DE10101501A1 - Verfahren zur fermentativen Herstellung von Pantothensäure - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft in Mikroorganismen der Gattung Corynebacterium replizierbare, gegebenenfalls rekombinante DNA. Sie betrifft weiterhin ein Verfahren zur fermentativen Herstellung von Pantothensäure. DOLLAR A Erfindungsgemäß wird durch eine Abschwächung oder Ausschaltung der Transaminase eine erhöhte Pantothensäurebildung möglich. Dies kann durch Deletion oder eine geringere Expression der für Transaminase codierenden Gensequenzen erreicht werden. Beispielsweise konnte durch Deletion oder Reduzierung des Expression des neu isolierten D-Pantothenatbiosynthesegens brnA aus Corynebacterium glutamicum in verbesserter Weise Panthotenat produziert werden. DOLLAR A Mit Hilfe der erfindungsgemäßen Nukleotidsequenz und dem Verfahren wird es möglich, durch Reduzierung der Transaminaseaktivität, eine verstärkte Pantothensäureproduktion zu erreichen.

Description

Die Erfindung betrifft in Mikroorganismen der Gattung Corynebacterium replizierbare, gegebenenfalls rekom­ binante DNA. Sie betrifft weiterhin ein Verfahren zur fermentativen Herstellung von Pantothensäure.

Die Pantothensäure stellt ein kommerziell bedeutendes Vitamin dar, das in der Kosmetik, der Medizin, der Hu­ manernährung und in der Tierernährung Anwendung findet. Es besteht daher ein allgemeines Interesse daran, ver­ besserte Verfahren zur Herstellung von Pantothensäure bereitzustellen.

Pantothensäure kann durch chemische Synthese oder bio­ technologisch durch Fermentation geeigneter Mikroorga­ nismen in geeigneten Nährlösungen hergestellt werden. Der Vorteil der biotechnologischen Herstellung durch Mikroorganismen liegt in der Bildung der korrekten ste­ reoisomeren Form, nämlich der D-Form von Pantothen­ säure, die frei von L-Pantothensäure ist.

Verschiedene Arten von Bakterien, wie z. B. Escherichia coli, Corynebacterium erythrogenes, Brevibacterium ammoniagenes und auch Hefen, wie z. B. Debaromyces castellii können wie in EPA 0 493 060 gezeigt, in einer Nährlösung, die Glucose, DL-Pantoinsäure und β-Alanin enthält, D-Pantothensäure produzieren. EP 0 493 060 zeigt weiterhin, daß bei Escherichia coli durch Amplifikation von Pantothensäure-Biosynthesegenen mit­ tels der Plasmide pFV3 und pFV5 die Bildung von D-Pan­ tothensäure verbessert wird.

EP 0 590 857 beschreibt Stämme von Escherichia coli, die Resistenzen gegen verschiedene Antimetabolite, wie z. B. Salizylsäure, α-Ketobuttersäure, β-Hydroxyaspara­ ginsäure etc. tragen und in einer Nährlösung, die Glu­ cose und β-Alanin enthält, D-Pantoinsäure und D-Panto­ thensäure produzieren. In EPA 0 590 857 wird weiterhin gezeigt, daß durch Amplifikation der Pantothensäure- Biosynthesegene, die auf dem Plasmid pFV31 enthalten sind, die Produktion von D-Pantoinsäure und D-Panto­ thensäure verbessert werden kann.

In WO 97/10340 wird darüber hinaus gezeigt, daß in Pan­ tothensäure bildenden Mutanten von Escherichia coli durch Erhöhung der Aktivität des Enzyms Acetohydroxy­ säure-Synthase II, einem Enzym der Valin Biosynthese, die Pantothensäureproduktion weiter gesteigert werden kann.

Durch stoffwechselbedingte Nebenreaktionen werden neben der Pantothensäure noch andere Aminosäuren, wie z. B. Isoleucin, Valin und Leucin gebildet. Um eine hohe Pro­ duktausbeute an Pantothensäure zu erzielen, muß die Bildung dieser Stoffwechselprodukte unterdrückt oder reduziert werden.

Es ist daher Aufgabe der Erfindung, eine DNA bzw. einen Plasmidvektor bereitzustellen, mit der bzw. dem eine gesteigerte Pantothensäurebildung erreicht werden kann. Weiterhin ist es Aufgabe der Erfindung, ein Verfahren zu schaffen, mit dem eine hohe Pantothensäureproduktion mit Mikroorganismen möglich wird. Eine weitere Aufgabe der Erfindung liegt in der Bereitstellung von Mikroor­ ganismen, mit denen eine erhöhte Pantothensäureproduk­ tion möglich ist.

Die Aufgabe wird erfindungsgemäß gelöst durch die re­ kombinanten DNA-Sequenzen, wie sie in den Ansprüchen niedergelegt sind. Die Aufgabe wird weiterhin gelöst durch die Verwendung der gemäß Anspruch 6 hergestell­ ten, verbesserten, Pantothensäure erzeugenden Mikro­ organismen sowie die Verwendung des gemäß Anspruch 7 hergestellten Plasmidvektors. Gegenstand der Erfindung ist weiterhin ein Verfahren zur fermentativen Herstel­ lung von Pantothensäure unter Verwendung von Mikroor­ ganismen, die insbesondere bereits Pantothensäure pro­ duzieren und in denen das für die Transaminase codie­ rende brnA-Gen deletiert wurde oder in seiner Expres­ sion abgeschwächt wird oder gar nicht exprimiert wird.

Vorteilhafte Weiterbildungen der Erfindungen sind in den Unteransprüchen angegeben.

Wenn im folgenden Text D-Pantothensäure oder Pantothen­ säure oder Pantothenat erwähnt werden, sind damit nicht nur die freie Säure sondern auch die Salze der D-Panto­ thensäure, wie z. B. das Calcium-, Natrium-, Ammonium- oder Kaliumsalz gemeint.

Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren und der DNA sowie den Mikroorganismen ist es nunmehr möglich, gegenüber herkömmlichen Verfahren eine erhöhte Konzentration an Pantothensäure zu produzieren. Die Erfinder fanden her­ aus, daß nach Deletion oder Reduzierung der Expression des neu isolierten D-Pantothenatbiosynthesegens brnA aus Corynebacterium glutamicum, das für das Enzym Tran­ saminase codiert, in verbesserter Weise D-Pantothenat produziert werden kann, da stoffwechselbedingte Neben­ reaktionen abgeschwächt oder komplett ausgeschaltet werden. Durch die Reduktion der Transaminase Aktivität wird die durch dieses Enzym katalysierte Produktion von L-Isoleucin, L-Valin und L-Leucin entweder abgeschwächt oder völlig blockiert. So können die für die Pantothen­ säurebildung benötigten Vorstufen nur noch in Richtung der Pantothensäure umgesetzt werden. Die Erfinder haben weiter festgestellt, daß in Kombination mit einer Ver­ stärkung bzw. Überexpression folgender Gene eine ver­ stärkte Pantothenatbildung bewirkt wird: ilvBN-Gene, die für das Enzym Acetohydroxysäuresynthase codieren, ilvC-Gen, das für das Enzym Isomeroreduktase codiert, ilvD-Gen, das für das Enzym Dihydroxysäuredehydratase codiert, sowie Verstärkung bzw. Überexpression des Gens panB, das für das Enzym Ketopantoathydroxymethyltrans­ ferase codiert und des Gens panC, das für das Enzym Pantothenatligase codiert sowie des Gens panD, welches für das Enzym Aspartatdecarboxylase codiert. Durch Ak­ tivierung eines, mehrerer oder aller dieser Enzyme wer­ den auch verstärkt die für die Pantothensäurebildung benötigten Vorstufen gebildet.

Der Begriff Verstärkung beschreibt in diesem Zusammen­ hang die Erhöhung der intrazellulären Aktivität eines oder mehrerer Enzyme in einem Mikroorganismus, die durch die entsprechende DNA codiert werden, indem man z. B. die Kopienzahl des Gens/der Gene erhöht, einen starken Promotor verwendet oder ein Gen verwendet, das für ein entsprechendes Enzym mit einer hohen Aktivität codiert und gegebenenfalls diese Maßnahmen kombiniert.

Der Begriff "geringer exprimiert" beinhaltet die Ab­ schwächung der Synthese der Transaminase bzw. die voll­ ständige Deletion des Transaminase brnA-Gens oder die Verringerung oder Ausschaltung der intrazellulären Ak­ tivität der Transaminase. Dies kann beispielsweise durch Verwendung eines schwachen Promotors oder Ver­ wendung eines Gens bzw. Allels, das für ein entspre­ chendes Enzym mit einer niedrigen Aktivität kodiert, bzw. durch Inaktivierung des entsprechenden Enzyms (Protein) und gegebenenfalls Kombination dieser Maß­ nahmen erfolgen.

Die erfindungsgemäßen Nukleotidsequenzen umfassen in Mikroorganismen der Gattung Corynbacterium replizier­ bare, gegebenenfalls rekombinante DNA, die entweder keine für eine Transaminase codierende Nukleotidsequenz enthalten oder eine für eine Transaminase codierende Nukleotidsequen enthalten, die nicht oder gegenüber na­ türlich vorkommenden Nukleotidsequenzen geringer expri­ miert werden. Der Begriff "natürlich" soll dabei solche Nukleotidsequenzen umfassen, die aus genetisch nicht veränderten Mikroorganismen, den Wildtypstämmen, iso­ liert werden können.

Weiterhin sollen die Nukleotidsequenzen Sequenzen um­ fassen, die

• a) eine Sequenz, dargestellt in Seq.-ID-Nr. 1, die für brnA codiert, umfaßt oder
• b) eine Sequenz umfaßt, die der Sequenz (i) inner­ halb des Bereichs der Degeneration des geneti­ schen Codes entspricht oder
• c) eine Sequenz umfaßt, die mit einer zur Sequenz (i) oder (ii) komplemetären Sequenz hybridisiert, und gegebenenfalls
• d) funktionsneutrale Sinnmutationen in (i) umfaßt.

Dabei bedeutet der Begriff funktionsneutrale Sinnmuta­ tionen den Austausch chemisch ähnlicher Aminosäuren, wie z. B. Glycin durch Alanin oder Serin durch Threo­ nin.

Mit Hilfe gerichteter rekombinanter DNA-Techiken können für eine Transaminase codierende Nukleotid­ sequenzen entfernt oder in ihrer Expression redu­ ziert werden. Mit Hilfe dieser Methoden kann zum Beispiel das für die Transaminase codierende brnA-Gen im Chromosom deletiert werden. Geeignete Methoden dazu sind bei Schäfer et al. (Gene (1994) 145: 69-73) oder auch Link et al. (Journal of Bacteriology (1998) 179: 6228-6237) beschrieben. Auch können nur Teile des Gens deletiert werden oder auch mutierte Fragmente des Transaminase-Gens ausgetauscht werden. Durch Deletion oder Austausch wird so ein Verlust oder eine Reduktion der Transa­ minaseaktivität erreicht (Möckel et al., (1994) Molecular Microbiology 13: 833-842; Morbach et al., (1996) Applied Microbiology and Biotechnology 45: 612-620). Ein Beispiel für eine derartige Mutante ist der erfindungsgemäße C. glutamicum Stamm 13032ΔbrnA, der eine Deletion im brnA-Gen trägt.

Eine weitere Möglichkeit, die Aktivität der Transa­ minase abzuschwächen oder auszuschalten, sind Muta­ geneseverfahren. Hierzu gehören ungerichtete Ver­ fahren, die chemische Reagenzien, wie z. B. N-methyl-N-nitro-N-nitrosoguanidin oder auch UV- Bestrahlung zur Mutagenese benutzen, mit an­ schließender Suche der gewünschten Mikroorganismen auf Bedürftigkeit für L-Valin, L-Leucin und L-Iso­ leucin. Verfahren zur Mutationsauslösung und Mutan­ tensuche sind allgemein bekannt und können unter anderem bei Miller (A Short Course in Bacterial Genetics, A Laboratory Manual and Handbook for Escherichia coli and Related Bacteria (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1992)) oder im Handbuch "Manual of Methods for General Bacteriology" der American Society for Bacteriology (Washington D. C., USA, 1981) nachgelesen werden.

