HUP0105145A2

HUP0105145A2 - Eljárás HMG-CoA-reduktáz gátlók előállítására

Info

Publication number: HUP0105145A2
Application number: HU0105145A
Authority: HU
Inventors: Hirofumi Endo; Shin-Ichi Hashimoto; Hiroshi Mizoguchi; Akio Ozaki; Yoshiyuki Yonetani
Original assignee: Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd.
Priority date: 1999-01-29
Filing date: 2000-01-28
Publication date: 2002-04-29
Also published as: CZ20012728A3; KR20010108139A; EP1148122B1; DE60042879D1; EP1148122A4; US20090148916A1; HK1040530A1; HUP0105145A3; EP1148122A1; US7897370B2; ATE441702T1; AU2321600A; US7470528B2; US20080261273A1; WO2000044886A1; CA2360080A1; CN1329508C; US20060154348A1; IL144526A0; US7049111B1

Abstract

A tal lm ny egy Bacillus nemzetséghez tartozó mikroorganizmusból szrmazó fehérjére vonatkozik, amely az (I-a) ltal nos képletű vegyületekhidroxilezésére képes, mely képletben R1 jelentése hidrogénatom,szubsztitu lt vagy szubsztitu latlan alkilcsoport, vagy alk lifématom,és R2 jelentése szubsztitu lt vagy szubsztitu latlan alkil- vagyszubsztitu lt vagy szubsztitu latlan arilcsoport, vagy ennek gyűrűbezrt lakton form ja. A tal lm ny t rgy t képezi tov bb a fenti fehérjétkódoló DNS és az említett DNS-t tartalmazó rekombin ns DNS. Ó

Description

ϊ

73.123/SM

S.B.G. & Χ· Nemzetközi Szabadalmi Iroda H-1062 Budapest, Andrássy út 113. Telefon: 34-24-950., Fax: 34-24-323

Eljárás HMG-CoA-reduktáz gátlók előállítására

A találmány területe

A jelen találmány egy DNS-re vonatkozik, mely felhasználható olyan vegyületek előállításához, amelyek gátolják a hidroxi-metil-glutaril-CoA (HMG-CoA) reduktázt és szérum-koleszterinszint csökkentő hatással rendelkeznek. A találmány tárgyát képezi továbbá az említett vegyületek előállítására szolgáló eljárás a fenti DNS felhasználásával.

A találmány háttere

A (Vl-a) általános képletű vegyületről,

(Vl-a) mely képletben R¹ jelentése hidrogénatom, szubsztituált vagy szubsztituálatlan alkil-csoport vagy alkálifématom; vagy a (Vl-a) általános képletű vegyület lakton formájáról, amelyet a (Vl-b) képlettel ábrázolunk,

HO (Vl-b) ismert, hogy gátolják a HMG-CoA-reduktázt és szérum-koleszterinszint csökkentő hatással rendelkeznek (The Journal of Antibiotics, 29, 1364 (1976)).

Számos cikkben ismertetnek eljárásokat a (Vl-a) általános képletű vegyület és a (Vl-b) képletű vegyület előállítására egy alábbi (V-a) általános képletű vegyületből,

(V-a) mely képletben R¹ jelentése a fent megadottakkal megegyező;

vagy az (V-a) általános képletű vegyület lakton formájából, amelyet az (V-b) képlettel ábrázolunk,

mikroorganizmus alkalmazásával.

Közelebbről az 57-50894 számú japán közrebocsátási iratban (kokai) fonalas gombákat alkalmazó eljárást ismertetnek; mind a 7-184670 számú japán közrebocsátási iratban (kokai), mind a WO 96/40863 számú közzétételi iratban Actinomycetes gombákat alkalmazó eljárást ismertetnek; a 2672551 számú japán közrebocsátási iratban pedig olyan eljárást írnak le, ami rekombináns Actinomycetes-t alkalmaz. Jól ismert azonban, hogy mivel a fonalas gomba és az Actinomycetes gomba fonalas formában meghosszabbodó hifákon keresztül növekszik, a fermentorban a tenyészet viszkozitása megnő.

Ez gyakran oxigénhiányt okoz a tenyészetben és mivel a tenyészet heterogénné válik, úgy tűnik, hogy a reakció hatékonysága csökken. Az oxigénhiány megoldására és a tenyészet homogenitásának fenntartása céljából a fermentorban a keverés mértékét kellene növelni, de a keverési érték növelésével a hifák shared(deformálódnak) és ennek eredményeként a mikroorganizmusok aktivitása csökken (Basic Fermentation Engineering (Hakko Kogaku no Kiso) 169-190, P.F. Stansbury, A. Whitaker, Japan Scientific Societies Press (1988)).

A találmány részletes leírása

A jelen találmány tárgya egy új hidroxilázt kódoló DNS és egy iparilag előnyös eljárás olyan vegyület előállítására, amely a HMG-CoA-reduktázt gátolja és szérum koleszterinszint csökkentő hatással rendelkezik.

A jelen feltalálók felismerték, hogy amennyiben az (I-a) általános képletű vegyület vagy az (I-b) képletű vegyület hidroxilációja kivitelezhető hifát nem-képző mikroorganizmussal, a tenyészet heterogenitása - amelyet a hifa képződés okoz - következtében fellépő hátrányok (mint például a reakció hatékonyságának csökkenése) kiküszöbölhető és ez iparilag előnyös lenne. így tehát az intenzív kutatások eredményeként a feltalá lók kidolgozták a jelen találmányt.

A fentiek alapján a jelen találmány az alábbi (1)-(39) pontban foglaltakra vonatkozik.

Az alábbi képletekben R¹ jelentése hidrogénatom, szubsztituált vagy szubsztituálatlan alkilcsoport vagy alkálifém és R² jelentése szubsztituált vagy szubsztituálatlan alkilcsoport, vagy szubsztituált vagy szubsztituálatlan arilcsoport, ha más kikötés nincs.

A találmány tárgyai az alábbiak:

(1) Egy fehérje, amely egy Bacillus nemzetségbe tartozó mikroorganizmusból származik és képes az (I-a) vagy (I-b) képletű vegyületből a (Il-a) vagy (ΙΙ-b) képletű vegyület termelésére, ahol az (I-a) általános képletű vegyületet az alábbi képlet szemlélteti:

R¹OOC

OH

HO (l-a) az (I-b) általános képletű vegyületet, mely az (I-a) általános képletű vegyület lakton formája, az (I-b) képlet szemlélteti:

a (II-a) általános képletű vegyületet az alábbi képlet szemlélteti :

R 00C

HO és a (ΙΙ-b) általános képletű vegyületet, mely a (Il-a) általános képletű vegyület lakton formája, az alábbi (ΙΙ-b) képlet szemlélteti.

OH (ll-b)

HO ^v (2) Egy fehérje, amely egy Bacillus nemzetségbe tartozó mikroorganizmusból származik és képes az (Ill-a) vagy (Ill-b) képletű vegyületből a (IV-a) vagy (IV-b) képletű vegyület előállítására, ahol az (Ill-a) általános képletű vegyületet az alábbi képletű:

rOoc ,λΟΗ (Ill-a) a (III-b) általános képletű vegyűletet, mely a (Ill-a) általános képletű vegyület lakton formája, a (Ill-b) képlet szemlélteti:

a (IV-a) általános képletű vegyűletet a (IV-a) képlet ábrázolja:

(IV-a) és a (IV-b) általános képletű vegyűletet, mely a (IV-a) képletű vegyület lakton formája, a (IV-b) képlet szemlélteti.

(3) Egy fehérje, amely egy Bacillus nemzetségbe tartozó mikroorganizmusból származik és képes az (V-a) vagy (V-b) képletű vegyületből a (Vl-a) vagy (Vl-b) képletű vegyület előállítására, ahol az (V-a) általános képletű vegyületet az alábbi képlet szemlélteti:

(V-a) az (V-b) képletű vegyületet, mely az (V-a) általános képletű vegyület lakton formája a (V-b) képlet szemlélteti:

általános a (Vl-a) (V-b) képletű vegyületet az alábbi képlet ábrázol ja:

(Vl-a) és a (Vl-b) általános képletű vegyületet, mely a (Vl-a) általá nos képletű vegyület lakton formája a (Vl-b) képlet mutatja be.

(Vl-b) (4) Egy fehérje, amely egy Bacillus nemzetségbe tartozó mikroorganizmusból származik és képes a (Vll-a) vagy (Vll-b) képletű vegyűletből a (VIII-a) vagy (VIII-b) képletű vegyület előállítására, ahol a (Vll-a) általános képletű vegyületet az alábbi képlet ábrázolja :

(Vll-a) a (Vll-b) képletű vegyületet, mely a (Vll-a) általános képletű vegyület lakton formája, a (Vll-b) képlet ábrázolja:

(Vll-b) a (VIII-a) általános képletű vegyületet az alábbi képlet ábrázolja :

(Vlll-a) és a (VIII-b) általános képletű vegyületet, mely a (VIII-a) általános képletű vegyület lakton formája, a (VIII-b) képlet ábrázolja.

(VIII-b) (5) A fenti (1)-(4) bármelyike szerinti fehérje, ahol a Bacillus nemzetségbe tartozó mikroorganizmust a következők közül választjuk ki: B. subtilis, B. megaterium, B. laterosporus, B. sphaericus, B. pumilus, B. stearothermophilus, B. cereus, B. badius, B. brevis, B. alvei, B. circulars és B. macerans.

(6) A fenti (1)-(5) bármelyike szerinti fehérje, ahol a Bacillus nemzetségbe tartozó mikroorganizmust a következők közül választjuk ki: B. subtilis ATCC6051, B. megaterium ATCC10778, B. megaterium ATCC11562, B. megaterium ATCC13402, B. megaterium

ATCC15177, B. megaterium ATCC15450, B. megaterium ATCC19213, B. megaterium IAM1032, B. laterosporus ATCC4517, B. pumilus FERM BP-2064, B. badius ATCC14574, B. brevis NRRLB-8029, B. alvei ATCC6344, B. circulars NTCT-2610 és B. macerans NCIMB-9368.

(7) A fenti (1)-(5) bármelyike szerinti fehérje, ahol a Bacillus nemzetségbe tartozó mikroorganizmust a következők közül választjuk ki: Bacillus sp. FERMBP-6029 vagy Bacillus sp. FERM BP-6030.

(8) Fehérje, mely az 1. számú aminosav szekvenciával rendelkezik.

(9) Fehérje, mely az 1. számú aminosav szekvenciából egy vagy több aminosav kivágásával, helyettesítésével vagy addiciójával létrehozott aminosav szekvenciával rendelkezik és képes az (I-a) vagy (I-b) vegyületekből a (Il-a) vagy (ΙΙ-b) vegyületek előállítására .

(10) A fenti (9) szerinti fehérje, mely a 42. vagy 45. számú aminosav szekvenciával rendelkezik.

(11) A fenti (9) szerinti fehérje, amelyben az (I-a) vegyületet a (Ill-a) vegyület, a (I-b) vegyületet a (Ill-b) vegyület, a (Il-a) vegyületet a (IV-a) vegyület és a (ΙΙ-b) vegyületet a (IV-b) vegyület helyettesíti.

(12) A fenti (9) szerinti fehérje, amelyben a (I-a) vegyületet a (V-a) vegyület, a (I-b) vegyületet a (V-b) vegyület, a (Il-a) vegyületet a (Vl-a) vegyület és a (ΙΙ-b) vegyületet a (Vl-b) vegyület helyettesíti.

(13) A fenti (9) szerinti fehérje, amelyben a (I-a) vegyületet a (Vll-a) vegyület, a (I-b) vegyületet a (Vll-b) vegyület, a (II

a) vegyületet a (VIII-a) vegyület és a (ΙΙ-b) vegyületet a (VIII-b) vegyület helyettesíti.

(14) Egy izolált DNS, amely a 2. számú nukleotid szekvenciával rendelkezik.

(15) Egy izolált DNS, amely a fenti (14) szerinti DNS-sel szigorú feltételek között hibridizál, és kódolja az (I-a) vagy (I-b) vegyületből a (Il-a) vagy (ΙΙ-b) vegyület előállítására képes fehérj ét.

(16) A fenti (15) szerinti DNS, mely a 41., 43. vagy 44. számú nukleotid szekvenciával rendelkezik.

(17) Egy izolált DNS, amely a fenti (1)-(12) bármelyike szerinti fehérjét kódolja.

(18) A fenti (15) szerinti DNS, ahol az (I-a) vegyületeta (Ill-a) vegyület, a (I-b) vegyületet a (Ill-b) vegyület,a (Il-a) vegyületet a (IV-a) vegyület és a (II—b) vegyületeta (IV-b) vegyület helyettesíti.

(19) A fenti (15) szerinti DNS, ahol az (I-a) vegyületet az (V-a) vegyület, az (I-b) vegyületet az (V-b) vegyület, a (Il-a) vegyületet a (Vl-a) vegyület és a (ΙΙ-b) vegyületet a (Vl-b) vegyület helyettesíti.

(20) A fenti (15) szerinti DNS, ahol az (I-a) vegyületet a (VIIa) vegyület, a (I-b) vegyületet a (Vll-b) vegyület, a (Il-a) vegyületet a (VIII-a) vegyület és a (ΙΙ-b) vegyületet a (VIII-b) vegyület helyettesíti.

(21) Rekombináns DNS vektor, mely a fenti (14)-(20) bármelyike szerinti DNS-t tartalmazza.

(22) Transzformáns, amelyhez úgy jutunk, hogy a fenti (21) szerinti rekombináns DNS vektort bevezetjük egy gazdasejtbe.

(23) A fenti (22) szerinti transzformáns, ahol a transzformáns az Escherichia, Bacillus, Corynebacterium és Streptomyces nemzetségekből kiválasztott mikroorganizmushoz tartozik.

(24) A fenti (22) vagy (23) szerinti transzformáns, amelyben a transzformáns a Escherichia coli, Bacillus subtilis, Corynebacterium glutamicum, Corynebacterium ammoniagenes, Corynebacterium callunae és Streptomyces lividans fajokból kiválasztott mikroorganizmushoz tartozik.

(25) Eljárás a (Il-a) vagy (ΙΙ-b) vegyületek előállítására, melyben a fenti (22)-(24) bármelyike szerinti transzformánst, a transzformáns tenyészetét vagy a tenyészet kezelt termékét enzim forrásként alkalmazzuk, és az eljárás abban áll, hogy: az (I-a) vagy (I-b) vegyület létezését vizes közegben biztosítj uk;

a (Il-a) vagy (ΙΙ-b) vegyületet az említett vizes közegben előállítjuk és felhalmozzuk; és a (Il-a) vagy (ΙΙ-b) vegyületet az említett vizes közegből öszszegyűjtjük.

(26) Eljárás a (IV-a) vagy (IV-b) vegyületek előállítására, melyben a fenti (22)-(24) bármelyike szerinti transzformánst, a transzformáns tenyészetét vagy a tenyészet kezelt termékét enzim forrásként alkalmazzuk, és az eljárás abban áll, hogy:

a (Ill-a) vagy (Ill-b) vegyületet vizes közegbe helyezzük;

a (IV-a) vagy (IV-b) vegyületet az említett vizes közegben előállítjuk és felhalmozzuk; és a (IV-a) vagy (IV-b) vegyületet az említett vizes közegből öszszegyűjtjük.

(27) Eljárás a (Vl-a) vagy (Vl-b) vegyületek előállítására, melyben a fenti (22)-(24) bármelyike szerinti transzformánst, a transzformáns tenyészetét vagy a tenyészet kezelt termékét enzim forrásként alkalmazzuk, és az eljárás abban áll, hogy:

a (V-a) vagy (V-b) vegyületet vizes közegbe helyezzük;

a (Vl-a) vagy (Vl-b) vegyületet az említett vizes közegben előállítjuk és felhalmozzuk; és a (Vl-a) vagy (Vl-b) vegyületet az említett vizes közegből öszszegyűjtjük.

(28) Eljárás a (VIII-a) vagy (VIII-b) vegyületek előállítására, melyben a fenti (22)-(24) bármelyike szerinti transzformánst, a transzformáns tenyészetét vagy a tenyészet kezelt termékét enzim forrásként alkalmazzuk, és az eljárás abban áll, hogy:

a (Vll-a) vagy (Vll-b) vegyületet vizes közegbe helyezzük;

a (VIII-a) vagy (VIII-b) vegyületet az említett vizes közegben előállítjuk és felhalmozzuk; és a (VIII-a) vagy (VIII-b) vegyületet az említett vizes közegből összegyűjtjük.

(29) A fenti (25) szerinti eljárás, melyben a (Il-a) vegyület lakton formává alakításával kapjuk a (ΙΙ-b) vegyületet.

(30) A fenti (25) szerinti eljárás, melyben a (ΙΙ-b) vegyület lakton gyűrűjének felnyitásával kapjuk a (Il-a) vegyületet.

(31) A fenti (26) szerinti eljárás, melyben a (IV-a) vegyület lakton formává alakításával kapjuk a (IV-b) vegyületet.

(32) A fenti (26) szerinti eljárás, melyben a (IV-b) vegyület lakton gyűrűjének felnyitásával kapjuk a (IV-a) vegyűletet.

(33) A fenti (27) szerinti eljárás, melyben a (Vl-a) vegyület lakton formává alakításával kapjuk a (Vl-b) vegyűletet.

(34) A fenti (27) szerinti eljárás, melyben a (Vl-b) vegyület lakton gyűrűjének felnyitásával kapjuk a (Vl-a) vegyűletet.

(35) A fenti (28) szerinti eljárás, melyben a (VIII-a) vegyület lakton formává alakításával kapjuk a (VIII-b) vegyűletet.

(36) A fenti (28) szerinti eljárás, melyben a (VIII-b) vegyület lakton gyűrűjének felnyitásával kapjuk a (VIII-a) vegyűletet.

(37) A fenti (25)-(28) bármelyike szerinti eljárás, amelyben a transzformáns tenyészet kezelt termékeit tenyésztett sejtekből választjuk ki; ilyen kezelt termékek a szárított sejtek, fagyasztva szárított sejtek, felületaktív anyaggal kezelt sejtek, enzimmel kezelt sejtek, ultrahanggal kezelt sejtek, mechanikai őrléssel kezelt sejtek, oldószerrel kezelt sejtek; a sejt fehérje frakciója; és a sejtek vagy a kezelt sejtek immobilizált termékei .

(38) Eljárás egy fehérje előállítására, amely eljárás abban áll, hogy transzformánst tenyésztünk a fenti (22)-(24) bármelyike szerint; a fenti (1)-(12) bármelyike szerinti fehérjét termeljük és felhalmozzuk a tenyészetben; és az említett fehérjét összegyűjtjük a tenyészetből.

(39) Egy oligonukleotid, mely megfelel 5-60 egymást követő nukleotidnak a 2., 41., 43. vagy 44. nukleotidszekvencia egyikében; vagy egy, az említett oligonukleotid komplementer szekven ciájának megfelelő oligonukleotid.

A találmány részletes leírása

I. A yjiB gén kinyerése

A jelen találmányban felhasznált DNS-t PCR eljárással kaphatjuk meg (Science, 230, 1350 (1985) ) a Bacillus subtilis egy kromoszómájának genomiális nukleotid szekvencia információjának felhasználásával, amelyet már meghatároztak (http://www.pasteur.fr/Bio/SubtiList.html), és az említett genomiális nukleotid szekvenciából kikövetkeztetett Bacillus subtilis yjiB génre kapott információ felhasználásával.

Közelebbről a jelen találmányban alkalmazott DNS az alábbi eljárással nyerhető ki.

A Bacillus subtilis-t (pl. B. subtilis ATCC15563) szokásos módon tenyésztjük a Bacillus subtilis-nek megfelelő tápközegben, pl. LB folyékony tápközeg (amely 10 g Bacto Tryptont (gyártó: Difco), 5 g élesztő-kivonatot (gyártó: Difco), és 5 g NaCl-t tartalmaz 1 1 vízben és a pH-t 7,2-re beállítjuk) . A tenyésztés után a sejteket centrifugálással összegyűjtjük a tenyészetből.

A kromoszómális DNS-t az összegyűjtött sejtektől már ismert eljárással elkülönítjük (pl. Molecular Cloning 2. kiadás).

A 2. számú nukleotidszekvencia információjának felhasználásával a jelen találmányban leírt fehérjét kódoló DNS szakasznak megfelelő nukleotidszekvenciákat tartalmazó szenz és antiszenz primereket szintetizálunk DNS szintetizátorral.

PCR-rel végzett amplifikáció után abból a célból, hogy az említett amplifikált DNS fragmenseket egy plazmidba tudjuk juttatni, előnyös, ha egy megfelelő restrikciós helyet, mint pél dául BamHI, EcoRI és hasonlókat adunk a szenz és antiszenz primerek 5' végéhez.

A fent-emlitett szenz és antiszenz primerek kombinációjára példaként szolgálnak azon DNS-ek kombinációi, amelyek a 13. és 14. számú nukleotidszekvenciával rendelkeznek.

Kromoszomális DNS-t alkalmazva templátként, a PCR-t az alábbi primerekkel kivitelezzük: TaKaRa LA-PCR™ Kit Ver. 2 (beszerezhető TaKaRa-tól), Expand™ High-Fidelity PCR System (beszerezhető Boehringer Mannheim-től) vagy hasonlók, DNS Thermal Cycler alkalmazásával (gyártó: Perkin-Elmer Japan).

