ITMI20061474A1

ITMI20061474A1 - Derivati della camptotecina ad attivita antitumorale

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Publication number: ITMI20061474A1
Application number: IT001474A
Authority: IT
Original assignee: Indena Spa
Priority date: 2006-07-26
Filing date: 2006-07-26
Publication date: 2008-01-27
Also published as: KR20090032100A; BRPI0714672B8; WO2008012003A1; US8193210B2; KR101496374B1; SI2044080T1; PL2044080T3; PT2044080T; RU2009102241A; NO20090252L; AU2007278509B2; CA2658902A1; NO342506B1; IL196652A0; DK2044080T3; CN101495485A; US20100010032A1; RU2450007C2; JP5313895B2; BRPI0714672B1

Description

- 2 - Bianchetti Bracco Minoja s.r.l.

Bianchetti Giuseppe ed altri 7779 M Descrizione del brevetto per invenzione industriale avente per titolo:

PB/mc “DERIVATI DELLA CAMPTOTECINA AD ATTIVITÀ ANTITUMORALE”

a nome : INDENA S.p.A.

con sede in: Milano

* * *

La presente invenzione riguarda nuovi derivati della camptotecina aventi attività antitumorale, metodi per la loro preparazione, il loro uso come farmaci antitumorali e composizioni farmaceutiche che li contengono.

Background dell’invenzione

La camptotecina è un alcaloide estratto dalla Camptotheca acuminata (Nyssaceae), descritto per la prima volta da Wall e Wani nel 1966 (J. Am. Chem. Soc. 1966, 88, 3888-3890). Benché dotata di un ampio spettro di attività antitumorale, in particolare contro il tumore del colon e altri tumori solidi e leucemie, la camptotecina non viene utilizzata in terapia a causa della elevata tossicità, che si manifesta specialmente come cistite emorragica, tossicità gastrointestinale e mielosoppressione.

Sono stati sintetizzati molti analoghi della camptotecina al fine di ottenere composti con bassa tossicità ed elevata solubilità. Attualmente sono due i farmaci usati in pratica clinica, CPT-11 e topotecan. Altri derivati sono a diversi stadi dello studio clinico quali belotecan, rubitecan, exatecan, gimatecan, pegamotecan, lurtotecan, karenitecin, afeletecan, homocamptothecin, diflomotecan, e molti altri. Il composto CPT-11 è un pro-drug altamente solubile della 10-idrossi-7-etilcamptotecina, comunemente nota come SN-38, approvato per il trattamento di molti tumori solidi e asciti - 3 - Bianchetti Bracco Minoja s.r.l.

Bianchetti Giuseppe ed altri (colon-retto, pelle, stomaco, polmone, cervice, ovaio, linfoma non-Hodgkin).

Il topotecan è un composto solubile in soluzione fisiologica attivo contro il tumore del polmone, ovaio, mammella, stomaco, fegato, prostata, sarcoma dei tessuti molli, testa e collo, esofago, retto, glioblastoma, leucemie mielocitiche croniche e acute. Tuttavia, anche in questo caso gli effetti collaterali come neutropenia e trombocitopenia sono importanti.

Il lurtotecan è il derivato più solubile, con una attività in vitro comparabile a quella del topotecan. In studi clinici sono stati osservate risposte in pazienti sofferenti di tumore del collo, ovaio, mammella, colorettale, e microcitoma polmonare. Anche in questo caso, tuttavia, si riscontra tossicità ematica.

Il rubitecan è un prodrug per uso orale efficace contro il tumore del pancreas, dell’ovaio e della mammella.

La camptotecina e i suoi analoghi sono inibitori della topoisomerasi I. L’interesse verso gli inibitori della topoisomerasi I è legato ai seguenti fattori: a) efficacia contro tumori naturalmente resistenti a farmaci convenzionali, inclusi gli inibitori della topoisomerasi II; b) i livelli di topoisomerasi rimangono elevati in tutte le fasi del ciclo cellulare; c) molti tumori esprimono livelli elevati di topoisomerasi; d) assenza del fenomeno della multi-drug resistance (Pgo o MRP) e assenza di metabolismo di detossificazione enzima-mediato, associato al sistema glutatione-dipendente (glutatione perossidasi e glutatione S-transferasi) (Gerrits CJH, et al., Brit. J. Cancer 76, 952-962). La ricerca attuale mira a identificare nuovi inibitori della topoisomerasi I con bassa tossicità rispetto a quella dimostrata dai farmaci sul mercato o in fase clinica.

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Bianchetti Giuseppe ed altri I fattori determinanti la potenza relativa degli analoghi delle camptotecine includono: a) attività intrinseca di inibizione della topoisomerasi I; b) vita media del farmaco; c) interazione con le proteine plasmatiche; rapporto tra la forma lattonica e la forma idrossi carbossilica circolanti; d) sensibilità del farmaco relativa ai meccanismi di outflow mediati dalla glicoproteina P o MRP; e) stabilità del complesso ternario DNA-Topoisomerasi I-farmaco.

I derivati della camptotecina con lattone aperto mostrano elevato binding proteico (in particolare con albumina) e bassa distribuzione nei tessuti tumorali. L’effetto che ne consegue è un accumulo di prodotto nell’organismo e bassa esposizione dei tumori.

L’alta lipofilia associata alla forma lattonica favorisce l’adesione dei derivati della camptotecina alle membrane cellulari, specie ai globuli rossi, alterando il rapporto di distribuzione tessuto/plasma e favorendo da ultimo l’esposizione dei tumori al principio attivo.

Per questo motivo, la ricerca sui derivati della camptotecina si è orientata negli ultimi anni verso due strategie alternative: a) disegno di prodotti a basso protein binding e comunque dotati di buona solubilità; b) prodotti ad elevata potenza che avessero potere curativo anche a dosi bassissime.

È stato dimostrato che le modifiche nelle posizioni 7, 9, 10 e 11 sono in genere tollerate e non alterano la stabilità del complesso ternario DNA-Topoisomerasi I-camptotecina, la cui formazione è responsabile della attività antitumorale dei composti.

Prodotti con configurazione 20R sono risultati inattivi, o molto meno - 5 - Bianchetti Bracco Minoja s.r.l.

Bianchetti Giuseppe ed altri attivi rispetto ai prodotti con configurazione 20S - coincidente con la configurazione naturale.

Le modifiche in posizione 5 con gruppi uscenti dal piano della molecola sono in genere state considerate sfavorevoli alla formazione del complesso ternario, mentre le modifiche all’anello piridonico D ed E sono state descritte deleterie per l’attività del prodotto (Masamichi Sugimori, Heteroc. 1994, 38(1), 81-94; Damri Subramanyan, Bioorg. & Med Chem.

1999 (7) 2013-2020; Bioorg. & Med Chem. Lett. 1999 (9) 1633-1638 e 2000(10), 368-371).

Descrizione dell’invenzione

In un primo aspetto, l’invenzione riguarda derivati della camptotecina di formula generale I:

R2 R1 R

R3 O

N

O

OHO

(I)

dove:

R rappresenta F, Cl, Br, I, -N3, NH2, -NR’R’’, -COOR’, -CONR’R’’, -NHR’’’-NR’R’’ in cui R’, R’’ e R’’’ possono essere H, alchile, arile, arilalchile, acile, alcossicarbonile, arilossicarbonile

R1 rappresenta alchile, aminoalchile, idrossialchile, nitrile, alcossimmino, arilossimmino, sililalchile;

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Bianchetti Giuseppe ed altri R2 rappresenta idrogeno, idrossile, alcossile, aminoalchile;

R3 rappresenta idrogeno, idrossile eventualmente protetto, alcossile, aminoalchile;

dove i gruppi alchile, acile, alcossile, aminoalchile o alcossimmino possono contenere da 1 a 8, preferibilmente da 1 a 4 atomi di carbonio, in catena lineare o ramificata, mentre i gruppi arile e arilossi possono contenere da 5 a 10 atomi di carbonio;

i loro sali farmaceuticamente accettabili, isomeri, enantiomeri, diastereoisomeri e le relative miscele.

I composti dell’invenzione mostrano basso legame proteico e sono dotati di buona solubilità ed elevata potenza anche a dosi bassissime.

Il metodo preferito per la preparazione dei composti è illustrato nello Schema e comprende i seguenti passaggi:

a) protezione dei gruppi ossidrilici del precursore

b) derivatizzazione in 5 attraverso formazione di un carbanione e reazione con un elettrofilo

c) deprotezione dei gruppi ossidrilici

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Bianchetti Giuseppe ed altri R2 R1 R2 R1

R3 O R3 O

N N

a) b) N N O O

<HO>OO O

PG

<R2 R1>R

R3<R2 R1>

OR

R3

N c) O

N N

N O O O O PG H O O

Nello Schema i gruppi R, R1, R2 e R3 hanno il significato sopra descritto, PG rappresenta un gruppo protettore del gruppo OH.

