HUP0302309A2 - Eljárás elhízás kezelésére és/vagy megelőzésére alkalmas vegyületek megtalálására és ezeket tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására - Google Patents

Abstract

A találmány elhízás kezelésére és/vagy megelőzésére alkalmasvegyületek megtalálására irányuló eljárásra vonatkozik, amely szerintmeghatározzák, hogy a vizsgálandó vegyületek emlősökben és/vagyemberben a de-novo-lipogenézis gátlására képesek-e. A találmány tárgyatovábbá emlősállatokban a de-novo-lipogenézis gátlására képesvegyületek felhasználása elhízás kezelésére és/vagy megelőzésérealkalmas gyógyászati készítmény előállítására. Ó

Description

·· ··*· ··

Találmányunk tárgya eljárás elhízás kezelésére és/vagy megelőzésére alkalmas vegyületek megtalálására. Találmányunk tárgya továbbá emlős állatokban a de-novo-lipogenézis gátlására képes és központi idegrendszeri (CNS) hatásoktól lényegében mentes vegyületek felhasználása elhízás kezelésére és/vagy megelőzésére szolgáló gyógyászati készítmények előállítására.

Az elhízás a fejlett ipari országokban napjainkban a lakosság egészségét veszélyeztető egyre súlyosabb probléma; az elhízást nagy részben a kiegyensúlyozatlan és zsírokban túlzottan gazdag táplálkozás okozza. A túlsúlyos embereknek a lakosság létszámában jelentkező százalékos növekedése következtében az elhízás következményeként fellépő utójelenségek is növekednek, amelyek a személyes elégedetlenségtől (rossz érzéstől) a szív-keringési megbetegedésekhez vagy a diabétesz meghatározott formáihoz vezetnek. Ezért az elhízás kezelésére vagy megelőzésére több terápiás eljárást fejlesztettek ki. Ezek példáiként a lipázgátló vegyületeket említjük meg, amelyek a bélrendszerben a zsírok hasítását csökkentik és ezáltal a felvett táplálék energiahasznosítását visszaszorítják. Ennél a terápiánál a táplálékban levő zsiradékok legalábbis részben lebomlás nélkül kiválasztódnak.

Igény mutatkozik az elhízás kezelésére és/vagy megelőzésére szolgáló, az ismert kezelési formákat kiegészítő új terápiás eljárások iránt.

Meglepő módon azt találtuk, hogy emlősökön - különösen emberen - a de-novo-lipogenézis gátlására képes vegyületek az elhízás hatékony kezelésére és/vagy megelőzésére • · · · · · · · · • ··♦ ··· · · · i · · · · · · ··· ·· ·· · ·· · ·· alkalmasak. A fenti vegyületek hosszabb időn át - pl. több héten keresztül - történő adagolása esetén különösen jó eredményeket kapunk.

Találmányunk tárgya eljárás elhízás kezelésére és/vagy megelőzésére alkalmas vegyületek megtalálására oly módon, hogy olyan vegyületeket választunk ki, amelyek emlősökben - különösen emberben - a de-novo-lipogenézis gátlására képesek.

Találmányunk tárgya továbbá emlősökben - különösen emberben - a de-novo-lipogenézis gátlására képes és különösen központi idegrendszeri hatásoktól (pl. antikonvulzív hatások) lényegében mentes vegyületek felhasználása elhízás kezelésére és/vagy megelőzésére szolgáló gyógyászati készítmények előállítására.

A „de-novo-lipogenézis” kifejezésen (a továbbiakban „DNL”) emlősök szervezetében a testsaját zsírsavak szénhidrátokból történő felépítését értjük. Ez a felépítési reakció a testsejtek cytosoljában játszódik le és az ún. citromsav-cikluson vagy Krebs-Martius-cikluson alapul. Ebben a ciklusban egy testsaját biokémiai reakcióban két építő elemből - nevezetesen a szénhidrátokból származó piruvátból és a hidrogén-karbonátból - különböző közbenső fokozatokon (többek között maleát, fumarát és alfa-ketoglutarát) keresztül végül citrát képződik. A citrát fölöslegben történő felépítése esetén az acetil-koenzim-A közbenső lépésen keresztül a citrát szabad zsírsavakká - lipidszerű termékekké - alakulhat át, amelyek zsírokat képeznek, majd a zsírsejtekbe (adipociták) beágyazódhatnak. A zsírsavakból képezett zsíroknak a testsejtekbe történő túlzott mértékű beágyazódása általánosságban elhízáshoz vezet. A citromsav-ciklusban külön4 • ··· ··« · · · I · · · · · ·

