CZ20012728A3

CZ20012728A3 - Způsob výroby inhibitorů HMG-CoA reduktasy

Info

Publication number: CZ20012728A3
Application number: CZ20012728A
Authority: CZ
Inventors: Hirofumi Endo; Yoshiyuki Yonetani; Hiroshi Mizoguchi; Shin-Ichi Hashimoto; Akio Ozaki
Original assignee: Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd.
Priority date: 1999-01-29
Filing date: 2000-01-28
Publication date: 2002-02-13
Also published as: KR20010108139A; EP1148122B1; DE60042879D1; EP1148122A4; US20090148916A1; HK1040530A1; HUP0105145A3; EP1148122A1; US7897370B2; ATE441702T1; AU2321600A; US7470528B2; US20080261273A1; HUP0105145A2; WO2000044886A1; CA2360080A1; CN1329508C; US20060154348A1; IL144526A0; US7049111B1

Description

Oblast techniky

Předkládaný vynález se týká DNA, která souvisí s produkcí sloučenin, které inhibují hydroxymethylglutaryl CoA (HMG-CoA) reduktasu a které snižují sérový cholesterol, a způsoby přípravy uvedených sloučenin pomocí této DNA.

Dosavadní stav techniky

Je známo, že sloučenina vzorce (Vl-a) (dále sloučenina (Vlaj )

(VI-a) kde R¹ znamená atom vodíku, substituovaný nebo nesubstituovaný alkyl nebo alkalický kov; nebo laktonová forma sloučeniny (VI-a) představovaná vzorcem (Vl-b) (dále sloučenina (Vl-b)):

(VI“b)

inhibují HMG-CoA reduktasu a snižuji sérový cholesterol (The Journal of Antibiotics 29: 1346 (1976)).

Existuje několik prací týkajících se způsobu přípravy sloučeniny (Vl-a) nebo sloučeniny (Vl-b) ze sloučeniny vzorce (V-a) (dále sloučenina V-a)):

kde R¹ má stejnou definici, jako výše; nebo laktonové formy sloučeniny (V-a) představované vzorcem (V-b) (dále sloučenina (V-b)):

(v-b) pomocí mikroorganismů.

Konkrétně, Japonská patentová přihláška (Kokai) č. 5750894 popisuje způsob, který využívá filamentosní houby; jak Japonská patentová přihláška (Kokai) č. 7-184670, tak Mezinárodní patentová přihláška WO 96/40863 popisují způsob, který využívá Actinomycetes; a Japonský patent č. 2672551 popisuje způsob, který využívá rekombinantních Actinomycetes Je vsak známo, že protože filamentosní houby a Aktinomycety rostoucí ve filamentosní formě pomocí elongace hyfů, zvyšuje • · · · · · • · * · ·· ·· · • · · · · · se viskozita kultury ve fermentačních nádobách.

Toto často způsobuje nedostatek kyslíku v kultuře a protože se kultura stává heterogenní, mají reakce tendenci k redukci. Pro vyřešení tohoto nedostatku kyslíku a zachování homogenity kultury se musí zvýšit rychlost třepání fermentační nádoby, ale tím dojde ke tření hyfů a nakonec se snižuje aktivita mikroorganismů (Basic Fermentation Engineering (Hakko Kogaku no Kiso) str. 169-190, P.F. Stansbury, A. Whitaker, japan Scientifics Societies Press (1988)).

Podstata vynálezu

Předmětem předkládaného vynálezu je získání DNA kódující novou hydroxylasu, a průmyslově výhodný způsob přípravy sloučeniny, která inhibuje HMG-CoA reduktasu a snižuje sérovou koncentraci cholesterolu.

Předkladatelé vynálezu předpokládají, že když bude moci být hydroxylace sloučeniny (I-a) nebo sloučeniny (I-b) provedena pomocí mikroorganismu netvořícímu hyfy, nebudou přítomny nevýhody jako je snížení účinnosti reakce v důsledku heterogenity kultury způsobené tvorbou hyfů a toto bude průmyslově výhodné. Tak došli předkladatelé vynálezu po důkladném výzkumu k předkládanému vynálezu.

Předkládaný vynález se tedy týká následujících bodů (1) až (39) .

Dále ve vzorcích znamená R¹ atom vodíku, substituovaný nebo nesubstituovaný alkyl nebo alkalický kov; a R znamená substituovaný nebo nesubstituovaný alkyl nebo substituovaný nebo nesubstituovaný aryl, pokud není uvedeno jinak.

Vynález se tedy týká:

(1) Proteinu odvozeného od mikroorganismu náležícího do rodu Bacillus, který je aktivní při produkci sloučeniny (II-a) nebo sloučeniny (ΙΙ-b) ze sloučeniny (I-a) nebo ze sloučeniny (Ib), kde sloučenina (I-a) je sloučenina representovaná vzorcem (I-a):

sloučenina (I-b) je laktonová forma sloučeniny (I-a) a je representovaná vzorcem (I—b):

OH

G-b) sloučenina (II-a) je sloučenina representovaná vzorcem (II-a):

Ola) sloučenina (II-b) je laktonová forma sloučeniny (Il-a) a je representovaná vzorcem (II—to) :

(2) Proteinu odvozeného od mikroorganismu náležícího do rodu Bacillus, který je aktivní při produkci sloučeniny (IV-a) nebo sloučeniny (IV-b) ze sloučeniny (IlI-a) nebo ze sloučeniny (ΙΙΙ-b), kde sloučenina (IlI-a) je sloučenina representovaná vzorcem (IlI-a) :

(ΙΠ-a) sloučenina (ΙΙΙ-b) je laktonová forma sloučeniny (IlI-a) a je representovaná vzorcem (ΙΙΙ-b):

sloučenina (IV-a) je sloučenina representovaná vzorcem (IV-a):

(IV-a) sloučenina (IV-b) je laktonová forma sloučeniny (IV-a) a je representovaná vzorcem (IV-b):

(3) Proteinu odvozeného od mikroorganismu náležícího do rodu Bacillus, který je aktivní při produkci sloučeniny (Vl-a) nebo sloučeniny (Vl-b) ze sloučeniny (V-a) nebo ze sloučeniny (Vb), kde sloučenina (V-a) je sloučenina representovaná vzorcem (V-a) :

sloučenina (V-b) je laktonová forma sloučeniny (V-a) a je representovaná vzorcem (V-b):

(V-b) sloučenina (Vl-a) je sloučenina representovaná vzorcem (Vl-a):

(Vl-a) sloučenina (Vl-b) je laktonová representovaná vzorcem (VI-b):

forma sloučeniny (Vl-a) a je

(VI-b) (4) Proteinu odvozeného od mikroorganismu náležícího do rodu ♦· · · ** ···· · · · · ·«· • · · · · · · ··· · · · · · ·· ···· ··· ··· ·· ·*·

Bacillus, který je aktivní při produkci sloučeniny (VlII-a) nebo sloučeniny (VlII-b) ze sloučeniny (VlI-a) nebo ze sloučeniny (VII-b), kde sloučenina (VlI-a) je sloučenina representovaná vzorcem (VlI-a):

(Vila) sloučenina (VII-b) je laktonová forma sloučeniny (VlI-a) a je representovaná vzorcem (VII-b):

(VII-b) sloučenina (VlII-a) je sloučenina representovaná vzorcem (VlII-a):

(VIII a) ; a sloučenina (VHI-b) je laktonová forma sloučeniny (VIII-a) a je representovaná vzorcem (VlII-b):

(Vin-b) (5) Protein podle jakéhokoliv z bodů (1) až (4) uvedených výše, kde mikroorganismus náležící do rodu Bacillus je mikroorganismus vybraný ze skupiny zahrnující B. subtilis., B. megarerium, B. laterosporus, B. sphaericus, B. pumilus, B. stearothermophilus, B. ceres, B. badius, B. brevis, B. alvei, B. circulans a B. macerans.

(6) Protein podle jakéhokoliv z bodů (1) až (5) uvedených výše, kde mikroorganismus náležící do rodu Bacillus je mikroorganismus vybraný ze skupiny zahrnující B. subtilis ATCC6051, B. megaterium ATCC10778, B. megaterium ATCC115627, B. megaterium ATCC13402, B. megaterium ATCC15177, B. megaterium ATCC15450, B. megaterium ATCC19213, B. megaterium IAMI032, B. laterosporus ATCC4517, B. pumilus FERM BP-2064, B. badius ATCC14574, B. brevis NRRL B-8029, B. alvei ATCC6344, B. circulans NTCT-2610 a B. macerans NCIMB-9368.

(7) Protein podle jakéhokoliv z bodů (1) až (7) uvedených výše, kde mikroorganismus náležící do rodu Bacillus je mikroorganismus vybraný ze skupiny zahrnující Bacillus sp. FERM BP-6029 nebo Bacillus sp. FERM BP-6030.

(8) Protein mající aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 1.

(9) Protein mající aminokyselinovou sekvenci obsahující delece, substituce nebo adice jedné nebo více aminokyselin v aminokyselinové sekvenci SEQ ID NO: 1, který je aktivní v produkci sloučeniny (II-a) nebo sloučeniny (II-b) ze sloučeniny (I-a) nebo sloučeniny (I-b).

(10) Protein podle bodu (9) výše, který má aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 42 nebo 45.

(11) Protein podle bodu (9), kde sloučenina (I-a) je

sloučenina	(IlI-a), sloučenina (I-b) je sloučenina (ΙΙΙ-b),
sloučenina	(II-a) je sloučenina (IV-a) a sloučenina (II-b) je
sloučenina	(IV-b).

(12) Protein podle bodu (9), kde sloučenina (I-a) je

sloučenina	(V-a), sloučenina (I-b) je sloučenina (V-b),
sloučenina	(II-a) je sloučenina (Vl-a) a sloučenina (II-b) je
sloučenina	(Vl-b).

(13) Protein podle bodu (9), kde sloučenina (I-a) je sloučenina (VlI-a), sloučenina (I-b) je sloučenina (VlI-b), sloučenina (II-a) je sloučenina (VlII-a) a sloučenina (II-b) je sloučenina (VlII-b).

(14) Izolovaná DNA mající nukleotidovou sekvenci uvedenou v SEQ ID NO: 2.

(15) Izolovaná DNA hybridizující s DNA podle bodu (14ú za přísných podmínek, která kóduje protein mající aktivitu v produkci sloučeniny (II-a) nebo sloučeniny (II-b) ze ···· ·· · · ··· • · · · · · φ sloučeniny (I-a) nebo ze sloučeniny (I-b).

(16) DNA podle bodu (15),která má nukleotidovou sekvenci vybranou ze skupiny zahrnující nukleotidové sekvence uvedené v SEQ ID NO: 41, 43 a 44.

(17) Izolovaná DNA kódující protein podle jakéhokoli z bodů (1) až (12) .

(18) DNA podle bodu (15), kde sloučenina (I-a) je sloučenina (ΙΙΙ-a), sloučenina (I-b) je sloučenina (ΙΙΙ-b), sloučenina (ΙΙ-a) je sloučenina (IV-a) a sloučenina (ΙΙ-b) je sloučenina (IV-b).

(19) DNA podle bodu (15), kde sloučenina (I-a) je sloučenina (V-a), sloučenina (I-b) je sloučenina (V-b), sloučenina (Il-a) je sloučenina (Vl-a) a sloučenina (ΙΙ-b) je sloučenina (Vl-b).

(20) DNA podle bodu (15), kde sloučenina (I-a) je sloučenina (VlI-a), sloučenina (I-b) je sloučenina (VlI-b), sloučenina (ΙΙ-a) je sloučenina (VlII-a) a sloučenina (II-b) je sloučenina (VlII-b).

(21) Rekombinantní DNA vektor obsahující DNA podle jakéhokoliv z bodů (14) až (20).

(22) Transformant získaný vložením rekombinantního DNA vektoru podle bodu (21) do hostitelské buňky.

(23) Transformant podle bodu (22), kde transformant náleží k mikroorganismům vybraným z rodů Escherichia, Bacillus, Corynebacterium a Streptomyces.

···· · · ·· ···· ·· ·« · · · • · · · · · · (24) Transformant podle bodu (22) nebo (23), kde transformant náleží k mikroorganismům vybraným z Escherichia coli, Bacillus subtilis, Bacillus megaterium, Corynebacterium glutamicum, Corynebacterium amminiagenes, Corynebacterium callunae a Streptomyces lividans.

(25) Způsob výroby sloučeniny (ΙΙ-a) nebo sloučeniny (Il-b), kde se transformant podle jakéhokoliv z bodů (22) až (24), kultura transformantu nebo zpracovaný produkt kultury použije jako zdroj enzymu, a způsob zahrnuje:

- umožnění existence sloučeniny (I-a) nebo sloučeniny (I-b) ve vodném mediu;

- umožnění produkce a akumulace sloučeniny (ΙΙ-a) nebo sloučeniny (ΙΙ-b) v uvedeném vodném mediu; a

- odebrání sloučeniny (ΙΙ-a) nebo sloučeniny (ΙΙ-b) z uvedeného vodného media.

(26) Způsob výroby sloučeniny (IV-a) nebo sloučeniny (IV-b), kde se transformant podle jakéhokoliv z bodů (22) až (24), kultura transformantu nebo zpracovaný produkt kultury použije jako zdroj enzymu, a způsob zahrnuje:

- umožnění existence sloučeniny (IlI-a) nebo sloučeniny (IIIb) ve vodném mediu;

- umožnění produkce a akumulace sloučeniny (IV-a) nebo sloučeniny (IV-b) v uvedeném vodném mediu; a

- odebrání sloučeniny (IV-a) nebo sloučeniny (IV-b) z uvedeného vodného media.

(27) Způsob výroby sloučeniny (Vl-a) nebo sloučeniny (Vl-b), kde se transformant podle jakéhokoliv z bodů (22) až (24), kultura transformantu nebo zpracovaný produkt kultury použije jako zdroj enzymu, a způsob zahrnuje:

- umožnění existence sloučeniny (V-a) nebo sloučeniny (V-b) ve vodném, mediu;

- umožnění produkce a akumulace sloučeniny (Vl-a) nebo sloučeniny (Vl-b) v uvedeném vodném mediu; a odebrání sloučeniny (Vl-a) nebo sloučeniny (Vl-b) z uvedeného vodného media.

(28) Způsob výroby sloučeniny (VlII-a) nebo sloučeniny (VIIIb), kde se transformant podle jakéhokoliv z bodů (22) až (24), kultura transformantu nebo zpracovaný produkt kultury použije jako zdroj enzymu, a způsob zahrnuje:

- umožnění existence sloučeniny (VlI-a) nebo sloučeniny (VIIb) ve vodném mediu;

- umožnění produkce a akumulace sloučeniny (VlII-a) nebo sloučeniny (VlII-b) v uvedeném vodném mediu; a odebrání sloučeniny (VIII-a) nebo sloučeniny (VlII-b) z uvedeného vodného media.

(29) Způsob podle bodu (25), kde sloučenina (ΙΙ-b) je sloučenina (ΙΙ-b) získaná přípravou laktonu ze sloučeniny (Ha) .

(30) Způsob podle bodu (25) , kde sloučenina (ΙΙ-a) je sloučenina (ΙΙ-a) získaná otevřením laktonového kruhu sloučeniny (ΙΙ-b).

(31) Způsob podle bodu (26) , kde sloučenina (IV-b) je sloučenina (IV-b) získaná přípravou laktonu ze sloučeniny (IVa).

(32) Způsob podle bodu (26), kde sloučenina (IV-a) je sloučenina (IV-a) získaná otevřením laktonového kruhu sloučeniny (IV-b).

···· · · ·· • · · · · · ·· · · · • · · · · · · (33) Způsob podle bodu (27), kde sloučenina (VI-b) je sloučenina (VI-b) získaná přípravou laktonu ze sloučeniny (Via).

(34) Způsob podle bodu (27), kde sloučenina (Vl-a) je sloučenina (Vl-a) získaná otevřením laktonového kruhu sloučeniny (VI-b).

(35) Způsob podle bodu (28), kde sloučenina (VlII-b) je sloučenina (VlII-b) získaná přípravou laktonu ze sloučeniny (Vlila) .

(36) Způsob podle bodu (28), kde sloučenina (VlII-a) je sloučenina (VlII-a) získaná otevřením laktonového kruhu sloučeniny (VlII-b).

(37) Způsob podle jakéhokoliv z bodů (25) až (28), kde zpracovaný produkt kultury transformantů je produkt vybraný ze skupiny zahrnující: kultivované buňky; zpracovaných produktů jako jsou sušené buňky, lyofilizované buňky, buňky ošetřené surfaktantem, buňky ošetřené enzymem, buňky zpracované ultrasonikací, buňky zpracované mechanickým mletím, buňky zpracované rozpouštědlem; proteinovou frakci buněk; a zmobilizované produkty buněk nebo zpracovaných buněk.

(38) Způsob výroby proteinu, který zahrnuje kultivaci transformantů podle jakéhokoliv z bodů (22) až (24) v mediu; produkci a akumulaci proteinu podle jakéhokoliv z bodů (1) až (12) v kultuře; a odběr uvedeného proteinu z uvedené kultury.

(39) Oligonukleotid odpovídající sekvenci skládající se z 5 až 60 sousedních nukleotidů v nukleotidové sekvenci vybrané ze skupiny zahrnující nukleotidové sekvence uvedené v SEQ ID NO:

···· · · ·· • · · · ·· ·· · · · • · · · · · · • · ·« · ···· • · · · · · 9

9999 999 999 99 9

2, 41, 43 a 44; nebo oligonukleotid odpovídající komplementární sekvenci k uvedenému oligonukleotidu.

Předkládaný vynález bude nyní podrobněji popsán dále.

1. Získání yjiB genu

DNA podle předkládaného vynálezu může být získána PCR metodou (Science 230, 1350 (1985)) za použití informace o genomové nukleotidové sekvenci chromosomu Bacillus subtilis, která již byla stanovena http.//www.pasteur.fr.

Bio/SubtiList.html a informace o yjiB genu Bacillus subtilis získané z uvedené genomové nukleotidové sekvence.

Přesněji, DNA podle předkládaného vynálezu může být získána následujícím způsobem.

Bacillus subtilis (například B. subtilis ATCC 15563) se kultivuje obvyklým způsobem v mediu vhodném pro B. subtilis, například v LB kapalném mediu (obsahujícím Bacto Trypton (Difco) 10 g, kvasinkový extrakt (Difco) 5 g a NaCl 5 g v 1 1 vody; pH 7,2). Po kultivaci se buňky získají z kultury odstředěním.

Chromosomální DNA se izoluje ze získaných buněk známým způsobem (například podle Molecular Cloning, 2. vydání).

Podle nukleotidové sekvence uvedené v SEQ ID NO: 2 se na DNA syntezátoru syntetizují kódující a protismyslné primery obsahující nukleotidóvou sekvenci odpovídající DNA regionu kódujícímu protein podle předkládaného vynálezu.

Po amplifikaci PCR je pro umožnění vkládání uvedených

amplifikovaných DNA fragmentů do plasmidu výhodné, aby byla na 5' konec kódujících a protismyslných primerů vložena vhodná restrikční místa, jako je BamHI, EcoRI a podobně.

Příklady kódujících a protismyslných primerů zahrnují kombinace DNA mající nukleotidové sekvence uvedené v SEQ ID NO: 13 a 14.

Za použití chromosomální DNA jako templátu se PCR provede s těmito primery: TaKaRa LA-PCRTM Kit verze 2 (TaKaRa), ExpandTM High-Fidelity PCR Systém (Boehringer Mannheim) a podobně, na DNA Thermal Cycler (Perkin-Elmer Japan).

