JP2001517797A

JP2001517797A - サンプル中の抗体を検出する方法

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Publication number: JP2001517797A
Application number: JP2000513145A
Authority: JP
Inventors: デイビッドワイ．チェン，; フィリップアルカンジェル，; スティーブンティレル，; ワンダジーグラー，
Original assignee: カイロンコーポレイション
Priority date: 1997-09-22
Filing date: 1998-09-22
Publication date: 2001-10-09
Anticipated expiration: 2018-09-22
Also published as: DE69837155T2; EP1021719B1; ES2281934T3; CA2303123C; JP4124961B2; EP1021719A1; DE69837155D1; WO1999015898A1; CY1107621T1; DK1021719T3; ATE354800T1; AU9497998A; CA2303123A1; US6391540B1; PT1021719E

Abstract

(57)【要約】本発明は抗体、例えば単回インキュベーション工程におけるサンプル中のＣ型肝炎ウイルスに対する抗体を検出するためのアッセイに関する。このアッセイは汎用固相および／または汎用検出マーカーを使用し、そして単一試験サンプル中の同じ供給源または異なる供給源由来の抗原の検出および鑑別を容易にする。本発明は本発明による方法を実施するための試験キットを含む。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】本願は、出願番号第６０／０５９，７０３号および同第６０／０８３，９２１
号に対して米国特許法第１１９条の下で優先権の利益を主張し、それらの全体が
本明細書中で参考として援用される。

【０００２】（発明の分野）本発明は、サンプル中の抗原に対する抗体の検出／定量に関する。

【０００３】（発明の背景）抗体捕獲アッセイは一般的に、サンプル中の特定の抗原に対する抗体の検出に
使用される。このような抗体の検出は、特定の抗原に対する曝露に関する情報を
提供するだけでなく、疾患の進行に関する情報をも提供し得る。しかし、固相抗
原を利用する抗体補足アッセイは、サンプル中の実際の抗体価の測定を可能にし
ない。試験サンプル中の少なくとも２つの異なる基質の検出および／または定量
に関するアッセイが記述されている。本明細書中に参考として援用される米国特
許第５，３９５，７５２号（’７５２特許）は、試験サンプル中の少なくとも２
つの基質の検出中の使用に関する検出マーカーとして化学発光化合物を記載する
。最小の重複を伴って、異なる波長での光を発する化学発光化合物が利用される
。しかし、検出マーカー、すなわち化学発光化合物は、この試験サンプル中で検
出／定量されるべき特定の基質に特異的である。

【０００４】実際の力価の測定を容易にし、試験サンプル中の同じ供給源に対して指向され
る異なる抗体種の検出に適用し得、ならびに試験サンプル中の異なる供給源に対
する異なる抗体の検出に適用し得る試験サンプル中の抗体をアッセイする方法が
必要である。

【０００５】（発明の要旨）１つの局面において、本発明は単回インキュベーション工程におけるサンプル
中の特定の標的抗原に対する抗体の検出／定量の方法に関する。

【０００６】別の局面において、本発明は、単回インキュベーション工程において単一の検
出マーカーを使用する、単一試験サンプル中の同じ供給源由来の少なくとも２つ
の抗原に対する抗体の検出／定量の方法に関する。

【０００７】なお別の局面において、本発明は、単回インキュベーション工程において、検
出可能マーカーとして異なる波長で光を発する少なくとも２つの光試薬を使用す
る、単一試験サンプル中の同じ供給源由来の少なくとも２つの抗原に対する抗体
の検出／定量の方法に関する。

【０００８】さらなる局面において、本発明は、単回インキュベーション工程において検出
マーカーとして異なる波長で光を発する光試薬を使用する、単一試験サンプル中
の１つより多い供給源由来の抗原の検出方法に関する。さらなる局面において、
本発明は、単一の検出マーカーを使用する単一被験体由来の試験サンプル中の特
定の供給源に関する抗体プロフィールおよび実際の抗体価を測定する方法に関す
る。

【０００９】さらなる局面において、本発明は本発明による方法を実施するための試験キッ
トに関する。本発明によるキットにおいて、固相および検出マーカーは同じコン
パートメントに格納され得る。

