JP2000290291A - 安定同位体標識オリゴヌクレオチド及びオリゴヌクレオチド検出方法 - Google Patents
安定同位体標識オリゴヌクレオチド及びオリゴヌクレオチド検出方法Info
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 生体内における分布や構造を経時的に測定す
ることが可能なアンチセンスオリゴヌクレオチド配列、
及びその検出方法を提供すること。 【解決手段】 天然型若しくは非天然型のヌクレオチ
ド、又はペプチド核酸を構成単位とし、各構成単位中の
炭素原子及び窒素原子をそれぞれ13Ｃ及び15Ｎで置換し
たアンチセンス鎖を、15Ｎ-1Ｈ又は13Ｃ -1Ｈ 異核種多
量子コヒーレンス分光法等のＮＭＲ法により検出する。
ることが可能なアンチセンスオリゴヌクレオチド配列、
及びその検出方法を提供すること。 【解決手段】 天然型若しくは非天然型のヌクレオチ
ド、又はペプチド核酸を構成単位とし、各構成単位中の
炭素原子及び窒素原子をそれぞれ13Ｃ及び15Ｎで置換し
たアンチセンス鎖を、15Ｎ-1Ｈ又は13Ｃ -1Ｈ 異核種多
量子コヒーレンス分光法等のＮＭＲ法により検出する。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、安定同位体で標識
したアンチセンスなオリゴヌクレオチド及びペプチド核
酸、並びに外来性アンチセンス鎖の検出方法に関する。
したアンチセンスなオリゴヌクレオチド及びペプチド核
酸、並びに外来性アンチセンス鎖の検出方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】癌、遺伝病、ＡＩＤＳなどの疾病の治療
用として、アンチセンス技術を利用したアンチセンス医
薬が近年注目されている。アンチセンス医薬とは、病気
の原因である特定遺伝子の配列の一部に相補的（アンチ
センス）な配列を有するオリゴヌクレオチド等のことで
あり、これを体内（標的細胞）に導入して原因遺伝子の
転写産物であるｍＲＮＡまたはその前駆体と特異的な二
本鎖を形成させることにより、翻訳や前駆体ｍＲＮＡの
プロセッシングを阻害するものである。そしてこの阻害
により病気の発症を抑制することが可能とするものであ
る。アンチセンス医薬の効果は、オリゴヌクレオチドの
標的部位へのデリバリー技術に大きく依存する。なぜな
らば、通常、生体内には核酸を分解するヌクレアーゼが
存在しているため、導入されたオリゴヌクレオチドが標
的部位に届く前にヌクレアーゼによる消化を受けてしま
うと、標的部位で相補的二本鎖を形成することができ
ず、効果が得られないからである。例えば、エンドサイ
トーシスにより細胞に取り込まれた核酸は、細胞内のリ
ソソームにとりこまれ、リソソーム内のヌクレアーゼに
より分解されてしまう。従って、導入したオリゴヌクレ
オチドが核内、又は細胞質内で標的の転写産物と二本鎖
を形成することができず、効果を発揮することができな
い。このような問題を回避することが可能である有用な
デリバリー技術としてはリポソーム調製物に代表される
ような細胞導入剤が挙げられるが、これにより一定の成
果があげられている。
用として、アンチセンス技術を利用したアンチセンス医
薬が近年注目されている。アンチセンス医薬とは、病気
の原因である特定遺伝子の配列の一部に相補的（アンチ
センス）な配列を有するオリゴヌクレオチド等のことで
あり、これを体内（標的細胞）に導入して原因遺伝子の
転写産物であるｍＲＮＡまたはその前駆体と特異的な二
本鎖を形成させることにより、翻訳や前駆体ｍＲＮＡの
プロセッシングを阻害するものである。そしてこの阻害
により病気の発症を抑制することが可能とするものであ
る。アンチセンス医薬の効果は、オリゴヌクレオチドの
標的部位へのデリバリー技術に大きく依存する。なぜな
らば、通常、生体内には核酸を分解するヌクレアーゼが
存在しているため、導入されたオリゴヌクレオチドが標
的部位に届く前にヌクレアーゼによる消化を受けてしま
うと、標的部位で相補的二本鎖を形成することができ
ず、効果が得られないからである。例えば、エンドサイ
トーシスにより細胞に取り込まれた核酸は、細胞内のリ
ソソームにとりこまれ、リソソーム内のヌクレアーゼに
より分解されてしまう。従って、導入したオリゴヌクレ
オチドが核内、又は細胞質内で標的の転写産物と二本鎖
を形成することができず、効果を発揮することができな
い。このような問題を回避することが可能である有用な
デリバリー技術としてはリポソーム調製物に代表される
ような細胞導入剤が挙げられるが、これにより一定の成
果があげられている。
【０００３】一方、オリゴヌクレオチドの構成単位であ
るヌクレオチドを非天然型の修飾ヌクレオチドにし、ヌ
クレアーゼによる分解を受けにくい非天然型修飾オリゴ
ヌクレオチドとすることによるアンチセンス鎖の安定性
向上も図られ、これによってもアンチセンス医薬の効果
の改善が図られている。
るヌクレオチドを非天然型の修飾ヌクレオチドにし、ヌ
クレアーゼによる分解を受けにくい非天然型修飾オリゴ
ヌクレオチドとすることによるアンチセンス鎖の安定性
向上も図られ、これによってもアンチセンス医薬の効果
の改善が図られている。
【０００４】ところで、治療薬の開発においては薬物の
吸収、代謝、排泄について薬物動態試験が実施される。
薬物動態試験は、放射性同位元素等で標識した被験物質
（薬物）を実験動物へ投与し、その濃度及び放射能レベ
ルを定量的且つ経時的に測定することにより行われてい
る。アンチセンス医薬についても例外ではなく、放射性
同位元素等で標識されたアンチセンスオリゴヌクレオチ
ドの動態試験が行われる。
吸収、代謝、排泄について薬物動態試験が実施される。
薬物動態試験は、放射性同位元素等で標識した被験物質
（薬物）を実験動物へ投与し、その濃度及び放射能レベ
ルを定量的且つ経時的に測定することにより行われてい
る。アンチセンス医薬についても例外ではなく、放射性
同位元素等で標識されたアンチセンスオリゴヌクレオチ
ドの動態試験が行われる。
【０００５】アンチセンスオリゴヌクレオチド医薬の利
用において、その機能が充分に発揮されるには、そのヌ
クレオチドが細胞内で配列及び長さにおいて保存されて
いる必要があるが、従来の放射性同位元素等を用いた動
態試験では、体内分布、吸収率や、排泄率等はわかるも
のの、オリゴヌクレオチドの配列及び長さの保存につい
ての情報は得ることができない。従って、オリゴヌクレ
オチドの保存性を確認するには実験動物より採取した血
液や臓器等から核酸を抽出し、その中に含まれるオリゴ
ヌクレオチドを高速液体クロマトグラフィー、サザンブ
ロット又はノーザンブロット、或いはキャピラリー電気
泳動等により分析して、オリゴヌクレオチドの保存状態
について確認する必要があった。また、投与したアンチ
センスヌクレオチドの長さの経時変化（分解の進行度）
を見ることは事実上は不可能であった。更に、標的のｍ
ＲＮＡ又は前駆体ｍＲＮＡと、細胞内に導入したオリゴ
ヌクレオチドが、相補的な二本鎖を形成しているか否か
を確認する手段はなく、オリゴヌクレオチドの導入によ
り効果が出ているかどうかについては、導入細胞の生理
的、又は形態的な変化に基づいて、細胞学的に判断する
しかなかった。又、従来の動態試験では放射性同位元素
を使用することが避けられなかっため、その取扱いにあ
たっては所定の法令に基づく特別の施設、及び熟練した
技術者が必要であった。
用において、その機能が充分に発揮されるには、そのヌ
クレオチドが細胞内で配列及び長さにおいて保存されて
いる必要があるが、従来の放射性同位元素等を用いた動
態試験では、体内分布、吸収率や、排泄率等はわかるも
のの、オリゴヌクレオチドの配列及び長さの保存につい
ての情報は得ることができない。従って、オリゴヌクレ
オチドの保存性を確認するには実験動物より採取した血
液や臓器等から核酸を抽出し、その中に含まれるオリゴ
ヌクレオチドを高速液体クロマトグラフィー、サザンブ
ロット又はノーザンブロット、或いはキャピラリー電気
泳動等により分析して、オリゴヌクレオチドの保存状態
について確認する必要があった。また、投与したアンチ
