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EP0891319A1 - Neue benzaldehyd-derivate aus hericeum erinaceus - Google Patents

Neue benzaldehyd-derivate aus hericeum erinaceus

Info

Publication number
EP0891319A1
EP0891319A1 EP97914303A EP97914303A EP0891319A1 EP 0891319 A1 EP0891319 A1 EP 0891319A1 EP 97914303 A EP97914303 A EP 97914303A EP 97914303 A EP97914303 A EP 97914303A EP 0891319 A1 EP0891319 A1 EP 0891319A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
erinaceus
hericeum
double bond
compound according
compound
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP97914303A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Heike Stump
Wilhelm Stahl
Joachim Wink
Irvin Winkler
Herbert Kogler
Jürgen Backhaus
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Hoechst AG
Original Assignee
Hoechst AG
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Hoechst AG filed Critical Hoechst AG
Publication of EP0891319A1 publication Critical patent/EP0891319A1/de
Withdrawn legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C59/00—Compounds having carboxyl groups bound to acyclic carbon atoms and containing any of the groups OH, O—metal, —CHO, keto, ether, groups, groups, or groups
    • C07C59/40—Unsaturated compounds
    • C07C59/74—Unsaturated compounds containing —CHO groups
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/40—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carboxyl group including Peroxycarboxylic acids
    • C12P7/42—Hydroxy-carboxylic acids

Definitions

  • the invention relates to new benzaldehyde derivatives, a process for their preparation and their use for the manufacture of a medicament, in particular for the treatment of a disease which is caused by an HIV infection.
  • HIV Human Immunodeficiency Virus
  • the diseases of the human body that are caused by the Human Immunodeficiency Virus (HIV) are life-threatening and are associated with a large number of secondary diseases.
  • the severity of the disease is directly linked to the virus titer, i.e. the number of viruses present in the body. Reducing the virus titer is one way to prevent the onset of the disease or to positively influence the course of the disease.
  • the enzyme reverse transcriptase is essential for the multiplication of the virus. Inhibitors of this enzyme have been shown to significantly slow virus replication (e.g. azidothymidine)
  • CONFIRMATION COPY Hericerin the effects of which are described as stimulating cytotoxicity or stimulating neurite outgrowth from nerve cells (cf. H. Kawagishi et al, Tetrahedr. Lett. (1990), 31, 373).
  • R 1 to R 10 are hydrogen or methyl, where two R 1 to R 10 located on adjacent carbon atoms together with a CC single bond can represent a CC double bond, with the proviso that in the group with R 1 to R 10 substituted carbon chain each means only one of the substituents R 1 to R 10 is methyl and in each case only an adjacent pair of these substituents contributes to a CC double bond.
  • R 5 in formula I is preferably methyl.
  • R 3 and R 6 (for example formula 1) or R 6 and R 7 (for example formula 2) are particularly preferably together with that between those of them substituted carbon atoms lie CC single bond a CC double bond.
  • the double bond of these compounds is preferably in the Z configuration.
  • the new compound of formula I in particular compounds 1 and 2, and their physiologically tolerable salts are distinguished by their action against HIV reverse transcriptase, which is clearly superior to that of other metabolites from basisiomycetes.
  • RT reverse transcriptase
  • SPA scintillation proximity assay
  • Bovine serum albumin was added to the "assay" buffer at the final concentration of 0.5 mg / ml.
  • the test was carried out in Eppendorf reaction vessels with a 100 I batch volume.
  • the manufacturer's RT concentrate (5000 U / ml) was dissolved in Tris-HCl buffer 20 mM; pH 7.2; Diluted 30% glycerol to an activity of 15 U / ml.
  • the incubation time for the batches was 60 min (37 C).
  • the present invention furthermore relates to a process for the preparation of the compounds mentioned.
  • a process for the preparation of the compounds mentioned is characterized in that the microorganism Hericeum erinaceus, preferably Hericeum erinaceus DSM 10600, is cultivated in an aqueous medium and the target compounds are then isolated and purified.
  • microorganism Hericeum erinaceus DSM 10600 was deposited on March 20, 1996 with the German Collection of Microorganisms and Cell Cultures GmbH (DSMZ), Marscheroder Weg 1 b, D-38124 Braunschweig, according to the provisions of the Budapest Treaty.
  • mutants and variants can also be used, provided that they can synthesize compounds of the formula I.
  • Such mutants can be known in a manner known per se by physical means, for example radiation, such as with ultraviolet or X-rays, or chemical mutagens, for example ethyl methanesulfonate (EMS), 2-hydroxy-4-methoxy-benzophenone (MOB) or N-meth ⁇ l- N ' -nitro-N-nitrosoguanidine (MNNG) are generated.
  • EMS ethyl methanesulfonate
  • MOB 2-hydroxy-4-methoxy-benzophenone
  • MNNG N-meth ⁇ l- N ' -nitro-N-nitrosoguanidine
  • the fermentation conditions described below apply to Hericeum erinaceus and the deposited isolate.
  • the fermentation can take place on a laboratory scale (milliliter and liter scale) or on an industrial scale (cubic meter scale).
  • Henricium erinaceus in particular H. erinaceus DSM 10600, produces the compound of the formula I in a nutrient solution which contains a carbon source and a nitrogen source and the customary inorganic salts.
