HUP0401357A2 - Kalcium-foszfát hordozóanyagok csontképződést serkentő fehérjék bejuttatásához - Google Patents

Abstract

A találmány tárgya csontdefektussal rendelkező emlős kezelséreszolgáló készítmény. A készítmény tartalmaz csontképző fehérjét mintelsődleges biológiailag aktív anyagot, kalcium-foszfátot minthordozót, és hatékony mennyiségű effervescens anyagot. Feltárnaktovábbá eljárásokat a készítmény elkészítésére és a csontképzőkészítmény csontritkulásos és/vagy csontfelpuhulásos csont kezelésérevaló alkalmazására. Ó

Description

KALCIUM-FOSZFÁT HORDOZÓANYAGOK CSONTKÉPZŐDÉST SEgfCENTCT FEHÉRJÉK

- « . . BEJUTTATÁSÁHOZ

A találmány tárgyát képezik oszteoinduktív (csontképződést serkentő) fehérjék bejuttatásához hordozóanyagként alkalmazható, kalcium-foszfát tartalmú keverékek. A találmány tárgyát képezik továbbá biokompatibilis, csontképződést serkentő összetevők, amelyek alkalmazhatók csontregenerációhoz és csont-augmentációhoz (csontkitöltéshez) , valamint szöveti helyreállításhoz és megerősítéshez csonttörés, fog- és csontbeültetés, protézisek stb. esetén.

A gyógyászat területén számos kutatás irányul olyan hatékony, beültethető hordozóanyagok kifejlesztésére, amelyek alkalmazhatók gyógyszerek bejuttatásához vagy egyéb műtéti eljárásokhoz. Az ilyen hordozóanyagoknak biokompatibilisnek kell lenniük, és képesnek kell lenniük az általuk bejuttatandó bármely biológiailag aktív szer aktivitásának megőrzésére. Sok biológiailag aktív szer labilis, és egy hordozóanyagba ágyazva könnyen veszít az aktivitásából. A fehérjeaktivitás megőrzése különösen nehéz problémákat szokott felvetni.

A' hatóanyag-bejuttatással foglalkozó szakemberek tanulmányozták a kalcium-foszfát kerámiákat mint lehetséges hordozóanyagokat, jól ismert biokpmpatibilitásuk és fehérjereagensekhez való affinitásuk miatt [lásd például Ijntema és tsai, Int. J. Pharm. 112:215 (1994); Itokazu és munkatársai, J. Orth. Rés. 10:440 (1992); Shinto és munkatársai, J. Bone Joint Surg. 74B:600 (1992); és Uchida és munkatársai, J. Orth. Rés. 10: 440 (1992)]. A legtöbb ilyen anyagot előregyártott, zsugorított hidroxiapatit formájában szokták alkalmazni, szemcsés vagy blokk kiszerelésben. Ezeknek a készítményeknek van néhány hátránya, többek között a vázrendszeri defektusokhoz való korlátozott alkalmazkodóképesség, különösen blokkok esetében; ezenkívül a (nem összetapadó) szemcsék nem megfelelő szerkezeti integritása; és azok a nehézségek, amelyeket a hiányzó támasztószövettel megegyező alakú implantátum blokkokból és szemcsékből történő kialakítása támaszt. A blokk formájú hidroxiapatit szerkezeti támasztékot biztosít, de egyéb komplikációk mellett mechanikai eszközökkel kell rögzíteni, ami nagymértékben korlátozza az alkalmazását és a kozmetikailag elérhető eredményeket. Ezenkívül nagyon nehéz egy hidroxiapatit blokkot olyan formájúra fűrészelni, amely illeszkedik a beteg egyéni defektusához. A szemcsés ι ·***···

PCT/ÜS02/17798

99982-6039/KT formával kozmetikailag jobb eredmények érhetők el, de nagyon korlátozott szerkezeti stabilitással rendelkezik, és formája nehezen őrizhető meg egy műtéti beavatkozás alatt és után. Általában ezek a termékek mind magas hőmérsékleten történő zsugorítással előállított kerámiák, és nem egyedi kristályokból állnak, hanem határolófelületeiknél összeolvadt kristályokból. Általában a legtöbb kerámia típusú anyag funkcionálisan biológiailag nemfelszívódó (abszorpciós rátájuk általában nem haladja meg az évi 1%-ot).

Egy porózus, korall alapú, nem-felszívódó anyag esetében lehetséges a csonttal való összenövés, de végül csak 20%-a alakul át csontszövetté, a maradék 80% hegszövetként marad meg. Az Osteogen által gyártott HA RESORB® egy felszívódó hidroxiapatit, de nem cement. Szemcsés formájú és nem tapad. A HA RESORB® lazán és nem tapasztva vihető fel a kívánt felületre. Nagy felületen való alkalmazásnál a csont túl gyorsan átveszi a helyét. A fogászati piacon kapható HAPSET® egy kalcium-foszfát-szemcsékből és cementálható égetett gipszből (kalcium-szulfát) álló készítmény. Ez az anyag nem valódi hidroxiapatit és a legtöbb biológiai alkalmazáshoz túl sok kalcium-szulfátot tartalmaz. Az ilyen készítmény kalcium-szulfát tartalma felszívódik, de a kalciumfoszfát-szemcsék nem.

A kalcium-foszfát-készítményeknek legalább egy osztályára jellemző, hogy a hidroxiapatit-képződés előanyagai és hogy biológiailag kompatibilisek, valamint két olyan egyedülálló tulajdonsággal rendelkeznek, amelyek más kalcium-foszfát biológiai anyagok esetében nem valósíthatóak meg: (1) önmaguktól megkeményednek, olyan anyaggá alakulva, amely számos orvosi és fogászati alkalmazáshoz elegendő erősségű, és (2) csontba ültetve ezek az anyagok lassan szívódnak fel és a helyüket teljesen átveszi az újonnan képződött csont, ami nem jár az implantátumot befogadó szövet térfogatának vagy integritásának csökkenésével. Lásd a Re. 33 221. és Re. 33 161 számú, amerikai egyesült államokbeli, újból engedélyezett szabadalmakat (Brown és Chow), amelyek kalcium-foszfátot remineralizáló vegyületeket és egy ugyanezen kalcium-foszfáton alapuló, finom kristályszerkezetű, nem-kerámia, fokozatosan felszívódó hidroxiapatit anyag készítését tárják fel.

I ··*· ·

PCT/US02/17798

99982-6039/KT t

Egy ezzel gyakorlatilag azonos kalcium-foszfát - rendszert, amely tetrakalcium-foszfátból (TTKF) és monokalcium-foszfátból (MKF) vagy annak monohidrát-formájából (MKFM) áll, írtak le Constantz és munktársai (5 053 212 és 5 129 905 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmak) . Ez a rendszer a beszámolók szerint magában foglalja a MKF dikalcium-foszfáttá való átalakulását, amely a TTKF-tal reagál és végtermékként hidroxiapatitot (HA) hoz létre, amely a fog és a csont fő ásványi alkotóeleme.

Egy másik kalcium-foszfát vegyülettípus amorf, apatitos kalcium-foszfát-reaktánst, promotert és vizes alapú folyadékot tartalmaz, amely megkeményedő pasztát hoz létre. Lásd például az 5 650 176; 5 676 976; 5 683 461; 6 027 742 és 6 117 456 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmakat (Lee és munktársai). Ez a rendszer egy olyan bioaktív kerámiát biztosít, amely biokompatibilis, biológiailag felszívódó és hosszú időn keresztül lehet vele szobahőmérsékleten dolgozni. A bioaktív kerámia alacsony hőmérsékleten képződhet, könnyen formázható és/vagy injektálható, de jelentős mértékben meg tud keményedni a további reakció során. A bioaktív kerámia olyan gyengén kristályos, szilárd, apatitos kalcium-foszfátokat tartalmaz, amelyekben a kalcium/foszfát (Ca/P) arányok hasonlóak a természetben előforduló csontásványokéhoz, és amelyek a természetes csonthoz hasonló merevséggel és törékenységgel rendelkeznek. A bioaktív kerámiavegyület biológiailag nagymértékben felszívódó és biológiai felszívódóképessége és reaktivitása az adott terápia és/vagy implantátumméret igényeinek megfelelően módosítható. Az anyag elkészíthető csontlemezként, csontcsavarként és egyéb olyan rögzítő és orvosi eszköszként, beleértve az állatorvosi alkalmazásokat, melyek biológiailag nagymértékben felszívódok és/vagy csontosodást elősegítők.

A rekonstruktív sebészet egyik célja, hogy lehetővé váljon a károsodott szövet új szövettel való helyettesítése, vagy a beteg saját sejtjeit, vagy növekedést serkentő fehérjéket alkalmazva. A kutatók például olyan porcregeneráló rendszerek kifejlesztésével kísérleteztek, amelyekben izolált porcsejteket injektálnak egy sérült területre, egy polimer-vázhoz rögzítve [lásd például Atala és munktársai, J. Urol. 150:747 (1993); Freed és munktársai, J. Cell. Biochem. 51:257 (1993) és az ezekben hivat

99982-6039/KT

PCT/US02/17798 kozott dokumentumok]. Hasonló sejtbeültetéses vázrendszereket vizsgáltak a csont-újraképződés szempontjából, ahol oszteoblaszt (csontépítő) sejteket alkalmaznak polimer vagy kerámia alapanyagú alátámasztásokhoz rögzítve [lásd például Elgendy és munktársai, Biomater. 14:263 (1993); Ishaug és munktársai, J. Biomed. Mater. Rés. 28:1445 (1994)]. Különösen érdekesek az olyan csontképződést elősegítő anyagok, mint a csont morfogén fehérjék (bone morphogenetic proteins, például rekombináns humán BMP-2), a demineralizált csont-mátrix; a transzformáló növekedési faktorok (transforming growth factors, például TGF-β); és különböző egyéb szerves anyagok, amelyekről ismert, hogy csontképződést indukálnak.

A kalcium-foszfát alapú hordozóanyagok három általános típusát kifejezetten beoltott készítményekkel való alkalmazásra fejlesztették ki. A hordozóanyag egyik típusa előregyártott kalcium-foszfát alapú szemcsékből áll, amelyek külső felszínéhez van kötve a bioaktív anyag. Általában nagy szemcsékre (ideálisan 100-1000 pm) van szükség a gyulladásos válaszreakció elkerüléséhez. Azonban az ilyen nagy, előregyártott szemcséket nem könnyű beinjektálni a perkután injekcióhoz szükséges kis gauge-os tűkkel. Ráadásul a hatóanyagokat csak előregyártott szemcsékhez lehet hozzákeverni, ami felületi bevonatot eredményez, ahelyett, hogy a hatóanyag beágyazódna vagy eloszlana a mátrixban. A hatóanyag beágyazódása a mátrixba lehetővé teszi a biomolekulák kontrolláltabb felszabadulását a mátrix felszívódása során. Az előregyártott szemcséket jellemzően nehéz kezelni és alkalmazni. Továbbá a legtöbb előregyártott hidroxiapatit-szemcsét zsugorításos folyamattal állítják elő, amely lényegében nem-felszívódóvá teszi őket.

