JPH07115987A - 安定同位体標識ｒｎａの製造方法 - Google Patents
安定同位体標識ｒｎａの製造方法Info
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- JPH07115987A JPH07115987A JP26391793A JP26391793A JPH07115987A JP H07115987 A JPH07115987 A JP H07115987A JP 26391793 A JP26391793 A JP 26391793A JP 26391793 A JP26391793 A JP 26391793A JP H07115987 A JPH07115987 A JP H07115987A
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 安定同位体で標識した酵母から、安定同位体
標識ＲＮＡ及び５′リボヌクレオチドを高い回収率と高
い純度で製造できる方法の提供。 【構成】 全炭素に占める13Ｃ原子の存在比および／ま
たは全窒素原子に占める15Ｎ原子の存在比が９５％以上
である安定同位体標識酵母の細胞壁を機械的あるいは酵
素的に破砕し、次いで該細胞壁破砕酵母菌体の懸濁液を
遠心分離して該菌体中のリボソーム画分を分離し、次い
で該リボソーム画分から標識ＲＮＡを分離する。
標識ＲＮＡ及び５′リボヌクレオチドを高い回収率と高
い純度で製造できる方法の提供。 【構成】 全炭素に占める13Ｃ原子の存在比および／ま
たは全窒素原子に占める15Ｎ原子の存在比が９５％以上
である安定同位体標識酵母の細胞壁を機械的あるいは酵
素的に破砕し、次いで該細胞壁破砕酵母菌体の懸濁液を
遠心分離して該菌体中のリボソーム画分を分離し、次い
で該リボソーム画分から標識ＲＮＡを分離する。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は13Ｃや15Ｎなどの安定同
位体で標識された酵母から安定同位体標識ＲＮＡを抽出
する方法であり、特に高分子状態の安定同位体標識ＲＮ
Ａを高純度、高収率で回収する技術に関する。
位体で標識された酵母から安定同位体標識ＲＮＡを抽出
する方法であり、特に高分子状態の安定同位体標識ＲＮ
Ａを高純度、高収率で回収する技術に関する。
【０００２】
【従来の技術】安定同位体標識ＲＮＡ及びそれを分解し
て得られる安定同位体標識５′リボヌクレオチドの標識
化合物は、最近目ざましい発展を遂げているＲＮＡの多
次元ＮＭＲによる構造解析に不可欠なものである。すな
わち、13Ｃや15Ｎは、1Ｈと同様にスピン１／２の原子
核を持つために、これらの安定同位体を有する物質は高
分解能ＮＭＲの測定が可能である。これらの標識化合物
では1Ｈの化学シフトに加えて13Ｃと15Ｎの化学シフト
が利用できるようになり、多次元ＮＭＲによる原子のシ
グナルの帰属の決定が容易となる。従ってＲＮＡのよう
な、わずか４種類の類似のヌクレオチド（シチジル酸、
アデニル酸、グアニル酸及びウリジル酸）からなり、Ｎ
ＭＲの化学シフトが極めて狭い範囲に集中している物質
の構造決定のためには、安定同位体標識ＲＮＡは不可欠
な物質である。そして安定同位体で標識されたＲＮＡお
よび５′リボヌクレオチドは、これらの測定に用いる任
意の標識ＲＮＡを化学合成または生物合成するための原
料として極めて価値のある物質である。
て得られる安定同位体標識５′リボヌクレオチドの標識
化合物は、最近目ざましい発展を遂げているＲＮＡの多
次元ＮＭＲによる構造解析に不可欠なものである。すな
わち、13Ｃや15Ｎは、1Ｈと同様にスピン１／２の原子
核を持つために、これらの安定同位体を有する物質は高