センスヌクレオチドの長さの経時変化（分解の進行度）
を見ることは事実上は不可能であった。更に、標的のｍ
ＲＮＡ又は前駆体ｍＲＮＡと、細胞内に導入したオリゴ
ヌクレオチドが、相補的な二本鎖を形成しているか否か
を確認する手段はなく、オリゴヌクレオチドの導入によ
り効果が出ているかどうかについては、導入細胞の生理
的、又は形態的な変化に基づいて、細胞学的に判断する
しかなかった。又、従来の動態試験では放射性同位元素
を使用することが避けられなかっため、その取扱いにあ
たっては所定の法令に基づく特別の施設、及び熟練した
技術者が必要であった。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】本発明は上記した問題
に鑑みてなされたものであり、アンチセンスオリゴヌク
レオチド医薬の生体内における分布、保存状態、及び構
造を経時的に測定することを可能とする、安定同位体で
標識されたアンチセンスオリゴヌクレオチド配列又はア
ンチセンスなペプチド核酸配列、及びこれらの配列の検
出方法を提供することを目的とする。
に鑑みてなされたものであり、アンチセンスオリゴヌク
レオチド医薬の生体内における分布、保存状態、及び構
造を経時的に測定することを可能とする、安定同位体で
標識されたアンチセンスオリゴヌクレオチド配列又はア
ンチセンスなペプチド核酸配列、及びこれらの配列の検
出方法を提供することを目的とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】上記課題を解決し本発明
の目的を達成するため、本発明は以下のごとく構成され
ている。即ち、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチ
ド配列及びアンチセンスなペプチド核酸配列は、構成原
子のＣの内の少なくとも一つが13Ｃで置換され、構成原
子のＮの内の少なくとも一つが15Ｎで置換されたヌクレ
オチド又はペプチド核酸を少なくとも一つ構成単位とし
て含む、一本鎖ＲＮＡ又は一本鎖若しくは二本鎖ＤＮＡ
であって、ハイブリッドを形成させる所望の標的配列
に対して相補的な、１０乃至１００塩基の長さを有して
いる。そしてこのアンチセンスオリゴヌクレオチド配列
及びアンチセンスなペプチド核酸配列における前記オリ
ゴヌクレオチドは、 １）リボース又はデオキシリボースの３'−ＯＨと５'−
ＯＨとがホスホジエステル結合で架橋されている天然型
オリゴヌクレオチド； ２）前記天然型オリゴヌクレオチドのホスホジエステル
結合の内、非架橋酸素原子の１個又は２個を硫黄原子で
置換したホスホロチオエートオリゴヌクレオチド；又
は、 ３）上記天然型オリゴヌクレオチドのホスホジエステル
結合の内、水酸基中の酸素原子をメチル基に置換したメ
チルホスホネートオリゴヌクレオチドであり、一方、前
記ペプチド核酸は、プリン又はピリミジンの塩基を有
し、前記の塩基同士が互いにペプチド結合により結合さ
れて２−アミノエチルグリシン骨格を有するペプチド核
酸配列を形成していることを特徴としている。
の目的を達成するため、本発明は以下のごとく構成され
ている。即ち、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチ
ド配列及びアンチセンスなペプチド核酸配列は、構成原
子のＣの内の少なくとも一つが13Ｃで置換され、構成原
子のＮの内の少なくとも一つが15Ｎで置換されたヌクレ
オチド又はペプチド核酸を少なくとも一つ構成単位とし
て含む、一本鎖ＲＮＡ又は一本鎖若しくは二本鎖ＤＮＡ
であって、ハイブリッドを形成させる所望の標的配列
に対して相補的な、１０乃至１００塩基の長さを有して
いる。そしてこのアンチセンスオリゴヌクレオチド配列
及びアンチセンスなペプチド核酸配列における前記オリ
ゴヌクレオチドは、 １）リボース又はデオキシリボースの３'−ＯＨと５'−
ＯＨとがホスホジエステル結合で架橋されている天然型
オリゴヌクレオチド； ２）前記天然型オリゴヌクレオチドのホスホジエステル
結合の内、非架橋酸素原子の１個又は２個を硫黄原子で
置換したホスホロチオエートオリゴヌクレオチド；又
は、 ３）上記天然型オリゴヌクレオチドのホスホジエステル
結合の内、水酸基中の酸素原子をメチル基に置換したメ
チルホスホネートオリゴヌクレオチドであり、一方、前
記ペプチド核酸は、プリン又はピリミジンの塩基を有
し、前記の塩基同士が互いにペプチド結合により結合さ
れて２−アミノエチルグリシン骨格を有するペプチド核
酸配列を形成していることを特徴としている。
【０００８】本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド
配列及びアンチセンスなペプチド核酸配列においては、
各構成単位であるヌクレオチド又はペプチド核酸の全て
において、全炭素原子が13Ｃで置換され、全窒素原子が
15Ｎで置換されていることが好ましい。
配列及びアンチセンスなペプチド核酸配列においては、
各構成単位であるヌクレオチド又はペプチド核酸の全て
において、全炭素原子が13Ｃで置換され、全窒素原子が
15Ｎで置換されていることが好ましい。
【０００９】本発明の組成物は、上記のアンチセンスオ
リゴヌクレオチド配列又はアンチセンスなペプチド核酸
配列と、薬学的に許容される担体を含むことを特徴とし
ている。
リゴヌクレオチド配列又はアンチセンスなペプチド核酸
配列と、薬学的に許容される担体を含むことを特徴とし
ている。
【００１０】本発明の、安定同位体を含有したアンチセ
ンスオリゴヌクレオチド配列若しくはこの分解物、又は
安定同位体を含有したアンチセンスなペプチド核酸配列
若しくはこの分解物の検出方法は、ハイブリッドを形成
させる所望の標的配列に対して相補的な配列を有するア
ンチセンスオリゴヌクレオチド配列又はアンチセンスな
ペプチド核酸配列を投与された試験対象動物より、血
液、組織、器官、体液、細胞、又は排泄物の少なくとも
一つの被測定物を採取するか、又は、ハイブリッドを形
成させる所望の標的配列に対して相補的な配列を有する
アンチセンスオリゴヌクレオチド配列又はアンチセンス
なペプチド核酸配列を投与された試験対象培養細胞を被
測定物として採取する工程と、前記の採取した被測定物
由来のアンチセンスオリゴヌクレオチド又はアンチセン
スなペプチド核酸を核磁気共鳴分光法により測定する工
程を具備し、前記のアンチセンスオリゴヌクレオチド配
列又はアンチセンスなペプチド核酸配列が、上記した本
発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド配列又はアンチ
センスなペプチド核酸配列であることを特徴としてい
る。
ンスオリゴヌクレオチド配列若しくはこの分解物、又は
安定同位体を含有したアンチセンスなペプチド核酸配列
若しくはこの分解物の検出方法は、ハイブリッドを形成
させる所望の標的配列に対して相補的な配列を有するア
ンチセンスオリゴヌクレオチド配列又はアンチセンスな
ペプチド核酸配列を投与された試験対象動物より、血
液、組織、器官、体液、細胞、又は排泄物の少なくとも
一つの被測定物を採取するか、又は、ハイブリッドを形
成させる所望の標的配列に対して相補的な配列を有する
アンチセンスオリゴヌクレオチド配列又はアンチセンス
なペプチド核酸配列を投与された試験対象培養細胞を被
測定物として採取する工程と、前記の採取した被測定物
由来のアンチセンスオリゴヌクレオチド又はアンチセン
スなペプチド核酸を核磁気共鳴分光法により測定する工
程を具備し、前記のアンチセンスオリゴヌクレオチド配
列又はアンチセンスなペプチド核酸配列が、上記した本
発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド配列又はアンチ
センスなペプチド核酸配列であることを特徴としてい
る。
【００１１】本発明の、安定同位体を含有したオリゴヌ
クレオチド配列及びこの分解物、又は安定同位体を含有
したアンチセンスなペプチド核酸配列及びこの分解物の
検出方法は、上記した本発明のアンチセンスオリゴヌク
レオチド配列又はアンチセンスなペプチド核酸配列を投
