RU2268938C2 - ПОЛИНУКЛЕОТИД, СОДЕРЖАЩИЙ НУКЛЕОТИДНУЮ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ, КОДИРУЮЩУЮ КОМПОНЕНТ Н СИСТЕМЫ ФОСФОТРАНСФЕРАЗЫ, ПЛАЗМИДНЫЙ ВЕКТОР, СПОСОБ ФЕРМЕНТАТИВНОГО ПОЛУЧЕНИЯ L-АМИНОКИСЛОТ, ШТАММ БАКТЕРИЙ И ПОЛИНУКЛЕОТИД, ПРЕДНАЗНАЧЕННЫЙ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ПОЛИНУКЛЕОТИДОВ, КОДИРУЮЩИХ ПРОДУКТ ГЕНА ptsH - Google Patents
ПОЛИНУКЛЕОТИД, СОДЕРЖАЩИЙ НУКЛЕОТИДНУЮ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ, КОДИРУЮЩУЮ КОМПОНЕНТ Н СИСТЕМЫ ФОСФОТРАНСФЕРАЗЫ, ПЛАЗМИДНЫЙ ВЕКТОР, СПОСОБ ФЕРМЕНТАТИВНОГО ПОЛУЧЕНИЯ L-АМИНОКИСЛОТ, ШТАММ БАКТЕРИЙ И ПОЛИНУКЛЕОТИД, ПРЕДНАЗНАЧЕННЫЙ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ПОЛИНУКЛЕОТИДОВ, КОДИРУЮЩИХ ПРОДУКТ ГЕНА ptsH Download PDFInfo
- Publication number
- RU2268938C2 RU2268938C2 RU2001100696/13A RU2001100696A RU2268938C2 RU 2268938 C2 RU2268938 C2 RU 2268938C2 RU 2001100696/13 A RU2001100696/13 A RU 2001100696/13A RU 2001100696 A RU2001100696 A RU 2001100696A RU 2268938 C2 RU2268938 C2 RU 2268938C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- polynucleotide
- lysine
- gene
- sequence
- gene encoding
- Prior art date
Links
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 title claims abstract description 41
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 title claims abstract description 41
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 title claims abstract description 41
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 36
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 title claims abstract description 14
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 title claims abstract description 14
- 150000008575 L-amino acids Chemical class 0.000 title claims description 29
- 101150045242 ptsH gene Proteins 0.000 title claims description 27
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 title claims description 9
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 title claims description 8
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 title claims description 7
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 title description 4
- 101100138542 Cupriavidus necator (strain ATCC 17699 / DSM 428 / KCTC 22496 / NCIMB 10442 / H16 / Stanier 337) phbH gene Proteins 0.000 title 1
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 claims abstract description 43
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 claims abstract description 25
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims abstract description 20
- 235000019766 L-Lysine Nutrition 0.000 claims abstract description 16
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims abstract description 6
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 claims abstract description 5
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 claims abstract description 5
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 57
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 36
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 28
- 241000186226 Corynebacterium glutamicum Species 0.000 claims description 27
- WPLOVIFNBMNBPD-ATHMIXSHSA-N subtilin Chemical compound CC1SCC(NC2=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C(C)CC)C(=O)NC(=C)C(=O)NC(CCCCN)C(O)=O)CSC(C)C2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C1NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C1NC(=O)C(=C/C)/NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)CNC(=O)C(NC(=O)C(NC(=O)C2NC(=O)CNC(=O)C3CCCN3C(=O)C(NC(=O)C3NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(=C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(CCCCN)NC(=O)C(N)CC=4C5=CC=CC=C5NC=4)CSC3)C(C)SC2)C(C)C)C(C)SC1)CC1=CC=CC=C1 WPLOVIFNBMNBPD-ATHMIXSHSA-N 0.000 claims description 15
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 14
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 12
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 12
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 11
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 9
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- 235000018977 lysine Nutrition 0.000 claims description 9
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 6
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims description 4
- 230000035772 mutation Effects 0.000 claims description 4
- 230000006696 biosynthetic metabolic pathway Effects 0.000 claims description 3
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 claims description 3
- 238000002955 isolation Methods 0.000 claims description 3
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 claims description 3
- OSJPPGNTCRNQQC-UWTATZPHSA-N 3-phospho-D-glyceric acid Chemical compound OC(=O)[C@H](O)COP(O)(O)=O OSJPPGNTCRNQQC-UWTATZPHSA-N 0.000 claims description 2
- 108091000044 4-hydroxy-tetrahydrodipicolinate synthase Proteins 0.000 claims description 2
- 101100246032 Corynebacterium glutamicum (strain ATCC 13032 / DSM 20300 / BCRC 11384 / JCM 1318 / LMG 3730 / NCIMB 10025) ptsM gene Proteins 0.000 claims description 2
- 101100138654 Escherichia coli (strain K12) manZ gene Proteins 0.000 claims description 2
- 108010053763 Pyruvate Carboxylase Proteins 0.000 claims description 2
- 108010042687 Pyruvate Oxidase Proteins 0.000 claims description 2
- 102100039895 Pyruvate carboxylase, mitochondrial Human genes 0.000 claims description 2
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 claims description 2
- 101150033985 TPI gene Proteins 0.000 claims description 2
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 claims description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims description 2
- 101150011371 dapA gene Proteins 0.000 claims description 2
- 101150073818 gap gene Proteins 0.000 claims description 2
- 102000006602 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Human genes 0.000 claims description 2
- 108020004445 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Proteins 0.000 claims description 2
- 101150044424 lysE gene Proteins 0.000 claims description 2
- 101150053253 pgi gene Proteins 0.000 claims description 2
- 101150047627 pgk gene Proteins 0.000 claims description 2
- 229930029653 phosphoenolpyruvate Natural products 0.000 claims description 2
- 101150002133 ptsM gene Proteins 0.000 claims description 2
- 101150061612 rus gene Proteins 0.000 claims description 2
- 102000001253 Protein Kinase Human genes 0.000 claims 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims 1
- 230000037353 metabolic pathway Effects 0.000 claims 1
- 108060006633 protein kinase Proteins 0.000 claims 1
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 abstract description 9
- 241000186216 Corynebacterium Species 0.000 abstract description 6
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 5
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 4
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 abstract description 4
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 abstract 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 37
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 16
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 15
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 15
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 14
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 13
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 12
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 11
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 10
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 9
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 9
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 9
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 9
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 9
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 8
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 8
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 8
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 8
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 8
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 7
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 7
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 7
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 6
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 6
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 6
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 6
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 6
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 6
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 6
- 238000011160 research Methods 0.000 description 6
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 5
- 241001485655 Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 Species 0.000 description 5
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 5
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 5
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 5
- -1 linoleic acid, alcohols Chemical class 0.000 description 5
- 239000013605 shuttle vector Substances 0.000 description 5
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 5
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 4
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 4
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 4
- 239000006142 Luria-Bertani Agar Substances 0.000 description 4
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 4
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 4
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 4
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 4
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 4
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 4
- 230000002906 microbiologic effect Effects 0.000 description 4
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 4
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 4
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 4
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000238557 Decapoda Species 0.000 description 3
- KWYUFKZDYYNOTN-UHFFFAOYSA-M Potassium hydroxide Chemical compound [OH-].[K+] KWYUFKZDYYNOTN-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 108010084455 Zeocin Proteins 0.000 description 3
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000010923 batch production Methods 0.000 description 3
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 3
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 3
- 239000013601 cosmid vector Substances 0.000 description 3
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 3
- 235000019441 ethanol Nutrition 0.000 description 3
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 3
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 3
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 3
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 3
- CWCMIVBLVUHDHK-ZSNHEYEWSA-N phleomycin D1 Chemical compound N([C@H](C(=O)N[C@H](C)[C@@H](O)[C@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@H](O)C)C(=O)NCCC=1SC[C@@H](N=1)C=1SC=C(N=1)C(=O)NCCCCNC(N)=N)[C@@H](O[C@H]1[C@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](CO)O1)O[C@@H]1[C@H]([C@@H](OC(N)=O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1)O)C=1N=CNC=1)C(=O)C1=NC([C@H](CC(N)=O)NC[C@H](N)C(N)=O)=NC(N)=C1C CWCMIVBLVUHDHK-ZSNHEYEWSA-N 0.000 description 3
- 238000007747 plating Methods 0.000 description 3
- 238000012552 review Methods 0.000 description 3
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 3
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 3
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 3
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 2
- OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 100676-05-9 Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OCC1C(O)C(O)C(O)C(OC2C(OC(O)C(O)C2O)CO)O1 OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 2
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N Ammonia chloride Chemical compound [NH4+].[Cl-] NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N Ammonium hydroxide Chemical compound [NH4+].[OH-] VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 2
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 2
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 2
- 229930091371 Fructose Natural products 0.000 description 2
- 239000005715 Fructose Substances 0.000 description 2
- RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N Fructose Chemical compound OC[C@H]1O[C@](O)(CO)[C@@H](O)[C@@H]1O RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N 0.000 description 2
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 2
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 2
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 2
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 2
- 239000007993 MOPS buffer Substances 0.000 description 2
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N Maltose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 2
