HUP0101166A2 - A dapC-gént kódoló nukleotid szekvenciák és eljárás L-lizin előállítására - Google Patents

Abstract

A találmány tárgya korinform baktériumokból származó izoláltpolinukleotid, amely az alábbi csoportból kiválasztott legalább egypolinukleotid szekvenciát tartalmaz: a) olyan polinukleotid, amelylegalább 70%-ban azonos a (SEQ ID No. 2) aminosavszekvenciáttartalmazó polipeptidet kódoló polinukleotiddal; b) olyan polipeptidetkódoló polinukleotid, amely olyan aminosav szekvenciával rendelkezik,amely legalább 70%-ban azonos a SEQ ID Bo. 2. szerintiaminosavszekvenciával c) olyan polinukleotid, amely az a) vagy b)szerinti polinukleotidok komplementere; d) olyan polinukleotid, amelylegalább 15 egymásután következő, a), b), vagy c) polinukleotidszekvenciájú nukleotidot tartalmaz, és eljárás L-aminosavak, különösenL-lizin előállítására. Ó

Description

pt/.4 Ο Ζ / é G

JI.G.AK.

' --'mzetköei Szabadalmi Iroda

KÖZZÉTÉTELI

72.053/PA

A dapC gént kódoló nukleotid szekvenciák és eljárás L-lizin előállítására

A találmány tárgyát a dapC gént kódoló nukleotid szekvenciák és fermentációs eljárás képezi L-lizin olyan korineform baktériumokkal való előállítására, amelyekben a dapC gén (N-szukcinil-amino-ketopimelát-transzamináz gén) fokozott hatású.

Az aminosavakat, különösen az L-lizint a humán gyógyászatban és a gyógyszeriparban, különösen azonban az állati takarmányozásban alkalmazzák.

Ismeretes, hogy korineform baktérium törzsekkel, különösen a Corynebacterium glutamicum-mal fermentációs úton aminosavak állíthatók elő. A kérdés nagy jelentősége miatt állandóan dolgoznak az előállítási eljárás továbbfejlesztésén. Az eljárás továbbfejlesztése érintheti a fermentációs technikai intézkedéseket (pl. a keverést és az oxigénnel való ellátást), a táptalaj összetételét (ide tartozik pl. a cukor koncentráció a fermentáció alatt) vagy a termék alakját pl. az ioncserélő kromatográfiával való feldolgozás során vagy magának a mikroorganizmusnak a teljesítménnyel kapcsolatos tulajdonságait.

A mikroorganizmusok teljesítménnyel kapcsolatos tulajdonságainak javítására a mutagenezis, szelekció és a mutánsok kiválasztása módszereit alkalmazzák. Ily módon olyan törzsekhez lehet jutni, amelyek rezisztensek antimetabolitokkal, pl. a lizin analóg S-(2-amino-etil)-ciszteinnel szemben vagy auxotrófok a reguláció szempontjából jelentős metabolitokra és L-aminosavakat, pl. L-lizint termelnek.

Néhány év óta a rekombináns DNS technika módszereit is alkalmazzák az L-aminosavakat termelő Corynebacterium glutamicum törzsek javítására. Ezek szerint egyes aminosav bioszintézis géneket amplifikálnak és vizsgálják ennek hatását az L-aminosav termelésre. Összefoglaló cikkek találhatók e tárgyban az (1)-(5) irodalmi helyeken.

A találmány szerinti feladat abban áll, hogy új intézkedéseket dolgozzunk ki az L-lizin javított fermentációs előállításához .

Az L-lizint a humán gyógyászatban, a gyógyszeriparban és kitüntetett módon az állat-takarmányozásban alkalmazzák. Általános érdeklődésre tarthat tehát az L-lizin előállítására irányuló új, továbbfejlesztett eljárások kidolgozása.

Túrikor a következőkben L-lizint vagy lizint említünk, ezen nemcsak a bázist, hanem a sókat -pl. a lizin-monohidrokloridot vagy a lizin-szulfátot is értjük.

A találmány tárgya korineform baktériumokból származó, egy polinukleotid szekvenciát tartalmazó izolált polinukleotid, a következők közül:

a) a polinukleotid legalább 70%-ban azonos egy olyan polipeptidet kódoló polinukleotiddal, amely a SEQ ID No. 2 aminosav szekvenciát tartalmazza,

b) a polinukleotid egy olyan aminosav szekvenciát tartalmazó polipeptidet kódol, amely legalább 70%-ban azonos a SEQ ID No.2 aminosav szekvenciával

c) a polinukleotid komplementer az a) vagy b) szerinti polinukleotiddal vagy

d) a polinukleotid az a) , b) vagy c) polinukleotid szekvenciák legalább 15 egymást követő nukleotidját tartalmazza.

Ugyancsak a találmány tárgyát képezi az 1. igénypont szerinti polinukleotid; ennek során előnyösen egy replikálható DNS-ről van szó, amely (i) a SEQ ID No. 1 szerinti nukleotid szekvenciát tartalmazza, vagy (ii) legalább egy olyan szekvenciát tartalmaz, amely az (i) szekvenciának felel meg a genetikai kód degenerációs tartományán belül, vagy (iii) legalább egy olyan szekvenciát tartalmaz, amely az i) szekvenciához vagy az (ii) szekvenciával komplementer szekvenciához hibridizál és adott esetben (iv) az (i)-ben jelenlevő funkció semleges szensz mutánsokat tartalmaz.

A találmány további tárgyai:

a 4. igénypont szerinti polinukleotid, amely a SEQ ID No. 1 szerinti nukleotid szekvenciát tartalmazza, polinukleotid, amely a SEQ ID No. 2 szerinti aminosav szekvenciát tartalmazó polipeptidet kódol, az 1. igénypont szerinti polinukleotidot tartalmazó vektor, különösen az ingavektor vagy a 2. ábrán bemutatott és a DSM 5715-ben DSM 13254 számon letétbe helyezett pXT-dapCexp plazmid vektor és a vektort tartalmazó, gazdasejtként szolgáló korineform baktériumok .

Ugyancsak a találmány tárgyát képezik olyan polinukleotidok, amelyek lényegében egy polinukleotid szekvenciából állnak. Ezeket egy megfelelő génbank hibridizáció segítségével történő screenelése útján lehet előállítani; ezek a SEQ ID No. 1.-nek megfelelő polinukleotid szekvenciával rendelkező teljes gént tartalmazzák, egy nyúlvánnyal (szonda), amely a SEQ ID No. 1.-nek megfelelő polinukleotid szekvenciát vagy ennek egy fragmentumát tartalmazza. Szintén a találmány tárgyát képezi az említett DNS szekvenciák elkülönítése.

A találmány szerinti polinukleotid szekvenciák RNS, cDNS és DNS hibridizációs szondaként alkalmazhatók az RNS, cDNS és DNS esetében, az N-szukcinil-aminoketopimelát-transzaminázt kódoló cDNS teljes hosszúságban való elkülönítésére, valamint olyan cDNS vagy gének elkülönítésére, amelyek a szekvencia tekintetében nagyfokú hasonlóságot mutatnak az N-szukcinil-aminoketopimelát-transzamináz gén szekvenciájával.

A találmány szerinti polinukleotid szekvenciák továbbá prímenként alkalmazhatók az N-szukcinil-aminoketopimelát-transzaminázt kódoló gének DNS-ének a polimeráz láncreakció (PCR) révén való előállítása során.

Az ilyen szondaként vagy primerként szolgáló oligonukleotidok legalább 30, előnyösen legalább 20 és különösen előnyösen legalább 15 egymás utáni nukleotidot tartalmaznak. Ugyancsak alkalmazhatók a legalább 40 vagy 50 nukleotid hosszúságú oligo nukleotidok.

Az „elkülönítés a természetes környezetből való kiválasztást jelent.

A „polinukleotid kifejezés általában poliribonukleotidokra és polidezoxiribonukleotidokra vonatkozik, mimellett nem-módosított vagy módosított RNS-ről vagy DNS-ről lehet szó.

A „polipeptidek kifejezés olyan peptideket vagy proteineket jelöl, amelyek két vagy több, peptid kötéssel összekapcsolt aminosavat tartalmaznak.

A találmány szerinti polipeptidek tartalmaznak egy SEQ ID No. 2. szerinti polipeptidet, különösen olyanokat, amelyek az N-szukcinil-aminoketopimelát-transzamináz biológiai aktivitásával rendelkeznek és olyanokat is, amelyek a SEQ ID No. 2. szerinti polipeptiddel legalább 70%-ban, előnyösen legalább 80%-ban és különösen legalább 90-95%-ban azonosak és az említett aktivitást mutatják.

A találmány tárgyát képezi továbbá egy eljárás aminosavak, különösen L-lizin előállítására olyan korineform baktériumok alkalmazásával, amelyek már egy aminosavat termelnek és amelyekben a dapC gént kódoló nukleotid szekvenciák fokozottak, közelebbről túlexprimáltak.

A „fokozás fogalom ebben az összefüggésben egy vagy több olyan enzim intracelluláris aktivitásának egy mikroorganizmusban való fokozását jelenti, amelyet a megfelelő DNS kódol. Ennek érdekében pl. növelhető a gén vagy gének kópiaszáma, erős promoter alkalmazható vagy olyan gén vagy alléi alkalmazható, amely egy megfelelő, magas aktivitású enzimet kódol és adott esetben ezeket a lépéseket kombináljuk.

A találmány tárgyát képező mikroorganizmusok L-aminosavakat, különösen lizint képesek előállítani glukózból, szacharózból, laktózból, fruktózból, maltózból, melaszból, keményítőből, cellulózból vagy glicerinből és etanolból. Mikroorganizmusként a korineform baktériumok képviselőiről, különösen a Corynebacterium genusról lehet szó. A Corynebacterium genus esetében különösen a Corynebacterium glutamicum speciest kell megneveznünk, amelyről a szakterületen ismert, hogy L-aminosavakat képes termelni.