【００１０】（詳細な説明）本発明の実施には、他に示されなければ、当業者内でウイルス学、免疫学、微
生物学、分子生物学、および組換えＤＮＡ技術の従来の方法を使用する。このよ
うな技術は、この文献中に完全に説明される。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍ
ｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ
（第２版、１９８９）；ＤＮＡＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＰｒａｃｔｉｃａｌＡ
ｐｐｒｏａｃｈ，ＩおよびＩＩ巻（Ｄ．Ｇｌｏｖｅｒ編）；ＭｅｔｈｏｄｓＩ
ｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ｓ．ＣｏｌｏｗｉｃｋａｎｄＮ．Ｋａｐｌａｎ
編，ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）；ＨａｎｄｂｏｏｋｏｆＥ
ｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｉ〜ＩＶ巻（Ｄ．Ｍ．Ｗｅｉ
ｒａｎｄＣ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ編，ＢｌａｃｋｗｅｌｌＳｃｉｅｎ
ｔｉｆｉｃＰｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ）；およびＦｕｎｄａｍｅｎｔａｌＶ
ｉｒｏｌｏｇｙ，第２版，ＩおよびＩＩ巻（Ｂ．Ｎ．ＦｉｅｌｄｓａｎｄＤ
．Ｍ．Ｋｎｉｐｅ，編）を参照のこと。

【００１１】単回インキュベーション工程中に（すなわち同時に）行われ得る、単一標的抗
原、同じ供給源由来の複数標的抗原、または単一試験サンプル中異なる供給源由
来の複数標的抗原に対する抗体の検出に関するアッセイが記載される。このアッ
セイは高処理能力自動システムで行われ得、従ってデータ繰り込みを可能にする
。本発明によるアッセイは、高い感受性（１００％）および特異性（献血者サン
プルで９９．５〜９９．７％）を示す。汎用固相および／または汎用検出マーカ
ーが使用される。

【００１２】以下の定義が本明細書中で使用される。

【００１３】本明細書中で使用する用語「標的抗原」には、単一エピトープおよび複数エピ
トープ抗原、ならびにハプテンが含まれる。

【００１４】本明細書中の標的抗原に関して使用する用語「供給源」には、ウイルス、細菌
、腫瘍、真菌、などが含まれるがこれらに限定されない。異なる供給源は、例え
ばウイルス、異なるウイルス、あるいはウイルスおよび細菌の異なるサブタイプ
であり得る。

【００１５】本明細書で使用する用語「リガンド」とは、結合パートナーをいう。好ましい
実施態様において、このリガンドはスーパーオキシドジスムターゼ（「ＳＯＤ」
）およびユビキチンである。

【００１６】本明細書で使用する用語「検出マーカー」には、発色団、酵素、その切断産物
が検出可能である酵素反応性化合物、ローダミン、ビオチン、ストレプトアビジ
ン、蛍光化合物、化学発光化合物、およびこれらのマーカーの誘導体ならびに／
または組合せがあるがこれらに限らない。提供した実施例において、化学発光化
合物ジメチルアクリジニウムエステル（ＤＭＡＥ，ＣｉｂａＣｏｒｎｉｎｇ
ＤｉａｇｎｏｓｔｉｃｓＣｏｒｐ．）を使用した。任意のマーカーを使用した
標識は、至適検出を得るためおよび抗体の結合のための条件下で実施した。

【００１７】検出マーカーを検出する手段は、使用されるマーカーに依存する。この適切な
手段および状況は当業者により容易に決定され得る。以下の実施例中に示すよう
に、アッセイ中ＤＭＡＥが検出マーカーである場合、得られる抗リガンドＤＭＡ
Ｅ結合体は、ＮａＯＨ／Ｈ₂Ｏ₂と反応した場合発光により検出可能なＤＭＡＥを
備えるトレーサーである。２つ以上の光試薬を含むアッセイにおいて、少なくと
も２つの光電子増倍管は測定結果を得るために利用されねばならない。