4·· ·· ·· · ·* · ·· böző enzimek vesznek részt. A citrát-ciklus anyagforgalma lényegében a rendelkezésre álló hidrogén-karbonát mennyiségétől fiigg. A rendelkezésre álló hidrogén-karbonát mennyisége pedig a széndioxidból történő képződés sebességétől függ. A hidrogén-karbonátokat képező egyensúlyi reakciót az ún. karboanhidrázok katalizálják. A jelenleg ismert karboanhidrázok és izozimjaik közül emlősökben túlnyomórészt a Π altípusú (CA Π) és V altípusú (CA V) karboanhidráz-izozimok vesznek részt azon reakciók katalízisében, amelyek a hidrogén-karbonátot a citromsav-ciklus rendelkezésére bocsájtják. Különösen fontos a V altípusú karboanhidrázok szerepe, mert ezek a mitochondriumokban fordulnak elő. A citromsav-ciklus is a mitochondriumokban játszódik le.

A DNL emlősök sejtjeiben történő gátlására különböző lehetőségek állnak rendelkezésre, amelyek célja minden esetben a citromsav-ciklus anyagforgalmának csökkentése. Ezáltal a zsírsavak felépítésére rendelkezésre álló, fölös mennyiségben termelt citrát koncentrációja csökkenthető. Találmányunknak megfelelően a DNL előnyösen oly módon gátolható, hogy a hidrogén-karbonátot a citromsav-ciklus számára rendelkezésre bocsájtó reakciókat katalizáló karboanhidrázokat gátoljuk. A találmányunk szerinti célkitűzésnek megfelelően előnyösen a II és/vagy V altípusba tartozó karboanhidrázokat gátoljuk.

A nem-specifikus karboanhidrázokat gátló vegyületek (nem-specifikus vagy klasszikus CA-inhibitorok) már régóta ismertek és ezeket a vegyületeket hosszabb ideje különböző gyógyászati területeken (főként diuretikumként vagy a szemgyógyászatban) • · · · ·· · · · j :··. ··: .* : :

··· ·· ·· · ·· * ·· alkalmazzák. A fenti klasszikus CA-inhibitorok felhasználási területeit pl. az alábbi irodalmi helyen foglalják össze: C.T. Supuran: Expert Opinion on Therapeutic Patents, 10(5). 575-600 (2000). A „specifikus CA-inhibitor” kifejezésen olyan vegyületeket értünk, amelyek messzemenően csak egy CA-altípust (pl. CA V) vagy a CA-altípusok meghatározott csoportját gátolják. A klasszikus CA-inhibitorok elhízás célzott kezelésére és/vagy megelőzésére történő felhasználása mindezideig nem volt ismert.

Általánosságban megállapítható, hogy az elhízás ismert eseteinek túlnyomó többsége a táplálékból felvett testidegen zsiradékok viszonylag túlzottan magas arányára vezethető vissza. A legfejlettebb országokban (pl. USA) az elhízott emberek táplálékuk 30 %-ig terjedő mennyiségét zsírok formájában veszik magukhoz. Jelenlegi ismereteink szerint az elhízáshoz vezető zsiradék-beágyazások túlnyomó részben a túlzott mennyiségben felvett táplálkozási zsiradékokból származnak, amely azonban a szénhidrát-metabolizmusra irányuló DNL által nem befolyásolható.

Bár a DNL gátlása által a zsírsavak adipocitákba csökkent mértékben történő beágyazása elérhető, a DNL gátlása a zsírsavaknak a testsejtekbe történő beágyazását csupán csekély mértékben képes befolyásolni és ezért az emberek elhízásának kezelésére és/vagy megelőzésére gyakorlatilag alkalmatlannak tekintették. A szakirodalom erre irányuló ismereteit pl. az alábbi irodalmi helyen foglalják össze: M.K. Hellerstein: European Journal of Clinical Nutrition, 53(1), 53-65. (1999). A fentiekben tárgyalt szakmai előítélet mindezideig gátját képezte az elhízás DNL-gátlás elvén alapuló gyógyszeres kezelésének és/vagy megelőzésének.

*. .u. *·.·

Találmányunk értélmében meglepő módon azt találtuk, hogy emlősökben - különösen emberben - a DNL gátlására képes vegyületek elhízás kezelésére és/vagy megelőzésére hatékonyan alkalmazhatók, különösen e vegyületek hosszabb időn át (pl. hat héten keresztül) történő adagolása esetén. Ily módon a DNL gátlás segítségével elhízott személyek testtömege hosszabb időn át szignifikáns mértékben csökkenthető annak ellenére, hogy a DNL az adipocitákba beágyazott testzsiradékot viszonylag csupán kis mértékben befolyásolja. A DNL hosszabb időn át történő gátlása révén azonban ez az önmagában csekély hatás oly mértékben felhalmozódik, hogy összességében a testtömeg csökkentéséhez szignifikáns mértékben hozzájárul.

