（意義）
遺伝子産物の細胞機能を解読する際に機能遺伝学を補足するいくつかの化学遺伝学技術が開発されている（Ｓｐｅｃｈｔ，Ｋ．Ｍ．およびＳｈｏｋａｔ，Ｋ．Ｍ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１４：１５５−１５９（２００２）；Ｖｅｒｄｕｇｏ，Ｄ．Ｅ．ら、Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．４４．２６８３−２６８６（２００１）；Ｓｈｅｎ，Ｋ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６，４７３１１−４７３１９（２００１）；ＭｃＫｅｎｎａ，Ｊ．Ｍ．ら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．４５，２１７３−２１８４（２００２）；Ｎｏｒｍａｎ，Ｔ．Ｃ．ら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１８，７４３０−７４３１（１９９６）；Ｋｕｒａｖｉｌｌａ，Ｆ．Ｇ．ら、Ｎａｔｕｒｅ ４１６，６５３−６５７（２００２）；Ｂｅｌｓｈａｗ，Ｐ．Ｊ．ら、Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．３４，２１２９−２１３２（１９９５）；Ｆａｍｕｌｏｋ，Ｍ．ら、Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．８，９３１−９３９（２００１））。これらのアプローチのうちの１つは、インビボでその標的タンパク質を阻害するＲＮＡアプタマーを利用する（Ｆａｍｕｌｏｋ，Ｍ．ら、Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．８，９３１−９３９（２００１）；Ｔｈｏｍａｓ，Ｍ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２，２７９８０−２７９８６（１９９７））。本発明者らは、タンパク質機能のＲＮＡインヒビターが、インビトロ進化によって発見され得、そして、特異的な低分子（誘導物質）の存在下でその標的から放出されることを示すことによって、このアプローチの利用を拡大した。このことは、特定の時点における誘導物質の添加の際に再活性化され得るので、標的タンパク質活性のより時間的な制御を可能にする。この方法は、現象に関する遺伝子産物の機能を規定する際に特に有用であるはずであり、この現象においては、事象のタイミング（例えば、細胞周期、体内時計、または胚発生）が重要である。さらに、本明細書中に記載されるものと同様に、リガンドで調節されたアプタマーの深い研究において、低分子による調節に対して感受性にするタンパク質−ＲＮＡ複合体の特徴を同定する。

（一般的な実験手順）
全ての水の反応および希釈に、滅菌の脱イオン水を使用した。生化学試薬は、他に示さない限り、Ｓｉｇｍａ／Ａｌｄｒｉｃｈから入手し、制限酵素および核酸修飾酵素は、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓから購入した。オリゴヌクレオチドは、β−シアノエチルホスホラミダイトを用いて、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ／ＡＢＩ Ｍｏｄｅｌ ３９２ ＤＮＡ／ＲＮＡ合成装置で調製した。５’−ジメトキシトリチル保護２’−デオキシアデノシン、２’−デオキシグアノシン、２’−デオキシシチジンおよびチミジンホスホラミダイトを、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ／ＡＢＩから購入した。［Ｋ−^３２Ｐ］ＡＴＰ（６０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ）および［^３２Ｐ］ｐＣｐ（３０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ）は、ＤｕＰｏｎｔ ＮＥＮから入手した。貯蔵蛍光体オートラジオグラフィーを、Ｋｏｄａｋから購入したイメージ板を使用して実施した。

Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ ＳＴＯＲＭ ８４０を使用して、リンイメージ板（ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｍａｇｉｎｇ ｐｌａｔｅ）から全てのデータを得た。

（Ｆｐｇ精製）
Ｅ．ｃｏｌｉ Ｆｐｇを以前に記載されたように過剰発現させ、精製した（Ｂｏｉｔｅｕｘ，Ｓ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５，３９１６−３９２２（１９９０）；Ｌｅｉｐｏｌｄ，Ｍ．Ｄ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３９，１４９８４−１４９９２（２０００）；Ｚｈａｒｋｏｖ，Ｄ．Ｏ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２，５３３５−５３４２（１９９７））。本発明者らは、酵素が７０％活性であったと見積もった。