A beoltott készítményekhez való vázanyagok második típusa beültethető, porózus hidroxiapatit- vagy trikalcium-blokkokból áll. Beültethető porózus blokkok különböző fokú porózussággal előállíthatok, jellemzően kontrollált részecskeméretű reaktánsok száraz keverékét alkalmazva. A porózusság elősegítésére szolgáló egyéb eljárások közé tartozik a kémiai vagy fizikai maratás és kilúgozás. Noha általában elegendő támasztékot nyújtanak, a porózus blokkoknak van néhány jelentős hátránya. Először is, a fent leírt előregyártott szemcsékhez hasonlóan a blokk-vázak

99982-6039/KT *' PCT/ÚS02/17798 y - 5 esetében a csontképződést indukáló anyag nincs beágyazódva a teljes térfogatba, így nem teszik lehetővé az aktív anyag kontrollált felszabadulását. Másodszor, a beültethető blokkok nem injektálhatok, így egy intruzívabb (durvább beavatkozást jelen5 tő) beültetési eljárást igényelnek. Végül, de nem utolsó sorban, a monolitikus blokkok lelassíthatják a csontképződés sebességét olyan klinikai alkalmazások esetén, ahol a normálisnál gyorsabb gyógyulásra lenne szükség. Ez a késlekedés feltehetően a szilárd hordozó lassú felszívódásának és az aktív anyag ebből eredő kés10 lelhetett felszabadulásának tulajdonítható. A monolitikus mátrix jelenléte azt is megakadályozhatja, hogy a sejtek a törés helyére vándoroljanak és abba behatoljanak. Feltételezve, hogy a blokk-mátrix tartalmaz a pórusok között öszekötő csatornákat, az új csont növekedését a pórusok és a hordozóanyagok felületére 15 kötődött anyagok fogják meghatározni, így korlátozva az új csont képződését.

A vázanyagok harmadik típusába tartoznak a kalcium-foszfát cementek. Eltérően az előregyártott szemcséktől és a monolitikus blokkoktól, a cementek könnyen injektálhatok és a csontképződést 20 indukáló anyagot a teljes térfogatba beágyazottan tartalmazhatják. Azonban ezek a cementek hajlamosak monolitikus aggregátumok képződésére, amelyek eredendően mikropórusosak. Noha leírtak makropórusos verziókat biológiailag lebontható pórusképzők alkalmazásával (lásd például a WO 98/16209 számú PCT szabadalmi 25 bejelentést, melynek tartalmát hivatkozás útján a kitanítás részének tekintjük), ezek a cementek monolitikus hordozófelületeket képeznek, amelyek inkább csatornákat, és nem mikropórusos szemcséket tartalmaznak, ami a fentiekben kifejtettek alapján jelentősen korlátozza az új csont képződését.

Ezek alapján elmondható, hogy az ezen a területen ismert jelentős erőfeszítések dacára még mindig fennáll az igény egy olyan gyógyszerhordozó anyagra, amely biokompatibilis, könnyen felszívódik és nem káros a gyógyszer aktivitására nézve. Ideálisan a hordozóanyagnak injektálhatónak, és alakíthatónak kell 35 lennie, hogy be lehessen injektálni vagy ültetni különböző méretű törések és defektusok helyére; elő kell segítenie a bioaktív anyagok homogén eloszlását a mátrixban, így lehetővé téve az aktív anyag kontrollált felszabadulását; és végül, különálló

99982-6039/KT

PCT/US02/17798 makroszemcseket kell kepeznie a műtéti vagy sérült helyre való beadáskor. A szemcsézettség szükséges ahhoz, hogy serkentse a sejtközötti csontmátrixot termelő sejtek vándorlását és behatolását, és hogy biztosítsa a hozzáférést a benövő erek számára. A szemcsék ezenkívül nagy felszínt biztosítanak az aktív anyag fokozott felszívódásához és felszabadulásához, valamint a megnövekedett sejt-mátrix kölcsönhatásokhoz is. A találmány megfelel ezeknek az igényeknek, olyan anyagokat és készítményeket biztosítva, amelyek alkalmazhatók gyógyszerek bejuttatásához és szöveti regenerációhoz.

Az alábbiakban röviden ismertetjük a találmány szerinti megoldást .

A találmány egyik megvalósítási módjának tárgya egy készítmény csontdefektussal rendelkező emlős kezelésére, amely kalcium-foszfátot, hatásos mennyiségű effervescens (pezsgést előidéző) anyagot és biológiailag aktív anyagot tartalmaz. A kalciumfoszfát lehet amorf, apatitos kalcium-foszfát, hidroxiapatit, trikalcium-foszfát vagy fluoroapatit. Egy előnyös megvalósítási mód szerint a kalcium-foszfát amorf, apatitos kalcium-foszfát, például egy gyengén kristályos, apatitos kalcium-foszfát. A gyengén kristályos, apatitos kalcium-foszfátban a kalcium/foszfát (Ca/P) arány hasonló lehet, mint a természetben előforduló csontásványokban. Előnyös megvalósítási módokban a Ca/P arány kisebb, mint 1:1,50; előnyösen körülbelül 1:1,40. A csontképződést serkentő fehérje származhat a csont morfogén fehérjék (bone morphogenic protein, BMP) családjából, beleértve a BMP-2t, BMP-4-et, ΒΜΡ-5-öt, BMP-6-ot, BMP-7-et, BMP-10-et, BMP-12-t és BMP-13-at. Egy előnyös megvalósítási mód szerint a csontképződést serkentő fehérje BMP-2 vagy BMP-6. Az effervescens anyag lehet bármelyik gáz az alábbiak közül: szén-dioxid, levegő, nitrogén, hélium, oxigén és argon. Egy előnyös megvalósítási mód szerint az effervescens anyag nátrium-bikarbonát. A nátriumbikarbonát körülbelül 10 és körülbelül 40 tömeg% közötti koncentrációban lehet jelen. A készítmény ezenkívül tartalmazhat egy vagy több kiegészítő anyagot, például gyógyászatilag elfogadható sókat, poliszaharidokat, peptideket, fehérjéket, aminosavakat, szintetikus polimereket, természetes polimereket és felületaktív anyagokat; szilárd szerkezeteket, például szivacso

99982-6039/KT

P^T/USoT/17 7 98 kát, hálókat, filmeket, rostokat, geleket, szalakat, mikrorészecskéket és nanorészecskéket; biológiailag lebontható polimereket, például kollagént, glikogént, kitint, cellulózokat, keményítőt, keratinokat, selymet, nukleinsavakat, demineralizált csont-mátrixot, származékolt hialuronsavat, polianhidrideket, poliortoésztereket, poliglikolsavat, politejsavat és ezek kopolimereit és származékait; α-hidroxikarbonsavat, például poli(Llaktid)-ot (PLLA), poli(D,L-laktid)-ot (PDLLA), poliglikolidot (PGA), poli(laktid-ko-glikolid)-ot (PLGA), poli(D,L-laktid-kotrimetilén-karbonát)-ot és polihidroxibutirátot (PHB), és ezek polianhidridjeit, kopolimereit és származékait; SiO₂-ot, Na₂O-ot, CaO-ot, P₂O₅-ot, Al₂O₃-ot és CaF₂-ot; és poliszaharidokat, peptideket és zsírsavakat. A készítmény ezenkívül tartalmazhat egy második aktív anyagot, például Hedgehog, Frazzled, Chordin, Noggin, Cerberus és Follistatin fehérjét.

Egy másik szempont szerint a találmány tárgya egy eljárás csontdefektussal rendelkező emlős kezelésére, ami magában foglalja egy csontképződést serkentő készítmény hatásos mennyiségben történő beadását a csontdefektus helyére, ahol a csontképződést serkentő készítmény tartalmaz csont morfogén fehérjét kalcium-foszfátot és effervescens anyagot. Egy előnyös megvalósítási mód szerint az effervescens anyag nátrium-bikarbonát.

Egy további szempont szerint a találmány tárgya csontképződést serkentő fehérje, kalcium-foszfát és effervescens anyag alkalmazása olyan gyógyászati készítmény előállítására, amely csontképződést serkentő fehérje bejuttatására szolgál.

Az alábbiakban részletesen ismertetjük a találmány szerinti megoldást.

A találmány tárgyát képezik olyan csontképződést serkentő készítmények, amelyek alkalmazhatók a csontszövet újjáépítéséhez és regenerációjához, illetve csontkitöltéshez. A készítmény biokompatibilis és biológiailag felszívódó kalcium-foszfátot, effervescens anyagot és biológiailag aktív anyagot tartalmaz. A keményedés során a kalcium-foszfát felszívódó vázat biztosít az új csont növekedéséhez. Az effervescens anyag megakadályozza, hogy a kalcium-foszfát egységes monolitikus szerkezetűvé alakuljon, azáltal, hogy elősegíti különálló makroszemcsék képződését, amelyek szétoszlanak a kalcium-foszfát keményedése során. A bio

99982-6039/KT

PCT/ŰS θ'*/17 7 98 lógiailag aktív anyag serkenti a jelenlévő vagy behatoló progenitor sejtek vagy más sejtek fokozott csontképző aktivitását. A csontképződést elősegítő készítmények alkalmazhatók csontkitöltéshez és csontszövet-regenerációhoz, például a csontfelpuhulásos (oszteopéniás) csontban, valamint a szöveti újjáépüléshez és megerősödéshez csonttörések, fogbeültetések, csontbeültetések, protézisek és hasonlók esetében.

Az általunk használt „kalcium-foszfát kifejezés egy olyan szintetikus csonthelyettesítő anyagot jelent, amelynek elsődleges összetevője a kalcium-foszfát. A témában járatos szakemberek által jól ismertek az alkalmas kalcium-foszfát-alapú anyagok, beleértve - nem korlátozó értelemben - az alábbiakat: amorf, apatitos kalcium-foszfát, hidroxiapatit, trikalcium-foszfát és fluoroapatit. Egy előnyös megvalósítási mód szerint a kalciumfoszfát egy szilárd, gyengén kristályos, apatitos kalciumfoszfát, amelyben a kalcium/foszfát (Ca/P) arány hasonló a természetben előforduló csontásványokéhoz. Ilyen anyagok előállíthatok amorf, apatitos kalcium-foszfát, mint reaktáns, egy promoter és egy vizes alapú folyadék keverékének alkalmazásával, amely megkeményedő pasztát képez. Egy alternatív megvalósítási mód szerint a kalcium-foszfát kristályos kalcium-foszfát reaktánsok szilárd állapotú sav-bázis reakciójával állítható elő, amelyek szilárd, kristályos hidroxiapatitokat képeznek.

„Effervescens anyag alatt olyan gáznemű anyagot vagy olyan anyagot értünk, amely buborékolást, habzást vagy egy gáz felszabadulását váltja ki.