Po provedení PCR se postupuje následujícím způsobem. Pokud je primerem DNA fragment velikosti 2 kb nebo méně, skládá se každý cyklus z reakčních kroků 30 sekund při 94 0C, 30 sekund až 1 minuta při 55 °C a 2 minuty při 72 0C. Pokud je primerem DNA fragment velikosti více než 2 kb, skládá se každý cyklus z reakčních kroků 20 sekund při 98 °C a 3 minuty při 68 0C. V každém případě se PCR provede za podmínek, při kterých se opakuje 30 cyklů, a potom se reakce provede po dobu 7 minut při 72 0C.

Amplifikované DNA fragmenty se štěpí ve stejných restrikčních místech, jako jsou místa vytvořená ve výše uvedených primerech, a DNA fragmenty se frakcionují a získají se metodou jako je například elektroforéza na agarosovém gelu, ultracentrifugace na gradientu sacharosy a podobně.

Pomocí získaných DNA fragmentů se připraví obvyklými způsoby klonovací vektor (jako jsou způsoby popsané v Molecular Cloning 2. vydání, Current Protocols in Molecular Biology, Supplement 1-38] John Wiley & Sons (1987-1997) (dále

Current Protocols in Molecular Biology, Supplement), DNA Cloning 1: Core Techniques: A Practical Approach, druhé vydáni, Oxford University Press (1995), nebo za použití komerčně dostupného kitu, jako je SuperScript Plasmid Systém for cDNA Synthesis a Plasmid Cloning (Life Technologies), ZAPcDNA Synthesis Kit (Stratagene), atd.), a takto připravený klonovací vektor se použije pro transformaci Escherichia coli, například E.coli DH5a kmen (TOYOBO).

Příklady klonovacích vektorů pro transformaci E. coli zahrnují fágové vektory a plasmidové vektory, pokud se mohou sami replikovat v K12 kmenu E. coli. Expresní vektor pro E. coli může být také použit jako klonovací vektor. Mezi specifické příklady patří ZAP Express (Stratagene, Strategies, 5: 58 (1992)), pBlueScript II SK(+) (Nucleic Acids Research, 17: 9494 (1989)), Lambda UP II (Stratagene), AgtlO, Agtll (DNA Cloning: A Practical Approach, 1, 49 (1985)), ÁTriplEx (Clonetech), ÁExCell (Pharmacia), pT7f318U (Pharmacia), pcD2 (H.Okayama a P.Berg ; Mol. Cell. Biol., 3, 280 (1983)), pMW218 (Wako Pure Chemical Industries), pUC118, pSTV28 (Takara), pEG400 (J. Bac., 172: 2392 (1990)), pHMV1520 (MoBiTec), pQE-30 (QIAGEN), atd.

Plasmid obsahující požadovanou DNA může být získán ze získaného transformovaného kmene obvyklými metodami popsanými například v Molecular Cloning, 2. vydání, Current Protocols in Molecular Biology Supplement, DNA Cloning 1: Core Techniques, A Practical Approach, druhé vydáni a Oxford University Press (1995), atd..

Za použití výše uvedených metod může být získán plasmid obsahující DNA kódující protein, který katalýzuje reakci produkující sloučeninu (ΙΙ-a) nebo sloučeninu (ΙΙ-b) ze ···· · · ·· ···· · · · · ··· 9 9 9 9 9 99

9 9 9 9 99

9999 999 999 99· sloučeniny (I-a) nebo sloučeniny (I-b).

Příklady plasmidů zahrnují výše uvedený pSyjiB.

Kromě výše uvedených metod může být plasmid obsahující DNA kódující protein, který katalyzuje reakci produkující sloučeninu (ΙΙ-a) nebo sloučeninu (ΙΙ-b) ze sloučeniny (I-a) nebo sloučeniny (I-b) získán také metodou, ve které je chromosomální knihovna Bacillus subtilis připravena s vhodným vektorem za použití E. coli jako hostitele a aktivita v produkci sloučeniny (ΙΙ-a) nebo sloučeniny (ΙΙ-b) ze sloučeniny (I-a) nebo sloučeniny (I-b) se měří pro každý kmen této knihovny.

Nukleotidová sekvence výše uvedeného genu může být použita pro získání homologů DNA z prokaryont nebo rostlin stejným způsobem, jako je je způsob popsaný výše.

DNA nebo DNA fragment podle předkládaného vynálezu získaná výše uvedeným způsobem může být použita pro přípravu oligonukleotidů, jako jsou protismyslné oligonukleotidy, kódující oligonukleotidy a podobně, které obsahují část DNA sekvence podle předkládaného vynálezu nebo takové oligonukleotidy obsahující RNA. Alternativně, podle informace o sekvenci výše uvedené DNA mohou být tyto oligonukleotidy syntetizovány na výše uvedeném DNA syntezátoru.

Příklady oligonukleotidů zahrnují DNA mající stejnou sekvenci jako kontinuálních 5 až 60 nukleotidů v nukleotidové sekvenci výše uvedené DNA, nebo DNA mající komplementární sekvenci k výše uvedené DNA.

Příklady uvedených oligonukleotidů zahrnují DNA mající ···· ·· 9 9 9 9 9

9 9 9 9 9 9

9999 9·9 999 99 9 stejnou sekvenci jako kontinuálních 5 až 60 nukleotidů v nukleotidové sekvenci SEQ ID NO: 2, 41, 43 nebo 44, nebo DNA mající komplementární sekvenci k uvedené DNA. Pokud jsou tyto oligonukleotidy použity jako kódující a protismyslné primery, tak se výhodně použijí oligonukleotidy s extrémními rozdíly v teplotě tání (t.t.) a počtu baží. Takovými příklady jsou oligonukleotidy mající nukleotidovou sekvenci uvedenou v SEQ ID NO: 3 až 39.

Dále, deriváty těchto oligonukleotidů (dále označované jako oligonukleotidové deriváty) mohou být také použity jako DNA podle předkládaného vynálezu.

Oligonukleotidové deriváty zahrnují oligonukleotidové deriváty, jejichž fosfo-diesterová vazba byla nahrazena fosforothioatovou vazbou, oligonukleotidové deriváty, jejichž fosfo-diesterová vazba byla nahrazena N3’-P5'-fosfoamidatovou vazbou, oligonukleotidové deriváty, jejichž riboso- a fosfodiesterová vazba byla nahrazena vazbou peptid-nukleová kyselina, oligonukleotidové deriváty, jejichž uráčil byl nahrazen C-5 thiazoluracilem, oligonukleotidové deriváty, jejichž cytosin byl nahrazen C-5 propinylcytosinem, oligonukleotidové deriváty, jejichž cytosin byl nahrazen fenoxazinem modifikovaným cytosinem, oligonukleotidové deriváty, jejichž ribosa byla nahrazena 2'-O-propylribosou, a oligonukleotidové deriváty, jejichž ribosa byla nahrazena 2'methoxy-ethoxyribosou (Saibo Kogaku, 16: 1463 (1997)).

II. Způsob výroby proteinu, který katalyzuje reakci produkující sloučeninu (ΙΙ-a) nebo sloučeninu (ΙΙ-b) ze sloučeniny (I-a) nebo ze sloučeniny (I-b)

Pro expresi výše uvedené DNA v hostitelské buňce se • · ·· ♦ 9 99

9 9 9 9 9 9 9 9 9 9

9 9 9 9 9 9 požadovaný DNA fragment naštěpí na fragment vhodné délky obsahující uvedený gen pomocí restrikčních enzymů nebo DNAsy a potom se fragment vloží do místa za promotorem expresního vektoru a expresní vektor se vloží do hostitelských buněk vhodných pro použití expresního vektoru.

Hostitelskými buňkami mohou být jakékoliv bakterie, kvasinky, živočišné buňky, hmyzí buňky a podobně, pokud mohou exprimovat daný gen.

Jako expresní vektor se použije vektor schopný autonomní replikace v hostitelské buňce nebo vektor schopný integrace do chromosomu, a obsahující promotor v místě vhodném pro transkripci daného genu.

Když jsou jako hostitelské buňky použita prokaryota, jako bakterie, tak je expresním vektorem pro expresi výše uvedené DNA výhodně vektor autonomně replikovatelný v uvedených buňkách a jedná se o rekombinantní vektor obsahující promotor, vazebnou sekvenci pro ribosomy, výše uvedenou DNA a transkripční terminační sekvenci. Může být obsažen gen pro regulaci promotoru.

Mezi expresní vektory patří pBTrp2, pBTac2 (které jsou komerčně dostupné od Boehringer mannheim), pKK233-2 (Pharmacia), pSE280 ( Invitrogen), pGEMEX-1 (Promega), pQE-8 (QIAGEN), pQE-30 (QIAGEN), pKYPlO (Japonská patentová přihláška č. 58-110600), pKYP200 (Agricultural Biological Chemistry, 48, 669 (1984)), pLSAl (Agric. Biol. Chem., 53: 277 (1989)), pGELl [Proč. Nati. Acad. Sci, USA, 82, 4306 (1985)), pBluescriptlI SK( + ), pBluescriptlI SK(-), (Stratagene), pTrS30 (FERM BP-5407), pTrS32 (FERM BP-5408), pGEX (Pharmacia), pET-3 (Novagen), pTerm2 (US 4,686,191, US 4,939,094, US 5,160,735), ···· » · ·· • · · · »9 · · · · · • · · · · · · • · · · · ♦ · ·· »··« ··· ··· ·· 9 pSupex, pUBllO, pTPS, pC194, pUC18 (Gene, 33, 103 (1985)), pUC19 [Gene, 33: 103 (1985)), pSTV28 (Takara), pSTV29 (Takara), pUC118 (Takara), pPAl (Japonská patentová přihláška č. 63-233798), pEG400 [J. Bacteriol. 172, 2392 (1990)), pQE-30 (QIAGEN), PHY300 (Takara), pHW1520 (MoBiTec), atd.

Promotorrem může být jakýkoliv promotor, pokud může být exprimován v hostitelské buňce. Příklady jsou promotory odvozené od E. coli, fágu atd., jako je trp promotor (Ptrp), lac promotor (Plac), PL promotor, PR promotor a PSE promotor a SP01 promotor, SP02 promotor, penP promotor a podobně. Artificiálně navržené a modifikované promotory, jako je Ptrp x 2 promotor obsahující dva Ptrp promotory v tandemu, tac promotor, letí promotor a lacl7 promotor, mohou být také použity. Dále mohou být také použity xylA promotor pro expresi v bakteriích rodu Bacillus nebo P54-6 promotor pro expresi v Corynebacteriích.

Jakákoliv vazebná sekvence pro ribosomy může být použita, pokud pracuje v hostitelské buňce, a výhodně je použit plasmid, ve kterém je vzdálenost mezi Shine-Dalgarnovou sekvencí a iniciačním kodonem upravena na vhodnou velikost (například 6 až 18 baží).

Pro účinnou transkripci a translaci může být protein, který katalyzuje reakci produkující sloučeninu (ΙΙ-a) nebo sloučeninu (II-b) ze sloučeniny (I-a) nebo sloučeniny (I-b), jehož N-konec nebo jeho část byly deletovány, fúzován na Nkonec proteinu kódovaného expresním vektorem, a může být exprimován takto získaný fúzní protein. Takovým příkladem je výše uvedený pWyjiB.

Ačkoliv není transkripční terminační sekvence nezbytně • 99

9 9 9 99 99 9 9 9

9 9 9 9 9 9 · · · « · « · ·· ···· ·«· ··· ·· · nutná pro expresi požadované DNA, je výhodné umístit transkripční terminační sekvenci těsně za strukturální gen.

Příklady mikroorganismů zahrnují mikroorganismy náležící do rodu Escherichia, Corynebacterium, Brevibacterium, Bacillus, Microbacterium, Serratia, Pseudomonas, Agrobacterium, Alicyclobacillus, Anabaena, Anacystis, Arthrobacter, Azotobacter, Chromatium, Erwinia, Methylobacterium, Phormidium, Rhodobacter, Rhodopseudomonas, Rhodospirillum, Streptomyces, Synechococcus a Zymomonas, výhodně Escherichia, Corynebacterium, Brevibacterium, Bacillus, Pseudomonas, Agrobacterium, Alicyclobacillus, Anabaena, Anacystis, Arthrobacter, Azotobacter, Chromatium, Erwinia, Methylobacterium, Phormidium, Rhodobacter, Rhodopseudomonas, Rhodospirillum, Streptomyces, Synechococcus a Zymomonas.

Specifickými příklady mikroorganismů jso Escherichia coli XL1 Blue, Escherichia coli XI2-Blue, Escherichia coli DH1, Escherichia coli DH5a , Escherichia coli MC1000, Escherichia coli KY3276, Escherichia coli W1485, Escherichia coli JMI09, Escherichia coli HB101, Escherichia coli č.49, Escherichia coli W3110, Escherichia coli NY49, Escherichia coli MP347, Escherichia coli NM522, Bacillus subtilis ATCC33712, Bacillus megaterium, Bacillus sp. FERM BP-6030, Bacillus amyloliquefacines, Brevibacterium ammmoniagenes, Brevibacterium immariophilum ATCC14068, Brevibacterium saccharolyticum ATCC14066, Brevibacterium flavum ATCC14067, Brevibacterium lactofermentum ATCC13869, Corynebacterium glutamicum ATCC13032, Corynebacterium glutamicum ATCCI4297, Corynebacterium acetoacidophilum ATCC13870, Corynebacterium callunae ATCC15991, Microbacterium ammoniaphilum ATCC15354, Serratia ficaria, Serratia fonticola, Serratia liquefaciens, Serratia marcescens, Pseudomonas sp. D-O110, Agrobacterium ·· ·· 9 9 99 9

9 9 · 9 9 99 9 999

9 9 9 9 9 9 9

9 9 9 9 9 9 9 9 9

9 9 9 9 9 9 9

9999 999 999 99 999 radiobacter, Agrobacterium rhizogenes, Agrobacterium rubi, Anabaena cylindrical, Anabaena doliolum, Anabaena flos-aquae, Arthrobacter aurescens, Arthrobacter citreus, Arthrobacter globíormis, Arthrobacter hydrocarboglutamicus, Arthrobacter mysorens, Arthrobacter nicotianae, Arthrobacter paraffineus, Arthrobacter protophormiae, Arthrobacter roseoparaffinus, Arthrobacter sulfurous, Arthrobacter ureafaciens, Chromatium buderi, Chromatium tepidum, Chromátium vinosum, Chromátium warmingii, Chromatium fluviatile, Erwinia uredovora, Erwinia carotovora, Erwinia ananas, Erwiinia herbicola, Erwinia punctata, Erwinia terreus, Methylobacterium rhodesianum, Methylobacterium extorquens, Phormidium sp. ATCC29409, Rhodobacter capsulatus, Rhodobacter sphaeroides, Rhodopseudomonas blastica, Rhodopseudomonas marina, Rhodopseudomonas palustris, Rhodospirillum rubrum, Rhodospirillum salexigens, Rhodospirillum salinarum, Strepromyces ambofaciens, Streptomyces aureofaciens, Streptomyces aureus, Streptomyces fungicidicus, Streptomyces griseochromogenes, Streptomyces griseus, Streptomyces lividans, Streptomyces olivogriseus, Streptomyces rameus, Streptomyces tanashiensis, Streptomyces vinaceus a Zymomonas mobilis.

Způsobem pro vkládání rekombinantního vektoru může být jakýkoliv způsob pro vkládání DNA do hostitelských buněk popsaných výše. Například může být uveden způsob využívající ionty vápníku (Proč. Nati. Acad Sci. USA, 69: 2110 (1972)), a protoplastová metoda (Japonská patentová přihláška č. 63248394), elektroporační metoda a metoda popsaná v Gene, 17: 107 (1982) a Molecular & Generál Genetics, 168: 111 (1979), a podobně.

Pokud jsou jako hostitelské buňky použity kvasinky, mohou

9« * * ·· • · · · · · · · · · · • · · · · 9 9 ·· 9999 999 999 99 9 být použity expresní vektory jako je YEpl3 (ATCC37115), YEp24 (ATCC37051), YCp50 (ATCC37419), pHS19 a pHS15.

Může být použit jakýkoliv promotor, pokud je exprimován v kvasinkách. Například mohou být použity promotory jako je PHO5 promotor, PGK promotor, GAP promotor, ADH promotor, gal 1 promotor, gal 10 promotor, promotor proteinu tepelného šoku, MFal promotor a CUP 1 promotor.

Příklady hostitelských buněk jsou Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Kluyveromyces lactis, Trichosporon pullulans a Schwanniomyces alluvius.

Způsobem pro vkládání rekombinantního vektoru může být jakýkoliv způsob pro vkládání DNA do kvasinek, včetně elektroporace (Methods Enzymol., 194: 182 (1990)), sféroplastový způsob (Proč. Nati. Acad Sci. USA, 75: 1929 (1978)), způsob využívající octan lithný (J. Bacteriol., 153: 163 (1983)) a způsob popsaný v Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 75: 1929 (1978).

Když jsou jako hostitelské buňky použity živočišné buňky, tak mohou být použity expresní vektory jako je pcDcDNAI, pcDM8 (Funakoshi), pAGE107 (Japonská patentová přihláška č. 322979; Cytotechnology, 3: 133 (1990)), pAS3-3 (Japonská patentová přihláška č. 2-227075), pCDM8 [Nátuře, 329:, 840 (1987)), pcDNAI/Amp (Invitrogen), pREP4 (Invitrogen), pAGElO3 [J. Biochem., 101: 1307 (1987)) a pAGE210.

Může být použit jakýkoliv promotor, pokud je exprimován v živočišných buňkách. Například může být použit promotor pro IE (bezprostřední časný) gen cytomegaloviru (lidský CMV), SV 40 časný promotor, retrovirový promotor, metallothioneinový • v ·· *4 ·♦ • · * 9 · 9 9 9 9 9 9

9 9 9 9 9 9 ··· * · · * · · ·· ··*.· >«· ··* *· « promotor, promotor proteinu teplotního šoku, Sra promotor a podobně. Společně s promotorem může být také použit zesilovač transkripce IE genu lidského CMV.

Příklady živočišných buněk jsou Namalwa buňky, HBT5637 (Japonská patentová přihláška č. 63-299), COSI buňky, COS7 buňky, CHO buňky a podobně.

Způsobem pro vkládáni rekombinantniho vektoru do živočišných buněk může být jakýkoliv způsob pro vkládáni DNA do živočišných buněk, včetně elektroporace (Cytotechnology, 3: 133 (1990)), způsob využívající fosforečnanu vápenatého (Japonská patentová přihláška č. 2-227075), lipofekční metoda [Proč. Nati. Acad. Sci., USA, 84; 7413 (1987)), metoda popsaná ve Virology, 52: 456 (1973), a podobně. Získání a kultivace transformantů může být provedena způsobem podle Japonské patentové přihlášky č. 2-227075 nebo Japonské patentové přihlášky č. 2-257891.

Pokud jsou jako hostitelské buňky použity hmyzí buňky, může být protein exprimován způsoby popsanými v Baculovirus Expression Vectors, A Laboratory Manual, Current Protocols in Molecular Biology Supplement 1-38 (1987-1997); Bio/Technology 6: 47 (1988) a podobně.

V tomto případě jsou rekombinantní genový přenosový vektor a bakulovirus současně transfektovány do hmyzích buněk za zisku rekombinantniho viru v supernatantu kultury hmyzích buněk a potom jsou hmyzí buňky infikovány rekombinantním virem a exprimují protein.

Příklady genových přenosových vektorů použitých v tomto způsobu zahrnují pVL1392, pVL1393 a pBlueBacIII (všechny od

		99		A
»	•	« 4	»·		• ·
•	•	•	•	•	• ·
•	•	•	•	•	• «
··		• ••a		···		1

Invitrogen).

Kromě bakuloviru je také možno použit například virus jaderné polyhedrosi Autgrapha californica, t.j. viru, který infikuje hmyz rodu Barathra.

Jako hmyzí buňky je možno použít Sf9, Sf21 (Baculovirus Expression vectors, A laboratory Manual, W.H. Freeman and Company, New York (1992), což jsou oocyty Spodoptera frugiperda, a High 5 (Invitrogen), což jsou oocyty Trichoplusia ni, a podobně.

