DE10026758A1 - Verfahren zur fermentativen Herstellung von D-Pantothensäure unter Verwendung corymeformer Bakterien - Google Patents
Verfahren zur fermentativen Herstellung von D-Pantothensäure unter Verwendung corymeformer BakterienInfo
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- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
- C12P13/02—Amides, e.g. chloramphenicol or polyamides; Imides or polyimides; Urethanes, i.e. compounds comprising N-C=O structural element or polyurethanes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/88—Lyases (4.)
Landscapes
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Abstract
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von D-Pantothensäure durch Fermentation coryneformer Bakterien, bei dem man Bakterien einsetzt, in denen man die für die Phosphoenolpyruvat-Carboxykinase (EC 4.1.1.49) kodierende Nucleotidsequenz (pck-Gen) abschwächt, wobei man folgende Schritte ausführt: DOLLAR A a) Fermentation der D-Pantothensäure produzierenden Bakterien, in denen zumindest das für Phosphoenolpyruvat-Carboxykinase kodierende Gen abgeschwächt wird, DOLLAR A b) Anreicherung der D-Pantothensäure im Medium oder in den Zellen der Bakterien und DOLLAR A c) Isolieren der produzierten D-Pantothensäure.
Description
Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur
fermentativen Herstellung von D-Pantothensäure unter
Verwendung coryneformer Bakterien, in denen das pck-Gen
abgeschwächt ist.
Die Pantothensäure stellt ein kommerziell bedeutendes
Vitamin dar, das in der Kosmetik, der Medizin, der
Humanernährung und in der Tierernährung Anwendung findet.
Pantothensäure kann durch chemische Synthese oder
biotechnisch durch Fermentation geeigneter Mikroorganismen
in geeigneten Nährlösungen hergestellt werden. Bei der
chemischen Synthese ist das DL-Pantolacton eine wichtige
Zwischenstufe. Es wird in einem mehrstufigen Verfahren aus
Formaldehyd, Isobutylaldehyd und Cyanid hergestellt. In
weiteren Verfahrensschritten wird das racemische Gemisch
aufgetrennt, D-Pantolacton mit β-Alanin kondensiert und so
die gewünschte D-Pantothensäure erhalten.
Der Vorteil der fermentativen Herstellung durch
Mikroorganismen liegt in der direkten Bildung der
gewünschten stereoisomeren D-Form, die frei von L-
Pantothensäure ist.
Verschiedene Arten von Bakterien, wie z. B. Escherichia
coli, Arthrobacter ureafaciens, Corynebacterium
erythrogenes, Brevibacterium ammoniagenes und auch Hefen,
wie z. B. Debaromyces castellii können wie in EP-A 0 493 060
gezeigt, in einer Nährlösung, die Glucose, DL-
Pantoinsäure und β-Alanin enthält, D-Pantothensäure
produzieren. EP-A 0 493 060 zeigt weiterhin, daß bei
Escherichia coli durch Amplifikation von Pantothensäure-
Biosynthesegenen aus E. coli, die auf den Plasmiden pFV3 und
pFVS enthalten sind, in einer Nährlösung, die Glucose, DL-
Pantoinsäure und β-Alanin enthält, die Bildung von D-
Pantothensäure verbessert wird.
EP-A 0 590 857 und US-Patent 5,518,906 beschreiben von
Escherichia coli Stamm IFO3547 abgeleitete Mutanten, wie
FV5714, FV525, FV814, FV521, FV221, FV6051 und FV5069, die
Resistenzen gegen verschiedene Antimetabolite wie
Salizylsäure, α-Ketobuttersäure, β-Hydroxyasparaginsäure,
O-Methylthreonin und α-Ketoisovaleriansäure tragen. Sie
produzieren in einer Nährlösung, die Glucose enthält,
Pantoinsäure, und in einer Glucose- und β-Alanin-haltigen
Nährlösung D-Pantothensäure. In EP-A 0 590 857 und US-
Patent 5,518,906 wird weiterhin gezeigt, daß nach
Amplifikation der Pantothensäure-Biosynthesegene, die auf
dem Plasmid pFV31 enthalten sind, in den oben genannten
Stämmen in glucose-haltigen Nährlösungen, die Produktion
von D-Pantoinsäure und in einer Nährlösung, die Glucose und
β-Alanin enthält, die Produktion von D-Pantothensäure
verbessert wird.
Verfahren zur Herstellung von D-Pantothensäure mit Hilfe
von Corynebacterium glutamicum sind in der Literatur nur
ansatzweise bekannt. So berichten Sahm und Eggeling
(Applied and Environmental Microbiology 65(5), 1973-1979
(1999) über den Einfluss der Überexpression der Gene panB
und panC und Dusch et al. (Applied and Environmental
Microbiology 65(4), 1530-1539 (1999)) über den Einfluß des
Gens panD auf die Bildung der D-Pantothensäure.
Die Erfinder haben sich die Aufgabe gestellt, neue
Grundlagen für verbesserte Verfahren zur fermentativen
Herstellung von Pantothensäure mit coryneformen Bakterien
bereitzustellen.
Das Vitamin Pantothensäure stellt ein kommerziell
bedeutendes Produkt dar, das in der Kosmetik, der Medizin,
der Humanernährung und in der Tierernährung Anwendung
findet. Es besteht ein allgemeines Interesse daran,
verbesserte Verfahren zur Herstellung von Pantothensäure
bereitzustellen.
Wenn im Folgenden D-Pantothensäure oder Pantothensäure oder
Pantothenat erwähnt werden, sind damit nicht nur die freien
Säuren, sondern auch die Salze der D-Pantothensäure wie
z. B. das Calcium-, Natrium-, Ammonium- oder Kaliumsalz
gemeint.
Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur
fermentativen Herstellung von D-Pantothensäure unter
Verwendung von coryneformen Bakterien, in denen die für das
Enzym Phosphoenolpyruvat-Carboxykinase (PEP-Carboxykinase)
(EC 4.1.1.49) kodierende Nucleotidsequenz (pck-Gen)
abgeschwächt wird.
Die eingesetzten Stämme produzieren gegebenenfalls bereits
vor der Abschwächung des pck-Gens D-Pantothensäure.
Bevorzugte Ausführungsformen finden sich in den Ansprüchen.
Der Begriff "Abschwächung" beschreibt in diesem
Zusammenhang die Verringerung oder Ausschaltung der
intrazellulären Aktivität eines oder mehrerer Enzyme
(Proteine) in einem Mikroorganismus, die durch die
entsprechende DNA kodiert werden, indem man beispielsweise
einen schwachen Promotor oder ein Gen bzw. Allel verwendet,
das für ein entsprechendes Enzym mit einer niedrigen
Aktivität kodiert bzw. das entsprechende Enzym (Protein)
inaktiviert und gegebenenfalls diese Maßnahmen kombiniert.
