JP2001136970A

JP2001136970A - 粒子担体を使用する改良された核酸の抽出方法

Info

Publication number: JP2001136970A
Application number: JP32312299A
Authority: JP
Inventors: Satoko Yoshiga; 聡子吉賀; Shigeru Komai; 茂駒井; Katsuya Daimon; 克哉大門
Original assignee: Toyobo Co Ltd
Current assignee: Toyobo Co Ltd
Priority date: 1999-11-12
Filing date: 1999-11-12
Publication date: 2001-05-22
Anticipated expiration: 2019-11-12
Also published as: JP4214255B2

Abstract

(57)【要約】【課題】核酸を含有すると考えられる材料から核酸を抽
出および単離する際に、臨床検体のような多量の夾雑物
質を含む試料から、効率よく核酸を抽出する方法を提供
する。【解決手段】核酸を含有すると考えられる材料から核酸
を抽出および単離するための方法であって、以下の工程
（ａ）〜（ｄ）を含むことを特徴とする核酸の抽出方
法。（ａ）核酸を含むと考えられる材料を水不溶性のフィル
タに通過させる工程（ｂ）核酸を含むと考えられる材料、核酸を吸着できる
核酸結合性磁性粒子担体、および核酸を該担体に吸着さ
せるための核酸抽出溶液とを混合する工程（ｃ）核酸以外のものを核酸と粒子担体との複合体を洗
浄することにより除去する工程（ｄ）核酸と担体との複合体より核酸を溶出して回収す
る工程

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、粒子担体を使用し
て核酸を含有すると考えられる材料から核酸を抽出し単
離する方法に関する。より詳細には、核酸を含むと考え
られる材料を水不溶性のフィルタに通過させる工程を介
することにより、改良された核酸の抽出方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】近年の遺伝子工学や分子生物学等の分野
の進歩により、感染症や遺伝子疾患等について、ＤＮＡ
／ＲＮＡレベルで解析することが可能になった。特に、
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ法；Science 230,p1350
-1354 (1985））や、核酸配列に基づく増幅法（以下、
ＮＡＳＢＡ法という；Nature 350,p91-92(1991)、特許
第２６４８８０２号公報及び特許第２６５０１５９号公
報）等に代表される核酸増幅方法の発明により、従来で
あれば検出が非常に困難であった極微量の核酸の検出が
可能となり、遺伝子解析が飛躍的に容易なものとなっ
た。ただし、生物試料中の核酸を、必要であれば増幅
し、検出するためには、試料中の核酸を選択的に取り出
す必要がある。これは、通常の生物試料中には核酸以外
の夾雑物質、例えば、タンパク質、脂質、糖類などが大
量に含まれており、これらが増幅や検出に悪影響を及ぼ
す可能性が少なくない。そのため、予め試料中の夾雑物
質を除き、核酸を抽出し単離する操作が必要となる。

【０００３】このような核酸の単離方法は古くから様々
な手法で行われてきた。代表的なものとして、フェノー
ル／クロロホルム抽出法（Biochimica et Biophysica a
cta72, p619-629(1963)）、アルカリＳＤＳ法（Nucleic
Acids Research 7,p1513-1523 (1979)）等の液相で行
う方法がある。これらは実験室スケールで汎用される
が、有害で廃棄の困難なフェノールやクロロホルムのよ
うな有機溶剤の他、危険物である水酸化ナトリウムなど
を使用するため、技術的には熟練を要し、再現性良く実
施することは容易でない。

【０００４】また、核酸の単離に核酸結合用担体を用い
る系としては、ガラス粒子とヨウ化ナトリウム溶液を使
用する方法（Proc. Natl. Acad. Sci.USA 76-2,p615-6
19 (1979））、ハイドロキシアパタイトを用いる方法
（特開昭６３−２６３０９３号公報）等がある。これら
の方法は有害な有機溶剤等は使用しないものの、工程中
に遠心分離操作を多く含むため、多数の試料を一度に処
理することが困難で、核酸を単離するのに長時間かかる
という問題を含んでいる。

【０００５】従って、上記の核酸単離方法は有機溶剤や
アルカリなどの危険な試薬を使用すること、遠心分離操
作を必要とし、多数検体の処理が難しいことなどの難点
がある。そしてさらに、抽出および単離工程の自動機械
化に際し大きな問題が生じる。多数の検体を再現性良く
処理し、更に人的コストを低減させるためには、核酸抽
出および単離法の自動化は今後不可欠になる。