（ランダムライブラリーの調製）
１０５ｎｔのＤＮＡオリゴヌクレオチド（０．２ｎｍｏｌ）を３サイクルのＰＣＲ反応のためのテンプレートとして使用し、ＥｃｏＲＩクローニング部位およびＨｉｄＩＩＩクローニング部位に挟まれたＴ７プロモーターおよび６０マーのランダム領域からなる、１３０ｂｐのｄｓＤＮＡ産物を得た。このＤＮＡからの転写を、１０５ｎｔ長のランダムＲＮＡプールを作製した（Ａｂｅｌｓｏｎ，Ｊ．Ｎ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．２６７，２９１−３３５（１９９６））。

（選択）
各ラウンドにおいて、約２ｎｍｏｌのＲＮＡプールを、９５℃にて０．５ｍｌの選択緩衝液（１×ＳＢ：１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、５０ｍＭ ＮａＣｌ、２．５ｍＭ ＭｇＣｌ_２（ｐＨ７．０））中で変性させ、室温までゆっくりと冷却させた。単一の３ｍｍ濾紙ディスク（ＨＡＷＰＯ１３００，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）をＲＮＡプールに添加し、チューブを穏やかに２０分間混合した。この工程は、濾紙がＲＮＡを結合する工程を排除した。次いで、ＲＮＡプールを０．３ｎｍｏｌのＦｐｇを含むチューブに移し、穏やかに混合しつつ２０分間結合させた。遊離ＲＮＡから結合したＦｐｇを分離するために、濾紙を底に敷いた真空マニホールドを設置した９６ウェルプレート（ＭＡＶＭ０９６ＯＲおよびＭＡＨＡＳ４５１０，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いた。結合反応物をウェルにロードし、真空を１分間適用した。結合していないのＲＮＡをフィルターに通過させ、この間にＦｐｇおよび結合したＲＮＡを保持した。ＲＮＡ−タンパク質複合体を、１ｍｌの１×ＳＢで洗浄して、弱く結合するＲＮＡを取り除いた。最初の６ラウンドにおいて、Ｆｐｇ−結合ＲＮＡを、予め６５℃に加温した０．２ｍｌの尿素溶出緩衝液（１００ｍＭ クエン酸ナトリウム、７Ｍ 尿素、１０ｍＭ ＥＤＴＡ［ｐＨ５．２］）で溶出した。溶出したＲＮＡをＹＭ−１０ミクロコン（ｍｉｃｒｏｃｏｎ）濃縮器（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）にて０．５ｍｌの水で３回洗浄し、次いで、５単位のＲＮａｓｅを含まないＤＮａｓｅＩ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて、３７℃にて３時間処理した。アクセスＲＴ−ＰＣＲキット（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて各ラウンドからのＲＮＡの成功物を増幅した。６ラウンド後、ＲＮＡプールを分割し、２つの平行した選択に使用した。一方の選択は、以前と同じ尿素溶出工程を利用し、さらに８ラウンドにわたって実施した。他方の選択は、ネオマイシンを補充した１×ＳＢから構成される溶出緩衝液を利用した。この選択におけるラウンド数（最初の６ラウンドを含む）は２３であった。

（クローニング）
各選択の最終ラウンドからのｃＤＮＡをＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ（ＮＥＢ）で消化し、次いで、ｐＵＣ−１９ベクターにクローニングし、Ｅ．ｃｏｌｉ ＸＬ−１ Ｂｌｕｅ細胞に形質転換した。個々のＲＮＡクローンをコードするプラスミドを単離し、配列決定し、そして、アプタマーの生成に使用した（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ；Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）（１９８９））。

（フィルター結合アッセイ）
タンパク質−ＲＮＡ結合親和性を、フィルター結合アッセイを使用して評価した。これらを、少量（０．１ｎＭ）の５’末端標識化アプタマーを漸増する濃度のＦｐｇと混合することによって実施し、その後、室温で１５分間インキュベートした。結合および遊離のＲＮＡを真空濾過下で濾紙を使用して分離し、洗浄した。合計および遊離（フロースルー＋洗浄）ＲＮＡを、シンチレーションカウンターにより測定し、結合した分画を算出した。データをＦｐｇ濃度の関数としてプロットし、単一部位結合等式：結合分画＝［Ｆｐｇ］／（［Ｆｐｇ］＋Ｋ_ｄ）を使用してフィットさせた。

