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DE69427705T2 - Bor-cluster enthaltende nukleoside und oligonukleoside - Google Patents

Bor-cluster enthaltende nukleoside und oligonukleoside

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DE69427705T2
DE69427705T2 DE69427705T DE69427705T DE69427705T2 DE 69427705 T2 DE69427705 T2 DE 69427705T2 DE 69427705 T DE69427705 T DE 69427705T DE 69427705 T DE69427705 T DE 69427705T DE 69427705 T2 DE69427705 T2 DE 69427705T2
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oligonucleotide
oligonucleotides
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nucleic acid
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F. Kattan
J. Lesnikowski
F. Schinazi
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Original Assignee
Emory University
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Description

  • Diese Erfindung liegt auf dem Gebiet der synthetischen organischen Chemie und liegt insbesondere auf dem Gebiet der Carboranyl enthaltenden synthetischen Nukleoside und Oligonukleotide und deren Herstellungsverfahren und ihrer Verwendung.
    • Hintergrund der Erfindung
  • Das Ziel einer Krebsbehandlung ist es, einen Grad an Selektivität zu erreichen, bei dem normale Zellen verschont werden und maligne Zellen zerstört, weil gerade eine kleine Zahl von verbleibenden malignen Zellen zum Wiederauftreten, Metastasierung und Tod zu führen kann. Ein Zweikomponenten- oder binäres System bestehend aus Konstituenten, die allein nicht letal sind und größtenteils auf maligne Zellen beschränkt sind und die, wenn sie kombiniert werden, gegenüber den neoplastischen Zellen letal wirken, aber unschädlich gegenüber normalen Zellen sind, eine ideale Modalität sind. Ein Vorteil dieses Typs eines binären Systems ist, daß jede Komponente unabhängig manipuliert werden kann, um die Selektivität zu maximieren.
  • Die Bor-Neutronen-Einfang-Therapie (BNCT, siehe Fig. 1) ist ein binäres System, das zwei separate nicht-letale Konstituenten kombiniert, eine strahlensensitivierende Verbindung, die ein stabile Bor-10-Isotop (¹&sup0;B) und nichtionische Neutronenstrahlung enthält. Wenn Bor-10 mit Neutronen bestrahlt wird, kommt es zu einer nuklearen Reaktion, bei der ein Heliumkern (α-Partikel), ein Lithiumkern und etwa 100 Millionen mal mehr Energie als die anfängliche Bestrahlungsenergie erzeugt wird. Die erzeugte Strahlung zerstört die malignen Zellen die die Borverbindung enthalten. Selektivität wird durch die Verwendung von Verbindungen erreicht, die primär in malignen Zellen akkumulieren und/oder des Neutronenstrahls auf die Tumormasse lenken, die den Borträger enthalten.
  • Die Haupthindernisse der BNCT sind: (1) das Erreichen einer ausreichend hohen intrazellulären Borkonzentration und (2) die Selektivität gegenüber Tumorzellen. Obwohl Versuche, tumorselektive Borverbindungen zu entwickeln, bis in die 1960er Jahre zurückreichen und trotz extensiver Untersuchungen blieb das Problem der selektiven Verabreichung von Borträgern auf Tumorzellen erhalten.
  • Viele Verbindungsklassen wurden für BNCT synthetisiert. Zum Beispiel, siehe Barth, R. F.; Soloway, A. H.; Fairchild, R. G.; Brugger, R. M. Cancer 1992, 70, 2995-3008; Fairchild, R. G.; Kahl, S. B.; Laster, B. H.; Kalef-Ezra, J.; Popenoe, E. A. Cancer Res. 1990, 50, 4860-4865 und Zamenhof, R. G.; Kalend, A. M.; und Bloomer, W. D. J. Natl. Cancer Inst. 1992, 84, 1290- 1291.
  • Das erste Bor enthaltende Nucleosid 5-Dihydroxyboryl-2'-desoxyuridin wurde von Schinazi und Prusoff 1978 synthetisiert. Schinazi, RF., Prusoff, W. H. Tetrahedron Lett. 1978, 4981- 4984; und Schinazi, R. F., Prusoff, W. H. J. Org. Chem. 1985, 50, 841-847. Sood et al. haben über die Synthese einer Reihe von Cyanoboranaddukten von 2'-Desoxyukleosiden berichtet, insbesondere 2'-Desoxyguanosin-N&sup7;-cyanoboran, 2'-Desoxyinosin-N&sup7;-cyanoboran, 2'- Desoxyadenosin-N&sup7;-cyanoboran und 2'-Desoxycytidin-N&sup7;-cyanoboran. Sood, A.; Spielvogel, B. F.; Shaw, B. R. J. Am. Chem. Soc. 1989, 111, 9234-9235.
  • Sood et al. haben auch über die Synthese von Oligonukleotiden mit eines mit Bor versetzten Intemukleotidgerüsts in der Form von Boranophosphaten und Boranophosphatmethylestern berichtet. Die Boran-(BH&sub3;) Gruppe in diesen mit Bor versetzten Oligonukleotiden ist isoelektronisch und isostrukturell zu normalen O-Oligonukleotiden und Oligonukleotidmethylphosphonaten. Sood, A.; Shaw, B. R.; Spielvogel, B. F. J. Am. Chem. Soc. 1990, 112, 9000-9001. Die Sood-Verbindungen haben im allgemeinen einen geringen Borgehalt und einige haben eine geringere als die gewünschte Lipophilie.
  • Das U.S. Patent Nr. 5,130,302 von Spielvogel et al. offenbart eine neue Klasse von mit Bor versetzten Nukleosiden, Nukleotiden und Oligonukleotiden, die als antineoplastische, antientzündlich wirkende und antihypersensitive Mittel verwendet werden. Die Nukleoside, Nukleotide und Oligonukleotide sind kovalent entweder an BH&sub2;CN, BH&sub3; oder BH&sub2;CO&sub2;R Anteile gebunden, wobei R ein C&sub1; bis C&sub1;&sub8; Alkyl ist.
  • Eine Anzahl von Carboranylpyrimidinen wurde für die Verwendung bei der Bor-Neutronen- Einfang-Therapie hergestellt. Beispiele von Carboranylpyrimidinen schließen 5-(3-0- Carboranylpropyl)-6-methyl-2-thiouracil (Verbindung A) (Wilson, LG. Pi ment Cell Res. 1989, 2, 297-303), 2,4-Dichlor-5-(1-o-carboranylmethyl)-6-methylpyrimidin, (Verbindung B) (Reynolds, R. C.; Trask, T. W.; Sedwick W. D. J. Org,, Chem. 1991, 56, 2391-2395) und 5- Carboranyluracil (Verbindung C) (Goudgaon, N. M.; El-Kattan, Y.; Fulcrand, G.; Liotta, D. C.; Schinazi, R. F, IMEBORON VIII, Knoxville, IN; S. 72, 1993) ein.
  • Es wurden auch Purin- und Pyrimidin-Nukleoside, die eine Carboranylgruppe enthalten, die an die Purin- oder Pyrimidinbase gebunden ist, beschrieben. Yamamoto, Y.; Seko, T.; Nakamura, H. Heteroatom. Chem. 1992, 3, 239-244 und Schinazi, R. F.; Goudgaon, N. M.; Soria, J.; Liotta, D. C. 5th International Symposium on Neutron Capture Therapy, Columbus, Ohio; S. 11, 1992; Schinazi, R. F.; Goudgaon, N. M.; Soria, J.; Liotta, D. C. Tenth International Roundtable: Nucleosides and Nucleotides, Park City, Utah; S. 28, 1992. Diese Verbindungen sind lipophil und einige werden schnell durch zelluläre Kinasen phosphoryliert und können in bestimmten Zellen in die DNA als Analoge von natürlichen 2'-Desoxypyrimidin-Nukleosiden aufgenommen werden. Beispiele schließen 5-Carboranyl-2'-desoxyuridin (Verbindung D, CDU), 5-Carboranyluridin (Verbindung E, CU), 5-(1-Hydroxymethyl)carboranyluridin und 5- (1-Hydroxymethyl)carboranyluridin (Verbindung F, JMCU) ein.
  • In der PCT WO 93/17028, eingereicht von Raymond F. Schinazi und Dennis C. Liotta, werden eine Anzahl von synthetischen Nukleosiden offenbart, die einen Carboranylanteil aufweisen, der kovalent an eine Purin- oder Pyrimidinbase gebunden ist, wobei der Zuckeranteil wahlweise ein zweites Heteroatom in der 3' -Position im Ring enthält. Bevorzugte Verbindungen sind 2-Hydroxymethyl-5-(5-carboranylcytosin-1-yl)-1,3- oxathiolan (Verbindung G) und 2-Hydroxymethyl-5-(5-carboranyluridin-1-yl)-1,3-oxathiolan (Verbindung H).
  • Powell et al. haben vor kurzem über die Synthese von Oligonukleotiden berichtet, die 3',5'- nido-o-Carboranyl-phosphoramidat-Bindungen enthalten (Verbindung I). Während das Oligonukleotid, wie berichtet, im Zellkern lokalisiert werden kann, ist der Boranteil säurelabil, weil es mit dem Phosphoratom durch eine Bindung vom Amidtyp verbunden ist.
  • Die Erfordernisse für eine wirksame BNCT mit Oligonukleotiden, die Zellselektivität (Fähigkeit vorzugsweise in erkrankten Zellen zu akkumulieren), Stabilität der chemotherapeutischen Mittel in vivo (Resistenz gegenüber dem Abbau durch zelluläre Nukleasen und chemische Stabilität) und Tranportfähigkeit (Fähigkeit der chemotherapeutischen Mittel, die zellulären Membranen leicht zu passieren) einschließen, sind sehr ähnlich den Erfordernissen für Antisense Oligonukleotid Therapie (AOT), einer anderen kürzlich entwickelten Therapie gegen Krebs ebenso wie anderer Krankheiten. Uhlmann "Antisense Oligonukleotides: A New Therapeutic Approach" Chemical Reviews, 90(4), Juni 1990. Die Verbindungen sollten ebenfalls relativ untoxisch sein. Die Antisense Technologie bezieht sich im allgemeinen auf die Modulation einer Genexpression durch ein Verfahren, bei dem ein synthetisches Oligonukleotid auf eine komplementäre Nucleinsäuresequenz hybridisiert wird, um Transkription oder Replikation (wenn die Trägersequenz eine DNA ist) zu inhibieren, um Translation (wenn die Trägersequenz eine RNA ist) zu inhibieren oder um das Processing (wenn die Trägersequenz eine Vorläufer-RNA ist) zu inhibieren. Es kann eine große Vielzahl von zellulären Aktivitäten unter Verwendung dieser Technik moduliert werden. Eineinfaches Beispiel ist die Inhibierung von Proteinbiosynthese durch ein Antisense Oligonukleotid, das an eine mRNA gebunden ist. In einer anderen Ausführungsform ist ein synthetisches Oligonukleotid auf eine spezifische Gensequenz in einer doppelsträngigen DNA hybridisiert, das einen dreifachsträngigen DNA- Komplex (Triplex) bildet, der die Expression dieser Gensequenz inhibiert. Antisense Oligonukleotide können auch verwendet werden, um die Genexpression indirekt durch Suppression der Biosynthese eines natürlichen Repressors zu aktivieren oder direkt durch Reduktion der Termination der Transkription. AOT kann verwendet werden, um die Expression von pathogenen Genen zu inhibieren, zum Beispiel von denen, die die Replikation von Viren erleichtern, einschließlich dem humanen Immundefektvirus (HIV), dem Hepatitis B Virus (HBV) und den Herpesviren, und Krebs, insbesondere soliden Turmoren, wie z. B. Gliomen; Brustkrebs und Melanomen.
  • Indem Fortschritte auf den Gebieten sowohl von BNCT und AOT gemacht wurden, zeigten keine der bis zu diesem Datum hergestellten synthetischen Oligonukleotide die optimale Kombination von Zellselektivität, Stabilität in vivo, und die Fähigkeit, leicht durch die zellulären Membranen zu passieren (Tranportfähigkeit).
  • Deshalb ist es eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung eine neue Klasse von synthetischen Oligonukleotiden bereitzustellen, die für BNCT, AOT oder beide verwendet werden können, die die gewünschten Profile von Zellselektivität, Stabilität in vivo, und der Fähigkeit, leicht durch die zellulären Membranen zu passieren, aufweisen.
  • Es ist eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, neue Verfahren zur Herstellung von Bor enthaltenden Nukleosiden und Oligonukleotiden bereitzustellen.
    • Zusammenfassung der Erfindung
  • Carboranyl-enthaltende Nukleoside und Oligonukleotide, die lipophil sind und einen hohen Gehalt an Boratomen aufweisen, werden bereitgestellt, um bei der Bor-Neutronen-Einfang- Therapie (BNCT) eingesetzt zu werden:
  • Oligonukleotide, die komplementär zu überexprimierten oder einzigartigen RNA- oder DNA- Sequenzen in Trägerkrebszellen sind, können für BNCT gemäß den hier beschriebenen Verfahren entworfen werden, um selektiv die Bor-enthaltenden Materialien in diesen Zellen zu akkumulieren.
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung werden Oligonukleotide bereitgestellt, die eine Carboranyl-modifizierte Base in wenigstens einem der Nukleoside des Oligomers enthalten. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Carboranyl-enthaltende Base in einem Nukleosid; das am 3'-Terminus lokalisiert ist, in dem Nukleosid, das dem 3'- terminalen Nukleosid benachbart ist, in dem 5'-terminalen Nukleosid oder in dem Nukleosid, das dem 5'-terminalen Nukleosid benachbart ist, vorhanden. Oligonukleotide, die die Carboranyl-enthaltende Base im 3'-terminalen Nukleosid oder dem Nukleosid, das dem 3' terminalen Nukleosid benachbart ist, enthalten, sind resistenter gegenüber Abbau durch 3'- Exonukleasen. Es wurde gefunden, daß Oligonukleotide, die die Carboranyl enthaltenden Baseneinheiten in den bevorzugten Positionen aufweisen, effektiver mit komplementären Nukleinsäuresequenzen hybridisieren als Oligonukleotide, die die Carboranyl enthaltenden Basen in anderen Positionen aufweisen.
  • In einer weiteren Ausführungsform werden Oligonukleotide bereitgestellt, die wenigstens einen 3',5'-[(0,0-Carboran-1-yl)phosphat]-Rest und wenigstens ein Nukleosid aufweisen, das eine Carboranyl-enthaltende Base enthält, um die Bordichte und Lipophie des Moleküls zu erhöhen und in Abhängigkeit von dem Ort der Modifikationen die Stabilität des Oligomers in vivo in biologischen Flüssigkeiten oder Zellen zu erhöhen.
  • Zusätzlich zu der Verwendung der hier beschriebenen Oligonukleotide für die BNCT können die hier offenbarten Oligonukleotide in vitro verwendet werden, um Strukturaktivitätsbeziehungen der Mengentoleranz der Hybridisierung von synthetischen Oligonukleotiden mit komplementären Nukleinsäuresequenzen, in MRI-Abbildungen oder als Sonden in einer Vielzahl diagnostischer Techniken durchzuführen.
  • Carboranyl-enthaltende Oligonukleotide können auch verwendet werden, um die Mutation von exprimierter HIV-1 Reverser Transkriptase unter Verwendung von in vitro oder in vivo zielgerichteter Mutagenese (SDM) zu bewirken.
  • Es können Oligonukleotide hergestellt werden, die Bor-Cluster enthalten, um die Lipophilie zu verstärken, bei dem das Bor nicht mit ¹&sup0;B, aber statt dessen mit dem ¹¹B-Isotop angereichert ist. Die Oligonukleotide der vorliegenden Erfindung, die für BNCT oder andere diagnostische Techniken verwendet werden, die vom Zerfall der Neutronenbestrahlung für die Zerstörung der erkrankten Zellen oder für Signalzwecke abhängig sind, sollten mit einer geeigneten Menge an ¹&sup0;B, normalerweise ungefähr 90 bis 100% ¹&sup0;B und typischerweise zwischen 92 bis 96% ¹&sup0;B angereichert sein.
    • Kurze Beschreibung der Figuren
  • Fig. 1 ist eine schematische Darstellung eines hypothetischen Wirkungsmechanismus von borierten Oligonukleotiden für BNCT.
  • Fig. 2 ist eine Darstellung des Verfahrens zur Herstellung von 5-(o-Carboranyl)-5'-O- dimethoxytrityl-2'-O-Desoxyuridin-3'-(N,N-diisopropyl-β-cyanoethyl)phosphoramidit.
  • Fig. 3 zeigt eine Darstellung der chemischen Strukturen eines BxH&sub1;&sub0; Carbor-Teils und des anionischen o-nido-7,8-C&sub2;B&sub9;H(11 oder 12) und o-closo-1,2-C&sub2;B&sub1;&sub0;H&sub1;&sub2; - Formen der Carborane.
  • Fig. 4 zeigt eine Darstellung des Verfahrens für die automatische Herstellung von Dodecathymidylicsäureanalogen, die einen oder mehrere 5-(o-Carboran-1-yl)uracil-Reste tragen, wie sie in Tabelle 1 weiter beschrieben werden.
  • Fig. 5 ist eine graphische Darstellung der Fraktionsänderung der Extinktion gegen die Temperatur in Grad Celcius für (dT)&sub6;CDU(dT)&sub5; (Tm = 15,2), (dT)&sub1;&sub0;CDU(dT) (Tm = 20,5), CDU(dT)&sub1;&sub1; (Tm = 28,8) und (dT)&sub1;&sub2; (Tm = 29,0).
  • Fig. 6 zeigt das Zirkulardichroismusspektrum einer ausgewählten einzelsträngigen CDU- modifizierten und -unmodifizierten (dT)&sub1;&sub2; (Verbindung 18).
  • Fig. 7 zeigt das Zirkulardichroismusspektrum von Komplexen, die zwischen CDU- modifizierten und -unmodifizierten (dT)&sub1;&sub2; und (dA)&sub1;&sub2; gebildet werden.