【０００６】この自動機械化を目指したものとして、シ
リカ粒子とカオトロピックイオンを用いた方法（J.Clin
ical Microbiology 28-3, p495-503(1990)、特開平２
−２８９５９６号公報）がある。これは、核酸結合性の
シリカ粒子と、試料中の核酸を遊離する能力を有するカ
オトロピックイオンとを試料と混合し、核酸をシリカ粒
子に結合させ、夾雑物質を洗浄により除去した後、シリ
カ粒子に結合した核酸を回収するものである。この方法
はＤＮＡに加えてより不安定であるＲＮＡの抽出にも好
適であり、また純度の高い核酸が得られるという点で非
常に優れている。ただしこの核酸が結合した粒子の洗浄
については遠心分離またはフィルターなどを使用した濾
過などを行う必要があり、機械化の際に工程が複雑とな
る恐れが高い。

【０００７】従って、シリカ粒子を容易に混合・洗浄す
るために、粒子に磁性を持たせ、磁気により混合および
撹拌する方法（特開平９−１９２９２号公報）が報告さ
れている。この方法は、核酸を磁性シリカ粒子に結合さ
せ、以下洗浄後回収するもので、機械化の際の工程はよ
り簡便になる。ただし、単に磁性を持たせた粒子を使用
するだけでは、検体中の夾雑物質の影響などを受け、回
収効率が低下する現象が多くみられる。その理由として
は、粒子の周囲に核酸を吸着させ、不要物を洗浄して除
去した後核酸を回収する方法において、夾雑物質が非常
に多い場合にはそれが粒子表面を覆ってしまい、核酸の
吸着効率が低下するためと推定されている。この問題を
解決するために、表面積のより大きい粒子担体を使用す
る方法（特願平１０−６５６６２号）や予め粒子担体を
界面活性剤で懸濁することにより夾雑物質の吸着を抑え
る方法（特願平９−３５１１０２号）が考案されてい
る。しかしながら、血液検体特に全血検体のような極め
て夾雑物質が多い試料については、現状では十分な抽出
量を得ることができず、磁性粒子の形状を最適化するだ
けでは試料中の目的核酸の有無を判定するのが困難であ
った。そこで、これらの問題点を克服した方法が必要と
されている。

【０００８】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、上記の問題
点を解決するためになされたものであり、核酸を含有す
ると考えられる材料から核酸を抽出および単離する際
に、臨床検体のような多量の夾雑物質を含む試料から、
効率よく核酸を抽出する方法を提供する。

【０００９】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、これらの
課題を解決するべく鋭意研究を進めた結果、粒子担体を
使用し生物材料から核酸を抽出し単離する際、臨床検体
のような多量の共雑物質を含む試料から効率よく核酸を
抽出するためには、抽出前の処理として水不溶性のフィ
ルタに通過させる工程を実施することが有効であること
を見出し、本発明に到達した。すなわち、本発明は以下
のような構成からなる。（１）核酸を含有すると考えられる材料から核酸を抽出
および単離するための方法であって、以下の工程（ａ）
〜（ｄ）を含むことを特徴とする核酸の抽出方法。（ａ）核酸を含有すると考えられる材料を水不溶性のフ
ィルタに通過させる工程（ｂ）核酸を含有すると考えられる材料、核酸を吸着で
きる核酸結合性磁性粒子担体、および核酸を該担体に吸
着させるための核酸抽出溶液とを混合する工程（ｃ）核酸以外のものを核酸と粒子担体との複合体を洗
浄することにより除去する工程（ｄ）核酸と担体との複合体より核酸を溶出して回収す
る工程（２）該核酸がＤＮＡおよび／またはＲＮＡである
（１）の核酸の抽出方法。（３）該核酸を含有すると考えられる材料が生物材料で
ある（１）の核酸の抽出方法。（４）該生物材料が、血液、組織、尿、喀痰よりなる群
から選ばれたいずれかである（３）の核酸の抽出方法。（５）該核酸抽出溶液がカオトロピック物質を含有する
（１）の核酸の抽出方法。（６）該カオトロピック物質が、グアニジン塩、ヨウ化
カリウム、ヨウ化ナトリウム、（イソ）チオシアン酸塩
および尿素よりなる群から選択される少なくとも１種を
含むものでなる（５）の核酸の抽出方法。（７）該カオトロピック物質が、グアニジン（イソ）チ
オシアン酸塩および／またはグアニジン塩酸塩である
（６）の核酸の抽出方法。（８）工程（ｃ）において用いられる洗浄液が、カオト
ロピック物質を含む第一の洗浄液およびアルコールを含
む第二の洗浄液を使用する（１）の核酸の抽出方法。（９）グアニジンチオシアン酸塩、グアニジン塩酸塩お
よびチオシアン酸ナトリウム塩よりなる群から選択され
る少なくとも１種を含有する第一の洗浄液を使用する
（８）の核酸の抽出方法。（１０）４０〜１００％濃度のアルコールを含有する第
二の洗浄液を使用する請求項８記載の核酸の抽出方法。（１１）４０〜１００％濃度のエタノールを含有する第
二の洗浄液および６０〜１００％濃度のエタノールを含
有する第三の洗浄液を使用する（８）の核酸の抽出方
法。