Mikor a PCR-t kivitelezzük, ez például a következő módszerrel történhet. Abban az esetben, ha a fenti primer 2 kb vagy ennél kisebb DNS fragmens, minden ciklus a következő reakciólépéseket foglalja magában: 30 s 94°C-on, 30 s - 1 perc 55 °C-on és 2 perc 72°C-on. Abban az esetben, ha a fenti primer 2 kb-nál nagyobb DNS fragmens, minden ciklus a következő reakciólépéseket foglalja magában: 20 s 98°C-on és 3 perc 68°C-on. A PCR-t minden esetben a 30 ciklusban kivitelezzük és utolsó lépésként a reakciót 7 percig 72°C-on tartjuk.

Az amplifikált DNS fragmenseket ugyanazon restrikciós helyen hasítjuk, mint amit a fenti primerek felhasználásához kialakítottunk, majd a DNS fragmenseket frakciónáljuk és agaróz gélelektroforézissel, szacharóz sűrűséggradienssel, ultracentrifugálással és hasonló eljárásokkal kinyerjük.

A kinyert DNS fragmensek felhasználásával egy klónozó vektort állítunk elő általános eljárásokkal, amelyeket az alábbiak ban ismertetnek: Molecular Cloning 2. kiadás, Current Protocols in Molecular Biology, 1-38, John Wiley & Sons (1987-1997) (az alábbiakban Current Protocols in Molecular Biology, Supplementként hivatkozunk rá), DNA Cloning 1: Core Techniques, A Practical Approach, Second Edition, Oxford University Press (1995), vagy a kereskedelemben beszerezhető kit felhasználásával, mint pl. Superscript Plasmid System for cDNA Synthesis and Plasmid Cloning (előállítja Life Technologies), ZAP-cDNA Synthesis Kit (előállítja Stratagene) stb., majd az így előállított klónozó vektort az Eschericia coli, pl. E.coli DH5oc törzs (beszerezhető TOYOBO-tól) transzformálására használjuk fel.

Az E. coli transzformálására használt klónozó vektorra példaként szolgál egy plazmid vektor és fág vektor, amennyiben képes önreprodukcióra E. coli K12 törzsben. Egy expressziós vektor szintén felhasználható klónozó vektorként az E. coli esetében. Közelebbről példaként nevezzük meg az alábbiakat: ZAP Express [előállítja Stratagene, Strategies, _5, 58 (1992)], pBluescript II SK( + ) [Nucleic Acids Research, 17, 9494 (1998)], Lambda ZAP II (előállítja Stratagene), XgtlO, Xgtll [DNS Cloning, A Practical Approach, ]1, 49 (1985)], XTriplEx (előállítja Clonetech), ZExCell (előállítja Pharmacia), pT7T318U (előállítja Pharmacia), pcD2 [H. Okayama és P. Berg; Mol. Cell. Biol., 3, 280 (1983)], pMW218 (előállítja Wako Pure Chemical Industries), pUC118, pSTV28 (előállítja Takara), pEG400 [J. Bac., 172, 2392 (1990)], pHMV1520 (előállítja MoBiTec), pQE-30 (előállítja QIAGEN), stb.

A megfelelő DNS-t tartalmazó plazmid a transzformált törzsből szokásos módokon kinyerhető, melyeket az alábbiakban ismer tetnek pl. Molecular Cloninig 2^nd edition, Current Protocols in Molecular Biology Supplement, DNA Cloning 1: Core Techniques, A Practical Approac, Second Edition, Oxford University Press (1995), stb.

Az előbb említett eljárás alkalmazásával megkaphatjuk az (I-a) vagy (I-b) vegyületből a (Il-a) vagy (Il-b) vegyület előállítását katalizáló fehérjét kódoló DNS-t tartalmazó plazmidot.

Példaként a plazmidokra alább említett pSyjiB szolgál.

A fent-említett eljárás mellett egy másik eljárással, amelyben egy Bacillus subtilis kromoszomális könyvtárat állítunk elő egy alkalmas vektorral (E. coli-t használva gazdaszervezetként), egy olyan plazmidot kapunk, amely az (I-a) vagy (I-b) vegyületből a (Il-a) vagy (ΙΙ-b) vegyület előállítását katalizáló fehérjét kódoló DNS-t tartalmazza, és az (I-a) vagy (I-b) vegyületből (Il-a) vagy (ΙΙ-b) vegyület előállításának hatékonyságát a könyvtár minden egyes törzsén mérjük.

Az így-kapott gén nukleotidszekvenciája felhasználható arra, hogy a DNS homológjait kinyerjük más prokariótákból vagy növényekből a fentiekkel azonos módon.

A fenti eljárás során kapott találmány szerinti DNS és DNS fragmens felhasználható oligonukleotidok előállítására, mint pl. a találmány szerinti DNS szekvenciát részben tartalmazó antiszenz oligonukleotidok, szenz oligonukleotidok, stb. vagy RNS-t tartalmazó oligonukleotidok. Közelebbről a fenti eljárás során kapott DNS szekvencia információja alapján ezek az oligonukleotidok megszintetizálhatók a fent említett DNS szinte tizátorral .

Példaként az oligonukleotidokra az alábbiakat soroljuk fel: a fenti DNS nukleotidszekvenciájának 5-60 egymást követő nukleotidját tartalmazó nukleotidszekvenciával rendelkező DNS, vagy az említett DNS komplementer szekvenciáját tartalmazó DNS. Ezen DNS-ek komplementer szekvenciáját tartalmazó RNS-ek szintén a jelen találmány oligonukleotidjai közé tartoznak.

Példaként az említett oligonukleotidokra az alábbiakat soroljuk fel: 5-60 nukleotidot tartalmazó 2., 41., 43. és 44. számú nukleotiszekvenciával rendelkező DNS, vagy az említett DNS komplementer szekvenciájával rendelkező DNS. Amennyiben ezeket szenz és antiszenz primerekként alkalmazzuk, a fenti oligonukleotidokat nagy különbségek nélkül olvadási hőmérsékleten használjuk. Közelebbről példaként említjük a 3-39. nukleotidszekvenciával rendelkező oligonukleotidokat.

Továbbá ezen oligonukleotidok származékai szintén felhasználhatók a jelen találmányban DNS-ként.

Oligonukleotid-származékra példaként szolgál egy oligonukleotid-származék, amelyben a foszfát-diészter kötést egy foszfor-tioát kötéssel helyettesítjük; egy oligonukleotid-származék, amelyben a foszfát-diészter kötést egy N3'-P5' foszfoamid-kötéssel helyettesítjük; egy oligonukleotid-származék, amelynek ribóz és foszfát-diészter kötését egy peptidnukleinsav kötéssel helyettesítjük; egy oligonukleotid-származék, amelyben az uracilt C-5 propinil-uracillal helyettesítjük; egy oligonukleotid-származék, amelyben az uracilt C-5 tiazol-uracillal helyettesítjük; egy oligonukleotid-származék, amelyben a citozint C-5 propinil-citozinnal helyettesítjük; egy oligonukleotid származék, amelyben a citozint fenoxazinmódosított citozinnal helyettesítjük; egy oligonukleotid-származék, amelyben a ribózt 2'-O-propil-ribózzal helyettesítjük; vagy egy oligonukleotid-származék, amelyben a ribózt 2'-metoxi-etoxi-ribózzal helyettesítjük; stb. [Saibo Kogaku, 16, 1463 (1997) ] .

II. Eljárás fehérje előállítására, amely az (I-a) vagy (I-b) vegyületből a (Il-a) vagy (ΙΙ-b) vegyület előállítási reakcióját katalizálj a

Abból a célból, hogy a fent kinyert DNS-t egy gazdasejtben expresszáljuk, a kívánt DNS fragmenst restrikciós vagy DNáz enzimekkel megfelelő hosszúságú, az említett gént tartalmazó fragmensekre vágjuk, ezt követően a fragmenst egy expressziós vektorba a promotertől downstream helyre beillesztjük, majd az expressziós vektort a felhasználására alkalmas gazdasejtekbe bevezetjük.

A gazdasejt lehet baktérium-, élesztő-, állati-, rovarsejt vagy ezekhez hasonló, amennyiben az adott gén expresszálására képes.

Expressziós vektorként olyan vektort alkalmazunk, amely a gazdasejtben önreprodukcióra vagy a kromoszómába integrálódni képes, és egy promotert tartalmaz az adott gén transzkripciójához alkalmas helyen.

Amikor gazdasejtként prokariótákat pl. baktériumot alkalmazunk, az expressziós vektor egy rekombináns vektor, amely a gaz dasejtben önreprodukcióra képes, ezáltal fenti

DNS expresszálására alkalmas, és egy promoterből, riboszóma-kötő szekvenciából, a fenti DNS-ből és egy transzkripciós terminátor szekvenciából áll. Ά vektor tartalmazhat egy gént a promoter szabályozásához.

Expressziós vektorok közé tartoznak az alábbiak: pBTrp2, pBTacl, pBTac2 (gyártó: Boehringer Mannheim), pKK233-2 (gyártó: Pharmacia), pSE280 (gyártó: Invitrogen), pGEMEX-1 (gyártó: Promega), pQE-8 (gyártó: QIAGEN), pQE-30 (gyártó: QIAGEN), pKYPIO (58-110600 számú japán közrebocsátás! irat), pKYP200 [Agricultural Biological Chemistry, 48 , 669 (1984)], pLSAl [Agric. Biol. Chem. 53, 277 (1989)], pGELl [Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 82, 4306 (1985)], pBluescriptII SK( + ), pBluescriptII SK(-) (gyártó: Stratagene), pTrS30 (FERM BP-5407), pTrS32 (FERM BP-5408), pGEX (gyártó: Pharmacia), pET-3 (gyártó: Novagen), pTerm2 (US 4,686,191, US 4,939,094, US 5,160,735), pSupex, pUBHO, pTP5, pC194, pUC18 [Gene, 33, 103 (1985)], pUC19 [Gene, 33, 103 (1985)], pSTV28 (gyártó: Takara), pSTV29 (gyártó: Takara), pUC118 (gyártó: Takara), pPAl (63-233798 számú japán közrebo-csátási irat), pEG400 [J. Bacteriol., 172, 2392 (1990)], pQE-30 (gyártó: QIAGEN), PHY300 (gyártó: Takara), pHW1520 (gyártó: MoBiTec), stb.

Promoterként bármely promotert alkalmazhatjuk, amennyiben az a gazdasejtben expresszálható. Példák az E. colí-ból, fágokból, stb. származó promoterekre a trp promoter (Ptrp), lac promoter (Piac), PL promoter, PR promoter, PSE promoter és SP01 promoter, SP02 promoter, penP promoter és hasonlók. Mestersége sen tervezett és módosított promoterek, mint például a tandemben két Ptrp promotert tartalmazó PtrpX2 promoter, tac promoter, letl promoter és lacT7 promoter, szintén alkalmazhatók. Továbbá Bacillus baktériumokban az xylA promoter vagy Corynebactérium baktériumokban a P45-6 promoter szintén felhasználható az expresszióhoz.

Bármilyen riboszóma-kötőhelyet kódoló szekvenciát felhasználhatunk, amennyiben az a gazdasejtben működőképes és előnyösen olyan plazmid alkalmazandó, melyben a Shine-Dalgarno szekvencia és az iniciáló kodon közötti távolság megfelelő távolságra van beállítva (például 6-18 bázis távolság).

A hatékony transzkripció és transzláció céljából az (I-a) vagy (I-b) vegyületből a (Il-a) vagy (ΙΙ-b) vegyület előállítási reakcióját katalizáló fehérjét, amelyből az N-terminális vagy ennek egy része hiányzik, fúzionálhatjuk egy, az expressziós vektor által kódolt fehérje N-terminálisához, és az így kapott fúziós fehérjét expresszálhatjuk. Erre példaként szolgál az alábbiakban tárgyalt pWyjiB.

Habár a transzkripciós terminációs szekvencia nem feltétlenül szükséges a kívánt DNS expressziójához, előnyös, ha a transzkripciós terminációs szekvencia a struktur géntől közvetlenül downstream irányban helyezkedik el.

Prokariotákra példaként az alábbi nemzetségekbe tartozó mikroorganizmusokat soroljuk fel: Escherichia, Corynebacterium, Brevibacterium, Bacillus, Microbacterium, Serratia, Pseudomonas, Agrobacterium, Alicyclobacillus, Anabaena, Anacystis, Arthrobacter, Azotobacter, Chromatium, Erwinia,

Methylobacterium

Phormidium

Rhodobacter

Rhodopseudomonas

RhodospiriHum, Streptomyces, Synechococcus és Zymomonas, előnyösen Escherichia, Corynebacterium, Brevibacterium, Bacillus, Pseudomonas, Agrobacterium, Alicyclobacillus, Anabaena, Anacystis, Arthrobacter, Azotobacter, Chromatium, Erwinia, Methylobacterium, Phormidium, Rhodobacter, Rhodopseudomonas, Rhodospirillum, Streptomyces, Synechococcus és Zymomonas.

A mikroorganizmusokra specifikus példaként az alábbiak szolgálnak: Eschericia coli XLl-Blue, Eschericia coli XL2-Blue, Eschericia coli DH1, Eschericia coli DH5a, Eschericia coli MC1000, Eschericia coli KY3276, Eschericia coli W1485, Eschericia coli JM109, Eschericia coli HB101, Eschericia coli No.49, Eschericia coli W3110, Eschericia coli NY49, Eschericia coli MP347, Eschericia coli NM522, Bacillus subtilis ATCC33712, Bacillus megaterium, Bacillus sp. FERM BP-6030, Bacillus amyloli-quefacines, Brevibacterium ammoniagenes, Brevibacterium immariophilum ATCC14068, Brevibacterium saccharolyticum ATCC14066, Brevibacterium flavum ATCC14067, Brevibacterium lactofermentum ATCC13869, Corynebacterium glutamicum ATCC13032, Corynebacterium glutamicum ATCC14297, Corynebacterium acetoacidophilum ATCC13870, Corynebacterium callunae ATCC15991, Microbacterium ammoniaphilum ATCC15354, Serratia ficaria, Serratia fonticola, Serratia liquefaciens, Serratia marcescens, Pseudomonas sp. D-0110, Agrobacterium radiobacter, Agrobacterium rhizogenes, Agrobacterium rubi, Anabaena cylindrical, Anabaena doliolum, Anabaena flos-aquae, Arthrobacter aurescens, Arthrobacter citreus, Arthrobacter globformis, Arthrobacter hydrocarboglutamicus

Arthrobacter mysorens

Arthrobacter nicotianae, Arthrobacter para ffineus, Arthrobacter protophormiae, Arthrobacter roseoparaffinus, Arthrobacter sulfurous, Arthrobacter ureafaciens, Chromatium buderi, Chromatium tepidum, Chromatium vinosum, Chromatium warmingii, Chromatium fluviatile, Erwinia uredovora, Erwinia carotovora, Erwinia ananas, Erwinia herbicola, Erwinia punctata, Erwinia terreus, Methylobacterium rhodesianum, Methylobacterium extorquens, Phormidium sp. ATCC29409, Rhodobacter capsulatus, Rhodobacter sphaeroides, Rhodopseudomonas blastica, Rhodopseudomonas marina, Rhodopseudomonas palustris, Rhodospirillum rubrum, Rhodospirillum salexigens, Rhodospirillum salinarum, Streptomyces ambofaciens, Streptomyces aureofaciens, Streptomyces aureus, Streptomyces fungicidicus, Streptomyces griseochromogenes, Streptomyces griseus, Streptomyces lividans, Streptomyces olivogriseus, Streptomyces rameus, Streptomyces tanashiensis, Streptomyces vinaceus és Zymomonas mobilis.

A rekombináns vektor bejuttatására szolgáló eljárásként bármely módszert alkalmazhatjuk a DNS bejuttatására a fent említett gazdasejtekbe. Például megemlíthetjük a kalcium-ionokat alkalmazó eljárást (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69, 2110 (1972)), protoplaszt eljárást (63-248394 számú japán közrebocsátási irat), elektroporációs eljárást, egy eljárást, amelyet az alábbiakban ismertetnek (Gene, 17, 107 (1982) és Molecular & General Genetics, 168, 111 (1979) és hasonlókat.

Ha gazdasejtként élesztőt alkalmazunk, expressziós vektorként a következő példák szolgálhatnak YEpl3 (ATCC37115), YEp24 (ATCC37051), YCp50 (ATCC37419), pHS19 és pHS15.

Promoterként bármely promotert alkalmazhatunk, amennyiben az élesztőkben képes kifejeződni. Példaként megemlíthetjük a PHO5 promotert, PGK promotert, GAP promotert, ADH promotert, gal 1 promotert, gal 10 promotert, hősokk-fehérje promotert, MFal promotert és CUP1 promotert.

Élesztő gazdasejtekre példaként az alábbiakat soroljuk fel: Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Kluvyeromyces lactis, Trichosporon pullulans és Scwanniomyces alluvius.

A rekombináns vektor bejuttatására szolgáló eljárásként bármely módszert alkalmazhatjuk a DNS bejuttatására élesztőkbe, példaként az alábbiak szolgálnak: elektroporációs eljárás (Methods Enzymol., 194, 182 (1990)), speroplaszt eljárás (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 7 5, 1929 (1978)), lítium-acetátos eljárás (J. Bacteriol., 153, 163 (1983)) és egy eljárás, amelyet Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 7 5, 1929 (1978) irodalmi helyen ismertetnek.

Ha gazdasejtként állati sejteket használunk fel, az alábbi expressziós vektorokat alkalmazhatjuk: pcDNAI, pcDM8 (előállítja: Funakoshi), pAGE107 (3-22979 számú japán közrebocsátást irat; Cytotechnology, 3_, 133 (1990)), pAS3-3 (2-227075 számú japán közrebocsátási irat) pCDM8 (Nature, 329, 840 (1987)), pcDNAI/Amp (Invitrogen), pREP4 (Invitrogen), pAGE103 (J. Biochem., 101, 1307 (1987)) és pAGE210.

Promoterként bármely promotert alkalmazhatunk, amely képes állati sejtekben expresszálódni. Példaként az alábbiakat soroljuk fel: a cytomegalovirus (humán CMV) IE (közvetlen korai) gén jének promoter©, SV40 korai promoter, retrovirus promoter, metallothionein promoter, hősokk-fehérje promoter, Sr a promoter és hasonlók. Továbbá a humán CMV IE génjének enhancere a promoterrel együtt alkalmazható.

Állati sejtekre példaként az alábiakat nevezzük meg: Namalwa sejt, HBT5637 (63-299 számú japán közrebocsátási irat), COS1 sejt, COS7 sejt, CHO sejt és hasonlók.

A rekombináns vektor állati sejtbe juttatására szolgáló eljárásként bármelyik DNS állati sejtbe juttatására szolgáló módszert alkalmazhatjuk. Ilyen eljárásokra példaként az alábbiak szolgálnak: elektroporációs eljárás (Cytotechnology, 3, 133 (1990)), kalcium-foszfátos eljárás (2-227075 számú japán közrebocsátási irat), lipofertőző módszer (Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 8 4, 7413 (1987)), egy eljárás, amelyet az alábbi cikkben ismertetnek: Virology, 52, 456 (1973) és hasonlók. A transz!ormáns tenyésztése és kinyerése az 2-227075 számú vagy a 2-257891 számú japán közrebocsátási iratban ismertetett eljárás alapján kivitelezhető.

Ha gazdasejtként rovarsejteket használunk, a fehérje az alábbiakban ismertetett eljárások alapján expresszálható: Baculovirus Expression Vectors, A Laboratory Manual, Current Protocols in Molecular Biology Supplement 1-38 (1987-1997); Bio/Technology, 6, 47 (1988) és hasonlók.

Ez az eljárás abban áll, hogy egy rekombináns gén transzfer vektort és egy baculovírust ko-transzfektálunk a rovarsejtekbe, igy a rovarsejtek tenyészetének felülúszójában megkapjuk a rekombináns vírust, majd a rovarsejteket megfertőzzük a rekombináns vírussal, miáltal a fehérje expresszálható.

Ebben az eljárásban felhasznált gén transzfer vektorok, köztük a pVL1392, pVL1393 és pBlueBacIII, a kereskedelemben beszerezhetők (mindegyik az Invitrogen-től).

Baculovirusként az alábbiakat alkalmazhatjuk pl. az Autographa californica nukleáris polihedrozis vírust, amely a Barathra családba tartozó rovarokat képes megfertőzni.

Rovarsejtekként alkalmazhatjuk az Sf9-t, Sf21-t [Baculovirus Expression Vectors, A Laboratory Manual, W.H. Freeman and Company, New York (1992)], mely a Spodopetera frugiperda oocitája és a High 5-t (beszerezhető az Invitrogentől) , mely a Trichoplusia ni oocitája és ezekhez hasonlókat.

A fent említett rekombináns gén transzfer vektor és baculovirus rovarsejtekbe történő ko-transzfektálására a rekombináns vírus előállítása céljából az alábbi módszereket alkalmazhatjuk: kalcium-foszfátos módszer (2-227075 számú japán közrebocsátási irat), lipofection módszer [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 8 4, 7413 (1987)] és ehhez hasonlók.

