[go: up one dir, main page]

HUP0100131A2 - Novel nucleotide sequences coding for the ptsh-gene - Google Patents

Novel nucleotide sequences coding for the ptsh-gene Download PDF

Info

Publication number
HUP0100131A2
HUP0100131A2 HU0100131A HUP0100131A HUP0100131A2 HU P0100131 A2 HUP0100131 A2 HU P0100131A2 HU 0100131 A HU0100131 A HU 0100131A HU P0100131 A HUP0100131 A HU P0100131A HU P0100131 A2 HUP0100131 A2 HU P0100131A2
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
polynucleotide
gene encoding
sequence
amino acid
gene
Prior art date
Application number
HU0100131A
Other languages
English (en)
Inventor
Farwick Mike Dr
Moeckel Bettina Dr
Pfefferle Walter Dr
Original Assignee
Degussa
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Degussa filed Critical Degussa
Publication of HU0100131D0 publication Critical patent/HU0100131D0/hu
Publication of HUP0100131A2 publication Critical patent/HUP0100131A2/hu

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
    • C12N9/1205—Phosphotransferases with an alcohol group as acceptor (2.7.1), e.g. protein kinases
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
    • C12P13/08—Lysine; Diaminopimelic acid; Threonine; Valine

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)

Description

.* P 6 {i' i Λ I
71.737/PA
KÖZZÉTÉTELI sli,.JÉLDÁNY
N em íciközi
Iroda >, Anurássy út H3.
/®; 34-24-->*3
Új, a ptsH gént kódoló nukleotid szekvenciák
A találmány tárgyát a ptsH gént kódoló nukleotid szekvenciák és fermentációs eljárás képezi L-aminosavak, különösen L-lizin olyan korineform baktériumokkal való előállítására, amelyekben a ptsH gén fokozott hatású.
Az L-aminosavakat, különösen az L-lizint a humán gyógyászatban és a gyógyszeriparban, főként azonban az állat-takarmányozásban alkalmazzák.
Ismeretes, hogy korineform baktérium törzsekkel, különösen a Corynebacterium glutamicum-mal fermentációs úton aminosavak állíthatók elő. A kérdés nagy jelentősége miatt állandóan dolgoznak az előállítási eljárás továbbfejlesztésén. Az eljárás továbbfejlesztése érintheti a fermentációs technikai intézkedéseket /pl. a keverést és az oxigénnel való ellátást/, a táptalaj összetételét /ide tartozik pl. a cukor koncentráció a fermentáció alatt/ vagy a termék alakját pl. az ioncserélő kromatográfiával való feldolgozás során vagy magának a mikroorganizmusnak a teljesítménnyel kapcsolatos tulajdonságait.
A mikroorganizmusok teljesítménnyel kapcsolatos tulajdonságainak javítására a mutagenezis, szelekció és a mutánsok kiválasztása módszereit alkalmazzák. Ily módon olyan törzsekhez lehet jutni, amelyek rezisztensek antimetabolitokkal, pl. a lizin analóg S-/2-amino-etil/-ciszteinnel szemben vagy auxotrófok a reguláció szempontjából jelentős metabolitokra és L-lizint termelnek.
Néhány év óta a rekombináns DNS technika módszereit is alkalmazzák az L-aminosavakat termelő Corynebacterium glutamicum törzsek javítására. Ezek szerint egyes aminosav bioszintézis géneket ampliflkainak és vizsgálják ennek hatását az L—aminosav termelésre. Összefoglaló cikkek találhatók e tárgyban az (1)-(5) irodalmi helyeken.
A találmány szerinti feladat abban áll, hogy új alapokat találjunk L-aminosavak, különösen az L-lizin javított fermentációs előállításához.
Az L-aminosavakat, különösen az L—lizint a humán gyógyászatban, a gyógyszeriparban és kitüntetett módon az állattakarmányozásban alkalmazzák. Általános érdeklődésre tarthat tehát számot az L-aminosavak, különösen az L-lizin előállítására irányuló új, továbbfejlesztett eljárások kidolgozása.
Amikor a következőkben L-lizint említünk, ezen nemcsak a bázist, hanem a sókat - pl. a lizin-monohidrokloridot vagy a lizin-szulfátot - is értjük.
A találmány tárgya korineform baktériumokból származó, egy polinukleotid szekvenciát tartalmazó izolált polinukleotid, a következők közül:
a) egy, a SEQ ID No. 2 aminosav szekvenciát tartalmazó polipeptidet kódoló polinukleotiddal legalább 70%-ban azonos polinukleotid,
b) a SEQ ID No. 2 aminosav szekvenciával legalább 70%-ban azonos aminosav szekvenciát tartalmazó polipeptidet kódoló polinukleotid,
c) az a) vagy b) polinukleotiddal komplementer polinukleotid,
d) az a) , b) vagy c) polinukleotid szekvencia legalább 15 egymást követő nukleotidját tartalmazó polinukleotid.
Ugyancsak a találmány tárgyát képezi egy polinukleotid, amely egy korineform baktériumokban replikálható, előnyösen rekombináns DNS.
Ugyancsak a találmány tárgya egy olyan polinukleotid, amely egy RNS.
Szintén a találmány tárgyát képezi egy polinukleotid, mégpedig előnyösen egy replikálható DNS, amely a következők valamelyikét tartalmazza:
i) a SEQ ID No.l nukleotid szekvencia, ii) legalább egy olyan szekvencia, amely az i) szekvenciának felel meg a genetikai kód degenerációs tartományán belül, iii) legalább egy olyan szekvencia, amely hibridizál egy, i)-vel vagy ii)-vel komplementer szekvenciával és adott esetben iv) egy funkció semleges szensz mutáció az i)-ben.
A találmány további tárgya az említett polinukleotidok valamelyikét tartalmazó vektor és a vektort tartalmazó, gazdasejtekként szolgáló korineform baktériumok.
Ugyancsak a találmány tárgyát képezik olyan polinukleotidok, amelyek lényegében egy polinukleotid szekvenciából állnak. Ezeket egy megfelelő génbank hibridizáció segítségével történő screenelése útján lehet előállítani; ezek a SEQ ID No. 1.-nek megfelelő polinukleotid szekvenciával rendelkező teljes gént tartalmazzák, egy nyúlvánnyal /szonda/, amely a SEQ ID No. 1.-nek megfelelő polinukleotid szekvenciát vagy ennek egy fragmentumát tartalmazza. Szintén a találmány tárgyát képezi az említett DNS szekvenciák elkülönítése.