I precursori possono essere reperiti in commercio od ottenuti come descritto in letteratura.

La formazione del carbanione in 5 può essere ottenuta trattando il precursore con una base organica forte, preferibilmente LiHMDS.

Il carbanione viene fatto reagire in situ con un reagente elettrofilo quale una fonte di alogeno o azadicarbossilato, isocianato, clorocarbonil derivato, tosilazide.

Quali gruppi proteggenti gli ossidrili sono preferiti i silili e i carbammati o una loro combinazione.

I composti dell’invenzione sono stati testati in un saggio di citotossicità su un ampio spettro di cellule tumorali. Si riportano a titolo esemplificativo i dati di citotossicità sulla linea NCI-H460 (NSCL cancer) relativi a due composti di formula (I), prendendo a riferimento la camptotecina e i farmaci Topotecan e Irinotecan:

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Bianchetti Giuseppe ed altri NCI-H460 Nome Formula IC50 (µg/mL)

Cellular count

O

N

Camptotecina O 0,115 ± 0,0174

FW =348.36<H O>O

N

H O O

Topotecan N

N 0,63 ± 0,44

O

FW = 421 H O

C23H23N3O5 O

H O O

N

SN38 N 0,0865 ± 0,0049

O

FW =392.42 H O

<C22H20N2O5>O

F

O

N<Isomero 1:>5-F-camptotecina<N>20.6±6.8

O

H O Isomero 2: F W = 366 O 20±5.1<C 20 H 15 F N 2 O 4>

N3

O

N Isomero 1:

5-N3- N 4.18±1,2

camptotecina O Isomero 2:

FW = 389 H O

C20H15N5O 4 2,59±0,7

O

<O O>

5-di-O

O

<N N>

tertbutossicarbonHIsomero 1:

O

ilidrazinocamptot N 50±16 ecina<N>Isomero 2: >100

O

FW = 578.63 H O

<C30H34N4O8>O

NH2

O

5-NH2- N

camptotecina N 11 ± 3,1

O

FW =363.38 H O

<C20H17N3O4>O

O<O>O

5-di- O

<N N>Isomero 1: benzilossicarboniH

O 55±15 lidrazinocamptot N Isomero 2:

ecina<N>

O 39±9.7 FW =646.66 H O

C36H30N4O8

O

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Bianchetti Giuseppe ed altri I composti più attivi sono stati valutati in un saggio di “cleavage” del DNA misurando la concentrazione attiva e la persistenza del danno (si veda la sezione ‘Esempi’). Sorprendentemente i derivati di formula (I), rispetto agli standard di riferimento (in particolare topotecan e camptotecina), mostrano una maggior persistenza nel bloccare la replicazione del DNA mantenendo al contempo un’efficace attività citotossica.

In un altro aspetto, l’invenzione riguarda composizioni farmaceutiche contenenti un composto di formula (I) insieme a veicoli ed eccipienti farmaceuticamente accettabili. Le forme farmaceutiche idonee alla somministrazione orale o parenterale dei composti (I) possono essere solide, preferibilmente capsule, compresse e granuli, o liquide, preferibilmente soluzioni iniettabili e per infusione.

I composti dell’invenzione, opportunamente formulati, possono essere utilizzati per il trattamento di tumori solidi e leucemie, in particolare tumori del polmone, ovaio, mammella, stomaco, fegato, prostata, sarcoma dei tessuti molli, testa e collo, esofago, pancreas, colon, retto, glioblastoma, leucemie mielocitiche croniche e acute.

ESEMPI ESEMPIO I - 20-OTES-camptotecina

Camptotecina (0,100 g, 0,287 mmol), viene sospesa in dimetil formammide anidra (3 mL), in atmosfera inerte e alla risultante sospensione si aggiunge imidazolo (0,980 g, 1,44 mmol). La miscela è agitata per 10’ minuti, successivamente viene gocciolato il trietilsilil cloruro, (TES-Cl), (0,193 mL, 1,15 mmol), seguita dall’aggiunta di 4-dimetilammino piridina, (DMAP), (0,040 g, 0,287 mmol). Dopo 46 h la miscela di reazione viene evaporata sotto - 10 - Bianchetti Bracco Minoja s.r.l.

Bianchetti Giuseppe ed altri vuoto, (si segue mediante TLC la scomparsa completa del reagente, eluente CH2Cl2/MeOH = 30/1). Il solido viene successivamente ridisciolto con CH2Cl2e lavato con H2O e NH4Cl saturo. La fase acquosa viene estratta con CH2Cl2(2 X 10 mL). Le fasi organiche vengono riunite e anidrificate con Na2SO4, si filtra e si concentra sotto vuoto. Si ottengono (0,133 g, 0,287 mmol) di prodotto desiderato. Solido giallo pallido.

<1>H NMR (CDCl3, 400 MHz) δ 8.37 (s, 1 H, Ar, H-7), 8.25 (d, 1 H, J = 8.4 Hz, Ar), 7.92 (d, 1 H, J = 8.0 Hz, Ar), 7.82 (t, 1 H, J = 8.0 Hz, Ar), 7.65 (t, 1 H, J = 8.4 Hz, Ar), 7.57 (s, 1 H, H-14), 5.67 (d, 1 H, J = 16.4 Hz, H-17), 5.29 (s, 2 H, H-5), 5.25 (d, 1 H, J = 16.4 Hz, H-17), 2.00-1.84 (m, 2 H, H-19), 1.03-0.93 (m, 12 H), 0.80-0.71 (m, 6 H).<13>C NMR (CDCl3, 100 MHz) δ 171.7, 157.6, 152.5, 151.5, 149.0, 145.9, 130.9, 130.4, 130.0, 128.4, 128.1, 128.0, 127.9, 118.9, 94.4, 75.3, 66.0, 50.0, 33.2, 7.9, 7.2, 6.4.

ESEMPIO II - 20-OTES SN-38

SN-38 (0,100 g, 0,255 mmol), viene sospeso in dimetil formammide anidra (5 mL), in atmosfera inerte e alla risultate sospensione si aggiunge imidazolo (0,087 g, 1,28 mmol). La miscela è agitata per 10’ minuti, successivamente viene gocciolato il trietilsilil cloruro, (TES-Cl), (0,171 mL, 1,02 mmol), seguita dall’aggiunta di 4-dimetilammino piridina, (DMAP), (0,031 g 0,255 mmol). Dopo 52 h la miscela di reazione viene evaporata sotto vuoto, si segue mediante TLC (CH2Cl2/MeOH = 10/1) la scomparsa completa del reagente. Il solido viene successivamente ridisciolto con CH2Cl2e lavato con H2O e NH4Cl saturo. La fase acquosa viene estratta con CH2Cl2(2 X 10 mL). Le fasi organiche vengono riunite e anidrificate con Na2SO4, si filtra e si concentra sotto vuoto. Si ottengono (0,121 g, 0,240 mmol, 94%) di prodotto - 11 - Bianchetti Bracco Minoja s.r.l.

Bianchetti Giuseppe ed altri desiderato. Solido giallo pallido.

<1>H NMR (CDCl3, 400 MHz) δ 9.26 (br s, 1 H,OH), 8.14 (d, 1 H, J = 9.2 Hz, Ar, H-12), 7.58 (s, 1 H, H-14), 7.49 (dd, 1 H, J1= 9.2 Hz J2= 2.2 Hz, H-11), 7.46 (d, 1 H, J = 2.2 Hz, H-9), 5.70 (d, 1 H, J = 16.5 Hz, H-17), 5.28 (d, 1 H, J = 16.5 Hz, H-17), 5.23 (s, 2 H, H-5), 3.05 (q, 2 H, J = 7.5 Hz), 1.97-1.81 (m, 2 H, H-19), 1.32 (t, 3 H, J = 7.5 Hz, Me), 0.98-0.88 (m, 12 H), 0.77-0.68 (m, 6 H).<13>C NMR (CDCl3, 100 MHz) δ 172.1, 157.9, 156.6, 152.1, 149.0, 146.7, 144.6, 143.6, 131.9, 128.7, 126.9, 122.8, 117.9, 105.5, 98.5, 75.4, 65.9, 49.5, 32.9, 23.2, 13.5, 7.8, 7.2, 6.4.