与された試験対象動物を磁気共鳴イメージングにかける
工程を具備することを特徴としている。
クレオチド配列及びこの分解物、又は安定同位体を含有
したアンチセンスなペプチド核酸配列及びこの分解物の
検出方法は、上記した本発明のアンチセンスオリゴヌク
レオチド配列又はアンチセンスなペプチド核酸配列を投
与された試験対象動物を磁気共鳴イメージングにかける
工程を具備することを特徴としている。
【００１２】
【発明の実施の形態】以下、本発明のアンチセンスオリ
ゴヌクレオチド配列及びアンチセンスなペプチド核酸配
列について説明する。本発明のアンチセンスオリゴヌク
レオチド配列及びアンチセンスなペプチド核酸配列（以
下、本願においては、アンチセンス鎖と呼ぶこともあ
る）の構成単位であるヌクレオチド及びペプチド核酸
は、天然型のヌクレオチド、又は非天然型の、ヌクレオ
チド若しくはペプチド核酸である。天然型のヌクレオチ
ドとしては、アデノシン、グアノシン等のプリンヌクレ
オチドや、チミジン、ウリジン、シチジン等のピリミジ
ンヌクレオチドが含まれる。非天然型のヌクレオチドと
しては、そのリン酸基の１個又は２個の酸素原子を硫黄
原子で置換したホスホロチオエートヌクレオチド、及び
そのリン酸基における水酸基中の酸素原子をメチル基に
置換したメチルホスホネートヌクレオチド、並びに２−
アミノエチルグリシン骨格に塩基を配した人工核酸であ
るペプチド核酸が含まれる。
ゴヌクレオチド配列及びアンチセンスなペプチド核酸配
列について説明する。本発明のアンチセンスオリゴヌク
レオチド配列及びアンチセンスなペプチド核酸配列（以
下、本願においては、アンチセンス鎖と呼ぶこともあ
る）の構成単位であるヌクレオチド及びペプチド核酸
は、天然型のヌクレオチド、又は非天然型の、ヌクレオ
チド若しくはペプチド核酸である。天然型のヌクレオチ
ドとしては、アデノシン、グアノシン等のプリンヌクレ
オチドや、チミジン、ウリジン、シチジン等のピリミジ
ンヌクレオチドが含まれる。非天然型のヌクレオチドと
しては、そのリン酸基の１個又は２個の酸素原子を硫黄
原子で置換したホスホロチオエートヌクレオチド、及び
そのリン酸基における水酸基中の酸素原子をメチル基に
置換したメチルホスホネートヌクレオチド、並びに２−
アミノエチルグリシン骨格に塩基を配した人工核酸であ
るペプチド核酸が含まれる。
【００１３】又、この構成単位は、その構成原子の炭素
原子の内の少なくとも一つが13Ｃで置換され、またその
構成原子の窒素原子の内の少なくとも一つが15Ｎで置換
されたものである。アンチセンス鎖中の炭素原子の置換
を行なうので、被測定物中におけるアンチセンス鎖の存
在を13Ｃ - 1Ｈ異核種多量子コヒーレンス分光法（以
下、ＨＭＱＣ法と呼ぶ）や13Ｃ - 1Ｈ異核種単量子コヒ
ーレンス分光法（以下、ＨＳＱＣ法と呼ぶ）などの核磁
気共鳴分光法により確認することが可能となる。更に、
アンチセンス中の窒素原子の置換を行なうので、アンチ
センス鎖が塩基対を形成しているか否かを15Ｎ - 1Ｈ
ＨＭＱＣ法や15Ｎ - 1Ｈ ＨＳＱＣ法等の核磁気共鳴分
光法により確認することができる。
原子の内の少なくとも一つが13Ｃで置換され、またその
構成原子の窒素原子の内の少なくとも一つが15Ｎで置換
されたものである。アンチセンス鎖中の炭素原子の置換
を行なうので、被測定物中におけるアンチセンス鎖の存
在を13Ｃ - 1Ｈ異核種多量子コヒーレンス分光法（以
下、ＨＭＱＣ法と呼ぶ）や13Ｃ - 1Ｈ異核種単量子コヒ
ーレンス分光法（以下、ＨＳＱＣ法と呼ぶ）などの核磁
気共鳴分光法により確認することが可能となる。更に、
アンチセンス中の窒素原子の置換を行なうので、アンチ
センス鎖が塩基対を形成しているか否かを15Ｎ - 1Ｈ
ＨＭＱＣ法や15Ｎ - 1Ｈ ＨＳＱＣ法等の核磁気共鳴分
光法により確認することができる。
【００１４】本発明においてアンチセンス鎖の標的は、
目的に応じて適宜選択され、且つ配列が既知のものであ
る。アンチセンス鎖の長さとしては、アンチセンス鎖の
合成にかかる費用、及び標的配列との安定なハイブリッ
ド形成能を考慮すると、１０〜１００塩基の範囲にある
ことが好ましく、１５〜５０塩基の範囲にあることがよ
り好ましい。アンチセンス鎖の長さが１０塩基未満だ
と、in vivoでの標的の配列との間に安定なハイブリッ
ドを形成することがより困難になり、一方、アンチセン
ス鎖の長さが１００塩基を越えると安定同位体を含有す
るアンチセンス鎖の合成にかかる費用が多大となるため
に好ましくない。アンチセンス鎖は、その構成単位のヌ
クレオチドやペプチド核酸の炭素原子、及び窒素原子
が、それぞれ濃縮された13Ｃ及び15Ｎで置換されたもの
を利用し、当該技術分野で周知の方法により合成され
る。合成使用する構成単位は、例えば、日本酸素株式会
社より入手できるものであり、その合成方法について
は、特開平６−３１９５８１号公報や特開平７−１１５
９８７号公報に詳細が記載されている。従って、この方
法により合成される本願のアンチセンス鎖においては、
13Ｃ及び15Ｎが天然の存在比以上の割合で含まれている
ことになり、分子中の炭素原子及び窒素原子のそれぞれ
が、９０％以上の13Ｃ及び15Ｎで置換されていることが
好ましい。
目的に応じて適宜選択され、且つ配列が既知のものであ
る。アンチセンス鎖の長さとしては、アンチセンス鎖の
合成にかかる費用、及び標的配列との安定なハイブリッ
ド形成能を考慮すると、１０〜１００塩基の範囲にある
ことが好ましく、１５〜５０塩基の範囲にあることがよ
り好ましい。アンチセンス鎖の長さが１０塩基未満だ
と、in vivoでの標的の配列との間に安定なハイブリッ
ドを形成することがより困難になり、一方、アンチセン
ス鎖の長さが１００塩基を越えると安定同位体を含有す
るアンチセンス鎖の合成にかかる費用が多大となるため
に好ましくない。アンチセンス鎖は、その構成単位のヌ
クレオチドやペプチド核酸の炭素原子、及び窒素原子
が、それぞれ濃縮された13Ｃ及び15Ｎで置換されたもの
を利用し、当該技術分野で周知の方法により合成され
る。合成使用する構成単位は、例えば、日本酸素株式会
社より入手できるものであり、その合成方法について
は、特開平６−３１９５８１号公報や特開平７−１１５
９８７号公報に詳細が記載されている。従って、この方
法により合成される本願のアンチセンス鎖においては、
13Ｃ及び15Ｎが天然の存在比以上の割合で含まれている
ことになり、分子中の炭素原子及び窒素原子のそれぞれ
が、９０％以上の13Ｃ及び15Ｎで置換されていることが
好ましい。
【００１５】本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド
配列又はアンチセンスなペプチド核酸配列では、各構成
単位（ヌクレオチド又はペプチド核酸）の全てにおいて
その構成原子である炭素原子及び窒素原子の全てがそれ
ぞれ13Ｃ、及び15Ｎで置換されていることが好ましい。
全ての炭素原子を13Ｃに置換することにより多くの炭素
原子が12Ｃで構成される他の物質を検出することなく、
13Ｃで標識されたアンチセンス鎖に起因するシグナルの
検出を選択的に行なうことが可能になる。一方、全ての
窒素原子を15Ｎに置換することにより、多くの窒素原子
が14Ｎで構成される他の物質を検出することなく、15Ｎ
で標識されたアンチセンス鎖に起因するシグナルの検出
を選択的に行なうことが可能になる。また、15Ｎで標識
した場合、それぞれの塩基対に関るイミノ基プロトンを
検出・判別することができるため、各塩基間での水素結
合（二次構造）の情報を得ることが可能になる。
配列又はアンチセンスなペプチド核酸配列では、各構成
単位（ヌクレオチド又はペプチド核酸）の全てにおいて
その構成原子である炭素原子及び窒素原子の全てがそれ
ぞれ13Ｃ、及び15Ｎで置換されていることが好ましい。
全ての炭素原子を13Ｃに置換することにより多くの炭素
原子が12Ｃで構成される他の物質を検出することなく、
13Ｃで標識されたアンチセンス鎖に起因するシグナルの
検出を選択的に行なうことが可能になる。一方、全ての
窒素原子を15Ｎに置換することにより、多くの窒素原子