Darüber hinaus kann auch die Expression des Transa­ minase (brnA)-Gens reduziert werden. So kann die Promoter- und Regulationsregion, die sich strom­ aufwärts des Strukturgens befindet, mutiert werden. In gleicher Weise wirken Expressionskassetten, die stromaufwärts des Strukturgens eingebaut werden. Durch regulierbare Promotoren ist es zusätzlich möglich, die Expression im Verlaufe der fermentativen D-Pantothenatbildung zu reduzieren. Daneben ist aber auch eine Regulation der Translation mög­ lich, indem beispielsweise die Stabilität der m-RNA reduziert wird. Desweiteren können Gene verwendet werden, die für das entsprechende Enzym mit gerin­ ger Aktivität codieren. Alternativ kann weiterhin eine reduzierte Expression des Transaminase-Gens durch Veränderung der Medienzusammensetzung und Kulturführung erreicht werden. Anleitungen findet der Fachmann unter anderem bei Martin et al. (Bio/Technology 5, 137-146 (1987)), bei Guerrero et al. (Gene 138, 35-41 (1994)), Tsuchiya und Morinaga (Bio/Technology 6, 428-430 (1988)), bei Eikmanns et al. (Gene 102, 93-98 (1991)), in der Europäischen Patentschrift EPS 0 472 869, im US Patent 4,601,893, bei Schwarzer und Pühler (Bio/Technology 9, 84-87 (1991), bei Remscheid et al. (Applied and Environmental Microbiology 60, 126-132 (1994)), bei LaBarre et al. (Journal of Bacteriology 175, 1001-1007 (1993)) und in der Patentanmeldung WO 96/15246.

Die Mikroorganismen, die Gegenstand der vorliegen­ den Erfindung sind, können Pantothensäure aus Glu­ cose, Saccharose, Lactose, Fructose, Maltose, Me­ lasse, Stärke, Cellulose oder aus Glycerin und Et­ hanol herstellen. Es kann sich um Gram-negative Bakterien, wie z. B. Escherichia coli, oder Gram­ positive Bakterien, z. B. der Gattung Bacillus oder um coryneforme Bakterien der Gattungen Coryne­ bacterium oder Arthrobacter handeln. Bei der Gat­ tung Corynebacterium ist insbesondere die Art Corynebacterium glutamicum zu nennen, die in der Fach­ welt für ihre Fähigkeit bekannt ist, nieder­ molekulare Metabolite wie D-Pantothensäure oder Aminosäuren zu bilden. Zu dieser Art gehören Wild­ typstämme, wie z. B. Corynebacterium glutamicum ATCC 13032, Brevibacterium flavum ATCC14067, Cory­ nebacterium melassecola ATCC17965 und andere.

Zur Isolierung des Gens brnA von C. glutamicum oder anderer Gene wird zunächst eine Genbank angelegt. Das Anlegen von Genbanken ist in allgemein bekann­ ten Lehrbüchern und Handbüchern niedergeschrieben. Als Beispiel seien das Lehrbuch von Winnacker: Gene und Klone, Eine Einführung in die Gentechnologie (Verlag Chemie, Weinheim, Deutschland, 1990) oder das Handbuch von Sambrook et al.: Molecular Cloning, A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989) genannt. Eine bekannte Gen­ bank ist die des E. coli K-12 Stammes W3110, die von Kohara et al. (Cell 50, 495-508 (1987)), die in λ-Vektoren angelegt wurde. Bathe et al. (Molecu­ lar and General Genetics, 252: 255-265, 1996) be­ schreiben eine Genbank von C. glutamicum 13032, die mit Hilfe des Cosmidvektors SuperCos I (Wahl et al., 1987, Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 84: 2160-2164) im E. coli K-12 NM554 (Raleigh et al., 1988, Nucleic Acids Research 16: 1563-1575) angelegt wurde. Als Wirte eignen sich besonders solche C. glutamicum Stämme, die restrik­ tions- und rekombinationsdefekt sind. Ein Beispiel hierfür ist der Stamm R127, der von Liebl et al. (FEMS Microbiol. Lett. 65: 269-304) beschrieben wurde.

Die Genbank wird anschließend in einen Indikator­ stamm durch Transformation (Hanahan, Journal of Mo­ lecular Biology 166, 557-580, 1983) oder Elektro­ poration (Tauch et. al., 1994, FEMS Microbiological Letters, 123: 343-347) eingebaut. Der Indikatorstamm zeichnet sich dadurch aus, daß er eine Mutation in dem interessierenden Gen besitzt, die einen detek­ tierbaren Phänotyp, z. B. eine Auxotrophie hervor­ ruft. Die Indikatorstämme bzw. Mutanten sind aus publizierten Quellen oder Stammsammlungen erhält­ lich oder müssen gegebenenfalls selbst hergestellt werden. Ein Beispiel hierfür ist die im Rahmen der vorliegenden Erfindung isolierte C. glutamicum Mutante R127/12, die in dem für die Transaminase codierendem brnA-Gen defekt ist. Nach erfolgreicher Transformation des Indikatorstammes, wie z. B. der brnA-Mutante mit einem rekombinanten Plasmid, kom­ pensiert das Plasmid die Eigenschaft des Indi­ katorstammes, wie z. B. die Bedürftigkeit für die verzweigtkettigen Aminosäuren L-Isoleucin, L-Valin, L-Leucin. Das Plasmid komplementiert den geneti­ schen Funktionsdefekt des Indikatorstammes.

Das dergestalt isolierte Gen bzw. DNA-Fragment kann durch Bestimmung der Sequenz, wie z. B. bei Sanger et al. (Proceedings of the National of Sciences of the United States of America USA, 74: 5463-5467, 1977) beschrieben und charakterisiert werden. An­ schließend kann der Grad an Identität zu bekannten Genen, die in Datenbanken wie z. B. der GenBank (Benson et el., 1998, Nuleic Acids Research, 26: 1-­ 7) enthalten sind, mit publizierten Methoden (Alt­ schul et al., 1990, Journal of Molecular Biology 215: 403-410) analysiert werden.

Auf diese Weise wurde die neue für das Gen brnA co­ dierende DNA-Sequenz von C. glutamicum erhalten, die als SEQ-ID-NR. 1 Bestandteil der vorliegenden Erfindung ist. Weiterhin wurden aus der vorliegen­ den DNA-Sequenz mit den oben beschriebenen Methoden die Aminosäuresequenz der Transaminase abgeleitet. In SEQ-ID-NR. 2 ist die sich ergebende Aminosäure­ sequenz des brnA-Genproduktes dargestellt.