  • assimilable carbohydrates and sugar alcohols such as glucose, lactose or D-mnanite, and carbohydrate-containing natural products, such as, for. B. malt extract.
  • Suitable nitrogenous nutrients are: amino acids, peptides and proteins and their degradation products, such as peptones or tryptones, also meat extracts, ground seeds, for example from corn, wheat, beans, soybeans or the cotton plant, distillation residues from alcohol production, meat flours or yeast extracts, but also Ammonium salts and nitrates.
  • the inorganic solution of inorganic salts can contain, for example, chlorides, carbonates, sulfates or phasphates of the alkali or alkaline earth metals, iron, zinc, cobalt and manganese.
  • the trace element solution can have the following composition:
  • the cultivation is carried out aerobically, for example submerged with shaking or stirring or in fermenters, if appropriate with the introduction of air or hydrogen. It will be carried out in a temperature range from 15 to 30 ° C, preferably from 20 to 30 ° C, in particular from 23 to 28 ° C.
  • the pH is from pH 1 to 7, advantageously from pH 2.5 to 4.5.
  • the fungus is cultivated under these conditions over a period of 100 to 300 hours, preferably 120 to 168 hours.
  • Cultivation is advantageously carried out in several stages, i. H. one or more precultures are first prepared in a liquid nutrient medium, which are then inoculated into the actual production medium, the main culture, for example in a volume ratio of 1:10.
  • the preculture is obtained e.g. B. by inoculating mycelium in a nutrient solution and growing for about 100 to 200 hours, preferably 120 to 168 hours.
  • the mycelium can be obtained, for example, by allowing the strain to grow on a solid or liquid nutrient medium, for example yeast-malt agar or potato-dextrose agar, for 7 to 40 days, preferably 10 to 20 days.
  • the course of the fermentation can each be based on the pH of the culture or the mycelium volume as well as by chromatographic methods, such as. B. thin layer chromatography or high pressure liquid chromatography, are monitored.
  • the compound of formula I is predominantly contained in the culture filtrate.
  • the isolation of the formal I compound from the respective culture medium is carried out according to known methods, taking into account the chemical, physical and biological properties of the products. It can e.g. B. the adsorption, ion exchange or gel filtration process can be applied.
  • Ethyl acetate / methanol / water mixtures are used as mobile solvents in concentrations known to those skilled in the art.
  • Detection in thin-layer chromatographic separation can, for example, also bring UV quenching and coloring reagents such as anisaldehyde, tetraozole blue or orcine into the suitable administration form and / or additives and / or auxiliary substances.
  • Hericenals can be found in both the mycelium and the culture filtrate, usually the majority is in the culture filtrate. It is therefore advisable to separate the cell mass from the filtrate by filtration or centrifugation.
  • the filtrate is lyophilized and the lyophilisate extracted with a solvent such as methanol or acetonitrii or 1-butanol.
  • Hericenals can be extracted from the mycelium in the same way. The extractions can be carried out over a wide pH range, a range from pH 3.0 to pH 7.5 is appropriate.
  • Another method of isolation is the solution distribution in a manner known per se.
  • Another method of purification is chromatography on adsorption resins such as on Diaion * HP-20 (Mitsubishi Casei Corp., Tokyo) on Amberlite ® XAD 7 (Rohm and Haas, USA) to Amber Chrome ® CG (Toso Haas, Philadelphia, USA) or on similar supports.
  • Numerous reversed-phase supports, for example RP-18, are also suitable, as are generally used in hop pressure liquid chromatography.
  • Another cleaning option for the Hericenale is the use of so-called straight-phase carriers such.
  • Many solvents such as chloroform / methanol or dichloromethane / n-butanol mixtures, are suitable for elution.
  • An alternative method for isolating the texenomycins is the use of so-called.
  • Molecular sieves such as Fractogel ® TSK HW-40, Sephadex ® LH-20 and others in a known manner. It is also possible to obtain the Texenomycins from enriched material by crystallization. Suitable for this purpose are, for example, organic solvents and their mixtures, anhydrous or with added water. Additions of acids such as trifluoroacetic acid, sulfuric acid, hydrochloric acid, formic acid or others can also be advantageous.
  • the compounds of formula I and their physiologically tolerable salts are also suitable as therapeutic agents against diseases which are caused by an HIV infection. Accordingly, the present invention also relates to the compound of formula I or a physiologically tolerable salt thereof for use as a medicament, preferably for the manufacture of a medicament for the treatment of a disease which is caused by an HIV infection.
  • the medicaments can contain one or more compounds of the formula I or their physiologically tolerable salts and pharmaceutical auxiliaries.
  • the present invention further relates to Hericeum erinaceus DSM 10600 and its mutants and variants.
  • 100 ml nutrient solution (20 g malt extract, 2 g yeast extract, 10 g glucose, 0.5 g (NH 4 ) 2 HPO 4 in 1 l tap water, pH value before sterilization 6.0) in a 500 ml sterile Erlenmeyer flask are mixed with Inoculated the strain DSM 7427 and incubated for 240 hours at 25 ° C and 140 rpm on a rotating shaker.
  • a sterile 500 ml Erlenmeyer flask with 100 ml of the nutrient solution described under a) is inoculated with a culture grown on a slant tube or with a 1 square centimeter piece of agar and incubated on a shaker at 140 rpm and 25 ° C.
