JP2001522454A

JP2001522454A - 細胞応答への影響に関する定量情報の抽出方法

Info

Publication number: JP2001522454A
Application number: JP54227698A
Authority: JP
Inventors: タストルプ，オーレ; ビヨルン，サラピーターセン; トゥリン，ソーレン; カスパー，アルムホルト; スクダー，クルト
Original assignee: バイオイメージエイ／エス
Priority date: 1997-04-07
Filing date: 1998-04-07
Publication date: 2001-11-13
Also published as: DE69837118T2; DE69804446D1; DK0986753T3; DE69804446T2; DE69837118D1; DK0986753T4; PT986753E; DE69824763T2; PT1199564E; EP0986753B1; US8058008B2; EP0986753B2; CA2286293C; AU6820998A; WO1998045704A2; DE1199564T1; DE69824763D1; US20030082564A1; DE69804446T3; EP1199564B1

Abstract

(57)【要約】細胞は、遺伝的に修飾されて、発光団、例えば転写因子、cGMP-又はcAMP-依存性プロテインキナーゼ、サイクリン-、カルモジユリン-又はリン脂質-依存性、又はマイトジェン活性化セリン/スレオニンプロテインキナーゼ、チロシンプロテインキナーゼ又はプロテインホスファターゼ(例えば、PKA、PKC、Erk、Smad、VASP、アクチン、p38、Jnk1、PKG、IkappaB、CDK2、Grk5、Zap70、p85、プロテインチロシンホスファターゼ1C、Stat5、NFAT、NFkappaB、RhoA、PKB)のような細胞内シグナル経路の成分に結合した修飾(F64L、S65T、Y66H)緑色蛍光タンパク質(GFP、EGFP)を発現する。この作用により、影響の程度に関連することが実験的に決定される方法で、発光団が再分布されるか、又は生細胞の成分で転位されるように、細胞内シグナル経路がモジュレートされる。再分布測定は、例えば蛍光顕微鏡及びCCDカメラからなる装置で光強度、蛍光寿命、偏向、波長シフト、共鳴エネルギー転移又は他の性質を記録して行われる。デジタル画像として蓄積したデータは、再分布の程度を示す数に処理される。この方法は、成分をモジュレートし、成分の機能に関連した疾患の治療ができる化合物を同定するスクリーニングプログラムとして用いることができる。

Description

【発明の詳細な説明】細胞応答への影響に関する定量情報の抽出方法発明の分野本発明は、細胞応答への影響、ことに細胞を細胞応答（細胞応答は細胞中の少なくとも１つの成分の再分布で現れる）に影響する物質と接触又はインキュベートさせることにより生じた影響に関する定量情報の抽出方法と手段に関する。特に、本発明は、細胞内経路に関連した少なくとも１つの成分の再分布を含む細胞内経路への影響に関する定量情報の抽出方法に関する。本発明の方法は、例えば新薬剤のスクリーニング、物質の毒性試験、公知もしくは新規薬剤に対する薬剤標識の同定に関連して、生理学的処理中の物質への影響を試験し又は見出す非常に効果的な方法として使用できる。本発明の方法と技術に関する他の価値ある用途は、以下の開示に基づくと当業者に明らかであろう。本発明の詳細な具体例では、本発明は、生物学的に活性なポリペプチド、好ましくは細胞内過程に影響する酵素の細胞内転位又は再分布を検出する方法、及びDNA構成物、及び本方法に用いる細胞に関する。発明の背景細胞内経路は、時間及び空間的に特徴的な様式でモジュレーションを行う成分のカスケードで厳密に制御される。幾つかの疾患状態は、個々のシグナル成分（すなわち、プロテインキナーゼ、プロテインホスファターゼ、転写因子）の改変した活性に起因している。従って、これらの成分それ自体が治療介入の魅力ある標識となっている。プロテインキナーゼとホスファターゼは、幾つかの細胞内シグナル経路の成分としてよく記述されている。プロテインキナーゼとホスファターゼの触媒活性は、実際上全ての制御しうる細胞過程で役割を果たしているものと推測される。細胞のシグナル化と制御でのプロテインキナーゼの改良について広範な研究がされているが、例えばシグナル事象の正確な時間及び空間的特性についての詳しい知識は、通常の技術が欠けるため、得ることがしばしば困難である。無傷の生細胞での細胞内経路の特殊なモジュレーションをモニターする新しい方法は、薬剤の発見、機能的ゲノム、毒性学、患者モニターなどに新しい機会を与えるものと考えられる。プロテインキナーゼ活性の空間的に調和の取れた統合(spatial orchestration )は、個々のプロテインキナーゼの高度な特異性に必須であるとみられる。プロテインキナーゼで媒介されるリン酸化は、ホスファターゼ活性でバランスがとられる。また、ホスファターゼ転位の群の内で例えばPTP2Cの膜ひだへの転位が観察されており[Cossetteら、1996]、同様にホスファターゼ活性を示唆しているものとみられる。プロテインキナーゼは、しばしば、活性化中及びその後に特異的な細胞内分布を示す。したがって、個々のプロテインキナーゼ又はそのサブユニットの転位過程及び／又は再分布をモニターすることは、それらの機能的活性を示すことになるであろう。ジアシルグリセロール(DAG)依存性プロテインキナーゼC(PKC)、cAM P依存性プロテインキナーゼ(PKA)[DeBernardiら、1996]やマイトジェン活性化プロテインキナーゼErk-1[Sanoら、1995]のようなプロテインキナーゼについては、転位と触媒活性化との関係が分かっている。プロテインキナーゼとホスファターゼの細胞内局在／活性の検出に普通に用いられる方法は、免疫沈降、ウェスタンブロッティング及び免疫細胞化学検出である。ジアシルグリセロール(DAG)依存性プロテインキナーゼC類（PKC類）の群を例にとると、異なる組織と細胞に分布する個々のPKCイソ型は、異なる活性化因子の必要条件を有し、活性に応じて異なる転位をすることが分かっている。触媒的に不活性なDAG依存性PKC類は一般に細胞質中に分布しており、そのため、活性化により、異なる細胞成分、例えば原形質膜[Farese,1992][Fulop Jrら、 1995]、核[Khalilら、1992]、細胞骨格[Blobeら、1996]と結合するよう転位する。PKC活性化を示す転位現象は、異なる方法を用いてモニターされた。すなわちa )細胞の浸透と固定化の後に、個々のイソ型の局在が検出できる免疫細胞化学[Kh alilら、1992]、及びb)蛍光標識ホルボルミリステートアセテート(PMA)での全てのDAG依存性PKCイソ型の標識[Godsonら、1996]、及びc)発蛍光団Cy3でのPKC b1 の化学標識[Bastiaens及びJovin，1996]及びd)PKCα[Schmidtら、1997]及びPKC γ及びPKCε[Sakaiら、1996]の遺伝子標識である。最初の方法は、後者の方法のような劇的な情報を提供しない。蛍光標識ホルボルミリステートアセテートでの PKCの標識化では、PKCの異なるDAG依存性イソ型を区別できないが、全てのイソ型の動きを標識し、示すであろう。特異的なDAG依存性PKC類を化学的かつ遺伝的に標識すると、活性化により、それらが特異的なイソ型の様式で細胞周辺又は核に移動することが分かった。代わりの方法としては、生細胞中でキナーゼサブユニットの１つを化学的に標識することにより、プロテインキナーゼA活性が測定される[Adamsら、1991]。その方法論は、精製プロテインキナーゼAの制御及び触媒サブユニットをそれぞれフルオセインとローダミンで標識することに基づく。プロテインキナーゼAは、低いcAMPレベルでヘテロテトラマー型に集合され、蛍光共鳴エネルギーを２つの蛍光色素間で転移させる。プロテインキナーゼAの活性化は複合体の解離を生じ、それによりエネルギー転移を除く。この技術の欠点は、対象の細胞に標識したプロテインキナーゼAをマイクロインジェクションしなければならないことである。この高度に非侵入性の技術は煩雑で、生理活性物質の大規模なスクリーニングに適用できない。本発明と比較すると、この技術の別の欠点は、標識プロテインキナーゼAが導入遺伝子として生物／動物に挿入できないことにある。最近、哺乳類細胞を含む多数の異なる細胞タイプで発現される緑色蛍光タンパク質(GFP)が高度に蛍光性になったことが見出された[Chalfieら、1994]。WO 95/ 07463号は、GFPを発現できる細胞と対象のタンパク質を細胞中で検出する方法を記載しいる。この方法は、GFPをエンコードするDNA配列に結合した対象のタンパク質をエンコードするDNA配列を有するDNA分子を細胞に導入することに基づいており、それ故、DNA分子で産生されるタンパク質はGFPに融合した対象のタンパク質を有し、次いで、融合タンパク質を発現させる条件下で細胞を培養し、細胞中の蛍光の局在を検出し、それにより細胞中に対象のタンパク質を局在化するものである。しかし、このような融合タンパク質の例は挙げられておらず、シグナル経路に関与するタンパク質(例えば、プロテインキナーゼ又はホスファターゼ)のような、活性化により細胞内過程に影響する生物活性ポリペプチドの転位又は再分布の検出又は定量にGFPとの融合タンパク質を用いることは、示唆されていない。さらに、WO 95/07463号は、生物サンプル中のホルモンや重金属のような分子の検出に有用な細胞を記載している。これは、対象の分子で作用される遺伝子の調節要素をGFPに作動的に結合させることによるもので、分子の存在が調節要素に影響し、次いでGFPの発現に影響するであろう。このように、GFPをエンコードする遺伝子は、特異的な分子の同一性の存在をモニターするために構築される細胞中のレポーター遺伝子として使用される。緑色蛍光タンパク質は、グルココルチコイドレセプター(GR)の転位検出用アッセイに使用されている[Carey，KLら、The Journal of Cell Biology，V ol.133，No.5，p985〜996(1996)]。GR-S65TGFP融合体が、サイトゾル（リガンドなしで存在する）から核細孔を経てリガンド結合後に残存する核へのアゴニストデキサメタゾンに応じたグルココルチコイドレセプター(GR)の転位に関与するメカニズムを研究するのに用いられている。GR-GFP融合体の使用により、蛍光シグナルの核／原形質割合のリアルタイムの画像化と定量が可能となる。プロテインキナーゼ活性に影響する化合物を見出すために設計された最近使用された多くのスクリーニングプログラムは、人工又は天然物のキナーゼリン酸化、レセプター結合及び／又はレポーター遺伝子発現の測定に基づいている。発明の開示本発明は、再分布(redistribution)を含む細胞システムの研究に重要で新規な局面を提供するもので、影響、代表的には化学物質又はその混合物との接触、また物理的環境の変化によって生じる再分布応答又は事象を定量化する。定量化は、細胞システムへの影響（又は影響の度合）と再分布応答との有意な関係を数値に表し、又は曲線あるいはグラフに表すことを可能とする。これは、非常に有利である。なぜなら、定量化が、迅速かつ再現可能なようにともになされることが見出されており、かつおそらくより重要なことには、本発明の方法を定量的に利用できるようになったシステムは、莫大な量の新しい情報と洞察を導きうるシステムであるからである。本発明のスクリーニングアッセイは、他のスクリーニングアッセイ、例えばレセプター結合アッセイ、酵素アッセイ及びレポーター遺伝子アッセイより明確な利点を有しており、完全に新しい作用様式（例えば、酵素活性の阻害／活性化よりむしろ、その作用の調節方法として生物活性ポリペプチドの再分布／転位を阻害又は促進）を有する生物活性物質が、特定のイソ型の生物活性ポリペプチドに対する非常に高い選択性と、さらに他のイソ型の同じ生物活性ポリペプチドもしくは同じシグナル経路の他の成分に対する化合物選択性の展開を保障するように同定できる。最も広い観点によれば、本発明は、細胞応答への影響に関する定量的情報の抽出方法に関し、その方法は、発光団から放射された空間的な分散光中で、機械的に無傷の生細胞又は機械的に無傷な生細胞類への影響で生じた変動を記録し(発光団は細胞（類）に存在し、影響の度合に関連するように再分布可能であり、かつ／又は影響の度合に関連するように再分布可能な成分でモジュレートされ、その関連性により発光団の発光特性のモジュレーションが生じる)、かつ発光団からの空間的な分散光を検出、記録し、かつ記録された空間的な分散光の変動を処理して、影響の度合に対する空間分散又は空間分散での変化に関する定量的情報を与えることからなる。本発明の好ましい具体例では、細胞（類）に存在する発光団は、細胞内経路の少なくとも１つの成分の再分布に関連しているように、細胞内経路のモジュレーションにより再分布しうる。本発明の他の好ましい具体例では、発光団は発蛍光団である。細胞本発明において、細胞及び／又は細胞類は、実験を通じて機械的に無傷で生きている。本発明の他の具体例で、細胞（類）は、予め応答が有意であると決められた影響の付加後の時点で固定され、任意の後の時間で記録される。機械的に無傷の生細胞（類）は、酵母細胞（類）のような菌類細胞（類）、昆虫細胞（類）を含む無脊椎動物細胞（類）及び哺乳類細胞（類）のような脊椎動物細胞（類）からなる群より選択できる。この細胞（類）は、影響が観察される期間中、30℃以上の温度、好ましくは32℃〜39℃の温度、より好ましくは35℃〜38℃の温度、最も好ましくは約37℃の温度で培養される。発明の１つの観点では、機械的に無傷の生細胞は、同一又は非同一細胞のマトリクスの一部である。本発明に使用される細胞は、ここに定義する融合ポリペプチドをエンコードする核酸構成物を含有し、構成物でエンコードされた配列を発現できる。細胞は、酵母細胞のような菌類細胞、昆虫細胞を含む無脊椎動物細胞、哺乳類細胞のような脊椎動物細胞からなる群から選択される真核細胞である。好ましい細胞は、哺乳類細胞である。本発明の他の観点では、細胞は、その細胞成分の少なくとも１つに、ここに定義する融合ポリペプチドをエンコードする核酸配列を有し、この核酸配列を発現できる生物に由来する。生物は、単細胞生物及び哺乳類のような多細胞生物からなる群から選択される。発光団発光団は、影響の程度に関連した空間分散光を放射することにより、再分布を可視化及び／又は記録させる成分である。本発明の１つの具体例で、発光団は、生理学的に影響の度合に関連しているように、再分布されることができる。他の具体例では、発光団は、生理学的に影響の度合に関連しているように再分布され得る成分と会合しうる。他の具体例では、発光団の再分布と影響の度合との発光団の相関関係が、実験的に決定できた。好ましい発明の観点では、発光団は、細胞内経路の少なくとも１つの成分と実質的に同様に再分布され得る。本発明のさらなる他の具体例では、発光団は、経路のモジュレーションで再分布される成分との空間的会合を瞬滅でき、その瞬滅は発光強度の変化として測定される。発光団は、発蛍光団であってもよい。好ましい発明の具体例で、発光団は、細胞（類）に有されるヌクレオチド配列でエンコードされ、発現されるポリペプチドであってもよい。発光団は、その１つが発光性ポリペプチドからなり、他の１つがここで定義するような生物活性ポリペプチドからなる２つのポリペプチドで、各々の少なくとも一部分の融合体からなるハイブリッドポリペプチドであってもよい。発光性ポリペプチドは、ここに定義のGFPであってもよく、又はF64L-GFP、F64 L-Y66H-GFP、F64L-S65T-GFPやEGFPのようなここに定義するF64L変異を有する緑色蛍光タンパク質からなる群から選択できる。GFPは、任意にぺプチドリンカーを介して、生物活性ポリペプチドもしくはその一部あるいはサブユニットにN-又はC-末端標識されてもよい。蛍光プローブは、細胞内シグナル経路の成分であってもよい。プローブは、核酸構成物でコードされる。本発明で研究の経路は、細胞内シグナル経路であってもよい。影響本発明の好ましい具体例で、影響は、機械的に無傷の生細胞又はその群と化学物質との接触、及び／又は機械的に無傷の生細胞又はその群と化学物質との培養でありうる。影響は、細胞内過程をモジュレートするであろう。１つの観点で、モジュレーションは、細胞内過程の活性化であってもよい。他の観点では、モジュレーションは、細胞内過程の不活化であってもよい。なお他の観点では、影響は、細胞内過程の成分の代謝活性を直接影響することなく、再分布を阻害又は促進する。１つの具体例では、本発明をスクリーニングプログラムの基礎として使用し、化合物ライブラリーのような未知の影響の作用を、標準化した条件下での既知の参照化合物の影響と比較できる。記録基礎をなす細胞現象への影響の効果でモジュレートされ、それ故に本発明に使用できる蛍光又は発光には、強度に加えて幾つかのパラメータがある。例えば、共鳴エネルギー転移、蛍光寿命、偏光、波長シフトである。これらの方法は、それぞれ放射光路に特定種類のフィルターを要し、所望の光成分を選択して他の成分を拒絶する。光の性質の記録は、CCDアレイ(array)のような順序アレイ値(ordered array of values)又はビディコンチューブのような真空チューブ装置の型であってもよい。本発明の１つの具体例で、発光団で放射された空間分散光は、発光団と発光団にエネルギーを伝達しうる他の発光体（その各々は、細胞内経路の特定成分の一部となるか、それらと結合又は会合するよう選択もしくは設計されている）との共鳴エネルギー転移の変化によって検出できる。この具体例で、発光団又は発光団にエネルギーを伝達しうる発光体は、いずれも影響に応じて再分布を行う。共鳴エネルギーの転移は、発光団からの放射強度変化として測定され、好ましくは、非空間的に解像した様式で発光団の平均強度のみに反応する単チャンネルの光検出器(photodetector)によって検知される。本発明の他の具体例では、空間分散光の記録は、影響の付加後の単一時点で行うことができる。他の具体例で、記録は、影響の付加前の１つの時点と、付加後の他の時点の２つの時点でなすことができる。結果又は変動は、影響又はモジュレーションの前に測定した蛍光に比較した蛍光の変化で決められる。