ESEMPIO III - 10-OTBDMS-20-OTES SN-38

20-OTES SN-38 (0,121 g, 0,240 mmol), viene sciolto con una miscela anidra di CH2Cl2/THF = 1:1 (8 mL) e in atmosfera inerte. Si aggiunge imidazolo (0,081 g, 1,20 mmol) e dopo 10’ minuti, viene addizionato il<t>butildimetilsilil cloruro, (TBDMS-Cl), (0,144 mg, 0,957 mmol), seguita dall’aggiunta di 4-dimetilammino piridina, (DMAP), (0,029 g, 0,240 mmol). Dopo 18 h la miscela di reazione viene evaporata sotto vuoto, si segue mediante TLC (Esano/AcOEt = 1/1) la scomparsa del reagente. Il solido viene successivamente ridisciolto con CH2Cl2e lavato H2O e NH4Cl saturo. La fase acquosa viene estratta con CH2Cl2(2 X 10 mL) e le fasi organiche vengono riunite ed anidrificate con Na2SO4. Si filtra e si concentra sotto vuoto. Il residuo viene purificato mediante cromatografia flash (SiO2, Esano/AcOEt = 1/1). Si ottengono (0,127 g, 0,205 mmol, 85%) di prodotto desiderato. Solido giallo pallido.

<1>H NMR (CDCl3, 400 MHz) δ 8.14 (d, 1 H, J = 8.8 Hz, Ar, H-12), 7.49 (s, 1 H, H-14), 7.40 (d, 1 H, J = 2.2 Hz, H-9), 7.38 (dd, 1 H, J1= 8.8 Hz J2= - 12 - Bianchetti Bracco Minoja s.r.l.

Bianchetti Giuseppe ed altri 2.5 Hz, H-11), 5.67 (d, 1 H, J = 16.5 Hz, H-17), 5.25 (d, 1 H, J = 16.5 Hz, H-17), 5.23 (s, 2 H, H-5), 3.11 (q, 2 H, J = 7.6 Hz), 1.99-1.82 (m, 2 H, H-19), 1.38 (t, 3 H, J = 7.6 Hz, Me), 1.04 (s, 9 H), 1.00-0.92 (m, 12 H), 0.78-0.69 (m, 6 H), 0.30 (s, 6 H).<13>C NMR (CDCl3, 100 MHz) δ 171.9, 157.7, 155.1, 151.5, 150.1, 146.8, 145.6, 143.5, 132.2, 128.2, 126.9, 125.9, 118.0, 110.5, 97.7, 75.4, 66.0, 49.3, 33.2, 25.6, 23.1, 18.3, 13.7, 7.9, 7.2, 6.4, -4.3.

ESEMPIO IV - 20-OTES Topotecan

Topotecan (0,100 g, 0,238 mmol), viene sospeso in dimetil formammide anidra (5 mL), in atmosfera inerte e alla risultate sospensione si aggiunge imidazolo (0,081 g, 1,19 mmol). La miscela è agitata per 10’ minuti, successivamente viene gocciolato il trietil silil cloruro, (TES-Cl), (0,160 mL, 0,952 mmol), seguita dall’aggiunta di 4-dimetil ammino piridina, (DMAP), (0,029 g, 0,238 mmol). Dopo 52 h la miscela di reazione viene evaporata sotto vuoto, si segue mediante TLC (CH2Cl2/MeOH = 10/1) la scomparsa completa del reagente. Il solido viene successivamente ridisciolto con CHCl3e H2O e NH4Cl saturo, la fase acquosa viene estratta con CHCl3(2 X 15 mL). Le fasi organiche vengono riunite e anidrificate con Na2SO4, si filtra e si concentra sotto vuoto. Si ottengono (0,120 g, 0,224 mmol, 94%) di prodotto desiderato. Solido giallo pallido.

<1>H NMR (CDCl3, 400 MHz) δ 9.65 (br s, 1 Η, ΟH), 8.26 (s, 1 H, Ar, H-7), 8.14 (d, 1 H, J = 8.8 Hz, Ar, H-12), 7.80 (d, 1 H, J = 8.8 Hz, Ar, H-11), 7.58 (s, 1 H, H-14), 5.67 (d, 1 H, J = 16.5 Hz, H-17), 5.25 (d, 1 H, J = 16.5 Hz, H-17), 5.20 (s, 2 H, H-5), 4.71 (s, 2 H), 2.81 (s, 6 H, 2 Me), 1.97-1.81 (m, 2 H, H-19), 0.98-0.88 (m, 12 H), 0.77-0.68 (m, 6 H).<13>C NMR (CDCl3, 100 MHz) δ 172.1, 157.9, 156.6, 152.1, 150.8, 146.8, 144.3, 134.3, 131.2 129.9, - 13 - Bianchetti Bracco Minoja s.r.l.

Bianchetti Giuseppe ed altri 127.9, 123.0, 118.9, 110.1, 98.5, 75.4, 65.9, 51.1, 50.0, 43.1, 32.9, 7.8, 7.2, 6.4.

ESEMPIO V - 10-OTBDMS 20-OTES Topotecan

20-OTES Topotecan (0,120 g, 0,224 mmmol), viene sciolto con una miscela anidra di CH2Cl2/THF = 1:1 (8 mL) e in atmosfera inerte. Si aggiunge imidazolo (0,076 g, 1,12 mmol) e dopo 10’ minuti, viene addizionato il<t>Butil dimetil silil cloruro, (TBDMS-Cl), (0,135 mg, 0,896 mmol), seguita dall’aggiunta di 4-dimetil ammino piridina, (DMAP), (0,027 g 0,224 mmol). Dopo 21 h la miscela di reazione viene evaporata sotto vuoto, si segue mediante TLC (Esano/AcOEt = 1/1) la scomparsa del reagente. Il solido viene successivamente ridisciolto con CHCl3e H2O e NH4Cl saturo, la fase acquosa viene estratta con CHCl3(2 X 15 mL). Le fasi organiche vengono riunite e anidrificate con Na2SO4, si filtra e si concentra sotto vuoto. Il residuo viene purificato mediante cromatografia flash (SiO2, Esano/AcOEt = 1/1). Si ottengono (0,116 g, 0,179 mmol, 80%) di prodotto desiderato. Solido giallo pallido.

<1>H NMR (CDCl3, 400 MHz) δ 8.26 (s, 1 H, Ar, H-7), 8.14 (d, 1 H, J = 8.8 Hz, Ar, H-12), 7.81 (d, 1 H, J = 8.8 Hz, Ar, H-11), 7.59 (s, 1 H, H-14), 5.64 (d, 1 H, J = 16.5 Hz, H-17), 5.22 (d, 1 H, J = 16.5 Hz, H-17), 5.19 (s, 2 H, H-5), 4.71 (s, 2 H), 2.81 (s, 6 H, 2 Me), 1.97-1.81 (m, 2 H, H-19), 1.04 (s, 9 H), 0.98-0.88 (m, 12 H), 0.77-0.68 (m, 6 H), 0.30 (s, 6 H).<13>C NMR (CDCl3, 100 MHz) δ 171.7, 157.7, 155.1, 151.5, 150.0, 146.8, 144.3, 134.3, 131.2 129.9, 127.9, 123.0, 118.9, 110.1, 98.5, 75.4, 65.9, 51.1, 50.0, 43.9, 32.9, 25.6, 18.3, 7.8, 7.2, 6.4, -4.3.

ESEMPIO VI - Sintesi della 20-OTES 10-idrossicamptotecina 10-idrossicamptotecina (0,100 g, 0,275 mmol), viene sospesa in dimetil - 14 - Bianchetti Bracco Minoja s.r.l.

Bianchetti Giuseppe ed altri formammide anidra (5 mL), in atmosfera inerte e alla risultate sospensione si aggiunge imidazolo (0,225 g, 3.31 mmol). La miscela è agitata per 10’ minuti, successivamente viene gocciolato il trietilsilil cloruro, (TES-Cl), (0,460 mL, 2.75 mmol), seguita dall’aggiunta di 4-dimetilammino piridina, (DMAP), (0,068 g, 0,550 mmol). Dopo 24 h la miscela di reazione viene evaporata sotto vuoto, si segue la scomparsa completa del reagente mediante TLC (CH2Cl2/MeOH = 20/1). Il solido viene successivamente ridisciolto con CH2Cl2e lavato con H2O e NH4Cl saturo. La fase acquosa viene estratta con CH2Cl2(2 X 10 mL). Le fasi organiche vengono riunite e anidrificate con Na2SO4. Si filtra e si concentra sotto vuoto. Si ottengono (0,124 g, 0,259 mmol, 94%) di prodotto desiderato. Solido giallo pallido.