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 2
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 2
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 2
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 2
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 2
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 2
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000011114 ammonium hydroxide Nutrition 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 2
- GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N beta-maltose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N 0.000 description 2
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 2
- 235000010980 cellulose Nutrition 0.000 description 2
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 2
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 description 2
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 2
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 2
- 238000001212 derivatisation Methods 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 2
- ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L dipotassium hydrogen phosphate Chemical compound [K+].[K+].OP([O-])([O-])=O ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 2
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 2
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 2
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 2
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 2
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 2
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 2
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 2
- IPCSVZSSVZVIGE-UHFFFAOYSA-N hexadecanoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(O)=O IPCSVZSSVZVIGE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 2
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 2
- 101150066555 lacZ gene Proteins 0.000 description 2
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 235000013379 molasses Nutrition 0.000 description 2
- FEMOMIGRRWSMCU-UHFFFAOYSA-N ninhydrin Chemical compound C1=CC=C2C(=O)C(O)(O)C(=O)C2=C1 FEMOMIGRRWSMCU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000012856 packing Methods 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- GHSJKUNUIHUPDF-UHFFFAOYSA-N s-(2-aminoethyl)-l-cysteine Chemical compound NCCSCC(N)C(O)=O GHSJKUNUIHUPDF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 238000002791 soaking Methods 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 2
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 2
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 2
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 2
- 230000008961 swelling Effects 0.000 description 2
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 2
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 2
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 2
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 2
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 2
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 2
- PAWQVTBBRAZDMG-UHFFFAOYSA-N 2-(3-bromo-2-fluorophenyl)acetic acid Chemical compound OC(=O)CC1=CC=CC(Br)=C1F PAWQVTBBRAZDMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DVLFYONBTKHTER-UHFFFAOYSA-N 3-(N-morpholino)propanesulfonic acid Chemical compound OS(=O)(=O)CCCN1CCOCC1 DVLFYONBTKHTER-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101100298079 African swine fever virus (strain Badajoz 1971 Vero-adapted) pNG2 gene Proteins 0.000 description 1
- ATRRKUHOCOJYRX-UHFFFAOYSA-N Ammonium bicarbonate Chemical compound [NH4+].OC([O-])=O ATRRKUHOCOJYRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004254 Ammonium phosphate Substances 0.000 description 1
- 108010023063 Bacto-peptone Proteins 0.000 description 1
- 241000908115 Bolivar Species 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001517047 Corynebacterium acetoacidophilum Species 0.000 description 1
- 241000807905 Corynebacterium glutamicum ATCC 14067 Species 0.000 description 1
- 241000133018 Corynebacterium melassecola Species 0.000 description 1
- 241000337023 Corynebacterium thermoaminogenes Species 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 1
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 1
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 1
- 241001646716 Escherichia coli K-12 Species 0.000 description 1
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- 239000004395 L-leucine Substances 0.000 description 1
- 235000019454 L-leucine Nutrition 0.000 description 1
- BVHLGVCQOALMSV-JEDNCBNOSA-N L-lysine hydrochloride Chemical compound Cl.NCCCC[C@H](N)C(O)=O BVHLGVCQOALMSV-JEDNCBNOSA-N 0.000 description 1
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 1
- 235000021314 Palmitic acid Nutrition 0.000 description 1
- 235000019483 Peanut oil Nutrition 0.000 description 1
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 1
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 1
- OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N Phosphorus Chemical compound [P] OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010019653 Pwo polymerase Proteins 0.000 description 1
- 238000012181 QIAquick gel extraction kit Methods 0.000 description 1
- 235000021355 Stearic acid Nutrition 0.000 description 1
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L Sulfate Chemical compound [O-]S([O-])(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 235000019486 Sunflower oil Nutrition 0.000 description 1
- JZRWCGZRTZMZEH-UHFFFAOYSA-N Thiamine Natural products CC1=C(CCO)SC=[N+]1CC1=CN=C(C)N=C1N JZRWCGZRTZMZEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000319304 [Brevibacterium] flavum Species 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 1
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001099 ammonium carbonate Substances 0.000 description 1
- 235000012501 ammonium carbonate Nutrition 0.000 description 1
- 235000019270 ammonium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 229910000148 ammonium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019289 ammonium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 238000005571 anion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 230000000340 anti-metabolite Effects 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 239000002518 antifoaming agent Substances 0.000 description 1
- 229940100197 antimetabolite Drugs 0.000 description 1
- 239000002256 antimetabolite Substances 0.000 description 1
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 1
- 238000012365 batch cultivation Methods 0.000 description 1
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 1
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 1
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003240 coconut oil Substances 0.000 description 1
- 235000019864 coconut oil Nutrition 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 238000012364 cultivation method Methods 0.000 description 1
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 1
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- MNNHAPBLZZVQHP-UHFFFAOYSA-N diammonium hydrogen phosphate Chemical compound [NH4+].[NH4+].OP([O-])([O-])=O MNNHAPBLZZVQHP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AIUDWMLXCFRVDR-UHFFFAOYSA-N dimethyl 2-(3-ethyl-3-methylpentyl)propanedioate Chemical class CCC(C)(CC)CCC(C(=O)OC)C(=O)OC AIUDWMLXCFRVDR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910000396 dipotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019797 dipotassium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 description 1
- 235000013312 flour Nutrition 0.000 description 1
- 238000005187 foaming Methods 0.000 description 1
- 230000005714 functional activity Effects 0.000 description 1
- 230000005021 gait Effects 0.000 description 1
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 1
- 238000012215 gene cloning Methods 0.000 description 1
- 230000034659 glycolysis Effects 0.000 description 1
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 1
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 150000002484 inorganic compounds Chemical class 0.000 description 1
- 229910010272 inorganic material Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 229910000358 iron sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- BAUYGSIQEAFULO-UHFFFAOYSA-L iron(2+) sulfate (anhydrous) Chemical compound [Fe+2].[O-]S([O-])(=O)=O BAUYGSIQEAFULO-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229960003136 leucine Drugs 0.000 description 1
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 235000013372 meat Nutrition 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 239000013586 microbial product Substances 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- IDSXLJLXYMLSJM-UHFFFAOYSA-N morpholine;propane-1-sulfonic acid Chemical compound C1COCCN1.CCCS(O)(=O)=O IDSXLJLXYMLSJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- WQEPLUUGTLDZJY-UHFFFAOYSA-N n-Pentadecanoic acid Natural products CCCCCCCCCCCCCCC(O)=O WQEPLUUGTLDZJY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- QIQXTHQIDYTFRH-UHFFFAOYSA-N octadecanoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(O)=O QIQXTHQIDYTFRH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OQCDKBAXFALNLD-UHFFFAOYSA-N octadecanoic acid Natural products CCCCCCCC(C)CCCCCCCCC(O)=O OQCDKBAXFALNLD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000014593 oils and fats Nutrition 0.000 description 1
- 238000002515 oligonucleotide synthesis Methods 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 150000007524 organic acids Chemical class 0.000 description 1
- 235000005985 organic acids Nutrition 0.000 description 1
- 125000001477 organic nitrogen group Chemical group 0.000 description 1
- 238000012261 overproduction Methods 0.000 description 1
- 239000000312 peanut oil Substances 0.000 description 1
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 1
- 229940066779 peptones Drugs 0.000 description 1
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011574 phosphorus Substances 0.000 description 1
- 229920000151 polyglycol Polymers 0.000 description 1
- 239000010695 polyglycol Substances 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 208000019585 progressive encephalomyelitis with rigidity and myoclonus Diseases 0.000 description 1
- 230000004952 protein activity Effects 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 239000012266 salt solution Substances 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 238000007086 side reaction Methods 0.000 description 1
- 159000000000 sodium salts Chemical class 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 1
- 239000003549 soybean oil Substances 0.000 description 1
- 235000012424 soybean oil Nutrition 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 239000008117 stearic acid Substances 0.000 description 1
- 239000008174 sterile solution Substances 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 1
- 239000002600 sunflower oil Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 230000009897 systematic effect Effects 0.000 description 1
- 235000019157 thiamine Nutrition 0.000 description 1
- KYMBYSLLVAOCFI-UHFFFAOYSA-N thiamine Chemical compound CC1=C(CCO)SCN1CC1=CN=C(C)N=C1N KYMBYSLLVAOCFI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960003495 thiamine Drugs 0.000 description 1
- 239000011721 thiamine Substances 0.000 description 1
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 1
- 238000011426 transformation method Methods 0.000 description 1
- 239000012137 tryptone Substances 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 108700026220 vif Genes Proteins 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
- C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
- C12N9/1205—Phosphotransferases with an alcohol group as acceptor (2.7.1), e.g. protein kinases
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
- C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
- C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
- C12P13/08—Lysine; Diaminopimelic acid; Threonine; Valine
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Abstract
Изобретение относится к биотехнологии. Для получения L-лизина осуществляют ферментацию с использованием продуцирующего L-лизин штамма коринебактерий, в котором усиливают полинуклеотид, содержащий полинуклеотидную последовательность, кодирующую компонент Н системы фосфотрансферазы. Полученный L-лизин выделяют. Заявленное изобретение позволяет повысить эффективность синтеза коринебактериями L-лизина. 5 н. и 11 з.п. ф-лы, 3 ил., 1 табл.
Description
Настоящее изобретение относится к кодирующим нуклеотидным последовательностям гена ptsH и к способу ферментативного получения L-аминокислот, прежде всего L-лизина, с использованием коринебактерий, в которых усиливают ген ptsH.
Предпосылки создания изобретения
L-аминокислоты, прежде всего L-лизин, находят применение в медицине и в фармацевтической промышленности, но прежде всего в кормах для животных.