分解能ＮＭＲの測定が可能である。これらの標識化合物
では1Ｈの化学シフトに加えて13Ｃと15Ｎの化学シフト
が利用できるようになり、多次元ＮＭＲによる原子のシ
グナルの帰属の決定が容易となる。従ってＲＮＡのよう
な、わずか４種類の類似のヌクレオチド（シチジル酸、
アデニル酸、グアニル酸及びウリジル酸）からなり、Ｎ
ＭＲの化学シフトが極めて狭い範囲に集中している物質
の構造決定のためには、安定同位体標識ＲＮＡは不可欠
な物質である。そして安定同位体で標識されたＲＮＡお
よび５′リボヌクレオチドは、これらの測定に用いる任
意の標識ＲＮＡを化学合成または生物合成するための原
料として極めて価値のある物質である。
【０００３】従来、13Ｃや15Ｎの一方または両方などの
安定同位体で標識されたＲＮＡおよび５′リボヌクレオ
チドの製造方法に関する報告はなかった。しかし近時、
ヌクレイックアシッドリサーチ（Nucleic Acid Reseac
h）２０巻１７号4507〜4513頁および同号4515〜4523頁
（1992年）に、安定同位体で標識された炭素源及び窒素
源を用いて生育させた細菌の菌体から標識されたＲＮＡ
および５′リボヌクレオチドを製造する方法が発表され
た。これらの発表のうち前者は、全ての炭素原子が完全
に標識されたグルコース（13Ｃ6Ｈ12０6）と窒素原子が
標識された硫酸アンモニウムを含む培地で大腸菌（E.Co
li MY 285）を培養して安定同位体標識を大腸菌に行
い、フレンチプレスで大腸菌の細胞を破壊したのち超遠
心によりリボソーム画分を得、フェノール処理すること
により安定同位体標識ＲＮＡを回収している。一方後者
は、炭素原子が標識されたメタノールと窒素原子が標識
された硫酸アンモニウムを原料としてメタノール資化性
細菌を培養、安定同位体標識を行い、溶菌させたのちに
核酸を酵素により加水分解し、カラムを用いてリボヌク
レオチドとデオキシリボヌクレオチドを分画して安定同
位体標識５′リボヌクレオチドを回収している。
安定同位体で標識されたＲＮＡおよび５′リボヌクレオ
チドの製造方法に関する報告はなかった。しかし近時、
ヌクレイックアシッドリサーチ（Nucleic Acid Reseac
h）２０巻１７号4507〜4513頁および同号4515〜4523頁
（1992年）に、安定同位体で標識された炭素源及び窒素
源を用いて生育させた細菌の菌体から標識されたＲＮＡ
および５′リボヌクレオチドを製造する方法が発表され
た。これらの発表のうち前者は、全ての炭素原子が完全
に標識されたグルコース（13Ｃ6Ｈ12０6）と窒素原子が
標識された硫酸アンモニウムを含む培地で大腸菌（E.Co
li MY 285）を培養して安定同位体標識を大腸菌に行
い、フレンチプレスで大腸菌の細胞を破壊したのち超遠
心によりリボソーム画分を得、フェノール処理すること
により安定同位体標識ＲＮＡを回収している。一方後者
は、炭素原子が標識されたメタノールと窒素原子が標識
された硫酸アンモニウムを原料としてメタノール資化性
細菌を培養、安定同位体標識を行い、溶菌させたのちに
核酸を酵素により加水分解し、カラムを用いてリボヌク
レオチドとデオキシリボヌクレオチドを分画して安定同
位体標識５′リボヌクレオチドを回収している。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】安定同位体で標識され
た原料の原価は非常に高価なので、標識菌体からの安定
同位体標識ＲＮＡの収率が重要な要素となる。前者の方
法は標識菌体に大腸菌を、後者の方法では標識菌体にメ
タノール資化性菌を用いているが、両者とも菌体内のＲ
ＮＡに対するＤＮＡの割合が高く、後者の場合はカラム
を用いてデオキシリボヌクレオチドを除去しても、煩雑