A Corynebacterium genushoz, különösen a Corynebacterium glutamicum specieshez tartozó megfelelő törzsek között kell külön megemlítenünk pl. a következő ismert vad típustörzseket:

Corynebacterium glutamicum ATCC13032

Corynebacterium acetoglutamicum ATCC15806

Corynebacterium acetoacidophilum ATCC13870

Corynebacterium thermoaminogenes FERM BP-1539

Corynebacterium melassecola ATCC17965

Brevibacterium flavum ATCC14067

Brevibacterium lactofermentum ATCC13869 és

Brevibacterium divaricatum ATCC14020 és az ezekből előállított, L-lizint termelő mutánsokat ill. törzseket, pl. a következő törzseket:

Corynebacterium glutamicum FERM-P 1709

Brevibacterium flavum FERM-P 1712

Brevibacterium lactofermentum FERM-P 1712

Corynebacterium glutamicum FERM-P 6463

Corynebacterium glutamicum FERM-P 6464,

Corynebacterium glutamicum DSM 5715

Corynebacterium glutamicum DSM 12866 és Corynebacterium glutamicum DM58-1.

Azt találtuk, hogy C. glutamicum-ból elkülöníthető az N-szukcinil-aminoketopimelát-transzaminázt /EC 2.6.1.17/ kódoló dapC gén.

A dapC gén vagy a C. glutamicum más génjei elkülönítéséhez először létre kell hozni e mikroorganizmus génbankját E. coliban. Génbankok létrehozását általánosan ismert tankönyvekben és kézikönyvekben írják le. Példaként a (6) tankönyvre vagy a (7) kézikönyvre hivatkozunk. Különösen ismert az E. coli K-12 törzs W3110 génbankja, amelyet λ-vektorokban alakítottak ki /(8)/. A (9) helyen a C. glutamicum ATCC 13032 génbankját írják le, amelyet a Supercos I (10) kozmid vektor segítségével hoztak létre az E. coli K-12 NM 554 törzsben (11). A (12) helyen szintén leírnak egy C. glutamicum ATCC 13032 génbankot, amelyhez a pHC79 kozmidot alkalmazták.

C. glutamicum génbank előállítására E.coli-ban a pBR322 (15) vagy a pUC9 (16) plazmid is alkalmazható. Gazdaszervezetként különösen olyan E. coli törzsek alkalmasak, amelyeknek restrikciós és rekombinációs hibái vannak. Példa erre a DH5amcr törzs (16). A kozmidok segítségével klónozott hosszú DNS fragmensek ezután ismét a szokásosan használt, szekvenálásra alkalmas vektorokba szubklónozhatók, majd szekvenálhatók (17).

Ilyen módon juthatunk az új, a zwa2 gént kódoló C. glutamicum DNS szekvenciához, amely az 1. azonosító számú szekvenciaként a találmány része. A továbbiakban e DNS szekvenciából a fent leírt módszerekkel a megfelelő fehérje aminosav-szekvenciája levezet hető. A 2. azonosítási számú szekvencia a dapC géntermék így létrejött aminosavszek-venciáját mutatja be.

Azok a kódoló DNS szekvenciák, amelyek az 1. azonosító számú szekvenciából a genetikai kód degeneráltsága miatt keletkeznek, ugyancsak részei a találmánynak. Hasonló módon részét képezik a találmánynak azok a DNS szekvenciák, amelyek a 1. azonosítási számú szekvenciával vagy annak részeivel hibridizálnak. A szakterületen szensz mutációként ismertek továbbá a fehérjékben végbemenő konzervatív aminosav cserék, pl. a glicin cseréje alaninra vagy az aszparaginsav cseréje glutaminsavra, amelyek nem vezetnek alapvető változásokhoz a fehérje aktivitásában, azaz funkciósemlegesek. Ismert továbbá, hogy egy fehérje N- vagy C-terminálisán végbemenő változások annak funkcióját nem befolyásolják lényegesen, sőt azt stabilizálni képesek. Erre vonatkozóan adatok találhatók a (18)-(21) helyen, valamint az ismert genetikai és molekuláris biológiai tankönyvekben. Azok az aminosav szekvenciák, amelyek megfelelő módon a SEQ ID No. 2-ből adódnak, szintén a találmány tárgyát képezik.

Alkotóelemei végül a jelen találmánynak azok a DNS szekvenciák is, amelyeket az 1. azonosító számú szekvenciákból levezethető primerek alkalmazásával polimeráz láncreakcióval (PCR) állítunk elő. Ezek az oligonukleotidok tipikusan legalább 15 nukleotid hosszúságúak.

A DNS szekvenciák hibridizálással történő azonosítására utalás található többek között a (22) kézikönyvben és a (23) cikkben. A DNS szekvenciák polimeráz láncreakcióval (PCR) végzett amplifikációjára utalást találhat a szakember többek között a (24) és (25) kézikönyvben.

Azt találtuk, hogy a korineform baktériumok a dapC gén túlexpressziója után tökéletesebb módon termelnek L-lizint.

A túlexpresszió elérése céljából növelhetjük a megfelelő gének kópiaszámát vagy mutációt hajthatunk végre azon promoter- és regulációs tartományokban ill. riboszóma kötőhelyen, amelyek a struktúrgéntől felfelé találhatók. Ugyanilyen hatásúak az olyan expressziós kazetták, amelyek a struktúrgéntől felfelé építhetők be. Indukálható promóterek segítségével lehetőség nyílik arra, hogy a fermentációs L-lizin termelés folyamán fokozzuk az expressziót. Az expresszió ugyancsak javítható az m-RNS élettartamának meghosszabbítására irányuló intézkedésekkel. Az enzimaktivitás fokozható az enzimfehérje lebomlásának gátlásával is. A gének vagy génkonstrukciók vagy a különböző kópiaszámú plazmidokban fordulhatnak elő, vagy a kromoszómában integrálva találhatók és amplifikálhatók. Egy másik megoldás szerint a gének túlexpresszióját a közeg összetételének megváltoztatása és a tenyésztés megfelelő levezetése révén érhetjük el.

Erre vonatkozóan a szakember adatokat találhat egyebek között a (26)-(39) irodalmi helyen, valamint az ismert genetikai és molekuláris biológiai tankönyvekben.

A találmány szerinti dapC gént pl. plazmidok segítségével lehet túlexprimálni.

Plazmádként azok alkalmasak, amelyek korineform baktériumokban replikálhatók. Számos ismert plazmid vektor - 1. pl. a (40), (29) és (41) irodalmat - a pHM1519, pBLl vagy a pGAl * · «·« · · ·· · kriptikus plazmidon alapul. Más plazmid vektorok, pl. azok, amelyek a pCG4-en (42), pNG2-n (43) vagy a pAGl-n (44) alapulnak, hasonlóképpen alkalmazhatók.

Példa egy olyan plazmidra, amelynek segítségével a dapC gén túlexprimálható, a pXT-dapCexp E. coli-C. glutamicum ingavektor. Ez tartalmazza a pAGl plazmid replikációs tartományát, ideértve a per replikációs effektort (45), a pGAl plazmid (44) tetraciklin rezisztenciát közvetítő tetA(Z) génjét /letétbe helyezve AF121000 számon az NCBI-ben, Bethesda, MD, ΑΕΆ/, valamint a replikációs eredőt, a trc promótert, a TI és T2 terminációs tartományokat és a pTRC99A plazmid lac^q génjét /amely az E. coli lac operonjának represszora, (46)/.

A pXT-dapCexp ingavektort a 2. ábrán mutatjuk be.

Alkalmasak továbbá azok a plazmid vektorok, amelyek segítségével a gén amplifikációs eljárást a kromoszómába való integrálás révén alkalmazhatjuk, amint ezt pl. a (33) helyen leírják a hom-thrB operon duplikációjára ill. amplifikációjára. E módszer szerint a teljes gént olyan plazmid vektorba klónozzuk, amely replikációra képes egy gazdaszervezetben (jellemző módon E. coliban), de nem képes erre a C. glutamicum-ban. Vektorként pl. a következők vehetők figyelembe: pSUP301 (47); pK18mob vagy pK19 mob (48); pGEM-T /Promega Co., Madison, WI, AEÁ/; PCR2.1-TOPO (49); pCR^RBlunt /Invitrogen, Groningen, Hollandia/ (50) vagy pEMl (51).

.:1. ^:·#·

Az amplifikálandó gént hordozó plazmid vektort ezután konjugációval vagy transzformációval bevisszük a kiválasztott C. glutamicum törzsbe. A konjugációs módszereket pl. az (52) irodalom ismerteti. Transzformációs módszereket ir le az (53)-(55) közlemény. „Cross over eredményeként létrejött homológ rekombináció után a kapott törzs a szóban forgó gén legalább két kópiáját tartalmazza.

Azt találtuk továbbá, hogy az N-szukcinil-amino-keto-pimelát transzamináz enzim fehérje 209. helyén levő aminosav, az L-prolin (1. a SEQ ID No. 2-t) kicserélése hatására valamely más proteinogén aminosavra, különösen L-leucinre (1. a SEQ ID No. 4-t) erősítés lép fel és a megfelelő aminosav cserén átesett korineform baktériumok fokozott mértékben termelnek L-lizint. Az aminosav szekvencia 209. helyén levő L-prolin cseréje L-leucinre előnyösen a 716. helyzetű citozin nukleobázis timinnel való kicserélésével valósítható meg, amint ezt a SEQ ID No. 3 nukleotid szekvencia bemutatja.

A mutagenezishez a klasszikus mutagenezisre szolgáló eljárásokat alkalmazhatjuk, mutagén anyagok /pl. az N-me-til-N'-nitroN-nitrozo-guanidin/ vagy UV fény segítségével. Az in vitro mutagenezis módszereiként megemlíthetjük pl. a hidroxil-aminnal végzett kezelést (56), a mutagén oligo-nukleotidok alkalmazását (57) vagy a polimeráz láncreakciót (58).

A találmány tárgyát képezik tehát az olyan korineform baktériumok is, amelyek az N-szukcinil-amino-keto-pimelinát enzim fehérjét tartalmazzák, és amelyekben a SEQ ID No. 2 jelű aminosav szekvencia a 209. helyen az L-prolin helyett egy másik aminosa * * ♦<· «V ···

J ’„···«-·* vat - az L-prolin kivételével - tartalmaz. A találmány körébe tartoznak azok a korineform baktériumok is, amelyekben az enzim fehérje (1. a SEQ ID No. 2-t) 209. helyén levő L-prolint L-leucinra cseréltük ki (SEQ ID No. 4).

A találmány további tárgyát képezik ennek megfelelően az olyan korineform baktériumokból származó polinukleotid szekvenciák, amelyek az említett N-szukcinil-amino-keto-pimelát transzamináz enzim fehérjét kódolják.