A találmány szerinti polinukleotid szekvenciák RNS, cDNS és DNS hibridizációs szondaként alkalmazhatók, a foszfotranszferáz rendszer H komponensét /ptsH/ kódoló cDNS teljes hosszúságban való elkülönítésére, valamint olyan cDNS vagy gének elkülönítésére, amelyek a szekvencia tekintetében nagyfokú hasonlóságot mutatnak a foszfotranszferáz rendszer H komponensét kódoló gén szekvenciájával.
A találmány szerinti polinukleotid szekvenciák továbbá primerként alkalmazhatók a foszfotranszferáz rendszer H komponensét kódoló gének DNS-ének a polimeráz láncreakció /PCR/ révén való előállítása során.
Az ilyen szondaként vagy primerként szolgáló oligonukleotidok legalább 30, előnyösen legalább 20 és különösen előnyösen legalább 15 egymás utáni nukleotidot tartalmaznak. Ugyancsak alkalmazhatók a legalább 40 vagy 50 nukleotid hosszúságú oligonukleotidok.
Az „elkülönítés a természetes környezetből való kiválasztást jelent.
A „polinukleotid kifejezés általában poliribonukleotidokra és polidezoxiribonukleotidokra vonatkozik, mimellett nem-módosított vagy módosított RNS-ről vagy DNS-ről lehet szó.
A „polipeptidek kifejezés olyan peptideket vagy proteineket jelöl, amelyek két vagy több, peptid kötéssel összekapcsolt aminosavat tartalmaznak.
A találmány szerinti polipeptidek tartalmaznak egy SEQ ID No. 2. szerinti polipeptidet, továbbá olyanokat, amelyek a foszfotranszferáz rendszer H komponense biológiai aktivitásával rendelkeznek és olyanokat is, amelyek a SEQ ID No. 2. szerinti polipeptiddel legalább 70%-ban, előnyösen legalább 80%-ban és különösen legalább 90-95%-ban azonosak és az említett aktivitást mutatják.
A találmány tárgyát képezi továbbá egy eljárás L-aminosavak, különösen L-lizin előállítására olyan korineform baktériumok alkalmazásával, amelyekről már ismert, hogy egy L-aminosavat termelnek és amelyekben a pstH gént kódoló nukleotid szekvenciák fokozottak, közelebbről túlexprimáltak.
A „fokozás fogalom ebben az összefüggésben egy vagy több olyan enzim intracelluláris aktivitásának egy mikroorganizmusban való fokozását jelenti, amelyet a megfelelő DNS kódol. Ennek érdekében pl. növelhető a gén vagy gének kópiaszáma, erős promoter alkalmazható vagy olyan gén alkalmazható, amely egy megfelelő, magas aktivitású enzimet kódol és adott esetben ezeket a műveleteket összekapcsolhatjuk.
A találmány tárgyát képező mikroorganizmusok L-aminosavakat, különösen L-lizint képesek termelni glukózból, szacharózból, laktózból, fruktózból, maltózból, melaszból, keményítőből, cellulózból vagy glicerinből és etanolból. A korineform baktériumok képviselőjeként különösen a Corynebacterium genust kell megemlí tenünk. Ennek körében különösen a Corynebacterium glutamicum speciesre kell hivatkoznunk, amelyről a szakterületen ismert, hogy L-aminosavakat képes termelni.
A Corynebacterium genushoz - és különösen a Corynebacterium glutamicum fajhoz - tartozó megfelelő törzsek közé sorolhatók pl. a következő vad típusú törzsek:
Corynebacterium glutamicum ATCC13032
Corynebacterium acetoglutamicum ATCC15806
Corynebacterium acetoacidophilum ATCC13870
Corynebacterium thermoaminogenes FERM BP-1539
Corynebacterium melassecola ATCC17965
Brevibacterium flavum ATCC14067
Brevibacteriium lactofermentum ATCC13869 és
Brevibacterium divaricatum ATCC14020 és az ezekből előállított, L-lizint termelő mutánsok ill. törzsek, pl. a következők:
Corynebacterium glutamicum FERM-P 1709
Brevibacterium flavum FERM-P 1708
Brevibacterium lactofermentum FERM-P 1712
Corynebacterium glutamicum FERM-P 6463
Corynebacterium glutamicum FERM-P 6464 és
Corynebacterium glutamicum DSM5715.
A találmány kidolgozása során sikerült elkülönítenünk az új, a foszfotranszferáz rendszer H komponensét kódoló ptsH gént a C. glutamicum-ból.
A ptsH gén vagy más C. glutamicum gének elkülönítése érdekében először e mikroorganizmus génbankját hozzuk létre E. coliban. Génbankok létrehozását általánosan ismert tankönyvekben és kézikönyvekben írják le /1. pl.: (6), (7)/. Nagyon ismert az E. coli K-12 W3110 génbankja (8), amelyet lambda vektorokban alakítottak ki. A (9) helyen a C. glutamicum ATCC 13032 génbankját írják le, amelyet a SuperCos I kozmid vektor (10) segítségével hoztak létre E. coli K-12 NM 554 törzsben (11) . A (12) helyen ugyancsak a C. glutamicum ATCC 13032 génbankját ismertetik a pHC79 kozmid (13) alkalmazása mellett. A C. glutamicum génbank— jának E. coli-ban való előállítására alkalmazhatók plazmidok (14), mint pl. a pBR322 vagy (15) a pUC9. Gazdaként különösen a restrikciós és rekombinációs hibát mutató törzsek alkalmasak. Példa erre a DH5aMCR törzs, amelyet (16) ír le. A kozmidok segítségével klónozott hosszú DNS fragmentumok ezután ismét a szekvenálás szempontjából megfelelő vektorokba szubklónozhatók, majd szekvenálhatók, pl. a (17) helyen leírt módon.
Ily módon kapjuk az új, a pstH-t kódoló C. glutamicum DNS szekvenciákat, amelyek SEQ ID No. 1-ként a találmány részét képezik. A szóban forgó DNS szekvenciákból az előbbiekben ismertetett módszerekkel továbbá levezettük a megfelelő protein aminosav szekvenciáját. A pstH gén termék aminosav szekvenciáját a SEQ ID No. 2 mutatja be.