A topiramát nevű vegyület példáján mutatjuk be, hogy a találmányunk tárgyát képező eljárás elhízás kezelésére és/vagy megelőzésére alkalmas vegyületek célzott megtalálására alkalmas. A topiramát az EP 0 138 441 A2 sz. európai közrebocsátási iratból ismert antiepileptikum. Ismeretes, hogy a topiramát multifaktorális farmakológiai hatásspektrummal rendelkező gyógyászati hatóanyag. így a topiramát a feszültségtől függő nátrium-csatornákat blokkolhatja és ezáltal a sejtek membránpotenciálját stabilizálhatja, a GABA-receptorokat aktiválhatja és ezáltal a GABA által közvetített gátlást erősíti, ezenkívül karboanhidráz-inhibitorként hat, végül a glutamát-receptorok altípusát képező kainát-AMPA receptorok gátlására képes, miáltal az AMPA által indukált áramlások fellépését gátolja. A topiramát továbbá a központi idegrendszerre kifejezetten hat. Nem ismert azonban, hogy a topiramat antiepilektikus tulajdonságai a fenti farmakológiailag releváns tényezőkre volnának visszavezethetők.

I ;··. ··: .· ϊ í «ft· ·· ·« · ·* · ··

A WO 98/00130 sz. nemzetközi közrebocsátási iratból ismert, hogy a topiramat olyan farmakológiai tulajdonságokkal rendelkezik, amelyek alapján elhízás kezelésére történő alkalmasságára lehet következtetni. Ezeket a tulajdonságokat epilepsziás betegeken hosszabb időn át végzett vizsgálatok kísérő hatásaként véletlenül fedezték fel. Mindezideig nem ismert, hogy az epilepsziás betegeken megfigyelt testtömeg veszteség a topiramat mely farmakológiai tulajdonságaira vezethető vissza. A topiramat a WO 98/00130 sz. nemzetközi közrebocsátási iratban feltüntetett, elhízás kezelésére alkalmas antikonvulzív hatású (I) általános képletű vegyületek körébe tartozik.

A találmány szerinti eljárással kimutatható, hogy a topiramát potens CA-inhibitor, éspedig különösen az emlősökben előforduló II és V altípusú karboanhidrázok potens inhibitora, valamint a topiramat emlősállatsejtekben a DNL hatékony gátlására képes. A találmány szerinti eljárás segítségével első ízben igazolható, hogy a topiramat epilepsziás betegek testtömegcsökkenéséhez vezető, mindezideig meg nem magyarázható farmakológiai kísérő hatásai lényegében azon alapulnak, hogy a topiramat emlősállatokban a DNL hatékony gátlására képes. Ennek alapján a találmány szerinti eljárás segítségével elhízás kezelésére és/vagy megelőzésére alkalmas további vegyületek megtalálása várható. A találmányunk tárgyát képező eljárás segítségével először nyílik lehetőség a DNL-gátlás elvén működő farmakológiailag potens vegyületek viszonylag gyors és egyszerű megtalálására. A találmány tárgyát képező eljárás segítségével az elhízás kezelésére és/vagy megelőzésére alkalmas, a fenti elven ható vegyületek egy első tájékoztató kiválasztási eljárással, hosszadalmas és költséges in vivo tesztek (pl. kísérleti állatokon végzett etetési vizsgálatok) nélkül kiválaszthatók.

hz· τ*· ·*τ.

A találmányunk szerinti felismerés és eredmények meglepőek. A topiramat farmakológiai tulajdonságaira vonatkozó korábbi vizsgálatok során ugyanis a topiramat CA-gátló hatékonysága mindezideig észrevétlen maradt, sőt csekélynek és gyógyászati szempontból jelentéktelennek bizonyult [B.E. Maryanoff és tsai: Journal of Medicinal Chemistry, 30, 880-887. (1987); B.E. Maryanoff és tsai: Journal of Medicinal Chemistry, 41, 1315-1343. (1998); S.J. Dodgson és tsai: Epilepsia, 41.(1), 35-39. (2000)]. A fent említett korábbi vizsgálatok során a topiramat CA-gátló aktivitásának meghatározásához minden esetben különböző emlősök CA-tartalmú teszt-oldatait alkalmazták, amelyek további különböző testkomponenseket (pl. vér vagy testszövetek) tartalmaztak.