Jako metoda současné transfekce výše uvedeného rekombinantního genového přenosového vektoru a výše uvedeného bakuloviru do hmyzích buněk pro přípravu rekombinantního viru může být použita metoda využívající fosforečnanu vápenatého (Japonská patentová přihláška č. 2-227075), lipofekční metoda (Proč. Nati. Acad. Sci. USA 84: 7413 (1987) a podobně.

Jako metoda pro expresi genu může být kromě přímé exprese provedena sekreční produkce, exprese ve fúzním proteinu a podobně, způsobem podle Molecular Clning, 2. vydání.

Když je protein exprimován ve kvasinkách, živočišných buňkách nebo hmyzích buňkách, může být získán protein, ke kterému je přidán sacharid nebo sacharidový řetězec.

Takto získaný transformant se kultivuje v mediu za produkce a akumulace proteinů, které katalyzují reakci produkující sloučeninu (ΙΙ-a) nebo sloučeninu (II-b) ze sloučeniny (I-a) nebo ze sloučeniny (I-b) v kultuře, a proteiny se získají z kultury za zisku proteinu, který katalýzuje reakci produkující sloučeninu (ΙΙ-a) nebo sloučeninu (II-b) ze sloučeniny (I-a) • · · 9 ··

999« 99 999 • 9 9 9 9· nebo ze sloučeniny (I-b).

Jako způsob pro kultivaci transformantů v mediu za účelem produkce proteinu podle předkládaného vynálezu, který katalyzuje reakci produkující sloučeninu (ΙΙ-a) nebo sloučeninu (Il-b) ze sloučeniny (I-a) nebo ze sloučeniny (Ib), mohou být použity běžné způsoby používané pro kultivaci transformantů v hostitelské buňce.

Pokud je transformantem podle předkládaného vynálezu prokaryotický organismus, jako je E. coli, nebo eukaryotický organismus, jako je kvasinka, tak může být mediem pro kultivaci těchto organismů přirozené nebo syntetické medium, pokud obsahuje zdroj uhlíku, zdroj dusíku, anorganické sole a podobně, které mohou být asimilovány uvedeným organismem, a pokud umožňuje účinnou kultivaci transformantů.

Jako zdroj uhlíku může být použit jakýkoliv zdroj uhlíku, pokud může být asimilován mikroorganismem, včetně uhlovodanů jako je glukosa, fruktosa, sacharosa, nebo melasy obsahující tyto zdroje, škrob nebo hydrolyzáty škrobu; organické kyseliny jako je kyselina octová, kyselina propionová; a alkoholy jako je ethanol, propanol.

Jako zdroj dusíku může být použit amoniak, ammoniové soli různých anorganických a organických kyselin, jako je chlorid amonný, síran amonný, octan amonný a fosforečnan amonný; jiné sloučeniny obsahující dusík; a pepton, masový extrakt, kvasinkové extrakty, výluh z kukuřice, hydrolyzáty kaseinu, sojová moučka, hydrolyzáty sojové moučky, různé fermentováné buňky a jejich hydrolyzáty a podobně,

Příklady anorganických substancí zahrnují ···· · · · · ··*· ·· · · ··· • · « · · · · dihydrogenfosforečnan draselný, hydrogenfosforečnan draselný, síran horečnatý, chlorid sodný, síran železnatý, síran manganičitý, síran měďnatý a uhličitan vápenatý.

Kultivace se provede za anaerobních podmínek za třepání kultury nebo třepání provzdušňováním kultury a podobně. Kultivační teplota je výhodně 15 až 50 °C a kultivační doba je výhodně 16 hodin až 7 dnů. Při kultivaci se pH udržuje mezi 3,0 a 9,0. pH se kontroluje pomocí anorganických nebo organických kyselin, alkalických roztoků, močoviny, uhličitanu vápenatého, amoniaku a podobně.

Pokud je to nutné, mohou být do media během kultivace přidávány antibiotika, jako je ampicilin a tetracyklin.

Když je mikroorganismus transformovaný expresním vektorem využívajícím indukovatelný promotor, tak může být během kultivace volitelně přidáno do media indukční činidlo. Do media mohou být přidány například isopropyl-p-Dthiogalaktopyranosid (IPTG), kyselina indolakrylová (IAA) nebo xylosa, když je mikroorganismus transformován expresními vektory obsahujícími lac promotor, trp promotor nebo xylA promotor.

Medium pro kultivaci transformantů získané při použití živočišných buněk jako hostitelských buněk může být jakékoliv běžné medium, jako je RPMI 1640 medium (The Journal of the Američan Medical Association 199: 519 (1967)), Eaglovo MEM medium (Science 122: 501 (1952)), DMEM medium (Virology 8: 396 (1959)), 199 medium (Proceedings of the Society for the Biological Medicine 73: 1 (1950)) nebo jakékoliv z těchto medií dále doplněné fetálním telecím sérem.

Kultivace se obvykle provádí po dobu 1-7 dnů při pH 6-8 a 30-40 °C za přítomnosti 5% CO2.

Pokud je to nutné, mohou být do media během kultivace přidávány antibiotika, jako je kanamycin a penicilín.

Medium pro kultivaci transformantů získané při použití hmyzích buněk jako hostitelských buněk může být jakékoliv běžně používané medium, jako je TNM-FH medium (Pharmingen), Sf-900 II SFM medium (Gibco BRL), ExCell 400 a ExCell 405 (obě od JRH Biosciences), Graceovo Insect Medium (Grace, T.C.C., Nátuře 195: 788 (1962)) a podobně.

Kultivace se obvykle provádí po dobu 1-5 dnů při pH 6-7 a 25-30 °C.

Pokud je to nutné, mohou být do media během kultivace přidávány antibiotika, jako je gentamycin.

Pro izolaci a přečištění proteinu, který katalyzuje reakci produkující sloučeninu (ΙΙ-a) nebo sloučeninu (ΙΙ-b) ze sloučeniny (I-a) nebo ze sloučeniny (I-b) z kultury transformantů podle předkládaného vynálezu může být použito jakýchkoliv běžných metod pro izolaci a přečištění enzymů.

Například, v případě, že protein podle předkládaného vynálezu je exprimován v buňkách v rozpustné formě, jsou po kultivaci buňky získány přečištěním a suspendují se ve vodném pufru, potom se provede rozdrcení buněk ultrazvukovým přístrojem, French lisem, Manto-Gaulin homogenizačním přístrojem, Dynomill a podobně, čímž se získá bezbuněčný extrakt. Ze supernatantu získaného odstředěním bezbuněčného extraktu se získá přečištěný přípravek běžnými způsoby izolace a přečištěni enzymů samostatně nebo v kombinaci, například extrakcí rozpouštědlem, vysolením nebo odsolením síranem amonným atd., srážením organickým rozpouštědlem, aniontovou výměnou chromatografii na pryskyřici jako je diethylaminoethyl (DEAE)-Sepharosa, DIAION HPA-75 (Mitsubishi Chemical Industries Ltd.) a podobně, kationtovou výměnou chromatografii na pryskyřici jako je S-Sepharose FF (Pharmacia) a podobně, hydrofobní chromatografii na pryskyřici jako je butylSepharosa, fenyl-Sepharosa a podobně, gelovou filtrací za použití molekulárního síta, afinitní chromatografii, chromatofokusování a elektroforesy jako je isoelektrická elektroforesa.

V případě, že je protein exprimován ve formě inklusních tělísek v buňkách, tak jsou buňky podobným způsobem získány, rozdrceny a odstředěny za zisku vysrážené frakce a protein se získá z této frakce obvyklým způsobem. Získaná inklusní tělíska se solubilizují činidlem denaturujícím proteiny. Solubilizovaný roztok se potom naředí nebo dialyzuje proti roztoku neobsahujícímu činidlo denaturující proteiny nebo roztoku obsahujícímu činidlo denaturující proteiny v koncentraci nedenaturující proteiny, čímž se protein renaturuje na svou normální terciární strukturu a přečištěný přípravek se získá stejným způsobem izolace a přečištění, jak bylo popsáno výše.

Když je protein podle předkládaného vynálezu nebo jeho sacharidem modifikovaný derivát secernován extracelulárně, tak může být protein nebo jeho derivát s přidaným sacharidovým řetězcem získán ze supernatantu kultury. To znamená, že kultura je zpracována výše uvedenými procesy jako je odstředění a podobně, za zisku solubilních frakcí, a potom může být přečištěný přípravek získán ze solubilních frakcí ···· · ·· · · ·· · ·· · · ·· · • · · · · ·· • · · · · · ♦ ·· • · · · · ·· ·· ···· ··· ····· · stejným způsobem, jaký byl popsán výše.

Příklady takto získaných proteinů jsou proteiny mající aminokyselinové sekvence uvedené v SEQ ID NO: 1, 42 nebo 45. Dále, protein exprimovaný způsobem uvedeným výše může být také připraven chemickou syntézou, jako je Fmoc metoda (fluorfenylmethoxykarbonylová metoda) a tBoc metoda (t-butoxykarbonylová metoda). Alternativně může být protein získán synteticky za použití peptidového syntezátoru vyráběného Sowa Trading (Advanced ChemTech, USA), Perkin-Elmer Japan (Perkin-Elmeř, USA), Pharmacia Biotech (Pharmacia Biotech, Sweden), ALOKA (Protein Technology Instrument, USA), KURABO (Synthecell-Vega, USA), Japan PerSeptive Ltd. (PerSeptive, USA), Shimazu atd.

III. Výroba sloučeniny (ΙΙ-a) nebo sloučeniny (II-b)

Za použití buněk získaných kultivací transformantu získaného způsobem uvedeným výše, kultury uvedených buněk, zpracovaného produktu uvedené kultury nebo enzymu extrahovaného z uvedených buněk jako zdroje enzymu může být sloučenina (ΙΙ-a) nebo sloučenina (ΙΙ-b) vyrobena tak, že se umožní existence sloučeniny (I-a) nebo sloučeniny (I-b) ve vodném mediu; umožní se produkce a akumulace sloučeniny (Il-a) nebo sloučeniny (II-b) v uvedeném vodném mediu; a odebere se sloučenina (ΙΙ-a) nebo sloučenina (II-b) z uvedeného vodného media.

Příkladem zpracovaného produktu kultury transformantů je produkt vybraný ze skupiny zahrnující: sušené buňky, lyofilizované buňky, buňky ošetřené surfaktantem, buňky ošetřené enzymem, buňky zpracované ultrasonikaci, buňky zpracované mechanickým mletím, buňky zpracované rozpouštědlem; proteinové frakce buněk; a imobilizované produkty uvedených buněk nebo zpracované produkty uvedených buněk.

Jako způsob pro přeměnu sloučeniny (I-a) nebo sloučeniny (I-b) na sloučeninu (ΙΙ-a) nebo sloučeninu (ΙΙ-b) může být použita jedna z následujících metod (a) nebo (b): (a) způsob, dke se sloučenina (I-a) nebo sloučenina (I-b) předem přidá do media pro kultivaci buněk; a (b) způsob, kde se sloučenina (Ia) nebo sloučenina (I-b) přidá do media během kultivace. Alternativně může být také použit způsob, ve kterém reaguje zdroj enzymu získaný z buněčné kultury se sloučeninou (I-a) nebo se sloučeninou (I-b) ve vodném mediu.

V případě, že se sloučenina (I-a) nebo sloučenina (I-b) přidá do media, ve kterém je mikroorganismus kultivován, tak se výhodně přidá 0,1 až 10 mg, výhodně 0,2-1,0 mg sloučeniny (I-a) nebo sloučeniny (I-b) do 1 ml media na začátku nebo během kultivace. Je vhodné, aby byla sloučenina (I-a) nebo sloučenina (I-b) přidána po rozpuštění v organickém rozpouštědle, jako je methylalkohol nebo ethylalkohol.

V případě, že metoda zahrnuje působení zdroje enzymu získaného kultivací buněk na sloučeninu (I-a) nebo sloučeninu (I-b) ve vodném mediu, tak množství použitého enzymu závisí na specifické aktivitě zdroje enzymu a na podobných okolnostech. Například, když je kultura buněk, buňka nebo její zpracovaný produkt použita jako zdroj enzymu, tak se 5 až 1000 mg, lépe 10 až 400 mg zdroje enzymu přidá na 1 mg sloučeniny (I-a) nebo sloučeniny (I-b). reakce se provede ve vodném mediu výhodně při teplotě 20 až 50 °C, lépe při 25 až 37 °C. reakčni doba závisí na množství, specifické aktivitě a podobných vlastnostech zdroje enzymu a je obvykle 2 až 150 hodin, lépe 6 až 120 hodin.

···· · · · · • · · · ♦ · · · ··· • · · · · · ·

Příklady vodného media zahrnují vodu nebo pufry jako je fosfátový pufr, HEPES (N-2-hydroxyethylpiperazin-Nethansulfonat) pufr a Tris (tris(hydroxymethyl)aminomethan)hydrochloridový pufr. Organické rozpouštědlo může být přidáno k výše uvedeným pufrům, pokud neinhibuje reakci. Příklady organických rozpouštědel jsou aceton, ethylacetat, dimethylsulfoxid, xylen, methylalkohol, ethylalkohol a butanol. Výhodně se použije směs organických rozpouštědel a vodného media, například při použití sloučeniny (I-b).

V případě, že je sloučenina (I-a) nebo sloučenina (I-b) přidána do vodného media, je sloučenina (I-a) nebo sloučenina (I-b) rozpuštěna ve vodném mediu schopném rozpustit sloučeninu (I-a) nebo sloučeninu (I-b), a potom se přidá do media. Organické rozpouštědlo může být přidáno k výše uvedeným pufrům, pokud neinhibuje reakci. Příklady organických rozpouštědel jsou aceton, ethylacetat, dimethylsulfoxid, xylen, methylalkohol, ethylalkohol a butanol.

Sloučenina (I-b) a sloučenina (ΙΙ-b) může být snadno přeměněna na sloučeninu (I-a) a sloučeninu (I-b), v příslušném pořadí, otevřením laktonového kruhu, jak je popsáno dále. Obdobně, sloučenina (I-a) a sloučenina (ΙΙ-a) může být snadno přeměněna na sloučeninu (I-b) a sloučeninu (Il-b), v příslušném pořadí, přípravou laktonu, jak je popsána dále.

Příklady způsobů pro otevření laktonového kruhu zahrnuji způsob, ve kterém je sloučenina (I-b) nebo sloučenina (Il-b) rozpuštěna ve vodném mediu a do roztoku se přidá kyselina nebo baze. Příkladem vodného media je voda a vodné roztoky obsahující soli, které neinhibují reakci, jako je fosfátový pufr, Tris pufr a podobně. Výše uvedené vodné roztoky mohou obsahovat organické rozpouštědlo, jako je methanol, ethanol, ·< ·· · · ·♦ ···· · · · · · · · • · · · · · · • · · · · · · ♦

9999 999 999 99 999 ethylacetat a podobně, v koncentraci, která neinhibuje reakci. Příklady kyselin zahrnují kyselinu octovou, kyselinu chlorovodíkovou a kyselinu sírovou, a příklady baží zahrnují hydroxid sodný, hydroxid draselný a amoniak.

Příklady způsobů pro přípravu laktonového kruhu zahrnují způsob, ve kterém je sloučenina (I—a) nebo sloučenina (II-a) rozpuštěna v non-vodném mediu a do roztoku se přidá kyselý nebo alkalický katalyzátor. Jako non-vodné rozpouštědlo se použije organické rozpouštědlo, které v podstatě neobsahuje vodu a které může rozpouštět sloučeninu (I-a) nebo sloučeninu (II-a), a může se jednat o non-vodné rozpouštědlo jakéhokoliv typu. Příklady non-vodných rozpouštědel jsou dichlormethan a ethylacetat. Jako katalyzátor může být použit jakýkoliv katalyzátor, který katalyzuje laktonizaci a nemá jiné účinky než laktonizaci substrátu nebo reakčního produktu. Příklady výše uvedených katalyzátorů jsou kyselina trifluoroctová a kyselina para-toluensulfonová. Reakční teplota je výhodně 0 až 100 °C a lépe je 20 až 80 °C.

Získání sloučeniny (II-a) nebo sloučeniny (Il-b) z reakčního roztoku může být provedeno běžnými způsoby používanými v organické syntéze, jako je extrakce organickými rozpouštědly, krystalizace, chromatografie na tenké vrstvě, vysoceúČinná kapalinová chromatografie a podobně.

Jako způsob pro detekci a kvantifikaci sloučeniny (II-a) nebo sloučeniny (ΙΙ-b) získané způsobem podle předkládaného vynálezu může být použita jakákoliv metoda, kterou může být provedena detekce a kvantifikace sloučeniny (II-a) nebo sloučeniny (Il-b). Příklady takových metod jsou ¹³C NMR spektroskopie, ¹H-NMR spektroskopie, hmotnostní spektroskopie a vysoceúČinná kapalinová chromatografie (HPLC).

·· ·· · · ·· • · · · ♦ · · · · * · • · · ♦ 9 ♦ 9

V předkládaném vynálezu mohou mít některé sloučeniny (I-a), (I-b), (II-a) a (ΙΙ-b) stereoizomery, jako jsou optické izomery. Předkládaný vynález zahrnuje všechny možné izomery a jejich směsi včetně těchto stereoizomerů.

Jako sloučenina (I-a) je výhodná sloučenina (IlI-a), výhodnější sloučenina (V-a) a nejvýhodnější sloučenina (VII-

a).

Jako sloučenina (I-b) je výhodná sloučenina (ΙΙΙ-b), výhodnější sloučenina (V-b) a nejvýhodnější sloučenina (VII-

b).

Jako sloučenina (II-a) je výhodná sloučenina (IV-a), výhodnější sloučenina (Vl-a) a nejvýhodnější sloučenina (VIII-

a).

Jako sloučenina (ΙΙ-b) je výhodná sloučenina (IV-b), výhodnější sloučenina (Vl-b) a nejvýhodnější sloučenina (VIII-

b).

Alkyl je lineární nebo rozvětvený alkyl obsahující 1 až 10 atomů uhlíku, výhodně 1 až 6 atomů uhlíku, jako je methyl, ethyl, propyl, isopropyl, butyl, isobutýl, sec.butyl, terc.butyl, pentyl, neopenytl, hexyl, isohexyl, heptyl, 4,4dimethylpentyl, oktyl, 2,2,4-trimethylpentyl, nonyl, decyl, a jejich různé rozvětvené izomery.

Příklady arylů jsou fenyl a naftyl.

Substituentem v substituovaném alkylu mohou být 1 až 3 identické nebo odlišné skupiny a jejich příklady jsou halogeny, hydroxy, amino, alkoxy a arylové skupiny.

Substituentem v substituovaném arylu mohou být 1 až 3 identické nebo odlišné skupiny a jejich příklady jsou halogeny, hydroxy, amino, alkyl a alkoxy skupiny.

Alkylová skupina v alkoxy skupině má stejnou definici jako v definici alkylu uvedené výše.

Mezi alkalické kovy patří lithium, sodík, draslík, rubidium, cesium nebo francium.

Následující příklady provedení vynálezu nijak neomezují rozsah předkládaného vynálezu.

Příklady provedeni vynálezu

Příklad 1: Získání DNA kódující protein mající aktivitu v produkci sloučeniny (VlII-a) nebo sloučeniny (VlII-b) ze sloučeniny (VlI-a) nebo sloučeniny (VlI-b)

100 mg sloučeniny (VlI-b) (Sigma) se rozpustí v 9,5 ml methanolu a přidá se 0,5 ml 1 mol/1 hydroxidu sodného. Směs se mísí při teplotě místnosti po dobu 1 hodiny. Získaný reakční roztok se suší do ztuhnutí a pevný materiál se potom rozpustí přidáním 5 ml deionizované vody a potom se pH upraví na pH přibližně 7 pomocí přibližně 0,1 ml 1 mol/1 kyseliny chlorovodíkové. Potom se do směsi přidá 4,9 ml deionizované vody za zisku 10 ml sloučeniny (VlI-a), jejíž konečná koncentrace je 10 mg/ml (sloučenina, kde ve vzorci (VII-a) znamená R¹ sodík).

