JP2001521004A

JP2001521004A - 脂肪酸−アシル化インスリン類似体

Info

Publication number: JP2001521004A
Application number: JP2000517731A
Authority: JP
Inventors: フローラ，デビッド，ベンジャミン
Original assignee: Eli Lilly and Co
Current assignee: Eli Lilly and Co
Priority date: 1997-10-24
Filing date: 1998-10-22
Publication date: 2001-11-06
Also published as: PL340255A1; US20010036916A1; AR020047A1; IL134901A0; SV1998000125A; EP1039920A1; PE123799A1; AU1116699A; US20020082199A1; NO20002038D0; CO4970769A1; BR9813111A; US6465426B2; JP2001521006A; WO1999021578A1; CA2306877A1; TR200001050T2; ID24890A; HRP20000236A2; AU1111799A

Abstract

(57)【要約】脂肪酸−アシル化インスリン類似体は適度に酸性のpHにて可溶性であり、グルコースレベルの長時間作用性基礎的制御をもたらす。そのような分子において、インスリン類似部分は、インスリンB-鎖の類似体に適正に架橋されたインスリンA-鎖またはその類似体を含む。ここで、B-鎖類似体の28位または29位のLys残基のε−アミノ基は脂肪酸でアシル化されている。分子のインスリン類似部分は、31位および32位にArgを含むB-鎖類似体に適正に架橋された、任意に０位にArgを有するインスリンのA-鎖またはその類似体を含む。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】本出願は、1997年10月24日に出願された米国仮出願第60/063104号および1998 年6月11日に出願された米国仮出願第60/088930号についての優先権を主張するも
のである。〔発明の分野〕本発明は、臨床医学の分野に属し、糖尿病および高血糖症の治療に有用な、等
電点がシフトした脂肪酸−アシル化インスリン類似体を提供する。

【０００２】〔発明の背景〕インスリン代償療法を用いることによって真性糖尿病では急性合併症による死
亡率および罹患率が抑制されている。しかしながら、慢性糖尿病の合併症は、主
として血糖の調節低下から生じる持続的な代謝障害により重大な健康上の問題を
残している。糖尿病管理および合併症試験(Diabetes Control and Complication
s Trial(DCCT))から浮き彫りになる結果から、HbAlc（グリコシル化ヘモグロビン）の1％の減少が網膜症の発生率の35％以上の改善と相関していることがわかる(DCCT研究グループ, New. Engl. J. Med., 329, 977-986(1993))。

【０００３】正常血糖を実現するために、正常な個体における内因性インスリン分泌のパタ
ーンと可能な限り厳密に対応するような治療法を設計しなければならない。イン
スリンの１日の生理学的要求量は変動し、２段階、すなわち(a)吸収段階（これは金属が関連した血糖急上昇を処理するためにインスリンのパルスが必要である
）、および(b)吸収後段階（これは肝臓グルコース生産量を調節して最適空腹時血糖を維持するために持続的な量のインスリンが必要である）に分けることがで
きる。したがって、有効な治療法は、２つのタイプの外因性インスリン、すなわ
ち即効性食事時間型インスリンおよび長時間作用性または中時間作用性基礎的イ
ンスリンを組み合わせて使用することを含む。

【０００４】現在利用可能な長時間作用性または中時間作用性基礎的インスリンは少なくと
も二つの点で理想的でない懸濁物質である。第１に、患者によって達成される再
懸濁の程度はかなり変動しやすいということが観察された。このように再懸濁の
程度が変動しやすいことにより、患者が使用をやめたり、インスリンを過剰また
は過少に注射するリスクが増大する(Skyler, J.S., Medical Clinics of North
America, 72, 1337-1354(1988))。過剰のインスリンを注射した場合、患者は低血糖症、ならびにそれに随伴する失神、痙攣および昏睡のリスクの増大に直面す
る。インスリン注射量が少なすぎた場合、患者の血糖値が希望する量よりも高い
ままになり、糖尿病の結果である血管の変性を発現する傾向が増大する。

【０００５】第２に、このような長時間作用性または中時間作用性基礎的グルコース制御用
の現存するインスリン製剤の多くは免疫原性である。ウシインスリンはヒトイン
スリンと３つの点で相違し、ウシインスリン（ウルトラレンテ(Ultralente))を長期間使用すると糖尿病患者の中には中和抗体の産生が生じる患者もいる。プロ
タミンは、抗体産生を生じる患者もいるということが分かっている魚タンパク質
である(Ellerhorst, J.A.ら, The American Journal of the Medical Sciences,
299, 298-301(1987))。したがって、ウシウルトラレンテまたはインスリン-NPH
製剤を長期間使用すると、患者がそのインスリン製剤に対してアレルギー性にな
るか、または抗体が特に短時間作用性インスリンの薬物動態を変化させるという
リスクが増大する。このような結果から、患者はこれらのインスリン製剤の使用
を停止しなければならなくなる可能性がある。

【０００６】これらの問題を最小限にするか、あるいは回避するために代替の二つのアプロ
ーチが推し進められている。第１のアプローチでは、インスリン類似体分子の等
電点を皮下部位のおおよその等電点まで上昇させるために適当なアミノ酸修飾を
行っている。そのようなインスリン類似体は、その等電点をかなり下回るpH、す
なわちpH3〜5の範囲で製剤化されるので、バイアル内で可溶性のままである。皮
下注射後、生理学的pHにすばやく調節されて、これらの類似体は沈殿または結晶
化する。その後、ゆっくりと溶解するので望みどおりの作用の遅延が得られる。
ある一定のインスリン類似体はpH3〜5で可溶性であるが、より高い生理学的pHで
沈殿するのでヒトインスリンと比べて長い時間作用する。例えば、Markussen, J
.ら, Protein Engineering, 1, 215-223(1987); Jorgensen, S.ら, British Med
ical Journal, 299, 415-419(1989); 1990年8月7日に発行されたMarkussen, J. の米国特許第4,946,828号; Zeuzem, S.ら, Diabetologia, 33, 65-71(1990); 19
96年4月9日に発行されたVertesy, L.らの米国特許第5,506,202号; 1996年2月13 日に発行されたHoffmann, J.らの米国特許第5,491,216号; 1997年8月12日に特許
されたDorschug, M.の米国特許第5,656,722号; 1997年8月15日に出願されたChan
ce, R.E.らの米国仮出願第60/055,828号を参照されたい。第1のアプローチはいくつかの興味深い結果をもたらしたが、このインスリン研究の分野においてはい
くつかの問題が残ったままである。

【０００７】血糖の基礎制御をもたらす第2の一般的な代替アプローチは、インスリンを脂肪酸でアシル化し、血清アルブミンによる脂肪酸の結合に依拠して血液循環にお
けるインスリン活性を長期間維持させることである(WalderらのWO92/01476; Mur
anishiらの日本特許出願1-254,699号; Hashimoto, M.ら, Pharmaceutical Resea
rch, 6, 171-176(1989); 1997年12月2日に発行されたBaker, J.C.らの米国特許第5,693,609号; 1995年3月23日に国際公開されたHavelund, S.らのWO95/07931;
および1996年9月26日に国際公開されたJonassen, I.らのWO96/29342）。ある程度延長されたものの、これらのアシル化インスリンおよびインスリン類似体の時
間作用は血糖値の理想的な基礎制御をもたらすには不十分な長さである。特に、
それらは1日当たり少なくとも2回投与する必要があるのに対して、理想的な基礎
インスリンにはもっぱら1日当たり1回の投与が要求される。さらに、アシル化イ
ンスリンのいくつかはインスリンと比較して効力が低く、血糖値の十分な制御を
得るにはこれらのアシル化インスリンがかなり大量に必要である。

【０００８】（発明の概要）本発明は、アミド結合により脂肪族アシル鎖が連結されたインスリン類似体を
含んでなる、インスリンの等電点よりも高い等電点を有する脂肪酸−アシル化イ
ンスリン類似体を提供する。上記の多くの刊行物のどれにも等電点が上昇したア
シル化インスリン類似体は開示されておらず、そしてその望ましさを示唆してい
るものはない。インスリンと比べて等電点が増大しているインスリン類似体のア
シル化は、優れた血糖制御と関連しており、予想外に治療上望ましい基礎的イン
スリンレベルをもたらす。

【０００９】本発明は、さらに、本発明の脂肪酸−アシル化インスリン類似体、ならびに保
存剤、金属イオン、等張剤および製薬上許容されるバッファーから選択される1 以上の賦形剤を含む可溶性製剤を提供する。また、本発明は、高血糖症の治療が
必要な患者に有効用量の本発明の脂肪酸−アシル化インスリン類似体を投与する
ことを含む、高血糖症を治療する方法も提供する。また、本発明は、高血糖症の
治療が必要な患者に有効用量の本発明の脂肪酸−アシル化インスリン類似体を投
与することを含む、高血糖症を治療する方法も提供する。

【００１０】本発明は、アミド結合により結合した脂肪族アシル鎖を有するインスリン類似
体を含んでなる、インスリンの等電点よりも高い等電点を有する脂肪酸−アシル
化インスリン類似体を含む。また、本発明はインスリンの等電点よりも高い等電
点を有する脂肪酸−アシル化インスリン類似体であって、該アシル化インスリン
類似体がインスリンよりも少なくとも1大きい正の実効電荷を有するものである、上記類似体も含む。また、本発明は、インスリンの等電点よりも高い等電点を
有する脂肪酸−アシル化インスリン類似体であって、該アシル化インスリンがイ
ンスリンよりも少なくとも２大きい正の実効電荷を有するものである、上記類似
体も含む。

【００１１】本発明は、下記式で示されるモノアシル化インスリン類似体であって、 (a) 配列番号２のポリペプチドに適正に架橋された配列番号１のポリペプチド
またはその薬学的に許容できる塩であって、配列番号１のポリペプチドは配列：

【化３】（式中、 0位のXaaはArgであるか、または存在せず、そして 21位のXaaはCysおよびLysを除く任意の天然アミノ酸である）を有し、配列番号２のポリペプチドは配列：

【化４】（式中、 3位のXaaはCysおよびLysを除く任意の天然アミノ酸であり； 27位のXaaはThrであるか、または存在せず； 28位のXaaはPro、Leu、Val、Ala、LysおよびAspからなる群から選択され； 29位のXaaはProおよびLysからなる群から選択され； 30位のXaaは存在しないか、またはCysまたはLysを除く任意の天然アミノ酸であり；さらに28位または29位はLysであり、28位がLysの場合には29位はLysではない）を有するものであること；ならびに (b) 配列番号２の28位または29位のLysがアシル化されていること、を特徴とする、前記類似体を包含する。

【００１２】本発明はさらに、配列番号２のポリペプチドの30位のXaaがThrである上記式で
示されるモノアシル化インスリン類似体；配列番号１のポリペプチドの21位のXa
aがAsnである上記式で示されるモノアシル化インスリン類似体；または配列番号
２のポリペプチドの3位のXaaがAsnである上記式で示されるモノアシル化インスリン類似体を含む。

【００１３】本発明はさらに、配列番号１のポリペプチドの21位のXaaがAsnであり、そして
配列番号２のポリペプチドの3位のXaaがAsnである、上記式で示されるモノアシル化インスリン類似体を含む。本発明はさらに、配列番号１の21位のXaaがAsnで
あり、配列番号２のポリペプチドの3位のXaaがAsnであり、そしてさらに配列番号２のポリペプチドの28位のXaaがProであり、そして配列番号２のポリペプチド
の29位のXaaがLysである、上記式で示されるモノアシル化インスリン類似体を含
む。本発明の別のモノアシル化インスリン類似体は、配列番号１のポリペプチド
の21位のXaaがAsnであり、そして配列番号２のポリペプチドの3位のXaaがAsnであり、そしてさらに配列番号２のポリペプチドの28位のXaaがLysであり、そして
配列番号２のポリペプチドの29位のXaaがProである上記式で表される。

【００１４】また本発明は、配列番号１のポリペプチドの21位のXaaがGlyであり、そして配
列番号２のポリペプチドの3位のXaaがGlnである、上記式で示されるモノアシル化インスリン類似体も含む。さらに別の類似体は、配列番号１のポリペプチドの
21位のXaaがGlyであり、そして配列番号２のポリペプチドの3位のXaaがAspである、上記式で表される。

【００１５】本発明はさらに、配列番号２のポリペプチドの28位または29位のLysがC₄〜C₂₁ 脂肪酸でアシル化されている、上記式で示されるモノアシル化インスリン類似体
を含む。また本発明は、配列番号２のポリペプチドの28位または29位のLysがC₁₀ 〜C₁₈脂肪酸でアシル化されている、上記式で示されるモノアシル化インスリン類似体も含む。また本発明は、配列番号２のポリペプチドの28位または29位のLy
sがパルミチン酸およびミリスチン酸からなる群から選択される脂肪酸でアシル化されている、上記式で示されるモノアシル化インスリン類似体も含む。

【００１６】本発明はさらに、配列番号２のポリペプチドの28位または29位のLysがC₄〜C₈ 脂肪酸でアシル化されている、上記式で示されるモノアシル化インスリン類似体
を含む。本発明はさらに、配列番号２のポリペプチドの28位または29位のLysがオクタン酸およびヘキサン酸からなる群から選択される脂肪酸でアシル化されて
いる、上記式で示されるモノアシル化インスリン類似体も含む。

【００１７】さらに別の類似体は、配列番号１のポリペプチドの0位のXaaがArgである上記式で表される、モノアシル化トリ-アルギニンインスリン類似体である。本発明は、このトリ-アルギニンインスリン類似体の改変体を含み、例えば配列番号１のポリペプチドの21位のXaaがGly、Asn、AlaおよびGlnからなる群から選択される類似体である。別のトリ-アルギニンインスリン類似体は配列番号１のポリペプチドの21位のXaaがGlyである。さらに別のトリ-アルギニンインスリン類似体は、配列番号１のポリペプチドの21位のXaaがAsnである。

【００１８】本発明の別のモノアシル化トリ-アルギニンインスリン類似体は、配列番号１のポリペプチドの21位のXaaがGlyであり、配列番号２の3位のXaaがAsnであり、配列番号２の27位のXaaがThrであり、配列番号２の28位のXaaがProであり、そし
て配列番号２の29位のXaaがLysである、上記式で表される。本発明のさらに別の
モノアシル化トリ-アルギニンインスリン類似体は、配列番号１のポリペプチドの21位のXaaがGlyであり、配列番号２の3位のXaaがGlnであり、配列番号２の27 位のXaaがThrであり、配列番号２の28位のXaaがProであり、そして配列番号２の
29位のXaaがLysである、上記式で表される。

【００１９】本発明のさらに別のモノアシル化トリ-アルギニンインスリン類似体は、配列番号１のポリペプチドの21位のXaaがGlyであり、配列番号２の3位のXaaがAspであり、配列番号２の27位のXaaがThrであり、配列番号２の28位のXaaがProであり
、そして配列番号２の29位のXaaがLysである、上記式で表される。本発明のさら
に別のモノアシル化トリ-アルギニンインスリン類似体は、配列番号１のポリペプチドの21位のXaaがAsnであり、配列番号２の3位のXaaがAsnであり、配列番号２の27位のXaaがThrであり、配列番号２の28位のXaaがProであり、そして配列番
号２の29位のXaaがLysである、上記式で表される。

【００２０】また本発明は、配列番号１のポリペプチドの21位のXaaがGlyであり、配列番号
２の3位のXaaがAsnであり、配列番号２の27位のXaaがThrであり、配列番号２の2
8位のXaaがLysであり、そして配列番号２の29位のXaaがProである、上記式で示されるモノアシル化トリ-アルギニンインスリン類似体も包含する。本発明のさらに別のモノアシル化トリ-アルギニンインスリン類似体は、配列番号１のポリペプチドの21位のXaaがGlyであり、配列番号２の3位のXaaがGlnであり、配列番号２の27位のXaaがThrであり、配列番号２の28位のXaaがLysであり、そして配列
番号２の29位のXaaがProである、上記式で表される。

【００２１】本発明は、配列番号１のポリペプチドの21位のXaaがGlyであり、配列番号２の
3位のXaaがAspであり、配列番号２の27位のXaaがThrであり、配列番号２の28位のXaaがLysであり、そして配列番号２の29位のXaaがProである、上記式で示され
るさらに別のモノアシル化トリ-アルギニンインスリン類似体を含む。また本発明は、配列番号１のポリペプチドの21位のXaaがAsnであり、配列番号２の3位のX
aaがAsnであり、配列番号２の27位のXaaがThrであり、配列番号２の28位のXaaが
Lysであり、そして配列番号２の29位のXaaがProである、上記式で示されるモノアシル化トリ-アルギニンインスリン類似体も含む。