【００１０】

【発明の実施の形態】次に本発明において使用する言葉
を定義し、その測定法を説明する。本発明において水不
溶性のフィルタとは、試料を通過させる際に不純物を内
部又は表面に保持するかまたは通過の際に以後の操作に
影響を及ぼさない程度に物理的な切断または破砕する性
質を有するものであれば特に限定はされない。素材に関
しても、一般的にこの分野において用いられるものであ
れば、特に限定されるものではない。このような性質を
有するフィルタとしては、具体的には、例えばすでに市
販されているQIAGEN社製の各種核酸精製用フィルタなど
が挙げられる。

【００１１】本発明において用いられる粒子担体は特に
限定されないが、磁性シリカ粒子であることが特に好ま
しい。該磁性シリカ粒子は以下のような構造を有してい
る。すなわち、下記超常磁性金属酸化物の表面がシリカ
で被覆されており、そして、さらに微小なシリカ粒子で
構成される無機多孔性壁物質で複合されている。この磁
性シリカ粒子はほぼ完全な球状である。核酸と該磁性シ
リカ粒子とは、シリカ表面の水酸基と核酸の塩基との間
で生じる水素結合により結合される。

【００１２】超常磁性金属酸化物とは、磁場変化度に応
答するが、永久磁化はされず、残留磁化が小さい金属酸
化物をいう。好ましい超常磁性金属酸化物としては、酸
化鉄が挙げられる。この酸化鉄としては、四三酸化鉄
（Ｆｅ₃Ｏ₄）および四三酸化鉄を徐々に酸化して得られ
るｒ型三二酸化鉄（ｒＦｅ₂Ｏ₃）などが用いられる。こ
の四三酸化鉄は残留磁気が小さく、さらに好ましい表面
構造を有するため、磁気分離および再分散のサイクルを
反復することが可能である。四三酸化鉄を含有する磁性
シリカ粒子は、弱酸性の水溶液中で安定であり、２年以
上も貯蔵可能である。

【００１３】上記磁性シリカ粒子中に含まれる超常磁性
漢族酸化物の重量は、磁極の強さにもよるが、１０〜６
０重量％が好ましく、さらに好ましくは２０〜４０重量
％である。この好ましい範囲内では、磁性担体は市販の
磁石を用いる場合に、特に迅速に分離できる。なお、シ
リカとは、ＳｉＯ₂結晶および他の形態の酸化ケイ素、
ＳｉＯ₂から構成されるケイソウ植物の骨格ならびに無
定型酸化ケイ素を含む。

【００１４】本発明に用いる磁性シリカ粒子は下記性質
を有するものが最も好ましい。（１）担体は、超常磁性酸化鉄を含む磁性シリカ粒子で
ある。（２）磁性シリカ粒子の外部表面積は少なくとも１０ｍ
²／ｇである。（３）磁性シリカ粒子は、その表面がシリカで被覆され
ている超常磁性金属酸化物を微小なシリカ粒子で構成さ
れる無機多孔性壁物質で複合してなる。（４）超常磁性酸化鉄の重量は１０〜６０重量％であ
る。（５）磁性シリカ粒子の比表面積は１０〜８００ｍ²／
ｇである。（６）磁性シリカ粒子の表面細孔直径は５０〜５００ｎ
ｍである。（７）磁性シリカ粒子の細孔容積は２００〜５０００ｍ
ｍ³／ｇである。（８）磁性シリカ粒子の粒子径は０．５〜１５．０μｍ
である。

【００１５】上記のような磁性シリカ粒子は、例えば特
開平６−４７２７３号公報の記載の方法により製造され
得る。例えば、四三酸化鉄をテトラエトキシシランのア
ルコ−ル溶液に添加し、超音波分散機により分散湿潤さ
せる。これにテトラエトキシシランの加水分解触媒を加
え、超音波分散させながら、四三酸化鉄の表面にシリカ
を沈着させる。このようにして得られた分散液に、ケイ
素ナトリウムを加え、有機溶媒おび界面活性剤（ソルビ
タンモノステアレ−トのトルエン溶液）を加えて乳化
し、Ｗ／Ｏ型エマルジョンを形成させる。この乳濁液を
硫酸アンモニウム水溶液に添加し、十分攪拌させるその
後、濾過分離、水洗、アルコ−ル沈殿を行い、乾燥させ
ることにより、所望の球状シリカ粒子が得られる。