Bacillus subtilis kmene Marburgl68 (ATCC 15563) se naočkuje • 9 · · · 9 99 9

9 9 9 99 99 · 999

9 9 9 9 9 9 9

9 9 9 9 9 9 9 · 9

9 9 9 9 9 9 9

9999 ··· ♦·· ·· ·*ι platinovým očkem do 10 ml LB kapalného media a kultivuje se při teplotě 30 °C přes noc. Po kultivaci se buňky odeberou ze získaného kultivačního roztoku odstředěním.

Chromosomální DNA se izoluje a přečistí z buněk obvyklým způsobem.

Kódující a protismyslné primery obsahující kombinaci nukleotidových sekvencí SEQ ID NO: 3 a 4, SEQ ID NO: 5 a 6, SEQ ID NO: 7 a 8, SEQ ID NO: 9 a 10, SEQ ID NO: 11 a 12, SEQ ID NO: 13 a 14, a SEQ ID NO: 15 a 16, se syntetizují na DNA syntezátoru.

PCR se provede při 30 cyklech, kde každý cyklus zahrnuje 30 sekund při 94 °C, 30 sekund při 55 °C a 2 minuty při 72 °C pro DNA fragmenty velikosti 2 kb nebo méně; a 20 sekund při 98 °C a 3 minuty při 68 °C pro DNA fragmenty velikosti větší než 2 kb, a potom se reakce provádí 7 minut při 72 °C.

Z DNA fragmentů amplifikovaných PCR se DNA fragment (obsahující biol gen) amplifikovaný kombinací primerů SEQ ID NO: 3 a 4 tráví restrikčními enzymy EcoRI a Sáli, DNA fragment (obsahující cypA gen) amplifikovaný kombinací primerů SEQ ID NO: 5 a 6 se tráví restrikčními enzymy Xbal a Smál, DNA fragment (obsahující cypX gen) amplifikovaný kombinací primerů SEQ ID NO: 7 a 8 se tráví restrikčními enzymy Smál a Sáli, DNA fragment (obsahující pksS gen) amplifikovaný kombinací primerů SEQ ID NO: 9 a 10 se tráví restrikčními enzymy EcoRI a Sáli,

DNA fragment (obsahující yetO gen) amplifikovaný kombinací primerů SEQ ID NO: 11 a 12 tráví restrikčními enzymy Xbal a BglII, DNA fragment (obsahující yjiB gen) amplifikovaný kombinací primerů SEQ ID NO: 13 a 14 se tráví restrikčními enzymy Xbal a Smál, a DNA fragment (obsahující yrhJ gen) amplifikovaný kombinací primerů SEQ ID NO: 15 a 16 se tráví restrikčními enzymy Xbal a Smál, v příslušném pořadí.

Po trávení se DNA fragmenty zpracované restrikčními enzymy zpracují elektroforesou na agarosovém gelu za zisku DNA fragmentů zpracovaných různými restrikčními enzymy.

Vektorový plasmid pUC119 (TAKARA) se tráví restrikčními enzymy Sáli a EcoRI a potom se zpracuje elektroforesou na agarosovém gelu za zisku Sall-EcoRI zpracovaného pUC119 fragmentu. Obdobně, vektorový plasmid pUC119 se tráví restrikčními enzymy Sáli a Smál a potom se zpracuje elektroforesou na agarosovém gelu za zisku Sall-Smal zpracovaného pUC119 fragmentu.

pSTV28 (TAKARA) se tráví restrikčními enzymy Xbal a Smál a potom se zpracuje elektroforesou na agarosovém gelu za zisku Xbal-Smal zpracovaného pSTV28 fragmentu. Obdobně, vektorový plasmid pSTV28 se tráví restrikčními enzymy Xbal a BamHI a potom se zpracuje elektroforesou na agarosovém gelu za zisku Xbal-BamHI zpracovaného pSTV28 fragmentu.

Takto získaný EcoRI-SalI zpracovaný DNA fragment (amplifikovaný PCR s kombinací primerů SEQ ID NO: 3 a 4) se smísí se Sall-EcoRI zpracovaným pUC119 fragmentem, Xbal-Smal zpracovaný DNA fragment (amplifikovaný PCR s kombinací primerů SEQ ID NO: 5 a 6) se smísí se Xbal-Smal zpracovaným pSTV28 fragmentem, Smal-Sall zpracovaný DNA fragment (amplifikovaný • · · · · · ·· · • · · · ·· ·· · ♦·· • · · 9 9 9 99

9 9 9 9 9 99

9999 9·· 999 99999

PCR s kombinací primerů SEQ ID NO: 7 a 8) se smísí se SallSmál zpracovaným pUC119 fragmentem, EcoRI-SalI zpracovaný DNA fragment (amplifikovaný PCR s kombinací primerů SEQ ID NO: 9a 10) se smísí se Sall-EcoRI zpracovaným pUC119 fragmentem, Xbal-BglII zpracovaný DNA fragment (amplifikovaný PCR s kombinací primerů SEQ ID NO: 11 a 12) se smísí se Xbal-BamHI zpracovaným pSTV28 fragmentem, Xbal-Smal zpracovaný DNA fragment (amplifikovaný PCR s kombinací primerů SEQ ID NO: 13 a 14) se smísí se Xbal-Smal zpracovaným pSTV28 fragmentem, Xbal-Smal zpracovaný DNA fragment (amplifikovaný PCR s kombinací primerů SEQ ID NO: 15 a 16) se smísí se Xbal-Smal zpracovaným pSTV28 fragmentem, v příslušném pořadí. Po srážení ethanolem se získané DNA sraženiny rozpustí v 5 μΐ destilované vody a provede se ligační reakce vedoucí k zisku rekombinantních DNA.

Touto rekombinantní DNA se E. coli (od TOYOBO) kmene DH5a transformuje obvyklým způsobem a transformant se potom vloží na LB agarové medium (obsahující Bacto Trypton (Difco) 10 g, Bacto kvasinkový extrakt (Difco) 5 g, NaCl 5 g v 1 1, pH se upraví na 7,4 pomocí 1 mol/1 NaOH tak, že agar je upraven na 1,5%) obsahující 100 gg/ml ampicilinu v případě použití pUC119 jako vektorového plasmidu; a na LB agarové medium obsahující 25 gg/ml chloramfenikolu v případě použití pSTV28 jako plasmidového vektoru, a potom se provede kultivace po dobu 2 dnů při 25 °C.

Selektuje se několik kolonií resistencních na ampicilin nebo na chloramfenikol, naočkují se do 10 ml LB kapalného media (obsahujícího Bacto Trypton (Difco) 10 g, Bacto kvasinkový extrakt (Difco) 10 g, NaCl 5 g v 1 1, pH se upraví na 7,4 pomocí 1 mol/1 NaOH) a potom se provede kultivace po dobu 2 dnů při 25 °C za třepání.

·« « · · 9·· • 9 · 9 99 99 9 99

9 9 9 9 99

9 9 9 9 9 99 ·· 9999 999 999 9·99

Získaná kultura se odstředí za účelem získání buněk.

Plasmid se izoluje z buněk obvyklým způsobem.

Struktura izolovaného plasmidu se určí štěpením různými restrikčními enzymy a stanovením nukleotidové sekvence, což potvrdí to, že požadovaný DNA fragment byl insertován do plasmidu. Plasmidy získané navázáním DNA fragmentu (amplifikovaného kombinací primerů SEQ ID NO: 3 a 4) zpracovaného EcoRI-SalI na pUC119 fragment zpracovaný SallEcoRI se označí pUbiol, plasmidy získané navázáním DNA fragmentu (amplifikovaného kombinací primerů SEQ ID NO: 5 a 6) zpracovaného Xbal-Smal na pSTV28 fragment zpracovaný Xbal-Smal se označí pScypA, plasmidy získané navázáním DNA fragmentu (amplifikovaného kombinací primerů SEQ ID NO: 7 a 8) zpracovaného Smal-Sall na pUC119 fragment zpracovaný Sall-Smal se označí pUcypX, plasmidy získané navázáním DNA fragmentu (amplifikovaného kombinací primerů SEQ ID NO: 9 a 10) zpracovaného EcoRI-SalI na pUC119 fragment zpracovaný SallEcoRI se označí pUpksS, plasmidy získané navázáním DNA fragmentu (amplifikovaného kombinací primerů SEQ ID NO: 11 a 12) zpracovaného Xbal-BglII na pSTV28 fragment zpracovaný Xbal-BamHI se označí pSyetO, plasmidy získané navázáním DNA fragmentu (amplifikovaného kombinací primerů SEQ ID NO: 13 a 14) zpracovaného Xbal-Smal na pSTV28 fragment zpracovaný XbalSmal se označí pSyjiB, plasmidy získané navázáním DNA fragmentu (amplifikovaného kombinací primerů SEQ ID NO: 15 a 16) zpracovaného Xbal-Smal na pSTV28 fragment zpracovaný XbalSmal se označí pSyrhJ.

E. coli DH5a obsahující takto získaný plasmid, E. coli DH5a obsahující pUC119 nebo pSTV28, a E. coli DH5a neobsahující žádný plasmid se naočkuji do 3 ml LB kapalného media (do kterého se přidá lék odpovídající genu resistence na léky ve vektorovém plasmidu) a provede se kultivace za třepání po dobu 12 hodin při teplotě 28 °C. Kultivační roztok (0,5 ml) se naočkuje do LB kapalného media (do kterého se přidá lék odpovídající genu resistence na léky) obsahující 1% glukosu a 1% CaCO3, a provede se kultivace za třepání po dobu 12 hodin při 28 °C. Roztok kultury (1 ml) se nalije do assist zkumavky (ASSIST), potom se přidá glukosa a dříve získaná sloučenina (VlI-a) (kde R¹ znamená Na) do konečné koncentrace 1% a 100 mg/1, v příslušném pořadí, a potom se provede třepání po dobu 24 hodin při 28 °C. Po dokončení reakce se buňky odstraní odstředěním, získaný supernatant se důkladně protřepe za přidání stejného množství ethylacetatu. Vrchní ethylacetatová vrstva se separuje z roztoku odstředěním, potom se ethylacetatová vrstva odpaří do sucha pomocí rotační odparky. Sušený materiál se rozpustí v methanolu (1/5 objemu vzhledem k prvnímu supernatantu kultury) a zpracuje se HPLC analýzou (kolona: Intersil ODS-2 (5 pm, 4x250 mm, GL Science), teplota kolony: 60 °C, mobilní fáze: acetonitril: voda: kyselina fosforečná = 55:45:0,05, průtok: 0,9 ml/min, detekční vlnová délka: 237 nm) pro analýzu a kvantifikaci sloučeniny (VIII-a) (Kde R¹ je Na). Výsledky jsou uvedeny v tabulce 1.

Tabulka 1

Plasmid	Sloučenina (VlII-a) (mg/1)
žádný	0
pUC119	0
pSTV28	0
pUbiol	0
pScypA	0
pUcypX	0
pUpks	0
pSyetO	0
pSyjiB	0, 6
pSyrhJ	0

Příklad 2: Exprese yjiB genu v Bacillus subtilis jako hostitelské buňce a potvrzení aktivity proteinu kódovaného uvedeným genem

Kódující a protismyslné primery obsahující kombinaci nukleotidových sekvencí uvedených v SEQ ID NO: 17 a 18, SEQ ID NO: 19 a 20, SEQ ID NO: 21 a 22, SEQ ID NO: 23 a 24, SEQ ID

NO: 25 a 26, SEQ ID NO: 27 a 28, a SEQ ID NO: 29 a 30 se syntetizují na DNA syntezátoru.

Za použití chromosomální DNA Bacillus subtilis získané v příkladu 1 jako templářů se PCR provede s těmito primery: TaKaRa LA-PCRTM Kit verze 2 (TaKaRa), Expand™ High-Fidelity PCR Systém (Boehringer Mannheim) Taq DNA polymerasy (Boehringer), za použití DNA Thermal Cycler (Perkin-Elmer Japan) .

PCR se provede při 30 cyklech za podmínek, kdy každý cyklus

ΦΦ φ» · φ·« φ φ · φ «« φφ · φ· ♦ · φ · · φ· • · φ φ φφ · ·· ···· 9·9. Φ«β ΦΦ φ zahrnuje 30 sekund při 94 °C, 30 sekund při 55 °C a 2 minuty při 72 °C pro DNA fragmenty velikosti 2 kb nebo méně; a 20 sekund při 98 °C a 3 minuty při 68 °C pro DNA fragmenty velikosti větší než 2 kb, a potom se reakce provádí 7 minut při 72 °C.

Z DNA fragmentů amplifikovaných PCR se DNA fragment (obsahující biol gen) amplifikovaný kombinací primerů SEQ ID NO: 17 a 18 tráví restrikčními enzymy Spěl a BamHI, DNA fragment (obsahující cypA gen) amplifikovaný kombinací primerů SEQ ID NO: 19 a 20 se tráví restrikčními enzymy Spěl a BamHI, DNA fragment (obsahující cypX gen) amplifikovaný kombinací primerů SEQ ID NO: 21 a 22 se tráví restrikčními enzymy Spěl a Nrul, DNA fragment (obsahující pksS gen) amplifikovaný kombinací primerů SEQ ID NO: 23 a 24 se tráví restrikčními enzymy Spěl a BamHI, DNA fragment (obsahující yeto gen) amplifikovaný kombinací primerů SEQ ID NO: 25 a 26 se tráví restrikčními enzymy Spěl a BamHI, DNA fragment (obsahující yjiB gen) amplifikovaný kombinací primerů SEQ ID NO: 27 a 28 se tráví restrikčními enzymy Spěl a BamHI, a DNA fragment (obsahující yrhJ gen) amplifikovaný kombinací primerů SEQ ID NO: 29 a 30 se tráví restrikčními enzymy Spěl a BamHI, v příslušném pořadí.

Vektorový plasmid pWH1520 (MoBiTec) se tráví restrikčními enzymy Spěl a BamHI a potom se zpracuje elektroforesou na agarosovém gelu za zisku Spěl a BamHI zpracovaného pWH152 fragmentu. Obdobně, vektorový plasmid pWH1520 se tráví restrikčními enzymy Spěl a Nrul a potom se zpracuje

4·	4·	4	4	>4
• t	• 9	44	44	4 4	44
• ·	•	•	4	i 4
• 4	•	4	ě	• 4
··	• 444	444		>4	• 4

elektroforesou na agarosovém gelu za zisku Spel-Nrul pWH1520 fragmentu.

Takto získané Spel-BamHI zpracované DNA fragmenty (amplifikované PCR s kombinací primerů SEQ ID NO: 17 a 18, SEQ ID NO: 19 a 20, SEQ ID NO: 23 a 24, SEQ ID NO: 25 a 26, SEQ ID NO: 27 a 28, a SEQ ID NO: 29 a 30) se smísí se Spel-BamHI zpracovaným pWH1520 fragmentem, Spel-Nrul zpracovaný DNA fragment (amplifikovaný PCR s kombinací primerů SEQ ID NO: 21 a 22) se smísí se Spel-Nrul zpracovaným pWH1520 fragmentem, v příslušném pořadí. Po srážení ethanolem se získané DNA sraženiny rozpustí v 5 μΐ destilované vody a provede se ligační reakce vedoucí k zisku rekombinantních DNA.

Touto rekombinantní DNA se E. coli (od TOYOBO) kmene DH5a transformuje obvyklým způsobem a transformant se potom vloží na LB agarové medium obsahující 10 pg/ml tetracyklinu a provede se kultivace po dobu 2 dnů při 25 °C. Buňky se získají ze získané kultury odstředěním.

Plasmid se izoluje z buněk obvyklým způsobem.

Struktura izolovaného plasmidu se určí štěpením různými restrikčními enzymy a stanovením nukleotidové sekvence, což potvrdí to, že požadovaný DNA fragment byl insertován do plasmidu. Plasmid získaný navázáním DNA fragmentu (amplifikovaného PCR s kombinací primetů SEQ ID NO: 17 a 18) na pWH1520 se označí pWbiol; plasmid získaný navázáním DNA fragmentu (amplifikovaného PCR s kombinací primerů SEQ ID NO: 19 a 20) na pWH1520 se označí pWcypA; plasmid získaný navázáním DNA fragmentu (amplifikovaného PCR s kombinací primerů SEQ ID NO: 21 a 22) na pWH1520 se označí pWcypX; plasmid získaný navázáním DNA fragmentu (amplifikovaného PCR s

kombinací primerů SEQ ID NO: 23 a 24) na pWH1520 se označí pWpksS; plasmid získaný navázáním DNA fragmentu (amplifikovaného PCR s kombinací primerů SEQ ID NO: 25 a 26) na pWH1520 se označí pWyetO; plasmid získaný navázáním DNA fragmentu (amplifikovaného PCR s kombinací primerů SEQ ID NO: 27 a 28) na pWH1520 se označí pWyjiB; plasmid získaný navázáním DNA fragmentu (amplifikovaného PCR s kombinaci primerů SEQ ID NO: 29 a 30) na pWH1520 se označí pWyrhJ; v příslušném pořadí.

Takto získané plasmidy a vektorový plasmid pWH1520 se vloží do Bacillus subtilis kmene ATCC33712 způsobem podle S. Chang and S.N. Cohen (Mol. Gen. Gnet. 168: 111 (1979)).

To znamená, že kmen ATCC 33712 se naočkuje do široké zkumavky obsahující 5 ml Pen media (kde se 1,75 g Difco antibiotického media č. 3 rozpustí ve 100 ml vody a sterilizuje se v autoklávu), potom se provede kultivace za třepání při 37 °C přes noc. Všechny buňky se kultivují přes noc ve 300 ml Erlenmeyerově zkumavce obsahující 100 ml Pen media se potom naočkují a kultivují se za třepání po dobu 3 hodin při 37 °C do dosažení metafáze exponenciálního růstu. Kultura se potom odstředí během 10 minut při 5000 rpm za germ free podmínek pro vysrážení buněk. Po odstranění supernatantu se buňky suspendují ve 4,5 ml SMMP (směs obsahující stejné množství 2 x SMMP (ve kterém se 34,2 g sacharosy, 0,464 g kyseliny maleinové, 0,813 g chloridu horečnatého.6 H2O rozpustí ve vodě, pH se upraví na pH 6,5 hydroxidem sodným a konečný objem 100 ml se sterilizuje v autoklávu) a 4 x Pen mediu (ve kterém se 7 g Difco antibiotického media č. 3 rozpustí ve 100 ml vody a sterilizuje se v autoklávu), potom se přidá 0,5 ml roztoku lysozymu (ve kterém se 10 g lysozymu (EIKAGAKU Corp.) rozpustí v 0,5 ml SMMP a sterilizuje se přes millipore filtr s • ·

velikosti pórů 0,45 μτη) a směs se pomalu třepe po dobu 2 hodin při 37 °C. Po mikroskopickém potvrzení toho, že se z ne méně než 90% buněk staly protoplasty, se protoplasty odstředí během 20 minut při 3000 rpm proto, aby se vysrážely. Supernatant se odstraní a získané protoplasty se resuspendují v 5 ml SMMP. Protoplasty se získají odstředěním během 20 minut při 3000 rpm a suspendují se ve 2 ml SMMP pro přípravu protoplastové suspenze hostitelského kmene pro transformaci.