が14Ｎで構成される他の物質を検出することなく、15Ｎ
で標識されたアンチセンス鎖に起因するシグナルの検出
を選択的に行なうことが可能になる。また、15Ｎで標識
した場合、それぞれの塩基対に関るイミノ基プロトンを
検出・判別することができるため、各塩基間での水素結
合（二次構造）の情報を得ることが可能になる。
【００１６】次に、本発明のアンチセンス鎖の検出方法
について説明する。本発明のアンチセンス鎖の検出方法
においては、まず、ハイブリッドを形成させる所望の標
的配列に対して相補的な配列を有し、安定同位体で標識
されたアンチセンスオリゴヌクレオチド配列又はアンチ
センスなペプチド核酸配列を投与した試験対象動物よ
り、血液、組織、器官、体液、細胞、又は排泄物の少な
くとも一つの被測定物を採取するか、又は同様の配列を
投与した試験対象培養細胞を被測定物として採取する。
試験対象動物及び試験対象培養細胞に対するアンチセン
ス鎖の投与方法については特に限定されるものではな
く、種々の細胞導入剤、例えばリポフェクチン等のリポ
ソームや、種々のドラッグデリバリーシステム、例えば
ヒストンサブユニットを利用したものなどを利用するこ
とができる。投与するアンチセンス鎖としては、本発明
の、安定同位体で標識したアンチセンスオリゴヌクレオ
チド配列やアンチセンスなペプチド核酸配列のみなら
ず、これらと薬学的に許容される担体を含む組成物であ
ってもよい。薬学的に許容される担体としては、リポフ
ェクチン等のリポソームや、ヒストン蛋白質等の核酸結
合性蛋白質が含まれる。
について説明する。本発明のアンチセンス鎖の検出方法
においては、まず、ハイブリッドを形成させる所望の標
的配列に対して相補的な配列を有し、安定同位体で標識
されたアンチセンスオリゴヌクレオチド配列又はアンチ
センスなペプチド核酸配列を投与した試験対象動物よ
り、血液、組織、器官、体液、細胞、又は排泄物の少な
くとも一つの被測定物を採取するか、又は同様の配列を
投与した試験対象培養細胞を被測定物として採取する。
試験対象動物及び試験対象培養細胞に対するアンチセン
ス鎖の投与方法については特に限定されるものではな
く、種々の細胞導入剤、例えばリポフェクチン等のリポ
ソームや、種々のドラッグデリバリーシステム、例えば
ヒストンサブユニットを利用したものなどを利用するこ
とができる。投与するアンチセンス鎖としては、本発明
の、安定同位体で標識したアンチセンスオリゴヌクレオ
チド配列やアンチセンスなペプチド核酸配列のみなら
ず、これらと薬学的に許容される担体を含む組成物であ
ってもよい。薬学的に許容される担体としては、リポフ
ェクチン等のリポソームや、ヒストン蛋白質等の核酸結
合性蛋白質が含まれる。
【００１７】試験対象動物からの被測定物の採取時期、
及び試験対象培養細胞の採取時期は、目的に応じて決定
する。即ち、アンチセンス鎖の投与後直ぐに行なうこと
も可能であり、またアンチセンス鎖の投与後、細胞内に
おけるリポソームなどからのアンチセンス鎖の放出に要
する時間等を考慮して、数日〜１０日間程度後に行なっ
てもよい。
及び試験対象培養細胞の採取時期は、目的に応じて決定
する。即ち、アンチセンス鎖の投与後直ぐに行なうこと
も可能であり、またアンチセンス鎖の投与後、細胞内に
おけるリポソームなどからのアンチセンス鎖の放出に要
する時間等を考慮して、数日〜１０日間程度後に行なっ
てもよい。
【００１８】次に被測定物を核磁気共鳴分光法による測
定にかけるが、場合によっては適宜前処理を行なう。例
えば、被測定物が血液や体液などの流動性を有するもの
である場合には、遠心による固形分の分離を行った後に
核磁気共鳴分光にかけることが好ましく、採取した被測
定物が組織や細胞などの固形の場合には、適宜ｐＨや塩
濃度を調節した緩衝液などの中で組織や細胞をホモジナ
イズし、核酸成分を抽出した後に核磁気共鳴分光にかけ
ることが必要である。尚、この場合の緩衝液やホモジナ
イズの条件は、当業者が被測定物に応じて適宜決定する
ことができるものである。
定にかけるが、場合によっては適宜前処理を行なう。例
えば、被測定物が血液や体液などの流動性を有するもの
である場合には、遠心による固形分の分離を行った後に
核磁気共鳴分光にかけることが好ましく、採取した被測
定物が組織や細胞などの固形の場合には、適宜ｐＨや塩
濃度を調節した緩衝液などの中で組織や細胞をホモジナ
イズし、核酸成分を抽出した後に核磁気共鳴分光にかけ
ることが必要である。尚、この場合の緩衝液やホモジナ
イズの条件は、当業者が被測定物に応じて適宜決定する
ことができるものである。
【００１９】核磁気共鳴分光測定においては、測定する
アンチセンス鎖が０．１ｍＭ乃至数ｍＭの濃度で含まれ
ていることが好ましく、測定前に適宜濃度調節すること
が好ましい。更にロックシグナルのために５乃至１０％
程度の重水を前処理済の被測定物に加えておく必要があ
る。
アンチセンス鎖が０．１ｍＭ乃至数ｍＭの濃度で含まれ
ていることが好ましく、測定前に適宜濃度調節すること
が好ましい。更にロックシグナルのために５乃至１０％
程度の重水を前処理済の被測定物に加えておく必要があ
る。
【００２０】核磁気共鳴分光は、15Ｎ−1Ｈ、及び13Ｃ
−1Ｈの、ＨＭＱＣ法、又はＨＳＱＣ法の何れかによ
り、一次元又は二次元の測定を行なうことが好ましい。
この際には、パルスフィールド勾配（ＰＦＧ）法による
コヒーレンス選択、又は溶媒シグナルの除去を行なうこ
とがより好ましい。
−1Ｈの、ＨＭＱＣ法、又はＨＳＱＣ法の何れかによ
り、一次元又は二次元の測定を行なうことが好ましい。
この際には、パルスフィールド勾配（ＰＦＧ）法による
コヒーレンス選択、又は溶媒シグナルの除去を行なうこ
とがより好ましい。
【００２１】13Ｃ−1Ｈの、ＨＭＱＣ法又はＨＳＱＣ法
による測定によって、被測定物中にアンチセンス鎖が含
まれているか否か、及び含まれている場合にはその濃度
を解析することができる。更に15Ｎ−1Ｈの、ＨＭＱＣ
法又はＨＳＱＣ法による測定によって、被測定物中に塩
基対が形成されているか否かを解析できる。上記方法に
より、予め測定した完全長のアンチセンス鎖のスペクト
ルと、試験対象動物から採取した被測定物中のアンチセ
ンス鎖のスペクトルとの比較を行なうことにより、測定
にかかるアンチセンス鎖が分解されて長さが短くなった
ものなのか、又は全長を保っているものなのかを解析す
ることができる。また、予め完全長のアンチセンス鎖と
標的配列との二本鎖をin vitroで形成させたものを測定
しておき、そのスペクトルと、試験対象動物から採取し
た被測定物中のアンチセンス鎖のスペクトルとの比較を
行うことにより、測定にかかるアンチセンスが標的配列
と二本鎖を形成しているかどうか判定することができ
る。更に、質量分析法と組み合わせて解析することによ
り、より高感度な分析を行うことが可能になるという利
点がある。
による測定によって、被測定物中にアンチセンス鎖が含
まれているか否か、及び含まれている場合にはその濃度
を解析することができる。更に15Ｎ−1Ｈの、ＨＭＱＣ
法又はＨＳＱＣ法による測定によって、被測定物中に塩
基対が形成されているか否かを解析できる。上記方法に
より、予め測定した完全長のアンチセンス鎖のスペクト
ルと、試験対象動物から採取した被測定物中のアンチセ
ンス鎖のスペクトルとの比較を行なうことにより、測定
にかかるアンチセンス鎖が分解されて長さが短くなった
ものなのか、又は全長を保っているものなのかを解析す
ることができる。また、予め完全長のアンチセンス鎖と
標的配列との二本鎖をin vitroで形成させたものを測定
しておき、そのスペクトルと、試験対象動物から採取し
た被測定物中のアンチセンス鎖のスペクトルとの比較を
行うことにより、測定にかかるアンチセンスが標的配列
と二本鎖を形成しているかどうか判定することができ
る。更に、質量分析法と組み合わせて解析することによ
り、より高感度な分析を行うことが可能になるという利
点がある。
【００２２】本発明においては、上記の核磁気共鳴分光
測定の代りに磁気共鳴イメージングを行なうことも可能
である。この場合においても、試験対象動物へのアンチ