Die erfindungsgemäß hergestellten Mikroorganismen können kontinuierlich oder diskontinuierlich im batch-Verfahren (Satzkultivierung) oder im fed batch (Zulaufverfahren) oder repeated fed batch- Verfahren (repetitives Zulaufverfahren) zum Zwecke der Pantothensäureproduktion kultiviert werden. Eine Zusammenfassung über bekannte Kultivierungsme­ thoden ist im Lehrbuch von Chmiel (Bioprozesstech­ nik 1. Einführung in die Bioverfahrenstechnik (Gu­ stav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991)) oder im Lehrbuch von Storhas (Bioreaktoren und periphere Einrichtungen (Vieweg Verlag, Braunschweig/Wiesba­ den, (1994)) beschrieben.

Das zu verwendende Kulturmedium muß in geeigneter Weise den Ansprüchen der jeweiligen Mikroorganismen genügen. Beschreibungen von Kulturmedien verschiedener Mikroorganismen sind im Handbuch "Manual of Methods for General Bacteriology" der American Society for Bacteriology (Washington D. C., USA, 1981) enthalten. Als Kohlenstoffquelle können Zuc­ ker und Kohlehydrate, wie z. B. Glucose, Saccharose, Lactose, Fructose, Maltose, Melasse, Stärke und Cellulose, Öle und Fette, wie z. B. Sojaöl, Sonnen­ blumenöl, Erdnussöl und Kokosfett, Fettsäuren, wie z. B. Palmitinsäure, Stearinsäure und Linolsäure, Alkohole, wie z. B. Glycerin und Ethanol und orga­ nische Säuren, wie z. B. Essigsäure, verwendet wer­ den. Diese Stoffe können einzeln oder als Mischung verwendet werden. Als Stickstoffquelle können orga­ nische stickstoffhaltige Verbindungen wie Peptone, Hefeextrakt, Fleischextrakt, Malzextrakt, Mais­ quellwasser, Sojabohnenmehl und Harnstoff oder an­ organische Verbindungen wie Ammoniumsulfat, Ammoni­ umchlorid, Ammoniumphosphat, Ammoniumcarbonat und Ammoniumnitrat verwendet werden. Die Stickstoff­ quellen können einzeln oder als Mischung verwendet werden. Als Phosphorquelle können Kaliumdihydrogen­ phosphat oder Dikaliumhydrogenphosphat oder die entsprechenden natriumhaltigen Salze verwendet wer­ den. Das Kulturmedium muß weiterhin Salze von Me­ tallen enthalten, wie z. B. Magnesiumsulfat oder Eisensulfat, die für das Wachstum notwendig sind. Schließlich können essentielle Wuchsstoffe wie Ami­ nosäuren und Vitamine zusätzlich zu den oben ge­ nannten Stoffen eingesetzt werden. Dem Kulturmedium können überdies Vorstufen der Pantothensäure, wie z. B. β-Alanin oder L-Valin, zugesetzt werden. Die genannten Einsatzstoffe können zur Kultur in Form eines einmaligen Ansatzes hinzugegeben oder in ge­ eigneter Weise während der Kultivierung zugefüttert werden.

Zur pH-Kontrolle der Kultur werden basische Verbin­ dungen wie Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid, Ammoni­ ak oder saure Verbindungen wie Phosphorsäure oder Schwefelsäure in geeigneter Weise eingesetzt. Zur Kontrolle der Schaumentwicklung können Antischaum­ mittel, wie z. B. Fettsäurepolyglykolester, einge­ setzt werden. Zur Aufrechterhaltung der Stabilität von Plasmiden können dem Medium geeignete selektiv wirkende Stoffe, z. B. Antibiotika, hinzugefügt wer­ den. Um aerobe Bedingungen aufrechtzuerhalten wer­ den Sauerstoff oder sauerstoffhaltige Gasmischun­ gen, wie z. B. Luft, in die Kultur eingetragen. Die Temperatur der Kultur liegt normalerweise bei 20°C bis 50°C und vorzugsweise bei 25°C bis 45°C. Die Kultur wird solange fortgesetzt, bis sich ein Maxi­ mum an Pantothensäure gebildet hat. Dieses Ziel wird normalerweise innerhalb von 10 bis 160 Stunden erreicht.

Die Konzentration an gebildeter Pantothensäure kann mit bekannten Verfahren (Velisek; Chromatographic Science 60, 515-560 (1992)) bestimmt werden. Zur mikrobiologischen Bestimmung von Pantothensäure wird gebräuchlicherweise der Stamm Lactobacillus plantarum ATCC8014 eingesetzt (U.S. Pharmacopeia 1980; AOAC International 1980). Darüber hinaus werden auch andere Testorganismen, wie z. B. Pediococcus acidilactici NCIB6990 zur mikrobiologischen Bestimmung von Pantothenatkonzentrationen eingesetzt (Sollberg and Hegna; Methods in Enzymo­ logy 62, 201-204 (1979)).

Folgende Mikroorganismen wurden am 22.12.2000 bei der Deutschen Sammlung für Mikrorganismen und Zellkulturen (DSMZ, Braunschweig, Deutschland) gemäß Budapester Ver­ trag hinterlegt:
Corynebacterium glutamicum 13032ΔbrnA als DSM 13971
Corynebacterium glutamicum R127/12 als DSM 13970

Vorteilhafte Weiterbildungen sind in den Unteransprü­ chen angegeben.

Die Zeichnungen zeigen eine beispielhafte Ausführungs­ form des erfindungsgemäßen Verfahrens:

Es zeigt:

Fig. 1 Plasmidvektor pJC1brnA

Fig. 2 Plasmidvektor pK19mobsacΔbrnA

Bei den Angaben der Basenpaarzahlen handelt es sich um ca. -Werte, die im Rahmen der Reproduzierbarkeit erhal­ ten werden. Die in den Figuren verwendeten Abkürzungen haben folgende Bedeutung:
aminopep: Kodierbereich des Aminopeptidasegens
ApaLI: Schnittstelle des Restriktionsenzyms ApaLI
ApoI: Schnittstelle des Restriktionsenzyms ApoI
Asp7181: Schnittstelle des Restriktionsenzyms Asp7181
AvaI: Schnittstelle des Restriktionsenzyms AvaI
BalI: Schnittstelle des Restriktionsenzyms BalI
BamHI: Schnittstelle des Restriktionsenzyms BamHI
BclI: Schnittstelle des Restriktionsenzyms BclI
BgII: Schnittstelle des Restriktionsenzyms BgII
BglII: Schnittstelle des Restriktionsenzyms BglII
brnA: Kodierbereich des Transaminasegens
bsp: Basenpaare
BspH:I Schnittstelle des Restriktionsenzyms BspHI
BsrDi: Schnittstelle des Restriktionsenzyms BsrDi
BsrGI: Schnittstelle des Restriktionsenzyms BsrGI
Bsu36I: Schnittstelle des Restriktionsenzyms Bsu36I
dbrnA: Deletiertes brnA Gen
DraIII: Schnittstelle des Restriktionsenzyms DraIII
DsaI: Schnittstelle des Restriktionsenzyms DsaI
Eco47III: Schnittstelle des Restriktionsenzyms Eco47III
EcoRI: Schnittstelle des Restriktionsenzyms EcoRI
HindIII: Schnittstelle des Restriktionsenzyms HindIII
Kan: Kodierbereich des Kanamycinresistenzgens
KpnI: Schnittstelle des Restriktionsenzyms KpnI
NaeI: Schnittstelle des Restriktionsenzyms NaeI
NcoI: Schnittstelle des Restriktionsenzyms NcoI
NheI: Schnittstelle des Restriktionsenzyms NheI
OriT: Origin of transfer
OriV: Origin der vegetativen Replikation
oxred': Kodierbereich des Oxidoreduktasegens
PstI: Schnittstelle des Restriktionsenzyms PstI
PvuI: Schnittstelle des Restriktionsenzyms PvuI
RsrII: Schnittstelle des Restriktionsenzyms RsrII
SacB: Kodierbereich des Sucroseresistenzgens
SalI: Schnittstelle des Restriktionsenzyms SalI
SexAI: Schnittstelle des Restriktionsenzyms SexAI
SgrAI: Schnittstelle des Restriktionsenzyms SgrAI
SmaI: Schnittstelle des Restriktionsenzyms SmaI
SphI: Schnittstelle des Restriktionsenzyms SphI
Sse8387I: Schnittstelle des Restriktionsenzyms Sse8387I
Tth111I: Schnittstelle des Restriktionsenzyms Tth111I
XbaI: Schnittstelle des Restriktionsenzyms XbaI
XhoI: Schnittstelle des Restriktionsenzyms XhoI
XmaI: Schnittstelle des Restriktionsenzyms XmaI

Beispiele

Die vorliegende Erfindung wird im folgenden anhand von Ausführungsbeispielen näher erläutert.

Beispiel 1 Klonierung, Sequenzierung und Expression des für die Transaminase codierenden brnA-Gens aus Corynebacterium glutamicum 1. Isolierung einer brnA Mutante von Corynebacterium glutamicum

Der Stamm Corynebacterium glutamicum R127 (Haynes 1989, FEMS Microbiology Letters 61: 329-334) wurde mit N-methyl-N-nitro-N-nitrosoguanidin mutagenisiert (Sambrook et al., Molecular cloning. A laboratory manual (1989) Cold Spring Harbour Laboratory Press). Dazu wurden 5 ml einer über Nacht angezogenen Coryne­ bacterium glutamicum Kultur mit 250 µl N-methyl-N- nitro-N-nitrosoguanidin (5 mg/ml Dimethylformamid) versetzt und 30 Minuten bei 30°C und 200 Upm inkubiert (Adelberg 1958, Journal of Bacteriology 76: 326). Die Zellen wurden anschließend zweimal mit steriler NaCl- Lösung (0,9%) gewaschen. Durch Replikaplattierung auf Minimalmediumplatten CGXII mit 15 g/l Agar (Keilhauer et al Journal of Bacteriology 175: 5595-5603), wurden Mutanten isoliert, die bei Zugabe von L-Valin, L-Iso­ leucin und L-Leucin (je 0,1 g/l) wuchsen, aber nicht bei Zugabe von Keto-Valin, Keto-Isoleucin und Keto- Leucin (je 0,1 g/l).

Die Enzymaktivität der Transaminase wurde im Rohextrakt dieser Mutanten bestimmt. Dazu wurden die Klone in 60 ml LB-Medium kultiviert und in der exponentiellen Wachstumsphase abzentrifugiert. Das Zellpellet wurde einmal mit 0,05 M Kaliumphosphatpuffer gewaschen und im selben Puffer resuspendiert. Der Zellaufschluß erfolgte mittels 10 minütiger Ultraschallbehandlung (Branson- Sonifier W-250, Branson Sonic Power Co, Danbury, USA). Anschließend wurden die Zelltrümmer durch eine 30 minü­ tige Zentrifugation bei 13000 rpm und 4°C abgetrennt und der Überstand als Rohextrakt in den Enzymtest ein­ gesetzt. Der Reaktionsansatz des Enzymtests enthielt 0,2 ml 0,25 M Tris/HCl, pH 8, 0,05 ml Rohextrakt, und 0,1 ml 2,5 mM Pyridoxalphosphat, 0,1 ml 40 mM Ketoiso­ caproat und 0,1 ml 0,5 M Na-Glutamat. Die Testansätze wurden bei 30°C inkubiert, nach 10, 20 und 30 Minuten wurden je 200 µl Proben genommen und deren Leucinkon­ zentration mittels HPLC-Analytik bestimmt (Hara et al., 1985, Analytica Chimica Acta 172: 167-173). Wie Tabelle 1 zeigt, weist der Stamm R127/12 keine Transaminase Ak­ tivität auf.

Tabelle 1

Spezifische Aktivität (µmol/min und mg Protein) der Transaminase in Corynebacterium glutamicum Stämmen

