HUP0004783A2 - Új, a glk-gént kódoló nukleotid szekvenciák - Google Patents
Új, a glk-gént kódoló nukleotid szekvenciák Download PDFInfo
- Publication number
- HUP0004783A2 HUP0004783A2 HU0004783A HUP0004783A HUP0004783A2 HU P0004783 A2 HUP0004783 A2 HU P0004783A2 HU 0004783 A HU0004783 A HU 0004783A HU P0004783 A HUP0004783 A HU P0004783A HU P0004783 A2 HUP0004783 A2 HU P0004783A2
- Authority
- HU
- Hungary
- Prior art keywords
- polynucleotide
- gene encoding
- sequence
- ala
- gly
- Prior art date
Links
- 101150042675 glk gene Proteins 0.000 title abstract description 27
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 title description 14
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 claims abstract description 42
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 claims abstract description 42
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 claims abstract description 42
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 37
- 150000008575 L-amino acids Chemical class 0.000 claims abstract description 19
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 14
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims abstract description 13
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims abstract description 12
- 108010021582 Glucokinase Proteins 0.000 claims abstract description 11
- 102000030595 Glucokinase Human genes 0.000 claims abstract description 10
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims abstract description 10
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims abstract description 10
- 230000008569 process Effects 0.000 claims abstract description 9
- 238000012262 fermentative production Methods 0.000 claims abstract description 8
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims abstract description 5
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 55
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 claims description 45
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 claims description 30
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 26
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 claims description 25
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 17
- 235000019766 L-Lysine Nutrition 0.000 claims description 13
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 13
- 241000186031 Corynebacteriaceae Species 0.000 claims description 12
- 235000018977 lysine Nutrition 0.000 claims description 12
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 claims description 9
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 5
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 4
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 claims description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 3
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 claims description 3
- 230000037432 silent mutation Effects 0.000 claims description 3
- 108010055400 Aspartate kinase Proteins 0.000 claims description 2
- 102000005731 Glucose-6-phosphate isomerase Human genes 0.000 claims description 2
- 108010070600 Glucose-6-phosphate isomerase Proteins 0.000 claims description 2
- 108010053763 Pyruvate Carboxylase Proteins 0.000 claims description 2
- 102100039895 Pyruvate carboxylase, mitochondrial Human genes 0.000 claims description 2
- 101150033985 TPI gene Proteins 0.000 claims description 2
- 102000005924 Triose-Phosphate Isomerase Human genes 0.000 claims description 2
- 108700015934 Triose-phosphate isomerases Proteins 0.000 claims description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims description 2
- 230000006696 biosynthetic metabolic pathway Effects 0.000 claims description 2
- 241000186254 coryneform bacterium Species 0.000 claims description 2
- 101150011371 dapA gene Proteins 0.000 claims description 2
- 101150073818 gap gene Proteins 0.000 claims description 2
- 102000006602 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Human genes 0.000 claims description 2
- 108020004445 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Proteins 0.000 claims description 2
- 101150035025 lysC gene Proteins 0.000 claims description 2
- 101150044424 lysE gene Proteins 0.000 claims description 2
- 101150094267 mqo gene Proteins 0.000 claims description 2
- 101150047627 pgk gene Proteins 0.000 claims description 2
- 101150096049 pyc gene Proteins 0.000 claims description 2
- AZQWKYJCGOJGHM-UHFFFAOYSA-N 1,4-benzoquinone Chemical compound O=C1C=CC(=O)C=C1 AZQWKYJCGOJGHM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 2
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 claims 2
- 102100025591 Glycerate kinase Human genes 0.000 claims 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 claims 1
- 108091000041 Phosphoenolpyruvate Carboxylase Proteins 0.000 claims 1
- 108010086476 glycerate kinase Proteins 0.000 claims 1
- 229940049920 malate Drugs 0.000 claims 1
- BJEPYKJPYRNKOW-UHFFFAOYSA-N malic acid Chemical compound OC(=O)C(O)CC(O)=O BJEPYKJPYRNKOW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 claims 1
- 101150053253 pgi gene Proteins 0.000 claims 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 claims 1
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 abstract 3
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 34
- 241000186226 Corynebacterium glutamicum Species 0.000 description 26
- 229960003646 lysine Drugs 0.000 description 24
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 21
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 20
- 239000000047 product Substances 0.000 description 20
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 19
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 19
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 14
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 13
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 12
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 12
- 235000013351 cheese Nutrition 0.000 description 11
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 11
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 11
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 10
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 10
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 9
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 8
- 241000186216 Corynebacterium Species 0.000 description 7
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 7
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 7
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 7
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 7
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 6
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 6
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 6
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 6
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 6
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 6
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 6
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 6
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 6
- WPLOVIFNBMNBPD-ATHMIXSHSA-N subtilin Chemical compound CC1SCC(NC2=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C(C)CC)C(=O)NC(=C)C(=O)NC(CCCCN)C(O)=O)CSC(C)C2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C1NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C1NC(=O)C(=C/C)/NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)CNC(=O)C(NC(=O)C(NC(=O)C2NC(=O)CNC(=O)C3CCCN3C(=O)C(NC(=O)C3NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(=C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(CCCCN)NC(=O)C(N)CC=4C5=CC=CC=C5NC=4)CSC3)C(C)SC2)C(C)C)C(C)SC1)CC1=CC=CC=C1 WPLOVIFNBMNBPD-ATHMIXSHSA-N 0.000 description 6
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 5
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 5
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 5
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 5
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 5
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 5
- 238000011160 research Methods 0.000 description 5
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 5
- 239000013605 shuttle vector Substances 0.000 description 5
- 241001485655 Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 Species 0.000 description 4