センス鎖の投与方法は、核磁気共鳴分光測定の場合と同
様であるが、投与後、被測定物を試験対象動物から分離
したり、前処理したりすることなく、試験対象動物又は
試験対象培養細胞自体を磁気共鳴イメージング装置にか
かることにより測定を行なえばよい。特に試験対象とし
て動物を用いる場合には、生体内におけるアンチセンス
鎖の吸収、分泌、排泄の様子を経時的且つ定量的に観察
・追跡することが可能となる。
測定の代りに磁気共鳴イメージングを行なうことも可能
である。この場合においても、試験対象動物へのアンチ
センス鎖の投与方法は、核磁気共鳴分光測定の場合と同
様であるが、投与後、被測定物を試験対象動物から分離
したり、前処理したりすることなく、試験対象動物又は
試験対象培養細胞自体を磁気共鳴イメージング装置にか
かることにより測定を行なえばよい。特に試験対象とし
て動物を用いる場合には、生体内におけるアンチセンス
鎖の吸収、分泌、排泄の様子を経時的且つ定量的に観察
・追跡することが可能となる。
【００２３】本発明のアンチセンス鎖及びアンチセンス
鎖検出方法は、上記した薬物動態試験以外の種々の用途
に用いることが可能である。他の用途には、癌、遺伝
病、ＡＩＤＳ、インフルエンザ等の疾病の診断及び治
療、並びに新規の細胞導入剤及びドラッグデリバリーシ
ステムの評価が含まれる。
鎖検出方法は、上記した薬物動態試験以外の種々の用途
に用いることが可能である。他の用途には、癌、遺伝
病、ＡＩＤＳ、インフルエンザ等の疾病の診断及び治
療、並びに新規の細胞導入剤及びドラッグデリバリーシ
ステムの評価が含まれる。
【００２４】疾病の診断へ適用する場合には、基本的に
薬物動態試験の場合と同様にして本発明の検出方法を実
施すれば良い。即ち、体外に採取することが可能な細胞
や血液を用いて診断を行なう場合には、細胞や血液中に
おいてアンチセンス鎖が標的配列と二本鎖を形成してい
るかを核磁気共鳴分光法により測定すればよく、また、
体外に摘出できない組織や器官の場合には、組織や器官
中においてアンチセンス鎖が標的配列と二本鎖を形成し
ているかを磁気共鳴イメージングにより測定すればよ
い。
薬物動態試験の場合と同様にして本発明の検出方法を実
施すれば良い。即ち、体外に採取することが可能な細胞
や血液を用いて診断を行なう場合には、細胞や血液中に
おいてアンチセンス鎖が標的配列と二本鎖を形成してい
るかを核磁気共鳴分光法により測定すればよく、また、
体外に摘出できない組織や器官の場合には、組織や器官
中においてアンチセンス鎖が標的配列と二本鎖を形成し
ているかを磁気共鳴イメージングにより測定すればよ
い。
【００２５】上記した疾病等の治療を行なう場合に本願
発明のアンチセンス鎖を使用すれば、治療が有効である
かどうかを適宜、核磁気共鳴分光測定や磁気共鳴イメー
ジングにより確認することが可能となる。したがって、
本発明は疾病の治療においても適用することができ、患
者へのアンチセンス医薬の投与量や投与間隔を決定する
のに役立てることが可能となる。
発明のアンチセンス鎖を使用すれば、治療が有効である
かどうかを適宜、核磁気共鳴分光測定や磁気共鳴イメー
ジングにより確認することが可能となる。したがって、
本発明は疾病の治療においても適用することができ、患
者へのアンチセンス医薬の投与量や投与間隔を決定する
のに役立てることが可能となる。
【００２６】新規の細胞導入剤やドラッグデリバリーシ
ステムを開発したときには、その効率を評価することが
必要になるが、本発明のアンチセンス鎖を用いて本発明
の検出方法を利用すれば、導入効率の評価を行なうこと
が可能である。
ステムを開発したときには、その効率を評価することが
必要になるが、本発明のアンチセンス鎖を用いて本発明
の検出方法を利用すれば、導入効率の評価を行なうこと
が可能である。
【００２７】
【実施例】安定同位体で標識したＲＮＡをマウスに接種
したときに、ＮＭＲにて検出可能であるかを確認するた
めの実験を行った。
したときに、ＮＭＲにて検出可能であるかを確認するた
めの実験を行った。
【００２８】（実験材料）第８週令の雌のＳＰＦ／ＶＡ
Ｆマウス（ＢＡＬＢ／ｃＡｎＮＣｒ）を４匹（Ｎｏ．１
〜Ｎｏ．４）、日本チャールズリバー（株）より入手し
て実験に用いた。13Ｃ及び15Ｎで標識されたヌクレオチ
ドは、特開平６−３１９５８１号公報、及び特開平７−
１１５９８７号公報に記載の方法により合成した。この
合成方法についての概略は以下のとおりである。
Ｆマウス（ＢＡＬＢ／ｃＡｎＮＣｒ）を４匹（Ｎｏ．１
〜Ｎｏ．４）、日本チャールズリバー（株）より入手し
て実験に用いた。13Ｃ及び15Ｎで標識されたヌクレオチ
ドは、特開平６−３１９５８１号公報、及び特開平７−
１１５９８７号公報に記載の方法により合成した。この
合成方法についての概略は以下のとおりである。
【００２９】まず、炭素原として13Ｃで標識してある酢
酸（13ＣＨ3 13ＣＯＯＨ）、窒素原として15Ｎで標識し
てある塩化アンモニウム（15ＮＨ4Ｃｌ）を用い、酵母
カンジダ・ウチリス（Candida utilis）ＩＦＯ−０３６
９を無機培地中で培養して集菌した。細胞壁溶解酵素ザ
イモリエース（キリンビール社製）で細胞壁を破壊後、
遠心して得られた上清を更に超遠心分離（１００，００
０ｇ×３時間）して、リボゾーム画分を沈殿として得
た。次いで、このリボゾーム画分を当量の水飽和フェノ
ールで除蛋白した後、エタノールを加えて13Ｃ及び15Ｎ
で標識したＲＮＡを沈殿させた。
酸（13ＣＨ3 13ＣＯＯＨ）、窒素原として15Ｎで標識し
てある塩化アンモニウム（15ＮＨ4Ｃｌ）を用い、酵母
カンジダ・ウチリス（Candida utilis）ＩＦＯ−０３６
９を無機培地中で培養して集菌した。細胞壁溶解酵素ザ
イモリエース（キリンビール社製）で細胞壁を破壊後、
遠心して得られた上清を更に超遠心分離（１００，００
０ｇ×３時間）して、リボゾーム画分を沈殿として得
た。次いで、このリボゾーム画分を当量の水飽和フェノ
ールで除蛋白した後、エタノールを加えて13Ｃ及び15Ｎ
で標識したＲＮＡを沈殿させた。
【００３０】沈殿をエタノールで洗浄した後、真空乾燥
させ、純度９０％以上の13Ｃ及び15Ｎで標識したＲＮＡ
を得た。これをヌクレアーゼＰ1（ヤマサ醤油社製）を
利用してリボヌクレオチド５'−リン酸に分解した後、
各リボヌクレオチド５'−リン酸を陰イオン交換カラム
ＡＧ１Ｘ８ギ酸型（バイオラッド社製）で分画し、それ
ぞれＡＭＰ、ＣＭＰ、ＵＭＰ、及びＧＭＰを得た。
させ、純度９０％以上の13Ｃ及び15Ｎで標識したＲＮＡ
を得た。これをヌクレアーゼＰ1（ヤマサ醤油社製）を
利用してリボヌクレオチド５'−リン酸に分解した後、
各リボヌクレオチド５'−リン酸を陰イオン交換カラム
ＡＧ１Ｘ８ギ酸型（バイオラッド社製）で分画し、それ
ぞれＡＭＰ、ＣＭＰ、ＵＭＰ、及びＧＭＰを得た。
【００３１】次に、Ｗｈｉｔｅｓｉｄｅｓらの方法
（Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．５５，ｐｐ１８３４−１８４
１、１９９０）により、ホスホエノールピルビン酸をリ
ン酸供与体として酵素的にリン酸基を上記のＡＭＰ、Ｃ
ＭＰ、ＵＭＰ、及びＧＭＰのそれぞれに２個付加して、
13Ｃ及び15Ｎで標識したリボヌクレオチド５'−三リン
酸を得た。
（Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．５５，ｐｐ１８３４−１８４
１、１９９０）により、ホスホエノールピルビン酸をリ
ン酸供与体として酵素的にリン酸基を上記のＡＭＰ、Ｃ
ＭＰ、ＵＭＰ、及びＧＭＰのそれぞれに２個付加して、
13Ｃ及び15Ｎで標識したリボヌクレオチド５'−三リン
酸を得た。
【００３２】上記の13Ｃ及び15Ｎで標識されたリボヌク
レオチド５'−三リン酸を基質として用いて、配列番号
１に示される４３塩基からなるオリゴヌクレオチドを合
成した。合成は、合成ＤＮＡ（北海道システムサイエン
ス社製；ＨＰＬＣ精製品）を鋳型とし、Ｔ７ＲＮＡポリ
メラーゼ（エアブラウン社製）により行なった。合成
後、精製のために反応液をポリアクリルアミドゲル電気
泳動にかけ、目的のバンドをゲルとともに切りだして、