な操作となって、しかも抽出した安定同位体標識５′リ
ボヌクレオチドにデオキシリボヌクレオチドの混入する
恐れもあり、純度の低下を招くことになる。本発明は上
記事情に鑑みてなされたもので、菌体内のＲＮＡ含量が
高く、またＲＮＡに対するＤＮＡの割合が著しく低い酵
母の特徴を利用し、安定同位体で標識した酵母から安定
同位体標識ＲＮＡおよび５′リボヌクレオチドを高い回
収率と高い純度で製造できる方法の提供を目的としてい
る。
た原料の原価は非常に高価なので、標識菌体からの安定
同位体標識ＲＮＡの収率が重要な要素となる。前者の方
法は標識菌体に大腸菌を、後者の方法では標識菌体にメ
タノール資化性菌を用いているが、両者とも菌体内のＲ
ＮＡに対するＤＮＡの割合が高く、後者の場合はカラム
を用いてデオキシリボヌクレオチドを除去しても、煩雑
な操作となって、しかも抽出した安定同位体標識５′リ
ボヌクレオチドにデオキシリボヌクレオチドの混入する
恐れもあり、純度の低下を招くことになる。本発明は上
記事情に鑑みてなされたもので、菌体内のＲＮＡ含量が
高く、またＲＮＡに対するＤＮＡの割合が著しく低い酵
母の特徴を利用し、安定同位体で標識した酵母から安定
同位体標識ＲＮＡおよび５′リボヌクレオチドを高い回
収率と高い純度で製造できる方法の提供を目的としてい
る。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本発明の安定同位体標識
ＲＮＡの製造方法は、全炭素に占める13Ｃ原子の存在比
および／または全窒素原子に占める15Ｎ原子の存在比が
９５％以上である安定同位体標識酵母の細胞壁を機械的
あるいは酵素的に破砕し、次いで該細胞壁破砕酵母菌体
の懸濁液を遠心分離して該菌体中のリボソーム画分を分
離し、次いで該リボソーム画分から標識ＲＮＡを分離す
ることを特徴としている。
ＲＮＡの製造方法は、全炭素に占める13Ｃ原子の存在比
および／または全窒素原子に占める15Ｎ原子の存在比が
９５％以上である安定同位体標識酵母の細胞壁を機械的
あるいは酵素的に破砕し、次いで該細胞壁破砕酵母菌体
の懸濁液を遠心分離して該菌体中のリボソーム画分を分
離し、次いで該リボソーム画分から標識ＲＮＡを分離す
ることを特徴としている。
【０００７】
【作用】本発明の安定同位体標識ＲＮＡの製造方法で
は、核膜を破壊することなく、酵母の細胞壁を機械的あ
るいは酵素的な方法により破壊するので、酵母のＲＮＡ
を遠心分離により容易に分離することができる。また、
酵母の全ＲＮＡの80％以上を占めるリボソーム画分から
ＲＮＡを分離精製するので、高分子状態のＲＮＡを回収
率よく抽出できる。
は、核膜を破壊することなく、酵母の細胞壁を機械的あ
るいは酵素的な方法により破壊するので、酵母のＲＮＡ
を遠心分離により容易に分離することができる。また、
酵母の全ＲＮＡの80％以上を占めるリボソーム画分から
ＲＮＡを分離精製するので、高分子状態のＲＮＡを回収
率よく抽出できる。
【０００８】本発明の方法により得られた安定同位体標
識ＲＮＡは、分解されずに全て高分子の状態を保ってお
り、安定同位体標識ＲＮＡを酵素的に分解して生成する
標識５′リボヌクレオチド画分には、標識２′リボヌク
レオチド、標識３′リボヌクレオチド、標識５′３′サ
イクリックリボヌクレオチド、標識２′３′サイクリッ
クリボヌクレオチドなどの不純物はほとんどなく、精製
処理工程を簡略にできる。
識ＲＮＡは、分解されずに全て高分子の状態を保ってお
り、安定同位体標識ＲＮＡを酵素的に分解して生成する
標識５′リボヌクレオチド画分には、標識２′リボヌク
レオチド、標識３′リボヌクレオチド、標識５′３′サ
イクリックリボヌクレオチド、標識２′３′サイクリッ
