JP2000507447A - ヘリシウム・エリナシウスからの新規ベンズアルデヒド誘導体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は式Ｉ： （式中、R¹〜R¹⁰は水素またはメチルであり、隣接する炭素原子上に存在する２個のR¹〜R¹⁰はＣ−Ｃ単結合とともにＣ−Ｃ二重結合であることが可能である。ただし、R¹〜R¹⁰によって置換された炭素鎖中、各場合１個の置換基R¹〜R¹⁰のみがメチルであり、各場合これらの置換基の１個の隣接対のみが二重結合の形成に寄与する）の化合物、それらの製造方法ならびにそれらのとくにHIV感染によって生じる疾患の処置用医薬としての使用に関する。

Description

【発明の詳細な説明】 ヘリシウム・エリナシウスからの新規ベンズアルデヒド誘導体 本発明は、新規なベンズアルデヒド誘導体、それらの製造方法、およびとくに HIV感染によって生じる疾患の処置用の医薬の製造のためのそれらの使用に関す る。 ヒト免疫不全ウイルス（HIV)によって生じるヒト生体の疾患は生命の危険があ り、様々な二次障害を伴う。その障害の重症度はウイルス力価すなわち生体内に 存在するウイルス数に直接関連する。ウイルス数の低下には、疾患の発症の予防 または障害の経過への陽性の影響の一つの可能性がある。このウイルスの複製に は逆転写酵素が必須である。この酵素の阻害剤（たとえばアジドチミジン）を用 いて、ウイルスの複製を著しく遅延させることが可能なことを示すことができて いる。 本出願の主題は、HIV逆転写酵素の阻害剤の利用、すなわちHIV感染により生じ る障害の処置を可能にすることである。 HIV逆転写酵素を阻害し、したがってHIV感染の処置の基本的前提条件を満たす すべての種類の合成および天然物質が知られている（たとえば、G．T．Tanら、B iochem．Biophys．Res．Commun．(1992)，185，370-378による一般検索参照）。 さらに担子菌類(Basidiomycetes)が生物活性を有する二次代謝物たとえば、スト ロビルリン(strobilurins)を形成することが知られている(たとえばS．Zapfら、 Angew．Chemie(1995)，107，255参照)。担子菌類のヘリシウム・エリナシウス(H ericeum erinaceus)の子実体は二次代謝物として、ヘリセノン(hericenones)お よびヘリセニン(hericenin)を形成し、それらの作用は細胞毒性あるいは神経細 胞からの軸索の生育の刺激と記載されている(H.Kawagishiら、Tetrahedr．Lett ．(1990)，31，373参照)。 驚くべきことに、担子菌類のヘリシウム・エリナシウスの菌糸体から、HIV逆 転写酵素を阻害し、したがってHIV感染の処置に適当な二次代謝物を単離できる ことも見出された。これらの化合物およびそれらの生理学的に許容される塩はこ れまで未知であり、以下の構造(式Ｉ)（式中、R¹〜R¹⁰は水素またはメチルであり、隣接する炭素原子上に存在する２ 個のR¹〜R¹⁰はＣ−Ｃ単結合とともにＣ−Ｃ二重結合であることが可能である。 ただし、R¹〜R¹⁰によって置換された炭素鎖中、各場合１個の置換基R¹〜R¹⁰のみ がメチルであり、各場合これらの置換基の１個の隣接対のみが二重結合の形成に 寄与できる）をその特徴とする。 式Ｉ中、R⁵は好ましくはメチルである。 R³およびR⁶（たとえば式１）またはR⁶およびR⁷（たとえば式２）はそれらによ って置換された炭素原子の間に存在するＣ−Ｃ単結合とともに、Ｃ−Ｃ二重結合 を形成することがとくに好ましい。 これらの化合物の二重結合は、好ましくは、Ｚコンフィギュレーションで存在 する。 