2. Klonierung des brnA-Gens von Corynebacterium gluta­ micum

Chromosomale DNA aus Corynebacterium glutamicum 13032 wurde wie bei Schwarzer und Pühler (Bio/Technology 9 (1990) 84-87) beschrieben isoliert. Diese wurde mit dem Restriktionsenzym Sau3A (Boehringer Mannheim) gespalten und durch Saccharose-Dichte-Gradienten-Zentrifugation (Sambrook et al., Molecular cloning. A laboratory man­ ual (1989) Cold Spring Harbour Laboratory Press) auf­ getrennt. Die Fraktion mit dem Fragmentgrößenbereich von etwa 6-10 kb wurde zur Ligation mit dem Vektor pJC1 (Cremer et al., Molecular and General Genetics 220 (1990) 478-480) eingesetzt. Der Vektor pJC1 wurde hier­ zu mit BamHI linearisiert und dephosphoryliert. Fünf ng davon wurden mit 20 ng der genannten Fraktion der chro­ mosomalen DNA ligiert und damit die Mutante R127/12 durch Elektroporation (Haynes und Britz, FEMS Microbio­ logy Letters 61 (1989) 329-334) transformiert. Die Transformanten wurden auf die Fähigkeit getestet auf CGXII Agarplatten ohne Zugabe der verzweigtkettigen Aminosäuren wachsen zu können. Von über 5000 getesteten Transformanden wuchsen nach Replicaplattierung und zweitägiger Inkubation bei 30°C 8 Klone auf Minimalme­ diumplatten. Von diesen Klonen wurden Plasmidpräpara­ tionen, wie bei Schwarzer et al. (Bio/Technology (1990) 9: 84-87) beschrieben, durchgeführt. Restriktionsanaly­ sen der Plasmid-DNA ergaben, daß in allen 8 Klonen das­ selbe Plasmid, im folgenden pJC1brnA genannt, enthalten war. Das Plasmid trägt ein Insert von 6,1 kb und wurde durch Retransformation auf seine Fähigkeit, die brnA- Mutante R127/12 zu komplementieren, getestet. Durch Subklonierung wurde der für die Komplementation der Mutante R127/12 verantwortliche Bereich auf ein 1,5 kb BglI/NaeI-Fragment eingegrenzt.

3. Sequenzierung des brnA-Gens

Die Nukleinsäuresequenz des 1,5 kb BglI/NaeI-Fragments wurde nach der Dideoxy-Kettenabbruchmethode von Sanger et al. durchgeführt (Proceedings of the National of Sciences of the United States of America USA (1977) 74: 5463-5467). Dabei wurde der Auto-Read Sequencing kit verwendet (Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Schwe­ den). Die gelelektrophoretische Analyse erfolgte mit dem automatischen Laser-Fluoreszenz Sequenziergerät (A.L.F.) von Amersham Pharmacia Biotech (Uppsala, Schweden). Die erhaltene Nukleotidsequenz wurde mit dem Programmpaket HUSAR (Release 4.0, EMBL, Cambridge, GB) analysiert. Die Nukleotidsequenz mit den flankierenden Bereichen BglI/NaeI ist als SEQ-ID-Nr. 1 wiedergegeben. Die Analyse ergab ein offenes Leseraster von 1573 Ba­ senpaaren, das als brnA-Gen identifiziert wurde und für ein Polypeptid von 367 Aminosäuren codiert, das als SEQ-ID-NR. 2 wiedergegeben ist.

4. Expression des brnA-Gens

Das Plasmid pJC1 wurde mit den Restriktionsenzymen BglI und NaeI entsprechend den Angaben des Herstellers des Restriktionsenzyms verdaut (Roche, Boehringer Mann­ heim). Anschließend wurde das 1,5 kb BglI/NaeI-Fragment mittels Ionenaustauschersäulchen isoliert (Quiagen, Hilden). Der überhängende BglI Schnitt des isolierten Fragmentes wurde mit Klenow Polymerase aufgefüllt. Der Vektor pJC1 (Cremer et al., Mol. Gen. Genet (1990) 220: 478-480) wurde PstI-geschnitten, ebenfalls mit Klenow Polymerase behandelt, und anschließend Fragment und Vektor ligiert. Mit dem Ligationsansatz wurde der E. coli Stamm DH5αmcr (Grant et al., Proceedings of the National of Sciences of the United States of America USA, 87 (1990) 4645-4649) transformiert (Hanahan, Jour­ nal of Molecular Biology 166 (1983) 557-580). Durch Plasmidpräparationen (Sambrook et al., Molecular clon­ ing. A laboratory manual (1989) Cold Spring Harbour Laboratory Press) von Klonen wurde ein Klon identi­ fiziert, der das rekombinante Plasmid pJC1brnA enthielt. Mit diesem Plasmid wurde Corynebacterium glutamicum R127 mittels Elektroporation transformiert wie bei Haynes et al. (1989, FEMS Microbiol. Lett. 61: 329-334) beschrieben. Von Corynebacterium glutamicum R127 pJC1 und Corynebacterium glutamicum R127 pJC1brnA wurde anschließend die durch brnA codierte Transamina­ se-Aktivität bestimmt. Dazu wurden die Klone in 60 ml LB-Medium kultiviert und in der exponentiellen Wachs­ tumsphase abzentrifugiert. Das Zellpellet wurde einmal mit 0,05 M Kaliumphosphatpuffer gewaschen und im selben Puffer resuspensiert. Der Zellaufschluß erfolgte mit­ tels 10 minütiger Ultraschallbehandlung (Branson- Sonifier W-250, Branson Sonic Power Co, Danbury, USA). Anschließend wurden die Zelltrümmer durch eine 30 minü­ tige Zentrifugation bei 13000 rpm und 4°C abgetrennt und der Überstand als Rohextrakt in den Enzymtest ein­ gesetzt. Der Reaktionsansatz des Enzymtests enthielt 0,2 ml 0,25 M Tris/HCl, pH 8, 0,05 ml Rohextrakt, und 0,1 ml 2,5 mM Pyridoxalphosphat, 0,1 ml 40 mM Ketoiso­ caproat und 0,1 ml 0,5 M Na-Glutamat. Die Testansätze wurden bei 30°C inkubiert, nach 10, 20 und 30 Minuten wurden je 200 µl Proben genommen und deren Leucinkon­ zentration mittels HPLC-Analytik bestimmt (Hara et al. 1985, Analytica Chimica Acta 172: 167-173). Wie Tabelle 2 zeigt, weist der Stamm Corynebacterium glutamicum R127 pJC1brnA eine gesteigerte Transaminase-Aktivität gegenüber dem Kontrollstamm auf.

