CN106770611B - 一种用于细胞原位检测小分子化合物进入线粒体的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于细胞原位检测小分子化合物进入线粒体的方法，具体为：选用适当的小分子化合物与细胞孵育，在不破坏细胞线粒体的条件下获取具有完整生理结构的线粒体，并收集胞浆；之后用小分子化合物与获取的线粒体进行孵育，将所得孵育小分子化合物后的线粒体及之前收集的胞浆在非变性条件下分别进行裂解以获得线粒体蛋白裂解液和胞浆蛋白裂解液，再结合质谱分析以实现在细胞原位水平上检测小分子化合物是否进入线粒体。采用该方法可以在细胞原位水平上检测小分子化合物是否进入线粒体，并可进一步检测小分子化合物进入线粒体的方式，可直接应用于先导药物的靶区验证或者用于以线粒体为效应器的先导药物的筛选，可靠性高，灵敏度高。
Description
技术领域
本发明涉及分子药理学领域，具体涉及一种用于细胞原位检测小分子化合物进入线粒体的方法。
背景技术
线粒体作为细胞内关键的细胞器，不仅具有为细胞供给能量、参与代谢等重要功能，而且参与细胞信号传导和细胞凋亡等重要的生物过程。大量研究表明，线粒体的数量、分布、结构、功能变化与神经退行性病变(如帕金森症、阿尔兹海默症)、代谢型疾病(如I I型糖尿病、肥胖症)、癌症及心血管疾病等病症密切相关。线粒体被冠以“细胞信号传导细胞器”和“细胞死亡之马达”等称号，与之相关的“线粒体学”已经成为生命科学和医学等领域的研究热点。在药物作用机理研究过程中，药物通过与靶点相互作用来发挥药效作用，其中线粒体通常是药物发挥作用的主要靶细胞器，因此在细胞原位水平研究小分子化合物是否可以进入线粒体，不仅有助于从分子水平阐述药物的作用机制，同时也为线粒体靶向先导药物的筛选和开发提供新的研究方法。
目前，研究小分子化合物定位于线粒体主要是通过与线粒体荧光探针(结合型荧光探针、置换型荧光探针、化学计量型荧光探针)共定位法。其响应机制主要有光致电子转移(PET，photo-induced electron transfer)、分子内电荷转移(ICT，intramolecularcharge transfer)、荧光共振能量转移(FRET，fluorescence resonance enery transfer)等。荧光探针检测法由于其灵敏度高，选择性好适合于实时检测与分子荧光成像。但该类检测方法的使用具有很大的局限性，首先要求化合物具有荧光基团，这对大部分化合物来说都不适用；其次该类检测方法主要基于成像后的共定位分析，容易造成假阳性结果；此外，该方法也不能说明小分子药物进入线粒体的方式。因此，开发一种能在细胞原位水平检测小分子化合物是否进入线粒体及进入线粒体方式的分析方法尤为重要。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种用于细胞原位检测小分子化合物进入线粒体的方法。采用该方法可以在细胞原位水平上检测小分子化合物是否进入线粒体，并可进一步检测小分子化合物进入线粒体的方式，可直接应用于先导药物的靶区验证或者用于以线粒体为效应器的先导药物的筛选，可靠性高，灵敏度高。
本发明所述的用于细胞原位检测小分子化合物进入线粒体的方法为：选用适当的小分子化合物与细胞孵育，在不破坏细胞线粒体的条件下获取具有完整生理结构的线粒体，并收集胞浆；之后用小分子化合物与获取的线粒体进行孵育，将所得孵育小分子化合物后的线粒体及之前收集的胞浆在非变性条件下分别进行裂解以获得线粒体蛋白裂解液和胞浆蛋白裂解液，再结合质谱分析以实现在细胞原位水平上检测小分子化合物是否进入线粒体。
更为具体的方法包括以下步骤：
(Ⅰ)选定小分子化合物；