【００１８】個々の抗原の検出マーカーでの標識は、非常に退屈であり得、さらに得られる
標識は安定でないかもしれない。本発明は、汎用検出マーカーを提供する。本発
明において、この抗原はリガンド、例えば抗原／リガンド融合タンパク質と結合
している。この融合タンパク質は、このリガンドに対して指向される抗体を含む
検出マーカーと対合する。このリガンドに対して指向される抗体はこの検出マー
カーと結合している。多くの異なる抗原は、同じリガンドに融合し得る。この様
式において、多くの抗原は、単一の汎用マーカーで検出され得る。

【００１９】本明細書中に使用される用語「被験体」とは、この試験サンプルの供給源をい
い、そしてヒトおよび他の脊椎動物を含むがこれらに限定されない。好ましい実
施態様において、被験体はヒトである。本明細書で使用される用語「試験サンプ
ル」とは、この標的抗原に対する抗体が存在し得る被験体由来の任意の生物学的
液体をいい、血清および血漿を含むがこれらに限定されない。

【００２０】「抗被験体免疫グロブリン抗体」とは一般に、この被験体由来の免疫グロブリ
ンに対して指向される抗体をいう。好ましい実施態様において、抗被験体免疫グ
ロブリン抗体は、ラット抗ヒト免疫グロブリン（Ｉｇ）である。より好ましい実
施態様において、抗被験体ヒト抗体はラット抗ヒトＩｇＧである。従って、この
抗被験体免疫グロブリン抗体は、試験サンプル中抗体を検出／定量するための汎
用固相を提供する固相と結合している。

【００２１】この固相は、常磁性微粒子（「ＰＭＰ」）、磁性ラテックス微粒子（「ＭＬＰ
」）、またはマイクロタイタープレートであり得る。好ましくはこの微粒子は、
直径約１０μｍ未満である。

【００２２】本発明に従う試験キットはまた、標準物質または対照を含む。上述のとおり、
好ましい実施態様において、この標的抗原は、融合タンパク質としてそのリガン
ドと結合している。例えば、この抗原は、ｃ１００−３（ＮＳ４，３６３ａａ）
Ｃ型肝炎ウイルス抗原の生成について以前に記載した方法を使用するヒトＳＯＤ
とのＣ末端融合のように、酵母Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ内での内部の抗原とし
て発現され得る。Ｋｕｏら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９８９，２４４，３６２−３６
４、その全体が本明細書中で参考として援用される；およびＣｏｕｓｅｎｓら，
Ｇｅｎｅ，１９８７，６１，２６５−２７５、その全体が本明細書中で参考とし
て援用される。このｃ３３ｃ抗原（ＮＳ３，３６３アミノ酸）はまた、５−１−
１抗原の合成について記載される方法によりＥ．ｃｏｌｉ中に、内部ＳＯＤ融合
ポリペプチドとして発現した。Ｃｈｏｏら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９８９，２４４
．３５９−３６２、その全体が本明細書中で参考として援用される。この組換え
ＨＣＶ抗原は、Ｃｈｉｅｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ
，１９８９，８９，１００１１−１００１５に記載されるとおり精製した。以下
に詳述した特定の実施例において、全ての抗原はＳＯＤ融合タンパク質として調
製した。しかし他の適切な融合タンパク質は、融合パートナーリガンドを認識す
る適切な抗体の入手可能性に依存して作製され得る。

【００２３】ＭＥＦＡ−６は複数エピトープ抗原であり、そしてＣ型肝炎ポリタンパク質の
コア、エンベロープ、ＮＳ３、ＮＳ４、およびＮＳ５領域由来のエピトープを含
み、１、２、および３型のＨＣＶ株由来の等価な抗原決定基を含む。ＨＣＶエピ
トープをコードする多様なＤＮＡセグメントは、ＰＣＲ増幅によるか、または合
成オリゴヌクレオチドにより構築した。ＭＥＦＡ−６抗原は、このコアおよびＮ
Ｓ５領域由来のＨＣＶエピトープの複数コピー；ＮＳ４５−１−１領域由来の
異なる血清型エピトープ；ｃ１００Ｃ末端領域、Ｅ１、およびＥ２領域、ならび
にＨＣＶＮＳ３（ｃ３３ｃ）領域由来の主要な線状エピトープの単一のコピー
を含む。ＭＥＦＡ−６融合タンパク質の一般的な構造式は、ｈＳＯＤ−Ｅ１−Ｅ
２−ｃ３３ｃ−５−１−１（１型）−５−５−１（３型）−５−１−１（２型）
−ｃ１００−ＮＳ５（２コピー）−コア（２コピー）である。この抗原は、酵母
中で非常に高い発現レベルを有し、高程度の均質性まで精製し、そして以下に記
載のイムノアッセイにおいて高い感受性および高い選択性を示す。ＭＥＦＡ−６
は、本明細書中にその全体が参考として援用される１９９７年５月２３日に出願
したＰＣＴ出願ＵＳ９７／０８９５０に記載されるとおり調整した。