    • Detaillierte Beschreibung der Erfindung
  • Der Ausdruck Alkyl, wie er hier verwendet wird, wenn es nicht anders spezifiziert ist, bezieht sich auf gesättigte geradkettige, verzweigte oder cyclische, primäre, sekundäre oder tertiäre Kohlenwasserstoffe von C&sub1; bis C&sub1;&sub0; und schließt insbesondere Methyl, Ethyl, Propyl, Isopropyl, Butyl, Isobutyl, t-Butyl, Pentyl, Cyclopentyl, Isopentyl, Neopentyl, Hexyl, Isohexyl, Cyclohexyl, Cyclohexylmethyl, 3-Methylpentyl, 2,2-Dimethylbutyl und 2,3- Dimethylbutyl ein. Die Alkylgruppe kann wahlweise mit einem oder mehreren Resten substituiert sein, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Hydroxyl, Amino, Alkylamino, Arylamino, Alkoxy, Aryloxy, Nitro, Cyano, Sulfonsäure, Sulfat, Phosphorsäure, Phosphat oder Phosphonat, entweder ungeschützt oder wenn nötig geschützt, wie es dem Fachmann bekannt ist, zum Beispiel wie in Greene et al. in "Protective Groups in Organic Synthesis", John Wiley and Sons, Second Edition, 1991, gelehrt wird. Der Ausdruck niedriges Alkyl, wie er hier verwendet wird, wenn es nicht anders spezifiziert ist, bezieht sich auf C&sub1; bis C&sub4;- gesättigte geradkettige oder verzweigte Alkylgruppen.
  • Der Ausdruck Alkylamino oder Arylamino bezieht sich auf eine Aminogruppe, die eine oder zwei Alkyl- beziehungsweise Arylsubstituenten aufweist.
  • Der Ausdruck "geschützt", wie er hier verwendet wird, wenn er nicht anders definiert wird, bezieht sich auf eine Gruppe, die einem Sauerstoff-, Stickstoff oder Phosphoratom zugefügt wird, um ihre weiteren Reaktionen zu verhindern oder für weitere Zwecke. Es sind eine Vielzahl von Sauerstoff und Stickstoffschutzgruppen für den Fachmann der organischen Synthese bekannt.
  • Der Ausdruck Aryl, wie er hier verwendet wird, und wenn er nicht anders spezifiziert wird, bezieht sich auf Phenyl, Biphenyl oder Naphthyl, und vorzugsweise Phenyl. Die Arylgruppe kann wahlweise mit einem oder mehreren Resten substituiert sein, die aus der Gruppe bestehend aus Hydroxyl, Amino, Alkylamino, Arylamino, Alkoxy, Aryloxy, Nitro, Cyano, Schwefelsäure, Sulfat, Phosphorsäure, Phosphat oder Phosphonat ausgewählt werden, entweder ungeschützt oder, wenn nötig, geschützt, wie es für den Fachmann bekannt ist, zum Beispiel wie in Greene et al. in "Protective Groups in Organic Synthesis", John Wiley and Sons, Second Edition, 1991, gelehrt wird.
  • Der Ausdruck Alkaryl oder Alkylaryl bezieht sich auf eine Alkylgruppe mit einem Arylsubstituenten.
  • Der Ausdruck Aralkyl oder Arylalkyl bezieht sich auf eine Arylgruppe mit einem Alkylsub stituenten,
  • Der Ausdruck Halogen, wie er hier verwendet wird, schließt Chlor, Brom, Iod und Fluor ein. Der Ausdruck Purin- oder Pyrimidinbase umfaßt, ist aber nicht beschränkt auf, Adenin, N&sup6;- Alkylpurine, N&sup6;-Acylpurine (wobei Acyl C(O)(Alkyl, Aryl, Alkylaryl oder Arylalkyl) ist, N&sup6;- Benzylpurin, N&sup6;-Halogenpurin, N&sup6;-Vinylpurin, N&sup6;-Acetylenpurin, N&sup6;-Acylpurin, N&sup6;- Hydroxyalkylpurin, N&sup6;-Thioalkylpurin, N²-Alkylpurine, N²-Alkyl-6-Thiopurine, Thymin, Cytosin, 6-Azapyrimidin, 2-und/oder 4-Thiopyrimidin, Uracil, C&sup5;-Alkylpyrimidine, C&sup5;- Benzylpyrimidine, C&sup5;-Halogenpyrimidine; C&sup5;-Vinylpyrimidin, C&sup5;-Acetylenpyrimidin, C&sup5;- Acylpyrimidin, C&sup5;-Hydroxyalkylpurin, C&sup5;-Amidopyrimidine, C&sup5;-Cyanopyrimidin, C&sup5;- Nitropyrimidin, C&sup5;-Aminopyrimidin, N²-Alkylpurine, N²-Alkyl-6-Thiopurine, 5- Azacytidinyl, 5-Azauracilyl, Triazolopyridinyl, Imidazolopyridinyl, Pyrrolopyrimidinyl, Pyrazolopyrimidinyl. Funktionelle Sauerstoff und Stickstoffgruppen der Base können, wenn nötig oder gewünscht, geschützt sein. Geeignete Schutzgruppen sind dem Fachmann bekannt und schließen Trimethylsilyl-, Dimethylhexylsilyl-, t-Butylmethylsilyl- und t- Butyldiphenylsilyl-, Trityl-, Alkylgruppen, Acylgruppen wie Acetyl und Propionyl, Methylsulfonyl und p-Toluylsulfonyl ein.
  • Der Ausdruck Heteroaryl oder Heteroatom, wie er hier verwendet wird, betrifft einen aromatischen Rest, der wenigstens einen Schwefel, Sauerstoff oder Stickstoff im aromatischen Ring einschließt. Nicht einschränkende Bespiele sind Furyl, Pyridyl, Pyrimidyl, Thienyl, Isothiazolyl, Imidazolyl, Tetrazolyl, Pyrazinyl, Benzofuranyl, Benzothiophenyl, Quinolyl, Isoquinolyl, Benzothienyl, Isobenzofuryl, Inolyl, Isoindolyl, Benzimidazolyl, Purinyl, Carbazolyl, Oxazolyl, Thiazolyl, Isothiazolyl, 1,2,4-Thiadiazolyl, Isooxazolyl, Pyrrolyl, Quinazolinyl, Pyridazinyl, Pyrazinyl, Cinnolinyl, Phthalazinyl, Quinoxalinyl, Xanthinyl, Hypoxanthinyl und Pteridinyl. Funktionelle Sauerstoff und Stickstoffgruppen können, wenn nötig oder gewünscht, geschützt werden. Geeignete Schutzgruppen sind dem Fachmann bekannt und schließen Trimethylsilyl-, Dimethylhexylsilyl-, t-Butylmethylsilyl- und t-Butyldiphenylsilyl-, Trityl-, Alkylgruppen, Acylgruppen wie Acetyl und Propionyl, Methylsulfonyl und p-Toluylsulfonyl ein.
  • Der Ausdruck Alkenyl, wie er hier verwendet wird, und wenn er nicht anders spezifiziert ist, bezieht sich auf geradkettige, verzweigte Kohlenwasserstoffe mit C&sub2; bis C&sub1;&sub0; mit wenigstens einer Doppelbindung.
  • Der Ausdruck Acyl bezieht sich auf den Teil der Formel -C(O)R', wobei R' Alkyl;
  • Alkoxyalkyl, einschließlich Methoxymethyl; Arylalkyl, einschließlich Benzyl; Aryloxyalkyl wie z. B. Phenoxymethyl; Aryl, einschließlich Phenyl wahlweise substituiert mit Halogen, C&sub1;- bis C&sub4;-Alkyl oder C&sub1;-bis C&sub4;-Alkoxy oder dem Rest einer Aminosäure ist.
  • Der Ausdruck enantiomerisch angereichert, wie er hier verwendet wird, bezieht sich auf eine Verbindung, die eine Mischung von Enantiomeren ist, bei der ein Enantiomer im Überschuss und vorzugsweise mit einem Gehalt von 95% oder mehr und noch bevorzugter 98% oder mehr in der Mischung vorhanden ist.
  • Der Ausdruck Oligonukleotid bezieht sich insbesondere auf ein Oligomer mit fünfundreißig oder weniger Nukleotiden, die über ihre 3'- und 5'-Hydroxylgruppen oder 2'- und 5'- Hydroxylgruppen miteinander verbunden sind.
  • Der Ausdruck Aminosäure schließt natürlich vorkommende und synthetische Aminosäuren ein und umfaßt, ist aber nicht beschränkt auf, Alanyl, Välinyl, Leucinyl, Isoleucinyl, Prolinyl, Phenylalaninyl, Tryptophanyl, Methionyl, Glycinyl, Serinyl, Threoninyl, Cysteinyl, Tyrosinyl, Asparaginyl, Glutaminyl, Aspartoyl, Glutaoyl, Lysinyl, Argininyl und Histidinyl.
  • Es sollte so verstanden werden, daß, wenn der Ausdruck (Carboran-1-yl)phosphat im Text verwendet wird, es so verstanden wird, daß -O-(Carboran-1-yl)alkyl]phosphat), S-(Carboran- 1-yl)alkyl]phoshorothioat oder Se-(Carboran-1-yl)alkyl]phosphorselenat anstelle dessen verwendet werden kann.
  • Eine neue Klasse modifzierter lipophiler Oligonukleotide, die einen Carboranylrest aufweisen, wird für die Verwendung bei BNCT, AOT und andere diagnostische Zwecke, einschließlich MRI und als Sonden, bereitgestellt. Die Oligonukleotide weisen einen oder mehrere Carboran-1-yl-Reste auf, die die konzentrierte und selektive Verabreichung von Bor gegenüber den Trägerzellen ermöglichen. Die Lipophilie der Bor-modifizierten Oligonukleotide kann durch eine geeignete Auswahl der Anzahl und des Ortes des Carboran- 1-yl-Restes in der Verbindung manipuliert werden. Im allgemeinen hat der Carboran-1-yl- Rest, der direkt an einem Phosphoratom gebunden ist oder durch einen geeigneten Spacer (z. B. Alkyl, Peptidyl) an Sauerstoff, Schwefel oder Selen gebunden ist einen signifikanteren Effekt auf die Lipophilie der Verbindung, als wenn die Carboranylgruppe an einem anderen Ort, z. B. an der Base gebunden ist, weil sie als ein Substituent für eine hydrophilie und ionisierbare Hydroxygruppe wirkt.
  • In einer Ausführungsform sind die Carboranyl enthaltenden Oligonukleotide spezifisch auf Krebszellen gerichtete, um die Überexpression von bestimmten Protoonkogenen zu inhibieren oder die Expression von Tumorsuppressorgenen, die gut mit klinischer Progression von Tumoren, einschließlich Gliomen, Melanomen und Brusttumoren korrelieren, zu optimieren.
    • A. Der Carboranyl-Anteil
  • Carborane (auch als Carbaborane bekannt) sind Verbindungen, die Kohlenstoffatome enthalten, die in ein polyedrisches Boran inkorporiert sind. Als eine Übersicht über die Carboran-Chemie siehe F. Cotton und G. Wilkinson in Advanced Inorganic Chemistry, 4. Auflage, John Wiley and Sons, 1980, Seiten 318 bis 320. Die CH-Gruppe ist isoelektronisch mit BH&supmin; und kann deshalb eine BH&supmin; Gruppe ersetzen. Polyedrische Carborane können deshalb betrachtet werden, förmlich als von BnHn-2-Ionen abgeleitet zu sein, mit dem Ersatz von zwei Kohlenstoffen führen sie zu Molekülen mit der allgemeinen Formel Bn-2C&sub2;Hn. Neutrale zwei Kohlenstoff-enthaltende Carborane haben die allgemeine Formel BnC&sub2;Hn+2, wobei n 3 bis 10 ist. Für die hier beschriebenen Zwecke, da alle diese Carborane in jeder isomeren Form verwendet werden können, sind Carborane, in denen n = 9 oder 10 ist, bevorzugt.
  • Wenn die zwei Kohlenstoffatome nahe beieinander im Kohlenstoffgerüst angeordnet sind, wird das Carboran als ein 1,2- oder ortho-Carboran (o-Carboran) bezeichnet. Zum Beispiel wird B&sub1;&sub0;C&sub2;H&sub1;&sub2; im allgemeinen als ein 1,2-Isomer hergestellt, das, wenn es erhitzt wird, sich zu einem 1,7-Isomer verändert.
  • Carborane können in einer Vielzahl von isomeren Formen vorhanden sein. "Closo"- Carborane sind geschlossene Käfigstrukturen, wohingegen "nido"-Carborane offene nestähnliche Strukturen sind. Beispiele sind anionische o-nido-7,8-C&sub2;B&sub9;H(11 oder 12) und neutrale o-closo-1,2-C&sub2;B&sub1;&sub0;H&sub1;&sub2;. Carborane kommen auch als eins von vier Arachno-Isomeren oder als Hypho-Iosmere vor. Sowohl die 1,2- als auch die 1,7-Dicarbadodecaborane und ihre C-substituierten Derivate werden durch Behandlung mit einer starken Base unter Verlust des Bors abgebaut und bilden isomere nido-Carboran-Anionen B9 C&sub2;H(11 oder 12). Beide isomeren B&sub9;C&sub2;H(11 oder 12)-Ionen werden durch die Behandlung mit wasserfreier Säure und anschließendem Erhitzen in die closo-Carborane B&sub9; C&sub2;H&sub1;&sub1; überführt.
  • Carbaborane werden typischerweise durch die Wechselwirkung von Boranen und Boranaddukten mit Acetylenen hergestellt. Die üblichsten Carborane sind B&sub1;&sub0;C&sub2;H&sub1;&sub2; und ihre kohlenstoffsubstituierten Derivate. Kohlenstoffsubstituierte Carborane können mit substituierten Acetylenen, wie es für den Fachmann bekannt ist, hergestellt werden oder zum Beispiel durch die Reaktion des Carborans mit einer starken Base, um ein Wasserstoff durch ein Lithium zu ersetzen, und anschließender Behandlung mit einem gewünschten elektrophilen Reagens. Acetylenderivate, die verwendet werden können, um substituierte Carborananteile herzustellen, sind zum Beispiel in Heying, T. L., et al. Inorganic Chemistry 2(6) 1089-1092, (1963) beschrieben.
  • Anionische Carborane können verabreicht werden als ein pharmazeutisch akzeptierbares Salz eines einwertigen oder mehrwertigen pharmazeutisch akzeptierbaren Kations, einschließlich, aber nicht einschränkend auf, Zink, Kalzium, Wismut, Barium, Magnesium, Aluminium, Kupfer, Kobalt, Nickel, Cadmium, Natrium, Kalium, Pyridinium, quaternäres Amin, Ammonium, protoniertes Ethylendiamin oder protonierte Aminosäuren, einschließlich aber nicht beschränkt auf protoniertes Lysin oder protoniertes Arginin.
    • B. Carboranyl Oligonukleotide Oligonukleotide mit einem Carboranyl-Anteil in der Base
  • Die vorliegende Erfindung stellt Oligonukleotide bereit, die einen Carboranyl-Anteil in der Baseneinheit eines der Nukleotide enthält. Die Carboranyl enthaltenden Basen sind in den Formeln V bis X dargestellt.
  • wobei: C eine Carboranylgruppe, wie z. B. B&sub1;&sub0;H&sub1;&sub0;C&sub2;R&sub4;, wobei R&sub4; -H, -OH, -CH&sub2;OH, - CH&sub2;X (bei dem X ein Halogen ist) oder - B&sub9;C&sub2; H(11 oder 12) (ein nido-Carboran- Anion; ist;
  • R&sup5; ist ein niedriges Alkyl;
  • G ist N oder CH,
  • M ist O oder S. und
  • z ist 0 bis 5.
  • Die Carboranyl-enthaltende Base kann in einem 3'- oder 5'-terminalen Nukleotid, in einem Nukleotid, das dem 3'- oder 5'- terminalen Nukleotid benachbart ist, oder in einem internen Nukleotid sein. Es wurde gefunden, daß Oligonukleotide, die Carboranyl-modifizierte Basen im 3'- oder 5'-terminalen Nukleotid oder in einem Nukleotid, das benachbart zu dem 3'- oder 5'-terminalen Nukleotid sind, aufweisen, effektiver mit der komplementären Nukleinsäuresequenz hybridisieren als Oligonukleotide, die die Carboranyl-enthaltende Basse in internen Nukleotiden aufweisen. Es wurde ebenfalls gefunden, daß Oligonukleotide, die die Carboranyl-modifizierten Basen im 3'-terminalen Nukleotid, in einem Nukleotid benachbart zum 3'-terminalen Nukleotid oder sowohl im 3'-terminalen als auch 5'-terminalen Nukleotid enthalten, restistenter gegenüber Abbau sind, als die, die in anderer Weise modifiziert sind.
  • Es sollte so verstanden werden, daß jede Nukleinsäuresequenz von Interesse durch die Addition eines Carboranyl-Anteils an die Baseneinheit im Oligomer modifiziert werden kann. Diese Erfindung ist nicht auf spezifische Nukleinsäuresequenzen gerichtet, soner ist eine allgemeine Technik.
    • Beispiel 1 DNA-Sequenz, die 5-(o-Carboran-1-yl)-2'-O-desoxyuridin enthält
  • Beispiele von modifizierten DNA-Sequenzen (bei denen X ein 5-(o-Carboran-1-yl)-2'-O- desoxyuridin ist, auch als CDU bezeichnet) sind ebenso wie Kontrollsequenzen unten aufgeführt. Diese Beispiele sind nur zur Veranschaulichung, und es ist nicht beabsichtigt, daß sie den Umfang der Erfindung einschränken. DNA-Sequenz
  • In einer alternativen Ausführungsform ist X eine Nukleosid, daß eine Base, wie in Abschnitt iv) dargestellt, enthält. In einer weiteren alternativen Ausführungsform stellt X ein nicht modifiziertes Nukleotid, wie beispielsweise Thymidin, Cytidin, Adenosin, Guanosin oder Uridin oder sein entsprechendes 2'-Desoxynukleotid dar, und die oben identifizierten Sequenzen sind statt dessen durch Substitution einer 3',5'-O,O-[(Carboran-1-yl- methyl)phosphonat]-Bindung für eine Phosphodiesterbindung (vorzugsweise bei oder nahe beim 3'-Terminus) mit oder ohne Basen-Carboranyl-Modifikation modifiziert.