Известно, что L-аминокислоты получают ферментативным путем с использованием штаммов коринебактерий, прежде всего с использованием Corynebacterium glutamicum. Поскольку эти продукты имеют большое значение, постоянно ведется работа по совершенствованию способа их получения. Усовершенствования способа могут касаться технологических сторон процесса ферментации, таких как перемешивание и обеспечение кислородом, или состава питательных сред, например концентрации сахара в процессе ферментации, или переработки продукта, например, с помощью ионообменной хроматографии, или присущей самому микроорганизму продуктивности.
Для улучшения продуктивности этих микроорганизмов применяют методы мутагенеза, селекции и отбора мутантов. Таким путем получают штаммы, которые обладают устойчивостью к антиметаболитам, таким как аналог лизина S-(2-аминоэтил)цистеин, или которые являются ауксотрофами в отношении обладающих регуляторной функцией метаболитов и продуцируют L-лизин.
В течение ряда лет для улучшения продуцирующих L-аминокислоты штаммов Corynebacterium также применяют методы рекомбинантной ДНК, с помощью которых амплифицируют отдельные гены биосинтеза L-аминокислот и исследуют влияние на продуцирование L-аминокислот. Обзор работ в этой области можно найти среди прочего у Kinoshita ("Glutamic Acid Bacteria", Biology of Industrial Microorganisms, под ред. Demain и Solomon, изд-во Benjamin Cummings, London, Великобритания, 1985, 115-142), у Hilliger (BioTec 2, 40-44 (1991)), у Eggeling (Amino Acids 6, 261-272 (1994)), у Jetten и Sinskey (Critical Reviews in Biotechnology 15, 73-103 (1995)) и у Sahm и др. (Annuals of the New York Academy of Sciences 782, 25-39 (1996)).
Задача изобретения
Задачей изобретения является разработка новых подходов по усовершенствованию способа ферментативного получения L-аминокислот, прежде всего L-лизина.
Описание изобретения
L-аминокислоты, прежде всего L-лизин, находят применение в медицине, в фармацевтической промышленности и прежде всего в кормах для животных. Поэтому представляет большой интерес разработка нового более эффективного способа получения L-аминокислот, прежде всего L-лизина.
Если в дальнейшем упоминается L-лизин или лизин, то при этом подразумеваются не только сами эти основания, но и их соли, такие как моногидрохлорид лизина или сульфат лизина.
Объектом изобретения является выделенный из коринебактерий полинуклеотид, содержащий полинуклеотидную последовательность, выбранную из группы, включающей
а) полинуклеотид, идентичный по крайней мере на 70% полинуклеотиду, кодирующему полипептид, который содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 2,
б) полинуклеотид, кодирующий полипептид, который содержит аминокислотную последовательность, идентичную по крайней мере на 70% аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO: 2,
в) полинуклеотид, комплементарный полинуклеотидам, указанным в подпункте а) или б), и
г) полинуклеотид, содержащий по крайней мере 15 последовательных пар оснований полинуклеотидной последовательности, указанной в подпункте а), б) или в).
Объектом изобретения также является полинуклеотид, который представляет собой реплицируемую в коринебактериях, предпочтительно рекомбинантную, ДНК.
Объектом изобретения также является полинуклеотид, который представляет собой РНК.
Объектом изобретения является также полинуклеотид, который предпочтительно представляет собой реплицируемую ДНК и который содержит:
(I) нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 1, или
(II) по меньшей мере одну последовательность, которая соответствует последовательности, указанной в подпункте (I), в пределах вырожденности генетического кода, или
(III) по меньшей мере одну последовательность, которая гибридизуется с последовательностью, комплементарной последовательности, указанной в подпункте (I) или (II), и при необходимости
(IV) функционально нейтральные смысловые мутации в последовательности, указанной в подпункте (I).
Другими объектами изобретения являются следующие:
вектор, несущий указанный полинуклеотид, и
коринебактерии, служащие в качестве клеток-хозяев и содержащие указанный вектор.
Объектом изобретения являются также полинуклеотиды, которые практически представляют собой полинуклеотидную последовательность и которые могут быть получены путем скрининга с использованием гибридизации соответствующего банка генов, содержащего полный ген, который имеет полинуклеотидную последовательность, соответствующую SEQ ID NO: 1, с зондом, который имеет указанную полинуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 1, или ее фрагмент, и путем выделения указанной последовательности ДНК.
Полинуклеотидные последовательности по изобретению пригодны в качестве гибридизационных зондов для РНК, кДНК и ДНК для выделения полноразмерной кДНК, кодирующей компонент Н системы фосфотрансферазы (ptsH), и для выделения тех кДНК или генов, которые имеют высокую степень сходства с последовательностью гена компонента Н системы фосфотрансферазы.
Кроме того, полинуклеотидные последовательности по изобретению пригодны в качестве праймеров для получения с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) ДНК генов, кодирующих компонент Н системы фосфотрансферазы.
Такие олигонуклеотиды, которые служат в качестве зондов или праймеров, включают по крайней мере 30, предпочтительно по крайней мере 20, наиболее предпочтительно по крайней мере 15 последовательных пар оснований. Также могут использоваться олигонуклеотиды, имеющие длину по крайней мере 40 или 50 пар оснований.
Понятие "выделенный" в контексте настоящего изобретения относится к какому-либо элементу, выделенному из его естественного окружения.
Понятие "полинуклеотид" в целом относится к полирибонуклеотидам и полидезоксирибонуклеотидам, которые могут представлять собой как немодифицированную РНК или ДНК, так и модифицированную РНК или ДНК.
Понятие "полипептиды" означает пептиды или протеины, содержащие две или более аминокислот, которые связаны пептидными связями.
Полипептиды по изобретению включают полипептид, последовательность которого представлена в SEQ ID NO: 2, прежде всего полипептиды, обладающие биологической активностью компонента Н системы фосфотрансферазы, а также полипептиды, идентичные полипептиду, последовательность которого представлена в SEQ ID NO: 2, по крайней мере на 70%, предпочтительно по крайней мере на 80% и наиболее предпочтительно по крайней мере на 90-95%, и обладающие указанной активностью.
Объектом изобретения является также способ ферментативного получения L-аминокислот, прежде всего L-лизина, с использованием коринебактерий, прежде всего таких, которые уже обладают способностью продуцировать L-аминокислоты и в которых усиливают, прежде всего сверхэкспрессируют, кодирующие нуклеотидные последовательности гена ptsH.
В контексте настоящего описания понятие "усиление" означает повышение в микроорганизме внутриклеточной активности одного или нескольких ферментов, кодируемых соответствующей ДНК, за счет, например, увеличения количества копий гена или генов, использования более сильного промотора или гена, кодирующего соответствующий фермент с высокой активностью, и при необходимости за счет сочетания этих мер.
Микроорганизмы, являющиеся объектом настоящего изобретения, могут продуцировать L-аминокислоты, прежде всего L-лизин, из глюкозы, сахарозы, лактозы, фруктозы, мальтозы, мелассы, крахмала, целлюлозы или из глицерина и этанола. Они могут включать представителей коринебактерий, прежде всего из рода Corynebacterium. В роде Corynebacterium следует прежде всего отметить вид Corynebacterium glutamicum, который, как известно специалистам, обладает способностью продуцировать L-аминокислоты.
Пригодными штаммами бактерий р. Corynebacterium, прежде всего вида Corynebacterium glutamicum, являются прежде всего следующие известные штаммы дикого типа:
Corynebacterium glutamicum ATCC 13032,
Corynebacterium acetoglutamicum ATCC 15806,
Corynebacterium acetoacidophilum ATCC 13870,
Corynebacterium thermoaminogenes FERM BP-1539,
Corynebacterium melassecola ATCC 17965,
Brevibacterium flavum ATCC 14067,
Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869 и
Brevibacterium divaricatum ATCC 14020,
а также полученные из них мутанты, соответственно штаммы, продуцирующие L-лизин, такие как:
Corynebacterium glutamicum FERM-P 1709,
Brevibacterium flavum FERM-P 1708,
Brevibacterium lactofermentum FERM-P 1712,
Corynebacterium glutamicum FERM-P 6463,
Corynebacterium glutamicum PERM-P 6464 и
Corynebacterium glutamicum DSM 5715.
Авторам изобретения удалось выделить новый ген ptsH С. glutamicum, кодирующий компонент Н системы фосфотрансферазы.
Для выделения гена ptsH, а также других генов С. glutamicum сначала создают банк генов этого микроорганизма в Е.coli. Создание банка генов описано в широко известных учебниках и справочниках. В качестве примера можно назвать учебник Winnacker: Gene und Klone, Eine Einführung in die Gentechnologie (изд-во Chemie, Weinheim, Германия, 1990) или справочник Sambrook и др.: Molecular Cloning, A Laboratory Manual (изд-во Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989). Одним из широко известных банков генов является банк генов штамма Е.coli K-12 W3110, созданный Kohara и др. (Cell 50, 495-508 (1987)) в λ-векторах. У Bathe и др. (Molecular and General Genetics, 252: 255-265 (1996)) описан банк генов штамма С.glutamicum ATCC 13032, полученный с помощью космидного вектора SuperCos I (Wahl и др., Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 84: 2160-2164 (1987)) в штамме Е.coli K-12 NM554 (Raleigh и др., Nucleic Acids Research 16, 1563-1575 (1988)). В свою очередь у Börmann и др. (Molecular Microbiology 6(3), 317-326 (1992)) описан банк генов штамма С.glutamicum ATCC 13032, полученный с использованием космиды рНС79 (Hohn и Collins, Gene 11, 291-298 (1980)). Для создания банка генов С.glutamicum в Е.coli могут быть использованы также такие плазмиды, как pBR322 (Bolivar, Life Sciences, 25, 807-818 (1979)) или pUC9 (Vieira и др., Gene, 19: 259-268, (1982)). В качестве хозяев могут быть использованы прежде всего такие штаммы Е.coil, которые имеют дефекты, полученные в результате рестрикции и рекомбинации. Примером такого штамма является штамм DH5αmcr, описанный у Grant и др. (Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 87: 4645-4649 (1990)). Затем клонированные с помощью космид длинные фрагменты ДНК могут быть снова субклонированы в обычных пригодных для секвенирования ДНК векторах и после этого секвенированы, например, согласно методу, описанному у Sanger и др. (Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 74: 5463-5467, (1977)).