Die Mikroorganismen, die Gegenstand der vorliegenden
Erfindung sind, können D-Pantothensäure aus Glucose,
Saccharose, Lactose, Fructose, Maltose, Melasse, Stärke,
Cellulose oder aus Glycerin und Ethanol herstellen. Es
handelt sich um Vertreter coryneformer Bakterien,
insbesondere der Gattung Corynebacterium. Bei der Gattung
Corynebacterium ist insbesondere die Art Corynebacterium
glutamicum zu nennen, die in der Fachwelt für ihre
Fähigkeit bekannt ist, L-Aminosäuren zu produzieren.
Geeignete Stämme der Gattung Corynebacaerium, insbesondere
der Art Corynebacterium glutamicum, sind beispielsweise die
bekannten Wildtypstämme
Corynebacterium glutamicum ATCC13032
Corynebacterium acetoglutamicum ATCC15806
Corynebacterium acetoacidophilum ATCC13870
Corynebacterium thermoaminogenes FERM BP-1539
Brevibacterium flavum ATCC14067
Brevibacterium lactofermentum ATCC13869 und
Brevibacterium divaricatum ATCC14020
und daraus hergestellte, D-Pantothensäure produzierende Mutanten wie beispielsweise
Corynebacterium glutamicum ATCC13032ΔilvA/pEC7panBC
Corynebacterium glutamicum ATCC13032/pND-D2
Corynebacterium glutamicum ATCC13032
Corynebacterium acetoglutamicum ATCC15806
Corynebacterium acetoacidophilum ATCC13870
Corynebacterium thermoaminogenes FERM BP-1539
Brevibacterium flavum ATCC14067
Brevibacterium lactofermentum ATCC13869 und
Brevibacterium divaricatum ATCC14020
und daraus hergestellte, D-Pantothensäure produzierende Mutanten wie beispielsweise
Corynebacterium glutamicum ATCC13032ΔilvA/pEC7panBC
Corynebacterium glutamicum ATCC13032/pND-D2
Es wurde gefunden, daß coryneforme Bakterien nach
Abschwächung des für die Phosphoenolpyruvat-Carboxykinase
(PEP-Carboxykinase) (EC 4.1.1.49) kodierenden pck-Gens in
verbesserter Weise Pantothensäure produzieren.
Die Nukleotidsequenz des pek-Gens ist in der SEQ ID No 1
und die sich daraus ergebende Aminosäuresequenz des
Enzymproteins in SEQ ID No 2 dargestellt.
Das in der SEQ ID No 1 beschriebene pck-Gen wird
erfindungsgemäß eingesetzt. Weiterhin können Allele des
pck-Gens verwendet werden, die sich aus der Degeneriertheit
des genetischen Codes oder durch funktionsneutrale
Sinnmutationen (sense mutations) ergeben.
Zur Erzielung einer Abschwächung kann entweder die
Expression des pck-Gens oder die katalytischen
Eigenschaften des Enzymproteins herabgesetzt bzw.
ausgeschaltet werden. Gegebenenfalls können beide Maßnahmen
kombiniert werden.
Die Verringerung der Genexpression können durch geeignete
Kulturführung oder durch genetische Veränderung (Mutation)
der Signalstrukturen der Genexpression erfolgen.
Signalstrukturen der Genexpression sind beispielsweise
Repressorgene, Aktivatorgene, Operatoren, Promotoren,
Attenuatoren, Ribosomenbindungsstellen, das Startkodon und
Terminatoren. Angaben hierzu findet der Fachmann z. B. in
der Patentanmeldung WO 96/15246, bei Boyd und Murphy
(Journal of Bacteriology 170: 5949 (1988)), bei Voskuil und
Chambliss (Nucleic Acids Research 26: 3548 (1998), bei
Jensen und Hammer (Biotechnology and Bioengineering 58: 191
(1998)), bei Patek et al. (Microbiology 142: 1297 (1996)
und in bekannten Lehrbüchern der Genetik und
Molekularbiologie wie z. B. dem Lehrbuch von Knippers
("Molekulare Genetik", 6. Auflage, Georg Thieme Verlag,
Stuttgart, Deutschland, 1995) oder dem von Winnacker ("Gene
und Klone", VCH Verlagsgesellschaft, Weinheim, Deutschland,
1990).
Mutationen, die zu einer Veränderung bzw. Herabsetzung der
katalytischen Eigenschaften von Enzymproteinen führen, sind
aus dem Stand der Technik bekannt; als Beispiele seien die
Arbeiten von Qiu und Goodman (Journal of Biological
Chemistry 272: 8611-8617 (1997)), Sugimoto et al.
(Bioscience Biotechnology and Biochemistry 61: 1760-1762
(1997)) und Möckel ("Die Threonindehydratase aus
Corynebacterium glutamicum: Aufhebung der allosterischen
Regulation und Struktur des Enzyms", Berichte des
Forschungszentrums Jülichs, Jül-2906, ISSN09442952, Jülich,
Deutschland, 1994) genannt. Zusammenfassende Darstellungen
können bekannten Lehrbüchern der Genetik und
Molekularbiologie wie z. B. dem von Hagemann ("Allgemeine
Genetik", Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1986) entnommen
werden.
Als Mutationen kommen Transitionen, Transversionen,
Insertionen und Deletionen in Betracht. In Abhängigkeit von
der Wirkung des Aminosäureaustausches auf die
Enzymaktivität wird von Fehlsinnmutationen (missense
mutations) oder Nichtsinnmutationen (nonsense mutations)
gesprochen. Insertionen oder Deletionen von mindestens
einem Basenpaar in einem Gen führen zu
Rasterverschiebungsmutationen (frame shift mutations), die
dazu führen, daß falsche Aminosäuren eingebaut werden oder
die Translation vorzeitig abbricht. Deletionen von mehreren
Kodonen führen typischerweise zu einem vollständigen
Ausfall der Enzymaktivität. Anleitungen zur Erzeugung
derartiger Mutationen gehören zum Stand der Technik und
können bekannten Lehrbüchern der Genetik und
Molekularbiologie wie z. B. dem Lehrbuch von Knippers
("Molekulare Genetik", 6. Auflage, Georg Thieme Verlag,
Stuttgart, Deutschland, 1995), dem von Winnacker ("Gene und
Klone", VCH Verlagsgesellschaft, Weinheim, Deutschland,
1990) oder dem von Hagemann ("Allgemeine Genetik", Gustav
Fischer Verlag, Stuttgart, 1986) entnommen werden.
Ein Beispiel für ein mutiertes pck-Gen ist das in Plasmid
pK19mobsacBΔpck (Fig. 3) enthaltene Δpck-Allel. Das Δpck-
Allel enthält lediglich die 5'- und die 3'-Flanke des pck-
Gens; ein 1071 bp langer Abschnitt der Kodierregion fehlt
(Deletion). Dieses Δpck-Allel kann durch
Integrationsmutagenese in coryneforme Bakterien eingebaut
werden. Hierzu bedient man sich des oben angegebenen
Plasmides pK19mobsacBΔpck, das in C. glutamicum nicht
replizierbar ist. Nach Übertragung durch Konjugation oder
Transformation und homologer Rekombination mittels eines
ersten, Integration bewirkenden "cross over"-Ereignisses
und eines zweiten, eine Excision bewirkenden "cross over"-
Ereignisses im pck-Gen erreicht man den Einbau des Δpck-
Allels und erzielt einen Totalverlust der Enzymfunktion in
dem jeweiligen Stamm.