クリボヌクレオチドなどの不純物はほとんどなく、精製
処理工程を簡略にできる。
【０００９】
【実施例】以下、本発明の詳細について説明する。本発
明で用いる標識酵母とは、13Ｃで標識された安定同位体
標識酵母、15Ｎで標識された安定同位体標識酵母、及び
13Ｃと15Ｎの両方で標識された安定同位体標識酵母であ
り、全炭素に占める13Ｃ原子の存在比および／または全
窒素原子に占める15Ｎ原子の存在比が９５％以上である
ことが望ましい。
明で用いる標識酵母とは、13Ｃで標識された安定同位体
標識酵母、15Ｎで標識された安定同位体標識酵母、及び
13Ｃと15Ｎの両方で標識された安定同位体標識酵母であ
り、全炭素に占める13Ｃ原子の存在比および／または全
窒素原子に占める15Ｎ原子の存在比が９５％以上である
ことが望ましい。
【００１０】一般に酵母は菌体内に含まれる核酸のう
ち、ＤＮＡに対するＲＮＡの比率が高く、大腸菌などの
細菌類よりもＲＮＡの原料としては適しており、調味料
用の核酸の製造のためには酵母が用いられている。本発
明に用いる酵母の規制は特になく、サッカロミセス（Sa
ccharomyces）属、キャンディダ（Candida）属、ピキア
（Pichia）属、ハンセヌラ（Hansenula）属、トルロプ
シス（Torulopsis）属、クレッケラ（Kloeckera）属等
の酵母に分類されている通常の酵母菌株を使用すること
ができる。
ち、ＤＮＡに対するＲＮＡの比率が高く、大腸菌などの
細菌類よりもＲＮＡの原料としては適しており、調味料
用の核酸の製造のためには酵母が用いられている。本発
明に用いる酵母の規制は特になく、サッカロミセス（Sa
ccharomyces）属、キャンディダ（Candida）属、ピキア
（Pichia）属、ハンセヌラ（Hansenula）属、トルロプ
シス（Torulopsis）属、クレッケラ（Kloeckera）属等
の酵母に分類されている通常の酵母菌株を使用すること
ができる。
【００１１】次に、上述した標識酵母からの標識ＲＮＡ
の抽出法について述べる。まず、標識酵母を緩衝液（ｐ
Ｈ7.5）に懸濁し、細胞壁を破壊する。細胞壁の破壊方
法としては、石英砂による磨砕、ガラスビーズによる磨
砕（ダイノミルなど）、液体窒素で菌体を凍結させてか
らミキサーなどで砕く凍結破砕、フレンチプレスによる
破砕などの機械的破砕方法や、ザイモリエース（Zymoly
ase，キリンビール社製，最適ｐＨ7.5）などのエンド-
β-1,3-グルカナーゼ系の酵素、カタツムリ酵素（Helix
pomatia, Helix aspersa の消化管，最適ｐＨ5.8）な
どを用いて酵素的に破壊する方法がある。機械的あるい
は酵素的に細胞壁を破壊する方法では、顕微鏡で観察し
て酵母が完全に壊れている条件で行うのが良い。例え
ば、酵母菌体が乾燥重量にして100mg/mlの濃度で懸濁し
ている緩衝液に、ザイモリエースを30 units/ml以上の
濃度になるように加え、pH6.5〜7.5、温度35〜45℃の条
件下で30分から２時間反応させる、あるいは、酵母菌体
を適度な濃度で緩衝液に懸濁させ、フレンチプレスを用
いて10,000〜20,000psi（ポンド／平方インチ）で２回
処理を行う、などの方法により酵母の細胞壁を完全に破
壊することができる。
の抽出法について述べる。まず、標識酵母を緩衝液（ｐ
Ｈ7.5）に懸濁し、細胞壁を破壊する。細胞壁の破壊方
法としては、石英砂による磨砕、ガラスビーズによる磨
砕（ダイノミルなど）、液体窒素で菌体を凍結させてか
らミキサーなどで砕く凍結破砕、フレンチプレスによる
破砕などの機械的破砕方法や、ザイモリエース（Zymoly
ase，キリンビール社製，最適ｐＨ7.5）などのエンド-
β-1,3-グルカナーゼ系の酵素、カタツムリ酵素（Helix