További tárgyai a találmánynak azok a korineform baktériumok, amelyek egy - a 209. helyen levő L-prolin L-leu-cionra való kicserélésével kapott N-szukcinil-amino-keto-pimelát transzamináz enzim fehérjét kódoló - DNS-t tartalmaznak és ez a DNS a 716. helyen a citozin nukleobázis helyett (SEQ ID No. 1) timint tartalmaz (SEQ ID No. 3).

Ezenkívül előnyös lehet, az L-lizin előállítása céljából, a dapC gén mellett az aktuális bioszintézis utak, a glikolízis, az anaplerotika vagy az aminosav export egy vagy több enzimjének fokozása vagy túlexprimálása.

így pl. az L-lizin előállításához a dapC génen kívül a következő csoportba sorolt egy vagy több gén egyidejűleg erősíthető, különösen túlexprimálható vagy amplifikálható:

- a dihidro-dipikolinát-szintázt kódoló dapA gén (59),

- a tetrahidro-dipikolinát-szukcinilázt kódoló dapD gén (60), génbank letéti száma AJ004934

- a feed back rezisztens aszpartát-kinázt kódoló lysC gén (61) ,

- az N-szukcinil-diamino-pimelát-deszukcinilázt kódoló dapE gén (62), génbank letéti száma X81379

- a piruvát karboxilázt kódoló pyc gén (63),

- a malát:kínon oxidoreduktázt kódoló mqo gén (64),

- a lizin exportot kódoló lysE gén (65), az aszpartát-szemialdehid-dehidrogenázt kódoló ásd gén (61), (66),

- a dihidro-dipikolinát reduktázt kódoló dapB gén, génbanki letéti száma AJ004934 (67),

- diamino-pimelát-epimerázt kódoló dapE gén, DSM 12968 (68),

- a diamino-pimelát-dekarboxilázt kódoló lysA gén, génbanki letéti száma XO7563 (69),

- a diamino-pimelát-dehidrogenázt kódoló ddh gén (70),

- a zwal gén (71), DSM 13115, és a glutamát-dehidrogenázt kódoló gdh gén (12). Előnyben részesítjük a dapD, dapE és dapE génekből álló csoportból egy vagy több gén egyidejű erősítését.

Emellett előnyös lehet az L-lizin előállítására a dpC gén erősítésén kívül, amelyet adott esetben a dapD, dapE és dapF génekből álló csoportból egy vagy több génnel kombinálva végzünk el, a következő gének valamelyikének egyidejű gyengítése:

- a foszfoenol-piruvát-karboxikinázt kódoló gén (72), DSM 13047

- a glukóz-6-foszfát izomerázt kódoló pgi gén (73), DSM 12969

- a piruvát-oxidázt kódoló poxB gén (74), DSM 13114

- a zwa2 gén(75), DSM 13113 vagy

- a szukcinil-CoA szintetázt kódoló sucC vagy sucD gén (76).

Ezen túlmenően előnyös lehet az L-lizin előállításakor a dapC gén erősítése mellett, amelyet adott esetben egy vagy több gén kombinációjával (a dapD, dapE és dapF alkotta csoportból) végzünk, a nem kívánt mellék-reakciók kiiktatása (77).

A találmány szerint előállított mikroorganizmusokat L-lizin termelése céljából folyamatosan vagy szakaszosan, rátáplálásos szakaszos fermentációval vagy ismételt rátáplálásos szakaszos fermentációval tenyészthetjük. Az ismert tenyésztési módszerekkel kapcsolatos összefoglalás található a (78) vagy a (79) tankönyvben .

Az alkalmazott tenyésztési közegnek megfelelő módon kell kielégítenie a mindenkori törzsek igényeit. Különböző mikroorganizmusok tenyésztési közegeinek leírása megtalálható a (80) kézikönyvben .

Szénforrásként cukor és szénhidrátok, mint például glukóz, szacharóz, laktóz, fruktóz, maltóz, melasz, keményítő és cellulóz, olajok és zsírok, mint például szójaolaj, napraforgó-olaj, földimogyoró-olaj és kókusz-olaj, zsírsavak, mint például palmitinsav, sztearinsav és linolsav, alkoholok, mint például glicerin és etanol, valamint szerves savak, mint például ecetsav, használhatók. Ezek az anyagok alkalmazhatók önmagukban vagy keverékként. Nitrogén forrásként felhasználhatók nitrogén-tartalmú szerves vegyületek, mint a peptonok, élesztő-kivonat, húskivonat, maláta-kivonat, kukoricalekvár, szójabab őrlemény és karbamid, vagy szervetlen vegyületek, mint az ammónium-szulfát, ammónium-klorid, ammónium-foszfát, ammonium-karbonát és ammonium

-nitrát. A nitrogén-tartalmú vegyületek alkalmazhatók önmagukban vagy keverékként.

Foszfor forrásként alkalmazható a foszforsav, kálium-dihidrogén-foszfát vagy dikálium-hidrogén-foszfát, illetve az ezeknek megfelelő nátrium tartalmú sók. A tenyésztési közegnek tartalmaznia kell továbbá fémsókat, mint például magnézium-szulfátot vagy vas-szulfátot, amelyek szükségesek a növekedéshez. Végül bevihetők még a fentieken kívül a növekedést serkentő esszenciális anyagok, mint az aminosavak és vitaminok. A táptalajhoz továbbá megfelelő elővegyületek is adagolhatok. A fent felsorolt anyagok egyszeri, egy tételben történő adagolással adhatók hozzá a tenyészethez, illetve megfelelő módon a tenyésztés folyamán táplálhatok be.

A tenyészet pH-jának szabályozására lúgos vegyületeket, mint nátrium-hidroxidot, kálium-hidroxidot, ammóniát vagy szalmiákszeszt, illetve savakat, mint foszforsavat vagy kénsavat adagolunk alkalmas módon. A habképződés szabályozására habzásgátlókat, mint például zsírsav-poliglikol-észtereket adhatunk a tenyészethez. A plazmidok stabilitásának fenntartására a közeghez megfelelő, szelektív hatású anyagokat, például antibiotikumokat adhatunk. Az aerób körülmények biztosítására oxigént vagy oxigéntartalmú gázkeveréket, például levegőt vezetünk a kultúrába. A tenyészet hőmérséklete normális körülmények között 20°C és 45°C, előnyösen 25°C és 40°C között állítható be. A tenyésztést addig folytatjuk, amíg maximális mennyiségű lizin keletkezik. Ezt a célt normál körülmények között 10-160 óra alatt érjük el.

Az L-lizin meghatározása anioncserélő-kromatográfiával és az azt követő ninhidrines származékképzéssel hajtható végre (81).

A következő mikroorganizmust a Budapesti Szerződésnek megfelelően a Deutsche Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturennél (DSMZ, Braunschweig, Deutschland) a DSM 13254 nyilvántartási számmal helyeztük letétbe:

- Corynebacterium glutamicum DSM5715' /pXT-dapCexp.

A találmány szerinti eljárás az L-lizin fermentációs úton való előállítására szolgál.

A találmányt a következőkben kiviteli példák segítségével közelebbről részletezzük.

1. példa

Genom kozmid génbank előállítása Corynebacterium glutamicum ATCC 13032-ből

Corynebacterium glutamicum ATCC 13032-ből kromoszomális DNSeket izoláltunk és Sau3AI restrikciós enzimmel (Amersham Pharmacia, Freiburg, Deutschland, Produktbeschreibung Sau3AI, Code no. 27-0913-02) részlegesen hasítottuk. A DNS fragmenseket borjúbél· lúgos foszfatázzal (Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, Deutschland, Produktbeschreibung SAP Code no. 1758250) defoszforileztük. A Stratagene cég (La Yolla, USA, Produktbeschreibung SuperCosl Cosmid Vector Kit, Code no. 251301) által szállított SuperCosl kozmid vektor DNS-ét 883) az Xbal restrikciós enzimmel (Amersham Pharmacia, Freiburg, Deutschland, Produktbeschreibung BamHI, Code no. 27-0948-02) hasítottuk és hasonlóképpen borjúbél lúgos foszfatázzal defoszforileztük. Ezután a kozmid DNS-t a BamHI restrikciós enzimmel (Amersham Pharmacia, Freiburg, Deutschland, Produktbeschreibung BamHI, Code no. 27-0968-04) hasítottuk. Az ilyen módon kezelt kozmid DNS-t öszszekevertük a kezelt ATCC13032 DNS-el és az egészet T4-DNS-1Ígázzal (Amersham Pharmacia, Freiburg, Deutschland, Produktbeschreibung T4-DNA-Ligase, Code no. 27-0870-04) kezeltük. A ligációs keveréket Gigapack II XL Packing Extracts (Stratagene, La Jolla, USA, Produktbeschreibung Gigapack, II XL Packing Extract, Code no. 200217) segítségével fágokba pakoltuk. Az NM554 E.coli törzs fertőzése céljából (84) a sejteket 10 mmol MgSO₄-tal vettük fel és a fág-szuszpenzió alikvot részével öszszekevertük. A kozmid bank fertőzését és titrálását (85) szerint hajtjuk végre, és ennek során a sejteket, 100 mg/1 ampicillinnel, LB-agaron (86) szélesztettük. Éjszakán át 37°C-on történő inkubálás után a rekombináns egyedi kiónokat szelektáltuk.

2. Példa

A dapC gén izolálása és szekvenálása

Egy különálló kolónia kozmid DNS-ét Qiaprep Spin Miniprep Kit (Poduct No. 27106 Qiagen, Hilden Germany) segítségével a gyártó előírása szerint izoláltuk és Sau3AI restrikciós enzimmel (Amersham Pharmacia, Freiburg, Deutschland, Produktbeschreibung Sau3AI Produkt No. 27-0913-02) részelegesen hasítottuk. A DNS fragmenseket borjúbél lúgos foszfatázzal (Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, Deutschland, Produktbeschreibung SAP, Produkt No.1758250) defoszforileztük. Gélelektroforézises szétválasztást követően, a QiaExII Gel Extraction Kit (Product No.