Tabelle 2

Spezifische Aktivität (µmol/min und mg Protein) der Transaminase in Corynebacterium glutamicum R127

Beispiel 2 Konstruktion einer brnA Deletionsmutante von Corynebac­ terium glutamicum

Die interne Deletion des brnA-Gens von Corynebacterium glutamicum 13032 wurde mit dem bei Schäfer et al. (Gene 145: 69-73 (1994)) beschriebenen System zum Genaus­ tausch durchgeführt. Zur Konstruktion des Inaktivie­ rungsvektors pK19mobsacBΔbrnA wurde zunächst das 1,5 kb BglI/NaeI-Fragment in die SmaI Schnittstelle des Vek­ tors pUC18 kloniert. Aus dem resultierenden Vektor pUC18brnA wurde ein internes 770 bp DraIII-Fragment entfernt. Hierzu wurde der Vektor mit DraIII geschnit­ ten und, nach Abtrennung des brnA internen DraIII- Fragmentes, mittels Agarosegelelektrophorese religiert. Anschließend wurde aus dem Vektor das unvollständige Gen als XhoI/SalI-Fragment isoliert und in den mit XhoI/SalI linearisierten Vektor pK19mobsacB (Schäfer 1994, Gene 145: 69-73) ligiert. Der erhaltene Inakti­ vierungsvektor pK19mobsacBΔbrnA wurde durch Transforma­ tion in den E. coli Stamm S 17-1 eingebracht (Hanahan 1983, Journal of Molecular Biology 166: 557-580) und per Konjugation nach Corynebacterium glutamicum 13032 transferiert (Schäfer et al. 1990, Journal of Bacterio­ logy 172: 1663-1666). Es wurden Kanamycin-resistente Klone von Corynebacterium glutamicum erhalten, bei de­ nen der Inaktivierungsvektor im Genom integriert vor­ lag. Um auf die Excision des Vektors zu selektionieren, wurden Kanamycin-resistente Klone auf Saccharose­ haltigem LB-Medium ((Sambrook et al., Molecular cloning. A laboratory manual (1989) Cold Spring Harbour Laboratory Press)) mit 15 g/l Agar, 2% Glucose/10% Saccharose) ausplattiert und Kolonien erhalten, welche den Vektor durch ein zweites Rekombinationsereignis wieder verloren haben (Jäger et al. 1992, Journal of Bacteriology 174: 5462-5465). Durch Überimpfen auf Mi­ nimalmediumplatten (Medium CGXII mit 15 g/l Agar (Keil­ hauer et al., Journal of Bacteriology 175 (1993) 5595-­ 5603)) mit und ohne 2 mM L-Isoleucin, 2 mM L-Valin, 2 mM L-Leucin, bzw. mit und ohne 50 µg/ml Kanamycin wurden 36 Klone isoliert, welche durch die Excision des Vektors Kanamycin sensitiv und Isoleucin-Leucin-Valin auxotroph waren und bei denen nun das unvollständige brnA-Gen (ΔbrnA-Allel) im Genom vorlag. Der Stamm wurde als Corynebacterium glutamicum 13032ΔbrnA bezeichnet und weiter verwendet.

Beispiel 3 Expression der Gene ilvD, ilvBN, ilvC und panBC in Co­ rynebacterium glutamicum

Zur Expression der Gene der Acetohydroxysäuresynthase (ilvBN) und der Isomeroreduktase (ilvC) wurde der Vek­ tor pECM3ilvBNCD benutzt (Sahm und Eggeling, Applied and Environmental Microbiology 65 (1999) 1973-1979) welcher ein Chloramphenicolresistenzgen trägt. Coryne­ bacterium glutamicum 13032ΔbrnA wurde mit pECM3ilvBNCD transformiert wie bei Schäfer et al., (Gene (1994) 145: 69-73) beschrieben. Der resultierende Stamm Corynebac­ terium glutamicum 13032ΔbrnA pECM3ilvBNCD wurde mit dem bei Sahm und Eggeling beschriebenen Vektor pEKEx2panBC transformiert (Applied and Environmental Microbiology 65 (1999), 1973-1979).

Beispiel 4 Produktion von D-Pantothenat mit verschiedenen C. glutamicum Stämmen

Zur Untersuchung ihrer Pantothenatbildung wurden die in Tabelle 4 angegebenen Stämme in 60 ml Brain Heart Infu­ sion-Medium (Difco Laboratories, Detroit, USA) für 14 h bei 30°C vorkultiviert. Anschließend wurden die Zellen einmal mit 0,9% NaCl-Lösung (w/v) gewaschen und mit dieser Suspension je 60 ml CgXII-Medium so angeimpft, daß die OD₆₀₀ 0,5 betrug. Das Medium war identisch mit dem bei Keilhauer et al., (Journal of Bacteriology (1993) 175: 5595-5603) beschriebenen Medium. Für die Kultivierung der ΔbrnA Stämme enthielt das Medium aber zusätzlich 2 mM L-Valin, L-Isoleucin und L-Leucin. Das Medium ist in Tabelle 3 dargestellt.

Tabelle 3

Zusammensetzung des Mediums CGXII

Bei der Kultivierung der Stämme wurde das Medium nach 5 Stunden zusätzlich mit 1 mM Isopropylthio-β-D- galactosid versetzt. Nach 48 stündiger Kultivierung wurden Proben genommen, die Zellen abzentrifugiert und der Überstand sterilfiltriert. Die Pantothenatkonzen­ tration des Überstands wurde wie bei Sahm und Eggeling beschrieben (Applied and Environmental Microbiology 65 (1999), 1973-1979) bestimmt. Die Ergebnisse sind in Ta­ belle 4 dargestellt.

Tabelle 4

D-Pantothenatbildung in verschiedenen C. glutamicum Stämmen

SEQUENZPROTOKOLL

Claims (27)

1. In Mikroorganismen der Gattung Corynebacterium re­ plizierbare, gegebenenfalls rekombinante DNA, die

• a) keine für eine Transaminase codierende Nucleo­ tidsequenz enthält oder
• b) eine für eine Transaminase codierende Nucleo­ tidsequenz enthält, die nicht oder gegenüber natürlich vorkommenden Nukleotidsequenzen ge­ ringer exprimiert wird.

2. Replizierbare DNA gemäß Anspruch 1, deren Nucleo­ tidsequenz

• a) keine für das brnA-Gen (Transaminase) codierende Nukleotidsequenz enthält oder
• b) eine für das brnA-Gen (Transaminase) codierende Nukleotidsequenz enthält, die nicht oder gegen­ über natürlich vorkommenden Nukleotidsequenzen geringer exprimiert wird.

3. Replizierbare DNA nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß diese im Fall b)

• a) eine Sequenz, dargestellt in Seq.-ID-Nr. 1, die für brnA codiert, umfaßt oder
• b) eine Sequenz umfaßt, die der Sequenz (i) inner­ halb des Bereichs der Degeneration des genetischen Codes entspricht; oder
• c) eine Sequenz umfaßt, die mit einer zur Sequenz (i) oder (ii) komplemetären Sequenz hybridisiert, und gegebenenfalls
• d) funktionsneutrale Sinnmutationen in (i) um­ faßt.

