KR20150110677A - N 말단 절단된 인슐린 유사체 - Google Patents
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Abstract
인슐린 유사체는 B1-B3 잔기가 없고, B 체인의 C말단 B23-B30 구간 내에서 추가적인 치환을 선택적으로 포함하는 단축된 인슐린 B 체인 폴리펩티드를 포함한다. B1-B3 잔기가 없는 인슐린 유사체는 B28 및/또는 빠른 활동을 부여하는 B29에서의 치환 또는 선택적으로 B24에서의 비표준 치환을 포함할 수 있다. 유사체는 인간 인슐린 등의 포유류 인슐린의 유사체일 수 있다. 이러한 인슐린 유사체를 인코딩하는 핵산도 제공된다. 환자의 치료 방법은 환자에게 생리학적으로 효과적인 양의 인슐린 유사체 또는 생리학적으로 받아들여지는 이의 소금을 투약하는 것을 포함한다. 비표준 아미노산 치환에 의한 내생 트립신 사이트의 변성을 통해 비보호 옥타펩티드를 사용하는 반합성 방법을 제공한다.
Description
연방으로부터 후원을 받은 연구 또는 개발에 관한 진술
본 발명은 미국 국립 보건원으로부터 받은 부여번호 DK040949 및 DK074176의 협력 계약서상의 정부 지원에 의해 만들어졌다. 미국 정부가 본 발명에 대해 특정 권리를 가질 수 있다.
본 발명은 상온 이상에서 열적 피브릴화에 더 빠른 약동학 및/또는 증가된 저항성과 같은 향상된 약제상 특성을 보여주는 폴리펩티드 호르몬 유사체에 관한 것이다. 더욱 상세하게는, 본 발명은 잔기 (B1-B3)의 삭제와 A 또는 B체인의 다른 변성과 함께 변성되는 인슐린 유사체에 관한 것이다. 이러한 비표준 시퀀스는 인슐린 유사체의 A 또는 B체인 내의 다른 사이트에 표준 아미노산 치환을 선택적으로 포함할 수 있다.
치료제 및 백신을 포함하는 절단된 및/또는 비표준 단백질의 조작은 광범위한 약학적 및 사회적 혜택을 제공할 수 있다. 약학적 혜택의 예로 단백질의 약동학적 특성의 최적화를 들 수 있다. 추가적인 사회적 혜택의 예로 전기 및 냉장이 지속적으로 제공되지 않는 개발도상국의 지역에서 사용될 수 있도록 상온 이상에서의 열화에 대해 표준 단백질들보다 더 내화성을 갖는 단백질들의 설계를 들 수 있다. 치료용 단백질의 예로 인슐린이 제공된다. 비표준 아미노산 치환을 포함하는 인슐린의 유사체는 약동학 또는 열화에 대한 저항성에 대해 우수한 특성을 원천적으로 보여준다. 피하 주사 후의 인슐린 흡수의 약동학에 의한 어려움은 엄격한 혈당 조절을 얻기 위한 환자들의 능력에 영향을 미치고 인슐린 펌프의 안전과 성능을 제약한다. 이의 물리적 열화로 인한 어려움은 아프리카와 아시아에서 계속되는 진성 당뇨병의 발병에 의해 더 어려워지고 있다. 피하 주사 이후의 흡수를 가속화하기 위한 당해 기술 분야에서 알려진 변성이 화학적 및/또는 물리적 열화에 대한 인슐린의 저항성을 보통 저감시키기 때문에 이러한 이슈들이 보통 결합된다. 피브릴화가 상온보다 높은 온도에서의 열화에 대한 주요 경로이기 때문에, 피브릴화 저항 제형들의 설계는 이와 같은 어려운 지역들에서 인슐린 대체 치료의 안정성과 약효를 향상시킬 수 있다. 본 발명은 인슐린의 고유 특성을 변성하고 향상시키기 위해 B1-B3 잔기가 부족한 절단된 B체인과 A체인 또는 B체인에서 다른 곳의 표준 또는 비표준 치환과의 결합의 사용에 관한 것이다. 지난 10년간 관심영역의 적용이 용이하도록 단백질의 하나 또는 다른 특정 특성을 선택적으로 변성하는 인슐린 분자에 대한 특정 화학적 변성에 대해 설명되었다. 재조합 DNA 시대(1980)의 초기에는 야생형 인간 인슐린이 다양한 치료에 사용되기에 최적이라고 예상되었지만, 지난 10년 동안 인슐린 유사체의 광범위한 임상적 사용은 각각 특정 잠재 니즈에 부응하도록 맞춘 유사체의 모임이 상당한 의학적 및 사회적 혜택을 제공할 수 있다는 것을 제시하고 있다.
인슐린의 처방은 오랫동안 진성 당뇨병의 치료로 자리 잡고 있다. 인슐린은 척추동물에서 신진대사에 중추적인 역할을 하는 작은 구상 단백질이다. 인슐린은 21개의 잔기들을 포함하는 A 체인 그리고 30개의 잔기들을 포함하는 B체인 등 2개의 체인들을 포함한다. 호르몬은 Zn2+ 안정된 헥사머로 췌장의 β세포로 저장되지만 혈관에서는 Zn2+ 자유 모노머로 기능 한다. 인슐린은 연결 영역(35개의 잔기들)이 B 체인의 C 터미널 잔기(B30 잔기)를 A 체인의 N 터미널 잔기로 링크시키는 단일 체인 전구체인 프로인슐린의 결과물이다(도 1A). 다양한 증거들이 이것이 인슐린 유사 코어 및 무질서 연결 펩티드를 포함하는 것을 나타내고 있다(도 1B). 세 개의 특정 이황화 브리지들(A6-A11, A7-B7, 및 A20-B19; 도 1A 및 1B)의 형성은 조면 소포체 (ER)에서의 프로인슐린의 산화적 접힘과 연관된다고 생각되어 지고 있다. 프로인슐린은 ER에서 골지 장치로 이출되고 얼마 안되어 액상 Zn2+ 배위 핵사머를 형성하기 위해 어셈블된다. 인슐린으로의 단백질 분해 소화 및 전환은 미숙 분비과립들과 뒤따르는 형태학적 응축에서 일어난다. 성숙 저장과립들 안의 아연 인슐린 헥사머들의 결정질 어레이들은 전자현미기술(EM)에 의해 시각화 되어졌다. 인슐린의 시퀀스를 도 1C에서 개략적으로 보여주고 있다. 개별 잔기들은 아미노산의 식별(보통 표준의 3개의 문자 코드를 사용), 체인 및 시퀀스 포지션(보통 위첨자로)로 지정된다.
피하 주사 이후의 인슐린 흡수의 약동학적 특징은 인슐린 헥사머의 분해율과 상관이 있다고 발견되었다. 본 발명이 이론에 제한되지 않아야 하지만, 인슐린 헥사머의 촉진된 분해로 이어지는 인슐린 분자로의 변성은 혈관으로의 피하 저장으로부터 인슐린 모노머 및 다이머의 급속한 흡수를 촉진하다고 생각되어지고 있다. 진성 당뇨병을 갖는 환자들에서의 기존 인슐린 대체 치료의 주요 목표는 혈당 농도를 엄격하게 조절하여 건강한 인체의 정상 범위 특성 위로 또는 아래로 이탈되는 것을 방지하는 것이다. 정상 범위 아래로의 이탈은 심할 경우에 경련, 혼수 상태 및 사망에 이르게 하는 즉각적인 아드레날린 작용 또는 신경 포도당 결핍에 의한 증상과 연관된다. 정상 범위 위로의 이탈은 망막증, 맹목, 및 신장 부전증을 포함하는 미세혈관 질환에 대해 증가하는 장기 리스크와 연관된다. 피하 주사 이후의 야생형 인간 인슐린 흡수의 약동학은 보통 식후 신진대사의 항상성의 생리학 요구조건에 비해 너무 느리거나 너무 오래 지속되고, 시작 시점에서는 더 급속하고 덜 지속되는 약역학적 효과를 갖고 더욱 빠른 흡수를 보여주는 인슐린 유사체를 개발하기 위해 지난 20년간 많은 노력을 기울였다. 당해 기술 분야에서 알려진 와 같은 빠른 행동 인슐린 유사체에는 [LysB28,ProB29]인슐린(KP인슐린, 휴마로그(Humalog®)의 활성 구성소자), [AspB28]인슐린(노바로그(Novalog®), 및 [LysB3,GluB29]인슐린(아피드라((Apidra®)) 등이 있다. 비록 임상 실무에서 널리 사용되고 있지만, 이들 유사체는 두 개의 원천적 한계가 있다. 먼저, 비록 이들의 약동학적 및 약역학적 형재가 야생형 인슐린에 비해 더 빠르지만, 많은 환자에서 혈당조절을 최적화하거나 알고리즘 기반 인슐린 펌프 (폐루프 시스템)의 안전하고 효과적인 사용이 가능하도록 충분히 빠르지 않다. 두 번째, 이들 유사체에 있는 아미노산 치환은 인슐린의 약역학적 안정성을 손상시키고, 상온 이상에서의 피브릴화에 대한 민감성을 악화시킨다. 그러므로, 이들 제품에서의 안전성, 약효, 및 실제 편의성이 촉진된 흡수 및 촉진된 열화간 상호 절충에 의해 제한되었었다.