【００１６】本発明における核酸抽出溶液とは、生物試
料中の核酸を含む細胞などを破壊し、核酸を露出させ、
そして、この核酸を磁性シリカ粒子に結合させる働きを
持つ溶液である。このような溶液としては、好ましく
は、カオトロピック物質のようなシリカ粒子表面の疎水
性を高める物質が選択される。さらに好ましくは、グア
ニジン（イソ）チオシアン酸塩および／またはグアニジ
ン塩酸塩のような核酸分解酵素の阻害活性を有する化合
物の溶液が使用できる。

【００１７】カオトロピック物質としては、具体的には
グアニジンチオシアン酸塩、グアニジン塩酸塩、ヨウ化
ナトリウム、ヨウ化カリウム、過塩素酸ナトリウム、尿
素等が挙げられるが、これらのうち、ＲＮＡを分解する
リボヌクレアーゼに対する阻害効果の大きなグアニジン
チオシアン酸塩あるいはグアニジン塩酸塩の使用が好ま
しい。これらのカオトロピック物質の使用濃度は、用い
られるカオトロピック物質により異なり、通常１．０〜
８．０Ｍ、より好ましくは４．０〜７．０Ｍである。例
えば、グアニジン塩酸塩を使用する場合は、４．０〜
７．５Ｍが好ましい。また、グアニジンチオシアン酸塩
を使用する場合には、３．０〜５．５Ｍが好ましい。

【００１８】本発明の吸着剤を含む核酸抽出溶液には、
緩衝剤を含有させることが好ましい。これは予め抽出溶
液に含まれていても、また、細胞を溶解した後に緩衝液
として添加してもよい。この緩衝剤としては、一般に使
用されるものであれば、特に限定されないが、中性付
近、すなわちｐＨ５．０〜９．０において緩衝能を有す
るものが好ましい。例えば、トリス−塩酸塩、四ホウ酸
ナトリウム−塩酸、リン酸二水素カリウム−四ホウ酸ナ
トリウム緩衝液等が挙げられる。その濃度としては１〜
５００ｍＭ、ｐＨは６．０〜９．０の範囲が好適であ
る。

【００１９】また、核酸抽出溶液には、細胞膜の破壊あ
るいは細胞中に含まれるタンパク質を変性させる目的で
界面活性剤を含有させてもよい。該界面活性剤として
は、一般に細胞等からの核酸抽出に使用されるものであ
れば、特に限定されないが、具体的には、トリトン系界
面活性剤およびツイーン系界面活性剤等の非イオン界面
活性剤、Ｎ−ラウロイルサルコシンナトリウム等の陰イ
オン界面活性剤が挙げられる。本発明においては、特に
非イオン界面活性剤を０．１〜２．０％の範囲で使用す
るのが好ましい。さらに、核酸抽出溶液には試料中に含
まれるタンパク質、特にリボヌクレアーゼを変性、失活
させる目的で、２−メルカプトエタノールあるいはジチ
オスレイトール等の還元剤を含有させることが好まし
い。

【００２０】本発明において必要により使用する洗浄液
とは、核酸結合性担体から核酸の溶離を促進することな
く、かつ、タンパク質、糖類、脂質の固相への結合を妨
げるものであれば特に限定されない。具体的には、４．
０〜７．５Ｍグアニジン塩酸塩溶液あるいは４０〜１０
０％エタノールで洗浄することが好ましい。また、初め
に溶解・吸着工程にて使用した抽出溶液を洗浄液として
使用すると、ゲノムＤＮＡとタンパク質の除去に有効で
ある。特に、カオトロピック物質を含む第一の洗浄液
と、アルコールを含む第二の洗浄液を併用するのが好ま
しい。カオトロピック物質としては、グアニジンチオシ
アン酸塩、グアニジン塩酸塩、チオシアン酸ナトリウム
塩などが挙げられる。また、アルコールとしては、エタ
ノール、イソアミルアルコール、２−プロパノールなど
が挙げられる。４０〜１００％、好ましくは６０〜１０
０％濃度のエタノールを含む溶液で洗浄することが特に
好ましい。さらには、６０〜８０％、より好ましくは７
０％程度の濃度のエタノールを含む第二の洗浄液と、６
０〜１００％、より好ましくは９９％程度の濃度のエタ
ノールを含む第三洗浄液とを用いるのが効果的である。