4. Replizierbare DNA nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß zur Erzielung der geringeren Expression die Promotor- und Regulationsregion, die sich stromauf­ wärts des Strukturgens befindet, mutiert ist.

5. Replizierbare DNA nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß zur Erzielung der geringeren Expression, die Expression des brnA-Gens in den Mikroorganismen durch Verkürzung der Lebensdauer der entsprechenden m-RNA und/oder der Beschleunigung des Abbaus des zugehörigen Enzymproteins beschleunigt ist.

6. Mikroorganismen, dadurch gekennzeichnet, daß sie eine Nukleotidsequenz gemäß einem der An­ sprüche 1 bis 5 enthalten.

7. Plasmidvektor pK19mobsacBΔbrnA, gekennzeichnet durch die in Fig. 2 wiedergegebene Restriktionskarte, hinterlegt als Corynebacterium glutamicum 13032ΔbrnA unter der Bezeichnung DSM 13971.

8. Verfahren zur fermentativen Herstellung von Panto­ thensäure, dadurch gekennzeichnet, daß für die Transaminase codierende Nukleotidse­ quenzen in Mikroorganismen deletiert werden oder gegenüber natürlich vorkommenden Sequenzen nicht oder geringer exprimiert werden und diese Mikroor­ ganismen zur Fermentation eingesetzt werden.

9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß die für das brnA-Gen codierende Nukleotidse­ quenz in Mikroorganismen deletiert wird oder gegen­ über natürlich vorkommenden Sequenzen geringer ex­ primiert wird und diese Mikroorganismen zur Fermen­ tation einsetzt werden.

10. Verfahren nach einem der Ansprüche 8 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß zur Erzielung der geringeren Expression, die sich stromaufwärts des Strukturgens befindende Pro­ motor- und Regulationsregion mutiert wird.

11. Verfahren nach einem der Ansprüche 8 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß zur Erzielung der geringeren Expression die Ex­ pression des brnA-Gens in den Mikroorganismen durch eine Verkürzung der Lebensdauer der entsprechenden m-RNA durchgeführt wird und/oder der Abbau des zu­ gehörigen Enzymproteins beschleunigt wird.

12. Verfahren nach einem der Ansprüche 8 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß man die DNA nach einem der Ansprüche 1 bis 5, in Mikroorganismen repliziert und (über)exprimiert, die eine oder mehrere Metabolit- und/oder Antimeta­ bolit-Resistenzmutationen aufweisen.

13. Verfahren nach einem der Ansprüche 8 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß der Plasmidvektor pJC1brnA, gekennzeichnet durch die in Fig. 1 wiedergegebene Restriktions­ karte, in Mikroorganismen mit einer inaktivierten Transaminase eingesetzt wird.

14. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß als Mikroorganismus Corynebacterium glutamicum R127/12, hinterlegt unter der Bezeichnung DSM 13970, eingesetzt wird.

15. Verfahren nach einem der Ansprüche 8 bis 14, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens ein Komponente aus der Gruppe der Gene ilvBN, ilvC, ilvD, panB, panC und panD in Mi­ kroorganismen gegenüber den in Wildstämmen vorkom­ menden entsprechenden Genen verstärkt werden, und diese Mikroorganismen zur Fermentation eingesetzt werden.

16. Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß man zur Erzielung der Verstärkung die Kopien­ zahl der Gene bzw. Nukleotidsequenzen durch Transformation von Mikroorganismen mit diesen Gene bzw. Nukleotidsequenzen tragenden Plasmidvektoren oder durch chromosomale Amplifikation erhöht.

17. Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß man zur Erzielung der Verstärkung die sich stromaufwärts des Strukturgens befindende Promotor- und Regulationsregion mutiert.

18. Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß man zur Erzielung der Verstärkung stromaufwärts der Strukturgene Expressionskassetten einbaut.

19. Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß man die Expression mindestens einer Komponente aus der Gruppe der Gene ilvBN, ilvC, ilvD, panB, panC und panD in den Mikroorganismen durch Verlän­ gerung der Lebensdauer der entsprechenden m-RNA und/oder Verhinderung des Abbaus der zugehörigen Enzymproteine verbessert.

20. Verfahren nach einem der Ansprüche 8 bis 19, dadurch gekennzeichnet, daß man die Mikroorganismen zur Verringerung der Expression des brnA-Gens bzw. zur Erzielung der Überexpression mindestens einer Komponente aus der Gruppe der Gene ilvBN, ilvC, ilvD, panB, panC und panD in geänderten Kulturmedien fermentiert und/oder die Fermentationsführung ändert.

21. Verfahren nach einem der Ansprüche 8 bis 20, dadurch gekennzeichnet, daß man Mikroorganismen einsetzt, in denen die Stoffwechselwege zumindest teilweise ausgeschaltet sind, die die Pantothenat-(Pantothensäure)-bildung verringern.

22. Verfahren nach einem der Ansprüche 8 bis 21, dadurch gekennzeichnet, daß man mit verschiedenen kompatiblen, mindestens eine Komonente aus der Gruppe der Gene ilvBN, ilvC, ilvD, panB, panC, und panD enthaltenden und das Gen brnA nicht enthaltenden Plasmidvektoren transfor­ mierte Mikroorganismen einsetzt.

23. Verfahren nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, daß man Mikroorganismen einsetzt, die mit einem Plasmidvektor pK19mobsacBΔbrnA transformiert sind.

24. Verfahren zur Herstellung von Pantothensäure, dadurch gekennzeichnet, daß man folgende Schritte durchführt:

• a) Fermentation von Mikroorganismen gemäß einem oder mehreren der vorhergehenden Ansprüche, in denen das brnA-Gen deletiert oder geringer ex­ primiert wird und gegebenenfalls mindestens eine Komponente aus der Gruppe der Gene ilvBN, ilvC, ilvD, panB, panC und panD verstärkt wird,
• b) Anreicherung der Pantothensäure im Medium oder in den Zellen der Mikroorganismen, und
• c) Isolieren der Pantothensäure.

25. Verfahren nach Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, daß die überexprimierten Gene aus Mikroorganismen der Gattungen Corynebacterium oder Escherichia stammen.

26. Verfahren nach einem der Ansprüche 24 bis 25, dadurch gekennzeichnet, daß man in Stufe a) als Vorstufe β-Alanin oder L- Valin zusetzt.

27. Verfahren gemäß einem oder mehreren der vorherge­ henden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man Mikroorganismen der Gattungen Escherichia oder Corynebacterium einsetzt.