Таким способом была получена новая кодирующая последовательность ДНК гена ptsH С.glutamicum, которая в виде SEQ ID NO: 1 является составной частью настоящего изобретения. Кроме того, из данной последовательности ДНК с использованием описанных выше методов была выведена аминокислотная последовательность соответствующего протеина. Выведенная аминокислотная последовательность продукта гена ptsH представлена в SEQ ID NO: 2.
Кодирующие последовательности ДНК, которые получают из SEQ ID NO: 1 на основе вырожденности генетического кода, также являются составной частью изобретения. Кроме того, в данной области известны консервативные замены аминокислот в протеинах, такие как замена глицина на аланин или аспарагиновой кислоты на глутаминовую кислоту, так называемые "смысловые мутации", которые не приводят к существенному изменению активности протеина, т.е. являются функционально нейтральными. Кроме того, известно, что изменения на N- и/или на С-конце протеина не оказывают существенного влияния на его функциональную активность или даже могут стабилизировать ее. Соответствующую информацию можно найти среди прочего у Ben-Bassat и др. (Journal of Bacteriology 169, 751-757 (1987)), у O'Regan и др. (Gene 77: 237-251 (1989)), у Sahin-Toth и др. (Protein Sciences 3: 240-247 (1994)), у Hochuli и др. (Bio/Technology 6: 1321-1325 (1988)), а также в известных учебниках по генетике и молекулярной биологии. Аминокислотные последовательности, которые могут быть получены соответствующим образом из SEQ ID NO: 2, и последовательности ДНК, кодирующие такие аминокислотные последовательности, также являются составной частью изобретения.
Равным образом составной частью изобретения являются последовательности ДНК, которые гибридизуются с последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 1, или с частями последовательности, представленной в SEQ ID NO: 1. И, наконец, составной частью изобретения являются последовательности ДНК, которые могут быть созданы путем полимеразной цепной реакции (ПЦР) с использованием праймеров, полученных из SEQ ID NO: 1. Такие олигонуклеотиды, как правило, имеют длину по крайней мере 15 пар оснований.
Соответствующие рекомендации по идентификации последовательностей ДНК с помощью гибридизации можно найти, в частности, в справочнике "The DIG System Users Guide for Filter Hybridization" фирмы Boehringer Mannheim GmbH (Маннгейм, Германия, 1993) и у Liebl и др. (International Journal of Systematic Bacteriology, 41: 255-260 (1991)). Рекомендации касательно амплификации последовательностей ДНК с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) можно найти среди прочего в справочнике Gait: Oligonucleotide synthesis: a practical approach (изд-во IRL Press, Oxford, Великобритания, 1984) и у Newton и Graham: PCR (изд-во Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, Германия, 1994).
При создании изобретения было установлено, что в результате сверхэкспрессии гена ptsH может быть повышена эффективность синтеза коринебактериями L-аминокислот, прежде всего L-лизина.
Для достижения сверхэкспрессии может быть увеличено количество копий соответствующего гена или могут быть вызваны мутации в промоторной и регуляторной областях или сайте связывания рибосом, расположенном против хода транскрипции относительно структурного гена. Равным образом действуют кассеты экспрессии, встраиваемые против хода транскрипции относительно структурного гена. Кроме того, экспрессию можно дополнительно повышать в процессе ферментативного получения L-аминокислот с помощью индуцибельных промоторов. Экспрессия также может быть усилена за счет увеличения продолжительности жизни мРНК. Кроме того, ферментативная активность также может быть усилена путем ингибирования разложения протеинов ферментов. При этом гены или генные конструкции либо могут находиться в различном количестве копий в плазмидах, либо их интегрируют в хромосомы и амплифицируют. В альтернативном варианте сверхэкспрессия рассматриваемых генов также может быть достигнута путем изменения состава среды и условий культивирования.
Соответствующие рекомендации можно найти у Martin и др. (Bio/Technology 5, 137-146 (1987)), у Guerrero и др. (Gene 138, 35-41 (1994)), Tsuchiya и Morinaga (Bio/Technology 6, 428-430 (1988)), у Eikmanns и др. (Gene 102, 93-98 (1991)), в европейской заявке ЕР-В 0472869, в патенте US 4601893, у Schwarzer и Pühler (Bio/Technology 9, 84-87 (1991)), у Reinscheid и др. (Applied and Environmental Microbiology 60, 126-132 (1994)), у LaBarre и др. (Journal of Bacteriology 175, 1001-1007 (1993), в заявке WO 96/15246, у Malumbres и др. (Gene 134, 15-24 (1993)), в заявке JP-A-10-229891, у Jensen и Hammer (Biotechnology and Bioengineering 58, 191-195 (1998)), у Makrides (Microbiological Reviews 60: 512-538 (1996)) и в известных учебниках по генетике и молекулярной биологии.
Ген ptsH по изобретению может быть сверхэкспрессирован, например, с помощью плазмид.
В качестве таких плазмид могут быть использованы плазмиды, обладающие способностью реплицироваться в коринебактериях. Многочисленные известные плазмидные векторы, такие как pZ1 (Menkel и др., Applied and Environmental Microbiology 64: 549-554 (1989)), pEKEx1 (Eikmanns и др., Gene 102: 93-98 (1991)) или pHS2-1 (Sonnen и др., Gene 107: 69-74 (1991)), базируются на криптических плазмидах рНМ1519, pBL1 или pGA1. Равным образом могут быть использованы и другие плазмидные векторы, такие как векторы, базирующиеся на pCG4 (US 4489160), pNG2 (Serwold-Davis и др., FEMS Microbiological Letters 66, 119-124 (1990)) или pAG1 (US 5158891).
Кроме того, могут использоваться такие плазмидные векторы, с помощью которых можно применять способ амплификации гена путем интеграции в хромосому, как это описано, например, у Reinscheid и др. (Applied and Environmental Microbiology 60, 126-132 (1994)) применительно к дубликации, соответственно амплификации оперона hom-thrB. С помощью этого метода полноразмерный ген клонируют в плазмидном векторе, который может реплицироваться в определенном хозяине (обычно в Е.coli), но не в С.glutamicum. В качестве таких векторов могут использоваться, например, pSUP301 (Simon и др., Bio/Technology 1, 784-791 (1983)), pK18mob или pK19mob (Schäfer и др., Gene 145, 69-73 (1994)), pGEM-T (фирма Promega corporation, Мадисон, шт. Висконсин, США), pCR2.1-TOPO (Shuman, Journal of Biological Chemistry, 269: 32678-32684 (1994), US 5487993), pCR®Blunt (фирма Invitrogen, Groningen, Нидерланды; Bernard и др., Journal of Molecular Biology, 234: 534-541 (1993)) или pEM1 (Schrumpf и др., Journal of Bacteriology 173: 4510-4516 (1991)). Затем плазмидный вектор, содержащий подлежащий амплификации ген, переносят путем конъюгации или трансформации в соответствующий штамм С. glutamicum. Метод конъюгации описан, например, у Schäfer и др. (Applied and Environmental Microbiology 60, 756-759 (1994)). Методы трансформации описаны, например, у Thierbach и др. (Applied Microbiology and Biotechnology 29, 356-362 (1988)), у Dunican и Shivnan (Bio/Technology 7, 1067-1070 (1989)) и у Tauch и др. (FEMS Microbiological Letters 123, 343-347 (1994)). В результате гомологичной рекомбинации с помощью одного кроссинговера образовавшийся штамм содержит по крайней мере две копии рассматриваемого гена.
Еще одним объектом изобретения является способ ферментативного получения L-аминокислот, прежде всего L-лизина, согласно которому применяют штамм, трансформированный плазмидным вектором, который несет нуклеотидную последовательность гена, кодирующего компонент Н системы фосфотрансферазы.
Кроме того, для повышения эффективности синтеза L-аминокислот, прежде всего L-лизина, может оказаться предпочтительным наряду с геном ptsH дополнительно усиливать другие гены пути биосинтеза целевой L-аминокислоты, сверхэкспрессируя тем самым один или несколько ферментов, участвующих в соответствующем пути биосинтеза, в гликолизе, анаплеротическом обмене веществ или экспорте аминокислот.