A gén-expressziós eljárást, továbbá az expresszió irányítását, a termék kiválasztását, fúziós fehérjék és hasonlók expresszióját a Molecular Cloning 2. kiadásban leírt eljárás szerint végezhetjük.

Ha a fehérjét élesztőkben, állati sejtekben vagy rovarsejtekben fejezzük ki, egy cukorral vagy cukorlánccal összekapcsolt fehérjét nyerhetünk.

Az így-kapott transzformánst tápközegben tenyésztjük, hogy előállítsuk és felhalmozzuk az (I-a) vagy (I-b) vegyületből a (Il-a) vagy (ΙΙ-b) vegyület előállítását katalizáló fehérjéket. A fehérjéket a tenyészetből kinyerjük, miáltal az (I-a) vagy (Ib) vegyületből a (Il-a) vagy (ΙΙ-b) vegyület előállítását katalizáló fehérjéhez jutunk.

A találmány szerinti, az (I-a) vagy (I-b) vegyületből a (Il-a) vagy (ΙΙ-b) vegyület előállítási reakcióját katalizáló fehérjék előállítása céljából a kapott transzformáns tápközegben történő tenyésztésére szolgáló eljárásként szokásos eljárásokat alkalmazhatunk, melyeket egy gazdasejtben lévő transzformáns tenyésztésére használnak.

Ha a jelen találmányban alkalmazott transzformáns prokarióta, mint pl. E. coli vagy eukarióta, mint pl. élesztő, ezen organizmusok tenyésztésére szolgáló táptalaj egyaránt lehet természetes és szintetikus, amennyiben szénforrást, nitrogénforrást, szervetlen sókat és hasonlókat tartalmaz, melyeket az említett organizmusok képesek asszimilálni, és a transzformáns hatékony tenyésztését lehetővé teszi.

Szénforrásként bármely szénforrást felhasználhatunk, amenynyiben azt a mikroorganizmusok asszimilálni tudják, beleértve a szénhidrátokat, pl. glukóz, fruktóz, szacharóz, vagy melaszokat, melyek azok forrásait tartalmazzák, keményítőt vagy keményítő hidrolizátumokat; szerves savakat, pl. ecetsav, propionsav; és alkoholokat, mint pl. etanol, propanol.

Nitrogénforrásként az alábbiakat alkalmazhatjuk: ammónia, különböző szervetlen és szerves savak amónium-sói, pl. ammónium klorid, ammónium-szulfát, ammónium-acetát és ammónium-foszfát; más nitrogén tartalmú vegyületek; pepton, hús-kivonat, élesztőkivonat, gabona áztató folyadék, kazein-hidrolizátumok, szójabab liszt, szójabab hidrolizátumok, különböző fermentált sejtek és ezek hidrolizált származékai és hasonlók.

A szervetlen összetevőkre példaként az alábbiak szolgálnak: kálium-dihidrogén-foszfát, kálium-hidrogén-foszfát, magnéziumfoszfát, magnézium-szulfát, nátrium-klorid, vas-szulfát, mangánszulfát és kalcium-karbonát.

A tenyésztés aerob körülmények között történik a tenyészet rázásával. A tenyészet hőmérséklete előnyösen 15-50°C, és a tenyésztési idő általában 16 óra - 7 nap. A tenyésztés alatt a pHt 3,0 - 9,0 között tartjuk. A pH ellenőrzése szervetlen vagy szerves savval, alkalikus oldattal, karbamiddal, kalcium-karbonáttal, ammóniával és hasonlókkal történik.

Ha szükséges antibiotikumokat, mint pl. ampicillint és tetraciklint adhatunk a tápközeghez a tenyésztés alatt.

Amikor egy mikroorganizmust induktív promotert tartalmazó (tenyésztett promoter) expressziós vektorral transzformálunk, adott esetben egy inducert adhatunk a tenyészethez. Például izopropil-p-D-tio-galakto-piranozid (IPTG), indol-akrilsav (IAA) vagy xilóz adható egyenként a tenyészethez, mikor a mikroorganizmus transzformálásához lac promotert, trp promotert vagy xylA promotert tartalmazó expressziós vektort alkalmazunk.

Gazdasejtként állati sejteket alkalmazva, a transzformáns tenyésztésére szolgáló tápközeg lehet egy általánosan használt tápközeg, úgy mint RPMI1640 tápközeg [The Journal of the

American Medical Association, 199, 519 (1967)], Eagle's MEM tápközeg [Science, 122, 501 (1952)], DMEM tápközeg [Virology, 8, 396 (1959) ] , 199 tápközeg [Proceeding of the Society for the Biological Medicine, 73, 1 (1950)] vagy ezen tápközegek bármelyike kiegészítve magzati borjú szérummal.

A tenyésztést általában 1-7 napig, pH 6-8 értéken, 30-40°Con, 5% CO₂ jelenlétében hajtjuk végre.

Ha szükséges antibiotikumokat, mint például kanamicint és penicillint adhatunk a tápközeghez a tenyésztés során.

Gazdasejtként rovarsejteket alkalmazva a transzformáns tenyésztésére szolgáló tápközeg egy általánosan használt tápközeg lehet, mint pl. TNM-FH tápközeg (gyártó: Pharmingen), Sf-900 II SFM tápközeg (gyártó: Gibco BRL), ExCell 400 és ExCell 405 (gyártó: JRH Biosciences) , Grace's Incest Medium [Grace T.C.C., Nature, 195, 788 (1962)].

A tenyésztés általában 1-5 nap alatt, pH 6-7 értéken, 2530°C-on történik.

Ha szükséges antibiotikumok, mint például gentamicin adhatók a tápközeghez a tenyésztés során.

Az (I-a) vagy (I-b) vegyületből a (Il-a) vagy (ΙΙ-b) vegyület előállítási reakcióját katalizáló fehérje kinyerésére a találmány szerinti transzformáns tenyészetéből és tisztítására bármely konvencionális eljárás alkalmazható, amely enzimek kinyerésére és tisztítására szolgál.

Például abban az esetben, amikor a jelen találmány fehérjéje oldott formában expresszálódik a sejtekben, a tenyésztést követően a sejteket centrifugálással leválasztjuk és vizes puffer ben szuszpendáljuk, majd ultrahanggal széttörjük, mint pl. French Press, Manton-Gaulin homogenizátor, Dynomill vagy hasonlók, így sejtmentes extraktumot kapunk. A sejtmentes extraktum centrifugálásával kapott felülúszóból tisztított készítményt kaphatunk hagyományos eljárások alkalmazásával, melyek enzimek egyedüli vagy kombinációs elválasztására és tisztítására szolgálnak, mint pl. oldószeres extrakció, kisózás vagy sómentesítés ammónium-szulfáttal, stb; kicsapás szerves oldószerrel; anioncserélő kromatográfia dietil-amino-etil(DEAE)-széfaróz gyantán, DIAION HPA-75 gyantán (beszerezhető Mitsubishi Chemical Industries Ltd.-tői); kationcserélő kromatográfia S-Sepharose FF (beszerezhető Pharmacia-tól) vagy hasonló gyantán; gél filtráció molekula szűrő alkalmazásával; affinitás kromatográfia; kromatofókuszálás; és elektroforézis, mint pl. izoelektroforézis.

Abban az esetben, amikor a fehérje a sejtekben zárványtestek formájában expresszálódik, a sejteket hasonlóképpen leválasztjuk, homogenizáljuk és centrifugáljuk, így csapadékos frakcióhoz jutunk, és a fehérjét a frakcióból szokásos módon kinyerjük. Az elválasztott zárványtesteket fehérje denaturáló ágenssel szolubilizáljuk. Ezután a szolubilizált oldatot olyan oldattal hígítjuk vagy olyan oldattal szemben dializáljuk, amely nem tartalmazza a fehérje denaturáló ágenst vagy megfelelően kis koncentrációban tartalmazza a fehérje denaturáló ágenst ahhoz, hogy a fehérje ne denaturálódjon, miáltal a fehérje renaturálódik, hogy normál harmadlagos szerkezettel rendelkezzen, és a tiszti tott terméket a fent leírt elválasztási és tisztítási eljárással kaphatjuk meg.

Amikor a jelen találmány fehérjéje vagy annak szachariddal módosított származéka extracellulárisan szekretálódik, a fehérje vagy annak szacharid-lánccal bővült származékai a tenyészet felülúszójából elválaszthatók. E szerint a tenyészetet egy fent említett eljárásnak vetjük alá, mint pl. centrifugálás és hasonlók, így oldható frakciókat kapunk, majd az oldható frakciókból a fent leírt módon egy tisztított terméket kaphatunk.

Az így kapott fehérjékre példaként az alábbiak szolgálnak: az 1., 42. vagy 45. aminosavszekvenciájú fehérjék. Továbbá a fenti eljárással expresszált fehérje kémiai szintetikus módszerekkel is előállítható, úgy mint Fmoc módszer (fluorenil-metil-oxi-karbonil módszer) és tBoc módszer (t-butil-oxi-karbonil módszer). Vagylagosan a fehérje megszintetizálható peptid szintetizátorral, gyártja Sowa Trading (Advanced chemTech, USA), Perking-Elmer Japan (Perking Elmer, USA), Pharmacia Biotech (Pharmacia Biotech, Sweden), ALOKA (Protein Technology Instrument, USA), KURABO (Synthecell-Vega, USA), Japan PerSeptive Ltd. (PerSeptive, USA), Shimazu, stb.

III. (Il-a) vagy (ΙΙ-b) vegyületek előállítása

Felhasználva a II fejezetben leírt módszer szerint kapott transzformáns tenyésztésével kapott sejteket, ezen sejtek tenyészetét, a tenyészet kezelt termékét, vagy az említett sejtekből, mint enzimforrásokból extrahált enzimet, a (Il-a) vagy (Il-b) vegyületet előállíthatjuk vizes közegben lévő (I-a) vagy (I-b) vegyületből oly módon, hogy hagyjuk, hogy a (Il-a) vagy (Il-b) vegyület megképződjön és felhalmozódjon a vizes közegben, és a vizes közegből a (Il-a) vagy (ΙΙ-b) vegyületet összegyűjtjük.

Ά sejttenyészet kezelt termékeire példaként az alábbiak szolgálnak, úgy mint szárított sejtek, liofilizált sejtek, felületaktív anyagokkal kezelt sejtek, enzimekkel kezelt sejtek, ultrahanggal kezelt sejtek, mechanikai őrléssel kezelt sejtek, oldószerrel kezelt sejtek; vagy a sejtek fehérje frakciói; vagy az említett sejtek immobilizált termékei és az említett sejtek említett kezelt termékei.

Az (I-a) vagy (I-b) vegyület (Il-a) vagy (ΙΙ-b) vegyületté történő konvertálására szolgáló eljárásként az alábbi (a) és (b) módszerek mindegyike alkalmazható: az (a) módszerben az (I-a) vagy (I-b) vegyületet a tenyésztést megelőzően adjuk a tápközeghez; a (b) módszerben az (I-a) vagy (I-b) vegyületet a tenyésztés alatt adjuk a tápközeghez. Vagylagosan egy olyan módszer is alkalmazható, amelyben a sejttenyészetből kinyert enzim forrást reagáltatjuk az (I-a) vagy (I-b) vegyülettel a vizes tápközegben .

Abban az esetben, amikor az (I-a) vagy (I-b) vegyületet adjuk a tápközeghez, melyben a mikroorganizmust tenyészteni fogjuk, 0,1-10 mg, előnyösen 0,2-1 mg (I-a) vagy (I-b) vegyületet adunk a tenyésztés kezdetén vagy valamely közti pontban 1 ml tápközeghez. Előnyös, hogy az (I-a) vagy (I-b) vegyületet szer vés oldószerben, mint pl. metil-alkoholban vagy etil-alkoholban való feloldás után adjuk a tápközeghez.

Abban az esetben, amikor a sejttenyészetből kinyert enzim forrást reagáltatjuk az (I-a) vagy (I-b) vegyülettel vizes tápközegben, a felhasznált enzim-mennyiség függ az enzim specifikus aktivitásától és hasonlóktól. Például, amikor sejttenyészetet, sejteket vagy ezek kezelt termékeit használjuk enzim forrásként, 5-1,000 mg, előnyösen 10-400 mg enzim forrást adunk az (I-a) vagy (I-b) vegyülethez 1 mg-onként. A reakciót vizes tápközegben kivitelezzük, előnyösen 20-50°C-on, és még előnyösebb 25-37°Con. A reakcióidő a felhasznált enzimforrás mennyiségétől, specifikus aktivitásától és hasonlóktól függ és általában 2-150 óra, előnyösen 6-120 óra.

Példaként a vizes tápközegre az alábbiak szolgálnak: víz, pufferek, mint pl. foszfát-puffer, HEPES (N-2-hidroxi-etil-piperazin-N-etán-szulfonát) puffer és Tris (tris(hidroxi-metil)-amino-metán)-hidroklorid puffer. A fenti pufferhez szerves oldószer adható, amennyiben nem gátolja a reakciót. A szerves oldószerre példaként soroljuk fel: aceton, etil-acetát, dimetil-szulfoxid, xylen, metil-alkohol, etil-alkohol és butanol. Előnyösen alkalmazható egy szerves oldószer és egy vizes tápközeg elegye, például ha az (I-b) vegyületet használjuk.

Abban az esetben, ha az (I-a) vagy (I-b) vegyületet vizes tápközeghez adjuk, az (I-a) vagy (I-b) vegyületet először feloldjuk a vegyület oldására képes vizes közegben, majd hozzáadjuk a tápközeghez. Szerves oldószert is adhatunk a fenti pufferhez, amennyiben az nem gátolja a reakciót. Szerves oldószerekre pél daként szolgálnak az aceton, etil-acetát, dimetil-szulfoxid, xilén, metil-alkohol, etil-alkohol és butanol.

Az (I-b) és (ΙΙ-b) vegyület könnyen átalakítható (I-a) és (I-b) vegyületté a lakton gyűrű felnyitásával, amint alábbiakban részletezzük. Ehhez hasonlóan az (I-a) és (Il-a) vegyület könynyen konvertálható (I-b) és (ΙΙ-b) vegyületté a lakton gyűrű létrehozásával, ahogy azt alábbiakban leírjuk.

A lakton gyűrű felnyitására szolgáló eljárások közé tartozik az az eljárás, melynek során az (I-b) vagy (ΙΙ-b) vegyületet vizes közegben feloldjuk és ehhez savat vagy lúgot adunk. Példaként a vizes közegre vizet és sókat tartalmazó vizes oldat szolgál, mely nem gátolja a reakciót, mint pl. foszfát-puffer, Trisz-puffer és hasonlók. A fenti vizes oldat szerves oldószert is tartalmazhat, mint pl. metanol, etanol, etil-acetát és hasonlók, olyan koncentrációban, mely nem gátolja a reakciót. A savakra példaként az ecetsav, sósav és kénsav, a lúgra pél-daként a nátrium-hidroxid, kálium-hidroxid és ammónia szolgálnak.

A lakton gyűrű létrehozására szolgáló eljárásra példa lehet az az eljárás, melynek során az (I-a) vagy (Il-a) vegyületet nem-vizes oldószerben feloldjuk és ehhez sav vagy bázis katalizátort adunk. A nem-vizes oldószer egy szerves oldószer, amely lényegében nem tartalmaz vizet és képes az (I-a) vagy (Il-a) vegyületet feloldani, bármely típusú nem-vizes oldószer lehet. Példaként a nem-vizes oldószerre a diklór-metánt és etilacetátot nevezzük meg. Katalizátorként bármely katalizátor felhasználható, amely a laktonizációt katalizálni képes, és a szubsztrát vagy a reakciótermék laktonizációján kívül nem mutat más hatást. Példaként a fenti katalizátorokra a trifluor-ecetsav és a para-toluén-szulfonsav szolgálnak. A reakció hőmérséklete szigorúan nem behatárolt, de előnyösen 0-100°C és még előnyösebben 20-80°C közötti tartományban van.

A (Il-a) vagy (ΙΙ-b) vegyület összegyűjtése a reakcióelegyből bármely, a szerves szintetikus kémia területén alkalmazott hagyományos módszerrel, mint pl. szerves oldószeres extrakció, kikristályosítás, vékonyréteg-kromatográfia, nagy hatékonyságú folyadék-kromatográfia és hasonlók, kivitelezhető.

A jelen találmányban kapott (Il-a) vagy (ΙΙ-b) vegyületek kimutatására és mennyiségi meghatározására szolgáló eljárásként bármely módszer alkalmazható, amellyel a (Il-a) vagy (ΙΙ-b) vegyületek detektálása és mennyiségi meghatározása kivitelezhető. Ezek közé tartoznak a ¹³C-NMR spektroszkópia, ¹H-NMR spektroszkópia, tömegspektroszkópia és nagy hatékonyságú folyadékkromatográfia (HPLC).

A jelen találmányban az (I-a), (I-b), (Il-a) és (ΙΙ-b) vegyületek közül néhánynak lehet sztereoizomerje, mint például optikai izomerek. A jelen találmány az összes lehetséges izomert és ezen sztereoizomerek keverékét magában foglalja.

Az (I-a) általános képletű vegyületként előnyös a (Ill-a) általános képletű vegyület, még előnyösebb az (V-a) általános képletű vegyület és legelőnyösebb a (Vll-a) általános képletű vegyület.

Az (I-b) általános képletű vegyületként előnyös a (Ill-b) általános képletű vegyület, még előnyösebb az (V-b) képletű ve gyület és legelőnyösebb a (Vll-b) képletű vegyület.

Az (II-a) általános képletű vegyületként előnyös a (IV-a) általános képletű vegyület, még előnyösebb a (Vl-a) általános képletű vegyület és legelőnyösebb a (VIII-a) általános képletű vegyület.

A (ΙΙ-b) általános képletű vegyületként előnyös a (IV-b) általános képletű vegyület, még előnyösebb a (Vl-b) képletű vegyület és legelőnyösebb a (VIII-b) képletű vegyület.

Az alkilcsoport egyenes vagy elágazó láncú 1-10 szénatomos alkilcsoport, előnyösen 1-6 szénatomos, mint például metil-, etil-, propil-, izopropil-, butil-, izobutil-, sek-butil-, tercbutil-, pentil-, neopentil-, hexil-, izohexil-, heptil-, 4,4-dimetil-pentil-, oktil-, 2,2,4-trimetil-pentil-, nonil-, decilcsoport és ezek különböző elágazó láncú izomerjei.

Az arilcsoport fenil- vagy naftilcsoport lehet.

A szubsztituált alkilcsoport szubsztituense 1-3 azonos vagy különböző csoport lehet, ezek halogénatomok, hidroxi-, amino-, alkoxi- és arilcsoportok.

A szubsztituált arilcsoport szubsztituense 1-3 azonos vagy különböző csoport lehet, ezek halogénatomok, hidroxi-, amino-, alkil- és alkoxicsoportok.

Az alkoxicsoportban az alkil-rész definíciója megegyező a fent-említett alkilcsoporttal.

Az alkálifém jelentése lítium, nátrium, kálium, rubium, cézium vagy francium.

A jelen találmányt az alábbi példákon mutatjuk be, de a je len találmány nem korlátozódik ezekre a példákra.

A TALÁLMÁNY LEGELŐNYÖSEBB KIVITELI MÓDJAI

1. példa: a (Vll-a) vagy (Vll-b) vegyületből a (VIII-a) vagy (VIII-b) vegyület előállítását katalizáló fehérjét kódoló DNS kinyerése

100 mg (Vll-b) vegyületet (gyártó: Sigma) feloldunk 9,5 ml metanolban és 0,5 ml 1 mol/1 nátrium-hidroxidot adunk hozzá. A keveréket szobahőmérsékleten 1 órán át keverjük. A kapott reakcióelegyet szárazra bepároljuk, és 5 ml deionizált víz hozzáadásával feloldjuk, majd a pH értékét körübelül 7-re beállítjuk kb. 0,1 ml 1 mol/1 sósavval. Ezután 4,9 ml deionizált vizet adunk az elegyhez, így 10 ml (Vll-a) vegyülethez jutunk, melynek végkoncentrációja 10 mg/ml (a (Vll-a) általános képletű vegyület, melyben R¹ jelentése nátrium).

Bacillus subtilis Marburgl68 törzset (ATCC15563) inokulálunk 1 platina hurokkal 10 ml LB folyékony tápközegbe, és 30°C-on egy éjszakán át tenyésztjük. A tenyésztést követően a sejteket centrifugálással a kapott tenyészoldatból összegyűjtj ük.

A kromoszómális DNS-t szokásos módon izoláljuk a sejtekből és tisztítjuk.

A szenz és antiszenz primereket, melyek az alábbi nukleotid szekvencia kombinációkkal rendelkeznek: 3. és 4. számú nukleotid szekvencia, 5. és 6. számú nukleotid szekvencia, 7. és 8. számú nukleotid szekvencia, 9. és 10. számú nukleotid szekvencia, 11. és 12. számú nukleotid szekvencia, 13. és 14. számú nukleotid szekvencia és 15. és 16. számú nukleotid szekvencia, DNS szintetizátorral szintetizáljuk.