진성 당뇨병의 치료를 위한 인슐린 및 인슐린 유사체의 제조, 저장 및 사용에서의 심각한 문제인 피브릴화는 더 높은 온도, 더 낮은 pH, 애지테이션, 또는 우레아, 구아니딘, 에탄올 조용매 또는 소수성 표면들의 존재에 의해 더 증가한다. 현재의 미국 제약 규정은 피브릴화가 1퍼센트 이상의 레벨에서 일어나면 인슐린을 폐기하도록 요구하고 있다. 피브릴화가 더 높은 온도에서 증가하기 때문에 진성 당뇨병을 가진 환자들은 인슐린을 사용하기 전에 냉장하여야 한다. 인슐린 또는 인슐린 유사체의 피브릴화는 작은 양의 인슐린 또는 인슐린 유사체가 환자의 몸에 일반적인 간격으로 주입되는 외부 인슐린 펌프를 활용하는 환자들에게 특히 문제가 될 수 있다. 이와 같은 사용에서는, 인슐린과 인슐린 유사체는 펌프 장치에서 냉장되지 않고 보관되며, 인슐린의 피브릴화는 결과적으로 몸에 인슐린 또는 인슐린 유사체를 주입하는데 사용되는 카테터를 차단하여 예측할 수 없는 혈당 레벨 변동 또는 위험한 과혈당증도 유발할 수 있다. 적어도 하나의 최근 리포트에서 리스프로 인슐린(KP-인슐린, B28 및 B29 잔기가 야생형 인간 인슐린에서의 이들의 포지션에 대해 치환된 유사체; 상호 휴마로그)이 피브릴화 및 이의 결과로 일어나는 인슐린 카데터의 방해에 특히 민감할 수 있다는 것을 지적하였다. 인슐린은 25°C 보다 높은 온도에서 10°C 증가할 때 열화율은 10배 또는 그 이상 증가하기 때문에, 지침들에서는 30°C 미만의 온도에서 저장하거나 바람직게는 냉장하도록 하고 있다.
단백질 피브릴화의 현재 이론에서는 피브릴화의 메커니즘은 부분적으로 접힌 중간 상태를 통해 진행되고, 이후에 아밀로이드 핵을 형성하도록 합쳐진다고 받아들여지고 있다. 이 이론에서는, 고유의 상태를 안정화시키는 아미노산 대체물들이 부분적으로 접힌 중간 상태를 안정화하거나 안정화하지 않고 고유 상태 및 중간 상태 사이의 자유에너지 장벽을 증가(또는 감소)시키거나 증가(또는 감소)시키지 않을 가능성이 있다. 따라서, 현재 이론은 인슐린 분자에서의 주어진 아미노산 대체물의 피브릴화의 위험을 증가 또는 감소시키는 성향은 예측하기 어렵다고 지적하고 있다.
아밀로이드 핵 형성의 초기 단계는 자연적 인슐린의 표면에서 노출되거나 부분적인 단백질 중첩 풀림으로 인해 일시적으로 노출된 무극성 측쇄간 비자연적인 소수성 상호작용을 수반할 수 있다. B1, B2, 및 B3 잔기(PheB1-ValB2-AsnB3)는 야생형 인슐린의 결정구조에서 상당한 노출 및 이들의 포지셔닝에서 상당한 변동성을 보여준다(도2A). B1-B3 잔기는 1H-NMR공명선폭, 13C-NMR 화학적 이동,장기 잔기간 핵오버하우저효과(NOEs)(도2B)의 결핍에서 지적된 바와 같이 용액내 조작된 인슐린 모노머의 NMR연구에서 질서가 덜 잡혀 있다. 포유류 인슐린 시퀀스 중에 이들 잔기가 보존되지만, 합성 유사체의 연구는 인슐린 수용기와의 결합의 상당한 손실이나 생물학적 활동의 상당한 손실 없이 B 체인에서 B1-B5 잔기가 제거될 수 있다는 것을 보여주고 있다. 그럼에도 불구하고, 야생형 및 돌연변이 프로인슐린의 폴딩 및 분비에 대한 연구는 B1-B5 잔기가, 독립적이거나 조합으로, 소포체에서 이황화 페어링의 효율과 충실도에 기여한다는 것을 보여주었다(Liu, M., Hua, Q.X., Hu, S.Q., Jia, W., Yang, Y., Saith, S.E., Whittaker, J., Arvan, P. & Weiss, M.A. (2010)).단백질 시퀀스의 숨겨진 정보 내용의 해독: 프로인슐린의 폴딩 능력은 성숙한 호르몬에서 불필요한 유연한 암(arm)에 달려 있다. J. Biol. Chem. 285, 30989-31001). 특히, B1 포지션에서의 다양한 극성 또는 하전 아미노산 치환은 배양에서의 인간 세포계에서의 프로인슐린의 세포 폴딩 및 분비를 손상시킨다고 발견되었다. 따라서, PheB1 잔기는 폴딩 프로세스에서“소수성앵커”로 여길 수 있다. B체인의 B1-B5암은 췌장 베타세포 안에서의 주요 폴딩요소를 나타낸다.
따라서, 상온 이상에서 피브릴화에 대한 증가된 저항성을 보이면서 빠른 헥사머 분해를 보유하고, 대응되는 야생형 인슐린의 활동 중 적어도 일부분을 보여주고, 자신의 화학적 및/또는 물리적 안정성 중 적어도 일부분을 유지하는 인슐린 유사체에 대한 필요성이 있다.
따라서, 본 발명의 일 측면은 상온 이상에서의 피브릴화에 대해 증가된 저항성을 제공하면서 빠른 헥사머 분해를 보유하여 피하 주사 이후에 촉진된 흡수력을 갖는 인슐린 유사체를 제공한다. 본 발명은 빠른 작용 인슐린 유사체의 기존 제한들, 즉, 이들이 야생형 인슐린보다 피브릴화에 더 민감하다는 것을 해결한다. 청구된 발명은 제조 과정에서 이황화 페어링 및 단백질 폴딩이 이루어지면 B1-B3 잔기가 불필요하다는 것을 이용한다. B1-B3 잔기의 제거는 야생형 잔기인 AsnB3 대신 B3포지션에 Lys 또 는Arg 포함하는 전구체에서의 트립신의 활동을 통해 이루어진다. 이와 같은 전구체의 예로는 아피드라(Sanofi-Aventis) 제품의 유효 성분인 유사체 인슐린 글루리신을 들 수 있다. 따라서, PheB1-ValB2-AsnB3 잔기가 없는 유사체는 단축된 B 체인(27개의 잔기)를 포함한다. 단축된 B체인은 상온 이상에서 피브릴화에 대한 저항성을 부여하면서 인슐린 수용기에 원형 결합을 가능하게 한다.
본 발명의 본질은 B1-B3 잔기의 N 말단 제거에 의한 B체인의 단축은 상온 이상에서의 피브릴화로부터 단백질을 보호하고, 새로운 트립신 사이트를 소개하기 위한 B3 포지션에 PheB1, ValB2, 및 Lys 또는 Arg 중 하나를 포함하는 전구체 폴리펩티드의 효율적 폴딩 및 이황화 페어링 이후에 이루어질 수 있다는 것이다. 트립신 제품인 des-[B1-B3]-des-B23-B30]인슐린 유사체는, 결과적으로, C 말단 B23-B30 구간에서 하나 이상의 치환 또는 비표준 변성을 포함하는 인슐린 유사체의 트립신 처리 반합성을 위한 전구체를 제공하고; 임계적으로, 트립신 처리 반합성은 B23-B30 잔기의 C 말단 제거를 "수리"하지만 B1-B3 구간을 복원하지는 못한다. 이 단계의 순서(즉, 트립신 소화 전에 폴딩)는 이황화 페어링 전에 B1-B3 잔기의 제거로 소개되는 폴딩 결함을 우회하게 한다. 시작물질은 B3 포지션에 Lys 또는 Arg를 포함하는 인슐린 유사체, B3 포지션에 Lys 또는 Arg를 포함하고 A8에 추가적인 치환을 포함하는 인슐린 유사체, B3 포지션에 Lys 또는 Arg를 포함하는 프로인슐린 유사체, B3 포지션에 Lys 또는 Arg를 포함하고 A8에 추가적인 치환을 포함하는 프로인슐린 유사체, 또는 B3 포지션에 Lys 또는 Arg를 포함하고 폴딩후 트립신 소화는 des-[B1-B3]인슐린 유사체를 제공하기 위한 반합성을 할 수 있는 des-[B1-B3]-des-B23-B30]인슐린 유사체를 만들어 내는 대응되는 단일 체인 생합성 전구체가 될 수 있다.
일반적으로, 본 발명은 B1-B3 잔기가 없고 A 또는 B체인에 하나 이상의 추가적인 치환을 갖는 단축된 B체인 폴리펩티드를 포함하는 인슐린 유사체를 제공한다. 별도의 언급이 없는 한, 아미노산의 포지션은 야생형 인슐린에 대응하는 포지션인 것을 이해하여야 할 것이다. 따라서, 예를 들면, des-[B1-B3] 인슐린 유사체에서는, B체인의 일곱 번째 아미노산은 계속 B10 포지션에 있다고 표시된다. 일 예로, 단축된 B체인 폴리펩티드는 B29 포지션에서 오르니틴(Orn), 노르로이신(Nle), 또는 글루탐산(Glu)을 포함한다. 다른 실시예에서, 단축된 B체인 폴리펩티드는 B28 포지션에서 리신(Lys)을 포함하고 B29 포지션에서 프롤린(Pro)를 포함한다. 다른 실시예에서, 단축된 B체인 폴리펩티드는 B28 포지션에서 아스파르트산(Asp)을 포함하고 B29 포지션에서 Nle 또는 Orn을 포함한다. 또 다른 실시예에서, 인슐린 유사체는 인간 인슐린의 유사체 등의 포유류 인슐린 유사체이다. 특정 집합의 실시예에서는, B체인 폴리펩티드는 트립신 치료 전에 SEQ ID NO: 4의 아미노산 시퀀스 및 세개 이하의 이의 추가적인 아미노산 치환을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 다른 특정 집합의 실시예에서는, 소화 및 트립신과의 반합성 후에, 결과적으로 얻는 폴리펩티드는 SEQ ID NOS: 5-7를 포함하는 그룹에서 선택되는 시퀀스를 포함할 수 있다. 또 다른 특정 집합의 실시예에서는, 싱글 체인 인슐린 유사체로 지정된, B체인 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 9에서 제공되는 아미노산 시퀀스 및 3개 이하의 아미노산 치환을 갖는 폴리펩티드를 포함하는 길이 51-86의 단일 확장된 폴리펩티드의 일부분이다.