【００２２】さらに別の類似体は、配列番号１のポリペプチドの0位のXaaが存在しない上記
式で表される、モノアシル化ジ-アルギニンインスリン類似体である。本発明の類似体は、配列番号１のポリペプチドの21位のXaaがGly、Asn、AlaおよびGlnからなる群から選択される、上記式で示されるモノアシル化ジ-アルギニンインスリン類似体である。

【００２３】また本発明は、配列番号１のポリペプチドの21位のXaaがGlyである、上記式で
示されるモノアシル化ジ-アルギニンインスリン類似体も含む。また本発明は、配列番号１のポリペプチドの21位のXaaがAsnである、上記式で示されるモノアシ
ル化ジ-アルギニンインスリン類似体も含む。

【００２４】また本発明は、配列番号１のポリペプチドの21位のXaaがGlyであり、配列番号
２の3位のXaaがAsnであり、配列番号２の27位のXaaがThrであり、配列番号２の2
8位のXaaがProであり、そして配列番号２の29位のXaaがLysである、上記式で示されるモノアシル化ジ-アルギニンインスリン類似体も含む。また本発明は、配列番号１のポリペプチドの21位のXaaがGlyであり、配列番号２の3位のXaaがGln であり、配列番号２の27位のXaaがThrであり、配列番号２の28位のXaaがProであ
り、そして配列番号２の29位のXaaがLysである、上記式で示されるモノアシル化
ジ-アルギニンインスリン類似体も含む。

【００２５】また本発明は、配列番号１のポリペプチドの21位のXaaがAsnであり、配列番号
２の3位のXaaがAsnであり、配列番号２の27位のXaaがThrであり、配列番号２の2
8位のXaaがProであり、そして配列番号２の29位のXaaがLysである、上記式で示されるモノアシル化ジ-アルギニンインスリン類似体も含む。本発明はさらに、配列番号１のポリペプチドの21位のXaaがGlyであり、配列番号２の3位のXaaがAs
nであり、配列番号２の27位のXaaがThrであり、配列番号２の28位のXaaがLysであり、そして配列番号２の29位のXaaがProである、上記式で示されるモノアシル
化ジ-アルギニンインスリン類似体も含む。

【００２６】また本発明は、配列番号１のポリペプチドの21位のXaaがGlyであり、配列番号
２の3位のXaaがGlnであり、配列番号２の27位のXaaがThrであり、配列番号２の2
8位のXaaがLysであり、そして配列番号２の29位のXaaがProである、上記式で示されるモノアシル化ジ-アルギニンインスリン類似体も含む。また本発明は、配列番号１のポリペプチドの21位のXaaがAsnであり、配列番号２の3位のXaaがAsn であり、配列番号２の27位のXaaがThrであり、配列番号２の28位のXaaがLysであ
り、そして配列番号２の29位のXaaがProである、上記式で示されるモノアシル化
ジ-アルギニンインスリン類似体も含む。

【００２７】本発明は、下記のモノアシル化インスリン類似体を含む： B29-N^ε-Gly^A21Arg^B31Arg^B32-ミリストイルヒトインスリン； B29-N^ε-Gly^A21Gln^B3Arg^B31Arg^B32-ミリストイルヒトインスリン； B29-N^ε-Arg^A0Gly^A21Arg^B31Arg^B32-ミリストイルヒトインスリン； B29-N^ε-Arg^A0Gly^A21Gln^B3Arg^B31Arg^B32-ミリストイルヒトインスリン； B29-N^ε-Arg^A0Gly^A21Asp^B3Arg^B31Arg^B32-ミリストイルヒトインスリン； B29-N^ε-Arg^B31Arg^B32-ミリストイルヒトインスリン； B29-N^ε-Arg^A0Arg^B31Arg^B32-ミリストイルヒトインスリン； B29-N^ε-Gly^A21Arg^B31Arg^B32-オクタノイルヒトインスリン； B29-N^ε-Gly^A21Gln^B3Arg^B31Arg^B32-オクタノイルヒトインスリン； B29-N^ε-Arg^A0Gly^A21Arg^B31Arg^B32-オクタノイルヒトインスリン； B29-N^ε-Arg^A0Gly^A21Gln^B3Arg^B31Arg^B32-オクタノイルヒトインスリン； B29-N^ε-Arg^A0Gly^A21Asp^B3Arg^B31Arg^B32-オクタノイルヒトインスリン； B29-N^ε-Arg^B31Arg^B32-オクタノイルヒトインスリン； B29-N^ε-Arg^A0Arg^B31Arg^B32-オクタノイルヒトインスリン類似体； B28-N^ε-Gly^A21Lys^B28Pro^B29Arg^B31Arg^B32-ミリストイルインスリン； B28-N^ε-Gly^A21Gln^B3Lys^B28Pro^B29Arg^B31Arg^B32-ミリストイルインスリン； B28-N^ε-Arg^A0Gly^A21Lys^B28Pro^B29Arg^B31Arg^B32-ミリストイルインスリン； B28-N^ε-Arg^A0Gly^A21Gln^B3Lys^B28Pro^B29Arg^B31Arg^B32-ミリストイルインスリン； B28-N^ε-Arg^A0Gly^A21Asp^B3Lys^B28Pro^B29Arg^B31Arg^B32-ミリストイルインスリン； B28-N^ε-Lys^B28Pro^B29Arg^B31Arg^B32-ミリストイルインスリン； B28-N^ε-Arg^A0Lys^B28Pro^B29Arg^B31Arg^B32-ミリストイルインスリン； B28-N^ε-Gly^A21Lys^B28Pro^B29Arg^B31Arg^B32-オクタノイルヒトインスリン； B28-N^ε-Gly^A21Gln^B3Lys^B28Pro^B29Arg^B31Arg^B32-オクタノイルヒトインスリン； B28-N^ε-Arg^A0Gly^A21Lys^B28Pro^B29Arg^B31Arg^B32-オクタノイルヒトインスリン； B28-N^ε-Arg^A0Gly^A21Gln^B3Lys^B28Pro^B29Arg^B31Arg^B32-オクタノイルヒトインスリン； B28-N^ε-Arg^A0Gly^A21Asp^B3Lys^B28Pro^B29Arg^B31Arg^B32-オクタノイルヒトインスリン； B28-N^ε-Lys^B28Pro^B29Arg^B31Arg^B32-オクタノイルヒトインスリン； B28-N^ε-Arg^A0Lys^B28Pro^B29Arg^B31Arg^B32-オクタノイルヒトインスリン。

【００２８】また本発明は、上記のモノアシル化インスリン類似体のいずれかを含む種々の
製剤も包含する。かかる製剤は、m-クレゾールもしくはフェノールのような保存
剤、等張剤、製薬上許容されるバッファー、および／またはコバルトもしくは亜
鉛のような+2の酸化状態にある金属を含み得る。また本発明は、約3.0〜約3.8の
pHで本発明のモノアシル化インスリン類似体を含有する製剤も含む。また本発明
は、約3.5のpHで本発明のモノアシル化インスリン類似体を含有する製剤も含む。

【００２９】本発明はさらに、約4.5〜7.6のpHで本発明のモノアシル化インスリン類似体を
含有する製剤を含む。本発明はさらに、約5.0〜約7.0のpHで本発明のモノアシル
化インスリン類似体を含有する製剤を含む。本発明はさらに、約6.5のpHで本発明のモノアシル化インスリン類似体を含有する製剤を含む。

【００３０】本発明は、糖尿病患者に本発明のモノアシル化インスリン類似体を含有する製
剤を投与することを含んでなる、治療方法を含む。特に、本発明の上記のモノア
シル化インスリン類似体はどれもかかる治療方法に適している。本発明の治療方
法において投与される製剤は、約3.0〜約3.8のpHであるか、または約3.5のpHであり得る。また本発明の治療方法において投与される製剤は、約4.5〜7.6のpHで
あるか、または約5.0〜約7.0のpHでもよく、あるいは製剤は約6.5のpHでもよい。

【００３１】〔発明の詳細な説明〕定義「アミノ酸改変」または「改変」とは、アミノ酸の欠失または除去、一のアミ
ノ酸の別のアミノ酸への置換、内部位置へのアミノ酸の挿入またはいずれか一方
の末端へのアミノ酸の付加を意味する。またアミノ酸改変は、アミノ基のアシル
化のようなアミノ酸の誘導体化も含む。

【００３２】「インスリン」という用語は、本明細書で用いられる場合、そのアミノ酸配列
および空間的構造が周知であるヒトインスリンを意味する。ヒトインスリンは、
ジスルフィド結合により架橋された21個のアミノ酸のA-鎖と30個のアミノ酸のB-
鎖から構成される。適正に架橋されたインスリンには３つのジスルフィド架橋が
含まれ、その一の架橋はA-鎖の7位とB-鎖の7位の間にあり、第2の架橋はA-鎖の2
0位とB-鎖の19位の間にあり、第3の架橋はA-鎖の6位と11位の間にある(Nicol, D
.S.H.W.およびSmith, L.F., Nature, 187, 483-485(1960))。

【００３３】「インスリン類似体」という用語は、それぞれ、ヒトインスリンのA-鎖および
／またはB-鎖と実質的に同一のアミノ酸配列を有するが、インスリン類似体のイ
ンスリン活性を破壊しないような1個以上のアミノ酸欠失、1個以上のアミノ酸置
換、および／または1個以上のアミノ酸付加を有することによりヒトインスリンのA-鎖およびB-鎖とは異なったA-鎖およびB-鎖を有するタンパク質を意味する。
インスリンの等電点「よりも高い」等電点を有するインスリン類似体はインスリ
ン類似体の一つの型である。インスリン類似体の別の型は「モノマー型(monomer
ic)インスリン類似体」である。

【００３４】「モノマー型インスリン類似体」は、速効性のヒトインスリン類似体であり、
例えばB28位のProがAsp、Lys、Leu、ValまたはAlaで置換されており、そしてB29
位のLysがLysであるかまたはProで置換されているヒトインスリンである。デス(
B27)ヒトインスリンとしても知られた別のモノマー型インスリン類似体は、B-鎖
の27位のThrが欠失したヒトインスリンである。モノマー型インスリン類似体は、1996年5月7日に発行されたChance, R.E.らの米国特許第5,514,646号; Brems,
D.N.ら, Protein Engineering, 5, 527-533(1992); Brange, J.J.V.ら, EPO公開
公報第214,826号(1987年3月18日に公開); およびBrange, J.J.V.ら, Current Op
inion in Structural Biology, 1, 934-940(1991)に開示されている。本発明の製剤に用いられるモノマー型インスリン類似体は、ヒトインスリンと同じ位置で
適正に架橋されている。

【００３５】配列番号１は、インスリンのA-鎖またはその類似体を意味し、アミノ酸配列：

【化５】（式中、 0位のXaaはArgであるか、または存在せず、そして 21位のXaaはCysおよびLysを除く任意の天然アミノ酸である）を有する。

【００３６】配列番号２は、アミノ酸配列：

【化６】（式中、 3位のXaaはCysまたはLysを除く任意の天然アミノ酸であり； 27位のXaaはThrであるか、または存在せず； 28位のXaaはPro、Leu、Val、Ala、AspまたはLysであり； 29位のXaaはProまたはLysであり； 30位のXaaは存在しないか、またはCysまたはLysを除く任意の天然アミノ酸であり；さらに28位または29位はLysであり、28位がLysの場合には29位はLysではない）を有するインスリンB-鎖類似体を意味する。

【００３７】本発明のインスリン類似体は、配列番号２のポリペプチドに適正に架橋された
配列番号１のポリペプチドを含んでなる。さらに、本発明のインスリン類似体は
、配列番号２によって規定されたB-鎖の28位または29位にあるLys残基のε−アミノ基が脂肪酸でアシル化されている。

【００３８】「天然アミノ酸」という用語は、通常、人体において見出されるポリペプチド
中にあるアミノ酸を意味する。天然アミノ酸としては、例えばAla、Arg、Asn、A
sp、Cys、Gln、Glu、Gly、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp
、Tyr、およびValが挙げられる。「CysまたはLysを除く任意の天然アミノ酸」と
いう語句が用いられる場合、それは上記のアミノ酸のリストからCysおよびLysを
削除したリストを意味するものである。

【００３９】「架橋」という用語は、システイン残基間のジスルフィド結合を意味する。「
適正に架橋された」ヒトインスリン、モノマー型インスリン類似体、インスリン
類似体またはプロインスリン様前駆体は、３つのジスルフィド架橋を含む。第1 の架橋はA-鎖の6位と11位のシステイン残基を結合する。第2のジスルフィド架橋
はA-鎖の7位のシステイン残基とB-鎖の7位のシステインを結合する。第3のジスルフィド架橋はA-鎖の20位のシステインとB-鎖の19位のシステインを結合する。

【００４０】「トリ-アルギニンインスリン類似体」という用語は、配列番号１に示したA- 鎖の0位にArgを有し、配列番号２に示したB-鎖の31位と32位の両方にArgを有するヒトインスリンの類似体を意味する。「トリ-アルギニン」という用語は、「t
ri-arg」と省略され得る。

【００４１】「ジ-アルギニンインスリン類似体」という用語は、配列番号２に示したB-鎖の31位と32位の両方にArgを有するヒトインスリンの類似体を意味する。「ジ-ア
ルギニン」という用語は、「di-arg」と省略され得る。

【００４２】「アシル化する」という動詞は、脂肪酸とタンパク質のアミノ基との間にアミ
ド結合を形成することを意味する。インスリンは、そのアミノ基の1個以上が脂肪酸の酸基とアミド結合で結合している場合、「アシル化され」ている。

【００４３】「アシル化基」という用語は、インスリン類似体のε-アミノ基に化学的に結合した脂肪酸を意味する。配列番号２のB28またはB29にあるLysの遊離アミノ基がε-アミノ基である。

【００４４】「アシル化」という用語は、1個以上のアシル基とタンパク質の遊離アミノ基との共有結合を意味する。「選択的アシル化」という用語は、αアミノ基よりも
ε-アミノ基のほうが選択的にアシル化されることを意味する。

【００４５】「脂肪酸」という用語は、飽和または不飽和C₄〜C₂₁脂肪酸を意味する。好ましい脂肪酸は飽和脂肪酸であり、ミリスチン酸(C₁₄)、ペンタデカン酸(pentadec
ylic acid)(C₁₅)、パルミチン酸(C₁₆)、ヘプタデカン酸(heptadecylic acid)(C₁ ₇ )およびステアリン酸(C₁₈)を含むC₁₀〜C₁₈酸が挙げられる。かかる群の中で最も好ましい脂肪酸としてはミリスチン酸およびパルミチン酸が挙げられる。本発
明においてその他の好ましい脂肪酸としては、ブタン酸(C₄)、ペンタン酸(C₅)、
ヘキサン酸(C₆)、ヘプタン酸(C₇)およびオクタン酸(C₈)を含むC₄〜C₈酸が挙げられる。かかる群の中で最も好ましい脂肪酸としてはヘキサン酸およびオクタン
酸が挙げられる。本発明の化合物は、ε-アミノ基がC₄〜C₂₁脂肪酸−アシル化モ
ノアシル化インスリン類似体である。好ましくは、本発明の類似体は、B-鎖の28
位または29位にあるリシンのε-アミノ基がモノアシル化されている。

【００４６】「モノアシル化インスリン類似体」という用語は、脂肪酸の酸基とタンパク質
のアミノ基との間に形成されたアミド結合により結合している脂肪酸でアシル化
されたインスリンおよびインスリン類似体、ならびにその薬学的に許容できる塩
および錯体からなる群から選択されるタンパク質を意味する。本発明においては
、前記アミノ基は、配列番号２に示したB-鎖の28位または29位にあるLys残基の ε-アミノ基である。脂肪酸によるインスリンのアシル化は、日本特許出願1-254
,699号に開示されている。また、Hashimoto, M.ら, Pharmaceutical Research,
6, 171-176(1989)およびLindsayら, Biochemical J., 121, 737-745(1971)も参照されたい。脂肪酸−アシル化インスリンおよび脂肪酸−アシル化インスリン類
似体、ならびにそれらの合成法についての開示は、1997年12月2日に発行されたB
akerらの米国特許第5,693,609号；1995年3月23日に公開されたHavelundらのWO95
/07931；および1996年9月26日に公開されたJonassenらのWO96/29342にある。