20021, Qiagen, Hilden, Germany) segítségével a 1500-2000 bp nagyságrendű kozmid fragmenseket izoláltuk. A pZero-1 szekvencia vektor DNS-ét (Firma Invitrogen, Groningen, Niederlande,

Produktionsbeschreibung Zero Background Cloning Kit, Product No.K2500-01) a BamHI restrikciós enzimmel (Amersham Pharmacia, Freiburg, Deutschland, Produktbeschreibung BamHI, Produkt No. 27-0868-04) hasítottuk. A kozmid fragmensek ligációját a pZero-1 szekvencia vektorokba (85) szerint végeztük, és ennek során a DNS keveréket T4-ligázzal (Pharmacia Biotech, Freiburg, Deutschland) egy éjszakán át inkubáltuk. Ezután ezt a ligációs keveréket a DH5aMCR E.coli törzsbe /(87), (88)/ elektroporáció segítségével vittük be és 50 mg/1 zeocinnal, LB-agaron (86) szélesztettük. A rekombináns kiónból a plazmid előállítását a Biorobot 9600-al (Product No. 90020, Qiagen, Hilden, Deutschland) hajtottuk végre. A szekvenálást a (90) által módosított (89) didezoxi-láncfelbontási eljárással végeztük. Ehhez a PE Applied Biosystems (Product No.403044, Weiterstadt, Deutschland) RR dRhodanin Terminator Cycle Sequencing Kit-jét használtuk. A Rotiphorese NF Acrylamid/Bisacrylamid gélben (29:1) (Product No. A124.1, Roth, Karlsruhe, Deutschland) történő gélelektroforézises szétválasztás kiértékelését és a szekvenáló reakció elemzését a PE Applied BioSystems (Weiterstadt, Deutschland) „ABI Prism 377 szekvenáló berendezésével hajtottuk végre.

A kapott nyers szekvencia adatokat ezután a Stadenprogramcsomag (Nucleic Acids Research 14,p. 217-231, 1986) 97-0 verziója alkalmazásával dolgoztuk fel. A pZero-1 származék egye19 di szekvenciáit összefüggő Contig-ba állítottuk össze. A komputerizált kódtartomány elemzést az XNIP programmal (Staden: Nucleic Acids Research, 14, p.217-231, 1986) hajtottuk végre.

További elemzést a „BLAST search programs (91) segítségével végeztünk, a National Center for Biotechnology Information (NBCI, Bethesda, MD, AEÁ) nem redundáns adatbankjával szemben.

A dapC gén így nyert nukleotid szekvenciát az 1. azonosító számú szekvenciában mutatjuk be. A nukleotid szekvenciák analízise egy 1101 bázispárból álló nyitott leolvasási keretet adott, amelyet dapC génként jelöltünk. A dapC gén egy 3 67 aminosavból álló polipeptidet kódol, melyet a 2. azonosító számú szekvenciában adtunk meg.

3. példa

A pXT-dapCexp ingavektor előállítása a dapC gén C. glutamicum-ban való fokozása céljából 3.1. A dapC gén klónozása

A (92)) szerint kromoszómális DNS-t izoláltunk az ATCC 13032 törzsből. A C. glutamicumra vonatkozó 2. példából ismert dapC gén szekvenciák alapján a következő oligonuk-leotidokat választjuk ki a polimeráz láncreakcióhoz (1. az 5. és 6. sz. azonosító szekvenciát is):

dapC /dCexl/:

5' GAT CTA(GAA TTC) GCC TCA GGC ATA ATC TAA CG 3' dapC /dCexna2/:

5' GAT CTA (TCT AGA) CAG AGG ACA AGG CAA TCG GA 3' ^:ν· !·

A bemutatott primereket az ARK Scientific GmbH Biosystems cég (Darmstadt, Németország/ szintetizálta és a PCR reakciót a (93) standard PCR módszerrel hajtottuk végre a Roche Diagnostics GmbH cég (Mannheim, Németország) Pwo-polimerázával. A polimeráz láncreakció segítségével a primerek lehetővé teszik egy körülbelül 1,6 kb nagyságú DNS fragmenst amplifikálását, amely a dapC gént hordozza. A DapC /dCexl/ primer ezenkívül tartalmazza az EcoRI restrikciós endonukleáz hasítási hely szekvenciáját és a DapC /dCexna2/ primer tartalmazza az Xbal restrikciós hasítási hely szekvenciáját (ezeket az előbbi képletekben zárójelben adtuk meg) .

A kb. 1,6 kb méretű amplifikált DNS fragmenst az Invitrogen Corporation cég (Carlsbad, CA, AEÁ; Katalog Nummer K4500-01) Zero Blunt™ Kit-je segítségével a pCR^R-Blunt II vektorba (94) ligáltuk. Ezután a ToplO' E. coli törzset a ligációs keverékkel a kitet gyártó cég utasításai szerint transzformáljuk. A plazmid hordozó sejtek szelektálása a transzformációs elegynek 25 mg/1 kanamicinnel kiegészített LB-agaron való szélesztésével (7) történt. Az egyik transzformánsból izoláltuk a DNS plazmidot a Qiagen cég /Hilden, Németország/ Quiaprep Spin Miniprep Kit-je segítségével és az Xbal és EcoRI restrikciós enzimmel való kezelés, majd agarózgél-elektroforézis segítségével (0,8%) megvizsgáltuk. Az amplifikált DNS fragmentum DNS szekvenciáját szekvenálással azonosítottuk. A kapott plazmidot pCRdapC-nek neveztük el. A törzs neve: E. coli ToplO/pCRdapC.

3.2 A pEC-XT99A E. coli-C. glutamicum ingavektor előállítása Az ingavektor létrehozásához kiindulási vektorként a pTRC99A E. coli expressziós vektort (95) alkalmaztuk. A BspHI restrikciós hasítás (Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, Németország, Produktbeschreibung BspHI, Product No. 1467123) után, majd a Klenow kezelést követően /Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg, Németország, Produktbeschreibung Klenow Fragment of DNA Polymerase I., Product No. 27-0928-01; (7) módszer/ a (bla) ampicillin rezisztencia gént kicseréltük a C. glutamicum pAGl plazmid /GenBank letéti szám AF121000/tetraciklin rezisztencia génjével. Ennek érdekében a rezisztenciagént hordozó tartományt Alul fragmentumként /Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg, Németország, Produktbeschreibung Alul, Product No. 27-08844-01;/ a lineárissá tett pTRC99A E. coli expressziós vektorba klónozzuk (7) . A ligálást (7) szerint hajtottuk végre, és ennek során a DNS keveréket T4-ligázzal /Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg, Németország, Produktbeschreibung T4-DNA Ligase, Product No. 27-0870-04/ egy éjjelen át inkubáltuk. Ezt a ligációs elegyet végül az E. coli DH5amcr törzsbe - (87) - visszük be, elektroporációval (55). A létrehozott E. coli expressziós vektort pXT99A-val jelöljük.

A Corynebacterium glutamicum-ból származó minimálreplikon klónozásához alapként a pGAl plazmidot /(41)/ alkalmaztuk. A pGAl vektor Ball/PstI restrikciós hasításával /Promega GmbH, Mannheim, Németoraszág, Produktbeschreibung Ball, Product No. R6691; Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg, Németország, Produktbeschreibung PstI, Product No. 27-0976-01/ egy 3484 bp méretű fragmentumot tudtunk klónozni a Smal-gyel és Pstl-gyel /Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg, Németország, Produktbeschreibung Smal, Product No. 27-0942-02; Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg, Németország, Produktbeschreibung PstI, Product No. 27-0976-01/ fragmentált pK18mob2 vektorba (95). BamHI/XhoI restrikciós hasítással /Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg, Németország, Produktbeschreibung BamHI, Product No. 27-0950-01/, majd Klenow kezeléssel /Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg, Németország, Produktbeschreibung Klenow Fragnent of DNA Polymerase I., Product No. 27-0928-01; (7)/ egy 839 bp méretű fragmentumot kapcsoltunk ki. A T4 ligázzal /Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg, Németország, Produktbeschreibung T4-DNA Ligase, Product No. 27-0870-04/ religált termékből a C. glutamicum minimálreplikon 2645 bp méretű fragmentumként a pXT99A E. coli expressziós vektorba volt klónozható. Ennek érdekében a minimálreplikont hordozó termék DNS-ét a KpnI /Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg, Németország, Produktbeschreibung KpnI, Product No. 27-0908-01/ és a PstI restrikciós enzimekkel /Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg, Németország, Produktbeschreibung PstI, Product No. 27-0886-03/ hasítjuk, majd Klenow polimerázzal /Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg, Németország, Produktbeschreibung Klenow Fragment of DNA Polymerase I, Product No. 27-0928-01/ 3'-5'-endonukleázos kezelést (7) végzünk.

Egy párhuzamos kísérletben a pXT99A E. coli expressziós vektort az RsrII restrikciós enzimmel elbontjuk (Roche Diagnostics, Mannheim, Németország, Produktbeschreibung RsrII, Product No. 1292587), majd Klenow polimerázzal /Amersham Pharmacia Bio tech, Freiburg, Németország, Produktbeschreibung Klenow Fragment of DNA Polymerase I, Product No. 27-0928-01/ előkészítjük a ligációra. A minimálreplikon ligációját a pXT99A vektor konstrukcióval (7) szerint hajtjuk végre; ennek során a DNS és a T4-ligáz /Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg, Németország, Produktbeschreibung T4-DNA-Ligase, Product No. 27-0870-04/ keverékét egy éjjelen át inkubáljuk.

Az így létrehozott pEC-XT99A E. coli-C. glutamicum expressziós ingavektort elektroporációval (96) bevisszük a C. glutamicum DSM5715-be. A transzformánsok szelekcióját 5 mg/1 tetraciklinnel kiegészített LBHIS agaron végezzük, amelynek összetétele a kö vetkező :

agy-szív infúziós húsleves 18,5 g/1 szorbit0,5 M bakto-tripton5 g/1 bakto-élesztő kivonat 2,5 g/1

NaCl5 g/1 bakto-agar 18 g/1

Az inkubálást 2 napon át végezzük 33°C-on.

A plazmád DNS-t egy transzformánsból a szokásos módon elkülönítjük (97), a Hindii! restrikciós endonukleázzal hasítjuk és a plazmidot agaróz gélelektroforézissel vizsgáljuk.

Az így kapott plazmid terméket, amelyet pEC-XT99A-nak neveztünk el, az 1. ábrán mutatjuk be. A plazmidot elektroporációval bevisszük a Corynebacterium glutamicum DSM5715 törzsbe; a kapott törzs jelölése DSM5616/pEC-XT99A. Ezt a Budapesti Szerződés sze • · · * · ·♦ · ·· ···· : ·♦,· ··/· · rint DASM12967 számon a DSMZ-ben /Braunschweig, Németország/ helyeztük letétbe.