  • the maximum production a compound of formula I is reached after about 168 hours.
  • a 1 68 hour old submerged culture (inoculation amount approx. 5%) from the same nutrient solution is sufficient to inoculate 4 (500 ml in 200 ml Erlenmeyer).
  • the pH is adjusted with aqueous 2 N NaOH or HCl.
  • composition Quantity in percent
  • the culture solution obtained according to Example 2 is centrifuged off and the cell mass is freeze-dried.
  • the clear culture filtrate is adsorbed on Mitsubishi Diaion ® CHP20 (column dimensions 30 x 6 cm) and eluted with an isopropanol gradient 0 - 70% isopropanol (flow 50 ml / min).
  • the fractions containing the Hericenale are combined, concentrated to the water phase in vacuo and lyophilized.
  • 270 mg of the crude mixture obtained in Example 3 are dissolved in 20% aqueous Acetonitrii and initially on a column of Nucleosil 100-12 ® C 18 with a gradient 25-40% Acetonitrii in water with 0.05% trifluoroacetic acid (column dimensions 250 x 32 mm, Flow 50 ml / min) chromatographed.
  • the fractions containing the Hericenale are pooled, concentrated in vacuo and Nucleosil 100-10 ® C 18 AB with the same gradient cleaned on (column dimensions 250 x 20 mm, flow 25 ml / min). After concentration of the fractions and lyophilization, 17.6 mg of a mixture of Hercenal A and Hericenal B are obtained.
  • the mixture is obtained by column chromatography on silica gel 60 (Merck, 0.015-0.040 mm, column volume 5 ml) with dichloromethane / n-butanol 20: 1 as Eluens separated into the individual components.
  • This international depository accepts the microorganism referred to under 1, which it received on 1996-03-20 (date of first deposit) 1 .
  • microorganism referred to under I was received by this international depository on (date of first deposit) and an application for conversion of this first deposit including a deposit in accordance with the Budapest Treaty was received on (date of receipt of the application for conversion).

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft eine Verbindung der Formel (I), worin R?1 bis R10¿ Wasserstoff oder Methyl bedeuten, wobei zwei sich an benachbarten Kohlenstoffatomen befindende R?1 bis R10¿ zusammen mit einer C-C-Einfachbindung für eine C-C-Doppelbindung stehen können, mit der Maßgabe, daß in der mit R?1 bis R10¿ substituierten Kohlenstoffkette jeweils nur einer der Substituenten R?1 bis R10¿ Methyl bedeutet und jeweils nur ein benachbartes Paar dieser Substituenten zu einer C-C-Doppelbindung beiträgt, ein Verfahren zu deren Herstellung sowie deren Verwendung als Arzneimittel, insbesondere zur Therapie von Krankheiten, die durch eine HIV-Infektion hervorgerufen werden.

Description

Neue Benzaldehyd-Derivate aus Hericeum erinaceus
Die Erfindung betrifft neue Benzaldehyd-Derivate, ein Verfahren zu deren Herstellung und ihre Verwendung zur Herstellung eines Arzneimittels, insbesondere zur Behandlung einer Krankheit, welche durch eine HIV-Infektion hervorgerufen wird.
Die Erkrankungen des menschlichen Körpers, die durch den Human Immunodeficiency Virus (HIV) hervorgerufen, werden, sind lebensbedrohend und gehen mit einer Vielzahl von Sekundär-Erkrankungen einher. Die Stärke der Erkrankung ist direkt mit dem Virus-Titer, also der Zahl der im Körper vorhandenen Viren, verbunden. Eine Reduzierung des Virus-Titers stellt eine Möglichkeit dar, den Ausbruch der Krankheit zu verhindern oder den Verlauf der Erkrankung positiv zu beeinflussen. Essentiell für die Vermehrung des Virus ist das Enzym Reverse Transkriptase. Mit Inhibitoren dieses Enzyms konnte gezeigt werden, daß die Virus-Vermehrung deutlich verlangsamt (z.B. Azidothymidin)
Es ist ein Gegenstand der vorliegenden Anmeldung, Inhibitoren der HIV Reversen Transkriptase und damit zur Behandlung von Erkrankungen, welche durch HIV-Infektionen hervorgerufen werden, bereitzustellen.
Von verschiedensten synthetischen und natürlichen Stoffen ist bekannt, daß sie die HIV Reverse Transkriptase inhibieren (vgl z. B. die Übersicht von G.T.Tan et al, Biochem. Biophys. Res. Commun. (1992), 185, 370-378) und damit eine Grundvorraussetzung für die Behandlung von HIV-Infektionen erfüllen. Darüberhinaus ist bekannt, daß Basisiomyceten Sekundärmetabolite mit biologischer Wirkung wie z. B. die Strobilurine (vgl. z. B. S. Zapf et al. Angew. Chemie (1995), 107, 255) bilden. Speziell der Fruchtkörper des Basisiomyceten Hericeum erinaceus bildet als Sekundärmetabolite die Hericenone und das
BESTATIGUNGSKOPIE Hericerin, deren Wirkungen mit cytotoxisch bzw. das Auswachsen von Neuriten aus Nervenzellend stimulieren beschrieben wird (vgl H. Kawagishi et al, Tetrahedr. Lett. (1990), 31 , 373).