Ugyancsak a találmány tárgyához tartoznak a SEQ ID No. 1-ből a genetikai kód degeneráltsága következtében leszármaztatható kódoló DNS szekvenciák. A szakterületen szensz mutációként ismertek továbbá a fehérjékben a konzervatív aminosav cserék, ami lyen pl. 3 glicin cseréje alaninra vagy aaz aszparaginsavé glutaminsavra; ezek nem vezetnek alapvető változásokhoz a fehérje aktivitásában, azaz funkciósemlegesek. Ismert továbbá, hogy a fehérje N- és/vagy C-terminálisán végbemenő változások a funkciót nem befolyásolják lényegesen vagy éppen stabilizálják azt. Erre vonatkozóan a szakember adatokat talál a (18)-(21) helyen és az ismert genetikai és molekuláris biológiai tankönyvekben. Szintén a találmány tárgyát képezik a megfelelő módon a SEQ ID No. 2-ből levezethető aminosav szekvenciák és az ezeket az aminosav szekvenciákat kódoló DNS szekvenciák.
A SEQ ID No. 1-gyel vagy ennek részeivel hibridizáló DNS szekvenciák ugyancsak a találmány tárgyát képezik, akárcsak azok a DNS szekvenciák, amelyek a SEQ ID No. 1-ből leszármaztatható primerek alkalmazása mellett polimeráz láncreakcióval /PCR/ állíthatók elő. Ezeknek az oligonukleotidoknak a hosszúsága jellemző módon legalább 15 nukleotid.
A DNS szekvenciák hibridizálás segítségével való azonosításához a szakember t.k. a (22) és (23) helyen talál útmutatást. A DNS szekvenciák polimeráz láncreakció /PCR/ segítségével végzett amplifikálására vonatkozóan a szakember útmutatást meríthet t.k. a (24) kézikönyvből és a (25) cikkből.
Azt találtuk, hogy a korineform baktériumok a ptsH gén túlexpresszió j a után javított L-aminosav, közelebbről L-lizin termelést mutatnak.
A túlexprimálás eléréséhez pl. növelhetjük a megfelelő gének kópiaszámát, vagy mutálhatjuk a promótor és a regulációs régiókat vagy a struktúrgéntől felfelé található riboszóma kötőhelye két. Ugyanígy hatnak az expressziós kazetták, amelyeket a struktúrgéntől felfelé építünk be. Indukálható promótorok segítségével továbbá lehetővé vált az expresszió fokozása az L-aminosavak fermentációs előállítása során. Az m-RNS élettartamának meghoszszabbítására vezető lépésekkel ugyancsak javítható az expreszszió. Az enzim fehérje lebomlásának akadályozásával ugyancsak fokozódik az enzimaktivitás. A gének vagy gén szerkezetek vagy különböző kópiaszámban fordulhatnak elő a plazmidokban vagy a kromoszómába integrálódtak és amplifikálódtak. Egy másik megoldás szerint a szóban forgó gén túlexprimálása érhető el a közeg összetételének és a tenyésztési körülményeknek a megváltoztatása révén.
A szakember számára információt nyújtanak t.k. a irodalmi források, valamint az ismert genetikai és molekulárbiológiai tankönyvek.
Plazmidként azok alkalmasak, amelyek korineform baktériumokban túlexprimálhatók. Számos ismert plazmid vektor, pl. a pZl (40), a pEKExl (41) vagy a pHS2-l (42) a pHM1519, a pBLl vagy a pGAl kriptikus plazmidon alapul. Más plazmid vektorok, pl. a pCG4-en (43) vagy pNG2-n (44) vagy a pAGl-en (45)alapulnak, ugyanígy felhasználhatók.
Alkalmazhatók továbbá olyan plazmid vektorok is, amelyek segítségével a gén-amplifikációs eljárás a kromoszómába való integrálás révén megvalósítható. Ezzel foglalkozik pl. a hom-thrB operon duplikációjával ill. amplifikációjával kapcsolatban a (46) közlemény. E módszer esetében a teljes gént egy plazmid vektorba klónozzuk, amely replikálható egy gazdaszervezetben /jellemző módon E. coli-ban/, de nem replikálható C. glutamicumban. Vektorként pl. a pSUP301 (47), a pK18mob vagy a pK19mob (48) alkalmazható, továbbá a pGEM-T (/Promega Co., MD, AEÁ/, pCR2.1-TOPO 8(49), pCRRBlunt (50) vagy a pEMl (51). Az amplifikálandó gént tartalmazó plazmád vektort ezután konjugációval vagy transzformációval az alkalmazni kívánt C. glutamicum törzsbe visszük át. A konjugációs módszert pl. (52) írja le. A transzformációs módszerek leírása pl. (53)-(55)-ben található meg. „Cross over esemény segítségével végzett homológ rekombináció után a kapott törzs a szóban forgó génből legalább két kópiát tartalmaz.
A találmány további tárgya tehát eljárás L-aminosavak, különösen az L-lizin fermentációs előállítására, amelynek során egy plazmid vektorral transzformált törzset alkalmazunk és a plazmid vektor a foszfotranszferáz rendszer H komponensét kódoló gén nukleotid szekvenciáját hordozza.
Az L-aminosavak, különösen az L-lizin termeléséhez ezenkívül előnyös lehet a ptsH gén mellett a keresett L-aminosav bioszintézis út további génjeinek fokozása, ezzel az aktuális bioszintézis út egy vagy több enzimének, a glikolí zisnek, az anaplerotikának és az aminosav exportnak a túlexprimálása.
Az L-lizin előállításához pl. túlexprimálható egy vagy több gén a következők közül:
a foszfoenol-piruvát-cukor-foszfotranszferáz rendszer M komponensét (ptsM) kódoló ptsM gén (56), a dihidrodipikolinát-szintetázt kódoló dapA gén (57) a piruvát-karboxilázt kódoló pyc gén (58) a gliceraldehid-3-foszfát-dehidrogenázt kódoló gap gén (59) a triózfoszfát-izomerázt kódoló tpi gén (59) a 3-foszfoglicerát-kinázt kódoló pgk gén (59) a lizin exportot kódoló lysE gén.
Az L-aminosavak, különösen az L-lizin termeléséhez továbbá előnyös lehet a ptsH gén mellett egyidejűleg a következők közül egy vagy több gén gyengítése:
a foszfoenolpiruvát-karboxikinázt kódoló pck gén (60) a glukóz-6-foszfát-izomerázt kódoló pgi gén (61) a piruvát-oxidázt kódoló poxB gén (62).
Az L-aminosavak, különösen az L-lizin termeléséhez továbbá előnyös lehet a ptsH gén túlexprimálása mellett a nem kívánt mellékreakciók kikapcsolása (63).