Anleitungen und Erläuterungen zur Integrationsmutagenese
findet man beispielsweise bei Schwarzer und Pühler
(Bio/Technology 9, 84-87 (1991)) oder Peters-Wendisch et al.
(Microbiology 144, 915-927 (1998)).
Ein Beispiel für einen Pantothensäure produzierenden
coryneformen Bakterienstamm mit abgeschwächtem pck-Gen ist
der Stamm ATCC13032ΔilvAΔpck/pXT-panD.
Zusätzlich kann es für die Produktion von Pantothensäure
vorteilhaft sein, zusätzlich zur Abschwächung des für die
Phosphoenolpyruvat-Carboxykinase kodierenden Gens ein oder
mehrere weitere für Enzyme des Pantothensäure-
Biosyntheseweges oder des Keto-Isovaleriansäure-
Biosyntheseweges codierende Gene wie z. B.
- - das für die Ketopantoat-Hydroxymethyltransferase kodierende panB-Gen (Sahm et al., Applied and Environmental Microbiology, 65, 1973-1979 (1999)) oder
- - das für die Pantothenat-Synthetase kodierende panC-Gen (Sahm et al., Applied and Environmental Microbiology, 65, 1973-1979 (1999)) oder
- - das für die Dihydroxysäure-Dehydratase kodierende ilvD- Gen
zu verstärken, insbesondere zu überexprimieren.
Weiterhin kann es für die Produktion von Pantothensäure
vorteilhaft sein, neben der Abschwächung der
Phosphoenolpyruvat-Carboxykinase unerwünschte
Nebenreaktionen auszuschalten (Nakayama: "Breeding of Amino
Acid Producing Micro-organisms", in: Overproduction of
Microbial Products, Krumphanzl, Sikyta, Vanek (eds.),
Academic Press, London, UK, 1982).
Die erfindungsgemäß hergestellten Mikroorganismen können
kontinuierlich oder diskontinuierlich im batch-Verfahren
(Satzkultivierung) oder im fed batch (Zulaufverfahren) oder
repeated fed batch Verfahren (repetitives Zulaufverfahren)
zum Zwecke der Pantothensäure-Produktion kultiviert werden.
Eine Zusammenfassung über bekannte Kultivierungsmethoden
sind im Lehrbuch von Chmiel (Bioprozesstechnik 1.
Einführung in die Bioverfahrenstechnik (Gustav Fischer
Verlag, Stuttgart, 1991)) oder im Lehrbuch von Storhas
(Bioreaktoren und periphere Einrichtungen (Vieweg Verlag,
Braunschweig/Wiesbaden, 1994)) beschrieben.
Das zu verwendende Kulturmedium muß in geeigneter Weise den
Ansprüchen der jeweiligen Mikroorganismen genügen.
Beschreibungen von Kulturmedien verschiedenener
Mikroorganismen sind im Handbuch "Manual of Methods for
General Bacteriology" der American Society for Bacteriology
(Washington D. C., USA, 1981) enthalten. Als
Kohlenstoffquelle können Zucker und Kohlehydrate wie z. B.
Glucose, Saccharose, Lactose, Fructose, Maltose, Melasse,
Stärke und Cellulose, Öle und Fette wie z. B. Sojaöl,
Sonnenblumenöl, Erdnussöl und Kokosfett, Fettsäuren wie z. B.
Palmitinsäure, Stearinsäure und Linolsäure, Alkohole wie
z. B. Glycerin und Ethanol und organische Säuren wie z. B.
Essigsäure verwendet werden. Diese Stoffe können einzeln
oder als Mischung verwendet werden. Als Stickstoffquelle
können organische, Stickstoffhaltige Verbindungen wie
Peptone, Hefeextrakt, Fleischextrakt, Malzextrakt,
Maisquellwasser, Sojabohnenmehl und Harnstoff oder
anorganische Verbindungen wie Ammoniumsulfat,
Ammoniumchlorid, Ammoniumphosphat, Ammoniumcarbonat und
Ammoniumnitrat verwendet werden. Die Stickstoffquellen
können einzeln oder als Mischung verwendet werden. Als
Phosphorquelle können Kaliumdihydrogenphosphat oder
Dikaliumhydrogenphosphat oder die entsprechenden Natrium
haltigen Salze verwendet werden. Das Kulturmedium muß
weiterhin Salze von Metallen enthalten wie z. B.
Magnesiumsulfat oder Eisensulfat, die für das Wachstum
notwendig sind. Schließlich können essentielle Wuchsstoffe,
wie Aminosäuren und Vitamine zusätzlich zu den oben
genannten Stoffen eingesetzt werden. Dem Kulturmedium
können überdies zur zusätzlichen Steigerung der
Pantothensäure-Produktion Vorstufen der Pantothensäure, wie
Aspartat, β-Alanin, Ketoisovalerat, Ketopantoinsäure oder
Pantoinsäure, und gegebenenfalls deren Salze zugesetzt
werden. Die genannten Einsatzstoffe können zur Kultur in
Form eines einmaligen Ansatzes hinzugegeben oder in
geeigneter Weise während der Kultivierung zugefüttert
werden.
Zur pH-Kontrolle der Kultur werden basische Verbindungen
wie Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid, Ammoniak oder saure
Verbindungen wie Phosphorsäure oder Schwefelsäure in
geeigneter Weise eingesetzt. Zur Kontrolle der
Schaumentwicklung können Antischaummittel wie z. B.
Fettsäurepolyglykolester eingesetzt werden. Zur
Aufrechterhaltung der Stabilität von Plasmiden können dem
Medium geeignete selektiv wirkende Stoffe, z. B.
Antibiotika, hinzugefügt werden. Um aerobe Bedingungen
aufrechtzuerhalten werden Sauerstoff oder Sauerstoff
haltige Gasmischungen wie z. B. Luft in die Kultur
eingetragen. Die Temperatur der Kultur liegt normalerweise
bei 20°C bis 45°C und vorzugsweise bei 25°C bis 40°C. Die
Kultur wird solange fortgesetzt, bis sich ein Maximum an
Pantothensäure gebildet hat. Dieses Ziel wird normalerweise
innerhalb von 10 Stunden bis 160 Stunden erreicht.