Überraschenderweise wurde nun gefunden, daß auch aus dem Mγcel des Basisiomyceten Hericeum erinaceus Sekundärmetabolite isoliert werden können, die die HIV Reverse Transkriptase inhibieren und sich deshalb zur Behandlung von HIV Infektionen eignen. Die Verbindungen und deren physiologisch verträglichen Salze sind bislang unbekannt und sind durch folgende Struktur (Formel I) gekennzeichnet
worin R1 bis R10 Wasserstoff oder Methyl bedeuten, wobei zwei sich an benachbarten Kohlenstoffatomen befindende R1 bis R10 zusammen mit einer C- C-Einfachbindung für eine C-C-Doppelbindung stehen können, mit der Maßgabe, daß in der mit R1 bis R10 substituierten Kohlenstoffkette jeweils nur einer der Substituenten R1 bis R10 Methyl bedeutet und jeweils nur ein benachbartes Paar dieser Substituenten zu einer C-C-Doppelbindung beiträgt.
Vorzugsweise bedeutet R5 in Formel I Methyl.
Besonders bevorzugt bedeuten R3 und R6 (beispielsweise Formel 1 ) oder R6 und R7 (beispielsweise Formel 2) zusammen mit der zwischen den von ihnen substituierten Kohlenstoffatomen liegenden C-C-Einfachbindung eine C-C- Doppelbindung.
Vorzugsweise liegt die Doppelbindung dieser Verbindungen in Z-Konfiguration vor.
Formel 1 Hericenal A Formel 2 Hericenal B
Die neue Verbindung der Formel I, insbesondere die Verbindungenl und 2, und deren physiologisch verträglichen Salze zeichnen sich durch ihre Wirkung gegen die HIV Reverse Transkriptase aus, die derjenigen von anderen Metaboliten aus Basisiomyceten deutlich überlegen ist.
Untersuchung der Substanzen auf Hemmung der HIV-"Reverse Transkriptase"
Die Aktivität der Reversen Transkriptase (RT) wurde mit Hilfe eines "Scintillation Proximity Assay" (SPA) bestimmt. Das Reagenzkit für den RT-SPA wurde von Amersham/Buchler (Braunschweig) bezogen. Das Enzym RT (aus HIV in E. coli cloniert) stammte von der Firma HT-Biotechnology LTD, Cambridge, UK. Ansatz:
Der Test wurde nach dem Methoden-Manual des Herstellers Amersham durchgeführt - mit folgenden Modifikationen:
Dem "Assay"-Puffer wurde Rinderserumalbumin zu der Endkonzentration 0,5 mg/ml zugesetzt.
Der Test wurde in Eppendorf-Reaktionsgefäßen mit 100 I Ansatzvolumen durchgeführt.
Das RT-Konzentrat des Herstellers (5000 U/ml) wurde in Tris-HCl Puffer 20 mM; pH 7,2; 30 % Glycerin auf eine Aktivität von 15 U/ml verdünnt. Die Inkubationszeit für die Ansätze betrug 60 min (37 C). Nach Abstoppen der Reaktion und "Entwicklung" mit der Perlen-Suspension wurden 130 ml Ansatz in 4,5 ml Tris-HCl Puffer, 10 mM; pH 7,4; 0, 1 5 M NaCl transferiert und die Tritium-Aktivität in einem ß-Counter gemessen.
Substanzprüfung:
Für eine Vorprüfung der Inhibitoraktivität wurden die Substanzen in Wasser gelöst {Stammlösung c == 1 mg/ml) und in verschiedenen Verdünnungen (10" , 10~2, 10"3 usw.) getestet.
Zur Bestimmung von ICso-Werten wurden die Inhibitor-Stammlösungen in Wasser weiterverdünnt und in geeigneten Konzentrationen getestet. Aus der graphischen Darstellung RT-Aktivität gegen den Logarithmus der Konzentration der jeweiligen Testsubstanz wurde die einer 50 %igen Enzymhemmung zugehörige Konzentration ermittelt. Substanz IC50 UvM]
(HIV-RT)
Hyphodontal 77
Mniopetal B 91
Mniopetal D 54
Hericenal A 0,37
Weiterhin gehören zum Gegenstand der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zur Herstellung der genannten Verbindungen. Ein Verfahren zur Herstellung der genannten Verbindungen ist dadurch gekennzeichnet, daß der Mikroorganismus Hericeum erinaceus , vorzugsweise Hericeum erinaceus DSM 10600, in einem wäßrigen Medium kultiviert wird und die Zielverbindungen anschließend isoliert und gereinigt werden.
Der Mikroorganismus Hericeum erinaceus DSM 10600 ist am 20. März 1996 bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ), Marscheroder Weg 1 b, D-38124 Braunschweig, nach den Vorschriften des Budapester Vertrags hinterlegt worden.
Anstelle des Stammes DSM 10600 können auch dessen Mutanten und Varianten eingesetzt werden, soweit sie Verbindungen der Formel I synthetisieren können. Solche Mutanten können in an sich bekannter Weise surch physikalische Mittel, beispielsweise Bestrahlung, wie mit Ultraviolett- oder Röntgenstrahlen, oder chemische Mutagene, wie beispielsweise Ethylmethansulfonat (EMS), 2-Hydroxy-4-methoxy-benzophenon (MOB) oder N- Methγl-N ' -nitro-N-nitrosoguanidin (MNNG) erzeugt werden. Die im folgenden beschriebenden Fermentationsbedingungen gelten für Hericeum erinaceus und das hinterlegte Isolat. Die Fermentation kann im Labormaßstab (Milliliter- und Litermaßstab) oder im industriellen Maßstab (Kubikmetermaßstab) erfolgen.