A találmány szerint előállított mikroorganizmusok az L-aminosav, különösen az L-lizin termelés céljából folyamatosan vagy szakaszosan sarzsokban (batch eljárás), sarzsokban betáplálással (fed batch eljárás) vagy sarzsokban ismételt betáplálással (repeated batch eljárás) tenyészthetők.
Az ismert tenyésztési módszerekre vonatkozó összefoglalás tankönyvekben megtalálható (64), (65).
Az alkalmazott tenyésztő közeg összetétele megfelelő módon ki kell, hogy elégítse az aktuális mikroorganizmus igényeit. Kü12 .........
··· · · *· · · ··· · lönböző mikroorganizmusok táptalajaira vonatkozóan kézikönyvekben - pl. (66) - találhatók leírások.
Szénforrásként a következők alkalmazhatók: cukor és szénhidrátok, pl. glukóz, szacharóz, laktóz, fruktóz, maltóz, melasz, keményítő és cellulóz; olajok és zsírok, mint pl. szójaolaj, napraforgóolaj, földi mogyoró olaj és kókuszzsír; zsírsavak, pl. palmitinsav, sztearinsav és linolsav; alkoholok, mint pl. glicerin és etanol és szerves savak, mint pl. ecetsav. Ezek az anyagok külön-külön vagy keverékként alkalmazhatók.
Nitrogénforrásként a következők alkalmazhatók: nitrogént tartalmazó szerves vegyületek, mint pepton, élesztőkivonat, húskivonat, malátakivonat, kukoricalekvár, szójaliszt és karbamid vagy szervetlen vegyületek, mint ammónium-szulfát, ammónium-klorid, ammónium-foszfát, ammonium-karbonát és ammónium-nitrát. A nitrogénforrások külön-külön vagy keverékként alkalmazhatók.
Foszfor forrásként a következők vehetők figyelembe: kálium-dihidrogénfoszfát, dikálium-hidrogénfoszfát vagy a megfelelő, nátriumot tartalmazó sók.
A táptalajnak ezenkívül tartalmaznia kell fémsókat (amilyen pl. a magnézium-szulfát vagy a vas-szulfát), amelyek a növekedéshez szükségesek. Végül az előbb említett anyagokon kívül eszszenciális növekedési anyagok, amilyenek az aminosavak és a vitaminok, alkalmazhatók. A tenyészközeghez megfelelő prekurzorok is adhatók. Az említett adalékanyagok egyszeri adag formájában adhatók a tenyészethez vagy megfelelő módon a tenyésztés során táplálhatok be.
A tenyészet pH-jának ellenőrzésére megfelelő módon bázisos vegyületeket, amilyen a nátrium-hidroxid, kálium-hidroxid, ammónia, vagy savas vegyületeket, így foszforsavat vagy kénsavat alkalmazunk. A habképződés ellenőrzésére habzásgátló szereket, igy pl. zsirsav-poliglikol-észtert használhatunk. A plazmidok stabilitásának megőrzésére megfelelő szelektíven ható anyagokat, pl. antibiotikumokat adagolhatunk. Az aerób feltételek biztosítására oxigént vagy oxigént tartalmazó gázelegyeket, pl. levegőt vezetünk a tenyészetbe. A tenyésztési hőmérséklet rendszerint 20-45°C, előnyösen 25-40°C. A tenyésztést addig folytatjuk, amíg L-lizin maximum alakul ki. Ez a cél rendszerint 10-160 óra alatt érhető el.
A találmány további tárgya ennek megfelelően eljárás L—ami— nosavak, különösen L-lizin fermentációs úton való előállítására, amelynek során a következő lépéseket hajtjuk végre:
i) fermentálunk egy, az L-aminosavat termelő korineform baktériumot, amelyben legalább a foszfotranszferáz rendszer H komponensét kódoló ptsH gén fokozott, különösen túlexprimált, ii) az L-aminosavat a táptalajban vagy a baktériumsejtekben dúsítjuk és iii) elkülönítjük az L-aminosavat.
Az L-lizin elemzését anioncserélő kromatográfiával, majd ninhidrines származékképzéssel végezhetjük, pl. a (67)-ben leírt módon.
A találmány szerinti eljárás L-aminosavak, különösen az L-lizin fermentációs előállítására irányul.
PÉLDÁK
A találmányt a továbbiakban megvalósítási példák segítségével szemléltetjük részletesebben.
1. példa
Genomiális kozmid génbank előállítása a Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 törzsből
A kromoszomális DNS-t a Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 törzsből a (68)-ban leírt módon különítettük el éa a Sau3AI restrikciós enzimmel (69) részlegesen elbontottuk. A DNS fragmentumokat tengeri sün lúgos foszfatázzal /SAP, (70)/ defoszforilezzük. A SuperCosl kozmid vektor DNS-ét /(71), (72)/ az Xbal restrikciós enzimmel (73) hasítjuk és szintén SAP-vel defoszforilezzük. Ezután a kozmid DNS-t a BamHI restrikciós enzimmel (74) elhasítjuk. Az ily módon kezelt kozmid DNS-t hozzáadjuk a kezelt ATCC 13032 DNS-hez és a keveréket T4-DNS ligázzal (75) kezeljük. A ligációs elegyet ezután a Gigapack II XL packing extract (76) segítségével fágokba csomagoljuk. Az E. coli NM 554 törzs megfertőzéséhez (11) szerint a sejteket 10 mM magnézium-szulfátban felvesszük és a fág szuszpenzióból egy alikvottal keverjük össze. A kozmid bank fertőzését és titrálását (7) szerint végeztük; a sejteket ennek során 100 μg/ml ampicillint tartalmazó LB agarra (77) szélesztettük. Egy éjjelen át 37°C-on való inkubálás után elkülönítjük a rekombináns egyes telepeket.
2. példa
A ptsH gén elkülönítése és szekvenálása
Egy egyes kolónia kozmid DNS-ét Quiaprep Spin Miniprep készlettel (78) a gyártó adatai szerint elkülönítjük és a Sau3AI restrikciós enzimmel (69) elbontjuk. A DNS fragmentumot SAP-vel (70) defoszforilezzük. Gélelektroforetikus szeparálás után következik az 1500-2000 bp mérettartományba eső kozmid fragmentumok izolálása a QuiaExII gélextrakciós készlettel (79). A pZero-1 szekvenáló vektor DNS-ét, amelyet az Invitrogen cégtől szereztünk be (80), a BanHI restrikciós enzimmel (69) megbontottuk. A kozmid fragmentumnak a pZero-1 szekvenáló vektorba való ligálását (7) szerint végeztük, a DNS keveréket egy éjjelen át inkubálva a T4 ligázzal (81) . Ezt a ligációs keveréket elektroporációval (55) bevisszük az E. coli DH5aMCR törzsbe (16), majd 50 gg/ml zeocint tartalmazó LB agaron (77) szélesztjük. A rekombináns klón plazmidjának előállítását Biorobot 9600-zal végeztük (82) . A szekvenálás a (83) szerinti didezoxi-lánchasításos módszerrel történt a (84) szerinti módosítással. Ennek során az RR drodamin terminátor ciklus szekvenáló készletet (85) alkalmaztuk. A gélelektroforézises szeparálás és a szekvenálási reakció analízise 29:1 Rotiphorese NF Acrylamid/bisacrilamid/Bisacrylamid géllel (86) történt, az ABI prizma 377 szekvenáló berendezéssel (86) .