A találmányunk szerinti eljárás első foganatosítási módja szerint elhízás kezelésére és/vagy megelőzésére alkalmas vegyületeket találunk meg, amelynek során olyan vegyületeket választunk ki, amelyek emlősállatokban előforduló legalább egy karboanhidráz aktivitásának gátlására képesek. így pl. legalább egy vizsgálandó vegyületet legalább egy karboanhidrázzal hozunk érintkezése, majd legalább egy karboanhidráz aktivitásának gátlására képes vegyületet önmagában ismert módon azonosítunk. A találmány tárgyát képező eljárás fenti foganatosítási módja szerint előnyösen emlősökben (pl. ember vagy rágcsálók, mint pl. patkány, egér vagy tengerimalac) előforduló karboanhidrázokat, különösen a II és/vagy V altípusú karboanhidrázokat alkalmazunk. Különösen előnyösen emberben előforduló karboanhidrázokat alkalmazunk. A karboanhidrázokat pl. a fenti emlősökből izolálhatjuk és kívánt esetben »i U · x . · · · t ··: ·* : :

- ♦« ·· tisztíthatjuk, vagy előnyösen önmagukban ismert kémiai vagy biotechnológiai eljárásokkal állíthatjuk elő.

A találmányunk tárgyát képező eljárás fenti első foganatosítási módjának egyik előnyös változata szerint a karboanhidrázok aktivitásának a vizsgálandó vegyület hatására történő változását önmagában ismert in vitro enzim-aktivitás teszt segítségével határozhatjuk meg; ennek során a karboanhidrázokat izolált, kísérő anyagoktól legalábbis messzemenően megszabadított enzim formájában alkalmazzuk. Előnyösen kémiai vagy biotechnológiai eljárásokkal előállított karboanhidrázokat alkalmazunk, mert ezek különösen tiszta formában állnak rendelkezésre. A karboanhidrázok aktivitásának meghatározására szolgáló aktivitás tesztek önmagukban ismertek. A találmányunk céljainak megfelelő, a karboanhidráz-aktivitás változásának meghatározására szolgáló in vitro enzim-aktivitás tesztek közül pl. a karboanhidrázok hatására bekövetkező pH-érték változást [K.M. Wilbur, N.G. Andersen: Journal of Biological Chemistry, 176, 147-154. (1948); G. Sanyal, T.H. Maren: Journal of Biological Chemistry, 256, 608-612. (1981)], a „stop-flow” mérési módszert [R.G. Khalifah: Journal of Biological Chemistry, 246, 2561-2573. (1971)] vagy a 4-nitro-fenil-acetát-észteráz módszert [Y. Pocker, J.T. Stone: Journal of the American Chemical Society, 87, 5497-5498. (1965)] említjük meg. Az utóbbi teszt során a 4-nitro-fenil-acetátnak a vizsgálandó karboanhidrázok hatására bekövetkező hidrolízis sebességét határozzuk meg; a teszt során a karboanhidrázok észterázként kifejtett hatását hasznosítjuk.

% · W · ' * · ♦ · ír;- ’“.LAT

Találmányunk értelmében a fenti összefüggésben a vegyületek CA-gátló tulajdonságainak meghatározására előnyösen alkalmazhatók az alábbi irodalmi helyeken leírt teszt-eljárások: C.T. Supuran és tsai: European Journal of Medicinal Chemistry, 33, 577-594. (1998) (lásd különösen az 592. oldalt; a továbbiakban Supuran és tsai), vagy A. Scozzafava és tsai: Journal of Medicinal Chemistry, 42, 3690-3700. (1999) (lásd különösen a 3697. oldalt; a továbbiakban Scozzafava és tsai). A fenti, Supuran és tsai, valamint Scozzafava és tsai által leírt teszt-módszerekre a jelen szabadalmi leírásban külön hangsúllyal hivatkozunk. Találmányunk értelmében CA-gátló hatású vegyületként (CA-inhibitorként) olyan vegyületeket választhatunk ki, amelyek a Supuran és tsai vagy Scozzafava és tsai által leírt in vitro standard aktivitási tesztben legalább 10 pmól/liter vagy ennél alacsonyabb (magasabb hatékonyság) IC50 koncentráció értéket mutatnak. Emberi CA-altípusok aktivitásának meghatározása során előnyösen a 4-nitro-fenil-acetát-észteráz-módszertől eltérő teszt-eljárásokat alkalmazhatunk. Különösen kedvezően alkalmazhatunk viszonylag gyors reakciólefolyást biztosító módszereket.