<1>H NMR (CDCl3+ 5% CD3OD, 400 MHz) δ 8.10 (s, 1 H, Ar, H-7), 8.05 (d, 1 H, J = 9.2 Hz, Ar), 7.50 (s, 1 H, H-14), 7.39 (dd, 1 H, J1= 9.2 Hz J2= 2.4 Hz, H-11), 7.11 (d, 1 H, J = 2.2 Hz, H-9), 5.60 (d, 1 H, J = 16.4 Hz, H-17), 5.21 (d, 1 H, J = 16.4 Hz, H-17), 5.15 (s, 2 H, H-5), 1.97-1.81 (m, 2 H, H-19), 0.98-0.88 (m, 12 H), 0.76-0.68 (m, 6 H).<13>C NMR (CDCl3+ 5% CD3OD, 100 MHz) δ 172.2, 157.8, 156.7, 151.8, 149.2, 146.1, 144.1, 130.9, 129.8, 129.0, 128.6, 123.2, 117.8, 108.8, 98.1, 75.4, 65.8, 50.0, 32.9, 7.7, 7.1, 6.3.

ESEMPIO VII - 10-OTBDMS-20-OTES Camptotecina

10-idrossi-20-OTES-Camptotecina (0,105 g, 0,219 mmol), viene sciolta con una miscela anidra di CH2Cl2/THF = 1:1 (4 mL) e in atmosfera inerte. Si aggiunge imidazolo (0,097 g, 1,42 mmol) e dopo 10’ minuti, viene addizionato il<t>Butildimetilsilil cloruro, (TBDMS-Cl), (0,164 mg, 1,10 mmol), seguita dall’aggiunta di 4-dimetilammino piridina, (DMAP), (0,040 g - 15 - Bianchetti Bracco Minoja s.r.l.

Bianchetti Giuseppe ed altri 0,329 mmol). Dopo 18 h la miscela di reazione viene evaporata sotto vuoto, si segue la scomparsa del reagente mediante TLC (Cicloesano/AcOEt = 1/3). Il solido viene successivamente ridisciolto con CH2Cl2e lavato con H2O e NH4Cl saturo, la fase acquosa viene estratta con CH2Cl2(2 X 10 mL). Le fasi organiche vengono riunite e anidrificate con Na2SO4. Si filtra e si concentra sotto vuoto. Il residuo viene purificato mediante cromatografia flash (SiO2, Cicloesano/AcOEt = 1/3). Si ottengono (0,117 g, 0,197 mmol, 90%) di prodotto desiderato. Solido giallo pallido.

<1>H NMR (CDCl3, 400 MHz) δ 8.22 (s, 1H, Ar, H-7), 8.13 (d, 1 H, J = 9.2 Hz, Ar, H-12), 7.51 (s, 1 H, H-14), 7.39 (dd, 1 H, J1= 9.2 Hz J2= 2.8 Hz, H-11), 7.22 (d, 1 H, J = 2.8 Hz, H-9), 5.66 (d, 1 H, J = 16.5 Hz, H-17), 5.25 (s, 2 H, H-5), 5.24 (d, 1 H, J = 16.5 Hz, H-17), 1.99-1.82 (m, 2 H, H-19), 1.03 (s, 9 H), 1.00-0.92 (m, 12 H), 0.78-0.69 (m, 6 H), 0.29 (s, 6 H).<13>C NMR (CDCl3, 100 MHz) δ 172.0, 157.7, 155.1, 151.5, 150.6, 146.1, 145.1, 131.4, 129.4, 129.3, 128.7, 126.7, 118.3, 114.5, 97.7, 75.3, 66.0, 49.9, 33.1, 25.6, 18.3, 7.9, 7.2, 6.4, -4.3.

ESEMPIO VIII - 5-F-20-OTES-camptotecina

Camptotecina 20-OTES (0,100 g, 0,216 mmol) viene sciolta in THF anidro (6 mL) sotto agitazione e in atmosfera inerte, successivamente si porta la temperatura a -78°C e si gocciola LiHMDS soluzione 1,0 M in THF (0,260 mL, 0,260 mmol). Dopo 20’ si introduce NFSI (0,089 g, 0,281 mmol) in THF anidro (2 mL). Dopo 2 h a -78°C si lascia salire la temperatura a 25°C e si controlla la scomparsa del reagente mediante TLC (Esano/AcOEt = 1/2). Si nota la formazione di due diastereoisomeri e dopo 3 h a temperatura ambiente si spegne la reazione aggiungendo NH4Cl saturo. La fase acquosa - 16 - Bianchetti Bracco Minoja s.r.l.

Bianchetti Giuseppe ed altri viene estratta con CH2Cl2(3 x 15 mL) e le fasi organiche vengono riunite e anidrificate con Na2SO4. Si filtra e si concentra sotto vuoto. Il residuo viene purificato mediante cromatografia flash (SiO2, Esano/AcOEt = 3/1, poi 2/1 e infine 1/1). Si ottengono (0,101 g, 0,210 mmol, 97%,) della miscela dei due isomeri (rapporto degli isomeri 1:1) come solido giallo pallido. I due isomeri vengono separati mediante ulteriore cromatografia. In ordine di eluizione:

1° diastereomero:<1>H NMR (CDCl3, 400 MHz) δ 8.52 (s, 1 H, Ar, H-7), 8.25 (d, 1 H, J = 8.4 Hz, Ar), 7.96 (d, 1 H, J = 8.4 Hz, Ar), 7.87 (t, 1 H, J = 8.4 Hz, Ar), 7.69 (t, 1 H, J = 8.4 Hz, Ar), 7.47 (d, 1 H,<1>JHF= 61.2 Hz, H-5), 7.45 (s, 1 H, H-14), 5.62 (d, 1 H, J = 16.8 Hz, H-17), 5.22 (d, 1 H, J = 16.8 Hz, H-17), 2.02-1.84 (m, 2 H, H-19), 1.03-0.93 (m, 12 H), 0.80-0.71 (m, 6 H).

<13>C NMR (CDCl3, 100 MHz) δ 171.4, 157.5, 152.3, 151.1, 150.2 (d, J = 1.5 Hz), 150.3 (d, J = 1.5 Hz), 143.6 (d, J = 5.3 Hz), 133.7, 131.7, 130.2, 128.9, 128.4, 127.9 (d, J = 15.0 Hz), 126.3 (d, J = 15.0 Hz), 121.8, 98.9, 93.8 (d,<1>JCF= 213.2 Hz, C-5), 75.1, 65.7, 33.1, 7.8, 7.2, 6.4.

2° diastereomero:<1>H NMR (CDCl3, 400 MHz) δ 8.51 (s, 1 H, Ar, H-7), 8.25 (d, 1 H, J = 8.4 Hz, Ar), 7.96 (d, 1 H, J = 8.4 Hz, Ar), 7.87 (t, 1 H, J = 8.4 Hz, Ar), 7.68 (t, 1 H, J = 8.4 Hz, Ar), 7.51 (d, 1 H,<1>JHF= 60.8 Hz, H-5), 7.42 (s, 1 H, H-14), 5.62 (d, 1 H, J = 17.2 Hz, H-17), 5.20 (d, 1 H, J = 17.2 Hz, H-17), 2.02-1.82 (m, 2 H, H-19), 1.04-0.93 (m, 12 H), 0.80-0.71 (m, 6 H).

<13>C NMR (CDCl3, 100 MHz) δ 171.2, 157.8, 152.5, 151.2, 150.3, 143.7, 133.7 (d, J = 2.4 Hz), 131.7, 130.2, 128.9, 128.3, 127.9 (d, J = 2.3 Hz), 126.3 (d, J = 16.7 Hz), 121.8 (d, J = 1.5 Hz), 99.0, 93.8 (d,<1>JCF= 214.8 Hz, C-5), 75.0, 65.8, 33.3, 7.9, 7.1, 6.4.

ESEMPIO IX - Preparazione del diastereomero 1 del - 17 - Bianchetti Bracco Minoja s.r.l.

Bianchetti Giuseppe ed altri 5-F-camptotecina

Il primo diastereomero del 5-F-20-OTES-camptotecina (0,025 g, 0,052 mmol) viene sciolto in THF anidro (5 mL) sotto agitazione e in atmosfera inerte. Successivamente si gocciola Et3N•3HF (0,060 mL, 0,368 mmol). La miscela di reazione è fatta reagire per 28 h a temperatura ambiente, si controlla la scomparsa del reagente mediante TLC (Esano/AcOEt = 1/2). Il solvente viene evaporato sotto vuoto e il residuo viene cromatografato (SiO2, Esano/AcOEt = 1/1). Si ottengono (0,019 g, 0,051 mmol, 98%) del composto desiderato come solido giallo pallido.