pomatia, Helix aspersa の消化管，最適ｐＨ5.8）な
どを用いて酵素的に破壊する方法がある。機械的あるい
は酵素的に細胞壁を破壊する方法では、顕微鏡で観察し
て酵母が完全に壊れている条件で行うのが良い。例え
ば、酵母菌体が乾燥重量にして100mg/mlの濃度で懸濁し
ている緩衝液に、ザイモリエースを30 units/ml以上の
濃度になるように加え、pH6.5〜7.5、温度35〜45℃の条
件下で30分から２時間反応させる、あるいは、酵母菌体
を適度な濃度で緩衝液に懸濁させ、フレンチプレスを用
いて10,000〜20,000psi（ポンド／平方インチ）で２回
処理を行う、などの方法により酵母の細胞壁を完全に破
壊することができる。
【００１２】細胞壁を破壊した酵母の懸濁液を5,000〜1
5,000Gで10〜30分間遠心し、上清を回収する。回収した
上清を更に100,000〜150,000Gで２〜３時間超遠心する
ことにより沈澱にリボソーム画分が得られる。なお、該
懸濁液からリボソーム画分を得る方法はこれに限らず、
塩化セシウム溶液などによる密度勾配遠心法を用いても
良い。次にリボソームから標識ＲＮＡを分離させるた
め、界面活性剤であるドデシル硫酸ナトリウム（ＮａＣ
12Ｈ25ＳＯ4，通称ＳＤＳ）を0.2〜5重量％になるよう
に添加し、更に水飽和フェノールを加え、攪拌後遠心す
る。中間層あるいはフェノール層には蛋白質が、水層に
は標識ＲＮＡが分離される。水層に分離された標識ＲＮ
Ａを沈澱させるために、エタノールを添加する。なお、
標識ＲＮＡの沈澱を良好にするため、酢酸ナトリウム、
安息香酸ナトリウム、塩化ナトリウム、酢酸カリウムな
どを加え、標識ＲＮＡをナトリウム塩あるいはカリウム
塩の形に変えると良い。そしてこの水層を遠心すること
により、安定同位体標識ＲＮＡが得られる。
5,000Gで10〜30分間遠心し、上清を回収する。回収した
上清を更に100,000〜150,000Gで２〜３時間超遠心する
ことにより沈澱にリボソーム画分が得られる。なお、該
懸濁液からリボソーム画分を得る方法はこれに限らず、
塩化セシウム溶液などによる密度勾配遠心法を用いても
良い。次にリボソームから標識ＲＮＡを分離させるた
め、界面活性剤であるドデシル硫酸ナトリウム（ＮａＣ
12Ｈ25ＳＯ4，通称ＳＤＳ）を0.2〜5重量％になるよう
に添加し、更に水飽和フェノールを加え、攪拌後遠心す
る。中間層あるいはフェノール層には蛋白質が、水層に
は標識ＲＮＡが分離される。水層に分離された標識ＲＮ
Ａを沈澱させるために、エタノールを添加する。なお、
標識ＲＮＡの沈澱を良好にするため、酢酸ナトリウム、
安息香酸ナトリウム、塩化ナトリウム、酢酸カリウムな
どを加え、標識ＲＮＡをナトリウム塩あるいはカリウム
塩の形に変えると良い。そしてこの水層を遠心すること
により、安定同位体標識ＲＮＡが得られる。
【００１３】本発明の方法で調整した安定同位体標識Ｒ
ＮＡは、通常の方法で５′リボヌクレオチドへの分解、
及びイオン交換クロマトグラフィーによる４種類の５′
リボヌクレオチドの分画が可能で、容易に安定同位体標
識５′リボヌクレオチドを調製することができる。以下
に本発明の方法について実施例を挙げて説明する。
ＮＡは、通常の方法で５′リボヌクレオチドへの分解、
及びイオン交換クロマトグラフィーによる４種類の５′
リボヌクレオチドの分画が可能で、容易に安定同位体標
識５′リボヌクレオチドを調製することができる。以下
に本発明の方法について実施例を挙げて説明する。
【００１４】（実施例１）キャンディダ・ウチリス Ｉ
ＦＯ ０３６９を、予め三角フラスコで種母培養し、こ
れをジャーファメンターに１％植菌した。種母培養及び