Az általunk használt „amorf kifejezés szignifikáns amorf jelleggel rendelkező anyagot jelent. A szignifikáns amorf jelleg feltétele a 75%-nál nagyobb amorf tartalom, előnyösen 90%-nál nagyobb amorf tartalom, és jellemző rá a széles, jellegtelen röntgendiffrakciós kép.

„Bioaktív alatt olyan anyagot értünk, amely elősegíti kemény szövet képződését az implantátum belsejében vagy környezetében. Lágy szövetbe való beültetés esetén a bioaktivitáshoz növekedési vagy trofikus faktor jelenléte, vagy kemény szövetet képző sejttípusoknak az implantátumba való beoltása is szükséges lehet.

J **!* -r ‘

99982-6039/KT '* PCT/US02/17798

Az általunk használt „biokompatibilis kifejezés azt jelenti, hogy az anyag nem vált ki lényeges károsító választ a fogadó szervezetben. Amikor egy idegen tárgyat élő szervezetbe juttatunk, mindig aggályos, hogy a tárgy immunreakciót fog kiváltani, 5 például gyulladásos választ, ami negatívan fog hatni a fogadó szervezetre. Például, noha a hidroxiapatitot általában „biokompatibilisnek tartják, jelentős gyulladást és szöveti nekrózist figyeltek meg, amikor kristályos hidroxiapatit mikrohordozókat helyeztek be állatokba intramuszkulárisan [lásd például 10 Untema és munkatársai: Int. J. Pharm. 112:215 (1994)].

A „biológiailag felszívódó kifejezés egy anyagnak arra a képességére utal, mennyire képes felszívódni in vivo. A felszívódási folyamat része az eredeti implantátum anyagainak eliminációja testfolyadékok, enzimek vagy sejtek révén. A felszívódott 15 kalcium-foszfát például újra lerakodhat csontásványként, vagy más módon újrahasznosulhat a testen belül, vagy kiválasztódhat. Az általunk használt „biológiailag erősen felszívódó kifejezés azt jelenti, hogy az intramuszkulárisan vagy szubkután beültetett anyag teljes tömegének legalább 80%-a egy éven belül fel20 szívódik. Előnyös megvalósítási módok esetén az anyag kilenc, hat, vagy három hónapon belül, ideálisan egy hónapon belül felszívódik.

Egy effervescens anyag „hatásos mennyisége olyan mennyiséget jelent, amely elegendő ahhoz, hogy befolyásolja a makroszem25 csék képződését a keményedés során, ami az alkalmazott kalciumfoszfáttól függ. Általában az effervescens anyagot körülbelül 1 és 90 tömeg% között adjuk, előnyösen körülbelül 1 és 50 tömeg% között, még előnyösebben körülbelül 10 és 40 tomeg% között.

Az általunk használt „makroszemcse kifejezés körülbelül 100 30 mikron és 1 milliméter közötti átmérőjű szemcsét vagy részecskét jelent. A találmány szerinti kalcium-foszfát készítmény keményedése során képződött makroszemcsés anyag biokompatibilis (azaz a makroszemcsék megfelelő méretűek ahhoz, hogy ne váltsanak ki gyulladásos választ), és makropórusos, ahogyan azt az alábbiak35 ban ismertetjük.

Az általunk használt „makropórusos kifejezés egy olyan megkeményedett kalcium-foszfátot jelent, amelynek pórusai megfelelő méretűek a sejtek vándorlásához és behatolásához. Egy előnyös

99982-6039/KT lcj’/s02/17798 megvalósítási mód szerint a találmánnyal megegyező módon képződött makropórusos anyag pórusátmérője nagyobb, mint 30 mikron, előnyösen körülbelül 30 és 200 mikron közötti, legelőnyösebben körülbelül 50 és 100 mikron közötti. A találmány szerinti makropórusos anyag elősegíti az extracelluláris csontmátrixot termelő sejtek vándorlását és behatolását, valamint serkenti a sejt-mátrix kölcsönhatásokat.

Egy biológiailag aktív anyag „hatásos mennyisége¹ egy olyan mennyiség, amely elegendő ahhoz, hogy serkentse a jelenlévő vagy behatoló progenitor vagy egyéb sejtek fokozott csontképző aktivitását. A mennyiség a kezelt károsodás méretétől és természetétől függ, valamint az alkalmazott kalcium-foszfát összetételétől. Általában a bejuttatandó biológiailag aktív anyag mennyisége körülbelül 0,1 és körülbelül 100 mg között van; előnyösen körülbelül 1 és körülbelül 100 mg között; és legelőnyösebben körülbelül 10 és körülbelül 80 mg között.

Egy kiegészítő anyag „hatásos mennyisége egy olyan mennyiség, amely elegendő ahhoz, hogy a készítményt felruházza a kívánt mechanikai vagy kémiai tulajdonsággal.

A „keményedés arra a folyamatra utal, amely során a képlékeny kalcium-foszfát készítmény átalakul egy megkeményedett kalcium-foszfáttá. A kalcium-foszfát akkor tekinthető „megkeményedett-nek, amikor lényegében nem formázható, .szilárd anyag. Az ilyen megkeményedett kalcium-foszfát minimális mértékben összenyomható, és plasztikus, nem pedig elasztikus deformálódásra hajlamos.

Az általunk használt „gyengén kristályos, apatitos kalciumfoszfát, „GYKA kalcium-foszfát és „GYKA anyag kifejezések alatt egy szintetikus, gyengén kristályos, apatitos kalciumfoszfátot értünk. A gyengén kristályos apatitos (GYKA) anyag nem feltétlenül jelent kizárólag egy kalcium-foszfát fázist, feltéve, hogy az rendelkezik a jellegzetes röntgendiffrakciós (XRD) és FTIR képpel. Egy GYKA kalcium-foszfát XRD-spektruma lényegében azonos a csontéval. A spektrumra általában csak két széles csúcs jellemző a 20-35° régióban, melyek közül az egyik centruma 26°-nál, a másiké 32°-nál van, valamint FTIR-csúcsok 563 cm^-1nél, 1034 cm^-nél, 1638 cm^-nél és 3432 cm^-1-nél (±2 cm^-1). Éles vállak figyelhetők meg 603 cm^-1-nél és 875 cm^-nél, egy kettős

99982-6039/ΚΤ j* ^:4cT*idS02/17798 csúccsal együtt, amelynek 1422 cm^-1-nél és 1457 cm'¹-nél van maximuma .

Az általunk használt „hidratált előanyag (prekurzor) egy olyan pasztára vagy gittre vonatkozik, amely a száraz GYKA5 előanyagok hidratációja során keletkezik, korlátozott mennyiségű vizes oldat jelenlétében (azaz kevesebb, mint körülbelül 1 ml vizes oldat/1 mg előanyag-por). A hidratált előanyag tartalmazhat reaktánsokat és termékeket is, különböző kombinációkban, attól függően, milyen mértékben zajlott le az átalakulás. Az itt 10 leírt „injektálható, és „formázható GYKA előanyag-paszták is hidratálható előanyagok. Az előnyös „injektálható hidratált előanyagok állaga alkalmas 18 gauge-os hipodermális tűvel való bej uttatásra.

Az általunk használt „promoter kifejezés egy olyan anyagot 15 vagy kezelést jelent, amely megindítja egy hidratált előanyag keményedését és serkentheti az amorf kalcium-foszfát (AKF) GYKA kalcium-foszfáttá való átalakulását. Egyes promoterek részt vehetnek az átalakulásban és beépülhetnek a GYKA anyagba; mások, amelyek ^passzív promoterekként is ismertek, nem vesznek részt 20 az átalakulásban.

Az általunk használt „reaktív kifejezés a kalcium-foszfátnak arra a képességére utal, hogy ha folyadékkal összekeverve hidratált előanyaggá alakítjuk, promoter jelenlétében GYKA anyaggá alakul át, ami a kiindulási anyagok megkeményedésével 25 jár. Az előnyös AKF-okra jellemző, hogy képesek teljesen átalakulni, képesek gyors és keményedéssel járó átalakulásra, képesek átalakulni egyébként inert összetevők jelenlétében, és/vagy képesek átalakulni lényegében homogén GYKA anyaggá. Ahol a GYKA-t egy második kalcium-foszfáttal reagáltakjuk, az „átalakulás ma30 gában foglalhatja az AKF és a második kalcium-foszfát átalakulását is. A keményedés mértéke és a keményedési folyamat kinetikája szintén fontos elemei a reaktivitásnak. Egyes AKF-ok reaktívabbak a többinél. Egy AKF „fokozottan reaktívnak tekinthető, ha átalakul és GYKA anyaggá keményedik egy gyenge promoter je35 lenlétében, mint például a dikalcium-foszfát-dihidrát (DKFD). Az előnyös, fokozottan reaktív AKF-ok megkeményedett GYKA anyagot eredményeznek a gyenge promoter DKFD és víz jelenlétében 37 °Con, kevesebb, mint 12 óra alatt, melynek során a keményedés lé

99982-6039/KT f ^€1^0302/17798

- 12 nyegében lezajlik körülbelül egytől öt óráig terjedő időtartam alatt, ideálisan 10-30 perc alatt.

A kalcium-foszfát

A találmány kalcium-foszfát komponense lehet bármely, a szakemberek által ismert biokompatibilis kalcium-foszfát. A kalcium-foszfátot a különböző eljárások bármelyikével elő lehet állítani, bármely megfelelő kiindulási komponensek alkalmazásával. Például a kalcium-foszfát előállítható amorf, apatitos kalciumfoszfát, mint reaktáns, egy promoter, és egy vizes folyadék keverékéből összeállított, megkeményedő paszta alkalmazásával. Egy másik lehetséges mód, hogy a kalcium-foszfátot kristályos kalcium-foszfát reaktánsok szilárd fázisú sav-bázis reakciójával állítjuk elő, szilárd, kristályos hidroxiapatitot képezve. A kalcium-foszfát mátrixanyagok készítésére szolgáló egyéb eljárások a szakemberek számára ismertek.

Gyengén kristályos apatitos (GYKA) kalcium-foszfát

Az egyik megvalósítási mód szerint a kalcium-foszfát gyengén kristályos, apatitos (GYKA) kalcium-foszfát. GYKA anyagot leírtak a 08/650 764 sorszámú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentésben és 5 650 176 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi iratban, melyek teljes tartalmát hivatkozás útján a kitanítás részének tekintjük. Az anyagot a „Hordozóanyag, „Amorf kalcium-foszfát átalakulása egy új biokerámiává, „Ortopédiai és fogászati kerámia-implantátumok és „Bioaktív kerámia-készítmények című, egymással összefüggő bejelentésekben is leírták, mindegyiküket 1997. október 16-án nyújtották be, és az ETEX Corporation részére ruházták át (Cambridge, MA, USA). Ezeket hivatkozás útján a kitanítás részének tekintjük. Tekintettel az összes ezzel kapcsolatos leírás terjedelmére, a GYKA anyagok részleteit az alábbiakban nem tárgyaljuk. Elegendő összefoglalni a jellemzőit.