In einer Nährlösung, die eine Kohlenstoffquelle und eine Stickstoffquelle sowie die üblichen anorganischen Salze enthält, produziert Henricium erinaceus, insbesondere H. erinaceus DSM 10600, die Verbindung der Formel I.
Als bevorzugte Kohlenstoffquellen für die aerobe Fermentation eignen sich assimilierbare Kohlenhydrate und Zuckeralkohole, wie Glukose, Laktose oder D- Mnanit sowie kohlenhydrathaltige Naturprodukte, wie z. B. Malzextrakt. Als stickstoffhaltige Nährstoffe kommen in Betracht: Aminosäuren, Peptide und Proteine sowie deren Abbauprodukte, wie Peptone oder Tryptone, ferner Fleischextrakte, gemahlene Samen, beispielsweise von Mais, Weizen, Bohnen, Soja oder der Baumwollpflanze, Destillationsrückstände der Alkoholherstellung, Fleischmehle oder Hefeextrakte, aber auch Ammoniumsalze und Nitrate. An anorganischen Salzen kann die Nährlösung beispielsweise Chloride, Carbonate, Sulfate oder Phasphate der Alkali- oder Erdalkalimetalle, Eisen, Zink, Kobalt und Mangan enthalten.
Die Bildung der Verbindung der Formel I mit H. erinaceus, bevorzugt DSM 10600, verläuft besonders gut in einer Nährlösung, die 0,1 bis 2 %, bevorzugt 0,5 - 1 %, Cornstep, 0,5 bis 10 % bevorzugt 1 bis 5 % Tomatenpaste, 0, 1 bis 5 % bevorzugt 0,5 bis 3 % Hafermehl 0,1 bis 5 % bevorzugt 0,5 bis 3 % Glucose sowie Spurenelemente (% Angaben jeweils bezogen auf das Gewicht der gesamten Nährlösung) enthält. Die Spurenelementlösung kann folgende Zusammensetzung aufweisen:
FeSO4 x 7 H2O 0,01 - 1 % bevorzugt 0,05 - 0,2 %
MuSO4 x 1 H2O 0,01 - 1 % bevorzugt 0,05 - 0,2 % CuCI2 x 2 H2O 0,0005 - 0,01 % bevorzugt 0,001 - 0,005 %
CaCI2 x 2 H2O 0,001 - 0,1 % bevorzugt 0,005 - 0,05 %
H3BO3 0,005 - 0,01 % bevorzugt 0,002 - 0,0075 %
(NH4)6 Mo7 O24 x 4 H2O 0,0005 - 0,01 % bevorzugt 0,001 - 0,005 %
ZnSO4 x 7 H20 0,001 - 0,1 % bevorzugt 0,001 - 0,05 %
Die Kultivierung erfolgt aerob, also beispielsweise submers unter Schütteln oder Rühren oder in Fermentern, gegebenenfalls unter Einführen von Luft oder Wasserstoff. Sie wird in einem Temperaturbereich von 15 bis 30 ° C, vorzugsweise von 20 bis 30 ° C, insbesondere von 23 bis 28 ° C, durchgeführt werden. Der pH-Wert liegt von pH 1 bis 7, vorteilhaft von pH 2,5 bis 4,5. Man kultiviert den Pilz unter diesen Bedingungen über einen Zeitraum von 100 bis 300 Stunden, bevorzugt 120 bis 168 Stunden.
Vorteilhaft kultiviert man in mehreren Stufen, d. h. man stellt zunächst eine oder mehrere Vorkulturen in einem flüssigen Nährmedium her, die dann in das eigentliche Produktionsmedium, die Hauptkultur, beispielsweise im Volumenverhältnis 1 :10, überimpft werden. Die Vorkultur erhält man z. B., indem man Mycel in eine Nährlösung überimpft und etwa 100 bis 200 Stunden, bevorzugt 120 bis 168 Stunden, wachsen läßt. Das Mycel kann beispielsweise erhalten werden, indem man den Stamm 7 bis 40 Tage, bevorzugt 10 bis 20 Tage, auf einem festen oder flüssigen Nährboden, beispielsweise Hefe-Malz- Agar oder Kartoffel-Dextrose-Agar, wachsen läßt.
Der Fermentationsverlauf kann jeweils anhand des pH-Wertes der Kultur oder des Mycelvolumens sowie durch chromatographische Methoden, wie z. B. Dünnschichtchromatographie oder High Pressure Liquid Chromatography, überwacht werden. Die Verbindung der Formel I ist überwiegend im Kulturfiltrat enthalten. Die Isolierung der Verbindung der Formal I aus dem jeweiligen Kulturmedium erfolgt nach bekannten Methoden unter Berücksichtigung der chemischen, physikalischen und biologischen Eigenschaften der Produkte. Es können z. B. das Adsorptions-, lonenaustausch- oder Gelfiltrationsverfahren angewendet werden.