Přibližně 1 gg plasmidové DNA se rozpustí v SMMP a důkladně se promísí s 0,5 ml protoplastové suspenze. Ihned po smísení se přidá 1,5 ml 40% roztoku polyethylenglykolu (ve kterém se 40 g polyethylenglykolu 6000 (Nacalai tesque) rozpustí ve 2 x SMMP a přidá se voda do objemu 100 ml a potom se provede sterilizace v autoklávu) a provede se důkladné promísení. Po stání při teplotě místnosti po dobu 2 minut se přidá 5 ml SMMP a provede se promísení a směs se odstředí během 20 minut při 3000 rpm. Po odstranění supernatantu se vysrážené protoplasty suspendují v 1 ml SMMP a potom se pomalu třepou po dobu 3 hodin při 30 °C. Po naředění SMMP se protoplasty aplikují do DM3 media (ve kterém se 45 ml 80 g/1 bactoagaru (Difco), 50 ml 50 g/1 kyseliny kasaminové, 250 ml 338 g/1 jantaranu sodného*6 H2O (pH 7,3), 50 ml fosfátového pufru (35 g/1 hydrogenfosforečnanu draselného, 15 g/1 dihydrogenfosforečnanu draselného), 25 ml 100 g/1 kvasinkového extraktu, 10 ml 203 g/1 chloridu hořečnatého*6H20, 25 ml 100 g/1 glukosy sterilizuje v autoklávu a promísí a do získané směsi se přidají 3,5 ml 20 mg/ml hovězího sérového albuminu sterilizovaného přes millipore filtr s velikostí pórů 0,45 gm) , kde toto medium obsahuje léky (v případě tetracyklinu v konečném objemu 10 gg/ml). Protoplasty se kultivují po dobu 1 až 2 dnů při teplotě 37 °C za zisku transfektovaného kmene.

Tak se získají kmeny B. subtilis ATCC 33712 obsahující výše uvedené plasmidy.

Získané transformanty a kmen ATCC 33712 neobsahující žádný plasmid se naočkují, v příslušném pořadí, do 3 ml LB media (10 mg/1 tetracyklinu se přidá ke kmenu obsahujícími plasmid) a provede se kultivace za třepání po dobu 24 hodin při 30 °C. 0,25 ml roztoku této kultury se naočkuje do testovací zkumavky obsahující 5 ml TB media (Bacto Trypton (Difco) 1,4%, Bacto kvasinkový extrakt (Difco) 2,4%, KH2PO4O 0,231 a K2HPO4 1,251%, upraveno na pH 7,4 pomocí 1 mol/1 hydroxidu sodného), a provede se kultivace za třepání po dobu 3 hodin při 30 °C. Po 3 hodinách se 1 ml kultury přenese do Assist zkumavky č. 60.540S (ASSIST) a přidá se 40 μΐ 50% sterilizovaného roztoku xylosy a potom se provede kultivace s třepáním po dobu 3 hodin. Potom se do každé testovací zkumavky přidá sloučenina (VlI-a) (kde R je Na) získaná v příkladu 1 v konečné koncentraci 0,2 mg/ml a směs se kultivuje za třepání po dobu 16 hodin při 30 °C.

Po dokončení reakce se pH reakčního roztoku upraví na pH

3,5 pomocí kyseliny octové. Do 0,5 ml tohoto reakčního roztoku se přidá 1 ml ethylacetátu a směs se třepe po dobu 1 hodiny. Po třepání se reakční roztok odstředí během 5 minut při 3000 rpm za separace do dvou vrstev a horní ethylacetatová vrstva se odebere, rozpouštědlo se odstraní pomocí rotační odparky a zbytek se rozpustí v 0,5 ml methanolu.

Za použití podílů tohoto methanolového roztoku se provede HPLC analýza způsobem popsaným v příkladu 1 za účelem detekce a kvantifikace sloučeniny (VlII-a) (kde R¹ znamená Na). Výsledky jsou uvedeny v tabulce 2.

Tabulka 2

Plasmid	Sloučenina(VlII-a) /mg/1)
žádný	0,5
pWH1520	0,5
pWbiol	0,5
pWcypA	0,5
pWcypX	0,5
pWpksS	0,5
pWyetO	0,5
pWyj iB	24,6
pWyrhJ	0,5

Z výsledků příkladů 1 a 2 je jasné, že aktivita produkce sloučeniny (VlII-a) nebo sloučeniny (VlII-b) ze sloučeniny (VlI-a) nebo sloučeniny (VlI-b) je kódovaná yjiB genem.

DNA fragment amplifikovaný PCR s kombinací primerů SEQ ID

NO: 27 a 28 obsahoval nukleotidovou sekvenci uvedenou v SEQ ID NO: 2 a uvedená nukleotidová sekvence obsahovala nukleotidovou sekvenci kódující aminokyselinovou sekvenci uvedenou v SEQ ID NO: 1.

Příklad 3: Exprese yjiB genu za použití Bacillus megaterium jako hostitelské buňky a produkce sloučeniny (VlII-a) pWyjiB připravený v příkladu 2 se vložil do Bacillus megaterium (MoBiTec) a Bacillus sp. FERM BP-6030 stejným způsobem, jako je způsob popsaný pro transformaci Bacillus subtilis v přikladu 2.

Získané transformanty a hostitelská buňka neobsahující plasmid se kultivovaly a reakce se provedla stejným způsobem, jako je způsob popsaný v přikladu 2, a změřilo se množství sloučeniny (VlII-a). Výsledky jsou uvedeny v tabulce 3.

Tabulka 3

Hostitel	Plasmid	Sloučenina (VlII-a) (mg/1)
B. megaterium	žádný	2,0
B. megaterium	pWyj iB	27,2
FERM BP-6030	žádný	4,5
FERM BP—6030	pWyj iB	30,3

Příklad 4: Příprava plasmidu pro expresi proteinu, který produkuje sloučeninu (VlII-a) v koryneformních bakteriích

Pro umožnění exprese yjiB genu získaného v příkladu 1 v koryneformních bakteriích se DNA mající nukleotidové sekvence uvedené v SEQ ID NO: 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38 a 39 syntetizovaly pomocí DNA syntezátoru.

Plasmidová pR1109 DNA, ve které byly DNA fragment obsahující promotorovou sekvenci p54-6 (GenBank AJ132582) pro expresi v koryneformních bakteriích a nukleotidová sekvence uvedená v SEQ ID NO: 40 insertovány do Sse83871-BamHI místa plasmidového vektoru pCS299P (Japonská Patentová přihláška č. 11-110437), se připraví obvyklým způsobem z E. coli NM522 kmene transformovaného tímto plasmidem.

Za použití pWyjiB DNA získané v příkladu 2 jako templářů se PCR provede s primery majícím nukleotidové sekvence uvedené v SEQ ID NO: 31 a 32 a s Taq DNA polymerasou (TAKARA), za použití DNA Thermal Cycler 480 (Perkin-Elmer Japan).

PCR se provede při 25 cyklech za podmínek, kdy každý cyklus zahrnuje 30 sekund při 96 °C, 45 sekund při 50 °C a 3 minuty při 72 °C.

DNA fragment amplifikovaný PCR se tráví Sáli a BamHI a zpracuje se elektroforesou na agarosovém gelu a přibližně 1,2 kb DNA fragment se přečistí obvyklým způsobem za zisku SallBamHI zpracovaného DNA fragmentu.

Výše uvedený plasmid pRI109 se tráví restrikčními enzymy Sáli a BamHI a zpracuje se elektroforesou na agarosovém gelu a přibližně 6 kb DNA fragment se přečistí obvyklým způsobem za zisku Sall-BamHI zpracovaného pRI109 fragmentu.

Výše uvedený Sall-BamHI zpracovaný pRI109 fragment a SallBamHI zpracovaný DNA fragment se smísí a provede se ligační reakce za zisku rekombinantní DNA.

Za použití rekombinantní DNA se E. coli DH5a (získaná od TOYOBO) transformuje obvyklým způsobem a potom se vloží na LB medium obsahující 20 gg/ml kanamycinu a provede se kultivace po dobu 1 dne při 30 °C za zisku transformantu.

Plasmid se izoluje z transformantu obvyklým způsobem. Za použití izolované plasmidové DNA jako templátu a za použití DNA mající nukleotidovou sekvenci uvedenou v SEQ ID NO: 33, 34, 35, 36 a 37 jako primeru, v příslušném pořadí, se nukleotidové sekvence insertovaných DNA fragmentů určí pomocí Dye-Terminator Cycle Sequencing Kitu (Applied Biosystems) a 373A sekvenátoru (Applied Biosystems), a potom se plasmid, ve kterém byla nukleotidové sekvence uvedená v SEQ ID NO: 41 insertována mezi Sáli a BamHI místa pRI109 označí pRIyjiB.

Nukleotidové sekvence uvedená v SEQ ID NO: 41 obsahuje nukleotidovou sekvenci, která kóduje protein mající ♦♦·· · · ·· · • · · ♦ tt · · · « ·· aminokyselinovou sekvenci uvedenou v SEQ ID NO: 42.

Za použití chromosomální DNA Bacillus subtilis kmene

Marburgl68 (ATCC 15563) získané v příkladu 1 jako templátu se PCR provede s primery majícím nukleotidové sekvence uvedené v SEQ ID NO: 38 a 39 a s LA-Taq DNA polymerasou (TAKARA), za použití DNA Thermal Cycler 480 (Perkin-Elmer Japan).

PCR se provede při 30 cyklech za podmínek, kdy každý cyklus zahrnuje 30 sekund při 96 °C, 30 sekund při 55 °C a 2 minuty při 72 °C.

DNA fragment amplifikovaný PCR se smísí s pT7Blue (TAKARA) a provede se ligační reakce za zisku rekombinantní DNA.

Za použití rekombinantní DNA se E. coli DH5a (získaná od TOYOBO) transformuje obvyklým způsobem a potom se vloží na LB medium obsahující 100 pg/ml ampicilinu a provede se kultivace po dobu 1 dne při 30 °C za zisku transformantu.

Plasmid se izoluje z transformantu obvyklým způsobem. Struktura izolovaného plasmidu se určí štěpením různými restrikčními enzymy, což potvrdí, že požadovaný DNA fragment byl insertován do plasmidu, a plasmid se označí pTSYN2-72.

pTSYN2-72 DNA se tráví Xhol a BamHI a zpracuje se elektroforesou na agarosovém gelu a přibližně 1,2 kb DNA fragment se přečistí obvyklým způsobem za zisku Xhol-BamHI zpracovaného DNA fragmentu.

DNA plasmidu pRI109 se tráví restrikčními enzymy Sáli a BamHI a zpracuje se elektroforesou na agarosovém gelu a přibližně 6 kb DNA fragment se přečistí obvyklým způsobem za

·· ···· ··· ··· zisku Sall-BamHI zpracovaného pRI109 fragmentu.

Výše uvedený Xhol-BamHI zpracovaný DNA fragment a SallBamHI zpracovaný pRI109 fragment se smísí a provede se ligační reakce za zisku rekombinantní DNA.

Za použití rekombinantní DNA se E. coli DH5<x (získaná od TOYOBO) transformuje obvyklým způsobem a potom se vloží na LB medium obsahující 20 μg/ml kanamycinu a provede se kultivace po dobu 1 dne při 30 °C za zisku transformantu.

Plasmid se izoluje z transformantu obvyklým způsobem. Za použití izolované plasmidové DNA jako templátu a za použití DNA mající nukleotidovou sekvenci uvedenou v SEQ ID NO: 33, 34, 35, 36 a 37, se nukleotidové sekvence insertovaného DNA fragmentu určí pomocí Dye-Terminator Cycle Sequencing Kitu (Applied Biosystems) a 373A sekvenátoru (Applied Biosystems), a potom se plasmid, ve kterém byla nukleotidová sekvence uvedená v SEQ ID NO: 41 insertována mezi Sáli a BamHI místa pRI109, označí pSYN2-72.

Nukleotidová sekvence uvedená v SEQ ID NO: 43 obsahuje nukleotidovou sekvenci, která kóduje protein mající aminokyselinovou sekvenci uvedenou v SEQ ID NO: 1.

Za pWyjiB DNA získané v příkladu 2 jako templátu se PCR provede s primery majícím nukleotidové sekvence uvedené v SEQ ID NO: 38 a 39 a s Z-Taq DNA polymerasou (TAKARA), za použití DNA Thermal Cycler 480 (Perkin-Elmer Japan).

PCR se provede při 25 cyklech za podmínek, kdy každý cyklus zahrnuje 20 sekund při 98 °C, 20 sekund při 55 °C a 30 minut při 72 °C.

·· ·· · » ·· · • · · ♦ ·· ·· * ·,, ·· · · ···· ···· » · · · · ··· · · · ·· *· ···· .·. ... ., ,,,

DNA fragment amplifikovaný PCR se tráví Xhol a BamHI a zpracuje se elektroforesou na agarosovém gelu a přibližně 1,2 kb DNA fragment se přečistí obvyklým způsobem za zisku XholBamHI zpracovaného DNA fragmentu.

DNA plasmidu pRI109 se tráví restrikčními enzymy Sáli a BamHI a zpracuje se elektroforesou na agarosovém gelu a přibližně 6 kb DNA fragment se přečistí obvyklým způsobem za zisku SalI-BamHI zpracovaného pRI109 fragmentu.

Výše uvedený Xhol-BamHI zpracovaný DNA fragment a SalIBamHI zpracovaný pRI109 fragment se smísí a provede se ligační reakce za zisku rekombinantní DNA.

Plasmid se izoluje z transformantu obvyklým způsobem. Za použití izolované plasmidové DNA jako templátu a za použití DNA mající nukleotidovou sekvenci uvedenou v SEQ ID NO: 33, 34, 35, 36 a 37, v příslušném pořadí, jako primerů, se nukleotidové sekvence insertovaného DNA fragmentu určí pomocí Dye-Terminator Cycle Sequencing Kitu (Applied Biosystems) a 373A sekvenátoru (Applied Biosystems), a potom se plasmid, ve kterém byla nukleotidové sekvence uvedená v SEQ ID NO: 44 insertována mezi Sáli a BamHI místa pRI109, označí pSYN2-39.

Nukleotidové sekvence uvedená v SEQ ID NO: 44 obsahuje nukleotidovou sekvenci, která kóduje protein mající aminokyselinovou sekvenci uvedenou v SEQ ID NO: 45.

Příklad 5: Vloženi plasmidu do C. glutamicum kmene ATCC 13032 a vyhodnocení aktivity

Kmen ATCC 13032 se naočkuje do testovacích zkumavek obsahujících 8 ml media (20 g/1 normálního kapalněného media (Kyokuto Pharmaceutical Indistry, Co. Ltd.), 5 g/1 Bacto Yeast extraktu (Difco)) a kultivuje se za třepání při 30 °C přes noc. Potom se 5 ml buněk kultivovaných přes noc naočkuje do 2 1 Erlenmeyerovy baňky (obsahující 250 ml kapalného media) a provede se kultivace za třepání po dobu 4 hodin při 30 °C. Získaný roztok kultury se odstředí pro vysrážení buněk. Po odstranění supernatantu se buňky resuspendují ve 30 ml ledově chladného EPB (250 mmol/1 sacharosy, 15% (obj./obj.) glycerolu a vysrážejí se odstředěním. Znovu se buňky resuspendují v EPB a separují se odstředěním a potom se suspendují ve 2 ml EPB. Získaná buněčná suspenze se nalije do 0,5 ml zkumavek v objemu 0,1 ml do každé zkumavky a rychle se zmrazí pomocí suchého ledu za zisku buněčné suspenze pro transformaci. Získané buňky se skladují při teplotě nižší než -80 °C*

0,1 ml zmrazené buněčné suspenze pro transformaci se rozpustí na ledu, zahřívá při 43,5 °C po dobu 10 minut a přenese se na led. Po přidání 2 μΐ vodného roztoku obsahujícího přibližně 2 μg pRI109 DNA se buněčná suspenze přenese do předem ledem ochlazení E. coli GenePulser kyvety (BioRad) a potom se DNA vloží do buněk při 25 μΓ, 200 Ω a 1,5 kV elektroporací za použití GenePulser (BioRad). Ihned po elektroporací se celá buněčná suspenze přenese do 15 ml testovací zkumavky obsahující 1 ml kapalného media a kultivuje se za třepání po dobu 1 hodiny při teplotě 30 °C.

Získaný roztok kultury se odstředí během 10 minut při 3500 »· ·· · · ·· · • · · · ·· ·· · · ·· • · · · * » · · ···· · ····· ··· · · ··· ·· ···· ··· ... ,, ,,, rpm pro vysrážení buněk. Po odstranění supernatantu se buňky suspendují přidáním 0,1 ml kapalného media a potom se suspenze aplikuje na agarové medium (které se solidifikuje pomocí 2% Difco agaru) obsahující 20 gg/ml kanamycinu a provede se kultivace po dobu 2 dnů při 30 °C za zisku transformantů.

Takto se získá kmen ATCC 13032 C. glutamicum obsahující pRI109.

Způsobem uvedeným výše se získají kmeny ATCC13032 obsahující jeden z plasmidů pRIyjiB, pSYN2-72, pSYN2-39.

Získané transformanty se naočkují do testovacích zkumavek, které obsahují 3 ml kapalného media obsahujícího 100 gg/ml kanamycinu a provede se kultivace za třepání po dobu 24 hodin při 30 °C. Kultura (0,2 ml) se naočkuje do testovací zkumavky obsahující 2 ml LMC media (ve kterém se samostatně sterilizovaná glukosa, MgSCh, FeSO4, MnSO₄ přidají do pre-LMC media sterilizovaného v autoklávu (NH4CI 1 g/1, KH2PO4 1 g/1, K2HPO4 3 g/1, Difco kvasinkový extrakt 0,2 g/1, močovina 1 g/1, biotin 0,05 mg/1, thiamin 0,5 mg/1, Corn Steep Liquor 10 g/1; pH 7,2) v konečné koncentraci 30 g/1, 0,1 g/1, 2 mg/1 a 2 mg/1, v příslušném pořadí), kde medium obsahuje 100 pg/ml kanamycinu, a provede se kultivace za třepání po dobu 5 hodin při 30 °C. Sloučenina (VlI-a) (kde R je Na) se přidá do media v konečné koncentraci 300 mg/1 a směs reaguje za třepání po dobu 16 hodin při 30 °C.

0,5 ml reakčního roztoku se přenese do 1,5 ml zkumavky a provede se odstředění po dobu 2 minut při 15000 rpm pro separaci buněk. Získaný supernatant se naředí 5-20-krát methanolem a odstředí se během 2 minut při 15000 rpm a potom se jeho podíl použije pro HPLC analýzu jako v příkladu 1 pro

JU · · · · ····«· •4« · 4 4 44

4444 «44 «44 4«4 4*· detekci a kvantifikaci sloučeniny (VlII-a) (kde R¹ je Na) .

Koncentrace sloučeniny (VlII-a) v reakčním roztoku se vypočte z výsledků kvantifikace a je uvedena v tabulce 4.

Tabulka 4

Plasmid	Sloučenina (VlII-a) (mg/ml)
pRI109	0,3
pSYN2-72	30
pRIyjiB	61
pSYN239	104

Příklad 6: Vloženi plasmidu do koryneformních bakterií a hodnocení aktivity pRIyjiB DNA získaná v příkladu 4 se vloží do C. callunae ATCC15991, C. ammoniagenese ATCC6872 a B.flavum ATCC14067 stejným způsobem, jako při transformaci kmene ATCC13032, která byla popsána v příkladu 5, a pro každý kmen se získají transformanty.