Templátként kromoszómális DNS-t használunk, a PCR-t ezekkel a primerekkel és az alábbiakkal végezzük: TaKaRa LA-PCR™ Kit Ver.2 (beszerezhető TAKARA-tól) , Expand™ High-Fidelity PCR System (beszerezhető Boehringer Mannheim-től) vagy Tag DNS polimeráz (beszerezhető Boelinnger-től), DNS Thermal Cycler alkalmazásával (beszerezhető Perkin-Elmer Japan-tól).

A PCR-t 30 ciklusban kivitelezzük, minden ciklus a következő reakciólépésekből áll: a 2 kb vagy kisebb DNS fragmensek esetében 30 s 94°C-on, 30 s 55°C-on, 2 perc 72°C-on; a 2 kb-nál nagyobb DNS fragmensek esetében 20 s 98°C-on, 3 perc 68°C-on, majd ezután a reakciót 7 percig 72°C-on folytatjuk.

A PCR-vel amplifikált DNS fragmensek között, a 3. és 4. nukleotid szekvenciájú primerek kombinációjával amplifikált DNS fragmenst (bioi gént tartalmazó) EcoRI és Sáli restrikciós enzimekkel emésztjük; a 5. és 6. nukleotid szekvenciájú primerek kombinációjával amplifikált DNS fragmenst (cypA gént tartalmazó) Xbal és Smal restrikciós enzimekkel emésztjük; a 7. és 8. nukleotid szekvenciájú primerek kombinációjával amplifikált DNS fragmenst (cypX gént tartalmazó) Smal és Sáli restrikciós enzimekkel emésztjük; a 9. és 10. nukleotid szekvenciájú primerek kombinációjával amplifikált DNS fragmenst (pksS gént tartalmazó) EcoRI és Sáli restrikciós enzimekkel emésztjük; a 11. és 12. nukleotid szekvenciájú primerek kombinációjával amplifikált DNS fragmenst (yetO gént tartalmazó) Xbal és BglII restrikciós enzimekkel emésztjük; a 13. és 14. nukleotid szekvenciájú primerek kombinációjával amplifikált DNS fragmenst (yjiB gént tartalmazó) Xbal és Smal restrikciós enzimekkel emésztjük; a 15. és 16.

nukleotid szekvenciájú primerek kombinációjával amplifikált DNS fragmenst (yrhJ gént tartalmazó) Xbal és Smal restrikciós enzimekkel emésztjük.

Az emésztést követően a restrikciós enzimmel kezelt DNS fragmenst agaróz gélelektroforézissel elválasztjuk, így különböző restrikciós enzimekkel kezelt DNS fragmensekhez jutunk.

A pUC119 vektor plazmidot (beszerezhető TAKARA-tól) Sáli és EcoRI restrikciós enzimekkel emésztjük, majd agaróz gélelektroforézissel elválasztjuk, így a Sall-EcoRI kezelt pUC119 fragmenst kapjuk. Hasonlóképpen a pUC119 vektor plazmidot Sáli és Smal restrikciós enzimekkel emésztjük, majd agaróz gélelektroforézissel elválasztjuk, így a Sall-Smal kezelt pUC119 fragmenst kapjuk.

A pSTV28 vektor plazmidot (beszerezhető TAKARA-tól) Xbal és Smal restrikciós enzimekkel emésztjük, majd agaróz gélelektroforézissel elválasztjuk, így a Xbal-Smal kezelt pSTV28 fragmens-hez jutunk. Hasonlóképpen a pSTV28 vektor plazmidot Xbal és BmaHI restrikciós enzimekkel emésztjük, majd agaróz gélelektroforézissel elválasztjuk, így Xbal-BmaHI kezelt pSTV28 fragmens-hez jutunk.

Az így kapott EcoRI-Sall kezelt DNS fragmenst (a 3. és 4. nukleotid szekvenciájú primerek kombinációjával PCR-vel amplifikált) összekeverjük a Sall-EcoRI kezelt pUC119 fragmenssel; a Xbal-Smal kezelt DNS fragmenst (a 5. és 6. nukleotid szekvenciájú primerek kombinációjával PCR-vel amplifikált) összekeverjük a Xbal-Smal kezelt pSTV28 fragmenssel; a Smal-Sall kezelt DNS fragmenst (a 9. és 10.

nukleotid szekvenciájú primerek kombinációjával PCR-vel amplifikált) összekeverjük a Sall-Smal kezelt pUC119 fragmenssel; az EcoRI-Sall kezelt DNS fragmenst (a 11. és 12. nukleotid szekvenciájú primerek kombinációjával PCR-vel amplifikált) összekeverjük a Sall-EcoRI kezelt pUC119 fragmenssel; az Xbal-Smal kezelt DNS fragmenst (a 13. és 14. nukleotid szekvenciájú primerek kombinációjával PCR-vel amplifikált) összekeverjük az Xbal-Smal kezelt pSTV28 fragmenssel; az Xbal-Smal kezelt DNS fragmenst (a 15. és 16. nukleotid szekvenciájú primerek kombinációjával PCR-vel amplifikált) összekeverjük az Xbal-Smal kezelt pSTV28 fragmenssel. Etanollal történő lecsapás után a kapott DNS csapadékot 5 μΐ desztillált vízben feloldjuk; és így a kapcsolási reakció után az egyes rekombináns DNS-ekhez jutunk.

A rekombináns DNS felhasználásával az E. coli DH5oc törzset (beszerezhető TOYOBO-tól) általános módszerrel transzformáljuk, majd a transzformánst LB agar tápközegbe helyezzük [amely 1 literben 10 g Bacto Tryptont (beszerezhető Difco-tól), 5 g Bactoélesztő extraktumot (beszerezhető Difco-tól), 5 g NaCl-t tartalmaz; és 1 mol/1 NaOH-val a pH-t 7,4-re beállítjuk, hogy az agar 1,5% legyen], amely abban az esetben, ha pUC119 vektor plazmidot használunk, további 100 pg/ml ampicillint tartalmaz; ha pSTV28 vektor plazmidot használunk, akkor a tápközeg további 25 pg/ml kloramfenikolt tartalmaz; ezt követően 2 napon át 25°C-on tenyésztjük.

A növekvő ampicillin-rezisztens vagy kloramfenikol-rezisz tens transzformánsok néhány kolóniáját elválasztjuk, és ezekkel ml LB folyékony tápközeget beoltunk [amely 1 1-ben tartalmaz 10 g Bacto Tryptont (beszerezhető Difco-tól) , 10 g Bacto-élesztő extraktumot (beszerezhető Difco-tól), 5 g NaCl-t; és 1 mol/1 NaOH-val a pH-t 7,4-re beállítjuk], majd 2 napon át, 25°C-on rázás közben tenyésztjük.

Ά sejtek kinyeréséhez a kapott tenyészetet centrifugáljuk.

A plazmidot általános módszerrel választjuk el a sejtektől.

Az izolált plazmid szerkezetét úgy vizsgáljuk, hogy különböző restrikciós enzimekkel elhasítjuk és a nukleotidszekvenciát meghatározzuk, ezáltal megerősítve, hogy a kívánt DNS szakasz beépült a plazmádba. Az EcoRI-Sall kezelt DNS fragmens (a 3. és 4. nukleotid szekvenciájú primerek kombinációjával PCR-vel amplifikált) és a Sall-EcoRI kezelt pUC119 fragmens összekapcsolásával kapott plazmidot pUbioI-nek nevezzük; az Xbal-Smal kezelt DNS fragmens (a 5. és 6. nukleotid szekvenciájú primerek kombinációjával PCR-vel amplifikált) és a Xbal-Smal kezelt pSTV28 fragmens összekapcsolásával kapott plazmid neve pScypA; az Smal-Sall kezelt DNS fragmens (a 7. és 8. nukleotid szekvenciájú primerek kombinációjával PCR-vel amplifikált) és Sall-Smal kezelt pUC119 fragmens összekapcsolásával kapott plazmid neve pUcypX; az EcoRI-Sall kezelt DNS fragmens (a 9. és 10. nukleotid szekvenciájú primerek kombinációjával PCR-vel amplifikált) és Sall-EcoRI kezelt pUC119 fragmens összekapcsolásával kapott plazmid neve pUpksS; a Xbal-BglII kezelt DNS fragmens (a 11. és 12. nukleotid szekvenciájú primerek kombinációjával PCR-vel amplifikált) és Xbal-BamHI kezelt pSTV28 fragmens összekapcsolásával kapott plazmid neve pSyetO; a Xbal-Smal kezelt DNS <»f fragmens (a 13. és 14. nukleotid szekvenciájú primerek kombinációjával PCR-vel amplifikált) és a Xbal-Smal kezelt pSTV28 fragmenssel összekapcsolásával kapott plazmád neve pSyjiB; a Xbal-Smal kezelt DNS fragmens (a 15. és 16. nukleotid szekvenciájú primerek kombinációjával PCR-vel amplifikált) és a Xbal-Smal kezelt pSTV28 fragmens összekapcsolásával kapott plazmid neve pSyrhJ.

Az igy kapott plazmidot tartalmazó E. coli DH5a-val, pUC119-t vagy pSTV28-t tartalmazó E. coli DH5oc-val és plazmidot nem tartalmazó E. coli DH5a-val egyenként 3 ml LB folyékony tápközeget beoltunk (amelyhez egy vektor plazmádban lévő gyógyszerrezisztens génnek megfelelő gyógyszert adunk), és 12 órán át 28°C-on rázás közben tenyésztjük. 0,5 ml tenyészoldatot átoltunk 1% glukózt és 1% CaCOa-ot tartalmazó LB folyékony tápközegbe (amelyhez egy gyógyszer-rezisztens génnek megfelelő gyógyszert adunk), és 12 órán át 28°C-on rázás közben tenyésztjük. 1 ml tenyészoldatot egy assist csőbe (beszerezhető ASSIST-tól) öntünk, majd glukózt és előbbiekben kapott (Vll-a) vegyűletet (amelyben R¹ jelentése Na) adunk hozzá egyenként, hogy a végső koncentráció 1% és 100 mg/1 legyen, majd ezt követően 24 órán át 28°C-on rázzuk. A reakció befejezéseként a sejteket centrifugálással elválasztjuk, a kapott felülúszót azonos mennyiségű etilacetáttal alaposan kirázzuk. A felső etil-acetátos réteget centrifugálással elválsztjuk az oldattól, majd ezt az etil-acetátos réteget szárazra pároljuk centrifugás bepárlókészülékkel. A szárított anyagot metanolban feloldjuk egy-ötszörös térfogatú metanolban az első tenyészet felülúszójához viszonyítva, és HPLC-vel analizáljuk [oszlop: Inertsil ODS-2 (5 μιη, 4x250 mm, előállítja GL science), oszlop hőmérséklet 60°C, mozgó fázis; acetonitril: víz: foszforsav = 55:45:0,05, átfolyási sebesség: 0,9 ml/perc, detektáló hullámhossz: 237 nm] hogy detektáljuk és mennyiségileg meghatározzuk a (VIII-a) vegyületet (amelyben R¹ jelentése Na). Ά mérési eredményeket az 1. táblázatban mutatjuk be.

1. táblázat

Plazmid	(VIII-a) vegyület (mg/1)
Nincs	0
pCU119	0
pSTV28	0
pübiol	0
pScypA	0
pUcypX	0
pUpksS	0
pSyetO	0
pSyjíB	0,6
pSyrhJ	0

2. példa: a yjiB gén expressziója Bacillus subtilis gazdasejtben és ezen gén által kódolt fehérje hatásának igazolása

A szenz és antiszenz primereket DNS szintetizátorral szintetizáljuk és a primerek az alábbi nukleotid szekvencia kombinációkkal rendelkeznek: 17. és 18. számú nukleotid szekvencia, 19. és 20. számú nukleotid szekvencia, 21. és 22. számú nukleotid szekvencia, 23. és 24. számú nukleotid szekvencia, 25. és 26. számú nukleotid szekvencia, 27. és 28. számú nukleotid szekvencia, 29. és 30. számú nukleotid szekvencia.

Templátként a Bacillus subtilis 1. példában kinyert kromoszómális DNS-ét felhasználva, a PCR-t ezekkel a primerekkel és az alábbiakkal végezzük: TaKaRa LA-PCR™ Kit Ver.2 (beszerezhető TAKARA-tól), Expand™ High-Fidelity PCR System (beszerezhető Boehringer Mannheim-től) vagy Taq DNS polimeráz (beszerezhető Boellinnger-től), DNS Thermal Cycler-t alkalmazva (beszerezhető Perkin-Elmer Japan-tól).

A PCR-t 30 ciklusban kivitelezzük, minden ciklus a következő reakciólépésekből áll: 30 s 94°C-on, 30 s 55°C-on és 2 perc 72°C-on a 2 kb vagy kisebb DNS fragmensek esetében; 20 s 98 °Con, 3 perc 68°C-on a 2 kb-nál nagyobb DNS fragmensek esetében, majd ezután a reakciót 7 percig 72°C-on folytatjuk.

A PCR-vel amplifikált DNS fragmensek között, a 17. és 18. nukleotid szekvenciájú primerek kombinációjával amplifikált DNS fragmenst (bioi gént tartalmazó) Spel és BamHI restrikciós enzimekkel emésztjük; a 19. és 20. nukleotid szekvenciájú primerek kombinációjával amplifikált DNS fragmenst (cypA gént tartalmazó) Spel és BamHI restrikciós enzimekkel emésztjük; a 21. és 22. nukleotid szekvenciájú primerek kombinációjával amplifikált DNS fragmenst (cypX gént tartalmazó) Spel és Nrul restrikciós enzimekkel emésztjük; a 23. és 24. nukleotid szekvenciájú primerek kombinációjával amplifikált DNS fragmenst (pksS gént tartalmazó) Spel és BamHI restrikciós enzimekkel emésztjük; a 25. és 26. nukleotid szekvenciájú primerek kombinációjával amplifikált DNS fragmenst (yetO gént tartalmazó) Spel és BamHI restrikciós enzimekkel emésztjük; a 27. és 28. nukleotid szekvenciájú primerek kombinációjával amplifikált DNS fragmenst (yjiB gént tartalmazó) Spel és BamHI restrikciós enzimekkel emésztjük; a 29. és 30. nukleotid szekvenciájú primerek kombinációjával amplifikált DNS fragmenst (yrhJ gént tartalmazó) Spel és BamHI restrikciós enzimekkel emésztjük.

Az emésztést követően a restrikciós enzimmel kezelt DNS fragmenst agaróz gélelektroforézissel elválasztjuk, így a különböző restrikciós enzimekkel kezelt DNS fragmenseket kapjuk.

A pWH1520 vektor plazmidot (beszerezhető MoBiTec-től) Spel és BamHI restrikciós enzimekkel emésztjük, majd agaróz gélelektroforézissel elválasztjuk, így a Spel-BamHI kezelt pWH1520 fragmenst kapjuk. Hasonlóképpen a pWH1520 vektor plazmidot Spell és Nrul restrikciós enzimekkel emésztjük, majd agaróz gélelektroforézissel elválasztjuk, így a Spel-Nrul kezelt pWH1520 fragmenst kapjuk.

A fent kapott Spel-BamHI kezelt DNS fragmenst (a 17. és 18. nukleotid szekvenciájú, 19. és 20. nukleotid szekvenciájú, 23. és 24. nukleotid szekvenciájú, 25. és 26. nukleotid szekvenciájú, 27. és 28. nukleotid szekvenciájú, 29. és 30. nukleotid szekvenciájú primerek kombinációjával PCR-vel amplifikált) öszszekeverjük a Spel-BamHI kezelt pWF1520 fragmenssel; a fenti Spel-Nrul kezelt DNS fragmenst (a 21. és 22. nukleotid szekvenciájú primerek kombinációjával PCR-vel amplifikált) összekeverjük a Spel-Nrul kezelt pWF1520 fragmenssel. Etanollal történő lecsapás után a kapott DNS csapadékot 5 μΐ desztillált vízben feloldjuk, és a kapcsolási reakció kivitelezésével a rekombináns DNS-ekhez jutunk.

Ά rekombináns DNS felhasználásával az E. coli DH5cc törzset (beszerezhető TOYOBO-tól) szokásos módon transzformáljuk, majd a transzformánst 10 gg/ml tetraciklint tartalmazó LB agar tápközegbe helyezzük, és 2 napon át 25°C-on tenyésztjük. A sejteket a kapott tenyészettől centrifugálással választjuk el.

A plazmidot általános módszerrel nyerjük ki a sejtekből.

Az izolált plazmid szerkezetének vizsgálatához azt különböző restrikciós enzimekkel elhasitjuk, és ezek nukleotid szekvenciáját meghatározzuk, ezáltal megerősítve, hogy a kívánt DNS szakasz beépült a plazmidba. A 17. és 18. nukleotid szekvenciájú primerek kombinációjával PCR-vel amplifikált DNS fragmens és pWH1520 összekapcsolásával kapott plazmidot pWbioI-nek nevezzük; a 19. és 20. nukleotid szekvenciájú primerek kombinációjával PCR-vel amplifikált DNS fragmens és pWH1520 összekapcsolásával kapott plazmid neve pWcypA; a 21. és 22. nukleotid szekvenciájú primerek kombinációjával PCR-vel amplifikált DNS fragmens és pWH1520 összekapcsolásával kapott plazmid neve pWcypX; a 23. és 24. nukleotid szekvenciájú primerek kombinációjával PCR-vel amplifikált DNS fragmens és pWH1520 összekapcsolásával kapott plazmid neve pWpksS; a 25. és 26. nukleotid szekvenciájú primerek kombinációjával PCR-vel amplifikált DNS fragmens és pWH1520 összekapcsolásával kapott plazmid neve pWyetO; a 27. és 28. nukleotid szekvenciájú primerek kombinációjával PCR-vel amplifikált DNS fragmens és pWH1520 összekapcsolásával kapott plazmid neve pWyjiB; a 29. és 30. nukleotid szekvenciájú prime rek kombinációjával PCR-vel amplifikált DNS fragmens és pWH1520 összekapcsolásával kapott plazmid neve pWyrhJ.

Az így kapott plazmidokat és a pWH1520 vektor plazmidot bevezetjük a Bacillus subtilis ATCC33712 törzsbe S.chang és S.N.cohen eljárása szerint [S.Chang és S.N.Cohen: Mol. Gen. Genet., 168, 111 (1979)].

Ez az eljárás abban áll, hogy az ATCC33712 törzset inokuláljuk egy 5 ml Pen tápközeget tartalmazó vastag csőbe (amelyben 1,75 g 3. számú Difco Antibiotic tápközeget 100 ml vízben feloldunk és autoklávban sterilizálunk), majd egy éjszakán át 37°C-on rázás közben tenyésztjük. Az egy éjszakán át tenyésztett összes sejtet beoltunk 100 ml Pen tápközeget egy 300 ml-es Erlenmeyer lombikban, és 3 órán át 37°C-on rázatás közben addig tenyésztjük, amíg elérik az exponenciális növekedés metafázisát. A sejtek elválasztásához a tenyészetet 10 percig 5000 ford/perc sebességei csíra-mentes körülmények között centrifugáljuk. A felülúszó eltávolítása után a sejteket 4,5 ml SMMP-ben szuszpendáljuk [keverék, amely egyenlő mennyiségű 2 x SMMp-t (melyben vízben oldunk 34,2 g szacharózt, 0,464 g maleinsavat, 0,813 g kristályvízes magnézium-kloridot és a pH-t 6,5-re beállítjuk nátrium-hidroxiddal, majd a végső 100 ml térfogatot autoklávban sterilizáljuk) és 4 x Pen tápközeget tartalmaz (amelyben 7 g 3. számú Difco Antibiotic tápközeget 100 ml vízben feloldunk és autoklávban sterilizálunk], ezt követően 0,5 ml lizozim-oldatot adunk a hozzá [amelyben 10 mg lizozimot (előállítja EIKAGAKU corp.) 0,5 ml SMMP-ben feloldunk és 0,45 μτη pórusátmérőjű szűrővel sterilizálunk] és az elegyet 2 órán át

37°C-on lassan rázogatjuk. Miután megbizonyosodunk róla, hogy a sejtek nem kevesebb, mint 90%-a protoplaszttá vált, a protoplasztokat 20 percig 3000 ford/perc sebességgel centrifugáljuk. A felülúszót eltávolítjuk és a kapott protoplasztokat 5 ml SMMP-ben újra szuszpendáljuk. A protoplasztokat 20 perces (3000 ford/perc) centrifugálással összegyűjtjük és 2 ml SMMP-ben szuszpendáljuk, hogy előállítsuk a befogadó törzs protoplaszt szuszpenzióját a transzformáláshoz.