Die Konzentration der Pantothensäure kann mit bekannten
chemischen (Velisek; Chromatographic Science 60, 515-560
(1992)) oder mikrobiologischen Verfahren wie z. B. dem
Lactobacillus plantarum Test (DIFCO MANUAL, 10th Edition,
S. 1100-1102; Michigan, USA) bestimmt werden.
Die D-Pantothensäure kann sowohl in isolierter reiner Form
als auch zusammen mit Bestandteilen der Fermentationsbrühe
in fester Form insbesondere in der Tierernährung eingesetzt
werden.
Werden die gewünschten Konzentrationen an D-Pantothensäure
in der Fermentation nicht erreicht, setzt man dem Gemisch
aus Fermentationsbrühebestandteilen und der Säure D-
Pantothensäure in gewünschter Menge zu.
Folgender Mikroorganismus wurde bei der Deutschen Sammlung
für Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ, Braunschweig,
Deutschland) gemäß Budapester Vertrag hinterlegt:
- - Escherichia coli Stamm DH5α/pK19mobsacBΔpck als DSM 13047
- - Corynebacterium glutamicum ATCC13032Δilva als DSM 12455
- - Corynebacterium glutamicum ATCC13022pND-D2 als DSM 12438
- - Corynebacterium glutamicum DSM 5715pEC-XT99A als DSM 12967
Die vorliegende Erfindung wird im folgenden anhand von
Ausführungsbeispielen näher erläutert.
Zu diesem Zweck wurden Versuche mit dem Isoleucin
bedürftigen Stamm ATCC13032ΔilvA durchgeführt. Der Stamm
ATCC13032ΔilvA ist als DSM 12455 bei der Deutschen Sammlung
für Mikroorganismen und Zellkulturen in Braunschweig
(Deutschland) gemäss Budapester Vertrag hinterlegt worden.
Das panD-Gen ist bei Dusch et al. (Applied and
Environmental Microbiology 65(4), 1530-1539 (1999)) und in
der DE 198 55 313.7 beschrieben und in Form des Stammes
Corynebacterium glutamicum ATCC13032/pND-D2 als DSM 12438
ebenfalls bei der Deutschen Sammlung für Mikroorganismen
und Zellkulturen in Braunschweig (Deutschland) gemäss
Budapester Vertrag hinterlegt.
Zur Isolierung des PEP-Carboxykinase-Gens (pck) aus C.
glutamicum wurde basierend auf dem Cosmid pHC79 (Hohn und
Collins, Gene 11 (1980) 291-298) eine Cosmid-Genbank nach
bekannter Methodik (Sambrook et al., Molecular Cloning, A
Laboratory Handbook, 1989, Cold Spring Harbour Laboratory
Press) angelegt. Dazu wurde aus C. glutamicum ATCC13032
chromosomale DNS isoliert (Eikmanns et al., Microbiology
140 (1994) 1817-1828) und mit dem Restriktionsenzym Sau3A
partiell verdaut. Nach Ligation der erhaltenen Fragmente in
die BamHI-Schnittstelle des Cosmids pHC79 wurde der Ansatz
in die Proteinhülle des Bakteriophagen Lambda verpackt und
der E. coli-Stamm ED8654 (Murray et al. Molecular and
General Genetics 150 (1997) 53-61) damit transfiziert. Die
Verpackung der rekombinanten Cosmide in die Proteinhülle
des Phagen Lambda erfolgte nach einer Methode von Sternberg
et al. (Gene 1 (1979) 255-280), die Transfektion von E.
coli ED8654 nach einer Methode von Sambrook et al.
(Molecular Cloning, A Laboratory Handbook, 1989, Cold
Spring Harbour Laboratory Press). Aus insgesamt 30 der
erhaltenen rekombinanten E. coli-Klone wurden die
entsprechenden Cosmide isoliert (Sambrock et al., Molecular
Cloning, A Laboratory Handbook, 1989, Cold Spring Harbour
Laboratory Press) und einer Restriktionsanalyse mit dem
Enzym HindIII unterzogen. Es zeigte sich, daß 24 der
untersuchten Cosmide Inserts besaßen, und daß die Inserts
Größen von ungefähr 35 kb aufwiesen. Insgesamt 2200 Cosmid
tragende E. coli-Klone wurden vereinigt und aus diesem
Gemisch nach bekanntem Verfahren (Sambrock et al.,
Molecular Cloning, A Laboratory Handbook, 1989, Cold Spring
Harbour Laboratory Press) die Cosmid-DNA präpariert.
Zur Isolierung des pck-Gens aus C. glutamicum wurde die
Cosmid-Genbank in die PEP-Carboxykinase-defekte E. coli-
Mutante HG4 (Goldie and Sanwal, Journal of Bacteriology 141
(1980) 115-1121) nach bekanntem Verfahren (Sambrock et al.,
Molecular Cloning, A Laboratory Handbook, 1989, Cold Spring
Harbour Laboratory Press) transformiert. Die Mutante HG4
ist aufgrund ihres PEP-Carboxykinase-Defektes nicht mehr in
der Lage, auf Succinat als einziger Kohlenstoffquelle zu
wachsen. Nach Transformation der Cosmid-Genbank in diese
Mutante wurden insgesamt 1200 Klone erhalten. Von diesen
zeigten insgesamt zwei Klone Wachstum auf M9-Minimalmedium
(Sambrock et al., Molecular Cloning, A Laboratory Handbook,
1989, Cold Spring Harbour Laboratory Press) mit Succinat
(0.4%) als einziger Kohlenstoffquelle. Nach Isolierung der
entsprechenden Cosmide (Sambrock et al., Molecular Cloning,
A Laboratory Handbook, 1989, Cold Spring Harbour Laboratory
Press) aus diesen Klonen und erneuter Transformation in die
E. coli-Mutante HG4 waren die resultierenden Klone erneut
in der Lage, auf M9-Medium mit Succinat als einziger
Kohlenstoffquelle zu wachsen.
Um das pck-Gen aus C. glutamicum auf einem kleineren
Fragment einzugrenzen, wurden die zwei komplementierenden
Cosmide mit den Restriktionsenzymen XhoI, ScaI und PvuII
verdaut und nach bekannter Methode (Sambrock et al.,
Molecular Cloning, A Laboratory Handbook, 1989, Cold Spring
Harbour Laboratory Press) auf einem 0,8%igen Agarosegel im
elektrischen Feld aufgetrennt. Fragmente im Größenbereich
über 3,0 kb wurden durch Elektroelution (Sambrock et al.,
Molecular Cloning, A Laboratory Handbook, 1989, Cold Spring
Harbour Laboratory Press) aus dem Gel isoliert und in die
SalI (XhoI-Verdau), bzw. in die Klenow-behandelte EcoRI-
Schnittstelle (ScaI- und PvuII-Verdau) des Vektors pEK0
(Eikmanns et al., Gene 102 (1991) 93-98) ligiert. Mit den
Ligationsansätzen wurde E. coli HG4 transformiert und die
erhaltenen Transformanten erneut auf ihre Fähigkeit
untersucht, auf Succinat als alleiniger Kohlenstoffquelle
zu wachsen. In dem Transformationsansatz mit dem PvuII-
Ligationsansatz zeigten sich sieben Klone, deren Plasmide
der Mutante HG4 Wachstum auf Succinat erlaubten. Aus den
rekombinanten Stämmen wurden die entsprechenden Plasmide
isoliert und einer Restriktionskartierung unterzogen. Es
zeigte sich, daß alle sieben Plasmide das gleiche 4.3-kb
PvuII-Insert trugen, drei in der einen Orientierung, vier
in der anderen. In Abhängigkeit von der Orientierung des
Inserts im Vektor wurden die neu konstruierten Plasmide als
pEK-pckA und pEK-pckB bezeichnet. Die Restriktionskarten
beider Plasmide sind in Fig. 1 und 2 dargestellt.