또한 또는 선택적으로, 인슐린 유사체는 B체인의 24 포지션에서 비표준 아미노산 치환을 포함할 수 있다. 특정 예에서, B24에서의 비표준 아미노산은 시클로헥사닐알라닌(Cha)이다. 다른 특정 예에서, B24에서의 비표준 아미노산은 penta-플루오르-Phe, 2-F-Phe, 2-Cl-Phe, 2-Br-Phe, 4-F-Phe, 4-Cl-Phe, 또는 4-Br-Phe 등의 할로겐화 방향족환을 포함하고, 여기서 "2"는 Phe의 방향족환의 오르토 포지션에서의 단일 할로겐화 치환을 나타내고, "4"는 Phe의 방향족환의 파라포지션을 나타낸다. 또한 또는 선택적으로, 인슐린 유사체는 A8 포지션에서 아미노산 치환을 포함하되, 야생형 인슐린(ThrA8)에서의 β브랜칭된 측쇄는 Arg, Gln, Glu, His, 또는 Lys 등의 비β브랜칭된 극성의 또는 하전된 측쇄로 치환된다. B24 또는 B29 또는 이들 모두의 포지션에서 비표준 아미노산을 포함하는 B체인 폴리펩티드를 포함하는 인슐린 유사체를 인코딩하는 핵산도 제공한다. 일 예로, 비표준 아미노산은 TAG 핵산 시퀀스 등의 정지 코돈으로 인코딩된다. 발현 벡터는 이와 같은 핵산을 포함할 수 있고 숙주 세포는 이와 같은 발현 벡터를 포함 할 수 있다.
A3 포지션에서 리신(Lys) 또는 아르기닌(Arg) 치환을 포함하는 A체인 폴리펩티드, 및, 선택적으로, B29 포지션에서 글루타민 치환을 일으키는 다른 치환 또는 A8 포지션에서의 Thr과 다른 아미노산을 포함하는 인슐린 유사체를 인코딩는 핵산도 제공한다. 발현 벡터는 이와 같은 핵산을 포함할 수 있고 숙주 세포는 이와 같은 발현 벡터를 포함 할 수 있다.
본 발명은 환자를 치료하는 방법도 제공한다. 이 방법은 생리학적으로 효과적인 양의 인슐린 유사체 또는 인슐린 유사체의 생리학적으로 허용되는 소금을 투여하되, 인슐린 유사체 또는 인슐린 유사체의 생리학적으로 허용되는 소금은 B1-B3 잔기가 없는 단축된 B체인 폴리펩티드와 상기와 같이 B24, B28, B29, 또는 A8 사이트에서 하나 이상의 추가적인 치환을 함께 포함한다. 일 실시예에서, 환자에게 투여한 인슐린 유사체의 단축된 B체인은 B29 포지션에서 Glu를 포함한다. 또 다른 실시예에서, 인슐린 유사체는 인간 인슐린의 유사체 등의 포유류 인슐린 유사체이다. 특정 집합의 실시예들에서, B체인 폴리펩티드는 SEQ ID NOS: 5-7을 포함하는 그룹에서 선택된 아미노산 시퀀스 및 세개 이하의 추가적인 아미노산 치환을 갖는 폴리펩티드를 포함한다.
도 1A는 A 및 B 체인을 포함하는 인간 프로인슐린(SEQ ID NO: 1)의 시퀀스를 보여주는 개략도로 플랭킹 이염기 분할 사이트들(채워진 원들) 및 C-펩티드(빈 원들)로 연결 영역을 나타낸다.
도 1B는 프로인슐린의 구조적 모델로 인슐린 유사 반족 및 무질서 연결 펩티드 (파선)을 포함한다.
도 1C는 B-체인에서의 B24 잔기의 포지션를 지정하는 인간 인슐린(SEQ ID NOS: 2 및 3)의 시퀀스를 보여주는 개략도이다.
도 2A 및 도 2B는 인슐린 B 체인의 N 말단암의 잠재적인 배좌 변동성을 보여주는 분자 모델들이다. B1-B6 잔기는 결정학적 T-상 프로토머(도 2A) 및 NMR 파생 용액 구조(도 2B)로 보여주고 있다. 모든 경우에, 암들은 한 개의 대표 구조의 공간 충전 모델에 기대는 막대로 나타낸다. 그레이스케일 코드는 도 2A의 우상측에서 보여주고 있다. 도 2A의 구조는 PDB 증착인 4INS, 1APH, 1BPH, 1CPH, 1DPH, 1G7A, 1TRZ, 1TYL, 1TYM 및 1ZNI로 얻었고, 도 2B의 구조는 PDB 증착인 1TYL 및 1G7A로 얻었다.
도 3은 인슐린 유사체의 수용기 결합 연구의 결과를 보여주는 한 쌍의 그래프이다. 도 2A에서, 인슐린 수용기(IR-B)의 B 아이소포름을 위한 상대적 활동은 수용기 결합 125I라벨링된 인간 인슐린이 인간 인슐린(■) 또는 이의 유사체인 OrnB29 인슐린(▲) 및 des-[B1-B3]-OrnB29 인슐린(▼)의 증가되는 농도로 대체되는 경합결합측정법으로 결정된다. 도 2B에서, Type I IGF 수용기(IGF-1R)의 상대적 활동은 수용기 결합 125I 라벨링된 인간 인슐린이 인간 인슐린(■) 또는 이의 유사체인 OrnB29 인슐린(▲) 및 des-[B1-B3]-OrnB29 인슐린(▼)의 증가되는 농도로 대체되는 경합결합측정법으로 결정된다.
도 4는 des-[B1-B3] 아피드라 인슐린(GluB29;■) 대 전장 아피드라 인슐린(LysB3, GluB29)(◆)의 용량 반응을 나타내는 그래프이다. 이 그래프는 투여 후 한 시간 동안의 혈당 저감 비율 대 300g rat당 나노몰로 나타낸 인슐린의 용량을 나타낸다.
도 1B는 프로인슐린의 구조적 모델로 인슐린 유사 반족 및 무질서 연결 펩티드 (파선)을 포함한다.
도 1C는 B-체인에서의 B24 잔기의 포지션를 지정하는 인간 인슐린(SEQ ID NOS: 2 및 3)의 시퀀스를 보여주는 개략도이다.
도 2A 및 도 2B는 인슐린 B 체인의 N 말단암의 잠재적인 배좌 변동성을 보여주는 분자 모델들이다. B1-B6 잔기는 결정학적 T-상 프로토머(도 2A) 및 NMR 파생 용액 구조(도 2B)로 보여주고 있다. 모든 경우에, 암들은 한 개의 대표 구조의 공간 충전 모델에 기대는 막대로 나타낸다. 그레이스케일 코드는 도 2A의 우상측에서 보여주고 있다. 도 2A의 구조는 PDB 증착인 4INS, 1APH, 1BPH, 1CPH, 1DPH, 1G7A, 1TRZ, 1TYL, 1TYM 및 1ZNI로 얻었고, 도 2B의 구조는 PDB 증착인 1TYL 및 1G7A로 얻었다.
도 3은 인슐린 유사체의 수용기 결합 연구의 결과를 보여주는 한 쌍의 그래프이다. 도 2A에서, 인슐린 수용기(IR-B)의 B 아이소포름을 위한 상대적 활동은 수용기 결합 125I라벨링된 인간 인슐린이 인간 인슐린(■) 또는 이의 유사체인 OrnB29 인슐린(▲) 및 des-[B1-B3]-OrnB29 인슐린(▼)의 증가되는 농도로 대체되는 경합결합측정법으로 결정된다. 도 2B에서, Type I IGF 수용기(IGF-1R)의 상대적 활동은 수용기 결합 125I 라벨링된 인간 인슐린이 인간 인슐린(■) 또는 이의 유사체인 OrnB29 인슐린(▲) 및 des-[B1-B3]-OrnB29 인슐린(▼)의 증가되는 농도로 대체되는 경합결합측정법으로 결정된다.
도 4는 des-[B1-B3] 아피드라 인슐린(GluB29;■) 대 전장 아피드라 인슐린(LysB3, GluB29)(◆)의 용량 반응을 나타내는 그래프이다. 이 그래프는 투여 후 한 시간 동안의 혈당 저감 비율 대 300g rat당 나노몰로 나타낸 인슐린의 용량을 나타낸다.
본 발명은 상온 이상에서 피브릴화에 대한 저항을 제공하는 인슐린 유사체에 관한 것으로 유사체는 빠른 헥사머 분해를 보유하고 유사체는 대응되는 변성되지 않은 인슐린 또는 인슐린 유사체의 생물학적 활동 중 적어도 일부분을 유지한다.
본 발명은 피브릴화의 시작 시점 이전의 지연시간에 대한 인슐린 유사체의 특성을 향상시키기 위한 전구체 분자의 폴딩 및 이황화 페어링 이후의 B1-B3 잔기의 제거에 관한 것이다. 한 경우에, B1-B3 잔기의 제거는 B23-B30 구간, 특히, B24, B28 및/또는 B29 포지션에서의 하나 이상의 아미노산 치환 또는 변성과 결합된다.