式Ｉの新規化合物、とくに化合物１および２ならびにそれらの生理学的に許容 される塩はHIV逆転写酵素に対するそれらの活性において傑出し、それらは担子 菌類の他の代謝物の場合よりも明らかに優れている。 HIV「逆転写酵素」の阻害物質の検討 逆転写酵素(RT)の活性は「シンチレーション近似アッセイ」(SPA)を用い測定 した。RT−SPA試薬キットはAmersham／Buchler(Brunswick)から入手した。酵素R T（HIVから大腸菌中にクローン化）はHT Biotechnology Ltd，Cambridge，UKか らのものとした。 セットアップ： 試験は、製造業者Amershamの方法の手引きに従い、以下の改良を加えて実施し た。 -ウシ血清アルブミンを「アッセイ」緩衝液に終濃度0.5mg／mlに加えた。 -試験は100μｌのバッチ容量を用いエッペンドルフ反応容器中で実施した。 -製造業者のRT濃度(5000U／ml)をtris HCl緩衝液20mM；pH7.2，30％グリセロ ール中、15U／mlの活性に希釈した。 -バッチのインキュベーション時間は60分とした(37℃)。 -反応を停止させ、ビーズ懸濁液により「発色」させたのち、130mlのバッチを 4.5mlのtris HCl緩衝液10mM；pH7.4，0.15mM NaClに移し、トリチウムの放射能 をβ−カウンター中で測定した。 物質試験： 阻害活性の予備試験では物質を水に溶解し(保存溶液、ｃ＝１mg／ml)、様々に 希釈して(10^-1、10^-2、10^-3等)試験した。 IC₅₀の測定には、阻害剤の保存溶液をさらに水で希釈して適当な濃度で試験し た。それぞれの試験物質の濃度の対数に対するRT活性のグラフから、50％酵素阻 害に生じる濃度を決定した。 本発明の課題にはさらに上述の化合物の製造方法が包含される。上述の化合物 の製造方法は、微生物、ヘリシウム・エリナシウス好ましくはヘリシウム・エリ ナシウス DSM 10600を水性メジウム中で培養し、ついで標的化合物を単離し、精 製することからなる。 微生物ヘリシウム・エリナシウス DSM 10600はブダペスト条約の規定によって 1996年３月20日、Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und ZellkulturenGm bH [ドイツ微生物および培養細胞収集機関(DSMZ)]，Mascheroder Weg 1b，D-381 24 Brunswick）に寄託された。 株 DSM 10600以外にも、それらが式Ｉの化合物を合成できる限り、その突然変 異体および変異体を使用することも可能である。このような突然変異体はそれ自 体既知の様式で、たとえば物理学的方法たとえば紫外線もし くはＸ線のような放射線照射、または化学的突然変異誘発物質たとえばメタンス ルホン酸エチルエステル(EMS)、２−ヒドロキシ−４−メトキシベンゾフェノン( MOB)もしくはＮ−メチル−N'−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン(MNNG)によって 製造することができる。 以下に記載する発酵条件はヘリシウム・エリナシウスおよびその寄託された単 離体に適用される。発酵は実験室規模(ミリリットルおよびリットル規模)または 工業規模(立法メートル規模)で実施できる。 炭素源および窒素源ならびに慣用の無機塩、ヘリシウム・エリナシウスとくに ヘリシウム・エリナシウス DSM 10600を含有する栄養溶液中で式Ｉの化合物が産 生される。 好気性発酵に適当な好ましい炭素源は同化可能な炭水化物および糖アルコール たとえばグルコース、ラクトースまたはＤ−マンニトール、ならびに炭水化物含 有天然産物たとえば麦芽エキスである。