Körülbelül 1 pg DNS plazmidot SMMP-ben oldunk és 0,5 ml protoplaszt szuszpenzióval alaposan elvegyítjük. Azonnal az öszszekeverés után 1,5 ml 40%-os polietilén-glikol-oldatot [amelyben 40 g polietilén-glikol 6000-t (Nacalai tesque) 2 x SMMP-ben feloldunk és a térfogatát vízzel 100 ml-re kiegészítjük, majd autoklávban sterilizáljuk] adunk hozzá és alaposan összekeverjük. Szobahőmérsékleten 2 percig állni hagyjuk, majd 5 ml SMMP-t adunk az oldathoz, elkeverjük és az elegyet 20 percig 3000ford/perc sebességgel centrifugáljuk. A felülúszó eltávolítása után, a leülepedett protoplasztot 1 ml SMMP-ben szuszpendáljuk, majd 3 órán át 30°C-on lassan rázatjuk. A protoplasztokat SMMP-vel megfelelő koncentrációra hígítjuk, majd a protoplasztokat DM3 tápközegre visszük [melyben 45 ml 80 g/1 bactoagart (gyártó: Difco) , 50 ml 50 g/1 kazaminosavat, 250 ml 338 g/1 kristályvizes nátrium-szukcinátot (pH=7,3), 50 ml foszfát-puffért (35 g/1 kálium-hidrogén-foszfát, 15 g/1 káliumdihidrogén-foszfát) , 25 ml 100 g/1 élesztő-kivonatot, 10 ml 203 g/1 kristályvizes magnézium-kloridot és 25 ml 100 g/1 glukózt egyenként autoklávban sterilizálunk és összekeverünk, majd 0,45

μιη pórusátmérőjű szűrővel sterilizált 3,5 ml 20 mg/ml marha szérum albumint adunk hozzzá], amelyben a tápközeg gyógyszert tartalmaz (a tetraciklin esetében a végső térfogathoz adjuk 10 pg/ml koncentrációban). A protoplasztokat 1-2 napon át 37°C-on tenyésztjük, így a transzformált törzshöz jutunk.

Ezáltal a fenti plazmidok mindegyikét tartalmazó B. subtilis ATCC33712 törzset kapjuk.

A plazmidot nem-tartalmazó transzformánsokat és az ATCC33712 törzset egyenként beoltjuk a 3 ml LB folyékony tápközegbe (melyben 10 mg/1 tetraciklint adunk a plazmád tartalmú törzshöz) és 24 órán át 30°C-on rázás közben tenyésztjük. Ebből a tenyészoldatból 25 ml-t beoltunk egy 5 ml TB tápközeget tartalmazó tesztcsőbe [1,4% Bacto Trypton (gyártó: Difco), 2,4% Bacto-élesztő kivonat (gyártó: Difco), 0,231% KH2PO4O és 1,251% K2HPO4, a pH 7,4-re beállítva 1 mol/1 nátrium-hidroxiddal] és 3 órán át 30°C-on rázás közben tenyésztjük. 3 óra elteltével a tenyészet 1 ml-ét 60.540S számú assist csőbe átvisszük (gyártó: ASSIST), és 40 μΐ 50%-os sterilizált xilóz oldatot adunk hozzá, majd 3 órán át rázatás alatt tenyésztjük. Ezt követően az 1. példában kapott (Vll-a) vegyületet (amelyben R¹ jelentése Na) adjuk mindegyik tesztcsőhöz 0,2 mg/ml végkoncentrációban, és az elegyeket 16 órán át 30°C-on rázás közben tenyésztjük.

A reakció befejező lépéseként a reakcióelegy pH-ját 3,5-re beállítjuk ecetsavval. 0,5 ml reakcióelegyhez 1 ml etil-acetátot adunk és az elegyet 1 órán át rázatjuk. A rázatást követően a reakcióelegyet 5 percig 3000 ford/perc sebességgel centrifugáljuk, így két fázisra szétválasztjuk, és a felső etil-acetátos réteget kinyerjük, az oldószert centrifugális bepárlással eltávolítjuk, és a maradékot 0,5 ml metanolban feloldjuk.

Hasonlóan az 1. példához a (VIII-a) vegyület (amelyben R¹jelentése Na) minőségi és mennyiségi meghatározását HPLC analízissel végezzük, a fenti metanolos oldat alikvotjának felhasználásával. Az eredményeket a 2. táblázatban adjuk meg.

2. táblázat

Plazmid	(VIII-a) vegyület (mg/1)
Nincs	0,5
pWH1520	0,5
Pwbiol	0,5
PwcypA	0,5
PwcypX	0,5
PWpksS	0,5
Pwyet0	0,5
Pwyj iB	24,6
PwyrhJ	0,5

Amint az 1. és 2. példa eredményeiből látható, nyilvánvaló, hogy a (Vll-a) vagy (Vll-b) vegyületből a (VIII-a) vagy (VIII-b) vegyület előállításának hatékonyságát a yjiB gén kódolja.

A fenti 27. és 28. nukleotid szekvenciájú primerek kombinációjával PCR-vel amplifikált DNS fragmens a 2. számú nukleotid szekvenciát tartalmazza; és ez a nukleotíd szekvencia az 1. számú aminosav szekvenciát tartalmazó fehérjét kódolja.

3. példa: a yjiB gén expressziója gazdasejtként Bacillus megaterium alkalmazásával és a (VIII-a) vegyület előállítása

A 2. példában előállított pWyjiB fragmenst Bacillus megateriumba (gyártó: MoBiTec) és Bacillus sp. FERM BP-6030-be juttatjuk a 2. példában leírt, Bacillus subtilis transzformációjával azonos módon.

A kapott transzformánst és a plazmidot nem tartalmazó gazdasejtet tenyésztjük, majd a 2. példában leírtakkal megegyező módon reagáltatjuk, és az előállított (VIII-a) vegyület mennyiségét mérjük. A kapott eredményeket a 3. táblázat szemlélteti.

3. táblázat

Gazdasejt	Plazmid	(VIII-a) vegyület (mg/1)
B. megaterium	nincs	2,0
B. megaterium	pWyj iB	27,2
FERM BP-6030	nincs	4,5
FERM BP-6030	pWyjiB	30,3

4. példa: plazmid előállítása a (VIII-a) vegyületet corynebacteriumokban termelő fehérje expresszálására

Hogy lehetővé tegyük az 1. példában kinyert yjiB gén hatékony expresszióját corynebacteriumokban, a 31., 32., 33., 43.,

35., 36., 37., 38. és 39. számú nukleotid szekvenciával rendelkező DNS-eket megszintetizáljuk DNS szintetizátorral.

Ά pRI109 plazmád DNS-t, melyben a DNS fragmens a corynebacteriumokban végbemenő expresszióhoz szükséges p54-6 promoter szekvenciát (GenBank AJ132582) tartalmazza és a 40. számú nukleotid szekvenciával rendelkezik, és behelyeztük a pCS299P vektor plazmád (11-110437 számú japán közrebocsátási irat) Sse83871-BamHI helyére, szokásos módon állítjuk elő ezzel a plazmiddal transzformált E. coli NM522 törzsből.

Templátként a 2. példában kinyert pWyjiB DNS-t alkalmazva, a PCR-t a 31. és 32. nukleotid szekvenciájú DNS primerekkel és Tag DNS polimerázzal (gyártó: TAKARA) kivitelezzük, DNS Thermal Cycler 480 alkalmazásával (gyártó: Perkin-Elmer Japan).

A PCR-t 25 ciklusban kivitelezzük, ahol minden ciklus a következő reakciólépéseket tartalmazza: 30 s 96°C-on, 45 s 50°C-on és 3 perc 72°C-on.

A PCR-vel amplifikált DNS fragmenseket Sáli és BamHI-vel emésztjük, agaróz gélelektroforézissel szétválasztjuk, és a kb. 1,2 kb DNS fragmenst a szokásos módon megtisztítva SalI-BamHIvel kezelt DNS fragmenst kapunk.

A fent kinyert pRI109 plazmid DNS-t Sáli és BamHI restrikciós enzimekkel emésztjük, agaróz gélelektroforézissel szétválasztjuk, és a kb. 6 kb DNS fragmenst a szokásos módon megtisztítva Sáli-BamHI-vei kezelt pRI109 fragmenst kapunk.

A fent kinyert Sáli-BamHI-vei kezelt DNS fragmenst és SallBamHI-vel kezelt pRI109 fragmenst összekeverjük és ligálási reakció kivitelezésével rekombináns DNS-t kapunk.

A rekombináns DNS felhasználásával az E. coli DH5a törzset (beszerezhető TOYOBO-tól) szokásos módon transzformáljuk, majd 20 pg/ml kanamicint tartalmazó LB agar tápközegbe helyezzük és 1 napon át 30°C-on tenyésztjük, így a transzformánshoz jutunk.

A plazmidot szokásos módon izoláljuk a transzformánsból. Az elkülönített plazmid DNS-t templátként alkalmazva és a 33., 34., 35., 36. és 37. nukleotid szekvenciájú DNS-eket primerként felhasználva, a beillesztett DNS fragmensek nukleotid szekvenciáját DyeTerminator Cycle Sequencing Kit-tel (gyártó: Applied Biosystem) és 373A szekvenálóval (gyártó: Applied Biosystem) határozzuk meg. Ezt követően a plazmidot, amelybe a 41. számú nukleotid szekvenciát a pRI109 fragmens Sáli és BamHI helye közé beillesztettük, pRIyjiB-nek nevezzük.

A 41. számú nukleotid szekvencia tartalmazza azt a nukleotid szekvenciát, amely a 42. aminosav szekvenciával rendelkező fehérjét kódolója.

Templátként a Bacillus subtilis Marburgl68 törzs (ATCC15563) 1. példában kinyert kromoszomális DNS-ét felhasználva, a PCR-t a 38. és 39. nukleotid szekvenciájú DNS primerekkel és LA-Taq DNS polimerázzal kivitelezzük (gyártó: TAKARA), DNS Thermal Cycler 480 alkalmazásával (gyártó: Perkin-Elmer Japan).

A PCR-t 30 ciklusban kivitelezzük, minden ciklus a következő reakciólépésekből áll: 30 s 96°C-on, 30 s 55°C-on és 2 perc 72°C-on, majd ezután a reakciót 7 percig 72°C-on folytatjuk.

A PCR-vel amplifikált DNS fragmenst a pT7Blue-val (gyártó: TAKARA) összekeverjük és a ligálási reakció kivitelezésével a rekombináns DNS-hez jutunk.

A rekombináns DNS felhasználásával az E. coli DH5a törzset (beszerezhető TOYOBO-tól) szokásos módon transzformáljuk, majd 100 pg/ml ampicillint tartalmazó LB agar tápközegbe helyezzük és 1 napon át 30°C-on tenyésztjük, így a transzformánshoz jutunk.

A plazmidot szokásos módon izoláljuk a transzformánsból. Az izolált plazmid szerkezetét úgy vizsgáljuk, hogy különböző restrikciós enzimekkel elhasítjuk, így megerősítve, hogy a kívánt DNS fragmens beépült a plazmidba, és a plazmidot pTSYN2-72-nek nevezzük.

A pTSYN2-72 DNS-t Xhol és BamHI-vel emésztjük és agaróz gélelektroforézissel elválasztjuk, majd a kb. 1,2 kb DNS fragmenst szokásos módon tisztítjuk, így a Xhol-BamHI-vel kezelt DNS fragmenst kapjuk.

A pRI109 plazmid DNS-t Sáli és BamHI restrikciós enzimekkel emésztjük és agaróz gélelektroforézissel elválasztjuk, majd egy kb. 6 kb DNS fragmenst szokásos módon tisztítunk, így a SallBamHI-vel kezelt pRI109 fragmenst kapjuk.

A fent kinyert Xhol-BamHI-kezelt DNS fragmenst és SallBamHI-kezelt pRI109 fragmenst összekeverjük és a ligálási reakció kivitelezésével rekombináns DNS-t kapunk.

A rekombináns DNS felhasználásával az E. coli DH5ot törzset (beszerezhető TOYOBO-tól) szokásos módon transzformáljuk, majd 20 μρ/ιηΐ kanamicint tartalmazó LB agar tápközegbe helyezzük és 1 napon át 30°C-on tenyésztjük, így a transzformánst kapjuk.

A plazmidot szokásos módon izoláljuk a transzformánsból. Az izolált plazmid DNS-t templátként alkalmazva, és a 33., 34.,

35., 36. és 37. nukleotidszekvenciájú DNS-eket primerként fel használva, a beillesztett DNS fragmens nukleotidszekvenciáit DyeTerminator Cycle Sequencing Kit-tel (gyártó: Applied Biosystem) és 373A szekvenálóval (gyártó: Applied Biosystem) határozzuk meg. A plazmidot, amelybe a 43. számú nukleotidszekvenciát a pRI109 fragmens Sáli és BamHI helye közé beillesztettük, pRSYN2-72-nek nevezzük.

A 43. számú nukleotid szekvencia tartalmazza azt a nukleotid szekvenciát, amely az 1. számú aminosav szekvenciával rendelkező fehérjét kódolja.

Templátként a 2. példában kinyert pWyjiB DNS fragmenst alkalmazva, a PCR-t a 38. és 39. nukleotid szekvenciajú DNS primerekkel és Z-Taq DNS polimerázzal kivitelezzük (gyártó: TAKARA), DNS Thermal Cycler 480 alkalmazásával (gyártó: Perkin-Elmer Japan).

A PCR-t 25 ciklusban kivitelezzük, minden ciklus a következő reakciólépésekből áll: 20 s 98°C-on, 20 s 55°C-on és 30 perc 72°C-on.

A PCR-vel amplifikált DNS fragmenst Xhol és BamHI-vel emésztjük és agaróz gélelektroforézissel elválasztjuk, majd egy kb. 1,2 kb DNS fragmenst szokásos módon tisztítunk, így a XholBamHI-kezelt DNS fragmenst kapjuk.

A pRI109 plazmád DNS-t Sáli és BamHI restrikciós enzimekkel emésztjük és agaróz gélelektroforézissel elválasztjuk, majd egy kb. 6 kb DNS fragmenst szokásos módon tisztítunk, így a SallBamHI-kezelt pRI109 fragmenst kapjuk.

A fent kinyert XhoI-BamHI-kezelt DNS fragmenst és SallBamHI-kezelt pRI109 fragmenst összekeverjük és a ligálási reakció kivitelezésével a rekombináns DNS-t kapjuk.

A rekombináns DNS felhasználásával az E. coli DH5oc törzset (beszerezhető TOYOBO-tól) szokásos módon transzformáljuk, majd 20 pg/ml kanamicint tartalmazó LB agar tápközegbe helyezzük és 1 napon át 30°C-on tenyésztjük, így a transzformánshoz jutunk.

A plazmidot szokásos módon nyerjük ki a transzformánsból. A kinyert plazmid DNS-t templátként alkalmazva és a 33., 34., 35., 36. és 37. nukleotid szekvenciájú DNS-eket primerként felhasználva, a beillesztett DNS fragmensek nukleotid szekvenciáját DyeTerminator Cycle Sequencing Kit-tel (gyártó: Applied Biosystem) és 373A szekvenálóval (gyártó: Applied Biosystem) meghatározzuk, és a plazmidot, amelybe a 44. számú nukleotidszekvenciát a pRI109 fragmens Sáli és BamHI helye közé beillesztettük, pSYN2-72-nek nevezzük.

A 45. számú aminosav szekvenciával rendelkező fehérjét kódoló nukleotid szekvenciát a 44. számú nukleotid szekvencia tartalmazza .

5. példa: A plazmid bejuttatása a C. glutamicum ATCC13032 törzsbe és az aktivitás kiértékelése

Az ATCC13032 törzset beoltjuk 8 ml húsleves-táptalajt tartalmazó tesztcsőbe [20 g/1 normál húsleves-táptalaj (gyártó: Kyokuto Pharmaceutical Industry, Co. Ltd), 5 g/1 Bacto-élesztő kivonat (gyártó: Difco)] és egy éjszakán át 30°C-on rázás közben tenyésztjük. Ezután a tenyészetből 5 ml-t beoltunk 250 ml húsle58 ves-táptalajt tartalmazó 2 1-es Erlenmeyer lombikba, és 4 órán át 30°C-on rázás közben tenyésztjük. A kapott tenyészoldatot a sejtek leülepitésére centrifugáljuk. A felülúszó eltávolítása után a sejteket 30 ml jéghideg EPB-be [250 mmol/1 szacharóz, 15% (tf/tf) glicerin] szuszpendáljuk és centrifugálással ülepítjük. Hasonlóképpen, a sejteket EPB-ben újraszuszpendáljuk és centrifugálással elválasztjuk, majd a sejteket 2 ml EPB-ben szuszpendáljuk. A kapott sejtszuszpenzió 0,1-0,1 ml-ét 0,5 ml-es csővekbe öntjük és száraz jéggel gyorsan lefagyasztjuk, így megkapjuk a sejtszuszpenziót a transzformáláshoz. A kapott sejteket -80°C alatti hőmérsékleten tároljuk.

A lefagyasztott sejtszuszpenzióból 0,1 ml-t jégen feloldunk, 10 percre 43,5°C-on tartjuk és jégre tesszük. Körübelül 2 pg pRI109 DNS-t tartalmazó vizes oldatból 2 μΐ-t adunk a szuszpenzióhoz, majd a sejtszuszpenziót az előzőleg lefagyasztott E. coli -hoz adjuk GenePulser küvettába (gyártja: BioRad), és ezután a DNS-t elektroporációval bevisszük a sejtekbe 25 μΕ, 200 Ω és 1,5 kV körülmények között GenePulser (gyártja: BioRad) alkalmazásával. Azonnal az elektroporáció után a sejtszuszpenzió teljes mennyiségét 1 ml húsleves-tápközeget tartalmazó 15 ml-es tesztcsőbe juttatjuk, és 1 órán át 30°C-on rázatás közben tenyésztj ük.

A kapott tenyészoldatot a sejtek ülepítésére 10 percig 3500 ford/perc sebességei centrifugáljuk. A felülúszó eltávolítása után a sejteket 0,1 ml húsleves-táptalaj hozzáadásával szuszpendáljuk, majd a szuszpenziót 20 pg/ml kanamicin-tartalmú húslevesagar-táptalajba juttatjuk [amelyet 2% Difco Agárral megszilárdi tünk] és 2 napig 30°C-on tenyésztjük, így a transzformánshoz jutunk .

Ezáltal a pRI109 plazmidot tartalmazó C. glutamícum ATCC13032 törzset kapjuk.

A fentiek szerint eljárva, az egyes pRIyjiB, pSYN2-72 és pSYN2-39 plazmidot tartalmazó C. glutamicum ATCC13032 törzseket is előállítjuk.

A kapott transzformánsokat 3 ml 100 μg/ml kanamicin tartalmú húsleves-táptalajba oltjuk, és 24 órán át 30°C-on rázás közben tenyésztjük. 0,2 ml tenyészetet 2 ml LMC tápközeget tartalmazó tesztcsőbe oltunk [amelybe egyenként sterilizált glukózt, MgSO₄t, FeSO₄-t, MnSO₄-t; 30 g/1, 0,1 g/1, 2 mg/1 és 2 mg/1 végső koncetrációban, egyenként az autoklávban sterilizált pre-LMC tápközeghez adjuk (1 g/1 NH₄C1, 1 g/1 KH₂PO₄, 3 g/1 K2HPO₄, 0,2 g/1 Difco-élesztő kivonat, 1 g/1 karbamid, 0,05 mg/1 biotin, 0,5 mg/1 tiamin, 10 g/1 gabona áztató folyadék; pH=7,2)], amely 100 μg/ml kanamicint tartalmaz, és 5 órán át 30°C-on rázás közben tenyésztjük. (Vll-a) vegyületet (amelyben R¹ jelentése Na) adunk hozzá 300 mg/1 végkoncentrációban, és az elegyet 16 órán át 30°C-on rázás közben reagáltatjuk.

0,5 ml reakcióoldatot öntünk egy 1,5 ml-es csőbe, és a sejtek elválasztására 2 percig 15000 ford/perc sebeséggel centrifugáljuk. A kapott felülúszót 5-szörös - 20-szoros metanollal meghigítjuk és 2 percig 15000 ford/perc sebeséggel centrifugáljuk, majd ennek alikvotját használjuk a HPLC analízishez, mint az 1. példában, a (VIII-a) vegyület (melyben R¹ jelentése Na) minőségi és mennyiségi meghatározására. A (VIII-a) vegyület kon centrációját a tenyészetben, melyet a mennyiségi eredmények alapján számítottunk, a 4. táblázatban mutatjuk be.

4. táblázat

Plazmid	(VIII-a) vegyület (mg/1)
pRI109	0,3
pSYN2-72	30
PRIyj iB	61
pSYN2-39	104

6. példa: A plazmid bejuttatása corynebacteriumokba és a hatékonyság kiértékelése

A 4. példában kinyert pRIyjiB DNS-t az 5. példában leírt ATCC13032 törzs transzformációjával azonos módon bejutattjuk a C. callunae ATCC15991, C. ammoniagenes ATCC6872 és B. flavum ATCC14067 törzsekbe, és az egyes törzsekből transzformánsokat nyerünk.