일 실시예에서, 본 발명은 시클로헥사닐알라닌 (Cha) 또는 방향족환의 4 포지션에서의 할로겐 원자(F, Cl, 또는 Br)를 포함하는 페닐알라닌의 유도체 등의 비표준 아미노산에 의한 B24 포지션에서의 페닐알라닌의 치환에 의한 더욱 빠른 헥사머 분해를 제공하는 인슐린 유사체를 제공한다. 다른 실시예에서, des-[B1-B3]유사체는방향족환의 2포지션에서의 할로겐 원자(F,Cl,또는Br)를 포함하는 유도체에 의한PheB24의 치환에 의한 열역학 안정성에 대해 향상된다. 또 다른 실시예에서, des-[B1-B3] 유사체는 B28 포지션 및/또는 B29에서 치환을 포함하여 더 빠른 헥사머의 분해율을 부여한다. 이 경우, 당해 기술분야에서 잘 알려진 예로는 AspB28(노바로그), LysB28-ProB29(휴마로그), 및 GluB29(아피드라) 등이 있다. 따라서, 본 발명은 이 유사체의 des-[B1-B3] 형태를 제공한다. 하지만, 본 발명은 인간 인슐린 및 이의 유사체에 제한되지 않는다. 이 치환은 돼지, 소, 말 및 개의 인슐린들과 같은 동물 인슐린들부터 만들어 질 수도 있고, 이에 제한되지 않는다. 또한 또는 선택적으로, 본 발명의 인슐린 유사체는 야생형 인슐린의 리신(Lys)인 B체인의 29 포지션에서 비표준 아미노산 치환을 포함할 수 있다. 특정 예에서, B29 포지션에서의 비표준 아미노산은 오르니틴(Orn)이고, B29에서의 비표준 아미노산은 노르로이신(Nle)일 수도 있다. B1-B3 잔기의 제거는 A8 포지션에서의 비베타 브랜칭된 측쇄에 의한 A체인 치환과 독립적으로 또는 B24, B28, 또는 B29 포지션에서의 상기의 변성과의 결합에 의해 결합 될 수 있다.
des-[B1-B3]-OrnB29 인슐린이 인슐린 수용기의 결합 손상 없이 야생형 인슐린 또는 OrnB29 인슐린에 대한 피브릴화로부터 보호를 제공해 준다고 발견되었다.
더욱이, 인간과 동물 인슐린들이 비슷하다는 것과 과거에 진성 당뇨병을 가진 인간 환자들에서의 동물 인슐린들의 사용을 고려하여, 인슐린의 시퀀스에서의 다른 작은 변형들, 특히, "보수적"이라고 여겨진 대체물들이 도입될 수 있다. 예컨대, 추가적인 아미노산의 대체물들이 발명에서 벗어나지 않고 비슷한 측쇄를 갖는 아미노산 그룹들 내에서 만들어질 수 있다. 이들은 중성 소수성 아미노산들을 포함한다: 알라닌(Ala 또는 A), 발린(Val 또는 V), 루신(Leu 또는 L), 이소루신(Ile 또는 I), 프롤린(Pro 또는 P), 트립토판 (Trp 또는 W), 페닐알라닌(Phe 또는 F) 및 메티오닌(Met or M). 이와 같이, 중성 극성 아미노산들이 글리신(Gly 또는 G), 세린(Ser 또는 S), 트레오닌(Thr 또는 T), 타이로신(Tyr 또는 Y), 시스테인(Cys 또는 C), 글루타민(Glu 또는 Q), 및 아스파라긴 (Asn 또는 N)의 그룹들 내에서 서로를 대체할 수 있다. 기본 아미노산들은 리신(Lys 또는 K), 아르기닌(Arg 또는 R) 및 히스티딘 (His 또는 H)을 포함한다고 볼 수 있다. 산성 아미노산들은 아스파르트산(Asp 또는 D) 및 글루탐산(Glu 또는 E)이다. 다른 언급이 없거나 문맥상에서 분명하면, 이후에 언급된 아미노산들은 L-아미노산이라고 간주되어야 한다. 표준 아미노산들은 같은 화학적 클래스에 속하는 비표준 아미노산들에 의해서도 대체될 수 있다. 제한되지 않는 예에 의해, 기본적인 측쇄 Lys는 더 짧은 측쇄 길이의 기본적 아미노산들(오르니틴, 다이아미노뷰틸릭산 또는 다이아미노프로피오닉산)에 의해 교체될 수 있다. Lys는 더 짧은 지방성 측쇄들(아미노뷰틸릭산 또는 아미노프로피오닉산)을 포함하는 유사체에 의해 대체되는 중성 지방성 등배전자체 노르로이신(Nle)에 의해서도 교체될 수 있다.
일 예로, 본 발명의 인슐린 유사체는 본 발명의 B1-B3 잔기의 제거 외에 3개 이하의 보수적 치환을 포함한다.
본 명세서 및 청구항에서 사용한 바와 같이, 인슐린 또는 인슐린 유사체의 다양한 아미노산은 아미노산 잔기로 표시될 수 있으며, 아미노산의 포지션이, 선택적으로 위첨자로, 뒤 따를 수 있다. 아미노산의 포지션은 치환이 위치하는 인슐린의 A 또는 B체인을 포함한다. 따라서, PheB1는 페닐알라닌을 야생형 인슐린의 B체인의 첫 아미노산으로 표시하며, ValB2는 야생형 인슐린의 B체인의 두번째 아미노산으로 표시하며, C말단 포지션의 ThrB30까지 계속된다. B1-B3 잔기(des-[B1-B3]로 지정된)가 제거되면, GluB4가 des-[B1-B3] B체인의 첫 번째 아미노산이 되고, PheB24이 des-[B1-B3] B-체인의 21번째 아미노산이 되고, 등등이 되도록 이 번호 표시 방법이 유지된다.
비록 이론에 제한되기를 바라지 않지만, 본 발명은 B1-B3 잔기가 아밀로이드 핵 형성의 메커니즘에서의 비자연적 분자간 상호작용에 관여하는 비극성 암을 의미할 수 있어 이의 제거는 상온 이상에서의 피브릴화의 시작을 지연 또는 방지한다. 기본적인 측쇄(Lys 또는 Arg)에 의한 야생형 B3 잔기(Gln)의 치환은 전구체 인슐린 유사체의 B체인 또는 전구체 단일 폴리펩티드의 B 도메인의 신규 트립신 사이트를 부여한다. 본 발명은 전구체 폴리펩티드의 폴딩 및 자연적 이황화 페어링이 완료된 후에만 B1-B3 잔기의 트립신 제거가 일어난다고 명시하고 있기 때문에, 이 프로세스에서 B1-B3 잔기의 주요 역할은 유지된다. 또한, 이 암이 수용기 결합 또는 생물학적 활동을 요구하지 않기 때문에, 피하 주사 또는 외부 또는 내부 펌프를 통한 계속적 주입에 의한 진성 당뇨병의 치료를 위한 성숙된 유사체 제품에서 제거될 수 있다.
우리는 B1-B3 구간이 des-[B1-B3]-des-B23-B30] 인슐린을 얻기 위한 트립신 소화에 의한 글루리신 인슐린([LysB3,GluB29]인슐린; 아피드라의 유효 성분)으로부터 용이하게 제거될 수 있다는 것을 발견하였다. 후자의 종은 옥타펩티드 GFFYTPOT(SEQ ID No:10)가 과도한 상태에서 트립신 처리 반합성에 의해 des-[B1-B3]-OrnB29 인슐린의 반합성을 위한 시작물질을 제공한다는 것으로 발견하였고, 여기서는 Ornithine(Orn)를 의미한다. 본 발명의 N 말단 B체인의 제거는 여러 기존 인슐린 유사체에서 이루어질 수 있을 것이다. 예를 들면, B1-B3 구간은 이들 제품의 유사체 또는 B3에서의 Lys 또는 Arg를 포함하는 단일 전구체에 대응하는 유사체를 통해 리스프로 인슐린([LysB28,ProB29] 인슐린, 여기에서 Kp 인슐린), 인슐린 아스파르트(AspB28인슐린)로부터 제거될 수 있다. 이 유사체는 미국 특허 5,149,777 및 5,474,978에서 설명하고 있다. 이 유사체는 각각 빠른 활동 인슐린으로 알려져 있다.
인간 프로인슐린의 아미노산 시퀀스가, 비교를 위해, SEQ ID NO: 1로 제공된다.
SEQ ID NO: 1 (인간 프로인슐린)
Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Lys-Thr-Arg-Arg-Glu-Ala-Glu-Asp-Leu-Gln-Val-Gly-Gln-Val-Glu-Leu-Gly-Gly-Gly-Pro-Gly-Ala-Gly-Ser-Leu-Gln-Pro-Leu-Ala-Leu-Glu-Gly-Ser-Leu-Gln-Lys-Arg-Gly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-Thr-Ser-Ile-Cys-Ser-Leu-Tyr-Gln-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-Asn
인간 인슐린의 A 체인의 아미노산 시퀀스가 SEQ ID NO: 2로 제공된다.
SEQ ID NO: 2 (인간 A 체인)
Gly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-Thr-Ser-Ile-Cys-Ser-Leu-Tyr-Gln-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-Asn
인간 인슐린의 B 체인의 아미노산 시퀀스가 SEQ ID NO: 3로 제공된다.
SEQ ID NO: 3 (인간 B 체인)
Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Lys-Thr
인간 인슐린의 전구체 B 체인의 아미노산 시퀀스는 B3 포지션에서의 리신(Lys) 또는 아르기닌(Arg) 및 선택적으로 B29 포지션에서의 글루타메이트(Glu)의 치환으로 변성될 수 있다. 이러한 시퀀스의 예를 SEQ ID NO: 4로 제공한다.