A GYKA anyagra jellemző, hogy biológiailag felszívódó és minimális mértékben kristályos. Kristályos jellege lényegében ugyanolyan, mint a természetes csonté. A GYKA szintén biokompatibilis és nem káros a fogadó szervezetre nézve.

A GYKA anyagot paszta vagy gitt formájában (azaz hidratált előanyagként) ültethetjük be a betegbe. Mivel a találmány szerinti reakció, melynek során homogén, makropórusos kalcium

99982-6039/KT ycy^üS02/17798

- 13 foszfát képződik, a testen kívül is megindítható, és szobahőmérsékleten lassan zajlik, minimális esélye van annak, hogy az anyag a műtéti helyre való behelyezés előtt „megköt és használhatatlanná válik. A reakció szignifikánsan felgyorsul fiziológiás körülmények között (vagyis a szervezeten belüli hőmérsékleten és nyomáson) és az anyag a megfelelő helyen keményedik meg. Ez a tulajdonság különösen hasznos műtéti körülmények között, ahol jellemzően szükséges az eszköz illeszkedése a beültetés helyéhez. Például az effervescens anyagot és biológiailag aktív anyagot tartalmazó GYKA-paszta alkalmazható a törés helyére való felvitelre és annak kitöltésére.

Egy alternatív megoldás, ha a GYKA anyagot a szervezeten kívül előkeményítjük, megtöltjük a kívánt biológiailag aktív anyaggal és effervescens anyaggal és egy későbbi időpontban ültetjük be. Ez a megközelítés azokban a szituációkban hasznos, amikor nem lényegesek a mérték alapján készült formák, és ahol az implantátumokat nagy mennyiségben szükséges előállítani.

Általában a találmány szerinti képződési reakció a műtéti helyre való felvitel után fejeződik be. Az anyag jellemzően kevesebb, mint öt óra alatt keményedik meg, fiziológiás körülmények között pedig lényegében körülbelül egy és öt óra közötti idő alatt keményedik meg. Előnyösen az anyag lényegében megkeményedik körülbelül 10-30 percen belül. A GYKA anyag állaga és formázhatósága, valamint a képződési reakció sebessége változtatható a terápiás igénynek megfelelően, néhány egyszerű paraméter módosításával [lásd például a 6 027 742 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi iratot (Lee és munktársai), melynek tartalmát hivatkozás útján a kitanitás részének tekintjük.]

Az átalakulási reakció, amelynek végterméke a GYKA anyag, megindítható a száraz előanyag-komponenesek keverékéhez adott desztillált vízzel, amely sűrű paszta vagy gitt formájú hidratált előanyag kialakulását eredményezi. Desztillált víz helyett egyéb vizes alapú anyagokat, például puffereket, sóoldatot, szérumot vagy szövettenyésztő tápoldatot is lehet alkalmazni. Más megvalósítási módok szerint az előanyag-porhoz a paszta kialakulásához elegendő vizet lehet hozzáadni, amely a találmány szerinti többi komponens hozzáadásakor könnyen injektálható egy 18 gauge-os tűvel. Leggyakrabban az így kapott biológiailag felszí99982-6039/KT

PCr«ÜS02/177 98

- 14 vódó kalcium-foszfát „kalciumhiányos lesz, ami kisebb, mint 1,5 kalcium-foszfát arányt jelent, szemben a hidroxiapatitra jellemző ideális, 1,67-es sztöchiometriai értékkel.

Alkalmas GYKA tartalmú anyagokat úgy kaphatunk, ha GYKAelőanyagokat összekeverünk, majd korlátozott mennyiségű vízzel hidratálunk (pasztát vagy gittet létrehozva), és GYKA anyaggá keményítjük. A megfelelő előanyagok képesek megkeményedni párás környezetben, testhőmérsékleten vagy akörül, kevesebb, mint 5 óra alatt, és előnyösen 10-30 percen belül. Az ily módon keményedő komponensek ekkor intramuszkulárisan vagy szubkután egy teszt-állatba vihetők, és biológiai felszívódóképességük megvizsgálható. Azok az anyagok felelnek meg, amelyek 1-5 g-os pasztillaként belültetve legalább 80%-ban felszívódnak egy éven belül. Előnyösen az anyag teljesen felszívódhat. Általában grammnyi mennyiségek felszívódását könnyebb tesztelni szubkután elhelyezkedés esetén.

A GYKA anyag képződhet olyan reakció során, amelyben legalább egy amorf kalcium-foszfát (AKF) előanyag vesz részt, és előnyösen részt vesz egy aktivált vagy reaktív AKF (lásd például a WO 98/16209 számú PCT szabadalmi bejelentés 1-4. példáját). Bizonyos esetekben a reakcióban csak egy AKF-előanyag vehet részt, amely kontrollált módon átalakul részben vagy teljesen GYKA anyaggá. Ezenkívül egy nem-résztvevő promoter is szerepelhet a reakcióban, hogy serkentse az aktivált AKF általakulását GYKA anyaggá. Bármelyik esetben igen előnyösek azok a reakcók, amelyek a testen kívül megindíthatok, amelyek paszta formában kivitelezhetők, és amelyek szignifikánsan felgyorsulnak 37°C-on, egy megkeményedett kalcium-foszfátot eredményezve.

Az AKF átalakulása GYKA anyaggá víz jelenlétében indul meg. Általában az AKF-ot por formájában használják, összekeverik bármelyik másik reaktánssal (például egy második kalciumfoszfáttal) és korlátozott mennyiségű vizet adnak hozzá, ami paszta vagy gitt kialakulásához vezet. A hidratált előanyag ekkor megkeményedik, és a keményedés GYKA anyag képződésével jár együtt. Az AKF átalakulása GYKA kalcium-foszfáttá kontrollált módon megy végbe pasztát vagy gittet képezve, amely megjósolható módon keményedik, és amely hasznosítható fogászati, ortopédiai vagy más terápiás alkalmazásoknál.

JR · · ·

99982-6039/KT “I ;* ^501^0502/17798

Ha csak amorf kalcium-foszfátot alkalmazunk előanyagként egy felszívódó GYKA anyag előállítására, fontos kontrollálni az AKF természetes hajlamát arra, hogy erősen kristályos hidroxiapatittá alakuljon. Azonban az átalakulásnak elég gyorsan kell lejátszódnia ahhoz, hogy műtétekhez alkalmazni lehessen. Az egyik megközelítés, hogy az előanyag-AKF-ot, ami a kristályképződés gátlószerét tartalmazza (lásd például a W0 98/16209 számú szabaközzétételi irat 1. példáját) összekeverjük egy olyan AKFtal, amely nem tartalmaz kristályképződést gátló szert (például promotert). A reaktánsok száraz állapotban összekeverhetők, a megfelelő részecskeméret biztosításával, és feleslegben adott, gátlószert tartalmazó AKF-tal. A reaktánsokat ezután víz hozzáadásával hidratálhatjuk, majd megemeljük a hőmérsékletet (ez történik például a testbe való bejuttatáskor), hogy a reaktánsok átalakuljanak GYKA anyaggá. A kontrollált átalakításra szolgáló egyéb eljárások katalizátorok bevonásával történnek.

Kristályos hidroxiapatit

Egy második megvalósítási mód szerint a kalcium-foszfát kristályos hidroxiapatit (HA). Kristályos HA-ot írnak le például a Re. 33 221. és Re. 33 161 számú, újból engedélyezett amerikai egyesült államokbeli szabadalmi iratokban (Brown és Chow), amelyek tartalmát hivatkozás útján a kitanítás részének tekintjük. A Brown és Chow szabadalmi iratok kalcium-foszfát remineralizáló készítmények előállítását tárják fel, továbbá leírnak egy finom kristályszerkezetű, nem-kerámia, fokozatosan felszívódó hidroxiapatit hordozóanyagot, amelynek ugyanez a kalcium-foszfátkészítmény az alapja. Hasonló kalcium-foszfát-rendszert, amely tetrakalcium-foszfátból (TTKF) és monokalcium-foszfátból (MKF) vagy annak monohidrát formájából (MKFM) áll, írnak le Constantz és munktársai az 5 053 212 és 5 129 905 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi iratokban, melyek tartalmát hivatkozás útján a kitanítás részének tekintjük. Eszerint a megvalósítási mód szerint a kalcium-foszfátot a kristályos kalcium-foszfát reaktánsok szilárd fázisú sav-bázis reakcióval állítják elő, amely szilárd, kristályos hidroxiapatit képződését eredményezi.

Kristályos HA anyagok (közismert néven: dahllitok) előállíthatok folyékony, képlékeny és in situ megkeményedni képes formában (lásd a Constanz-féle 5 962 028 számú amerikai egyesült ál99982-6039/KT t

2^0302/17798

- 16 lamokbeli szabadalmi iratot). Ezek a HA anyagok (közismert nevükön: karbonátos hidroxiapatitok) úgy állíthatók elő, hogy a nedves és száraz reaktánsokat összekeverjük, amely lényegében egységes keveréket eredményez, majd a készítményt a kívánt módon formázzuk és hagyjuk megkeményedni. Egy alternatív megoldás, ha az előanyag reakcióelegyeket a műtéti helyre juttatjuk és in situ hagyjuk megkeményedni és/vagy formázzuk meg. A keményedés során a készítmény szilárd és lényegében monolitikus apatitos szerkezetté keményedik.

A reaktánsok általában egy szabad vizet lényegében nem tartalmazó foszforsav-forrásból, alkáliföldfém-, különösen kalciumforrásból, esetleg kristályos magokból, különösen hidroxiapatit vagy kalcium-foszfát-kristályokból, kalcium-karbonátból és egy fiziológiailag elfogadható síkosítóanyagból állnak, például vízből, amely tartalmazhat különböző oldott anyagokat. A száraz összetevőket előre össze lehet keverni, majd ezt követően hozzáadni a folyékony összetevőket, olyan körülmények között, ahol lényegében egységes keveredés játszódik le.

A foszforsav-forrás lehet bármilyen, részben semlegesített foszforsav, különösen az első proton teljes semlegesítését értve ezalatt, mint például a monobázikus kalcium-foszfát esetében. Ehelyett vagy ezzel együtt tartalmazhat ortofoszforsavat, lehetőleg kristályos formában, amely szabad víztől lényegében mentes. A kalcium-források általában ellenionokat is tartalmaznak, mint a karbonát, foszfát és hasonlók, különösen a kettős kalcium-foszfát- és foszfát-források, például a tetrakalcium-foszfát vagy trikalcium-foszfát.

A különböző száraz komponensek összekeverhetők a nedves komponensek hozzáadása előtt. A keverés elvegyíti az összetevőket és alkalmazható az összetevők közötti reakciók mértékének szabályozására. A száraz összetevők bármelyike vagy mindegyike hozzáadható a keverékhez a keverés megkezdése előtt, vagy a mechanikus keverés befejezése előtt. Keverés után a készítményt nyugalmi állapotban hagyjuk összeállni, majd egy hosszabb ideig tartó szakasz következik, ami alatt a készítmény megkeményedik.