【００４７】本発明の好ましいモノアシル化インスリン類似体としては、ジ-アルギニン種およびトリ-アルギニン種が挙げられる。本発明の好ましいモノアシル化インスリン類似体は、配列番号２の30位にThrを有する。本発明のその他の好ましいモノアシル化インスリン類似体としては、配列番号１の21位にGly、Asn、AlaまたはGlnを有するトリ-アルギニン種およびジ-アルギニン種が挙げられる。特に好ましくは、配列番号１の21位にGlyまたはAsnを有する種である。本発明のさらに
その他の好ましいモノアシル化インスリン類似体としては、配列番号１の21位も
しくは配列番号２の3位、またはその両方にAsnを有するジ-アルギニンおよびトリ-アルギニン種が挙げられる。本発明の好ましいモノアシル化インスリン類似体の別の群としては、配列番号１の21位にGlyを有し、配列番号２の3位にAspまたはGlnを有するトリ-アルギニン種が挙げられる。好ましいモノアシル化インス
リン類似体の別の群としては、配列番号１の21位にGlyを有し、配列番号２の3位
にGlnを有するジ-アルギニン種が挙げられる。最後に、本発明のその他の好まし
いアシル化インスリン類似体としては、配列番号２の28位にLysを有し、配列番号２の29位にProを有するか、または配列番号２の28位にProを有し、配列番号２
の29位にLysを有するジ-アルギニン種およびトリ-アルギニン種が挙げられる。

【００４８】いくつかの非常に好ましいジ-アルギニン種およびトリ-アルギニン種としては
、例えば、配列番号１の21位にAsnまたはGly；配列番号２の3位にAsn；配列番号
２の27位にThr；配列番号２の28位にPro；そして配列番号２の29位にLysを有するものが挙げられる。その他の非常に好ましいジ-アルギニン種およびトリ-アル
ギニン種としては、配列番号１の21位にAsnまたはGly；配列番号２の3位にAsn；
配列番号２の27位にThr；配列番号２の28位にLys；そして配列番号２の29位にPr
oを有するものが挙げられる。

【００４９】最も好ましいジ-アルギニン種およびトリ-アルギニン種としては、配列番号２
の28位または29位にあるLysのε-アミノ基がアシル化されており、そのアシル化
基がオクタン酸またはミリスチン酸であるインスリン類似体が挙げられる。これ
らの最も好ましいモノアシル化インスリン類似体としては、例えば、下記のもの
が挙げられる。

【００５０】 B29-N^ε-Gly^A21Arg^B31Arg^B32-ミリストイルヒトインスリン類似体； B29-N^ε-Gly^A21Gln^B3Arg^B31Arg^B32-ミリストイルヒトインスリン類似体； B29-N^ε-Arg^A0Gly^A21Arg^B31Arg^B32-ミリストイルヒトインスリン類似体； B29-N^ε-Arg^A0Gly^A21Gln^B3Arg^B31Arg^B32-ミリストイルヒトインスリン類似体； B29-N^ε-Arg^A0Gly^A21Asp^B3Arg^B31Arg^B32-ミリストイルヒトインスリン類似体； B29-N^ε-Arg^B31Arg^B32-ミリストイルヒトインスリン類似体； B29-N^ε-Arg^A0Arg^B31Arg^B32-ミリストイルヒトインスリン類似体； B29-N^ε-Gly^A21Arg^B31Arg^B32-オクタノイルヒトインスリン類似体； B29-N^ε-Gly^A21Gln^B3Arg^B31Arg^B32-オクタノイルヒトインスリン類似体； B29-N^ε-Arg^A0Gly^A21Arg^B31Arg^B32-オクタノイルヒトインスリン類似体； B29-N^ε-Arg^A0Gly^A21Gln^B3Arg^B31Arg^B32-オクタノイルヒトインスリン類似体； B29-N^ε-Arg^A0Gly^A21Asp^B3Arg^B31Arg^B32-オクタノイルヒトインスリン類似体； B29-N^ε-Arg^B31Arg^B32-オクタノイルヒトインスリン類似体； B29-N^ε-Arg^A0Arg^B31Arg^B32-オクタノイルヒトインスリン類似体； B28-N^ε-Gly^A21Lys^B28Pro^B29Arg^B31Arg^B32-ミリストイルヒトインスリン類似体； B28-N^ε-Gly^A21Gln^B3Lys^B28Pro^B29Arg^B31Arg^B32-ミリストイルヒトインスリン類
似体； B28-N^ε-Arg^A0Gly^A21Lys^B28Pro^B29Arg^B31Arg^B32-ミリストイルヒトインスリン類
似体； B28-N^ε-Arg^A0Gly^A21Gln^B3Lys^B28Pro^B29Arg^B31Arg^B32-ミリストイルヒトインスリン類似体； B28-N^ε-Arg^A0Gly^A21Asp^B3Lys^B28Pro^B29Arg^B31Arg^B32-ミリストイルヒトインスリン類似体； B28-N^ε-Lys^B28Pro^B29Arg^B31Arg^B32-ミリストイルヒトインスリン類似体； B28-N^ε-Arg^A0Lys^B28Pro^B29Arg^B31Arg^B32-ミリストイルヒトインスリン類似体； B28-N^ε-Gly^A21Lys^B28Pro^B29Arg^B31Arg^B32-オクタノイルヒトインスリン類似体； B28-N^ε-Gly^A21Gln^B3Lys^B28Pro^B29Arg^B31Arg^B32-オクタノイルヒトインスリン類
似体； B28-N^ε-Arg^A0Gly^A21Lys^B28Pro^B29Arg^B31Arg^B32-オクタノイルヒトインスリン類
似体； B28-N^ε-Arg^A0Gly^A21Gln^B3Lys^B28Pro^B29Arg^B31Arg^B32-オクタノイルヒトインスリン類似体； B28-N^ε-Arg^A0Gly^A21Asp^B3Lys^B28Pro^B29Arg^B31Arg^B32-オクタノイルヒトインスリン類似体； B28-N^ε-Lys^B28Pro^B29Arg^B31Arg^B32-オクタノイルヒトインスリン類似体；および B28-N^ε-Arg^A0Lys^B28Pro^B29Arg^B31Arg^B32-オクタノイルヒトインスリン類似体。

【００５１】インスリンの等電点「よりも高い」等電点を有するインスリン類似体とは、イ
ンスリンと比較した場合にアミノ酸配列が1個または複数個改変されていることによりインスリンと比べて等電点が高くなったインスリン類似体を意味する。ヒ
トインスリンの等電点はpH5.4である（Markussen, J.ら, Protein Engineering
1, 205-213(1987)）。インスリンの等電点よりも高い等電点を有するアシル化イ
ンスリン類似体とは、等電点が少なくともpH約6.0であるアシル化インスリン類似体を意味する。好ましくは、インスリンの等電点よりも高い等電点を有するア
シル化インスリン類似体は、約pH6.0〜約8.0の等電点を有する。より好ましくは
、その等電点は約6.0〜7.0のpHである。最も好ましくは、その等電点は約7.0のp
Hである。これらの類似体の等電点に関し、「約」とは±0.1のpH単位を意味する
。したがって、「約6.0」とはpH5.9〜pH6.1を意味する。

【００５２】等電点の変化は、例えば、配列に1個以上の塩基性アミノ酸を付加すること、配列中の1個以上のアミノ酸を塩基性アミノ酸で置換すること、配列から1個以上
のアミノ酸残基を除去すること、または1個以上の酸性アミノ酸を非荷電アミノ酸または塩基性アミノ酸で置換することにより得られる。インスリンよりも高い
等電点を有する一定のインスリン類似体は開示されている（Markussen, J.ら, P
rotein Engineering, 1, 215-223(1987); Jorgensen, S.ら, British Medical J
ournal, 299, 415-419(1989); 1990年8月7日に発行されたMarkussen, J.の米国特許第4,946,828号; Zeuzem, S.ら, Diabetologia, 33, 65-71(1990); 1996年4 月9日に発行されたVertesy, L.らの米国特許第5,506,202号; 1996年2月13日に発
行されたHoffman, J.らの米国特許第5,941,216号; 1997年8月12日に発行されたD
orschug, M.の米国特許第5,656,722号; 1997年8月15日に出願されたChance, R. らの米国仮特許出願第60/055,828号）。

【００５３】本発明のモノアシル化ジ-アルギニンおよびトリ-アルギニンインスリン類似体
は、それぞれ、その両方の種に存在する配列番号２のポリペプチドの31位および
32位に塩基性Argが付加されていること、ならびにトリ-アルギニンインスリン類
似体においては配列番号１の0位にArg残基が存在することによってヒトインスリ
ンの等電点よりも高い等電点を有する。さらに、ジ-アルギニンおよびトリ-アル
ギニン種はそれぞれ配列番号２の28位または29位のいずれかに存在するLys残基のε-アミノ基が脂肪酸でアシル化されている。したがって、本発明は、インスリンの等電点よりも高い等電点を有する脂肪酸−アシル化インスリン類似体であ
る。これは、アミド結合によりインスリン類似体に結合した脂肪族アシル鎖を有
するインスリン類似体を含む。本発明の好ましい実施形態は、アシル化インスリ
ン類似体がインスリンよりも少なくとも1大きい正の実効電荷を有する化合物を含む。またアシル化インスリン類似体がインスリンよりも少なくとも２大きい正
の実効電荷を有する化合物も好ましい。本発明の化合物に固有の特性は、その等
電点のシフトと脂肪酸基の結合に関連する。これらの本発明の化合物およびかか
るインスリン類似体の医薬製剤は長期持続性の基礎的作用を示す。

【００５４】ポリペプチドの等電点とはタンパク質において実効電荷が存在しないpHである
。このpHでは、電気泳動移動度はゼロであり、分子は電気泳動ゲル中で移動しな
い。等電点よりも低いpHではArg、LysおよびHisのようなアミノ酸の塩基性基がプロトン化されて分子に正の電荷を生じさせ、等電点よりも高いpHではGluまたはAsp残基のカルボン酸基が脱プロトン化されて分子に負の電荷を生じさせる。プロトン化または脱プロトン化により荷電したポリペプチドはより極性が大きく
なり、必然的にその等電点にあるポリペプチドと比べて水中での溶解度が大きく
なる。したがって、水系におけるポリペプチドの溶解度は系のpHおよびポリペプ
チドの等電点に依存して変動する。インスリン類似体の等電点のシフトは生理学
的pHでの類似体の溶解度にかなり影響を与え得る。

【００５５】インスリン、インスリン類似体またはアシル化インスリン類似体の実効電荷を
決定する方法は非常に簡単である。まず、塩基性アミノ酸(Lys、HisおよびArg) の数を合計し、それぞれを正電荷が１に等しくなるように処理することにより総
正電荷を計算する。次に、酸性アミノ酸(AspおよびGlu)の数を合計し、それぞれ
負電荷が１に等しくなるように処理することにより総負電荷を計算する。最後に
、総正電荷から総負電荷を引き算することによりインスリン、インスリン類似体
またはアシル化インスリン類似体の実効電荷が得られる。これらの電荷は生理学
的pHにおける各アミノ酸の電荷に基づいて割り当てられる。例えば、LysおよびA
rgは生理学的pHでそのそれぞれの塩基性基がプロトン化されてそれらに１の正の
電荷を生じさせるので正の電荷が付与される。Hisは生理学的pHにてその局所的な環境に依存して荷電したり荷電しなかったりするが、Hisにはこの考察の目的のために+1の電荷が付与される。AspおよびGluには、これらのアミノ酸の遊離カ
ルボン酸の官能基が生理学的pHにて脱プロトン化されてそれらに負の電荷を生じ
させるので負の電荷が付与される。

【００５６】ヒトインスリンの実効電荷は上記の方法を用いて容易に計算される。例えば、
4個の塩基性アミノ酸（B5のHis、B10のHis、B22のArgおよびB29のLys）には+4の
総正電荷が付与される。同様に、4個の酸性アミノ酸（A4位のGlu、A17位のGlu、
B13位のGluおよびB21位のGlu）には-4の総負電荷が付与される。よってヒトイン
スリンの実効電荷は０である。

【００５７】インスリンの29位のLysのアシル化により塩基性部位が除去されるので、アシル化インスリンの正の実効電荷は天然ヒトインスリンよりも１小さくなる。しか
しながら、31位および32位のArgのような2個の塩基性アミノ酸基の存在により、
モノアシル化ジ-アルギニン種については、アミノ酸の残りがインスリンと同一である場合、+1の正の実効電荷がもたらされる。同様に、3個のArg残基が付加し
たモノアシル化トリ-アルギニン種は+2の正の実効電荷を有する。B-鎖の28位のP
roおよびB-鎖の29位のLysが交換された種についての結果は同一の結果をもたらす。しかしながら、中性、塩基性または酸性アミノ酸を別のアミノ酸で置換する
場合、得られる種の電荷全体が変化し得るが、依然としてヒトインスリンの実効
電荷と同程度の実効電荷を有するものと計算され得るということは当業者には容
易に分かるであろう。

【００５８】脂肪酸−アシル化インスリン類似体の「薬学的に許容できる塩」とは、インス
リン類似体における任意の1個以上の荷電基と、任意の1個以上の薬学的に許容で
きる非毒性カチオンまたはアニオンとの間に形成される塩を意味する。有機塩お
よび無機塩としては、例えば、塩酸、硫酸、スルホン酸、酒石酸、フマル酸、臭
化水素酸、グリコール酸、クエン酸、マレイン酸、リン酸、コハク酸、酢酸、硝
酸、安息香酸、アスコルビン酸、p-トルエンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、
ナフタレンスルホン酸、ピロピオン酸、炭酸などの酸から調製される塩が挙げら
れる。その他の薬学的に許容できる塩としては、例えば、脂肪酸−アシル化イン
スリン類似体のアンモニウム塩、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、ま
たはマグネシウム塩が挙げられる。

【００５９】「錯体」という用語は、遷移金属に少なくとも1個の配位子が配位している化合物を意味する。配位子としては、多くの化合物の中でも特にインスリン、ペプ
チド、アミノ酸、TRISなどの窒素含有分子が挙げられる。本発明において用いら
れる脂肪酸−アシル化インスリン類似体は、２価の金属イオン、好ましくはコバ
ルトまたは亜鉛、最も好ましくは亜鉛との錯体として存在し得るものであり、こ
こではタンパク質分子が金属イオンの配位子として作用する。

【００６０】インスリン類似体の「薬学的に許容できる錯体」とは、電子供与性配位子とし
て作用し得るインスリン類似体中の1個以上の基と、1個以上の薬学的に許容でき
る正に荷電した金属との間に形成される錯体を意味する。遷移金属、アルカリ金
属、およびアルカリ土類金属は、インスリンと錯体を形成することが知られてい
る金属の例である。本発明の製剤に添加することができる好ましい金属としては
+2の酸化状態にある金属が挙げられる。遷移金属は好ましい錯化剤であり、コバ
ルトおよび亜鉛が製剤に添加することができる好ましい金属である。亜鉛が特に
好ましい金属である。

【００６１】「保存剤」という用語は、抗菌剤として作用させるために医薬製剤に加えられ
る化合物を意味する。非経口製剤は、商業的に成り立つような (viable)多目的製品であるための保存的有効性についてのガイドラインを満たす必要がある。非
経口製剤において有効であり、許容できることが当技術分野で知られている保存
剤には、塩化ベンザルコニウム、ベンゼトニウム、クロロヘキシジン、フェノー
ル、m-クレゾール、ベンジルアルコール、メチルパラベン、クロロブタノール、
o-クレゾール、p-クレゾール、クロロクレゾール、レゾルシノール、硝酸フェニ
ル水銀、チメロサール、安息香酸、およびそれらの種々の混合物がある。例えば
、Wallhausser, K-H., DEVELOP. BIOL. STANDARD. 24, pp.9-28(S. Krager, Bas
al 1974)を参照されたい。フェノールおよびm-クレゾールのような一定のフェノ
ール系保存剤は、インスリン様分子に結合し、それによって物理的もしくは化学
的安定性またはその両方を増大させるコンホメーション変化をもたらすことが知
られている（Birnbaum, D.T.ら, Pharmaceutical Res., 14, 25(1997); Rahauel
-Clermont, S.ら, Biochemistry, 36, 5837-5845(1997)）。本発明のモノアシル
化インスリン類似体の製剤において好ましい保存剤としては、m-クレゾール、フ
ェノールまたはそれらの混合物が挙げられる。