【００２１】本発明における核酸の結合した核酸結合性
担体から核酸を溶出する核酸溶出液とは、核酸結合性担
体から核酸の溶離を促進するものであれば特に限定され
ない。具体的には、水あるいはＴＥ緩衝液（１０ｍＭト
リス−塩酸塩、１．０ｍＭＥＤＴＡ；ｐＨ８．０）が好
ましい。この核酸−磁性シリカ粒子複合体を形成する
際、夾雑物を多量に含む生物試料、例えば血液のような
検体を処理する場合、核試料由来の物質が磁性シリカ粒
子の周囲に付着し、核酸の結合を妨げる傾向にある。実
際、夾雑物が多い試料ほど核酸の回収能力が低下する。
この問題を解決するため、本発明においては、細孔直径
および細孔容積がより大きい粒子を使用することによ
り、上記試料由来の夾雑物質が粒子に付着しても、核酸
の結合に影響が出にくく、従って高い回収率を維持する
ことが可能となる。

【００２２】本発明では、このような磁性シリカ粒子
を、核酸を含有すると考えられる試料とともに核酸吸着
用溶液中に添加し、磁性シリカ粒子−核酸複合体を形成
する。本発明の核酸単離方法は、具体的には下記（ａ）
〜（ｄ）の工程を含む。（ａ）核酸を含有すると考えられる材料を水不溶性のフ
ィルタに通過させる工程（前処理工程）（ｂ）核酸結合性担体、核酸を含有すると考えられる試
料および核酸を核酸結合性担体に吸着させるための核酸
抽出溶液を混合して、核酸を核酸結合性担体に結合させ
る工程（吸着工程）（ｃ）核酸が結合した核酸結合性担体を液体から分離
し、必要により洗浄する工程（分離工程）（ｄ）核酸結合性担体−核酸複合体から核酸を溶出する
工程（溶出工程）

【００２３】核酸を含有すると考えられる材料とは特に
限定されないが、全血、血清、血漿、尿、唾液、体液な
どの動物由来の生物材料、その他、植物、微生物などの
動物以外の生物材料を包含する。また、これらの生物か
ら分離した細胞および培養細胞を含む。さらに、部分精
製された核酸も包含する。

【００２４】核酸とは、ＤＮＡまたはＲＮＡを意味す
る。ＤＮＡとしては、２本鎖ＤＮＡ、１本鎖ＤＮＡ、プ
ラスミドＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡなどを含む。
また、ＲＮＡとしては、ウイルス、細菌あるいは真菌等
の外来性寄生生物由来のＲＮＡに加えて、これらの生物
材料を産する生物に由来する内在性のＲＮＡを含み、ｔ
ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡなどを含む。

【００２５】本発明において、前処理工程（ａ）では核
酸を含むと考えられる材料を水不溶性のフィルタに通過
させ、不純物をフィルタの内部又は表面に保持するかま
たは通過の際に以後の操作に影響を及ぼさない程度に物
理的な切断または破砕する。通過の際には卓上の遠心機
で２分程度の遠心を実施した。吸着工程（ｂ）では、核
酸結合性担体、核酸を含有すると考えられる試料および
核酸抽出溶液を混合し、核酸を核酸結合性担体に吸着さ
せる。混合方法は、ボルテックスによる攪拌、転倒混
和、磁気による攪拌などがあり、混合時間は約１〜６０
分間である。これらの物質を混合することにより、試料
中の核酸、タンパク質、糖類などが核酸結合性担体に物
理的に吸着する。分離工程（ｃ）における液相と核酸結
合性担体との分離手段としては、粒子内の超常磁性金属
酸化物を使用することによる、磁石等を用いた簡便な磁
気分離法が可能である。分離工程（ｃ）では、必要によ
り洗浄を行い、不要なタンパク質、糖類、脂質などを溶
離する。洗浄は１回または２回以上行う。溶出工程
（ｄ）は、上記分離工程（ｃ）における核酸が吸着した
核酸結合性担体から該核酸を溶出する工程である。この
とき回収した核酸は、透析やエタノール沈殿法等の脱
塩、濃縮操作を施すことなく、制限酵素やＤＮＡポリメ
ラーゼ等を使用する酵素反応に直接使用することができ
る。また必要により増幅した後、核酸プローブ試薬を使
用して目的核酸を検出することもできる。

【００２６】

【実施例】以下に実施例を挙げることにより、本発明の
効果をより一層明瞭なものとする。ただし、これらの実
施例によって本発明の範囲は限定されるものではない。
ここでは、核酸配列（β２．７）を利用したサイトメガ
ロウイルス（ＣＭＶ）核酸の増幅ならびに検出用試薬キ
ットおよびこれらの試薬を用いてＣＭＶを簡便かつ迅速
に増幅し、検出する方法を例示する。

【００２７】実施例１（抽出前処理を実施した試料中の
核酸の抽出）磁性シリカ粒子は、細孔直径が１〜２００ｎｍ、細孔容
積が４０〜２２００ｍｍ³／ｇ、平均粒子径の範囲が
１．０〜５．０μｍ、四三酸化鉄粒子の含有量がグラム
重量あたり３０％である粒子を準備した。また、抽出に
は自動核酸抽出装置であるMAGFREX(東洋紡績製)を用い
た。まず、０．１ｍｇ／ｍｌ濃度になるように５．０Ｍ
ＮａＣｌ溶液に懸濁した磁性シリカ粒子を準備した。
被験試料としては、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）核
酸を保有する全血検体の希釈物(サンプル１，２)、合成
競合ＲＮＡ(サンプル３，４)を使用した。