3.3 . A dapC klónozása a pEC-XT99A E. coli-C. glutamicum ingavektorban

Vektorként a 3.2 példa szerinti pEC-XT99A E. coli-C. glutamicum ingavektort alkalmazzuk. E plazmid DNS-ét teljesen elbontjuk az EcoRI és Xbal restrikciós enzimmel, majd borjúbél lúgos foszfatázzal (Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, Deutschland, Produktbeschreibung SAP, Product No. 1758250) defoszforilezzük.

A 3.1 példában leírt pCRdapC plazmádból EcoRI és Xbal enzimekkel való teljes elbontással elkülönítjük a dapC gént. A kb. 1600 bp méretű dapC fragmentumot az agaróz gélből a QiaExII Gél Extraction Kit (Product No.20021, Qiagen, Hilden, Germany) segítségével izoláljuk.

Az így kapott dapC fragmentunot összekeverjük az előkészített pEC-XT99A vektorral és a keveréket T4-ligázzal /Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg, Németország, Produktbeschreibung T4DNA-Lígase, Product No. 27-0870-04/ kezeljük. A ligációs elegyet az E. coli DH5aMCR törzsbe transzformáljuk (98). A plazmidot hordozó sejtek szelekcióját a transzformációs elegy 5 mg/1 tetraciklint tartalmazó LB agarra (99) való szélesztésével végezzük. Egy éjjelen át 37°C-on való inkubálás után szelektáljuk az egyes rekombináns telepeket. A plazmid DNS-t egy transzformánsból a Qiaprep Spin Kit (Product No.27106, Qiagen, Hilden, Németország) segítségével a gyártó előírásai szerint izoláljuk és az EcoRI és Xbal restrikciós enzimekkel elbontjuk, majd a plazmidot agaróz gélelektroforézissel vizsgáljuk. A kapott plazmidot pXT-dapCexp-nek neveztük el és a 2. ábrán mutatjuk be.

4. példa

A DSM5715 törzs transzformációja a pXT-dapCexp plaz-middal

A DSM5715 törzset a pXT-dapCexp plazmiddal (96) szerint elektroporációs módszerrel transzformáljuk. A szelektálást LBHIS agáron végezzük, amelynek összetétele a következő:

agy-sziv infúziós húsleves 18,5 g/1 szorbit0,5 M bakto-tripton5 g/1 bakto-élesztő kivonat 2,5 g/1

NaCl5 g/1 bakto-agar 18 g/1

Az inkubálást 2 napon át végezzük 33°C-on.

A plazmid DNS-t egy transzformánsból a szokásos módszerekkel (97) elkülönítjük, az EcoRI és Xbal restrikciós endonukleázokkal elhasítjuk és agaróz gélelektroforézissel vizsgáljuk a plazmidot. A kapott törzset DSM5715/pXT-dapCexp-nek nevezzük el és DSM 13254 számon a DSMZ-ben /Braunschweig, Németország/ letétbe helyezzük .

5. Példa

Lizin előállítása

A 4. példa szerint kapott DM5715/pXT-dapCexp C. glutamicum törzset lizin előállítására alkalmas tápközegben tenyésztjük és a felülúszóban meghatározzuk a lizin tartalmat.

Ennek érdekében a törzset agar-lemezen, amely megfelelő antibiotikumot tartalmaz (agy-szív agar, 5 mg/1 tetracik-lin) 33°C hőmérsékleten 24 óráig inkubáljuk. Kiindulva ebből az agar-lemez tenyészetből beoltunk egy előtenyészetet (10 ml közeg 100 ml-es Erlenmeyer lombikban). Az előtenyészet közegeként a CglII teljes táptalajt alkalmazzuk:

CglII táptalaj

NaCl 2,5 g/1 bakto-pepton 10 g/1 bakto-élesztőkivonat 10 g/1 glukóz /külön autoklávozva/ 2 tömeg/térf%

A pH értéket 7,4-re állítjuk be.

Ehhez 5 mg/1 tetraciklint adunk. Az előtenyészetet 33°C hőmérsékleten rázógépen 240 rpm mellett 16 órán át inku-báljuk. Ebből az előtenyészetből főtenyészetet oltunk, úgy, hogy a főtenyészet kezdeti OD-je (660 nm) 0,1 legyen. A főtenyészethez az MM közeget használjuk:

MM közeg

CSL (kukoricalekvár) 5 g/1

MOPS (morfolino-propán- szulfonsav) 20 g/1 glukóz (külön autoklávozott) 50 g/1

(NH4) 2SO4	25 g/1
kh2po4	0,1 g/1
MgSO4.7 H2O	1,0 g/1
CaCl2.2 H2O	10 mg/1
FeSO4.7 H2O	10 mg/1
MnSO4.H2O	5 mg/1
biotin (sterilre szűrt)	0,3 mg/1
tiamin.HCl (sterilre szűrt)	0,2 mg/1
L-leucin (sterilre szűrt)	0,1 mg/1
CaCO3	25 g/1

A CSL-t, a MOPS-t és a sóoldatot vizes ammónia oldattal 7 pH-ra állítjuk be és autoklávozzuk. Ezután hozzáadjuk a steril szubsztrátum és vitamin oldatot, valamint a szárazon autoklávozott CaCO3~t.

A tenyésztést 10 ml térfogatban hajtjuk végre 100 ml-es Erlenmeyer lombikban. 5 mg/1 tetraciklint adagolunk. A tenyésztés 33°C hőmérsékleten történt, 80 % légnedvesség mellett.

óra elteltével 660 nm mérési hullámhosszon megmérjük az OD-t, Biomek 1000-el (Beckmann Instruments GmbH, München). A keletkezett lizin mennyiséget az Eppendorf-BioTronik cég (Hamburg, Németország) aminosav analizátora segítségével ioncserélő kromatográfiával és az oszlop utáni ninhidrines származék képzéssel határoztuk meg.

A kísérleti eredményeket az 1. táblázatban mutatjuk be.

1. táblázat

Törzs	OD (660 nm)	lizin-HCl g/1
DSM5715/pXT-dapCexp	7,1	14,7
DSM5715	7,0	13,7

A következő ábrákat mutatjuk be:

1. ábra: A pEC-XT99A plazmid képe.

2. ábra: A pXT-dapCexp plazmid képe.

Az alkalmazott rövidítések és jelölések jelentése a következő:

per a GA1 gén kópiaszámát ellenőrző gén oriE az E. coli plazmid által kódolt replikációs origója rep a C. glutamicum pGAl plazmid által kódolt repliká- ciós origój a

Ptrc trc promoter a pTRC99A-ból

TI, T2 az 1 és 2 terminátor régiók a pTRC99A-ból laclq represszor gén a Lac operonból

Tét tetraciklin rezisztencia gén dapC a C. glutamicum dapC génje

EcoRI az EcoRI restrikciós enzim hasítási helye

OEcoRV az EcoRV restrikciós enzim hasítási helye

Hindii! a Hindin restrikciós enzim hasítási helye

KpnI a KpnI restrikciós enzim hasítási helye

Sall a Sáli restrikciós enzim hasítási helye

SamI az Smal restrikciós enzim hasítási helye

Ndel az Ndel restrikciós enzim hasítási helye

BamHI	a	BamHI	restrikciós	enzim	hasítási	helye
Ncol	az	Ncol	restrikciós	enzim	hasítási	helye
Xbal	az	Xbal	restrikciós	enzim	hasítási	helye
SacI	az	SacI	restrikciós	enzim	hasítási	helye

<110> SZEKVENCIA LISTA <120> A dapC gént kódoló nukleotid szekvenciák és eljárás L-lizin előállítására <130> 990217 BT <140>

<141>

<160> 6 <170> bejelentő, 2.1 kísérlet <210> 1 <211> 1300 <212> DNS <213> Corynebacterium glut ami cum <220>

<221> CDS <222> (91). . (1191) <223> dapC-gén <400> 1 gggctcccca ggtggtgcgg ctaagcttgg accacaagat tttgatcacc caatgatcgc 60 tgcgctgccg cctcaggcat aatctaacgc atg acc tct ege acc cég ett gtt 114

Met Thr Ser Arg Thr Pro Leu Val tct gtt ett cet gat ttt ccg tgg gat teg etc get tcc gca aaa gcc162

Ser Val Leu Pro Asp Phe Pro Trp Asp Ser Leu Alá Ser Ala Lys Alá aaa get geg tot cac ccg gat ggg ate gtg aat ett tct gtt ggc act210

Lys Ala Alá Ser His Pro Asp Gly Ile Val Asn Leu Ser Val Gly Thr ccg gtt gat ccg gtc gcg ccc agc att cag atc gcg ttg gca gaa gca258

Pro Val Asp Pro Val Alá Pro Ser lie Gin lie Ala Leu Ala Glu Alá gcg ggg ttt teg ggt tac cet caa acc atc ggc acc ccg gaa ctc ege306

Alá Gly Phe Ser Gly Tyr Pro Gin Thr Ile Gly Thr Pro Glu Leu Arg gca gcc atc agg ggc gcg ett gag egg ege tac aac atg aca aag ett354

Ala Ala lie Arg Gly Ala Leu Glu Arg Arg Tyr Asn Met Thr Lys Leu gtc gac gcc tcc ctc ctc ccc gtc gtg ggt acc aag gag gca att gcc402