【００２４】抗ＳＯＤ−ＤＭＡＥは汎用検出マーカーとして使用された。抗ＳＯＤ抗体はＤ
ＭＡＥに共有結合した反応部分を有するアミノ酸側鎖（例えば、リジンε側鎖ま
たはシステインチオール）の反応によりＤＭＡＥで標識した（その全体が本明細
書中に参考として援用される１９９５年１０月１９日に公開したＷＯ９５／２７
７０２，ＣｉｂａＣｏｒｎｉｎｇＤｉａｇｎｏｓｔｉｃｓＣｏｒｐを参照
のこと）。アミノ酸側鎖のチオールは、ＤＭＡＥ−ＥＤ−ＭＣＣまたはＮＳＰ−
ＤＭＡＥ−ＰＥＧ−ＢｒＡｃ（ＣｉｂａＣｏｒｎｉｎｇ）を使用して標識され
得る。標識手順は一般的に、本明細書中に参考として援用されるＷＯ９５／２７
７０２に記載されるとおりであり、最適な検出および抗原性を提供するために各
抗原について必要な場合、条件において変更を伴う。

【００２５】感受性は光学密度ユニット（ｓ／ｃｏ）においてカットオフされたアッセイ検
出により分割されたアッセイサンプルの光学密度として報告された。全ての公知
のネガティブサンプルは１未満のｓ／ｃｏ値を示した。

【００２６】

【実施例】

（実施例１：手動アッセイ）ＭａｇｉｃＬｉｔｅＡｎａｌｙｚｅｒＳｙｓｔｅｍＩＩ（ＭＬＡＩＩ）
を手動アッセイに使用する。容積、濃度、時間、および温度のようなパラメータ
ーをガイダンスのために提供するが、適宜調製し得る。簡単には、試験サンプル
の１０μｌアリコートを、ＨＣＶについての抗体プロフィールを得るための５つ
の別々の７５×１２ｍｍ試験管に添加した。各試験管に、１００μｌのサンプル
希釈液または緩衝液、ラット抗ヒトＩｇＧ抗体と結合した常磁性微粒子（ＰＭＰ
）（ＰＭＰ／抗ヒトＩｇＧ，３０μｇ／アッセイ）を含む１００μｌの固相緩衝
液、５０μｌＨＣＶ抗原／ＳＯＤ融合タンパク質（コア（ｃ２２−３，５０ｎｇ
），ＮＳ３（ｃ３３ｃ，１００ｎｇ），ＮＳ４（ｃ−１００−３１００ｎｇ）
，ＮＳ４（５−１−１１００ｎｇ），およびＮＳ５（１００ｎｇ））、ならび
にリガンド試薬（ＬＲ）希釈液中にＤＭＡＥ（３千万の相対光単位「ＲＬＵ」）
と結合した１００μｌ抗ＳＯＤを添加し、そして３７℃で１８分間インキュベー
トした。この固相／光試薬希釈緩衝液は、５０ｍＭＴｒｉｓ、０．５ＭＫＣｌ
、１ｍＭＥＤＴＡ二ナトリウム、３．７５％ＢＳＡ、０．００３％酵母、
０．０５ｇ／ＬＥ．ｃｏｌｉ抽出物、０．５％Ｔｗｅｅｎ−２０、２ｍｇ／
ＬアンホテリシンＢ、２４ｍｇ／Ｌ硫酸ゲンタマイシン、３０μｇ／試験固
相および４５×１０⁶試験光試薬（抗ＳＯＤ^*ＤＭＡＥ抗体）を含んだ。補助的な
希釈緩衝液は、５０ｍＭＴｒｉｓ、０．５ＭＫＣｌ、１ｍＭＥＤＴＡ二ナト
リウム、３．７５％ＢＳＡ、０．００３％酵母、０．０５ｇ／ＬＥ．ｃｏ
ｌｉ抽出物、０．５％Ｔｗｅｅｎ−２０、２ｍｇ／ＬアンホテリシンＢ、２
４ｍｇ／Ｌ硫酸ゲンタマイシン、０．０５ｇ／Ｌ腹水ＩｇＧ１および０．１
ｇ／Ｌ腹水ＩｇＧ２Ａ（ブロッキング抗体）を含んだ。洗浄試薬はＰＢＳ／Ｔ
ｗｅｅｎ−２０を含んだ。酸性試薬は、０．５％Ｈ₂Ｏ₂／０．１ＮＨＮＯ₃ を含む。塩基性試薬は界面活性剤を有する＜０．２５ＮＮａＯＨを含む。