本発明の他の具体例では、記録は一連の時点で行うことができ、影響の付加は一連の記録での第１時点後の数回で行い、記録は、例えば、0.1秒〜１時間、好ましくは１〜6 0秒、より好ましくは１〜30秒、特に１〜10秒の所定の時間隔で、１秒〜12時間、例えば10秒〜12時間、10秒〜１時間、60秒〜30分又は20分の期間で行うことができる。結果又は変動は、時間に対する蛍光の変化で決定される。また、結果又は変動は、時間に対する蛍光の空間分布での変化として決定することができる。装置発光団から放射される空間分散発光の記録は、細胞（類）中の蛍光の分布、及びそれによる細胞（類）中の蛍光分布の変化を測定する装置で行われる。その装置は、最低でも次の構成部を含む：(a)光源、(b)タンパク質の蛍光を励起する光源からの光波長の選択手段、(c)励起光をシステムの残部に急速にブロック又は通過させることができる装置、(d)励起光を試料に運び、空間的に解像した様式で放射蛍光を回収し、かつこの蛍光放射から画像を形成する一連の光学部材、(e) 一連の光学部材に対し所定のジオメトリーで測定される細胞の容器を保持するベンチもしくはスタンド、(f)空間的に解像した蛍光を画像の形で記録する検出器、(g)記録した画像を捕捉して蓄積し、かつ記録した画像から再分布の度合を計算するコンピューター又は電子システム及び関連ソフトウェア。本発明の好ましい具体例で、装置システムは自動化される。１つの具体例で、上記ｄとｅでの構成要素は、蛍光顕微鏡からなる。１つの具体例で、上記ｆの構成要素は、CCDカメラである。１つの具体例で、画像は、光学スキャンシステムで形成、記録される。１つの具体例で、前もって所定の時点で細胞ホルダー中の細胞の何れかもしくは全部に既知もしくは未知化合物を添加するのに、液体添加システムが用いられる。液体添加システムは、コンピューター又は電子システムの制御下にあるのが好ましい。このような自動化システムは、その能力によって、操作をする人が手動で装置を用いて行うより多数の試験化合物を結果づけるため、スクリーニングプログラムに使用できる。影響の定量化発光団から放射された光に関する変動又は結果の記録は、空間分散光を１以上のデジタル画像として記録することによって行われ、記録した変動を１以上の代表的な再分布の度合に縮小するための処理は、デジタル画像処理方法又はその組合せからなる。細胞内経路に対する影響への細胞応答の度合又は影響の結果を示す定量的な情報は、同様に記録した応答又は結果に基づいて、関連の特異的な影響の既知の度合に予め行った較正に従った記録（類）から抽出される。この較正手法は、次に記載の原理により開発されている(Devel oping an Image-based Assay Technique)。特定のアッセイ方法の詳細な記載を実施例に示す。画像（類）を代表的な値に縮小するのに必要な段階的手法は各アッセイに特定であるが、個々の工程は、一般に周知の画像処理方法である。個々のステップの例としては、減法混色(subtraction)、比較的拡大・縮小(rationing)、及び感度限界のようなポイント処理、平滑化、先鋭化、エッジ検出のようなデジタル・フィルタリング法、フーリエ・フィルタリング、画像相互相関法及び画像自動相関法、対象物発見と分類(ブロブ解析)、視覚化カラー空間操作のような空間周波数法がある。アルゴリズム手法に加えて、ニューラル・ネットワークのような帰納的方法も用いられる。核酸構成物本発明に使用される核酸構成物は、その核酸配列に、細胞内シグナル経路の成分である生物活性ポリペプチドからなる融合ポリペプチド又はその一部、及びGF P、好ましくはGFPのF64L変異体（任意にペプチドリンカーを介し、生物活性ポリペプチド又はその一部にN又はC末端融合したもの）をエンコードする。１つの具体例では、核酸構成物でエンコードされる生物活性ポリペプチドは、プロテインキナーゼ又はホスファターゼである。１つの具体例では、核酸構成物でエンコードされる生物活性ポリペプチドは、活性化により細胞局在を変える転写因子又はその一部である。１つの具体例では、核酸構成物でエンコードされる生物活性ポリペプチドは、細胞骨格ネットワークと結合し活性化で細胞局在を変えるタンパク質又はその一部である。１つの具体例では、核酸構成物でエンコードされる生物活性ポリペプチドは、活性化で細胞局在を変えるプロテインキナーゼ又はその一部である。１つの具体例では、核酸構成物でエンコードされる生物活性ポリペプチドは、活性化で細胞内局在を変えうるセリン／スレオニンプロテインキナーゼ又はその一部である。１つの具体例では、核酸構成物でエンコードされる生物活性ポリペプチドは、活性化で細胞内局在を変えうるチロシンプロテインキナーゼ又はその一部である。１つの具体例では、核酸構成物でエンコードされる生物活性ポリペプチドは、活性化で細胞内局在を変えうるリン脂質依存性セリン／スレオニンプロテインキナーゼ又はその一部である。１つの具体例では、核酸構成物でエンコードされる生物活性ポリペプチドは、活性化で細胞局在を変えうるcAMP依存性プロテインキナーゼ又はその一部である。好ましい例では、核酸構成物でエンコードされる生物活性ポリペプチドは、PK Ac-F64L-S65T-GFP融合体である。１つの具体例では、核酸構成物でエンコードされる生物活性ポリペプチドは、活性化で細胞局在を変えうるcGMP依存性プロテインキナーゼ又はその一部である。１つの具体例では、核酸構成物でエンコードされる生物活性ポリペプチドは、活性化で細胞局在を変えうるカルモジュリン依存性セリン／スレオニンプロテインキナーゼ又はその一部である。１つの具体例では、核酸構成物でエンコードされる生物活性ポリペプチドは、活性化で細胞局在を変えうるマイトジェン活性化セリン／スレオニンプロテインキナーゼ又はその一部である。好ましい具体例で、核酸構成物でエンコードされる生物活性ポリペプチドは、ERK1-F64L-S65T-GFP融合体又はEG FP-ERK1融合体である。１つの具体例では、核酸構成物でエンコードされる生物活性ポリペプチドは、活性化で細胞局在を変化しうるサイクリン依存性セリン／スレオニンプロテインキナーゼ又はその一部である。１つの具体例では、核酸構成物でエンコードされる生物活性ポリペプチドは、活性化で細胞局在を変えうるプロテインホスファターゼ又はその一部である。本発明の１つの好ましい具体例で、核酸構成物はDNA構成物であってもよい。１つの具体例で、核酸構成物でエンコードされる生物活性ポリペプチド１つの具体例で、核酸構成物でGFPをエンコードする遺伝子は、エクオレア・ビクトリア(Aequorea victoria)から誘導される。好ましい具体例で、核酸構成物でGFPをエンコードする遺伝子は、F64L-GFP、F64L-Y66H-GFP及びF64L-S65T-GF Pから選択されるEGFP又はGFP変異体である。本発明の好ましい具体例で、DNA構成物は、SEQ ID NO:38、40、42、44、46、4 8、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、108、110 、112、114、116、118、120、122、124、126、128、130、132、134、136、138、 140、142に示すDNA配列の何れかで同定されるか、又は、同じ融合ポリペプチドもしくはそれらに生物学的に等価な融合ポリペプチド(例えば、イソ型)、又はスプライス変異体又は別の種由来のホモログをエンコードしうるこれらの配列の変異体である。スクリーニングプログラム本発明は、直接又は間接的に細胞内シグナル経路に影響し、この性質のため医薬として潜在的に有用な生物活性物質を同定するためのスクリーニングプログラムの確立に使用できる方法を記載する。細胞内シグナル経路の活性化又は非活性化で分布を変化させる発光団から空間的に解像した発光の再分布を生細胞中で測定することに基づくと、スクリーニングされる各物質の個々の測定結果は、潜在的な生物活性を示す。本発明の１つの具体例で、スクリーニングプログラムは、細胞内シグナル経路での干渉により毒性作用を奏する、ここに定義するような生物学的に毒性の物質の同定に使用される。細胞内シグナル経路の活性化又は非活性化で分布を変化させる発光団から空間的に解像した発光の再分布を生細胞中で測定することに基づくと、スクリーニングされる各物質の個々の測定結果は、潜在的な生物毒性活性を示す。スクリーニングプログラムの１つの具体例で、ここに定義するような細胞内経路の成分をモジュレートする化合物が見出されており、化合物の治療量が本発明による方法で推定されている。好ましい具体例では、本発明は、生物活性ポリペプチドの細胞内機能に関連した症状又は疾患の患者に、本発明の方法のいずれかで発見された化合物の有効量を投与することからなる、前記症状又は疾患の新しい治療方法の発見を導くものである。本発明の他の好ましい具体例では、細胞内シグナル経路の成分である生物活性ポリペプチドの群から、新しい薬剤のターゲット又は幾つかの新しい薬剤のターゲットを同定する方法が、確立される。本発明の他の具体例では、慢性疾患の治療に用いられた入手可能な医薬を、患者の１つ又は幾つかの組織から得た関連する一次細胞（類）について試験する、選定した慢性疾患患者に選択的な治療をするための個々の治療管理が確立される。これは、本発明の蛍光プローブをエンコードする少なくとも１つのDNA配列で細胞（類）をトランスフェクトし、トランスフェクトした細胞（類）を患者に戻すか、又は前記プローブを発現させる条件下で細胞（類）を培養して入手可能な医薬のアレイにさらし、次いで、無傷生細胞（類）の蛍光プローブの蛍光パターン又は再分布パターンの変化を比較して特異的な医薬に対する細胞応答を検出し(細胞作用プロフィルを得る)、次いで所望の活性と許容できる副作用レベルに基づいて１以上の医薬（類）を選択し、これらの医薬の有効量を選択した患者に投与することからなる方法を用いる。シグナル変換経路のバックトラッキング(Back-tracking) 本発明は、ここに定義するようなシグナル変換経路をバックトラックするスクリーニングプログラムを確立するのに使用できる方法を記載するものである。１つの具体例では、スクリーニングプログラムは、研究中の細胞内シグナル経路の活性化又は不活化により分布を変化させる幾つかの発光団から空間的に解像した発光の再分布に対する化合物（類）の影響を継続的に又は平行して試験することにより、１又は幾つかの化合物が特異的なシグナル変換経路に影響するレベルをより正確に確立するのに使用される。プローブの構築と試験一般に、プローブすなわち“GeneX”-GFP融合体又はGFP-“GeneX”融合体は、 “GeneX-”特異的プライマーでPCRを用い、次いでフレームを合わせてGFPと“Ge neX”を融合するクローニング工程で構築される。融合体は、“GeneX”とGFP間に短いベクター由来の配列（例えば、プラスミド中のマルチクローニング部位領域の一部）を含み、得られる融合タンパク質の“GeneX”とGFPとの間にペプチドリンカーを生じてもよい。詳細な段階的手法 -遺伝子配列の同定：これは、遺伝子情報の寄託所、例えば分子生物学者に広く利用され、通常使用されているGeneBank Sequence Databaseを検索することで、もっとも容易になされる。下記の詳細な実施例には、対象の遺伝子のGeneBank受託番号を記載する。 -遺伝子特異性プライマーのデザイン：PCR反応に用いられる遺伝子特異性プライマーのデザインは、遺伝子配列を見れば可能である。代表的なものとして、トップ-ストランド(top-strand)プライマーは遺伝子のATG開始コドンと次の約20ヌクレオチドを包含し、遺伝子がGFPの後に融合される場合、すなわちGFP-“GeneX” 融合体の場合は、ボトム-ストランド(bottom-strand)プライマーは停止コドンと約20の先行ヌクレオチドを包含する。遺伝子がGFPの前に融合され、つまり“Gen eX”-GFP融合体である場合には、停止コドンは避けなければならない。任意に、 GeneXの全長配列は融合体に使用されないが、シグナルに応じてGeneXのように局在化し再分布する単なる部分は使用される。プライマーは、遺伝子特異性配列に加えて、その後にPCR産物をクローニングさせるため、制限酵素用の認識配列を少なくとも１つ含む。部位はPCR産物にユニークで、クローニングベクターの部位と適合性であるように選択される。その上、融合遺伝子及び／又は翻訳開始共通配列の読み枠を正確なものにするため、制限酵素部位と遺伝子特異的配列との間に正確な数のヌクレオチドを含めることが必要であろう。最後に、プライマーは、制限酵素部位の前に数個のヌクレオチドを常に含むことにより、酵素での消化を効率よくする。 -増幅すべき遺伝子源の同定：PCR反応で遺伝子特異性プライマーとの産物をつくるため、遺伝子配列は、例えばcDNAの型で反応当初から存在しなければならない。GenBankでの情報又は科学文献は、遺伝子が発現される組織（類）を通常示しており、様々な種の多様な組織又は細胞系由来のcDNAライブラリーが市場で入手可能である(例えばClontech[Palo Alto]、Stratagene[La Jolla]及びInvitrogen [San Diego])。また、多くの遺伝子は、The American Type Tissue Collection[ Virginia]からクローン形態で入手可能である。 -PCR反応の最適化：幾つかの因子が、プライマーのアニーリング温度、反応物に存在するイオン、特にMg²⁺とK⁺の濃度、ならびに反応のpHを含むPCR反応の効率と特異性に影響することが知られている。PCR反応の結果が不十分であると思われる場合は、上記のパラメータが最適でないことによるであろう。各種のアニーリング温度は、内蔵の温度勾配を有するPCR装置（例えば、Stratagene[La Jolla ]から入手可能）で試験すべきで、かつ／又は各種バッファー組成物、例えばOpt iPrime緩衝システム(Stratagene[La Jolla])を使用すべきである。 -PCR産物のクローニング：増幅遺伝子産物をクローンし、GFPと融合させるベクターは、プライマーを設計する際にすでに考慮すべきである。ベクターを選択するとき、プローブの発現を制御するプロモーターが細胞と適合性であるように、その後どの細胞系でプローブを発現させるかを少なくとも考えるべきである。大抵の発現ベクターは、安定なトランスフェクタントを作りたい場合に有用な特徴である選択マーカー（例えば、薬剤耐性付与）も１以上含有する。また、選択マーカーは、使用される細胞と適合性であるべきである。 PCR産物の実際のクローニングは、２つの異なる制限酵素で消化したフラグメントを同じ２つの酵素で消化したベクターに一工程でクローニングするのが代表的であるように、困難性はない。クローニングに問題があるとすれば、制限酵素がPCRフラグメントに十分に作用しなかったことによるものと思われる。この場合、プライマーの末端により長いイクステンション(extension)を加えれば、フラグメント近くの消化に関する困難性を解消でき、制限酵素消化に基づかない中間クローニング工程を導入できる。幾つかの会社が、この方法システムを提供している（例えばInvitrogen[San Diego]及びClontech[Palo Alto])。遺伝子がクローン化され、その工程でGFP遺伝子と融合されれば、予想したものか否かを確かめるため、得られた産物（通常プラスミド）を注意深く調べるべきである。最も正確な試験により、融合遺伝子のヌクレオチド配列が得られる。プローブの試験プローブのDNA構成物が得られると、その機能性と有用性は次の試験に付すことにより試験できる。 -プローブを発現しうる細胞への構成物のトランスフェクション：細胞の蛍光を、その後速やかに、通常翌日調べる。この点で、細胞の蛍光についての２つの特徴、強度とサブ細胞の局在が認められる。強度は、通常、少なくとも細胞中の非融合GFPと同じ強さであるべきである。そうでない場合は、プローブ-DNAの配列又は質に欠陥があるので注意してチェックすべきである。サブ細胞の局在は、プローブが十分に機能する可能性があるか否かを示している。対象の遺伝子が予期されたように局在し、例えば核から除かれていれば、直ちに機能試験に付すことができる。プローブがトランスフェクション処理後に速やかに局在されなければ、この時点での過剰発現が原因と思われる。というのは、細胞が非常に多数のプラスミドコピーを採取するのが通常であるからで、プラスミドコピー数と発現レベルが減少するにつれて、まもなく、局在化が例えば2 〜3週間以内に生ずる。局在化が長時間起こらない場合は、GFPへの融合が局在化機能を破壊、例えば通常の細胞アンカープロテインとの相互作用に必須のタンパク質配列がマスクされたことによるのであろう。この場合、反対の融合が作用する可能性がある。例えばGeneX-GFPが作動しないと、GeneXの２つの異なる部分が GFP近傍で影響されて、GFP-GeneXを生じる可能性がある。これが作動しなければ GFPの何れもの末端の近傍が問題となるが、これは、DNA構成物中のGeneXとGFPとの間により長いリンカーを挿入することにより距離を増すことができる。局在化に関する先の知見がなくて、局在化が観察されない場合は、GFPに融合したタンパク質の性質に起因して、この時点でプローブは局在化されてないはずである。次いで、それは機能試験に付すべきである。機能試験では、通常シグナル経路（プローブは、それ自体細胞内で再分布することにより伝達すると予期される）を活性化することにより、不安定にすることが知られている少なくとも１つの化合物とプローブ発現細胞を処理する。再分布が予期される場合、例えば先の知見が場所Xから場所Yへの転位を示している場合には、最初の重要な試験がとばされる。この場合、応答の特徴づけと定量化をさらに進めることができる。予期したように行われないとすれば、これは、細胞がシグナル経路の少なくとも１つの成分、例えば細胞表面レセプターを欠いているか、又は種の不適合性（例えば、プローブがヒト遺伝子産物の配列情報でモデル化されている場合に、細胞がハムスター由来）による可能性がある。いずれの場合にも、他の細胞タイプは、これらの潜在的な問題があてはまらない試験方法で同定すべきである。再分布パターンについての先行知見がなければ、再分布の分析は、本質的で暗示的な特徴が何であるかを同定するため、より完全に行う必要がある。特徴が明らかな場合は、応答のさらなる特徴づけと定量化を進めることができる。再分布の特徴が同定できなければ、上記したごとき問題がありうるので、プローブはより最適な細胞条件下で再試験すべきである。