A kapott közelítő szekvencia adatokat a Staden programcsomag, Version 97-0 (87) alkalmazásával dolgoztuk fel. A pZerol származék egyes szekvenciáit összefüggő contig-gá szerkesztettük. A számítógép alapú kódoló tartomány elemzést az XNIP programmal (87) végeztük. Továbvbi elemzést végeztünk a BLAST kereső programokkal (88) a NCBI (89) nemredundáns adatbankjával szemben .
A kapott nukleotid szekvenciát a SEQ ID No. 1 mutatja be. A nukleotid szekvencia elemzése 267 bázispárból álló nyitott leolvasókeretet mutat, amelyet pstH génként jelöltünk. A ptsH gén egy 89 aminosavból álló fehérjét kódol.
3. példa
A pEC-K18mob2ptsHexp ingavektor előállítása C. gluatmicumban a ptsH gén fokozására
3.1 A ptsH gén klónozása a pCRRBlunt II vektorba
A kromoszomális DNS-t az ATCC 13021 törzsből különítettük el (90) szerint. A ptsH génnek a 2. példából a C. glutamicum-ra ismert szekvenciája alapján a következő oligoukleotidokat választottuk ki a polimeráz láncreakcióhoz:
ptsHexpl:
5' -ACC ACT GGT GCA ATC TCC AT-3' ptsHexp2:
5' -TTT ACT CAG CGT CAA GGT CC-3'
A szintetikus primereket a (91) helyről szereztük be és a PCR reakciót (92) standard PCR módszere szerint végeztük, a (93)-tói származó Pwo polimerázzal. A polimeráz láncreakció segítségével a primerek lehetővé teszik egy 686 bp DNS elkülönítését, amely a potenciális promoter régióval együtt a pstH gént hordozza. Az amplifikált DNS fragmentum DNS szekvenciáját szekvenálással elemeztük.
Az amplifikált DNS fragmentumot a Zero Blunt™ készlettel (94) a pCRRBlunt II vektorba ligáljuk (95).
Az E. coli TOPIC törzset ezután a ligációs keverékkel elektroporációnak vetjük alá (96). A plazmid hordozó sejteket oly módon szelektáltuk, hogy a transzformációs keveréket 25 pg/ml kanamicint tartalmazó LB agaron /(7)/ szélesztettük. A plazmid DNS-t egy transzformánsból QIAprep Spin Miniprep készlet /Qiagen/ alkalmazásával különítjük el az EcoRI restrikciós enzimmel elemezzük, majd agaróz gél /0,8%/ elektroforézist végzünk. A plazmidot pCRBl-nek nevezzük el és az 1. ábrám mutatjuk be.
3.2 A pEC-K16mob2 E. coli-C. glutamicum ingavektor előállítása
Az E. coli-C. glutamicum ingavektort a technika állása szerint állítottuk elő. A vektor a pGAl plazmid replikációs régióját tartalmazza, ideértve a „per replikációs effektort (47), a Tn5 transzpozon (98) kanamicin rezisztenciáért felelős aph(3'-IIa) génjét (98) , a pMBl plazmid oriv replikációs tartomány génjét (99), a lacZa génfragmentumot, ideértve a lac promótort és egy többszörös klónozási helyet /mcs; (60)/ és az RP4 plazmid mob tartományát (47). A létrehozott vektort átalakítjuk a DH5amcr törzzsé (96). A plazmidot hordozó sejteket úgy szelektáljuk, hogy a transzformációs keveréket 25 mg/1 kanamicint tartalmazó LB agaron szélesztjük. A plazmid DNS-t egy transzformánsból QIAprep Spin Miniprep készlet /Qiagen/ alkalmazásával különítjük el és az EcoRI és Hindii! restrikciós enzimmel elemezzük, majd agaróz gél /0,8%/ elektroforézist végzünk. A plazmidot pECK18mob-2-nek nevezzük el és a 2. ábrán mutatjuk be.
A következő mikroorganizmust helyeztük letétbe a Mikroorganizmusok és Sejttenyészetek Német Gyűjteményében /MSMZ, Braunschweig, Németország/ a Budapesti Szerződés szerint:
C. glutamicum DMS 5715/pEC-K18mob2 /DSM 13245/.
3.3 A pstH gén klónozása a pEC-K18mob2 E. coli-C. glutamicum ingavektorba
A 3.2 példában leírt ingavektorba való klónozás érdekében a pEC-K18mob2 plazmid DNS-ét teljesen elbontjuk a KpnI és Xbal restrikciós endonukleázzal és SAP-val kezeljük (93).
Az E. coli ToplO-ből elkülönítjük a pCRBl-pstHexp vektort és teljesen elbontjuk a KpnI és Xbal restrikciós endonukleázzal, a pstH gént hordozó 788 bp méretű fragmentumot pedig 0,8%-os agaróz gélből a QIAquick gélextrakciós készlettel (78) tisztítjuk. A pstH-t hordozó fragmentumot T4-ligázzal összekapcsoljuk a pEC-K18mob2 vektorral (70). A ligációs keveréket az E. coli DH5amcr törzsbe transzformáljuk (96). A plazmidot hordozó sejteket úgy szelektáljuk, hogy a transzformációs keveréket 25 mg/1 kanamicint tartalmazó LB agaron (7) szélesztjük. Egyik transzformánsból elkülönítjük a plazmid DNS-t a QIAprep Spin Miniprep készlet /Qiagen (78)/ alkalmazásával. Az elemzést az EcoRI restrikciós enzimmel végzett kezeléssel végezzük, majd agaróz gélben elektroforézist hajtunk végre. A plazmidot pEC-K18mob2pstHexp-nek nevezzük el és a 3. ábrán mutatjuk be.
A törzset E. coli DH5amcr/pEC-K18mob2pstHexp-nek nevezzük el és tiszta tenyészet alakjában 2000.11.28.-án helyeztük letétbe a Budapesti Szerződés szerint a DSMZ-ben DSM 13878 számon.
4. példa
A DSM 5715 törzs transzformálása a pEC-K18mob2pstHexp plazmáddal
A DSM 5715 törzset az elektroporációs módszer (101) alkalmazásával a pEC-K18mob2pstHexp plazmiddal transzformáljuk.
A transzformánsok szelekcióját 25 mg/1 kanamicinnel kiegészített LHBIS agaron végezzük, amelynek összetétele:
18,5 g/1 agy-szív húsleves