- 241000644323 Escherichia coli C Species 0.000 description 4
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 4
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 4
- 102100024319 Intestinal-type alkaline phosphatase Human genes 0.000 description 4
- 101710184243 Intestinal-type alkaline phosphatase Proteins 0.000 description 4
- 239000006142 Luria-Bertani Agar Substances 0.000 description 4
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 4
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 4
- 244000309466 calf Species 0.000 description 4
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 4
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 4
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 4
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 4
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 4
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 4
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 3
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N Ammonia chloride Chemical compound [NH4+].[Cl-] NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010079364 N-glycylalanine Proteins 0.000 description 3
- KWYUFKZDYYNOTN-UHFFFAOYSA-M Potassium hydroxide Chemical compound [OH-].[K+] KWYUFKZDYYNOTN-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 3
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 3
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 3
- 239000013601 cosmid vector Substances 0.000 description 3
- VPZXBVLAVMBEQI-UHFFFAOYSA-N glycyl-DL-alpha-alanine Natural products OC(=O)C(C)NC(=O)CN VPZXBVLAVMBEQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 3
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 3
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 3
- -1 linoleic acid, alcohols Chemical class 0.000 description 3
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 3
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 3
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 3
- 238000012552 review Methods 0.000 description 3
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 3
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 3
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 2
- OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 100676-05-9 Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OCC1C(O)C(O)C(O)C(OC2C(OC(O)C(O)C2O)CO)O1 OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 2
- ZIWWTZWAKYBUOB-CIUDSAMLSA-N Ala-Asp-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O ZIWWTZWAKYBUOB-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 2
- DWYROCSXOOMOEU-CIUDSAMLSA-N Ala-Met-Glu Chemical compound C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCC(=O)O)C(=O)O)N DWYROCSXOOMOEU-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 2
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 2
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OGUPCHKBOKJFMA-SRVKXCTJSA-N Arg-Glu-Lys Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCCN=C(N)N OGUPCHKBOKJFMA-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 2
- CZUHPNLXLWMYMG-UBHSHLNASA-N Arg-Phe-Ala Chemical compound NC(N)=NCCC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 CZUHPNLXLWMYMG-UBHSHLNASA-N 0.000 description 2
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 2
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 2
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 2
- 241001646716 Escherichia coli K-12 Species 0.000 description 2
- 229930091371 Fructose Natural products 0.000 description 2
- RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N Fructose Chemical compound OC[C@H]1O[C@](O)(CO)[C@@H](O)[C@@H]1O RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N 0.000 description 2
- 239000005715 Fructose Substances 0.000 description 2
- SZXSSXUNOALWCH-ACZMJKKPSA-N Glu-Ala-Asn Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O SZXSSXUNOALWCH-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 2
- RLFSBAPJTYKSLG-WHFBIAKZSA-N Gly-Ala-Asp Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O RLFSBAPJTYKSLG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 2
- GAFKBWKVXNERFA-QWRGUYRKSA-N Gly-Phe-Asp Chemical compound OC(=O)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)CC1=CC=CC=C1 GAFKBWKVXNERFA-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 2
- VPZXBVLAVMBEQI-VKHMYHEASA-N Glycyl-alanine Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)CN VPZXBVLAVMBEQI-VKHMYHEASA-N 0.000 description 2
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 2
- MMEDVBWCMGRKKC-GARJFASQSA-N Leu-Asp-Pro Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)N MMEDVBWCMGRKKC-GARJFASQSA-N 0.000 description 2
- GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N Maltose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N 0.000 description 2
- DZMGFGQBRYWJOR-YUMQZZPRSA-N Met-Pro Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(O)=O DZMGFGQBRYWJOR-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 2
- RIYZXJVARWJLKS-KKUMJFAQSA-N Phe-Asp-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 RIYZXJVARWJLKS-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 2
- NQZFFLBPNDLTPO-DLOVCJGASA-N Ser-Phe-Ala Chemical compound C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC1=CC=CC=C1)NC(=O)[C@H](CO)N NQZFFLBPNDLTPO-DLOVCJGASA-N 0.000 description 2
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 2
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 2
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 244000269722 Thea sinensis Species 0.000 description 2
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000019728 animal nutrition Nutrition 0.000 description 2
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N beta-maltose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N 0.000 description 2
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 2
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 2
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 2
- 235000010980 cellulose Nutrition 0.000 description 2
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 2
- 238000012136 culture method Methods 0.000 description 2
- 238000001212 derivatisation Methods 0.000 description 2
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 2
- 235000019441 ethanol Nutrition 0.000 description 2
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 2
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 2
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 description 2
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 2
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 2
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 2
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 2
- XKUKSGPZAADMRA-UHFFFAOYSA-N glycyl-glycyl-glycine Chemical compound NCC(=O)NCC(=O)NCC(O)=O XKUKSGPZAADMRA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IPCSVZSSVZVIGE-UHFFFAOYSA-N hexadecanoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(O)=O IPCSVZSSVZVIGE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000011167 hydrochloric acid Nutrition 0.000 description 2
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 2
- BAUYGSIQEAFULO-UHFFFAOYSA-L iron(2+) sulfate (anhydrous) Chemical compound [Fe+2].[O-]S([O-])(=O)=O BAUYGSIQEAFULO-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 2
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 description 2
- 230000002906 microbiologic effect Effects 0.000 description 2
- 235000013379 molasses Nutrition 0.000 description 2
- FEMOMIGRRWSMCU-UHFFFAOYSA-N ninhydrin Chemical compound C1=CC=C2C(=O)C(O)(O)C(=O)C2=C1 FEMOMIGRRWSMCU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 2
- 238000012856 packing Methods 0.000 description 2
- 238000007747 plating Methods 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- GHSJKUNUIHUPDF-UHFFFAOYSA-N s-(2-aminoethyl)-l-cysteine Chemical compound NCCSCC(N)C(O)=O GHSJKUNUIHUPDF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 2
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 2
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 2
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 2
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 2
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 2
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 2