Так, например, для получения L-лизина можно одновременно сверхэкспрессировать один или несколько генов, выбранных из группы, включающей
- ген dapA, кодирующий дигидродипиколинат-синтазу (ЕР-В 0197335),
- ген gap, кодирующий глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназу (Eikmanns и др., Journal of Bacteriology 174: 6076-6086 (1992)),
- ген tpi, кодирующий триозофосфатизомеразу (Eikmanns и др., Journal of Bacteriology 174: 6076-6086 (1992)),
- ген pgk, кодирующий 3-фосфоглицераткиназу (Eikmanns, Journal of Bacteriology 174: 6076-6086 (1992)),
- ген ptsM, кодирующий компонент М системы фосфоенолпируват-сахар-фосфотрансферазы (ptsM) (Lee и др., FEMS Microbiology Letters, 1-2, 137-145 (1994)),
- ген рус, кодирующий пируваткарбоксилазу (DE-A 19831609), и
- ген lysE, обеспечивающий экспорт лизина (DE-A 19548222).
Кроме того, для продуцирования L-аминокислот, прежде всего L-лизина, может оказаться целесообразным наряду с усилением гена ptsH одновременно ослаблять
- ген pck, кодирующий фосфоенолпируваткарбоксикиназу (DE 19950409.1 DSM 13047), и/или
- ген pgi, кодирующий глюкозо-6-фосфатизомеразу (US 09/396478, DSM 12969),
- ген рох, кодирующий пируватоксидазу (DE 19846499.1 DSM 13114).
Кроме того, для продуцирования L-аминокислот, прежде всего L-лизина, может оказаться целесообразным наряду со сверхэкспрессией гена ptsH исключить нежелательные побочные реакции (Nakayama: "Breeding of Amino Acid Producing Microorganisms", Overproduction of Microbial Products, под ред. Krumphanzl, Sikyta, Vanek, изд-во Academic Press, London, Великобритания, 1982).
Для продуцирования L-аминокислот, прежде всего L-лизина, созданные согласно изобретению микроорганизмы можно культивировать непрерывно или периодически с использованием периодического процесса (культивирование партий) или периодического процесса с подпиткой, либо периодического процесса с повторяющейся подпиткой. Обзор известных способов культивирования представлен в учебнике Chmiel (Bioprozesstechnik 1. Einführung in die Bioverfahrenstechnik (изд-во Gustav Fischer, Stuttgart, 1991)) или в учебнике Storhas (Bioreaktoren und periphere Einrichtungen (изд-во Vieweg, Braunschweig/Wiesbaden, 1994)).
Используемая культуральная среда должна быть соответствующим образом адаптирована к требованиям конкретного штамма. Описания культуральных сред для различных микроорганизмов содержатся в справочнике "Manual of Methods for General Bacteriology" Американского общества бактериологии (Вашингтон, округ Колумбия, США, 1981). В качестве источника углерода могут быть использованы сахара и углеводы, такие как глюкоза, сахароза, лактоза, фруктоза, мальтоза, меласса, крахмал и целлюлоза, масла и жиры, такие как соевое масло, подсолнечное масло, арахисовое масло и кокосовое масло, жирные кислоты, такие как пальмитиновая кислота, стеариновая кислота и линолевая кислота, спирты, такие как глицерин и этанол, и органические кислоты, такие как уксусная кислота. Эти вещества могут применяться по отдельности или в виде смеси. В качестве источника азота могут применяться органические азотсодержащие соединения, такие как пептоны, дрожжевой экстракт, мясной экстракт, солодовый экстракт, жидкость, образующаяся после замачивания зерен кукурузы до разбухания, соевая мука и мочевина, или неорганические соединения, такие как сульфат аммония, хлорид аммония, фосфат аммония, карбонат аммония и нитрат аммония. Источники азота могут применяться по отдельности или в виде смеси. В качестве источника фосфора могут применяться фосфорная кислота, кислый фосфат калия или дикалийгидрофосфат, либо соответствующие натриевые соли. Кроме того, культуральная среда должна содержать соли металлов, такие как сульфат магния или сульфат железа, которые необходимы для роста. И, наконец, в дополнение к вышеназванным соединениям могут использоваться такие важные для роста вещества, как аминокислоты и витамины. Помимо этого в культуральную среду могут быть добавлены соответствующие предшественники. Вышеуказанные добавки могут быть введены в культуральную среду в виде одноразовой добавки или добавляться соответствующим образом в процессе культивирования.
Для контроля значения рН культуральной среды используют соответственно либо основания, такие как гидроксид натрия, гидроксид калия, аммиак, соответственно аммиачную воду, либо кислоты, такие как фосфорная кислота или серная кислота. Для контроля пенообразования добавляют антивспениватели, такие как полигликолевые эфиры жирных кислот. Для поддержания стабильности плазмид могут быть добавлены соответствующие конкретной среде вещества, обладающие избирательным действием, например антибиотики. Для поддержания аэробных условий в культуру вводят кислород или содержащие кислород газовые смеси, например воздух. Температура культуральной среды в норме составляет от 20°С до 45°С, предпочтительно от 25°С до 40°С. Культивирование продолжают до тех пор, пока не образуется максимальное количество L-лизина. Как правило, эта цель достигается за 10-160 ч.
Еще одним объектом изобретения в соответствии с этим является способ ферментативного получения L-аминокислот, прежде всего L-лизина, согласно которому осуществляют следующие стадии:
а) ферментацию с использованием продуцирующих L-аминокислоту коринебактерий, в которых усиливают, прежде всего сверхэкспрессируют, по крайней мере ген, кодирующий компонент Н системы фосфотрансферазы,
б) накопление L-аминокислоты в среде или в клетках бактерий и
в) выделение L-аминокислоты.
Анализ L-лизина можно проводить с помощью анионообменной хроматографии с последующей дериватизацией с обнаружением нингидрином согласно методу, описанному у Spackman и др. (Analytical Chemistry, 30, 1190 (1958)).
Способ по изобретению предназначен для ферментативного получения L-аминокислот, прежде всего L-лизина.
Примеры
Ниже настоящее изобретение проиллюстрировано на примерах его осуществления.
Пример 1
Создание геномного космидного банка генов штамма Corynebacterium glutamicum ATCC 13032
Хромосомную ДНК выделяли из штамма Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 по методу, описанному у Tauch и др. (Plasmid 33: 168-179 (1995)), и частично расщепляли рестриктазой Sau3AI (фирма Amersham Pharmacia, Фрейбург, Германия, описание продукта Sau3AI: продукт №27-0913-02). Фрагменты ДНК дефосфорилировали щелочной фосфатазой креветки (ЩФК) (фирма Roche Molecular Biochemicals, Маннгейм, Германия, описание продукта ЩФК: продукт №1758250). ДНК космидного вектора SuperCos I (Wahl и др., Proceedings of the National Academy of Sciences USA 84: 2160-2164 (1987)), полученного от компании Stratagene (Ла Джолла, США, описание продукта, представляющего собой набор SuperCos I Cosmid Vector Kit: продукт №251301), расщепляли рестриктазой XbaI (фирма Amersham Pharmacia, Фрейбург, Германия, описание продукта XbaI: продукт №27-0948-02) и также дефосфорилировали щелочной фосфатазой креветки. Затем космидную ДНК расщепляли рестриктазой BamHI (фирма Amersham Pharmacia, Фрейбург, Германия, описание продукта BamHI: продукт №27-0868-04). Обработанную таким образом космидную ДНК смешивали с обработанной ДНК штамма АТСС 13032 и смесь обрабатывали ДНК-лигазой фага Т4 (фирма Amersham Pharmacia, Фрейбург, Германия, описание продукта ДНК-лигазы фага Т4: продукт №27-0870-04). Полученный в результате лигирования продукт встраивали затем в фаги с помощью наборов Gigapack II XL Packing Extract (фирма Stratagene, Ла Джолла, США, описание продукта, представляющего собой набор Gigapack II XL Packing Extract: продукт №200217). Для инфицирования штамма Е.coli NM554 (Raleigh и др., Nucleic Acid Research 16: 1563-1575 (1988)) клетки переносили в 10 мМ MgSO4 и смешивали с аликвотным количеством суспензии фага. Инфицирование и титрование космидного банка осуществляли в соответствии с методом, описанным у Sambrook и др. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor (1989)), при этом клетки высевали на LB-arap (Lennox, Virology, 1: 190 (1955)), содержащий 100 мкг/мл ампициллина. После инкубации в течение ночи при 37°С отбирали отдельные рекомбинантные клоны.