Ethylacetat/Methanol/Wasser-Mischungen werden als Laufmittel in dem Fachmann bekannten Konzentrationen, angewandt. Die Detektion bei der dünnschichtchromatographischen Auftrennung kann beispielswiese auch UV- Löschung und Färbereagentien wie Anisaldehyd, Tetraozolblau oder Orcin gegebenenfalls Zusatz- und/oder Hilfsstoffe in die bzw. eine geeignete Darreichungsform bringt.
In den sich anschließenden Beispielen wird die Erfindung weiter erläutert. Prozentangaben beziehen sich auf das Gewicht, Mischungsverhältnisse bei Flüssigkeiten beziehen sich auf das Volumen, wenn keine anderen Angaben gemacht wurden.
Die Hericenale können sowohl im Mycel als auch im Kulturfiltrat vorkommen, gewöhnlich befindet sich die Hauptmenge im Kulturfiltrat. Es ist deshalb zweckmäßig, die Zellmasse durch Filtration oder Zentrifügation vom Filtrat zu trennen. Das Filtrat wird lyophilisiert und das Lyophilisat mit einem Lösungmittel wie Methanol oder Acetonitrii oder 1 -Butanol extrahiert. In gleicher Weise können Hericenale aus dem Mycel extrahiert werden. Die Extraktionen können über einen weiten pH-Bereich durchgeführt werden, zweckmäßig ist ein Bereich von pH 3.0 - pH 7.5.
Eine andere Methode der Isolierung ist die Lösungs- Verteilung in an sich bekannter Weise. Eine weitere Methode der Reinigung ist die Chromatographie an Adsorptionsharzen wie z.B. an Diaion* HP-20 (Mitsubishi Casei Corp., Tokyo) an Amberlite® XAD 7 (Rohm und Haas, USA) an Amberchrom® CG (Toso Haas, Philadelphia, USA) oder an ähnlichen Trägern. Geeignet sind darüberhinaus zahlreiche reversed-phase Träger, z.B. RP-18, wie sie in der Hopchdruckflüssigkeits-Chromatographie allgemein verwendet werden. Eine weitere Reinigungsmöglichkeit für die Hericenale besteht in der Verwendung sogenannter straight-Phase Träger wie z. B. Kieselgel oder Aluminiumoxid, oder anderen in an sich bekannter Weise. Geeignet zur Elution sind viele Lösungsmittel wie z.B. Chloroform/Methanol- oder Dichlormethan/n-Butanol- Gemische.
Ein alternatives Verfahren zur Isolierung der Texenomycine ist die Verwendung sog. Molekularsiebe, wie z.B. Fractogel® TSK HW-40, Sephadex® LH-20 und andere in an sich bekannter Weise. Es ist darüberhinaus auch möglich, die Texenomycine aus angereichertem Material durch Kristallisation zu gewinnen. Geeignet hierzu sind z.B. organische Lösungsmittel und ihre Gemische, wasserfrei oder mit Wasserzusatz. Ebenso können Zusätze von Säuren, wie z.B. Trifluoressigsäure, Schwefelsäure, Salzsäure, Ameisensäure oder andere von Vorteil sein.
Die Verbindungen der Formel I und deren physiologisch verträglichen Salze sind ferner als Therapeutikum gegen Krankheiten geeignet, welche durch eine HIV- Infektion hervorgerufen werden. Demgemäß betrifft die vorliegende Erfindung betrifft ferner auch die Verbindung der Formel I oder ein physiologisch verträgliches Salz derselben zur Verwendung als Arzneimittel, vorzugsweise zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung einer Krankheit welche durch eine HIV-Infektion hervorgerufen wird. Die Arzneimittel können eine oder mehrere Verbindungen der Formel I oder deren physiologisch verträglichen Salze sowie pharmazeutische Hilfsstoffe enthalten.
Die vorliegende Erfindung betrifft ferner Hericeum erinaceus DSM 10600 sowie dessen Mutanten und Varianten.
Beispiele
1. a) Herstellung von Mycel des Produzentenstammes H. erinaceus DSM 10600
100 ml Nährlösung (20 g Malzextrakt, 2 g Hefeextrakt, 10 g Glucose, 0,5 g (NH4)2HPO4 in 1 I Leitungswasser, pH-Wert vor der Sterilisation 6,0) in einem 500 ml sterilen Erlenmeyerkolben werden mit dem Stamm DSM 7427 beimpft und 240 Stunden bei 25 °C und 140 UpM auf einer rotierenden Schüttelmaschine inkubiert. Anschließend werden 20 ml Kulturflüssigkeit in einem sterilen 500 ml Erlenmeyerkolben mit dem Nährboden [Kartoffelinfus 4,0 g/1 (Infus aus 200 g Kartoffel in 1000 ml H2O), 20,0 g D-Glucose, pH vor der Sterilisation 5,6] dem zusätzlich 15 g Agar/I zur Verfestigung zugegeben wurde, gleichmäßig verteilt und dekantiert. Die Kulturen werden 10 bis 21 Tage bei 25 °C inkubiert. Das nach diesr Zeit entstandene Mycel eines Kolben wird mit einer sterilen Impfnadel abgenommen, sofort weiterverwendet oder bei - 4°C in Wasser aufbewahrt.
b) Herstellung einer Vorkultur des Produzentestammes
Ein steriler 500 ml Erlenmeyerkolben mit 100 ml der unter a) beschriebenen Nährlösung wird mit einer auf einem Schrägröhrchen gewachsenen Kultur oder mit einem 1 Quadratzentimeter großen Agarstück angeimpft und auf einer Schüttelmaschine bei 140 UpM und 25 °C inkubiert. Die maximale Produktion einer Verbindung der Formel I ist nach ca. 168 Stunden erreicht. Zum Animpfen von 4 (500 ml in 200 ml Erlenmeyer) genügt eine 1 68 Stunden alte Submerskultur (Animpfmenge ca. 5 %) aus der gleichen Nährlösung.