Val Asp Alá Ser Leu Leu Pro Val Val Gly Thr Lys Glu Ala lie Alá

100 ett ett cca ttc gcg ttg ggt att tcc ggc acc gtt gtc atc cca gag450

Leu Leu Pro Phe Alá Leu Gly Ile Ser Gly Thr Val Val Ile Pro Glu

105

110

115

120

att lie

geg tac cca ace tac gaa

gtc get

gtc gtg

gcc Ala

gca gga tgc

acc Thr

498

Ala Tyr

Pro

Thr Tyr Glu 125

Vai

Ala

Vai 130

Vai

Ala

Gly

Cys 135

5

gtg Vai

ttg cgt Leu Arg

tet Ser 140

gat teg ctg Asp Ser Leu

ttt Phe

aag Lys 145

etc Leu

ggc Gly

ccg Pro

cag Gin

ate He 150

ccg Pro

teg Ser

546

atg

atg ttt

ate

aac tea cca

tec

aac

ccc

aca

ggc

aag

gtt

ctg

ggc

594

10

Met

Met Phe 155

He

Asn Ser Pro

Ser 160

Asn

Pro

Thr

Gly

Lys 165

Vai

Leu

Gly

15

ate He

cca cac Pro His 170

ttg Leu

ege aag gtt Arg Lys Vai 175

gtg Vai

aag Lys

tgg Trp

geg Ala

cag Gin 180

gaa Glu

aac Asn

aac· gtg Asn Vai

642

ate He 185

etc gca Leu Ala

get Ala

gat gaa tgc Asp Glu Cys 190

tac Tyr

ttg Leu

ggt Gly

ett Leu 195

ggc Gly

tgg Trp

gac Asp

gat Asp

gaa Glu 200

690

20

aac Asn

cca ccg Pro Pro

ate He

tea att ttg Ser He Leu 205

gat Asp

cca Pro

cgt Arg 210

gtc Vai

tgc Cys

gat Asp

ggc Gly

gac Asp 215

cac His

738

25

ace Thr

aac ttg Asn Leu

ate He 220

gee att cac Ala He His

teg Ser

ctg Leu 225

tet Ser

aaa Lys

acc Thr

tea Ser

aac Asn 230

etc Leu

get Ala

786

tot

tac ege

gca

ggt tac etc

gtt

ggc

gat

cca

geg

ctg

att

ggt

gaa

834

30

Ser

Tyr Arg 235

Ala

Gly Tyr Leu

Vai 240

Gly

Asp

Pro

Ala

Leu 245

He

Gly

Glu

35

etc Leu

acg gaa Thr Glu 250

gtc Vai

cgt aag aac Arg Lys Asn 255

ttg Leu

ggt Gly

etc Leu

atg Met

gtt Vai 260

cct Pro

ttc Phe

cca Pro

ate lie

882

cag Gin 265

cag gee Gin Ala

atg Met

ate gca gcc He Ala Ala 270

etc Leu

aac Asn

gac Asp

gat Asp 275

gac Asp

caa Gin

gag Glu

gca Ala

ggg Gly 280

930

40

cag Gin

aag etc Lys Leu

ace Thr

tac geg att Tyr Ala He 285

cgt Arg

ega Arg

gca Ala 290

aaa Lys

etc Leu

atg Met

age Arg

gcc Ala 295

ctg Leu

978

45

ttg Leu

gaa tec Glu Ser

ggc Gly 300

ttt cag gta Phe Gin Vai

gat Asp

aat Asn 305

tet Ser

gaa Glu

geg Ala

ggt Gly

ctg Leu 310

tac Tyr

etc Leu

1026

tgg

geg acg

cgt

gaa gaa cct

tgc

cgt

gac

act

gtc

gat

tgg

ttc

get

1074

50

Trp

Ala Thr 315

Arg

Glu Glu Pro

Cys 320

Arg

Asp

Thr

Vai

Asp 325

Trp

Phe

Ala

55

gag Glu

cgt ggc Arg Gly 330

att He

etc gtt gcc Leu Vai Ala 335

cca Pro

gga gac Gly Asp

ttc Phe

tat Tyr 340

ggc Gly

cct Pro

ege Arg

gga Gly

1122

geg Ala 345

cag cat Gin His

gtg Vai

cgt gtg geg Arg Vai Ala 350

atg Met

acc Thr

gaa Glu

acc Thr 355

gac Asp

gag Glu

ege Arg

gtc Vai

gac Asp 360

1170

gcc ttt gtt tct ege ctg age taaacacgac taagettatt ttgtttaatt 1221 Ala Phe Vai Ser Arg Leu Ser

365 gagtttgaag ttttccgtcg aaagaggcca tttgagttcc gagtccagtc etgagtegag 1281 taccgagcaa aaaacctgg 1300 <210> 2 <211> 367 <212> PRT <213> Corynebacterium glutamicum <400> 2

Met Thr Ser Arg Thr Pro Leu Vai Ser Vai Leu Pro Asp Phe Pro Trp

5 1015

Asp Ser Leu Ala Ser Ala Lys Ala Lys Ala Ala Ser His Pro AspGly

2530 lie Vai Asn Leu Ser Vai Gly Thr Pro Vai Asp Pro Vai Ala Pro Ser 35 4045 lie Gin lie Ala Leu Ala Glu Ala Ala Gly Phe Ser Gly Tyr Pro Gin 50 5560

Thr lie Gly Thr Pro Glu Leu Arg Ala Ala lie Arg Gly Ala LeuGlu

70 7580

Arg Arg Tyr Asn Met Thr Lys Leu Vai Asp Ala Ser Leu Leu ProVai

9095

Vai Gly Thr Lys Glu Ala lie Ala Leu Leu Pro Phe Ala Leu Gly lie 100 105110

Ser Gly Thr Vai Vai lie Pro Glu lie Ala Tyr Pro Thr Tyr Glu Vai 115 120125

Ala Vai Vai Ala Ala Gly Cys Thr Vai Leu Arg Ser Asp Ser Leu Phe 130 135140

Lys Leu Gly Pro Gin lie Pro Ser Met Met Phe lie Asn Ser ProSer

145 150 155160

Asn Pro Thr Gly Lys Vai Leu Gly lie Pro His Leu Arg Lys VaiVai

165 170175

Lys Trp Ala Gin Glu Asn Asn Vai lie Leu Ala Ala Asp Glu Cys Tyr 180 185190

Leu Gly Leu Gly Trp Asp Asp Glu Asn Pro Pro lie Ser lie Leu Asp 195 200205

Pro Arg Vai Cys Asp Gly Asp His Thr Asn Leu He Ala lie His Ser 210 215220

Leu Ser Lys Thr Ser Asn Leu Ala Ser Tyr Arg Ala Gly Tyr Leu Vai 225 230 235240

Gly Asp Pro Ala Leu lie Gly Glu 245

Gly Leu Met Vai Pro Phe Pro lie 260

Asn Asp Asp Asp Gin Glu Ala Gly 275280

Arg Ala Lys Leu Met Arg Ala Leu 290295

Asn Ser Glu Ala Gly Leu Tyr Leu 305310

Arg Asp Thr Vai Asp Trp Phe Ala 325

Gly Asp Phe Tyr Gly Pro Arg Gly 340

Thr Glu Thr Asp Glu Arg Vai Asp 355360

Leu Thr Glu Vai Arg Lys Asn Leu 250255

Gin Gin Ala Met He Ala Ala Leu 265270

Gin Lys Leu Thr Tyr Ala He Arg 285

Leu Glu Ser Gly Phe Gin Vai Asp 300

Trp Ala Thr Arg Glu Glu Pro Cys 315320

Glu Arg Gly He Leu Vai Ala Pro 330335

Ala Gin His Vai Arg Vai Ala Met 345350

Ala Phe Vai Ser Arg Leu Ser 365 <210> 3 <211> 1300 <212> DNS <213> Corynebacterium glutamicum <220>

<221> CDS <222> (91)..(1191) <223> dapC-alléi <400> 3 gggctcccca ggtggtgcgg ctaagcttgg accacaagat tttgatcacc caatgatcgc 60 tgcgctgccg cctcaggcat aatctaacgc atg acc tot cgc acc cog ctt gtt 114

Met Thr Ser Arg Thr Pro Leu Vai 15 tot gtt ctt cct gat ttt ccg tgg gat teg etc get tec gca aaa gee162