- ZNAIHAPCDVUWRX-DUCUPYJCSA-N (4s,4as,5as,6s,12ar)-7-chloro-4-(dimethylamino)-1,6,10,11,12a-pentahydroxy-6-methyl-3,12-dioxo-4,4a,5,5a-tetrahydrotetracene-2-carboxamide;4-amino-n-(4,6-dimethylpyrimidin-2-yl)benzenesulfonamide;(2s,5r,6r)-3,3-dimethyl-7-oxo-6-[(2-phenylacetyl)amino]-4-t Chemical compound CC1=CC(C)=NC(NS(=O)(=O)C=2C=CC(N)=CC=2)=N1.N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1.C1=CC(Cl)=C2[C@](O)(C)[C@H]3C[C@H]4[C@H](N(C)C)C(=O)C(C(N)=O)=C(O)[C@@]4(O)C(=O)C3=C(O)C2=C1O ZNAIHAPCDVUWRX-DUCUPYJCSA-N 0.000 description 1
- PAWQVTBBRAZDMG-UHFFFAOYSA-N 2-(3-bromo-2-fluorophenyl)acetic acid Chemical compound OC(=O)CC1=CC=CC(Br)=C1F PAWQVTBBRAZDMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OSJPPGNTCRNQQC-UWTATZPHSA-N 3-phospho-D-glyceric acid Chemical compound OC(=O)[C@H](O)COP(O)(O)=O OSJPPGNTCRNQQC-UWTATZPHSA-N 0.000 description 1
- 108091000044 4-hydroxy-tetrahydrodipicolinate synthase Proteins 0.000 description 1
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101100298079 African swine fever virus (strain Badajoz 1971 Vero-adapted) pNG2 gene Proteins 0.000 description 1
- SDMAQFGBPOJFOM-GUBZILKMSA-N Ala-Arg-Arg Chemical compound NC(=N)NCCC[C@H](NC(=O)[C@@H](N)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O SDMAQFGBPOJFOM-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- KRHRBKYBJXMYBB-WHFBIAKZSA-N Ala-Cys-Gly Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)NCC(O)=O KRHRBKYBJXMYBB-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- ROLXPVQSRCPVGK-XDTLVQLUSA-N Ala-Glu-Tyr Chemical compound N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCC(=O)O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(C=C1)O)C(=O)O ROLXPVQSRCPVGK-XDTLVQLUSA-N 0.000 description 1
- CWEAKSWWKHGTRJ-BQBZGAKWSA-N Ala-Gly-Met Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCSC)C(O)=O CWEAKSWWKHGTRJ-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- QHASENCZLDHBGX-ONGXEEELSA-N Ala-Gly-Phe Chemical compound C[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 QHASENCZLDHBGX-ONGXEEELSA-N 0.000 description 1
- MNZHHDPWDWQJCQ-YUMQZZPRSA-N Ala-Leu-Gly Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(O)=O MNZHHDPWDWQJCQ-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- XWFWAXPOLRTDFZ-FXQIFTODSA-N Ala-Pro-Ser Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O XWFWAXPOLRTDFZ-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- OEVCHROQUIVQFZ-YTLHQDLWSA-N Ala-Thr-Ala Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@H](O)C)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O OEVCHROQUIVQFZ-YTLHQDLWSA-N 0.000 description 1
- LFFOJBOTZUWINF-ZANVPECISA-N Ala-Trp-Gly Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](NC(=O)[C@@H](N)C)C(=O)NCC(O)=O)=CNC2=C1 LFFOJBOTZUWINF-ZANVPECISA-N 0.000 description 1
- PGNNQOJOEGFAOR-KWQFWETISA-N Ala-Tyr-Gly Chemical compound OC(=O)CNC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)C)CC1=CC=C(O)C=C1 PGNNQOJOEGFAOR-KWQFWETISA-N 0.000 description 1
- ATRRKUHOCOJYRX-UHFFFAOYSA-N Ammonium bicarbonate Chemical compound [NH4+].OC([O-])=O ATRRKUHOCOJYRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N Ammonium hydroxide Chemical compound [NH4+].[OH-] VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004254 Ammonium phosphate Substances 0.000 description 1
- HULHGJZIZXCPLD-FXQIFTODSA-N Arg-Ala-Cys Chemical compound C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)N HULHGJZIZXCPLD-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- OZNSCVPYWZRQPY-CIUDSAMLSA-N Arg-Asp-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O OZNSCVPYWZRQPY-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- CYXCAHZVPFREJD-LURJTMIESA-N Arg-Gly-Gly Chemical compound NC(=N)NCCC[C@H](N)C(=O)NCC(=O)NCC(O)=O CYXCAHZVPFREJD-LURJTMIESA-N 0.000 description 1
- OTZMRMHZCMZOJZ-SRVKXCTJSA-N Arg-Leu-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O OTZMRMHZCMZOJZ-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- OLVIPTLKNSAYRJ-YUMQZZPRSA-N Asn-Gly-Lys Chemical compound C(CCN)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(=O)N)N OLVIPTLKNSAYRJ-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- WQLJRNRLHWJIRW-KKUMJFAQSA-N Asn-His-Tyr Chemical compound C1=CC(=CC=C1C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC2=CN=CN2)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)N)O WQLJRNRLHWJIRW-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 1
- ICDDSTLEMLGSTB-GUBZILKMSA-N Asn-Met-Arg Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O ICDDSTLEMLGSTB-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- XTMZYFMTYJNABC-ZLUOBGJFSA-N Asn-Ser-Ala Chemical compound C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)N XTMZYFMTYJNABC-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 1
- HPBNLFLSSQDFQW-WHFBIAKZSA-N Asn-Ser-Gly Chemical compound NC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(O)=O HPBNLFLSSQDFQW-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- ZEDBMCPXPIYJLW-XHNCKOQMSA-N Asp-Glu-Pro Chemical compound C1C[C@@H](N(C1)C(=O)[C@H](CCC(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)O)N)C(=O)O ZEDBMCPXPIYJLW-XHNCKOQMSA-N 0.000 description 1
- DGKCOYGQLNWNCJ-ACZMJKKPSA-N Asp-Glu-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O DGKCOYGQLNWNCJ-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 1
- BWJZSLQJNBSUPM-FXQIFTODSA-N Asp-Pro-Asn Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O BWJZSLQJNBSUPM-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- AHWRSSLYSGLBGD-CIUDSAMLSA-N Asp-Pro-Glu Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O AHWRSSLYSGLBGD-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- 108010023063 Bacto-peptone Proteins 0.000 description 1
- 241000908115 Bolivar Species 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- 241001517047 Corynebacterium acetoacidophilum Species 0.000 description 1
- 241000807905 Corynebacterium glutamicum ATCC 14067 Species 0.000 description 1
- 241000337023 Corynebacterium thermoaminogenes Species 0.000 description 1
- XLLSMEFANRROJE-GUBZILKMSA-N Cys-Leu-Glu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(=O)O)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CS)N XLLSMEFANRROJE-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 1
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 1
- 108010081616 FAD-dependent malate dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 1
- CKOFNWCLWRYUHK-XHNCKOQMSA-N Glu-Asp-Pro Chemical compound C1C[C@@H](N(C1)C(=O)[C@H](CC(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)O)N)C(=O)O CKOFNWCLWRYUHK-XHNCKOQMSA-N 0.000 description 1
- PKYAVRMYTBBRLS-FXQIFTODSA-N Glu-Cys-Glu Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O PKYAVRMYTBBRLS-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- BRKUZSLQMPNVFN-SRVKXCTJSA-N Glu-His-Arg Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O BRKUZSLQMPNVFN-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- OCJRHJZKGGSPRW-IUCAKERBSA-N Glu-Lys-Gly Chemical compound NCCCC[C@@H](C(=O)NCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O OCJRHJZKGGSPRW-IUCAKERBSA-N 0.000 description 1
- YRMZCZIRHYCNHX-RYUDHWBXSA-N Glu-Phe-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)NCC(O)=O YRMZCZIRHYCNHX-RYUDHWBXSA-N 0.000 description 1
- RFTVTKBHDXCEEX-WDSKDSINSA-N Glu-Ser-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(O)=O RFTVTKBHDXCEEX-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- KXRORHJIRAOQPG-SOUVJXGZSA-N Glu-Tyr-Pro Chemical compound C1C[C@@H](N(C1)C(=O)[C@H](CC2=CC=C(C=C2)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)O)N)C(=O)O KXRORHJIRAOQPG-SOUVJXGZSA-N 0.000 description 1
- 229920001503 Glucan Polymers 0.000 description 1
- PYTZFYUXZZHOAD-WHFBIAKZSA-N Gly-Ala-Ala Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)CN PYTZFYUXZZHOAD-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- UGVQELHRNUDMAA-BYPYZUCNSA-N Gly-Ala-Gly Chemical compound [NH3+]CC(=O)N[C@@H](C)C(=O)NCC([O-])=O UGVQELHRNUDMAA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- MBOAPAXLTUSMQI-JHEQGTHGSA-N Gly-Glu-Thr Chemical compound [H]NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O MBOAPAXLTUSMQI-JHEQGTHGSA-N 0.000 description 1
- UQJNXZSSGQIPIQ-FBCQKBJTSA-N Gly-Gly-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)CNC(=O)CN UQJNXZSSGQIPIQ-FBCQKBJTSA-N 0.000 description 1