【００６２】「バッファー」または「製薬上許容されるバッファー」という用語は、インス
リンおよびインスリン類似体製剤における使用が安全であることが分かっており
、製剤のpHをその製剤に望ましいpHに調節する作用を有する化合物を意味する。
pHを適度に酸性のpHに調節するための製薬上許容されるバッファーは、限定する
ものではないが、リン酸塩、酢酸塩、クエン酸塩、TRIS、アルギニンまたはヒス
チジンのような化合物が挙げられる。TRISは、トリス（ヒドロキシメチル）アミ
ノメタンおよびトロメタミンとしても知られた一般的に用いられるバッファーで
ある。

【００６３】「等張剤」という用語は、生理学的に許容でき、細胞膜を横切る水の正味の流
れを妨げるために製剤に適当な張性(tonicity)を付与する化合物を意味する。限
定するものではないが、グリセリンのような化合物が既知濃度でかかる目的のた
めに一般に用いられる。グリセリンはグリセロールとしても知られている。その
他の許容される等張剤としては、塩、例えばNaCl、デキストロース、マンニトー
ルおよびラクトースが挙げられる。12〜25mg/mLの濃度のグリセリンが等張剤として好ましい。本発明の製剤においては14〜18mg/mLの濃度のグリセリンがより好ましく、16mg/mLの濃度のグリセリンが最も好ましい。

【００６４】本発明のモノアシル化インスリン類似体は、糖尿病または高血糖症のような症
状の治療に適している。特に、本発明の類似体は糖尿病または高血糖症を患う人
々の血糖値を低下させるのに適している。そのような治療が必要な患者の血糖値
を低下させることにおける本発明の類似体の有効性、ならびにインスリンまたは
モノマー型インスリンと比べた場合のその時間作用性は、本出願の他の箇所に記
載した当技術分野で認められた技術を用いて測定することにより確認することが
できる。

【００６５】本明細書で用いる場合、当技術分野で周知の「高血糖症」という用語は、正常
なヒトよりも高い血糖値を特徴とする症状を意味する。正常なヒトの空腹時血糖
値は110mg/dL未満である。The Expert Committee on the Diagnosis and Classi
fication of Diabetes Mellitus, Diabetes Care, 21(Suppl.1), S5-S19(1992) を参照されたい。

【００６６】本明細書で用いられる場合、「有効量」という用語は、治療上または予防上血
糖値を低下または維持するために必要な本発明の1種以上のインスリン類似体の量を意味する。この量は、典型的には、1日当たり約10単位〜約60単位（または1
mg当たり約29単位と仮定すると約0.3〜約2mg）の範囲である。しかしながら、実
際に投与される本発明のインスリン類似体の量は、治療される症状（すなわち高
血糖症の原因）、投与される特定の類似体、選択された非経口投与経路、年齢、
体重および個々の患者の応答性、ならびに患者の症状の重篤度のような関連性の
ある状況を考慮して医師が決定するであろうことは理解されるべきである。した
がって、上記の投与量の範囲は本発明の範囲をいかなる場合にも限定するもので
はない。

【００６７】本発明のアシル化インスリン類似体は、糖尿病または高血糖症の患者のような
その投与が必要な患者に対し、有効量の本発明の少なくとも1種のインスリン類似体と1種以上の製薬上許容される賦形剤または担体との組み合わせを含む医薬組成物によって投与される。かかる目的のために、医薬組成物は、典型的には、
1mL当たり約100単位を含むように、または本発明のインスリン類似体の有効量を
含む同様の濃度になるように製剤化され得る。これらの組成物は、典型的には、
必ずしもそうではないかもしれないが、事実上非経口性であり、当技術分野で周
知の非経口製剤用の通常の賦形剤または担体を用いて種々の技術のいずれかによ
り調製し得る。例えば、REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, 第17版, Mack
Publishing Company, Easton, PA, USA(1985)を参照されたい。

【００６８】本発明の非経口製剤は、通常の溶解法および混合法を用いて調製することがで
きる。適当な製剤を調製するために、例えば、正確に測った一定量のインスリン
類似体を加えた水溶液と、所望の保存剤を加えた水溶液とを所望の濃度のタンパ
ク質および保存剤を得るのに十分な量で混合する。製剤のpHは、インスリン類似
体と保存剤を混合する前または混合した後に適度な酸性に調節され得る。製剤は
、一般的に投与前に滅菌濾過される。

【００６９】「トリプシン」という用語は、塩基性アミノ酸のα-カルボキシル基とその隣接アミノ酸のα-アミノ基により形成されたアミド結合の加水分解を触媒する任意の哺乳類セリンプロテアーゼを意味する。

【００７０】「トリプシン様活性を有する酵素」には、任意の起源由来のトリプシン、TPCK
-トリプシンなどのトリプシンの誘導体、ならびにトリプシン活性を保持するトリプシンの類似体がある。

【００７１】「プロインスリン様前駆体」という用語は、インスリン類似体と、接続結合(c
onnecting bond)または１〜37個のアミノ酸を有する接続ペプチド(connecting p
eptide)とを含む１本鎖ペプチドを意味する。ここで、接続結合または接続ペプチドは、それぞれ、A-鎖の末端アミノ酸およびB-鎖の末端アミノ酸に1個のα-ア
ミド結合または2個のα-アミド結合により接続しており、接続ペプチドのアミノ
酸はどれもシステインではなく、そして接続ペプチドのC-末端アミノ酸はLysまたはArgである。適当な接続ペプチドの例の一つはヒトプロインスリンのC鎖であ
る。例えば、米国特許第5,491,216号(Hoffman)を参照されたい。プロインスリン
様前駆体の特定の群は、式X-B-C-Aで示されるか、または式X-A-C-Bで示され、ここで、 Xは、水素、またはそのC-末端アミノ酸にLysもしくはArgを有する１〜約100
個のアミノ酸からなるペプチドであり； Aは配列番号１のA-鎖であり； Cはシステインを除く１〜約35個のアミノ酸からなるペプチドであってC-末端アミノ酸はLysまたはArgであり；そして Bは配列番号２のB-鎖である。

【００７２】ジスルフィド結合はプロインスリン様前駆体にも存在する。特に、A-鎖の6位のCysはA-鎖の11位のCysにジスルフィド結合により結合しており、B-鎖の7位のC
ysはA-鎖の7位のCysにジスルフィド結合により結合しており、B-鎖の19位のCys はA-鎖の20位のCysにジスルフィド結合により結合している。式X-B-C-Aで示され
るか、またはX-A-C-Bで示されるプロインスリン様前駆体をトリプシン様活性を有する酵素に曝すと、本発明の一定のインスリン類似体が形成される。具体的に
は、配列番号２に関して、B-鎖の28位のXaaがPro、Asp、Leu、Val、またはAlaで
あり、B-鎖の29位のXaaがProまたはLysであり、そしてB-鎖の27位のXaaが存在し
ないインスリン類似体は、X-B-C-AまたはX-A-C-Bからトリプシン処理によって形
成される。

【００７３】「活性化脂肪酸エステル」という用語は、記述された一般的な技術を用いて活
性化された脂肪酸を意味する。Riordan, J.F. Methods of Enzymology, XXV, 49
4-499(1972)およびLapidotら, J. of Lipid Res., 8, 142-145(1967)。活性化脂
肪酸エステルにはヒドロキシベンゾトリアジド(HOBT)、N-ヒドロキシスクシンイ
ミドおよびその誘導体のような一般に用いられるアシル化剤の誘導体が含まれる
。好ましい活性化エステルはN-スクシンイミジルパルミテートである。

【００７４】「塩基性条件」という用語は、本明細書で用いられる場合、反応の塩基性を意
味する。インスリン類似体のε-アミノ基を選択的にアシル化するために、反応は、実質的に脱プロトン化された遊離アミノ基全部で行われなければならない。
水性溶媒または共溶媒においては、塩基性条件はその反応が9.0よりも高いpHで行われることを意味する。有機溶媒においては、反応は水中で10.75以上のpKaと
同等の塩基度を有する塩基の存在下で行われる。

【００７５】インスリン類似体の調製本発明のモノアシル化インスリン類似体は、まず分子のインスリン類似体部分
を合成し、次いでインスリン類似体をアシル化することにより調製される。

【００７６】本発明のインスリン類似体は、周知の化学的方法単独で、組換えDNA法単独で、または化学的方法と組換えDNA法を組合せることにより合成される。下記にこれらのインスリン類似体を合成するためのいくつかの基本的な方法を簡単に概説
する。これは網羅的ではなく、その他の種々の基本スキームが可能であり、当業
者には公知であろう。

【００７７】 1) 1983年12月20日に発行されたChanceらの米国特許第4,421,685号に開示され
ているように、組換えDNAを用いた標準的生合成法によりヒトインスリンA-鎖類似体（配列番号１）を合成し、そしてそれとは別に組換えDNAを用いた標準的生合成法によりヒトインスリンB-鎖またはヒトインスリンB-鎖類似体（配列番号２
）を合成し、次いで公知のジスルフィド化学作用によりそれらの鎖を結合させる
。

【００７８】 2) 上記で参照したように、標準的な化学合成法によりヒトインスリンA-鎖類似体（配列番号１）を合成し、そしてそれとは別に標準的な化学合成法によりヒ
トインスリンB-鎖またはヒトインスリンB-鎖類似体（配列番号２）を合成し、次
いで公知のジスルフィド化学作用によりそれらの鎖を結合させる。

【００７９】 3) 上記で参照したように、一方の鎖を化学合成し、もう一方を組換えDNAから
生合成し、その後公知のジスルフィド化学作用によりそれらを結合させる。

【００８０】 4) 化学合成するか、または好ましくは組換えDNAから出発してトリプシン様活
性を有する酵素を用いて生合成することによりプロインスリン様前駆体を切断す
る。

【００８１】化学合成ポリペプチドの固相化学合成の原理は周知であり、当分野の一般的なテキスト
で見つけることができる。例えば、H.DugasおよびC.Penny, BIOORGANIC CHEMIST
RY, (1981) Springer-Verlag, New York, pp.54-92を参照されたい。本発明のペ
プチドは、Applied Biosystems 430Aペプチド合成装置（Applied Biosystems，F
oster City, CAから市販されている）およびApplied Biosystemsから供給されて
いる合成サイクルを用いて固相法により合成することができる。t-ブトキシカル
ボニル保護アミノ酸のような保護アミノ酸ならびにその他の試薬は多くの化学品
供給業者から市販されている。

【００８２】二重カップリングプロトコル(double couple protocols)を用いる逐次t-ブトキシカルボニル化学法は、C-末端ルボキシアミドの製造のために出発物質p-メチ
ルベンズヒドリルアミン樹脂に適用される。C-末端酸の製造のために、対応する
ピリジン-2-アルドキシムメチオダイド樹脂が用いられる。アスパラギン、グルタミン、およびアルギニンは予め合成したヒドロキシ-ベンゾトリアゾールエステルを用いてカップリングされる。下記の側鎖保護基： Arg、トシル Asp、シクロヘキシル Glu、シクロヘキシル Ser、ベンジル Thr、ベンジル Tyr、4-ブロモカルボベンゾキシが用いられる。

【００８３】 t-ブトキシカルボニル部分の除去（脱保護）は、塩化メチレン中でトリフルオロ
酢酸(TFA)を用いて行うことができる。合成が終了した後、ペプチドは脱保護され、10％メタ-クレゾールを含む無水フッ化水素を用いて樹脂から切断され得る。側鎖保護基の切断および樹脂からのペプチドの切断は、０℃以下、好ましくは
-20℃にて30分間、その後0℃にて30分間で行われる。

【００８４】フッ化水素を除去した後、ペプチド／樹脂をエーテルで洗浄し、氷酢酸を用い
てペプチドを抽出し、次いで凍結乾燥する。精製は、例えば、10％酢酸中、Seph
adex G-10(Pharmacia)カラムにてサイズ排除クロマトグラフィーにより行われる
。

【００８５】組換えDNA技術を用いた合成本発明のＡ鎖およびＢ鎖のそれぞれまたは本発明のインスリン類似体のプロイ
ンスリン様前駆体は、組換えDNAから出発して生合成することができる。大量に所望する場合には、組換え法が好ましい。任意の所望のDNA配列を構築する一般的な方法は、J.Brownら,Methods in Enzymology,68,109(1979)に示されている。
[J.Sambrookら,MOLECULAR CLONING:A LABORATORY MANUAL,Cold Spring Harbor,N
ew York(1989)も参照のこと]

【００８６】所望のタンパク質を組換え生産する標準的な工程は、以下の通りである。 (a)目的タンパク質をコードする合成または半合成DNAを構築する工程、 (b)単独でまたは融合タンパク質として目的タンパク質を発現させるのに適した手法で、発現ベクター中に上記のDNAを組み込む工程、 (c)上記の発現ベクターを用いて、適当な真核性または原核性の宿主細胞を形質転換する工程、 (d)目的タンパク質を発現させるような手法で形質転換またはトランスフェクションした上記の宿主細胞を培養する工程、および (e)組換え生産した目的タンパク質を回収し、精製する工程。

【００８７】一般に、本発明のベクター構築におけるDNA配列のクローニングには、原核生物を用いる。目的タンパク質の生産においても原核生物が用いられ得る。例えば
、大腸菌(Escherichia coli)K12株294(ATCC No.31446)は、外来タンパク質を原核生物で発現させるのに特に有用である。使用され得る他のE.coli株(およびその関連する遺伝子型)としては表１に示されたものが挙げられている。

【００８８】

【表１】

【００８９】これらの株はすべてBethesda Research Laboratories(Gaithersburg,Maryland
20877)およびStratagene Cloning Systems(La Jolla, California 92037)などの発売元から市販されており、またはAmerican Type Culture Collection(12301
,Parklawn Drive, Rockville,Maryland,10852-1776)のような供給元から公けに容易に入手できる。

【００９０】特記した場合を除き、これらの菌株は互換的に利用することができる。列挙さ
れた遺伝子型は細菌宿主を選ぶ際に所望する特性の多くを説明するものであるが
、どのような形であれ、本発明を限定するものではない。該遺伝子型の名称は、
標準的な命名法に従ったものである[例えば、前述のJ.Sambrookらを参照のこと]
。本発明の遺伝子のクローニングおよび発現に用いられる好ましいE.coliの株は
RV308である。この株はATCCからATCC 31608の受託番号に基づき入手でき、また米国特許第4,551,433号(1985年11月5日発行)に記載されている。

【００９１】前述のE.coli株に加え、Bacillus subtilisなどの桿菌、Salmonella typhimur
iumあるいはSerratia marcescansなどの他のグラム陰性通性嫌気性桿菌、および
種々のシュードモナス（Pseudomonas）種が利用され得る。これらのグラム陰性細菌に加えて、他の細菌、特にStreptomyces種が、本発明のタンパク質の原核生
物を用いたクローニングおよび発現の際に用いられ得る。

【００９２】原核生物宿主とともに用いるのに適したプロモーターとしては、β-ラクタマーゼプロモーター系[ベクターpGX2907(ATCC 39344)はレプリコンおよびβ-ラクタマーゼ遺伝子を含む]、ラクトースプロモーター系[Changら,Nature(London),2
75,615(1978);およびGoeddelら,Nature(London),281,544(1979)]、アルカリホス
ファターゼ、トリプトファン(trp)プロモーター系[ベクターpATH1(ATCC 37695) は、trpプロモーターの制御の下で、trpE融合タンパク質としてのオープンリーディングフレームの発現を促進するよう設計されている]並びにtacプロモーター
(これはプラスミドpDR540 ATCC-37282から単離できる)などのハイブリッドプロモーターが挙げられる。しかしながら、他の機能的な細菌プロモーターでも、そ
の核酸配列が一般に公知であれば、当業者は、リンカーまたはアダプターを用い
て本発明のタンパク質をコードするDNAと該プロモーターを連結することにより任意の必要な制限部位を付与することができる。細菌系で用いられるプロモータ
ーは、所望のポリペプチドをコードするDNAに機能しうる形で連結されたシャインーダルガルノ(Shine-Dalgarno)配列も含むであろう。これらの例は、本発明を
限定するものではなく例証するものである。