A Scozzafava és tsai által (Id. fent) leírt egyik 4-nitro-fenil-acetát-észteráz módszeren alapuló enzim-aktivitás tesztnél [Y. Pocker és J.T. Stone: Biochemistry, 6, 668-678. (1967) írta le] találmányunk segítségével bizonyítjuk, hogy a topiramat a biotechnológiai eljárással nyert Π. altípusú karboanhidrázt kifejezetten gátolja (IC50 = 5 nmól/1), és ez a gátló hatás lényegesen erősebb, mint az összehasonlító anyagként felhasznált acetazolamid vagy methazolamid (klasszikus CA-inhibitorok) által kifejtett gátló hatás. A II altípusú emberi karboanhidrázokat a Scozzafava és tsai által leírt módszerekkel nyerjük.

A fenti teszttel bizonyítjuk, hogy a topiramát a biotechnológiai eljárással nyert egér Va altípusú karboanhidrázra (mCA Va) is kifejezett gátló hatást fejt ki (IC50 = 74 nmól/1). Ez esetben a mCA Va enzimet a Scozzafava és tsai által megadott kísérleti előírástól eltérően 120 nM koncentrációban alkalmazzuk. A mCA Va-t az alábbi helyen leírt módszerrel önmagában ismert módon nyeljük: H.R. Heck és tsai: Journal of Biological Chemistry, 269, 24742-24746. (1994). Ennek során az izopropil-beta-D-tiogalaktopirazonid (IPTG) ellenőrzése alatt indukálható T7-promotort tartalmazó, a mCA Va-t kódoló szekvenciát magában foglaló plazmid-vektort tartalmazó Escherichia coli BL 21 (DE 3) baktériumtörzset alkalmazunk. A baktériumtörzset 37°C-on keverés közben 100 pg/ml ampicillint tartalmazó Lura-Bertani folyékony táptalajba oltjuk és a növekedést 600 mm mellett spektrofotometriásán követjük nyomon. Mihelyt a baktériumtenyészet az exponenciális növekedési fázisba belépett, 1 mmól/liter végső koncentrációban IPTG-t adunk hozzá. A baktériumtenyészetet 3 órás indukációs idő után (37°C keverés közben) 7000 xg mellett 15 percen át centrifugáljuk és a felülúszót elöntjük. A kapott pelletet 0,1 térfogat kétszer desztillált vízben felvesszük és 1,00 mg ml lizozimot adunk hozzá. A sejt-lízist ultrahang besugárzás mellett végezzük el. E célból a kapott baktérium szuszpenzió aliquot részeit (10 ml) nyitott üvegtartályhoz adjuk és ezeket a mintákat 4x3 percen keresztül ultrahanggal kezeljük. A minták abszorpcióját minden ultrahang-impulzus után 600 nm mellett meghatározzuk, amelynek során minden 100 μΐ mintát 900 μΐ, kétszer desztillált vízzel hígítunk. A végpontot akkor éljük el, amikor a minta 600 nm abszorpciós értéke a kiindulási érték kb. egytizede. A sejt-lízis lejátszódása után kalcium-klorid kötődési puffért (Stratagene cég) adunk hozzá és a kapott sejt-lizátumot tisztítás céljából calmodulin-affinitás gyantaoszlopra visszük fel. A tisztítás a gyantához kötött calmodulin-tartománynak a kifejezett mCA Va fehérje N-terminális végén levő calmodulin-kötődési pepiidhez mutatott magasfokú affinitásán alapul (Id. Stratagene cég Affinity LIC Cloning and Protein Purification Kit Manual” c. kézikönyve).

A találmányunk tárgyát képező eljárás második foganatosítási módja szerint elhízás kezelésére és/vagy megelőzésére alkalmas vegyületeket találunk meg olyan vegyületek kiválasztása útján, amelyek izolált élő emlősállatsejtek citromsav-ciklusában képződő anyagcseretermékek vagy a citromsav-ciklus lipidszerkezetű utótermékei mennyiségének csökkentésére képesek. A vizsgálandó vegyületek hatására mérhetően csökkenthető mennyiségű citromsav-ciklus anyagcseretermékként savoldható anyagcseretermékek (pl. citrát, maleát, fumarát és/vagy alfa-ketoglutarát) alkalmazhatók. A citrát előnyösnek bizonyult. Anyagcseretermékként továbbá a citromsav-ciklus lipidszerű utótermékei (pl. szabad zsírsavak) alkalmazhatók. A találmány tárgyát képező eljárás fentemlített második foganatosítási módjánál is a vizsgálandó vegyületeknek az emlősállatokban előforduló legalább egy karboanhidráz aktivitását gátló hatását határozzuk meg; azonban az első foganatosítási módnál említett teszt-modellként eltérő teszt-modellt alkalmazunk. A találmány tárgyát képező eljárás fentemlített második foganatosítási módja azon az elven alapul, hogy izolált élő emlősállatsejtek citromsav14