- PAWIVEIWWYGBAM-YUMQZZPRSA-N Gly-Leu-Ala Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O PAWIVEIWWYGBAM-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- UUYBFNKHOCJCHT-VHSXEESVSA-N Gly-Leu-Pro Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)NC(=O)CN UUYBFNKHOCJCHT-VHSXEESVSA-N 0.000 description 1
- MIIVFRCYJABHTQ-ONGXEEELSA-N Gly-Leu-Val Chemical compound [H]NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O MIIVFRCYJABHTQ-ONGXEEELSA-N 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- VOEGKUNRHYKYSU-XVYDVKMFSA-N His-Asp-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O VOEGKUNRHYKYSU-XVYDVKMFSA-N 0.000 description 1
- 108010065920 Insulin Lispro Proteins 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- LHSGPCFBGJHPCY-UHFFFAOYSA-N L-leucine-L-tyrosine Natural products CC(C)CC(N)C(=O)NC(C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 LHSGPCFBGJHPCY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QOOWRKBDDXQRHC-BQBZGAKWSA-N L-lysyl-L-alanine Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CCCCN QOOWRKBDDXQRHC-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- LJHGALIOHLRRQN-DCAQKATOSA-N Leu-Ala-Arg Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCN=C(N)N LJHGALIOHLRRQN-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- YVKSMSDXKMSIRX-GUBZILKMSA-N Leu-Glu-Asn Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O YVKSMSDXKMSIRX-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- HFBCHNRFRYLZNV-GUBZILKMSA-N Leu-Glu-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O HFBCHNRFRYLZNV-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- OTXBNHIUIHNGAO-UWVGGRQHSA-N Leu-Lys Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCCN OTXBNHIUIHNGAO-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 1
- ZRHDPZAAWLXXIR-SRVKXCTJSA-N Leu-Lys-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O ZRHDPZAAWLXXIR-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- ZAVCJRJOQKIOJW-KKUMJFAQSA-N Leu-Phe-Asp Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 ZAVCJRJOQKIOJW-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 1
- JLYUZRKPDKHUTC-WDSOQIARSA-N Leu-Pro-Trp Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CC1=CNC2=C1C=CC=C2)C(O)=O JLYUZRKPDKHUTC-WDSOQIARSA-N 0.000 description 1
- KZZCOWMDDXDKSS-CIUDSAMLSA-N Leu-Ser-Asn Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O KZZCOWMDDXDKSS-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 1
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 1
- GCMWRRQAKQXDED-IUCAKERBSA-N Lys-Glu-Gly Chemical compound [NH3+]CCCC[C@H]([NH3+])C(=O)N[C@@H](CCC([O-])=O)C(=O)NCC([O-])=O GCMWRRQAKQXDED-IUCAKERBSA-N 0.000 description 1
- AIXUQKMMBQJZCU-IUCAKERBSA-N Lys-Pro Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(O)=O AIXUQKMMBQJZCU-IUCAKERBSA-N 0.000 description 1
- BOJYMMBYBNOOGG-DCAQKATOSA-N Lys-Pro-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O BOJYMMBYBNOOGG-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- 239000007993 MOPS buffer Substances 0.000 description 1
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 1
- 235000021314 Palmitic acid Nutrition 0.000 description 1
- 235000019483 Peanut oil Nutrition 0.000 description 1
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 1
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 1
- JJHVFCUWLSKADD-ONGXEEELSA-N Phe-Gly-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(O)=O JJHVFCUWLSKADD-ONGXEEELSA-N 0.000 description 1
- BONHGTUEEPIMPM-AVGNSLFASA-N Phe-Ser-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O BONHGTUEEPIMPM-AVGNSLFASA-N 0.000 description 1
- OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N Phosphorus Chemical compound [P] OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZSKJPKFTPQCPIH-RCWTZXSCSA-N Pro-Arg-Thr Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O ZSKJPKFTPQCPIH-RCWTZXSCSA-N 0.000 description 1
- STASJMBVVHNWCG-IHRRRGAJSA-N Pro-His-Leu Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C([O-])=O)NC(=O)[C@H]1[NH2+]CCC1)C1=CN=CN1 STASJMBVVHNWCG-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 1
- XNJVJEHDZPDPQL-BZSNNMDCSA-N Pro-Trp-Arg Chemical compound NC(=N)NCCC[C@H](NC(=O)[C@H](Cc1c[nH]c2ccccc12)NC(=O)[C@@H]1CCCN1)C(O)=O XNJVJEHDZPDPQL-BZSNNMDCSA-N 0.000 description 1
- 102000001253 Protein Kinase Human genes 0.000 description 1
- 108010019653 Pwo polymerase Proteins 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- QGAHMVHBORDHDC-YUMQZZPRSA-N Ser-His-Gly Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(=O)NCC(O)=O)CC1=CN=CN1 QGAHMVHBORDHDC-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- YUJLIIRMIAGMCQ-CIUDSAMLSA-N Ser-Leu-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O YUJLIIRMIAGMCQ-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- JAWGSPUJAXYXJA-IHRRRGAJSA-N Ser-Phe-Arg Chemical compound NC(N)=NCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CO)N)CC1=CC=CC=C1 JAWGSPUJAXYXJA-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 1
- NUEHQDHDLDXCRU-GUBZILKMSA-N Ser-Pro-Arg Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(O)=O NUEHQDHDLDXCRU-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- RXUOAOOZIWABBW-XGEHTFHBSA-N Ser-Thr-Arg Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@H](O)C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCN=C(N)N RXUOAOOZIWABBW-XGEHTFHBSA-N 0.000 description 1
- 235000019764 Soybean Meal Nutrition 0.000 description 1
- 235000021355 Stearic acid Nutrition 0.000 description 1
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L Sulfate Chemical compound [O-]S([O-])(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 235000019486 Sunflower oil Nutrition 0.000 description 1
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 1
- JZRWCGZRTZMZEH-UHFFFAOYSA-N Thiamine Natural products CC1=C(CCO)SC=[N+]1CC1=CN=C(C)N=C1N JZRWCGZRTZMZEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IGROJMCBGRFRGI-YTLHQDLWSA-N Thr-Ala-Ala Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O IGROJMCBGRFRGI-YTLHQDLWSA-N 0.000 description 1
- LVHHEVGYAZGXDE-KDXUFGMBSA-N Thr-Ala-Pro Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)N)O LVHHEVGYAZGXDE-KDXUFGMBSA-N 0.000 description 1
- AKXBNSZMYAOGLS-STQMWFEESA-N Tyr-Arg-Gly Chemical compound NC(N)=NCCC[C@@H](C(=O)NCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 AKXBNSZMYAOGLS-STQMWFEESA-N 0.000 description 1
- CRWOSTCODDFEKZ-HRCADAONSA-N Tyr-Arg-Pro Chemical compound C1C[C@@H](N(C1)C(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@H](CC2=CC=C(C=C2)O)N)C(=O)O CRWOSTCODDFEKZ-HRCADAONSA-N 0.000 description 1
- BSCBBPKDVOZICB-KKUMJFAQSA-N Tyr-Leu-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O BSCBBPKDVOZICB-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 1
- OFTXTCGQJXTNQS-XGEHTFHBSA-N Val-Thr-Ser Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)O)NC(=O)[C@H](C(C)C)N)O OFTXTCGQJXTNQS-XGEHTFHBSA-N 0.000 description 1
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 1
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 1
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 1
- 108010084455 Zeocin Proteins 0.000 description 1
- 241000319304 [Brevibacterium] flavum Species 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 1
- 108010005233 alanylglutamic acid Proteins 0.000 description 1
- 108010087924 alanylproline Proteins 0.000 description 1
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001099 ammonium carbonate Substances 0.000 description 1
- 235000012501 ammonium carbonate Nutrition 0.000 description 1
- 235000019270 ammonium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 235000011114 ammonium hydroxide Nutrition 0.000 description 1
- 229910000148 ammonium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019289 ammonium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 238000005571 anion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 1
- 108010092854 aspartyllysine Proteins 0.000 description 1
- 230000000721 bacterilogical effect Effects 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 1
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 1
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 150000001722 carbon compounds Chemical class 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 description 1