本培養における培地は、13ＣＨ3 13ＣＯＯＮａ（米国ア
イソテック社製；＞９９atom％）1.3重量％、15ＮＨ4Ｃ
ｌ（同アイソテック社製）0.25重量％、ＫＨ2ＰＯ4 0.1
重量％、Ｋ2ＨＰＯ4 0.1％、ＭｇＳＯ4・7Ｈ2Ｏ 0.05重
量％を用いた。槽内液量３リットル、培養温度２８℃、通気
量３リットル／min、攪拌数700r.p.m.、ｐＨ6.5（自動調
整）の培養条件下で本培養を行った。
ＦＯ ０３６９を、予め三角フラスコで種母培養し、こ
れをジャーファメンターに１％植菌した。種母培養及び
本培養における培地は、13ＣＨ3 13ＣＯＯＮａ（米国ア
イソテック社製；＞９９atom％）1.3重量％、15ＮＨ4Ｃ
ｌ（同アイソテック社製）0.25重量％、ＫＨ2ＰＯ4 0.1
重量％、Ｋ2ＨＰＯ4 0.1％、ＭｇＳＯ4・7Ｈ2Ｏ 0.05重
量％を用いた。槽内液量３リットル、培養温度２８℃、通気
量３リットル／min、攪拌数700r.p.m.、ｐＨ6.5（自動調
整）の培養条件下で本培養を行った。
【００１５】培養終了後、5,000Gにて10分間酵母菌体を
遠沈し、蒸留水で水洗を３回行った後、乾燥重量10.5g
の標識酵母菌体を得た。なおこの菌体のＲＮＡ含量をＳ
ＴＳ法（Schmidt-Thannhauser-Schnider法）により測定
した。測定値は、乾燥重量当り7.0％であった。
遠沈し、蒸留水で水洗を３回行った後、乾燥重量10.5g
の標識酵母菌体を得た。なおこの菌体のＲＮＡ含量をＳ
ＴＳ法（Schmidt-Thannhauser-Schnider法）により測定
した。測定値は、乾燥重量当り7.0％であった。
【００１６】乾燥重量 1.27gの標識酵母を、乾燥重量と
して100mg/mlとなるように、50mMのトリス緩衝液（ｐＨ
7.5，ＫＣｌ 30mM，ＭｇＣｌ2 10mMを含む）に懸濁させ
た。続いて、β−メルカプトエタノール 0.1重量％と、
細胞壁溶解酵素であるザイモリエースを 35units/mlに
なるように加え、37℃で１時間反応させた。
して100mg/mlとなるように、50mMのトリス緩衝液（ｐＨ
7.5，ＫＣｌ 30mM，ＭｇＣｌ2 10mMを含む）に懸濁させ
た。続いて、β−メルカプトエタノール 0.1重量％と、
細胞壁溶解酵素であるザイモリエースを 35units/mlに
なるように加え、37℃で１時間反応させた。
【００１７】反応終了後、ＫＣｌ 30mM，ＭｇＣｌ2 10m
M，ＮａＮ3 2mM，グリセロール 20重量％を含む50mMの
トリス緩衝液（ｐＨ7.5）を等量加え、8,000Gにて20分
間遠心し、上清を回収した。引き続いて、回収した上清
に 1/3容量の2M ＫＣｌを加え、100,000Gにて３時間超
遠心を行い、沈澱（リボソーム画分）を得た。この沈澱
を酢酸緩衝液（ＣＨ3ＣＯＯＮａ 50mM，（ＣＨ3ＣＯ
Ｏ）2Ｍｇ 10mM，ｐＨ7.4）に溶かし、1/10容量の５％
ＳＤＳを加えて攪拌後、等量の水飽和フェノールを加え
て１時間振とうした。引き続き、10,000Gにて20分間遠
心し、フェノール層と水層に分離したのち水層を回収し
た。この水層に等量のクロロホルムを加え、攪拌後3,00
0Gにて15分間遠心し、水層とクロロホルム層に分離した
のち水層を回収した。同じ操作をもう一度繰り返し行う
ことによりフェノールを除去した。フェノール除去後の
水層に 1/10容量の 1.3M ＣＨ3ＣＯＯＫを加え、更に２
容量のエタノールを加えた後に-20℃のフリーザーで一
晩放置し、ＲＮＡを沈澱させた。引き続き、95％エタノ
ール及び99％エタノールで洗浄し、真空乾燥することに
より、純度90％以上の標識ＲＮＡを53mg得た。
M，ＮａＮ3 2mM，グリセロール 20重量％を含む50mMの