Für die Sequenzierung wurde das circa 3.9 kb große EcoRI-
Fragment aus pEK-pckA (dabei stammt eine EcoRI-
Schnittstelle aus dem Vektor pEK0) nach bekannter Methode
isoliert. Die überhängenden Enden des Fragmentes wurden mit
Klenow-Polymerase zu glatten Enden aufgefüllt (Sambrock et
al., Molecular Cloning, A Laboratory Handbook, 1989, Cold
Spring Harbour Laboratory Press) und in die EcoRV-
Schnittstelle des Vektors pGEM-5Zf(+)(Promega Corporation,
Madison, WI, USA) ligiert. Die Insertion des so erzeugten
Plasmides wurde durch die Kettenabbruch-Sequenziermethode
(Sanger et al., Proceedings of the National Academy of
Sciences USA, 74 (1977) 5463-5467) sequenziert. Sie ist als
SEQ ID No. 1 dargestellt. Die erhaltene Nukleotidsequenz
von 3935 bp wurde mit dem Programmpaket HUSAR (Release 3.0)
des Deutschen Krebsforschungszentrums (DKFZ, Heidelberg,
Deutschland) analysiert. Die Sequenzanalyse der Fragmente
ergab ein offenes Leseraster von 1830 bp Länge, das für
eine Protein bestehend aus 610 Aminosäuren kodiert.
Für die Inaktivierung des PEP-Carboxykinase-Gens wurde aus
dem Vektor pEK-pckB (Fig. 2) das EcoRI-SacI Fragment des
pck-Gens isoliert und in den Vector pGEM-7Zf(+)(Promega
Corporation, Madison, WI, USA) einligiert. Aus dem
resultierenden Plasmid wurde ein pck-internes 1,07 kb
HindII-HindIII-Fragment deletiert, anschließend das pck-Gen
mit der 1,07-kb-Deletion als BfrI-SacI-Fragment isoliert
und nach Auffüllen der überhängenden Enden in den in C.
glutamicum nicht-replikativen Vektor pK19mobsacB (Schäfer
et al., Gene 145, 69-73 (1994)) ligiert. In dem so
konstruierten Integrationsplasmid pK19mobsacBΔpck (Fig. 3)
grenzt der 5'-Bereich des pck-Gens (350 bp) direkt an den
3'-Bereich des pck-Gens (340 bp); im Genom sind die beiden
Bereiche durch 1071 bp voneinander getrennt. Die
Klonierungen wurden in E. coli DH5α als Wirt durchgeführt.
Für die Deletion des pck-Gens wurde das Integrationsplasmid
pK19mobsacBΔpck in den Stamm C. glutamicum ATCC13032ΔilvA
elektroporiert. Nach Selektion auf Kanamycin (25 µg/ml)
wurden Einzelklone erhalten, bei denen der
Inaktivierungsvektor im Genom integriert vorlag. Um die
Excision des Vektors zu ermöglichen wurden Einzelkolonien
in 50 ml flüssigem LB-Medium ohne Antibiotika 24 Stunden
bei 30°C und 130 rpm inkubiert und dann auf Saccharose
haltigen Agarplatten (LB mit 15 mg/ml Agar und 10%
Saccharose) ausgestrichen. Durch diese Selektion wurden
Klone erhalten, die den Vektoranteil durch ein zweites
Rekombinationsereignis wieder verloren haben (Jäger et al.
1992, Journal of Bacteriology 174: 5462-5465). Um solche
Klone zu identifizieren, bei denen nun das unvollständige
pck-Gen im Genom vorliegt, wurde eine Polymerase
Kettenreaktion durchgeführt. Die Oligonucleotide wurden so
ausgewählt, daß sie die Deletionsregion überspannen. Die
Primer pck-1 mit der Sequenz 5'-GGAACTGCTGAACTGGATCG-3' und
pck-2 mit der Sequenz 5'-GAACTGGCTGTGAACCTCTG-3'
amplifizieren auf Gesamt-DNA des Ausgangsstamms C.
glutamicum ATCC13032ΔilvA ein 1741 bp großes Fragment,
während die Primer auf der DNA von pck-Deletionsmutanten
ein verkürztes, 670 bp großes Fragment amplifizierten.
Einer so identifizierten Deletionsmutante fehlt folglich
das zuvor in vitro deletierte 1,07 kb große interne
Fragment des pck-Gens.
Der auf diese Weise hergestellte und geprüfte Stamm C.
glutamicum ATCC13032ΔilvAΔpck wurde für die weiteren
Untersuchungen eingesetzt.
Als Ausgangsvektor zur Konstruktion des E. coli-C.
glutamicum-Shuttle-Expressionsvektors pEC-XT99A wurde der
E. coli-Expressionsvektor pTRC99A (Amann et al. 1988, Gene
69: 301-315) verwandt. Nach BspHI-Restriktionsspaltung
(Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Deutschland,
Produktbeschreibung BspHI, Product No. 1467123) und
anschließender Klenow-Behandlung (Amersham Pharmacia
Biotech, Freiburg, Deutschland, Produktbeschreibung Klenow
Fragment of DNA Polymerase I, Product No. 27-0928-01;
Methode nach Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning: A
laboratory Manual, Cold Spring Harbor) wurde das
Ampicillin-Restenzgen (bla) gegen das Tetracyclin-
Resistenzgen des C. glutamicum Plasmids pAG1 (GenBank
Accession No. AF121000) ausgetauscht. Hierzu wurde der
Resistenzgen-tragende Bereich als AluI-Fragment (Amersham
Pharmacia Biotech, Freiburg, Deutschland,
Produktbeschreibung AluI, Product No. 27-0884-01) in den
linearisierten E. coli-Expressionsvektor pTRC99A kloniert.
Die Ligation wurde wie von Sambrook et al. (1989, Molecular
Cloning: A laboratory Manual, Cold Spring Harbor)
beschrieben durchgeführt, wobei das DNA-Gemisch mit T4-
Ligase (Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg, Deutschland,
Produktbeschreibung T4-DNA-Ligase, Product No. 27-(0870-04)
über Nacht inkubiert wurde. Dieses Ligationsgemisch wurde
anschließend in den E. coli-Stamm DH5αmcr (Grant, 1990,
Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A.,
87: 4645-4649) elektroporiert (Tauch et al. 1994, FEMS
Microbiology Letters, 123: 343-7). Der konstruierte E. coli-
Expressionsvektor wurde mit pXT99A bezeichnet.