Az effervescens anyag

A találmány egy új eljárást kínál kalcium-foszfát-mátrix vagy hordozófelület előállítására, amely önmagától „szemcséző99982-6039/KT rca/ÖS02/17798 't

- 17 dik és fiziológiás körülmények között (azaz beadás után) megkeményedett makroszemcsékként vagy makrorészecskékként szétoszlik. A kalcium-foszfát lehet bármely, a szakemberek számára ismert biokompatibilis kalcium-foszfát, például a fent leírt GYKA kalcium-foszfát és kristályos hidroxiapatit tartalmú anyagok. A találmány szerzői azt a meglepő felfedezést tették, hogy egy effervescens anyag hozzáadása ezekhez a kalcium-foszfátokhoz lényegesen megváltoztatja az anyag biológiai, kémiai és mechanikai tulajdonságait, ezáltal szignifikánsan növelve annak terápiás alkalmazhatóságát. A találmány szerinti effervescens anyag lehet bármely olyan, gyógyászatilag elfogadható anyag, amely egy gáz buborékolását vagy felszabadulását okozza fiziológiás hőmérsékleten és/vagy nyomáson.

A beültetett készítményekhez alkalmazható kalcium-foszfátok előállítására szolgáló, jelenleg hozzáférhető eljárások mindegyike bizonyos hátrányokkal jár, többek között korlátozott mértékben injektálhatóak, az előállítás során vagy a beadáshoz való elkészítéskor a fecskendőben bekövetkező szemcseképződés miatt. Az előregyártott kalcium-foszfát szemcséknek, amelyekhez a bioaktív anyag hozzátapad, nagynak kell lenniük (ideálisan 100-1000 pm-esnek) a gyulladásos válaszreakciók kiváltásának elkerüléséhez. Azonban az ilyen nagy, előregyártott szemcséket nem könnyű injektálni a perkután injekciókhoz szükséges kis gauge-os tűkön keresztül. Továbbá ezeket a szemcséket jellemzően nehéz kezelni és alkalmazni, és sok esetben zsugorítással állítják elő őket, amitől lényegében nem-felszívódók lesznek. Ezenkívül az aktív anyagot csak előregyártott szemcsékhez lehet hozzákeverni, amely egy bevonatot eredményez, ahelyett, hogy az anyagba egyenletesen beágyazódna, vagy abban eloszlana. Az eloszlás a biomolekulák kontrolláltabb felszabadulását teszi lehetővé a mátrix felszívódása során.

A találmány egyik fontos szempontja, hogy a találmány szerinti biokerámia műtéti körülmények közötti könnyű használata jelentős előrelépést jelent a szakemberek által ismert egyéb csonthelyettesítő anyagokhoz képest. Nevezetesen egy effervescens anyagot adunk a készítmény egyéb komponenseihez (például kalcium-foszfáthoz és bármilyen kiegészítő anyaghoz) gáz általi habzás vagy buborékolás előidézésére meghatározott körülmények

99982-6039/ΚΤ ;* ^:«rcr7üS02/177 98 között (azaz fiziológiás hőmérsékleten és/vagy nyomáson). A buborékolás vagy pezsgés (effervescencia) szemcséződést és a kalcium-foszfát szétoszlását váltja ki injekció vagy in vivo beültetés során. Ahogy a keményedés és/vagy a cementálódási reakció 5 zajlik, a szemcséződés szimultán lejátszódik és az aktív anyag (amit közvetlenül a beadás előtt hozzá lehet keverni a többi komponenshez vagy hozzáadni a készítményhez) egyenletesen eloszlik az egyes szemcsék teljes térfogatában.

Az effervescens anyagot megfelelő mennyiségben adjuk ahhoz, 10 hogy megakadályozzuk egy monolitikus kalcium-foszfát massza kialakulását. Az effervescens anyag gyorsan és teljes mértében reagál számos különböző kalcium-foszfáttal és egyéb kalciumot vagy foszfort tartalmazó anyaggal, egy homogén, injektálható hordozóanyagot létrehozva. Az adott kalcium-foszfáttól függően az 15 effervescens anyagot úgy választjuk ki, hogy elegendő mértékben befolyásolja a keményedést vagy cementálódást ahhoz, hogy viszonylag egységes szemcsék alakuljanak ki, de nem olyan mértékben, hogy a kalcium-foszfát cement nem-reaktívvá váljon. Az effervescens anyag hozzáadásának hatására a szemcséződés lénye20 gében csak az injektálás vagy az in vivo beültetés után játszódik le. Ennek eredményeképpen a szemcséződés nem játszódik le a kalcium-foszfát elkészítése és/vagy a cement képződése alatt, az injektálás vagy beültetés előtt. Az effervescens anyag jelenlétében képződött szemcsék eléggé nagyok ahhoz, hogy meggátolják a 25 gyulladásos reakciót (jellemzően nagyobbak, mint 30 pm) mégis eléggé kicsik ahhoz, hogy szignifikáns felület/térfogat arányt biztosítsanak. A nagy felület/térfogat arány lehetővé teszi a kalcium-foszfát gyors felszívódását az új csont regenerációja során. A nagy felszín serkenti a biológiailag aktív anyag fel30 szabadulását is, miközben ott tartja a hatóanyagot a műtéti beavatkozás helyén, a csontképződés megindulásához szükséges ideig. Ezenkívül a nagy felület/térfogat arány serkenti a sejtek vándorlását és behatolását a mátrixba, ami lehetővé teszi az extracelluláris csontmátrix termelését és biztosítja a hozzáfé35 rést az erek számára. A találmány szerinti eljárások és készítmények alkalmazása során in vivo képződött szemcsék mérete az 12000 pm tartományban van, előnyösen a 30-1000 pm tartományban,

99982-6039/KT ~ί ;* ^:*Íct7öS02/17798 még előnyösebben a 30-500 pm tartományban, legelőnyösebben az 50-100 pm tartományban.

Az egyik megvalósítási mód szerint az effervescens anyag egy gáz, amelyet feloldunk a hidratált kalcium-foszfátban. A gázt 5 feloldhatjuk az anyagban nyomás alatt, vagyis a készítményt a gáz olyan magas nyomásának alávetve, ami nem befolyásolja a cementálódási reakciót. A gáz ezután fiziológiás hőmérsékleten (vagyis az injekció vagy a beültetés során) felszabadul, a gáz oldékonyságának a hőmérséklet növekedésével járó csökkenése mi10 att. Ilyen körülmények között a gáz oldódása és az ezt követő szemcséződés csak a keményedés során játszódik le in vívó, és nem a beadás előtt. Ez különösen kedvező, mivel nem kívánatos, hogy a szemcséződés szobahőmérsékleten lejátszódjon a fecskendőben. Csak példaként említjük, hogy alkalmas gáz lehet többek kö15 zött a szén—dioxid, a levegő, a nitrogén, a hélium, az oxigén és az argon.

Egy másik megvalósítási mód szerint az effervescens anyag egy illékony folyadék, amely fiziológiás hőmérsékleten elpárolog .

Ismét egy másik megvalósítási mód szerint az effervescens anyag egy szilárd anyag, amely gázfelszabadulás kíséretében oldódik. Például a nátrium-bikarbonát szén-dioxid gázt szabadít fel, miközben instabil karbonsav-intermedierré alakul, amelyből a továbbiakban szén-dioxid és víz keletkezik.

Biológiailag aktív anyagok

Bármely biológiailag hasznos hatóanyag, amely elősegíti vagy serkenti az új csont növekedését, bejuttatható a találmány szerinti kalcium-foszfát segítségével. Különösen fontosak a csontképződést serkentő anyagok, például a csont morfogén fehérjék 30 (például rekombináns humán BMP-2), a demineralizált csontmátrix, a transzformáló növekedési faktorok (például TGF-β) és különböző egyéb szerves anyagok, amelyekről ismert, hogy serkentik a csontképződést. Ehelyett vagy emellett, a csontosodás optimizálásához a hordozóanyagba csontképző sejteket olthatunk be.

Csontképződést serkentő fehérjék

A biológiailag aktív anyagokat előnyösen a transzformáló növekedési faktor-béta (TGF-β) szupercsaládként ismert fehérjecsa99982-6039/KT f ^:*3CT^0S02/17798

Iádból választjuk, ezek közé tartoznak az aktivinek, az inhibinek és a csont morfogén fehérjék (BMP-k). Legelőnyösebben az aktív anyag legalább egy fehérjét tartalmaz az általában BMPkként ismert fehérje-alcsaládból, amelyeknek feltárták csontképződést serkentő aktivitását, és egyéb növekedésre és differenciálódásra gyakorolt hatását. Ezek közé a BMP-k közé tartozik a BMP-2, BMP-3, BMP-4, BMP-5, BMP-6 és BMP-7, amelyeket például az 5 108 922; 5 013 649; 5 116 738; 5 106 748, 5 187 076 és

141 905 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi iratban írtak le; a BMP-8, amelyet a WO91/18098 számú PCT közzétételi iratban írtak le; a BMP-9, amelyet a WO93/00432 számú PCT közzétételi iratban írtak le; a BMP-10, amelyet a WO94/26893 számú PCT közzétételi iratban írtak le; a BMP-11, amelyet a WO94/26892 számú PCT közzétételi iratban írtak le; vagy BMP-12 vagy BMP-13, amelyet a WO95/16035 számú PCT közzétételi iratban írtak le; a BMP-15, amelyet az 5 635 372 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi iratban írtak le; vagy a BMP-16, amelyet az 5 965 403 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi iratban írtak le. A találmány szerint aktív anyagként alkalmazható egyéb TGF-β fehérjék közé tartozik a Vgr-2 [Jones és munktársai, Mol. Endocrinol. 6:1961-1968 (1992)] és bármelyik a növekedési és differenciációs faktorok közül (GDF-ek), beleértve azokat, amelyeket többek között az alábbi PCT közzétételi iratokban írtak le: WO94/15965; WO94/15949; WO95/01801; WO95/01802; WO94/21681; WO94/15966; WO95/10539; WO96/01845; WO96/02559 stb. A találmányban szintén hasznos lehet a BIP, amelyet a WO94/01557 számú közzétételi iratban írtak le; a HP00269, amelyet a JP 7250688 számú közzétételi iratban írtak le, és az MP52, amelyet a WO93/16099 számú PCT közzétételi iratban írtak le. Valamennyi fenti közlés tartalmát hivatkozás útján a kitanítás részének tekintjük. A BMP-k egy csoportja, amelyeket a találmány szerint előnyben részesítünk, magában foglalja a BMP-2-t, a BMP-4-et, a ΒΜΡ-5-öt, a BMP-6-ot, a BMP-7-et, a BMP-10-et, a BMP-12-t és a BMP-13-at. Az aktív anyag legelőnyösebben BMP-2, amelynek a szekvenciáját az 5 013 649 számú egyesült államokbeli szabadalmi iratban írták le, melynek tartalmát hivatkozás útján a kitanítás részének tekintjük. A szakemberek számára ismert egyéb BMP-k és TGF-β fehérjék szintén alkalmazhatók.