【００２７】この試験管を、そのＰＭＰ粒子を沈降するに充分な時間、磁石上に静置した。
このサンプルを、そのＰＭＰ粒子を保持するために磁石を使用してデカンテーシ
ョンした。このＰＭＰ粒子を１ｍｌのＰＢＳ中でボルテックスしながら２回洗浄
した。この洗浄溶液は、ＰＢＳ、０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０、０．０９％Ｎ
ａＮ₃、および１ｍＭＥＤＴＡであった。混合、インキュベート、沈降、およびデカンテーションの工程を、少なくとも１回繰り返し得る。各試験管に、１０
０μｌの水を添加しＰＭＰ粒子を再懸濁した。次にこの試験管をＭＬＡ−ＩＩ器
具中に置き、そして２秒間発光を測定した。

【００２８】慢性の有償提供者サンプルを使用する結果を表１中に示した。

【００２９】（実施例２：自動アッセイと他の商業的なアッセイとの比較）上述の手動抗ＨＣＶアッセイを、ＡＣＳ：Ｃｅｎｔａｕｒ装置を使用する自動
使用について適用した。以下の手順を使用した。簡単には、このＡＣＳ：Ｃｅｎ
ｔａｕｒシステムは自動的に以下の工程を行う：システム作業指示書中に、また
はオンラインヘルプシステム中に記述されるとおり、１）１０μｌのサンプルを
キュベットに施す；２）１００μｌの補助的な希釈緩衝液、１００μｌの光試薬
／固相、５０μｌの抗原試薬２（例えば、ＭＥＦＡ−６）、５０μｌの抗原試薬
１（例えば、ｃ３３ｃ）を施し、そしてこの混合物を３７℃で１８分間インキュ
ベートする；３）この固相を混合物から分離し、そして結合していない試薬を吸
引する；４）キュベットを洗浄試薬１で洗浄する；５）各々３００μｌの酸性試
薬および塩基性試薬を施して、化学発光反応を開始する；そして６）選択による
結果を報告する。

【００３０】この固相／光試薬希釈緩衝液は、５０ｍＭＴｒｉｓ、０．５ＭＫＣｌ、１
ｍＭＥＤＴＡ二ナトリウム、３．７５％ＢＳＡ、０．００３％酵母、０．
０５ｇ／ＬＥ．ｃｏｌｉ抽出物、０．５％Ｔｗｅｅｎ−２０、２ｍｇ／Ｌ
アンホテリシンＢ、２４ｍｇ／Ｌ硫酸ゲンタマイシン、３０μｇ／試験固相、
および４５×１０⁶試験光試薬（抗ＳＯＤ^*ＤＭＡＥ抗体）を含んだ。この補助的
な希釈緩衝液は、５０ｍＭＴｒｉｓ、０．５ＭＫＣｌ、１ｍＭＥＤＴＡ二
ナトリウム、３．７５％ＢＳＡ、０．００３％酵母、０．０５ｇ／ＬＥ．
ｃｏｌｉ、０．５％Ｔｗｅｅｎ−２０、２ｍｇ／ＬアンホテリシンＢ、２４
ｍｇ／Ｌ硫酸ゲンタマイシン、０．０５ｇ／Ｌ腹水ＩｇＧ１および０．１ｇ
／Ｌ腹水ＩｇＧ２Ａ（ブロッキング抗体）を含有した。洗浄試薬はＰＢＳ／Ｔ
ｗｅｅｎ−２０を含んだ。酸性試薬は０．５％Ｈ₂Ｏ₂／０．１ＮＨＮＯ₃を含む。塩基性試薬は界面活性剤を有する＜０．２５ＮＮａＯＨを含む。