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 1
- 239000003240 coconut oil Substances 0.000 description 1
- 235000019864 coconut oil Nutrition 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- MNNHAPBLZZVQHP-UHFFFAOYSA-N diammonium hydrogen phosphate Chemical compound [NH4+].[NH4+].OP([O-])([O-])=O MNNHAPBLZZVQHP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AIUDWMLXCFRVDR-UHFFFAOYSA-N dimethyl 2-(3-ethyl-3-methylpentyl)propanedioate Chemical class CCC(C)(CC)CCC(C(=O)OC)C(=O)OC AIUDWMLXCFRVDR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L dipotassium hydrogen phosphate Chemical compound [K+].[K+].OP([O-])([O-])=O ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 239000003925 fat Substances 0.000 description 1
- 235000019197 fats Nutrition 0.000 description 1
- 239000006260 foam Substances 0.000 description 1
- 230000005021 gait Effects 0.000 description 1
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 1
- 108010013768 glutamyl-aspartyl-proline Proteins 0.000 description 1
- 101150089730 gly-10 gene Proteins 0.000 description 1
- 230000034659 glycolysis Effects 0.000 description 1
- XBGGUPMXALFZOT-UHFFFAOYSA-N glycyl-L-tyrosine hemihydrate Natural products NCC(=O)NC(C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 XBGGUPMXALFZOT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010062266 glycyl-glycyl-argininal Proteins 0.000 description 1
- 108010067216 glycyl-glycyl-glycine Proteins 0.000 description 1
- 108010066198 glycyl-leucyl-phenylalanine Proteins 0.000 description 1
- 108010074027 glycyl-seryl-phenylalanine Proteins 0.000 description 1
- 108010089804 glycyl-threonine Proteins 0.000 description 1
- YMAWOPBAYDPSLA-UHFFFAOYSA-N glycylglycine Chemical compound [NH3+]CC(=O)NCC([O-])=O YMAWOPBAYDPSLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010020688 glycylhistidine Proteins 0.000 description 1
- 108010087823 glycyltyrosine Proteins 0.000 description 1
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 1
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 150000002484 inorganic compounds Chemical class 0.000 description 1
- 229910010272 inorganic material Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 229910000358 iron sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910000359 iron(II) sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 108010034529 leucyl-lysine Proteins 0.000 description 1
- 108010091798 leucylleucine Proteins 0.000 description 1
- 108010012058 leucyltyrosine Proteins 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 235000013372 meat Nutrition 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 1
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 239000013586 microbial product Substances 0.000 description 1
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019796 monopotassium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- IDSXLJLXYMLSJM-UHFFFAOYSA-N morpholine;propane-1-sulfonic acid Chemical compound C1COCCN1.CCCS(O)(=O)=O IDSXLJLXYMLSJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- ZIUHHBKFKCYYJD-UHFFFAOYSA-N n,n'-methylenebisacrylamide Chemical compound C=CC(=O)NCNC(=O)C=C ZIUHHBKFKCYYJD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WQEPLUUGTLDZJY-UHFFFAOYSA-N n-Pentadecanoic acid Natural products CCCCCCCCCCCCCCC(O)=O WQEPLUUGTLDZJY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QJGQUHMNIGDVPM-UHFFFAOYSA-N nitrogen group Chemical group [N] QJGQUHMNIGDVPM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- QIQXTHQIDYTFRH-UHFFFAOYSA-N octadecanoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(O)=O QIQXTHQIDYTFRH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OQCDKBAXFALNLD-UHFFFAOYSA-N octadecanoic acid Natural products CCCCCCCC(C)CCCCCCCCC(O)=O OQCDKBAXFALNLD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 1
- 235000019198 oils Nutrition 0.000 description 1
- 238000002515 oligonucleotide synthesis Methods 0.000 description 1
- 150000007524 organic acids Chemical class 0.000 description 1
- 235000005985 organic acids Nutrition 0.000 description 1
- 238000012261 overproduction Methods 0.000 description 1
- 239000000312 peanut oil Substances 0.000 description 1
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 1
- 229940066779 peptones Drugs 0.000 description 1
- 108010073101 phenylalanylleucine Proteins 0.000 description 1
- CWCMIVBLVUHDHK-ZSNHEYEWSA-N phleomycin D1 Chemical compound N([C@H](C(=O)N[C@H](C)[C@@H](O)[C@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@H](O)C)C(=O)NCCC=1SC[C@@H](N=1)C=1SC=C(N=1)C(=O)NCCCCNC(N)=N)[C@@H](O[C@H]1[C@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](CO)O1)O[C@@H]1[C@H]([C@@H](OC(N)=O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1)O)C=1N=CNC=1)C(=O)C1=NC([C@H](CC(N)=O)NC[C@H](N)C(N)=O)=NC(N)=C1C CWCMIVBLVUHDHK-ZSNHEYEWSA-N 0.000 description 1
- PJNZPQUBCPKICU-UHFFFAOYSA-N phosphoric acid;potassium Chemical compound [K].OP(O)(O)=O PJNZPQUBCPKICU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011574 phosphorus Substances 0.000 description 1
- 238000013492 plasmid preparation Methods 0.000 description 1
- 229920001522 polyglycol ester Polymers 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 108060006633 protein kinase Proteins 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 108010026333 seryl-proline Proteins 0.000 description 1
- 238000007086 side reaction Methods 0.000 description 1
- 159000000000 sodium salts Chemical class 0.000 description 1
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 1
- 239000004455 soybean meal Substances 0.000 description 1
- 239000003549 soybean oil Substances 0.000 description 1
- 235000012424 soybean oil Nutrition 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 239000008117 stearic acid Substances 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 1
- 239000002600 sunflower oil Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 230000009897 systematic effect Effects 0.000 description 1
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 1
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 1
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 1
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 1
- 235000019157 thiamine Nutrition 0.000 description 1
- KYMBYSLLVAOCFI-UHFFFAOYSA-N thiamine Chemical compound CC1=C(CCO)SCN1CC1=CN=C(C)N=C1N KYMBYSLLVAOCFI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960003495 thiamine Drugs 0.000 description 1
- 239000011721 thiamine Substances 0.000 description 1
- 108010061238 threonyl-glycine Proteins 0.000 description 1
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 1
- 238000011426 transformation method Methods 0.000 description 1
- 230000004102 tricarboxylic acid cycle Effects 0.000 description 1
- 108010080629 tryptophan-leucine Proteins 0.000 description 1
- 108010020532 tyrosyl-proline Proteins 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 150000003722 vitamin derivatives Chemical class 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
- C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
- C12N9/1205—Phosphotransferases with an alcohol group as acceptor (2.7.1), e.g. protein kinases
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
- C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
- C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
- C12P13/08—Lysine; Diaminopimelic acid; Threonine; Valine
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Abstract
A találmány tárgya izolált polinukleotid, amely az alábbi csopo tokbólkiválasztott polinukleotid szekvenciákat tartalmazza: a) olyanpolinukleotidok, amelyek legalább 70%-ban azonosak a 2. azonosítószámú szekvencia (SEQ ID NO) szerinti aminosavszekvenciát tartalmazópolipeptidet kódoló polinukleotiddal; b) olyan polipeptidet kódolópolinukleotid, amely olyan aminosavszekvenciával rendelkezik, amelyiklegalább 70%-ban azonos a 2. azonosító számú aminosavszekvenciával; c)olyan polinukleotid, amelyik az a) vagy b) szerinti polinukleotidokkomplementere; d) olyan polinukleotid, amelyik legalább 15 egymásutánkövetkező - a), b), vagy c) szerinti polinukleotid szekvenciájúnukleotidot tartalmaz. Eljárás L-aminosavak fermentatív előállítására,a glükokináz enzimet kódoló glk gének felerősítésével. Ó
Description
71.508/PA
S.B.G. & K.