99982-6039/KT

PCT/US02/17798

- 21 Az aktív anyagot elő lehet állítani rekombináns módon, vagy egy fehérjekeverékből tisztítva. Az aktív anyag, akár TGF-β, akár BMP vagy egyéb dimer fehérje, lehet homodimer, vagy képezhet heterodimert más BMP-kkel (például egy BMP-2 és egy BMP-6 5 monomerből álló heterodimer), vagy a TGF-β szupercsalád más tagjaival, például aktivinekkel, inhibinekkel és TGF-βl-gyel (például egy BMP monomerből és a TGF-β szupercsalád egyik tagjából álló heterodimer). Az ilyen heterodimer fehérjékre írnak le példákat többek között a WO 93/09229 számon közzétett PCT szabadal10 mi bejelentésben, amelynek tartalmát hivatkozás útján a kitanítás részének tekintjük.

Az aktív anyag továbbá tartalmazhat kiegészítő hatóanyagokat, például a Hedgehog, Frazzled, Chordin, Noggin, Cerberus és Follistatin fehérjéket. Ezen fehérjecsaládok általános leírását 15 lásd Sasai és munktársai, Cell 79:779-790 (1994) (Chordin); a WO 94/05800 számú PCT közzétételi irat (Noggin); és Fukui és mtsai; Devel. Biol. 159:131-139 (1993) (Follistatin). Hedgehog fehérjéket a WO96/16668; a WO96/17942; és a WO95/18856 számú szabadalmi bejelentésben írnak le. A Frazzled fehérjecsalád egy 20 közelmúltban leírt fehérjecsalád, amely nagyfokú homológiát mutat a Frizzled néven ismert receptorfehérje-család extracelluláris kötődomainjével. A Frizzled gén- és fehérjecsaládot Wang és munktársai írták le [J. Bioi. Chem. 271:4468-4476 (1996)]. Az aktív anyagok közé tartozhatnak egyéb oldékony receptorok is, 25 például a WO95/07982 számú PCT közzétételi iratban leírt csonka (truncated) oldékony receptorok. A WO95/07982 számú közzétételi iratban leírtak szeint a témában járatos szakember fel fogja ismerni, hogy csonka oldékony receptorokat számos egyéb receptorfehérje esetén elő lehet állítani. Ezek szintén a találmány tár30 gyát képezik. A fenti publikációk tartalmát hivatkozás útján a kitanítás részének tekintjük.

Az általunk alkalmazott aktív hatóanyag alkalmas mennyisége az a mennyiség, amely hatékonyan fokozza a jelenlévő vagy behatoló progenitor- vagy egyéb sejtek csontképző aktivitását, és ez 35 a mennyiség a kezelendő károsodás méretétől és természetétől, valamint az alkalmazott hordozóanyagtól függ. Általában a bejuttatandó fehérje mennyisége körülbelül 0,1 és körülbelül 100 mg

99982 6039/KT ··; ,· Í.|e j7®S02 /17 7 98 között lehet, előnyösen körülbelül 1 és körülbelül 100 mg között, legelőnyösebben körülbelül 10 és körülbelül 80 mg között.

Csontképző sejtek

Az egyik megvalósítási mód szerint a csontosodás optimalizálásának érdekében a kalcium-foszfát-készítménybe csontképző sejteket ültethetünk, például progenitor-sejteket, őssejteket és/vagy oszteoblasztokat (csontépítő sejteket). Ezt a legkönnyebben úgy végezhetjük el, hogy a kalcium-foszfát-készítményt érintkezésbe hozzuk a beteg saját csontképző sejtjeinek egyik forrásával. Ilyen sejtek találhatók a csonthoz kapcsolódó szövetekben, vérben vagy testfolyadékokban, beleértve olyan külső folyadékokat, amelyek érintkeztek csonttal vagy a csont anyagaival vagy bizonyos régiókkal, beleértve a csonthártyát, a szivacsos csontállományt és a csontvelőt. Amikor a készítményt olyan eszközökkel összekapcsolva használjuk, amelyeknek a csontba való behatolását a csonthártya szakadása és/vagy vérzés kíséri, például csavarokkal és tűkkel, nincs szükség sejtek beoltására. Lemezek esetében, amelyek csak a csont kéregállományával érintkeznek, javasolt a csonthártyában végzett lézió, amely érintkezni fog az eszközzel. Egyéb megvalósítási módok szerint hasznos, ha a beültetés helyén műtétileg készítünk a csontban egy alapot a csont kéregállománya egy részének eltávolításával. A betegből kivett csontképző sejtek beépíthetők az átültetett szövetbe, hogy fokozzák a csontosodást. Nem saját csontsejtek alkalmazása szintén a találmány oltalmi körébe tartozik, ha a kívánt mértékű csontregeneráció azelőtt lezajlik, hogy a fogadó szervezet kivetné magából a csontképző sejteket. így az elsődleges forrásokból, sejtvonalakból vagy sejtbankokból származó sejtek vagy szövetek hasznosak lehetnek bizonyos megvalósítási módok esetében. Lásd a 6 132 463 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi iratot, melynek tartalmát hivatkozás útján a kitanítás részének tekintjük.

Kiegészítő anyag

A találmány szerinti készítmény elkészíthető kalciumfoszfát, effervescens anyag és biológiailag aktív anyag egy kiválasztott kiegészítő anyaggal való összekeverésével. A kalciumfoszfát szolgálhat megerősítő anyagként, mátrixként vagy mindkettőként. A kalcium-foszfátra kezdeti, hidratált formájában egy

99982-6039/KT f ^:f*2ÍlÍ?S02/17798

- 23 körülbelül 6 és 7 közötti pH-érték jellemző, ezért a kiegészítő anyagok széles körével kompatibilis károsító hatás nélkül. A kiegészítő anyagot a kalcium-foszfáttal és a többi komponenssel való kompatibilitása alapján választjuk, és az alapján, hogy milyen (biológiai, kémiai vagy mechanikai) tulajdonságokkal képes felruházni a készítményt, amelyek egy adott terápiás célhoz kívánatosak. Például a kiegészítő anyag választható a húzószilárdság és a keménység növelése, a törési szilárdság növelése, a képalkotó eljárásokkal való megjeleníthetőség, és/vagy a kalcium-foszfát áramlási és ülepedési tulajdonságainak megváltoztatása érdekében.

A kiegészítő anyagot különböző mennyiségben és különböző fizikai módosulatok formájában adhatjuk a kalcium-foszfát készítményhez a feltételezett terápiás alkalmazástól függően. Például a kiegészítő anyag alkalmazható szilárd szerkezet formájában, például szivacsok, hálók, filmek, rostok, gélek, szálak vagy részecskék, ezen belül mikro- és nanorészecskék formájában. A kiegészítő anyag maga is lehet keverék. A kiegészítő anyag lehet egy részecskékből álló vagy folyékony adalék vagy kenőanyag, amelyet kíméletesen összekeverünk a felszívódó kalcium-foszfáttal. Egy GYKA kalcium-foszfáttal kíméletesen összekeverve a kiegészítő anyag makroszkopikus szinten befolyásolhatja a cementálódási reakciót. Ez előfordulhat, ha a kiegészítő anyag bevonatot képez a cementrészecskék egy hányadán, lehetővé téve, hogy a bevont részecskék felszínén egy gyenge cementálódási reakció játszódjon le. Az is előfordulhat, hogy a folyadék vagy szilárd anyag fizikai szétválást okoz a reaktív felek között, ami fokális cementképződést (vagy szemcséket) eredményez. A kiegészítő anyag szolgálhat mátrixként a kalcium-foszfát számára, ami a mátrixba beágyazódik vagy abban eloszlik. Az is lehetséges, hogy a kalcium-foszfát szolgál mátrixként a kiegészítő anyag számára, amely abban eloszlik. A kiegészítő anyag alkalmazható egy kalcium-foszfát-testen képzett bevonatként, például egy elkészítés után képzett bevonatként, amivel lelassítható a felszívódás, vagy egyéb módon befolyásolhatók a biokerámia tulajdonságai. Végül a kiegészítő anyag bevonható a kalcium-foszfát készítménnyel .

99982-6039/KT t ίφ£#»02/17798

- 24 A kiegészítő anyagok előnyösen biokompatibilisek, ami azt jelenti, hogy az anyag nem vált ki károsító reakciót, amikor a fogadó szervezetbe ültetjük. Számos esetben kívánatos, hogy a kiegészítő anyag biológiailag felszívódó is legyen. A kiegészítő anyag rendelkezhet kalciumhoz, foszfáthoz vagy kalcium-foszfátokhoz való affinitással, ami fokozni fogja a kalcium-foszfát és a kiegészítő anyag közötti kölcsönhatások erősségét. Az affinitás lehet fajlagos vagy nem-specifikus ionos kölcsönhatások által közvetített. Az alkalmas, biológiailag lebontható polimerekre, amelyeket a készítményben mátrixként alkalmazhatunk, nem korlátozó értelmű példaként említjük a kollagént, glikogént, kitint, cellulózokat, keményítőt, keratinokat, selymet, nukleinsavakat, demineralizált csontmátrixot, származékolt hialuronsavat, polianhidrideket, poliortoésztereket, poliglikolsavat, politejsavat és ezek kopolimerjeit. Ezen belül az a-hidroxikarboxisavak poliészterei, például a poli(L-laktid) (PLLA), poli(D,L-laktid) (PDLLA), poliglikolid (PGA), poli(laktid-ko-glikolid) (PLGA), poli(D,L-laktid-ko-trimetilén-karbonát) és polihidroxibutirát (PHB), és polianhidridek, például a poli(anhidrid-ko-imid) és ezek kopolimerei közismerten biológiailag lebonthatók és alkalmasak a találmány szerinti alkalmazásra. Ezenkívül bioaktív üvegkeverékek, például SiO₂-ot, Na₂O-ot, CaO-ot, P₂0₅-ot, A1₂O₃ot és/vagy CaF₂-ot tartalmazó keverékek szintén alkalmazhatók a találmány szerinti kalcium-foszfát-készítménnyel kombinálva. Az egyéb alkalmas biológiailag lebontható polimerek közé tartoznak a poliszaharidok, a peptidek és a zsírsavak.

Biológiailag lebontható polimereket előnyösen alkalmazhatunk biológiailag felszívódó eszközök elkészítéséhez, nem korlátozó értelmű példaként említve az intermedulláris szögeket, tűket, csavarokat, lemezeket és horgonyokat egy csontos helyszínre való beültetéshez. A biológiailag felszívódóképes rost alkalmazható ún. bajuszok formájában, amely kölcsönhatásba lép a kalciumfoszfátokkal a készítménytervezésnek és -gyártásnak a szakemberek számára ismert elveinek megfelelően. Ilyen eszköz előállítható a kalcium-foszfát és a polimer porrá őrlésével. Egy másik lehetőség, hogy a kalcium-foszfát-mátrixot PLLA rostokkal erősítjük meg, hasonló PLLA rostokat használva, mint amiket Tormala és munktársai leírtak [Clin. Mater. 10: 29-34 (1992), melynek

99982-6039/KT ;* ·φτ^602/17798

- 25 tartalmát hivatkozás útján a kitanítás részének tekintjük] biológiailag lebontható, önmegerősítő készítmények gyártására.