(Ⅱ)细胞给药：将选定的小分子化合物与细胞孵育使小分子化合物进入细胞，得到孵育后的细胞；设置对照组；
(Ⅲ)线粒体的分离：将孵育后的细胞在不破坏线粒体的条件下用线粒体分离试剂获取具有完整生理结构的线粒体，并收集胞浆；
(Ⅳ)药物与线粒体孵育：将选定的小分子化合物与获取的线粒体进行孵育，得到孵育小分子化合物后的线粒体；
(Ⅴ)蛋白质的提取：将孵育小分子化合物后的线粒体和之前收集的胞浆在非变性条件下分别进行裂解，分别得到具有完整生理结构蛋白质的线粒体蛋白裂解液和具有完整生理结构蛋白质的胞浆蛋白裂解液；
(Ⅵ)质谱分析：将所得的线粒体蛋白裂解液和胞浆蛋白裂解液进行质谱分析，同时与标准样品和对照组样品对比，检测各组线粒体蛋白裂解液和胞浆蛋白裂解液中是否有前述选定的小分子化合物析出，并以此来判断小分子化合物是否进入线粒体中。
本发明所述的技术方案中，所述的小分子化合物根据体外活性初筛结果进行确定。具体来源可以是目前已经上市的药物，如癌症治疗药物索拉非尼、解热镇痛药阿司匹林、抗高血压药物硝苯地平、抑制胃酸分泌药雷尼替丁等，也可以是自行合成的化合物，或者是天然的化合物。
本发明所述的技术方案中，所述的细胞为肿瘤细胞株，具体为非小细胞肺癌细胞株NCI-H460。
上述方法的步骤(Ⅱ)中，所述小分子化合物与细胞进行孵育的条件与时间与现有技术相同，通常是在37℃培养箱里孵育0.5～5h。本申请中，在孵育时，优选所述小分子化合物在培养液中的浓度为1～10μmol/L。
上述方法的步骤(Ⅲ)中，将孵育后的细胞在不破坏线粒体的条件下用线粒体分离试剂获得具有完整生理结构的线粒体的具体操作与现有技术相同。
上述方法的步骤(Ⅳ)中，所述小分子化合物与获取的线粒体进行孵育的条件与时间与现有技术相同，通常是在35～37℃条件下孵育0.5～1h。本申请中，在孵育时，优选所述小分子化合物在储存液中的浓度为1～10μmol/L。
上述方法的步骤(Ⅴ)中，将孵育小分子化合物后的线粒体和胞浆在非变性条件下进行裂解以分别获得具有完整生理结构蛋白质的线粒体蛋白裂解液和具有完整生理结构蛋白质的胞浆蛋白裂解液的具体操作与现有技术相同。
上述方法的步骤(Ⅵ)中，当未经给药细胞提取的线粒体与药物孵育得到的线粒体蛋白裂解液的线粒体蛋白裂解液中能检测到前述选定的小分子化合物析出，则表示该小分子化合物可以直接进入线粒体；当经过单次给药细胞提取的胞浆蛋白裂解液和给药细胞提取的线粒体再次与药物孵育得到的线粒体蛋白裂解液中均有前述选定的小分子化合物析出，且经过单次给药细胞提取的线粒体的蛋白裂解液和未经给药细胞提取的线粒体与药物孵育得到的线粒体蛋白裂解液的线粒体蛋白裂解液中均未检测到前述选定的小分子化合物析出时，则表示该小分子化合物可以间接进入线粒体内。
当采用本发明所述方法在细胞原位水平检测在非小细胞肺癌细胞株NCI-H460中，小分子化合物是否可以进入线粒体中，具体包括以下步骤：
(Ⅰ)选定下述式(A)所示结构的化合物作为小分子化合物：
上述式(A)所示结构的小分子化合物可参照公开号为CN104557887A的发明专利进行合成，也可自行设计合成路线进行合成。
(Ⅱ)细胞给药：将非小细胞肺癌细胞株NCI-H460与式(A)所示结构的小分子化合物进行孵育，使小分子化合物进入细胞，孵育后的非小细胞肺癌细胞株NCI-H460，同时设置对照组；
(Ⅲ)线粒体的分离：将孵育后的非小细胞肺癌细胞株NCI-H460在不破坏线粒体的条件下用线粒体分离试剂分离获得具有完整生理结构的线粒体，并收集胞浆；
(Ⅳ)药物与线粒体孵育：将式(A)所示结构的小分子化合物与获取的线粒体按现有常规技术进行孵育，得到孵育式(A)所示结构小分子化合物后的线粒体；
(Ⅴ)蛋白质的提取：将孵育式(A)所示结构小分子化合物后的线粒体和之前收集的胞浆在非变性条件下分别进行裂解，得到具有完整生理结构蛋白质的线粒体蛋白裂解液和具有完整生理结构蛋白质的胞浆蛋白裂解液；