ゲルからＲＮＡの抽出を行なった。抽出されたＲＮＡに
ついて、脱塩のためのエタノール沈殿を２回行って、目
的の13Ｃ及び15Ｎで標識されたＲＮＡを得た。
レオチド５'−三リン酸を基質として用いて、配列番号
１に示される４３塩基からなるオリゴヌクレオチドを合
成した。合成は、合成ＤＮＡ（北海道システムサイエン
ス社製；ＨＰＬＣ精製品）を鋳型とし、Ｔ７ＲＮＡポリ
メラーゼ（エアブラウン社製）により行なった。合成
後、精製のために反応液をポリアクリルアミドゲル電気
泳動にかけ、目的のバンドをゲルとともに切りだして、
ゲルからＲＮＡの抽出を行なった。抽出されたＲＮＡに
ついて、脱塩のためのエタノール沈殿を２回行って、目
的の13Ｃ及び15Ｎで標識されたＲＮＡを得た。
【００３３】ドラッグデリバリーシステムとしては、べ
ーリンガー・マンハイム社製のヒストンサブユニットＨ
２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３、及びＨ４の混合物を用いた。
ーリンガー・マンハイム社製のヒストンサブユニットＨ
２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３、及びＨ４の混合物を用いた。
【００３４】（実験方法）上記のオリゴヌクレオチド５
ｍｇ当たり、１２０μｌの生理食塩水に溶解し、各３０
μｌの試料を４つ調製した。そのうち２つはドラッグデ
リバリーシステムなしで投与するものとし、残りの２つ
の試料には上記のヒストンサブユニットの混合物を加え
て、複合体を形成させた。
ｍｇ当たり、１２０μｌの生理食塩水に溶解し、各３０
μｌの試料を４つ調製した。そのうち２つはドラッグデ
リバリーシステムなしで投与するものとし、残りの２つ
の試料には上記のヒストンサブユニットの混合物を加え
て、複合体を形成させた。
【００３５】試料１：13Ｃ - 15Ｎで標識したＲＮＡ
（Ｎｏ．１のマウスに接種及び採取）。 試料２：13Ｃ - 15Ｎで標識したＲＮＡ（Ｎｏ．２のマ
ウスに接種及び採取）。 試料３：13Ｃ - 15Ｎで標識したＲＮＡとドラッグデリ
バリーシステムとの複合体（Ｎｏ．３のマウスに接種及
び採取）。 試料４：13Ｃ - 15Ｎで標識したＲＮＡとドラッグデリ
バリーシステムとの複合体（Ｎｏ．４のマウスに接種及
び採取）。
（Ｎｏ．１のマウスに接種及び採取）。 試料２：13Ｃ - 15Ｎで標識したＲＮＡ（Ｎｏ．２のマ
ウスに接種及び採取）。 試料３：13Ｃ - 15Ｎで標識したＲＮＡとドラッグデリ
バリーシステムとの複合体（Ｎｏ．３のマウスに接種及
び採取）。 試料４：13Ｃ - 15Ｎで標識したＲＮＡとドラッグデリ
バリーシステムとの複合体（Ｎｏ．４のマウスに接種及
び採取）。
【００３６】上記のマウスに対して、６２．５ｍｇ／ｋ
ｇに調製したオリゴヌクレオチド含有試料１００μｌを
尾静注した。投与して３時間後に、マウスをエーテル麻
酔して、約１ｍｌの全血を心臓より採取した。この全血
を３０分間室温にて静置し、その後室温で１５００ｒｐ
ｍにて１５分間遠心した。遠心後得られた上清の血清を
以下のＮＭＲ測定にかけた。
ｇに調製したオリゴヌクレオチド含有試料１００μｌを
尾静注した。投与して３時間後に、マウスをエーテル麻
酔して、約１ｍｌの全血を心臓より採取した。この全血
を３０分間室温にて静置し、その後室温で１５００ｒｐ
ｍにて１５分間遠心した。遠心後得られた上清の血清を
以下のＮＭＲ測定にかけた。
【００３７】上記の遠心分離により得られた試料、各４
００μｌに対して２０μｌの重水を加え、２５℃でＮＭ
Ｒスペクトルの測定を行った。測定には、ＢＲＵＫＥＲ
社製のＤＲＸ−５００ＮＭＲ分光器を使用した。非交換
性プロトンの測定には前飽和（pre-saturation）を行
い、交換性のイミノプロトンスペクトルの測定には、ジ
ャンプ・アンド・リターン（jump-and-return）パルス
を用いた。
００μｌに対して２０μｌの重水を加え、２５℃でＮＭ
Ｒスペクトルの測定を行った。測定には、ＢＲＵＫＥＲ
社製のＤＲＸ−５００ＮＭＲ分光器を使用した。非交換
性プロトンの測定には前飽和（pre-saturation）を行
い、交換性のイミノプロトンスペクトルの測定には、ジ
ャンプ・アンド・リターン（jump-and-return）パルス
を用いた。
【００３８】（測定結果）図１〜図１５に測定結果を示
した。ドラッグデリバリーシステムとの複合体を形成さ
せなかった場合には、安定同位体で標識された本発明の
オリゴヌクレオチドはいずれもほとんど検出されなかっ
たのに対し、ドラッグデリバリーシステムとの複合体を
形成させた場合には、完全長のオリゴヌクレオチドが検
出された。以下に、詳細についてそれぞれの図を参照し
ながら説明する。
した。ドラッグデリバリーシステムとの複合体を形成さ
せなかった場合には、安定同位体で標識された本発明の
オリゴヌクレオチドはいずれもほとんど検出されなかっ
たのに対し、ドラッグデリバリーシステムとの複合体を
形成させた場合には、完全長のオリゴヌクレオチドが検
出された。以下に、詳細についてそれぞれの図を参照し
ながら説明する。
【００３９】（評価）図１は、試料１〜試料４について
の非交換性プロトンを５００ＭＨｚ−1Ｈで測定したス
ペクトルを示し、符号１〜４はそれぞれ試料１〜４を示
すものである。核酸塩基に由来するシグナルは主として
９〜６．５ｐｐｍの領域に観測されるが、この領域に注
目すると、ドラッグデリバリーシステムなしで投与した
試料１及び試料２では、極めて弱いシグナルしか検出さ
れていない。一方、ドラッグデリバリーシステムを使用
して投与した試料３及び試料４については、この領域に
はっきりとしたシグナルが検出されている。よって、ド
ラッグデリバリーシステムを使用した場合には、血中で
３時間もアンチセンス鎖が存在していることがわかる。
の非交換性プロトンを５００ＭＨｚ−1Ｈで測定したス
ペクトルを示し、符号１〜４はそれぞれ試料１〜４を示
すものである。核酸塩基に由来するシグナルは主として
９〜６．５ｐｐｍの領域に観測されるが、この領域に注
目すると、ドラッグデリバリーシステムなしで投与した
試料１及び試料２では、極めて弱いシグナルしか検出さ
れていない。一方、ドラッグデリバリーシステムを使用
して投与した試料３及び試料４については、この領域に
はっきりとしたシグナルが検出されている。よって、ド
ラッグデリバリーシステムを使用した場合には、血中で
３時間もアンチセンス鎖が存在していることがわかる。
【００４０】図２は、試料１〜試料４についての交換性
プロトン（イミノプロトン）を５００ＭＨｚ−1Ｈで測
定したスペクトルを示し、符号１〜４はそれぞれ試料１
〜４を示すものである。この図に示した領域において
は、二次構造を形成することによって安定化された塩基
対に由来するシグナルが観測される。試料１及び試料２
においては全くシグナルが検出されなかったが、試料３
及び試料４においてはともに一組の強い、シャープなシ
グナルが観測されている。このことより、ドラッグデリ
バリーシステムを使用した場合には、血中に存在するＲ
ＮＡは部分分解を受けていないことが示唆される。尚、
ＲＮＡが部分分解を受けている場合にはこのようなシャ
ープなシグナルは観測されず、また、スペクトルももっ
と複雑なものとなるはずである。
プロトン（イミノプロトン）を５００ＭＨｚ−1Ｈで測
定したスペクトルを示し、符号１〜４はそれぞれ試料１
〜４を示すものである。この図に示した領域において
は、二次構造を形成することによって安定化された塩基
対に由来するシグナルが観測される。試料１及び試料２
においては全くシグナルが検出されなかったが、試料３
及び試料４においてはともに一組の強い、シャープなシ
グナルが観測されている。このことより、ドラッグデリ
バリーシステムを使用した場合には、血中に存在するＲ
ＮＡは部分分解を受けていないことが示唆される。尚、
ＲＮＡが部分分解を受けている場合にはこのようなシャ
ープなシグナルは観測されず、また、スペクトルももっ
と複雑なものとなるはずである。
【００４１】図３、図６、図８、及び図１２は、それぞ