2. Herstellung der Verbindungen der Formeln 1 und 2
Ein 2000 ml Erlenmeyer Schüttelkolben wird unter folgenden Bedingungen betrieben:
5 g/l Cornsteep 10 g / 1 Glucose
4 g/l Tomatenpaste 10 ml / 1 Spurenelementlösung
10 g/l Hafermehl pH 6,8 (vor der Sterilisation)
Der pH-Wert wird mit wäßriger 2 N NaOH oder HCI eingestellt.
Inkubationszeit: 168 Stunden
Inkubationstemperatur: 25 °C Schüttelgeschwindigkeit: 140 Rpm
Spurenelementlösung
Zusammensetzung: Menge in Prozent
FeSo^ H2O 0,100
MnSO4_1 H2O 0,100
CuCI2_2 H2O 0,0025
CaCI2_2 H2O 0,010
H3BO3 0,0056
(NH4) 6Mo7024_4 H2O 0,0019
ZnSO4_7 H2O 0,020 3. Isolierung der Hericenale
Die nach Beispiel 2 gewonnene Kulturlösung wird abzentrifugiert und die Zellmasse wird gefriergetrocknet. Das klare Kulturfiltrat wird an Mitsubishi Diaion® CHP20 adsorbiert Säulenmaße 30 x 6 cm) und mit einem Isopropanol Gradienten 0 - 70 % Isopropanol eluiert (Fluß 50 ml/min). Die die Hericenale enthaltenden Fraktionen werden vereinigt, im Vakuum bis auf die Wasserphase eingeengt und lyophilisiert.
4. Reinigung der Hericenale
270 mg des in Beispiel 3 erhaltenen Rohgemisches werden in 20 % wäßrigem Acetonitrii gelöst und zunächst an einer Säule mit Nucleosil® 100-12 C18 mit einem Gradienten von 25 - 40 % Acetonitrii in Wasser mit 0.05 % Trifluoressigsäure (Säulenmaße 250 x 32 mm, Fluß 50 ml/min) chromatographiert. Die Fraktionen, die die Hericenale enthalten, werden vereinigt, im Vakuum konzentriert und an Nucleosil® 100-10 C18 AB mit dem gleichen Gradienten endgereinigt (Säulenmaße 250 x 20 mm, Fluß 25 ml/min). Nach Konzentration der Fraktionen und Lyophilisation werden 17,6 mg eines Gemisches aus Hercenal A und Hericenal B. Das Gemisch wird durch Säulenchromatographie an Kieselgel 60 (Merck, 0,015 - 0,040 mm, Säulenvolumen 5 ml) mit Dichlormethan /n-Butanol 20:1 als Eluens in die Einzelkomponenten getrennt.
INTERNATIONALES FORMBLATT
Hoechst AG
Zentrale Pharma Forschung
Gebäude H 780
65926 Frankfurt/Main EMPFANGSBESTÄTIGUNG BEI ERSTHΓNTERLEGUNG, ausgestellt gemäß Regel 7.1 von der unten angegebenen INTERNATIONALEN HINTERLEGUNGSSTELLE
I. KENNZEICHNUNG DES MIKROORGANISMUS
Vom HINTERLEGER zugeteiltes Bezugszeichen: Von der INTERNATIONALEN HINTERLEGUNGSSTELLE zugeteilte EINGANGSNUMMER:
HAG 000 951
DSM 10600
II. WISSENSCHAFTLICHE BESCHREIBUNG UND/ODER VORGESCHLAGENE TAXONOMISCHE BEZEICHNUNG
Mit dem unter I. bezeichneten Mikroorganismus wurde
( ) eine wissenschaftliche Beschreibung
(X ) eine vorgeschlagene taxonomische Bezeichnung eingereicht (Zutreffendes ankreuzen).
III. EINGANG UND ANNAHME
Diese internationale Hinterlegungsstelle nimmt den unter 1 bezeichneten Mikroorganismus an, der bei ihr am 1996 - 03 - 20 (Datum der Ersthinterlegung)1 eingegangen ist.
IV. EINGANG DES ANTRAGS AUF UMWANDLUNG
Der unter I bezeichnete Mikroorganismus ist bei dieser Internationalen Hinterlegungsstelle am eingegangen (Datum der Erst¬ hinterlegung) und ein Antrag auf Umwandlung dieser Ersthinterlegung ui eine Hinterlegung gemäß Budapester Vertrag ist am eingegangen (Datum des Eingangs des Antrags auf Umwandlung).