プローブが最適細胞条件下で機能しない場合は、最初の段階に戻る。画像ベースのアッセイ技法の開発画像ベースの再分布アッセイの開発方法は、再分布現象が目視可能な計画されていない実験観察か、または既に起こることが知られた再分布現象を特異的に追跡するプローブのデザインから始まる。何れの場合も、最初で最良の調査技術というのは、熟練科学者または技術者が現象を観察することである。コンピューター技術の急速な発展でも、ヒトの目−脳の組合せが、いまなお既知の最も強力なパターン認識システムで、生データ中の潜在的に重要で有用なパターンを見出すのにシステムの事前知識を要しない。このことは、ことにデータがヒトの目視工程用の天然の“データタイプ”という画像の形で提供されるとき、あてはまる。ヒトの目視工程は、比較的狭い周波数範囲で最も効果的に作用する。すなわち、我々の視野で非常に速い又は非常に緩やかな変化を見ることができないため、データを記録し、時間を拡張又は圧縮して表わす必要があろう。発光現象には、ヒトの目で直接見ることができないものがある。例えば、偏光と蛍光寿命である。しかし、適当なフィルター又は検出器を用いると、これらのシグナルを画像又は一連の画像として記録でき、上記のようにヒトに表示できる。このようにして、パターンが検出でき、同じ方法が適用できる。再分布が再現性のある現象であると決定されると、データからの定量情報の抽出手順を開発するために１以上のデータセットが生じる。平行して、生物学的及び光学的条件が、アッセイについて最高品質の生データが得られるように決定される。これは、反復方法となり得る。すなわち、アッセイ条件の操作に関するアッセイへの影響を評価するため、定量法を開発する必要があろう。データセットは、生物学的現象の知識を有し、画像処理技術の使用に熟練した人によって調査する。この操作は、「応答」の記録を構成する画像又は一連の画像を、応答の程度に対応する値に換算する方法を決定するか少なくとも提案することを目標とする。相互作用画像処理ソフトウエア又は画像処理ツールボックス及びプログラム用言語の何れかを用いると、方法は、画像を取り込み、応答の程度を（何れかの単位で）出力する方法又はアルゴリズムとして記号化される。特定の方法の有効性を評価する基準の幾つかは、次のとおりである：・応答の程度が生物学的に意味あるように変化するか、すなわち刺激剤の濃度又は条件に既知又は推定の従属性を示すか、・応答の程度が再現しうるか、すなわち、同じ刺激剤の濃度もしくはレベル又は条件で許容変動に同じ応答を生じるか、・応答の動的範囲がアッセイの目的に十分か、もし十分でなければ、方法又はパラメータの１つの変化で動的範囲を改良できるか、・方法がいずれかの明らかな“病理性”を示すか、すなわち、画像処理で普通に起こる欠陥があると応答に対するおかしな値を生じるか、これらの病理性を削除、制御又は説明できるか、・方法は、画像の細胞の数及び／又は大きさの正常変動で扱えるか。方法には、明瞭である場合があり、他方、数多くの可能性が考えられる場合もある。１つの方法が他より明らかに優れているとしても、パラメータの最適化が必要である。各種の方法がデータセットに適用され、上で示唆した基準が決定されるか、又はシグナル、ノイズ、レンジ(range)などの最も満足すべき組合せに至るまで、パラメータの調節に単一手法が繰り返し適用される。これは、何らかのタイプの単チャンネルセンサーの較正に等しい。画像から単一の値を抽出する方法は非常に多くあり、この数を小さく特定数に縮小するには、可能性のある方法の最初の工程に理知的なアプローチが必要となる。到達した方法が必ずしも最良の方法であるとは言わないが、最良の方法についての広範な研究は、関与している可能性の数のために問題とならないだけである。画像ベースのアッセイは他のアッセイ法と異ならず、その有用性は、アッセイが作動するサンプルの所望成分、動的範囲、変動、感度、濃度範囲に対する特異性のようなパラメータや他のこのようなパラメータによって特徴づけられる。アッセイを使用する前に、これらの各々及び全てを特徴付ける必要はないが、１つのアッセイを他と比較する唯一の方法を示す。実施例：GLUT4転位の定量アッセイの開発 GLUT4は細胞グルコース摂取に重要なグルコース輸送分子群の１つである。グルコース摂取についての刺激のある条件下で、原形質膜を転位することが知られている。グルコース摂取を実際に測定せず、グルコース摂取応答を非侵襲的に目視できれば、例えばタイプII糖尿病の治療を調べるのに非常に有用なアッセイとなる。ヒトインシュリンレセプターを安定的に発現するCHO細胞系を、GLUT4とGFPとの融合体を安定的に発現する新しい細胞系のベースとして用いた。この細胞系は、GFPの移動で目視されるようにGLUT4の原形質膜への転位を示すことが期待された。転位は、特長的な形態又はパターンを有する原形質膜領域で、蛍光の局所増加を生じる形で明確に見ることができる。これを図12に示す。これらの目的物は、“スニルクルズ(snircles)”として知られ、この出現の現象が“スニルクリング”として知られる。この出現を定量するため、これを画像視野内で目的物として隔離し、次いで数え、その面積を測定するか、又は細胞がさらされるインシュリン濃度に対して用量-依存の形で相関するスニルクルズについての幾つかのパラメータを決定する方法を見出した。スニルクルズを分離するため二値化手法（binarization procedure）を用い、比較的厳しいガウス核（ gaussian kernel）(シグマ=2.5)で平滑化した画像の１つのコピーを、比較的緩いガウス平滑のみを付与（シグマ=0.5）した他のコピーから除いた。得られた画像は、その最小／最大レンジに較正し、自動閾値を付与して画像を２つのレベルに分けた。閾値化した画像は、一方の値のバックグランドと、他方の値を有する見出された全目的物を含む。見出された目的物は、まずフィルターを介してろ過し、スニルクルズであるのにあまり大きすぎたり小さすぎたりする目的物を除く。残りの目的物は、スニルクルズ及びこれとほぼ同じ大きさと強度特性を有する画像からの他の人工産物を示し、スニルクルズを見分けて、他の人工産物を排除するため、多くのスニルクルズの画像によって予め整備した分類手法に付される。この手法による結果は、見出したスニルクルズのみを、その分類法が正確に同定できる程度に示す二値画像となる。スニルクルズの全面積を合わすと、この値が、その画像に対するスニルクル化の程度を表す定量測定値となる。定義本明細書と請求の範囲で、語“影響”とは、細胞応答が再分布からなる何れの影響も含む。したがって、例えば、加熱、冷却、高圧、低圧、湿気又は乾燥が細胞応答への影響で、生じる再分布を定量できる。しかし、上記のように、おそらく最も重要な影響は、再分布に寄与する細胞応答を奏し影響することが知られているか、又はそのように推測される物質と、細胞（類）を接触又は培養することの影響である。本発明の他の具体例では、影響は、化合物のドラッグライブラリー由来の物質である。本明細書で、語“緑色蛍光タンパク質”とは、細胞で発現されたとき、正しい励起波長の光にさらされて蛍光を発するタンパク質を示すことを意図する[Chalf ieら、1994参照]。次に、１以上のアミノ酸が置換、挿入又は欠失されたGFPは、ほとんどの場合“修飾GFP”と称する。ここで使用した “GFP”は、クラゲのエクオレア・ビクトリア由来の野性型GFP及び、例えばHeim ら[Proc.Natl.Acad.Sci.，91，12501，1994]に開示されているGFPの青色蛍光変異体のようなGFPの修飾物、及びGFP蛍光のスペクトル性質を変化する他の修飾物、又は約30℃以上の温度で細胞で発現されたとき蛍光を増す修飾物（ここに参照として組入れるWO 97/1104として1997年３月27日に公告のPCT/DK96/00051に記載）(これはエクオレアの緑色蛍光タンパク質(GFP)由来の蛍光タンパク質又はその機能性類似体からなり、発光団の上流の位置１でのアミノ酸は、発明の蛍光タンパク質が細胞で発現されたとき蛍光強度を増すように変異されている)を含む。好ましいGFP変異体は、F64L-GFP、F64L-Y66H-GFPとF64L-S65T-GFPである。この発明のすべての観点での使用に特に好ましいGFP変異体は、EGFPである(哺乳類細胞での発現に最適化したコドンを有するF64L-S65T変異体であるEGFPをエンコードしているDNAはClontech[Palo Alto]から入手でき、EGFPDNA配列を含有するプラスミドも入手可能である(GenBank Acc No．U55762とU55763参照))。語“細胞内シグナル経路”と“シグナル変換経路”は、調和した細胞内過程を示し、それにより生細胞は、外部又は内部のシグナルを細胞応答に変換する。このシグナル変換は酵素反応を含み、酵素はプロテインキナーゼ、GTPアーゼ、ATP アーゼ、プロテインホスファターゼ、ホスホリパーゼを含むがこれらに限定されない。細胞応答は、遺伝子転写、分泌、増殖、機械的活性、代謝活性、細胞死を含むがこれらに限定されない。語“セカンドメッセンジャー”は、細胞内シグナル変換経路の初期段階に含まれる低分子量成分を示すのに用いられる。語“発光団(luminophore)”は、固有に、又は化学的もしくは物理的手段での刺激で光を発する性質を有する化学物質を示すのに用いる。これには、蛍光、生物発光、リン発光、化学発光を含むが、これに限定されない。用法“機械的に無傷の生細胞”とは、正常膜ポテンシャル、エネルギー代謝、増殖能の保持のような、特定タイプの細胞についての標準的な基準にしたがって生きていると考えられ、かつマイクロインジェクションのような外部物質を細胞に導入することを意図した物理的な侵襲処置を全く受けていない細胞を示すのに用いられる。語“生理学的な関連”とは、発光の性質又は分布の変化を測定するごとく、細胞内成分について実験的に測定した再分布に用いる際に、その再分布が、再分布を生ずる基礎となる生物学的現象の用語で説明できることを示すのに用いる。語“画像処理”と“画像分析”とは、順序アレイ数（画像）を、これらの順序アレイ数を述べる定量情報に減ずる大きな群のデジタル画像分析技術又はこれらの技術の組合せを述べるのに用いる。順序アレイ数が物理的方法で測定した値を示すとき、定量情報は、物理的方法での計測に由来する。語“蛍光プローブ”は、任意に１以上のアミノ酸残基からなるペプチドリンカー（その大きさは、蛍光プローブの所望の機能性が保持される限り重要ではない）を介し、ここで定義の生物活性ポリペプチドに、N又はC末端で融合しているGF P又はその機能部分からなる蛍光融合ポリペプチドを示すのに用いられる。本発明による蛍光プローブは細胞中で発現され、融合ポリペプチドの生物活性ポリペプチド分子の生理学的挙動を基本的に模倣する。語“哺乳類細胞”は、哺乳動物源の何れかの生細胞を示すことを意図する。細胞は、樹立細胞系(その多くはThe American Type Culture Colletion[ATCC,Virginia、合衆国]から入手できる)、もしくはトランスジェニック動物由来の組織を含む哺乳類組織由来の限定寿命を有する一次細胞、あるいはトランスジェニック組織を含む哺乳類組織由来の新たな樹立不死細胞系、又は哺乳動物源の異なる細胞タイプを融合して得られるハイブリッド細胞又は細胞系、例えばハイブリドーマ細胞系であってもよい。細胞は、蛍光プローブの前に、又はプローブを加えて、１以上の非在来の遺伝子産物（例えば、レセプター、酵素、酵素基質）を発現してもよい。好ましい細胞系には、線維芽細胞源のもの( 例えばBHK、CHO、BALB)、又は内皮細胞源のもの(例えばHUVEC、BAE(ウシ動脈内皮細胞)、CPAE(ウシ肺動脈内皮細胞))、膵臓源のもの(例えばRIN、INS-1、MIN6 、bTC3、aTC6、bTC6、HIT)、又は造血源のもの(例えばアジポサイト(adipocyte) 源、例えば、3T3-L1)、神経／神経内分泌源(例えばAtT20、PC12、GH3)、筋肉源( 例えばSKMC、A10、C2C12)、腎源（例えばHEK293、LLC-PKI）が含まれるが、これらに限定されない。語“ハイブリッドポリペプチド”は、２つのタンパク質の各々の少なくとも一部（この場合に、緑色蛍光タンパク質の少なくとも一部と、プロテインキナーゼの触媒及び／又は調節ドメインの少なくとも一部）が融合したポリペプチドを示すことを意図する。その上、ハイブリッドポリペプチドは、GFP又は機能性発蛍光団を含む緑色蛍光タンパク質の少なくとも一部と、ここに定義した生物活性ポリペプチドの少なくとも一部からなる融合ポリペプチドを示すことを意図するが、ただしSchmidtらとSakaiらがそれそれ開示するPKCα-GFP、PKCγ-GFP及びPKC ε-GFPではない。従って、GFPは、任意に１以上のアミノ酸配列からなるリンカー部分又はリンカーペプチドを介して生物活性ポリペプチドのN又はC末端に標識化されてもよい。ハイブリッドポリペプチド又は融合ポリペプチドは、そのハイブリッドポリペプチドを発現させる条件下で、ハイブリッドポリペプチドをエンコードしているDNA配列を担持する無傷の生細胞中で蛍光プローブとして作用しうる。語“キナーゼ”は、細胞成分をリン酸化できる酵素を示すことを意図する。語“プロテインキナーゼ”は、ペプチド及び／又はタンパク質中のセリン及び／又はスレオニン及び／又はチロシンをリン酸化できる酵素を示すのに用いられる。語“ホスファターゼ”は、ペプチド及び／又はタンパク質中のホスホセリン及び／又はホスホスレオニン及び／又はホスホチロシンを脱リン酸化できる酵素を示すのを意図する。本明細書で、語“生物活性ポリペプチド”は、活性化により細胞内過程に作用するポリペプチド(例えば、細胞内過程で活性な酵素)、又は生物学的機能を有するか、もしくは細胞系で生物学的効果を奏する所望のアミノ酸配列からなる前記ペプチドの部分を示すことを意図する。このポリペプチドで、１つ又は幾つかのアミノ酸は、欠失、挿入又置換され、例えば触媒部位を不活性にすることで、その生物学的機能を変えてもよい。生物活性ポリペプチドは、細胞内シグナル経路に関与するタンパク質（例えば、ここで定義したようなキナーゼ、プロテインキナーゼとホスホリラーゼを含む細胞内リン酸化と脱リン酸化過程に関与する酵素）からなる群から選択するのが好ましいが、細胞骨格を作るタンパク質も細胞内シグナル導入に重要な役割を果たすので、これも“生物活性ポリペプチド”の意味に含まれる。より好ましい生物活性ポリペプチドは、活性化又は不活化の状態により、細胞内局在を変えるタンパク質、好ましくはシグナル変換経路での中間成分である。この好ましい生物活性ポリペプチドの群には、cAMP依存性プロテインキナーゼAが含まれる。語“生物活性物質”は、生物学機能を有するか、又は細胞系で生物的作用を奏するサンプルを示すのを意図する。サンプルは、血液、血漿、唾液、乳、尿を含む体液サンプルのような生物材料サンプル、又は微生物又は植物抽出物サンプル、重金属や毒素を含む汚染物を含有する環境サンプルでもよい。また、有機合成や遺伝子技術でつくられる化合物又はその混合物を含むサンプルでもよい。 “蛍光の変化”なる句は、波長と強度のような吸収性質の変化、又は波長、蛍光寿命、強度又は偏光の変化のような射出光のスペクトル性の変化、又は発蛍光団の細胞内局在の変化を意味する。従って特異的な細胞成分（例えば、細胞器官、膜、細胞骨格、分子構造）に局在化でき、また細胞もしくはその部分を通して均一に分布できる。 “シグナル変換経路のバックトラッキング”は、示すことを意図する。ここで用いる語“生物”は、単細胞又は多細胞生物、好ましくは原虫を含む動物由来のもの、また、藻類、菌類、コケ類のような植物由来の生物を示す。維管束植物も、この定義に含まれる。語“核酸”は、DNA配列、cDNA配列又はRNA配列のようなポリもしくはオリゴ核酸配列の何れかのタイプを示すことを意味する。語“生物学的に等価”は、タンパク質に関して、第１のタンパク質と第２のタンパク質の２つのタンパク質の細胞機能が互いに置換できれば、例えば２つのタンパク質が異なる遺伝子でエンコードされる密接に関連したイソ型（スプライシング変異体）又は同じ遺伝子由来のアレリック変異体である場合、それらが異なる遺伝子細胞タイプもしくは異なる種で同一の細胞機能を行う場合に、第１のタンパク質は第２のタンパク質に等価であることを意味することを意図する。語“ 生物学的に等価”は、DNAに関して、ポリペプチドをエンコードする第１のDNA配列とポリペプチドをエンコードする第２のDNA配列でエンコードされる機能性タンパク質が生物学的に等価である場合に、両者のDNA配列が生物学的に等価であることを意味することを意図する。句「シグナル変換経路のバックトラッキング」とは、シグナル変換経路が、化学物質の影響又は生物の疾患状態の何れかによって、どのレベルで影響されるかをより正確に定義する方法を示すことを意図する。AからDへのシグナル変換を伴う、生体活性ポリペプチドA-B-C-Dで示される特異的なシグナル変換経路を想定する。シグナル変換経路のすべての成分を調べるとき、Dのみの活性又は再分布に影響する化合物又は疾患状態は、C又はCの下流に作用すると考えられる。しかし、AとBではなく、CとDの活性又は再分布に影響する化合物又は疾患状態は、B の下流に作用すると考えられる。語“固定細胞”とは、グルタルアルデヒドやホルムアルデヒドのような細胞学的固定剤で処理した細胞を意味するのに用いられ、この処理により、可溶性又は不溶性タンパク質が細胞構造内に化学的に架橋もしくは安定化される。この状態になると、このようなタンパク質は、現在の死細胞の構造から消失されない。図面の簡単な説明図１：PKAc-F64L-S65T-GFPハイブリッドタンパク質を発現するCHO細胞を、HAM F12培地中50mMフォルスコリン(forskohn)と37℃で処理した。これらの細胞のGFP 蛍光の画像を、処理後の異なる時間間隔、a)40秒、b)60秒、c)70秒、d)80秒で取り込んだ。蛍光は、点状からより均一な分布に（非核）細胞質内で変化する。図２：フォルスコリン誘導性PKAc-F64L-S65T-GFP再分布の時差分析。PKAc-F64 L-S65T-GFP融合タンパク質を発現するCHO細胞を時差蛍光顕微鏡で分析した。アゴニストの添加の２分前から８分後まで、規則的な間隔で蛍光マイクログラフを捕捉した。上左の画像を得た直後(t=0)、細胞に1mMフォルスコリンを投与した。フレームを、i)0、ii)1、iii)2、 iv）4とvi）5分で集めた。目盛10mm。図３：各種アゴニストへの応答におけるPKAc-F64L-S65T-GFPの再分布の時差分析。