Als Basis zur Klonierung eines Minimalreplikons aus
Corynebacterium glutamicum wurde das Plasmid pGA1 (Sonnen
et al. 1991, Gene, 107: 69-74) verwandt. Durch BalI/PstI-
Restriktionsspaltung (Promega GmbH, Mannheim, Deutschland,
Produktbeschreibung BalI, Product No. R6691; Amersham
Pharmacia Biotech, Freiburg, Deutschland
Produktbeschreibung PstI, Product No. 27-0976-01) des
Vektors pGA1 konnte ein 3484 bp großes Fragment in den mit
SmaI und PstI (Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg,
Deutschland, Produktbeschreibung SmaI, Product No. 27-0942-
02, Produktbeschreibung PstI, Product No. 27-0976-01)
fragmentierten Vektor pK18mob2 (Tauch et al., 1998,
Archives of Microbiology 169: 303-312) kloniert werden.
Mittels BamHI/XhoI-Restriktionsspaltung (Amersham Pharmacia
Biotech, Freiburg; Deutschland, Produktbeschreibung BamHI,
Product No. 27-086803, Produktbeschreibung XhoI, Product
No. 27-0950-01) und anschließender Klenow-Behandlung
(Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg, Deutschland,
Produktbeschreibung Klenow Fragment of DNA Polymerase I,
Product No. 27-0928-01; Methode nach Sambrook et al., 1989,
Molecular Cloning: A laboratory Manual, Cold Spring Harbor)
wurde ein 839 bp großes Fragment deletiert. Aus dem mit T4-
Ligase (Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg, Deutschland,
Produktbeschreibung T4-DNA-Ligase, Product No. 27-0870-04)
religierten Konstrukt konnte das C. glutamicum
Minimalreplikon als 2645 bp großes Fragment in den E. coli-
Expressionsvektor pXT99A kloniert werden. Hierzu wurde die
DNA des Minimalreplikon-tragenden Konstruktes mit den
Restriktionsenzymen KpnI (Amersham Pharmacia Biotech,
Freiburg, Deutschland, Produktbeschreibung KpnI, Product
No. 27-0908-01) und PstI (Amersham Pharmacia Biotech,
Freiburg, Deutschland, Produktbeschreibung PstI, Product
No. 27-0886-03) gespalten und anschließend mittels Klenow-
Polymerase (Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg,
Deutschland, Produktbeschreibung Klenow Fragment of DNA
Polymerase I, Product No. 27-0928-01) eine 3'-5'-
Exonukleasebehandlung (Sambrook et al., 1989, Molecular
Cloning: A laboratory Manual, Cold Spring Harbor)
durchgeführt.
In einem parallelen Ansatz wurde der E. coli-
Expressionsvektor pXT99A mit dem Restriktionsenzym RsrII
(Roche Diagnostics, Mannheim, Deutschland,
Produktbeschreibung RsrII, Product No. 1292587) gespalten
und mit Klenow-Polymerase (Amersham Pharmacia Biotech,
Freiburg, Deutschland, Klenow Fragment of DNA Polymerase I,
Product No. 27-0928-01) zur Ligation vorbereitet. Die
Ligation des Minimalreplikons mit dem Vektorkonstrukt
pXT99A wurde wie von Sambrook et al. (1989, Molecular
Cloning: A laboratory Manual, Cold Spring Harbor)
beschrieben durchgeführt, wobei das DNA-Gemisch mit T4-
Ligase (Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg, Deutschland,
Produktbeschreibung T4-DNA-Ligase, Product No. 27-0870-04)
über Nacht inkubiert wurde.
Der so konstruierte E. coli-C. glutamicum-Shuttle-
Expressionsvektor pEC-XT99A wurde mittels Elektroporation
(Liebl et al., 1989, FEMS Microbiology Letters, 53: 299-303)
in C. glutamicum DSM 5715 transferiert. Die Selektion der
Transformanten erfolgte auf LBHIS Agar bestehend aus 18,5 g/l
Brain-Heart Infusion Boullion, 0,5 M Sorbitol, 5 g/l
Bacto-Trypton, 2,5 g/l Bacto-Yeast-Extract, 5 g/l NaCl und
18 g/l Bacto-Agar, der mit 5 mg/l Tetracyclin
supplementiert worden war. Die Inkubation erfolgte für 2
Tage bei 33°C.
Plasmid DNA wurde aus einer Transformante nach den üblichen
Methoden isoliert (Peters-Wendisch et al., 1998,
Microbiology, 144, 915-927), mit der
Restriktionsendonuklease HindIII geschnitten und das
Plasmid durch anschließende Agarosegel-Elektrophorese
überprüft.
Das so erhaltene Plasmidkonstrukt wurde als pEC-XT99A
bezeichnet und ist in Fig. 4 dargestellt. Der durch
Elektroporation des Plasmides pEC-XT99A in den
Corynebacterium glutamicum Stamm DSM 5715 erhaltene Stamm
wurde DSM 5715/pEC-XT99A genannt und als DSM 12967 bei der
Deutschen Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen
(DSMZ, Braunschweig, Deutschland) gemäß Budapester Vertrag
hinterlegt.
Ausgehend von den Nucleotidsequenzen des
Pantothenatbiosynthese Gens panD von C. glutamicum ATCC
13032 (Dusch et al. (Applied and Environmental Microbiology
65(4), 1530-1539 (1999)) und DE 198 55 313.7) wurden PCR-
Primer so ausgewählt, daß das amplifizierte Fragment das
Gen mit seiner nativen Ribosomen-Bindestellen enthält. Das
mit den PCR-Primer panD-Cg1 (5'-CATCTCACGCTATGAATTCT-3')
und panD-Cg2 (5'-ACGAGGCCTGCAGCAATA-3) amplifizierte 405 bp
große Fragment wurde den Herstellerangaben zufolge in den
Vektor pCR®2.1 (Original TA Cloning Kit, Invitrogene (Leek,
Niederlande), Produktbeschreibung Original TA Cloning® Kit,
Cat. no. KNM2030-01) ligiert und anschließend in den E.
coli Stamm TOP10'(Katalog "Invitrogen 2000" der Firma
Invitrogen, Groningen, Niederlande) transformiert. Die
Selektion auf Transformanten erfolgte durch Inkubation bei
37°C für 24 Stunden auf LB-Agarplatten mit 100 µg/ml
Ampicillin und 40 µg/ml X-Gal (5-Bromo-4-Chloro-3-Indolyl-
β-D-Galaktosid).