れ試料１〜試料４についての非交換性プロトンの５００
ＭＨｚ 1Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示すものである。こ
れらの比較より、試料１及び２においてはＲＮＡがほと
んど検出されておらず、一方、試料３及び試料４におい
てはＲＮＡが検出されていることがわかる。そして図３
及び図４の上段と下段との比較により、９〜６．５ｐｐ
ｍの領域のスペクトルがデカップリングにより変化して
いることがわかるが、これよりこの領域のシグナルが標
識済のＲＮＡに由来するものであることがわかる。尚、
図８及び図１２の８．４ｐｐｍに観測されるシグナルは
デカップリングによって変化していないことから、ドラ
ッグデリバリーシステムに由来するものであると考えら
れる。
れ試料１〜試料４についての非交換性プロトンの５００
ＭＨｚ 1Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示すものである。こ
れらの比較より、試料１及び２においてはＲＮＡがほと
んど検出されておらず、一方、試料３及び試料４におい
てはＲＮＡが検出されていることがわかる。そして図３
及び図４の上段と下段との比較により、９〜６．５ｐｐ
ｍの領域のスペクトルがデカップリングにより変化して
いることがわかるが、これよりこの領域のシグナルが標
識済のＲＮＡに由来するものであることがわかる。尚、
図８及び図１２の８．４ｐｐｍに観測されるシグナルは
デカップリングによって変化していないことから、ドラ
ッグデリバリーシステムに由来するものであると考えら
れる。
【００４２】図４、図７、図９、及び図１３は、それぞ
れ試料１〜試料４についての交換性プロトンの５００Ｍ
Ｈｚ 1Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示すものである。これ
らの比較より、試料１及び２においてはＲＮＡがほとん
ど検出されておらず、一方、試料３及び試料４において
はＲＮＡが検出されていることがわかる。そして図９及
び図１３の上段と下段との比較により、この領域の全て
のシグナルがデカップリングにより変化していることが
わかるが、これよりこの領域のシグナルが標識済のＲＮ
Ａに由来するものであることがわかる。
れ試料１〜試料４についての交換性プロトンの５００Ｍ
Ｈｚ 1Ｈ−ＮＭＲスペクトルを示すものである。これ
らの比較より、試料１及び２においてはＲＮＡがほとん
ど検出されておらず、一方、試料３及び試料４において
はＲＮＡが検出されていることがわかる。そして図９及
び図１３の上段と下段との比較により、この領域の全て
のシグナルがデカップリングにより変化していることが
わかるが、これよりこの領域のシグナルが標識済のＲＮ
Ａに由来するものであることがわかる。
【００４３】図５、図１０、及び図１４はそれぞれ、試
料１、試料３、及び試料４についての非交換性プロトン
についての13Ｃ - 1Ｈ ＨＭＱＣスペクトルを示すもの
である。縦軸は13Ｃの化学シフトであり、横軸は1Ｈ化
学シフトである。試料１については、ノイズのみであ
り、ＲＮＡに由来するスペクトルは全く観測されていな
い。一方、試料３及び試料４についてのスペクトルは、
典型的なＲＮＡのパターンである。図１１及び図１５
は、それぞれ試料３及び試料４についての非交換性プロ
トンの15Ｎ - 1Ｈ ＨＭＱＣスペクトルを示すものであ
る。縦軸は15Ｎの化学シフトであり、横軸は1Ｈ化学シ
フトである。これらの図より、測定しているＲＮＡは化
学的・構造的に均一なものであることがわかる。
料１、試料３、及び試料４についての非交換性プロトン
についての13Ｃ - 1Ｈ ＨＭＱＣスペクトルを示すもの
である。縦軸は13Ｃの化学シフトであり、横軸は1Ｈ化
学シフトである。試料１については、ノイズのみであ
り、ＲＮＡに由来するスペクトルは全く観測されていな
い。一方、試料３及び試料４についてのスペクトルは、
典型的なＲＮＡのパターンである。図１１及び図１５
は、それぞれ試料３及び試料４についての非交換性プロ
トンの15Ｎ - 1Ｈ ＨＭＱＣスペクトルを示すものであ
る。縦軸は15Ｎの化学シフトであり、横軸は1Ｈ化学シ
フトである。これらの図より、測定しているＲＮＡは化
学的・構造的に均一なものであることがわかる。
【００４４】
【発明の効果】本発明のアンチセンス鎖は、天然型又は
非天然型のヌクレオチド又はペプチド核酸を構成単位と
し、安定同位体である13Ｃ又は15Ｎで炭素原子又は窒素
原子を置換しているので、本発明の検出方法により15Ｎ
−1Ｈ及び13Ｃ−1Ｈの異核種多量子コヒーレンス分光法
等の核磁気共鳴分光法や、磁気共鳴イメージングを行な
えば、アンチセンス鎖を経時的且つ定量的に検出するこ
とができ、又、二本鎖の形成も検出することが可能とな
る。更に、本発明の検出方法において磁気共鳴イメージ
ングを利用すれば、試験対象動物より被測定物を採取す
ることなく、アンチセンス鎖の生体内での分布等につい
ての解析を経時的に行なうことが可能である。
非天然型のヌクレオチド又はペプチド核酸を構成単位と
し、安定同位体である13Ｃ又は15Ｎで炭素原子又は窒素
原子を置換しているので、本発明の検出方法により15Ｎ
−1Ｈ及び13Ｃ−1Ｈの異核種多量子コヒーレンス分光法
等の核磁気共鳴分光法や、磁気共鳴イメージングを行な
えば、アンチセンス鎖を経時的且つ定量的に検出するこ
とができ、又、二本鎖の形成も検出することが可能とな
る。更に、本発明の検出方法において磁気共鳴イメージ
ングを利用すれば、試験対象動物より被測定物を採取す
ることなく、アンチセンス鎖の生体内での分布等につい
ての解析を経時的に行なうことが可能である。
【配列表】 SEQUENCE LISTING ＜１１０＞Nippon Sanso Corporation ＜１２０＞Oligonucleotides labeled with stable isotopes and a method for detecting the same. ＜１３０＞Ｊ７８０３９Ａ１ ＜１６０＞１ ＜２１０＞１ ＜２１１＞４３ ＜２１２＞ＲＮＡ ＜２１３＞Artificial Sequence ＜４００＞１ gggag agggc aaccu gaccu guuau cuucg caaga agcuu ccg 43
【図１】 試料１〜４についての非交換性プロトンの５
００ＭＨｚ 1Ｈ−ＮＭＲのスペクトルを示す図であ
る。
００ＭＨｚ 1Ｈ−ＮＭＲのスペクトルを示す図であ
る。
【図２】 試料１〜４についての交換性プロトンの５０
０ＭＨｚ 1Ｈ−ＮＭＲのスペクトルを示す図である。
０ＭＨｚ 1Ｈ−ＮＭＲのスペクトルを示す図である。
【図３】 試料１についての非交換性プロトンの５００
ＭＨｚ 1Ｈ−ＮＭＲのスペクトルを示す図である。
ＭＨｚ 1Ｈ−ＮＭＲのスペクトルを示す図である。
【図４】 試料１についての交換性プロトンの５００Ｍ
Ｈｚ 1Ｈ−ＮＭＲのスペクトルを示す図である。
Ｈｚ 1Ｈ−ＮＭＲのスペクトルを示す図である。
【図５】 試料１についての非交換性プロトンの13Ｃ -
1Ｈ ＨＭＱＣスペクトルを示す図である。
1Ｈ ＨＭＱＣスペクトルを示す図である。
【図６】 試料２についての非交換性プロトンの５００
ＭＨｚ 1Ｈ−ＮＭＲのスペクトルを示す図である。
ＭＨｚ 1Ｈ−ＮＭＲのスペクトルを示す図である。
【図７】 試料２についての交換性プロトンの５００Ｍ
Ｈｚ 1Ｈ−ＮＭＲのスペクトルを示す図である。
Ｈｚ 1Ｈ−ＮＭＲのスペクトルを示す図である。
【図８】 試料３についての非交換性プロトンの５００
ＭＨｚ 1Ｈ−ＮＭＲのスペクトルを示す図である。
ＭＨｚ 1Ｈ−ＮＭＲのスペクトルを示す図である。
【図９】 試料３についての交換性プロトンの５００Ｍ
Ｈｚ 1Ｈ−ＮＭＲのスペクトルを示す図である。
Ｈｚ 1Ｈ−ＮＭＲのスペクトルを示す図である。
【図１０】 試料３についての非交換性プロトンの13Ｃ
- 1Ｈ ＨＭＱＣスペクトルを示す図である。
- 1Ｈ ＨＭＱＣスペクトルを示す図である。
【図１１】 試料３についての非交換性プロトンの15Ｎ
- 1Ｈ ＨＭＱＣスペクトルを示す図である。