PKAc-F64L-S65T-GFP融合タンパク質の局在化に対する1mMフォルスコリン(A) 、50mMフォルスコリン(B)、1mM dbcAMP(C)及び100mM IBMX(D)の作用（添加は白矢印て示した）を、CHO/PKAc-F64L-S65T-GFP細胞の時差蛍光顕微鏡で分析した。 10mMフォルスコリン（白矢印）を添加し、すぐに緩衝液で繰返し洗浄したとき（黒矢印）のPKAc-F64L-S65T-GFP融合タンパク質の局在化への影響を、同じ細胞(E )で分析した。平行して、10mMフォルスコリンと100mM IBMX（白矢印）を添加し、100mM IBMX含有の緩衝液で繰返し洗浄した（黒矢印）場合の影響を実験し、分析した(F)。フォルスコリン除去で、PKAc-F64L-S65T-GFP融合タンパク質が細胞質凝集物に戻るが、これはIBMX(F)の連続存在で防止される。100nMグルカゴン（図３G、白矢印）のPKAc-F64L-S65T-GFP融合タンパク質の局在化への影響は、BHK /GR、PKAc-F64L-S65T-GFP細胞についても示している。10mMノルエプネフリン(H) （黒矢印）のPKAc-F64L-S65T-GFP融合タンパク質の局在化への影響を、同様に分析した。図3H（X軸は画像数、画像間12秒）で、[cAMP]_i;N.B.を増加さすため、一時的にトランスフェクトしたCHO、PKAc-F64L-S65T-GFP細胞（10mMフォルスコリンで前処理、白矢印）で分析した。緩衝液又はアゴニストの添加前に得た幾つかの画像を含む一定の間隔で、60蛍光マイクログラフからなる各実験の生データを捕捉した。チャート(A-G)は、それぞれ分析法２に記載のように行った全60画像でみられた応答の定量化を示す。蛍光凝集体の当初面積に対する高度な蛍光凝集体の全面積の変化を、各実験の時間に対し、図３の全グラフの縦座標としてプロットする。図４：PKAc-F64L-S65T-GFP融合体のフォルスコリン誘導性再分布に対する用量応答曲線(２つの実験)。図５：半最大(t_1/2max)と最大(t_max)pKAc-F64L-S65T-GFP再分布への応答の開始からの時間。データは図２で示した曲線から抽出した。すべてのt_1/2maxとt_ma _x 値は平均±SDとして示し、各フォルスコリン濃度に対する2〜3の独立実験からの合計20〜30細胞に基づいている。観察された再分布は一定時間以上維持されるので、t_max値は完全な再分布に達する最も早い時点で取った。値は、再分布の度合に関連していないことに注意すべきである。図６：フォルスコリン誘導性のcAMP上昇とPKAc-F64L-S65T-GFP再分布の平行用量応答分析。96ウェルのプレート中で成長させたCHO/PKAc-F64L-S65T-GFP細胞中でのPKAc-F64L-S65T-GFP融合タンパク質の局在化に対する緩衝液又は濃度を増していく５つのフォルスコリンの影響を、上記のように分析した。フォルスコリンの添加前と添加30分後に同じフィルドの細胞から採取した蛍光マイクログラフの SD比を計算し、PKAc-F64L-S65T-GFP再分布を再現性のある測定とした。グラフは、個々の48測定と各フォルスコリン濃度での平均±s.e.mのトレースを示す。比較のため、緩衝液又は濃度を増していく８つの[cAMP]_iに対する影響を、同じ条件下で成長させた細胞のシンチレーション近傍アッセイで分析した。グラフは、任意単位で表した４つの実験の平均±s.e.mのトレースを示す。図７：ヒトムスカリン(hM1)レセプターとPKCa-F64L-S65T-GFP融合体を安定的にトランスフェクトしたBHK細胞。カルバコール（100mMを1.0秒で添加）は、細胞質から原形質膜へのPKCa-F64L-S65T-GFPの一時的な再分布を誘因した。a)カルバコール添加１秒前、b)添加後8.8秒、c)添加後52.8秒で画像を取った。図８：hM1レセプターとPKCa-F64L-S65T-GFP融合体で安定的にトランスフェクトしたBHK細胞を、カルバコール（1mM、10mM、100mM）で処理した。単一細胞で、PKCa-F64L-S65T-GFPの再分布と同時に細胞内[Ca²⁺]をモニターした。ダッシュ線は、カルバコールの添加時を示す。上のパネルは、各処理時での個々の細胞についての細胞内Ca²⁺濃度の変化を示す。中央のパネルは、各処理時間に対する、個々の細胞についての平均的な細胞質GFP蛍光の変化を示す。下のパネルは、単一細胞周辺の蛍光の変化を示す。このなかで、通常の映像でみられる細胞の周辺端を特別に含む領域は、原形質膜の蛍光強度の変化をモニターするのにベストの機会を与える。図９：a)100mMのMEK1阻害剤PD98059で、HAMF12（血清なし）中37℃で30分間処理したHEK293細胞で発現されたhERK1-F64L-S65T-GFP融合体。核はこの処理中蛍光なし。 b)10％ウシ胎児血清で37℃で15分間処理後の(a)と同じ細胞。 c)HEPES緩衝液（HAMF-12を実験前に直接HEPES緩衝液で置換）中の各種濃度のE GFで処理後のHEK293細胞中でのGFP蛍光の再分布の時間プロフィル。蛍光の再分布は、単一細胞の核と細胞質の面積間の割合値の変化として表わす。各時間プロフィルは、６つの単一細胞でみられた変化の平均である。 d)各種濃度のEGFによる蛍光変化（核：細胞質）についてEGF処理の開始後600 秒での終点測定の棒チャート。図１０：a)HAM F-12中の血清に一晩飢えさせたHEK293細胞で発現されたSMAD2- EGFP融合体を、実験直前にHEPES緩衝液(pH 7.2)に置換した。目盛は10mm。 b）SMADS-EGFP融合体を発現するHEK293細胞を、示したような各種濃度のTGF- βで処理し、蛍光の再分布を経時的にモニターした。時のプロフィルプロットは、測定した各細胞での初期値に標準化した核内での蛍光の増加を示す。各トレースは、単一細胞核の時プロフィルである。 c)棒チャートは、異なる濃度のTGF-βに対する核内の蛍光の終点変化（処理後 850秒）を示す。各棒は、各処理での単一核に対する値である。図１１：ヒトインシュリンレセプターで安定的にトランスフェクトしたCHO細胞中のVASP-F64L-S65T-GFP融合体。細胞は、血清のないHAMF-12で２時間飢えさせ、次いで10％ウシ胎児血清で処理した。画像は、処理15分後の蛍光の再分布の結果を示す。GFP蛍光は、アクチンストレス繊維（actin stress fibres）の長さに沿った焦点癒着（focal adhesions）として同定された構造に局在化している。図１２：CHO-HIR細胞中のGLUT4-GFP再分布を記録する時差。時は100nMインシュリン添加後の分を示す。実施例１：生細胞内でのリアルタイムのPKA活性に基づくcAMPアッセイの構築、試験及び方法cAMP 濃度を変えるシグナル経路の活性、例えばG_s又はG₁クラスのG-タンパク質に結合するG-タンパク質結合レセプターの活性化のモニターの有用性マウスcAMP依存性プロテインキナーゼ(PKAc)の触媒サブユニットは、GFP誘導体F64L-S65TのC-末端に融合させた。得られた融合体(PKAc-F64L-S65T-GFP)は、生体内での転位、それによるPKA活性化をモニターするのに用いた。PKAc-F64L-S65T-GFP 融合体の構築ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)により、マウスのPKAc［GenBank受託番号:M12303 ］及びF64L-S65T-GFP[WO 97/11094号に開示の配列]をエンコードするcDNAに簡便な制限エンドヌクレアーゼ部位を導入した。PCR反応は、以下のプライマーを用いて標準的な方法にしたがって行った。次いで、PKAcの増幅産物をHindIII＋AscIで消化し、F64L-S65T-GFP産物をAscI ＋XhoIで消化した。次に、HindIII＋XhoIで消化したプラスに２つの消化したPCR産物を結合した。得られた融合構築物(SEQ ID NO:68及び69 )は、SV40プロモーターの制御下とした。トランスフェクション及び細胞培養条件 HEPES-緩衝生理食塩水でリン酸カルシウム沈殿法［Sambrookら、1989］を用いて、PKAc-F64L-S65T-GFP融合体を含むプラスミドでチャイニーズハムスター卵巣細胞(CHO)をトランスフェクションした。安定なトランスフェクタントは、成長培地(グルコース1000mg/l、ウシ胎児血清(FBS)10％、ペニシリン-ストレプトマイシン混合物100mg/ml、L-グルタミン2mMを有するDMEM、Life Technologies Inc .，Gaithersburg，MD，合衆国より購入)中ゼオシン(Zeocin)1000mg/ml[Invitrog en]を用いて選択した。非トランスフェクトCHO細胞は、対照として用いた。融合タンパク質の転位に対するグルカゴンの作用を評価するために、PKAc-F64L-S65T -GFP融合体を、ヒトグルカゴンレセプターを過剰発現するベビーハムスターの腎臓細胞(BHK/GR細胞)で安定的に発現した。非トランスフェクトBHK/GR細胞は、対照として用いた。GRの発現はG418 500mg/ml(Neoマーカー)で維持し、PKAc-F64L- S65T-GFPはゼオシン500mg/ml(Sh bleマーカー)で維持した。また、CHO細胞は、PKAc-F64L-S65T-GFP融合体及びヒトa2a アドレノセプター(adrenoceptor)(hARa2a)を含むベクターで同時にトランスフェクトした。蛍光顕微鏡用に、少なくとも24時間、Lab-Tekチェンバーカバーガラス[Nalge Nunc Int.，Naperville，IL，合衆国]に細胞を付着させ、約80％の集団(conflue nce)に培養した。実験前に、グルタマクス(glutamax)[Life Technologies]を有するHAMF-12培地(ペニシリン-ストレプトマイシン混合物100mg/ml及びFBS 0.3％ )で選択圧なしに一晩細胞を培養した。この培地は自己蛍光が低く、インキュベーターから連続した細胞の蛍光顕微鏡法を可能にする。リアルタイムでのPKA活性のモニター活性生細胞の画像のアキジション(aquisition)は、Fluar 40X、NA:1.3オイル浸漬対物レンズを用いてフォトメトリックCH250電荷結合素子(CCD)カメラに連結した Zeiss Axiovert 135M蛍光顕微鏡を用いて集められた。細胞は、100WのHBOアークランプで照明した。画像のバックグランドを最小限にするために、470±20nmの励起フィルター、510nmのダイクロイックミラー及び515±15nmの放射フィルターを光路に置いた。細胞を置き、オーダーメードのステージヒーターで37℃にしてモニターした。画像を処理し、以下の方法で分析した。方法1.：PKAの転位を定量する段階的方法 1.暗画像に対し画素ごとの減算を行って、暗電流に対する画像修正を行った( カメラのシャッターが開かないようにする以外は、画像は実際の画像と同じ条件で取りこんだ)。 2.平坦視野修正画像に基づいて画素ごとの比をとり、照射のムラに対する画像修正を行った(画像は、均一な蛍光試片の実際の画像と同じ条件でとりこんだ)。 3.画像のヒストグラム、つまり画像における各強度値の発生頻度を算出した。 4.ヒストグラムを平坦にした副次的な微分係数(second derivative)を算出し、副次的なゼロを測定する。このゼロは、大部分の画像の画素値を示すメインピークの高い位置にあるヒストグラムの屈折点に相当する。 5.段階４で測定した値は、画像から除いた。全てのネガティブ値を切り捨てた。 6.残りの画素値の変動（標準的な偏向の二乗）を測定した。この値は、その画像の「反応」を示す。 7.独立したcAMP定量のためのシンチレーション近似アッセイ(SPA)。方法2.：PKAの再分布を定量する代替方法 1.蛍光凝集物は、対象物とバックグランド間の情報測定の最大化に基づいて自動的に見出された閾値を用いて各画像から分けられる。画像ヒストグラムの優先的(priori)なエントロピーは、情報測定として用いる。 2.疑集物で占められる各画像面積は、分割面積での画素を計測して算出する。 3.一連の各画像の段階２で得られた値又は処理ペアは、回収した最初の（刺激していない）画像に見られる値に標準化する。ゼロ(0)値は、開始条件から蛍光の再分布を示さない。この方法で１の値は、全体的な再分布に等しい。細胞は、上記のようにHAMF-12培地で、但し96ウェルプレートで培養した。培地は、IBMX 100mMを含むCa²⁺-HEPES緩衝液で交換し、異なる濃度のフォルスコリンで10分間細胞を刺激した。反応はNaOHを0.14Mまで加えて停止し、製品に記載されているようにして、産生されるcAMP量をcAMP-SPAキット、RPA538[Amersham] で測定した。PKAc-F64L-S65T-GFP 融合体を試験するcAMP細胞内レベルの操作 cAMPレベルを変えるのに以下の化合物を用いた：フォルスコリン、アデニレートサイクラーゼ活性体；dbcAMP、ホスホジエステラーゼで分解されない膜透過性 cAMP類似体；IBMX、ホスホジエステラーゼ阻害剤。 PKAc-F64L-S65T-GFPを安定的に発現するCHO細胞は、フォルスコリン1mM(n=3 )、フォルスコリン10mM(n=4)及びフォルスコリン50mM(n=4)(図１)、又はdbcAMP 1mM(n=6)の刺激で、融合タンパク質が点状の分布から細胞質全体での均一な分布へ劇的に転位することを示した。図２は、フォルスコリン1mMでの処置による経時的な応答の進行を示す。図３は、融合タンパク質の再分布についての平均的な経時的プロフィルの比較及び３つのフォルスコリン濃度(図3A、E、B)、及び似ているが、より遅い反応を生じるdbcAMP 1mM（図3C）及びアデニレートサイクラーゼの刺激がない場合でさえ遅い反応を生じるIBMX 100mM(n=4、図3D)に対する各反応程度の測定を示す。緩衝液の添加(n=2)は、作用しなかった(データ示さず)。融合タンパク質の挙動の対照として、F64L-S65T-GFPのみをCHO細胞で発現させ、フォルスコリン50mMを加えた(n=5)。これらの細胞でのGFPの均一な分散分布特性は、このような処置によっては影響されなかった(データ示さず)。 PKAc-F64L-S65T-GFPの転位を誘導するフォルスコリンは、用量-応答の関係を示した(図４及び６)(前述の定量方法、参照)。PKAc-F64L-S65T-GFP 転位の可逆性細胞質に近接しているホットスポットからのPKAcプローブの放出は、可逆性であった。フォルスコリン10μMでの処置後に緩衝液で細胞を繰り返し（5〜8回）洗浄して、点状のパターンを2〜5分以内に完全に回復した(n=2、図3E)。実際に、蛍光性細胞質凝集物のパターンに戻った融合タンパク質は、フォルスコリンでの刺激前に見られたパターンと視覚的に区別できる。細胞質凝集物への融合タンパク質の回復が減少した[cAMP]_iを反映しているかどうかを試験するために、フォルスコリン10mMとIBMX 100mMの組み合わせで細胞を処理し(n=2)、IBMX 100mM含有緩衝液で繰り返し(5〜8回)洗浄した(図3F)。これらの実験では、融合タンパク質は、フォルスコリンの除去後に、その刺激前の局在に戻らなかった。生理的な関連剤でのPKA-F64L-S65T-GFPプローブの試験アデニレートサイクラーゼの活性化レセプターに対するプローブの反応を試験するために、BHK細胞はグルカゴンレセプターで安定的にトランスフェクトし、P KA-F64L-S65T-GFPプローブをグルカゴンの刺激にさらした。グルカゴンレセプターは、アデニレートサイクラーゼを活性化するG_sタンパク質に結合し、それによりcAMPレベルを増大する。これらの細胞では、グルカゴン100nMの添加(n=2)により細胞質凝集物からPKA-F64L-S65T-GFPプローブが放出され、2〜3分以内でより均一な細胞質分布に融合タンパク質を転位させる(図3G)。より低いグルカゴン濃度では、似ているが明らかに小さい作用が見られた(n=2、データ示さず)。緩衝液の添加(n=2)は、時間中、作用しなかった(データ示さず)。 hARa2aを発現する瞬間的にトランスフェクトしたCHO細胞及びPKA-F64L-S65T-G FPプローブは、7.5分間フォルスコリン10mMで処理し、次いでフォルスコリンを連続的に存在させて、ノルエピネフリン10mMにさらして外因性アドレノセプターを刺激し、G_tタンパク質に結合し、アデニレートサイクラーゼを阻害する。この処理により、[cAMP]_iの減少を示す細胞質凝集物に蛍光性が再現される(図3H)。[cAMP]_i に関連する融合タンパク質の転位上記のように、反応が終了するのに要する時間はフォルスコリンの用量に依存した(図５)。さらに、反応の程度も用量に依存した。中位いの高さのスループットシステムでPKA-F64L-S65T-GFP融合タンパク質の転位を試験するために、PKA-F64L-S65T-GFP融合体で安定的にトランスフェクトしたCHO細胞を、緩衝液及び５つの用量を増大させたフォルスコリンで刺激した(n=8)。上記の画像解析アルゴリズム（方法１）を用いて、用量反応関係が、0.01〜50mMの範囲のフォルスコリンで認められた(図６)。最大刺激の半分は、約2mMのフォルスコリンで認められた。平行して、緩衝液及び0.01〜50mM範囲の８つの濃度を増大させたフォルスコリンで、細胞を刺激した(n=4)。産生されるcAMP量は、SPAアッセイで測定した。融合タンパク質の転位曲線のもっとも急な部分と一致する1〜5mMのフォルスコリンで、急激な増加が認められた(図６)。実施例２：生細胞内のリアルタイムでの再分布の定量生細胞内のリアルタイムでのPKC活性の検出用プローブPKC-GFP 融合体の構築：プローブは、マウスのPKCα［GenBank受託番号:M25811］及びF64L-S65T-GFP[W O 97/11094号に開示の配列]それぞれのcDNAについてのポリメラーゼ連鎖反応(PC R)増幅産物を処理した２つの制限酵素で連結して構PCRに用いた。ハイブリッドDNA鎖は、実施例１に記載するようにHindIII-XhoIカセ細胞培養：誘導性のメタロチオニンプロモーターの制御下でヒトM1レセプターを発現し、ジヒドロフォレートレダクターゼマーカーで維持されるBHK細胞は、HEPES緩衝生理食塩水(HBS[pH7.10])でのリン酸カルシウム沈殿法を用いてPKCα-F64L-S65T-G FPプローブでトランスフフェクトした。