<1>H NMR (CDCl3, 400 MHz) δ 8.52 (s, 1 H, Ar, H-7), 8.25 (d, 1 H, J = 8.4 Hz, Ar), 7.96 (d, 1 H, J = 8.4 Hz, Ar), 7.87 (t, 1 H, J = 8.4 Hz, Ar), 7.69 (t, 1 H, J = 8.4 Hz, Ar), 7.59 (s, 1 H, H-14), 7.46 (d, 1 H,<1>JHF= 61.2 Hz, H-5), 5.69 (d, 1 H, J = 16.8 Hz, H-17), 5.26 (d, 1 H, J = 16.8 Hz, H-17), 3.87 (br s, 1 H, OH), 2.01-1.81 (m, 2 H, H-19), 1.05 (t, 3 H, J = 7.6 Hz, Me).<13>C NMR (CDCl3, 100 MHz) δ 173.5, 157.6, 151.1, 151.0, 150.2, 144.1, 133.9, 131.9, 130.0, 129.0, 128.5, 127.8, 126.4, 121.7, 98.8, 93.8 (d,<1>JCF= 214.0 Hz, C-5), 72.5, 66.0, 31.5, 7.8.

ESEMPIO X - Preparazione del diastereomero 2 del 5-F-camptotecina

Il secondo diastereomero del 5-F-20-OTES-camptotecina (0,025 g, 0,052 mmol) viene sciolto in THF anidro (5 mL) sotto agitazione e in atmosfera inerte, successivamente si gocciola Et3N•3HF (0,060 mL, 0,368 mmol). La miscela di reazione è fatta reagire per 28 h a temperatura ambiente, si controlla la scomparsa del reagente mediante TLC (Esano/AcOEt = 1/2). Il solvente viene evaporato sotto vuoto e il residuo viene cromatografato (SiO2, Esano/AcOEt = 1/1). Si ottengono (0,018 g, - 18 - Bianchetti Bracco Minoja s.r.l.

Bianchetti Giuseppe ed altri 0,050 mmol, 97%) del composto desiderato come solido giallo pallido.

<1>H NMR (CDCl3, 400 MHz) δ 8.52 (s, 1 H, Ar, H-7), 8.24 (d, 1 H, J = 8.4 Hz, Ar), 7.96 (d, 1 H, J = 8.4 Hz, Ar), 7.88 (t, 1 H, J = 8.4 Hz, Ar), 7.69 (t, 1 H, J = 8.4 Hz, Ar), 7.56 (s, 1 H, H-14), 7.51 (d, 1 H,<1>JHF= 60.4 Hz, H-5), 5.69 (d, 1 H, J = 16.4 Hz, H-17), 5.25 (d, 1 H, J = 16.4 Hz, H-17), 3.87 (br s, 1 H, OH), 1.98-1.78 (m, 2 H, H-19), 1.04 (t, 3 H, J = 7.6 Hz, Me).<13>C NMR (CDCl3, 100 MHz) δ 173.3, 157.7, 151.2, 151.2, 150.2, 144.2, 133.8, 131.9, 130.0, 129.0, 128.5, 127.8, 126.4, 121.6, 98.9, 93.7 (d,<1>JCF= 214.0 Hz, C-5), 72.5, 66.1, 31.6, 7.8.

ESEMPIO XI - Preparazione della 5-N3-20-OTES-camptotecina Camptotecina 20-OTES (0,100 g, 0,216 mmol) viene sciolta in THF anidro (6 mL) sotto agitazione e in atmosfera inerte, successivamente si porta la temperatura a -78°C e si gocciola LiHMDS soluzione 1,0 M in THF (0,260 mL, 0,260 mmol). Dopo 20’ si introduce Tosil azide (TsN3) (0,055 g, 0,281 mmol) in THF anidro (2 mL). Dopo 2 h a -78°C si lascia salire la temperatura a 25°C e si controlla la scomparsa del reagente mediante TLC (Esano/AcOEt = 2/1). Si nota la formazione di due diastereoisomeri e dopo 2h 1⁄2 a temperatura ambiente si spegne la reazione aggiungendo NH4Cl saturo. La fase acquosa viene estratta con CH2Cl2(3 x 15 mL) e le fasi organiche vengono riunite e anidrificate con Na2SO4. Si filtra e si concentra sotto vuoto. Il residuo, costituito da due diastereomeri, viene purificato mediante cromatografia flash (SiO2, Esano/AcOEt = 3/1, poi 2/1 e infine 1/1). Si ottengono (0,106 g, 0,210 mmol, 97%) della miscela dei due isomeri (rapporto degli isomeri 1:1) come solido giallo pallido. I due isomeri vengono separati mediante ulteriore cromatografia. In ordine di eluizione:

- 19 - Bianchetti Bracco Minoja s.r.l.

Bianchetti Giuseppe ed altri 1° diastereomero:<1>H NMR (CDCl3, 400 MHz) δ 8.45 (s, 1 H, Ar, H-7), 8.25 (d, 1 H, J = 8.4 Hz, Ar), 7.95 (d, 1 H, J = 8.4 Hz, Ar), 7.86 (t, 1 H, J = 8.4 Hz, Ar), 7.68 (t, 1 H, J = 8.4 Hz, Ar), 7.49 (s, 1 H, H-14), 6.97 (s, 1 H, H-5), 5.65 (d, 1 H, J = 16.8 Hz, H-17), 5.26 (d, 1 H, J = 16.8 Hz, H-17), 2.01-1.84 (m, 2 H, H-19), 1.03-0.94 (m, 12 H), 0.80-0.71 (m, 6 H).<13>C NMR (CDCl3, 100 MHz) δ 171.6, 158.3, 152.2, 150.8, 150.0, 144.0, 132.9, 131.4, 130.1, 128.6, 128.3, 128.2, 128.1, 120.8, 98.7, 75.4, 75.2, 65.7, 33.1, 7.9, 7.2, 6.4.

2° diastereomero:<1>H NMR (CDCl3, 400 MHz) δ 8.45 (s, 1 H, Ar, H-7), 8.24 (d, 1 H, J = 8.4 Hz, Ar), 7.95 (d, 1 H, J = 8.4 Hz, Ar), 7.86 (t, 1 H, J = 8.4 Hz, Ar), 7.68 (t, 1 H, J = 8.4 Hz, Ar), 7.46 (s, 1 H, H-14), 6.99 (s, 1 H, H-5), 5.66 (d, 1 H, J = 16.8 Hz, H-17), 5.22 (d, 1 H, J = 16.8 Hz, H-17), 2.02-1.84 (m, 2 H, H-19), 1.03-0.94 (m, 12 H), 0.80-0.71 (m, 6 H).<13>C NMR (CDCl3, 100 MHz) δ 171.4, 158.4, 152.3, 150.9, 150.0, 144.0, 132.9, 131.4, 130.1, 128.6, 128.3, 128.2, 128.1, 120.8, 98.7, 75.3, 75.1, 65.8, 33.3, 7.9, 7.2, 6.4.

ESEMPIO XII - Preparazione del diastereomero 1 della 5-N3-camptotecina

Il diastereomero 1 del 5-N3-20-OTES-camptotecina (0,070 g, 0,139 mmol) viene sciolto in THF anidro (6 mL) sotto agitazione e in atmosfera inerte, successivamente si gocciola Et3N•3HF (0,170 mL, 1,016 mmol). La miscela di reazione è fatta reagire per 26 h a temperatura ambiente, si controlla la scomparsa del reagente mediante TLC (Esano/AcOEt =1/1). Il solvente viene evaporato sotto vuoto e il residuo viene purificato mediante cromatografia flash (SiO2, Esano/AcOEt = 1/1). Si ottengono (0,053 g, 0,136 mmol, 98%) del composto desiderato come solido giallo pallido.

<1>H NMR (CDCl3, 400 MHz) δ 8.44 (s, 1 H, Ar, H-7), 8.24 (d, 1 H, J = - 20 - Bianchetti Bracco Minoja s.r.l.

Bianchetti Giuseppe ed altri 8.4 Hz, Ar), 7.93 (d, 1 H, J = 8.4 Hz, Ar), 7.85 (t, 1 H, J = 8.4 Hz, Ar), 7.67 (t, 1 H, J = 8.4 Hz, Ar), 7.63 (s, 1 H, H-14), 6.97 (s, 1 H, H-5), 5.70 (d, 1 H, J = 16.8 Hz, H-17), 5.29 (d, 1 H, J = 16.8 Hz, H-17), 3.99 (br s, 1 H, OH), 2.00-1.84 (m, 2 H, H-19), 1.04 (t, 3 H, J = 7.6 Hz, Me).<13>C NMR (CDCl3, 100 MHz) δ 173.6, 158.3, 150.8, 150.7, 149.8, 144.4, 133.1, 131.5, 129.9, 128.6, 128.3, 128.3, 128.1, 120.6, 98.6, 75.4, 72.7, 66.0, 31.5, 7.8.