  • ii) Oligonukleotide mit sowohl einer 3',5'-O,O-[(Carboran-1-yl-methyl)phosphonat]- Internukleotidbindung als auch einer Carboranyl enthaltenden Base
  • In einer weiteren Ausführungsform werden Oligonukleotide bereitgestellt, die sowohl eine 3',5'-O,O-[(Carboran-1-yl-methyl)phosphonat]-Internukleotidbindung als auch eine Carboranyl-enthaltende Base enthalten. Die Carboranyl-enthaltende Base kann an demselben oder einem anderen Nukleotid sein, als die, die über eine 3',5'-O,O-[(Carboran-1-yl- methyl)phosphonat]-Brücke gebunden ist.
    • B. Stererochemie und Enantiomere
  • Die Stereochemie der hier dargestellten Oligonukleotide wird durch die Konfiguration der Nukleoside und der Konfiguration des chiralen (Carboran-1-yl-)methyl)phosphonatanteils, wenn er in der Verbindung vorhanden ist, beeinflußt.
    • Stereochemie der Nukleoside
  • In einer Ausführungsform umfassen die Oligonukleotide der vorliegenden Erfindung natürlich vorkommende Nukleoside, vorzugsweise Adenosin, Guanosin, Cytidin, Thymidin und Uridin, die durch die Hinzufügung von 3',5'-O,O-[(Carboran-1-yl-methyl)phosphonat]- Bindung oder durch die Hinzufügung eines Carboranylanteils an eine oder mehrere Baseneinheiten modifiziert wurden. Die natürlich vorkommenden Nukleoside haben eine stereochemische Konfiguration, die durch die Natur vorgegeben ist. Wenn jedoch ein nicht- natürlich vorkommendes Nukleosid in einem Oligonukleotid oder allein verwendet wird, werden die stereochemischen Punkte relevant. Weil die 1'- und 4'-Kohlenstoffatome des Zuckers oder des modifizierten Zuckerrestes (im weiteren allgemein als Zuckerrest bezeichnet) der synthetischen Nukleoside chiral sind, können ihre Nicht-Wasserstoff- Substituenten (CH&sub2;OR&sub2;) und die Pyrimidin- beziehungsweise Purinbasen) entweder cis (auf der gleichen Seite) oder trans (auf der gegenüberliegenden Seite) im Hinblick auf das Zuckerringsystem sein. Die vier optischen Isomere werden deshalb durch die folgenden Konfigurationen dargestellt (wenn der Zuckerrest in der horizontalen Ebene orientiert ist, so daß der "primäre" Sauerstoff (der zwischen den C1'- und C4'-Atomen) im Hintergrund ist): cis (mit beiden Gruppen "oben", dies entspricht der Konfiguration der natürlich vorkommenden Nukleoside), cis (mit beiden Gruppen "unten", was eine nicht atürlich vorkommende Konfiguration ist), trans (mit dem C1'-Substituenten "oben" und dem C4'- Substituenten "unten") und trans (mit dem C1'-Substituenten "unten" und dem C4'- Substituenten "oben"). Im allgemeinen sind "D-Nukleoside" cis-Nucleoside in einer natürlichen Konfiguration und die "L-Nukleoside" sind cis-Nukleoside in der nicht natürlich vorkommenden Konfiguration.
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung können synthetische Oligonukleotide in jeder dieser Konfigurationen verwendet werden. Es ist bekannt, daß bestimmte synthetische Nukleoside aktiver und weniger toxisch oder beides in einer Konfiguration als anderen Konfigurationen sein können. Der Fachmann, dem diese Offenbarung gegeben wird, kann einfach die optimale stereochemische Konfiguration für ein spezifisches synthetisches Nukleosid für eine gewünschte Anwendung bestimmen. Alternativ können die Nukleoside als eine racemische Mischung oder in der Form einer enantiomerisch angereicherten Form verwendet werden.
  • Enzymatische Verfahren für die Trennung von D- und L-Enantiomeren von cis-Nukleosiden sind beispielsweise in Nucleosides and Nucleotides, 12(2), 225-236 (1993); Europäischen Patentanmeldungen Nr. 92 304 551.2 und 92 304 552.0 eingereicht von Biochem Pharma, Inc.; und PCT-Veröffentlichungen Nr. WO 91/11186, WO 92/14729 und WO 92/14743 eingereicht von Emory University offenbart.
  • Die Trennung der acylierten oder alkylierten racemischen Mischung von D- und L- Enantiomeren von cis-Nukleosiden kann auch durch Hochdruck-Flüssigkeits- Chromatographie mit einer chiralen stationären Phase durchgeführt werden, wie es in der PCR-Veröffentlichung Nr. WO 92/14729 offenbart ist.
  • α- und β-L-Nukleoside können gemäß den Verfahren, wie sie offenbart sind, in oder durch Standardmodifikationen, wie sie offenbart sind in zum Beispiel den folgenden Publikationen:Jeong; et al. J. ofMed. Chem 36, 182-195,1993; Europäische Patentanmeldung Nr. 0 285 884; Génu-Dellac, C., G. Gosselin, A. -M. Aubertin, G. Obert, A. Kirn und J.-L. Imbach, 3-substituierte Thymin α-L-Nukleosid-Derivate als potentielle antivirale Mittel; Synthese und biologische Auswertung, Antiviral Chem. Chemother., 2: 83- 92 (1991); Johansson, K. N. G., B. G. Lindborg und R. Nöreen, Europäische Patentanmeldung Nr. 0 352 248; Mansuri, M. M, V. Farina, J. E. Starren, D.A. Benigni, V. Brankovan und J. C. Martin, Herstellung der geometrischen Isomere von DDC, DDA, D4C und D4T als potentielle Anti-HIV-Mittel, Bioor. Med. Chem. Lett.; 1: 65-68 (1991); Fujimori, S., N. Iwanami, Y. Hashimoto und K. Shudo, Eine geeignete und stereoselektive Synthese von 2'- Desoxy-β-L-ribonukleosid, Nucleösides & Nucleotides 11: 34I-349 (1992); Génu-Dellac; C., G. Gosselin, A.-M. Aubertin, G. Obert, A. Kirn und J.-L. Irnbach, 3-substituierte Thymin α- L-Nukleosid-Derivate als potentielle antivirale Mittel; Synthese und biologische Auswertung, Antiviral Chem. Chemother., 2: 83-92 (1991); Holy, A., Synthese von 2'-Desoxy-L-uridin, Tetrahedron Lett. 2: 189-192 (1972); Holy, A., Nukleinsäurekomponenten und ihre Analoge. CLIII. Herstellung von 2'-Desoxy-L-ribonukleosiden der Pyrimidinreihe. Collect Czech Chem Commun. 37: 4072-4087 (1992); Holy, A., 2'-Desoxy-L-uridin: Vollständige Synthese eines Uracil-2'-desoxynukleosids aus einem Zucker-2-aminooxalin aus einem 2,2'- wassserfreien Anhydronukleosid Zwischenprodukt, in: Townsend LB, Tipson R5, ed. Nuleic Acid Chem., New York: Wiley, 347-353. Vol 1) (1992); Okabe, M., R.-C. Sun, S. Tan, L. Todaro und D. L. Coffen, Synthese der Didesoxynukleoside ddC und CNT aus Glutaminsäure; Ribonolacton und Pyrimidinbasen, J. Ort. Chem. 53: 4780-4786 (1988); Robins, M. J., T. A. Khwja und R. K. Robins, Purin-Nukleoside. XXIX. Synthese von 2'- Desoxy-L-adenosin und 2'-Desoxy-L-guanosin und ihre alpha-Anomere. J. Ort. Chem. 35: 363-639 (1992); Génu-Dellac, C., G. Gosselin, A.-M. Aubertin, G. Obert; A.Kirn und J.-L. Imbach, 3-substituierte Thymin α-L-Nukleosid-Derivate als potentielle antivirale Mittel; Synthese und biologische Auswertung. Antiviral Chem. Chemother., 2(2): 83-92 (1991); Génu-Dellac, C., Gosselin, G. und Imbach, J.-L.; 3-substituierte Thymin α-L-Nukleosid- Derivate als potentielle antivirale Mittel; Synthese und biologische Auswertung, Antiviral Chem. Chemother., 2: 83-92 (1991); Génu-Dellac, C., Gosselin, G., imbach, J.-L., Synthese von neuen 2'-Desoxy-3-substituierte-α-L-threo-pentofuranonukleoside des Thymins als potentielle antivirale Mittel; Tet. Lett 32(1): 79-82 (1991); Génu-Dellac, C., Gosselin, G., Imbach, J.-L., Herstellung neuer acetylierter Derivate von L-Arabinofuranose und 2-Desoxy- L-erythro-pentofuranose als Vorläufer für die Synthese von L-Pentofuranosyl-Nukleosiden. 216: 240-255 (1991); und Génu-Dellac, C., Gosselin, G., Puech, F. et al. Systematische Synthese und antivirale Auswertung von α-L-Arabinofuranosyl- und 2'-Desoxy-α-L-erythropentofuranosylnukleoside der fünf natürlich vorkommenden Nukleinsäurebasen 10 (b): 1345- 1376 (1991).
  • β-D-Nukleoside und racemische Mischungen synthetischer Nukleoside können hergestellt werden wie beschrieben wird in oder durch routinemäßige Modifikationen oder Erweiterungen von Präparationen wie sie in einer Vielzahl von Literaturverweisen beschrieben werden, einschließlich aber nicht beschränkend auf, US. Patent Nr. 4,916,122 von Chu et al., Europäische Patentanmeldung Nr. 0 217 580; PCT-Anmeldung Nr. WO 92/10497; Chu, C. K. et al., "Ein allgemeines Syntheseverfahren für 2',3'- Didesoxynukleoside: Eine vollständige synthetische Methode", Nucleosides & Nucleotides 8: 5&6, 903-906 (1989); Chu, C. K., et al. "Enantiomere Synthese von (+)-BHC-189 und (+)-1- β-D-5-(1,3-Oxothiolanyl)cytosin aus D-Mannose und ihre Anti-HIV-Aktivität", J. Org. Chem. (1991); Chu, C. K., et al. "Strukturaktivitätsbeziehungen von Pyrimidinukleosiden als antivirale Mittel für das humane Immundefektvirus Typ 1 in peripheren mononukleären Blutzellen", J. Med. Chem. 32: 612 (1989); Huryn, D. M., et al., "Synthese von iso-DDA, einem Mitglied einer neuen Klasse von Anti-HIV Mitteln", Tetrahedron Lett. 30: 6259-6262, (1989); Kreitsky, T. A., "3'-Amino-2',3'-Didesoxyribonukleoside einiger Pyrimidine: Synthese und biologische Aktivitäten", J. Med. Chem. 26: 891-895 (1983); Lin, T., et al., "Synthese und biologische Aktivität von verschiedenen 3'-Azido- und 3'-Amino-Analogen von 5-substituierten Pyrimidin-Desoxyribonukleosiden", J. Med. Chem. 26: 1691-1696 (1983); Mansuri, M. M, et al., "Herstellung der geometrischen Isomere von DDC, DDA, D4C und D4T als potentielle Anti-HIV-Mittel", Bioor. Med. Chem. Lett" 1: 65-68 (1991); Okabe, M., et al., "Synthese der Didesoxynukleoside ddC und CNT aus Glutaminsäure, Ribonolacton und Pyrimidinbasen", J. Org. Chem. 53: 4780-4786 (1988); Peterson, M. L., et al., "Synthese und biologische Auswertung von 4-Purinylpyrtolidin-Nukleosiden", J. Med. Chem. 34: 2787-2797 (1991); Sterzycki, R. Z.; et al., "Synthese und Anti-HIV-Aktivität von einigen 2'-Fluor-enthaltenden Pyrimidin-Nukleosiden", J. Med. Chem. 33: 2150-2157 (1990); Wilson, L. J., et al., "Ein allgemeines Verfahren zur Kontrolle der Glykosylierungsstereochemie bei der Synthese von 2'-Desoxyribösenukleosiden", Tetrahedron Lett. 1815, (1990); und Wilson, L. J., et al., "Die Synthese und Anti-HIV- Aktivität von Pyrimidindioxolanylnukleosiden", Bioorg. Med. Chem. Lett. 3: 2 169-174 (1993).
    • Stereochemie des Phosphoratoms
  • Das Ersetzen eines der anionischen prochiralen Sauerstoffatome des Phosphors mit einem (Carboran-1-yl)methyl-Rest erzeugt ein Chiralitätszentrum am Phosphoratom und bei den Oligonukleotiden, die diesen Rest aufweisen. Infolge dieser Modifikation und der Nichtstereroselektivität der hier beschriebenen Kupplungsreaktion wird das (Carboran-1- yl)methylphosphonat typischerweise als eine Mischung aus Diastereomeren erhalten.
  • Ein Verfahren zur stereokontrollierten Synthese von P-chiralen Oligonukleotidanalogen siehe Lesnikowski, Bioorg. Chem., 1993, 21 127-155. Kurz gesagt, P-stereodefinierte, P-chirale Oligonukleotide können unter Verwendung der folgenden Verfahren hergestellt werden.
  • (i) Enzymatische Verfahren. Diese Anwendung ist nützlich für die stereokontrollierte Synthese von Phosphorothioat- und Methylphosphonat-Oligonukleotid-Analoge.
  • (ii) Trennung der diastereomeren Oligonukleotide. Dieses Verfahren ist das gebräuchlichste für Oligonukleotide, die bis zu drei P-chirale Internukleotid-Bindungen (acht Diastereomere) aufweisen.
  • (iii) Blocksynthese: Ein Dinukleotid wird zuerst als eine Mischung von Diastereomeren hergestellt. In einem zweiten Schritt wird die Mischung in individuelle diastereomere Spezies getrennt. Die diastereoisomeren Dinukleotide werden als nächstes phosphoryliert oder phosphityliert und als Synthone für die Synthese von längeren Oligonukleotiden verwendet. Dieses Verfahren liefert eine Methode für die Synthese von Oligonukleotiden mit stereodefinierten synthetischen Internukleotidverbindungen, die durch natürliche oder modifizierte, aber nicht stereodefinierte Internukleotidverbindungen getrennt werden.
  • (iv) Stereospezifische Bildung der Internukleotidbindung: Diastereomerisch reine Monomere werden als erste synthetisiert. Bei Verwendung diastereomerisch reiner Monomere und einer stereospezifischen Kupplungsreaktion können P-stereoreguläre Oligomere hergestellt werden.
  • (v) Stereospezifische Modifikation der Internukleotidbindung. Der Einfluß der absoluten Konfiguration des Phosphors der P-chiralen Antisense-Oligonukleotide auf ihre physiochemischen und biochemischen Eigenschaften wurde untersucht. Die absolute Konfiguration des Phosphoratoms beeinflußt, unter anderem, Löslichkeit, Transportfähigkeit durch zelluläre Membranen, Affinität gegenüber komplementären Sequenzen von Zielnukleinsäuren (Schmelztemperatur) und Widerstandsfähigkeit gegenüber nukleolytischen Enzymen (Uhlmann, et al., Chem. Rev. 1990, 90, 544-584).
    • II. Verfahren zur Herstellung von Carboranyl-enthaltende Oligonukleotiden A. Herstellung von Oligonukleotiden, die Carboranyl-enthaltende Baseneinheiten aufweisen
  • Wie im Kapitel zum Hintergrund der Erfindung beschrieben, wurde kürzlich über Nukleoside berichtet, die einen Carboranyl-Rest in der Baseneinheit aufweisen. Es wird jedoch angenommen, daß dies die erste Offenbarung von Oligonukleotiden ist, die ein oder mehrere Nukleoside mit einem Carboranyl-Rest in ausgewählten Baseneinheiten einschließen. Es wurde überraschenderweise gefunden, daß es bevorzugt ist, daß die Base die das Carboranyl enthält, am 3'- oder 5'-Terminus oder in der Nähe der 3'- oder 5'-terminalen Nukleoside oder in einigen Kombinationen davon lokalisiert ist, wohingegen brauchbare Oligonukleotide hergestellt werden können, die die Carboranyl-enthaltende Base in jedem Nukleosid enthalten.
  • Verfahren zur automatisierten Herstellung von Oligonukleotiden sind unten beschrieben. Mit der hier gemachten Offenbarung wird der Fachmann wissen, wie eine große Anzahl von Oligonukleotiden mit Carboranyl enthaltenden Baseneinheiten für verschiedene Anwendungsbereiche hergestellt werden können, von denen alle in den Umfang dieser Erfindung fallen. Oligonukleotide, die ein oder mehrere Carboranyl-enthaltende Basen enthalten, können auch unter Verwendung von Techniken zur Lösung dieses Problems hergestellt werden, die dem Fachmann bekannt sind.
  • Beispiel 2 stellt eine detaillierte Beschreibung zur Herstellung eines Oligonukleotides dar, das zwölf Thyminreste enthält, wobei eine oder mehrere Thymidinbasen den Carboranylrest in der 5-Position aufweisen. Beispiel 3 zeigt die detaillierte physikalische Charakterisierung der in Beispiel 2 hergestellten Oligonukleotide. Diese Beispiele sind hauptsächlich zur Veranschaulichung und es ist nicht beabsichtigt, den Umfang der Erfindung einzuschränken.
    • Beispiel 2 Herstellung von Dodecathymidylat-enthaltende 5-(o-Carborany-1-yl)-2'-O- desoxyuridin
  • 5'-O-Dimethoxytritylthymidin 3'-(N,N-diisopropyl-2-cyanoethyl)phophoramidit wurde von Chem-Impex International (Wood Dale, IL, Lot.Nr. 105198) erworben. Thymidin-beladene Säulen 1 uM CPG (500 Å Porengröße) wurden von Applied Biosystems (Foster City, CA) käuflich erworben.
    • 5-(o-Carboran-1-yl)2'-O-desoxyuridin (CDU)(13, siehe Fig. 2).
  • 5-(o-Carboran-1-yl)-2'-O-desoxyuridin (CDU) (Verbindung 13, siehe Fig. 2) wurde aus 5- Iodo-2'-O-desoxyuridin in einem fünfschrittigen Verfahren, wie detailliert von Yamamoto, Y., Seko, T., Rong, F. G., Nemoto, H., Tetrahedron Lett., 1989, 30, 7191-7194 beschrieben, hergestellt.
    • 5-(o-Cabroran-1-yl)-5'-O-dimethoxytrityl-2'-O-desoxyuridin (14).