適当な窒素源含有栄養物にはアミノ酸、 ペプチドおよびタンパク質、ならびにそれらの分解産物たとえばペプトン、もし くはトリプトン、さらには肉汁エキス、粉砕された種子たとえばトウモロコシ、 小麦、豆、大豆もしくは綿実、アルコール製造に際しての蒸留残留物、肉汁もし くは酵母エキス、さらにはアンモニウム塩および硝酸塩がある。栄養溶液に添加 できる無機塩は、たとえばアルカリ金属、アルカリ土類金属、鉄、亜鉛、コバル トおよびマンガンの塩化物、炭酸塩、硫酸塩またはリン酸塩である。 ヘリシウム・エリナシウス好ましくはDSM 10600による式Ｉの化合物の形成は 、0.1〜２％好ましくは0.5〜１％のコーンスティープ、0.5〜10％好ましくは１ 〜５％のトマトペースト、0.1〜５％好ましくは0.5〜３％のオートミール、0.1 〜５％好ましくは0.5〜３％のグルコースならびに微量元素を含有する栄養溶液 中でとくに良好に進行する(％データはいずれも 総栄養溶液の重量に対する値)。微量元素溶液は以下の組成とすることができる 。 FeSO₄×７H₂O 0.01〜１％ 好ましくは 0.05〜0.2％ MnSO₄×１H₂O 0.01〜１％ 好ましくは 0.05〜0.2％ CuCl₂×２H₂O 0.0005〜0.1％ 好ましくは 0.001〜0.005％ CaCl₂×２H₂O 0.001〜0.1％ 好ましくは 0.005〜0.005％ H₃BO₃ 0.005〜0.01％ 好ましくは 0.002〜0.0075％ (NH₄)₆Mo₇O₂₄×４H₂O 0.0005〜0.01％好ましくは 0.001〜0.005％ ZnSO₄×７H₂O 0.001〜0.1％ 好ましくは 0.001〜0.05％ 培養は好気的に、すなわち、たとえば振盪もしくは攪拌しながら深部培養で、 またはファーメンター中で、適宜、空気もしくは酸素を導入しながら行われる。 それは15〜30℃、好ましくは20〜30℃、とくに23〜28℃の温度範囲で行われる。 pHはpH１〜７、有利にはpH2.5〜4.5である。菌体はこれらの条件下において100 〜300時間好ましくは120〜168時間にわたり培養される。 培養は多くの段階で実施するのが有利である。すなわち、最初に液体栄養メジ ウム中で１または２以上の前培養を調製し、ついで実際の産生メジウム、主培養 に、たとえば容量比１：10で移す。前培養はたとえば菌糸体を栄養溶液に移し、 これを約100〜200時間好ましくは120〜168時間増殖させて得られる。菌糸体はた とえば、菌株を固体または液体栄養培地たとえば酵母−麦芽アガーまたは馬鈴薯 −デキストロースアガー上、７〜40日間好ましくは10〜20日間増殖させて得るこ とができる。 発酵の経過は、各場合、培養液のpHまたは菌糸体の容量によりおよびクロマト グラフィー法たとえば薄層クロマトグラフィーまたは高速液体クロマトグラフィ ーによってモニタリングすることができる。式Ｉの化合物は 主として培養ろ液中に得られる。 式Ｉの化合物は、生成物の化学的、物理学的および生物学的性質を考慮して既 知の方法に従い、それぞれの培養培地から単離される。たとえば、吸着、イオン 交換またはゲルろ過方法を使用することができる。 酢酸エチル／メタノール／水の混合物を本技術分野の熟練者には既知の濃度で 、溶出液として使用することができる。薄層クロマトグラフィー分離の場合の検 出は、たとえばUV消光および染色試薬たとえばアニスアルデヒド、テトラゾール ブルーまたはオルシノールによっても実施できる。 本発明をさらに以下の実施例によって例示する。とくに他の指示がない限り、 百分率は重量比であり、液体の場合の混合比は容量比である。 ヘリセナールは菌糸体および培養ろ液の両者に存在し、通常大部分の量は培養 ろ液中に見出される。