ESEMPIO XIII - Preparazione del diastereomero 2 del 5-N3-camptotecina

Il diastereomero 2 del 5-N3-20-OTES-camptotecina (0,055 g, 0,109 mmol) viene sciolto in THF anidro (6 mL) sotto agitazione e in atmosfera inerte, successivamente si gocciola Et3N•3HF (0,135 mL, 0,820 mmol). La miscela di reazione è fatta reagire per 26 h a temperatura ambiente, si controlla la scomparsa del reagente di partenza mediante TLC (Esano/AcOEt = 1/1). Il solvente viene evaporato sotto vuoto e il residuo viene purificato mediante cromatografia flash (SiO2, Esano/AcOEt = 1/1). Si ottengono (0,042 g, 0,107 mmol, 98%) del composto desiderato come solido giallo pallido.

<1>H NMR (CDCl3, 400 MHz) δ 8.45 (s, 1 H, Ar, H-7), 8.23 (d, 1 H, J = 8.4 Hz, Ar), 7.95 (d, 1 H, J = 8.4 Hz, Ar), 7.85 (t, 1 H, J = 8.4 Hz, Ar), 7.68 (t, 1 H, J = 8.4 Hz, Ar), 7.60 (s, 1 H, H-14), 7.00 (s, 1 H, H-5), 5.74 (d, 1 H, J = 16.8 Hz, H-17), 5.28 (d, 1 H, J = 16.8 Hz, H-17), 3.86 (br s, 1 H, OH), 1.98-1.82 (m, 2 H, H-19), 1.04 (t, 3 H, J = 7.6 Hz, Me).<13>C NMR (CDCl3, 100 MHz) δ 173.4, 158.4, 150.9, 150.7, 149.8, 144.5, 133.0, 131.5, 129.9, 128.6, 128.4, 128.3, 128.1, 120.6, 98.6, 75.3, 72.6, 66.1, 31.6, 7.8.

ESEMPIO XIV - Preparazione del 5-NH2-camptotecina

Il diastereomero 2 del 5-N3-20-OH-camptotecina (0,050 g, 0,129 mmol) - 21 - Bianchetti Bracco Minoja s.r.l.

Bianchetti Giuseppe ed altri viene sciolto in una miscela di THF anidro (1,5 mL) e MeOH anidro (6 mL) sotto agitazione e in atmosfera inerte, successivamente si addiziona Pd/C (14 mg ~ 10%) e si fanno un paio di cicli vuoto/H2(H2baloon pressure). La miscela di reazione è fatta reagire per 3 h a temperatura ambiente e si controlla la scomparsa del reagente mediante TLC (Esano/AcOEt = 1/3). Si filtra su celite e si lava con CH2Cl2(2 x 15 mL). Il solvente viene evaporato sotto vuoto ed un’analisi del grezzo di reazione mediante spettroscopia<1>H NMR rivela che il prodotto atteso è stato ottenuto come miscela 1:1 di due epimeri alla posizione C5. Cromatografia flash (SiO2, CH2Cl2/MeOH = 35/1 poi 25/1) permette l’ isolamento della miscela dei due diastereomeri (0,046 g, 0,126 mmol, 98%).

<1>H NMR (CDCl3, 400 MHz) δ 8.48 (s, 1 H, Ar, H-7), 8.22-8.17 (m, 1 H, Ar), 7.95-7.90 (m, 1 H, Ar), 7.85-7.78 (m, 1 H, Ar), 7.68-7.60 (m, 1 H, Ar), 7.58 (s, 0.5 H, H-14), 7.54 (s, 0.5 H, H-14) 6.50 (s, 0.5 H, H-5), 6.47 (s, 0.5 H, H-5), 5.74-5.64 (m, 1 H, H-17), 5.28-5.22 (m, 1 H, H-17), 4.00-2.40 (br s, 3 H, OH NH2), 1.98-1.82 (m, 2 H, H-19), 1.07-1.01 (m, 3 H, Me).<13>C NMR (CDCl3, 100 MHz) δ 173.8 (2 C), 158.5 (2 C), 151.2 (2 C), 150.4 (2 C), 149.7 (2 C), 144.5 (2 C), 132.7 (2 C), 131.0 (2 C), 129.8 (2 C), 128.5 (2 C), 128.3 (2 C), 128.0 (2 C), 127.8 (2 C), 120.2 (2 C), 113.8 (2 C), 97.7 (2 C), 72.7 (2 C), 66.3, 66.0 31.5 (2 C), 7.8, 7.8.

ESEMPIO XV - 5-di-t-butossicarbonilidrazino-20-OTES-camptotecina

Camptotecina 20-OTES (0,100 g, 0,216 mmol) viene sciolta in THF anidro (6 mL) sotto agitazione e in atmosfera inerte, successivamente si porta la temperatura a -78°C e si gocciola LiHMDS soluzione 1,0 M in THF - 22 - Bianchetti Bracco Minoja s.r.l.

Bianchetti Giuseppe ed altri (0,281 mL, 0,281 mmol). Dopo 20’ si introduce il di-tert-butilazo dicarbossilato (DTBAC) (0,075 g, 0,324 mmol) in THF anidro (2 mL). Dopo 4 h a -78°C si controlla la scomparsa del reagente mediante TLC (Esano/AcOEt = 3/1). Si nota la formazione dei due diastereoisomeri. Si spegne la reazione aggiungendo NH4Cl saturo. La fase acquosa viene estratta con CH2Cl2(3 x 15 mL) e le fasi organiche vengono riunite e anidrificate con Na2SO4. Si filtra e si concentra sotto vuoto. Il residuo viene purificato mediante cromatografia flash (SiO2, Esano/AcOEt = 3/1). Si ottengono (0,145 g, 0,210 mmol, 97%) della miscela dei due isomeri. I due isomeri vengono separati mediante ulteriore cromatografia. In ordine di eluizione:

1° diastereoisomero:<1>H NMR (CDCl3, 400 MHz) δ 8.80 (br s, 1 H, Ar), 8.23 (d, 1 H, J = 8.4 Hz, Ar), 8.01 (br d, 1 H, Ar), 7.90-7.71 (m, 2 H, Ar), 7.70-7.45 (m, 2 H, Ar H-14), 6.52 (br s, 1 H, H-5), 5.61 (d, 1 H, J = 16.8 Hz, H-17), 5.23 (d, 1 H, J = 16.8 Hz, H-17), 2.03-1.81 (m, 2 H, H-19), 1.79-1.08 (br s, 18 H), 1.06-0.92 (m, 12 H), 0.80-0.70 (m, 6 H).<13>C NMR (CDCl3, 100 MHz) δ 171.7, 157.8, 155.5, 155.5, 152.0, 152.0, 151.2, 149.4, 145.0, 132.1, 130.6, 130.0, 128.7, 128.4, 127.9, 119.9, 98.2, 82.7, 81.5, 79.7, 75.2, 65.7, 33.2, 28.3, 27.6, 7.7, 7.2, 6.4.

2° diastereoisomero:<1>H NMR (CDCl3, 400 MHz) δ 8.79 (br s,1 H, Ar), 8.23 (d, 1 H, J = 8.4 Hz, Ar), 8.01 (br d, 1 H, Ar), 7.85-7.76 (m, 2 H, Ar), 7.65 (br t, 1 H, J = 8.4 Hz, Ar), 7.52 (s, 1 H, H-14), 6.54 (br s, 1 H, H-5), 5.61 (d, 1 H, J = 16.8 Hz, H-17), 5.22 (d, 1 H, J = 16.8 Hz, H-17), 2.03-1.82 (m, 2 H, H-19), 1.76-1.08 (br s, 18 H), 1.04-0.92 (m, 12 H), 0.80-0.70 (m, 6 H).<13>C NMR (CDCl3, 100 MHz) δ 171.5, 157.9, 155.5, 155.5, 152.3, 152.0, 151.2, 149.4, 145.1, 132.1, 130.6, 130.0, 128.7, 128.4, 127.9, 119.9, 98.2, 82.9, 81.5, - 23 - Bianchetti Bracco Minoja s.r.l.

Bianchetti Giuseppe ed altri 79.6, 75.2, 65.8, 33.3, 28.3, 27.4, 7.8, 7.2, 6.4.

ESEMPIO XVI - Preparazione del 1° diastereomero di 5-di-<t>butossicarbonilidrazinocamptotecina

Il primo diastereomero del 5-di-<t>butossicarbonilidrazino-20-OTES-camptotecina (0,050 g, 0,072 mmol) viene sciolto in THF anidro (4 mL) sotto agitazione e in atmosfera inerte, successivamente si gocciola Et3N•3HF (0,088 mL, 0,542 mmol). La miscela di reazione è fatta reagire per 35 h a temperatura ambiente, si controlla la scomparsa del reagente mediante TLC (Esano/AcOEt = 3/2). Il solvente viene evaporato sotto vuoto e il residuo viene purificato mediante cromatografia flash (SiO2, Esano/AcOEt = 3/2). Si ottengono (0,041 g, 0,071 mmol, 98%) del composto desiderato come solido giallo pallido.