【００９３】本発明のタンパク質は、直接発現させるか、または目的タンパク質を含有する
融合タンパク質として合成することができる。該融合タンパク質は、酵素的また
は化学的切断によって除去し得る他のタンパク質またはペプチドとの翻訳融合物
である。組換え系におけるある一定のペプチドの生産においては、融合タンパク
質として発現させることで、そのライフスパンを引き伸ばし、所望するペプチド
の量を増加させ、または目的タンパク質の都合のよい精製法を得ることがしばし
ば観察される。特異的部位でポリペプチドを切断し、またはペプチド鎖のアミノ
末端もしくはカルボキシ末端からペプチドを消化する（例えば、ジペプチジルア
ミノペプチダーゼ）種々のペプチダーゼ（例えば、トリプシン）が公知である。
さらに、特定の化学物質（例えば、臭化シアン）は特異的部位でポリペプチド鎖
を切断するであろう。当業者には、部位特異的な内部切断部位を組み込むために
は、アミノ酸配列（および、組換え法を用いる場合には合成または半合成コード
配列）に修飾を施すことが必要であることが理解されよう。[例えば、P.Carter,
"Site Specific Proteolysis of Fusion Proteins",PROTEIN PURIFICATION:FROM
MOLECULAR MECHANISMS TO LARGE SCALE PROCESSESの13章（American Chemical
Society,Washington,D.C.(1990)）を参照のこと]

【００９４】前記で概要を述べたように、本発明のインスリン類似体のうちのいくつかは、
トリプシン様活性をもつ酵素を用いて、構造式X-B-C-Aまたは構造式X-A-C-Bを有
するプロインスリン様前駆体を処理することにより作製される[Belagaje,R.M.ら
、A-C-Bプロインスリンについては米国特許第5,304,473号（1994年4月19日発行）を参照のこと]。該前駆体は、好ましくは、適当な組換えDNA構造体を用いて形
質転換した生物内で生合成される。該発現ペプチドを精製し、前駆体の３つのジ
スルフィド結合を正確に形成し、トリプシン様活性を有する酵素で該前駆体を処
理することによりXを切断しCを切除する。トリプシン様活性を有する酵素を用い
てプロインスリン様前駆体を切断することは周知である[Chance,R.E.ら,Science
,161,165-167(1968);Kemmler W.ら,J.Biol.Chem.,246,6786-6791(1971);Frank,B
.H.ら,in Peptides:Synthesis,Structure,Function,Proceedings of the Sevent
h American Peptide Symposium(編),Rich,D.H.およびGross,E.,Pierce Chemical Company(1981)pp729-38;Hansen,H.ら,米国特許第5,149,777号(1992年9月22日発
行);Balschmidtら,米国特許第5,164,366号(1992年11月17日発行)]。プロインスリン様前駆体の３つの正確なジスルフィド結合を形成するための手法も周知であ
る[例えば、Frank,B.H.,米国特許第4,430,266号（1984年2月7日発行）を参照のこと]。

【００９５】アシル化インスリンを含むタンパク質の遊離アミノ基のアシル化は、当技術分野では公
知である。アシル化の一般的な方法はRiordan,J.F.およびVallee,B.L.,Methods
of Enzymology,XXV,494-499(1972)に示されており、活性化エステル、酸ハロゲン化物、または酸無水物の使用を含む。脂肪酸によって遊離アミノ酸をアシル化
する際、脂肪酸の活性化エステル、特にN-ヒドロキシスクシンイミドエステルの
使用が特に都合がよい。Lapidot,Y.ら,J.of Lipid Res.8,142-145(1967)。Lapid
otらに、N-ラウロイルグリシン、N-ラウロイル-L-セリン、およびN-ラウロイル-
L-グルタミン酸の調製の際の、N-ヒドロキシスクシンイミドエステルの調製とそ
の使用について記載されている。

【００９６】 ε-アミノ基を選択的にアシル化するために、カップリングの際に様々な保護基を用いてα-アミノ基をブロックすることができる。p-メトキシベンゾキシカルボニル基（pmZ)などの適当な保護基の選択は当業者には公知である。好ましく
は、アミノ基保護基を使用せずにε-アミノ基のアシル化を一段階合成により行う。アシル化は、極性溶媒中、塩基性条件下において活性化脂肪酸エステルと該
タンパク質のε-アミノ基とを反応させることによって行われる。反応の塩基性度は、インスリン類似体の全ての遊離アミノ基を脱プロトン化するのに十分でな
ければならない。弱塩基性条件下では、全ての遊離アミノ基が脱プロトン化され
ず、N末端またはα-アミノ基が優先的にアシル化される。水性溶液または共溶媒
においては、塩基性条件とは反応がpH9.0以上でなされることを意味する。pH12.
0を超えるとタンパク質の分解が起こるので、反応混合液のpHは好ましくは10.0 〜11.5、最も好ましくは10.5である。有機溶媒と水性溶媒との混合溶媒中での反
応混合液の反応のpH測定値は、混合する前の水性溶媒のpHである。

【００９７】非水溶媒では、ε-アミノ基の選択的アシル化は、ε-アミノ基を十分に脱プロ
トン化するために、水中でのpKa10.75以上に相当する塩基性度の塩基の存在下で
行われる。すなわち、該塩基は、少なくともトリエチルアミンと同程度の強塩基
でなくてはならない。好ましくは、該塩基はテトラメチルグアニジン、ジイソプ
ロピルエチルアミン、または水酸化テトラブチルアンモニウムである。より弱い
塩基を使用すると、α-アミノ基のアシル化が生じることになる。

【００９８】溶媒の選択は重要ではなく、インスリン類似体および脂肪酸エステルの溶解度
に大きく依存する。溶媒はもっぱら有機性であり得る。一般に許容される有機溶
媒には、DMSO、DMFなどが含まれる。水性溶媒や、水性溶媒と有機溶媒の混合物も使用できる。極性溶媒の選択は、試薬の溶解度によってのみ制限される。好ま
しい溶媒は、DMSO、DMF、アセトニトリル／水、アセトン／水、エタノール／水、イソプロピルアルコール／水、イソプロピルアルコール／エタノール／水、エ
タノール/プロパノール/水である。好ましくは、該溶媒はアセトニトリル／水で
あり、最も好ましくは、50％アセトニトリルである。当業者であれば、他の極性
溶媒も使用可能であることを認識するであろう。

【００９９】一般に、活性化脂肪酸エステルはモル過剰であることが好ましい。好ましくは
反応は該エステルを１〜４モル当量、最も好ましくは１〜２モル当量を用いるこ
とにより行う。当業者であれば、活性化エステルが非常に高レベルに存在すると
、ビス−またはトリ−アシル化生成物が有意な量で生産されることを認識するで
あろう。

【０１００】反応温度は重要ではない。反応は20〜40℃で行い、一般に15分〜24時間で完了
する。

【０１０１】アシル化の後、生成物を逆相疎水性クロマトグラフィーのような標準的な方法
で精製する。その後生成物を凍結乾燥または結晶化のような標準的方法によって
回収する。

【０１０２】本発明の製剤の調製と使用非経口投与用の本発明のインスリン類似体の製剤は、所望の量の本発明のモノ
アシル化ジ−アルギニンまたはトリ−アルギニンインスリン類似体を、水性媒体
などの注射に適した非毒性液体ビヒクルに懸濁または溶解し、懸濁液または溶液
を殺菌することにより調製することができる。あるいは正確に測定した一定量の
該化合物をバイアル瓶に入れ、該バイアル瓶およびその内容物を殺菌し、密封し
てもよい。バイアル瓶またはビヒクルを、投与する前に該化合物を溶解する目的
で添付してもよい。

【０１０３】非経口投与に適した医薬組成物には、典型的には、グリセリン、水溶性プロピ
レングリコール、N,N-ジメチルホルムアミドなどの水混和性有機溶媒および水の
ような希釈剤、賦形剤および担体を用いる。そのような医薬組成物の例としては
、製薬上許容されるバッファーで緩衝化され、発熱物質を除いた、アシル化ジ−
アルギニンまたはトリ−アルギニンインスリン類似体の無菌等張食塩水溶液が挙
げられる。さらに、非経口医薬製剤は、メタクレゾールもしくはフェノールのよ
うな保存剤、または水酸化ナトリウムもしくは塩酸のような最終生成物のpHを調
整するために加える化合物を含んでもよい。

【０１０４】これらの製剤のバリエーションは、当業者には認識されるであろう。例えば、
化合物を加える手法、pHを調整する手法、用いた界面活性剤、もしあれば等張剤
、塩形成剤または錯化剤のタイプおよび量、製剤を調製する際の温度とイオン強
度は、用いる濃度と投与方法に対して最適化され得る。

【０１０５】一つの実施形態では、本発明の好ましい製剤は、モノアシル化ジ−アルギニン
またはトリ−アルギニンインスリン類似体を、pH値約3.0〜約3.8で含有する。最
も好ましくは、そういった製剤のpHは約3.5である。これらのpH値の製剤においては、本発明のインスリン類似体の大部分が可溶化するであろうことは、当業者
であれば認めるところであろう。これらの製剤のpHに関しては、「約」は、プラスマイナス0.05のpH単位を表わす。「約3.8」は、3.75〜3.85を意味する。このような製剤は、保存剤などの当技術分野では周知の様々な化合物を含有し得る。

【０１０６】よって本発明には、本発明のモノアシル化ジ−アルギニンまたはトリ−アルギ
ニンインスリン類似体を含有し、pHが約pH3.0〜約3.8である製剤を、糖尿病の治
療が必要な患者に投与することを含む、糖尿病の治療法も包含する。そのような
方法は、pH値約3.5のその製剤を用いて施すこともできる。

【０１０７】別の実施形態では、本発明の好ましい製剤は、モノアシル化ジ−アルギニンま
たはトリ−アルギニンインスリン類似体を含有し、pH値は約4.5〜約7.6である。
別の好ましいpH範囲は、約5.0〜約7.0である。最も好ましくは、そのような製剤
のpHは約6.5である。当業者であれば、これらの製剤において、本発明のインスリン類似体の大部分は不溶であることは認識されよう。これらの製剤のpHに関し
て、「約」は、プラスマイナス0.05のpH単位を表わす。このような製剤は、保存
剤などの当技術分野では周知の様々な化合物を含有し得る。

【０１０８】よって本発明には、本発明のモノアシル化ジ−アルギニンまたはトリ−アルギ
ニンインスリン類似体を含有し、pHが約pH4.5〜約7.6である製剤を、糖尿病の治
療が必要な患者に投与することを含む、糖尿病の治療法も包含する。そのような
方法は、pH値約5.0〜約7.0のその製剤を用いて施すこともできる。そのような方
法は、pH値約6.5のその製剤を用いて施すこともできる。

【０１０９】本発明のさらに別の実施形態では、本発明の好ましい製剤は、モノアシル化ジ
−アルギニンまたはトリ−アルギニンインスリン類似体を含有し、該類似体の少
なくとも約50％、または約60％、または約70％、または約80％、または約90％、
または約95％、または約96％、または約97％が不溶である。溶解度パーセンテー
ジに関して、「約」は与えられた値のプラスマイナス2％を表わす。例えば、「約50％」は48〜52％を意味する。少なくとも約50％を有する製剤が特に好ましい
。

【０１１０】よって、本発明は、本発明のモノアシル化ジ−アルギニンまたはトリ−アルギ
ニンインスリン類似体を含有し、該類似体の少なくとも約50％、または約60％、
または約70％、または約80％、または約90％、または約95％、または約96％、ま
たは約97％が不溶である製剤を、糖尿病の治療が必要な患者に投与することを含
む、糖尿病の治療法も包含する。

【０１１１】モノアシル化ジ−アルギニンまたはトリ−アルギニンインスリン類似体のよう
な、特定の化合物が可溶であるか否かを決めるのに適した方法が多く存在するこ
とは、当業者の認めるところであろう。そのような方法ではインスリン類似体を
含む製剤のタンパク質濃度をまず決定することが必要である。タンパク質濃度の
決定法は当技術分野では周知であり、吸光度、ラジオイムノアッセイ、蛍光法、
キャピラリー電気泳動、SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動、およびHPLCを含む。次に、遠心分離のような、物理的に可溶および不溶な類似体を分離する技術
を用いて、不溶物質を可溶物質から分離する。遠心分離に続き、遠心分離した物
質の上清のタンパク質濃度を、当技術分野で周知の多くの技術の一つを用いて決
定する。

【０１１２】以下の実施例は、本発明をさらに例示するためのものにすぎない。本発明の範
囲が単に以下の実施例からなるものと解釈されるべきではない。

【０１１３】調製１ Gly^A21Arg^B3lArg^B32およびArg^A0Gly^A21Arg^B3lArg^B32-ヒトインスリン類似体 Gly^A21Arg^B3lArg^B32およびArg^A0Gly^A21Arg^B3lArg^B32ヒトインスリン類似体は、E. coli発酵物から得た。この発酵物中では、G1y^A2l-ヒトプロインスリン前駆
体分子が過剰発現され、封入体を形成した。これらの前駆体分子をコードするポ
リヌクレオチドは、先に説明したように標準的な組換えDNA法を使用して調製した。

【０１１４】 0.1M TRIS、0.27M亜硫酸ナトリウム、および0.1M四チオン酸ナトリウムを含有
する6Mグアニジン-HCl 500mL(pH10.5)中に室温にて封入体の一部分(94.7g)を可溶化させた。5N NaOHを用いて激しく攪拌しながらpHを7.7から10.4まで上昇させ
た。12N HClを用いてpHを8.8まで急速に低下させた。開放容器中で45分間激しく
攪拌した後、H₃PO₄を用いてpHを2.1まで低下させ、4℃で一晩かけてサンプルの遠心分離を行った。上清をデカントし、後続処理のために4℃で保存した。更に、pH10.5の溶液200mLを用いてペレットを再抽出し(上記参照)、次いで4℃で3時間遠心分離した。この上清と先に得られた上清をpH4の100mM NaH₂PO₄でそれぞれ
4倍に希釈し、生成物および他の酸性成分を沈殿させた。沈殿を沈降させた後、上清の大部分をデカントして廃棄した。

【０１１５】得られた懸濁液を遠心分離し、続いて、デカントして更なる上清を除去し、未
精製のG1y^A21-ヒトプロインスリンS-スルホネート前駆体の湿潤ペレットを残した。1.5リットルの7M脱イオン尿素でペレットを可溶化し、5N NaOHでpHを8に調整し、4℃で数時間攪拌した。次に、濃度1Mとなるように塩(NaCl)を添加し、このサンプルを14×20cm XAD‐7(Toso-Haas, Montgomeryville, PN)カラム上に充填した。このカラムは、50%アセトニトリル／50% 50mM重炭酸アンモニウム、10%
アセトニトリル／90% 50mM重炭酸アンモニウム、最後に、7M脱イオン尿素／1M N
aCl／20 mM TRIS、pH8で予めフラッシュしたものであった。充填後直ちに、4.5 リットルの7M脱イオン尿素／1M NaCl／20 mM TRIS, pH8溶液、続いて、3リットルの50mM重炭酸アンモニウム／1M NaClおよび6リットルの50mM重炭酸アンモニウ
ムをカラムに通液した。280nmのUVで溶出液をモニターしながら、直線濃度勾配でアセトニトリルを含んでなる50mM重炭酸アンモニウムを用いてカラムの溶離を
行った。

【０１１６】部分的に精製されたGly^A2l-ヒトプロインスリンS-スルホネート前駆体である目的のピーク部分を採取し、凍結乾燥し、更に、以下のように折畳み／ジスルフ
ィド結合法で処理した。所定量(5.4g)の前駆体を、pH10.5、4℃の20mMグリシン3
リットル中に溶解した。次に、pHを10.5に、また温度を4℃に保持しつつ、攪拌しながら15mLの240mMシステインHClを添加した。4℃で27時間にわたり反応溶液を緩やかに攪拌し、次に、H₃PO₄でpHを3.1まで低下させることにより反応を停止
させた。アセトニトリル(155mL)を添加し、次いで、この溶液を5×25cm C4逆相カラム(Vydac、Hesperia CA)上に充填した。このカラムは、予め60%アセトニトリル／39.9%H₂O／0.1%TFAを通液し、10%アセトニトリル／90%H₂O／0.1%TFA中で平衡させたものであった。充填後直ちに、1リットルの10%アセトニトリル／89.9
%H₂O／0.1%TFAをカラムに通液し、次いで、280nmでモニターしながら、直線濃度
勾配でアセトニトリルを含んでなる0.1%TFAを用いて溶離を行った。選択された画分をプールし、凍結乾燥したところ、回収量は714mgであった。

【０１１７】 Gly^A21ヒトプロインスリン前駆体の切断によりGly^A2lArg^B31Arg^B32またはArg^A ⁰ Gly^A2lArg^B3lArg^B32ヒトインスリン類似体のいずれかが得られることは当業者には分かるであろう。ジ-アルギニン種およびトリ-アルギニン種の調製について
以下で説明する。