【００２８】また、核酸抽出用溶液としては、以下の組
成のものを使用した。５０ｍＭトリス−ＨＣｌ５．０Ｍグアニジンチオシアン酸塩２０ｍＭＥＤＴＡ１．２％ Polyethylene Glycol Mono-p-isooctylpheny
l Ether

【００２９】本実施例の具体的な操作は次の通りであ
る。（１）１．５ｍｌ容のエッペンドルフチューブに、上記
の組成を持つ核酸抽出用試薬０．９ｍｌを入れ、次に核
酸を含有すると考えられる生物試料０．１ｍｌを添加
し、よく混合した。（２）次に、混合した試料を市販の核酸前処理フィルタ
QIAshredder(QIAGEN社製)に通過させ、所定の方法によ
り抽出前処理を実施した（条件Ａ）。なお、対照として
前処理なし（条件Ｂ）も同時に実施した。 (３)次に、５．０ＭＮａＣｌ溶液に懸濁した磁性シリ
カ粒子担体３５．０μｌを加え、よく混合した試料を自
動核酸抽出装置MAGFREXに設置し室温で１０分間撹拌し
反応させた。 (４)磁気分離機構により粒子をチューブ底部に厚め、溶
液層を静かに吸引は移出した。 (５)次に、洗浄液として５．０Ｍチオシアン酸ナトリウ
ム塩を含むトリス−塩酸緩衝液０．９ｍｌを加え、混合
した後、上記(４)と同様にして磁気分離、吸引排出を実
施した。 (６)洗浄液による洗浄操作をもう一度繰り返した。 (７)０．９ｍｌの７０％エタノール溶液により上記(５)
と同様に、核酸の吸着したシリカ粒子を洗浄し、高濃度
の塩溶液を除去した。 (８)再度０．９ｍｌの７０％エタノール溶液で洗浄した
後、０．９ｍｌの９９％エタノールで同様に洗浄した。 (９)５６．０℃に上記の試料を加温し、約３０分間静置
することにより、チューブ内およびシリカ粒子中のエタ
ノールを完全に蒸発させて除去した。 (１０)０．９ｍｌのトリス−ＮａＣｌ洗浄液（１０．０
ｍＭトリス−ＨＣｌ,１５．０ｍＭＮａＣｌ）を加
え、同様に洗浄した。 (１０)０．１ｍｌの滅菌水を加え、５６．０℃に上記試
料を加温し１０分間反応させた。 (１１)MAGFREX磁気分離機構により溶出された核酸を新
しいチューブに回収した。 (１２)１２０００rpmで約５分間遠心分離することによ
り残存した粒子をチューブ底部に集め、別の新しいチュ
ーブに回収した。回収液量は通常６０〜７０μｌ程度で
ある。

【００３０】実施例２（サイトメガロウイルス核酸の増
幅）次にこの回収した核酸をＮＡＳＢＡ法（Nature 350,p9
1-92 (1991）、特許第２６４８８０２号公報及び特許第
２６５０１５９号公報）により増幅した。増幅反応はサ
イトメガロウイルスの核酸配列中より最適な配列を有す
る増幅用プライマーを使用した。５'側プライマーの塩
基配列が、5'-TCCTTTCCTT AATCTCGGAT TATCA-3'（配列
番号１）、３'側プライマーの塩基配列が、5'-AATTCTAA
TA CGACTCACTA TAGGGAGGAG GGAATCGTCG ACTTTGAATT CTT
CGA -3'（配列番号２；Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼのプロ
モーター配列を含む）である。これらのプライマー配列
は、特開平９−２８９９００号公報に開示されたもので
ある。また、ＮＡＳＢＡ法はＴ７ＲＮＡポリメラー
ゼ、逆転写酵素およびＲＮａｓｅＨ（一重鎖もしくは二
重鎖ＲＮＡまたはＤＮＡを加水分解することなくＲＮＡ
−ＤＮＡハイブリッドのＲＮＡを加水分解するリボヌク
レアーゼ）を用いた。ＮＡＳＢＡ法による高濃度核酸配
列の調製は、まず下記の増幅反応液２０．０μｌに、実
施例１の方法により抽出、単離したＣＭＶ核酸溶液１
５．０μｌを加え、６５℃で５分間静置した。そして４
１℃に反応温度を下げ、その後下記に示すような酵素溶
液５．０μｌを加えた。その後、４１℃で９０分間静置
した。こうして得られた増幅核酸溶液を、核酸評価のた
め検出に用いた。