Il prodotto viene ulteriormente purificato mediante cristallizzazione CH2Cl2/Pentano = 1/50.

<1>H NMR (CDCl3, 400 MHz) δ 8.77 (br s, 1 H, Ar), 8.16 (br d, 1 H, J = 8.0 Hz, Ar), 7.97 (br s, 1 H, Ar), 7.86-7.50 (m, 4 H, Ar), 6.51 (br s, 1 H, H-5), 5.66 (d, 1 H, J = 16.4 Hz, H-17), 5.24 (d, 1 H, J = 16.4 Hz, H-17), 3.86 (br s, 1 H, OH), 2.00-1.80 (m, 2 H, H-19), 1.79-1.13 (br s, 18 H), 1.03 (t, 3 H, J = 7.6 Hz, Me).<13>C NMR (CDCl3, 100 MHz) δ 173.7, 157.9, 155.5, 155.5, 152.1, 151.3, 150.7, 149.6, 145.7, 132.3, 130.7, 129.9, 128.7, 127.9, 127.6, 120.0, 97.9, 82.8, 81.6, 79.7, 72.7, 66.1, 31.8, 28.3, 27.7, 7.7.

ESEMPIO XVII - Preparazione del 2° diastereomero di 5-di-<t>butossicarbonilidrazinocamptotecina

Il secondo diastereomero del 5-di-<t>butossicarbonilidrazino-20-OTES-camptotecina (0,050 g, 0,072 mmol) viene sciolto in THF anidro (4.5 mL) - 24 - Bianchetti Bracco Minoja s.r.l.

Bianchetti Giuseppe ed altri sotto agitazione e in atmosfera inerte, successivamente si gocciola Et3N•3HF (0,088 mL, 0,542 mmol). La miscela di reazione è fatta reagire per 35 h a temperatura ambiente, si controlla la scomparsa del reagente mediante TLC (Esano/AcOEt = 3/2). Il solvente viene evaporato sotto vuoto e il residuo viene purificato mediante cromatografia flash (SiO2, Esano/AcOEt = 3/2). Si ottengono (0,040 g, 0,069 mmol, 96%) del composto desiderato come solido giallo pallido.

<1>H NMR (CDCl3, 400 MHz) δ 8.79 (br s, 1 H, Ar), 8.22 (br d, 1 H, J = 8.4 Hz, Ar), 7.99 (br s, 1 H, Ar), 7.88-7.50 (m, 4 H, Ar), 6.53 (br s, 1 H, H-5), 5.65 (d, 1 H, J = 16.4 Hz, H-17), 5.26 (d, 1 H, J = 16.4 Hz, H-17), 3.80 (br s, 1 H, OH), 2.00-1.80 (m, 2 H, H-19), 1.79-1.13 (br s, 18 H), 1.03 (t, 3 H, J = 7.2 Hz, Me).<13>C NMR (CDCl3, 100 MHz) δ 173.6, 157.9, 155.4, 155.4, 152.1, 151.3, 150.8, 149.5, 145.6, 132.3, 130.8, 129.8, 128.7, 127.9, 127.8, 119.8, 98.0, 83.0, 81.5, 79.7, 72.7, 66.3, 31.8, 28.3, 27.7, 7.8.

ESEMPIO XVIII - Preparazione del 5-dibenzilossicarbonilidrazino-20-OTES-camptotecina

Camptotecina 20-OTES (0,100 g, 0,216 mmol) viene sciolta in THF anidro (6 mL) sotto agitazione e in atmosfera inerte, successivamente si porta la temperatura a -78°C e si gocciola LiHMDS soluzione 1,0 M in THF (0,281 mL, 0,281 mmol). Dopo 20’ si introduce il dibenzil azodicarbossilato (0,097 g, 0,324 mmol) in THF anidro (2 mL). Dopo 3 h a -78°C si lascia salire la temperatura a 25°C e si controlla la scomparsa del reagente mediante TLC (Esano/AcOEt = 3/1). Si nota la formazione di due diastereoisomeri. Dopo 90 min - 25 - Bianchetti Bracco Minoja s.r.l.

Bianchetti Giuseppe ed altri a temperatura ambiente si spegne la reazione aggiungendo NH4Cl saturo. La fase acquosa viene estratta con CH2Cl2(3 x 15 mL) e le fasi organiche vengono riunite e anidrificate con Na2SO4. Si filtra e si concentra sotto vuoto. Il residuo viene purificato mediante cromatografia flash (SiO2, Esano/AcOEt = 4/1 poi 7/2). Si ottengono (0,161 g, 0,212 mmol, 98%) solido giallo pallido. I due isomeri vengono separati mediante ulteriore cromatografia. In ordine di eluizione:

1° diastereomero:<1>H NMR (CDCl3, 400 MHz) δ 8.70 (br s, 1 H, Ar), 8.39 (br s 1 H, Ar), 8.22 (br d, 1 H, J = 7.6 Hz, Ar), 7.95 (br d, 1 H, J = 7.6 Hz, Ar), 7.83 (br t, 1 H, J = 7.6 Hz, Ar), 7.65 (br t, 1 H, J = 7.6 Hz, Ar), 7.64-7.00 (m, 11 H, Ar H-14), 6.49 (br s, 1 H, H-5), 5.57 (d, 1 H, J = 16.4 Hz, H-17), 5.47-4.44 (m, 5 H), 1.98-1.82 (m, 2 H, H-19), 1.02-0.89 (m, 12 H), 0.80-0.70 (m, 6 H).<13>C NMR (CDCl3, 100 MHz) δ 171.6, 158.0, 156.3, 156.3, 153.0, 152.2, 151.0, 149.6, 144.8, 135.3, 132.1, 130.6, 130.0, 128.6-127.8 (11 C), 119.9, 98.4, 79.5, 75.2, 68.4, 67.9, 65.6, 33.0, 7.9, 7.2, 6.4.

2° diastereomero:<1>H NMR (CDCl3, 400 MHz) δ 8.85 (br s, 1 H, Ar), 8.58 (br s 1 H, Ar), 8.20 (br s, 1 H, Ar), 7.93 (br s, Ar), 7.81 (br t, 1 H, J = 7.6 Hz, Ar), 7.63 (br t, 1 H, J = 7.6 Hz, Ar), 7.56-6.90 (m, 11 H, Ar H-14), 6.52 (br s, 1 H, H-5), 5.55 (d, 1 H, J = 16.8 Hz, H-17), 5.44-4.71 (m, 5 H), 1.98-1.80 (m, 2 H, H-19), 1.05-0.90 (m, 12 H), 0.81-0.70 (m, 6 H).<13>C NMR (CDCl3, 100 MHz) δ 171.5, 157.9, 156.4, 156.4, 152.9, 152.4, 150.9, 149.4, 144.8, 135.3, 132.1, 130.6, 129.9, 128.6-127.8 (11 C), 119.9, 98.5, 79.3, 75.2, 68.4, 67.8, 65.6, 32.9, 7.8, 7.2, 6.4.

ESEMPIO XIX - Preparazione del 1° diastereomero di 5-dibenzilossicarbonilidrazinocamptotecina

Il 1° diastereomero di 5-dibenzilossicarbonilidrazino-20-OTES- 26 - Bianchetti Bracco Minoja s.r.l.

Bianchetti Giuseppe ed altri camptotecina (0,140 g, 0,184 mmol) viene sciolto in THF anidro (6 mL) sotto agitazione e in atmosfera inerte, successivamente si gocciola Et3N•3HF (0,225 mL, 1.380 mmol). La miscela di reazione è fatta reagire per 52 h a temperatura ambiente, si controlla la scomparsa reagente mediante TLC (Esano/AcOEt = 1/3). Il solvente viene evaporato sotto vuoto e il residuo viene purificato mediante cromatografia flash (SiO2, Esano/AcOEt = 1/1 poi 2/3). Si ottengono (0,113 g, 0,175 mmol, 95%) del composto desiderato come solido giallo pallido. Il prodotto viene ulteriormente purificato mediante cristallizzazione CH2Cl2/Pentano = 1/50

<1>H NMR (CDCl3, 400 MHz) δ 8.67 (br s, 1 H, Ar), 8.39 (br s 1 H, Ar), 8.12 (br d, 1 H, J = 7.6 Hz, Ar), 7.95 (br s, 1 H, Ar), 7.74 (br t, 1 H, J = 7.6 Hz, Ar), 7.65-6.66 (m, 12 H, Ar H-14), 6.48 (br s, 1 H, H-5), 5.55 (d, 1 H, J = 16.0 Hz, H-17), 5.42-4.44 (m, 5 H), 3.86 (br s, 1 H, OH), 1.92-1.72 (m, 2 H, H-19), 0.95 (t, 3 H, J = 7.6 Hz, Me).<13>C NMR (CDCl3, 100 MHz) δ 173.5, 158.0, 156.2, 156.0, 153.0, 150.9, 150.9, 149.5, 145.3, 135.4, 132.2, 130.7, 129.8, 128.7-127.8 (11 C), 119.9, 98.2, 79.6, 72.7, 68.5, 68.0, 65.9, 31.6, 7.8.