Пример 2
Выделение и секвенирование гена ptsH
Космидную ДНК из отдельной колонии выделяли с помощью набора Qiaprep Spin Miniprep Kit (продукт №27106, фирма Qiagen, Гильден, Германия) согласно инструкциям производителя и частично расщепляли рестриктазой Sau3AI (фирма Amersham Pharmacia, Фрейбург, Германия, описание продукта Sau3AI: продукт №27-0913-02). Фрагменты ДНК дефосфорилировали щелочной фосфатазой креветки (фирма Roche Molecular Biochemicals, Маннгейм, Германия, описание продукта ЩФК: продукт №1758250). После разделения с помощью гель-электрофореза выделяли фрагменты космиды, имеющие размеры в интервале от 1500 до 2000 пар оснований, с использованием набора QiaExII Gel Extraction Kit (продукт №20021, фирма Qiagen, Гильден, Германия). ДНК секвенирующего вектора pZero-1, полученного от компании Invitrogen (Гронинген, Нидерланды, описание продукта, представляющего собой набор Zero Background Cloning Kit: продукт №K2500-01), расщепляли рестриктазой BamHI (фирма Amersham Pharmacia, Фрейбург, Германия, описание продукта BamHI: продукт №27-0868-04). Встраивание фрагментов космиды в секвенирующий вектор pZero-1 путем лигирования осуществляли по методу, описанному у Sambrook и др. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor (1989)), при этом смесь ДНК инкубировали в течение ночи с лигазой фага Т4 (фирма Pharmacia Biotech, Фрейбург, Германия). Затем этот полученный в результате лигирования продукт встраивали путем электропорации (Tauch и др., FEMS Microbiol. Letters, 123: 343-347 (1994)) в штамм Е.coli DH5αmcr (Grant, Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 87: 4645-4649 (1990)) и высевали на LB-агар (Lennox, Virology, 1: 190 (1955)), содержащий 50 мкг/мл зеоцина. Плазмиду выделяли из рекомбинантных клонов с помощью устройства Biorobot 9600 (продукт №900200, фирма Qiagen, Гильден, Германия). Секвенирование проводили с помощью дидезокси-метода на основе разрыва цепи, описанного у Sanger и др. (Proceedings of the National Academy of Sciences USA 74: 5463-5467 (1977)), с модификациями согласно Zimmermann и др. (Nucleic Acids Research, 18: 1067 (1990)). Использовали набор "RR dRhodamin Terminator Cycle Sequencing Kit" фирмы РЕ Applied Biosystems (продукт №403044, Вейтерштадт, Германия). Разделение с помощью гель-электрофореза и анализ результатов реакции секвенирования проводили в геле "Rotiphorese NF Akrylamid/Bisakrylamid" (29:1) (продукт №А124.1, фирма Roth, Карлсруэ, Германия) с использованием секвенатора типа "ABI Prism 377" фирмы РЕ Applied Biosystems (Вейтерштадт, Германия).
Полученные первичные данные о последовательностях затем обрабатывали с использованием пакета программ Staden (Nucleic Acids Research, 14: 217-231 (1986)), версия 97-0. Отдельные последовательности производных pZero-1 объединяли в непрерывную группу последовательностей. Компьютерный анализ кодирующей области проводили с использованием программы XNIP (Staden, Nucleic Acids Research, 14: 217-231 (1986)). Дальнейшие анализы проводили с помощью программы "BLAST search programs" (Altschul и др., Nucleic Acids Research, 25: 3389-3402 (1997)) на основе неизбыточного банка данных Национального центра биотехнологической информации (NCBI, Бетезда, шт. Мэриленд, США).
Полученная нуклеотидная последовательность представлена в SEQ ID NO: 1. Анализ нуклеотидной последовательности позволил выявить открытую рамку считывания длиной 267 пар оснований, которую обозначили как ген ptsH. Ген ptsH кодирует протеин, состоящий из 89 аминокислот.
Пример 3
Создание челночного вектора pEC-K18mob2ptsHexp для усиления гена ptsH в С. glutamicum
3.1. Клонирование гена ptsH в векторе pCR®Blunt II
Из штамма АТСС 13032 выделяли хромосомную ДНК согласно методу, описанному у Eikmanns и др. (Microbiology 140, 1817-1828 (1994)). На основе известной последовательности гена ptsH из С.glutamicum, полученной согласно примеру 2, выбирали следующие олигонуклеотиды для полимеразной цепной реакции:
ptsHexp1:
5'-АСС ACT GGT GCA АТС ТСС АТ-3';
ptsHexp2:
5'-ТТТ ACT CAG CGT САА GGT СС-3'.
Указанные праймеры были синтезированы фирмой ARK Scientific GmbH Biosystems (Дармштадт, Германия), а ПЦР проводили согласно стандартному методу, описанному у Innis и др. (PCR protocols. A guide to methods and applications, изд-во Academic Press (1990)) с использованием полимеразы Pwo фирмы Roche Diagnostics GmbH (Маннгейм; Германия). С помощью полимеразной цепной реакции с использованием указанных праймеров оказалось возможным амплифицировать фрагмент ДНК длиной 686 пар оснований, несущий ген ptsH с возможной промоторной областью. Последовательность ДНК амплифицированного фрагмента ДНК проверяли путем секвенирования.
Амплифицированный фрагмент ДНК встраивали путем лигирования с помощью набора Zero Blunt™ фирмы Invitrogen Corporation (Карлсбад, шт. Калифорния, США; каталожный номер К2700-20) в вектор pCR®Blunt II (Bernard и др., Journal of Molecular Biology, 234: 534-541 (1993)).
Затем полученный в результате лигирования продукт встраивали путем электропорации (Hanahan, DNA cloning. A practical approach, т.I, изд-во IRL Press, Oxford, Washington D.C., США (1985)) в штамм Е.coli ТОР10. Отбор несущих плазмиду клеток осуществляли путем посева полученного в результате трансформации продукта на LB-агар (Sambrook и др., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2-е изд., изд-во Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)), дополненный 25 мг/л канамицина. Из одного трансформанта выделяли плазмидную ДНК с помощью набора QIAprep Spin Miniprep Kit фирмы Qiagen и анализировали путем рестрикции с помощью рестриктазы EcoRI и последующего электрофореза на агарозном геле (0,8%-ном). Плазмиду обозначили как pCRB1-ptsHexp, и она представлена на фиг.1.
3.2. Конструирование челночного вектора pEC-K18mob2, способного реплицироваться в Е.coli и в С.glutamicum
Челночный вектор, способный реплицироваться в Е.coli и в С.glutamicum, конструировали согласно известному методу. Этот вектор содержал область репликации rep из плазмиды pGA1, включая эффектор репликации per (US 5175108; Nesvera и др., Journal of Bacteriology 179, 1525-1532 (1997)), обусловливающий устойчивость к канамицину ген aph(3')-IIa транспозона Тn5 (Beck и др., Gene 19, 327-336 (1982)), область репликации oriV плазмиды pMB1 (Sutcliffe, Cold Spring Harbor Symposium on Quantitative Biology 43, 77-90 (1979)), фрагмент гена lacZα, включая промотор lac и множественный сайт клонирования (mcs) (Norrander и др., Gene 26, 101-106 (1983)), и область mob плазмиды RP4 (Simon и др., Bio/Technology 1: 784-791 (1983)). Сконструированным вектором трансформировали штамм Е.coli DH5αmcr (Hanahan, DNA cloning. A practical approach, т.I, изд-во IRL Press, Oxford, Washington D.C., США). Отбор несущих плазмиду клеток осуществляли путем посева полученного в результате трансформации продукта на LB-агар (Sambrook и др., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2-е изд., изд-во Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.), дополненный 25 мг/л канамицина. Из одного трансформанта выделяли плазмидную ДНК с помощью набора QIAprep Spin Miniprep Kit фирмы Qiagen и анализировали путем рестрикции с помощью рестриктаз EcoRI и HindIII и последующего электрофореза на агарозном геле (0,8%-ном). Плазмиду обозначили как pEC-K18mob2, и она представлена на фиг.2.
В соответствии с Будапештским договором в Немецкой коллекции микроорганизмов и клеточных культур (DSMZ, Брауншвейг, Германия) был депонирован следующий микроорганизм:
- штамм С.glutamicum DSM 5715/pEC-K18mob2 под регистрационным номером DSM 13245.
3.3. Клонирование ptsH в челночном векторе pEC-K18mob2, способном реплицироваться в Е.coli и в С.glutamicum
Для клонирования гена ptsH в описанном в примере 3.2. челночном векторе pEC-K18mob2, способном реплицироваться в Е.coli и в С.glutamicum, плазмидную ДНК pEC-K18mob2 полностью расщепляли рестриктазами KpnI и XbaI и обрабатывали щелочной фосфатазой (щелочная фосфатаза, фирма Roche Diagnostics GmbH, Маннгейм, Германия).
Вектор pCRB1-ptsHexp выделяли из штамма Escherichia coli Top10 и полностью расщепляли рестриктазами KpnI и XbaI и фрагмент гена ptsH длиной 788 пар оснований выделяли на 0,8%-ном агарозном геле (набор QIAquick Gel Extraction Kit фирмы Qiagen, Гильден, Германия). Затем фрагмент гена ptsH встраивали путем лигирования в вектор pEC-K18mob2 (лигаза фага Т4, фирма Roche Diagnostics GmbH, Маннгейм, Германия). Полученным в результате лигирования продуктом трансформировали штамм Е.coli DH5αmcr (Hanahan, DNA cloning. A practical approach, т.I, изд-во IRL Press, Oxford, Washington D.C., США). Отбор несущих плазмиду клеток осуществляли путем посева полученного в результате трансформации продукта на LB-агар (Sambrook и др., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2-е изд., изд-во Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)), дополненный 25 мг/л канамицина. Из одного трансформанта выделяли плазмидную ДНК с использованием набора QIAprep Spin Miniprep Kit фирмы Qiagen (Гильден, Германия) и анализировали путем обработки рестриктазой EcoRI и последующего электрофореза на агарозном геле. Полученную плазмиду обозначили как pEC-K18mob2ptsHexp, и она представлена на фиг.3.
Штамм обозначили как Е.coli DH5αmcr/pEC-K18mob2ptsHexp, и он в соответствии с Будапештским договором был депонирован в виде чистой культуры 28 ноября 2000 г. в Немецкой коллекции микроорганизмов и клеточных культур (DSMZ, Брауншвейг, Германия) под регистрационным номером DSM 13878.