  • Nach drei Stunden gemeinsamen Verdampfen mit wasserfreiem Pyridin wurde CDU (400 mg, 1,08 mmol) in wasserfreiem Pyridin (10 ml) unter Argonatmosphäre gelöst. Zu der gerührten Lösung wurden 4,4'-Dimethoxytritylchlorid (457 mg, 1,35 mmol, 1,25 eq.) hinzugefügt. Nach sechstündigem Rühren bei Raumtemperatur unter Argon wurde die Reaktion mit 1 ml Methanol rasch abgekühlt, anschließend mit CH&sub2;Cl&sub2; (30 ml) verdünnt. Die Mischung wurde mit einer gesättigten Lösung NaHCO&sub3; (25 ml) und dann mit Wasser (2 · 25 ml) gewaschen. Die organische Schicht wurde extrahiert, über Na&sub2;SO&sub4; getrocknet, filtriert und dann unter reduziertem Vakuum abgedampft und mit Toluol verdampft. Der restliche Schaum wurde in CH&sub2;Cl&sub2; gelöst und dann einer Kieselsäuregelsäule zugeführt. Als Elutionsmittel wurde ein Gradient von 0% bis 5% CH&sub3;OH in CH&sub2;Cl&sub2; verwendet. Die Fraktionen, die das gewünschte Produkt enthielten, wurden vereinigt, das Lösungsmittel unter Vakuum abgedampft und dann der Rest mit n-Hexan ausgefällt, um 5'-O-Dimethoxytrityl-CDU als ein weißes Pulver (487 mg, 68% Ausbeute) zu erhalten. ¹H NMR (CDCl&sub3;) δ 7,81 (s, 1H, NH); 7,51-7,319 (m, 10 H, H-6 und 9H-aromatisch); 6,96 (m, 4H, H in α von OCH&sub3;); 6,23 (t, 1 H, H-1'); 5,78 (bs, 1H, H-Carboranyl), 4,50 (m, 1H, H-3'); 4,21 (m, 1H, H-4'); 3,90 (s, 6H, 2xOCH&sub3;); 3,60 (in, 1H, H-5'(H-5")); 3,35 (dd, 1H, H-5" (11-5')); 3,12 (d, 1H exch, OH-3'); 3,2-1,2 (bm, 10 H, H von B&sub1;&sub0;H&sub1;&sub0;); 2,61 (m, 1H, H-2' (H-2")); 2,15 (m, 1H, H-2"(H-2')).
    • 5-(O-Carboran-l-yl)-5'-O-dimethoxytrityl-2'-O-desoxyuridin-3'-[N,N-diisoproyl--β- cyanoethylphophoramidit (15, siehe Fig. 2).
  • Verbindung 14 (200 mg, 0,297 mmol) wurde intisch destilliertem wasserfreien CH&sub2;Cl&sub2; (1,2 ml) gelöst. Nach dem Rühren unter einer Argonatmosphäre für 5 Minuten wurde tropfenweise Diisopropylethylamin (DIEA, 207 ul, 1,19 mmol, 4 eq.) unter Argon zugegeben, dann folgte die Zugabe des Phophitylierungsmittels 2-Cyanoethyl-N,Ndiisopropylaminochlorphosphin (100 ul, 0,445 mmol, 1,5 eq.). Die Reaktion wurde mittels TLC unter Verwendung von n-Hexan-EtOCa-NEt&sub3;; 50 : 49 : 1 beobachtet. Nach Rühren über 1 Stunde unter Argon bei Raumtemperatur wurde das Phosphitylierungsmittel im Überschuss zugegeben (20 ul, 0,089 mmol) und die Reaktion für 30 Minuten weitergeführt. Die Mischung wurde mit Ethylacetat, das frisch über Al&sub2;O&sub3; gegeben war (10 ml) verdünnt und in eine Salzlösung geschüttet. Die organische Schicht wurde dann zwei und mehr Mal mit Salzlösung (2 · 6 ml) gewaschen und über Na&sub2;SO&sub4; getrocknet, filtriert und dann bis zur Trockenheit unter Vakuum abgedampft. Das verbleibende Öl wurden dann unter hohem Vakuum getrocknet, um überschüssiges Diisopropylethylamin zu entfernen, wobei ein weißer Schaum erhalten wurde. Die Reinigung des Rohmaterials wurde mit einer Kieselsäuregelchromatographie unter Verwendung von n-Hexan-EtOAc-NEt&sub3; als Elutionsmittel im Verhältnis von 90 : 9 : 1 bis 20 : 79 : 1 durchgeführt. Geeignete Fraktionen, die 3'-Phosphoramidit-CDU als eine Diastereomermischung enthielten, wurden vereinigt und unter Vakuum abgedampft. Die gewünschte Verbindung 15 wurden dann in gekühltem n- Hexan bei -20ºC gefällt und das Pellet unter Hochvakuum für 20 Stunden getrocknet (217,7 mg, 84% Ausbeute). ³¹P NMR (CDCl&sub3;) δ 149,90 und 149,61 ppm. ¹H NMR (CDCl&sub3;) δ 7,99 (s, 1H, NH); 7,74-7,17 (m, 10 H, H-6 und 9H-aromatisch); 6,81 (m, 4H, H in α von OCH&sub3;); 6,11 (m, 1H, H-1'); 5,65 (bs, 1H, H-Carboranyl), 4,48 (m, 1H, H-3'); 4,22 (m, 1H, H-4'); 4,13 (m, 1H, H-5' (H-5")), 3,77 (2s, 6H, 2 OCH&sub3;); 3,74-3,19 (m, 5H, H-5', H-2' und H-2", 2xH von NCH(CH&sub3;)&sub2;); 2,72 (t, 1H von POCH&sub2;CH&sub2;CN), 2,58 (t, 2H, H von POCH&sub2;CH&sub2;CN); 2,42 (t, 1H, H von POCH&sub2;CH&sub2;CN); 3,2 - 1 (bm, 10 H, H von B&sub1;&sub0;H&sub1;&sub0;); 1,2 (sev d, 12H, H von NCH(CH&sub3;)&sub2;).
    • Automatische Synthese von CDU enthaltendem Dodecathymidylat (19-24) und nicht- modifiziertem d(T)&sub1;&sub2;(18) und (A)&sub1;&sub2; (19).
  • Dodecathymidylsäureanaloge, die einen oder zwei 5-(o-Carboran-1-yl)uracil-Reste am ersten (Verbindung 19), zweiten (Verbindung 20), siebten (Verbindung 21), elften (Verbindung 22) und sowohl zehnten als auch elften (Verbindung 23) und ersten als auch elften (Verbindung 24) Ort des Zwölfmers 18 (siehe Tabelle 1) aufweisen, wurden durch eine automatische Festphasensynthese unter Verwendung eines Standard-β-Cyanozyklus erhalten (siehe, zum Beispiel Applied Biosystems Benutzerbulletin Nr. 43, 1987, Applied Biosystems, Foster City, Kalifornien, dargestellt in Fig. 4). Säulen, die mit kontrolliertem Porenglas gefüllt waren, das mit 5'-O-Dimethoxytritylthymidin (1 uM) funktionalirsiert war, wurden verwendet. Alle 5'-Dimethoxytrityl-3'-phosphoramidit-Derivate wurden als eine 0,09 M Lösung in wasserfreiem CH&sub3;CN hergestellt. Die Verlängerun der Oligonukleotide wurde unter Verwendung von Standard-β-Cyanoethyl 1 uM DNA Synthesezyklus ohne irgendeine Veränderung in der Kondensationszeit durchgeführt. Nach der automatischen Entfernung der 5'-Dimethoxytritytgruppe wurden die Oligonukleotide von dem Träger durch Inkubation in konzentriertem Ammoniak bei Raumtemperatur für 1 Stunde getrennt. Die ungeschützten Oligonukleotide wurden durch HPLC gereinigt und für ausgewählte Fälle in die nido-[nido- 7,8-C&sub2;B&sub9;H(11 oder 12) und closo-Formen [closo-1,2-C&sub2;B&sub1;&sub0;H&sub1;&sub0;] getrennt (siehe Fig. 4 und Tabelle 1). Kane, R. R., Pak, R H., Hawthorne, M. F., J. Org. Chem., 1993, 58, 991-992.
  • Die Ausbeute für die Gesamtsynthese von CDU-enthaltenden (Verbindungen 19-24) war vergleichbar mit nicht-modifiziertem (dT)&sub1;&sub2; (Verbindung 18) nach dem Freisetzendes Trityls. Es erscheint deshalb, daß die Anwesenheit einer großen Menge von Carboranyl- Substituenten in der 5-Position des Uracils nicht die Effizienz der Kupplungsreaktion beeinflußt. Tabelle 1
  • a closo/nido-Oligomere wurden mittels HPLC isoliert und getrennt in den Tm-Versuchen verwendet; b closo/nido-Oligomere wurden mittels HPLC nachgewiesen, aber als eine Mischung in den Tm-Versuchen verwendet. HPLC-Bedingungen: Puffer A: 0,05 M Triethylammoniumacetat (TEAA) (pH = 7,0), Puffer B: CH&sub3;CN/H&sub2;O (50/50) enthaltend 0,05 M TEAA; c 25 Min von 21% B zu 23% B; d 25 Min von 26% B zu 40% B, 5 Min von 60% B und 5 Min mit 60% B; e 20 Min von 30% B zu 55% B; f 25 Min von 26% B zu 40% B; g 25 Min von 30% B zu 40% B, h 25 Min von 30% B bis 60% B und 5 Min mit 60% B. Tm in PIPES-Puffer mit 120 mM NACl; lineare graphische Auswertungen von Tm gegen log (Natrium-Ionen-Aktivität) ergab Steigungen von 15 ± 1ºC. i d(A)&sub1;&sub2; wurde als komplementärer Strang für die Duplexbildung verwendet; j Polyriboadenylsäure wurde als Target verwendet.
    • Beispiel 3 Charaktisierung von Dodecathymidylat-enthaltendes 5-(o-Carboran-1-yl)-2'-O- desoxyuridin Experimentelles Verfahren
  • Phosphodiesterase I (EC 3.1. 4.1) Typ VIII aus Crotalus durissus terrzficus Gift (lot 119F0370 wurde von Sigma (St. Louis, MO) bezogen. Polyacrylamid wurde von International Biotechnologies Inc. (New Haven, CT) erhalten. Bispolyacrylamid und Harnstoff wurden von Fischer Scientifc (Fair Lawn, N. J.) gekauft. Die thermalen Schmelzkurven für die Oligomere wurden mit einem Varion Cary 4 Spektrophotorneter, der mit einem Dell Mikrocomputer verbunden war, bestimmt. LSIMS Massenspektren wurden mit einem Finnigan MAT 95 mit Cs&spplus; Elektronenverfahren bei 13 KeV (Glycerin-Matrix) oder mit VG 70-S Spektrometer aufgezeichnet. CD Spektren wurden mit Jasco, J-600 Spektralpolarimeter, der mit einem IBM-Computer verbunden war, aufgezeichnet. Polyacrylamidgelelektrophorese wurde unter Verwendung eines BRL-Gerätes (Gaithersburg, MD) durchgeführt.
  • HPLC-Analysen von Carboranyl-modifizierten Dodecathymidylat (19-24) wurden auf einem Hewlett-Packard 1050 System mit einer Whatman-Partisphere C&sub1;&sub8; 5 um, 4,7 · 235 Säule durchgeführt. Alle Analysen wurden bei Raumtemperatur gemacht. Im allgemeinen wurde ein Gradient aus CH&sub3;CN von 0% bis 50% in 0,05 M Triethylammoniumacetatpuffer (TESA) pH 7,0 als Elutionsmittel mit einer Flußgeschwindigkeit von 1,0 ml/min verwendet. Die Retentionszeitwerte (Rt) und die Bedingungen, die für die einzelnen Oligonukleotide verwendet wurden, sind in Tabelle 1 gezeigt.
    • Polyacrylamidgelelektrophorese (PAGE).
  • Markierte oder nicht markierte Proben von modifizierten Oligonukleotiden (19-24) und Dodeca(thymidinphosphat) (18), die wie oben beschrieben hergestellt wurden, wurden durch Elektrophorese unter Verwendung eines 20%igen denaturierenden Polyacrylamidgels, das 7 M Harnstoff enthielt, über 45 Minuten bei 50 mA getrennt. Die Proben wurden mit einer Standardautoradiographie eines X-Omat AR-Films (Eastman Kodak, Rochester, NY) oder im Fall von nicht markierten Oligonukleotiden durch UV-Schattierung sichtbar gemacht.
    • Radioaktive Markierung von Dodeca(thymidinphosphaten)-enthaltenden CDU (19-24).
  • Modifizierte Oligonukleotide 19-24 und unmodifiziertes Dodeca(thymidinphosphat) (18) (jeweils 20 pMol) wurden bei 37ºC in der Anwesenheit von 0,5 ul T4-Polynukleotidkinase und 10 uCi [³²P-γ] ATP (5000 Ci/mMol) in einem 70 mM Tris-HCl Puffer (pH 7,6) enthaltend 10 mM MgCl&sub2; und 5 mM Dithiothreitol inkubiert. Das Endvolumen der Reaktionsmischung war 10 ul. Nach 30 Minuten wurde die Reaktionsmischung auf 92ºC für 2 Minuten erhitzt, um das Enzym zu inaktivieren. Danach wurde 10 · Auftragsfarbstoff (0,5 % Bromphenolblau, 0,5% Xylolcyanol FF, 30% Glycerin in Wasser (5 ul) zu der Reaktionsmischung hinzugegeben und 5 ul Aliquots mit PAGE analysiert.
  • Schmelztemperatur (Tm) Messungen. Die Proben wurden für die Tm Messungen hergestellt durch die Zugabe konzentrierter Stammlösungen d(T)&sub1;&sub2; (18) oder CDU-modifiziertem d(T)&sub1;&sub2; (19-24) und d(A)&sub1;&sub2;-Stammlösung zu 1 ml 10 mM 1,4-Piperazin-bis-(ethansulfonsäure) (PIPES) Puffer (pH 7,0) enthaltend 100 mM NaCl in solchen Mengen, um ein 1 : 1 Verhältnis zu erhalten. Jeder Strang war in einer Menge von 40 uM vorhanden. Die molaren Extinktionskoeffizienten 60 (pro Base) wurden wie folgt bestimmt: 18: 8,150; d(A)&sub1;&sub2;: 12,280; 19-24: 8,200. Die Proben wurden auf 85ºC erhitzt und langsam auf Raumtemperatur vor dem Schmelzen abgekühlt. Die isolierten Zellkompartimente des UV-Spektrometers wurden kontinuierlich von 0ºC bis 85ºC mit einer Geschwindigkeit von 0,5 ºC pro Minute erwärmt. Die Proben wurden in Quarzküvetten, auf die ein Teflonverschluß (1 cm Weglänge) montiert war, erhitzt. Die Absorptionsänderung bei 260 nm wurde als eine Funktion der Temperatur verfolgt und die Tm-Werte von der ersten Darstellung der Werte erhalten, nachdem die Daten auf eine Macintosh Computer zur Sichtbarmachung und Analyse übertragen wurden.
  • Messungen des Zirkulärne Dichroismus (CD). CD-Spektren wurden bei 10ºC in einer doppelwandigen Zelle, die mit Stickstoffgas gespült wurde, um Kondensation zu verhindern, aufgenommen. Die Proben wurden durch Zugabe von konzentrierter Stammlösung der Oligomere 19-24 zu 2,7 ml eines 3,75 mM Phosphatpuffers (pH 7,0), der 0,5 mM EDTA und 100 mM NaCl enthielt, präpariert. In Küvetten, die natürliches oder modifziertes d(T)&sub1;&sub2; 19- 24 enthielten, wurde d(A)&sub1;&sub2;-Lösung in einer geeigneten Menge gegeben, um ein Verhältnis von 1 : 1 zu erhalten. Zur Duplex-Bildung wurden die Proben auf 85ºC erhitzt und langsam auf Raumtemperatur abgekühlt. CD-Spektren wurden von 320 bis 200 nm für Einzelstränge und Duplexe erhalten.
  • Molekülmodell. Molekulare mechanische Methoden mit dem AMBER Ganzatomkraftfeld und -gleichungen wurden verwendet, um die vergleichenden Effekte der Carborankäfige auf die Stabilität der DNA zu untersuchen, die an verschiedenen Sequenzpositionen verändert wurde. Das Carboran wurde als ein fixiertes Strukturaggregat behandelt. Der Effekt der Carboranyl- enthaltenden Baseneinheit auf die lokale DNA-Konformation wurde bestimmt.
  • Widerstandsfähigkeit von Dodeca(thymidinphophaten) enthaltenden-CDU (19-24) gegenüber Phosphodiesterase I (EC 3.1.4.1): Zu 100 mM TRIS-HCl Puffer, pH 8,9 (90 ul), enthaltend 20 mMMgCl&sub2;, 0,1 A&sub2;&sub6;&sub0; CDU des Oligonukleotids 19-24 (5 ul) wurden 1,5 · 10-3 Einheiten (5ul) Phosphodiesterase gegeben. Eine Leerprobe ohne Enzym und eine Kontrollreaktion mit d(T)&sub1;&sub2; wurden gleichzeitig untersucht. Die Reaktionen wurden bei 37ºC für 10 Minuten durchgeführt und dann 50 ul Aliquots mittels HPLC unter den oben beschriebenen Bedingungen analysiert.
    • Ergebnisse.
  • Eine Schwierigkeit bei der Synthese von Carboranyl-modifiziertem Oligonukleotid ist die relativ einfache Umwandlung der neutralen closo-Form der Borkäfigs in sein nido- Gegenstück, das eine negative Ladung unter basischen Bedingungen trägt, was es schwierig macht, die reinen closo-Verbindungen in einigen Fällen zu synthetisieren. Unter Verwendung eines kolometrischen Assays (TLC-Sprays zum Nachweis der nido- und closo-Verbindungen: 30 mg PdCl&sub2; in 0,5 L 1% HCl) und HPLC-Analyse wurde ermittelt, daß die verwendete CDU-Probe mit bis 5% nido-Verbindung verunreinigt war. Die Bildung des nido-Isomers kann während der Entblockierung der benzoylierten Hydroxylfunktionen der CDU unter basischen Bedingungen auftreten. Die CDU-modifizierten Oligonukleotide, die die Borcluster in der nido-Form aufweisen, sind durch eine geringere Retentionszeit auf einer Reverse- Phase-HPLC Säule gekennzeichnet (Tabelle 1). Dies ermöglicht die einfache Trennung der zwei Komponenten. Die Schmelztemperaturmessungen der getrennten nido- und closo-CDU- Oligonukleotide zeigen keinen signifikanten Unterschied für die Tm-Werte für beide Formen der CDU-Modifikation (Tabelle 1).