Nemzetközi ‘'ft' t 1 Ληι b, Ja Γ*~Ν qx , \>dM,sy Úí 113. ,tlJl 1 ' > I «4 34-24-323
KÖZZÉTÉTELI
PÉLDÁNY
Új glk gént kódoló nukleotid szekvenciák
Jelen találmány tárgya glk gént kódoló nukleotid szekvenciák, valamint eljárás aminosavak - különösen Llizin - fermentatív előállítására, különösen korineform baktériumok alkalmazásával, amelyekben a glk gén felerősödik.
A technika állása
L-Aminosavakat - különösen L-lizint - használnak a humán gyógyászatban, a gyógyszeriparban, de különösen az állatok táplálásához.
Ismeretes, hogy az aminosavakat korineform baktérium törzsek - különösen a Corynebacterium glutamicum fermentációjával állítják elő. Nagy jelentősége miatt állandóan dolgoznak az előállítási eljárás továbbfejlesztésén. Az előállítási eljárás tökéletesítése történhet fermentációs technikai eszközökkel, mint például keveréssel és oxigén ellátással, vagy a tápközeg összetételével, például a fermentáció alatti cukor koncentrációval, esetleg termékké való feldolgozással, például ioncserélő kromatográfiával, illetve maguknak a mikroorganizmusoknak saját, belső teljesítőképességével.
71.508/ΡΆ
A mikroorganizmusok teljesítőképességének javítására módszerként mutagenezist, szelekciót és mutáns-kiválasztást használnak. Ily módon, olyan törzseket nyernek, amelyek ellenállóak az anyagcsere gátló anyagokkal szemben, mint például a lizin-analóg S-(2-amino-etil)-cisztein vagy az auxotrófok a szabályzó jellegű metabolitok szempontjából és L-aminosavakat, pl. L-lizint hoznak létre.
Néhány év óta a rekombinációs DNS technikát szintén alkalmazzák az aminosavakat termelő korinebaktérium törzsek törzs-javítására, amelynek során egyes aminosavbioszintézís-géneket amplifikálnak és vizsgálják az aminosav kitermelésre gyakorolt hatásukat. Erre vonatkozó áttekintő cikkek többek között: Kinoshita (Glutamic Acid Bacteria, Biology of Industrial Microorganismus, Demain and Solomon kiadó; Benjamin Cumings, London, UK, (1985), 115-142; Hillinger (BioTec 2, 40-44, (1991)); Eggeling (Amino Acids 6:261-272, (1994)); Jetten und Sinskey (Critical Rewiews in Biotechnology 15, 73-103, (1995)) és Sahm és társai. (Annuals of the New York Academy of Science 782, 25-39, (1996) ) .
A találmány célja:
A feltalálók azt a feladatot tűzték ki maguk elé, hogy új módszereket dolgozzanak ki aminosavak, különösen Llízin, tökéletesebb fermentatív előállítására.
71.508/PA
A találmány leírása:
Aminosavakat - különösen L- lizint - használnak a humán gyógyászatban, a gyógyszeriparban, de különösen az állatok táplálásánál. Ezért közérdekű egy új továbbfejlesztett eljárás kidolgozása aminosavak, különösen L-lizin, előállítására.
Amikor a továbbiakban L-lizint vagy lizint említünk, nemcsak az alap-vegyületről van szó, hanem annak sóiról is, például lizin-monokloridról vagy lizin-szulfátról.
Jelen találmány tárgya korineform baktériumokból izolált polinukleotid, amely az alábbi csoportokból kiválasztott polinukleotid szekvenciákkal rendelkezik:
a) olyan polinukleotidok, amelyek legalább 70 %-ban azonosak a 2. azonosító számú szekvencia (SEQ ID NO) szerinti aminosav-szekvenciát tartalmazó polipeptidet kódoló polinukleotiddal;
b) olyan polipeptidet kódoló polinukleotid, amely olyan aminosav szekvenciával rendelkezik, amelyik legalább 70 %ban azonos a 2. azonosító számú aminosav szekvenciával;
c) olyan polinukleotid, amelyik az a) vagy b) szerinti polinukleotidok komplementere;
d) olyan polinukleotid, amelyik legalább 15 egymásután következő - a) , b) , vagy c) szerinti polinukleotid szekvenciájú nukleotidot tartalmaz.
Hasonlóképpen tárgya a találmánynak egy polinukleotid, amely egy korinerform baktériumban replikálható, előnyösen
71.508/PA rekombináns DNS.
Ugyancsak tárgya a találmánynak egy polinukleotid, amely egy RNS.
Hasonlóképpen tárgya a találmánynak az 1. igénypont szerinti polinukleotid, ami előnyösen egy replikálható DNS, amely a következőket tartalmazza:
(i) az 1. azonosító számú szekvencia szerinti nukleotid szekvencia, vagy (ii) legalább egy szekvencia, amelyik megfelel az (i) szekvenciának a genetikus kód degenerációs tartományán belül, vagy (iii) legalább egy szekvencia, amelyik az (i) vagy (ii) szekvenciák komplementer szekvenciáival hibridizál és esetleg (iv) az (i) szerinti funkció semleges néma mutációi.
A találmány további tárgyát képezi:
egy az 1. igénypont szerinti polipeptidet tartalmazó vektor, és a gazdasejtként szolgáló korinerform baktériumok, amelyek a vektort tartalmazzák.