【００３１】増幅反応液の組成は以下に示す通りであ
る。４０．０ｍＭトリス−ＨＣｌ１２．０ｍＭＭｇＣｌ₂ ７０．０ｍＭＫＣｌ５．０ｍＭＤＴＴ１５％（ｖ／ｖ）ＤＭＳＯ１．０ｍＭｄＮＴＰ２．０ｍＭｒＮＴＰ０．２μＭプライマー×２

【００３２】酵素液の組成は以下に示す通りである。０．０１ＵＲＮａｓｅＨ（東洋紡績（株）製；Thermu
s thermophilus由来）２０．０ＵＴ７ＲＮＡポリメラーゼ（ギブコＢＲＬ
製）７．５Ｕ逆転写酵素（生化学工業（株）製）１μｇＢＳＡ

【００３３】実施例３(増幅した核酸溶液の検出) 核酸のサンドイッチハイブリダイゼーション法により、
サイトメガロウイルス遺伝子の検出を行った。〔サイトメガロウイルス遺伝子検出用捕捉プローブおよ
び標識プローブの合成〕捕捉プローブおよび標識プロー
ブは、ＤＮＡシンセサイザー３９１型（アプライドバイ
オシステムズ社製）を用いてホスホアミダイト法により
合成した。捕捉プローブの塩基配列は、5'-TTCCCTCTCC
TACCTACCAC GAA-3'（配列番号３）、標識プローブの塩
基配列は、5'-CGCAGATGAT AAACAAGAGG GTAA-3'（配列番
号４）である。標識プローブの配列中Ｘは、５'位にリ
ンカーアームを有するウリジンを示す。これらのプロー
ブは特開平９−２８９９００号公報に開示されているも
のである。

【００３４】〔標識プローブの酵素（アルカリフォスフ
ァターゼ）標識〕合成標識プローブと、そのリンカーア
ームを介してのアルカリフォスファターゼとの結合を、
文献（Nucleic Acids Research 14,p6155(1986)）に従
って行った。

【００３５】〔捕捉プローブ−固相の調製法〕固相はポ
リスチレン製のマイクロタイタープレート（マイクロラ
イト２、ダイナテック社製）を用い、上記方法で得られ
た捕捉プローブを、マイクロタイタープレートのウェル
に１００μｌずつ分注し、２５℃で一夜インキュベート
し、捕捉プローブをプレートに結合させた後、デオキシ
リボヌクレオチド三リン酸によりブロックを行った。

【００３６】〔サンドイッチハイブリダイゼーション法
による核酸の検出〕以上の方法で調製した試薬および試
料を用いて、核酸溶液の検出を以下に述べる方法で行っ
た。得られた核酸溶液を、水酸化ナトリウム溶液で処理
して変性させた。そして上記プレートに、変性させた試
料を２．０μｌ、ハイブリダイゼーション緩衝液を５
０．０μｌ、アルカリフォスファターゼ標識プローブ溶
液を５０．０μｌ加え、５０℃で３０分間ハイブリダイ
ゼーションを行った。ウェルから液を除き、１．０％ラ
ウリル硫酸ナトリウムを含む洗浄液１を２００μｌ加
え、５０℃で５分間洗浄し、次に０．５％ Polyethylen
e Glycol Mono-p-isooctylphenyl Etherを含む洗浄液２
を２００μｌ加え室温で５分間洗浄、さらに１×ＳＳＣ
溶液２００μｌで洗浄した。そして、アルカリフォスフ
ァターゼの基質であるLumiphos 480（和光純薬工業
製）を１００μｌ加え、３７℃で１５分間酵素反応を行
った後、発光量をマイクロライト１０００（ダイナテッ
ク社製）で測定した。実施例１〜３の結果を表1に示
す。

【００３７】

【表１】

【００３８】表１から明白なように、核酸抽出前の前処
理として水不溶性のフィルタで処理した場合には、前処
理なしと比較して抽出効率において明らかな差が認めら
れ、検出感度が大きく向上していることが示される。

【００３９】実施例４(各種前処理フィルタを使用した
抽出感度の比較) 上記と同様の粒子を使用し、次に、混合した試料を市販
の核酸前処理カラムとして、Ａ：QIAshredder(QIAGEN社
製)、核酸精製用カラム、Ｂ：RNeasy Spin Columns、
Ｃ：QIA amp Spin Columns、Ｄ：QIA quick Spin Column
s(全てQIAGEN社製)に通過させ、所定の方法により抽出
前処理を実施した。被験試料としては、ＣＭＶ核酸を保
有する全血検体の希釈物を使用した。結果を表２に示
す。