【００３１】結果を市販のセロコンバージョンパネルを使用するＯｒｔｈｏ３．０、Ａｂｂ
ｏｔｔ３．０、およびＲＩＢＡ（登録商標）３．０アッセイと比較した。そして
この結果を表ＩＩに示す。Ｏｒｔｈｏ、Ａｂｂｏｔｔ、およびＲＩＢＡ（登録商
標）アッセイの結果は、以下のセロコンバージョンパネルについてのこれらの販
売者により提供される；ＢＢＩ（ＢＢＩ）とは、ＢｏｓｔｏｎＢｉｏｍｅｄｉ
ｃａＩｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄをいい、そしてＢＣＰとはＢｉｏＣｌｉｎｉｃ
ａｌＰａｒｔｎｅｒｓをいう。ＰＨＶはそのパネル名を命名する接頭辞である
。ロット番号１〜４とは、ディッツ（ｄｉｔｓ）由来の試薬（試薬コンパートメ
ントおよび固相）複数ロットをいう。

【００３２】この結果から明らかであるように、本発明によるアッセイは、Ｏｒｔｈｏ３．
０、およびＡｂｂｏｔｔ３．０よりも何回かの採決回数分抗体の検出を可能にし
た。早いＲＩＢＡ（登録商標）アッセイは、ＨＣＶ発明を確認する。

【００３３】（実施例３：自動アッセイの感受性）本発明のによるアッセイの感受性は、Ｏｒｔｈｏ３．０アッセイにおいて陽性
とスクリーニングされた５１０人の患者の試験集団において確かめた。アッセイ
条件は上述のとおりであった。試験の結果を表ＩＩＩに示す。表中で、「ＩＶＤ
Ａ」とはＩＶ薬物乱用をいい、「ＳＴＤ」とは性行為感染症をいい、「Ｎ」とは
試験した各グループのサンプル数をいい、ならびに「ＲＲ」とは繰り返し反応性
を言う。このアッセイにおいて初期に反応性（陽性）であるサンプルを再試験し
た；このサンプルが繰り返し試験の上で反応性（陽性）である場合、「繰り返し
反応性」とみなす。

【００３４】表ＩＩＩから解るとおり、ＲＩＢＡ（登録商標）３．０アッセイにおいてＨＣ
Ｖについて陽性であると試験された全てのサンプルは、本発明に従うアッセイを
使用して繰り返し陽性であった。

【００３５】（実施例４：単一サンプル中の複数ウイルスについてのアッセイ）アッセイ条件は、異なるリガンドおよび異なる光試薬を各抗原について使用す
ることを除いて、上述の実施例３に記載のとおりである。ＭＥＦＡ−６−ＳＯＤ
は抗−ＳＯＤ−ＤＭＡＥを用いて使用および検出する；ｃ３３ｃユビキチンは抗
ユビキチン−ＬＥＡＥ（長い波長を発するアクリジニウムエステル）を用いて使
用および検出する。

【００３６】上述の実施例は、本発明を例示することを意味し、そしていかなる場合におい
ても本発明を限定すると解釈されない。当業者は、本発明の精神と範囲内である
修飾を認める。本明細書中に引用した全ての参考文献はその全体が参考として援
用される。

【００３７】

【表１】

【００３８】

【表２】

【００３９】

【表３】

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、本発明に従う例示のアッセイフォーマットを示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ) ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者ティレル，スティーブンアメリカ合衆国マサチューセッツ 02038，フランクリン，プロスペクトストリート 287 (72)発明者ジーグラー，ワンダアメリカ合衆国マサチューセッツ 02032，メドウェイ，ウィントープストリート５エイ