-ciklusának C-izotóppal jelzett metabolikus közbenső termék vagy utótermék szubsztrátumai radioaktivitás-felvételét önmagában ismert módon meghatározzuk, majd a kapott eredményeket az egyébként azonos körülmények között, azonban CA-gátló hatású vegyületek jelenlétében nyert eredményekkel összehasonlítjuk. A találmány fenti foganatosítás! módja során előnyösen rágcsálók (pl. patkány, egér vagy tengerimalac) vagy ember izolált élő sejtjeit alkalmazzuk. Előnyösen emberi sejteket alkalmazunk. Emlősállatsejtek esetében adipocitákat vagy hepatocitákat alkalmazunk. Előnyösen rágcsálók adipocitáit alkalmazhatjuk. Emberi sejtek esetében adipocitákat vagy hepatocitákat alkalmazhatunk. Előnyösek az emberi hepatociták. A fenti foganatosítás! mód szerint alkalmazott emlősállatsejtek szokásos tenyésztési és/vagy klónozási eljárásokkal nyerhetők. Természetes vagy biotechnológiailag módosított emlősállatsejteket alkalmazhatunk. A citrát-ciklus savoldható közbenső termékeiben lejátszódó radioaktivitás-felvétel meghatározása esetén C-jelzett szubsztrátumként előnyösen

14

C-hidrogén-karbonátot (NaH[ QO3) alkalmazhatunk. A citrát-ciklus lipidszerű utótermékeiben lejátszódó radioaktivitás felvétel meghatározása esetén C-jelzett szubsztrátumként előnyösen [U- C]-glükózt alkalmazhatunk.

A vizsgálandó vegyületek emlősökben DNL aktivitást gátló hatásának vizsgálatát az alábbi irodalmi helyen ismertették: S.A. Hazen és tsai: FASEB Journal, 10(4), 481-490. (1996) (a továbbiakban „Házén és tsai”). A fent említett, Hazen és tsai által leírt teszt módszerre a jelen szabadalmi leírás keretein belül külön hangsúllyal hivatkozunk. Találmányunk értelmében megfelelő hatásúnak az olyan vizsgált vegyületeket választjuk ki, amelyek a Hazen és tsai által leírt, fentemlített tesztben a citromsav-ciklus

14 előszakaszaként szolgáló C-jelzett anyagokból - pl. C-hidrogén-karbonátból származó radioaktivitásnak a citrátba, maleátba, fumarátba és/vagy alfa-ketoglutarátba történő beépülését legalább IC50 = 10 pmól/liter vagy ennél kisebb (nagyobb hatékonyság) érték mellett szignifikáns mértékben gátolják.

A Hazen és tsai által leírt teszt-modellnek megfelelő, a találmányunk keretein belül végrehajtott egyik teszt-modellben a topiramat biotechnológiai eljárással nyert patkány-adipocita 3T3-F442A sejtvonal citromsav-ciklusa savoldható anyagcseretermékeinek keletkezésére kifejezett gátló hatást fejt ki. A topiramat fentemlített gátló hatása (IC5o=34O mmól/liter) lényegesen kifejezettebb, mint az összehasonlító anyagként felhasznált ethoxzolamid (klasszikus CA-inhibitor) mért gátló hatása.

A találmányunk tárgyát képező, elhízás kezelésére és/vagy megelőzésére alkalmas vegyületek megtalálására szolgáló eljárás különösen előnyösen változata szerint olyan vegyületeket választunk ki, amelyek a találmány szerinti eljárás fentemlített első foganatosítási módja szerint - különösen a fent említett in vitro enzim-aktivitás tesztben - az emlősökben előforduló legalább egyik karboanhidráz gátlására alkalmasnak bizonyultak és ezenkívül a találmány szerinti eljárás fentemlített második foganatosítási módja szerint izolált élő emlősállatsejtek citromsav-ciklusában képződő anyagcseretermékek mennyiségének csökkentésére képesek. A találmány tárgyát képező eljárás első foganatosítási módja szerint a vegyületek emlősállatokban előforduló karboanhidrázok aktivitását gátló képessége gyorsan és hatékonyan megállapítható. A találmány tárgyát képező eljárás második foganatosítási módja többek között támpontot szolgáltat arra nézve, hogy a vizsgált vegyületek élő emlősállatsejtek mitochondriumaiba - ahol a CA V lokalizálva van - behatolni képesek-e. A megfelelő vegyületek kiválasztásához a találmány tárgyát képező eljárás fentemlített első és második foganatosítási módját párhuzamosan vagy tetszés szerinti sorrendben egymás után hajthatjuk végre.