DNA des so konstruierte Plasmids pCR-D2 wurde nach der
üblichen Methode aus einer Transformante isoliert, mit den
Restriktionsendonukleasen SacI und XbaI verdaut und in den
ebenso gespaltenen Vektor pEC-XT99A ligiert. Da die zweite
XbaI-Schnittstelle, welche in der panD-Kodierregion liegt,
in dem E. coli Wirt Top10F' methyliert vorliegt, wurde
diese Spaltstelle nicht geschnitten und das Gen wurde
folglich intakt durch die flankierenden SacI und XbaI
Schnittstellen aus dem Plasmid pCR-D2 herausgespalten. Nach
der Ligation wurd der Ansatz in den Stamm E. coli DH5αmcr
elektroporiert. Die Selektion erfolgte auf LB-Agarplatten
mit 50 µg/ml Kanamycin. Plasmid-DNA aus einer so erhaltenen
Transformante wurde isoliert, mit den
Restriktionsendonukleasen SacI und XbaI gespalten und die
Fragmente wurden anschließend durch Agarose-
Gelelektrophorese überprüft. Das so konstruierte Plasmid
wurde als pXT-panD bezeichnet und ist in Fig. 5
dargestellt.
Das in Beispiel 5 beschriebene Plasmid pXT-panD wurde in
die beiden C. glutamicum Stämme ATCC13032ΔilvA und
ATCC13032ΔilvAΔpck elektroporiert und nach Selektion auf
LB-Agarplatten mit 10 µg/ml Tetracyclin wurde das Plasmid
aus je einer der Transformanten reisoliert und, wie im
Beispiel 5 beschrieben, mit Restriktionsenzymen gespalten
und überprüft.
Die Bildung von Pantothenat durch die C. glutamicum Stämme
ATCC13032ΔilvA/pXT-panD und ATCC13032ΔilvAΔpck/pXT-panD
wurde in Medium CGXII (Keilhauer et al., 1993, Journal of
Bacteriology, 175: 5595-5603; Tabelle 1) geprüft, das mit 10 µg/ml
Tetracyclin und 2 mM Isoleucin supplementiert wurde,.
Dieses Medium wird im Folgenden als C. glutamicum-
Testmedium bezeichnet. Je 50 ml frisch angesetztes C.
glutamicum-Testmedium wurden aus einer 16 Stunden alten
Vorkultur des gleichen Mediums dergestalt angeimpft, daß
die optische Dichte der Kultursuspension (o. D.580) bei
Inkubationsbeginn 0,1 betrug. Die Kulturen wurden bei 30°C
und 130 U/min bebrütet. Nach 5 stündiger Inkubation wurde
IPTG (Isopropyl β-D-thiogalactosid) in einer
Endkonzentration von 1 mM hinzugefügt. Nach 48 stündiger
Inkubation wurde die optische Dichte (o. D.580) der Kultur
bestimmt und anschließend die Zellen durch 10 minütige
Zentrifugation bei 5000 g entfernt und der Überstand
sterilfiltriert.
Zur Bestimmung der optischen Dichte wurde ein Novaspec II
Photometer der Firma Pharmacia (Freiburg, Deutschland) bei
einer Messwellenlänge von 580 nm eingesetzt.
Die Quantifizierung des D-Pantothenats im Kulturüberstand
erfolgte mittels Lactobacillus plantarum ATCC 8014 nach
Angaben des Handbuchs der Firma DIFCO (DIFCO MANUAL, 10th
Edition, S. 1100-1102; Michigan, USA). Für die Kalibrierung
wurde das Hemicalciumsalz von Pantothenat der Firma Sigma
(Deisenhofen, Deutschland) verwendet.
Die Ergebnisse der Pantothenat-Produktion durch die Stämme
ATCC13032ΔilvA/pXT-panD und ATCC13032ΔilvAΔpck/pXT-panD
sind in Tabelle 2 zusammengefasst.
Folgende Figuren sind beigefügt:
Fig. 1 Restriktionskarte des Plasmides pEK-pckA
Fig. 2 Restriktionskarte des Plasmides pEK-pckB
Fig. 3 Restriktionskarte des Plasmides pK19mobsacBΔpck
Fig. 4 Restriktionskarte des Plasmides pEC-XT99A
Fig. 5 Restriktionskarte des Plasmides pXT-panD
Bei der Angabe der Basenpaarzahlen handelt es sich um ca. -
Werte, die im Rahmen der Reproduzierbarkeit erhalten
werden.
Die verwendeten Abkürzungen und Bezeichnungen haben
folgende Bedeutung:
'lacZ: 3'-Terminus des lacZα Genfragmentes
Km-r: Kanamycin Resistenzgen
lacIq: LacIq Allel des lac Repressorgens
lacZ': 5'-Terminus des lacZα Genfragmentes
oriT: Replikationsursprung für den Transfer
oriV: Replikationsursprung V
panD: Aspartat-Decarboxylase Gen
pck: pck-Gen
pck': 3'-terminales Fragment des pck-Gens
pck': 5'-terminales Fragment des pck-Gens
per: Gen zur Kontrolle der Kopienzahl
Ptrc: trc-Promotor
rep: Replikationsregion für C. glutamicum
sacB: sacB-Gen
T1: Transkriptionsterminator T1
T2: Transkriptionsterminator T2
Tet: Tetracyclinresistenzgen
BamHI: Schnittstelle des Restriktionsenzyms BamHI
BfrI: Schnittstelle des Restriktionsenzyms BfrI
EcoRI: Schnittstelle des Restriktionsenzyms EcoRI
HindII: Schnittstelle des Restriktionsenzyms HindII
HindIII: Schnittstelle des Restriktionsenzyms HindIII
KpnI: Schnittstelle des Restriktionsenzyms KpnI
NcoI: Schnittstelle des Restriktionsenzyms NcoI
NotI: Schnittstelle des Restriktionsenzyms NotI
PstI: Schnittstelle des Restriktionsenzyms PstI
SacI: Schnittstelle des Restriktionsenzyms SacI
SalI: Schnittstelle des Restriktionsenzyms SalI
ScaI: Schnittstelle des Restriktionsenzyms ScaI
SmaI: Schnittstelle des Restriktionsenzyms SmaI
SphI: Schnittstelle des Restriktionsenzyms SphI
XbaI**: Methylierte Schnittstelle XbaI
XbaI: Schnittstelle des Restriktionsenzyms XbaI
'lacZ: 3'-Terminus des lacZα Genfragmentes
Km-r: Kanamycin Resistenzgen
lacIq: LacIq Allel des lac Repressorgens
lacZ': 5'-Terminus des lacZα Genfragmentes
oriT: Replikationsursprung für den Transfer
oriV: Replikationsursprung V
panD: Aspartat-Decarboxylase Gen
pck: pck-Gen
pck': 3'-terminales Fragment des pck-Gens
pck': 5'-terminales Fragment des pck-Gens
per: Gen zur Kontrolle der Kopienzahl
Ptrc: trc-Promotor
rep: Replikationsregion für C. glutamicum
sacB: sacB-Gen
T1: Transkriptionsterminator T1
T2: Transkriptionsterminator T2
Tet: Tetracyclinresistenzgen
BamHI: Schnittstelle des Restriktionsenzyms BamHI
BfrI: Schnittstelle des Restriktionsenzyms BfrI
EcoRI: Schnittstelle des Restriktionsenzyms EcoRI
HindII: Schnittstelle des Restriktionsenzyms HindII
HindIII: Schnittstelle des Restriktionsenzyms HindIII
KpnI: Schnittstelle des Restriktionsenzyms KpnI
NcoI: Schnittstelle des Restriktionsenzyms NcoI
NotI: Schnittstelle des Restriktionsenzyms NotI
PstI: Schnittstelle des Restriktionsenzyms PstI
SacI: Schnittstelle des Restriktionsenzyms SacI
SalI: Schnittstelle des Restriktionsenzyms SalI
ScaI: Schnittstelle des Restriktionsenzyms ScaI
SmaI: Schnittstelle des Restriktionsenzyms SmaI
SphI: Schnittstelle des Restriktionsenzyms SphI
XbaI**: Methylierte Schnittstelle XbaI
XbaI: Schnittstelle des Restriktionsenzyms XbaI
Claims (11)
1. Verfahren zur Herstellung von D-Pantothensäure durch
Fermentation coryneformer Bakterien,
dadurch gekennzeichnet,
daß man Bakterien einsetzt, in denen man die für die
Phosphoenolpyruvat-Carboxykinase (PEP-Carboxykinase)
(EC 4.1.1.49) kodierende Nucleotidsequenz (pck)
abschwächt, insbesondere ausschaltet.