- 1Ｈ ＨＭＱＣスペクトルを示す図である。
【図１２】 試料４についての非交換性プロトンの５０
０ＭＨｚ 1Ｈ−ＮＭＲのスペクトルを示す図である。
０ＭＨｚ 1Ｈ−ＮＭＲのスペクトルを示す図である。
【図１３】 試料４についての交換性プロトンの５００
ＭＨｚ 1Ｈ−ＮＭＲのスペクトルを示す図である。
ＭＨｚ 1Ｈ−ＮＭＲのスペクトルを示す図である。
【図１４】 試料４についての非交換性プロトンの13Ｃ
- 1Ｈ ＨＭＱＣスペクトルを示す図である。
- 1Ｈ ＨＭＱＣスペクトルを示す図である。
【図１５】 試料４についての非交換性プロトンの15Ｎ
- 1Ｈ ＨＭＱＣスペクトルを示す図である。
- 1Ｈ ＨＭＱＣスペクトルを示す図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き Ｆターム(参考） 4B024 AA11 AA19 CA01 CA11 GA11 GA13 HA13 HA17 4B063 QA01 QA05 QA20 QQ03 QQ08 QQ42 QQ52 QR32 QR50 QS03 QS36 QS39 QX10 4C057 BB02 CC03 DD01 MM02 MM04 MM09
Claims (5)
- 【請求項１】 構成原子のＣの内の少なくとも一つが13
Ｃで置換され、構成原子のＮの内の少なくとも一つが15
Ｎで置換されたヌクレオチド又はペプチド核酸を少なく
とも一つ構成単位として含み、ハイブリッドを形成させ
る所望の標的配列に対して相補的な、１０乃至１００塩
基の長さを有する、一本鎖ＲＮＡ又は一本鎖若しくは二
本鎖ＤＮＡからなるアンチセンスオリゴヌクレオチド配
列又はアンチセンスなペプチド核酸配列であって、 前記オリゴヌクレオチドは、 １）リボース又はデオキシリボースの３'−ＯＨと５'−
ＯＨとがホスホジエステル結合で架橋されている天然型
オリゴヌクレオチド； ２）前記天然型オリゴヌクレオチドのホスホジエステル
結合の内、非架橋酸素原子の１個又は２個を硫黄原子で
置換したホスホロチオエートオリゴヌクレオチド；又
は、 ３）上記天然型オリゴヌクレオチドのホスホジエステル
結合の内、水酸基中の酸素原子をメチル基に置換したメ
チルホスホネートオリゴヌクレオチドであり、 前記ペプチド核酸は、 プリン又はピリミジンの塩基を有し、 前記の塩基同士が互いにペプチド結合により結合されて
２−アミノエチルグリシン骨格を有するペプチド核酸配
列を形成していることを特徴とするアンチセンスオリゴ
ヌクレオチド配列又はアンチセンスなペプチド核酸配
列。 - 【請求項２】 各構成単位であるヌクレオチド又はペプ
チド核酸の全てにおいて、全炭素原子が13Ｃで置換さ
れ、全窒素原子が15Ｎで置換されていることを特徴とす
る請求項１記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド配列
又はアンチセンスなペプチド核酸配列。 - 【請求項３】 請求項１又は２記載のアンチセンスオリ
ゴヌクレオチド配列又はアンチセンスなペプチド核酸配
列と、薬学的に許容される担体を含むことを特徴とする
組成物。 - 【請求項４】 ハイブリッドを形成させる所望の標的配
列に対して相補的な配列を有するアンチセンスオリゴヌ
クレオチド配列又はアンチセンスなペプチド核酸配列を
投与された試験対象動物より、血液、組織、器官、体
液、細胞、又は排泄物の少なくとも一つの被測定物を採
取するか、又は、 ハイブリッドを形成させる所望の標的配列に対して相補
的な配列を有するアンチセンスオリゴヌクレオチド配列
又はアンチセンスなペプチド核酸配列を投与された試験
対象培養細胞を被測定物として採取する工程と、 前記の採取した被測定物由来のアンチセンスオリゴヌク
レオチド又はアンチセンスなペプチド核酸を核磁気共鳴
分光法により測定する工程を具備し、 前記のアンチセンスオリゴヌクレオチド配列又はアンチ
センスなペプチド核酸配列が、請求項１又は２記載のア
ンチセンスオリゴヌクレオチド配列又はアンチセンスな
ペプチド核酸配列であることを特徴とする、安定同位体
を含有したアンチセンスオリゴヌクレオチド配列若しく
はこの分解物、又は安定同位体を含有したアンチセンス
なペプチド核酸配列若しくはこの分解物の検出方法。 - 【請求項５】 請求項１又は２記載のアンチセンスオリ
ゴヌクレオチド配列又はアンチセンスなペプチド核酸配
列を投与された試験対象動物を磁気共鳴イメージングに
かける工程を具備することを特徴とする安定同位体を含
有したオリゴヌクレオチド配列及びこの分解物、又は安
定同位体を含有したアンチセンスなペプチド核酸配列及
びこの分解物の検出方法。
Priority Applications (6)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP11094323A JP2000290291A (ja) | 1999-03-31 | 1999-03-31 | 安定同位体標識オリゴヌクレオチド及びオリゴヌクレオチド検出方法 |
| US09/535,786 US20030073075A1 (en) | 1999-03-31 | 2000-03-28 | Oligonucleotides labeled with stable isotopes and a method for detecting the same |
| DE60031320T DE60031320T2 (de) | 1999-03-31 | 2000-03-31 | Verfahren zur Erfassung von Antisense-Oligonucleotiden und Peptidnucleinsäuren |
| EP00106939A EP1041145B1 (en) | 1999-03-31 | 2000-03-31 | Oligonucleotides labeled with stable isotopes and a method for detecting the same |
| US10/214,503 US7038036B2 (en) | 1999-03-31 | 2002-08-07 | Oligonucleotides labeled with stable isotopes and a method for detecting the same |
| US11/248,852 US20060051804A1 (en) | 1999-03-31 | 2005-10-11 | Oligonucleotides labeled with stable isotopes and a method for detecting the same |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP11094323A JP2000290291A (ja) | 1999-03-31 | 1999-03-31 | 安定同位体標識オリゴヌクレオチド及びオリゴヌクレオチド検出方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2000290291A true JP2000290291A (ja) | 2000-10-17 |
Family
ID=14107087
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP11094323A Pending JP2000290291A (ja) | 1999-03-31 | 1999-03-31 | 安定同位体標識オリゴヌクレオチド及びオリゴヌクレオチド検出方法 |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| US (3) | US20030073075A1 (ja) |
| EP (1) | EP1041145B1 (ja) |
| JP (1) | JP2000290291A (ja) |
| DE (1) | DE60031320T2 (ja) |
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