安定なトランスフェクタントは、成長培地(グルコース1000mg/l、ウシ胎児血清(FBS)10％、ペニシリン-ストレプトマイシン混合物100mg/ml、L- た。hM1レセプター及びPKCα-F64L-S65T-GFP融合タンパク質は、それぞいずれの実験の24時間前にも、グルタマクス、ペニシリン-ストレプトマイシン混合物100μg/ml及びFBS 0.3％を有するHAM F-12培地に細胞を移した。この培地は選択圧を和らげ、シグナル変換経路の誘導が低く、関連する波長での自己蛍光が低いので、インキュベーターから連続した細胞の蛍光顕微鏡法を可能にする。リアルタイムでのPKC活性のモニター生細胞のデジタル画像は、40X、NA:1.3オイル浸漬対物レンズを適用してフォトメトリックCH250電荷結合素子(CCD)カメラに連結したZeiss Axiovert 1 35M蛍光顕微鏡を用いて集められた。細胞は、100Wのアークランプで照明した。画像のバックグランドを最小限にするために、470±20nmの励起フィルター、510 nmのダイクロイックミラー及び515±15nmの放射フィルターを光路に置いた。細胞を置き、オーダーメードのステージヒーターで37℃にしてモニターした。マッキントッシュ用のIPLabソフトウエアパッケージを用いて、画像を解析した。 PKCα-F64L-S65T-GFP融合体を安定的に発現するM1-BHK細胞の刺激で、細胞質から原形質膜への用量依存性の瞬間的な転位が、カルバコールを用いて確認された(図7a、b、c)。カルシウム濃度がないサイトゾルを同時に測定して、カルバコール誘導性のカルシウム代謝が転位に先立つことが分かった(図８)。PKC 転位を定量する段階的方法 1.暗画像に対し画素ごとの減算を行って、暗電流に対する画像修正を行った( カメラのシャッターが開かないようにする以外は、画像は、実際の画像と同じ条件で取りこんだ)。 2.平坦視野修正画像に基づいて画素ごとの比をとり、照射のムラに対する画像修正を行った(画像は、均一な蛍光試片の実際の画像と同じ条件でとりこんだ)。 3.エッジを同定した画像のコピーをつくった。画像のエッジは、標準的なエッジ検出方法、つまり核を用いて、大形の変化のない要素（つまりバックグランド）を除去し、小形の変化のある要素（つまり、鋭いエッジ）を目立たせる画像の取り込みにより見出される。次いで、この画像は閾値により二値化画像に変換された。細胞のエッジを示すには小さすぎる二値化画像の対象物は、切り捨てた。二値化画像を拡張して、画像エッジのギャップをふさいだ。画像の縁に接した画像の周縁部の対象物は、切り捨てる。この二値化画像は、エッジマスクを示す。 4.画像の別のコピーは、段階３の方法にしたがってつくられた。このコピーをさらに処理し、「ホール」を囲み、ホール内の全画素をエッジのバイナリー値つまり１に設定する対象物を検出する。この画像は、全細胞マスクを示す。 5.最初の画像は段階３のエッジマスクを用いてマスクし、全画素値の合計を決定する。 6.最初の画像は段階４の全細胞マスクを用いてマスクし、全画素値の合計を決定した。 7.段階５の値を段階６の値で割り算し、最終結果としてエッジ内に局在する細胞についての蛍光強度の割合を得た。実施例３：マイトジェン活性プロテインキナーゼErk1再分布の検出用プローブ例えば生細胞における経路の活性を調節する化合物を同定するための、MAPKに関与するシグナル経路のモニターの有用性セリン／スレオニンプロテインキナーゼErk1は、例えば多くの成長因子で活性化されるシグナル経路の成分である。生細胞内のリアルタイムでのERK-1活性の検出用プローブ細胞外シグナル調節キナーゼ(ERK-1、マイトジェン活性化プロテインキナーゼ、MAPK)は、GFP誘導体のN-末端もしくはC-末端に融合する。異なる哺乳類細胞で発現される、得られた融合体は、生体内の核転位、それによるMAPK経路を活性化する刺激に応じたERK1の活性化をモニターするのに用いる。 a)マウスERK1-F64L-S65T-GFP融合体の構築：ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)により、マウスのERK1[Gen Bank受託番号:Z14249］及びF64L-S65T-GFP[WO 97/11094号に開示の配列]をエンコードするc DNAに、簡便な制限エンドヌクレアーゼ部位を導入する。PCR反応は、以下のプライマーを用いて標準的な方法にしたがって行う。 mERK1-F64L-S65T-GFP(SEQ ID NO:56及び57)融合体を生じるために、ERK1増幅産物をHindIII＋AscIで消化し、F64L-S65T-GFP産物をAscI＋XhoIで消化する。次いで、F64L-S65T-GFP-mERK1融合体を生じるために、ERK1増幅産物をHindIII＋Bs 哺乳類発現ベクター、Invitrogen，San Diego，CA，合衆国)に２対の消化PCR産物を連結した。得られた融合構築物は、SV40プロモーターの制御下とする。 b)ヒトErk1遺伝子[GenBank受託番号:X60188]は、プライマーのErk1-トップ(to p)(SEQ ID NO:9)及びErk1-ボトム(bottom)/+ストップ(stop)(SEQ ID N0:10)で標準的な方法でPCRを用いて増幅した。PCR産物は、制限酵素EcoR1及びBamHIで消化し、EcoR1及びBamHIで消化したpEGFP-C1[Clontech,Palo Alto;GenBank受託番号: U55763]に連結した。この方法は、CMVプロモーター制御下でEGFP-Erk1融合体(SE Q ID NO:38及び39)を産生する。 EGFP-Erk1融合体を含有するプラスミドは、FUGENEトランスフェクション剤［B oehringer Mannheim]を用いてHEK293細胞にトランスフェクトした。実験前に、F CS 10％を有するDMEM中の８ウェルチェンバーで80〜90％の集団に細胞を成長させた。細胞は、単純なHAM F-12培地(FCSなし)で洗浄し、PD98059(MEK1阻害剤、E rk1活性化キナーゼ)100μMを有する単純なHAMF-12培地(FCSなし)で30〜60分培養した。この工程により、EGFP-Erk1の核が有効に空になる。実験の開始直前に、H AM F-12をHepes緩衝液で置換し、Hepes緩衝液で洗浄する。これにより、PD98059 阻害剤が除かれる。MEK1のブロッキングがさらに必要（例えば、対照実験で）であれば、阻害剤はHepes緩衝液に含まれる。顕微鏡の実験条件は、実施例１に記載のようにした。 10秒間隔で60個の画像を回収し、10番目の画像後に試験化合物を加えた。 EGF(1〜100nM)の添加で、細胞質から核へのEGFP-Erk1の再分布が数分で生じた (図9a、b)。反応を後述のように定量して、EGF濃度とEGFP-Erk1の核転位の用量-依存関係が見出された(図9c、d)。この実施例でGFP蛍光の再分布は、細胞の細胞質画分に対する核面積の比の変化として示される。各時間プロフィルは、各処理における６つの細胞についての細胞質に対する核の割合平均である。実施例４：Erk2再分布の検出用プローブ例えば生細胞における経路の活性化を調節する化合物の同定するための、MAPKに関与するシグナル経路のモニターの有用性セリン／スレオニンプロテインキナーゼErk2は、Erk1と密接に関連しているが、同一ではない。これは、例えば多くの成長因子で活性化されるシグナル経路の成分である。 a)ラットErk2遺伝子[GenBank受託番号:M64300]は、プライマーErk2-トップ(SE Q ID NO:11)及びErk2-ボトム/+ストップ(SEQ ID NO:13)で標準的な方法でPCRを用いて増幅した。PCR産物は、制限酵素Xho1及びBamHIで消化し、Xho1及びBamHI で消化したpEGFP-C1[Clontech,Palo Alto;GenBank受託番号:U55763]に連結した。この方法は、CMVプロモーター制御下でEGFP-Erk2融合体(SEQ ID NO:40及び41) を産生する。 b)ラットErk2遺伝子[Gen Bank受託番号:M64300]は、プライマーErk2-トップ(S EQ ID NO:11)及びErk2-ボトム/-ストップ(SEQ ID NO:12)で標準的な方法でPCRを用いて増幅した。PCR産物は、制限酵素Xho1及びBamHIで消化し、Xho1及びBamHI で消化したpEGFP-N1［Clontech,Palo Alto;GenBank受託番号:U55762]に連結した。この方法は、CMVプロモーター制御下でErk2-EGFP融合体(SEQ ID NO:58及び59) を産生する。得られたプラスミドは、CHO細胞及びBHK細胞にトランスフェクションした。細胞は、標準的な条件下で成長させた。実験前に、細胞を血清のない培地で48〜72 時間付した。これにより、両プローブ、特にBHK細胞での優勢な細胞質の局在化が生じる。ウシ胎児血清10％を細胞に加え、実施例３に記載するように細胞の蛍光を記録した。血清の添加で、血清を加えて数分以内に核へのプローブの再分布が引き起こされた。実施例５：Smad2再分布の検出用プローブ例えば生細胞における経路の活性化を調節する化合物の同定するための、トランスフォーミング成長因子β群の幾つかの要素で活性化されるシグナル経路のモニターの有用性シグナルトランスデューサ−Smad2は、サイトカインのTGFβ群の幾つかの要素で誘導されるシグナル経路の成分である。 a)ヒトSmad2遺伝子[GenBank受託番号:AF027964]は、プライマーのSmad2-トップ(SEQ ID NO:24)及びSmad2-ボトム/+ストップ（SEQ ID NO:26)で標準的な方法でPCRを用いて増幅した。PCR産物は、制限酵素EcoR1及びA cc65Iで消化し、EcoR1及びAcc65Iで消化したpEGFP-C1[Clontech，Palo Alto;Gen Bank受託番号:U55763]に連結した。この方法は、CMVプロモーター制御下でEGFP- Smad2融合体(SEQ ID NO:50及び51)を産生する。 b）ヒトSmad2遺伝子[GenBank受託番号:AFO27964]は、プライマーSmad2-トップ (SEQ ID NO:24)及びSmad2-ボトム/-ストップ（SEQ ID NO:25)で標準的な方法でP CRを用いて増幅した。PCR産物は、制限酵素EcoR1及びAcc65Iで消化し、EcoR1及びAcc65Iで消化したpEGFP-N1[Clontech，Palo Alto;GenBank受託番号:U55762]に連結した。この方法は、CMVプロモーター制御下でSmad2-EGFP融合体(SEQ ID NO: 74及び75)を産生する。 EGFP-Smad2融合体を含むプラスミドはHEK293細胞にトランスフェクションし、細胞質分布が示された。実験前に、80％の集団まで、FCS 10％を有するDMEMの８ウェルのNuncチェンバーで細胞を成長させ、FCSのないHAM F-12培地で一晩付した。実験には、HAM F-12培地をHepes緩衝液(pH7.2)で置換した。顕微鏡の実験条件は、実施例１に記載のようにした。 10秒間隔で90個の画像を回収し、５番目の画像の後に試験化合物を加えた。細胞を血清に飢えさせた後、核は、それぞれ周囲の細胞質より少ないGFP蛍光を含む(図10a)。TGFβの添加は、数分で細胞質から核へのEGFP-Smad2の再分布を生じた(図10b)。処理した細胞内での蛍光の再分布は、非刺激細胞それぞれの核でのGFP蛍光の開始値に標準化した核蛍光での分画の増大として、単純に定量した。実施例６ :VASP再分布の検出用プローブ例えば生細胞における経路の活性化を調節する化合物の同定するための、細胞骨格要素の再配列に関与するシグナル経路のモニターの有用性リンタンパク質VASPは、細胞骨格構造物の成分であり、焦点癒着に作用するシグナルに応じて再分布する。 a)ヒトVASP遺伝子[GenBank受託番号:Z46389]は、プライマーVASP-トップ(SEQ ID NO:94)及びVASP-ボトム/+ストップ(SEQ ID NO:95)で標準的な方法でPCRを用いて増幅した。PCR産物は、制限酵素HindIII及びBamHIで消化し、HindIII及びBa mHIで消化したpEGFP-C1[Clontech,Palo Alto;GenBank受託番号:U55763]に連結した。この方法は、CMVプロモーター制御下でEGFP-VASP融合体(SEQ ID NO:124及び 125)を産生する。得られたプラスミドは、リン酸カルシウムトランスフェクション法を用いてヒトインシュリンレセプターを発現するCHO細胞にトランスフェクトした。実験前に、８ウェルのNuncチェンバーで細胞を成長させ、FCSのない培地に一晩付した。実験は、実施例１に記載する顕微鏡条件で行う。 FCS 10％を細胞に加え、画像を回収した。EGFP-VASP融合体は、周辺付近の幾分均一な分布から、より局在化した構造に再分布され、焦点癒着点として同定された（図11）以下の実施例7〜22から明らかであるように、多くの別のGFP融合体がつくられるか、又はつくられる途中にあり、モニターし、分析するのに適切な宿主細胞及び細胞シグナル経路の活性化物質を示唆している。実施例７ :アクチン再分布の検出用プローブ例えば生細胞での細胞骨格の再配列を生じる経路の活性化を調節する化合物を同定するためのアクチンフィラメントの再配列又は形成に関与するシグナル経路のモニターの有用性アクチンは細胞骨格成分で、非常に多くの細胞シグナルに応じて再分布する。ヒトα-アクチン遺伝子[GenBank受託番号:X15804]のアクチン結合ドメインは、プライマーABD-トップ(SEQ ID NO:90)及びABD-ボトム/-トップ(SEQ ID NO:91) で標準的な方法でPCRを用いて増幅した。PCR産物は制限酵素HindIII及びBamHIで消化し、HindIII及びBamHIで消化したpEGFP-N1［Clontech,Palo Alto;GenBank受託番号:U55762]に連結した。これにより、CMVプロモーター制御下でアクチン-結合ドメインEGFP融合体(SEQ ID NO:128及び129)が産生される。得られたプラスミドは、ヒトインシュリンレセプターを発現するCHO細胞にトランスフェクトした。細胞をインシュリンで刺激し、アクチン結合ドメイン-EGF Pプローブを形態学的に異なる膜結合構造に再分布した。実施例８ :p38再分布の検出用プローブ例えば生細胞における経路の活性化を調節する化合物の同定するための、又はカウンタースクリーン(counterscreen)としての、様々な細胞ストレスの状況に反応するシグナル経路のモニターの有用性セリン/スレオニンプロテインキナーゼp38は、多くのタイプの細胞ストレス、例えばTNFα、アニソマイシン(anisomycin)、UV及びマイトマイシンCで活性化されるストレス誘導性シグナル経路の成分である。 a)ヒトp38遺伝子[GenBank受託番号:L35253]は、プライマーp38-トップ(SEQ ID NO:14)及びp38-ボトム/+ストップ(SEQ ID NO:16)で標準的な方法でPCRを用いて増幅した。PCR産物は、制限酵素XhoI及びBamHIで消化し、XhoI及びBamHIで消化したpEGFP-C1[Clontech，Palo Alto;GenBank受託番号:U55763]に連結した。これにより、CMVプロモーター制御下でEGFP-p38融合体(SEQ ID NO:46及び47)が生じた。 b)ヒトp38遺伝子[GenBank受託番号:L35253]は、プライマーp38-トップ(SEQ ID NO:13)及びp38-ボトム/-ストップ(SEQ ID NO:15)で標準的な方法でPCRを用いて増幅した。PCR産物は、制限酵素XhoI及びBamHIで消化し、XhoI及びBamHIで消化したpEGFP-N1[Clontech，Palo Alto;GenBank受託番号:U55762]に連結した。これにより、CMVプロモーター制御下でp38-EGFP融合体(SEQ ID NO:64及び65)が生じた。得られたプラスミドは、適切な細胞系、例えばHEK293にトランスフェクトし、例えばアニソマイシンでのシグナル経路の活性化に応じて数分で、EGFP-p38プローブ及び／又はp38-EGFPプローブの細胞分布を優勢な細胞質から核へ変える。実施例９：Jnk1再分布の検出用プローブ例えば生細胞における経路の活性化を調節する化合物の同定するための、又はカウンタースクリーンとしての、様々な細胞ストレス状況に応じるシグナル経路のモニターの有用性セリン/スレオニンプロテインキナーゼJnk1は、上記のp38とは異なるが、多くのタイプの細胞ストレス、例えばTNFα、アニソマイシン及びUVでも活性化されるストレス誘導性シグナル経路の成分である。 a)ヒトJnk1遺伝子[GenBank受託番号:L26318]は、プライマーJnk-トップ(SEQ I D NO:17)及びJnk-ボトム/＋ストップ(SEQ ID NO:19)で標準的な方法でPCRを用いて増幅した。PCR産物は、制限酵素XhoI及びBamHIで消化し、XhoI及びBamHIで消化したpEGFP-C1[Clontech,Palo Alto;GenBank受託番号:U55763]に連結した。これにより、CMVプロモーター制御下でEGFP-Jnk1融合体(SEQ ID NO:44及び45)が生じた。 b)ヒトJnk1遺伝子[GenBank受託番号:L26318]は、プライマーJnk-トップ(SEQ I D NO:17)及びJnk-ボトム/-ストップ(SEQ ID NO:18)で標準的な方法でPCRを用いて増幅した。PCR産物は、制限酵素XhoI及びBamHIで消化し、X hoI及びBamHIで消化したpEGFP-N1[Clontech,Palo Alto;GenBank受託番号:U55762 ]に連結した。これにより、CMVプロモーター制御下でJnk1-EGFP融合体(SEQ ID N O:62及び63)が生じた。得られたプラスミドは、適切な細胞系、例えばHEK293にトランスフェクトし、例えばアニソマイシンでのシグナル経路の活性化に応じて、EGFP-Jnk1プローブ及び／又はJnk1-EGFPプローブの細胞分布を優勢な細胞質から核へ変える。