【０１１８】プロインスリン前駆体を所望のインスリン類似体に変換するために、Gly^A2l- ヒトプロインスリン前駆体697mgを50mM重炭酸アンモニウム70mL中に溶解し、次いで4℃まで冷却した(pH8.3)。0.01N HClを溶剤とするブタトリプシン(Sigma Ch
emical Company, St. Louis, MO)の1mg/mL溶液の所定量(0.14mL)をサンプル溶液
に添加し、4℃で約24時間にわたり緩やかに攪拌した。追加のトリプシン溶液0.1
4mLを反応溶液に添加し、次いで、この溶液を更に21時間45分間にわたり攪拌した。氷酢酸0.7mLおよびH₃PO₄ 0.3mLを用いてpHを3.2まで低下させることによって、反応を停止させた。

【０１１９】トリプシンによる切断反応生成物を含む反応停止させた溶液を、30%アセトニトリル／70% 50mM酢酸、pH3.1で4倍に希釈し、1×30cm S HyperD F (Biosepra,
Marlborough, MA)カラム(23.5mL)上に充填した。このカラムは、予め、30%アセトニトリル／70%50mM酢酸／500 mM NaCl、pH3.3を通液し、30%アセトニトリル／
70% 50mM酢酸中で平衡させたものであった。充填後直ちに、約50mLの30%アセトニトリル／70% 50mM酢酸をカラムに通液し、次いで、276nmで溶出液をモニターしながら、直線濃度勾配でNaClを含んでなる30%アセトニトリル／50mM酢酸を用いて、トリプシンによる切断生成物を溶離させた。

【０１２０】上記の手順を用いると、ジ-アルギニン類似体(Arg^A0Gly^A2lArg^B3lArg^B32)およ
びトリ-アルギニン類似体(Arg^A0Gly^A21Arg^B3lArg^B32ヒトインスリン)の両方が得
られるであうが、ジ-アルギニン類似体の方が比較的多量に生成するであろう。反応時間を短くし、トリプシンの量を低減させると、トリ-アルギニン種がより高い比率で得られるようになるであろう。上記の手順のほかに、ジ-およびトリ-
アルギニン種を生成させるための他の技法も当技術分野で周知である。例えば、
米国特許第5,491,216号(Hoffmann, J. A.ら)およびZeuzem, S.ら， Diabetologi
a 33:65-71 (1990)を参照されたい。

【０１２１】 1×30cm S HyperD F (Biosepra)カラムから溶離されたジ-アルギニン種および
トリ-アルギニン種を含む画分を、分析用HPLCを使用して同定した。他の技法も精製カラムから溶離されたピークの同一性を決定するのに好適である。例えば、
トリ-アルギニン種がジ-アルギニン種よりも正電荷を１つ多く含んでいるので、
pH4などの低いpHで行われるキャピラリー電気泳動により、ジ-アルギニン種とト
リ-アルギニン種が識別されるだろう。溶離された物質を同定するのに使用可能な他の技法は、N末端アミノ酸配列分析である。トリ-アルギニン種は、A鎖のN末
端にアルギニンを有するであろうが、ジ-アルギニン種はそのN末端にグリシンを
有するだろう。ジ-およびトリ-アルギニン種を検出するために質量分析法を使用
することもできる。

【０１２２】 Gly^A2lArg^B3lArg^B32-ヒトインスリン類似体を含む選択された画分を分析用HPL
Cアッセイに基づいてプールし、精製水で3倍に希釈し、2.2×25cm C4逆相カラム
(Vydac, Hesperia CA)に充填した。このカラムは、予め、60%アセトニトリル／3
9.9%H₂O／0.1%TFA、次いで10%アセトニトリル／89.9%H₂O／0.1%TFAを通液したも
のであった。充填後直ちに、約200mLの10%アセトニトリル／89.9%H₂O／0.1%TFA をカラムに通液し、次に、直線濃度勾配でアセトニトリルを含んでなる0.1% TFA
で溶離させた。選択された画分をプールし、凍結乾燥したところ、回収量は101m
gであった。分析用HPLCにより、主ピークの純度は95%を超えることが判明した。
精製タンパク質をエレクトロスプレイ質量分析(ES/MS)にかけたところ、分子量は6062.9であった。この値は、理論分子量6063.0とほとんど同じである。

【０１２３】従って、トリアルギニン類似体を単離するために、トリプシンによる切断の後
でS HyperD F (Biosepra)カラムクロマトグラフィーから得られた、Arg^A0Gly^A2l Arg^B31Arg^B32ヒトインスリン類似体を含むそれらの画分を一緒にした。次に、こ
れらの画分を精製水で2倍に希釈し、2.2×25cm C4 (Vydac、Hesperia、CA)逆相カラム上に充填した。充填後直ちに、2カラム容量(c.v.)の10%アセトニトリル／
90% 0.1%TFAをカラムに通液し、次に、直線濃度勾配でアセトニトリルを含んでなる0.1% TFAで溶離させた。選択された画分を合わせて凍結し、更に、凍結乾燥
させた。32mgの凍結乾燥されたArg^A0Gly^A2lArg^B31Arg^B32ヒトインスリン類似体を回収した。分析用HPLCにより、主ピークの純度は82%を超えることが判明した。精製タンパク質をエレクトロスプレイ質量分析(ES/MS)にかけたところ、分子量は6218.9であった(分子量の理論計算値: 6219.2)。

【０１２４】調製2 B29-N^ε-Gly^A2lArg^B31Arg^B32-ミリストイルおよびB29-N^ε-Arg^A0Gly^A2lArg^B31Ar
g^B32-ミリストイルヒトインスリン類似体の調製次に、ジ-アルギニンおよびトリ-アルギニンインスリン類似体をアシル化する
ために利用される手順について説明する。表2中のデータおよび上記のアシル化手順と関連させて概要を理解されたい。

【０１２５】 pH2.57で正確に測った一定体積の50mMホウ酸を添加することによって、正確に
測った一定質量の精製インスリン類似体を溶解させた。次に、ホウ酸溶液の体積
に等しい、正確に測った一定体積のアセトニトリルを、攪拌しながら徐々に添加
した。「溶剤」の体積は、ホウ酸の体積とアセトニトリルの体積の合計である。
その後、NaOHを添加することによって、溶液のpHを10.2〜10.5に調整した。別の
容器中で、正確に測った一定質量のN-アシル-スクシンイミド(「NAS」)を正確に
測った一定体積のアセトニトリル中に溶解させた。次に、正確に測った一定体積
の第２の溶液を第1の溶液に添加した。次に、pHを10.2を超える値に保持しながら室温で反応液を攪拌し、HPLCを使用して反応混合物のサンプルを分析すること
によって反応の進行をモニターした。HPLCにより反応の完了が示唆されたとき、
pH2〜3まで酸性化することによって反応を停止させた。次に、逆相クロマトグラ
フィーを使用して反応混合物を精製した。グラジエント溶離用に構成されたPhar
macia FPLC Chromatography System (Vydac) C4カラム(1×25cm)をUV検出器に接
続し、更に、チャートリーダーやコンピュータなどのデータ記録装置およびフラ
クションコレクターに接続した。バッファーB (0.1%TFA、70%ACN、pH2)でカラム
を洗浄し、次に、バッファーA (0.1%TFA、10%ACN)と平衡させた。FPLCのAポンプ
を介して、平衡させたカラムに希釈されたサンプルを直接添加した。次に、カラ
ムを100%バッファーAと平衡させ、アセトニトリルの濃度勾配を使用してサンプルを溶離させた。サンプルを溶離させるために使用したグラジエント系は次の通
りであった。(1) 0分: 0%バッファーB; (2) 30分: 30%バッファーB; (3) 210分:
60%バッファーB; (4) 270分: 100%BバッファーB。

【０１２６】表2は、本発明の種々の実施形態を提示するために使用した誘導体化タンパク質の合成に関する実験データを、上記の概要説明に基づいて記載したものである
。精製された誘導体の分子量は、エレクトロスプレイ質量分析法(ES/MS)を使用して確定した。アシル化部位の帰属は、クロマトグラフ分析(分析用HPLC)を使用
して確定した。N末端アミノ酸分析も使用することができる。分析用HPLCは、Alt
ex Model 420 System Controller、2台のBeckman 11Aポンプ、Bio-Rad Model AS
-100オートサンプラー、カラムヒーター、チャートリコーダーやコンピュータな
どのデータ記録装置に接続されたUV検出器を用いて行った。Vydac C4カラム(0.4
6×25cm)をバッファーA (0.1% TFA、10% ACN)と平衡させ、20μlのサンプルを加
え、更に、バッファーB (0.1% TFA、70%CAN)を使用して次の濃度勾配でサンプル
を溶離させた。(1) 0分: 0%バッファーB; (2) 5分: 0% バッファーB; (3) 6分:
30% バッファーB; (4) 36分: 60% バッファーB; (5) 37分: 100% バッファーB;
(6) 42分: 100% バッファーB; (7) 43分: 0% バッファーB; (8)53分: 0% バッフ
ァーB。サンプルの溶出は214nmの吸収によって検出した。流量は1.0ml/分であり
、温度は45℃であった。また、Jupiter C18カラム(0.46×15cm)を用いて同じ手順を繰り返した。一連のサンプルを分析した際、54分ごとに注入を行った。

【０１２７】

【表２】

【０１２８】調製3 B29-N^ε-Gly^A2lArg^B31Arg^B32-ドデカノイルおよびB29-N^ε-Gly^A2lArg^B31Arg^B32-
デカノイルヒトインスリン類似体の調製このほかの誘導体化タンパク質の合成について、その概要を以下に示す。全体
的合成スキームを提供すべく以下に示された表3中のデータと合わせて概要を理解されたい。

【０１２９】陽イオン交換カラム(S HyperD F(Biosepra))からプールされ、1.7mg/mlペプチ
ド(UV推定値)、0.4M NaCl、および30%アセトニトリル(v/v)を含む精製Gly^A2lArg ^B31 Arg^B32-ヒトインスリンの20mlサンプルに、更に8mlのアセトニトリルを添加して、50%アセトニトリル溶液を作製した。最終体積は28mlであり、pHは3.6であ
った。次に、Gly^A2lArg^B31Arg^B32-ヒトインスリンのこの28ml溶液を2つの14ml部
分に分けた。NaOHを用いて各溶液のpHを10.6〜10.9に調節した。別の容器中で、
正確に測定した一定質量のC10またはC12-スクシンイミドを0.5mlのDMSOに溶解し
た。C10またはC12-スクシンイミドのいずれかをそれぞれのGly(A21)ジ-Argヒトインスリン溶液に添加した。pHを10.2より大きい値に保持しながら室温で反応を
行い、HPLCを使用して反応混合物のサンプルを分析することによって反応の進行
をモニターした。HPLCにより反応の終了を確認した後に、pH2〜3まで酸性化する
ことによって反応を停止させた。

【０１３０】この後、逆相クロマトグラフィー系を使用して反応混合物の精製を行った。C1
2-B29-Gly^A2l-ジ-アルギニンヒトインスリンに対して、次の系を使用した。グラ
ジエント溶離用に構成されたPharmacia FPLC Chromatography System (Vydac) C
4カラム(1×25cm)をUV検出器に接続し、更に、チャートリコーダーやコンピュー
タなどデータ記録装置およびフラクションコレクターに接続した。カラムをバッ
ファーB (0.1% TFA、70% ACN、pH2)で洗浄し、次に、バッファーA (0.1% TFA、1
0% ACN)と平衡させた。FPLCのAポンプを介して、平衡させたカラムに希釈された
サンプルを直接添加した。次に、カラムを100%バッファーAと平衡させ、アセトニトリルの濃度勾配を使用してサンプルを溶出させた。サンプルを溶出させるの
に使用したグラジエント系は次の通りであった。(1) 0分: 0%バッファーB; (2)
20分: 30%バッファーB; (3) 180分: 60%バッファーB。

【０１３１】 C10-B29-Gly^A2l-ジ-アルギニンヒトインスリンに対して、次の系を使用した。
グラジエント溶離用に構成されたPharmacia FPLC Chromatography System (Vyda
c) C18カラム(1×25cm)をUV検出器に接続し、更に、チャートリコーダーやコンピュータなどデータ記録装置およびフラクションコレクターに接続した。カラム
をバッファーB (0.1% TFA、70% ACN、pH2)で洗浄し、次に、バッファーA (0.1%
TFA、10% ACN)と平衡させた。FPLCのAポンプを介して、平衡させたカラムに希釈
されたサンプルを直接添加した。次に、カラムを100%バッファーAと平衡させ、アセトニトリルの濃度勾配を使用してサンプルを溶出させた。サンプルを溶出さ
せるのに使用したグラジエント系は次の通りであった。(1) 0分: 0%バッファーB
; (2) 20分: 30%バッファーB; (3) 180分: 60%バッファーB。

【０１３２】表3は、本発明の種々の実施形態を提示するために使用した誘導体化タンパク質の合成に関する実験データを、上記の概要説明に基づいて記載したものである
。精製された誘導体の分子量は、エレクトロスプレイ質量分析法(ES/MS)を使用して確定した。アシル化部位の帰属は、クロマトグラフ分析(「HPLC」)を使用し
て確定した。

【０１３３】

【表３】

【０１３４】実験1 B29-N^ε-Arg^A0Gly^A2lArg^B31Arg^B32-ミリストイルヒトインスリン類似体、Gly^A2l Arg^B31Arg^B32ヒトインスリン類似体、およびArg^A0Gly^A2lArg^B31Arg^B32ヒトインスリン類似体についての溶解性の比較研究 2mMグリシン、ホウ酸ナトリウム、およびクエン酸ナトリウムを含むpH9のバッ
ファー溶液5.3094g中に、7.5mgのポリペプチドを溶解することによって、B29-N ^ε -Arg^A0Gly^A2lArg^B31Arg^B32-ミリストイルヒトインスリン類似体のストック溶液を調製した。得られた溶液は濁っており、pHは8.59であった。130μLの0.1N
NaOHを添加することによってpHを調節し、最終pH9を有する視覚的に清澄な溶液を得た。得られた溶液を0.2ミクロンのシリンジフィルターに通した。ペプチドの濃度を推定すべく、濾過されたストック溶液の特性決定をUV分光法により行っ
た。UV分析の結果、ポリペプチドの濃度は1.0589mg/mLであることが分かった。

【０１３５】ストック溶液の160μL部分を採取して順次水で希釈し、HPLC分析により標準曲
線を作成した。次に、350μLのサンプル10個をストック溶液から採取した。0.1N
HClを注意深く添加することによって、これらの10個のサンプルのpHをそれぞれ
、値が順次小さくなるように調節した。表4は、pH調節されたサンプルの目標pH および実測pHを示したものである。

【０１３６】最後のサンプルのpHを調節した後、室温(23〜25℃)でサンプルを30分間静置し
た。次に、14,000 rpmでサンプルを22分間遠心分離し、300μlの上清を取り出し
た。その後、ストックの連続希釈液およびpH調節したサンプルを、HPLCにより分
析した。得られたクロマトグラムを積分することにより、標準曲線の作成に使用
する面積を求めた。溶液中に残存するサンプルの濃度は、この標準曲線から計算
した。これらのmg/ml単位の推定値を、UV分光法によるストック溶液濃度の推定値に対する溶液中のポリペプチドのパーセントに変換した。表5は、B29-N^ε-Arg ^A0 Gly^A2lArg^B31Arg^B32-ミリストイルヒトインスリン類似体の溶解性の研究で得られたデータを示したものであり、図1は、同じデータをグラフで表したものである。データから分かるように、この研究対象のアシル化されたヒトインスリン
類似体の溶解性は、pHがpH8.66よりも低下すると著しく減少し、pHが約4.5未満に減少するまで増大しない。

【０１３７】表5に示されているように、B29類似体はpH4.47〜7.63のpH範囲で少なくとも約
96%不溶であることが判明した。

【０１３８】

【表４】

【０１３９】

【表５】

【０１４０】比較データを得るために、先に概説したものと同じ技法を用いて、アシル化さ
れていないトリ-アルギニン(Arg^A0Gly^A2lArg^B31Arg^B32)およびジ-アルギニン(Gl
y^A2lArg^B31Arg^B32)ヒトインスリン類似体に関する溶解性の研究を行った。これらが研究から得られた結果は表6に示されている。また、図2にはグラフで表され
ている。