0,5 M szorbit g/1 bakto-tripton
2,5 g/1 bakto-élesztő kivonat g/1 NaCl g/1 bakto-agar.
Az inkubálást 2 napon át 33°C-on végeztük.
A plazmid DNS-t egy transzformánsból a szokásos módon különítjük el (102), EcoRI restrikciós endonukleázzal elbontjuk és a plazmidot agaróz gélelektroforézissel elemezzük.
A kapott törzset DSM 5715/pEC-K18mob2pstHexp-nek nevezzük el.
5. példa
Lizin előállítása
A 4. példa szerint előállított C. glutamicum DSM 5715/- pECK18mob2pstHexp-törzset a lizin termelés szemopontjából megfelelő táptalajon tenyésztjük és a tenyészet felülűszójában meghatározzuk a lizin tartalmat.
Ecélból a törzset kiindulásként 24 órán át 33°C-on agar lemezen, a megfelelő antibiotikum jelenlétében inkubáljuk /agyszív agar, 25 μg/ml kanamicin/. Ebből az agar lemez tenyészetből kiindulva beoltunk egy előtenyészetet /10 ml táptalaj 100 ml-es Erlenmeyer lombikban/. Az előtenyészethez a Cg III táptalajt alkalmazzuk:
g/1 bakto-pepton g/1 bakto-élesztő kivonat
2,5 g/1 NaCl tömeg/térf% /külön autoklávozott/ glukóz
A pH-t 7,4-re állítjuk be.
mg/1 kanamicint adunk a táptalajhoz. Az előtenyészetet 16 órán át 33°C-on inkubáljuk 240 fordulat/perc rázatási sebesség21
gél. A főtenyészetet ebből az hogy a főtenyészet kiindulási OD előtenyészetből oltjuk be úgy, értéke /660 nm/ 0,05 legyen.
A főtenyészet esetében a MM táptalajt alkalmaztuk:
kukoricalekvár /CSL/ 5 g/1
MOPS /morfolino-propánszulfonsav/ 20 g/1
glukóz /külön autoklávozva/ 100 g/1
ammónium-szulfát 25 g/1
kálium-dihidro-foszfát 0, 1 g/1
magnézium-szulfát.7H2O U 3 g/1
kalcium-klorid.2H2O 10 mg/1
vas/II/szulfát.7H2O 10 mg/1
mangán-szulfát.H2O 5, 0 mg/1
biotin /szűréssel sterilezve/ 0, 3 mg/1
tiamin.HCl /szűréssel sterilezve/ 0,2 mg/1
L-leucin /szűréssel sterilezve/ 0,1 g/i
kalcium-karbonát 25 g/i
A CSL-t, MOPS-ot és a sóoldatot ammónia oldattal pH 7-re állítottuk be és autoklávoztuk. A steril szubsztrát és vitamin oldatokat, valamint a szárazon autoklávozott kalcium-karbonátot ezután adtuk hozzá.
A tenyésztést 10 ml térfogatban, terelőlapokkal ellátott 100 ml-es Erlenmeyer lombikokban végeztük, 25 mg/1 kanamicin hozzá adásával. A tenyésztést 33°C-on és 80% levegő-nedvesség mellett végeztük.
és 72 óra elteltével az OD értéket 660 nm mérési hullámhosszúságon a Biomek 1000 készülékkel /Beckmann Instruments GmbH, München, Németország/ határoztuk meg. A képződött lizin mennyiségét aminosav elemzővel /Eppendorf-Biotronik, Hamburg, Németország/ határoztuk meg, ioncserélő kromatográfia és az oszlop utáni származék-képzés /ninhidrines kimutatás/ segítségével.
A kísérlet eredményeit az 1. táblázatban mutatjuk be.
1. táblázat
Törzs OD (660 nm) lizin.HC1, g/1
DSM 5715/pEC-K18mob2 48 óra 11,4 14,14
DSM5715/pEC-K18mob2ptsHexp 48 óra 10,7 15, 98
DSM5715/pEC-K18mob2mob2 72 óra 10,1 15,24
DSM5715/pEC-K18mob2ptsHexp 72 óra 10,0 17,13
Ábrák
A következő ábrákat mutatjuk be:
1. ábra: A pCRBI-ptsHexp plazmid térképe
2. ábra: A pEC-K18mob2 plazmid
3. ábra: A pEC-K18mob2ptsHexp plazmid
Az alkalmazott rövidítések és jelölések magyarázata a következő: Kan: kanamicin rezisztencia gén zeocin: zeonin rezisztencia gén pstH: a C. glutamicum ptsH génje CelEl: a CelEl plazmid replikációs origója lacZ-alpha: a lacZ génfragmentum az E. coli-ból lacZ-alpha': a LacZ génfragmentum fragmentuma E. coli-ból per: a pGAl kópia számát ellenőrző gén oriV: ColEl-hez hasonló origó a pMBl-ből rep: a C. glutamicum pGAl plazmid ból származó, plazmid által kódolt replikációs tartomány RP4mob: RP4 mobilizációs hely EcoRI: az EcoRI restrikciós enzim restrikciós helye Hindii!: a Hindii! restrikciós enzim restrikciós helye KpnI: a KpnI restrikciós enzim restrikciós helye Xbal: az Xbal restrikciós enzim restrikciós helye
Szekvencia protokoll <110> Degussa-Hüls AG <120> új, a ptsH gént kódoló nukleotid szekvenciák <130> 990219 BT <140> <141>
<160> 2 <170> Patentln Ver. 2.1 <210> 1 <211> 480 <212> DNS <213> Corynebacterium glutamicum <220> <221> CDS <222> (163)..(429) <400> 1 ggacattgtt tttgcttceg gtaacgtggc aaaacgaaca atgtctcact agactaaagt 60 gagatcgaca ttaaatcccc tcccttgggg ggtttaacta acaaatcgct gcgccctaat 120 ccgttcggat taacggcgta gcaacacgaa aggacacttt cc atg get tcc aag 174
Met Ala Ser Lys act gta acc gtc ggt tcc tcc gtt ggc ctg
Thr Val Thr Val Gly Ser Ser Val Gly Leu
510 ate ate get gaa gcg get get gag tac gac lie He Ala Glu Ala Ala Ala Glu Tyr Asp
2530 ctg gtt ggc tec gat gat gac gaa gag acc gac gcg tcc tet tcc etc 318
Leu Val Gly Ser Asp Asp Asp Glu Glu Thr Asp Alá Ser Ser SerLeu 40 4550 atg atc atg gcg ctg ggc gca gag cac ggc aac gaa gtt acc gtc acc366
Met lie Met Ala Leu Gly Ala Glu His Gly Asn Glu Val Thr ValThr
6065 tcc gac aac get gaa get gtt gag aag atc get gcg ett atc gca cag414
Ser Asp Asn Ala Glu Ala Val Glut LyS He Ala Ala Leu He AlaGin
7580 gac ett gac get gag taaacaacgc tctgcttgtt aaaagetegt tagaaqctta 469
Asp Leu Asp Ala Glu ttaaaagegg t480
cac His 15 gca Ala cgt Arg cca gca tcc Ser 20 222
Pro Ala
gac gaa atc ttg ctg acc 270
Asp Glu He Leu Leu Thr
<210> 2 <211> 89 <212> PRT <213> Corynebacterium glutamicum <400> 2
Met Ala 1 Ser Lys Thr 5 Vai Thr Vai Gly Ser 10 Ser Vai Gly Leu His 15 Ala
Arg Pro Ala Ser 20 He He Ala Glu Ala 25 Ala Ala Glu Tyr Asp 30 Asp Glu
lie Leu Leu 35 Thr Leu Vai Gly Ser 40 Asp Asp Asp Glu Glu 45 Thr Asp Ala
Ser Ser 50 Ser Leu Met He Met 55 Ala Leu Gly Ala Glu 60 His Gly Asn Glu
Vai Thr 65 Vai Thr Ser Asp 70 Asn Ala Glu Ala Vai 75 Glu Lys lie Ala Ala 80
Leu lie Ala Gin Asp Leu Asp Ala Glu 85