V. INTERNATIONALE HINTERLEGUNGSSTELLE
Name: DSMZ-DEUTSCHE SAMMLUNG VON Unterschriften) der zur Vertretung der internationalen Hinterlegungsstelle
MIKROORGANISMEN UND ZELLKULTUREN GmbH befugten Ferson(en) oder des (der) von ihr ermächtigten Bediensteten:
Anschrift Mascheroder Weg lb D-38124 Braunschweig L>. UJ^ύ*
Datum: 1996 - 03 - 26
' Falls Regel 64 Buchstabe d zutπfft, ist dies der Zeitpunkt zu dem der Status einer intemaüonalen Hinterlegungsstelle erworben worden ist Formblatt DSMZ-BP/4 (einzige Seite) 0196 INTERNATIONALES FORMBLATT
Hoechst AG
Zentrale Pharma Forschung
Gebäude H 780
65926 Frankfurt/Main LEBENSFÄKGKEITSBESCHEINIGUNG ausgestellt gemäß Regel 102 von der unten angegebenen
INTERNATIONALEN HINTERLEGUNGSSTELLE
I. HINTERLEGER II. KENNZEICHNUNG DES MIKROORGANISMUS
Name: Hoechst AG Von der INTERNATIONALEN HINTERLEGUNGSSTELLE
Zentrale Pharma Forschung zugeteilte EINGANGSNUMMER: Anschrift: Gebäude H 780 DSM 10600
65926 Frankfurt /Main Datum der Hinterlegung oder Weiterleitung': 1996 - 03 - 20
in. LEBENSFÄHIGKEITSBESCHEINIGUNG
Die Lebensfähigkeit des unter II genannten Mikroorganismus ist am 1996 - 03 - 20 * geprüft worden. Zu diesem Zeitpunkt war der Mikroorganismus
(X)1 lebensfähig
( )' nicht mehr lebensfähig
(V. BEDINGUNGEN, UNTER DENEN DIE LEBENSFAHIGKErrSPRUFUNC DURCHGEFÜHRT WORDEN IST*
V. INTERNATIONALE HttπΕRLEGUNGSSTELLE
Name: DSMZ-DEUTSCHE SAMMLUNG VON Unterschrift(en) der zur Vertretung der intemaüonalen Hinterlegungsstelle
MIKROORGANISMEN UND ZELLKULTUREN GmbH befugten Person(en) oder des (der) von ihr ermächtigten Bediensteten:
Anschrift: Mascheroder Weg lb D-38124 Braunschweig
Datum: 1996 - 03 -26
Angabe des Datums der Ersthinteriegung. Wenn eine erneute Hinterlegung oder eine Weiterleiiung vorgenommen worden ist Angabe des Datums der jeweils letzten erneuten Hinterlegung oder Weiterleitung.
In den in Regei 102 Buchstabe a Ziffer ii und iii vorgesehenen Fällen Angabe der letzten Lebensfähigkeitsprufung.
Zutreffendes ankreuzen.
Ausfüllen, wenn die Angaben beantragt worden sind und wenn die Ergebnisse der Prüfung negativ waren.
Formblatt DSMZ-BP/9 (einzige Seite) 0196

Claims

Patentansprüche:
1. Verbindung der Formel I
oder ein physiologisch verträgliches Salz derselben, worin R1 bis R10 Wasserstoff oder Methyl bedeuten, wobei zwei sich an benachbarten Kohlenstoffatomen befindende R1 bis R10 zusammen mit einer C-C- Einfachbindung für eine C-C-Doppelbindung stehen können, mit der Maßgabe, daß in der mit R1 bis R10 substituierten Kohlenstoffkette jeweils nur einer der Substituenten R1 bis R10 Methyl bedeutet und jeweils nur ein benachbartes Paar dieser Substituenten zu einer C-C- Doppelbindung beiträgt.
Verbindung nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, daß R5 Methyl bedeutet.
Verbindung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß R3 und R6 zusammen mit der zwischen den von ihnen substituierten Kohlenstoffatomen liegenden C-C-Einfachbindung eine C-C- Doppelbindung bedeuten.
4. Verbindung nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Doppelbindung in Z-Konfiguration vorliegt.
5. Verbindung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß R6 und R7 zusammen mit der zwischen den von ihnen substituierten Kohlenstoffatomen liegenden C-C-Einfachbindung eine C-C- Doppelbindung bedeuten.
6. Verbindung nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Doppelbindung in Z-Konfiguration vorliegt.
7. Verfahren zur Herstellung einer Verbindung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß der Mikroorganismus Hericeum erinaceus in einem wäßrigen Medium kultiviert wird und die Zielverbindung anschließend isoliert und gereinigt wird.
8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß Hericeum erinaceus DSM 10600 eingesetzt wird.
9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß Mutanten oder Varianten des Mikroorganismus Hericeum erinaceus DSM 10600 eingesetzt werden.
10. Verbindung oder ein physiologisch verträgliches Salz derselben gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6 zur Verwendung als Arzneimittel.
11. Verwendung einer Verbindung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6 oder eines physiologisch verträglichen Salzes derselben zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung einer Krankheit, welche durch eine HIV- Infektion hervorgerufen wird.
12. Arzneimittel enthaltend mindestens eine Verbindung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6 oder ein physiologisch verträgliches Salz derselben sowie pharmazeutische Hilfsstoffe.
13. Hericeum erinaceus DSM 10600 sowie dessen Mutanten und Varianten.
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