【０１４１】

【表６】

【０１４２】実験２ in vivo試験 -- ブタにおけるHumulin(登録商標) NPH、B29- N^ε-ミリストイルヒトインスリン、B29-N^ε-Arg^A0Gly^A2lArg^B31Arg^B32-ミリストイルヒトインスリ
ン類似体、およびB29-N^ε-Gly^A2lArg^B31Arg^B32-ミリストイルヒトインスリン類似体の比較試験約0.8mg/mLの理論濃度になるように0.01N HCl中にアシル化ヒトインスリンの秤量済みサンプルを最初に溶解することによって、B29-N^ε-ミリストイルヒトイ
ンスリンの製剤を調製した。光路長1cmの石英キュベットを使用してHewlett-Pac
kard HP8452Aホトダイオードアレイ分光光度計によりUVスペクトルを測定した。
0.01N HClのバックグラウンドスペクトルをサンプルスペクトルから算術的に引き算した。また、276nmの吸収値から322nmの吸収値を引き算することによって光
散乱効果の補正を行った。ミリストイル化されたヒトインスリンのストック溶液
の濃度は、276nmにおける理論吸光係数および吸収値から計算した。次に、この濃度を使用し、Zn対インスリンモノマーのモル比が0.35になるようにミリストイ
ル化ヒトインスリンに添加すべくZnOストック溶液の量を計算した。次に、0.1N
NaOHを用いてミリストイル化ヒトインスリンのpHを7.78まで注意深く上昇させ、
それに要した体積を記録した。最後に、凍結乾燥後にバイアル1個あたり約3.61m
gにするのに必要な体積のミリストイル化ヒトインスリンをバイアルに注ぎ、凍結乾燥した。

【０１４３】凍結乾燥されたB29-N^ε-ミリストイルヒトインスリンの入ったバイアル（先に
記載したように調製したアシル化ヒトインスリン3.58mgと、アシル化インスリン
1モルあたり0.35モルのZnOとが含まれると推定される）を再構成することによっ
て、ブタにおける研究を行うためのB29-N^ε-ミリストイルヒトインスリン製剤を
調製した。7mM第1リン酸ナトリウムと、16mg/mLグリセリンと、5mg/mLフェノールとを含んでなるpH7.5の希釈液991μLを用いてバイアルの再構成を行った。再構成の後、pHを測定したところ7.5〜7.6であった。

【０１４４】 Humulin(登録商標) NPHの市販の製剤を使用した。この市販の製剤は、16mg/ml
グリセロール、25μg/ml Zn、0.73mg/mlフェノール、1.6mg/ml m-クレゾール、0
.35mg/mlプロタミンスルフェート、および3.78mg/ml第2リン酸ナトリウムを含有
する水溶液中に600μM亜鉛-ヒトインスリン結晶を含んでなる製剤であった。Hum
ulin(登録商標) NPHおよびHumulin(登録商標) Nは、同じインスリン物質を規定するのに使用される用語である。

【０１４５】 B29-N^ε-Arg^A0Gly^A2lArg^B31Arg^B32-ミリストイルヒトインスリン類似体の製剤
を調製した。この製剤は、16mg/mlグリセロール、80μg/ml Zn、および2.5mg/ml m-クレゾールを含有するpH3.06の水溶液中に311μMのモノアシル化トリ-アルギ
ニンインスリン類似体を含んでなる製剤であった。

【０１４６】 B29-N^ε-Gly^A2lArg^B31Arg^B32-ミリストイルヒトインスリン類似体の製剤を調製した。この製剤は、16mg/mlグリセロール、80μg/ml Zn、および2.5mg/ml m- クレゾールを含有するpH3.03の水溶液中に825μMのモノアシル化ジ-アルギニンインスリン類似体を含んでなる製剤であった。

【０１４７】若い(3〜4月齢)、意識のある、常時カテーテルの挿入された、22〜24時間の絶
食後の体重が15〜25kgである雌のブタで研究を行った。内因性膵液分泌を抑圧す
るために、移植された2つの頸静脈カテーテルのうちの1つを介してソマトスタチ
ン(0.3mg/kg/分)を注入した[例えば、Radziuk, J.ら, Diabetes 46:548 (1997) を参照されたい]。ソマトスタチン注入開始の15分後に、耳のすぐ後ろの柔らかい皮膚にインスリン類似体 (6nmol/kg) を皮下注入した。8匹のブタを使用した。B29-N^ε-Gly^A2lArg^B31Arg^B32-ミリストイルヒトインスリン類似体を用いて1匹
のブタを処置し、B29-N^ε-Arg^A0Gly^A2lArg^B31Arg^B32-ミリストイルヒトインスリ
ン類似体を用いて1匹のブタを処置し、Humulin(登録商標) NPHを用いて3匹のブタを処置し、更に、B29- N^ε-ミリストイルヒトインスリンを用いて3匹のブタを
処置した。各実験において、インスリン類似体の薬力学的および薬動学的挙動を
モニターするために、注入後14時間まで動脈血サンプルを間欠的に採取した。実
験中、血漿グルコース濃度をほぼ基底濃度に保持するために、必要に応じて、移
植された第2の頸静脈カテーテルを介してグルコースを注入した。この研究日に、YSI Glucose/Lactate Analyzer (Yellow Springs, OH)またはBeckman Glucose
Analyzer II (Fullerton, CA)のいずれかを用いてグルコースオキシダーゼ法に
よりグルコース濃度を測定した。後日、2抗体ラジオイムノアッセイ(Linco Rese
arch, St. Charles, MOから提供されたラットインスリン抗体)を用いて、インス
リン濃度を測定した。

【０１４８】各類似体についてグルコースの注入量を時間に対してプロットし、更に、各類
似体について注入グルコースの累積量を時間に対してプロットした。Humulin(登
録商標) NPH (n = 3)およびB29- N^ε-ミリストイルヒトインスリン(n = 3)に対する履歴データ(同じプロトコルに従って測定した)も、一緒にプロットした。

【０１４９】注入グルコースの累積-- 図3は、Humulin(登録商標) NPH、B29- N^ε-ミリスト
イルヒトインスリン、B29-N^ε-Arg^A0Gly^A2lArg^B31Arg^B32-ミリストイルヒトイン
スリン類似体、およびB29-N^ε-Gly^A2lArg^B31Arg^B32-ミリストイルヒトインスリン類似体を含む等量の4種の化合物を用いて正常なブタの処置を行った実験において、時間に対する注入グルコースの累積量を比較したグラフである。図3にプロットされたデータは、実験時に注入されたグルコースの全量を表している。デ
ータから分かるように、B29-N^ε-Arg^A0Gly^A2lArg^B31Arg^B32-ミリストイルヒトイ
ンスリン類似体およびB29-N^ε-Gly^A2lArg^B31Arg^B32-ミリストイルヒトインスリン類似体ではいずれの場合もグルコースが消費されたが、Humulin(登録商標) NP
HまたはB29- N^ε-ミリストイルヒトインスリンと比較して極めて少ないレベルで
あった。これらの結果は、デザインされた物理的特性、すなわち、生理的pHでの
沈殿および血清アルブミンとの結合、に基づくインスリン類似体の活性出現の遅
れと一致する。一般に、注入したグルコースの累積量の値がプラトーに達する時
間を調べることによって、所定のインスリン調製物またはインスリン類似体調製
物の活性の持続時間を決定することができる。ここで行った実験の継続時間は14
時間であり、この時間は研究対象の4種のいずれに対しても終点を求めるのに充分な長さではなかった。しかし、当業者には、B29- N^ε-ミリストイルヒトインスリンがプラトーになり始めたことからその活性が停止状態に近いものであるこ
とが分かる。これらの結果に基づいて、本発明の類似体の方がHumulin NPHよりも活性の持続時間が長いことが期待される。

【０１５０】 Humulin(登録商標)および類似体の血漿レベル -- 図4は、正常なブタにおける
4種の化合物の血漿レベルを比較したグラフである。この研究で使用した化合物は、Humulin(登録商標) NPH、B29- N^ε-ミリストイルヒトインスリン、B29-N^ε-
Arg^A0Gly^A2lArg^B31Arg^B32-ミリストイルヒトインスリン類似体、およびB29-N^ε-
Gly^A2lArg^B31Arg^B32-ミリストイルヒトインスリン類似体であった。データから分かるように、Humulin(登録商標) NPHは、皮下注射後0〜150分の間、ほぼ0.5nM
のピーク血液レベルを有し、次に、実験の残りの時間では0.25nMのかなり一定し
たレベルを保持する。B29-N^ε-Gly^A2lArg^B31Arg^B32-ミリストイルヒトインスリン類似体では、200分まで薬物レベルがゆっくりと増大し、その後、約400分まで
一定の状態に保たれる。この時点でブロードな活性ピークを示し、約700分の時点で安定する。B29-N^ε-Arg^A0Gly^A2lArg^B31Arg^B32-ミリストイルヒトインスリン
類似体は、Humulin(登録商標) NPHの場合と類似した薬物レベルの初期傾向を示すが、約50分の時点から実験の終わりまで0.6〜0.7nMのレベルを保持し、このレ
ベルがすぐに減少しそうな徴候は見られない。B29- N^ε-ミリストイルヒトインスリンの薬物レベルは、100分の時点で、Humulin(登録商標) NPH、B29-N^ε-Arg^A ⁰ Gly^A2lArg^B31Arg^B32-ミリストイルヒトインスリン類似体、およびB29-N^ε-Gly^A ^2l Arg^B31Arg^B32-ミリストイルヒトインスリン類似体の薬物レベルの約18倍であり、アルブミンに結合したインスリンの影響が現れた。Radzuik, J. Diabetolog
ica 41:116 (1998)。このことから、この種が血清アルブミンに結合する能力を、B29- N^ε-ミリストイルヒトインスリンによって増強できることが分かる。ミリストイル化されたジ-アルギニンおよびトリ-アルギニン類似体のいずれにおい
ても、100分の時点から実験の終わりまで薬物レベルはHumulin(登録商標) NPHよ
りも著しく高かった。しかしながら、B29-N^εrg^A0Gly^A2lArg^B31Arg^B32-ミリスト
イルヒトインスリン類似体およびB29-N^ε-Gly^A2lArg^B31Arg^B32-ミリストイルヒトインスリン類似体の薬物レベルは、実験の開始時点から約600分の時点まで、B
29- N^ε-ミリストイルヒトインスリンの薬物レベルよりもかなり低かった。

【０１５１】グルコース注入速度 -- 図5は、正常な雌のブタにおいて、種々のインスリンに対して正常血糖を保持するためのグルコース注入速度を比較したグラフである
。使用した化合物は、Humulin(登録商標) NPH、B29- N^ε-ミリストイルヒトイン
スリン、B29-N^ε-Arg^A0Gly^A2lArg^B31Arg^B32-ミリストイルヒトインスリン類似体
、およびB29-N^ε-Gly^A2lArg^B31Arg^B32-ミリストイルヒトインスリン類似体であった。プロットされたデータから分かるように、等電点のシフトした脂肪酸アシ
ル化類似体は、正常な雌のブタにおいて、インスリン様活性を有する。いずれの
類似体も、Humulin(登録商標) NPHまたはB29- N^ε-ミリストイルヒトインスリン
(B29- N^ε-ミリストイルヒトインスリンが、時間延長効果が得られるように、血
清アルブミンに結合させるべくデザインされていることに注目されたい)と比較して平坦な活性プロフィルを呈した。B29-N^ε-Arg^A0Gly^A2lArg^B31Arg^B32-ミリス
トイルヒトインスリン類似体およびB29-N^ε-Gly^A2lArg^B31Arg^B32-ミリストイルヒトインスリン類似体のグルコース代謝回転速度のレベルは、2〜3mg/kg/分の範
囲であった。一方、Humulin(登録商標) NPHおよびB29- N^ε-ミリストイルヒトイ
ンスリンのグルコース代謝回転速度はそれぞれ、25および30mg/kg/分に明瞭なピ
ークを示し、実験全体にわたりかなり高い代謝回転速度に保たれる。このほか、
Humulin NPHは、実験全体にわたり、アシル化されたGly^A2lトリ-アルギニン種お
よびGly^A2lジ-アルギニン種よりも高い代謝回転速度を保持する。

【０１５２】基礎的インスリン製剤の目標は、時間が経つにつれて排出される肝臓グルコー
スだけを補うことである。肝臓グルコースの排出量は、典型的には、2〜3mg/kg/
分の範囲である。従って、Humulin(登録商標) NPHおよびB29- N^ε-ミリストイル
ヒトインスリンの代謝回転速度は、基底インスリンに望まれる代謝回転速度を超
える。その結果、Humulin(登録商標) NPHおよびB29- N^ε-ミリストイルヒトイン
スリンは、低血糖症の状態を引き起こす可能性がある。図5に示されているように、B29-N^ε-Arg^A0Gly^A2lArg^B31Arg^B32-ミリストイルヒトインスリン類似体およ
びB29-N^ε-Gly^A2lArg^B31Arg^B32-ミリストイルヒトインスリン類似体は、優れた基礎的インスリン製剤に望まれる代謝回転速度と一致する代謝回転速度を有する
。

【０１５３】いかなる時点においても、B29-N^ε-Arg^A0Gly^A2lArg^B31Arg^B32-ミリストイルヒ
トインスリン類似体およびB29-N^ε-Gly^A2lArg^B31Arg^B32-ミリストイルヒトインスリン類似体はいずれも、グルコース注入速度または血漿薬物レベルに関してピ
ークを示さない。これらの新規な種の代謝回転速度の方が遅いので、低血糖症の
発生率を低減しつつ、基礎的肝臓グルコース排出量を補うことができるものと期
待される。従って、ミリストイル化されたGly21-ジ-アルギニン種およびGly21- トリ-アルギニン種はHumulin(登録商標) NPHの場合よりも大きい治療指数を有す
ることが期待される。従って、ミリストイル化されたGly-ジおよびトリ-アルギニン種はHumulin NPHよりも大きな治療指数を有すると推定される。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、B29-N^ε-Arg^A0Gly^A21Arg^B31Arg^B32-ミリストイルヒトインスリン類似
体の溶解度をpHの関数として示したグラフである。

【図２】図２は、B29-N^ε-Arg^A0Gly^A21Arg^B31Arg^B32-ミリストイルヒトインスリン類似
体、Gly^A21Arg^B31Arg^B32ヒトインスリン類似体、およびArg^A0Gly^A21Arg^B31Arg^B3 ² ヒトインスリン類似体の溶解度をpHの関数として比較したグラフである。

【図３】図３は、正常なブタにおいて、Humulin（登録商標）NPH、B29-N^ε-ミリストイ
ルヒトインスリン、B29-N^ε-Arg^A0Gly^A21Arg^B31Arg^B32-ミリストイルヒトインス
リン類似体、およびB29-N^ε-Gly^A21Arg^B31Arg^B32-ミリストイルヒトインスリン類似体を含む種々のインスリンを6nmol/kg皮下投与した後の注入されたグルコー
スの累積量対時間を比較したグラフである。

【図４】図４は、正常なブタにおいて、Humulin（登録商標）NPH、B29-N^ε-ミリストイ
ルヒトインスリン、B29-N^ε-Arg^A0Gly^A21Arg^B31Arg^B32-ミリストイルヒトインス
リン類似体、およびB29-N^ε-Gly^A21Arg^B31Arg^B32-ミリストイルヒトインスリン類似体を６nmol/kg皮下投与した後の種々のインスリンの血漿レベルを比較したグラフである。

【図５】図５は、正常なブタにおいて、Humulin（登録商標）NPH、B29-N^ε-ミリストイ
ルヒトインスリン、B29-N^ε-Arg^A0Gly^A21Arg^B31Arg^B32-ミリストイルヒトインス
リン類似体、およびB29-N^ε-Gly^A21Arg^B31Arg^B32-ミリストイルヒトインスリン類似体を６nmol/kg皮下投与した後の、種々のインスリンについての正常血糖を維持するために注入するグルコースの速度を比較するグラフである。

【手続補正書】

【提出日】平成１２年４月２６日（２０００．４．２６）

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】特許請求の範囲

【補正方法】変更

【補正内容】

【特許請求の範囲】

【化１】（式中、 0位のXaaはArgであるか、または存在せず、そして 21位のXaaはCysおよびLysを除く任意の天然アミノ酸である）を有し、配列番号２のポリペプチドは配列：

【化２】（式中、 3位のXaaはCysおよびLysを除く任意の天然アミノ酸であり； 27位のXaaはThrであるか、または存在せず； 28位のXaaはPro、Leu、Val、Ala、LysおよびAspからなる群から選択され； 29位のXaaはProおよびLysからなる群から選択され； 30位のXaaは存在しないか、またはCysまたはLysを除く任意の天然アミノ酸であり；さらに28位または29位はLysであり、28位がLysの場合には29位はLysではない）を有するものであること；ならびに (b) 配列番号２の28位または29位のLysがアシル化されていること、を特徴とする、前記類似体。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ) ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷＦターム(参考） 4C084 AA02 AA07 CA53 CA59 DB34 NA14 ZC352 4H045 AA10 AA30 BA17 BA18 BA55 DA37 EA27 FA70 FA74 GA01 GA15 GA25 HA04