(Ⅵ)质谱分析：将所得的线粒体蛋白裂解液和胞浆蛋白裂解液进行质谱分析，同时与标准样品(小分子化合物纯品)和对照样品(未经给药处理分离提取的线粒体蛋白裂解液和胞浆蛋白裂解液)对比，当未经给药细胞提取的线粒体与药物孵育得到的线粒体蛋白裂解液中能检测到式(A)所示结构的小分子化合物析出，则表示该小分子化合物可以直接进入线粒体；当经过单次给药细胞提取的胞浆蛋白裂解液和给药细胞提取的线粒体再次与药物孵育得到的线粒体蛋白裂解液中均有式(A)所示结构的小分子化合物析出，且经过单次给药细胞提取的线粒体的蛋白裂解液和未经给药细胞提取的线粒体与药物孵育得到的线粒体蛋白裂解液中均未检测到式(A)所示结构的小分子化合物析出时，则表示该小分子化合物可以间接进入线粒体内。
与现有技术相比，本发明提供了一种用于细胞原位检测小分子化合物是否进入线粒体的广谱分析方法，该方法可直接应用于先导药物的靶区验证，也可用于以线粒体为靶区的先导药物的筛选。另一方面，本发明所述方法是在保持细胞内全部蛋白未丢失、未变性的条件下进行的分析过程，符合体内实际情况，所得试验结果更可靠；再者，本发明结合质谱分析的高灵敏性，从而可以更真实地反应小分子化合物在细胞或线粒体内的完整性，灵敏度高、无背景干扰。
附图说明
图1为实施例1制得的最终产物式(A)所示结构的小分子化合物溶解在DMSO中的质谱分析结果；
图2为细胞(非小细胞肺癌细胞株NCI-H460)孵育式(A)所示结构的小分子化合物5h的胞浆蛋白裂解液的质谱分析结果；
图3为细胞(非小细胞肺癌细胞株NCI-H460)孵育式(A)所示结构的小分子化合物5h的线粒体蛋白裂解液的质谱分析结果；
图4为细胞(非小细胞肺癌细胞株NCI-H460)未孵育式(A)所示结构的小分子化合物的胞浆蛋白裂解液的质谱分析结果；
图5为细胞(非小细胞肺癌细胞株NCI-H460)未孵育式(A)所示结构的小分子化合物的线粒体蛋白裂解液的质谱分析结果；
图6为细胞(非小细胞肺癌细胞株NCI-H460)未经给药处理提取的线粒体单独孵育式(A)所示结构的小分子化合物1h的线粒体蛋白质谱分析结果；
图7为细胞(非小细胞肺癌细胞株NCI-H460)孵育式(A)所示结构的小分子化合物5h后，再提取其中的线粒体并再次与式(A)所示结构的小分子化合物孵育1h的线粒体蛋白质谱分析结果。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的详述,以更好地理解本发明的内容,但本发明并不限于以下实施例。
实施例1：式(A)所示结构的小分子化合物(以下用NA17表示)的制备
NA17的合成路线如下所示，其中的试剂和条件为：a：胡椒乙胺，乙醇，70℃，搅拌反应10h；b：丙胺，DMSO，135℃：
将式(B)所示结构的化合物(2.77g,10mmol)溶于150ml乙醇(100v/v％)中，充分搅拌，然后加入胡椒乙胺(1.65g,10mmol)，将反应混合物于70℃下搅拌反应10个小时，反应结束后，将溶液冷却至室温并过滤，收集滤饼，得式(C)所示结构的中间产物，该中间产物无需进一步纯化，直接用于下一步反应；取式(C)所示结构的中间产物(4.23g 10mmol)、3-二甲氨基丙胺(1.02g,10mmol)溶于DMSO中，充分搅拌，混合物在135℃下搅拌反应8个小时。反应结束后，将反应液倒入冰水中，溶液中有黄色固体析出，收集粗产物并通过硅胶柱色谱法进行纯化(CH2Cl2:CH3OH＝100:5)，得纯化后的黄色固体(yield 53％)。