Získané transformanty se naočkují do 3 ml kapalného media v testovacích zkumavkách obsahujících 100 μg/ml kanamycinu a provede se kultivace za třepání po dobu 24 hodin při 30 °C. Kultura (0,5 ml) se přenese do testovací zkumavky obsahující 5 ml TB media (ve kterém je 14 g Bacto Tryptonu (Difco) a 24 g Bacto kvasinkového extraktu (Difco) rozpuštěno v 900 ml vody a sterilizováno v autoklávu, a do této směsi je přidáno 100 ml PB (KH2PO4 23,1 g/1, K2HPO4 125,1 g/1) samostatně sterilizovaného v autoklávu), kde toto medium obsahuje 100 gg/ml kanamycinu a 10 g/1 glukosy, a provede se kultivace za třepání po dobu 5 hodin při teplotě 30 °C. Kultura (1 ml) se přenese do assist zkumavky (ASSIST) a sloučenina (VlI-a) (kde R znamená Na) se do kultury přidá v konečné koncentraci 300

5Ί

• *	«9	9	«	♦ *	•
•	to	• »	« to	to·	• ·	• to
to	9	•	•	to	« to	•
to	*	• ·	•	•	• H 9	•
•	•	•	•	•	• *	•
··	·*··	*<·	« · ·	to to	*·

mg/1 a směs reaguje za třepání po dobu 16 hodin při 30 °C.

Po dokončení reakce se sloučenina (VIII-a) (kde R¹ znamená Na) v kultuře detekuje a kvantifikuje způsobem podle příkladu 2. Koncentrace sloučeniny (VIII-a) v kultuře se vypočte z výsledků kvantifikace a je uvedena v tabulce 5.

Tabulka 5

Hostitelská buňka	Plasmid	Sloučenina (VIII-a) (mg/ml)
C.callunae ATCC15991 (KY3510)	pRIyjiB	22
C.ammoniagenes ATCC6872 (KY3454)	pRIyjiB	12
B. flavum ATCC14067 (KY10122)	pRIyjiB	23

Průmyslové použití

Předkládaný vynález umožňuje účinnou produkci DNA kódující novou hydroxylasu a sloučeninu inhibující hydroxymethylglutaryl CoA (HMG-CoA) reduktasu a způsobující snížení sérového cholesterolu.

Volný popis seznamu sekvencí

SEQ ID NO:	3	- syntetická DNA
SEQ ID NO:	4	- syntetická DNA
SEQ ID NO:	5	- syntetická DNA
SEQ ID NO:	6	- syntetická DNA
SEQ ID NO:	7	- syntetická DNA
SEQ ID NO:	8	- syntetická DNA
SEQ ID NO:	9	- syntetická DNA
SEQ ID NO:	10	- syntetická DNA
SEQ ID NO:	11	- syntetická DNA

SEQ ID NO:	12	- syntetická DNA
SEQ ID NO:	13	- syntetická DNA
SEQ ID NO:	14	- syntetická DNA
SEQ ID NO:	15	- syntetická DNA
SEQ ID NO:	16	- syntetická DNA
SEQ ID NO:	17	- syntetická DNA
SEQ ID NO:	18	- syntetická DNA
SEQ ID NO:	19	- syntetická DNA
SEQ ID NO:	20	- syntetická DNA
SEQ ID NO:	21	- syntetická DNA
SEQ ID NO:	22	- syntetická DNA
SEQ ID NO:	23	- syntetická DNA
SEQ ID NO:	24	- syntetická DNA
SEQ ID NO:	25	- syntetická DNA
SEQ ID NO:	26	- syntetická DNA
SEQ ID NO:	27	- syntetická DNA
SEQ ID NO:	28	- syntetická DNA
SEQ ID NO:	29	- syntetická DNA
SEQ ID NO:	30	- syntetická DNA
SEQ ID NO:	31	- syntetická DNA
SEQ ID NO:	32	- syntetická DNA
SEQ ID NO:	33	- syntetická DNA
SEQ ID NO:	34	- syntetická DNA
SEQ ID NO:	35	- syntetická DNA
SEQ ID NO:	36	- syntetická DNA
SEQ ID NO:	37	- syntetická DNA
SEQ ID NO:	38	- syntetická DNA
SEQ ID NO:	39	- syntetická DNA
SEQ ID NO:	40	- syntetická DNA

Seznam sekvencí <110> KYOWA HAKKO KOGYO CO., LTD <120> Způsob výroby inhibitorů HMG-CoA reduktasy <130> H110011T4 <160> 45 <170> Patentln verze 2.0 <400> Γ ; Met Asn Val Leu Asn Arg Arg Gin Ala Leu Gin Arg Ala Leu Leu Asn ! . 1 5 1015 í

Gly Lys Asn Lys Gin Asp Ala Tyr His Pro Phe Pro Trp Tyr Glu Ser 20 2530

Met Arg Lys Asp Ala Pro Val Ser Phe Asp Glu Glu Asn Gin Val Trp 35 4045

Ser Val Phe Leu Tyr Asp Asp Val Lys Lys Val Val Gly Asp Lys Glu 50 5560

Leu Phe Ser Ser Cys Met Pro Gin Gin Thr Ser Ser lle Gly Asn Ser 65 70 7580

- lle lle Asn Met Asp Pro Pro Lys His Thr Lys lle Arg Ser Val Val

9095 | Asn Lys Ala Phe Thr Pro Arg Val Met Lys Gin Trp Glu Pro Arg lle

100 105110

Gin Glu lle Thr Asp Glu Leu lle Gin Lys Phe Gin Gly Arg Ser Glu 115 120125 l

Phe Asp Leu Val His Asp Phe Ser Tyr Pro Leu Pro Val lle Val lle 130 135140

Ser Glu Leu Leu Gly Val Pro Ser Ala His Met Glu Gin Phe Lys Ala i 145 150 155160

Trp Ser Asp Leu Leu Val Ser Thr Pro Lys Asp Lys Ser Glu Glu Ala

165 170175

Glu Lys Ala Phe Leu Glu plu Arg Asp Lys Cys Glu Glu Glu Leu Ala 180 185190

Ala Phe Phe Ala Gly lle lle Glu Glu Lys Arg Asn Lys Pro Glu Gin 195 200205

Asp lle lle Ser lle Leu Val Glu Ala Glu Glu Thr Gly Glu Lys Leu • ·

Λ ··♦········ • · · · · · · ···· · · · · · · · · ···· ti v ···· ··· ··· · · ·

210 215220

Ser Gly Glu Glu Leu lle Pro Phe Cys Thr Leu Leu Leu Val Ala Gly 225 230 235240

Asn Glu Thr Thr Thr Asn Leu lle Ser Asn Ala Met Tyr Ser lle Leu 245 250255

Glu Thr Pro Gly Val Tyr Glu Glu Leu Arg Ser His Pro Glu Leu Met 260 265270

Pro Gin Ala Val Glu Glu Ala Leu Arg Phe Arg Ala Pro Ala Pro Val 275 280285

Leu Arg Arg lle Ala Lys Arg Asp Thr Glu lle Gly Gly His Leu lle 290 295300

Lys Glu Gly Asp Met Val Leu Ala Phe Val Ala Ser Ala Asn Arg Asp 305 310 315320

Glu Ala Lys Phe Asp Arg Pro His Met Phe Asp lle Arg Arg His Pro 325 330335

Asn Pro His lle Ala Phe Gly His Gly lle His Phe Cys Leu Gly Ala 340 345350

Pro Leu Ala Arg Leu Glu Ala Asn lle Ala Leu Thr Ser Leu lle Ser 355 360365

Ala Phe Pro His Met Glu Cys Val Ser lle Thr Pro lle Glu Asn Ser 370 375380

Val lle Tyr Gly Leu Lys Ser Phe Arg Val Lys Met

385 390395 <210>2 <211>1191 <212> DNA <213> Bacillus subtilis <220>

<221>CDS <222> (1)..(1191) <400> 2 atg aat gtg tta aac cgc cgg caa gcc ttg cag ega gcg ctg ctc aat 48 Met Asn Val Leu Asn Arg Arg Gin Ala Leu Gin Arg Ala Leu Leu Asn 15 1015 ggg aaa aac aaa cag gat gcg tat cat ccg ttt cca tgg tat gaa tcg 96 Gly Lys Asn Lys Gin Asp Ala Tyr His Pro Phe Pro Trp Tyr Glu Ser 20 2530 atg aga aag gat gcg cct gtt tcc ttt gat gaa gaa aac caa gtg tgg 144 Met Arg Lys Asp Ala Pro Val Ser Phe Asp Glu Glu Asn Gin Val Trp 35 4045 age gtt ttt ctt tat gat gat gtc aaa aaa gtt gtt ggg gat aaa gag 192

Ser Val Phe Leu Tyr Asp Asp Val Lys Lys Val Val Gly Asp Lys Glu 50 5560 ttg ttt tcc agt tgc atg ccg cag cag aca agc tet att gga aat tcc 240 Leu Phe Ser Ser Cys Met Pro Gin Gin Thr Ser Ser lle Gly Asn Ser 65 70 7580 atc att aac atg gac ccg ccg aag cat aca aaa atc cgt tea gtc gtg 288 lle lle Asn Met Asp Pro Pro Lys His Thr Lys lle Arg Ser Val Val

9095 aac aaa gcc ttt act ccg ege gtg atg aag caa tgg gaa ccg aga att 336 Asn Lys Ala Phe Thr Pro Arg Val Met Lys Gin Trp Glu Pro Arg lle 100 105110 caa gaa atc aca gat gaa ctg att caa aaa ttt cag ggg ege agt gag 384 Gin Glu lle Thr Asp Glu Leu lle Gin Lys Phe Gin Gly Arg Ser Glu

115 120125 ttt gac ctt gtt cac gat ttt tea tac ccg ctt ccg gtt att gtg ata 432

Phe Asp Leu Val His Asp Phe Ser Tyr Pro Leu Pro Val lle Val lle 130 135140 tet gag ctg ctg gga gtg cct tea gcg cat atg gaa cag ttt aaa gca 480 Ser Glu Leu Leu Gly Val Pro Ser Ala His Met Glu Gin Phe Lys Ala 145 150 155160 tgg tet gat ctt ctg gtc agt aca ccg aag gat aaa agt gaa gaa get 528 Trp Ser Asp Leu Leu Val Ser Thr Pro Lys Asp Lys Ser Glu Glu Ala 165 170175 gaa aaa gcc ttt ttg gaa gaa ega gat aag tgt gag gaa gaa ctg gcc 576 Glu Lys Ala Phe Leu Glu Glu Arg Asp Lys Cys Glu Glu Glu Leu Ala 180 185190 gcg ttt ttt gcc ggc atc ata gaa gaa aag ega aac aaa ccg gaa cag 624 Ala Phe Phe Ala Gly lle lle Glu Glu Lys Arg Asn Lys Pro Glu Gin

195 200205 gat att att tet att tta gtg gaa gcg gaa gaa aca ggc gag aag ctg 672 Asp lle lle Ser lle Leu Val Glu Ala Glu Glu Thr Gly Glu Lys Leu

210 215220 tcc ggt gaa gag ctg att ccg ttt tgc acg ctg ctg ctg gtg gcc gga 720 Ser Gly Glu Glu Leu lle Pro Phe Cys Thr Leu Leu Leu Val Ala Gly 225 230 235240 aat gaa acc act aca aac ctg att tea aat gcg atg tac agc ata tta 768 Asn Glu Thr Thr Thr Asn Leu lle Ser Asn Ala Met Tyr Ser lle Leu 245 250255 gaa acg cca ggc gtt tac gag gaa ctg ege agc cat cct gaa ctg atg 816 Glu Thr Pro Gly Val Tyr Glu Glu Leu Arg Ser His Pro Glu Leu Met 260 265270 cct cag gca gtg gag gaa gcc ttg cgt ttc aga gcg ccg gcc ccg gtt 864 Pro Gin Ala Val Glu Glu Ala Leu Arg Phe Arg Ala Pro Ala Pro Val 275 280285 ttg agg cgc att gcc aag cgg gat acg gag atc ggg ggg cac ctg att 912 Leu Arg Arg lle Ala Lys Arg Asp Thr Glu lle Gly Gly His Leu lle

290 295300 aaa gaa ggt gat atg gtt ttg gcg ttt gtg gca tcg gca aat cgt gat 960 Lys Glu Gly Asp Met Val Leu Ala Phe Val Ala Ser Ala Asn Arg Asp 305 310 315320 gaa gca aag ttt gac aga ccg cac atg ttt gat atc cgc cgc cat ccc 1008 Glu Ala Lys Phe Asp Arg Pro His Met Phe Asp lle Arg Arg His Pro 325 330335 aat ccg cat att gcg ttt ggc cac ggc atc cat ttt tgc ctt ggg gcc 1056 Asn Pro His lle Ala Phe Gly His Gly lle His Phe Cys Leu Gly Ala 340 345350 ccg ctt gcc cgt ctt gaa gca aat atc gcg tta acg tet ttg att tet 1104

Pro Leu Ala Arg Leu Glu Ala Asn lle Ala Leu Thr Ser Leu lle Ser 355 360365 get ttt cct cat atg gag tgc gtc agt atc act ccg att gaa aac agt 1152 Ala Phe Pro His Met Glu Cys Val Ser lle Thr Pro lle Glu Asn Ser

370 375380 gtg ata tac gga tta aag age ttc cgt gtg aaa atg taa1191

Val lle Tyr Gly Leu Lys Ser Phe Arg Val Lys Met

385 390395 <210>3 <211 >39 <212> DNA <213>'Artificiální sekvence <220>

<223> Syntetická DNA <400> 3 tttggatccg aattcaaaag tgctggcgct gttccgttt 39 <210>4 <211> 41 <212> DNA <213>; Artificiální sekvence <220>

<223> Syntetická DNA <400> 4 gtgggatccg tcgaccactt ttttcacgat gttcactccc c 41 <210>5 <211 >39 <212> DNA <213> Artificiální sekvence <220>

I • · · · · • ♦ * · · · ♦ • · · ·

<223> Syntetická DNA <400>5 ccaggatcct ctagatggtg aaatggttgt tgccgctct 39 <210 6 <211>39 <212> DNA <213^>| Artificiální sekvence <220 <223> Syntetická DNA <400 6 tcaggatccc ccgggtgagc ggcaaatcca cccaccctg 39 <210> 7 <211 >37 <212> DNA <213> Artificiální sekvence <220>

<223> Syntetická DNA <400 7 taagcgcgcc ccgggttaat tggatgggcg aaagctc 37 <210> 8 <211 >39 <212> DNA <213>; Artificiální sekvence <220>

<223> Syntetická DNA <400 8 atcgcgcgcg tcgacgatag cggcagaaaa ttggcggca <210>9 <211>38 <212> DNA <213> i Artificiální sekvence <220 <223> Syntetická DNA <400 9 agcggatccg aattcgctgg aatcaaaagt cggccaga 38 <210 10 <211 >38 <212>DNA <213> Artificiální sekvence • ·

<220>

<223>! Syntetická DNA <400> 10 tcaggatccg tcgactgaga aaacacaaac gccccctc 38 <210> 11 <211 >39 <212> DNA <213>( Artificiálni sekvence <220>

<223> I Syntetická DNA <400> 11 atgggatcct ctagacatgt tgtagtttgg gttggaatc 39 <210> 12 <211 >42 <212> DNA <213> j Artificiálni sekvence <220>

<223> I Syntetická DNA <400> 12 gccggatcca gatctggcat cacacaacaa taaatacacc gc 42 <210>13 <211> 39 <212>DNA <213>! Artificiálni sekvence <220>.

<223> I Syntetická DNA <400>13 tctggatcct ctagaagaga acacaaagag tacgaatgc 39 <210> 14 <211> 41 <212> DNA ^<213>!Artificiálni sekvence <220> , <223> I Syntetická DNA <400> 14 aaaggatccc ccgggtttac cagccagcgc aacaaagtca t 41 <210> 15 <211 >39 <212> DNA <213> i Artificiálni sekvence ·· ·· ♦ φ ♦* • · · · · · φ φ ·»φ φ · · · · · · <223> Syntetická DNA <400> 15 cctgaattct ctagaaggct ttcaccacgt attttgctg 39 <210> 16 <211> 41 <212> DNA <213> Artificíálni sekvence <220> , <223> Syntetická DNA <400> 16 tctgaattcc ccgggagaac aaaatgccaa aagcctgagtc 41 <210> 17 <211 >34 <212> DNA <213>i Artificíálni sekvence <220>

<223>I Syntetická DNA <400> 17.

aatactagta caattgcatc gtcaactgca tctt 34 <210> 18 <211 >41 <212> DNA <213>i artificíálni sekvence <220>

<223>! Syntetická DNA <400> 18 gtgggatccg tcgaccactt ttttcacgat gttcactccc c 41 <210> 19 <211 >34 <212> DNA <213> Artificíálni sekvence <220>

<223>| Syntetická DNA <400> 19 gaaactagtt cttcaaaaga aaaaaagagt gtaa <210> 20 <211> 39 <212> DNA <213| Artificíálni sekvence

<220> <223>i Syntetická DNA
<400> 20 tcaggatccc ccgggtgagc ggcaaatcca cccaccctg	39
<210>21 <211>34 <212> DNA <213>) Artificiálni sekvence <220> <223> Syntetická DNA <400> 21 taaactagta gccaatcgat taaattgttt agtg	34
<210> 22 <211 >34 <212> DNA <213>i Artificiálni sekvence <220> <223> Syntetická DNA <400> 22 ggaggtacct tatgccccgt caaacgcaac gaga	34
<210> 23 <211 >34 <212> DNA ^<213> Artificiálni sekvence <220> <223>: Syntetická DNA <400> 23 aggactagtc aaatggaaaa attgatgttt catc	34
<210> 24 <211 >38 <212> DNA <213> Artificiálni sekvence <220>, <223> Syntetická DNA <400> 24 tcaggatccg tcgactgaga aaacacaaac gccccctc	□@38

<210> 25 <211> 34 <212> DNA <213>| ^_r^ificiální sekvence

k	67 (	• · · · ·· ·· • · · · · • ♦ ♦ · · • · ···· · · · ···
<220> <223> syntetická DNA <400> 25 ggtactagta aggaaacaag cccgattcct cagc	34
<210> 26 <211 >42 <212> DNA <213>*Artificiálni sekvence <220> <223> í Syntetická DNA		z
<400> 26 gccggatcca gatctggcat cacacaacaa taaatacacc gc	42
<210> 27 <211 >38 <212> DNA <213>, Artificiální sekvence <220> <223> i Syntetická DNA <400> 27 ttggatccac tagtaatgtg ttaaaccgcc ggcaagcc	38
<210> 28 <211> <211>41 <212> DNA <213>r Artificiální sekvence <220> <223> j Syntetická DNA <400> 28 aaaggatccc ccgggtttac cagccagcgc aacaaagtca t	41
<210> 29 <211 >34 <212> DNA ^<213> . Artificiální sekvence <220> <223>; syntetická DNA <400> 29 atgactagta aacaggcaag cgcaatacct cagc	34

<210> 30 <211 >34 <212> DNA (

<213> Artificiální sekvence <220>

<223>! Syntetická DNA <400 30 tttggtacct tacattcctg tccaaacgtc tttc 34 <210> 31 <211 >29 <212> DNA <213>iArtificiální sekvence <220>

<223^ Syntetická DNA <400> 31 agcggtcgac aatgaatgtg ttaaaccgc 29 <210> 32 <211 >29 <212> DNA <213>i Artificiální sekvence <220>

<223> Syntetická DNA <400 32 acgcggatcc ttacattttc acacggaag 29 <210> 33 <211>24 <212> DNA <213> Artificiální sekvence <220>

<223>. syntetická DNA <400 33 cgccagggtt ttcccagtca cgac 24 <210> 34 <211> 18 <212> DNA <213> Artificiální sekvence <220>

<223> - Syntetická DNA <400 34 cgcaatatgc ggattggg 18 <210 35 <211> 18 • ·

<212> DNA ^<213> Artificiální sekvence <220>

<223> Syntetická DNA <400> 35 tttccggcca ccagcagc 18 <210> 36 <211> 18 <212> DNA <213>; Artificiální sekvence <220>

<223> Syntetická DNA <400> 36 taaccggaag cgggtatg 18 <210> 37 <211> 18 <212> DNA <213> Artificiální sekvence <220>