2. Verfahren nach Anspruch 1,
dadurch gekennzeichnet,
daß man zur Erzielung der Abschwächung das Verfahren
der Deletion des pck-Gens insbesondere mittels des
Vektors pk19mobsacBΔpck, dargestellt in Fig. 3 und
hinterlegt in E. coli als DSM 13047, verwendet.
3. Verfahren gemäß Anspruch 1,
dadurch gekennzeichnet,
daß man Bakterien einsetzt, in denen man zusätzlich
weitere Gene des Biosyntheseweges der D-Pantothensäure
verstärkt.
4. Verfahren gemäß Anspruch 1,
dadurch gekennzeichnet,
daß man Bakterien einsetzt, in denen die
Stoffwechselwege zumindest teilweise ausgeschaltet
sind, die die Bildung der D-Pantothensäure verringern.
5. Verfahren gemäß Anspruch 3,
dadurch gekennzeichnet,
daß man gleichzeitig das für die Ketopantoat-
Hydroxymethyltransferase kodierende panB-Gen
verstärkt.
6. Verfahren gemäß Anspruch 3,
dadurch gekennzeichnet,
daß man gleichzeitig das für die Pantothenat-
Synthetase kodierende panC-Gen verstärkt.
7. Verfahren gemäß Anspruch 3,
dadurch gekennzeichnet,
daß man gleichzeitig das für die Dihydroxysäure-
Dehydratase kodierende ilvD-Gen verstärkt.
8. Verfahren gemäß den Ansprüchen 5 bis 7,
dadurch gekennzeichnet,
daß man die genannten Gene in coryneformen Bakterien
verstärkt, die bereits D-Pantothensäure produzieren.
9. Verfahren zur fermentativen Herstellung von
D-Pantothensäure gemäß einem oder mehreren der
vorhergehenden Ansprüche,
dadurch gekennzeichnet,
daß man folgende Schritte durchführt:
- a) Fermentation der D-Pantothensäure produzierenden Bakterien, in denen zumindest das für die Phosphoenolpyruvat-Carboxykinase kodierende Gen abgeschwächt wird,
- b) Anreicherung der D-Pantothensäure im Medium oder in den Zellen der Bakterien und
- c) Isolieren der produzierten D-Pantothensäure.
10. Coryneforme Bakterien, in denen die für die
Phosphoenolpyruvat-Carboxykinase (PEP-Carboxykinase)
kodierenden Nucleotidsequenzen (pck-Gen) abgeschwächt
sind.
11. Escherichia coli Stamm DH5α/pK19mobsacBΔpck,
hinterlegt unter der Nummer DSM 13047 bei DSMZ,
Braunschweig.
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| DE10026758A DE10026758A1 (de) | 2000-05-30 | 2000-05-30 | Verfahren zur fermentativen Herstellung von D-Pantothensäure unter Verwendung corymeformer Bakterien |
| EP01940381A EP1285083A1 (de) | 2000-05-30 | 2001-04-28 | Verfahren zur fermentativen herstellung von d-pantothensäure durch coryneformer bakterien mit deletiertem pck (phosphoenolpyruvat-carboxykinase, 4.1.1.49) gen |
| PCT/EP2001/004816 WO2001092556A1 (en) | 2000-05-30 | 2001-04-28 | A process for the fermentative preparation of d-pantothenic acid using coryneform bacteria with deleted pck (phosphoenolpyruvate carboxykinase, 4.1.1.49) gene |
| AU2001273978A AU2001273978A1 (en) | 2000-05-30 | 2001-04-28 | A process for the fermentative preparation of d-pantothenic acid using coryneform bacteria with deleted pck (phosphoenolpyruvate carboxykinase, 4.1.1.49) gene |
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|---|---|---|---|---|
| DE19855312A1 (de) * | 1998-12-01 | 2000-06-08 | Degussa | Verfahren zur fermentativen Herstellung von D-Pantothensäure unter Verwendung coryneformer Bakterien |
| EP1083225A1 (de) * | 1999-09-09 | 2001-03-14 | Degussa-Hüls Aktiengesellschaft | Verfahren zur fermentativen Herstellung von D-Pantothensäure unter Verwendung coryneformer Bakterien |
| DE19950409A1 (de) * | 1999-10-20 | 2001-04-26 | Degussa | Neue für das pck-Gen codierende Nukleotidsequenzen |
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- 2000-05-30 DE DE10026758A patent/DE10026758A1/de not_active Withdrawn
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- 2001-04-28 WO PCT/EP2001/004816 patent/WO2001092556A1/en not_active Application Discontinuation
- 2001-04-28 AU AU2001273978A patent/AU2001273978A1/en not_active Abandoned
- 2001-04-28 EP EP01940381A patent/EP1285083A1/de not_active Withdrawn
- 2001-05-10 US US09/852,118 patent/US20020042104A1/en not_active Abandoned
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2002072854A2 (en) * | 2001-03-14 | 2002-09-19 | Degussa Ag | Process for the preparation of d-pantothenic acid and/or salts thereof |
| WO2002072854A3 (en) * | 2001-03-14 | 2002-12-05 | Degussa | Process for the preparation of d-pantothenic acid and/or salts thereof |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| AU2001273978A1 (en) | 2001-12-11 |
| WO2001092556A1 (en) | 2001-12-06 |
| US20020042104A1 (en) | 2002-04-11 |
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