したがって、ろ過または遠心分離によってろ液から細胞塊 を分離することが有利である。ろ液を凍結乾燥し、凍結乾燥物をメタノール、ア セトニトリルまたは１−ブタノールのような溶媒によって抽出する。ヘリセナー ルは菌糸体からも同様にして抽出できる。抽出は広範のpH範囲において実施でき る。pH3.0〜pH7.5の範囲が有利である。 単離の他の方法はそれ自体既知の溶液分配である。 クロマトグラフィーがある。多くの逆相支持体、たとえば高速液体クロマトグラ フィーで一般的に用いられるようなRP−18がさらに適当である。ヘリセナールの 更なる精製の可能性には、それ自体既知の様式でのたとえば シリカゲルまたはアルミナ等のような、いわゆる直相支持体の使用がある。たと えば、クロロホルム／メタノールまたはジクロロメタン／ｎ−ブタノール混合物 のような多くの溶媒が溶出に適している。 ヘリセナールの単離の別法にはそれ自体既知の様式でのいわゆるモルキ 使用がある。さらに、濃縮された材料からは結晶化によってヘリセナールを得る こともできる。この目的では、たとえば無水または水を添加した有機溶媒および それらの混合物が適当である。酸たとえばトリフルオロ酢酸、硫酸、塩酸、ギ酸 等の添加も同様に有利である。 式Ｉの化合物およびそれらの生理学的に許容される塩はさらに、HIV感染によ って生じる疾患に対して治療剤として適している。したがって、本発明は、さら にまた式Ｉの化合物およびそれらの生理学的に許容される塩の医薬としての使用 、好ましくはHIV感染によって生じる疾患の処置用医薬の製造のための使用に関 する。 これらの医薬には、式Ｉの化合物またはそれらの生理学的に許容される塩１種 または２種以上、ならびに医薬補助剤を含有させることができる。 本発明はまた、ヘリシウム・エリナシウス DSM 10600ならびにその突然変異体 および変異体に関する。 実施例 １．ａ）産生株ヘリシウム・エリナシウス DSM 10600の菌糸体の調製 500mlの滅菌エルレンマイヤーフラスコ中100mlの栄養溶液(１ｌの水道水中に2 0ｇの麦芽エキス、２ｇの酵母エキス、10ｇのグルコース、0.5ｇの(NH₄)₂HPO₄を 含有。滅菌前のpH6.0)にDSM 7427株を接種し、回転振盪器上140rpm、25℃で240 時間インキュベートする。栄養溶液［馬鈴薯浸出液(200ｇの馬鈴薯から1000mlの H₂O中で浸出)4.0ｇ／ｌ、20.0ｇのＤ−グ ルコース、滅菌前のpH5.6］を含有する500mlの滅菌エルレンマイヤーフラスコに 20mlの培養液体を均一に分布させ、これにさらに固化のためにアガ−15ｇ／ｌを 加え、傾瀉する。培養液を25℃で10〜21日間中インキュベートする。この時間後 にフラスコ内に生じた菌糸体を滅菌接種針を用いて採取し、直ちに再使用するか −４℃で水中に保存する。 ｂ）産生株の前培養の調製 上記ａ）記載の栄養溶液100mlを含有する500mlの滅菌エルレンマイヤーフラス コに斜面培養で増殖させた培養液またはサイズ１cm²の寒天(アガー)片を接種し 、回転振盪器上140rpm、25℃でインキュベートする。式Ｉの化合物の最大産生は 約168時間後に達成される。同じ栄養液からの168時間齢深部培養液(接種量約５ ％)は４回の接種(200mlエルレンマイヤーフラスコ中500ml)に十分である。 ２．式１および２の化合物の調製 2000mlのエルレンマイヤー振盪フラスコを以下の条件で操作する。 コーンスティープ ５ｇ／ｌ トマトペースト ４ｇ／ｌ オートミール 10ｇ／ｌ グルコース 10ｇ／ｌ 微量元素溶液 10ml／ｌ pH6.8（滅菌前） pHは２Ｎ NaOHまたはHClを用いて調整する． インキュベーション時間：168時間 インキュベーション温度：25℃ 振盪器速度：140rpm 微量元素溶液３．