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】被験体由来の試験サンプル中の標的抗原に対する抗体を検出
／定量する方法であって、該方法は以下：ａ）該試験サンプルを、ｉ）固相抗被験体免疫グロブリン抗体、ｉｉ）リガン
ドに結合した該標的抗原、およびｉｉｉ）検出マーカーに結合した抗リガンド抗
体と同時にインキュベートして、ｉｖ）該被験体由来の該試験サンプル中の抗標
的抗原抗体と、ｉ）該固相抗被験体免疫グロブリン抗体と、ｉｉ）リガンドに結
合した該標的抗原と、ｉｉｉ）検出マーカーに結合した該抗リガンド抗体との間
の反応を行う工程；ならびにｂ）該検出マーカーを適切な手段により検出する工程、を包含する、方法。
【請求項２】前記標的抗原がＣ型肝炎ウイルスの少なくとも１つのエピト
ープである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】前記標的抗原がＣ型肝炎ウイルスの少なくとも２つのエピト
ープを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】前記標的抗原がＣ型肝炎ウイルス由来のＮＳ３抗原である、
請求項２に記載の方法。
【請求項５】前記リガンドがＳＯＤである、請求項３または４に記載の方
法。
【請求項６】前記検出マーカーが化学発光試薬である、請求項３または４
に記載の方法。
【請求項７】前記化学発光試薬がアクリジニウムエステルである、請求項
６に記載の方法。
【請求項８】リガンドに結合した前記標的抗原が融合タンパク質である、
請求項１に記載の方法。
【請求項９】被験体由来の試験サンプル中の２つ以上の標的抗原に対する
抗体を検出／定量する方法であって、ここで該標的抗原は同じ供給源由来であり
、該方法は以下：ａ）該試験サンプルを、ｉ）固相抗被験体免疫グロブリン抗体、ｉｉ（ａ）リ
ガンドに結合した第１標的抗原、ｉｉ（ｂ）該リガンドに結合した少なくとも第
２標的抗原、およびｉｉｉ）検出マーカーに結合した抗リガンド抗体と同時にイ
ンキュベートして、ｉｖ）該被験体由来の該試験サンプル中の抗第１標的抗原抗
体、ｉ）該固相抗被験体免疫グロブリン抗体と、ｉｉ（ａ）リガンドに結合した
該第１標的抗原と、ｉｉｉ）検出マーカーに結合した該抗リガンド抗体との間、
ならびにｖ）該被験体由来の試験サンプル中の抗第２標的抗原抗体と、ｉ）該固
相抗被験体免疫グロブリン抗体と、ｉｉ（ｂ）該リガンドに結合した該少なくと
も第２標的抗原と、ｉｉｉ（ａ）検出マーカーに結合した該抗リガンド抗体との
間の反応を行う工程；ならびにｂ）該検出マーカーを適切な手段により検出する工程、を包含する、方法。
【請求項１０】前記供給源がＣ型肝炎ウイルスである、請求項９に記載の
方法。
【請求項１１】前記第１標的抗原がＣ型肝炎ウイルス由来のＮＳ３抗原で
ある、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】前記少なくとも第２標的抗原がＣ型肝炎ウイルス由来のコ
ア抗原である、請求項９に記載の方法。
【請求項１３】前記リガンドがＳＯＤである、請求項１１または１２に記
載の方法。
【請求項１４】前記検出マーカーが化学発光試薬である、請求項１１また
は１２に記載の方法。
【請求項１５】前記化学発光試薬がアクリジニウムエステルである、請求
項１４に記載の方法。
【請求項１６】リガンドに結合した前記標的抗原が融合タンパク質である
、請求項１０に記載の方法。
【請求項１７】被験体由来の試験サンプル中の２つ以上の標的抗原に対す
る抗体を検出／定量する方法であって、ここで該標的抗原は異なる供給源由来で
あり、該方法は以下：ａ）該試験サンプルを、ｉ）固相抗被験体免疫グロブリン抗体、ｉｉ（ａ）第