トリス緩衝液（ｐＨ7.5）を等量加え、8,000Gにて20分
間遠心し、上清を回収した。引き続いて、回収した上清
に 1/3容量の2M ＫＣｌを加え、100,000Gにて３時間超
遠心を行い、沈澱（リボソーム画分）を得た。この沈澱
を酢酸緩衝液（ＣＨ3ＣＯＯＮａ 50mM，（ＣＨ3ＣＯ
Ｏ）2Ｍｇ 10mM，ｐＨ7.4）に溶かし、1/10容量の５％
ＳＤＳを加えて攪拌後、等量の水飽和フェノールを加え
て１時間振とうした。引き続き、10,000Gにて20分間遠
心し、フェノール層と水層に分離したのち水層を回収し
た。この水層に等量のクロロホルムを加え、攪拌後3,00
0Gにて15分間遠心し、水層とクロロホルム層に分離した
のち水層を回収した。同じ操作をもう一度繰り返し行う
ことによりフェノールを除去した。フェノール除去後の
水層に 1/10容量の 1.3M ＣＨ3ＣＯＯＫを加え、更に２
容量のエタノールを加えた後に-20℃のフリーザーで一
晩放置し、ＲＮＡを沈澱させた。引き続き、95％エタノ
ール及び99％エタノールで洗浄し、真空乾燥することに
より、純度90％以上の標識ＲＮＡを53mg得た。
【００１８】（実施例２）実施例１で使用した標識酵母
（キャンディダ・ウチリス ＩＦＯ ０３６９）と同じ酵
母を乾燥重量 1.5g はかりとり、50mMのトリス緩衝液
（ｐＨ7.5，ＫＣｌ30mM，ＭｇＣｌ2 10mMを含む）10ml
に懸濁させた。フレンチプレスを用いて15,000psiで２
回処理を行い、標識酵母の細胞壁を破壊した。
（キャンディダ・ウチリス ＩＦＯ ０３６９）と同じ酵
母を乾燥重量 1.5g はかりとり、50mMのトリス緩衝液
（ｐＨ7.5，ＫＣｌ30mM，ＭｇＣｌ2 10mMを含む）10ml
に懸濁させた。フレンチプレスを用いて15,000psiで２
回処理を行い、標識酵母の細胞壁を破壊した。
【００１９】細胞壁破壊後の標識酵母の懸濁液に、ＫＣ
ｌ 30mM，ＭｇＣｌ2 10mM，ＮａＮ32mM，グリセロール
20重量％を含む50mMのトリス緩衝液（ｐＨ7.5）を等量
加え、8,000Gにて20分間遠心し、上清を回収した。引き
続いて、回収した上清に 1/3容量の2M ＫＣｌを加え、1
00,000Gにて３時間超遠心を行い、沈澱（リボソーム画
分）を得た。
ｌ 30mM，ＭｇＣｌ2 10mM，ＮａＮ32mM，グリセロール
20重量％を含む50mMのトリス緩衝液（ｐＨ7.5）を等量
加え、8,000Gにて20分間遠心し、上清を回収した。引き
続いて、回収した上清に 1/3容量の2M ＫＣｌを加え、1
00,000Gにて３時間超遠心を行い、沈澱（リボソーム画
分）を得た。
【００２０】標識酵母のリボソーム画分からの標識ＲＮ
Ａの抽出に関しては、実施例１と同じ方法により行い、
純度90％以上の標識ＲＮＡを61mg得た。
Ａの抽出に関しては、実施例１と同じ方法により行い、
純度90％以上の標識ＲＮＡを61mg得た。
【００２１】
【発明の効果】以上説明したように、本発明は13Ｃと15
Ｎのうち一方または両方で標識された安定同位体標識酵
母の細胞壁を破壊し、酵母中の全ＲＮＡの80％以上を占
めるリボソームの画分を得、そこから安定同位体標識Ｒ
ＮＡを分離精製する方法であり、高分子状態の標識ＲＮ
Ａを回収率、純度ともに高く抽出することができる。ま
た、ＤＮＡ混入の心配は殆どなく、その後ＤＮＡを分離
する操作が要らない。従って、本発明によれば、純度の
高い安定同位体標識ＲＮＡを高分子の状態で安価に製造
することが可能となる。
Ｎのうち一方または両方で標識された安定同位体標識酵
母の細胞壁を破壊し、酵母中の全ＲＮＡの80％以上を占
めるリボソームの画分を得、そこから安定同位体標識Ｒ
ＮＡを分離精製する方法であり、高分子状態の標識ＲＮ