Találmányunk szerint a DNL emlősállatokban történő gátlására képes vegyületeket elhízás kezelésére és/vagy megelőzésére alkalmas gyógyászati készítmény előállítására alkalmazhatjuk. A fenti célra olyan vegyületeket alkalmazhatunk, amelyek az emlősállatokban előforduló legalább egy karboanhidráz gátlására képesek. Természetesen csak fiziológiailag elviselhető és a gyógyászati hatóanyagokkal szemben általában támasztott követelményeknek (pl. biztonság és elviselhetőség) megfelelő vegyületeket választhatunk ki. Előnyösen alkalmazhatunk az emlősállatokban előforduló II és/vagy V altípusú karboanhidrázok gátlására képes vegyületeket. Különösen előnyösnek bizonyultak a CA II és/vagy V - különösen CA V - specifikus gátlására képes vegyületek.

A hosszabb időn át történő adagolás esetén a kezelt személyek testtömegének csökkentését előidéző, CA-gátló hatással rendelkező ismert vegyületek (pl. topiramat) kifejezett központi idegrendszeri hatásokkal (pl. antikonvulzív hatások) is rendelkeznek. Az elhízás kezelésére és/vagy megelőzésére hosszabb időn át történő adagolással felhasználandó vegyületek esetében a kísérő központi idegrendszeri hatások gyakran nemkívánatosak. A találmányunk szerinti eljárás segítségével elhízás kezelésére és/vagy megelőzésére alkalmasnak kiválasztott vegyületek továbbá központi idegrendszeri hatásokra is vizsgálhatók. így pl. a vegyületeket az adott esetben jelenlevő antikonvulzív tulajdonságaikra is vizsgálhatjuk. A vegyületek antikonvulzív tulajdonságainak vizsgálatára pl. az ún. „szupramaximális elektrosokk teszt” (SES-teszt; más szóval „maximális-elektrosokk teszt”, röviden MES-teszt) [G. Chen és tsai: Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine, 87, 334-339. (1954); a továbbiakban „Chen és tsai”; és [J.E.P. Toman és tsai: Journal of Neurophysiology, 9, 231 (1946); a továbbiakban „Toman és tsai”] alkalmazható. A fentemlített Chen és tsai, illetve Toman és tsai által leírt teszt-módszerekre a jelen szabadalmi leírásban külön hangsúllyal hivatkozunk. így az elhízás kezelése és/vagy megelőzése céljából a betegeknek hosszabb időn át beadagolandó vegyületeknek a fentemlített Chen és tsai, illetve Toman és tsai által leírt SES-tesztben lényegében hatástalannak kell lenni és magasabb dózisokban - legalább 100 mg/kg p.o. dózisban - a fenti tesztekben szereplő kritériumok szerint nem mutathatnak szignifikáns hatást (azaz G. Chen és tsai szerint a „protektív dózis” >100 mg/kg p.o.; illetve a G. Chen és tsai által megadott PD₅₀-értékek a szokásos dózisok értelmében lényegében „minimális hatékony dózisnak” - MED tekinthetők). A találmány tárgyát képező eljárással alkalmasként kiválasztott, a Chen és tsai féle MES-teszt értelmében lényegében hatástalannak minősített vegyületek különösen előnyösen alkalmazhatók elhízás kezelésére és/vagy megelőzésére szolgáló gyógyászati készítmény előállítására. A fentemlített SES- illetve MES-tesztek standard farmakológiai vizsgálati módszerek és megfelelő szolgáltató intézmények (pl. „Banlabs” cég) által rutin módszerként elvégeztethetők.

A találmányunk tárgyát képező eljárás szerint elhízás kezelésére és/vagy megelőzésére alkalmasnak talált vegyületeket a gyógyászatban szokásos segédanyagok felhasználásával szokásos galenikus készítményekké (pl. tabletták, kapszulák, kúpok vagy oldatok) alakíthatók. A fenti galenikus készítményeket szilárd vagy folyékony hordozóanyagok (pl. tejcukor, keményítő vagy talkum, illetve folyékony parafinok) és/vagy szokásos gyógyászati segédanyagok (pl. a tabletta szétesését elősegítő anyagok, oldásközvetítők vagy konzerválószerek) felhasználásával önmagukban ismert módszerekkel állíthatjuk elő. A találmány szerint alkalmas gyógyászati készítmények pl. au EP 0 138 441 A2 sz. európai közrebocsátási iratból és a WO 98/00130 sz. nemzetközi közrebocsátási iratból ismertek.