１リガンドに結合した第１標的抗原、ｉｉ（ｂ）第２リガンドに結合した少なく
とも第２標的抗原、ｉｉｉ）第１光試薬に結合した抗第１リガンド抗体、および
ｉｉｉ（ａ）第２光試薬に結合した少なくとも抗第２リガンド抗体と同時にイン
キュベートして、ｉｖ）該被験体由来の該試験サンプル中の抗第１標的抗原抗体
と、ｉ）該固相抗被験体免疫グロブリン抗体と、ｉｉ（ａ）第１リガンドに結合
した該第１標的抗原と、ｉｉｉ）第１光試薬に結合した抗第１リガンド抗体との
間、ならびにｖ）該被験体由来の該試験サンプル中の抗第２標的抗原抗体と、ｉ
）該固相抗被験体免疫グロブリン抗体と、ｉｉ（ｂ）第２リガンドに結合した該
少なくとも第２標的抗原と、ｉｉｉ（ａ）第２光試薬に結合した該抗第２リガン
ド抗体との間の反応を行う工程であって、ここで該第１および少なくとも該第２
光試薬は検出可能な異なる波長の光を発する、工程；ならびにｂ）各々の該光試薬の発光シグナルを検出する工程、を包含する、方法。
【請求項１８】前記異なる供給源が同じウイルスのサブタイプである、請
求項１７に記載の方法。
【請求項１９】前記異なる供給源が異なるウイルスである、請求項１７に
記載の方法。
【請求項２０】前記第１リガンドがＳＯＤである、請求項１７に記載の方
法。
【請求項２１】前記第２リガンドがユビキチンである、請求項１７に記載
の方法。
【請求項２２】前記化学発光試薬がアクリジニウムエステルである、請求
項１７に記載の方法。
【請求項２３】リガンドに結合する前記標的抗原が融合タンパク質である
、請求項１７に記載の方法。
【請求項２４】単回インキュベーション工程における試験サンプル中の１
つ以上の標的抗原に関する抗体の検出用のための試験キットであって、ここで該
標的抗原は同一供給源由来であり、該試験キットは、固相抗被験体免疫グロブリ
ン抗体、第１リガンドに結合した少なくとも第１標的抗原、検出マーカーに結合
した抗第１リガンド抗体、および該検出マーカーの検出手段を備える、キット。
【請求項２５】該リガンドがＳＯＤである、請求項２４に記載の試験キッ
ト。
【請求項２６】該検出マーカーが化学発光試薬である、請求項２４に記載
の試験キット。
【請求項２７】該検出マーカーがアクリジニウムエステルである、請求項
２４に記載の試験キット。
【請求項２８】前記固相抗被験体免疫グロブリン抗体および検出マーカー
が同じコンパートメント中に格納される、請求項２４に記載の試験キット。
【請求項２９】前記第１リガンドに結合する第２標的抗原をさらに含む、
請求項２４に記載の試験キット。
【請求項３０】単回インキュベーション工程における試験サンプル中の２
つ以上の標的抗原に関する抗体の検出用の試験キットであって、ここで該標的抗
原は異なる供給源由来であり、該試験キットは、固相抗被験体免疫グロブリン抗体、第１リガンドに結合した第１標的抗原、第２リガンドに結合した少なくとも第２標的抗原、第１光試薬に結合する抗第１リガンド抗体、第２光試薬に結合する少なくとも抗第２リガンド抗体であって、該第１および
少なくとも該第２光試薬は検出可能な異なる波長の発光シグナルを発する、抗体
ならびに、各々の該光試薬の発光シグナルの検出のための手段を包含する、キット。
【請求項３１】前記検出マーカーが化学発光試薬である請求項３０に記載
の試験キット。
【請求項３２】前記検出マーカーがアクリジニウムエステルである、請求
項３０に記載の試験キット。
【請求項３３】前記第１リガンドがＳＯＤである、請求項３０に記載の試
験キット。
【請求項３４】前記第２リガンドがＣＰＫである、請求項３０に記載の試
験キット。
【請求項３５】前記固相抗被験体免疫グロブリン抗体および検出マーカー
が同じコンパートメント中に格納される、請求項３０に記載の試験キット。