<223> i Syntetická DNA <400> 37 aaggaaacag gcgcatcc 18 <210> 38 <211 >67 <212> DNA <213>Artificiální sekvence <220>

<223>· Syntetická DNA <400> 38 tcgcctcgag tcgaggaggt cgactaatat gaacgttctg aaccgccgtc aagccttgca 60 gcgagcg 67 <210> 39 <211>28 <212> DNA <213> Artificiální sekvence <220>

<223> Syntetická DNA <400> 39 tcgcggatcc ttacattttc acacggaa

ΊΟ <210> 40 <211> 715 <212> DNA <213> Artificiální sekvence <220>

<223>' Syntetická DNA <400> 40 cctgcaggtc atcacccgag caggcgaccc gaacgttcgg aggctcctcg ctgtccattc 60 gctcccctgg cgcggtatga accgccgcct catagtgcag tttgatcctg acgagcccag 120 catgtctgcg cccaccttcg cggaacctga ccagggtccg ctagcgggcg gccggaaggt 180 gaatgctagg catgatctaa ccctcggtct ctggcgtcgc gactgcgaaa tttcgcgagg 240 gtttccgaga aggtgattgc gcttcgcaga tctcgtggac ggcttggttg acgccctccg 300 cccattgggt gatggtggca ccatttggct gttgactcct ggtgcaggaa aacgtggaac 360 tattgctcca ggtgaaattt ccgaatccgc acaattggca ggcctcgtcc agaccaccgc 420 agagcgtctc ggtgattggc agggcagctg cttggtcgcg cgcggcgcga tgaagaagta 480 agaattagcc gaaaacacct tccagccagg cgatttgctt aagttagaag gtgtggctag 540 tattctaaga gtgctcatga ggaagcggaa agcttttaag agagcatgat gcggctttag 600 ctcagctgga agagcaactg gtttacaccc agtaggtcgg gggttcgatc cagctgtgaa 660 caattgcact ttggatctaa ttaagggatt agtcgactat ggatccccgg gtacc 715 <210> 41 <211>1204 <212> DNA <213> Bacillus subtilis <220>

<221>CDS <222> (8)..(1195) <400> 41 gtcgaca atg aat gtg tta aac cgc cgg caa gcc ttg cag ega gcg ctg 49 Met Asn Val Leu Asn Arg Arg Gin Ala Leu Gin Arg Ala Leu 1 510 ctc aat ggg aaa aac aaa cag gat gcg tat cat ccg ttt cca tgg tat 97 Leu Asn Gly Lys Asn Lys Gin Asp Ala Tyr His Pro Phe Pro Trp Tyr 15 20 2530 gaa tcg atg aga aag gat gcg cct gtt tcc ttt gat gaa gaa aac caa 145 Glu Ser Met Arg Lys Asp Ala Pro Val Ser Phe Asp Glu Glu Asn Gin 35 4045 gtg tgg age gtt ttt ctt tat gat gat gtc aaa aaa gtt gtt ggg gat 193

Val Trp Ser Val Phe Leu Tyr Asp Asp Val Lys Lys Val Val Gly Asp 50 5560 i )

aaa gag ttg ttt tcc agt tgc atg ccg cag cag aca agc tet att gga 241 Lys Glu Leu Phe Ser Ser Cys Met Pro Gin Gin Thr Ser Ser lle Gly 65 7075 aat tcc atc att aac atg gac ccg ccg aag cat aca aaa atc cgt tea 289 Asn Ser lle lle Asn Met Asp Pro Pro Lys His Thr Lys lle Arg Ser 80 8590 gtc gtg aac aaa gcc ttt act ccg ege gcg atg aag caa tgg gaa ccg 337 Val Val Asn Lys Ala Phe Thr Pro Arg Ala Met Lys Gin Trp Glu Pro

100 105110 aga att caa gaa atc aca gat gaa ctg att caa aaa ttt cag ggg ege 385 Arg lle Gin Glu lle Thr Asp Glu Leu lle Gin Lys Phe Gin Gly Arg 115 120125 agt gag ttt gac ctt gtt cac gat ttt tea tac ccg ctt ccg gtt att 433

Ser Glu Phe Asp Leu Val His Asp Phe Ser Tyr Pro Leu Pro Val lle 130 135140 gtg ata tet gag ctg ctg gga gtg cct tea gcg cat atg gaa cag ttt 481 Val lle Ser Glu Leu Leu Gly Val Pro Ser Ala His Met Glu Gin Phe 145 150155 aaa gca tgg tet gat ctt ctg gtc agt aca ccg aag gat aaa agt gaa 529 Lys Ala Trp Ser Asp Leu Leu Val Ser Thr Pro Lys Asp Lys Ser Glu 160 165170 gaa get gaa aaa gcc ttt ttg gaa gaa ega gat aag tgt gag gaa gaa 577 Glu Ala Glu Lys Ala Phe Leu Glu Glu Arg Asp Lys Cys Glu Glu Glu 175 180 185190 ctg gcc gcg ttt ttt gcc ggc atc ata gaa gaa aag ega aac aaa ccg 625 Leu Ala Ala Phe Phe Ala Gly lle lle Glu Glu Lys Arg Asn Lys Pro 195 200205 gaa cag gat att att tet att tta gtg gaa gcg gaa gaa aca ggc gag 673 Glu Gin Asp lle lle Ser lle Leu Val Glu Ala Glu Glu Thr Gly Glu

210 215220 aag ctg tcc ggt gaa gag ctg att ccg ttg tgc acg ctg ctg ctg gtg 721 Lys Leu Ser Gly Glu Glu Leu lle Pro Leu Cys Thr Leu Leu Leu Val 225 230235 gcc gga aat gaa acc act aca aac ctg att tea aat gcg atg tac agc 769 Ala Gly Asn Glu Thr Thr Thr Asn Leu lle Ser Asn Ala Met Tyr Ser 240 245250 ata tta gaa acg cca ggc gtt tac gag gaa ctg ege agc cat cct gaa 817 lle Leu Glu Thr Pro Gly Val Tyr Glu Glu Leu Arg Ser His Pro Glu 255 260 265270 ctg atg cct cag gca gtg gag gaa gcc ttg cgt ttc aga gcg ccg gcc 865 Leu Met Pro Gin Ala Val Glu Glu Ala Leu Arg Phe Arg Ala Pro Ala 275 280285 ccg gtt ttg agg ege att gcc aag cgg gat acg gag atc ggg ggg cac 913 Pro Val Leu Arg Arg lle Ala Lys Arg Asp Thr Glu lle Gly Gly His

290 295300 • · ctg att aaa gaa ggt gat atg gtt ttg gcg ttt gtg gca tcg gca aat 961

Leu lle Lys Glu Gly Asp Met Val Leu Ala Phe Val Ala Ser Ala Asn 305 310315 cgt gat gaa gca aag ttt gac aga ccg cac atg ttt gat atc cgc cgc 1009 Arg Asp Glu Ala Lys Phe Asp Arg Pro His Met Phe Asp lle Arg Arg 320 325330 cat ccc aat ccg cat att gcg ttt ggc cac ggc atc cat ttt tgc ctt 1057 His Pro Asn Pro His lle Ala Phe Gly His Gly lle His Phe Cys Leu 335 340 345350 ggg gcc ccg ctt gcc cgt ctt gaa gca aat atc gcg tta acg tet ttg 1105 Gly Ala Pro Leu Ala Arg Leu Glu Ala Asn lle Ala Leu Thr Ser Leu 355 360365 att tet get ttt cct cat atg gag tgc gtc agt atc act ccg att gaa 1153 lle Ser Ala Phe Pro His Met Glu Cys Val Ser lle Thr Pro lle Glu 370 375380 aac agt gtg ata tac gga tta aag age ttc cgt gtg aaa atg taaggatcc 1204 Asn SerVal lle Tyr Gly Leu Lys Ser Phe Arg Val Lys Met

385 390395 <210>42 <211 >396 <212> PRT <213> Bacillus subtilis <400> 42

Met Asn Val Leu Asn Arg Arg Gin Ala Leu Gin Arg Ala Leu Leu Asn 15 1015

Gly Lys Asn Lys Gin Asp Ala Tyr His Pro Phe Pro Trp Tyr Glu Ser 20 2530

Met Arg Lys Asp Ala Pro Val Ser Phe Asp Glu Glu Asn Gin Val Trp 35 4045

Ser Val Phe Leu Tyr Asp Asp Val Lys Lys Val Val Gly Asp Lys Glu 50 5560

Leu Phe Ser Ser Cys Met Pro Gin Gin Thr Ser Ser lle Gly Asn Ser 65 70 7580 lle lle Asn Met Asp Pro Pro Lys His Thr Lys lle Arg Ser Val Val

9095

Asn Lys Ala Phe Thr Pro Arg Ala Met Lys Gin Trp Glu Pro Arq lle 100 105110

Gin Glu lle Thr Asp Glu Leu lle Gin Lys Phe Gin Gly Arg Ser Glu 115 120125

Phe Asp Leu Val His Asp Phe Ser Tyr Pro Leu Pro Val lle Val lle 130 135140

Ser Glu Leu Leu Gly Val Pro Ser Ala His Met Glu Gin Phe Lys Ala

145 150 155160

Trp Ser Asp Leu Leu Val Ser Thr Pro Lys Asp Lys Ser Glu Glu Ala 165 170175

Glu Lys Ala Phe Leu Glu Glu Arg Asp Lys Cys Glu Glu Glu Leu Ala 180 185190

Ala Phe Phe Ala Gly lle lle Glu Glu Lys Arg Asn Lys Pro Glu Gin 195 200205

Asp lle lle Ser lle Leu Val Glu Ala Glu Glu Thr Gly Glu Lys Leu 210 215220

Ser Gly Glu Glu Leu lle Pro Leu Cys Thr Leu Leu Leu Val Ala Gly 225 230 235240

Asn Glu Thr Thr Thr Asn Leu lle Ser Asn Ala Met Tyr Ser lle Leu 245 250255

Glu Thr Pro Gly Val Tyr Glu Glu Leu Arg Ser His Pro Glu Leu Met 260 265270

Pro Gin Ala Val Glu Glu Ala Leu Arg Phe Arg Ala Pro Ala Pro Val 275 280285

Leu Arg Arg lle Ala Lys Arg Asp Thr Glu lle Gly Gly His Leu lle 290 295300

Lys Glu Gly Asp Met Val Leu Ala Phe Val Ala Ser Ala Asn Arg Asp 305 310 315320

Glu Ala Lys Phe Asp Arg Pro His Met Phe Asp lle Arg Arg His Pro 325 330335

Asn Pro His lle Ala Phe Gly His Gly lle His Phe Cys Leu Gly Ala 340 345350

Pro Leu Ala Arg Leu Glu Ala Asn lle Ala Leu Thr Ser Leu lle Ser 355 360365

Ala Phe Pro His Met Glu Cys Val Ser lle Thr Pro lle Glu Asn Ser 370 375380

Val lle Tyr Gly Leu Lys Ser Phe Arg Val Lys Met

385 390395 <210> 43 <211> 1221 <212> DNA <213> Bacillus subtilis <220>

<221>CDS <222> (25)..(1212) <400> 43 ctcgagtcga ggaggtcgac taat atg aac gtt ctg aac cgc cgt caa gcc 51

I «· * * •· · •· * · • ·· ·« ♦·<· •t ·· * « · • e ·· • ♦· « · · · ·· ··« ♦ · *· ·

Met Asn Val Leu Asn Arg Arg Gin Ala ttg cag ega gcg ctg ctc aat ggg aaa aac aaa cag gat gcg tat cat 99 Leu Gin Arg Ala Leu Leu Asn Gly Lys Asn Lys Gin Asp Ala Tyr His 10 15 2025 ccg ttt cca tgg tat gaa tcg atg aga aag gat gcg cct gtt tcc ttt 147

Pro Phe Pro Trp Tyr Glu Ser Met Arg Lys Asp Ala Pro Val Ser Phe 30 3540 gat gaa gaa aac caa gtg tgg agc gtt ttt ctt tat gat gat gtc aaa 195 Asp Glu Glu Asn Gin Val Trp Ser Val Phe Leu Tyr Asp Asp Val Lys 45 5055 aaa gtt gtt ggg gat aaa gag ttg ttt tcc agt tgc atg ccg cag cag 243 Lys Val Val Gly Asp Lys Glu Leu Phe Ser Ser Cys Met Pro Gin Gin 60 6570 aca agc tet att gga aat tcc atc att aac atg gac ccg ccg aag cat 291 Thr Ser Ser lle Gly Asn Ser lle lle Asn Met Asp Pro Pro Lys His 75 8085 aca aaa atc cgt tea gtc gtg aac aaa gcc ttt act ccg ege gtg atg 339 Thr Lys lle Arg Ser Val Val Asn Lys Ala Phe Thr Pro Arg Val Met 90 95 100105 aag caa tgg gaa ccg aga att caa gaa atc aca gat gaa ctg att caa 387 Lys Gin Trp Glu Pro Arg lle Gin Glu lle Thr Asp Glu Leu lle Gin

110 115120 aaa ttt cag ggg ege agt gag ttt gac ctt gtt cac gat ttt tea tac 435

Lys Phe Gin Gly Arg Ser Glu Phe Asp Leu Val His Asp Phe Ser Tyr 125 130135 ccg ctt ccg gtt att gtg ata tet gag ctg ctg gga gtg cct tea gcg 483

Pro Leu Pro Val lle Val lle Ser Glu Leu Leu Gly Val Pro Ser Ala 140 145150 cat atg gaa cag ttt aaa gca tgg tet gat ctt ctg gtc agt aca ccg 531

His Met Glu Gin Phe Lys Ala Trp Ser Asp Leu Leu Val Ser Thr Pro 155 160165 aag gat aaa agt gaa gaa get gaa aaa gcc ttt ttg gaa gaa ega gat 579 Lys Asp Lys Ser Glu Glu Ala Glu Lys Ala Phe Leu Glu Glu Arg Asp 170 175 180185 aag tgt gag gaa gaa ctg gcc gcg ttt ttt gcc ggc atc ata gaa gaa 627 Lys Cys Glu Glu Glu Leu Ala Ala Phe Phe Ala Gly lle lle Glu Glu

190 195200 aag ega aac aaa ccg gaa cag gat att att tet att tta gtg gaa gcg 675 Lys Arg Asn Lys Pro Glu Gin Asp lle lle Ser lle Leu Val Glu Ala

205 210215 gaa gaa aca ggc gag aag ctg tcc ggt gaa gag ctg att ccg ttt tgc 723 Glu Glu Thr Gly Glu Lys Leu Ser Gly Glu Glu Leu lle Pro Phe Cys 220 225230 έ

• ·

acg ctg ctg ctg gtg gcc gga aat gaa acc act aca aac ctg att tca 771 Thr Leu Leu Leu Val Ala Gly Asn Glu Thr Thr Thr Asn Leu lle Ser 235 240245 aat gcg atg tac agc ata tta gaa acg cca ggc gtt tac gag gaa ctg 819 Asn Ala Met Tyr Ser lle Leu Glu Thr Pro Gly Val Tyr Glu Glu Leu 250 255 260265 cgc agc cat cct gaa ctg atg cct cag gca gtg gag gaa gcc ttg cgt 867 Arg Ser His Pro Glu Leu Met Pro Gin Ala Val Glu Glu Ala Leu Arg 270 275280 ttc aga gcg ccg gcc ccg gtt ttg agg cgc att gcc aag cgg gat acg 915 Phe Arg Ala Pro Ala Pro Val Leu Arg Arg lle Ala Lys Arg Asp Thr 285 290295 gag atc ggg ggg cac ctg att aaa gaa ggt gat atg gtt ttg gcg ttt 963 Glu lle Gly Gly His Leu lle Lys Glu Gly Asp Met Val Leu Ala Phe 300 305310 gtg gca tcg gca aat cgt gat gaa gca aag ttt gac aga ccg cac atg 1011 Val Ala Ser Ala Asn Arg Asp Glu Ala Lys Phe Asp Arg Pro His Met 315 320325 ttt gat atc cgc cgc cat ccc aat ccg cat att gcg ttt ggc cac ggc 1059 Phe Asp lle Arg Arg His Pro Asn Pro His lle Ala Phe Gly His Gly 330 335 340345 atc cat ttt tgc ctt ggg gcc ccg ctt gcc cgt ctt gaa gca aat atc 1107 lle His Phe Cys Leu Gly Ala Pro Leu Ala Arg Leu Glu Ala Asn lle 350 355360 gcg tta acg tet ttg att tet get ttt cct cat atg gag tgc gtc agt 1155 Ala Leu Thr Ser Leu lle Ser Ala Phe Pro His Met Glu Cys Val Ser 365 370375 atc act ccg att gaa aac agt gtg ata tac gga tta aag agc ttc cgt 1203 lle Thr Pro lle Glu Asn Ser Val lle Tyr Gly Leu Lys Ser Phe Arg 380 385390 gtg aaa atg taaggatcc1221

Val Lys Met

395 <210> 44 <211>1221 <212> DNA <213> Bacillus subtilis <221>CDS <221> (25)..(1212) <400> 44 ctcgagtcga ggaggtcgac taat atg aac gtt ctg aac cgc cgt caa gcc 51 Met Asn Val Leu Asn Arg Arg Gin Ala

5 ttg ccg ega gcg ctg ctc aat ggg aaa aac aaa cag gat gcg tat cat 99 Leu Pro Arg Ala Leu Leu Asn Gly Lys Asn Lys Gin Asp Ala Tyr His • 9·

15 2025 ccg ttt cca tgg tat gaa tcg atg aga aag gat gcg cct gtt tcc ttt 147 Pro Phe Pro Trp Tyr Glu Ser Met Arg Lys Asp Ala Pro Val Ser Phe 30 3540 gat gaa gaa aac caa gtg tgg agc gtt ttt ctt tat gat gat gtc aaa 195 Asp Glu Glu Asn Gin Val Trp SerVal Phe Leu Tyr Asp Asp Val Lys 45 5055 aaa gtt gtt ggg gat aaa gag ttg ttt tcc agt tgc atg ccg cag cag 243 Lys Val Val Gly Asp Lys Glu Leu Phe Ser Ser Cys Met Pro Gin Gin 60 6570 aca agc tet att gga aat tcc atc att agc atg gac ccg ccg aag cat 291 Thr Ser Ser lle Gly Asn Ser lle lle Ser Met Asp Pro Pro Lys His 75 8085 aca aaa atc cgt tea gtc gtg aac aaa gcc ttt act ccg ege gcg atg 339 Thr Lys lle Arg Ser Val Val Asn Lys Ala Phe Thr Pro Arg Ala Met 90 95 100105 aag caa tgg gaa ccg aga att caa gaa atc aca gat gaa ctg att caa 387 Lys Gin Trp Glu Pro Arg lle Gin Glu lle Thr Asp Glu Leu lle Gin 110 115120 aaa ttt cag ggg ege agt gag ttt gac ctt gtt cac gat tat tea tac 435 Lys Phe Gin Gly Arg Ser Glu Phe Asp Leu Val His Asp Tyr Ser Tyr 125 130135 ccg ctt ccg gtt att gtg ata tet gag ctg ctg gga gtg cct tea gcg 483