  • 5'-Ende [³²P]-markierte Oligonukleotide 18-24 sind homogen, wie mit der Polyacrylamidgelelektrophorese (PAGE) analysiert wurde, sie zeigen die gleiche elektrophoretische Mobilität. Closo-Carboranderivate können leicht in die reine nido-Form nach Behandlung mit Pyrrolidin überführt werden. Kane, R. R., Lee, C. S., Drechsel, K., Hawthorne, M. F., J. Org. Chem., 1993, 58, 3227-3228. Dieses Verfahren wurde verwendet, um CDU und CDU(dT)&sub1;&sub1; in die reine nido-Struktur umzuwandeln.
  • Schmelztemperaturen der gebildeten Doppelstränge zwischen CDU-modifizierten Dodecathymidylsäuren und d(A)&sub1;&sub2; hängen stark davon ab, wo CDU in der Oligonukleotidkette lokalisiert ist und werden durch den closo/nido-Status des Carboranylrestes nicht beeinflußt (Fig. 5 und Tabelle 1). Deshalb wurden Oligonukleotide, die mit CDU in der ersten (19), der siebten (21) und elften (22) Position modifiziert sind, in die closo-und nido-Derivative durch HPLC getrennt und ihre Schmelztemperaturen unabhängig voneinander gemessen. Es wurde gefunden, daß die Tm für die closo- und nido- Form innerhalb desselben Typs der Oligonukleotidmodifikation (3'-, 5'-Ende oder in der mittleren Position) immer identisch sind. Der Effekt der CDU-Position war jedoch auffallend. 5'-Modifikationen an der ersten (19) ebenso wie an der zweiten (20) Position beeinflussen die Stabilität des Doppelstranges verglichen mit nicht-modifiziertem (dT)&sub1;&sub2; (18) nicht, ihre jeweiligen Tm waren 28,0, 27,2 und 29,0ºC. Im Gegensatz dazu bewirken Modifikationen in der zentralen Position der Oligonukleotidkette (Position 7, 21) einen bemerkbare Abnahme der Doppelstrangstabilität wie durch den niedrigsten Tm Wert von 15,2ºC gezeigt wurde. Ein weniger deutlicher Effekt wurden durch die Anwesenheit von CDU an der elften Position erzeugt. Die Tm des Doppelstrangs, der gebildet wurde durch Modifikation am 3'-Ende des Oligonukleotids 10; vermindert sich auf 20,5ºC. Das Einbringen eines zweiten CDU- Nukleosids am 3'-Ende (23) bewirkt eine weitere Destabilisierung des Doppelstranges und eine Abnahme des Tm Werts auf 15,3ºC. Verschiedene Konsequenzen der Modifikation am 3'- und 5'-Ende werden durch die obigen Daten deutlich. Es scheint, daß das Einbringen der CDU-Nukleoside am 3'-Ende einen ungünstigeren Effekt besitzt als am 5'-Ende. Dies wird sehr deutlich beim Vergleich der Tm Werte zwischen den Oligonukleotiden 20 und 21, wo das CDU-Nukleotid in der zweiten Position vom 5'-Ende beziehungsweise vom 3'-Ende lokalisiert ist. Der Unterschied im Tm ist 7 bis 8ºC, was signifikant ist und offenbart die Wichtigkeit der Carboranylclusterwechselwirkung mit benachbarten Basen.
  • Diese Ergebnisse sind in Übereinstimmung mit Tm-Messungen der Doppelstränge, die zwischen CDU-modifizierten Oligomeren und Poly(rA) gebildet wurden. Die Lokalisierung der CDU-Nukleoside innerhalb der Oligonukleotidkette induziert ein größeres Destabilisierungsergebnis, was deutlicher zu sein scheint, wenn die Modifikation näher am 3'-Ende ist.
  • Zirkuläre Dichroismus (CD)-Spektren von einzelsträngiger (dT)&sub1;&sub2; und CDU-modifizierter (dT)&sub1;&sub2; (19-24), die unter analogen Bedingungen aufgenommen wurden, waren meistens identisch hinsichtlich ihrer Form und des molekularen Elliptizitäts-Wertes (siehe Fig. 6). Dies legt identische Konformation in Lösung für die Carboranyloligomere verglichen mit (dT)&sub1;&sub2; (18)-Standard nahe. Die CD-Spektren der Doppelstränge, die zwischen CDU- modfizierten Oligothymidylaten (20-24) und nicht-modifiziertem (dT)&sub1;&sub2; (18) und (dA)&sub1;&sub2; gebildet wurden, zeigten eine Reduktion in der Größe der molekularen Elliptizität bei 246 nm, was mit einer ansteigenden thermischen Stabilität des Doppelstranges übereinstimmt (Fig. 7).
  • Die Stabilität der Oligonukleotide gegenüber Nukleasen ist ein wichtiger Faktor bei in vivo Anwendungen: Es ist bekannt, daß 3'-Exonuklease-Aktivität meistens für den Abbau der nicht modifizierten Antisense-Oligonukleotide im Serum verantwortlich ist. Vlassov, V. V., Yakubov, L. A., in Prospects für Antisense Nucleic Acid Therapy of Cancers and AaS, 1991, 243-266, Wiley-Liss, Inc., New York; Nucleic Acids Res., 1993, 21, 145.
  • Das Ersetzen aller natürlichen Phophodiesterbindungen innerhalb der Oligonukleotidkette durch Methylphosphonate ist ein Beispiel von Modifikationen, die die vollständige Stabilität der Oligonukleotide gegenüber Exo- und Endonukleasen sicherstellen. Um die Widerstandsfähigkeit von CDU-Oligonukleotiden gegenüber 3'-exonukleolytischer Aktivität (Hydrolye des Oligonukleotids vom 3'-Ende) zu testen, wurde Schlangengiftphosphodiesterase (SVPD) aus Crotalus durissus ternficus verwendet. Es wurde gefunden, daß diese Oligonukleotide bemerkbar stabil gegenüber 3'-Exonukleasen sind, wenn der CDU-Rest in der 3'- oder sowohl dem 3'- als auch 5'-Ende eingebaut ist:
  • Die Oligonukleotide, die sowohl 3'- als auch 5'-Modifikationen (24) aufweisen, waren ebenfalls gegenüber SVPD und Kalbsmilzphophodiesterase resistent.
  • Modifizierte Oligonukleotide mit Carboranyl enthaltenden Basen können auch als Primer für verschiedene Polymerasen, einschließlich Humaner Immundefekt-Reverser-Transkriptase, dienen.
  • Um vergleichende Effekte der Carborankäfige auf die Stabilität der doppelsträngigen DNA, die an verschiedenen Positionen modifiziert ist, abzuschätzen, wurden molekulare Mechanismus verwendet. Für diesem Zweck das AMBER Ganzatomkraftfeldverfahren (Singh, U.C., Weiner, P. K., Caldwell, J., Lollman, P. A. AMBER 3.0, University of California: San Francisco, CA, 1986). Es zeigten sich ungünsige signifikante Wechselwirkungen der Carboran-Substituenten mit benachbarten Basen und die Wechselwirkungen waren asymmetrisch in der Orientierung in der rechtsdrehenden DNA. Dies ist in Übereinstimmung mit den beobachteten auffallenden Unterschieden der thermalen Stabilität der Duplex zwischen 5'- und 3'-modifizierten (dT)&sub1;&sub2; (19-24). Zum Beispiel ist das Oligonukleotid 5'-CDUd(T)&sub1;&sub1; (19.1) charakterisiert durch eine Tm von 28,0ºC verglichen mit einem Tm von 15,2ºC für 5'd(T)&sub6;CDUd(T)&sub5; (21.1) (Tabelle 1). Die Ergebnisse der Energieminimierung mit (dT)&sub1;&sub2; (dA)&sub1;&sub2;-Strängen zeigen, daß sie Substitution des 5'-Endes des (dT)&sub1;&sub2;-Strangs Energien für die Gesamthelices ergibt, die signifikant niedriger sind als für die Duplex, die an der 3'-Stelle des (dT)&sub1;&sub2; substituiert ist. Substitution an der inneren Base der Duplex bewirkt eben eine größere Helixdestabilität.
  • Mit der 5'-substituierten Duplex gibt es eine geringe Wechselwirkung des Carboran mit Basen und die Gesamthelixgeometrie ist ähnlich der der nicht substituierten Duplex. An dem 3'-Ende der Duplex können sich die Basen verdrehen, um einigen Strängen die sterische Kollision infolge der Endeffekte und der Bewegungsfreiheit der Basenpaare am Ende der Doppelhelix zu erleichtern. CDU-substituierte Basen im Zentrum der Helix zeigen eine ähnliche sterische Kollision, aber sie haben nicht die Flexibilität der Basenpaare aum 3'-Ende der Helix.
    • Beispiel 4 Kinetische Untersuchungen der Stabilität der CDU-Oligonukleotide gegenüber SVPD 3'-Exonuklease
  • Die Halbwertszeiten (T1/2) von 3'-CDU-, 3'-,5'-CDU und 3'-CDU&sub2;-Oligonukleotiden wurden durch kinetische Untersuchungen ihres Abbaus durch SVPDE (Schlangengiftphosphodiesterase) bestimmt. Aliquots der enzymatischen Reaktion (0, 5, 10, 20, 40, 80 und 240 Minuten) wurden mittels HPLC analysiert. Die Bestimmungen der Halbwertszeiten basierten auf dem Verschwinden des 12-mers (oder 11mer im Fall der CDU- modifizierten Oligos) nach Standardisierung mit 2'-Desoxycytidin, das als interner Standard verwendet wurde. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 dargestellt. Tabelle 2
    • III. Bestimmung weiterer Eigenschaften der modifizierten Oligonukleotide
  • Verfahren für die Bestimmung der wässrigen und Serum-Stabililät, der Aufnahme in die Zelle, des Washouts aus der Zelle und des Verteilungskoeffizienten der hier beschriebenen Verbindungen werden unten angegeben. In einer bevorzugten (aber nicht erforderlichen) Ausführungsform weisen die ausgewählten Verbindungen für in vivo Zwecke eine wässrige Stabilität unter den unten beschriebenen Bedingungen von wenigstens einer Stunde, eine Serum-Stabilität von wenigstens einer Stunde, eine Zellaufnahme von wenigstens 1% der Dosis, ein Zellwashout von wenigstens einer Stunde und einen Verteilungskoefflzienten, der eine geeignete Lipophilie zeigt, auf.
    • Oligonukleotidstablilitätsuntersuchungen.
  • (a) In Puffer: Fünf Proben (pH 3-7) wurden durch Lösen von 10 ODU Oligonukleotid in 100 ul geeignetem 0,2 M Phosphatpuffer (KHPO&sub4;/KOH/H&sub3;PO&sub4;) hergestellt und bei 4ºC, 22ºC und 37ºC gehalten: Nach bestimmten Zeitintervallen wurden 10 ul Aliquots jeder Lösung mittels HPLC analysiert. Die Konzentration der Mischung der Komponenten wurde als die Prozentzahl der gesamten Fläche unter der Kurve für die Oligonukleotide und die vermuteten Abbauprodukte bestimmt.
  • (b) Oligonukleotidstabilität in humanem, Maus- und Rattenserum: Die Stabilität der Oligomere wurde durch Inkubation der Nukleotide bei 37ºC für den gewünschten Zeitraum bestimmt und nach Ausfällung des Proteins mit kaltem 60% MeOH/H&sub2;O und Lyophilisierung des Überstands wurden die Proben in Puffer resuspendiert und ein Aliquot mittels HPLC analysiert. Eine Reverse-Phase- Merck PR-18, 5 mm · 25 cm Säule wurde zur Bestimmung der Stabilität der Oligonukleotide verwendet. Die mobile Phase ist Acetonitril in Triethylammoniumacetat (oder ein ähnliches System). Eine isokratische Fließgeschwindigkeit von 1 ml/min wurde verwendet und die Höchstwerte wurde unter Verwendung eines UV- Detektorsets bei 260 nm aufgezeichnet.
  • Dreifache Untersuchungen wurden mit nicht markierten oder radioaktiv markierten Oligonukleotiden durchgeführt, um den intrazellulären Profilen der Droge zu folgen. Es wurden zum Beispiel humane Gliomzellen U 251 (2 · 10&sup6; Zellen) in einem Medium, das 10% fötales Kälberserum und Antibiotika enthielt, suspendiert und bei 37ºC in einem 5% CO&sub2;-Inkubator inkubiert. Der Versuch wird durch die Zugabe von 2-10 uM [³H]-Oligomer (spezifische Aktivität -1000 bis 2000 DPM/pmol) gestartet und die Zellen für 1, 2, 4, 6, 12 und 24 Stunden der Droge ausgesetzt. Das Medium wurde entfernt und die Zellen dreimal mit kalter Hank's-Balanced-Salzlösung gewaschen. Die Extraktion wurde durch Zugabe von 1 ml 60% kaltem Methanol/Wasser durchgeführt, anschließend folgte die Lagerung über Nacht bei -70ºC. Die Suspensionen wurden dann zentrifugiert und die Überstände bis zur Trockenheit lyophilisiert. Die Reste wurden in 250 ul Wasser wieder suspendiert und Aliquots, die 50-100 ul enthielten, wurden mittels HPLC analysiert. Die quantitative Bestimmung der intrazellulären Oligomere wurde mit HPLC-Verfahren durchgeführt, die in unserem Labor entwickelt wurden. Ein Puffersystem, das dem physiologischen pH nahe kommt, wird, wenn benötigt, verwendet.
    • Zelt Washout-Untersuchungen.
  • Die Untersuchungen wurden mit nicht markierten und radioaktiv markierten Agentien durchgeführt, um die intrazellulären Profile der Oligomer zu verfolgen, die in der Zelle nach dem Entfernen der Droge zu verschiedenen Zeiten nach der Gabe nachgewiesen wurden.
  • Zellen (2 · 10&sup6; Zellen) wurden in einem geeigneten Medium, das mit Serum versetzt war, suspendiert und bei 37ºC in einem CO&sub2;-Inkubator inkubiert. Es wurden Konzentrationen der radioaktiv markierten Drogen von 2 und 10 uM verwendet. Nach der Gabe mit der markierten Probe zu den Zellen über die gewünschte Zeit wurden die Zellen gründlich gewaschen und dann mit frischem Medium ohne Drogen (0 Stunden) aufgefüllt. Nach 0, 2, 4, 6, 8, 24 und 48 Stunden (zweite Inkubationszeit) wurden die Zellen entfernt und sofort mit 60% kaltem Methanol/Wasser extrahiert. Die Extrakte wurden durch Zentrifugation erhalten und das Zellpellet entfernt. Die Extrakte wurden lyophilisiert und bei -70ºC gelagert. Das Material wurde in 200 ul HPLC-Puffer resuspendiert und sofort analysiert. Die quantitative Bestimmung der intrazellulären Oligomere wurde wie oben beschrieben durchgeführt.
    • Bestimmung des Verteilungskoeffizienten.
  • Das Oligonukleotid (1 mg/ml) wurde in Wasser gelöst und dann 1 ml Oktanol zugegeben. Der Verbindung wurde es ermöglicht, sich zwischen den beiden Lösungsmitteln durch Schütteln über zwei Stunden zu verteilen. Die Konzentration der Droge wurden in verschiedenen Phasen durch HPLC bestimmt, wie oben beschrieben.
    • IV. Verfahren zur Verwendung von Carboranyl enthaltenden Oligonukleotiden A. Verwendung bei der Bor-Neutronen-Einfang Therapie
  • Die Carboranyl enthaltenden Oligonukleotide, die hier beschrieben werden, können bei der Bor-Neutronen-Einfang-Therapie verwendet werden, um eine Vielzahl von Krankheiten und insbesondere Krebs zu behandeln, zum Beispiel Gehirngliome, Melanome und Brustkrebs.
  • BNCT-Techniken sind dem Fachmann gut bekannt und sind detailliert beschrieben, zum Beispiel in Hatanaka et al., Z. Neurol., Vol. 204, S. 309-332 (1973); Tolpin et al., Oncology, Vol. 32, S. 223-246 (1975); US-Patente Nr. 5,130,302; 5,066,479, 5,021,572; 4,959,356 und 4,855,493; und Barth et al., Cancer Res., Vol. 50, S. 1061-1070 (1990). Zum Beispiel, ein Patient, der dies benötigt, wird mit einer wirksamen Menge einer oder mehrerer der offenbarten Verbindungen behandelt und dann Neutronen, vorzugsweise epithermalen Neutronen, die 5 · 10¹² n/cm² (Gesamtdosis) nicht überschreiten sollte, ausgesetzt. Eine bevorzugte Dosis des Carboranyl enthaltenden Oligonukleotids ist 0,01 bis 100 mg/kg Körpergewicht bei einer einzelnen Dosis und vorzugsweise 0,1 bis 20 mg/kg Körpergewicht in einer einzelnen Dosis, die intravenös verabreicht wird. Es kann vorteilhaft sein, die Dosis schrittweise zu verabreichen, um die Verbindung in bestimmten Zellen zu akkumulieren, wie z. B. in Glionizellen. Die Verbindung kann zu jeder geeigneten Zeit verabreicht werden und wird typischerweise 30 Minuten bis eine Stunde vor der Neutronenbestrahlung verabreicht.
    • B. Antivirale Aktivität
  • Eine Anzahl der Carboranyl enthaltenden Verbindungen, die hier offenbart werden, weist eine antivirale Aktivität, einschließlich anti-HIV- oder anti-HBV-Aktivität auf. Die Verbindungen können einfach auf anti-HIV-Aktivtät untersucht werden, dabei können eine Vielzahl von Verfahren verwendet werden, zum Beispiel die, die in den Europäischen Patentanmeldungen Nr. 92 304 551.2 und 92 304 552.0 eingereicht von Biochem Pharma Inc. offenbart sind; PCT-Veröffentlichungen Nr. WO 92/14729 und WO 92/14743 eingereicht durch die Emory University und Schinazi et al., Antimicrobial Agents Chemother., 34, Seite 1061 (1990).