Claims (17)

  1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK
    1. Korineform baktériumokból izolált polinukleotid, amely a következők közül egy polinukleotid szekvenciát tartalmaz:
    a) polinukleotid, amely legalább 70%-ban azonos egy olyan polipeptidet kódoló polinukleotiddal, amely a SEQ ID No. 2 aminosav szekvenciát tartalmazza,
    b) polinukleotid, amely legalább 70%-ban azonos egy olyan polipeptidet kódoló polinukleotiddal, amely a SEQ ID No. 2 aminosav szekvenciát tartalmazza,
    c) polinukleotid, amely komplementer az a) vagy b) polinukleotiddal ,
    d) polinukleotid, amely az a) , b) vagy c) polinukleotid szekvencia legalább 15 egymás utáni nukleotidját tartalmazza.
  2. 2. Az 1. igénypont szerinti polinukleotid, azzal jellemezve, hogy a polinukleotid egy korineform baktériumokban replikálható, előnyösen rekombináns DNS.
  3. 3. Az 1. igénypont szerinti polinukleotid, azzal jellemezve, hogy RNS.
  4. 4. A 2. igénypont szerinti replikálható DNS, azzal jellemezve, hogy a következők valamelyikét tartalmazza:
    i) a SEQ ID No. 1 nukleotid szekvenciát vagy ii) legalább egy olyan szekvenciát, amely az i) szekvenciának felel meg a genetikai kód degenerációs tartományán belül, vagy
    TI iii) legalább egy olyan szekvenciát, amely az i) vagy ii) szekvenciával komplementer szekvenciához hibridizál és adott esetben iv) i) funkció semleges szensz mutációit.
  5. 5. A 2. igénypont szerinti polinukleotid szekvencia, azzal jellemezve, hogy olyan polipeptidet kódol, amely a SEQ ID No. 2 szerinti aminosav szekvenciát tartalmazza.
  6. 6. Vektor, azzal jellemezve, hogy valamely, az 1. igénypont szerinti polinukleotid szekvenciát tartalmaz.
  7. 7. Korineform baktérium, azzal jellemezve, hogy egy 6. igénypont szerinti vektort tartalmaz.
  8. 8. Eljárás L-aminosavak fermentációs úton történő előállítására, azzal jellemezve, hogy
    i) a keresett L-aminosavat termelő korineform baktériumokat, amelyekben legalább a foszfotranszferáz rendszer H komponensét kódoló gén fokozott, tenyésztjük, közelebbről túlexprimáljuk, ii) az L-aminosavat a közegben vagy a baktérium sejtekben dúsítjuk és iii) az L-aminosavat elkülönítjük.
  9. 9. A 8. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan baktériumokat alkalmazunk, amelyekben a keresett L-aminosavhoz vezető bioszintézis út további génjei is fokozottak.
  10. 10. A 9. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan baktériumokat alkalmazunk, amelyekben a keresett L-aminosav képződését csökkentő anyagcsere utak legalább részben ki vannak kapcsolva.
  11. 11. A 9. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy egy plazmid vektorral transzformált törzset alkalmazunk és a plazmid vektor a foszfotranszferáz rendszer H komponensét kódoló gén nukleotid szekvenciáját hordozza.
  12. 12. A 9-11. igénypont közül egy vagy több szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan korineform baktériumokat alkalmazunk, amelyek L-lizint termelnek.
  13. 13. A 10. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy egyidejűleg fokozunk, azaz túlexprimálunk vagy amplifikálunk egy vagy több következő gént:
    a gliceraldehid-3-foszfát-dehidrogenázt kódoló gap gén, a piruvát-karboxilázt kódoló pyc gén, a triózfoszfát-izomerázt kódoló tpi gén, a dihidropikolinát-szintetázt kódoló dapA gén, a foszfoenol-piruvát-cukor-foszfotranszferáz rendszert /ptsM/ kódoló ptsm gén a 3-foszfoglicerát-kinázt kódoló pgk gén és a lizin exportot kódoló lysE gén.
  14. 14. A 11. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy L-lizin előállítására olyan baktériumokat alkalmazunk, amelyekben egyidejűleg gyengítünk egy vagy több következő gént:
    a foszfoenol-piruvát-karboxikinázt kódoló pck gén, a piruvát-oxidázt kódoló poxB gén, a glukóz-6-foszfát-izomerázt kódoló pgi gén.
  15. 15. Az előző igénypontok közül egy vagy több szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a Corynebacterium glutamicum fajhoz tartozó mikroorganizmusokat alkalmazunk.
  16. 16. Az 1. igénypont szerinti polinukleotid szekvenciák primerként való alkalmazása olyan gének DNS-einek előállítására, amelyek a ptsH génterméket kódolják, azzal jellemezve, hogy a polimeréz-láncreakciót alkalmazzuk.
  17. 17. Az 1. igénypont szerinti polinukleotid szekvenciák alkalmazása, azzal jellemezve, hogy ezeket hibridizációs szondaként használjuk fel.
    A meghatalmazott:
    az S.B.G. & K. Nemzetközt Szabadalmi Iroda tagja, H-W62 Budapest, Andrássy út 113. Telefon: 34-24-950, Fax: 34-24-323
HU0100131A 2000-01-13 2001-01-12 Novel nucleotide sequences coding for the ptsh-gene HUP0100131A2 (en)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE10001101A DE10001101A1 (de) 2000-01-13 2000-01-13 Neue für das ptsH-Gen codierende Nukleotidsequenzen