对纯化后的黄色固体进行结构鉴定，确定其为目标产物NA17。具体的氢谱、碳谱及质谱数据分别如下：1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ:8.60(d,J＝8.3Hz,1H),8.41(d,J＝7.2Hz,1H),8.25(d,J＝8.5Hz,1H),7.96(t,J＝5.0Hz,1H),7.67(t,J＝10.0Hz,1H),6.84(d,J＝1.5Hz,1H),6.82(d,J＝7.9Hz,1H),6.75(d,J＝8.7Hz,1H),6.69(dd,J＝7.9,1.5Hz,1H),5.98(s,2H),4.20-4.13(m,2H),3.40(dd,J＝12.3,6.6Hz,2H),2.81(t,J＝10Hz,2H),2.38(t,J＝6.7Hz,2H),2.20(s,6H),1.88-1.81(m,2H).13C NMR(126MHz,DMSO-d6)δ:163.54,162.66,150.67,147.17,145.55,134.21,132.67,130.53,129.33,128.33,124.20,121.73,121.36,120.02,108.87,108.11,107.36,103.61,100.62,56.90,45.08,41.38,40.67,33.33,25.56.HR-MS m/z:446.20527([M+H]+).
实施例2：在细胞原位水平检测NA17是否可以进入线粒体
(一)细胞给药
1.将非小细胞肺癌细胞株NCI-H460接种于70cm培养皿，当细胞汇合度达到50％～60％时小心移去培养皿中的培养基，PBS洗两次，加入新的DMEM培养液。
2.以DMSO为溶剂配2mM的NA17原药，加入培养皿中使其终浓度为10μM，给药5h，同时设置不加药的对照组。
(二)线粒体的分离
1给药处理结束后小心移去培养皿中的培养基，PBS洗两次，用浓度为0.25％胰蛋白酶消化贴壁细胞；加入5mL PBS溶液，吹散贴壁细胞并收集悬液于10mL离心管中，在离心机上以2000rpm离心10min；
2.弃去上清PBS，加1ml冰浴预冷的PBS，漂洗细胞一次，2000rpm离心2min；
3.弃去上清PBS，加入适量添加了PMSF的线粒体分离试剂冰上孵育15min，期间定时吹散悬浮细胞，防止细胞沉淀；
4.把细胞悬液转移到一适当大小的玻璃匀浆器中，匀浆30下；
5.把细胞匀浆在1000g，4℃离心10分钟；
6.小心把上清转移到另一离心管中，在3500g，4℃离心10分钟；
7.收集部分上清(即为胞浆)，并且在收集上清时注意勿触及沉淀；小心去除剩余上清，沉淀即为分离得到的细胞线粒体。
(三)NA17与线粒体孵育
1.将步骤(二)中给药组提取的线粒体分成2份，取出1份与NA17进行孵育，药物孵育浓度与细胞给药浓度相同，均为10μM，充分混匀后在37℃水浴锅中孵育1h；对照组提取的线粒体同样分为2份，取其中1份与10μM的NA17充分混匀后于37℃水浴锅中孵育1h；
2.孵育结束后于9000g，4℃离心10分钟；
3.小心弃去上清，加入100μl线粒体储存液混匀于9000g，4℃离心10分钟；
4.完全去除上清，沉淀即为孵育NA17后的线粒体；
(四)线粒体蛋白质和胞浆蛋白质的提取
1.依据胞浆量加入100～200μl RIPA裂解液和PMFS(RIPA:PMSF＝100:1)，混匀，冰上超声裂解30min，每10min震荡混匀细胞裂解液，使胞浆裂解充分，得到胞浆裂解溶液；
2.依据线粒体量加入40～80μl线粒体裂解液和PMFS(线粒体裂解液:PMSF＝100:1)，混匀，冰上超声裂解15min，每5min震荡混匀细胞裂解液，使线粒体裂解充分，得到线粒体裂解溶液；
3.将胞浆裂解溶液和线粒体裂解溶液分别移至1.5ml EP管中，4℃、12000rpm条件下离心15min；