  • Die Fähigkeit der Bor-Cluster-Nukleoside, HBV zu inhibieren, kann auch durch verschiedene experimentelle Techniken gemessen werden. Ein üblicher Test, die Fähigkeit der offenbarten Verbindungen, die Replikation von HBV zu inhibieren, zu bestimmen, ist detailliert in Korba und Gerin, Antiviral Res., 19: 55-70 (1992) beschrieben.
    • C. Fähigkeit der Bor-Cluster-Oligonukleotide, zielgerichtete Mutagenese zu bewirken
  • Zielgerichtete Mutagenese (SDM) ist eine bekannte Technik, bei der Mutationen in Nukleinsäuresequenzen bewirkt werden, die Proteine kodieren. Im allgemeinen wird ein synthetisches Oligonukleotid anfänglich in vivo oder in vitro unter Standardbedingungen auf eine Trägernukleinsäure hybridisiert. (Baumgart, P. M., Kliem, H.-C., Gottfried-Anacker, J., Wiessler, M., Schmeiser, H. H., 1993, Nucl. Acids Res., 21, 3755-3760). Bei der Transkription oder Translation der Nukleinsäuresequenz wird eine defekte Nukleinsäurebeziehungsweise Aminosäuresequenz hergestellt.
  • Es wurde gefunden, daß die synthetischen Bor-Cluster-enthaltenden Oligonukleotide, die hier offenbart sind, verwendet werden können, um zielgerichtete Mutagenese in vivo oder in vitro zu bewirken. Insbesondere kann ein virales, eukaryontisches oder prokaryontisches Genom durch Insertion eines Carboranyl enthaltenden Oligonukleotids in eine Zelle mutiert werden, wobei Oligonukleotide auf eine Nukleinsäuresequenz hybrisiert werden, in einer Art, daß eine Mutation während der Transkription oder Zellteilung stattfindet. Beispiele von viralen Nukleinsäuresequenzen, die mutiert werden können, schließen solche in HIV und Hepatitisviren ein, einschließlich HBV.
  • Als ein Beispiel können mutagene Oligonukleotide und mutante E. coli Stämme, denen ein DNA-Reparatur Mechanismus (oder nested-PCR) fehlt, verwendet werden, um Mutationen auf exprimierter HIV-1 Reverser Transkriptase zu bewirken. Weil Mutantenreparatur minus DNA-Polymerase und RT ähnlich funktionalisieren, ist es möglich, zielgerichtete Mutagenese in vivo während der HIV-1 RNA reversen Transkription durchzuführen, um eine nachfolgende Expression des integrierten Virusgenoms zu bewirken. Die Expression des mutierten RT-Gens in den weiteren Stadien des Virusreplikationszyklus ergibt die Produktion eines nicht-funktionellen Enzyms, das andererseits die virale Replikation inhibieren kann. Mutationen in anderen Trägerbereichen von HIV können wie gewünscht bei Verwendung der geeigneten Sequenz erzeugt werden.
  • Beispiel 5 beschreibt die in vivo Mutation des RT-Gens mit dem YMDD-Motiv, das in einen passenden Vektor in E. coli Zellen eingebracht ist. Die mutagene Oligonukleotid-DNA- Träger-Region ist in dem YMDD-Motiv konserviert (Nukleotide 5' 2678 bis 3' 2689) der HIV-1 RT. Die verwendeten mutagenen Oligonukleotide sind 5'- AATACATGGA(CDU)GATTTGTAT-3' und 5' AATACATGG(CDU)(CDU)GATTTGTAT 3'. Die Oligonukleotide wurden unter Verwendung der β-Cyanoethylphosphoramidit-Chemie und einem automatischen DNA-Synthesizer hergestellt. Jedes enthielt ein oder zwei modifizierte Nukleotide [(5-[o-Carboran-lyl)-2'-desoxyuridin (CDU)}.
    • Beispiel 5 Zielgerichtete Mutagenese von HIV-1-Reverser Transkriptase HIV-Klonierung
  • Eine Restriktionskarte des molekularen infektiösen Klons, pBRU, wurde unter Verwendung eines Systems 7 DNASTAR-Programm erzeugt (DNASTAR Inc., Madison). Die Restriktionsenyme, die für das Klonieren der Reversen Transkriptase (RT)-Gene verwendet wurden, wurden so ausgewählt, daß sie die aktive Stelle des RT enthielten und um eindeutige Restriktionsstellen für die Klonierung der Mutanten zurück in pBRU sicherzustellen. Die Restriktionsenzyme Sac 1 (Base 228) und Sal 1 (Base 5367) wurden verwendet, um die gewünschten Fragmente in dem Phagemid pALTER-1 zu plazieren. Dieses Plasmid war versehen mit dem Alteres Sites in vitro Mutagenese System (Promega Corp., Madison, WI. 53711-5399). Positive Klone für die RT-Insertion in pALTER-1 wurden durch Sequenzierung von der T7-Primerstelle (5'-AACAGCTATGACCATG-3') ausgewählt (Gibco BRL, Gaithersburg, MD). Die Sequenzierung wurde mit einer Sequenase-Version 2.0 Kit (United States Biochemical Corp., Cleveland, OH) durchgeführt. Die Konstrukte wurden in JM109 (endA1, recA1, gyrA96, thi, hdsRl7 (rk&supmin;, mk&supmin;) relA1, supE44, lambda, Δ(lac-proAB), [F', traD36, proA&supmin;B&supmin;, lacIqZΔM15] transformiert, wobei das Verfahren der CaCl&sub2;-Transformation verwendet wurde, wie in (Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T., 1989, Molecular Cloning. A Laboratory Manual, (Nolan, C., Ed.) Cold Spring Harbor Laboratory Press) beschrieben.
    • Herstellung von einzelsträngiger DNA
  • Übernachtkulturen des JM109 (pHIVALT-1)-Konstruktes wuchsen in 2 ml TYP-Brühe (16 g Bacton-Tryton -16 g Bacto-Hefeextrakt - 5 g NaCl/Liter), die 15 ug/ml Tetracyclin (tet) enthielt, die bei 200 rpm bei 37ºC geschüttelt wurden. Am folgenden Morgen wurden 5 ml der TYP-Brühe, die 15 ul/ml tet plus 2,5 g/l K&sub2;HPO&sub4; enthielt, mit 100 ul der Übernachtkultur geimpft. Die Kultur wurde bei 37ºC über 30 Minuten in einem 50 ml Kolben kräftig geschüttelt. Die Kultur wurde dann mit R408 und M13K07, Helferphagen, mit einer Infektionsmultiplizität (m.o.i.) von 10 infiziert. Die Kulturen wurden dann bei 200 rpm über Nacht bei 37ºC geschüttelt. Am nächsten Morgen wurde die Kultur durch Zentrifugieren bei 12000 rpm über 15 Minuten geerntet und der Überstand wurde in ein neues Röhrchen überführt. Der Überstand dann erneut bei 12000 rpm über Minuten zentrifugiert, um alle verbliebenen Zellen oder Überbleibsel zu entfernen. Der Phage wurde dann durch Zugabe von 0,25 Volumen eines Polyethylenglycol (PEG)-Lösung (3,75 M Ammoniumacetat- 20% Polyethylenglykol; MW 8000) gefällt. Die Probe wurde dann für 30 Minuten in Eis gestellt, darauf folgte eine Zentrifugation bei 12000 · g für 15 Minuten. Das Pellet wurde durch Umdrehen des Röhrchens für 2-3 Minuten auf ein Papiertuch vollständig von der Flüssigkeit befreit. Das Pellet, das den Phagen enthielt, wurde dann mit 400 ul TE- Puffer [10mM Tris-HCl (pH 8,0), 1 mM EDTA] resuspendiert. Es wurde das gleiche Volumen Chloroform : Isoamylalkohol 24 : 1 direkt zu dem resuspendierten Phagen gegeben, um die Partikel zu lysieren und jeden Überschuss an PEG-Lösung zu entfernen. Die Mischung wurde mehrere Male "auf den Kopf gestellt" und bei 12000 · g für 5 Minuten zentrifugiert. Die obere wässrige Lösung wurde in ein neues Röhrchen überführt und ein gleiches Volumen TE gesättigtes Phenol : Chloroform : Isoamylalkohol (25 : 24 : 1) wurde hinzugefügt. Die Lösung wurde dann mehrere Male "auf den Kopf gestellt" und bei 12000 · g für 5 Minuten geschleudert. Aus dieser letzten Phenol : Chloroform : Isoamylalkohol Extraktion wurde die wässrige Phase entfernt und in ein neues Eppendorf-Röhrchen gegeben. Schließlich wurden 0,5 Volumen 7,5 M Ammoniumacetat und 2 Volumen eiskalter 95% EtOH zu der Lösung hinzugegeben. Die Lösung wurde bei -70ºC ungestört stehen gelassen. Nach einer Stunde wurde die Probe bei 14000 · g für 30 Minuten zentrifugiert, danach zweimal mit 70% EtOH bei 14000 · g für jeweils 15 Minuten gewaschen. Die Probe wurde dann in einer Speed Vac bei Raumtemperatur für 10 Minuten getrocknet. Die Proben wurden anschließend in 20 ul dH&sub2;O resuspendiert und auf Spots mit einem ethidiumgefärbten 0,8% Agarosegel, das bei 45 Volt für etwa 1,5 Stunden lief, geprüft.
    • Herstellung des Oligonukleotids Automatische Synthese von 5'-AATACATGGA(CDU)GATTTGTAT 3' und 5'- AATACATGG(CDU)(CDU)GATTTGTAT 3'.
  • Die modifizierten Oligonukleotide wurden mit einem Applied Biosystems 391 DNA- Synthesizer hergestellt. Säulen, die mit kontrolliertem reinem Glas, das mit 5'-O- Dimethoxytritylthymidin (1mM) funktionalisiert war, beladen waren, wurden als fester Träger verwendet. Alle 5'-Dimethoxytrityl 3'-Phosphoramiditderivate wurden als 0,09 M Lösung in wasserfreiem CH&sub3;CN hergestellt. Die Elongation der Oligonukleotide wurde mit dem Standard β-Cyanoethyl 1 mM DNA-Synthesezyklus ohne irgendeine Änderung in der Kondensationszeit durchgeführt (Applied Biosystems USER Bulletin No. 43, 1987, Applied Biosystems, Foster City, CA). Von den Oligonukleotiden wurden dann die Schutzgruppen entfernt und sie wurden vom Träger durch Inkubation über Nacht in konzentrierter NH&sub4;OH bei Raumtemperatur abgetrennt. Die Oligonukleotide wurden dann mit einer OPCTM- Kartusche (Applied Biosystems, Foster City, CA) gereinigt und ihre Reinheit wurden durch HPLC, wie unten beschrieben, überprüft.
    • HPLC Analysse von 5'-AATACATGGA(CDU)GATTTGTATT-3' und 5'- AATACATGG(CDU)(CDU)GATTTGTAT 3'.
  • Die HPLC-Analyse wurde mit einem Hewlett-Packard 1050 System mit einer Whatman Partisphere C&sub1;&sub8; 5 um, 4,7 · 235 mm Säule durchgeführt. Alle Analysen wurden bei Raumtemperatur durchgeführt. Typischerweise wurde ein Gradient aus CH&sub3;CN von 5% bis 30% in Triethylammoniumacetatpuffer (TEAA) pH 7,0 als Elutionsmittel bei einer Fließgeschwindigkeit von 1,0 ml/min durchgeführt. 5'- AATACATGGA(CDU)GATTTGTAT-3', Rf 14,83 Minuten und 5'- AATACATGG(CDU)(CDU)GATTTGTAT-3', Rf 14,64 Minuten.
    • In vitro zielgerichtete Mutagenese
  • Das Verfahren für die in vitro zielgerichtete Mutagenese, das in diesem Experiment verwendet wird, war eine Modifikation desjenigen, das in dem Altered Stites Kit #Q6210 (Promega Cor., Madison, Will) verwendet wird. Kurz gesagt werden Oligonukleotide, 5'- AATACATGGA(CDU)GATTTGTAT-3' und 5'- AATACATGG(CDU)(CDU)GATTTGTAT-3' und eine Kontrolle, die an der putativen katalytisch aktiven Stelle für HIV-1 RT (5'-2676 bis 3'-2696) mit T4 Polynukleotidkinase 5'- phosphoryliert. Die Reaktion wird durch Erhitzen auf 70ºC über 10 Minuten beendet. Die Mutagenese-Annealing-Reaktion wurde durch Zugabe von 0,05 umol pHIVALT-1 ssDNA, 0,25 umol Ampicillin-Reparaturoligonukleotid (im Kit vorhanden), 1,25 umol des 5'- phosphorylierten mutagenen Oligos und einem Annealing-Puffer, der in dem Kit in einem Gesamtvolumen von 20 ul vorhanden ist, durchgeführt. Die Kontrollreaktionen mit den Oligonukleotiden für dieses Experiment wurden separat zusammen mit einer zusätzlichen Reaktion, die das Ampicillin-Reparatur-Oligo, aber keine mutagenen Oligos 5'- AATACATGGA(CDU)GATTTGTAT-3' und 5'- AATACATGG(CDU)(CDU)GATTTGTAT-3' und unmodifizierte Kontrolle, enthielt, durchgeführt. Die Reaktionen wurden dann auf 70ºC für 5 Minuten erhitzt und dann auf Raumtemperatur über einen Zeitraum von 15 bis 20 Minuten abgekühlt. Die Annealingreaktionen wurden auf Eis gestellt und die folgenden Reagentien wurden zugefügt: 3 ul 10 · Synthesepuffer (im Kit vorhanden), 1 ul T4 DNA-Polymerase (10U/u1), 1 ul T4 DNA-Ligase (2U/u1) und 5 ul steriles dH&sub2;O. Die 30 ul Reaktionslösung wurde bei 37ºC über 90 Minuten inkubiert, um die Synthese und Ligation des zweiten Stranges durchzuführen.
    • Mutagenese
  • Um die Wirkungen der CDU-modifizierten Oligonukleotide auf die Mutagenese zu untersuchen, wurde die vollständige Reaktionsmischung (30 ul) aus dem in vitro Mutageneseschritt (oben) zu den Komponenten 71-18 mut S (thi, subE, Δ(lac-proAB), [mutS:Tn10][F', traD36, proA&supmin;B&supmin;, lacIqZΔM15] einem Reparatur-Minus-Strang und DH5δ, einem positiven Reparatur-Strang, gegeben. Die Reaktonsmischung wurde dann durch CaCl&sub2;, wie durch Maniatis et al. beschrieben, transformiert. Ein Teil der Tranformanten wurden auf Lennox L Agar (LB Agar) (Gibco-BRL, Madison; WL, Kat.# M27000B) plus 100 ug/ml Ampicillin ausgestrichen und der andere wurde in S ml LB-Brühe, die 100 ug/ml Ampicillin enthielt, gegeben, um nur die Mutanten aus dem BMH 71-18 mut S Transformanten auszuwählen.
    • Mutanten Auswahl für die Sequenzierung
  • Transformierte BMH 71-18 mut S aus den Kontroll- und experimentellen Reaktionen wurden über Nacht in 5 ml LB-Brühe, die Ampicillin 100 ml/ml enthielt, wachsen gelassen, bei 250 rpm bei 37ºC geschüttelt. Die Übernachtkulturen wurden zentrifugiert und für die Plasmidextraktion mit dem Qiagen Plasmid Kit # 12123 tip-20 (Qiagen, Chatsworth, CA. 91311) lysiert. Die Verfahren für die Plasmidextraktion wurden gemäß den Herstellerangaben ohne spezielle Modifikationen durchgeführt. Am folgenden Morgen wurden die vollständigen Kulturen zentrifugiert und, wie oben beschrieben, lysiert. Nach dem Wiedergewinnen der Plasmid-DNA aus BMH 78-18 mut S. wurde die gereinigte Plasmid-DNA in 20 ul sterilem dH2O resuspendiert und in kompetente JM109 transformiert, wie oben beschrieben, und auf LB-Agar-Platten, die mit 100 ug/ml Ampicillin ergänzt waren, ausgestrichen.
    • Sequenzierung
  • Die Sequenzierung wurde mit dem Zyklus-Sequenzierungs-Verfahren aus einem AmpliTaq Sequenzierungs Kit (Perkin Elmer Cetus Corp., Norwalk, Conn.) durchgeführt. Die für die Sequenzierung der Mutanten verwendeten Primer waren RT-MT4 (5'- CAATGAGACACCAGGG-3') lokalisiert bei 5'-2539 bis 3'-2554 von HIVBRU und RT- MT7RC (5'-GTCATTGACAGTCCAGCTGTC-3') lokalisiert auf dem gegenüberliegenden Strang 5'-2899 bis 3'-2879). Die Primer sind auf der gegenüberliegenden Stelle der aktiven Stelle der RT lokalisiert und sollten einen Sequenznachweis von beiden Strängen des Plasmids ergeben.
    • Ergebnisse Mutagenese
  • Die in vitro Mutagenese Reaktionen, die CDU-modifizierte Oligomere [5'- AATACATGGA(CDU)GATTTGTAT-3' und 5'- AATACATGG(CDU)(CDU)GATTTGTAT-3 '3 und die Kontrollreaktionen enthielten, wurden in Reparatur-positive und Reparatur-negative Stämme von E. coli gegeben. Die Reaktionen, die Ampicillin (amp) Reparaturoligo plus neutrales Oligo (ausgenommen CDU- Modifikation) in einem Reparatur-positiven Stamm (DH5δ) von E. coli enthielten, konnten kien beginnen Kolonien auf den amp-Platten, aber jedoch auf Kolonien auf Tetracyclin-(tet) Platten produzieren. Die Kontrollreaktionen, die in den Reparatur-minus Stamm transformiert wurden, produzierten Kolonien auf Ampicillin- und tet-Platten. Reaktionsmischungen aus den experimentellen mutagenen CDU-modifizierten Transformationen in die Reparatur-positiven Stämme zeigten eine Fehlen der Fähigkeit, Kolonien auf amp- oder tet-Platten zu bilden. Die Reaktionen der CDU-modifizierten in vitro Mutagenese in dem Reparatur-minus Stamm zeigten die Fähigkeit auf amp-Platten zu wachsen und schließlich nach der Transformation in JM109 zeigten sie amp- und tet-Resistenz.