Biológiailag felszívódó polimereket csontragasztók vagy gittek előállításához is lehet alkalmazni terheléses szituációkban történő alkalmazáshoz. A készítményhez kiegészítő anyagokat adhatunk a csontragasztó összenyomhatóságának és teherbíró képességének fokozására. Különösen szénszálakat vagy más erősítő rostokat lehet a készítményhez adni. A rostokkal megerősített csonthelyettesítő ragasztók előállításánál előnyös lehet a rostok plazma-maratása a kalcium-foszfát/rost kölcsönhatások minőségének és erősségének javítására. A kalcium-foszfát keményedése történhet 37°C-on, porrá törve vagy egyéb módon aprítva, és ismert kötőanyagokkal keverve, például csontragasztókkal, cementekkel, töltőanyagokkal, gipszekkel, epoxikkal, más kalciumfoszfátokkal vagy gélekkel, mint - nem korlátozó értelmű példaként - a kalcium-szulfát, alginát, kollagén vagy kereskedelmi forgalomban kapható termékek, mint az Endobone (Merck), Hapset (Lifecore Biomedical), SRS® (Norian), Bonesource® (Leibinger), Collograft® (Zimmer), Osteograf® (CereMed) és Simplex® (Howmedica). Olyan alkalmazásoknál, ahol a megkeményedett kalcium-foszfát eloszlik a kötőanyagban, a kötőanyagot leggyakrabban a szakember számára ismert eljárásokkal készítik és körülbelül egyenlő arányban vegyítik a szemcsés kalcium-foszfáttal, noha a tényleges arányok a szakember számára ismert módon változnak a kívánt állagú, megmunkálhatóságú és tapadékonyságú készítmény előállítása érdekében.

Egy másik megvalósítási mód szerint fonott szerkezetű varratokat, amelyek jellemzően poliészterből készülnek, be lehet vonni a találmány szerinti kalcium-foszfát készítménnyel, a biokompatibilitás megnövelése érdekében. Bevonatos varratok úgy készíthetők, hogy a varratot a kalcium-foszfátot tartalmazó cementlébe mártjuk. A varrat affinitása a kalcium-foszfát bevonathoz növelhető, ha a varratot, a kalcium-foszfát részecskéket vagy mindkettőt felületi kezelésnek vetjük alá. A felületi kezelések közé tartozik a plazma-maratás és/vagy a kémiai oltás.

Egyéb megvalósítási módok szerint egy olyan készítmény állítható elő, amely a kalcium-foszfátból és egy nem-felszívódó vagy rosszul felszívódó anyagból áll. Az alkalmas nem-lebontható

99982-6039/KT ;* ^7^002/17 798

- 26 vagy rosszul lebontható anyagok közé tartoznak a következők: dextránok, polietilén, polimetil-metakrilát (ΡΜΜΆ), szénszálak, polivinil-alkohol (PVA), poli(etilén-tereftalát)poliamid, bioüvegek és azok a vegyületek, amelyeket korábban a csontragasztókhoz vagy gittekhez való alkalmazásnál felsoroltunk.

Egy másik alkalmazás különböző eszközök, például tűk vagy erősítő háló állandó beágyazása magába a csontba. A tárgy horgonyként szolgál a természetes csonthoz való stabil kapcsolódáshoz. Ez különösen hasznos szalagok és inak csonthoz való rögzítéséhez. Biológiailag felszívódó és csontképző kalcium-foszfátból és egy alkalmas nem-felszívódó eszközből álló tárgyak belehelyezhetők egy csontba és további kalcium-foszfáttal vagy keverékanyaggal rögzíthetők csontragasztó formájában. Ezáltal az eszköz beágyazódik a csontba a kalcium-foszfát újracsontosodását követően.

A találmány egy másik megvalósítási módja szerint a készítményt kalcium-foszfát vagy keverékanyag és egy olyan kiegészítő anyag összekeverésével készítjük, amely megváltoztatja a készítmény felszívódóképességét, megkötési idejét és/vagy áramlási sajátságait. Például szilikonolajat vagy egyéb síkosító polimereket vagy folyadékokat adhatunk a készítményhez, hogy javítsuk a fogadó szervezetbe fecskendővel bejuttatandó készítmény áramlási tulajdonságait. A síkosító anyag előnyösen biokompatibilis és képes gyorsan leázni a csonthelyettesítő készítményről a kalcium-foszfát készítmény in vivo megszilárdulását követően. Az alkalmas síkosítókra csak példaként említjük a polimer viaszokat, lipideket és zsírsavakat. Síkosítókat körülbelül 0,1 és körülbelül 30 tömeg% közötti koncentrációban lehet alkalmazni.

A következő példákban részletezzük a találmány jelenlegi előnyös megvalósítási módjait. A témában járatos szakemberek ezeknek a leírásoknak számos módosításával és változatával találkozhatnak a gyakorlatban. Úgy véljük, hogy ezek a módosítások és változatok a csatolt igénypontokban benne foglaltatnak. Ezek a példák semmilyen értelemben nem korlátozzák a találmányt.

A leírásban hivatkozott valamennyi szabadalom és közzétett szabadalmi bejelentés teljes tartalmát hivatkozás útján a kitanítás részének tekintjük.

-. *»«« · »»»»

99982-6039/KT f ^¢^02/17798

Példák

Az ezen példákban alkalmazott valamennyi összetevő gyógyászati tisztaságú. A kalcium-foszfát komponens a kereskedelmi forgalomban kapható csonthelyettesítő anyag volt, amelyet CEREDEX® márkanéven forgalmaz az Etex Corporation (38 Sydney Street, Cambridge, MA 02139, USA) . Az alkalmazott biológiailag aktív anyag rekombináns, 2. típusú humán csont morfogén fehérje (rhBMP-2) volt. A BMP-2 előállításának és jellemzésének részletes leírását lásd az 5 013 649 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi iratban.

1. példa

Kalcium-foszfát készítmény előállítása

Egy gyengén kristályos, amorf, apatitos kalcium-foszfát pasztát készítettünk az 5 650 176 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi iratban leírtak alapján, azzal a különbséggel, hogy 20 tömeg% nátrium-bikarbonátot adtunk a por formájú amorf kalcium-foszfát (AKF) előanyaghoz. Ekkor az AKF-ot korlátozott mennyiségű vízzel hidratáltuk, egy pasztát létrehozva, amely szobahőmérsékleten 20-30 percig megmunkálható maradt.

2. példa

In vitro beültetés analízise

Kalcium-foszfát készítményt állítottunk elő az 1. példában leírtak szerint. A hidratált pasztát ekkor egy sóoldat-fürdőbe injektáltuk szobahőmérsékleten. A kalcium-foszfát makroszemcsékké keményedett szimulált in vivo körülmények között (vagyis 37°C hőmérsékleten).

3. példa

Intramuszkuláris injekció

Az első, 20 tömeg% nátrium-bikarbonátot tartalmazó kalciumfoszfát készítményt az 1. példában leírtak alapján készítettük. A második kalcium-foszfát pasztát az 5 650 176 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi iratban leírtak alapján készítettük, azzal a különbséggel, hogy 29 tömeg% polietilén-glikolt adtunk a por formájú amorf kalcium-foszfát (AKF) előanyaghoz. A két AKF készítményt ezután korlátozott mennyiségű vízzel hidratáltuk két pasztát képezve, amelyekben körülbelül 100-1000 mikronos makroszemcsék keletkeztek a kiültetés során, néhány órával az injekció után. Ezenkívül (ezeket az adatokat nem tüntettük

-, ►»· ♦ · ».«« * ♦ υ *

99982-6039/KT fPCTÍ‘Usjk2/17798

- 28 fel) a szemcséződés lejátszódott 20 μς rhBMP-2 beinjektálása után, akár a kalcium-foszfát monolitikus alapozócementben, akár az önszemcséződő kalcium-foszfát készítményben bejuttatva. Az újonnan képződött csont mennyisége a 21. napon szignifikánsan nagyobb volt, ha rhBMP-2-t juttattunk be a makroszemcsés (kalcium-foszfát) készítményben, mint a kontroll anyagban (monolitikus cement); az adatokat nem tüntettük fel. Továbbá a makroszemcsés kalcium-foszfát alkalmazásával bejuttatott rhBMP-2 helyi kilökődése szignifikánsan kisebb volt, mint a kontroll anyag esetében (vagyis körülbelül 30%, szemben a 75%-kal, az adatokat nem tüntettük fel) . A találmány szerinti makroszemcsés készítmény a csontképződést serkentő fehérje gyorsabb felszabadulását biztosítja a megnövekedett felületnek köszönhetően, ami a mátrix csontképző sejtjeinek felszívódásához rendelkezésre áll. A mátrix felszívódása következtében oldékony rhBMP-2 szabadul fel a kalcium-foszfátból.

4. példa

Intrafibuláris oszteotómia (szárkapocscsont-vésés) injekció

Egy 20 tömeg% nátrium-bikarbonátot tartalmazó kalciumfoszfát készítményt készítettünk az 1. példában leírtak alapján. 20 pg rhBMP-2-t adtunk a keletkezett AKF készítményhez, amelyet ezután korlátozott mennyiségű vízzel hidratáltuk, pasztát képezve. A hidratált anyagból 0,5 cm³-t injektáltunk egy nem-ember főemlős fibula-oszteotómiájába (szárkapocscsont-vésésébe). A szemcséződés és a makroszemcsék eloszlása egy nap után nyilvánvaló volt. Ezzel szemben egy héttel az injekció után a nátriumbikarbonát-mentes standard kalcium-foszfát (kontroll) szilárd monolitikus massza maradt (az adatokat nem tüntettük fel).

5. példa

Nem-ember főemlős fibula-oszteotómiája

Egy 20 tömeg% nátrium-bikarbonátot tartalmazó kalciumfoszfát készítményt (rhBMP-2/NaBSM20) készítettünk a 4. példában leírtak alapján. Ennek a vizsgálatnak az volt a célja, hogy meghatározzuk az egyszeri, 7 nappal a műtét után adott perkután rhBMP-2/NaBSM20 injekció hatékonyságát a fibula-oszteotómia gyógyulásának felgyorsításában felnőtt hím cynomolgus-majmokban. Ezeket az eredményeket összevetettük egy korábbi vizsgálattal, ahol az injekciót 3 órával a műtét után adtuk (az adatokat nem

99982-6039/KT PCT/W0ő/*L7 7 98

- 29 tüntettük fel). Kisméretű intramedulláris tűvel stabilizált, kétoldali fibula-oszteotómiát hoztunk létre 12 állatban. 6 állatnál az egyik oszteotómiába 0,5 ml, milliliterenként 1,5 mg rhBMP-2-t tartalmazó NaBSM20 oldatot injektáltunk, hét nappal az oszteotómia létrehozása után. Az ellenoldali fibula-oszteotómiát műtéti kontrollként kezeletlenül hagytuk. A fennmaradó hat állatnál az egyik oszteotómiába rhBMP-2 nélküli puffer/NaBSM20 oldatot injektáltunk hordozókontrollként. Az ellenoldali oszteotómia itt is kezeletlen műtéti kontrollként szolgált.