A találmány tárgya még egy olyan polinukleotid, amely a számunkra fontos polinukleotid szekvenciából áll, és egy megfelelő génbankból szkríneléssel nyerhető, ahol a megfelelő 1. azonosító számú szekvenciát tartalmazó teljes gén egy 1. azonosító számú szekvenciának megfelelő polinukleotid szekvenciát, vagy annak egy fragmensét tartalmazó próbával hibridizál, valamint a nevezett DNS
71.508/ΡΆ szekvenciák izolálása.
A találmány szerinti polinukleotid szekvenciák hibridizációs próbaként alkalmasak az RNS, cDNS és DNS teljes hosszában cDNS-ként történő izolálására, amelyek glükokinázt kódolnak és olyan cDNS-ek vagy gének izolálására, amelyeknek szekvenciája nagy hasonlóságot mutat a glükokináz génekéhez.
A találmány szerinti polinukleotid szekvenciák alkalmazhatók továbbá prímenként, DNS-ek glükokinázt kódoló génekből polimeráz láncreakció (PCR) révén történő előállítására.
Az ilyen próbaként vagy primőrként szolgáló oligonukleotidok legalább 30, előnyösen legalább 20, különösen előnyösen legalább 15 szomszédos bázist tartalmaznak. Ugyancsak alkalmazhatók legalább 40 vagy 50 oligonukleotid hosszúságú nukleotidok.
Az izolál szó annyit jelent, hogy természetes környezetétől elválasztjuk.
A polinukleotid kifejezés általában poli-ribonukleotidokra és poli-dezoxiribo-nukleotidokra vonatkozik, ahol módosított, illetve nem módosított RNS-ről vagy DNSről lehet szó.
Polipeptidek alatt olyan peptidek és fehérjék értendők, amelyek két vagy több, peptidkötésű aminosavat tartalmaznak.
A találmány szerinti polipeptidek a 2. azonosító számú szekvenciának megfelelő polipeptidekből állnak, különösen
71.508/PA glükokináz aktivitással rendelkezőkből, és olyanokból, amelyek legalább 70 %-ban, előnyösen 80 %-ban és különösen előnyösen 90-95 %-ban azonosak a 2. azonosító számú szekvenciának megfelelő polipeptidekkel és rendelkeznek a fent említett aktivitással.
Vonatkozik továbbá a találmány L-aminosavak, különösen L-lizin fermentatív előállítási eljárására, korineform baktériumok alkalmazásával, amelyek különösen alkalmasak aminosav előállítására, és amelyekben a glk gén kódolású nukleotid szekvenciák felerősödnek, különösen, ha túlexpresszálódnak.
Az felerősödnek fogalom ebben az összefüggésben egy vagy több enzim sejten belüli (intracelluláris) aktivitásának megnövekedését jelenti egy mikroorganizmusban, amelyben például a gén vagy gének kópia száma megnövekszik, erős promótert vagy gént használ a kódoló DNS-ben, ami egy megfelelő nagy aktivitású enzimet kódol, valamint adott esetben ezek kombinációját.
Jelen találmány tárgyát képező mikroorganizmusok Laminosavakat, különösen L-lizint tudnak előállítani glükózból, szacharózból, laktózból, fruktózból, maltózból, melaszból, keményítőből, cellulózból vagy glicerinből. A korineform baktériumokat, különösen a Corynebactérium nemzetség képviselheti. A Corynebacterium nemzetségben különösen a Corynebacterium glutamicum az, amelyet a szakemberek L-aminosav-termelő képességükről ismernek.
Corynebacterium nemzetségbe különösen
71.508/PA
Corynebacterium glutamicum fajba tartozó megfelelő törzsek például az alábbi vad-típusú fajták:
Corynebacterium glutamicum ATCC13032
Corynebacterium acetoglutamicum ATCC15806
Corynebacterium acetoacidophilum ATCC13870
Corynebacterium thermoaminogenes FERM BP-1539
Corynebacterium melassecola ATCC17965
Brevibacterium flavum ATCC14067
Brevibacterium lactofermentum ATCC13869 és
Brevibacterium divaricatum ATCC14020 és az azokból előállított L-lizint termelő mutánsok, illetve törzsek, például:
Corynebacterium glutamicum FERM-P 1709
Brevibacterium flavum FERM-P 1708
Brevibacterium lactofermentum FERM-P 1712
Corynebacterium glutamicum FERM-P 6463
Corynebacterium glutamicum FERM-P 6464 és
Corynebacterium glutamicum DSM5715
A feltalálóknak sikerült az új glükokináz enzimet (EC 2.7.1.2) kódoló glk gént izolálni Corynebacterium glutamicumból.
A glk-gén vagy más gének Corynebacterium glutamicumból való izolálására ezután ennek a mikroorganizmusnak egy génbankját E.coli-ba visszük be. Génbankok bevitelét általánosan ismert tankönyvekben és kézikönyvekben leírták már. Példaként szolgáljon Winnacker kézikönyve: Gene und Klone, Eine Einführung in die Gentechnologie (Verlag
71.508/PA
Chemie, Weinheim, Deutschland, 1990) vagy Sambrook és társai kézikönyve: Molecular Cloning A Laboratoy Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989). Jólismert génbank az E.coli K-12 W3110 törzsei, amelyet Kohara és társai (Cell 50, 495-508, 1987) lambda-vektorokba vittek be. Bathe és társai (Molecular and General Genetics, 252:255-265, 1966) leírnak egy génbankot C. glutamicum
ATCC13032-ból, amelyet SuperCos I kozmid vektorok segítségével (Wahl és társai, 1987, Proceedings of the National Academy of Science USA, 84:2160-2164) NM554 E.coli K-12 törzsbe vittek be (Raleigh és társai, 1988, Nucleic Acids Research 16:1563-1575). Börmann és társai (Molecular Microbiology 6(3), 317-326, 1992) ugyancsak leírnak egy C. glutamicum ATCC13032-ből származó génbankot, pHC7 9 kozmidok alkalmazásával (Hohn és Collins, Gene 11, 291-298, 1980) .
Szintén lehetséges génbank előállítása E.coliban pBR322 (Bolivar, Life Sciences, 25, 807-818,1979) C. glutamicumból vagy pUC9 (Vieira és társai, 1982, Gene, 19:259-268) plazmidok alkalmazásával. Gazdaszervezetként különösen olyan E. coli törzsek szolgálnak, amelyeknek restrikciós és rekombinációs hibái vannak. Példa erre a DH5-á-mcr törzs, amelyet Grant és társai írtak le, (Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, 87, 1990, 4645-4649).
Kozmidokkal klónozott hosszú DNS fragmensek segítségével lehetséges ezután használatban levő, szekvenálásra alkalmas, vektorokba szubklónozni és szekvenálni, ahogy azt például Sanger és társai (Proceedings of the National
71.508/PA például Sanger és társai (Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 74:5463-5467, 1977) leírták.