    • Sequenzierung
  • Die Sequenzierung der Mutanten, die aus der in vitro zielgerichteten Mutagenese mit 5'- AATACATGGA(CDU)GATTTGTAT-3' (RL. 1) und 5'- AATACATGG(CDU)(CDU)GATTTGTAT-3' (RL-2) und Kontrolloligonukieotiden gebildet wurden, wurde durchgeführt. In 60% der Klone (mit RL-1), kamen die Mutationen nächstliegend der Base gegenüber von CDU auf dem komplementären Strang (z. B. 5'- AATACATGGTTGATTTGTAT) vor, dies führte zu einem Aminosäureaustausch von YMDD zu YMVD. Eine Sequenzänderung von YMDD zu YMGD wurde in diesem Fall ebenfalls beobachtet.
  • Die zweite Sequenz (RL-2) bewirkte einen Aminosäurenaustausch von YMDD zu YRVD in einem Prozentsatz der Klone.
    • D. Verwendung der Oligonukleotide als Sonden
  • Die Oligonukleotide der vorliegenden Erfindung können als Sonden in einer Vielzahl von diagnostischen Techniken, einschließlich Kernspinresonanztomographie (MRI), verwendet werden. MRI ist eine nicht-invasive Technik, die verwendet wird, um das Vorhandensein und den Ort von Tumoren bei einem Patienten nachzuweisen. Zum Beispiel können krebszellenspezifische borierte Verbindungen einem Patienten gegeben werden, die sich in dem kanzerösen Gewebe konzentrieren. Das MRI-Instrument besitzt die Fähigkeit, Regionen mit abnormalen Borkonzentrationen nachzuweisen und zu lokalisieren. Durch den Hinweis auf die Regionen mit relativ hohen Borkonzentrationen bestätigt MRI das Vorhandensein und den Ort der Tumoren.
  • Eine andere diagnostische Anwendung der Oligonukleotide der vorliegenden Erfindung ist ihre Verwendung als molekulare Sonde. Das Oligonukleotid wird verwendet, um die Anwesenheit von komplementären Sequenzen von DNA und RNA in einer Probe durch Hybridisierung nach Standardtechniken nachzuweisen. Zum Beispiel können die Sonden in einem Southern-Blot- oder einem Northeren-Blot-Assay verwendet werden, die Details sind bekannt. Siehe z. B. R. Old und S. Primrose, Principles of Gene Manipulation, 8-10 (3.Ed., 1985). Wenn sie als Sonden verwendet werden, dienen die Boratome als radioaktiv markiertes Kennzeichen, obgleich sie nicht selbst radioaktiv sind, bis sie Neutronenbestrahlung ausgesetzt werden. Wenn es Neutronen ausgesetzt wird, absorbiert ¹&sup0;B ein Neutron und bildet instabiles ¹¹B, das rasch zerfällt und ein alpha-Teilchen und gamma-Strahlung freisetzt, wobei es ein nachweisbares Signal liefert. Diese Techniken, die die Bildung von alpha-Teilchen einschließen, sind bekannt. Siehe z. B. A. Soloway, Borax Rev. 3, 7-9 (1988).
  • Die Reaktionsbedingungen für die Hybridisierung einer Oligonukleotidsonde oder Primer auf eine Nukleinsäuresequenz variieren von Oligonukleotid zu Oligonukleotid in Abhängigkeit von Faktoren wie zum Beispiel der Oligonukleotidlänge und der Zusammensetzung des Puffers, der für die Hybridisierungsreaktion verwendet wird. Moderate stringente Hybridisierungsbedingungen sind im allgemeinen für den Fachmann verständlich, wie Bedingungen etwa 25ºC unter der Schmelztemperatur einer perfekten basengepaarten doppelsträngigen DNA. Höhere Spezifität wird im allgemeinen durch die Verwendung von Inkubationsbedingungen mit höheren Temperturen, mit anderen Worten stringenteren Bedingungen, erreicht. Kapitel 11 des bekannten Laborhandbuchs von Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1990), beschreibt Hybridisierungsbedingungen für Oligonukleotidsonden und Primer im größerem Detail, einschließlich einer Beschreibung der involvierten Faktoren und dem Niveau der Stringenz, die notwendig sind, um spezifische Hybridisierung zu gewährleisten.
    • E. Nachweis von Bor in Gewebeproben
  • Die von Ganbel, et al. entwickelte Technik (Gabel, D., Hocke, I. und Eisen, W., Determination of sub-ppm amounts of boron-10 solutions by means of solid state track detectors. Phys. Med. Biol. 28: 1453-1457, 1983; Fairchild, R. G., Gabel, D., Laster, B. und Kiszenick, W., B-10 Analysis in Tissue by Prompt gamma and Track Etching Techniques. Proc. the First International Symposium on Neutron Capture Therapy, October 12-14, 1983. BNL Report Nr. 51730, S. I06-113, 1984) wurde verwendet, bei der ein Cellulosenitratfilm verwendet wird, um ng-Mengen von natürlichem Bor in 0,5 mg Tropfen (1, 2) nachzuweisen. Kleine Tropfen (0,5 ul), die bekannte oder unbekannte Mengen Bor enthalten, werden auf Cellulosenitratfilmen (Kodak Pathe Typ LR115) aufgetragen, getrocknet und dann mit 6 · 10¹² n/cm² bestrahlt. Der resultierenden alpha-Spuren wurden mit NaOH geätzt und dann optoelektronsich gezählt. Der Borgehalt in 106 Zellen ( 1 mg des Gewebes oder der Probe) kann durch Lysieren der zu analysierenden Zellen erhalten werden und dann wie oben beschrieben behandelt werden. Dieses Verfahren kann einfach durch einen Fachmann für diagnostische Verwendungen mit Bor-enthaltenden Sonden angepaßt werden.
    • F. Antisense Therapie
  • Die Oligonukleotide der vorliegenden Erfindung, die fähig sind, an Polyribonukleinsäuren oder Polydesoxyribonukleinsäuren zu binden, sind als Antisense-Agentien in der gleichen Weise wie herkömmliche Antisense-Agentien zu verwenden. Siehe im allgemeinen Antisense Molecular Biology and S-oligos, Synthesis 1 (Oct. 1988) (veröffentlicht durch Synthecell Corp., Rockville, Md.); 2 Veröffentlichungen in Antisense Nucleic Acids (C. Brakel und R. Fraley eds. 1989); Uhlmann et al., "Antisense Oligonucleotides: A New Therapeutic Technique," Chem. Rev. 90 (4), 1990; und Milligan, J. F., Matteucci, M. D., Martin, J. C., J. Med. Chem., 1993, 36, 1923-1937. Die Antisense-Agentien der vorliegenden Erfindung können zur Konstruktion eines Antisense-Agens verwendet werden, das fähig ist, selektiv an eine vorbestimmte Polydesoxyribonukleinsäure- oder Polyribonukleinsäuresequenz zu binden, in einer Zelle, die eine solche Sequenz enthält (z. B. durch Zugabe des Antisense- Agens in ein Kulturmedium, das diese Zelle enthält), so daß das Antisense-Agens von der Zelle aufgenommen wird, die vorherbestimmte Sequenz bindet und deren Transkription, Translation oder Replikation blockiert. Die Bedingungen für selektive Bindung der Antisense-Agens sind bekannt (z. B. eine Länge von 17 Basen für die selektive Bindung innerhalb des menschlichen Genoms).
    • V. Pharmazeutische Verbindungen und Abgabe von Carboranyl enthaltenden Oligonukleotiden
  • Die Carboranyl-modifizierten Oligonukleotide können Menschen in einer wirksamen Menge für jeden hier beschriebenen Zweck verabreicht werden. Das aktive Material kann wahlweise als ein pharmazeutisch akzeptables Derivat oder Salz oder wahlweise in Kombination mit einem pharmazeutisch akzeptablen Träger oder Verdünnungsmittel verabreicht werden. Die aktiven Materialien können, mittels jedes geeigneten Wegs, zum Beispiel oral, parenteral, intravenös, intradermal, subkutan oder topisch in flüssiger oder fester Form verabreicht werden.
  • Die aktive Verbindung ist in dem pharmazeutisch akzeptablen Träger oder Verdünnungsmittel in einer Menge vorhanden, die ausreichend ist, die gewünschten therapeutischen Ergebnisse zu erreichen, ohne ernsthafte toxische Wirkungen in dem behandelten Patienten zu bewirken. Für die Behandlung von Krankheiten, wie Krebs oder ein Virus, sind Verbindungen mit einem therapeutischen Index von wenigstens 2 und vorzugsweise von wenigstens 5 oder 10 akzeptabel. Der therapeutische Index ist definiert als IC&sub5;&sub0;/EC&sub5;&sub0;, wobei EC&sub5;&sub0; die Konzentration der Verbindung ist, die das Wachstum für 50% der erkrankten Zellen inhibiert und IC&sub5;&sub0; ist die Konzentration der Verbindung, die zu 50% der ansonsten gesunden Zielzellen toxisch ist. Zelluläre Toxizität kann durch direkte Zellmessungen, Trypanblau-Ausschluß oder verschiedene metabole Aktivitätsstudien, wie ³H- Thymidin-Einbau, wie es dem Fachmann bekannt ist, gemessen werden.
  • Eine bevorzugte Dosis der aktiven Verbindung für alle oben genannten Bedingungen kann im Bereich von 0,01 bis 1000 mg/kg Körpergewicht und vorzugsweise 0,1 bis 20 mg/kg Körpergewicht in einer einzelnen Dosis pro Tag liegen. Der wirksame Dosierungsbereich der pharmazeutisch akzeptablen Derivate kann auf der Basis des Gewicht der Stammverbindung, die verabreicht werden soll, berechnet werden. Wenn das Derivat seinerseits Aktivität aufweist, kann die wirksame Menge, wie oben, mit dem Gewicht des, Derivats bestimmt werden oder durch andere Mittel, die dem Fachmann bekannt sind.
  • Die Verbindung wird günstigerweise in Einheiten jeder geeigneten Dosierungsform, einschließlich aber nicht beschränkt auf eine, die 5 bis 3000 mg, vorzugsweise 70 bis 1400 mg des aktiven Bestandteils pro Einheitsdosierungsform enthält, verabreicht. Eine orale Dosierung von 50 bis 1000 mg ist im allgemeinen passend.
  • Idealerweise sollte der aktive Bestandteil so verabreicht werden, um Höchstplasmakonzentrationen der aktiven Verbindung von etwa 0,01 bis 100 uM, vorzugsweise etwa 0,1 bis 40 uM zu erreichen. Dies kann beispielsweise durch intravenöse Injektion einer 0,1 bis 2% Lösung des akiven Bestandteils wahlweise in Salzlösung verabreicht werden oder als ein Bolus des aktiven Bestandteils erreicht werden.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform für BNCT wird die aktive Verbindung in einer intravenösen Lösung mit einer Dosis im Bereich von 1 mg/kg bis 20 mg/kg verabreicht. In einer bevorzugten Ausführungsform für die Antisense-Therapie wird die aktive Verbindung in einer solchen pharmazeutischen Zusammensetzung für die orale Verabreichung gegeben, die die Verbindung vor Säuren Magenbereich, zum Beispiel durch einen Darmüberzug, schützt.
  • Die Konzentration der aktiven Verbindung in der Arzneimittelzusammensetzung hängt von der Absorption, der Inaktivierung und den Ausscheidungsraten des Arzneimittels ebenso wie von anderen Faktoren, die dem Fachmann bekannt sind, ab. Es sei angemerkt, daß, wenn die Verbindung zur Behandlung einer Krankheit verwendet wird, die Dosierungswerte in Abhängigkeit von der Schwere des Zustandes, der erleichtert werden soll, variieren können. Es ist weiterhin zu verstehen, daß für jede besondere Anwendung spezielle Dosierungsvorschriften über den Zeitraum gemäß des individuellen Bedarfs und der professionellen Beurteilung der Person, die verabreicht oder die Verabreichung der Verbindungungen überwacht wird, eingestellt werden sollten, und daß die Konzentrationsbereiche, die hier genannt werden, nur beispielhaft sind und es nicht beabsichtigt ist, den Umfang oder das Verfahren der beanspruchten Verbindungen einzuschränken. Der aktive Bestandteil kann sofort verabreicht werden oder kann in eine Anzahl kleinere Dosen eingeteilt werden, die in verschiedenen Zeitenintervallen verabreicht werden.
  • Orale Zusammensetzungen werden im allgemeinen ein inertes Lösungmittel oder einen eßbaren Träger einschließen. Sie können in Gelatinekapseln eingeschlossen oder zu Tabletten gepreßt sein. Für die Zwecke der oralen Verabreichung kann die aktive Verbindung in Excipiens eingebracht sein und in der Form von Tabletten, Pastillen oder Kapseln verwendet werden. Pharmazeutisch kompatible Bindemittel und/oder unterstützende Mittel können als Teil der Zusammensetzung eingeschlossen sein.
  • Die Tabletten, Pillen, Kapseln, Pastillen und dergleichen können jeden der folgenden Bestandteile oder Verbindungen ähnlicher Natur enthalten: ein Bindemittel, wie mikrokristalline Zellulose; Tragantgummi oder Gelatine; ein Excipiens, wie Stärke oder Lactose, ein Zerfallsmittel wie Alginsäure, Primogel oder Getreidestärke; ein Schmiermittel, wie Magnesiumstearat oder Sterotes; ein Gleitmittel, wie kolloidales Siliziumdioxid; ein Süßmittel, wie Saccharose oder Saccharin; oder ein Geschmacksmittel, wie Pfefferminz, Methylsalicylat oder Orangengeschmacksmittel. Wenn die Form der Dosierungseinheit eine Kapsel ist, kann sie zusätzlich zu dem Material des obigen Typs, einen flüssigen Trägerstoff, wie ein Fettöl enthalten. Zusätzlich können die Formen der Dosierungseinheiten verschiedene andere Materialien, die die physikalische Form der Dosierungseinheit modifizieren, zum Beispiel Überzüge aus Zucker, Schellack oder andere Darmmittel, enthalten.
  • Die aktive Verbindung oder ihr pharmazeutisch akzeptables Salz kann als eine Komponente eines Elixiers, einer Suspension, eines Sirups, einer Waffel, eines Kaugummis oder dergleichen verabreicht werden. Ein Sirup kann zusätzlich zu den aktiven Verbindungen Saccharose als Süßmittel und verschiedene Konservierungsmittel, Farbstoffe, Kolorationsmittel oder Geschmacksstoffe enthalten.
  • Die aktive Verbindung oder ihr pharmazeutisch akzeptables Salz kann auch mit anderen aktiven Materialien gemischt sein, die die gewünschte Wirkung nicht beeinträchtigen, oder mit Materialien, die die gewünschte Wirkung unterstützen, wie Antibiotika, Antipilzmittel, entzündungshemmende Mittel, oder andere antivirale, einschließlich anderer Nukleosid-Anti- HIV-Verbindungen.
  • Lösungen oder Suspensionen für parenterale, intradermale, subkutane oder topische Applikation können die folgenden Komponenten enthalten: eine steriles Lösungsmittel, wie Wasser für die Injektion, Salzlösung, fixierte Öle, Polyethylenglykole, Gycerin, Propylenglykol oder andere synthetische Lösungsmittel; antibakterielle Mittel; wie Benzylalkohol oder Methyl-4-Hydroxybenzoesäureester; antioxidierende Mittel, wie Ascorbinsäure oder Natriumbisulfit; Chelatbildner, wie Ethylendiamintetraessigsäure; Puffer, wie Acetate, Citrate oder Phosphate und Mittel zur Einstellung der Tonizität, wie Natriumchlorid oder Dextrose. Das parenterale Präparat kann in Ampullen, Einmalspritzen oder multiplen Dosierungskolben aus Glas oder Plastik eingeschlossen sein.
  • Wenn intravenös verabreicht wird, sind bevorzugte Träger physiologische Salze oder Phosphat-gepuffertes Salzlösung (PBS).
  • In einer bevorzugten Ausführungsform wird die aktive Verbindung mit einem Träger hergestellt, der die Verbindung gegen schnelle Eliminierung vom Körper schützt, wie eine Formulierung zur kontrollierten Freisetzung, einschließlich Implantaten oder Mikrokapselabgabesystemen. Bioabbaubare, bioverträgliche Polymere können verwendet werden, wie Ethylenvinylacetat, Polyanhydride, Polyglykolsäure, Kollagen, Polyorthoester und Polymilchsäure. Verfahren zur Herstellung dieser Formulierungen sind dem Fachmann bekannt. Die Materialien können im Handel von Alza Corporation und Scios-Nova Pharmaceuticals, Inc. erhalten werden.
  • Liposomale Suspensionen (einschließlich Liposome, die gegen infizierte Zellen mit monoklonalen Antikörpern gegen virale Antigene gerichtet sind) sind auch als pharmazeutisch akzeptable Träger bevorzugt. Diese können gemäß den für den Fachmann bekannten Verfahren hergestellt werden, zum Beispiel wie im US-Patent Nr. 4,522,811 beschrieben wird. Zum Beispiel können Liposomformulierungen durch Lösen geeigneter Lipide (wie Stearoylphosphatidylethanolamin, Stearoylphosphatidylcholin und -cholesterin) in einem anorganischen Lösungsmittel hergestellt werden, daß dann eingedampft wird und einen dünnen Film des getrockneten Lipids auf der Oberfläche des Gefäßes zurückläßt. Eine wässrige Lösung der aktiven Verbindung oder ihrer Monophosphat-, Diphosphat- und/oder Triphosphatderivate werden dann in das Gefäß eingebracht. Das Gefäß wird dann per Hand gedreht, um freies Lipidmaterial von den Seiten des Gefäße zu entfernen und die Lipidaggregate zu verteilen, wobei die liposomale Dispersion gebildet wird.
    • SEQUENZPROTOKOLL (1) ALLGEMEINE INFORMATION:
  • (i) ANMELDER: Schinazi, Raymond F. Fulcrand-El Kattan, Geraldine Lesnikowski, Zbigniew J.