【００４０】

【表２】

【００４１】表２から明白なように、核酸抽出前の前処
理として水不溶性のフィルタである各種カラムで処理し
た場合には、従来の抽出法である前処理なしと比較して
格段の差がみられる。水不溶性フィルタを使用した抽出
前処理を実施する場合、検出感度が大きく向上している
ことがわかる。特にカラムＡ（QIA shredder）とカラム
Ｂ（RNeasy Spin columns）で良好な感度が得られてい
ることが分かる。

【００４２】

【発明の効果】上述したように、本発明における核酸抽
出方法は、核酸を含むと考えられる材料を水不溶性のフ
ィルタを用いて予め処理を行うことで、生物材料から高
い回収率で核酸を抽出および単離することが可能とな
る。特に、全血試料のような夾雑物質を多量に含む材料
からの核酸抽出においては、従来の粒子担体と比べて飛
躍的な効果が得られるという利点を有する。

【００４３】

【配列表】配列番号：１配列の長さ：25 配列の形：他の核酸合成ＤＮＡトポロジー：一本鎖配列の特徴：サイトメガロウイルスのｍＲＮＡに相同な配列を有する。配列 TCCTTTCCTT AATCTCGGAT TATCA 25

【００４４】配列番号：２配列の長さ：56 配列の形：他の核酸合成ＤＮＡトポロジー：一本鎖配列の特徴：サイトメガロウイルスのｍＲＮＡに相補的な配列を有する。またＴ７ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列を持つ。配列 AATTCTAATA CGACTCACTA TAGGGAGGAG GGAATCGTCG ACTTTGAATT CTTCGA 56

【００４５】配列番号：３配列の長さ：23 配列の形：他の核酸合成ＤＮＡトポロジー：一本鎖配列の特徴：サイトメガロウイルスのｍＲＮＡに相同な配列を有する。配列 TTCCCTCTCC TACCTACCAC GAA 23

【００４６】配列番号：４配列の長さ：24 配列の型：他の核酸合成ＤＮＡトポロジー：一本鎖配列の特徴：サイトメガロウイルスのｍＲＮＡに相同な配列を有する。配列 CGCAGATGAT AAACAAGAGG GTAA 24

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Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】核酸を含有すると考えられる材料から核
酸を抽出および単離するための方法であって、以下の工
程（ａ）〜（ｄ）を含むことを特徴とする核酸の抽出方
法。（ａ）核酸を含有すると考えられる材料を水不溶性のフ
ィルタに通過させる工程（ｂ）核酸を含有すると考えられる材料、核酸を吸着で
きる核酸結合性磁性粒子担体、および核酸を該担体に吸
着させるための核酸抽出溶液とを混合する工程（ｃ）核酸以外のものを核酸と粒子担体との複合体を洗
浄することにより除去する工程（ｄ）核酸と担体との複合体より核酸を溶出して回収す
る工程
【請求項２】該核酸がＤＮＡおよび／またはＲＮＡで
ある請求項１記載の核酸の抽出方法。
【請求項３】該核酸を含有すると考えられる材料が生
物材料である請求項１記載の核酸の抽出方法。
【請求項４】該生物材料が、血液、組織、尿、喀痰よ
りなる群から選ばれたいずれかである請求項３記載の核
酸の抽出方法。
【請求項５】該核酸抽出溶液がカオトロピック物質を
含有する請求項１記載の核酸の抽出方法。
【請求項６】該カオトロピック物質が、グアニジン
塩、ヨウ化カリウム、ヨウ化ナトリウム、（イソ）チオ
シアン酸塩および尿素よりなる群から選択される少なく
とも１種を含むものである請求項５記載の核酸の抽出方
法。
【請求項７】該カオトロピック物質が、グアニジン
（イソ）チオシアン酸塩および／またはグアニジン塩酸
塩である請求項６記載の核酸の抽出方法。
【請求項８】工程（ｃ）において用いられる洗浄液
が、カオトロピック物質を含む第一の洗浄液およびアル
コールを含む第二の洗浄液を使用する請求項１記載の核
酸の抽出方法。
【請求項９】グアニジンチオシアン酸塩、グアニジン
塩酸塩およびチオシアン酸ナトリウム塩よりなる群から
選択される少なくとも１種を含有する第一の洗浄液を使
用する請求項８記載の核酸の抽出方法。
【請求項１０】４０〜１００％濃度のアルコールを含
有する第二の洗浄液を使用する請求項８記載の核酸の抽
出方法。
【請求項１１】４０〜１００％濃度のエタノールを含
有する第二の洗浄液および６０〜１００％濃度のエタノ
ールを含有する第三の洗浄液を使用する請求項８記載の
核酸の抽出方法。