A műtét után hetenként végzett, sorozatos radiográfiával mineralizált csontképződés volt kimutatható, az rhBMP-2/NaBSM20 oldattal kezelt osztotómiák esetében már 1 héttel az injekció után. Az injekció utáni két héten belül jelentős mértékű új csontképződés volt látható radiográfiával. Az oszteotómián átívelő új csontkallusz már a kezelés után 3-5 héttel jelen volt (az oszteotómia után 4-6 héttel). Az oszteotómiák radiográfiával gyógyultnak tűntek a kezelés utáni 7. hétre (8 héttel az oszteotómia után). Ebben az időpontban nem volt bizonyíték NaBSM hordozóanyag-maradék jelenlétére. Az ellenoldali kontroliokban nem volt bizonyítható az új csontképződés az injekció utáni 3.4. hétig (az oszteotómia utáni 4.-5. hétig). Nem volt radiográfiás bizonyíték az átívelő kalluszra vagy az oszteotómia gyógyulására a kezelés után 7 héttel (az oszteotómia után 8 héttel) az rhBMP-2/NaBSM20 oldattal kezelt csoport kontralaterális műtéti kontrolljában. A második állatcsoportban a puffer/NaBSM oldattal kezelt, ellenoldali műtéti kontrollok radiográfiás képe hasonló volt az rhBMP-2/NaBSM20 oldattal kezelt csoport ellenoldali műtéti kontrolijaihoz. Az injekció után 7 héttel (az oszteotómia után 8 héttel) még mindig bizonyítható volt a hordozóanyag maradékának jelenléte a puffer/NaBSM oldattal kezelt oszteotómiákban.

Az rhBMP-2/NaBSM20 oldattal kezelt oszteotómiák torziós mechanikai ereje 8 héttel az oszteotómia után szignifikánsan nagyobb volt, mint a normál csont ereje és merevsége (1,58 ± 0,40 vs 1,24 ± 0,26 Nm). A torziós erő szintén szignifikánsan nagyobb volt ebben a csoportban az ellenoldali műtéti kontrollokhoz képest (0,72 ± 0,19 Nm) és ennek a csoportnak a puffer/NaBSM20 oldattal kezelt ellenoldali műtött oszteotómiáihoz képest (0,87 ±

99982-6039/KT ..'P(tT/Vét)2./177 98

0,29 és 0,74 ± 0,21 Nm) . Nem volt szignifikáns különbség a torziós mechanikus erő tekintetében a puffer/NaBSM20 oldattal kezelt oszteotómiákban, összehasonlítva ugyanazon állatok ellenoldali kontroll oszteotómiáival, illetve az rhBMP-2/NaBSM oldattal 5 kezelt állatok műtéti kontrolijaival. A kezeletlen műtéti kontroll oszteotómiák megközelítik a normál csont mechanikai erejét körülbelül 14-16 hét után. Hasonló eredmények figyelhetők meg az oszteotómiák merevségét illetően.

Ez a vizsgálat az oszteotómia gyógyulásának 50%-nál nagyobb 10 gyorsulását mutatja rhBMP-2/NaBSM20 injekció eredményeképpen 7 nappal az oszteotómia létrehozása után. Az új csont képződése sokkal hamarabb jelent meg, mint az rhBMP-2/NaBSM20 oldattal és rhBMP-2/aBSM oldattal kezelt oszteotómiákban, amelyeket az oszteotómia után 3 órával és 1 nappal kezeltek a korábbi vizsgá15 latokban. A torziós mechanikai erő szintén nagyobb volt az oszteotómia után 7 nappal kezelt állatokban a 3 órás és 1 napos kezeléshez képest. Az oszteotómia gyógyulásának felgyorsulása körültbelül 30-40%-os volt, amikor a kezelést ebben a két időpontban végezték. Előzetes eredmények azt mutatják, hogy a fel20 gyorsult oszteotómia-gyógyulást el lehet érni az oszteotómia létrehozása után 2 héttel végzett kezeléssel is. Ezeknek a vizsgálatoknak az eredményei azt mutatják, hogy az rhBMP-2/NaBSM20 kombináció szignifikánsan felgyorsítja az oszteotómia gyógyulását, ha a beadást az oszteotómia utáni 3. óra és 7. nap között 25 végezzük.

Claims (23)

1. 99982-6039/KT

   PÍT/ÜS*0e*/177 98

   Szabadalmi igénypontok

   1. Készítmény csontdefektussal rendelkező emlős kezelésére, amely tartalmaz egy oszteogén (csontképződést serkentő) fehérjét mint elsődleges biológiailag aktív anyagot, egy kalcium-foszfátot mint hordozót és hatékony mennyiségű effervescens anyagot.
2. 2. Az 1. igénypont szerinti készítmény, amelyben a csontképződést serkentő fehérje a csont morfogén fehérjecsalád (BMP) tagjainak egyike.
3. 3. A 2. igénypont szerinti készítmény, amelyben a csontképződést serkentő fehérje a BMP-2, BMP-4, BMP-5, BMP-6, BMP-7, BMP-10, BMP-12 és BMP-13 fehérjék bármelyike.
4. 4. A 2. igénypont szerinti készítmény, amelyben a csontképződést serkentő fehérje BMP-2 vagy BMP-6.
5. 5. Az 1-4. igénypontok bármelyike szerinti készítmény, amelyben a kalcium-foszfát az alábbi kalcium-foszfátok bármelyike: amorf apatitos kalcium-foszfát, hidroxiapatit, trikalciumfoszfát és fluoroapatit.
6. 6. Az 1-4. igénypontok bármelyike szerinti készítmény, amelyben a kalcium-foszfát egy amorf apatitos kalcium-foszfát.
7. 7. Az 1-4. igénypontok bármelyik szerinti készítmény, amelyben a kalcium-foszfát gyengén kristályos, apatitos kalciumfoszfát .
8. 8. A 7. igénypont szerinti készítmény, amelyben a gyengén kristályos, apatitos kalcium-foszfátban a kalcium/foszfát arány összevethető a természetben előforduló csontásványokéval.
9. 9. A 7. vagy 8. igénypont szerinti készítmény, amelyben a gyengén kristályos, apatitos kalcium-foszfátban a kalcium/foszfát arány kisebb, mint 1:1,50.
10. 10. A 7-9. igénypontok bármelyike szerinti készítmény, amelyben a gyengén kristályos, apatitos kalcium-foszfátban a kalcium/foszfát arány kisebb, mint 1:1,40.

    99982-6039/KT

    ΡΓΤ/Π5Ό^/17798
11. 11. Az 1-10. igénypontok bármelyike szerinti készítmény, amelyben az effervescens anyag az alábbi gázok bármelyike: szén-dioxid, levegő, nitrogén, hélium, oxigén és argon.
12. 12. Az 1-10. igénypontok bármelyike szerinti készítmény, amelyben az effervescens anyag nátrium-bikarbonát.
13. 13. A 12. igénypont szerinti készítmény, amelyben a nátriumbikarbonát körülbelül 10 és körülbelül 40 tömeg% közötti koncentrációban van jelen.
14. 14. Az 1-13. igénypontok bármelyike szerinti készítmény, amely tartalmaz továbbá egy kiegészítő anyagot, amely az alábbiak bármelyike: gyógyászatilag elfogadható sók, poliszaharidok, peptidek, fehérjék, aminosavak, szintetikus polimerek, természetes polimerek és felületaktív anyagok.
15. 15. Az 1-14. igénypontok bármelyike szerinti készítmény, amely tartalmaz továbbá egy kiegészítő anyagot, amely az alábbi szilárd szerkezetek bármelyike: szivacsok, hálók, filmek, rostok, gélek, szálak, mikrorészecskék és nanorészecskék.
16. 16. Az 1-14. igénypontok bármelyike szerinti készítmény, amely tartalmaz továbbá egy kiegészítő anyagot, amely az alábbi biológiailag lebontható polimerek bármelyike: kollagén, glikogén, kitin, cellulózok, keményítő, keratinok, selyem, nukleinsavak, demineralizált csont-mátrix, származékolt hialuronsav, polianhidridek, poliortoészterek, poliglikolsav, politejsav és ezek kopolimerei és származékai.
17. 17. Az 1-14. igénypontok bármelyike szerinti készítmény, amely tartalmaz továbbá egy kiegészítő anyagot, amely az alábbi poliészterek bármelyike: α-hidroxikarbonsavak, például poli(Llaktid) (PLLA), poli(D,L-laktid) (PDLLA), poliglikolid (PGA), poll(laktid-ko-glikolid) (PLGA), poli (D,L-laktid-ko-trimetilénkarbonát) és polihidroxibutirát (PHB), és ezek polianhidridjei, kopolimerei és származékai.
18. 18. Az 1-14. igénypontok bármelyike szerinti készítmény, amely tartalmaz továbbá legalább egy kiegészítő anyagot az alábbiak közül: SiCh, Na₂O, CaO, P2O5, ΆΙ2Ο3 és CaF₂.

    99982-6039/KT Ζ Wt/üSoH/17798
19. 19. Az 1-14. igénypontok bármelyike szerinti készítmény, amely tartalmaz továbbá egy kiegészítő anyagot, amely az alábbiak bármelyike: poliszacharidok, peptidek és zsírsavak.
20. 20. Az 1-19. igénypontok bármelyike szerinti készítmény, amely tartalmaz továbbá egy második aktív anyagot, ahol a második aktív anyag az alábbi fehérjék bármelyike: Hedgehog, Frazzled, Chordin, Noggin, Cerberus és Follistatin.
21. 21. Készítmény csontdefektussal rendelkező emlős kezelésére, amely tartalmaz egy csont morfogén fehérjét mint elsődleges biológiailag aktív anyagot, egy kalcium-foszfátot mint hordozót, és hatékony mennyiségű effervescens anyagot, ahol az effervescens anyag az alábbi gázok bármelyike: szén-dioxid, levegő, nitrogén, hélium, oxigén és argon.
22. 22. Készítmény csontdefektussal rendelkező emlős kezelésére, amely tartalmaz egy csont morfogén fehérjét mint elsődleges biológiailag aktív anyagot, egy kalcium-foszfátot mint hordozót, és hatékony mennyiségű effervescens anyagot, ahol az effervescens anyag nátrium-bikarbonát.
23. 23. Az 1-20. igénypontok bármelyike szerinti készítmény hatásos mennyiségének alkalmazása csontdefektussal rendelkező emlős kezelésére szolgáló gyógyszer előállítására.

    WYETH helyett a meghatalmazott:

    DANUBIA

    Szabadalmi és Védjegy Iroda Kft.

    Kmethy Boglárka

    szabadalmi ügyvivő