Ａを回収率、純度ともに高く抽出することができる。ま
た、ＤＮＡ混入の心配は殆どなく、その後ＤＮＡを分離
する操作が要らない。従って、本発明によれば、純度の
高い安定同位体標識ＲＮＡを高分子の状態で安価に製造
することが可能となる。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 飯野 寿美子 茨城県つくば市大久保10 日本酸素株式会 社つくば研究所内 (72)発明者 福田 裕章 茨城県つくば市大久保10 日本酸素株式会 社つくば研究所内
Claims (1)
- 【請求項１】 全炭素に占める13Ｃ原子の存在比および
／または全窒素原子に占める15Ｎ原子の存在比が９５％
以上である安定同位体標識酵母の細胞壁を機械的あるい
は酵素的に破砕し、次いで該細胞壁破砕酵母菌体の懸濁
液を遠心分離して該菌体中のリボソーム画分を分離し、
次いで該リボソーム画分から標識ＲＮＡを分離すること
を特徴とする安定同位体標識ＲＮＡの製造方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP26391793A JPH07115987A (ja) | 1993-10-21 | 1993-10-21 | 安定同位体標識ｒｎａの製造方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP26391793A JPH07115987A (ja) | 1993-10-21 | 1993-10-21 | 安定同位体標識ｒｎａの製造方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH07115987A true JPH07115987A (ja) | 1995-05-09 |
Family
ID=17396067
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP26391793A Withdrawn JPH07115987A (ja) | 1993-10-21 | 1993-10-21 | 安定同位体標識ｒｎａの製造方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH07115987A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2000290291A (ja) * | 1999-03-31 | 2000-10-17 | Nippon Sanso Corp | 安定同位体標識オリゴヌクレオチド及びオリゴヌクレオチド検出方法 |
-
1993
- 1993-10-21 JP JP26391793A patent/JPH07115987A/ja not_active Withdrawn
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2000290291A (ja) * | 1999-03-31 | 2000-10-17 | Nippon Sanso Corp | 安定同位体標識オリゴヌクレオチド及びオリゴヌクレオチド検出方法 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
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| A300 | Withdrawal of application because of no request for examination |
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