SEQ ID NO: 4
Phe-Val- Xaa1-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Xaa2-Thr
[Xaa1는 Arg 또는 Lys; Xaa2는 Lys 또는 Glu]
B3 포지션에서 Arg 또는 Lys를 포함하는 전구체 유사체 또는 전구체 단일 체인 인슐린 유사체의 폴딩 및 트립신 소화 이후 및 변성된 옥타펩티드를 갖는 트립신 처리 반합성 이후에, 결과적으로 얻게 되는 des-(B1-B3) 변성은 SEQ ID NOS: 5-7에서 제공된 바와 같이 B24 등의 다른 포지션에서의 비표준 치환과 선택적으로 결합될 수 있다.
SEQ ID NO: 5
Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-Xaa3-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Xaa1-Phe-Tyr-Thr-Pro-Xaa2-Thr
[Xaa1는 Phe, Cha, penta-fluoro-Phe, 2F-Phe, 2-Cl-Phe, 2-Br-Phe, 4F-Phe, 4-Cl-Phe, 또는 4-Br-Phe; Xaa2는 Glu, Lys, 오르니틴, 다이아미노뷰틸릭산, 다이아미노프로피오닉산, 노르로이신, 아미노부트르산, 또는 아미노프로프리온산(Aminoproprionicacid); Xaa3는 His, Asp, Pro, 또는 Glu]
SEQ ID NO: 6
Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-Xaa3-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Xaa1-Phe-Try-Thr-Xaa2-Pro-Thr
[Xaa1는 Phe, Cha, penta-fluoro-Phe, 2F-Phe, 2-Cl-Phe, 2-Br-Phe,4F-Phe, 4-Cl-Phe, 또는 4-Br-Phe; Xaa2는 Lys, Arg, Ala, Glu, Gln, 또는 Val; Xaa3는His, Asp, Pro,또는 Glu]
SEQ ID NO: 7
Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-Xaa2-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Xaa1-Phe-Try-Thr-Pro-Glu-Thr
[Xaa1는 Phe, Cha, penta-fluoro-Phe, 2F-Phe, 2-Cl-Phe, 2-Br-Phe, 4F-Phe, 4-Cl-Phe, 또는 4-Br-Phe; Xaa2는 His, Asp, Pro, 또는 Glu]
SEQ ID 5-7에서 명시된 변종 B 체인은 SEQ ID NO: 8에 나타난 바와 같이 A8 포지션에서 선택적으로 치환을 포함하는 A 체인과 결합될 수 있다.
SEQ ID NO: 8 (인간 A 체인)
Gly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-Xaa4-Ser-Ile-Cys-Ser-Leu-Tyr-Gln-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-Asn
[여기서 Xaa4는 Arg, Gln, Glu, His, Lys, 또는 Thr]
여기서 원문이 원용되고 출원 중인 국제 특허 출원 PCT/US07/00320 및 미국특허출원 12/160,187에서 더 상세하게 설명된 바와 같이, B1-B3 잔기의 제거도 A4, A8 및/또는 B1 잔기의 His 치환을 포함하는 인간 인슐린의 유사체에서도 영향을 받을 수 있다. 예를 들면, B3 포지션에서의 Arg 또는 Lys의 트립신 민감 치환은 SEQ ID NO: 9로 표현되는 아미노산 시퀀스를 갖는 단일 인슐린 유사체 또는 프로인슐린 유사체에서의 HisA8 및/또는 HisB1 치환과 함께 존재할 수 있다.
SEQ ID NO: 9
Phe-Val-Xaa1-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Xaa2-Phe-Tyr-Thr-Xaa3-Xaa4-Thr-Xaa5-Gly-Ile-Val-Xaa6-Gln-Cys-Cys-Xaa7-Ser-Ile-Cys-Ser-Leu-Tyr-Gln-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-Asn; 여기서 Xaa1는 Arg 또는 Lys; Xaa2는 Phe, Cha, penta-fluoro-Phe, 2F-Phe, 2-Cl-Phe, 2-Br-Phe, 4F-Phe, 4-Cl-Phe, 또는 4-Br-Phe; Xaa3는 Pro, Lys, 또는 Asp; Xaa4는 Lys 또는 Pro; Xaa6는 His 또는 Glu; Xaa7는 His, Lys, Arg, Glu, Gln 또는Thr; Xaa5는 C말단 잔기가 Thr이 되는 어떠한 아미노산의 0-34 또는 아미노산 체인에서의 브레이크;및 Xaa6는 Glu, His, Arg 또는 Lys.
트립신 처리 반합성은 무손상 인슐린의 주요 수용기 결합 결정요인을 포함하고 트립신 소화 사이트를 포함하지 않는 특성을 공유하는 SEQ ID NO: 10-15의 옥타펩티드의 합성을 사용한다.
SEQ ID NO: 10
Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Orn-Thr
[여기서 Orn은 오르니틴을 나타낸다]
SEQ ID NO: 11
Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Glu-Thr
SEQ ID NO: 12
Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Lys-Pro-Thr
SEQ ID NO: 13
Gly-Xaa1-Phe-Tyr-Thr-Lys-Pro-Thr
[여기서 Xaa1는 Cha, penta-fluoro-Phe, 2F-Phe, 2-Cl-Phe, 2-Br-Phe, 4F-Phe, 4-Cl-Phe,또는 4-Br-Phe]
SEQ ID NO: 14
Gly-Xaa1-Phe-Tyr-Thr-Pro-Orn-Thr
[여기서 Xaa1는 Cha, penta-fluoro-Phe, 2F-Phe, 2-Cl-Phe, 2-Br-Phe, 4F-Phe, 4-Cl-Phe, 또는 4-Br-Phe]
SEQ ID NO: 15
Gly-Xaa1-Phe-Tyr-Thr-Pro-Glu-Thr
[여기서 Xaa1는 Cha, penta-fluoro-Phe, 2F-Phe,2-Cl-Phe, 2-Br-Phe, 4F-Phe, 4-Cl-Phe, 또는 4-Br-Phe]
SEQ ID NO: 16
Gly-Xaa1-Phe-Tyr-Thr-Asp-Xaa2-Thr
[여기서 Xaa1는 Cha, 펜타-플루오로-Phe, 2F-Phe, 2-Cl-Phe, 2-Br-Phe, 4F-Phe, 4-Cl-Phe, 또는 4-Br-Phe; 및 Xaa2는 오르니틴, 다이아미노뷰틸릭산, 다이아미노프로프리온산, 노르로이신, 아미노부트르산, 또는 아미노프로프리온산]
B1-B3 잔기가 없는 인슐린의 유사체는 글루리신 인슐린(SEQ ID NO:2 및 SEQ ID NO:4, LysB3,GluB29)을 시작물질로 사용하여 제조하였다. 이 유사체의 완전한 트립신 소화로 역상 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)로 정제한 des-[B1-B3]-des-B23-B30]인슐린을 얻었다. 야생형 인슐린의 세개의 자연 이황화 브리지를 포함하는 이 조각으로부터, 변성된 B23-B30 펩티드 구간은 트립신 촉매화된 반합성에 의해 부착되었고 고성능 액체 크로마토그래피에 의해 정제되었다(Mirmira, R.G., 및 Tager, H.S., 1989. J.Biol.Chem.264:6349-6354.). 이 프로토콜은 (i) (N)-GFFYTPOT 또는 (N)-GFFYTPET(치환은 밑줄; 각각 SEQ ID NOS: 10 및 11)잔기를 나타내는 합성옥타펩티드 및 (ii) 절단된 유사체 des-tripeptide[B1-B3]-des-옥타펩티드[B23-B30] 인슐린 또는 GluA8 인슐린 유사체의 경우 GluA8-des-트리펩티드[B1-B3]-des-옥타펩티드[B23-B30] 인슐린을 사용한다. 트립신은 Orn 이후에 쪼개지지 않는다. 간단히 말해서, des-옥타펩티드(15mg) 및 옥타펩티드(15mg)를 10mM 칼슘아세테이트 및 1mM 에틸렌디아민테트라-아세트산(EDTA)(35:35:30,v/v,0.4mL)을 포함하는 디에틸아세타마이드/1,4-부탄디올/0.2M Tris 아세테이트(pH8)의 혼합물에 용해 하였다. 최종 pH는 N-메틸모르포린의 1μL로 7.0으로 조절하였다. 용액은 12°C로 냉각하였고, TPCK 트립신 1.5 mg을 추가하여 12°C에서 2일간 배양하였다. 24시간 후에 트립신 1.5 mg을 추가하였다. 이 반응은 0.1%의 트리플루오로아세트산으로 산화하였고 예비 역상 HPLC(C4)로 정제하였다. 각 사례에서 매트릭스 지원 레이저 이탈 이온화 이동시보(MALDI-TOF; Applied Biosystems, 포스터시, 캘리포니아, 미국)를 이용한 질량 분석법에서는 예상되는 값을 보여주었다(미도시). 고체상 합성을 위한 일반적인 프로토콜을 설명한다(Merrifield 외, 1982. Biochemistry21:5020-5031). 9-플루오렌-9-yl-메톡시-카본닐(F-moc)-보호 페닐알라닌 유사체를 Chem-Impex International((Wood Dale, IL, 미국)로부터 구매하였다.
B29 포지션에서 오르니틴 또는 글루탐산을 포함하는 인간 인슐린의 des-트리펩티드[B1-B3]를 제조하기 위해 위의 프로토콜을 사용하였다. 이 제조 방법은 B체인의 C말단 옥타펩티드(즉, LysB29 및 ThrB30 사이) 내에 보통 존재하는 트립신사이트를 제거하면서 28 포지션에서 프롤린을 유지하기 위해 29 포지션에서 비표준 아미노산 치환을 활용한다. ProB28는 인슐린 헥사머 내에서 다이머 상호작용의 안정성에 기여하기 때문에, 이 제조방법은 번거로운 측쇄 보호의 필요없이 다른 변성이 편리하게 포함될 수 있는 야생형 인슐린의 등전자와 가까운 모델을 제공한다.