A kapott transzformánsokat külön-külön beoltjuk tesztcsövekben 3 ml húsleves-táptalajba, amely 100 pg/ml kanamicint tartalmaz, és 24 órán át 30°C-on rázás közben tenyésztjük. 0,5 ml tenyészetet 5 ml TB tápközeget tartalmazó tesztcsőbe juttatunk [amely tápközegbe 14 g Bacto triptont (gyártja: Difco) és 24 g Bacto-élesztő kivonatot (gyártja: Difco) 900 ml vízben feloldunk, autoklávban sterilizálunk és ehhez autoklávban elkülönítve sterilizált 100 ml PB-t adunk (23,1 g/1 KH2PO4, 125,1 g/1 K₂HPO₄) ] , amely 100 pg/ml kanamicint és 10 g/1 glukózt tartalmaz, és 5 órán át 30°C-on rázás közben tenyésztjük. 1 ml tenyészetet assist csőbe (gyártó: ASSIST) helyezünk, és (Vll-a) vegyületet (amelyben R jelentése Na) adunk hozzá 300 mg/1 vég- koncentrációban, majd az elegyet 16 órán át 30°C-on rázás mellett reagáltatjuk.

Miután a reakció befejeződött, a (VIII-a) vegyületet (melyben R jelentése Na) a 2. példában leírtak szerint minőségileg és mennyiségileg meghatározzuk. A (VIII-a) vegyület koncentráció-ját a tenyészetben, melyet a mennyiségi eredmények alapján számoltunk, az 5. táblázatban adjuk meg.

5. táblázat

Gazdasejt	Plazmid	(VIII-a) ve- gyület (mg/1)
C. callunae ATCC15991 (KY3510)	PRIyj iB	22
C. ammoniagenes ATCC6872 (KY3454)	PRIyj iB	12
B. flavum ATCC14067 (KY10122)	PRIyj iB	23

Ipari alkalmazhatóság

A jelen találmány képes egy új hidroxilázt kódoló DNS és egy hidroxi-metil-glutaril-CoA (HMG-CoA) reduktázt gátló és szérumkoleszterin-szintet csökkentő hatású vegyület hatékony termelé sere .

Szekvencia-lista

3. számú szekvencia: szintetikusDNS

4. számú szekvencia: szintetikusDNS

5. számú szekvencia: szintetikusDNS

6. számú szekvencia: szintetikusDNS

7. számú szekvencia: szintetikusDNS

8. számú szekvencia: szintetikusDNS

9. számú szekvencia: szintetikusDNS

10. számú szekvencia: szintetikusDNS

11. számú szekvencia: szintetikusDNS

12. számú szekvencia: szintetikusDNS

13. számú szekvencia: szintetikusDNS

14. számú szekvencia: szintetikusDNS

15. számú szekvencia: szintetikusDNS

16. számú szekvencia: szintetikusDNS

17. számú szekvencia: szintetikus DNS

18. számú szekvencia: szintetikusDNS

19. számú szekvencia: szintetikusDNS

20. számú szekvencia: szintetikusDNS

21. számú szekvencia: szintetikusDNS

22. számú szekvencia: szintetikusDNS

23. számú szekvencia: szintetikusDNS

24. számú szekvencia: szintetikusDNS

25. számú szekvencia: szintetikusDNS

26. számú szekvencia: szintetikusDNS

27. számú szekvencia: szintetikusDNS

28. számú szekvencia: szintetikus DNS

29.

.

31.

32.

33.

.

35.

36.

.

számú szekvencia: szintetikus DNS számú szekvencia: szintetikus DNS számú szekvencia: szintetikus DNS számú szekvencia: szintetikus DNS számú szekvencia: szintetikus DNS számú szekvencia: szintetikus DNS számú szekvencia: szintetikus DNS számú szekvencia: szintetikus DNS számú szekvencia: szintetikus DNS számú szekvencia: szintetikus DNS számú szekvencia: szintetikus DNS számú szekvencia: szintetikus DNS

Az alábbiakban a részletes szekvencia-listát ismertetjük.

SZEKVENCIA-LISTA <110> KYOWA HAKKO KOGYO CO., LTD <120> A Process for producing HMG-CoA Reductase inhibitor <130> H11-0011T4 <160> 45 <170> Patentin Ver. 2.0 <210> 1 <211> 396 <212> PRT <213> Bacillus subtilis <400> 1. számú aminosav szekvencia

Met Asn Vai Leu Asn Arg Arg Gin Ala Leu Gin Arg Ala Leu Leu Asn

10 15

Gly Lys Asn Lys Gin Asp Ala Tyr His Pro Phe Pro Trp Tyr Glu Ser

Met Arg Lys Asp Ala Pro Vai Ser Phe Asp Glu Glu Asn Gin Vai Trp

Ser Vai Phe Leu Tyr Asp Asp Vai Lys Lys Vai Vai Gly Asp Lys Glu

Leu Phe Ser Ser Cys Met Pro Gin Gin Thr Ser Ser lie Gly Asn Ser lie lie Asn Met Asp Pro Pro Lys His Thr Lys lie Arg Ser Vai Vai

Asn Lys Ala Phe Thr Pro Arg Vai Met Lys Gin Trp Glu Pro Arg lie

100

105

110

Gin Glu lie Thr Asp Glu Leu lie Gin Lys Phe Gin Gly Arg Ser Glu

115

120

125

Phe Asp

130

Ser Glu 145

Trp Ser

Glu Lys

Ala Phe

Asp lie

210

Ser Gly 225

Asn Glu

Glu Thr

Pro Gin

Leu Arg

290

Lys Glu 305

Glu Ala

Asn Pro

Leu Vai

Leu Leu

Asp Leu

165

Ala Phe

180

Phe Ala 195 lie Ser

Glu Glu

Thr Thr

Pro Gly 260

Ala Vai

275

Arg lie

Gly Asp

Lys Phe

His lie

340

His Asp

Gly Vai 150

Leu Vai

Leu Glu

Gly lie lie Leu Leu lie

230

Thr Asn 245

Vai Tyr

Glu Glu

Ala Lys

Met Vai

310

Asp Arg 325

Ala Phe

Phe Ser

135

Pro Ser

Ser Thr

Glu Arg

He Glu

200

Vai Glu 215

Pro Phe

Leu He

Glu Glu

265

Ala Leu

280

Arg Asp 295

Leu Ala

Pro His

Gly His

Tyr Pro

Ala His

Pro Lys 170

Asp Lys 185

Glu Lys

Ala Glu

Cys Thr

Ser Asn

250

Leu Arg

Arg Phe

Thr Glu

Phe Vai

Met Phe

330

Gly He 345

Leu Pro

140

Met Glu 155

Asp Lys

Cys Glu

Arg Asn

Glu Thr

220

Leu Leu 235 Ala Met

Ser His

Arg Ala

He Gly

300

Ala Ser 315

Asp lie

His Phe

Vai lie

Gin Phe

Ser Glu

175

Glu Glu

190

Lys Pro 205

Gly Glu

Leu Vai

Tyr Ser

Pro Glu 270

Pro Ala

285

Gly His

Ala Asn

Arg Arg

Cys Leu

350

Vai He

Lys Ala

160

Glu Ala

Leu Ala

Glu Gin

Lys Leu

Ala Gly

240

He Leu 255

Leu Met

Pro Vai

Leu He

Arg Asp

320

His Pro

335

Gly Ala

Pro Leu Ala Arg

355

Ala Phe Pro His

370

Vai lie Tyr Gly

385

Leu Glu Ala Asn

360

Met Glu Cys Vai

375

Leu Lys Ser Phe

390 lie Ala Leu Thr

Ser lie Thr Pro

380

Arg Vai Lys Met

395

Ser Leu lie Ser

365 lie Glu Asn Ser <210> 2 <211> 1191 <212> DNA <213> Bacillus subtilis <220>

<221> CDS <222> (1)..(1191)

<400> 2.	számú nukleotíd és	a megfelelő	aminosa^	^r szekvencia
atg aat	gtg tta aac ege egg	caa gcc ttg	cag ega	geg ctg etc aat 48
Met Asn 1	Vai Leu Asn Arg Arg 5	Gin Ala Leu 10	Gin Arg	Ala Leu Leu Asn 15
ggg aaa	aac aaa cag gat geg	tat cat ccg	ttt cca	tgg tat gaa teg 96
Gly Lys	Asn Lys Gin Asp Ala 20	Tyr His Pro 25	Phe Pro	Trp Tyr Glu Ser 30
atg aga	aag gat geg cct gtt	tcc ttt gat	gaa gaa	aac caa gtg tgg 144
Met Arg	Lys Asp Ala Pro Vai 35	Ser Phe Asp 40	Glu Glu	Asn Gin Vai Trp 45
age gtt	ttt ett tat gat gat	gtc aaa aaa	gtt gtt	ggg gat aaa gag 192
Ser Vai 50	Phe Leu Tyr Asp Asp 55	Vai Lys Lys	Vai Vai 60	Gly Asp Lys Glu
ttg ttt	tcc agt tgc atg ccg	cag cag aca	age tet	att gga aat tcc 240
Leu Phe 65	Ser Ser Cys Met Pro 70	Gin Gin Thr	Ser Ser 75	lie Gly Asn Ser 80
ate att	aac atg gac ccg ccg	aag cat aca	aaa ate	cgt tea gtc gtg 288
He He	Asn Met Asp Pro Pro 85	Lys His Thr 90	Lys lie	Arg Ser Vai Vai 95
aac aaa	gcc ttt act ccg ege	gtg atg aag	caa tgg	gaa ccg aga att 336
Asn Lys	Ala Phe Thr Pro Arg 100	Vai Met Lys 105	Gin Trp	Glu Pro Arg He 110

caa gaa ate aca gat gaa ctg att caa aaa ttt cag ggg ege agt gag384

Gin Glu He Thr Asp Glu Leu He Gin Lys Phe Gin Gly Arg SerGlu

115 120125 ttt gac ett gtt cac gat ttt tea tac ccg ett ccg gtt att gtg ata432

Phe Asp Leu Vai His Asp Phe Ser Tyr Pro Leu Pro Vai lie Vailie

130 135140

tet Ser 145

gag Glu

ctg Leu

gga Gly

gtg Vai 150

cet Pro

tea Ser

geg Ala

cat His

atg Met 155

gaa Glu

cag Gin

ttt Phe

aaa Lys

gca Ala 160

480

tgg

tot

gat

ett

ctg

gtc

agt

aca

ccg

aag

gat

aaa

agt

gaa

get

528

Trp

Ser

Asp

Leu

Leu 165

Vai

Ser

Thr

Pro

Lys 170

Asp

Lys

Ser

Glu

Glu 175

Ala

gaa

aaa

gee

ttt

ttg

gaa

ega

gat

aag

tgt

gag

gaa

ctg

gee

576

Glu

Lys

Ala

Phe 180

Leu

Glu

Arg

Asp 185

Lys

Cys

Glu

Glu 190

Leu

Ala

geg

ttt

gee

ggc

ate

ata

gaa

aag

ega

aac

aaa

ccg

gaa

cag

624

Ala

Phe

Phe 195

Ala

Gly

He

Glu 200

Glu

Lys

Arg

Asn

Lys 205

Pro

Glu

Gin

gat

att

tot

att

tta

gtg

gaa

geg

gaa

aca

ggc

gag

aag

ctg

672

Asp

He 210

lie

Ser

He

Leu

Vai 215

Glu

Ala

Glu

Thr 220

Gly

Glu

Lys

Leu

tee

ggt

gaa

gag

ctg

att

ccg

ttt

tgc

acg

ctg

gtg

gee

gga

720

Ser 225

Gly

Glu

Leu

He 230

Pro

Phe

Cys

Thr

Leu 235

Leu

Vai

Ala

Gly 240

aat

gaa

ace

act

aca

aac

ctg

att

tea

aat

geg

atg

tac

age

ata

tta

768

Asn

Glu

Thr

Thr 245

Asn

Leu

He

Ser

Asn 250

Ala

Met

Tyr

Ser

He 255

Leu

gaa Glu

acg Thr

cca Pro 260

ggc Gly

gtt Vai

tac Tyr

gag Glu

gaa Glu 265

ctg Leu

ege Arg

age Ser

cat His

cot Pro 270

gaa Glu

ctg Leu

atg Met

816

cot

cag

gca

gtg

gag

gaa

gee

ttg

cgt

ttc

aga

geg

ccg

gee

ccg

gtt

864

Pro

Gin

Ala 275

Vai

Glu

Ala

Leu 280

Arg

Phe

Arg

Ala

Pro 285

Ala

Pro

Vai

ttg

agg

ege

att

gee

aag

egg

gat

acg

gag

ate

ggg

cac

ctg

att

912

Leu

Arg 290

Arg

He

Ala

Lys

Arg 295

Asp

Thr

Glu

He

Gly 300

Gly

His

Leu

He

aaa

gaa

ggt

gat

atg

gtt

ttg

geg

ttt

gtg

gca

teg

gca

aat

cgt

gat

960

Lys 305

Glu

Gly

Asp

Met

Vai 310

Leu

Ala

Phe

Vai

Ala 315

Ser

Ala

Asn

Arg

Asp 320

gaa Glu

gca Ala

aag Lys

ttt Phe

gac Asp 325

aga Arg

ccg Pro

cac His

atg Met

ttt Phe 330

gat Asp

ate He

ege Arg

cat His 335

ccc Pro

1008

aat

ccg

cat

att

geg

ttt

ggc

cac

ggc

ate

cat

ttt

tgc

ett

ggg

gcc

1056

Asn

Pro

His

lie 340

Ala

Phe

Gly

His

Gly 345

He

His

Phe

Cys

Leu 350

Gly

Ala

ccg

ett

gcc

cgt

ett

gaa

gca

aat

ate

geg

tta

acg

tet

ttg

att

tet

1104

Pro

Leu

Ala 355

Arg

Leu

Glu

Ala

Asn 360

He

Ala

Leu

Thr

Ser 365

Leu

He

Ser

get

ttt

cct

cat

atg

gag

tgc

gtc

agt

ate

act

ccg

att

gaa

aac

agt

1152

Ala gtg Vai 385

Phe 370 ata lie

Pro tac Tyr

His gga Gly

Met tta Leu

Glu aag Lys 390

Cys 375 age Ser

Vai ttc Phe

Ser cgt Arg

He gtg Vai

Thr aaa Lys 395

Pro 380 atg Met

He taa

Glu

Asn

Ser

1191

<210> <211> <212> <213>	3 39 DNA Artificial Sequence
<220> <223>	Synthetic DNA
<400> 3. számú nukleotid szekvencia tttggatccg aattcaaaag tgctggcgct gttccgttt	39
<210> <211> <212> <213>	4 41 DNA Artificial Sequence
<220> <223>	Synthetic DNA
<400> 4. számú nukleotid szekvencia gtgggatccg tcgaccactt ttttcacgat gttcactccc c	41

<210> 5 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220>

<223> Synthetic DNA <400> 5. számú nukleotid szekvencia ccaggatcct ctagatggtg aaatggttgt tgccgctct <210> 6 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220>

<223> Synthetic DNA <400> 6. számú nukleotid szekvencia tcaggatccc ccgggtgagc ggcaaatcca cccaccctg 39 <210> 7 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220>

<223> Synthetic DNA <400> 7. számú nukleotid szekvencia taagcgcgcc ccgggttaat tggatgggcg aaagctc 37 <210> 8 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220>

<223> Synthetic DNA <400> 8. számú nukleotid szekvencia atcgcgcgcg tcgacgatag cggcagaaaa ttggcggca 39 <210> 9 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220>

<223> Synthetic DNA <400> 9. számú nukleotid szekvencia agcggatccg aattcgctgg aatcaaaagt cggccaga 38 <210> 10 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220>

<223> Synthetic DNA <400> 10. számú nukleotid szekvencia tcaggatccg tcgactgaga aaacacaaac gccccctc <210> 11 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220>

<223> Synthetic DNA <400> 11. számú nukleotid szekvencia atgggatcct ctagacatgt tgtagtttgg gttggaatc 39 <210> 12 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220>

<223> Synthetic DNA <400> 12. számú nukleotid szekvencia gccggatcca gatctggcat cacacaacaa taaatacacc gc 42 <210> 13 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220>

<223> Synthetic DNA <400> 13. számú nukleotid szekvencia tctggatcct ctagaagaga acacaaagag tacgaatgc 39 <210> 14 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220>

<223> Synthetic DNA <400> 14. számú nukleotid szekvencia aaaggatccc ccgggtttac cagccagcgc aacaaagtca t 41 *· ♦ ~ * · · »4 « ♦ >·· *·* «Τ“· -

<210> <211> <212> <213>	15 39 DNA Artificial Sequence
<220> <223>	Synthetic DNA

<400> 15. számú nukleotid szekvencia cctgaattct ctagaaggct ttcaccacgt attttgctg39

<210> <211> <212> <213>	16 41 DNA Artificial Sequence
<220> <223>	Synthetic DNA

<400> 16. számú nukleotid szekvencia tctgaattcc ccgggagaac aaaatgccaa aagcctgagtc41

<210> <211> <212> <213>	17 34 DNA Artificial Sequence
<220> <223>	Synthetic DNA

<400> 17. számú nukleotid szekvencia aatactagta caattgcatc gtcaactgca tett34

<210> <211> <212> <213>	18 41 DNA Artificial Sequence
<220> <223>	Synthetic DNA

<400> 18. számú nukleotid szekvencia gtgggatccg tcgaccactt ttttcacgat gttcactccc c41

<210> <211> <212> <213>	19 34 DNA Artificial Sequence
<220> <220> <223>	Synthetic DNA

<400> 19. számú nukleotid szekvencia gaaactagtt cttcaaaaga aaaaaagagt gtaa <210> 20 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220>

<223> Synthetic DNA <400> 20. számú nukleotid szekvencia tcaggatccc ccgggtgagc ggcaaatcca cccaccctg 39 <210> 21 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220>

<223> Synthetic DNA <400> 21. számú nukleotid szekvencia taaactagta gccaatcgat taaattgttt agtg 34 <210> 22 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220>

<223> Synthetic DNA <400> 22. számú nukleotid szekvencia ggaggtacct tatgccccgt caaacgcaac gaga 34 <210> 23 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220>

<223> Synthetic DNA <400> 23. számú nukleotid szekvencia aggactagtc aaatggaaaa attgatgttt catc 34 <210> 24 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220>

<223> Synthetic DNA <400> 24. számú nukleotid szekvencia tcaggatccg tcgactgaga aaacacaaac gccccctc <210> 25 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220>

<223> Synthetic DNA <400> 25. számú nukleotid szekvencia ggtactagta aggaaacaag cccgattcct cage 34 <210> 26 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220>

<223> Synthetic DNA <400> 26. számú nukleotid szekvencia gccggatcca gatctggcat cacacaacaa taaatacacc gc 42 <210> 27 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220>

<223> Synthetic DNA <400> 27. számú nukleotid szekvencia ttggatccac tagtaatgtg ttaaaccgcc ggcaagcc 38 <210> 28 <211>

<211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220>

<223> Synthetic DNA <400> 28. számú nukleotid szekvencia aaaggatccc ccgggtttac cagccagcgc aacaaagtca t 41 <210> 29 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220>

<223> Synthetic DNA <400> 29. számú nukleotid szekvencia atgactagta aacaggcaag cgcaatacct cage 34 <210> 30 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220>

<223> Synthetic DNA <400> 30. számú nukleotid szekvencia tttggtacct tacattcctg tccaaacgtc tttc 34 <210> 31 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220>

<223> Synthetic DNA <400> 31. számú nukleotid szekvencia agcggtcgac aatgaatgtg ttaaaccgc 29 <210> 32 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220>

<223> Synthetic DNA <400> 32. számú nukleotid szekvencia acgcggatcc ttacattttc acacggaag 29 <210> 33 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220>

<223> Synthetic DNA <400> 33. számú nukleotid szekvencia cgccagggtt ttcccagtca cgac <210> 34 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220>

<223> Synthetic DNA <400> 34. számú nukleotid szekvencia cgcaatatgc ggattggg 18 <210> 35 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220>

<223> Synthetic DNA <400> 35. számú nukleotid szekvencia tttccggcca ccagcagc 18 <210> 36 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220>

<223> Synthetic DNA <400> 36. számú nukleotid szekvencia taaccggaag cgggtatg 18 <210> 37 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220>

<223> Synthetic DNA <400> 37. számú nukleotid szekvencia aaggaaacag gcgcatcc 18 <210> 38 <211> 67 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220>

<223> Synthetic DNA <400> 38. számú nukleotid szekvencia tcgcctcgag tcgaggaggt cgactaatat gaacgttctg aaccgccgtc aagccttgca gcgagcg <210> 39 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220>

<223> Synthetic DNA <400> 39. számú nukleotid szekvencia tcgcggatcc ttacattttc acacggaa <210> 40 <211> 715 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220>

<223> Synthetic DNA <400> 40. számú nukleotid szekvencia

cctgcaggtc	atcacccgag	caggcgaccc	gaacgttcgg	aggctcctcg	ctgtccattc	60
gctcccctgg	cgcggtatga	accgccgcct	catagtgcag	tttgatcctg	acgagcccag	120
catgtctgcg	cccaccttcg	cggaacctga	ccagggtccg	ctagcgggcg	gccggaaggt	180
gaatgctagg	catgatctaa	ccctcggtct	ctggcgtcgc	gactgcgaaa	tttcgcgagg	240
gtttccgaga	aggtgattgc	gcttcgcaga	tctcgtggac	ggcttggttg	acgccctccg	300
cccattgggt	gatggtggca	ccatttggct	gttgactcct	ggtgcaggaa	aacgtggaac	360
tattgctcca	ggtgaaattt	ccgaatccgc	acaattggca	ggcctcgtcc	agaccaccgc	420
agagcgtctc	ggtgattggc	agggcagctg	cttggtcgcg	cgcggcgcga	tgaagaagta	480
agaattagcc	gaaaacacct	tccagccagg	cgatttgctt	aagttagaag	gtgtggctag	540
tattctaaga	gtgctcatga	ggaagcggaa	agcttttaag	agagcatgat	gcggctttag	600
ctcagctgga	agagcaactg	gtttacaccc	agtaggtcgg	gggttcgatc	cagctgtgaa	660

caattgcact ttggatctaa ttaagggatt agtcgactat ggatccccgg gtacc

715 <210> 41 <211> 1204 <212> DNA <213> Bacillus subtilis <220>

<221> CDS <222> (8)..(1195)