実施例10 ：ＰＫＧ再分布の検出用プローブ例えば生細胞における経路の活性化を調節する化合物の同定するための環状GMP レベルでの変化に関与するシグナル経路のモニターの有用性 cGMP依存性セリン/スレオニンプロテインキナーゼPGKは、グアニリル-サイクラーゼ/cGMPシグナルを媒介する。 a)ヒトPKG遺伝子[GenBank受託番号:Y07512]は、プライマーPKG-トップ(SEQ ID NO:81)及びPKG-ボトム/+ストップ(SEQ ID NO:83)で標準的な方法でPCRを用いて増幅する。PCR産物は、制限酵素XhoI及びBamHIで消化し、XhoI及びBamHIで消化したpEGFP-C1[Clontech，Palo Alto;GenBank受託番号:U55763]に連結した。これにより、CMVプロモーター制御下でEGFP-PKG融合体(SEQ ID NO:134及び135)が生じた。 b)ヒトPKG遺伝子[GenBank受託番号:Y07512]は、プライマーPKG-トップ(SEQ ID NO:81)及びPKG-ボトム/-ストップ(SEQ ID NO:82)で標準的な方法でPCRを用いて増幅する。PCR産物は、制限酵素XhoI及びBamHIで消化し、XhoI及びBamHIで消化したpEGFP-N1[Clontech，Palo Alto;GenBank受託番号:U55762]に連結した。これにより、CMVプロモーター制御下でPKG-EGFP融合体(SEQ ID NO:136及び137)が生じる。得られたプラスミドは、適切な細胞系、例えばA10にトランスフェクトし、硝酸酸化物(NO)レベルを増す剤での治療に応じて数分で、EGFP-PKGプローブ及び／又はPKG-EGFPプローブの細胞分布を細胞質から細胞骨格成分に結合した細胞質へ変える。実施例11 ：IkappaBキナーゼの再分布の検出用プローブ例えば生細胞における経路の活性化を調節する化合物の同定するための NFkappaB 活性化を生じるシグナル経路のモニターの有用性セリン/スレオニンキナーゼIkappaBキナーゼは、サイトカイン、リンホカイン、成長因子及びストレスを含む様々なインデューサーで活性化されるシグナル経路の成分である。 a)ヒトIkappaBキナーゼ遺伝子[GenBank受託番号:AF009225]のαサブユニットは、プライマーIKK-トップ(SEQ ID NO:96)及びIKK-ボトム/+ストップ(SEQ ID NO :98)で標準的な方法でPCRを用いて増幅する。PCR産物は、制限酵素EcoRI及びAcc 65Iで消化し、EcoRI及びAcc65Iで消化したpEGFP-C1[Clontech，Palo Alto;GenBa nk受託番号:U55763]に連結した。これにより、CMVプロモーター制御下でEGFP-Ik appaB-キナーゼ融合体(SEQ ID NO:120及び121)が生じる。 b)ヒトIkappaBキナーゼ遺伝子[GenBank受託番号:AF009225]のαサブユニットは、プライマーIKK-トップ(SEQ ID NO:96)及びIKK-ボトム/-ストップ(SEQ ID NO :97)で標準的な方法でPCRを用いて増幅する。PCR産物は、制限酵素EcoRI及びAcc 65Iで消化し、EcoRI及びAcc65Iで消化したpEGFP-N1[Clontech,Palo Alto;GenBan k受託番号:U55762]に連結した。これにより、CMVプロモーター制御下でIkappaB キナーゼ-EGFP融合体(SEQ ID NO:122及び123)が生じる。得られたプラスミドは、適切な細胞系、例えばJurkatにトランスフェクトし、例えばTNFαでの刺激から数秒で、EGFP-IkappaBキナーゼプローブ及び／又はIka ppaBキナーゼ-EGFPプローブが、より多くの細胞質分布に達せられる。実施例12 ：CDK2再分布の検出用プローブ例えば生細胞における経路の活性化を調節する化合物の同定するための細胞周期のシグナル経路のモニターの有用性サイクリン依存性セリン/スレオニンキナーゼCDK2は、細胞周期を制御するシグナルシステムの成分である。 a)ヒトCDK2遺伝子[GenBank受託番号:X61622]は、プライマーCDK2-トップ(SEQ ID NO:102)及びCDK2-ボトム/+ストップ(SEQ ID NO:104)で標準的な方法でPCRを用いて増幅する。PCR産物は制限酵素XhoI及びBamHIで消化し、XhoI及びBamHIで消化したpEGFP-C1[Clontech,Palo Alto;GenBank受託番号:U55763]に連結した。これにより、CMVプロモーター制御下でEGFP-CDK2融合体(SEQ ID NO:114及び115) が生じる。 b)ヒトCDK2遺伝子[GenBank受託番号:X61622]は、プライマーCDK2-トップ(SEQ ID NO:102)及びCDK2-ボトム/-ストップ(SEQ ID NO:103)で標準的な方法でPCRを用いて増幅する。PCR産物は、制限酵素XhoI及びBamHIで消化し、XhoI及びBamHI で消化したpEGFP-N1[Clontech,Palo Alto;GenBank受託番号:U55762]に連結した。これにより、CMVプロモーター制御下でCDK2-EGFP融合体(SEQ ID NO:112及び11 3)が生じる。得られたプラスミドは、適切な細胞系、例えばHEK293にトランスフェクトし、幾つかの成長因子、例えばIGFでの活性化に応じて、接触阻害細胞中の細胞質から核の位置へ、EGFP-CDK2プローブ及び／又はCDK2-EGFPプローブの細胞分布を変える。実施例13 ：Grk5再分布の検出用プローブ例えば生細胞における経路の活性化を調節する化合の同定するためのG-タンパク質結合レセプターの脱感作に関与するシグナル経路のモニターの有用性 G-タンパク質結合レセプターキナーゼGvk5は、膜結合G-タンパク質結合レセプターに関与するシグナル経路の成分である。 a)ヒトGrk5遺伝子[GenBank受託番号:L15388]は、プライマーGrk5-トップ(SEQ ID NO:27)及びGrk5-ボトム/+ストップ(SEQ ID NO:29)で標準的な方法でPCRを用いて増幅する。PCR産物は、制限酵素EcoRI及びBamHIで消化し、EcoRI及びBamHI で消化したpEGFP-C1[Clontech,Palo Alto;GenBank受託番号:U55763]に連結した。これにより、CMVプロモーター制御下でEGFP-Grk5融合体(SEQ ID NO:42及び43) が生じる。 b)ヒトGrk5遺伝子[GenBank受託番号:L15388]は、プライマーGrk5-トップ(SEQ ID NO:27)及びGrk5-ボトム/-ストップ(SEQ ID NO:28)で標準的な方法でPCRを用いて増幅した。PCR産物は、制限酵素EcoRI及びBamHIで消化し、EcoRI及びBamHI で消化したpEGFP-N1[Clontech,Palo Alto;GenBank受託番号:U55762]に連結する。これにより、CMVプロモーター制御下でGrk5-EGFP融合体(SEQ ID NO:60及び61) が生じる。得られたプラスミドは、適切な細胞系、例えばラットのドーパミンD1Aレセプターを発現するHEK293にトランスフェクトし、例えばドーパミンでのシグナル経路の活性化に応じて、EGFP-Grk5プローブ及び／又はGrk5-EGFPプローブの細胞分布を優勢な細胞質から末梢へ変える。実施例14 ：Zap70の再分布の検出用プローブ例えば生細胞における経路の活性化を調節する化合物の同定するためのT細胞レセプターに関与するシグナル経路のモニターの有用性チロシンキナーゼZap70は、例えばT細胞の分化で活性なシグナル経路の成分である。 a)ヒトZap70遺伝子[GenBank受託番号:L05148]は、プライマーZap70-トップ(SE Q ID NO:105)及びZap70-ボトム/+ストップ(SEQ ID NO:107)で標準的な方法でPCR を用いて増幅する。PCR産物は制限酵素EcoRI及びBamHIで消化し、EcoRI及びBamHIで消化したpEGFP-C1[GenBank受託番号:U55763 ]に連結する。これにより、CMVプロモーター制御下でEGFP-Zap70融合体(SEQ ID NO:108及び109)が生じる。 b)ヒトZap70遺伝子[GenBank受託番号:L05148]は、プライマーZap70-トップ(SE Q ID NO:105)及びZap70-ボトム/-ストップ(SEQ ID NO:106)で標準的な方法でPCR を用いて増幅する。PCR産物は制限酵素EcoRI及びBamHIで消化し、EcoRI及びBamH Iで消化したpEGFP-N1[Clontech,Palo Alto;GenBank受託番号:U55762]に連結する。これにより、CMVプロモーター制御下でZap70-EGFP融合体(SEQ ID NO:110及び1 11)が生じる。得られたプラスミドは、適切な細胞系、例えばJurkatにトランスフェクトし、例えばCD3エピシロン(epsilon)抗体でT細胞レセプターシグナル経路の活性化に応じて数秒で、EGFP-Zap70プローブ及び／又はZap70-EGFPプローブの細胞分布を細胞質から膜結合型へ変える。実施例15 ：p85再分布の検出用プローブ例えば生細胞における経路の活性化を調節する化合物を同定するためのP1-3キナーゼに関与するシグナル経路のモニターの有用性 p85αは、P13キナーゼの制御サブユニットで、膜結合チロシンキナーゼレセプター及びG-タンパク質結合レセプターに関与する多くの経路の成分である。 a)ヒトp85α遺伝子[GenBank受託番号:M61906]は、プライマーp85-トップ-C(SE Q ID NO:22)及びp85-ボトム/+ストップ(SEQ ID NO:23)で標準的な方法でPCRを用いて増幅した。PCR産物は制限酵素BgIII及びBamHIで消化し、BgIII及びBamHIで消化したpEGFP-C1[Clontech,Palo Alto;GenBank受託番号:U55763]に連結した。これにより、CMVプロモーター制御下でEGFP-p85融合体(SEQ ID NO:48及び49)が生じる。 b)ヒトp85α遺伝子[GenBank受託番号:M61906]は、プライマーp85-トップ-N(SE Q ID NO:20)及びp85-ボトム/-ストップ(SEQ ID NO:21)で標準的な方法でPCRを用いて増幅した。PCR産物は制限酵素EcoRI及びBamHIで消化し、EcoRI及びBamHIで消化したpEGFP-N1[Clontech,Palo Alto;GenBank受託番号:U55762]に連結した。これにより、CMVプロモーター制御下でp85α-EGFP融合体(SEQ ID NO:66及び67) が生じた。得られたプラスミドは、適切な細胞系、例えばヒトインシュリンレセプターを発現するCHOにトランスフェクトし、インシュリンレセプターの活性化に応じて数分で、EGFP-p85プローブ及び／又はp85-EGFPプローブの細胞分布を細胞質から膜結合型へ変える。実施例16 ：プロテイン-チロシンホスファターゼ再分布の検出用プローブ例えば生細胞における経路の活性化を調節する化合物を同定するためのチロシンキナーゼに関与するシグナル経路のモニターの有用性チロシン特異的なホスファターゼであるプロテイン−チロシンホスファターゼ 1Cは、例えば幾つかの成長因子が関与するシグナル経路の阻害成分である。 a)ヒトプロテイン−チロシンホスファターゼ1C遺伝子[GenBank受託番号:X6205 5]は、プライマーPTP-トップ(SEQ ID NO:99)及びPTP-ボトム/+ストップ(SEQ ID NO:101)で標準的な方法でPCRを用いて増幅する。PCR産物は制限酵素XhoI及びEco RIで消化し、Xhol及びEcoRIで消化したpEGFP-C1［Clontech,Palo Alto;GenBank 受託番号:U55763]に連結した。これにより、CMVプロモーター制御下でEGFP-PTP 融合体(SEQ ID NO:116及び117)が生じる。 b)ヒトプロテイン−チロシンホスファターゼ1C遺伝子[GenBank受託番号:X6205 5]は、プライマーPTP-トップ(SEQ ID NO:99)及びPTP-ボトム/-ストップ(SEQ ID NO:100)で標準的な方法でPCRを用いて増幅する。PCR 産物は制限酵素XhoI及びEcoRIで消化し、XhoI及びEcoRIで消化したpEGFP-N1［C1 ontech,Palo Alto;GenBank受託番号:U55762]に連結する。これにより、CMVプロモーター制御下でPTP-EGFP融合体(SEQ ID NO:118及び119)が生じる。得られたプラスミドは、適切な細胞系、例えばMCF-7にトランスフェクトし、例えばソマトスタチンでの成長阻害シグナル経路の活性化に応じて数分で、EGFP -PTPプローブ及び／又はPTP-EGFPプローブの細胞分布を細胞質から原形質膜へ変える。実施例17 ：Smad4再分布の検出用プローブ例えば生細胞における経路の活性化を調節する化合物を同定するためのトランスフォーミング成長因子β群の多くの成分に関連するシグナル経路のモニターの有用性シグナルトランスデューサーSmad4は、サイトカインのTGFβ群の様々な要素で誘導されるシグナル経路の共通成分である。 a)ヒトSmad4遺伝子[GenBank受託番号:U44378]は、プライマーSmad4-トップ及びSmad4-ボトム/+ストップ(SEQ ID NO:35)で標準的な方法でPCRを用いて増幅した。PCR産物は制限酵素EcoRI及びBamHIで消化し、EcoRI及びBamHIで消化したpEG FP-C1[Clontech，Palo Alto; GenBank受託番号:U55763]に連結した。これにより、CMVプロモーター制御下でEGFP-Smad4融合体(SEQ ID NO:52及び53)が生じる。 b)ヒトSmad4遺伝子[GenBank受託番号:U44378]は、プライマーSmad4-トップ(SE Q ID NO:33)及びSmad4-ボトム/-ストップ(SEQ ID NO:34)で標準的な方法でPCRを用いて増幅した。PCR産物は制限酵素EcoRI及びBamHIで消化し、EcoRI及びBamHI で消化したpEGFP-N1[Clontech,Palo Alto;GenBank受託番号:U55762]に連結した。これにより、CMVプロモーター制御下でSmad4-EGFP融合体(SEQ ID NO:76及び77 )が生じた。得られたプラスミドは、細胞系、例えばHEK293にトランスフェクトし、例えば TGFβでのシグナル経路の活性化に応じて、EGFP-Smad4プローブ及び／又はSmad4 -EGFPプローブの細胞分布を細胞質から核へ数分で変える。実施例18 ：Stat5再分布の検出用プローブ例えば生細胞における経路の活性化を調節する化合物を同定するためのJak群のチロシンキナーゼの活性化に関与するシグナル経路のモニターの有用性シグナルトランスデューサー及び転写活性体であるStat5は、例えば多くのサイトカイン及び成長因子で誘導されるシグナル経路の成分である。 a)ヒトStat5遺伝子[GenBank受託番号:L41142]は、プライマーStat5-トップ(SE Q ID NO:30)及びStat5-ボトム/+ストップ(SEQ ID NO:32)で標準的な方法でPCRを用いて増幅した。PCR産物は制限酵素BglII及びAcc65Iで消化し、BglII及びAcc65 Iで消化したpEGFP-C1[Clontech,Palo Alto;GenBank受託番号:U55763]に連結した。これにより、CMVプロモーター制御下でEGFp-Stat5融合体(SEQ ID NO:54及び55 )が生じる。 b)ヒトStat5遺伝子[GenBank受託番号:L41142]は、プライマーStat5-トップ(SE Q ID NO:30)及びStat5-ボトム/-ストップ(SEQ ID NO:331)で標準的な方法でPCR を用いて増幅した。PCR産物は制限酵素BglII及びAcc65Iで消化し、BglII及びAcc 65Iで消化したpEGFP-N1[Clontech,Palo Alto;GenBank受託番号:U55762]に連結した。これにより、CMVプロモーター制御下でStat5-EGFP融合体(SEQ ID NO:78及び 79)が生じた。得られたプラスミドは、適切な細胞系、例えばMIN6にトランスフェクトし、例えばプロラクチンでのシグナル経路の活性化に応じて数分で、EGFP-Stat5プローブ及び／又はStat5-EGFPプローブの細胞分布を細胞質から核へ変える。実施例19 ：NFAT再分布の検出用プローブ例えば生細胞における経路の活性化を調節する化合物を同定するためのNFATの活性化に関与するシグナル経路のモニターの有用性転写活性体であるNFATは、例えば免疫応答に関与するシグナル経路の成分である。 a)ヒトNFAT1遺伝子[GenBank受託番号:U43342]は、プライマーNFAT-トップ(SEQ ID NO:84)及びNFAT-ボトム/+ストップ(SEQ ID NO:86)で標準的な方法でPCRを用いて増幅する。PCR産物は制限酵素XhoI及びEcoRIで消化し、XhoI及びEcoRIで消化したpEGFP-C1[Clontech,Palo Alto;GenBank受託番号:U55763]に連結する。これにより、CMVプロモーター制御下でEGFP-NFAT融合体(SEQ ID NO:130及び131)が生じる。 b)ヒトNFAT遺伝子[GenBank受託番号:U43342]は、プライマーNFAT-トップ(SEQ ID NO:84)及びNFAT-ボトム/-ストップ(SEQ ID NO:85)で標準的な方法でPCRを用いて増幅する。PCR産物は制限酵素XhoI及びEcoRIで消化し、XhoI及びEcoRIで消化したpEGFP-N1[Clontech,Palo Alto;GenBank受託番号:U55762]に連結する。これにより、CMVプロモーター制御下でNFAT-EGFP融合体(SEQ ID NO:132及び133)が生じる。得られたプラスミドは、適切な細胞系、例えばJurkatにトランスフェクトし、例えばCD3エピシロン抗体でのシグナル経路の活性化に応じて数分で、EGFP-NFAT プローブ及び／又はNFAT-EGFPプローブの細胞分布を細胞質から核へ変える。