ヘリセナールの単離 実施例２に従って得られた培養液を遠心分離により除去し、細胞塊を凍 ズ30×６cm)に吸着させ、０〜70％イソプロパノールのイソプロパノール勾配で 溶出する(流速50ml／分)。ヘリセナールを含む分画を合わせて真空中で水相に濃 縮し、凍結乾燥する。 ４．ヘリセナールの精製 実施例３で得られた粗製の混合物270mgを20％の含水アセトニトリルに を含む水中25〜40％アセトニトリルの勾配を用いて最初のクロマトグラフィーに 付す(カラムサイズ250×32mm，流速50ml／分)。ヘリセナールを含 勾配を用いて最後の精製を行う(カラムサイズ250×20mm，流速25ml／分)。分画 の濃縮および凍結乾燥後、ヘリセナールＡおよびヘリセナールＢの混合物17.6mg が得られる。この混合物をシリカゲル60(Merck，0.015〜0.040mm，カラム容量5m l)上、溶出液としてジクロロメタン／ｎ−ブタノール20：１を用いるカラムクロ マトグラフィーによって個々の成分に分離する。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｒ 1:645） (72)発明者 ヴインクラー，イルフイン ドイツ連邦共和国デー―65835 リーダー バツハ．イン デンアイヒエン40 (72)発明者 コグラー，ヘルベルト ドイツ連邦共和国デー―61479 グラース ヒユツテン．ダツテンバツハシユトラーセ 12 (72)発明者 バツクハウス，イユルゲン ドイツ連邦共和国デー―68535エデインゲ ン．シユターレンヴエーク11

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．式Ｉ： （式中、R¹〜R¹⁰は水素またはメチルであり、隣接する炭素原子上に存在する２ 個のR¹〜R¹⁰はＣ−Ｃ単結合とともにＣ−Ｃ二重結合であることが可能である。 ただし、R¹〜R¹⁰によって置換された炭素鎖中、各場合１個の置換基R¹〜R¹⁰のみ がメチルであり、各場合これらの置換基の１個の隣接対のみが二重結合の形成に 寄与できる）の化合物またはそれらの生理学的に許容しうる塩。 ２．R⁵はメチルである請求項１記載の化合物。 ３．R³およびR⁶はそれらによって置換された炭素原子の間に存在するＣ−Ｃ単結 合とともにＣ−Ｃ二重結合である請求項２記載の化合物。 ４．二重結合はＺコンフィギュレーションで存在する請求項３記載の化合物。 ５．R⁶およびR⁷はそれらによって置換された炭素原子の間に存在するＣ−Ｃ単結 合とともにＣ−Ｃ二重結合である請求項２記載の化合物。 ６．二重結合はＺコンフィギュレーションで存在する請求項５記載の化合物。 ７．請求項１〜６のいずれかに記載の化合物を製造する方法において、微 生物ヘリシウム・エリナシウスを水性培地中で培養し、ついで標的化合物を単離 精製することからなる方法。 ８．ヘリシウム・エリナシウス DM 10600を用いる請求項７記載の方法。 ９．ヘリシウム・エリナシウス DM 10600の突然変異体または変異体を用いる請 求項８記載の方法。 10．医薬として使用するための請求項１〜６のいずれかに記載の化合物またはそ れらの生理学的に許容される塩。 11．HIV感染によって生じる疾患の処置用医薬の製造のための請求項１〜６のい ずれかに記載の化合物もしくはそれらの生理学的に許容される塩の使用。 12．請求項１〜６のいずれかに記載の化合物またはそれらの生理学的に許容され る塩少なくとも１種ならびに医薬用補助剤からなる医薬。 13．ヘリシウム・エリナシウス DM 10600ならびにその突然変異体および変異体 。