Claims (19)

1. Szabadalmi igénypontok

   1. Eljárás elhízás kezelésére és/vagy megelőzésére alkalmas vegyületek megtalálására azzal jellemezve, hogy emlősökben - különösen emberben - a de-novo— -lipogenézis gátlására képes vegyületeket választunk ki.
2. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy emlősállatokban előforduló legalább egy karboanhidráz aktivitásának gátlására képes vegyületeket választunk ki.
3. 3. A 2. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy legalább egy vegyületet legalább egy karboanhidrázzal hozunk érintkezésbe, majd a legalább egy karboanhidráz aktivitását gátló vegyületeket kiválasztjuk.
4. 4. A 2. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy rágcsálókban vagy emberben előforduló karboanhidrázokat alkalmazunk.
5. 5. A 4. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy emberben előforduló karboanhidrázokat alkalmazunk.
6. 6. A 2. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy emlősökben - különösen emberben - előforduló II és/vagy V altípusú karboanhidrázokat alkalmazunk.
7. 7. A 6. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy emlősökben - különösen emberben - előforduló V altípusú karboanhidrázokat alkalmazunk.
8. 8. A3, igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy kémiai vagy biotechnológiai eljárással nyert, izolált enzim formájában levő karboanhidrázt alkalmazunk és a karboanhidráz aktivitásának a vizsgált vegyület hatására bekövetkező változását valamely in vitro enzim-aktivitás teszttel határozzuk meg.
9. 9. Az 1. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy olyan vegyületeket válaszunk ki, amelyek izolált élő emlősállatsejtek citromsav-ciklusában képződő anyagcseretermékek mennyiségének csökkentésére képesek.
10. 10. A 9. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy a sejtek citromsavciklusában képződő citrát, maleát, fumarát, alfa-ketoglutarát mennyiségének csökkenését és/vagy a citromsav-ciklus lipidszerű utótermékei képződésének a vizsgált vegyület hatására bekövetkező csökkenését határozzuk meg.
11. 11. A 9. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy rágcsálók vagy ember izolált élő sejtjeit alkalmazzuk.
12. 12. All. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy adipocitákat vagy hepatocitákat alkalmazunk.
13. 13. Eljárás elhízás kezelésére és/vagy megelőzésére alkalmas vegyületek megtalálására azzal jellemezve, hogy olyan vegyületeket válaszunk ki, amelyeket a 8. igénypont szerinti valamely eljárással és ezenkívül a 9. igénypont szerinti eljárással alkalmas vegyületként azonosítottunk.
14. 14. Eljárás elhízás kezelésére és/vagy megelőzésére alkalmas vegyületek megtalálására azzal jellemezve, hogy olyan vegyületeket választunk ki, amelyeket az 1. igénypont szerinti eljárással megfelelő vegyületként azonosítottunk, és ezenkívül az antikonvulzív tulajdonságok megtalálására szolgáló valamely standard teszt szerint lényegében hatástalannak azonosítottunk.
15. 15. Emlősállatokban de-novo-lipogenézis gátlására képes vegyületek alkalmazása elhízás kezelésére és/vagy megelőzésére alkalmas gyógyászati készítmények előállítására.
16. 16. A 15. igénypont szerinti alkalmazás azzal jellemezve, hogy emlősállatokban előforduló legalább egy karboanhidráz gátlására képes vegyületeket alkalmazunk.
17. 17. A 15. vagy 16. igénypont szerinti alkalmazás azzal jellemezve, hogy emlősállatokban előforduló II és/vagy V altípusú karboanhidrázok gátlására képes vegyületeket alkalmazunk.
18. 18. A 15. igénypont szerinti alkalmazás azzal jellemezve, hogy antikonvulzív tulajdonságoktól lényegében mentes vegyületeket alkalmazunk.
19. 19. Első ízben az 1. igénypont szerinti eljárással elhízás kezelésére és/vagy megelőzésére alkalmasnak azonosított vegyületek felhasználása elhízás kezelésére és/vagy megelőzésére alkalmas gyógyászati készítmény előállítására.

    A bejelentő helyett a meghatalmazott:

    I)r. ' ’ . '

    G<·. · 7 7 /

    W·' · A - f ( ^u ; i