実施例20 ：NFkappaB再分布の検出用プローブ例えば生細胞における経路の活性化を調節する化合物を同定するためのNFkappaB の活性化を生じるシグナル経路のモニターの有用性転写活性体であるNFkappaBは、サイトカイン、リンホイカイン、幾つかの免疫抑制剤を含む種々のインデューサーに反応するシグナル経路の成分である。 a)ヒトNFkappaB p65サブユニット遺伝子[GenBank受託番号:M62399]は、プライマーNFkappaB-トップ(SEQ ID NO:87)及びNFkappaB-ボトム/+ストップ(SEQ ID NO :89)で標準的な方法でPCRを用いて増幅する。PCR産物は制限酵素XhoI及びBamHI で消化し、XhoI及びBamHIで消化したpEGFP-C1[Clontech,Palo Alto;GenBank受託番号:U55763]に連結する。これにより、CMVプロモーター制御下でEGFP-NFkappaB 融合体(SEQ ID NO:142及び143)が生じる。 b)ヒトNFkappaB p65サブユニット遺伝子[GenBank受託番号:M62399]は、プライマーNFkappaB-トップ(SEQ ID NO:87)及びNFkappaB-ボトム/-ストップ(SEQ ID NO :88)で標準的な方法でPCRを用いて増幅する。PCR産物は制限酵素XhoI及びBamHI で消化し、XhoI及びBamHIで消化したpEGFP-N1[Clontech,Palo Alto;GenBank受託番号:U55762]に連結した。これにより、CMVプロモーター制御下でNFkappaB-EGFP 融合体(SEQ ID NO:140及び141)が生じる。得られたプラスミドは、適切な細胞系、例えばJurkatにトランスフェクトし、例えばTNFαでのシグナル経路の活性化に応じて、EGFP-NFkappaBプローブ及び／又はNFkappaB-EGFPプローブの細胞分布を細胞質から核へ変える。実施例21 ：RhoA再分布の検出用プローブ例えば生細胞における経路の活性化を調節する化合物を同定するためのRhoAに関与するシグナル経路のモニターの有用性小さなGTPアーゼであるRhoAは、例えばLPA誘導性細胞骨格再配列のような多くのシグナル経路の成分である。ヒトRhoA遺伝子[GenBank受託番号:L25080]は、プライマーRhoA-トップ(SEQ ID NO:92)及びRhoA-ボトム/+ストップ(SEQ ID NO:93)で標準的な方法でP CRを用いて増幅した。PCR産物は制限酵素HindIII及びBamHIで消化し、HindIII及びBamHIで消化したpEGFP-C1[Clontech，Palo Alto;GenBank受託番号:U55763]に連結した。これにより、CMVプロモーター制御下でEGFP-RhoA融合体(SEQ ID NO:1 26及び127)が生じる。得られたプラスミドは、適切な細胞系、例えばSwiss3T3にトランスフェクトし、例えばLPAでのシグナル経路の活性化から数分で、EGFP-RhoAプローブの細胞分布を適度な均質さから末梢分布へ変える。実施例22 ：PKB再分布の検出用プローブ例えば生細胞における経路の活性化を調節する化合物を同定するためのPKBに関与するシグナル経路のモニターの有用性セリン/スレオニンキナーゼPKBは、多くが成長因子で活性化される様々なシグナル経路の成分である。 a)ヒトPKB遺伝子[GenBank受託番号:M63167]は、プライマーPKB-トップ(SEQ ID NO:36)及びPKB-ボトム/+ストップ(SEQ ID NO:80)で標準的な方法でPCRを用いて増幅する。PCR産物は制限酵素XhoI及びBamHIで消化し、XhoI及びBamHIで消化したpEGFP-C1[Clontech，Palo Alto;GenBank受託番号:U55763]に連結する。これにより、CMVプロモーター制御下でEGFP-PKB融合体(SEQ ID NO:138及び139)が生じる。 b)ヒトPKB遺伝子[GenBank受託番号:M63167]は、プライマーPKB-トップ(SEQ ID NO:36)及びPKB-ボトム/-ストップ(SEQ ID NO:37)で標準的な方法でPCRを用いて増幅した。PCR産物は制限酵素XhoI及びBamHIで消化し、XhoI及びBamHIで消化したpEGFP-N1[Clontech，Palo Alto;GenBank受託番号:U55762]に連結した。これにより、CMVプロモーター制御下でPKB-EGFP融合体(SEQ ID NO:70及び71)が生じた。得られたプラスミドは、適切な細胞系、例えばヒトインシュリンレセプターを発現するCHOにトランスフェクトし、EGFP-PKBプローブ及び／又はPKB-E GFPプローブが、例えばインシュリンの添加後の活性化−不活化工程のあいだに細胞質及び膜位置間を循環する。転移は、数分で現れる。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項【提出日】平成１１年６月７日（１９９９．６．７）【補正内容】請求の範囲１．発光団（細胞（類）に存在し、影響の度合に関連するように再分布可能であり、かつ／又は影響の度合に関連するように再分布可能な成分と会合する）から放射された空間分散光において、機械的に無傷な生細胞（類）への影響により生じる変動を記録し、空間分散光で記録された変動を処理して空間分布を細胞応答への影響度合に相関する定量情報にすることによって、細胞応答への物質の影響に関する定量情報を抽出することからなり、同様に記録した応答又は結果に基づいて、関連した特異的影響の既知の度合にあらかじめ行った較正にしたがって、空間分散光で記録された変動を処理して１以上の代表的な再分布の度合に縮小し、処理の結果が物質の生物活性を示す、細胞応答への影響に関する物質の生物活性を発見又は試験するための方法。２．細胞応答への影響に関する物質の影響が、経路又はその一部に関連した少なくとも１つの成分の再分布を含む細胞内経路に対する影響である請求頂１に記載の方法。３．物質が化学物質であり、影響が、機械的に無傷の生細胞（類）と化学物質の接触及び／又は機械的に無傷の生細胞（類）と化学物質の培養である請求項１又は２に記載の方法。４．記録が、影響の付加後の単一の時点でなされる前記請求項の何れかに記載の方法。５．記録が２つの時点でなされ、その１点は影響の付加前で、他の点はその後である請求項１〜３の何れかに記載の方法。６．記録が一連の時点で行われ、影響の付加は一連の記録の第１時点後の数回で行い、例えば0.1秒〜１時間、好ましくは１〜60秒、より好ましくは１〜30秒、特に１〜10秒の所定の時間隔で、１秒〜12時間、10秒〜12時間、例えば10秒〜１時間、60秒〜30分又は20分のような時間範囲をかけて記録される請求項１〜３の何れかに記載の方法。７．細胞（類）が、応答が有意であるとして予め決められた影響の付加後の時点で固定され、かつ記録が後の任意の時間でなされる請求項１〜５の何れかに記載の方法。８．再分布可能な成分との発光団の会合で、発光団の発光特性がモジュレーションされる前記請求項のいずれかに記載の方法。９．発光団が、生理学的に影響の度合に関連するように再分布可能な発光団である前記請求項の何れかに記載の方法。１０．発光団が、生理学的に影響の度合に関連するように再分布可能な成分と会合しうる発光団である前記請求項の何れかに記載の方法。１１．発光団が、影響の度合に相関することが実験的に決定されるように再分布できる発光団である前記請求項の何れかに記載の方法。１２．発光団が、細胞内経路の少なくとも１つの成分と実質的に同様に、細胞内経路のモジュレーションにより再分布可能な発光団である前記請求項の何れかに記載の方法。１３．発光団が、その発光が経路のモジュレーションで再分布される成分との空間的会合で消滅可能な発光団であり、その消滅は発光強度の減少として測定される請求項１〜１２の何れかに記載の方法。１４．発光団で放射された空間分散光に関する変動又は結果が、発光団とそれにエネルギーを伝達しうる他の発光体との共鳴エネルギーの転移変化で検出され、その各々は細胞内経路の特定成分の一部となるか、結合又は会合するよう選択又は設計されており、その１つは影響に応じて再分布し、それによって共鳴エネルギー転移の量を変化させ、共鳴エネルギー転移の変化が発光団からの放射強度の変化として測定される請求項１〜１２の何れかに記載の方法。１５．発光団からの放射強度の変化が、非空間的な解像様式で、発光団の平均強度のみに反応する単チャンネルの光検出器で検知される請求項１４に記載の方法。１６．記録される光の性質が、強度、蛍光寿命、偏光、波長シフト又は基礎をなす細胞応答の結果としてモジュレートされる他の性質である請求項１〜１５の何れかに記載の方法。１７．空間分散光の記録が、光の記録可能な性質の空間分布を順序アレイ値の型で記録する記録システムを用いて行われる請求項１〜１４又は１６の何れかに記載の方法。１８．光の記録可能な性質の空間分散の記録が、CCDアレイのような電荷転移装置又はビディコンチューブのような真空チューブ装置を用いて行われる請求項１７に記載の方法。１９．測定される光が、測定すべき光の所望成分を選択し、他の成分を拒絶するフィルターを通過する前記請求項の何れかに記載の方法。２０．記録可能な光の性質に関する空間分散の記録が、蛍光顕微鏡で行われる前記請求項の何れかに記載の方法。２１．発光団から放射される光に関する変動又は結果の記録が、空間分散光を１以上のデジタル画像として記録することにより行われ、１以上の代表的な再分布の度合に記録した変動を縮小する処理が、デジタル画像処理法又はその組合せからなる前記請求項の何れかに記載の方法。２２．細胞内経路が、細胞内シグナル経路である請求項２〜２１の何れかに記載の方法。２３．発光団が発蛍光団である前記請求項の何れかに記載の方法。２４．発光団が、細胞（類）に保持されるヌクレオチド配列でエンコードされ、発現されるポリペプチドである前記請求項の何れかに記載の方法。２５．発光団が、ここに定義の２つのポリペプチド（一方が発光性ポリペプチド、他方が生物活性ポリペプチドからなる）各々の少なくとも一部分の融合体からなるハイブリッドポリペプチドである前記請求項の何れかに記載の方法。２６．発光性ポリペプチドが、ここに定義するGFPである請求項２５に記載の方法。２７． GFPが、ここに定義するF64L変異を有する緑色蛍光タンパク質からなる群から選択される請求項２６に記載の方法。２８． GFPが、F64L-GFP、F64L-Y66H-GFP、F64L-S65T-GFPとEGFPからなる群から選択されるGFP変異体である請求項２７に記載の方法。２９． a)任意にリンカーを介し、ヌクレオチド配列を発現させる条件下で生物活性ポリペプチドのN又はC末端標識されているGFPからなるハイブリッドポリペプチド形態の発光団をコードするヌクレオチド配列を含有する１以上の細胞を培養し、 b)細胞（類）を物質と培養して生物活性ポリペプチドの活性をモジュレートし、かつ c) 培養した細胞（類）が産生した蛍光の変動を記録することからなる、前記請求項の何れかに記載の方法。３０．ヌクレオチド配列がDNA配列である請求項２９に記載の方法。３１．モジュレーションが活性化である請求項２９又は３０に記載の方法。３２．モジュレーションが不活化である請求項２９又は３０に記載の方法。３３．細胞（類）の蛍光がモジュレーション前に測定され、請求頂２８に記載の工程(c)で測定された結果又は変動が、モジュレーション前に測定した蛍光と比較した蛍光の変化である請求項２９〜３２の何れかに記載の方法。３４．細胞内過程が、細胞内シグナル経路である請求項２９〜３３の何れかに記載の方法。３５．工程(c)で測定された蛍光の変化が、蛍光の空間分散の変化を決定することからなる請求項３３に記載の方法。３６．機械的に無傷の生細胞（類）が哺乳類細胞（類）で、影響が観察される期間、30℃又はそれ以上の温度、好ましくは32〜39℃の温度、より好ましくは35 ℃〜38℃の温度、最も好ましくは約37℃の温度で培養される前記請求項の何れかに記載の方法。３７．少なくとも１つの機械的に無傷の生細胞が、同一又は非同一細胞のマトリクスの一部である前記請求項の何れかに記載の方法。３８．細胞（類）が、酵母細胞のような菌類細胞、昆虫細胞を含む無脊椎動物細胞及び哺乳類細胞のような脊椎動物細胞からなる群から選択される請求項１〜３５及び３７の何れかに記載の方法。３９．細胞内シグナル経路の成分である生物活性ポリペプチド、又はその一部及びGFPからなる融合ポリペプチドをコードし、但し、生物活性ポリペプチドがP KC-α、PKC-γ及びPKC-εからなる群から選択される融合ポリペプチドをコードする構造物ではない、核酸構造物。４０．細胞内シグナル経路の成分である生物活性ポリペプチド、又はその一部及びGFPのF64L変異体からなる融合ポリペプチドをコードする核酸構造物。４１．生物活性ポリペプチドが、プロテインキナーゼ又はホスファターゼである請求項３９又は４０に記載の核酸構造物。４２． GFPが、任意にペプチドリンカーを介して、生物活性ポリペプチド又はその一部のN-又はC-末端標識されている請求項３９〜４１のいずれかに記載の核酸構造物。４３．生物活性ポリペプチドが、活性化で細胞局在を変える転写因子又はその一部である請求項３９、４０及び４２のいずれかに記載の核酸構造物。４４．生物活性ポリペプチドが、細胞骨格ネットワークに結合し、活性化で細胞局在を変えるタンパク質又はその一部である請求項３９、４０及び４２のいずれかに記載の核酸構造物。４５．生物活性ポリペプチドが、活性化で細胞局在を変えるプロテインキナーゼ又はその一部である請求項３９〜４２のいずれかに記載の核酸構造物。４６．プロテインキナーゼが、活性化で細胞内局在を変え得るセリン／スレオニンプロテインキナーゼ又はその一部である請求項４５に記載の核酸構造物。４７．プロテインキナーゼが、活性化で細胞内局在を変え得るチロシンプロテインキナーゼ又はその一部である請求項４５に記載の核酸構造物。４８．プロテインキナーゼが、活性化で細胞内局在を変え得るリン脂質-依存性セリン／スレオニンプロテインキナーゼ又はその一部である請求項４５に記載の核酸構造物。４９．プロテインキナーゼが、活性化で細胞局在を変え得るcAMP-依存性プロテインキナーゼ又はその一部である請求項４５に記載の核酸構造物。５０． PKAc-F64L-S65T-GFP融合体をコードする請求項４９に記載の核酸構造物。５１．プロテインキナーゼが、活性化で細胞局在を変え得るcGMP-依存性プロテインキナーゼ又はその一部である請求項４５に記載の核酸構造物。５２．プロテインキナーゼが、活性化で細胞局在を変え得るカルモジュリン- 依存性セリン/スレオニンプロテインキナーゼ又はその一部である請求項４５に記載の核酸構造物。５３．プロテインキナーゼが、活性化で細胞局在を変え得るマイトジェン-活性化セリン/スレオニンプロテインキナーゼ又はその一部である請求項４５に記載の核酸構造物。５４． ERK1-F64L-S65T-GFP融合体をコードする請求項５３に記載の核酸構造物。５５． EGFP-ERK1融合体をコードする請求項５３に記載の核酸構造物。５６．プロテインキナーゼが、活性化で細胞局在を変え得るサイクリン-依存性セリン/スレオニンプロテインキナーゼ又はその一部である請求項４５に記載の核酸構造物。５７．生物活性ポリペプチドが、活性化で細胞局在を変え得るプロテインホスファターゼ又はその一部である請求項４１又は４２に記載の核酸構造物。５８．DNA構造物である請求項３９〜５７のいずれかに記載の核酸構造物。５９． GFPをエンコードする遺伝子が、エクオレア・ビクトリア由来である請求項３９〜５８のいずれかに記載の核酸構造物。６０． GFPをエンコードする遺伝子が、ここに定義するEGFPをエンコードする遺伝子である請求項５９に記載の核酸構造物。６１． GFPをエンコードする遺伝子が、F64L-GFP、F64L-Y66H-GFP及びF64L-S65 T-GFPから選択されるGFP変異体をエンコードする遺伝子である請求項５９に記載の核酸構造物。６２． SEQ ID NO:38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64 、66、68、70、72、74、76、78、108、110、112、114、116、118、120、122、12 4、126、128、130、132、134、136、138、140及び142に示すDNA配列の何れかで同定される構造物か、又は、ここに定義する同じ融合ポリペプチドもしくはそれらと生物学的に等価な融合ポリペプチドをエンコードしうるそれらの変異体である請求項５８及び６０又は６１に記載のDNA構造物。６３．構造物でエンコードされる配列を発現しうる請求項３９〜６２のいずれかに記載の核酸構造物を含む細胞。６４．真核細胞である請求項６３に記載の細胞。６５．酵母細胞のような菌類細胞、昆虫細胞を含む無脊椎動物細胞及び哺乳類細胞のような脊椎動物細胞からなる群から選択される請求項６３に記載の細胞。６６．哺乳類細胞である請求項６５に記載の細胞。６７．核酸配列を発現しうる細胞成分の少なくとも１つに、請求項３９〜５８のいずれかに記載の構造物に含まれるような核酸配列を有する生物。６８．単細胞及び哺乳動物のような多細胞生物からなる群から選択される請求項６７に記載の生物。６９．任意にペプチドリンカーを介して、生物活性ポリペプチド又はその一部又はそのサブユニット（ここに定義する細胞内シグナル経路の成分である）のN- 又はC-末端標識されているGFPからなり、請求項３９〜５８のいずれかに記載の核酸構造物でエンコードされるプローブである蛍光プローブ。７０．発光団が、請求項３９〜６２のいずれかに記載の核酸構造物でエンコードされるような融合ポリペプチドである請求項１〜３８のいずれかに記載の方法。７１．本発明の方法が、ここに定義するスクリーニングプログラムに用いられる請求項１〜３８又は７０に記載の方法。７２． (a)光源、(b)タンパク質の蛍光を励起する光源からの光波長の選択手段、(c)励起光をシステムの残部に急速にブロック又は通過させる手段、(d)励起光を試料に運び、空間的に解像した様式で放射蛍光を回収し、かつこの蛍光からの画像を形成する一連の光学部材、(e)一連の光学部材に対し所定のジオメトリーで測定される細胞の容器を保持するベンチもしくはスタンド、(f)空間的に解像した蛍光を画像の形で記録する検出器、(g)記録した画像を捕捉して蓄積し、かつ記録した画像から再分布の度合を計算するコンピューター又は電子システム及び関連ソフトウェアの構成部を含む、少なくとも１つの細胞での蛍光分布、それによる少なくとも１つの細胞での蛍光分布の何れかの変化を測定する装置。７３．システムの一部又は全てが自動化されている請求項７２に記載の装置。７４．構成部ｄ及びｅが、蛍光顕微鏡からなる請求項７２に記載の装置。７５．構成部ｆがCCDカメラである請求項７２に記載の装置。７６．光学スキャンシステムで画像を形成し、記録する請求項７２に記載の装置。７７．液体付加システムが、所定の時間で細胞ホルダー中の細胞のいずれか又は全てに既知もしくは未知の化合物を加えるのに用いられる請求項７２に記載の装置。７８．液体付加システムが、コンピューター又は電子システムの制御下にある請求項７７に記載の装置。７９．細胞内シグナル経路に直接又は間接に作用し、医薬として有用な可能性がある生物活性物質（類）の同定のためのスクリーニングプログラムの一部として行う際の請求項１〜３８又は７０のいずれかに記載の方法。８０．細胞内シグナル経路での干渉により毒性作用を奏する生物学的に毒性の物質の同定のためのスクリーニングプログラムの一部として行う際の請求項１〜３８又は７０のいずれかに記載の方法。８１．ここに定義されるシグナル変換経路のバックトラッキング用プログラムの一部として行う際の請求項１〜３８又は７０のいずれかに記載の方法。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＧＷ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者カスパー，アルムホルトデンマーク国、コペンハーゲンエスディーケイ―2300、ティヴィ４．、エイギルスガーデ 32 (72)発明者スクダー，クルトデンマーク国、ヴィルムディーケイ― 2830、ラヴェンデルハーヴェン 70