（Ｆｐｇアッセイ）
Ｆｐｇ活性アッセイを、１ｎＭ Ｆｐｇの定常条件下、１×ＳＢ中、室温にて実施した。１８マーのｄｓＤＮＡをＦｐｇ基質として使用した。８−オキソ−ｄＧ含有鎖を５’標識し、以下の配列を有した；ｄ（５’−ＴＣＡＴＧＧＧＴＣ（８−オキソ−Ｇ）ＴＣＧＧＴＡＴＡ−３’）。そして、相補鎖は、８−オキソ−ｄＧに対向するシチジンを含んだ。反応成分を１８μｌで混合し、１２分間インキュベートし、その後、２μｌの２００ｎＭ ＤＮＡ基質（２０ｎＭ終濃度）を添加した。７分後、反応を１５μｌの９５℃停止溶液（０．２×ＴＢＥ中９７％ホルムアミド、０．０２％キシレンシアノール）でクエンチし、９５℃でさらに５分間加熱した。反応物を１５％変性ＰＡＧＥで分解させ、リン画像化スクリーンを用いて可視化した。生成物の量を２０ｎＭの基質の百分率として算出し、インヒビターなしでは、これらの条件下で約２ｎＭであると測定された。

（二次構造の予測および試験）
二次構造予測を、Ｍｉｃｈａｅｌ Ｚｕｋｅｒ博士のウェブサイト、ｈｔｔｐ：／／ｂｉｏｉｎｆｏ．ｍａｔｈ．ｒｐｉ．ｅｄｕ／〜ｍｆｏｌｄ／ｍａ／ｆｏｒｍｌ．ｃｇｉ．上のウェブベースのＭＦＯＬＤプログラムを用いて実施した（Ｍａｔｈｅｗｓ，Ｄ．Ｈ．ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２８８，９１１−９４０（１９９９））。予測構造の試験を、Ｔ１、Ｓ１およびＶ１リボヌクレアーゼ消化を使用して実施した。全ての反応を、ネイティブな条件下、１０μｇ／ｍＬの酵母ｔＲＮＡ^Ｐｈｅの存在下で、１×ＳＢ中、室温で１０分間実施した。Ｓ１リボヌクレアーゼの場合、反応物を、最適活性のために０．１ｍＭ ＺｎＣｌ_２を補充した。

（Ｔ１定量的フットプリンティング）
Ｆｐｇおよびネオマイシンの両方についてのフットプリンティングを、ネイティブな条件下でＴ１ ＲＮａｓｅを用いて得た。反応を、１０μｇ／ｍｌのｔＲＮＡ^Ｐｈｅを用いて、１×ＳＢ中室温にて実施した。漸増量のＦｐｇまたはネオマイシンを１０ｎＭの標識化アプタマーと共に１０分間インキュベートし、その後１０分間酵素で消化した。反応を１５μｌの停止溶液でクエンチし、熱変性し、そして、各々５μｌを、１０％変性ＰＡＧＥで分解した。ゲルをリン画像化した後、Ｇ２７における切断効率を、コントロールレーンのバックグラウンドバンドを減算し、レーンあたりの別のローディングについての正規化することによって算出した。切断データを、ネオマイシンについての結合データに変換し、最大切断がネオマイシンによる０％占有率に対応し、最小切断がネオマイシンによる１００％占有率に対応すると見積もった。ネオマイシンによるアプタマー結合の分画を、ネオマイシン濃度の関数としてプロットし、データを単一部位結合等式：結合分画＝［ｎｅｏ］／（［ｎｅｏ］＋Ｋ_ｄ）を用いてフィットさせた。これらの結果を、３つの異なる実験についての平均および標準偏差として報告する。

（実施例２ グルコースで調節されたアプタマー）
グルコースにインシュリンレセプターアゴニストアプタマーを活性化させ、インシュリンレセプター標的を結合し、細胞によるグルコース取込みを引き起こす。