원평광 이색성(CD) 스펙트럼은 Aviv 분광 편광계를 사용하여 4°C 및/또는 25°C에서 얻었다(Weiss외, Biochemistry39:15429-15440). 샘플은 ca. 25μM DKP 인슐린 또는 50 mM의 칼륨 인산염(pH 7.4)내의 유사체를 포함하고 있으며, 샘플은 25°C에서 구이니딘 유도 변성 연구를 위해 5μM로 희석하였다. 폴딩 풀림의 자유에너지를 추출하기 위해, 변성 전이는, Sosnick 외, MethodsEnzymol. 317:393-409에서 설명한 바와 같이, 비선형 최소 제곱법에서 두 상태 모델에 의해 맞추었다. 간단히 말해서, CD 데이터θ(x)(x는 변성의 농도를 나타냄)가 다음의 식에 따르는 비선형 최소 제곱법 프로그램에 의해 맞추어졌다.
여기서 x는 구아니딘의 농도이고, θ A 및 θ B 는 자연적 및 폴딩되지 않은 상태에서의 베이스라인 값이다. 베이스라인은 이전 및 이후 전이 라인인 
및 
에 의해 근사화하였다. 이형 폴딩되지 않은 전이에 맞추는데 얻은 m 값은 야생형 폴딩되지 않은 커브에 맞추는데 얻은 m 값보다 작았다. 이 차이와 ΔGu의 분명한 변화가 완전히 폴딩되지 않은 상태에서 CD신호를 측정할 수 없다는 것에서 기인한다는 것을 시험하기 위해, 더 높은 구아니딘의 농도에서 안정된 CD값에서 추론된 시뮬레이션을 실시하였으며, 근본적으로 동일한 ΔGu 및 m의 추정값을 얻었다.
상대적 활동은 유사체 대 야생형 인간 인슐린의 호르몬-수용체 해리상수의 비율로 정의되고, 이는 125I-인간 인슐린을 사용한 경쟁적 변위 분석에 의해 측정된다. 미량정량 스트립판들(Nunc Maxisorb)은 4°C에서 AU5 IgG (인산완충식염수에서 40 mg/ml의 100μl/well)로 하룻밤 동안 배양되었다. 결합 데이터는 2측 순차적인 모델에 의해 분석되었다. 데이터는 비특이성 결합(1um의 인간 인슐린의 존재에서 연관된 막에 남아 있는 방사능의 양)에 대해 보상되었다. 모든 분석에서 경쟁하는 리간드의 부재내에 속박된 추적자의 비율은 리간드-소모 아티팩트를 피하기 위해 15% 미만이었다. 도 3A에서 대표적인 데이터를 보여주고 있으며, 도 3B에서 Type I IGF 수용기(IGF-1R)로 수행한 대응되는 분석을 보여주고 있다.
des-트리펩티드[B1-B3] 유사체의 원자외선 원편광 2색성(CD) 스펙트럼은 부모 유사체의 것과 비슷하다. 25°C에서의 중첩풀림(ΔGu)의 자유에너지는 영변성 농도로 추정된 2상태 모델을 기준으로 추정하였다. 지연 시간은 무아연 인산완충식염수(pH 7.4) 안에서 30oC에서 서서히 저어서 단백질 피브릴화의 개시에 필요한 시간(일기준)을 나타낸다.
25oC에서 변성의 2상태 모델로부터 추론된 야생형 인슐린 및 OrnB29 인슐린의 베이스라인 열역학적 안정성은 각각 3.5±0.1kcal/mole 및 3.5±0.1kcal/mole로 구별하기 어렵다. CD 검출된 구아니딘 변성 연구는 B1-B3 잔기의 제거는 OrnB29인슐린에서의열역학적 안정성의 작은 감소와 연관되어 있다고 지적하고 있으며, ΔGu3.2±0.1kcal/mole, ΔΔGu 3.2±0.2kcal/mole임을 시사한다. 그럼에도 불구하고, 서서히저으면서 30oC에서 pH7.4에서 300μM 인산완충식염수(PBS)에서의 배양 동안 3배가 되는 것에서 평가된 것처럼 des-[B1-B3] 유사체의 물리적 안정성은 야생형 인슐린 또는 OrnB29 인슐린의 것보다 크다고 발견되었다. 샘플들은 10일이 될 때까지 또는 침전이 일어날 때까지 또는 유리병의 프로스팅이 관측될 때까지 관측하였다. 야생형 인슐린의 세개의 튜브 및 OrnB29 인슐린의 세개의 튜브가 4일 미만에서 흐려진 반면, des-[B1-B3]-OrnB29 인슐린의 세개의 튜브는 적어도 7일 동안 맑게 유지되었다. des-[B1-B3]-GluB29 인슐린 및 [LysB3,GluB29] 인슐린 (아피드라의 활성성분)간 피브릴화 지연시간에 대한 비슷한 비교는 B1-B3잔기의 제거가 지연 시간을 적어도 2배 늘렸다는 것을 보여 주었다.
해리상수(Kd)는 Whittaker과 Whittaker(2005. J. Biol Chem. 280:20932-20936)에 의해 설명된 수학 모델에 맞추어 결정되었으며, 적은 변성 미량정량판 항체 포획 분석에서 125I-TyrA14인슐린(Novo-Nordisk에서 제공) 및 용해된 인슐린 수용기(아이소포름B 또는 A)를 사용한 경쟁적 변위 분석을 사용하였으며, 감염된 수용기는 FLAG 에피토프(DYKDDDDK)의 세번 반복에 의해 C말단에서 태그 되었고, 미량정량판은 anti-FLAG M2 단일 클론항체(Sigma)에 의해 코팅되었다. 경쟁하는 리간드의 부재내에 속박된 추적자의 비율은 리간드-소모 아티팩트를 피하기 위해 15% 미만이었다. 결합 데이터는 해리상수를 얻기 위해 이종 경쟁 모형을 사용하는 비선형 회귀분석(Wang, 1995, FEBSLett.360:111-114)에 의해 분석하였다. 표 1은 이의 결과를 보여주고 있으며, 해리상수는 나노몰 단위이다. 흥미롭게도, B1-B3 잔기의 제거는 수용기 결합을 적어도 2배 향상시키는 것으로 보인다.
| 단백질 | IR-B 결합 | IGF-1R 결합 |
| 인슐린 | 0.061 ± 0.010 nM | 6.4 ± 1.0 nM |
| OrnB29 인슐린 | 0.118 ± 0.018 nM | 7.5 ± 1.2 nM |
| des-[B-B3]-OrnB29 인슐린 | 0.035 ± 0.006 nM | 3.2 ± 0.5 nM |
| IR-B, 인슐린 수용체의 아이소포름 B; IGF-1R, 제1종 IGF 수용체. | ||
인슐린 유사체와 인슐린 수용기 및 IGF 수용기간 결합
도 4를 참조하면, 글루이신 인슐린(아피드라, SEQ ID NOS:2 및 4, ◆) 및 des-[B1-3] 글루이신 인슐린(SEQ ID NOS:2 및 5; ■)은 HPLC로 정제하고, 분말로 감압하에 동결 건조하고, 인슐린 희석제에 희석하였다. 수컷 루이스 쥐를 시간=0 시점에 0.875, 3.5 또는 8.75 mM의 글루리신 또는 100μl의 희석제 내의 des-[B1-3 글루이신을 피하 주사하였으며, 더 높은 투여량은 야생형 인슐린 투여량 반응 곡선의 안정점에 있지만 더 낮은 투여량은 포도당의 최대 초기 처리율의 40% 정도로 대응된다. 희석제만의 주사는 음성 대조군으로 실행하였다. 각 그룹에서 6개의 쥐들을 분석하였다. 피는 시간 0 시점과 120분까지 일정 간격으로 꼬리의 끝단을 절개하여 얻었다. 혈당은 Hypoguard Advance Micro-Draw 계측기를 사용하여 측정하였다. 혈당 농도는 감소하는 것으로 관측되었다. 초기 속도 또는 기간의 어떠한 차이도 통계적으로 유효하지 않았다.
환자를 치료하는 방법은 당해 기술 분야에서 알려지거나 여기에서 설명된 단축된 des-트리펩티드[B1-B3] 체인을 포함하는 인슐린 유사체를 투여하는 것을 포함한다. 본 발명의 다른 측면에서, des-트리펩티드[B1-B3]-des-펜타펩티드[B23-B30] 인슐린이 폴딩 이후에 두 체인 또는 단일 체인 전구체 폴리펩티드의 트립신 소화로 용이하게 얻어 자연적 이황화 페어링을 이룰 수 있다. 본 발명의 또 다른 측면에서, 비표준 아미노산 치환의 사용은 보호되지 않은 옥타펩티드를 사용하는 트립신 처리 반합성에 의한 인슐린 유사체의 빠르고 효율적인 제조 방법을 가능하게 한다.
또 다른 예에서, 인슐린 유사체는 외부 또는 매식 인슐린 펌프에 의해 투여된다. 본 발명의 인슐린 유사체는, 여기서 원문이 원용되고 출원 중인 미국 특허 출원 12/419,169에서 더 상세하게 설명된 바와 같이, B 체인의 C말단 및 A체인의 N말단 사이이의 사슬과 같은 다른 변성도 포함할 수 있다.