  • (ii) BEZEICHNUNG DER ERFINDUNG: Nukleoside und Oligonukleotide, die Borcluster enthalten
  • (iii) ANZAHL DER SEQUENZEN: 18
  • (iv) BRIEFADRESSe:
  • (A) ADRESSAT: Cheryl K. Zalesky
  • (B) STRASSE: 1100 Peachtree Street
  • (C) ORT: Atlanta
  • (D) BUNDESLAND: Georgia
  • (E) LAND: USA
  • (F) POSTLEITZAHL: 30309-4530
  • (v) COMPUTERLESBARE FASSUNG:
  • (A) DATENTRÄGER: Floppydisk
  • (B) COMPUTER: IBM PC kompatibel
  • (C) BETRIEBSSYSTEM: PC-DOS/MS-DOS
  • (D) SOFTWARE: PatentIn Release #1,0, Version #1,25
  • (vi) DATEN DER JETZIGEN ANMELDUNG:
  • (A) ANMELDENUMMER:
  • (B) ANMELDETAG: 2. Dezember 1994
  • (C) KLASSIFIKATION:
  • (vii) ANGABEN ZUM VERTRETER:
  • (A) NAME: Cheryl K. Zalesky
  • (B) VERTRETERNUMMER: 33,052
  • (C) AKTENZEICHEN: E269/75773
  • (ix) TELEKOMMUNIKATION:
  • (A) Telefon: (404)-815-6439
  • (B) TELEFAX: 404)-815-6555
    • (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO:1:
  • (i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
  • (A) LÄNGE: 20 Basenpaare
  • (B) TYP: Nukleinsäure
  • (C) STRANGFORM: Einzelstrang
  • (D) TOPOLOGIE: linear
  • (ii) ART DES MOLEKÜLS: DNA (synthetisch)
  • (iii) HYPOTHETISCH: nein
  • (iv) ANTISENSE: ja
  • (ix) MERKMAL:
  • (A) NAME/SCHLÜSSEL: misc_Merkmal
  • (B) LAGE: 11
  • (C) SONSTIGE ANGABEN: /Funktion = "N = CDU"
  • (x) ANGABEN ZU PUBLIKATIONEN:
  • (A) AUTOREN: Schinazi, Raymond F. Lesnikowski, Zbigniew J.
  • (K) RELEVANTE RESTE IN SEQ ID NO: 1: von 1 bis 20
  • (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 1:
  • AATACATGGA NGATTTGTAT 20
    • (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 2:
  • (i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
  • (A) LÄNGE: 20 Basenpaare
  • (B) TYP: Nukleinsäure
  • (C) STRANGFORM: Einzelstrang
  • (D) TOPOLOGIE: linear
  • (ii) ART DES MOLEKÜLS: DNA (synthetisch)
  • (iii) HYPOTHETISCH: nein
  • (iv) ANTISENSE: ja
  • (ix) MERKMAL:
  • (A) NAME/SCHLÜSSEL: misc_Merkmal
  • (B) LAGE: 10..11
  • (C) SONSTIGE ANGABEN: /Funktion = "N = CDU"
  • (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 2:
  • AATACATGGN NGATTTGTAT 20
    • (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 3:
  • (i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
  • (A) LANGE: 20 Basenpaare
  • (B) TYP: Nukleinsäure
  • (C) STRANGFORM: Einzelstrang
  • (D) TOPOLOGIE: linear
  • (ii) ART DES MOLEKÜLS: DNA (genomisch)
  • (iii) HYPOTHETISCH: nein
  • (iv) ANTISENSE: nein
  • (xi) Sequenzbeschreibung: SEQ ID NO: 3:
  • ATACAAATCA TCCATGTATT 20
  • (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 4:
  • (i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
  • (A) LÄNGE: 20 Basenpaare
  • (B) TYP: Nukleinsäure
  • (C) STRANGFORM: Einzelstrang
  • (D) TOPOLOGIE: linear
  • (ii) ART DES MOLEKÜLS:, DNA (genomisch)
  • (iii) HYPOTHETISCH: nein
  • (iv) ANTISENSE: nein
  • (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 4:
  • ATACAAATCA ACCATGTATT 20
    • (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 5:
  • (i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
  • (A) LÄNGE: 20 Basenpaare
  • (B) TYP: Nukleinsäure
  • (C) STRANGFORM: Einzelstrang
  • (D) TOPOLOGIE: linear
  • (ii) ART DES MOLEKÜLS: DNA (synthetisch)
  • (iii) HYPOTHETISCH: nein
  • (iv) ANTISENSE: nein
  • (ix) MERKMAL:
  • (A) NAME/SCHLÜSSEL: misc_Merkmal
  • (B) LAGE: 1..19
  • (C) SONSTIGE ANGABEN: /Funktion = "N = CDU"
  • (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 5:
  • NACACCCAAT TCTGAAATNG 20
    • (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 6:
  • (i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
  • (A) LANGE: 20 Basenpaare
  • (B) TYP: Nukleinsäure
  • (C) STRANGFORM: Einzelstrang
  • (D) TOPOLOGIE: linear
  • (ii) ART DES MOLEKÜLS: DNA (genomisch)
  • (iii) HYPOTHETISCH: nein
  • (iv) ANTISENSE: nein
  • (x) Angaben zu Publikationen:
  • (A) AUTOREN: Shibahara S., et al.
  • (C) ZEITSCHRIFT: Nucleic Acid Research
  • (D) BAND: 17
  • (F) SEITEN: 239-240
  • (D) DATUM: 1989
  • (K) RELEVANTE RESTE IN SEQ ID NO 6: von 1 bis 20
  • (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 6:
  • GACACCCAAT TCTGAAATGG 20
    • (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 7:
  • (i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
  • (A) LANGE: 20 Basenpaare
  • (B) TYP: Nukleinsäure
  • (C) STRANGFORM: Einzelstrang
  • (D) TOPOLOGIE: linear
  • (ii) ART DES MOLEKÜLS: DNA (genomisch)
  • (iii) HYPOTHETISCH: nein
  • (iv) ANTISENSE: nein
  • (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 7:
  • GCACCCATCG ACGTCCAACC 20
    • (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 8:
  • (i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
  • (A) LÄNGE: 20 Basenpaare
  • (B) TYP: Nukleinsäure
  • (C) STRANGFORM: Einzelstrang
  • (D) TOPOLOGIE: linear
  • (ii) ART DES MOLEKÜLS: DNA (genomisch)
  • (iii) HYPOTHETISCH: nein
  • (iv) ANTISENSE: nein
  • (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 8:
  • CAATTTCAGA ATTGGGTGTA 20
    • (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 9:
  • (i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
  • (A) LÄNGE: 20 Basenpaare
  • (B) TYP: Nukleinsäure
  • (C) STRANGFORM: Einzelstrang
  • (D) TOPOLOGIE: linear
  • (ii) ART DES MOLEKÜLS: DNA (genomisch)
  • (iii) HYPOTHETISCH: nein
  • (iv) ANTISENSE: nein
  • (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 9:
  • CCATTTCAGA ATTGGGTGTC 20
    • (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 10:
  • (i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
  • (A) LÄNGE: 20 Basenpaare
  • (B) TYP: Nukleinsäure
  • (C) STRANGFORM: Einzelstrang
  • (D) TOPOLOGIE: linear
  • (ii) ART DES MOLEKÜLS: DNA (synthetisch)
  • (iii) HYPOTHETISCH: nein
  • (iv) ANTISENSE: nein
  • (ix) MERKMAL:
  • (A) NAME/SCHLÜSSEL: misc_Merkmal
  • (B) LAGE: 1..19
  • (C) SONSTIGE ANGABEN: /Funktion = "N = CDU"
  • (x) ANGABEN ZU PUBLIKATIONEN:
  • (A) AUTOREN: Marshall, W. S. Caruthers, M. H.
  • (C) ZEITSCHRIFT: Science
  • (D) BAND: 259
  • (F) SEITEN: 1564-1565
  • (D) DATUM: 1993
  • (K) RELEVANTE RESTE IN SEQ ID NO 10: von 1 bis 20
  • (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 10:
  • NCCCTGTTCG GGCGCCACNG 20
    • (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 11:
  • (i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
  • (A) LÄNGE: 20 Basenpaare
  • (B) TYP: Nukleinsäure
  • (C) STRANGFORM: Einzelstrang
  • (D) TOPOLOGIE: linear
  • (ii) ART DES MOLEKÜLS: DNA (genomisch)
  • (iii) HYPOTHETISCH: nein
  • (iv) ANTISENSE: nein
  • (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 11:
  • TCCCTGTTCG GGCGCCACTG 20
    • (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 12:
  • (i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
  • (A) LÄNGE: 20 Basenpaare
  • (B) TYP: Nukleinsäure
  • (C) STRANGFORM: Einzelstrang
  • (D) TOPOLOGIE: linear
  • (ii) ART DES MOLEKÜLS: DNA (genomisch)
  • (iii) HYPOTHETISCH: nein
  • (iv) ANTISENSE: nein
  • (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 12:
  • CAGTGGCGCC CGAACAGGGA 20
    • (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 13:
  • (i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
  • (A) LÄNGE: 22 Basenpaare
  • (B) TYP: Nukleinsäure
  • (C) STRANGFORM: Einzelstrang
  • (D) TOPOLOGIE: linear
  • (ii) ART DES MOLEKÜLS: DNA (genomisch)
  • (iii) HYPOTHETISCH: ja
  • (iv) ANTISENSE: nein
  • (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 13:
  • GGCGCTTGTG GAGAAGGAGT TC 22
    • (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 14:
  • (i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
  • (A) LANGE: 22 Basenpaare
  • (B) TYP: Nukleinsäure
  • (C) STRANGFORM: Einzelstrang
  • (D) TOPOLOGIE: linear
  • (ii) ART DES MOLEKÜLS: DNA (synthetisch)
  • (iii) HYPOTHETISCH: ja
  • (iv) ANTISENSE: nein
  • (ix) MERKMAL:
  • (A) NAME/SCHLÜSSEL: misc_Merkmal
  • (B) LAGE: 1..19
  • (C) SONSTIGE ANGABEN: /Funktion = "N = CDU"
  • (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 14:
  • NGCGCTTGTG GAGAAGGAGT NC 22
    • (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 15:
  • (i) SEQUENZCHAPAKTERISTIKA:
  • (A) LÄNGE: 23 Basenpaare
  • (B) TYP: Nukleinsäure
  • (C) STRANGFORM: Einzelstrang
  • (D) TOPOLOGIE: linear
  • (ii) ART DES MOLEKÜLS: DNA (genomisch)
  • (iii) HYPOTHETISCH: nein
  • (iv) ANTISENSE: nein
  • (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: 5EQ ID NO: 15:
  • TGAGATGCCG TCGAGGATGT ACC 23
    • (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 16:
  • (i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
  • (A) LÄNGE: 23 Hasenpaare
  • (B) TYP: Nukleinsäure
  • (C) STRANGFORM: Einzelstrang
  • (D) TOPOLOGIE: linear
  • (ii) ART DES MOLEKÜLS: DNA (synthetisch)
  • (iii) HYPOTHETISCH: nein
  • (iv) ANTISENSE: nein
  • (ix) MERKMAL:
  • (A) NAME/SCHLÜSSEL: misc_Merkmal
  • (B) LAGE: 1..19
  • (ix) MERKMAL:
  • (A) NAME/SCHLÜSSEL: misc_Merkmal
  • (B) LAGE: 1..19
  • (C) SONSTIGE ANGABEN: /Funktion = "N = CDU"
  • (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 16:
  • NGAGATGCCG TCGAGGATGT ANC 23
    • (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 17:
  • (i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
  • (A) LÄNGE: 19 Basenpaare
  • (B) TYP: Nukleinsäure
  • (C) STRANGFORM: Einzelstrang
  • (D) TOPOLOGIE: linear
  • (ii) ART DES MOLEKÜLS: DNA (genomisch)
  • (iii) HYPOTHETISCH: nein
  • (iv) ANTISENSE: nein
  • (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 17:
  • TGGACTGCAG GAACTCCTT 19
    • (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO: 18:
  • (i) SEQUENZCHARAKTERISTIKA:
  • (A) LANGE: 19 Basenpaare
  • (B) TYP: Nukleinsäure
  • (C) STRANGFORM: Einzelstrang
  • (D) TOPOLOGIE: linear
  • (ii) ART DES MOLEKÜLS: DNA (synthetisch)
  • (iii) HYPOTHETISCH: nein
  • (iv) ANTISENSE: nein
  • (ix) MERKMAL:
  • (A) NAME/SCHLÜSSEL: misc_Merkmal
  • (B) LAGE: 1..18
  • (C) SONSTIGE ANGABEN: /Funktion = "N = CDU"
  • (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 18:
  • NGGACTGCAG GAACTCCNT 19

Claims (21)

1. 2'-5' oder 3'-5' verbundenes Oligonukleotid, das wenigstens eine Carboranyl enthaltende Base der Formel:
enthält,
wobei C eine Carboranylgruppe ist, wie B&sub1;&sub0;H&sub1;&sub0;C&sub2;R&sub4;, wobei R&sub4; -H, -OH, -CH&sub2;OH, - CH&sub2;X, wobei X ein Halogen ist, oder -B&sub9;C&sub2;H(11 oder 12), ein nido-Carboran-Anion ist; R&sub5; ein gegebenenfalls substituiertes C&sub1; bis C&sup4;, gesättigtes, geradkettiges oder verzweigtes Alkyl ist, wobei gegebenenfalls substituiert bedeutet, wahlweise Substitution mit einem oder mehreren Teile ausgewählt aus Hydroxyl, Amino, Alkylamino, Arylamino, Alkoxy, Aryloxy, Nitro, Cyano, Sulfonsäure, Sulfat, Phosphorsäure, Phosphat oder Phosphonat, entweder geschützt oder ungeschützt, wobei der Ausdruck Alkylamino bedeutet, daß eine Aminogruppe mit einem oder zwei Alkylsubstituenten substituiert ist, und der Ausdruck Arylamino bedeutet, daß ein Aminogruppe mit einem oder zwei Arylsubstituenten substituiert ist, wobei Alkyl eine C&sub1;&submin;&sub1;&sub0;-Alkylgruppe bedeutet, die gegebenenfalls, wie hier definiert, substituiert ist und wobei Aryl eine Phenyl-, Biphenyl- oder Naphthylgruppe bedeutet, alle gegebenenfalls, wie hier definiert, substituiert;
G N oder CH ist;
M O oder S ist; und
z 0 bis 5 ist.
2. Oligonukleotid nach Anspruch 1, bei dem eine Carboranyl-enthaltende Base am 3'- terminalen Nukleosid lokalisiert ist:
3. Oligonukleotid nach Anspruch 1, bei dem eine Carboranyl-enthaltende Base am 5'- terminalen Nukleosid lokalisiert ist.
4. Oligonukleotid nach Anspruch 1, bei dem eine Carboranyl-enthaltende Base in dem Nukleosid benachbart dem 3'-terminalen Nukleosid lokalisiert ist.
5. Oligonukleotid nach Anspruch 1, bei dem eine Carboranyl-enthaltende Base in dem Nukleosid benachbart dem 5'-terminalen Nukleosid ist.
6. Oligonukleotid nach irgendeinem der vorherigen Ansprüche, wobei R&sub5; ein nicht substituierter C&sub1; bis C&sub4; gesättigte, geradkettige oder verzweigte Alkylgruppe ist.
7. Oligonukleotid nach irgendeinem der vorherigen Ansprüche, das 35 oder weniger Nukleotide aufweist, die über ihre 3'- und 5' Hydroxyl- oder 2'- und 5'- Hydroxylgruppen verbunden sind.
8. Zusammensetzung, die das Oligonukleotid nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 7 in einem pharmazeutisch akzeptablen Träger umfaßt.
9. Zusammensetzung nach Anspruch 8, bei der der Träger für die intravenöse Verabreichung geeignet ist.
10. Zusammensetzung nach Anspruch 8, bei der der Träger das Oligonukleotid gegenüber Abbau in einer sauren Umgebung schützt.
11. Oligonukleotid nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 7 für die Verwendung in der Medizin.
12. Verwendung eines Oligonukleotids nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 7 zur Herstellung eines Medikaments für die Durchführung der Bor-Neutronen-Einfang- Therapie, bei einem Patienten der diese benötigt.
13. In vitro Verfahren zur Induktion einer Mutation in einem viralen, eukaryontischen oder prokaryontischen Genom umfassend den Schritt des Einfügens eines Carboranyl enthaltenden Oligonukleotids nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 7 in eine Zelle, bei dem das Oligonukleotid mit einer Nukleinsäuresequenz in einer Weise hybridisiert, daß eine Mutation während der Transkription oder Zellteilung bewirkt wird.
14. Verfahren nach Anspruch 13, bei dem die Mutation in einem viralen Genom induziert wird.
15. Verfahren nach Anspruch 13, bei dem die Mutation in einem eukaryontischen Genom induziert wird.
16. Verfahren nach Anspruch 14, bei dem das Virus HTV ist.
17. Verfahren nach Anspruch 14, bei dem das Virus HBV ist.
18. Verwendung eines Carboranyl enthaltenden Oligonukleotids nach einem der Ansprüche 1 bis 7, das selektiv in einem Tumorgewebe akkumuliert, zur Herstellung eines Mittels zum Nachweis der Anwesenheit oder des Ortes von Tumoren in einem Patienten mittels Kernspinresonanztomographie.
19. In vitro Verfahren zum Nachweis einer Zielnukleinsäuresequenz, umfassend Hybridisierung eines Carboranyl enthaltenden Oligonukleotids gemäß einem der Ansprüche. 1 bis 7 mit der Zielsequenz und Nachweis des Hybrids.
20. Verwendung eines Carboranyl enthaltenden Oligonukleotids gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7 für die Herstellung eines Mittels zur Induktion einer Mutation in einem viralen, eukaryontischen oder prokaryontischen Genoms durch Insertion des Oligonukleotids in eine Zelle, bei der das Oligonukleotid mit einer Nukleinsäuresequenz in einer Weise hybridisiert, daß eine Mutation während der Transkription oder Zellteilung bewirkt wird.
21. Verwendung eines Carboranyl-enthaltenden Oligonukleotids gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7 für die Herstellung eines Mittels zum Nachweis einer Zielnukleinsäuresequenz durch Hybridisierung des Oligonukleotids mit der Zielsequenz und Nachweis des Hybrids.
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