ESEMPIO XX - Preparazione del 2° diastereomero di 5-dibenzilossicarbonilidrazinocamptotecina

Il 2° diastereomero di 5-dibenzilossicarbonilidrazino-20-OTES-camptotecina (0,140 g, 0,184 mmol) viene sciolto in THF anidro (6 mL) sotto agitazione e in atmosfera inerte, successivamente si gocciola Et3N•3HF (0,150 mL, 0,921 mmol). La miscela di reazione è fatta reagire per 55 h a temperatura ambiente, si controlla la scomparsa del reagente mediante TLC (Esano/AcOEt = 3/2). Il solvente viene evaporato sotto vuoto e il residuo - 27 - Bianchetti Bracco Minoja s.r.l.

Bianchetti Giuseppe ed altri viene purificato mediante cromatografia flash (SiO2, Esano/AcOEt = 1/1). Si ottengono (0,113 g, 0,175 mmol, 95%) del composto desiderato come solido giallo pallido. Il prodotto viene ulteriormente purificato mediante cristallizzazione CH2Cl2/Pentano = 1/50.

<1>H NMR (CDCl3, 400 MHz) δ 8.71 (br s, 1 H, Ar), 8.34 (br s 1 H, Ar), 8.18 (br s, 1 H, Ar), 7.94 (br s, 1 H, Ar), 7.79 (br t, 1 H, J = 7.6 Hz, Ar), 7.70-6.70 (m, 12 H, Ar H-14), 6.52 (br s, 1 H, H-5), 5.53 (d, 1 H, J = 16.4 Hz, H-17), 5.44-4.48 (m, 5 H), 3.87 (br s, 1 H, OH), 1.90-1.70 (m, 2 H, H-19), 0.99 (t, 3 H, J = 7.6 Hz, Me).<13>C NMR (CDCl3, 100 MHz) δ 173.4, 158.0, 156.3, 156.1, 153.0, 151.0, 150.9, 149.6, 145.3, 135.5, 132.3, 130.8, 129.8, 128.7-127.8 (11 C), 119.8, 98.4, 79.5, 72.7, 68.5, 67.8, 66.0, 31.6, 7.7.

ESEMPIO XXI - Saggio di inibizione della crescita cellulare Cellule di tumore umano polmonare a larghe cellule H460 furono coltivate in terreno di coltura RPMI-1640 contenente il 10% siero fetale di vitello. La sensibilità cellulare fu determinata per mezzo del saggio di inibizione della crescita cellulare dopo 1 ora o 72 di esposizione ai farmaci. Le cellule nella fase logaritmica di crescita furono raccolte e seminate in duplicato in piastre a sei pozzetti. Ventiquattro ore dopo la semina le cellule furono esposte ai farmaci e contate con un contatore Coulter 72 ore dopo l’ esposizione ai farmaci per la determinazione della IC50, che è definita come la concentrazione inibente il 50% della crescita cellulare rispetto a quella dei controlli non trattati.

ESEMPIO XXII - Saggio di rottura al DNA dipendente dalla Topoisomerasi-I

Per la determinazione della rotture al DNA fu utilizzato un gel - 28 - Bianchetti Bracco Minoja s.r.l.

Bianchetti Giuseppe ed altri

purificato 751-bp BamHI-EcoRI DNA SV40 (Beretta GL, Binaschi M, Zagni

E, Capuani L, Capranico G. Tethering a type IB topoisomerase to a DNA site

by enzyme fusion to a heterologous site-selective DNA-binding protein

domain. Cancer Res 1999; 59:3689-97). I frammenti di DNA furono

unicamente marcati in 3’. La reazione di rottura del DNA

(20,000 cpm/sample) fu fatta in 20 mL di 10mM Tris-HCL (pH 7.6), 150 mM

KCL, 5mM MgCl2, 15 µg/mL BSA, 0,1 mM di thiotreitol, e l’enzima

ricombinante umano (full length top1) per 30 min a 37°C. Le reazioni furono

bloccate usando 0,5% SDS e 0,3 mg/mL di proteinase K per 45 min. a 42°C.

La persistenza del danno al DNA a diversi tempi fu esaminata aggiungendo

0,6M NaCl dopo 30 min. di incubazione con 10 µM di farmaco. Dopo la

precipitazione il DNA fu risospeso in un tampone di denaturazione (80%

formamide, 10 mM NaOH, 0,01 M EDTA e 1 mg/mL dyes) prima di

seminarlo in un gel denaturante (7% polyacrylamide in tampone TBE). Tutti i

livelli di rottura del DNA furono misurati con un PhospsoImager modello 425

(Molecular Dynamics) (Dallavalle S, Ferrari A, Biasotti B, et al. Novel

7-oxyiminomethyl derivatives of camptothecin with potent in vitro and in

vivo antitumor activity. J Med Chem 2001; 44:3264-74).

Persitenza del danno al DNA (%)

Composti Tempo (min)

0 1 5 10 Topotecan 100 65 20 10 Camptotecina 100 58 23 20

SN38 100 60 33 28

5-F CPT isomero 1 100 18 18 10 5-F CPT isomero 2 100 10 10 13

5-N3 CPT 100 50 30 15

Claims

- 29 - Bianchetti Bracco Minoja s.r.l. Bianchetti Giuseppe ed altri RIVENDICAZIONI 1. Composti di formula generale I: R2 R1 R R3 O N N O OHO (I) dove: R rappresenta F, Cl, Br, I, -N3, NH2, -NR’R’’, -COOR’, -CONR’R’’, -NHR’’’-NR’R’’ in cui R’, R’’ e R’’’ possono essere H, alchile, arile, arilalchile, acile, alcossicarbonile, arilossicarbonile; R1 rappresenta alchile, aminoalchile, idrossialchile, nitrile, alcossimmino, arilossimmino, sililalchile; R2 rappresenta idrogeno, idrossile, alcossile, aminoalchile; R3 rappresenta idrogeno, idrossile eventualmente protetto, alcossile, aminoalchile, dove i gruppi alchile, acile, alcossile, aminoalchile o alcossimmino possono contenere da 1 a 8, preferibilmente da 1 a 4 atomi di carbonio, in catena lineare o ramificata, mentre i gruppi arile e arilossi possono contenere da 5 a 10 atomi di carbonio; i loro sali farmaceuticamente accettabili, isomeri, enantiomeri, diastereoisomeri e le relative miscele.
2. Un composto di formula (I) secondo la rivendicazione 1, che è scelto - 30 - Bianchetti Bracco Minoja s.r.l. Bianchetti Giuseppe ed altri nel gruppo comprendente: a) 5-F-camptotecina b) 5-N3-camptotecina c) 5-NH2-camptotecina d) 5-di-tertbutossicarbonilidrazinocamptotecina e) 5-di-benzilossicarbonilidrazinocamptotecina 3. Processo per la preparazione dei composti di formula (I), che comprende essenzialmente i passaggi illustrati nello Schema, in cui: a) protezione dei gruppi ossidrilici del precursore b) derivatizzazione in 5 attraverso formazione di un carbanione e reazione con un elettrofilo c) deprotezione dei gruppi ossidrilici R2 R1 R2 R1 R3 O R3 O N N a)<b)>N N O O <HO>OO O PG <R2 R1>R R3<R2 R1> OR R
3 N c) O N N N O O O O PG H O O dove R, R1, R2 e R3 hanno il significato sopra descritto, PG rappresenta un gruppo protettore del gruppo OH.
4. Composizione farmaceutica contenente un composto di formula (I) - 31 - Bianchetti Bracco Minoja s.r.l. Bianchetti Giuseppe ed altri insieme a veicoli ed eccipienti farmaceuticamente accettabili.
5. Composizione farmaceutica secondo la rivendicazione 4, che è in una forma idonea alla somministrazione orale o parenterale.
6. Uso di un composto secondo le rivendicazioni 1-2 o di una composizione secondo le rivendicazioni 4-5 per la preparazione di un medicamento per il trattamento del tumore.
7. Uso secondo la rivendicazione 6, dove detto medicamento è utilizzato per il trattamento di tumori solidi e leucemie, in particolare tumori del polmone, ovaio, mammella, stomaco, fegato, prostata, sarcoma dei tessuti molli, testa e collo, esofago, pancreas, colon, retto, glioblastoma, leucemie mielocitiche croniche e acute. Milano, 26 luglio 2006