Пример 4
Трансформация штамма DSM 5715 плазмидой pEC-K18mob2ptsHexp
Штамм DSM 5715 трансформировали плазмидой pEC-K18mob2ptsHexp с помощью метода электропорации, описанного у Liebl и др. (FEMS Microbiological Letters, 53: 299-303 (1989)). Отбор трансформантов осуществляли на LBHIS-агаре, содержащем 18,5 г/л бульона, используемого для инфузии в мозг и сердце, 0,5М сорбит, 5 г/л бакто-триптона, 2,5 г/л экстракта бакто-дрожжей, 5 г/л NaCl и 18 г/л бакто-агара и дополненном 25 мг/л канамицина. Инкубацию проводили в течение 2 дней при 33°С.
Плазмидную ДНК из одного трансформанта выделяли обычными методами (Peters-Wendisch и др., Microbiology, 144, 915-927 (1998)), расщепляли с помощью рестриктазы EcoRI и затем плазмиду анализировали с помощью электрофореза на агарозном геле. Полученный штамм обозначили как DSM 5715/pEC-K18mob2ptsHexp.
Пример 5
Получение лизина
Созданный согласно примеру 4 штамм DSM 5715/pEC-K18mob2ptsHexp культивировали в питательной среде, пригодной для получения лизина, и определяли содержание лизина в надосадочной жидкости культуры.
Для этого штамм сначала инкубировали в течение 24 ч при 33°С на агаровой пластине, содержащей соответствующий антибиотик (агар со средой, используемой для инфузии в мозг и сердце, дополненной канамицином (25 мг/л)). Этой культурой, выращенной на агаровой пластине, инфицировали предварительную культуру (10 мл среды в колбе Эрленмейера объемом 100 мл), В качестве среды для предварительной культуры использовали полную среду CgIII.
Состав среды CgIII:
| NaCl | 2,5 г/л |
| бакто-пептон | 10 г/л |
| экстракт бакто-дрожжей | 10 г/л |
| глюкоза (автоклавированная отдельно) | 2% (мас./об.) |
Значение рН доводили до 7,4.
Среду дополняли канамицином (25 мг/л). Предварительную культуру инкубировали в течение 16 ч при 33°С на шейкере при 240 об/мин. Этой предварительной культурой инфицировали основную культуру таким образом, чтобы начальная оптическая плотность ОП (660 нм) основной культуры составляла 0,05. В качестве среды для основной культуры использовали среду ММ.
Состав среды ММ:
ЖЗК (жидкость, образующаяся при замачивании
| зерен кукурузы до разбухания) | 5 г/л |
| МОПС (морфолинпропансульфоновая кислота) | 20 г/л |
| глюкоза (автоклавированная отдельно) | 100 г/л |
| соли (NH4)2SO4 | 25 г/л |
| КН2PO4 | 0,1 г/л |
| MgSO4•7H2O | 1,0 г/л |
| CaCl•2H2O | 10 мг/л |
| FeSO4•7H2O | 10 мг/л |
| MnSO4•H2O | 5,0 мг/л |
| биотин (стерилизованный фильтрацией) | 0,3 мг/л |
| тиамин·HCl (стерилизованный фильтрацией) | 0,2 мг/л |
| L-лейцин (стерилизованный фильтрацией) | 0,1 г/л |
| СаСО3 | 25 г/л |
Значения рН ЖЗК, МОПС и раствора солей доводили до 7 с помощью аммиачной воды и эти растворы автоклавировали. Затем добавляли стерильные растворы субстрата и витаминов, а также безводный автоклавированный СаСО3.
Культивирование осуществляли в колбе Эрленмейера объемом 100 мл с дефлекторами, в которую помещали 10 мл среды. В среду добавляли канамицин (25 мг/л). Культивирование осуществляли при 33°С и 80%-ной относительной влажности воздуха.
Через 48 ч и 72 ч с помощью прибора типа Biomek 1000 (фирма Beckmann Instruments GmbH, Мюнхен) определяли ОП при длине волны 660 нм. Концентрацию образовавшегося лизина определяли с помощью анализатора аминокислот фирмы Eppendorf-BioTronik (Гамбург, Германия) с использованием ионообменной хроматографии и последующей дериватизации на колонках с обнаружением нингидрином.
В таблице 1 представлены результаты опыта.
| Таблица 1 | ||
| Штамм | ОП (660 нм) | Лизин·HCl, г/л |
| DSM 5715/pEC-K18mob2 (48 ч) | 11,4 | 14,14 |
| DSM 5715/pEC-K18mob2ptsHexp (48 ч) | 10,7 | 15,98 |
| DSM 5715/pEC-K18mob2 (72 ч) | 10,1 | 15,24 |
| DSM 5715/pEC-K18mob2ptsHexp (72 ч) | 10,0 | 17,13 |
На прилагаемых к описанию чертежах показано:
на фиг.1 - карта плазмиды pCRBl-ptsHexp,
на фиг.2 - карта плазмиды pEC-K18mob2,
на фиг.3 - карта плазмиды pEC-K18mob2ptsHexp.
| Использованные сокращения и обозначения имеют следующие значения: | |
| Kan: | ген устойчивости к канамицину, |
| Zeocin: | ген устойчивости к зеоцину, |
| ptsH: | ген ptsH С.glutamicum, |
| Co1E1: | начало репликации плазмиды Co1E1, |
| lacZ-alpha: | фрагмент гена lacZ из Е.coil, |
| lacZ-alpha': | фрагмент фрагмента гена lacZ из Е.coli, |
| per: | ген контроля количества копий из плазмиды pGA1, |
| oriV: | сходное с Co1E1 начало репликации плазмиды рМВ1, |
| rep: | кодируемая плазмидой область репликации плазмиды pGA1 С. glutamicum, |
| RP4mob: | сайт мобилизации плазмиды RP4, |
| EcoRI: | сайт рестрикции рестриктазы EcoRI, |
| HindIII: | сайт рестрикции рестриктазы HindIII, |
| KpnI: | сайт рестрикции рестриктазы KpnI, |
| XbaI: | сайт рестрикции рестриктазы XbaI. |
Claims (16)
1. Полинуклеотид, содержащий полинуклеотидную последовательность, кодирующую компонент Н системы фосфотрансферазы и выбранную из группы, включающей
а) полинуклеотид, идентичный по крайней мере на 70% полинуклеотиду, кодирующему полипептид, который содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:2,
б) полинуклеотид, кодирующий полипептид, который содержит аминокислотную последовательность, идентичную по крайней мере на 70% аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO:2,
в) полинуклеотид, комплементарный полинуклеотидам, указанным в подпункте а) или б).
2. Полинуклеотид по п.1, который представляет собой реплицируемую в коринебактериях предпочтительно рекомбинантную ДНК.
3. Полинуклеотид по п.1, который представляет собой РНК.
4. Полинуклеотид по п.2, который представляет собой реплицируемую ДНК, включающую
(I) нуклеотидную последовательность, представленную в SEQ ID NO:1, или
(II) по крайней мере одну последовательность, которая соответствует последовательности, указанной в подпункте (I), в пределах вырожденности генетического кода или
(III) по крайней мере одну последовательность, которая гибридизуется с последовательностью, комплементарной последовательности, указанной в подпункте (I) или (II) и при необходимости
(IV) функционально нейтральные смысловые мутации в последовательности, указанной в подпункте (I).
5. Полинуклеотид по п.2, который содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид с аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 2.
6. Плазмидный вектор экспрессии, содержащий полинуклеотидную последовательность по п.1.
7. Способ ферментативного получения L-лизина, отличающийся тем, что осуществляют следующие стадии:
а) ферментацию с использованием продуцирующего L-лизин штамма коринебактерий, в которых усиливают, прежде всего сверхэкспрессируют, по крайней мере один из полинуклеотидов согласно п.1,
б) накопление L-лизина в среде или в клетках штамма и
в) выделение L-лизина.
8. Способ по п.7, отличающийся тем, что применяют штаммы, в которых дополнительно усиливают другие гены пути биосинтеза целевой L-аминокислоты.
9. Способ по п.7, отличающийся тем, что применяют штаммы, в которых по крайней мере частично подавляют пути обмена веществ, препятствующие образованию L-аминокислоты.
10. Способ по п.7, отличающийся тем, что применяют штамм, трансформированный плазмидным вектором по п.6.
11. Способ по любому из пп.7-10, отличающийся тем, что применяют штаммы, продуцирующие L-лизин.
12. Способ по п.8, отличающийся тем, что одновременно усиливают, прежде всего сверхэкспрессируют или амплифицируют, один или несколько генов, выбранных из группы, включающей
ген dapA, кодирующий дигидродипиколинат-синтазу,
ген рус, кодирующий пируваткарбоксилазу,
ген tpi, кодирующий триозофосфатизомеразу,
ген gap, кодирующий глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназу,
ген ptsM, кодирующий компонент М системы фосфоенолпируват-сахар-фосфотрансферазы (ptsM),
ген pgk, кодирующий 3-фосфоглицераткиназу и
ген lysE, обеспечивающий экспорт лизина.
13. Способ по п.9, отличающийся тем, что для продуцирования L-лизина применяют штаммы, в которых одновременно ослабляют один или несколько генов, выбранных из группы, включающей
ген pck, кодирующий фосфоенолпируваткарбоксикиназу,
ген pgi, кодирующий глюкозо-6-фосфатизомеразу,
ген рох, кодирующий пируватоксидазу.
14. Способ по любому из пп.8-14, отличающийся тем, что применяют штаммы Corynebacterium glutamicum.
15. Штамм бактерий Corynebacterium glutamicum DSM 5715/pEC-K18mob2ptsHesp - продуцент L-лизина.