의약 조성물은 이러한 인슐린 유사체들을 포함할 수 있고 선택적으로 아연을 포함할 수 있다. 아연 이온은 이와 같은 조성물에 인슐린 유사체의 헥사머 당 2.2 및 3.0의 몰비율로 포함될 수 있다. 이와 같은 형태에서, 인슐린 유사체의 농도는 보통 약 0.1에서 약 3 mM이며, 인슐리 펌프의 저장기에서 3 mM까지의 농도를 사용할 수 있다. 식사 시간 인슐린 유사체의 변성은 (a) 휴물린(Humulin®) 휴마로그 (Eli Lilly and Co.), 노발린(Novo-Nordisk), 및 노바로그(Novo-Nordisk) 및 인간 사용에 허가된 다른 빠른 행동 인슐린 형성의 "보통" 형성, (b) 위의 인슐린 유사체 및 다른 인슐린 유사체의 "NPH" 형성, 및 (c) 이 형성의 혼합에서 설명된 바와 같이 형성될 수 있다. B1-B3 잔기가 없고 GluB29를 포함하는 인슐린 유사체는 인슐린 글루리신의 형성을 위한 당해 기술분야에서 알려진 바와 같이 아연이온 없이 형성될 수있다.
첨가제는 글리세롤, 글리신, 아르가닌, 트리스, 다른 버퍼들과 소금, 및 페놀 및 메타 크레졸과 같은 항균성 보존제를 포함하고 후자의 보존제는 인슐린 헥사머의 안정성을 향상시킨다고 알려져 있다. 이와 같은 의약 조성물은 환자에게 생리학적으로 효과적인 양의 조성물을 투약하여 진성 당뇨병 또는 다른 질병을 갖는 환자를 치료하는 사용될 수 있다.
핵산은 B3 포지션에서 Arg 또는 Lys 및 B24 포지션에서 비표준 아미노산으로 적어도 B 체인을 인코딩하는 시퀀스를 포함하는 인슐린 유사체를 인코딩하는 폴리펩티드를 인코딩하는 시퀀스를 포함할 수 있다. 위에서 설명한 바와 같이, 후자는 억제제인 tRNA(호박 코돈 사용시 박호박 억제제 사용) 및 비표준 아미노산을 정지 코돈에 대응하여 폴리펩티드에 포함하는 대응되는 tRNA 합성효소와 함께 B24 포지션에서 정지 코돈(호박 코돈, TAG와 같은)의 소개를 통해 이루어 진다(Furter, 1998,ProteinSci.7:419-426;Xie외,2005,Methods.36:227-238). 특정 시퀀스는 핵산 시퀀스가 소개되는 종의 선호 코돈 사용에 의존할 수 있다. 핵산은 야생형 인슐린의 다른 변성을 인코딩 할 수 있다. 핵산 시퀀스는 폴리펩티드 또는 변성된 프로인슐린 유사체 내의 다른 곳에서의 관련 없는 치환 또는 확장을 포함하는 변성된 A 또는 B 체인 시퀀스를 인코딩할 수 있다. 핵산은 발현벡터의 한 부분일 수도 있으며, 이 벡터는 E. coli 세포계 또는 S.cereviciae 또는 Pischiapastoris 스트레인 또는 세포계와 같은 진핵 세포계 등의 전핵 숙주 세포로 주입될 수 있다.
예컨대, 합성 유전자는 Piscia pastoris 이스트 및 다른 미생물 내의 B체인 폴리펩티드의 발현을 조정할 수 있도록 합성될 수 있다. B24 포지션에 시클로헥사닐알라닌 또는 Phe의 할로겐 유도체를 포함시키기 위해 B24 포지션에 정지 코돈을 활용하는 B 체인 폴리펩티드의 뉴클리오티드 시퀀스는 다음 또는 다음의 이형일 수 있다:
(a) 인간 코돈 선호:
TTTGTGXXXCAACACCTGTGCGGCTCACACCTGGTGGAAGCTCTCTACCTAGTGTGCGGGGAACGAGGCTAGTTCTACACACCCAAGACC
(SEQ ID NO: 17)
[여기서 XXX는 AGG, AGA, CGG 또는 CGC (Arg 인코딩), 또는 AAG 또는 AAA (Lys 인코딩)]
(B) 피치아 코돈 선호:
TTTGTTXXXCAACATTTGTGTGGTTCTCATTTGGTTGAAGCTTTGTACTTGGTTTGTGGTGAAAGAGGTTAGTTTTACACTCCAAAGACT
(SEQ ID NO: 18)
[여기서 XXX는 AGA, CGU 또는 AGG (Arg 인코딩) 또는 AAG 또는 AAA (Lys 인코딩)]
비슷하게, B3 포지션에 Arg 또는 Lys를 인코딩하고, B24 포지션에 시클로헥사닐알라닌 또는 Phe의 할로겐 유도체를 포함시키기 위해 B24 포지션에 정지 코돈을 활용하는 인간 코돈 선호를 갖는 전장 프로인슐린 cDNA는 SEQ ID NO: 19를 가질 수 있다.
TTTGTXXXCC AACACCTGTG CGGCTCACAC CTGGTGGAAG CTCTCTACCT AGTGTGCGGG GAACGAGGCT AGTTCTACAC ACCCAAGACC CGCCGGGAGG CAGAGGACCT GCAGGTGGGG CAGGTGGAGC TGGGCGGCGG CCCTGGTGCA GGCAGCCTGC AGCCCTTGGC CCTGGAGGGG TCCCTGCAGA AGCGTGGCAT TGTGGAACAA TGCTGTACCA GCATCTGCTC CCTCTACCAG CTGGAGAACT ACTGCAACTA G (SEQ ID NO: 19)
[여기서 XXX는 AGG, AGA, CGG 또는 CGC (Arg 인코딩), 또는 AAG 또는 AAA (Lys 인코딩)]
이와 같이, B24 포지션에 시클로헥사닐알라닌 또는 Phe의 할로겐 유도체를 포함시키기 위해 B24 포지션에 정지 코돈을 활용하고 P.pastoris에 의해 선호되는 코돈을 포함하는 전장 인간 프로인슐린 cDNA는 B체인 폴리펩티드의 뉴클리오티드 시퀀스는 SEQ ID NO: 20를 가질 수 있다.
TTTGTTXXXCAACATTTGTGTGGTTCTCATTTGGTTGAAGCTTTGTACTTGGTTTGTGGTGAAAGAGGTTAGTTTTACACTCCAAAGACTAGAAGAGAAGCTGAAGATTTGCAAGTTGGTCAAGTTGAATTGGGTGGTGGTCCAGGTGCTGGTTCTTTGCAACCATTGGCTTTGGAAGGTTCTTTGCAAAAGAGAGGTATTGTTGAACAATGTTGTACTTCTATTTGTTCTTTGTACCAATTGGAAAACTACTGTAACTAA (SEQ ID NO: 20)
[여기서 XXX는 AGA, CGU 또는 AGG (Arg 인코딩) 또는 AAG 또는 AAA (Lys 인코딩)]
같은 폴리펩티드 시퀀스를 인코딩하는 위 시퀀스의 다른 이형들도 유전자 코드내에서의 유의어를 고려하면 가능하다.
앞서 개시한 내용을 바탕으로, 제공되는 인슐린 유사체가 위의 목표를 수행하는 것은 이제 당연할 것이다. 즉, 이 인슐린 유사체는 피브릴화에 대해 향상된 저항성을 보여주면서 헥사머 분해로 인한 빠른 활동을 보유하고 야생형 인슐린의 생물학적 활동 중 적어도 일부분을 유지한다. 어떠한 조합과 변형에 관계된 내용들은 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 할 것이고 특성 구성요소의 선택은 여기에서 개시되고 설명된 발명의 범위에 포함된다고 해석되어야 할 것이다.
다음의 문헌들이 여기서 설명한 시험 및 분석 방법들이 당해 기술분야의 통상의 지식을 가진 자가 이해할 수 있다는 것을 보여주기 위해 인용되었다.
Furter, R., 1998. 유전자 코드의 확장: Escherichiacoli에서의 사이트 지향성 p-플루오로-페닐알라닌의 포함.ProteinSci. 7:419-426.
Merrifield, R.B., Vizioli, L.D., 및 Boman, H.G. 1982. 항균성 펩티드 세크로핀 A (1-33)의 합성. Biochemistry 21:5020-5031.
Mirmira, R.G., 및 Tager, H.S. 1989. 인슐린 상호작용과 이의 수용기를 관리하는데 페닐알라 B24 측쇄의 역할: 주쇄 형태의 중요성. J.Biol.Chem. 264:6349-6354.
Sosnick, T.R., Fang, X., 및 Shelton, V.M. 2000. RNA 폴딩 전이를 연구하기 위한 원형 2색성의 응용. MethodsEnzymol. 317:393-409.
Wang, Z.X. 1995. 단백질 분자와 두개의 다른 리간드들의 경쟁적 결합을 설명하는 정확한 수학적 표현. FEBSLett. 360:111-114.
Weiss, M.A., Hua, Q.X., Jia, W., Chu, Y.C., Wang, R.Y., 및 Katsoyannis, P.G. 2000. 위계적 단백질 "비설계": 인슐린의 홰내 이황화 브리지가 인지 α-헬릭스 를 묶음. Biochemistry 39:15429-15440.
Whittaker, J., 및 Whittaker, L. 2005. 전장 인슐린 수용기의 기능적 인슐린 결합 에피토프의 특성. J.Biol.Chem. 280:20932-20936.