Ser Vai Leu Pro Asp Phe Pro Trp Asp Ser Leu Ala Ser Ala LysAla

1520 aaa get geg tet cac ccg gat ggg ate gtg aat ctt tet gtt ggc act210

Lys Ala Ala Ser His Pro Asp Gly lie Vai Asn Leu Ser Vai GlyThr

30 3540 ccg gtt gat ccg gtc geg ccc age att cag ate geg ttg gca gaa gca258

Pro Vai Asp Pro Vai Ala Pro Ser He Gin lie Ala Leu Ala GluAla

5055 geg ggg ttt teg ggt tac cct caa acc ate ggc acc ccg gaa etc cgc306

Ala Gly Phe Ser Gly Tyr Pro Gin Thr lie Gly Thr Pro Glu LeuArg

6570

gca gcc ate agg

ggc Gly

geg ett gag

egg ege tac aac atg

aca Thr

aag ett

354

Ala

Ala

He 75

Arg

Ala Leu

Glu 80

Arg

Arg

Tyr

Asn Met 85

Lys

Leu

5

gtc Vai

gac Asp 90

gcc Ala

tcc Ser

etc Leu

etc ccc Leu Pro 95

gtc Vai

gtg Val

ggt Gly

acc Thr

aag gag Lys Glu 100

gca Ala

att He

gcc Ala

402

ett

ett

cca

ttc

geg

ttg ggt

att

tec

ggc

acc

gtt gtc

ate

cca

gag

450

10

Leu 105

Leu

Pro

Phe

Ala

Leu Gly 110

lie

Ser

Gly

Thr 115

Val Val

lie

Pro

Glu 120

15

att He

geg Ala

tac Tyr

cca Pro

acc Thr 125

tac gaa Tyr Glu

gtc Vai

get Ala

gtc Val 130

gtg Val

gcc gca Ala Ala

gga Gly

tgc Cys 135

acc Thr

498

gtg Vai

ttg Leu

cgt Arg

tet Ser 140

gat Asp

teg ctg Ser Leu

ttt Phe

aag Lys 145

etc Leu

ggc Gly

ccg cag Pro Gin

ate He 150

ccg Pro

teg Ser

546

20

atg Met

atg Met

ttt Phe 155

ate He

aac Asn

tea cca Ser Pro

tec Ser 160

aac Asn

ccc Pro

aca Thr

ggc aag Gly Lys 165

gtt Val

ctg Leu

ggc Gly

594

25

ate He

cca Pro 170

cac His

ttg Leu

ege Arg

aag gtt Lys Vai 175

gtg Vai

aag Lys

tgg Trp

geg Ala

cag gaa Gin Glu 180

aac Asn

aac Asn

gtg Val

642

ate

etc

gca

get

gat

gaa tgc

tac

ttg

ggt

ett

ggc tgg

gac

gat

gaa

690

30

lie 185

Leu

Ala

Ala

Asp

Glu Cys 190

Tyr

Leu

Gly

Leu 195

Gly Trp

Asp

Asp

Glu 200

35

aac Asn

cca Pro

ccg Pro

ate He

tea Ser 205

att ttg lie Leu

gat Asp

eta Leu

cgt Arg 210

gtc Val

tgc gat Cys Asp

ggc Gly

gac Asp 215

cac His

738

ace Thr

aac Asn

ttg Leu

ate He 220

gcc Ala

att cac He His

teg Ser

ctg Leu 225

tet Ser

aaa Lys

acc tea Thr Ser

aac Asn 230

etc Leu

get Ala

786

40

tet Ser

tac Tyr

ege Arg 235

gca Ala

ggt Gly

tac etc Tyr Leu

gtt Vai 240

ggc Gly

gat Asp

cca Pro

geg ctg Ala Leu 245

att lie

ggt Gly

gaa Glu

834

45

etc Leu

acg Thr 250

gaa Glu

gtc Vai

cgt Arg

aag aac Lys Asn 255

ttg Leu

ggt Gly

etc Leu

atg Met

gtt cct Val Pro 260

ttc Phe

cca Pro

ate He

882

cag

cag

gcc

atg

ate

gca gcc

etc

aac

gac

gat

gac caa

gag

gca

ggg

930

50

Gin 265

Gin

Ala

Met

He

Ala Ala 270

Leu

Asn

Asp

Asp 275

Asp Gin

Glu

Ala

Gly 280

55

cag Gin

aag Lys

etc Leu

acc Thr

tac Tyr 285

geg att Ala He

cgt Arg

ega Arg

gca Ala 290

aaa Lys

etc atg Leu Met

ege Arg

gcc Ala 295

ctg Leu

978

ttg Leu

gaa Glu

tec Ser

ggc Gly 300

ttt Phe

cag gta Gin Vai

gat Asp

aat Asn 305

tet Ser

gaa Glu

geg ggt Ala Gly

ctg Leu 310

tac Tyr

etc Leu

1026

tgg geg acg cgt gaa gaa cct tgc cgt gac act	gtc Vai	gat Asp 325	tgg Trp	ttc Phe	get Ala	1074
Trp Ala Thr Arg Glu Glu Pro Cys	Arg	Asp	Thr
	315	320
gag	cgt ggc	att etc gtt gcc cca	gga	gac	ttc	tat	ggc	cct	ege	gga	1122
Glu	Arg Gly 330	lie Leu Vai Ala Pro 335	Gly	Asp	Phe	Tyr 340	Gly	Pro	Arg	Gly
geg	cag cat	gtg cgt gtg geg atg	acc	gaa	acc	gac	gag	ege	gtc	gac	1170
Ala 345	Gin His	Vai Arg Vai Ala Met 350	Thr	Glu	Thr 355	Asp	Glu	Arg	Vai	Asp 360

gcc ttt gtt tct ege ctg age taaacacgac taagettatt ttgtttaatt 1221 Ala Phe Vai Ser Arg Leu Ser

365 gagtttgaag ttttccgtcg aaagaggcca tttgagttcc gagtccagtc etgagtegag 1281 taccgagcaa aaaacctgg 1300 <210> 4 <211> 367 <212> PRT <213> Corynebacterium glutamicum <400> 4 Met Thr Ser Arg Thr Pro 1 5

Asp Ser Leu Ala Ser Ala 20 lie Vai Asn Leu Ser Vai 35 lie Gin He Ala Leu Ala 50

Thr He Gly Thr Pro Glu 65 70

Arg Arg Tyr Asn Met Thr 85

Vai Gly Thr Lys Glu Ala 100

Ser Gly Thr Vai Vai He 115

Ala Vai Vai Ala Ala Gly 130

Lys Leu Gly Pro Gin lie 145 150

Asn Pro Thr Gly Lys Vai 165

Leu Vai Ser Vai	Leu	Pro Asp Phe	Pro 15	Trp
	10
Lys Ala Lys 25	Ala	Ala	Ser His Pro 30	Asp	Gly
Gly Thr Pro 40	Vai	Asp	Pro Vai Ala 45	Pro	Ser
Glu Ala Ala 55	Gly	Phe	Ser Gly Tyr 60	Pro	Gin
Leu Arg Ala	Ala	He 75	Arg Gly Ala	Leu	Glu 80
Lys Leu Vai	Asp 90	Ala	Ser Leu Leu	Pro 95	Vai
lie Ala Leu 105	Leu	Pro	Phe Ala Leu 110	Gly	He
Pro Glu He 120	Ala	Tyr	Pro Thr Tyr 125	Glu	Vai
Cys Thr Vai 135	Leu	Arg	Ser Asp Ser 140	Leu	Phe
Pro Ser Met	Met	Phe 155	He Asn Ser	Pro	Ser 160
Leu Gly He	Pro 170	His	Leu Arg Lys	Vai 175	Vai

.:.. : ·„···/

Lys Trp Ala Gin Glu Asn Asn Vai lie Leu Ala Ala Asp Glu Cys Tyr 180 185190

Leu Gly Leu Gly Trp Asp Asp Glu Asn Pro Pro He Ser He Leu Asp

195 200205

Leu Arg Vai Cys Asp Gly Asp His Thr Asn Leu lie Ala He His Ser

210 215220

Leu Ser Lys Thr Ser Asn Leu Ala Ser Tyr Arg Ala Gly Tyr LeuVai

225 230 235240

Gly Asp Pro Ala Leu He Gly Glu Leu Thr Glu Vai Arg Lys AsnLeu

245 250255

Gly Leu Met Vai Pro Phe Pro He Gin Gin Ala Met lie Ala Ala Leu 260 265270

Asn Asp Asp Asp Gin Glu Ala Gly Gin Lys Leu Thr Tyr Ala He Arg 275 280285

Arg Ala Lys Leu Met Arg Ala Leu Leu Glu Ser Gly Phe Gin Vai Asp 290 295300

Asn Ser Glu Ala Gly Leu Tyr Leu Trp Ala Thr Arg Glu Glu ProCys

305 310 315320

Arq Asp Thr Vai Asp Trp Phe Ala Glu Arg Gly He Leu Vai AlaPro

325 330335

Gly Asp Phe Tyr Gly Pro Arg Gly Ala Gin His Vai Arg Vai Ala Met 340 345350

Thr Glu Thr Asp Glu Arg Vai Asp Ala Phe Vai Ser Arg Leu Ser

355 360365 <210> 5 <211> 32 <212> DNS <213> mesterséges szekvencia <220> _z , <223> a mesterséges szekvencia leírása: primer <220>

<223> DapC primer (dCexl) <400> 5 gatctagaat tcgcctcagg cataatctaa eg <210> 6 <211> 32 <212> DNS <213> mesterséges szekvencia <220> . , z <223> ar mesterséges szekvencia leirasa: primer <220>

<223> DapC primer (dCexna2) <400> 6 gatctatcta gacagaggac aaggcaatcg ga

IRODALOMJEGYZÉK (1) Kinoshita: Glutamic Acid Bacteria. Biology of Industrial Microorganisms, Domain and Solomon Eds., Benjamin Cummings, London, EK, p. 115-142, 1985 (2) Hilliger: Bio Tecnol. 2, p. 40-44, 1991 (3) Eggeling: Amino Acids 6, p. 261-272, 1994 (4) Jetten és Sinskey: Critical Review in Biotechnologie 15, p. 73-103, 1995 (5) Sahm et al.: Annuals of the New York Academy of Science 782, p. 25-39, 1996 (6) Winnacker: Gene und Klone, Eine Einführung in die

Gentechnologie. Verlag Chemie, Weinheim, Németország, 1990 (7) Sambrook et al.: Molecular Cloning. A laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989 (8) Kohara et al.: Cell 50, 495-508, 1987 (9) Bathe et al.: Molec. General Genetics 252, p. 255-265, 1996 (10) Wahl et al.: Proc. Natl.Acad.Sci. USA 84, p. 2160-2164, 1987 (11) Raleigh et al.: Nucleic Acid Res. 16, p. 1563-1575, 1988 (12) Bormann et al.: Molecular Microbiol. 6(3), p. 317-326, 1992 (13) Hohn és Collins: Gene 11, p. 291-298, 1980 (14) Bolivar, Life Sciences, 25, p. 807-818,1979 (15) Vieira et al.: 1982, Gene, 19, p. 259-268 (16) Grant et al.: Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87, p. 4645-4669, 1990 (17) Sanger et al.: Proc.Natl.Acad.Sci. USA 74, p. 5463-5467, 1977 (18) Ben-Bassat et al.: J.Bact. 169, p. 751-757, 1987 (19) O'Regan et al.: Gene 77, p. 237-252, 1989 (20) Sahin-Toth et al.: Protein Sciences 3, p. 240-247, 1994 (21) Hochuli et al.: Bio/Technol. 6, p. 1321-1325, 1988 (22) The DIG System Users Guide for Hibridization (Firma Boehringer Mannheim GmbH Deutschland, 1993) (23) Liebl et al.: Int.J. of Systematic Bacterology, 1991, 41, p. 255-260 (24) Gait: Oligonukleotide Synthesis: a Practical Approach (IRL Press, Oxford, EK, 1984 (25) Newton und Graham: PCR., Spectrum Akademischer Verlag, Heidelberg, Németország, 1994 (26) Martin et al.: Bio/Technol. 5, p. 137-146, 1987 (27) Guerrero et al.: Gene 138, p. 35-41, 1994 (28) Tsuchiya és Morinaga: Bio/Technol. 6, p. 428-430, 1988 (29) Eikmanns et al·.: Gene 102, p. 93-98, 1991 (30) EP 472 869 (31) US 4 601 893 (32) Schwarzer und Fühler: Bio/Technol. 9, p. 84-87, 1991 (33) Reinscheid et al.: Appl.Environm.Microbiol. 60, p. 126-132, 1994 (34) LaBarre et al.: J.Bact. 175, p. 1001-1007, 1993 (35) WO 96/15246 (36) Malumbres et al.: Gene 134, p. 15-24, 1993 (37) JP-A-10-229891 (38) Jensen és Hammer: Biotechnol.Bioeng. 58, p. 191-195, 1998 (39) Makrides: Microbiol.Revews 60, p. 512-538, 1996 (40) Menkel et al.: Appl.Environm.Microbiol. 64, p. 549-554,

1989 (41) Sonnen et al.: Gene 107, p. 69-74, 1991 (42) US 4 489 168 (43) Serwold-Davis et al.: FEMS Microbiol. Letters 66, p. 119-124, 1990 (44) US 5 158 891 (45) US 5 175 108; Nesvera et al.: J.Bact. 179, p. 1525-1532, 1997 (46) Amann et al.: Gene 69, p. 301-315, 1988 (47) Simon et al.: Bio/Technol. 1, p. 784-791, 1983 (48) Schafer et al.: Gene 149, p. 69-73, 1994 (49) Shuman: J.Biol.Chern. 269, p. 32678-32684; US 5 487 993 (50) Bernard et al·.: J.Mol. Biology 234, p. 534-541, 1993 (51) Schrumpf et al.: J.Bact. 173, p. 4510-4516, 1991 (52) Schafer et al.: Appl.Environm.Microbiol. 60, p. 756-759,