16. Полинуклеотид, содержащий по крайней мере 15 последовательных пар оснований полинуклеотидной последовательности, указанной в подпункте а), б) или в) по п.1 и предназначенный для получения полинуклеотидов, кодирующих продукт гена ptsH (или компонент Н системы фосфотрансферазы).
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE10001101.2 | 2000-01-13 | ||
| DE10001101A DE10001101A1 (de) | 2000-01-13 | 2000-01-13 | Neue für das ptsH-Gen codierende Nukleotidsequenzen |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2001100696A RU2001100696A (ru) | 2003-03-27 |
| RU2268938C2 true RU2268938C2 (ru) | 2006-01-27 |
Family
ID=7627360
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2001100696/13A RU2268938C2 (ru) | 2000-01-13 | 2001-01-12 | ПОЛИНУКЛЕОТИД, СОДЕРЖАЩИЙ НУКЛЕОТИДНУЮ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ, КОДИРУЮЩУЮ КОМПОНЕНТ Н СИСТЕМЫ ФОСФОТРАНСФЕРАЗЫ, ПЛАЗМИДНЫЙ ВЕКТОР, СПОСОБ ФЕРМЕНТАТИВНОГО ПОЛУЧЕНИЯ L-АМИНОКИСЛОТ, ШТАММ БАКТЕРИЙ И ПОЛИНУКЛЕОТИД, ПРЕДНАЗНАЧЕННЫЙ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ПОЛИНУКЛЕОТИДОВ, КОДИРУЮЩИХ ПРОДУКТ ГЕНА ptsH |
Country Status (14)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP1118666A3 (ru) |
| JP (1) | JP2001224390A (ru) |
| KR (1) | KR100762112B1 (ru) |
| CN (1) | CN1319667A (ru) |
| AU (1) | AU7254800A (ru) |
| BR (1) | BR0100063A (ru) |
| CA (1) | CA2328583A1 (ru) |
| DE (1) | DE10001101A1 (ru) |
| HU (1) | HUP0100131A2 (ru) |
| ID (1) | ID28932A (ru) |
| MX (1) | MXPA01000261A (ru) |
| RU (1) | RU2268938C2 (ru) |
| SK (1) | SK362001A3 (ru) |
| ZA (1) | ZA200100332B (ru) |
Families Citing this family (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE1246922T1 (de) * | 1999-07-01 | 2003-03-20 | Basf Ag | Für proteine des phosphoenolpyruvat:zucker phosphotransferase systems kodierende gene aus corynebacterium glutamicum |
| US6884614B1 (en) | 1999-07-01 | 2005-04-26 | Basf Aktiengesellschaft | Corynebacterium glutamicum genes encoding phosphoenolpyruvate: sugar phosphotransferase system proteins |
| DK1404838T3 (da) * | 2001-07-06 | 2010-07-12 | Evonik Degussa Gmbh | Fremgangsmåde til fremstilling af L-aminosyrer ved anvendelse af stammer fra enterobacteriaceae-familien, der overeksprimerer FBA |
| JP5583311B2 (ja) * | 2005-03-10 | 2014-09-03 | 味の素株式会社 | プリン系物質生産菌及びプリン系物質の製造法 |
| US7326546B2 (en) | 2005-03-10 | 2008-02-05 | Ajinomoto Co., Inc. | Purine-derived substance-producing bacterium and a method for producing purine-derived substance |
| KR101999667B1 (ko) | 2011-10-26 | 2019-07-12 | 콘티넨탈 오토모티브 게엠베하 | 분사 밸브용 밸브 조립체 및 분사 밸브 |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH0655149B2 (ja) * | 1985-03-12 | 1994-07-27 | 協和醗酵工業株式会社 | Ｌ―リジンの製造法 |
| EP1947186B1 (en) * | 1995-05-05 | 2011-11-16 | Danisco US Inc. | Application of glucose transport mutants for production of aromatic pathway compounds |
| TR200700069T2 (tr) * | 1999-07-01 | 2007-02-21 | Basf Aktiengesellschaft | Corynebacterium glutamicum gen kodlayıcı fosfoenol piruvat: şeker fosfotransferaz sistem proteini. |
| JP4623825B2 (ja) * | 1999-12-16 | 2011-02-02 | 協和発酵バイオ株式会社 | 新規ポリヌクレオチド |
-
2000
- 2000-01-13 DE DE10001101A patent/DE10001101A1/de not_active Withdrawn
- 2000-12-28 AU AU72548/00A patent/AU7254800A/en not_active Abandoned
-
2001
- 2001-01-04 ID IDP20010001D patent/ID28932A/id unknown
- 2001-01-09 MX MXPA01000261A patent/MXPA01000261A/es active IP Right Grant
- 2001-01-09 SK SK36-2001A patent/SK362001A3/sk not_active Application Discontinuation
- 2001-01-10 CA CA002328583A patent/CA2328583A1/en not_active Abandoned
- 2001-01-11 ZA ZA200100332A patent/ZA200100332B/xx unknown
- 2001-01-12 BR BR0100063-2A patent/BR0100063A/pt not_active Application Discontinuation
- 2001-01-12 CN CN01100614A patent/CN1319667A/zh active Pending
- 2001-01-12 RU RU2001100696/13A patent/RU2268938C2/ru not_active IP Right Cessation
- 2001-01-12 EP EP01100695A patent/EP1118666A3/de not_active Withdrawn
- 2001-01-12 HU HU0100131A patent/HUP0100131A2/hu unknown
- 2001-01-12 JP JP2001005671A patent/JP2001224390A/ja active Pending
- 2001-01-13 KR KR1020010002020A patent/KR100762112B1/ko not_active Expired - Fee Related
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| SAFFEN DW et al., Sugar transport by the bacterial phosphotransferase system. J. Biol. Chem., 1987, nov. 25, 262(33), p.16241-53. * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP1118666A2 (de) | 2001-07-25 |
| ZA200100332B (en) | 2001-07-26 |
| SK362001A3 (en) | 2002-06-04 |
| KR100762112B1 (ko) | 2007-10-04 |
| MXPA01000261A (es) | 2002-08-06 |
| ID28932A (id) | 2001-07-19 |
| CA2328583A1 (en) | 2001-07-13 |
| BR0100063A (pt) | 2002-03-05 |
| CN1319667A (zh) | 2001-10-31 |
| JP2001224390A (ja) | 2001-08-21 |
| AU7254800A (en) | 2001-07-26 |
| DE10001101A1 (de) | 2001-07-19 |
| KR20010086331A (ko) | 2001-09-10 |
| HUP0100131A2 (en) | 2002-10-28 |
| HU0100131D0 (en) | 2001-03-28 |
| EP1118666A3 (de) | 2001-08-16 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US7262036B2 (en) | Process for the preparation of l-amino acids | |
| KR20010086395A (ko) | ｔａｌ 유전자를 암호화하는 뉴클레오티드 서열 | |
| US20050100927A1 (en) | Nucleotide sequence encoding the dapC gene and process for the production of L-lysine | |
| EP1287143B1 (en) | Corynebacterium glutamicum nucleotide sequences coding for the glbo gene | |
| RU2268938C2 (ru) | ПОЛИНУКЛЕОТИД, СОДЕРЖАЩИЙ НУКЛЕОТИДНУЮ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ, КОДИРУЮЩУЮ КОМПОНЕНТ Н СИСТЕМЫ ФОСФОТРАНСФЕРАЗЫ, ПЛАЗМИДНЫЙ ВЕКТОР, СПОСОБ ФЕРМЕНТАТИВНОГО ПОЛУЧЕНИЯ L-АМИНОКИСЛОТ, ШТАММ БАКТЕРИЙ И ПОЛИНУКЛЕОТИД, ПРЕДНАЗНАЧЕННЫЙ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ПОЛИНУКЛЕОТИДОВ, КОДИРУЮЩИХ ПРОДУКТ ГЕНА ptsH | |
| US6913910B2 (en) | Nucleotide sequences coding for the glk-gene | |
| US20040005675A9 (en) | Nucleotide sequences encoding the ptsH gene | |
| US6818432B2 (en) | Nucleotide sequences encoding the ptsH gene | |
| US6806068B1 (en) | Nucleotide sequences which encode the pfk gene | |
| US6830921B2 (en) | Nucleotide sequences which code for the ACP gene | |
| US6680186B2 (en) | Nucleotide sequences which encode plsC gene | |
| US7306939B2 (en) | Nucleotide sequences encoding the gpm gene | |
| KR20010051876A (ko) | ｐｆｋＡ 유전자를 암호화하는 신규한 뉴클레오타이드 서열 | |
| US6987015B1 (en) | Nucleotide sequences encoding the pfkA gene | |
| US20020034794A1 (en) | Nucleotide sequences which encode the gpsA gene | |
| KR20020097245A (ko) | ｃｄｓＡ 유전자를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열 | |
| US20020042106A1 (en) | Nucleotide sequences which code for the cma gene | |
| KR20020097250A (ko) | ｃｍａ 유전자를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열 | |
| KR20020097248A (ko) | ｆａｄＤ15 유전자를 암호화하는 뉴클레오티드 서열 | |
| KR20020097244A (ko) | ｐｇｓＡ2 유전자를 암호화하는 신규한 뉴클레오타이드 서열 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PC43 | Official registration of the transfer of the exclusive right without contract for inventions |
Effective date: 20100901 |
|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20170113 |