Claims

【特許請求の範囲】１．発光団（細胞（類）に存在し、影響の度合に関連するように再分布可能であり、及び／又は影響の度合に関連するように再分布可能な成分でモジュレートされ、その関連性により発光団の発光特性のモジュレーションが生じる）から放射された空間分散光における機械的に無傷な生細胞（類）への影響により生じる変動を記録し、空間分散光で記録された変動を処理して空間分布を細胞応答への影響度合に相関する定量情報にすることからなる、細胞応答への影響に関する定量情報の抽出方法。２．発光団（細胞（類）に存在し、経路をモジュレートすることにより、細胞内経路の少なくとも１つの成分の再分布に関連するように再分布可能である）から放射される空間分散光で現れるごとく、機械的に無傷の生細胞（類）に対する影響の結果を記録し、記録した結果を処理して空間分散光に関する定量情報を与え、かつ細胞内経路への影響度合に定量情報を相関させることからなる、細胞内経路に関連した少なくとも１つの成分又はその一部の再分布に関与する細胞内経路への影響に関する定量情報を抽出するのに用いられる、請求項１に記載の方法。３．細胞応答の影響への度合又は細胞内経路への影響の結果を示す定量情報を、同様に記録した応答又は結果に基づいて、関連した特異的影響の既知の度合にあらかじめ行った較正による記録（類）から抽出する請求項１又は２に記載の方法。４．影響が、機械的に無傷の生細胞（類）と化学物質との接触及び／又は機械的に無傷の生細胞（類）と化学物質との培養である前記請求項の何れかに記載の方法。５．物質が、細胞内経路への影響を決定できる物質である請求項４に記載の方法。６．記録が、影響の付加後の単一の時点でなされる前記請求項の何れかに記載の方法。７．記録が２つの時点でなされ、その１点は影響の付加前で、他の点はその後である請求項１〜５の何れかに記載の方法。８．記録が一連の時点で行われ、影響の付加は一連の記録の第１時点後の数回で行い、例えば0.1秒〜１時間、好ましくは１〜60秒、より好ましくは１〜30秒、特に１〜10秒の所定の時間隔で、１秒〜12時間、10秒〜12時間、例えば10秒〜１時間、60秒〜30分又は20分のような時間範囲をかけて記録される請求項１〜５の何れかに記載の方法。９．細胞（類）が、応答が有意であるとして予め決められた影響の付加後の時点で固定され、かつ記録が後の任意の時間でなされる請求項１〜７の何れかに記載の方法。１０．発光団が、生理学的に影響の度合に関連するように再分布可能な発光団である前記請求項の何れかに記載の方法。１１．発光団が、生理学的に影響の度合に関連するように再分布可能な成分と会合しうる発光団である前記請求項の何れかに記載の方法。１２．発光団が、影響の度合に相関することが実験的に決定されるように再分布できる発光団である前記請求項の何れかに記載の方法。１３．発光団が、細胞内経路の少なくとも１つの成分と実質的に同様に、細胞内経路のモジュレーションにより再分布可能な発光団である前記請求項の何れかに記載の方法。１４．発光団が、経路のモジュレーションで再分布される成分との空間的会合で消滅可能な発光団であり、その消滅は発光強度の減少として測定される請求項１〜１３の何れかに記載の方法。１５．発光団で放射された空間分散光に関する変動又は結果が、発光団とそれにエネルギーを伝達しうる他の発光体との共鳴エネルギーの転移変化で検出され、その各々は細胞内経路の特定成分の一部となるか、結合又は会合するよう選択又は設計されており、その１つは影響に応じて再分布し、それによって共鳴エネルギー転移の量を変化させ、共鳴エネルギー転移の変化が発光団からの放射強度の変化として測定される請求項１〜１３の何れかに記載の方法。１６．発光団からの放射強度の変化が、非空間的な解像様式で、発光団の平均強度のみに反応する単チャンネルの光検出器で検知される請求の項１５に記載の方法。１７．記録される光の性質が、強度、蛍光寿命、偏光、波長シフト又は基礎をなす細胞応答の結果としてモジュレートされる他の性質である請求項１〜１６の何れかに記載の方法。１８．空間分散光の記録が、光の記録可能な性質の空間分布を順序アレイ値の型で記録する記録システムを用いて行われる請求項１〜１５又は１７の何れかに記載の方法。１９．光の記録可能な性質の空間分散の記録が、CCDアレイのような電荷転移装置又はビディコンチューブのような真空チューブ装置を用いて行われる請求項１８に記載の方法。２０．測定される光が、測定すべき光の所望成分を選択し、他の成分を拒絶するフィルターを通過する前記請求項の何れかに記載の方法。２１．記録可能な光の性質に関する空間分散の記録が、蛍光顕微鏡で行われる前記請求項の何れかに記載の方法。２２．発光団から放射される光に関する変動又は結果の記録が、空間分散光を１以上のデジタル画像として記録することにより行われ、１以上の代表的な再分布の度合に記録した変動を縮小する処理が、デジタル画像処理法又はその組合せからなる前記請求項の何れかに記載の方法。２３．細胞内経路が、細胞内シグナル経路である請求項２〜２２の何れかに記載の方法。２４．発光団が発蛍光団である前記請求項の何れかに記載の方法。２５．発光団が、細胞（類）に保持されるヌクレオチド配列でエンコードされ、発現されるポリペプチドである前記請求項の何れかに記載の方法。２６．発光団が、ここに定義の２つのポリペプチド（一方が発光性ポリペプチド、他方が生物活性ポリペプチドからなる）各々の少なくとも一部分の融合体からなるハイブリッドポリペプチドである前記請求項の何れかに記載の方法。２７．発光性ポリペプチドが、ここに定義するGFPである請求項２６に記載の方法。２８． GFPが、ここに定義するF64L変異を有する緑色蛍光タンパク質からなる群から選択される請求項２７に記載の方法。２９． GFPが、F64L-GFP、F64L-Y66H-GFP、F64L-S65T-GFPとEGFPからなる群から選択されるGFP変異体である請求項２８に記載の方法。３０． a)任意にリンカーを介し、ヌクレオチド配列を発現させる条件下で生物活性ポリペプチドのN又はC末端標識されているGFPからなるハイブリッドポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含有する１以上の細胞を培養し、 b)細胞（類）を生物活性物質と培養して、生物活性ポリペプチドの活性をモジュレートし、かつ c)培養した細胞（類）が産生した蛍光を測定し、蛍光に関する結果又は変動（細胞内の生物活性ポリペプチドの転位を示す）を決定することからなる、活性化で細胞内過程に影響する生物活性ポリペプチドの細胞内転位を検出する前記請求項の何れかに記載の方法。３１．ヌクレオチド配列がDNA配列である請求項３０に記載の方法。３２．モジュレーションが活性化である請求項３０又は３１に記載の方法。３３．モジュレーションが不活化である請求項３０又は３１に記載の方法。３４．細胞（類）の蛍光がモジュレーション前に測定され、工程(c)で測定された結果又は変動が、モジュレーション前に測定した蛍光と比較した蛍光の変化である請求項３０〜３３の何れかに記載の方法。３５．細胞内過程が、細胞内シグナル経路である請求項３０〜３４の何れかに記載の方法。３６．工程(c)で測定された蛍光の変化が、蛍光の空間分散の変化を決定することからなる請求項３４に記載の方法。３７．機械的に無傷の生細胞（類）が哺乳類細胞（類）で、影響が観察される期間、30℃又はそれ以上の温度、好ましくは32〜39℃の温度、より好ましくは35 ℃〜38℃の温度、最も好ましくは約37℃の温度で培養される前記請求項の何れかに記載の方法。３８．少なくとも１つの機械的に無傷の生細胞が、同一又は非同一細胞のマトリクスの一部である前記請求項の何れかに記載の方法。３９．細胞（類）が、酵母細胞のような菌類細胞、昆虫細胞を含む無脊椎動物細胞及び哺乳類細胞のような脊椎動物細胞からなる群から選択される請求項１〜３６及び３８の何れかに記載の方法。４０．細胞内シグナル経路の成分である生物活性ポリペプチド、又はその一部及びGFPからなる融合ポリペプチドをコードし、但し、生物活性ポリペプチドがP KC-α、PKC-γ及びPKC-εからなる群から選択される融合ポリペプチドをコードする構造物ではない、核酸構造物。４１．細胞内シグナル経路の成分である生物活性ポリペプチド、又はその一部及びGFPのF64L変異体からなる融合ポリペプチドをコードする核酸構造物。４２．生物活性ポリペプチドが、プロテインキナーゼ又はホスファターゼである請求項４０又は４１に記載の核酸構造物。４３． GFPが、任意にペプチドリンカーを介して、生物活性ポリペプチド又はその一部のN-又はC-末端標識されている請求項４０〜４２のいずれかに記載の核酸構造物。４４．生物活性ポリペプチドが、活性化で細胞局在を変える転写因子又はその一部である請求項４０、４１及び４３のいずれかに記載の核酸構造物。４５．生物活性ポリペプチドが、細胞骨格ネットワークに結合し、活性化で細胞局在を変えるタンパク質又はその一部である請求項４０、４１及び４３のいずれかに記載の核酸構造物。４６．生物活性ポリペプチドが、活性化で細胞局在を変えるプロテインキナーゼ又はその一部である請求項４０〜４３のいずれかに記載の核酸構造物。４７．プロテインキナーゼが、活性化で細胞内局在を変え得るセリン／スレオニンプロテインキナーゼ又はその一部である請求項４６に記載の核酸構造物。４８．プロテインキナーゼが、活性化で細胞内局在を変え得るチロシンプロテインキナーゼ又はその一部である請求項４６に記載の核酸構造物。４９．プロテインキナーゼが、活性化で細胞内局在を変え得るリン脂質-依存性セリン／スレオニンプロテインキナーゼ又はその一部である請求項４６に記載の核酸構造物。５０．プロテインキナーゼが、活性化で細胞内局在を変え得るcAMP- 依存性プロテインキナーゼ又はその一部である請求項４６に記載の核酸構造物。５１． PKAc-F64L-S65T-GFP融合体をコードする請求項５０に記載の核酸構造物。５２．プロテインキナーゼが、活性化で細胞内局在を変え得るcGMP-依存性プロテインキナーゼ又はその一部である請求項４６に記載の核酸構造物。５３．プロテインキナーゼが、活性化で細胞内局在を変え得るカルモジュリン -依存性セリン/スレオニンプロテインキナーゼ又はその一部である請求項４６に記載の核酸構造物。５４．プロテインキナーゼが、活性化で細胞局在を変え得るマイトジェン-活性化セリン/スレオニンプロテインキナーゼ又はその一部である請求項４６に記載の核酸構造物。５５． ERK1-F64L-S65T-GFP融合体をコードする請求項５４に記載の核酸構造物。５６． EGFP-ERK1融合体をコードする請求項５４に記載の核酸構造物。５７．プロテインキナーゼが、活性化で細胞局在を変え得るサイクリン-依存性セリン/スレオニンプロテインキナーゼ又はその一部である請求項４６に記載の核酸構造物。５８．生物活性ポリペプチドが、活性化で細胞局在を変え得るプロテインホスファターゼ又はその一部である請求項４２又は４３に記載の核酸構造物。５９．DNA構造物である請求項４０〜５８のいずれかに記載の核酸構造物。６０． GFPをエンコードする遺伝子が、エクオレア・ビクトリア由来である請求項４０〜５９のいずれかに記載の核酸構造物。６１． GFPをエンコードする遺伝子が、ここに定義するEGFPをエンコードする遺伝子である請求項６０に記載の核酸構造物。６２． GFPをエンコードする遺伝子が、F64L-GFP、F64L-Y66H-GFP及びF64L-S65 T-GFPから選択されるGFP変異体をエンコードする遺伝子である請求項６０に記載の核酸構造物。６３． SEQ ID NO:38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64 、66、68、70、72、74、76、78、108、110、112、114、116、118、120、122、12 4、126、128、130、132、134、136、138、140及び142に示すDNA配列の何れかで同定される構造物か、又は、ここに定義する同じ融合ポリペプチドもしくはそれらと生物学的に等価な融合ポリペプチドをエンコードしうるそれらの変異体である請求項５９及び６１又は６２に記載のDNA構造物。６４．構造物でエンコードされる配列を発現しうる請求項４０〜６３のいずれかに記載の核酸構造物を含む細胞。６５．真核細胞である請求項６４に記載の細胞。６６．酵母細胞のような菌類細胞、昆虫細胞を含む無脊椎動物細胞及び哺乳類細胞のような脊椎動物細胞からなる群から選択される請求項６４に記載の細胞。６７．哺乳類細胞である請求項６６に記載の細胞。６８．核酸配列を発現しうる細胞成分の少なくとも１つに、請求項４０〜５９のいずれかに記載の構造物に含まれるような核酸配列を有する生物。６９．単細胞及び哺乳動物のような多細胞生物からなる群から選択される請求項６８に記載の生物。７０．任意にペプチドリンカーを介して、生物活性ポリペプチド又はその一部又はそのサブユニット（ここに定義する細胞内シグナル経路の成分である）のN-又はC-末端標識されているGFPからなり、請求項４０〜５９のいずれかに記載の核酸構造物でエンコードされるプローブである蛍光プローブ。７１．発光団が、請求項４０〜６３のいずれかに記載の核酸構造物でエンコードされるような融合ポリペプチドである請求項１〜３９のいずれかに記載の方法。７２．本発明の方法が、ここに定義するスクリーニングプログラムに用いられる請求項１〜３９又は７１に記載の方法。７３． (a)光源、(b)タンパク質の蛍光を励起する光源からの光波長の選択手段、(c)励起光をシステムの残部に急速にブロック又は通過させる手段、(d)励起光を試料に運び、空間的に解像した様式で放射蛍光を回収し、かつこの蛍光からの画像を形成する一連の光学部材、(e)一連の光学部材に対し所定のジオメトリーで測定される細胞の容器を保持するベンチもしくはスタンド、(f)空間的に解像した蛍光を画像の形で記録する検出器、(g)記録した画像を捕捉して蓄積し、かつ記録した画像から再分布の度合を計算するコンピューター又は電子システム及び関連ソフトウェアの構成部を含む、少なくとも１つの細胞での蛍光分布、それによる少なくとも１つの細胞での蛍光分布の何れかの変化を測定する装置。７４．システムの一部又は全てが自動化されている請求項７３に記載の装置。７５．構成部d及びeが、蛍光顕微鏡からなる請求項７３に記載の装置。７６．構成部fがCCDカメラである請求項７３に記載の装置。７７．光学スキャンシステムで画像を形成し、記録する請求項７３に記載の装置。７８．液体付加システムが、所定の時間で細胞ホルダー中の細胞のいずれか又は全てに既知もしくは未知の化合物を加えるのに用いられる請求項７３に記載の装置。７９．液体付加システムが、コンピューター又は電子システムの制御下にある請求項７８に記載の装置。８０．細胞内シグナル経路に直接又は間接に作用し、医薬として有用な可能性があるここに定義する生物活性物質の同定のためのスクリーニングプログラムであって、スクリーニングされる各物質の個々の測定結果が、細胞内シグナル経路の活性化で分布を変化させる空間的に解像された発光の再分布を生細胞で測定することに基づいて、潜在的な生物活性を示す請求項１〜７９のいずれかに記載の方法。８１．細胞内シグナル経路での干渉により毒性作用を奏する、ここに定義するような生物学的に毒性の物質の同定のためのスクリーニングプログラムであって、スクリーニングされる各物質の個々の測定結果が、生細胞での蛍光プローブの再分布測定に基づいて潜在的な生物毒性活性を示し、細胞内シグナル経路の活性化で分布を変化させる請求項１〜７９のいずれかに記載の方法。８２．蛍光プローブが、ここに定義するシグナル変換経路のバックトラッキングに用いられる請求項１〜８０のいずれかに記載の方法。８３．プロテインキナーゼの細胞内機能に関連した症状又は疾患の患者に、本発明のいずれかの方法で発見された化合物の有効量を投与することからなる、前記症状又は疾患の治療方法。８４．本発明の方法で決定される、ここに定義される細胞内経路の成分をモジュレートする化合物。８５．本発明の方法で同定された化合物の治療上の量を含む医薬組成物。８６．医薬治療に応じた慢性疾患の患者から一次細胞（類）を得て、本発明の蛍光プローブをエンコードする少なくとも１つのDNA配列で細胞（類）をトランスフェクトし、前記プローブを発現させる条件下で細胞（類）を培養して慢性疾患を和らげることができると推測される医薬のアレイにさらし、次いで、無傷の生細胞（類）での蛍光プローブの蛍光パターン又は再分布パターンの変化を比較して、特異的な医薬に対する細胞応答を検出し(細胞作用プロフィルを得る)、次いで所望の活性と許容できる副作用レベルに基づいて医薬（類）を選択し、これらの医薬（類）の有効量を患者に投与することからなる前記患者を選択的に治療する方法。８７．細胞内シグナル経路の成分である生物活性ポリペプチドの群から薬剤のターゲットを同定する請求項１〜８０のいずれかに記載の方法。