<400> 41. s:

zámú aat Asn

nukleotid szekvencia

geg Ala

ctg Leu

49

gtcgaca

atg Met 1

gtg Vai

tta Leu

aac Asn

ege Arg 5

egg Arg

caa Gin

gcc Ala

ttg Leu

cag Gin 10

ega Arg

etc Leu

aat Asn 15

ggg Gly

aaa Lys

aac Asn

aaa Lys

cag Gin 20

gat Asp

geg Ala

tat Tyr

cat His

ccg Pro 25

ttt Phe

cca Pro

tgg Trp

tat Tyr 30

97

gaa Glu

teg Ser

atg Met

aga Arg

aag Lys 35

gat Asp

geg Ala

cct Pro

gtt Vai

tcc Ser 40

ttt Phe

gat Asp

gaa Glu

aac Asn 45

caa Gin

145

gtg Vai

tgg Trp

age Ser

gtt Vai 50

ttt Phe

ett Leu

tat Tyr

gat Asp

gat Asp 55

gtc Vai

aaa Lys

gtt Vai

gtt Vai 60

ggg Gly

gat Asp

193

aaa Lys

gag Glu

ttg Leu 65

ttt Phe

tec Ser

agt Ser

tgc Cys

atg Met 70

ccg Pro

cag Gin

aca Thr

age Ser 75

tet Ser

att He

gga Gly

241

aat Asn

tee Ser 80

ate He

att He

aac Asn

atg Met

gac Asp 85

ccg Pro

aag Lys

cat His

aca Thr 90

aaa Lys

ate He

cgt Arg

tea Ser

289

gtc Vai

gtg Vai 95

aac Asn

aaa Lys

gee Ala

ttt Phe

act Thr 100

ccg Pro

ege Arg

geg Ala

atg Met

aag Lys 105

caa Gin

tgg Trp

gaa Glu

ccg Pro

337 110

aga Arg

att lie

caa Gin

gaa Glu

ate He 115

aca Thr

gat Asp

gaa Glu

ctg Leu

att He 120

caa Gin

aaa Lys

ttt Phe

cag Gin

ggg Gly 125

ege Arg

385

agt Ser

gag Glu

ttt Phe

gac Asp 130

ett Leu

gtt Vai

cac His

gat Asp

ttt Phe 135

tea Ser

tac Tyr

ccg Pro

ett Leu

ccg Pro 140

gtt Vai

att He

433

gtg Vai

ata He

tet Ser 145

gag Glu

ctg Leu

gga Gly

gtg Vai 150

cct Pro

tea Ser

geg Ala

cat His

atg Met 155

gaa Glu

cag Gin

ttt Phe

481

aaa Lys

gca Ala 160

tgg Trp

tet Ser

gat Asp

ett Leu

ctg Leu 165

gtc Vai

agt Ser

aca Thr

ccg Pro

aag Lys 170

gat Asp

aaa Lys

agt Ser

gaa Glu

529

gaa Glu 175

get Alá

gaa Glu

aaa Lys

gcc Alá

ttt Phe 180

ttg Leu

gaa Glu

cga Arg

gat Asp 185

aag Lys

tgt Cys

gag Glu

gaa Glu

gaa Glu 190

577

ctg

gcc

gcg

ttt

gcc

ggc

atc

ata

gaa

aag

cga

aac

aaa

ccg

625

Leu

Alá

Phe

Phe 195

Alá

Gly

Ile

Glu 200

Glu

Lys

Arg

Asn

Lys 205

Pro

gaa

cag

gat

att

tet

att

tta

gtg

gaa

gcg

gaa

aca

ggc

gag

673

Glu

Gin

Asp

Ile 210

Ile

Ser

Ile

Leu

Val 215

Glu

Alá

Glu

Thr 220

Gly

Glu

aag

ctg

tcc

ggt

gaa

gag

ctg

att

ccg

ttg

tgc

acg

ctg

gtg

721

Lys

Leu

Ser 225

Gly

Glu

Leu

Ile 230

Pro

Leu

Cys

Thr

Leu 235

Leu

Val

gcc

gga

aat

gaa

acc

act

aca

aac

ctg

att

tea

aat

gcg

atg

tac

agc

769

Alá

Gly 240

Asn

Glu

Thr

Thr 245

Asn

Leu

Ile

Ser

Asn 250

Alá

Met

Tyr

Ser

ata

tta

gaa

acg

cca

ggc

gtt

tac

gag

gaa

ctg

ege

agc

cat

cet

gaa

817

Ile 255

Leu

Glu

Thr

Pro

Gly 260

Val

Tyr

Glu

Leu 265

Arg

Ser

His

Pro

Glu 270

ctg

atg

cet

cag

gca

gtg

gag

gaa

gcc

ttg

cgt

ttc

aga

gcg

ccg

gcc

865

Leu

Met

Pro

Gin

Alá 275

Val

Glu

Alá

Leu 280

Arg

Phe

Arg

Alá

Pro 285

Alá

ccg

gtt

ttg

agg

ege

att

gcc

aag

egg

gat

acg

gag

atc

ggg

cac

913

Pro

Val

Leu

Arg 290

Arg

Ile

Alá

Lys

Arg 295

Asp

Thr

Glu

Ile

Gly 300

Gly

His

ctg

att

aaa

gaa

ggt

gat

atg

gtt

ttg

gcg

ttt

gtg

gca

teg

gca

aat

961

Leu

Ile

Lys 305

Glu

Gly

Asp

Met

Val 310

Leu

Alá

Phe

Val

Alá 315

Ser

Alá

Asn

cgt

gat

gaa

gca

aag

ttt

gac

aga

ccg

cac

atg

ttt

gat

atc

ege

1009

Arg

Asp 320

Glu

Alá

Lys

Phe

Asp 325

Arg

Pro

His

Met

Phe 330

Asp

Ile

Arg

cat

ccc

aat

ccg

cat

att

gcg

ttt

ggc

cac

ggc

atc

cat

ttt

tgc

ett

1057

His 335

Pro

Asn

Pro

His

Ile 340

Alá

Phe

Gly

His

Gly 345

Ile

His

Phe

Cys

Leu 350

ggg

gcc

ccg

ett

gcc

cgt

ett

gaa

gca

aat

atc

gcg

tta

acg

tet

ttg

1105

Gly

Alá

Pro

Leu

Ala 355

Arg

Leu

Glu

Alá

Asn 360

Ile

Alá

Leu

Thr

Ser 365

Leu

att

tet

get

ttt

cet

cat

atg

gag

tgc

gtc

agt

atc

act

ccg

att

gaa

1153

Ile

Ser

Alá

Phe 370

Pro

His

Met

Glu

Cys 375

Val

Ser

Ile

Thr

Pro 380

Ile

Glu

aac Asn

agt Ser

gtg Val 385

ata Ile

tac Tyr

gga Gly

tta Leu

aag Lys 390

agc Ser

ttc Phe

cgt Arg

gtg Val

aaa Lys 395

atg Met

taaggatccl204

<210> 42 <211> 396 <212> PRT <213> Bacillus <400> 42. számú

Met Asn Vai Leu

Gly Lys Asn Lys

Met Arg Lys Asp Ala

Ser Vai Phe Leu Tyr 50

Leu Phe Ser Ser Cys 65 lie He Asn Met Asp 85

Asn Lys Ala Phe Thr

100

Gin Glu He Thr Asp

115

Phe Asp Leu Vai His

130

Ser Glu Leu Leu Gly 145

Trp Ser Asp Leu Leu

165

Glu Lys Ala Phe Leu

180 subtills aminosav

Asn Arg

Pro

Asp

Met 70

Pro szekvencia

Arg Gin Ala Leu

Ala Tyr His Pro 25

Vai Ser Phe Asp 40

Asp Vai Lys Lys 55

Pro Gin Gin Thr

Pro Lys His Thr

Pro Arg Ala Met Lys

105

Glu Leu lie Gin Lys

120

Asp Phe Ser Tyr Pro

135

Vai Pro Ser Ala His

150

Vai Ser Thr Pro Lys 170

Glu Glu Arg Asp Lys

185

Gin Arg Ala Leu Leu Asn

Phe Pro Trp Tyr Glu Ser

Glu Glu Asn Gin Vai Trp

Vai Vai Gly Asp Lys Glu

Ser Ser He Gly Asn Ser

80

Lys lie Arg Ser Vai Vai

Gin Trp Glu Pro Arg He

110

Phe Gin Gly Arg Ser Glu

125

Leu Pro Vai lie Vai lie

140

Met Glu Gin Phe Lys Ala

155 160

Asp Lys Ser Glu Glu Ala

175

Cys Glu Glu Glu Leu Ala

190

Ala Phe Phe Ala Gly 195

Asp He He Ser lie 210

Ser Gly Glu Glu Leu 225

Asn Glu Thr Thr Thr

245

Glu Thr Pro Gly Vai 260

Pro Gin Ala Vai Glu 275

Leu Arg Arg lie Ala 290

Lys Glu Gly Asp Met 305

Glu Ala Lys Phe Asp

325

Asn Pro His lie Ala

340

Pro Leu Ala Arg Leu 355

Ala Phe Pro His Met

370

Vai He Tyr Gly Leu 385

He lie Glu Glu Lys 200

Leu Vai Glu Ala Glu

215 lie Pro Leu Cys Thr 230

Asn Leu lie Ser Asn

250

Tyr Glu Glu Leu Arg 265

Glu Ala Leu Arg Phe 280

Lys Arg Asp Thr Glu 295

Vai Leu Ala Phe Vai

310

Arg Pro His Met Phe

330

Phe Gly His Gly lie 345

Glu Ala Asn lie Ala

360

Glu Cys Vai Ser lie 375

Lys Ser Phe Arg Vai 390

Arg Asn Lys Pro Glu 205

Glu Thr Gly Glu Lys 220

Leu Leu Leu Vai Ala 235

Ala Met Tyr Ser lie

255

Ser His Pro Glu Leu

270

Arg Ala Pro Ala Pro 285 lie Gly Gly His Leu 300

Ala Ser Ala Asn Arg 315

Asp lie Arg Arg His

335

His Phe Cys Leu Gly

350

Leu Thr Ser Leu lie

365

Thr Pro lie Glu Asn

380

Lys Met

395

Gin

Leu

Gly 240

Leu

Met

Vai

He

Asp 320 Pro

Ala

Ser

Ser <210> 43 <211> 1221 <212> DNA <213> Bacillus subtilis <220>

<221> CDS <222> (25) . . (1212) <400> 43. számú szekvencia ctcgagtcga ggaggtcgac taat atg aac gtt Met Asn Vai ctg aac cgc cgt caa gcc Leu Asn Arg Arg Gin Ala 5

ttg Leu 10

cag Gin

ega Arg

geg Ala

ctg Leu

etc Leu 15

aat Asn

ggg Gly

aaa Lys

aac Asn

aaa Lys 20

cag Gin

gat Asp

geg Ala

tat Tyr

cat His 25

99

ccg

ttt

cca

tgg

tat

gaa

teg

atg

aga

aag

gat

geg

cct

gtt

tcc

ttt

147

Pro

Phe

Pro

Trp

Tyr 30

Glu

Ser

Met

Arg

Lys 35

Asp

Ala

Pro

Vai

Ser 40

Phe

gat

gaa

aac

caa

gtg

tgg

age

gtt

ttt

ett

tat

gat

gtc

aaa

195

Asp

Glu

Asn 45

Gin

Vai

Trp

Ser

Vai 50

Phe

Leu

Tyr

Asp

Asp 55

Vai

Lys

aaa

gtt

ggg

gat

aaa

gag

ttg

ttt

tec

agt

tgc

atg

ccg

cag

243

Lys

Vai

Vai 60

Gly

Asp

Lys

Glu

Leu 65

Phe

Ser

Cys

Met 70

Pro

Gin

aca

age

tet

att

gga

aat

tec

ate

att

aac

atg

gac

ccg

aag

cat

291

Thr

Ser 75

Ser

Tie

Gly

Asn

Ser 80

He

lie

Asn

Met

Asp 85

Pro

Lys

His

aca

aaa

ate

cgt

tea

gtc

gtg

aac

aaa

gcc

ttt

act

ccg

cgc

gtg

atg

339

Thr 90

Lys

lie

Arg

Ser

Vai 95

Vai

Asn

Lys

Ala

Phe 100

Thr

Pro

Arg

Vai

Met 105

aag

caa

tgg

gaa

ccg

aga

att

caa

gaa

ate

aca

gat

gaa

ctg

att

caa

387

Lys

Gin

Trp

Glu

Pro 110

Arg

He

Gin

Glu

He 115

Thr

Asp

Glu

Leu

He 120

Gin

aaa

ttt

cag

ggg

cgc

agt

gag

ttt

gac

ett

gtt

cac

gat

ttt

tea

tac

435

Lys

Phe

Gin

Gly 125

Arg

Ser

Glu

Phe

Asp 130

Leu

Vai

His

Asp

Phe 135

Ser

Tyr

ccg

ett

ccg

gtt

att

gtg

ata

tet

gag

ctg

gga

gtg

cct

tea

geg

483

Pro

Leu

Pro 140

Vai

He

Vai

He

Ser 145

Glu

Leu

Gly

Vai 150

Pro

Ser

Ala

cat

atg

gaa

cag

ttt

aaa

gca

tgg

tet

gat

ett

ctg

gtc

agt

aca

ccg

531

His

Met 155

Glu

Gin

Phe

Lys

Ala 160

Trp

Ser

Asp

Leu

Leu 165

Vai

Ser

Thr

Pro

aag gat aaa agt gaa gaa Lys Asp Lys Ser Glu Glu 170 175 get gaa aaa gee ttt Ala Glu Lys Ala Phe 180 ttg gaa gaa ega gat 579

Leu Glu Glu Arg Asp

185

aag Lys

tgt Cys

gag Glu

gaa Glu

gaa Glu 190

ctg Leu

gee Ala

geg Ala

ttt Phe

ttt Phe 195

gee Ala

ggc Gly

ate He

ata lie

gaa Glu 200

gaa Glu

627

aag

ega

aac

aaa

ccg

gaa

cag

gat

att

tet

att

tta

gtg

gaa

geg

675

Lys

Arg

Asn

Lys 205

Pro

Glu

Gin

Asp

He 210

He

Ser

He

Leu

Val 215

Glu

Ala

gaa

aca

ggc

gag

aag

ctg

tee

ggt

gaa

gag

ctg

att

ccg

ttt

tgc

723

Glu

Thr 220

Gly

Glu

Lys

Leu

Ser 225

Gly

Glu

Leu

He 230

Pro

Phe

Cys

acg

ctg

gtg

gee

gga

aat

gaa

acc

act

aca

aac

ctg

att

tea

771

Thr

Leu 235

Leu

Val

Ala

Gly 240

Asn

Glu

Thr

Thr 245

Asn

Leu

He

Ser

aat

geg

atg

tac

age

ata

tta

gaa

acg

cca

ggc

gtt

tac

gag

gaa

ctg

819

Asn 250

Ala

Met

Tyr

Ser

He 255

Leu

Glu

Thr

Pro

Gly 260

Val

Tyr

Glu

Leu 265

ege

age

cat

cct

gaa

ctg

atg

cct

cag

gca

gtg

gag

gaa

gee

ttg

cgt

867

Arg

Ser

His

Pro

Glu 270

Leu

Met

Pro

Gin

Ala 275

Val

Glu

Ala

Leu 280

Arg

ttc

aga

geg

ccg

gee

ccg

gtt

ttg

agg

ege

att

gee

aag

egg

gat

acg

915

Phe

Arg

Ala

Pro 285

Ala

Pro

Val

Leu

Arg 290

Arg

He

Ala

Lys

Arg 295

Asp

Thr

gag

ate

ggg

cac

ctg

att

aaa

gaa

ggt

gat

atg

gtt

ttg

geg

ttt

963

Glu

He

Gly 300

Gly

His

Leu

He

Lys 305

Glu

Gly

Asp

Met

Val 310

Leu

Ala

Phe

gtg

gca

teg

gca

aat

cgt

gat

gaa

gca

aag

ttt

gac

aga

ccg

cac

atg

1011

Vai

Ala 315

Ser

Ala

Asn

Arg

Asp 320

Glu

Ala

Lys

Phe

Asp 325

Arg

Pro

His

Met

ttt

gat

ate

ege

cat

ccc

aat

ccg

cat

att

geg

ttt

ggc

cac

ggc

1059

Phe 330

Asp

He

Arg

His 335

Pro

Asn

Pro

His

He 340

Ala

Phe

Gly

His

Gly 345

ate

cat

ttt

tgc

ett

ggg

gee

ccg

ett

gee

cgt

ett

gaa

gca

aat

ate

1107

lie

His

Phe

Cys

Leu 350

Gly

Ala

Pro

Leu

Ala 355

Arg

Leu

Glu

Ala

Asn 360

He

geg

tta

acg

tet

ttg

att

tet

get

ttt

cct

cat

atg

gag

tgc

gtc

agt

1155

Ala

Leu

Thr

Ser 365

Leu

He

Ser

Ala

Phe 370

Pro

His

Met

Glu

Cys 375

Val

Ser

ate act ccg att gaa aac agt gtg ata tac gga tta aag age ttc cgt 1203 He Thr Pro lie Glu Asn Ser Vai lie Tyr Gly Leu Lys Ser Phe Arg

380 385 390 gtg aaa atg taaggatcc 1221

Vai Lys Met

395 <210> 44 <211> 1221 <212> DNA <213> Bacillus subtilis <221> CDS <221> (25) . . (1212) <400> 44. számú szekvencia etegagtega ggaggtcgac taat atg aac gtt ctg aac ege cgt caa gcc 51