Pro Leu Pro Val lle Val lle Ser Glu Leu Leu Gly Val Pro Ser Ala

140 145150 cat atg gaa cag ttt aaa gca tgg tet gat ctt ctg gtc agt aca ccg 531 His Met Glu Gin Phe Lys Ala Trp Ser Asp Leu Leu Val Ser Thr Pro 155 160165 aag gat aaa agt gaa gaa get gaa aaa gcc ttt ttg gaa gaa ega gat 579 Lys Asp Lys Ser Glu Glu Ala Glu Lys Ala Phe Leu Glu Glu Arg Asp 170 175 180185 aag tgt gag gaa gaa ctg gcc gcg ttt ttt gcc ggc atc ata gaa gaa 627 Lys Cys Glu Glu Glu Leu Ala Ala Phe Phe Ala Gly lle lle Glu Glu 190 195200 aag ega aac aaa ccg gaa cag gat att att tet att tta gtg gaa gcg 675 Lys Arg Asn Lys Pro Glu Gin Asp lle lle Ser lle Leu Val Glu Ala 205 210215 gaa gaa aca ggc gag aag ctg tcc ggt gaa gag ctg att ccg ttg tgc 723 Glu Glu Thr Gly Glu Lys Leu Ser Gly Glu Glu Leu lle Pro Leu Cys 220 225230 acg ctg ctg ctg gtg gcc gga aat gaa acc act aca aac ctg att tea 771 Thr Leu Leu Leu Val Ala Gly Asn Glu Thr Thr Thr Asn Leu lle Ser 235 240245 aat gcg atg ttc agc ata tta gaa acg cca ggc gtt tac gag gaa ctg 819 • · · · · * • ·· · · · ·· · • · · · · ·

Asn Ala Met Phe Ser lle Leu Glu Thr Pro Gly Val Tyr Glu Glu Leu

250 255 260265 cgc agc cat cct gaa ctg atg ccc cag gca gtg gag gaa gcc ttg cgt 867 Arg Ser His Pro Glu Leu Met Pro Gin Ala Val Glu Glu Ala Leu Arg 270 275280 ttc aga gcg ccg gcc ccg gtt ttg agg cgc att gcc aag cgg gat acg 915 Phe Arg Ala Pro Ala Pro Val Leu Arg Arg lle Ala Lys Arg Asp Thr 285 290295 gag atc ggg ggg cac ctg att aaa gaa ggt gat acg gtt ttg gcg ttt 963 Glu lle Gly Gly His Leu lle Lys Glu Gly Asp Thr Val Leu Ala Phe 300 305310 gtg gca tcg gca aat cgt gat gaa gca aag ttt gac aga ccg cac atg 1011 Val Ala Ser Ala Asn Arg Asp Glu Ala Lys Phe Asp Arg Pro His Met 315 320325 ttt gat atc cgc cgc cat ccc aat ccg cat att gcg ttt ggc cac ggc 1059 Phe Asp lle Arg Arg His Pro Asn Pro His lle Ala Phe Gly His Gly 330 335 340345 atc cat ttt tgc ctt ggg gcc ccg ctt gcc cgt ctt gaa gca aat atc 1107 lle His Phe Cys Leu Gly Ala Pro Leu Ala Arg Leu Glu Ala Asn lle 350 355360 gcg tta acg tet ttg att tet get ttt cct cat atg gag tgc gtc agt 1155 Ala Leu Thr Ser Leu lle Ser Ala Phe Pro His Met Glu Cys Val Ser 365 370375 atc act ccg att gaa aac agt gtg ata tac gga tta aag agc ttc cgt 1203 lle Thr Pro lle Glu Asn Ser Val lle Tyr Gly Leu Lys Ser Phe Arg 380 385390 gtg aaa atg taaggatcc1221

Val Lys Met

395 <210> 45 <211 >396 <212> PRT <213> Bacillus subtilis <400> 45

Met Asn Val Leu Asn Arg Arg Gin Ala Leu Pro Arg Ala Leu Leu Asn 15 1015

Gly Lys Asn Lys Gin Asp Ala Tyr His Pro Phe Pro Trp Tyr Glu Ser 20 2530

Met Arg Lys Asp Ala Pro Val Ser Phe Asp Glu Glu Asn Gin Val Trp 35 4045

Ser Val Phe Leu Tyr Asp Asp Val Lys Lys Val Val Gly Asp Lys Glu 50 5560

Leu Phe Ser Ser Cys Met Pro Gin Gin Thr Ser Ser lle Gly Asn Ser

70 7580 lle lle Ser Met Asp Pro Pro Lys His Thr Lys lle Arg Ser Val Val 85 9095

Asn Lys Ala Phe Thr Pro Arg Ala Met Lys Gin Trp Glu Pro Arg lle 100 105110

Gin Glu lle Thr Asp Glu Leu lle Gin Lys Phe Gin Gly Arg Ser Glu 115 120125

Phe Asp Leu Val His Asp Tyr Ser Tyr Pro Leu Pro Val lle Val lle 130 135140

Ser Glu Leu Leu Gly Val Pro Ser Ala His Met Glu Gin Phe Lys Ala 145 150 155160

Trp Ser Asp Leu Leu Val Ser Thr Pro Lys Asp Lys Ser Glu Glu Ala 165 170175

Glu Lys Ala Phe Leu Glu Glu Arg Asp Lys Cys Glu Glu Glu Leu Ala 180 185190

Ala Phe Phe Ala Gly lle lle Glu Glu Lys Arg Asn Lys Pro Glu Gin 195 200205

Asp lle lle Ser lle Leu Val Glu Ala Glu Glu Thr Gly Glu Lys Leu 210 215220

Ser Gly Glu Glu Leu lle Pro Leu Cys Thr Leu Leu Leu Val Ala Gly 225 230 235240

Asn Glu Thr Thr Thr Asn Leu lle Ser Asn Ala Met Phe Ser lle Leu 245 250255

Glu Thr Pro Gly Val Tyr Glu Glu Leu Arg Ser His Pro Glu Leu Met 260 265270

Pro Gin Ala Val Glu Glu Ala Leu Arg Phe Arg Ala Pro Ala Pro Val 275 280285

Leu Arg Arg lle Ala Lys Arg Asp Thr Glu lle Gly Gly His Leu lle 290 295300

Lys Glu Gly Asp Thr Val Leu Ala Phe Val Ala Ser Ala Asn Arg Asp 305 310 315320

Glu Ala Lys Phe Asp Arg Pro His Met Phe Asp lle Arg Arg His Pro 325 330335

Asn Pro His lle Ala Phe Gly His Gly lle His Phe Cys Leu Gly Ala 340 345350

Pro Leu Ala Arg Leu Glu Ala Asn lle Ala Leu Thr Ser Leu lle Ser 355 360365

Ala Phe Pro His Met Glu Cys Val Ser lle Thr Pro lle Glu Asn Ser 370 375380

Val lle Tyr Gly Leu Lys Ser Phe Arg Val Lys Met 385 390 395

Claims

1. Protein odvozený od mikroorganismu náležícího do rodu Bacillus, který je aktivní při produkci sloučeniny (ΙΙ-a) nebo sloučeniny (ΙΙ-b) ze sloučeniny (I-a) nebo ze sloučeniny (Ib), kde sloučenina (I-a) je sloučenina representovaná vzorcem (I-a):

(pa) kde R¹ znamená atom vodíku, substituovaný nebo nesubstituovaný alkyl nebo alkalický kov, a R² znamená substituovaný nebo nesubstituovaný alkyl nebo substituovaný nebo nesubstituovaný aryl ;

sloučenina (I-b) je laktonová forma sloučeniny (I-a) a je representovaná vzorcem (I-b): a-b) kde R² má stejnou definici jako výše;

sloučenina (ΙΙ-a) je sloučenina representovaná vzorcem (ΙΙ-a):

(ITa) kde R¹ a R² mají stejnou definici jako výše; a sloučenina (ΙΙ-b) je laktonová forma sloučeniny (ΙΙ-a) a je representovaná vzorcem (ΙΙ-b):

(Π-b) kde R² má stejnou definici jako výše.

2. Protein odvozený od mikroorganismu náležícího do rodu Bacillus, který je aktivní při produkci sloučeniny (IV-a) nebo sloučeniny (IV-b) ze sloučeniny (IlI-a) nebo ze sloučeniny (ΙΙΙ-b), kde sloučenina (ΙΙΙ-a) je sloučenina representovaná vzorcem (ΙΙΙ-a):

kde R¹ znamená atom vodíku, substituovaný nebo nesubstituovaný alkyl nebo alkalický kov, a R² znamená substituovaný nebo nesubstituovaný alkyl nebo substituovaný nebo nesubstituovaný aryl;

sloučenina (III-b) je laktonová forma sloučeniny (IlI-a) a je representovaná vzorcem (III-b):

(III-b) kde R² má stejnou definici jako výše; a sloučenina (IV-a) je sloučenina representovaná vzorcem (IV-a): (IV-a) kde R¹ a R² mají stejnou definici jako výše; a sloučenina (IV-b) je laktonová forma sloučeniny (IV-a) a je representovaná vzorcem (IV-b):

• · · · • · · ♦ « • · • • · • · • 6 • · • · · • • • · • · · « · · «« · • · · « · • 9

(iv-b) kde R² má stejnou definici jako výše.

3. Protein odvozený od mikroorganismu náležícího do rodu Bacillus, který je aktivní při produkci sloučeniny (Vl-a) nebo sloučeniny (Vl-b) ze sloučeniny (V-a) nebo ze sloučeniny (Vb), kde sloučenina (V-a) je sloučenina representovaná vzorcem (V-a):

kde R¹ znamená atom vodíku, substituovaný nebo nesubstituovaný alkyl nebo alkalický kov;

(V-b) sloučenina (Vl-a) je sloučenina representovaná vzorcem (VI-a):

(VI-a) kde R¹ má stejnou definici jako výše; a sloučenina (Vl-b) je laktonová forma sloučeniny (VI-a) a je representovaná vzorcem (Vl-b):

(Vlb)

4. Protein odvozený od mikroorganismu náležícího do rodu Bacillus, který je aktivní při produkci sloučeniny (VlII-a) nebo sloučeniny (VlII-b) ze sloučeniny (VII-a) nebo ze sloučeniny (VlI-b), kde sloučenina (VII-a) je sloučenina representovaná vzorcem (VII-a):

(Vn-a) kde R¹ znamená atom vodíku, substituovaný nebo nesubstituovaný alkyl nebo alkalický kov;

sloučenina (VÍI-b) je laktonová forma sloučeniny (VlI-a) a je representovaná vzorcem (VlI-b):

(VlI-b) sloučenina (VlII-a) je sloučenina representovaná vzorcem (VlII-a):

(VlII-a) kde Ri má stejnou definici jako výše; a sloučenina (VIII-b) je laktonová forma sloučeniny (VlII-a) a je representovaná vzorcem (VIII-b):

• φ Φ · φ · φφ φ φ φ φ φφ φφ φφφ φ φ φ φ φ φ · φ φ φ φ φ φ φ ·· φφφφ φφφ φφφ φφ φ

5. Protein podle jakéhokoliv z nároků 1 až 4, kde mikroorganismus náležící do rodu Bacillus je mikroorganismus vybraný ze skupiny zahrnující B. subtilis., B. megaterium, B. laterosporus, B.sphaericus, B.pumilus, B.stearothermophilus, B. ceres, B. badius, B. brevis, B. alvei, B. circulans a B. macerans.

6. Protein podle jakéhokoliv z nároků 1 až 5, kde mikroorganismus náležící do rodu Bacillus je mikroorganismus vybraný ze skupiny zahrnující B. subtilis ATCC6051, B. megaterium ATCC10778, B. megaterium ATCC115627, B. megaterium ATCC13402, B. megaterium ATCC15177, B. megaterium ATCC15450, B. megaterium ATCC19213, B. megaterium IAM1032, B.

laterosporus ATCC4517, B. pumilus FERM BP-2064, B. badius ATCC14574, B. brevis NRRL B-8029, B. alvei ATCC6344, B. circulans NTCT-2610 a B. macerans NCIMB-9368.

7. Protein podle jakéhokoliv z nároků 1 až 5, kde mikroorganismus náležící do rodu Bacillus je mikroorganismus vybraný ze skupiny zahrnující Bacillus sp. FERM BP-6029 nebo Bacillus sp. FERM BP-6030.

8. Protein mající aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 1.

9. Protein mající aminokyselinovou sekvenci obsahující delece, substituce nebo adice jedné nebo více aminokyselin v aminokyselinové sekvenci SEQ ID NO: 1, který je aktivní v produkci sloučeniny (ΙΙ-a) nebo sloučeniny (ΙΙ-b) ze sloučeniny (I-a) nebo sloučeniny (I-b).

10. Protein podle nároku 9, který má aminokyselinovou sekvenci uvedenou v SEQ ID NO: 42 nebo 45.

11. Protein podle nároku 9, kde sloučenina (I-a) je sloučenina (IlI-a), sloučenina (I-b) je sloučenina (ΙΙΙ-b), sloučenina (II-a) je sloučenina (IV-a) a sloučenina (ΙΙ-b) je sloučenina (IV-b).

12. Protein podle nároku 9, kde sloučenina (I-a) je sloučenina (V-a), sloučenina (I-b) je sloučenina (V-b), sloučenina (II-a) je sloučenina (VI-a) a sloučenina (ΙΙ-b) je sloučenina (Vl-b).

13. Protein podle nároku 9, kde sloučenina (I-a) je sloučenina (VlI-a), sloučenina (I-b) je sloučenina (VlI-b), sloučenina (II-a) je sloučenina (VlII-a) a sloučenina (ΙΙ-b) je sloučenina (VlII-b).

14. Izolovaná DNA mající nukleotidovou sekvenci uvedenou v SEQ ID NO: 2.

15. Izolovaná DNA hybridizující s DNA podle nároku 14 za přísných podmínek, která kóduje protein mající aktivitu v produkci sloučeniny (II-a) nebo sloučeniny (ΙΙ-b) ze sloučeniny (I-a) nebo ze sloučeniny (I-b).

16. DNA podle nároku 15, která má nukleotidovou sekvenci vybranou ze skupiny zahrnující nukleotidové sekvence uvedené v SEQ ID NO: 41, 43 a 44.

17. Izolovaná DNA kódující protein podle jakéhokoli z nároků 1 až 12.

18. DNA podle nároku 15, kde sloučenina (I-a) je sloučenina (IlI-a), sloučenina (I-b) je sloučenina (ΙΙΙ-b), sloučenina (II-a) je sloučenina (IV-a) a sloučenina (ΙΙ-b) je sloučenina (IV-b).

19. DNA podle nároku 15, kde sloučenina (I-a) je sloučenina (V-a), sloučenina (I-b) je sloučenina (V-b), sloučenina (Il-a) je sloučenina (Vl-a) a sloučenina (II—b) je sloučenina (Vl-b).

20. DNA podle nároku 15, kde sloučenina (I-a) je sloučenina (VH-a), sloučenina (I-b) je sloučenina (VlI-b), sloučenina (ΙΙ-a) je sloučenina (VlII-a) a sloučenina (ΙΙ-b) je sloučenina (VlII-b).

21. Rekombinantní DNA vektor vyznačující se tím, že obsahuje DNA podle jakéhokoliv z nároků 14 až 20.

22. Transformant vyznačující se tím, že je získaný vložením rekombinantniho DNA vektoru podle nároku 21 do hostitelské buňky.

23. Transformant podle nároku 22 vyznačující se tím, že náleží k mikroorganismům vybraným z rodů Escherichia, Bacillus, Corynebacterium a Streptomyces.

24. Transformant podle nároku 22 nebo 23 vyznačuj ící se t í m, že náleží k mikroorganismům vybraným z Escherichia coli, Bacillus subtilis, Bacillus megaterium, Corynebacterium glutamicum, Corynebacterium ammoniagenes, Corynebacterium callunae a Streptomyces lividans.

25. Způsob výroby sloučeniny (II~a) nebo sloučeniny (Il-b) vyznačující se tím, že transformant podle jakéhokoliv z nároků 22 až 24, kultura transformantu nebo zpracovaný produkt kultury, se použije jako zdroj enzymu, a způsob zahrnuje:

26. Způsob výroby sloučeniny (IV-a) nebo sloučeniny (IV-b) vyznačující se tím, že transformant podle * jakéhokoliv z nároků 22 až 24, kultura transformantu nebo zpracovaný produkt kultury, se použije jako zdroj enzymu, a způsob zahrnuje:

27. Způsob výroby sloučeniny (Vl-a) nebo sloučeniny (Vl-b) vyznačující se tím, že transformant podle • jakéhokoliv z nároků 22 až 24, kultura transformantu nebo zpracovaný produkt kultury, se použije jako zdroj enzymu, a způsob zahrnuje:

- umožnění existence sloučeniny (V-a) nebo sloučeniny (V-b) ve vodném mediu;

- umožnění produkce a akumulace sloučeniny (Vl-a) nebo sloučeniny (Vl-b) v uvedeném vodném mediu; a odebrání sloučeniny (Vl-a) nebo sloučeniny (Vl-b) z uvedeného > vodného media.

28. Způsob výroby sloučeniny (VlII-a) nebo sloučeniny (VlII-b) vyznačující se tím, že transformant podle ·♦ ·♦ · Λ·« • · · · ·· ·· e «· • * ♦ · · ·· • · · · · ·«· f ·· 9999 999 999 99999 jakéhokoliv z nároků 22 až 24, kultura transformantu nebo zpracovaný produkt kultury, se použije jako zdroj enzymu, a způsob zahrnuje:

- umožnění existence sloučeniny (VlI-a) nebo sloučeniny (VII-

-¼ b) ve vodném mediu;

- umožnění produkce a akumulace sloučeniny (VlII-a) nebo “ sloučeniny (VlII-b) v uvedeném vodném mediu; a odebráni sloučeniny (VlII-a) nebo sloučeniny (VlII-b) z uvedeného vodného media.

a

29. Způsob podle nároku 25 vyznačující se tím, že sloučeninou (II-b) je sloučenina (II-b) získaná přípravou laktonu ze sloučeniny (Ha) .

30. Způsob podle nároku 25 vyznačující se tim, že sloučeninou (ΙΙ-a) je sloučenina (ΙΙ-a) získaná otevřením laktonového kruhu sloučeniny (II-b).

31. Způsob podle nároku 26 vyznačující se tím, že sloučeninou (IV-b) je sloučenina (IV-b) získaná přípravou laktonu ze sloučeniny (IVa).

32. Způsob podle nároku 26vyznačující se tím, že sloučeninou (IV-a) je sloučenina (IV-a) získaná otevřením laktonového kruhu sloučeniny (IV-b).

33. Způsob podle nároku 27 vyznačující se tím, že sloučeninou (VI-b) je sloučenina (VI-b) získaná přípravou laktonu ze sloučeniny (Via).

9r

34. Způsob podle nároku 27 vyznačující se tím, že sloučeninou (Vl-a) je sloučenina (Vl-a) získaná otevřením laktonového kruhu sloučeniny (VI-b).

35. Způsob podle nároku 28 vyznačující se tím, že sloučeninou (VIII-b) je sloučenina (VIII-b) získaná přípravou laktonu ze sloučeniny (Vlila).

36. Způsob podle nároku 28vyznačující se tím, že sloučeninou (VlII-a) je sloučenina (VlII-a) získaná otevřením laktonového kruhu sloučeniny (VIII-b).

* ů

37. Způsob podle jakéhokoliv z nároků 25 až 28 vyznačující se tím, že zpracovaným produktem kultury transformantů je produkt vybraný ze skupiny zahrnující: kultivované buňky; zpracované produkty jako jsou sušené buňky, lyofilizované buňky, buňky ošetřené surfaktantem, buňky zpracované enzymem, buňky zpracované ultrasonikací, buňky zpracované mechanickým mletím, buňky zpracované rozpouštědlem; proteinovou frakci buněk; a imobilizované produkty buněk nebo zpracovaných buněk.

38. Způsob výroby proteinu vyznačující se tím, že zahrnuje kultivaci transformantů podle jakéhokoliv z nároků * 22 až 24 v mediu; produkci a akumulaci proteinu podle jakéhokoliv z nároků 1 až 12 v kultuře; a odběr uvedeného proteinu z uvedené kultury.

39. Oligonukleotid odpovídající sekvenci skládající se z 5 až 60 sousedních nukleotidů nukleotidové sekvenci vybrané ze skupiny zahrnující nukleotidové sekvence uvedené v SEQ ID NO: 2, 41, 43 a 44; nebo oligonukleotid odpovídající f· komplementární sekvenci k uvedenému oligonukleotidu.