Publications (2)

Publication Number Publication Date
HU0100131D0 HU0100131D0 (en) 2001-03-28
HUP0100131A2 true HUP0100131A2 (en) 2002-10-28

Family

ID=7627360

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU0100131A HUP0100131A2 (en) 2000-01-13 2001-01-12 Novel nucleotide sequences coding for the ptsh-gene

Country Status (14)

Country Link
EP (1) EP1118666A3 (hu)
JP (1) JP2001224390A (hu)
KR (1) KR100762112B1 (hu)
CN (1) CN1319667A (hu)
AU (1) AU7254800A (hu)
BR (1) BR0100063A (hu)
CA (1) CA2328583A1 (hu)
DE (1) DE10001101A1 (hu)
HU (1) HUP0100131A2 (hu)
ID (1) ID28932A (hu)
MX (1) MXPA01000261A (hu)
RU (1) RU2268938C2 (hu)
SK (1) SK362001A3 (hu)
ZA (1) ZA200100332B (hu)

Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6884614B1 (en) 1999-07-01 2005-04-26 Basf Aktiengesellschaft Corynebacterium glutamicum genes encoding phosphoenolpyruvate: sugar phosphotransferase system proteins
DE1246922T1 (de) * 1999-07-01 2003-03-20 Basf Ag Für proteine des phosphoenolpyruvat:zucker phosphotransferase systems kodierende gene aus corynebacterium glutamicum
US7241600B2 (en) * 2001-07-06 2007-07-10 Degussa Ag Process for the preparation of L-amino acids using strains of the enterobacteriaceae family
JP5583311B2 (ja) * 2005-03-10 2014-09-03 味の素株式会社 プリン系物質生産菌及びプリン系物質の製造法
US7326546B2 (en) 2005-03-10 2008-02-05 Ajinomoto Co., Inc. Purine-derived substance-producing bacterium and a method for producing purine-derived substance
US9664161B2 (en) 2011-10-26 2017-05-30 Continental Automotive Gmbh Valve assembly for an injection valve and injection valve

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH0655149B2 (ja) * 1985-03-12 1994-07-27 協和醗酵工業株式会社 Ｌ―リジンの製造法
DE3737729A1 (de) * 1987-11-06 1989-05-18 Degussa Pendelvektor pz1, rekombinantes, ein aspartasegen enthaltendes plasmid, seine verwendung zur herstellung von aminosaeuren der aspartat-familie aus fumarat-haltigem naehrmedium und es enthaltende mikroorganismen
JP3008549B2 (ja) * 1991-03-06 2000-02-14 味の素株式会社 発酵法によるｌ−リジンの製造法
ATE533848T1 (de) * 1995-05-05 2011-12-15 Danisco Us Inc Anwendung von glukose-transport-mutanten zur erzeugung von aromatischen stoffwechselverbindungen
SK285201B6 (sk) * 1996-12-05 2006-08-03 Ajinomoto Co., Inc. Rekombinantná DNA, autonómne reprodukovaná v bunkách koryneformnej baktérie, koryneformná baktéria a spôsob výroby L-lyzínu, vektor pVK7
TR200103854T2 (tr) * 1999-07-01 2002-06-21 Basf Aktiengesellschaft Corynebacterium glutamicum gen kodlayıcı fosfonolpiruvat: şeker fosfotransferaz sistem proteini
JP4623825B2 (ja) * 1999-12-16 2011-02-02 協和発酵バイオ株式会社 新規ポリヌクレオチド

Also Published As

Publication number Publication date
KR100762112B1 (ko) 2007-10-04
SK362001A3 (en) 2002-06-04
RU2268938C2 (ru) 2006-01-27
CA2328583A1 (en) 2001-07-13
AU7254800A (en) 2001-07-26
MXPA01000261A (es) 2002-08-06
EP1118666A2 (de) 2001-07-25
DE10001101A1 (de) 2001-07-19
ID28932A (id) 2001-07-19
CN1319667A (zh) 2001-10-31
HU0100131D0 (en) 2001-03-28
BR0100063A (pt) 2002-03-05
ZA200100332B (en) 2001-07-26
KR20010086331A (ko) 2001-09-10
JP2001224390A (ja) 2001-08-21
EP1118666A3 (de) 2001-08-16

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US7262036B2 (en) Process for the preparation of l-amino acids
JP2001161386A (ja) ｐｏｘＢ−遺伝子をコードする新規ヌクレオチド配列
HUP0004715A2 (en) Novel nucleotide sequences coding for the succ and sucd genes
HUP0004876A2 (en) Novel nucleotid sequences coding for the zwa2 gene
MXPA00009077A (es) Nuevas secuencias nucleotidicas que codifican al gen eno..
SK13282000A3 (sk) Nukleotidové sekvencie kódujúce gén dapF a spôsoby fermentačnej výroby L-aminokyselín
HUP0004877A2 (en) Novel nucleotid sequences coding for the sdha, sdhb and sdhc genes
HUP0101166A2 (hu) A dapC-gént kódoló nukleotid szekvenciák és eljárás L-lizin előállítására
EP1287143B1 (en) Corynebacterium glutamicum nucleotide sequences coding for the glbo gene
HUP0100131A2 (en) Novel nucleotide sequences coding for the ptsh-gene
US7205131B2 (en) Process for the preparation of L-amino acids via overexpression of the PTSH gene
US20040005675A9 (en) Nucleotide sequences encoding the ptsH gene
US6806068B1 (en) Nucleotide sequences which encode the pfk gene
HUP0004783A2 (hu) Új, a glk-gént kódoló nukleotid szekvenciák
SK17372000A3 (sk) Nukleotidové sekvencie kódujúce gén pfka
US6987015B1 (en) Nucleotide sequences encoding the pfkA gene
US6638753B2 (en) Nucleotide sequences which code for the cma gene
AU3343401A (en) Nucleotide sequences that code for the rp 1K gene and methods of use thereof

Legal Events

Date Code Title Description
FA9A Lapse of provisional patent protection due to relinquishment or protection considered relinquished