グルコースで調節されたアプタマーを調製する方法は、以下の工程を包含する：１）インシュリンレセプターアゴニスト活性およびグルコース結合活性を有するアプタマーを、ＳＥＬＥＸを用いて別個に単離する工程、２）両方の機能モチーフを含む分子の多様な配列プールを遺伝子操作する工程、ならびに３）レセプター結合活性がグルコースの存在に依存するアプタマーについて選択する工程。

あるいは、核酸分子のプールを、選択方法（２）を使用して、インシュリンレセプターの細胞外部分に結合する能力について選択する。以前の研究が、インシュリンの効果を模倣し得るＩＲ特異的抗体に対するエピトープを同定している（Ｓｔｅｅｌｅ−Ｐｅｒｋｉｎｓ，１９９０）。これらのエピトープを含有するタンパク質分画は、インシュリン模倣活性を有するアプタマーの単離についての適切な出発点である。ＩＲ特異的アプタマーの修飾単量体および二両体形態を、ＩＲの内因性レセプターキナーゼ活性を刺激する能力についてアッセイし、次いで、内因性のアゴニスト活性を有する分子を同定し得る。

インシュリン様活性を有するアプタマーの最小限の機能ドメインを使用して、ランダム配列ドメイン（例えば、Ｎ_２０）での線形濃度により強力なグルコース依存性分子のプールを構築し、定常配列プライマーにより挟み、その後の選択を容易にし得る。高い初期濃度（例えば、１００ｍＭ）のグルコースをエフェクターとして用いる選択方法（２）の適用により、グルコース調節性インシュリン模倣アプタマーを得る。

非限定的な例によって例示する目的で記載されている本発明は、ここで、添付の特許請求の範囲の精神および範囲により規定される。

図１は、ＳＥＬＥＸ方法の概略図を示す。 図２は、インシュリンを調節するためのグルコース活性化治療剤の概略図を示す。

Claims (9)

1. 第２のリガンドを認識する第２の結合ドメインに結合された第１のリガンドを認識する第１の結合ドメインを含むアプタマーであって、該第２の結合ドメインによる該第２のリガンドの結合は、該第１の結合ドメインによる該第１のリガンドの結合により調節される、アプタマー。
2. 前記第１のリガンド結合ドメインが、アロステリックエフェクター分子と特異的に相互作用し、前記第２のリガンド結合ドメインが、該アロステリックエフェクター分子の薬物標的と特異的に相互作用する、請求項１に記載のアプタマー。
3. 前記アロステリックエフェクター分子がグルコースであり、前記薬物標的がインシュリンレセプターである、請求項２に記載のアプタマー。
4. 前記第２の結合ドメインによる前記第２のリガンドの結合が、前記第１の結合ドメインによる前記第１のリガンドの結合により活性化される、請求項１に記載のアプタマー。
5. 前記第２の結合ドメインによる前記第２のリガンドの結合が、前記第１の結合ドメインによる前記第１のリガンドの結合により活性化される、請求項２に記載のアプタマー。
6. 前記第２の結合ドメインによる前記第２のリガンドの結合が、前記第１の結合ドメインによる前記第１のリガンドの結合により抑制される、請求項１に記載のアプタマー。
7. 前記第２の結合ドメインによる前記第２のリガンドの結合が、前記第１の結合ドメインによる前記第１のリガンドの結合により抑制される、請求項２に記載のアプタマー。
8. 調節されたアプタマーを選択する方法であって、該方法は、ＳＥＬＥＸを使用して、それぞれ、第１および第２のリガンドに結合する第１および第２のアプタマーを単離する工程、該第１および第２のアプタマーの結合ドメインを含む分子の多様な配列プールを操作する工程、ならびにこのプールから調節されたアプタマーを選択する工程を包含し、該第２の結合ドメインによる該第２のリガンドの結合は、該第１の結合ドメインによる該第１のリガンドの結合により調節される、方法。
9. 被験体において糖尿病を処置する方法であって、該方法は、治療有効量のインシュリンレセプターアプタマーを投与する工程を包含し、該インシュリンレセプターアプタマーは、グルコースエフェクターに結合し、該グルコースエフェクターにより活性化されて該インシュリンレセプターに結合し、そして、細胞によるグルコース取込みを開始させる、方法。

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