4.小心收集上清液，分别得到胞浆蛋白裂解液和线粒体蛋白裂解液，用于下一步的质谱检测。
(五)胞浆蛋白裂解液和线粒体蛋白裂解液的质谱检测
将经步骤(一)至(四)中处理所得的样品进行质谱分析，结果如图1～7所示。其中，图1为实施例1制得的最终产物NA17溶解在DMSO中的质谱分析结果；图2为细胞孵育NA17 5h的胞浆蛋白裂解液的质谱分析结果；图3为细胞孵育NA17 5h的线粒体蛋白裂解液的质谱分析结果；图4为细胞未孵育NA17的胞浆蛋白裂解液的质谱分析结果；图5为细胞未孵育NA17的线粒体蛋白裂解液的质谱分析结果；图6为细胞未经给药处理提取的线粒体单独孵育NA17 1h的线粒体蛋白裂解液的质谱分析结果；图7为细胞孵育NA175h，之后提取孵育NA17后细胞的线粒体再与NA17孵育1h的线粒体蛋白裂解液的质谱分析结果。
分析结果显示，在非小细胞肺癌细胞株NCI-H460细胞中NA17可以间接进入线粒体中。
Claims (8)
1.一种用于细胞原位检测小分子化合物进入线粒体的方法，其特征在于：选用适当的小分子化合物与细胞孵育，在不破坏细胞线粒体的条件下获取具有完整生理结构的线粒体，并收集胞浆；之后用小分子化合物与获取的线粒体进行孵育，将所得孵育小分子化合物后的线粒体及之前收集的胞浆在非变性条件下分别进行裂解以获得线粒体蛋白裂解液和胞浆蛋白裂解液，再结合质谱分析以实现在细胞原位水平上检测小分子化合物是否进入线粒体。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：具体包括以下步骤：
(Ⅰ)选定小分子化合物；
(Ⅱ)细胞给药：将选定的小分子化合物与细胞孵育使小分子化合物进入细胞，得到孵育后的细胞；设置对照组；
(Ⅲ)线粒体的分离：将孵育后的细胞在不破坏线粒体的条件下用线粒体分离试剂获取具有完整生理结构的线粒体，并收集胞浆；
(Ⅳ)药物与线粒体孵育：将选定的小分子化合物与获取的线粒体进行孵育，得到孵育小分子化合物后的线粒体；
(Ⅴ)蛋白质的提取：将孵育小分子化合物后的线粒体和之前收集的胞浆在非变性条件下分别进行裂解，分别得到具有完整生理结构蛋白质的线粒体蛋白裂解液和具有完整生理结构蛋白质的胞浆蛋白裂解液；
(Ⅵ)质谱分析：将所得的线粒体蛋白裂解液和胞浆蛋白裂解液进行质谱分析，同时与标准样品和对照组样品对比，检测各组线粒体蛋白裂解液和胞浆蛋白裂解液中是否有前述选定的小分子化合物析出，并以此来判断小分子化合物是否进入线粒体中。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述的小分子化合物根据体外活性初筛结果进行确定。
4.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述小分子化合物与细胞孵育时，所述小分子化合物在培养液中的浓度为1～10μmol/L。
5.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述小分子化合物与获取的线粒体进行孵育时，所述小分子化合物在储存液中的浓度为1～10μmol/L。
6.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述的细胞为肿瘤细胞株。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述的细胞为非小细胞肺癌细胞株NCI-H460。
8.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述的小分子化合物为具有下述式(A)所示结构的化合物：
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