Met Asn Vai Leu Asn Arg Arg Gin Ala

5

ttg Leu 10

ccg Pro

ega Arg

geg Ala

ctg Leu

etc Leu 15

aat Asn

ggg Gly

aaa Lys

aac Asn

aaa Lys 20

cag Gin

gat Asp

geg Ala

tat Tyr

cat His 25

99

ccg

ttt

cca

tgg

tat

gaa

teg

atg

aga

aag

gat

geg

cct

gtt

tcc

ttt

147

Pro

Phe

Pro

Trp

Tyr

Glu

Ser

Met

Arg

Lys

Asp

Ala

Pro

Vai

Ser

Phe

30

35

40

gat

gaa

aac

caa

gtg

tgg

age

gtt

ttt

ett

tat

gat

gtc

aaa

195

Asp

Glu

Asn

Gin

Vai

Trp

Ser

Vai

Phe

Leu

Tyr

Asp

Vai

Lys

45

50

55

aaa

gtt

ggg

gat

aaa

gag

ttg

ttt

tcc

agt

tgc

atg

ccg

cag

243

Lys

Vai

Gly

Asp

Lys

Glu

Leu

Phe

Ser

Cys

Met

Pro

Gin

60

65

70

aca

age

tet

att

gga

aat

tcc

ate

att

age

atg

gac

ccg

aag

cat

291

Thr

Ser

He

Gly

Asn

Ser

He

Ser

Met

Asp

Pro

Lys

His

75

80

85

aca

aaa

ate

cgt

tea

gtc

gtg

aac

aaa

gcc

ttt

act

ccg

ege

geg

atg

339

Thr

Lys

He

Arg

Ser

Vai

Asn

Lys

Ala

Phe

Thr

Pro

Arg

Ala

Met

90

95

100

105

aag caa tgg gaa ccg aga att caa gaa ate Lys Gin Trp Glu Pro Arg lie Gin Glu lie 110 115 aaa ttt cag ggg ege agt gag ttt gac ett Lys Phe Gin Gly Arg Ser Glu Phe Asp Leu 125 130

aca gat gaa ctg att caa 387 Thr Asp Glu Leu lie Gin 120 gtt cac gat tat tea tac 435 Vai His Asp Tyr Ser Tyr 135

ccg Pro

ett Leu

ccg Pro 140

gtt Vai

att lie

gtg Val

ata He

tet Ser 145

gag Glu

ctg Leu

gga Gly

gtg Val 150

cct Pro

tea Ser

geg Ala

483

cat

atg

gaa

cag

ttt

aaa

gca

tgg

tet

gat

ett

ctg

gtc

agt

aca

ccg

531

His

Met 155

Glu

Gin

Phe

Lys

Ala 160

Trp

Ser

Asp

Leu

Leu 165

Val

Ser

Thr

Pro

aag

gat

aaa

agt

gaa

get

gaa

aaa

gee

ttt

ttg

gaa

ega

gat

579

Lys 170

Asp

Lys

Ser

Glu

Glu 175

Ala

Glu

Lys

Ala

Phe 180

Leu

Glu

Arg

Asp 185

aag

tgt

gag

gaa

ctg

gee

geg

ttt

gee

ggc

ate

ata

gaa

627

Lys

Cys

Glu

Glu 190

Leu

Ala

Phe

Phe 195

Ala

Gly

He

Glu 200

Glu

aag

ega

aac

aaa

ccg

gaa

cag

gat

att

tet

att

tta

gtg

gaa

geg

675

Lys

Arg

Asn

Lys 205

Pro

Glu

Gin

Asp

Tie 210

He

Ser

lie

Leu

Val 215

Glu

Ala

gaa

aca

ggc

gag

aag

ctg

tee

ggt

gaa

gag

ctg

att

ccg

ttg

tgc

723

Glu

Thr 220

Gly

Glu

Lys

Leu

Ser 225

Gly

Glu

Leu

He 230

Pro

Leu

Cys

acg

ctg

gtg

gee

gga

aat

gaa

ace

act

aca

aac

ctg

att

tea

771

Thr

Leu 235

Leu

Val

Ala

Gly 240

Asn

Glu

Thr

Thr 245

Asn

Leu

He

Ser

aat

geg

atg

ttc

age

ata

tta

gaa

acg

cca

ggc

gtt

tac

gag

gaa

ctg

819

Asn 250

Ala

Met

Phe

Ser

He 255

Leu

Glu

Thr

Pro

Gly 260

Val

Tyr

Glu

Leu 265

cgc

age

cat

cct

gaa

ctg

atg

ccc

cag

gca

gtg

gag

gaa

gee

ttg

cgt

867

Arg

Ser

His

Pro

Glu 270

Leu

Met

Pro

Gin

Ala 275

Val

Glu

Ala

Leu 280

Arg

ttc

aga

geg

ccg

gee

ccg

gtt

ttg

agg

cgc

att

gee

aag

egg

gat

acg

915

Phe

Arg

Ala

Pro 285

Ala

Pro

Val

Leu

Arg 290

Arg

He

Ala

Lys

Arg 295

Asp

Thr

gag

ate

ggg

cac

ctg

att

aaa

gaa

ggt

gat

acg

gtt

ttg

geg

ttt

963

Glu

lie

Gly 300

Gly

His

Leu

He

Lys 305

Glu

Gly

Asp

Thr

Val 310

Leu

Ala

Phe

gtg

gca

teg

gca

aat

cgt

gat

gaa

gca

aag

ttt

gac

aga

ccg

cac

atg

1011

Vai

Ala 315

Ser

Ala

Asn

Arg

Asp 320

Glu

Ala

Lys

Phe

Asp 325

Arg

Pro

His

Met

ttt

gat

ate

cgc

cat

ccc

aat

ccg

cat

att

geg

ttt

ggc

cac

ggc

1059

Phe 330

Asp

lie

Arg

His 335

Pro

Asn

Pro

His

He 340

Ala

Phe

Gly

His

Gly 345

ate

cat

ttt

tgc

ett

ggg

gee

ccg

ett

gee

cgt

ett

gaa

gca

aat

ate

1107

lie

His

Phe

Cys

Leu 350

Gly

Ala

Pro

Leu

Ala 355

Arg

Leu

Glu

Ala

Asn 360

He

geg tta acg tet ttg att tet get

Ala Leu Thr Ser Leu He Ser Ala

365 ate act ccg att gaa aac agt gtg

He Thr Pro He Glu Asn Ser Vai

380 385 gtg aaa atg taaggatcc

Vai Lys Met 395 <210> 45 <211> 396 <212> PRT <213> Bacillus subtilis <400> 45. számú szekvencia

Met Asn Vai Leu Asn Arg Arg Gin

Gly Lys Asn Lys Gin Asp Ala Tyr

Met Arg Lys Asp Ala Pro Vai Ser

3540

Ser Vai Phe Leu Tyr Asp Asp Vai

5055

Leu Phe Ser Ser Cys Met Pro Gin

6570 lie lie Ser Met Asp Pro Pro Lys

Asn Lys Ala Phe Thr Pro Arg Ala

100

Gin Glu lie Thr Asp Glu Leu lie

115120

Phe Asp Leu Vai His Asp Tyr Ser ttt cct cat atg gag tgc gtc agt1155

Phe Pro His Met Glu Cys VaiSer

370375 ata tac gga tta aag age ttc cgt1203 lie Tyr Gly Leu Lys Ser Phe Arg

390

1221

Ala Leu Pro Arg Ala Leu Leu Asn 1015

His Pro Phe Pro Trp Tyr Glu Ser 2530

Phe Asp Glu Glu Asn Gin Vai Trp 45

Lys Lys Vai Vai Gly Asp Lys Glu 60

Gin Thr Ser Ser lie Gly Asn Ser 7580

His Thr Lys lie Arg Ser Vai Vai 9095

Met Lys Gin Trp Glu Pro Arg He 105110

Gin Lys Phe Gin Gly Arg Ser Glu

125

Tyr Pro Leu Pro Vai lie Vai He

130

135

140

4·*.

Ser Glu Leu Leu 145

Trp Ser Asp Leu

Glu Lys Ala Phe

180

Ala Phe Phe Ala 195

Asp lie lie Ser 210

Ser Gly Glu Glu 225

Asn Glu Thr Thr

Glu Thr Pro Gly

260

Pro Gin Ala Vai

275

Leu Arg Arg lie 290

Lys Glu Gly Asp 305

Glu Ala Lys Phe

Asn Pro His lie

340

Gly Vai Pro Ser 150

Leu Vai Ser Thr 165

Leu Glu Glu Arg

Gly He He Glu 200 lie Leu Vai Glu 215

Leu He Pro Leu

230

Thr Asn Leu lie 245

Vai Tyr Glu Glu

Glu Glu Ala Leu

280

Ala Lys Arg Asp 295

Thr Vai Leu Ala

310

Asp Arg Pro His 325

Ala Phe Gly His

Ala His Met Glu

155

Pro Lys Asp Lys 170

Asp Lys Cys Glu 185

Glu Lys Arg Asn

Ala Glu Glu Thr

220

Cys Thr Leu Leu 235

Ser Asn Ala Met

250

Leu Arg Ser His 265

Arg Phe Arg Ala

Thr Glu lie Gly

300

Phe Vai Ala Ser

315

Met Phe Asp He

330

Gly He His Phe 345

Gin Phe Lys Ala

160

Ser Glu Glu Ala

175

Glu Glu Leu Ala

190

Lys Pro Glu Gin 205

Gly Glu Lys Leu

Leu Vai Ala Gly

240

Phe Ser lie Leu

255

Pro Glu Leu Met

270

Pro Ala Pro Vai

285

Gly His Leu lie

Ala Asn Arg Asp

320

Arg Arg His Pro 335

Cys Leu Gly Ala

350

Pro Leu Ala Arg

355

Ala Phe Pro His

370

Vai lie Tyr Gly

385

Leu Glu Ala Asn

360

Met Glu Cys Vai

375

Leu Lys Ser Phe

390 lie Ala Leu Thr

Ser lie Thr Pro

380

Arg Vai Lys Met

395

Ser Leu lie Ser

365 lie Glu Asn Ser

Claims

Szabadalmi igénypontok

1. Fehérje, amely egy Bacillus nemzetségbe tartozó mikroorganizmusból származik és képes (I-a) vagy (I-b) képletű vegyületből (Il-a) vagy (ΙΙ-b) képletű vegyület termelésére, ahol az (I-a) általános képletű vegyületet az alábbi képlet szemlélteti, mely képletben

R OOC

HO

R¹ jelentése hidrogénatom, szubsztituált vagy szubsztituálatlan alkilcsoport vagy alkálifématom és

R² jelentése szubsztituált vagy szubsztituálatlan alkil- vagy szubsztituált vagy szubsztituálatlan arilcsoport;

az (I-b) általános képletű vegyületet, mely az (I-a) általános képletű vegyület lakton formája az (I-b) képlet szemlélteti, amelyben R² jelentése a fentiekben megadott; a (II-a) általános képletű vegyületet az alábbi képlet szemlélteti,

(ll-a) amelyben R¹ és R² jelentése a fentiekben megadott; és és a (ΙΙ-b) általános képletű vegyületet, mely a (Il-a) általános képletű vegyület lakton formája, a (ΙΙ-b) képlet szemlélteti ,

(ll-b) amelyben R² jelentése a fentiekkel megegyező.
2. Fehérje, amely egy Bacillus nemzetségbe tartozó mikroorganizmusból származik és képes (Ill-a) vagy (Ill-b) képletű vegyületből (IV-a) vagy (IV-b) képletű vegyület előállítására, ahol az (Ill-a) általános képletű vegyületet az alábbi képlet szemlélteti, mely képletben

R¹ jelentése hidrogénatom, szubsztituált vagy szubsztituálatlan alkilcsoport vagy alkálifématom és

R² jelentése szubsztituált vagy szubsztituálatlan alkil- vagy szubsztituált vagy szubsztituálatlan arilcsoport;

(lll-a) a (IH-b) általános képletű vegyűletet, mely a (IH-a) általános képletű vegyület lakton formája a (IH-b) képlet szemlélteti,

amelyben R² jelentése a fentiekben megadott;

a (IV-a) általános képletű vegyűletet a (IV-a) képlet ábrázolja,

(IV-a) amelyben R¹ és R² jelentése a fentiekben megadott;

és a (IV-b) általános képletű vegyűletet, mely a (IV-a) képletű vegyület lakton formája, a (IV-b) képlet szemlélteti,

amelyben R² jelentése a fentiekkel megegyező.
3. Fehérje, amely egy Bacillus nemzetségbe tartozó mikroorganizmusból származik és képes (V-a) vagy (V-b) képletű vegyületből (Vl-a) vagy (Vl-b) képletű vegyület előállítására, ahol az (V-a) általános képletű vegyületet az alábbi képlet szemlélteti, mely képletben

(V-a)

R¹ jelentése hidrogénatom, szubsztituált vagy szubsztituálatlan alkilcsoport vagy alkálifématom;

az (V-b) képletű vegyületet, mely az (V-a) általános képletű vegyület lakton formája a (V-b) képlet szemlélteti,

a (Vl-a) általános képletű vegyületet az alábbi képlet ábrázolja, amelyben R¹ jelentése a fentiekben megadott;

és

(Vl-a) a (Vl-b) általános képletű vegyületet, mely a (Vl-a) általános képletű vegyület lakton formája, a (Vl-b) képlet mutatja be.

(Vl-b)
4. Fehérje, amely egy Bacillus nemzetségbe tartozó mikroorganizmusból származik és képes (VH-a) vagy (VH-b) képletű ve gyületből (VIII-a) vagy (VIII-b) képletű vegyület előállítására, ahol a (VH-a) általános képletű vegyületet az alábbi képlet áb rázolja, mely képletben

R¹ jelentése hidrogénatom, szubsztituált vagy szubsztituálatlan alkilcsoport vagy alkálifématom;

(Vll-a) a (VII-b) képletű vegyületet, mely a (VII-a) általános képletű vegyület lakton formája a (VH-b) képlet ábrázolja,

(Vll-b) a (VIII-a) általános képletű vegyületet az alábbi képlet ábrá zolj a,

amelyben R¹ jelentése (VI ll-a) a fentiekben megadott; és a (VIII-b) általános képletű vegyületet, mely a (VIII-a) általá nos képletű vegyület lakton formája, a (VIII-b) képlet ábrázol ja.

(Vlll-b)
5. Az 1-4. igénypontok bármelyike szerinti fehérje, ahol a Bacillus nemzetségbe tartozó mikroorganizmust a következők közül választjuk ki: B. subtilis, B. megaterium, B. laterosporus, B. sphaericus, B. pumilus, B. stearothermophilus, B. cereus, B. badius, B. brevis, B. alvei, B. circulars és B. macerans.
6. Az 1-5. igénypontok bármelyike szerinti fehérje, ahol a Bacillus nemzetségbe tartozó mikroorganizmust a következők közül választjuk ki: B. subtilis ATCC6051, B. megaterium ATCC10778, B. megaterium ATCC11562, B. megaterium ATCC13402, B. megaterium ATCC15177, B. megaterium ATCC15450, B. megaterium ATCC19213, B. megaterium IAM1032, B. laterosporus ATCC4517, B. pumilus FERM BP-2064, B. badius ATCC14574, B. brevis NRRLB-8029, B. alvei ATCC6344, B. circulars NTCT-2610 és B. macerans NCIMB-9368.
7. Az 1-5. igénypontok bármelyike szerinti fehérje, ahol a Bacillus nemzetségbe tartozó mikroorganizmus Bacillus sp. FERM BP-6029 vagy Bacillus sp. FERM BP-6030.
8. Fehérje, mely az 1. számú aminosav szekvenciával rendelkezik.
9. Fehérje, mely az 1. számú aminosav szekvenciából egy vagy több aminosav kivágásával, helyettesítésével vagy addiciójával létrehozott aminosav szekvenciával rendelkezik, és képes (I-a) vagy (I-b) vegyületből (Il-a) vagy (ΙΙ-b) vegyület előállítására .
10. A 9. igénypont szerinti fehérje, mely a 42. vagy 45. számú aminosav szekvenciával rendelkezik.
11. A 9. igénypont szerinti fehérje, ahol az (I-a) vegyületet a (IH-a) vegyület, az (I-b) vegyületet a (Ill-b) vegyület, a (Il-a) vegyületet a (IV-a) vegyület és a (ΙΙ-b) vegyületet a (IV-b) vegyület helyettesíti.
12. A 9. igénypont szerinti fehérje, ahol az (I-a) vegyületet az (V-a) vegyület, az (I-b) vegyületet az (V-b) vegyület, a (Il-a) vegyületet a (Vl-a) vegyület és a (ΙΙ-b) vegyületet a (Vl-b) vegyület helyettesíti.
13. A 9. igénypont szerinti fehérje, ahol az (I-a) vegyületet a (VH-a) vegyület, az (I-b) vegyületet a (VH-b) vegyület, a (Il-a) vegyületet a (VIII-a) vegyület és a (ΙΙ-b) vegyületet a (VIII-b) vegyület helyettesíti.
14. Izolált DNS, amely a 2. számú nukleotid szekvenciával rendelkezik.
15. Izolált DNS, amely a 14. igénypont szerinti DNS-sel szigorú feltételek között hibridizál, és (I-a) vagy (I-b) vegyületből a (Il-a) vagy (ΙΙ-b) vegyület előállítására képes fehérjét kódolja.
16. A 15. igénypont szerinti DNS, amely a 41., 43. vagy 44. számú nukleotid szekvenciával rendelkezik.
17. Izolált DNS, amely az 1-12. igénypontok bármelyike sze rinti fehérjét kódolja.
18. A 15. igénypont szerinti DNS, ahol az (I-a) vegyületet a (IH-a) vegyület, az (I-b) vegyületet a (IH-b) vegyület, a (Il-a) vegyületet a (IV-a) vegyület és a (Il-b) vegyületet a (IV-b) vegyület helyettesíti.
19. A 15. igénypont szerinti DNS, ahol az (I-a) vegyületet az (V-a) vegyület, az (I-b) vegyületet az (V-b) vegyület, a (IIa) vegyületet a (Vl-a) vegyület és a (Il-b) vegyületet a (Vl-b) vegyület helyettesíti.
20. A 15. igénypont szerinti DNS, ahol az (I-a) vegyületet a (VH-a) vegyület, az (I-b) vegyületet a (VH-b) vegyület, a (II — a) vegyületet a (VIII-a) vegyület és a (Il-b) vegyületet a (VIII-b) vegyület helyettesíti.
21. Rekombináns DNS vektor, amely a 14-20. igénypontok bármelyike szerinti DNS-t tartalmazza.
22. Transzformáns, amelyet egy 21. igénypont szerinti rekombináns DNS vektornak gazdasejtbe történő bevezetésével kapunk.
23. A 22. igénypont szerinti transzformáns, ahol a transzformáns egy Escherichia , Bacillus, Corynebactéri urn vagy Streptomyces nemzetséghez tartozó mikroorganizmus.
24. A 22. vagy 23. igénypont szerinti transzformáns, ahol a transzformáns egy, az Escherichia coli, Bacillus subtilis, Bacillus megateríum, Corynebacterium glutamicum, Corynebacterium ammoniagenes, Corynebacterium callunae vagy Streptomyces lividans fajhoz tartozó mikroorganizmus.
25. Eljárás (Il-a) vagy (Il-b) vegyület előállítására, mely ben a 22-24. igénypontok bármelyike szerinti transzformánst, a transzformáns tenyészetét vagy a tenyészet kezelt termékét enzim forrásként alkalmazzuk, azzal jellemezve, hogy biztosítjuk az (I-a) vagy (I-b) vegyület létezését vizes közegben;

hagyjuk, hogy a (Il-a) vagy (Il-b) vegyület az említett vizes közegben megképződjön és felhalmozódjon; és a (Il-a) vagy (Il-b) vegyületet az említett vizes közegből öszszegyűjtjük.
26. Eljárás (IV-a) vagy (IV-b) vegyület előállítására, melyben a 22-24. igénypontok bármelyike szerinti transzformánst, a transzformáns tenyészetét vagy a tenyészet kezelt termékét enzim forrásként alkalmazzuk, azzal jellemezve, hogy a (IH-a) vagy (IH-b) vegyületet vizes közegbe helyezzük;

a (IV-a) vagy (IV-b) vegyületet az említett vizes közegben előállítjuk és felhalmozzuk; és a (IV-a) vagy (IV-b) vegyületet az említett vizes közegből öszs zegyűj tj ük.
27. Eljárás (Vl-a) vagy (Vl-b) vegyületek előállítására, melyben a 22-24. igénypontok bármelyike szerinti transzformánst, a transzformáns tenyészetét vagy a tenyészet kezelt termékét enzim forrásként alkalmazzuk, azzal jellemezve, hogy az (V-a) vagy (V-b) vegyületet vizes közegbe helyezzük;

a (Vl-a) vagy (Vl-b) vegyületet az említett vizes közegben előállítjuk és felhalmozzuk; és a (Vl-a) vagy (Vl-b) vegyületet az említett vizes közegből ösz szegyűjtjük.
28. Eljárás (VIII-a) vagy (VIII-b) vegyületek előállítására, melyben a 22-24. igénypontok bármelyike szerinti transzformánst, a transzformáns tenyészetét vagy a tenyészet kezelt termékét enzim forrásként alkalmazzuk, azzal jellemezve, hogy a (Vll-a) vagy (Vll-b) vegyületet vizes közegbe helyezzük;

a (VIII-a) vagy (VIII-b) vegyületet az említett vizes közegben előállítjuk és felhalmozzuk; és a (VIII-a) vagy (VIII-b) vegyületet az említett vizes közegből összegyűjtjük.
29. A 25. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a (Il-a) vegyület lakton formává alakításával kapjuk a (Il-b) vegyületet.
30. A 25. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a (ΙΙ-b) vegyület lakton gyűrűjének felnyitásával kapjuk a (Il-a) vegyületet.
31. A 26. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a (IV-a) vegyület lakton formává alakításával kapjuk a (IV-b) vegyületet.
32. A 26. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a (IV-b) vegyület lakton gyűrűjének felnyitásával kapjuk a (IV-a) vegyületet.
33. A 27. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a (Vl-a) vegyület lakton formává alakításával kapjuk a (Vl-b) vegyületet.
34. A 27. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a (Vl-b) vegyület lakton gyűrűjének felnyitásával kapjuk a (Vl-a) vegyületet.

«...
35. A 28. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a (VIII-a) vegyület lakton formává alakításával kapjuk a (VIII-b) vegyületet.
36. A 28. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a (VIII-b) vegyület lakton gyűrűjének felnyitásával kapjuk a (VIII-a) vegyületet.
37. A 25-28. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a transzformáns tenyészetének kezelt termékeit tenyésztett sejtekből választjuk ki; ilyen kezelt termékek a szárított sejtek, fagyasztva szárított sejtek, felületaktív anyaggal kezelt sejtek, enzimmel kezelt sejtek, ultrahanggal kezelt sejtek, mechanikai őrléssel kezelt sejtek, oldószerrel kezelt sejtek; a sejt fehérje frakciója; és a sejtek vagy a kezelt sejtek immobilizált termékei.
38. Eljárás fehérje előállítására, azzal jellemezve, hogy a 22-24. igénypontok bármelyike szerinti transzformánst tápközegben tenyésztjük; így az 1-12. igénypontok bármelyike szerinti fehérjét termeljük és felhalmozzuk a tenyészetben; és az említett fehérjét összegyűjtjük a tenyészetből.
39. Oligonukleotid, mely megfelel 5-60 egymást követő nukleotidnak a 2., ben; vagy egy, az ciájának megfelelő 41., 43. vagy 44. nukleotidszekvencia egyikéemlitett oligonukleotid komplementer szekvenoligonukleotid. A meghatalmazott: _{z z} < / Soni<^|4^aé;--- /;··' y'’ / '7 ................szabadalmi ügyvivő / w. S.B.G. & K. Szabadalmi Ügyvivői Iroda o tagja H-1062 Budapest, Andrássy út 113. T Z.v - Telefon: 461-1000 Fax: 461-1099