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<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 86
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 1
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Arg Arg
20 25 30
Glu Ala Glu Asp Leu Gln Val Gly Gln Val Glu Leu Gly Gly Gly Pro
35 40 45
Gly Ala Gly Ser Leu Gln Pro Leu Ala Leu Glu Gly Ser Leu Gln Lys
50 55 60
Arg Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln
65 70 75 80
Leu Glu Asn Tyr Cys Asn
85
<210> 2
<211> 21
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 2
Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu
1 5 10 15
Glu Asn Tyr Cys Asn
20
<210> 3
<211> 30
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 3
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr
20 25 30
<210> 4
<211> 30
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (3)..(3)
<223> Xaa is Arg or Lys
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (29)..(29)
<223> Xaa is Glu or Lys
<400> 4
Phe Val Xaa Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Xaa Thr
20 25 30
<210> 5
<211> 27
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (7)..(7)
<223> Xaa is His, Asp, Pro, or Glu
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (21)..(21)
<223> Xaa is Phe, Cyclohexanylalanine, penta-fluoro-Phe, 2F-Phe,
2-Cl-Phe, 2-Br-Phe, 4F-Phe, 4-Cl-Phe, or 4-Br-Phe
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (26)..(26)
<223> Xaa is Glu, Lys, Ornithine, Diaminobutyric acid,
Diaminoproprionic acid, Norleucine, Aminobutric acid, or
Aminoproprionic acid
<400> 5
Gln His Leu Cys Gly Ser Xaa Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys
1 5 10 15
Gly Glu Arg Gly Xaa Phe Tyr Thr Pro Xaa Thr
20 25
<210> 6
<211> 27
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (7)..(7)
<223> Xaa is His, Asp, Pro, or Glu
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (21)..(21)
<223> Xaa is Phe, Cyclohexanylalanine, penta-fluoro-Phe, 2F-Phe,
2-Cl-Phe, 2-Br-Phe, 4F-Phe, 4-Cl-Phe, or 4-Br-Phe
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (25)..(25)
<223> Xaa is Lys, Arg, Ala, Glu, Gln, or Val
<400> 6
Gln His Leu Cys Gly Ser Xaa Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys
1 5 10 15
Gly Glu Arg Gly Xaa Phe Tyr Thr Xaa Pro Thr
20 25
<210> 7
<211> 27
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (7)..(7)
<223> Xaa is His, Asp, Pro, or Glu
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (21)..(21)
<223> Xaa is Phe, Cyclohexanylalanine, penta-fluoro-Phe, 2F-Phe,
2-Cl-Phe, 2-Br-Phe, 4F-Phe, 4-Cl-Phe, or 4-Br-Phe
<400> 7
Gln His Leu Cys Gly Ser Xaa Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys
1 5 10 15
Gly Glu Arg Gly Xaa Phe Tyr Thr Pro Glu Thr
20 25
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<213> Homo sapiens
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (8)..(8)
<223> Xaa is Arg, Gln, Glu, His, Lys, or Thr
<400> 8
Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Xaa Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu
1 5 10 15
Glu Asn Tyr Cys Asn
20
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<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (3)..(3)
<223> Xaa is Arg or Lys
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (24)..(24)
<223> Xaa is Phe, Cyclohexanylalanine, penta-fluoro-Phe, 2F-Phe,
2-Cl-Phe, 2-Br-Phe, 4F-Phe, 4-Cl-Phe, or 4-Br-Phe
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (28)..(28)
<223> Xaa is Pro, Lys, or Asp
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (29)..(29)
<223> Xaa is Glu, Lys or Pro
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (31)..(31)
<223> Xaa is 0-34 of any amino acid or a break in the amino-acid chain
<220>
<221> MISC_FEATURE
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<223> Xaa is Glu, Arg or Lys
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (39)..(39)
<223> Xaa is His, Lys, Arg, Glu, Gln or Thr
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Phe Val Xaa Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr
1 5 10 15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Xaa Phe Tyr Thr Xaa Xaa Thr Xaa Gly
20 25 30
Ile Val Xaa Gln Cys Cys Xaa Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu
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Asn Tyr Cys Asn
50
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<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (7)..(7)
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<400> 10
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<210> 11
<211> 8
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<213> Homo sapiens
<400> 11
Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Glu Thr
1 5
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<211> 8
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<213> Homo sapiens
<400> 12
Gly Phe Phe Tyr Thr Lys Pro Thr
1 5
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<211> 8
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> Xaa is Cyclohexanylalanine, penta-fluoro-Phe, 2F-Phe, 2-Cl-Phe,
2-Br-Phe, 4F-Phe, 4-Cl-Phe, or 4-Br-Phe
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<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> Xaa is Cyclohexanylalanine, penta-fluoro-Phe, 2F-Phe, 2-Cl-Phe,
2-Br-Phe, 4F-Phe, 4-Cl-Phe, or 4-Br-Phe
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<221> MISC_FEATURE
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Gly Xaa Phe Tyr Thr Pro Xaa Thr
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<220>
<221> MISC_FEATURE
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<220>
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<221> MISC_FEATURE
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acid, Norleucine, Aminobutric acid, or Aminoproprionic acid
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<213> Homo sapiens
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<221> misc_feature
<222> (6)..(8)
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<220>
<221> misc_feature
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<223> n is a, c, g, or t
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tttgtgnnnc aacacctgtg cggctcacac ctggtggaag ctctctacct agtgtgcggg 60
gaacgaggct agttctacac acccaagacc 90
<210> 18
<211> 90
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<221> misc_feature
<222> (7)..(9)
<223> NNN is AGA, CGU, AGG, AAG or AAA
<400> 18
tttgttnnnc aacatttgtg tggttctcat ttggttgaag ctttgtactt ggtttgtggt 60
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<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<221> misc_feature
<222> (6)..(8)
<223> NNN is AGG, AGA, CGG, CGC, AAG or AAA
<400> 19
tttgtnnncc aacacctgtg cggctcacac ctggtggaag ctctctacct agtgtgcggg 60
gaacgaggct agttctacac acccaagacc cgccgggagg cagaggacct gcaggtgggg 120
caggtggagc tgggcggcgg ccctggtgca ggcagcctgc agcccttggc cctggagggg 180
tccctgcaga agcgtggcat tgtggaacaa tgctgtacca gcatctgctc cctctaccag 240
ctggagaact actgcaacta g 261
<210> 20
<211> 260
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<221> misc_feature
<222> (7)..(9)
<223> NNN is AGA, CGU, AGG, AAG or AAA
<400> 20
tttgttnnnc aacatttgtg tggttctcat ttggttgaag ctttgtactt ggtttgtgtg 60
aaagaggtta gttttacact ccaaagacta gaagagaagc tgaagatttg caagttggtc 120
aagttgaatt gggtggtggt ccaggtgctg gttctttgca accattggct ttggaaggtt 180
ctttgcaaaa gagaggtatt gttgaacaat gttgtacttc tatttgttct ttgtaccaat 240
tggaaaacta ctgtaactaa 260
Claims (17)
- B1-B3 잔기가 없고, B23-B30의 B 체인 구간 내에서 적어도 하나의 다른 아미노산 치환 또는 변성을 선택적으로 포함하는 단축된 인슐린 B 체인 폴리펩티드를 포함하는 인슐린 유사체.
- 제1항에 있어서, Glu, Gln, His, Lys, 또는 Arg의 그룹에서 선택되는 A8 치환을 더 포함하는 인슐린 유사체.
- 제1항 내지 제2항 중의 어느 한 항에 있어서, GluB29을 더 포함하는 인슐린 유사체.
- 제1항 내지 제2항 중의 어느 한 항에 있어서, OrnB29을 더 포함하는 인슐린 유사체.
- 제1항에 있어서, 상기 유사체는 포유류 인슐린의 유사체인 인슐린 유사체.
- 제1항에 있어서, 상기 유사체는 포유류 프로인슐린의 유사체인 인슐린 유사체.
- 제1 항에 있어서, SEQ ID NO: 7의 폴리펩티드 시퀀스를 포함하는 인슐린 유사체.
- 제1항 내지 제6항 중의 어느 한 항에 따른 인슐린 유사체를 인코딩하는 핵산.
- 제7항의 핵산 시퀀스를 포함하는 발현 벡터.
- 제8항의 발현 벡터로 변형되는 숙주 세포.
- 생리학적으로 효과적인 양의 인슐린 유사체 또는 생리학적으로 허용되는 인슐린 유사체의 소금을 환자에게 투여하되, 인슐린 유사체 또는 인슐린 유사체의 생리학적으로 허용되는 소금은 B1-B3 잔기가 없는 단축된 B체인 폴리펩티드를 포함하는 환자의 혈당을 저감시키는 방법.
- 제10항에 있어서, 인슐린 유사체 또는 인슐린 유사체의 생리학적으로 허용되는 소금은 B체인 구간 B23-B30 내에서 적어도 하나의 다른 아미노산 치환 또는 변성을 더 포함하는 환자의 혈당을 저감시키는 방법.
- 제11항에 있어서, 인슐린 유사체 또는 인슐린 유사체의 생리학적으로 허용되는 소금은 포지션 B29에서 오르니틴 치환 및 글루타민산 치환 중에 선택되는 치환을 추가적으로 포함하는 환자의 혈당을 저감시키는 방법.
- 중간체인 des-트리펩티드[B1-B3]-des-펜타펩티드[B23-B30] 인슐린을 얻기 위해 포지션 B3에서 Arg 또는 Lys를 포함하는 폴딩된 단일 체인 또는 2체인 인슐린 관련 전구체 폴리펩티드의 트립신 소화를 포함하는 B1-B3 잔기가 없는 인슐린 유사체의 제조 방법.
- 제14항에 있어서, des-[B1-B3] 인슐린 유사체를 얻기 위해 트립신 촉매화된 반합성에 의해 B23-B30 펩티드 구간을 des-트리펩티드[B1-B3]-des-펜타펩티드[B23-B30] 인슐린에 부착하는 것을 추가적으로 포함하는 B1-B3 잔기가 없는 인슐린 유사체의 제조 방법.
- 제14항 또는 제15항에 있어서, 폴딩된 단일 체인 또는 2 체인 인슐린 관련 전구체 폴리펩티드는 SEQ ID No: 9를 포함하는 B1-B3 잔기가 없는 인슐린 유사체의 제조 방법.
- SEQ ID No: 4의 시퀀스를 포함하는 폴리펩티드.
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