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】アミド結合により脂肪族アシル鎖が連結されたインスリン類
似体を含んでなる、インスリンの等電点よりも高い等電点を有する脂肪酸−アシ
ル化インスリン類似体。
【請求項２】請求項１に記載のインスリンの等電点よりも高い等電点を有
する脂肪酸−アシル化インスリン類似体であって、該アシル化インスリン類似体
がインスリンよりも少なくとも１大きい正の実効電荷を有することを特徴とする
、前記類似体。
【請求項３】請求項１に記載のインスリンの等電点よりも高い等電点を有
する脂肪酸−アシル化インスリン類似体であって、アシル化インスリン類似体が
インスリンよりも少なくとも２大きい正の実効電荷を有することを特徴とする、
前記類似体。
【請求項４】モノアシル化インスリン類似体であって、 (a) 配列番号２のポリペプチドに適正に架橋された配列番号１のポリペプチド
またはその薬学的に許容できる塩であって、配列番号１のポリペプチドは配列：【化１】（式中、 0位のXaaはArgであるか、または存在せず、そして 21位のXaaはCysおよびLysを除く任意の天然アミノ酸である）を有し、配列番号２のポリペプチドは配列：【化２】（式中、 3位のXaaはCysおよびLysを除く任意の天然アミノ酸であり； 27位のXaaはThrであるか、または存在せず； 28位のXaaはPro、Leu、Val、Ala、LysおよびAspからなる群から選択され； 29位のXaaはProおよびLysからなる群から選択され； 30位のXaaは存在しないか、またはCysまたはLysを除く任意の天然アミノ酸であり；さらに28位または29位はLysであり、28位がLysの場合には29位はLysではない）を有するものであること；ならびに (b) 配列番号２の28位または29位のLysがアシル化されていること、を特徴とする、前記類似体。
【請求項５】配列番号２のポリペプチドの30位のXaaがThrである、請求項
４に記載のモノアシル化インスリン類似体。
【請求項６】配列番号１のポリペプチドの21位のXaaがAsnである、請求項
４に記載のモノアシル化インスリン類似体。
【請求項７】配列番号２のポリペプチドの3位のXaaがAsnである、請求項４に記載のモノアシル化インスリン類似体。
【請求項８】配列番号１のポリペプチドの21位のXaaがAsnであり、配列番
号２のポリペプチドの3位のXaaがAsnである、請求項４に記載のモノアシル化インスリン類似体。
【請求項９】配列番号２のポリペプチドの28位のXaaがProであり、配列番
号２のポリペプチドの29位のXaaがLysである、請求項８に記載のモノアシル化イ
ンスリン類似体。
【請求項１０】配列番号２のポリペプチドの28位のXaaがLysであり、配列
番号２のポリペプチドの29位のXaaがProである、請求項８に記載のモノアシル化
インスリン類似体。
【請求項１１】配列番号１のポリペプチドの21位のXaaがGlyであり、配列
番号２のポリペプチドの3位のXaaがGlnである、請求項４のモノアシル化インスリン類似体。
【請求項１２】配列番号１のポリペプチドの21位のXaaがGlyであり、配列
番号２のポリペプチドの3位のXaaがAspである、請求項４に記載のモノアシル化インスリン類似体。
【請求項１３】配列番号１のポリペプチドの0位のXaaがArgである、請求項４に記載のモノアシル化インスリン類似体。
【請求項１４】配列番号１のポリペプチドの21位のXaaがGly、Asn、Alaお
よびGlnからなる群から選択される、請求項１３に記載のモノアシル化インスリン類似体。
【請求項１５】配列番号１のポリペプチドの21位のXaaがGlyである、請求
項１３に記載のモノアシル化インスリン類似体。
【請求項１６】配列番号１のポリペプチドの21位のXaaがAsnである、請求
項１３に記載のモノアシル化インスリン類似体。
【請求項１７】配列番号１のポリペプチドの21位のXaaがGlyであり、配列
番号２の3位のXaaがAsnであり、配列番号２の27位のXaaがThrであり、配列番号２の28位のXaaがProであり、配列番号２の29位のXaaがLysである、請求項１３に
記載のモノアシル化インスリン類似体。
【請求項１８】配列番号１のポリペプチドの21位のXaaがGlyであり、配列
番号２の3位のXaaがGlnであり、配列番号２の27位のXaaがThrであり、配列番号２の28位のXaaがProであり、配列番号２の29位のXaaがLysである、請求項１３に
記載のモノアシル化インスリン類似体。
【請求項１９】配列番号１のポリペプチドの21位のXaaがGlyであり、配列
番号２の3位のXaaがAspであり、配列番号２の27位のXaaがThrであり、配列番号２の28位のXaaがProであり、配列番号２の29位のXaaがLysである、請求項１３に
記載のモノアシル化インスリン類似体。
【請求項２０】配列番号１のポリペプチドの21位のXaaがAsnであり、配列
番号２の3位のXaaがAsnであり、配列番号２の27位のXaaがThrであり、配列番号２の28位のXaaがProであり、配列番号２の29位のXaaがLysである、請求項１３に
記載のモノアシル化インスリン類似体。
【請求項２１】配列番号１のポリペプチドの21位のXaaがGlyであり、配列
番号２の3位のXaaがAsnであり、配列番号２の27位のXaaがThrであり、配列番号２の28位のXaaがLysであり、配列番号２の29位のXaaがProである、請求項１３に
記載のモノアシル化インスリン類似体。
【請求項２２】配列番号１のポリペプチドの21位のXaaがGlyであり、配列
番号２の3位のXaaがGlnであり、配列番号２の27位のXaaがThrであり、配列番号２の28位のXaaがLysであり、配列番号２の29位のXaaがProである、請求項１３に
記載のモノアシル化インスリン類似体。
【請求項２３】配列番号１のポリペプチドの21位のXaaがGlyであり、配列
番号２の3位のXaaがAspであり、配列番号２の27位のXaaがThrであり、配列番号２の28位のXaaがLysであり、配列番号２の29位のXaaがProである、請求項１３に
記載のモノアシル化インスリン類似体。
【請求項２４】配列番号１のポリペプチドの21位のXaaがAsnであり、配列
番号２の3位のXaaがAsnであり、配列番号２の27位のXaaがThrであり、配列番号２の28位のXaaがLysであり、配列番号２の29位のXaaがProである、請求項１３に
記載のモノアシル化インスリン類似体。
【請求項２５】配列番号１のポリペプチドの0位のXaaが存在しない、請求
項４に記載のモノアシル化インスリン類似体。
【請求項２６】配列番号１のポリペプチドの21位のXaaがGly、Asn、Alaお
よびGlnからなる群から選択される、請求項２５に記載のモノアシル化インスリン類似体。
【請求項２７】配列番号１のポリペプチドの21位のXaaがGlyである、請求
項２５に記載のモノアシル化インスリン類似体。
【請求項２８】配列番号１のポリペプチドの21位のXaaがAsnである、請求
項２５に記載のモノアシル化インスリン類似体。
【請求項２９】配列番号１のポリペプチドの21位のXaaがGlyであり、配列
番号２の3位のXaaがAsnであり、配列番号２の27位のXaaがThrであり、配列番号２の28位のXaaがProであり、配列番号２の29位のXaaがLysである、請求項２５に
記載のモノアシル化インスリン類似体。
【請求項３０】配列番号１のポリペプチドの21位のXaaがGlyであり、配列
番号２の3位のXaaがGlnであり、配列番号２の27位のXaaがThrであり、配列番号２の28位のXaaがProであり、配列番号２の29位のXaaがLysである、請求項２５に
記載のモノアシル化インスリン類似体。
【請求項３１】配列番号１のポリペプチドの21位のXaaがAsnであり、配列
番号２の3位のXaaがAsnであり、配列番号２の27位のXaaがThrであり、配列番号２の28位のXaaがProであり、配列番号２の29位のXaaがLysである、請求項２５に
記載のモノアシル化インスリン類似体。
【請求項３２】配列番号１のポリペプチドの21位のXaaがGlyであり、配列
番号２の3位のXaaがAsnであり、配列番号２の27位のXaaがThrであり、配列番号２の28位のXaaがLysであり、配列番号２の29位のXaaがProである、請求項２５に
記載のモノアシル化インスリン類似体。
【請求項３３】配列番号１のポリペプチドの21位のXaaがGlyであり、配列
番号２の3位のXaaがGlnであり、配列番号２の27位のXaaがThrであり、配列番号２の28位のXaaがLysであり、配列番号２の29位のXaaがProである、請求項２５に
記載のモノアシル化インスリン類似体。
【請求項３４】配列番号１のポリペプチドの21位のXaaがAsnであり、配列
番号２の3位のXaaがAsnであり、配列番号２の27位のXaaがThrであり、配列番号２の28位のXaaがLysであり、配列番号２の29位のXaaがProである、請求項２５に
記載のモノアシル化インスリン類似体。
【請求項３５】配列番号２のポリペプチドの28位または29位のLysがC₄〜C ₂₁ 脂肪酸でアシル化されている、請求項４に記載のモノアシル化インスリン類似
体。
【請求項３６】配列番号２のポリペプチドの28位または29位のLysがC₁₀〜
C₁₈脂肪酸でアシル化されている、請求項４に記載のモノアシル化インスリン類似体。
【請求項３７】配列番号２のポリペプチドの28位または29位のLysがパルミチン酸およびミリスチン酸からなる群から選択される脂肪酸でアシル化されて
いる、請求項４に記載のモノアシル化インスリン類似体。
【請求項３８】配列番号２のポリペプチドの28位または29位のLysがC₄〜C ₈ 脂肪酸でアシル化されている、請求項４に記載のモノアシル化インスリン類似体。
【請求項３９】配列番号２のポリペプチドの28位または29位のLysがオクタン酸およびヘキサン酸からなる群から選択される脂肪酸でアシル化されている
、請求項４に記載のモノアシル化インスリン類似体。
【請求項４０】 B29-N^ε-Gly^A21Arg^B31Arg^B32-ミリストイルヒトインスリン類似体。
【請求項４１】 B29-N^ε-Gly^A21Gln^B3Arg^B31Arg^B32-ミリストイルヒトイン
スリン類似体。
【請求項４２】 B29-N^ε-Arg^A0Gly^A21Arg^B31Arg^B32-ミリストイルヒトイン
スリン類似体。
【請求項４３】 B29-N^ε-Arg^A0Gly^A21Gln^B3Arg^B31Arg^B32-ミリストイルヒトインスリン類似体。
【請求項４４】 B29-N^ε-Arg^A0Gly^A21Asp^B3Arg^B31Arg^B32-ミリストイルヒトインスリン類似体。
【請求項４５】 B29-N^ε-Arg^B31Arg^B32-ミリストイルヒトインスリン類似体。
【請求項４６】 B29-N^ε-Arg^A0Arg^B31Arg^B32-ミリストイルヒトインスリン
類似体。
【請求項４７】 B29-N^ε-Gly^A21Arg^B31Arg^B32-オクタノイルヒトインスリン類似体。
【請求項４８】 B29-N^ε-Gly^A21Gln^B3Arg^B31Arg^B32-オクタノイルヒトイン
スリン類似体。
【請求項４９】 B29-N^ε-Arg^A0Gly^A21Arg^B31Arg^B32-オクタノイルヒトイン
スリン類似体。
【請求項５０】 B29-N^ε-Arg^A0Gly^A21Gln^B3Arg^B31Arg^B32-オクタノイルヒトインスリン類似体。
【請求項５１】 B29-N^ε-Arg^A0Gly^A21Asp^B3Arg^B31Arg^B32-オクタノイルヒトインスリン類似体。
【請求項５２】 B29-N^ε-Arg^B31Arg^B32-オクタノイルヒトインスリン類似体。
【請求項５３】 B29-N^ε-Arg^A0Arg^B31Arg^B32-オクタノイルヒトインスリン
類似体。
【請求項５４】 B28-N^ε-Gly^A21Lys^B28Pro^B29Arg^B31Arg^B32-ミリストイルヒトインスリン類似体。
【請求項５５】 B28-N^ε-Gly^A21Gln^B3Lys^B28Pro^B29Arg^B31Arg^B32-ミリスト
イルヒトインスリン類似体。
【請求項５６】 B28-N^ε-Arg^A0Gly^A21Lys^B28Pro^B29Arg^B31Arg^B32-ミリスト
イルヒトインスリン類似体。
【請求項５７】 B28-N^ε-Arg^A0Gly^A21Gln^B3Lys^B28Pro^B29Arg^B31Arg^B32-ミリストイルヒトインスリン類似体。
【請求項５８】 B28-N^ε-Arg^A0Gly^A21Asp^B3Lys^B28Pro^B29Arg^B31Arg^B32-ミリストイルヒトインスリン類似体。
【請求項５９】 B28-N^ε-Lys^B28Pro^B29Arg^B31Arg^B32-ミリストイルヒトインスリン類似体。
【請求項６０】 B28-N^ε-Arg^A0Lys^B28Pro^B29Arg^B31Arg^B32-ミリストイルヒ
トインスリン類似体。
【請求項６１】 B28-N^ε-Gly^A21Lys^B28Pro^B29Arg^B31Arg^B32-オクタノイルヒトインスリン類似体。
【請求項６２】 B28-N^ε-Gly^A21Gln^B3Lys^B28Pro^B29Arg^B31Arg^B32-オクタノ
イルヒトインスリン類似体。
【請求項６３】 B28-N^ε-Arg^A0Gly^A21Lys^B28Pro^B29Arg^B31Arg^B32-オクタノ
イルヒトインスリン類似体。
【請求項６４】 B28-N^ε-Arg^A0Gly^A21Gln^B3Lys^B28Pro^B29Arg^B31Arg^B32-オクタノイルヒトインスリン類似体。
【請求項６５】 B28-N^ε-Arg^A0Gly^A21Asp^B3Lys^B28Pro^B29Arg^B31Arg^B32-オクタノイルヒトインスリン類似体。
【請求項６６】 B28-N^ε-Lys^B28Pro^B29Arg^B31Arg^B32-オクタノイルヒトインスリン類似体。
【請求項６７】 B28-N^ε-Arg^A0Lys^B28Pro^B29Arg^B31Arg^B32-オクタノイルヒ
トインスリン類似体。
【請求項６８】請求項４に記載のモノアシル化インスリン類似体、および
保存剤を含む製剤。
【請求項６９】保存剤がm-クレゾールおよびフェノールからなる群から選
択される、請求項６８に記載の製剤。
【請求項７０】等張剤をさらに含む、請求項６８に記載の製剤。
【請求項７１】製薬上許容されるバッファーをさらに含む、請求項６８に
記載の製剤。
【請求項７２】 +2の酸化状態にある金属をさらに含む、請求項６８に記載
の製剤。
【請求項７３】金属がコバルトおよび亜鉛からなる群から選択される、請
求項７２に記載の製剤。
【請求項７４】金属が亜鉛である、請求項７２に記載の製剤。
【請求項７５】製剤が約pH3.0〜約pH3.8のpHである、請求項６８に記載の
製剤。
【請求項７６】製剤が約3.5のpHである、請求項６８に記載の製剤。
【請求項７７】製剤が約4.5〜約7.6のpHである、請求項６８に記載の製剤
。
【請求項７８】製剤が約5.0〜約7.0のpHである、請求項６８に記載の製剤
。
【請求項７９】製剤が約6.5のpHである、請求項６８に記載の製剤。
【請求項８０】糖尿病の治療が必要な患者に有効用量の請求項４に記載の
インスリン類似体を投与することを含む、糖尿病を治療する方法。
【請求項８１】糖尿病の治療が必要な患者に有効用量の請求項７５に記載
の製剤を投与することを含む、糖尿病の治療方法。
【請求項８２】糖尿病の治療が必要な患者に有効用量の請求項７６に記載
の製剤を投与することを含む、糖尿病の治療方法。
【請求項８３】糖尿病の治療が必要な患者に有効用量の請求項７７に記載
の製剤を投与することを含む、糖尿病の治療方法。
【請求項８４】糖尿病の治療が必要な患者に有効用量の請求項７８に記載
の製剤を投与することを含む、糖尿病の治療方法。
【請求項８５】糖尿病の治療が必要な患者に有効用量の請求項７９に記載
の製剤を投与することを含む、糖尿病の治療方法。