1994 (53) Thierbach et al.: Appl.Microbiol. Biotech. 29, p. 356-362, 1988 (54) Dunican és Shivnan: Bio/Technol. 7, p. 1067-1070, 1989 (55) Tauch et al.: FEMS Microbiol. Letters 123, p. 343-347, 1994 (56) Molec. General genetics, 145, p. 101, 1978 (57) T.A. Brown: Gentechnologie für Einsteiger, Spektrum AV, Heidelberg, 1993 (58) Newton és Graham: PCR. Spektrum AV, Heidelberg, 1994 (59) EP 197 335 (60) Wehrmann et al.: J.Bact.180, p. 3159-3163, 1998

(61) Kalinowski et al.: Molec. General Genetics 224, p. 317-324, 1990 (62) Wehrmann et al.: Microbiol. 140, p. 3349-3356,1994 (63) Eikmanns: J.Bact. 174, p. 6076-6086, 1992 (64) Molenaar et al. : European Journal of Biochemistry 254, p. 395-403, 1998), (65) DE 198 48 222 (66) EP 219 027; (61); Kalinowski et al.: Molec.Microbiol. 5, p. 1197-1204, 1991 (67) Pisabarro et al.: J.Bact. 175(9), p. 2743-2749, 1993 (68) DE 199 43 587.1 (69) Yeh et al.: Molecular and General Genetics 212, p. 112-119, 1988 (70) Ishino et al.: Agricultural and Biological Chern. 52(11), p. 2903-2909, 1988 (71) DE 199 59 328.0 (72) DE 199 50 409.1 (73) US 09/396,478 (74) DE 199 51975.7 (75) DE 199 59327.2 (76) DE 19956686.0 (77) Nakayama: Breeding of Amino Acid Producing Micro-organisms, in: Overproduction of Microbial Products, Krumphanzl, Sikyta, Vanek (eds.), Academic Press, London, Nagy-Britannia, 1982 (78) Chmiel: Bioprozesstechnik 1. Einführung in die Bioverfahrenstechnik. Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991 (79) Storhas: Bioreaktoren und periphere Einrichtungen, Vieweg Verlag, Braunschweig/Wiesbaden, 1994 (80) American Society for Bacterology (Washington D. C., AEÁ Manual of Methods for General Bacterology, 1981 (81) Spackman et al.: Analytical Chemistry, 30, 1958, p. 1190) (82) Tauch et al.: 1955, Plasmid 33, p. 168-179 (83) Wahl et al.: Proc. Natl. Acad.Sci. USA, 84, p.2160-2164, 1987 (84) Raleigh et al.: Nucleic Acid Research 16, p.1563-1575, 1988 (85) Sambrook et al·.: Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, 1989 (86) Lennox: Virology, 1, p.190, 1955 (87) Grant: Proc. Natl. Acad.Sci. USA, 87, p.4645-4649, 1990 (88) Tauch et al.: FEMS Microbiol. Letters, 123, p.343-347, 1994 (89) Sanger et al.: Proc.Natl.Acad.Sci.USA 74, p.5463-5467, 1977 (90) Zimmermann et al.:Nucleic Acids Research 18, p.1067, 1990 (91) Altschul et al.: Nucleic Acids Research 25, p.3389-3402, 1997 (92) Eickmanns et al.: Microbiology 140, p.1817-1828, 1994 (93) Innis et al.: PCR Protocols. A Guide to Methods and Applications, 1990, Academic Press (94) Bernard et al.: J.Molec. Biol. 234, p. 534-541, 1993

Claims (20)

1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK

   1. Izolált polinukleotid, amely az alábbi csoportból kiválasztott polinukleotid szekvenciát tartalmaz:

   a) olyan polinukleotid, amely legalább 70 %-ban azonos a 2. aminosav szekvenciát (SEQ ID NO 2) tartalmazó polipeptidet kódoló polinukleotiddal;

   b) olyan polipeptidet kódoló polinukleotid, amely olyan aminosav szekvenciával rendelkezik, amely legalább 70 %-ban azonos a 2. aminosav szekvenciával;

   c) olyan polinukleotid, amely az a) vagy b) szerinti polinukleotidok komplementere;

   d) olyan polinukleotid, amely az a) , b) vagy c) polinukleotid szekvenciából legalább 15 egymásutáni nukleotidot tartalmaz .
2. 2. Az 1. igénypont szerinti polinukleotid, amely polinukleotid egy korineform baktériumokban replikálható, előnyösen rekombináns DNS.
3. 3. Az 1. igénypont szerinti polinukleotid, amely polinukleotid egy RNS.
4. 4. A 2. igénypont szerinti polinukleotid, amely az 1. számú (SEQ ID NO 1) nukleinsav szekvenciát tartalmazza.
5. 5. A 2. igénypont szerinti replikálható DNS, azzal jellemezve, hogy magában foglalja:

   (i) az 1. számú nukleotid szekvenciát, vagy (ii) legalább egy olyan szekvenciát, amely a genetikai kód degenerációs tartományán belül az (i) szekvenciáknak felel meg, vagy (iii) legalább egy olyan szekvenciát, amely az (i) vagy (ii) szekvenciákkal komplementer szekvenciával hibridizál, és adott esetben (iv) az (i)-ben funkció-semleges szensz mutációkat.
6. 6. Vektor, amely az 1. igénypont szerinti polinukleotidot tartalmazza, különösen a pXT-dapCexp, amely a 2. ábrán bemutatott restrikciós képpel rendelkezik és Corynebacterium glutamicum-ban DSM 13254 számon van letétbe helyezve.
7. 7. Gazdasejtként szolgáló korineform baktériumok, amelyek a 6. igénypont szerinti vektort tartalmazzák, vagy amelyekben a zwal gén fokozott hatású.
8. 8. Eljárás L-aminosavak, különösen L-lizin előállítására, azzal jellemezve, hogy a következő műveleteket hajtjuk végre:

   i) a kívánt L-aminosavat termelő baktériumokat fermentáljuk, melyben legalább a dapC gént fokoztuk, ii) a kívánt termékeket feldúsítjuk a közegben, vagy a baktériumok sejtjeiben és iii) az L-aminosavat izoláljuk.
9. 9. A 8. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan baktériumokat alkalmazunk, amelyekben az L-aminosavak bioszintézis útjainak további génjeit felerősítettük.
10. 10. A 8. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan baktériumokat alkalmazunk, amelyekben legalább részben ki iktattuk azokat az anyagcsere utakat, amelyek az L-lizin képződését csökkentik.
11. 11. A 8.-12. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan korineform baktériumokat alkalmazunk, amelyek L-lizint termelnek.
12. 12. A 8. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az L-lizin előállítására olyan baktériumokat fermentálunk, amelyekben a dapC génen kívül egyidejűleg fokoztunk, különösen túlexprimáltunk egy vagy több gént a következők közül:

    - a dihidro-dipikolinát-szintázt kódoló dapA gén,

    - a tetrahidro-dipikolinát-szukcinilázt kódoló dapD gén,

    - a feed back rezisztens aszpartát-kinázt kódoló lysC gén

    - az N-szukcinil-diamino-pimelát-deszukcinilázt kódoló dapE gén,

    - a piruvát karboxilázt kódoló pyc gén,

    - a malát:kinon oxidoreduktázt kódoló mqo gén,

    - a lizin exportot kódoló lysE gén,

    - az aszpartát-szemialdehid-dehidrogenázt kódoló ásd gén,

    - a dihidro-dipikolinát reduktázt kódoló dapB gén,

    - diamino-pimelát-epimerázt kódoló dapE gén,

    - a diamino-pimelát-dekarboxilázt kódoló lysA gén,

    - a diamino-pimelát-dehidrogenázt kódoló ddh gén,

    - a zwal gén,

    - a glutamát-dehidrogenázt kódoló gdh gén.
13. 13. A 8. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az L-lizin előállítására olyan baktériumokat fermentálunk, ame lyekben egyidejűleg gyengítettünk egy vagy több gént a következő csoportból:

    - a foszfoenolpiruvát-karboxikinázt kódoló pck gén,

    - a glukóz-6-foszfát-izomerázt kódoló pgi gén,

    - a piruvát-oxidázt kódoló poxB gén,

    - a zwa2 gén,

    - a szukcinil-CoA szintetázt kódoló sucC vagy sucD gén.
14. 14. A 8-13. igénypont közül egy vagy több szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a Corynebacterium glutamicum fajba tartozó mikroorganizmusokat alkalmazunk.
15. 15. Az 1. igénypont szerinti polinukleotid szekvenciák alkalmazása hibridizációs szondaként olyan cDNS izolálására, amely a dapC génterméket kódolja.
16. 16. Az 1. igénypont szerinti polinukleotid szekvenciák alkalmazása hibridizációs szondaként olyan cDNS vagy gén izolálására, amelyek szekvenciája nagy hasonlóságot mutat a dapC gén szekvenciájával.
17. 17. Korineform baktériumokból származó DNS, amely egy N-szukcinil-aminoketopimelát-transzamináz enzimfehérjét kódol és ennek aminosav szekvenciája /SEQ ID No. 2/ a 209. helyen egy, az L-prolintól eltérő aminosavat tartalmaz.
18. 18. A 17. igénypont szerinti DNS, amely egy N-szukcinil-aminoketopimelát-transzamináz enzimfehérjét kódol és ennek aminosav szekvenciája /SEQ ID No. 4/ a 209. helyen L-leucint tartalmaz .
19. 19. A 18. igénypont szerinti DNS, amely a 716. helyen a timin nukleobázist tartalmazza /SEQ ID No. 3/.

    j.
20. 20. Korineform baktériumok, amelyek egy, a 17., 18. vagy

    19.

    igénypont szerinti DNS-t tartalmaznak.

    A meghatalmazott:

    sztös.<iaJuú ügyvivő á ís.G. .‘í S. Nemzetközi

    Szabadalmi Ir.xia tagja ’; i.!< :,-.pest, <vndríssy út 113.

    • Ρ;λ: -Í4V.4-323