Ilyen módon nyerhető az új glk . gént kódoló DNS szekvencia C. glu tárni curnból, amely az 1. azonosító számú szekvenciaként a jelen találmány része. A továbbiakban e DNS szekvenciából a fent leírt módszerrel a megfelelő fehérje aminosav-szekvenciái levezethetők. A 2. azonosítási számú szekvencia az így létrejött glk géntermékek aminosavszekvenciáit mutatja be.
Azok a kódoló DNS szekvenciák, amelyek az 1. azonosító számú szekvenciákból a genetikai kód degeneráltsága miatt keletkeznek, ugyancsak részei a találmánynak. A szakemberek előtt jól ismert továbbá a konzervatív aminosav csere például egy fehérjében a glicin cseréje alaninnal vagy a glutaminsav cseréje az aszparaginsavval - mint néma mutáció, ami a fehérje aktivitásában semmilyen alapvető változást nem idéz elő, azaz funkció-semleges. Ismeretes továbbá, hogy egy protein N- és/vagy C-terminálisainak változásai ezt a funkciót nem rontják, sőt stabilizálhatják. A szakemberek erre vonatkozó adatokat találhatnak többek között az alábbiaknál: Ben-Bassat és társai, (Journal of Bacterology, 169:751-757, 1987),
O'Reagan és társai, (Gene, 77:237-251, 1989), Sahin-Tóth és társai (Protein Sciences, 3:240-247, 1994), Hochuli és társai (Bio/Technology 6:1321-1325, 1988), valamint a genetika és mikrobiológia ismert tankönyveiben és kézikönyveiben. A 2. azonosító számú szekvenciából
71.508/PA megfelelő módon nyert aminosav szekvenciák, valamint ezeket az aminosav szekvenciákat kódoló DNS szekvenciák szintén részei ennek a találmánynak.
Hasonló módon részét képezik a találmánynak azok a DNS szekvenciák, amelyek a 1. azonosító számú szekvenciával vagy annak részeivel hibridizálnak. Alkotóelemei végül a jelen találmánynak azok a DNS szekvenciák, amelyeket az 1. azonosító számú szekvenciákból következő primerek alkalmazása révén polimeráz láncreakcióval állítunk elő. Az ilyen oligonukleotidok jellemzően legalább 15 nukleotid hosszúságúak.
A DNS szekvenciák hibridizálással történő azonosítására utalás található többek között az alábbi kézikönyvekben: The DIG System Users Guide for Hibridization (Firma Boehringer Mannheim GmbH Deutschland, 1993) és Liebl és társai (International Journal of Systematic Bacterology, 1991, 41:255-260). A DNS szekvenciák polimeráz láncreakcióval (PCR) végzett amplifikációjára utalást találhat a szakember többek között az alábbi kézikönyvekben: Gait: Oligonukleotide Synthesis: a Practical Approach (IRL Press, Oxford, UK, 1984) és Newton und Graham: PCR (Spectrum Akademischer Verlag, Heidelberg, Deutschland, 1994) .
A feltalálók rájöttek, hogy a korineform baktériumok a glk gének túlexpresszálása után tökéletesebb módon termelnek L-aminosavakat, különösen L-lizint.
A túlexpresszálás célja lehet, hogy a megfelelő gén r ··#
71.508/PA kópia száma megnő, illetve a promoter és szabályzó tartomány vagy a riboszóma kötő helye, amely a struktúra géntől upstream található, mutációt szenved. Azonos módon működnek az expressziós kazetták, amelyek a struktúra gén előtt épültek be. Gerjeszthető promoterek révén lehetséges emellett, a fermentatív L-lizin termelés folyamatánál növelni az expressziót. Ugyancsak javítható az expresszió az mRNS élettartamának megnövelésével. Ugyanúgy erősíthető továbbá az enzim aktivitás, az enzim fehérjék leépülésének megakadályozásával. A gének és gén-szerkezetek előfordulhatnak akár különböző kópia számmal a plazmidokban, akár a kromoszómákba integrálva és amplifikálva. Más megoldásként elérhető az adott gén túlexpresszálása, a közeg összetétele és a kultúra tenyésztés megváltoztatásával.
Utalás található ezekre, többek között, az alábbi forrásokban: Martin és társai (Bio/Technology 5, 137146,1987), Guerrero és társai, (Gene, 138, 35-41, 1994), Tsuchija és Morinaga (Bio/Technology 6,428-430, 1988), Eikmanns és társai (Gene, 10293-98, 1991), EP 0,472,869 számú európai szabadalmi leírás, US 4,601,893 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás, Schwarzer és Pühler (Bio/Technology 9, 84-87, 1991), Reinscheid és társai (Applied and Enviromental Microbiology 60, 126-132, 1994), LaBarre és társai (Journal of Bacterology 175, 10011007, 1993), WO 96/15246 számú PCT közzétételi irat, Malumbres és társai (Gene 134, 15-24, 1993), a JP-A-10
71.508/ΡΆ
229891 számú japán szabadalmi leírás, Jensen és Hammer (Biotechnologyand Bioengineering 58, 191-195, 1998), Makrides (Microbiological Rewiews 60:512-538, 1996), valamint ismert genetikai és mikrobiológiai tankönyvek.
Példaként a találmány szerinti glk gént plazmidok segítségével túlexpresszáljuk.
Plazmidként azok alkalmasak, amelyek a korineform baktériumokban replikálódnak. Számos ismert plazmid vektor a pHM1519, pBLl vagy pGAl kriptikus plazmidokon alapszik, mint például pZl (Menkel és társai, Applied and Eviromental Microbiology, 1989, 64:549-554), pEKExl (Eikmann és társai, Gene, 102:93-98, 1991), vagy pHS2-l (Sonnen és társai, Gene 107:69-74, 1991). Más plazmid vektorok, mint például olyanok, amelyek pCG4-en (US-A-4,489,160 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás) vagy a pNG2-en (Serwold-Davis és társai, (FEMS Microbiology Letters 66, 119-124, 1991), illetve a pAGl-en (US-A-5,158,891 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás) alapulnak, hasonló módon alkalmazhatók.
Alkalmasak továbbá olyan plazmid vektorok, a kromoszómába való integrálással történő génamplifikálásnál alkalmazott eljárásra, mint amelyeket például Reinscheid (Applied and Environmental Microbiology 60, 126-132, 1994) hom-thrB-operonok duplikálásával, illetve amplifikálásával kapcsolatban írt le. Ezeknél a módszereknél a teljes gént klónozzák egy plazmid vektorba, amelyiket egy gazda szervezetben (jellemzően E. coliban) , de nem C.
.Ü .·... ·’?·“/· · * 71.508/PA glutamicumban replikálhatnak. Vektorként szóba jöhetnek például a következők: pSUP301 (Simon és társai,
Bio/Technology 1,784-791, 1983), pK18mob vagy pK19mob (Schaffer és társai, Gene 145, 69-73, 1994), pGEM-T (Promega corporation, Madison WI, USA), pCR2.1-TOPO (Shuman, 1994, Journal of Biological Chemistry 269:2367884; US-A 5,487,993 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás), pCROBlunt (Firma Invitrogen, Groningen Niederlande; Bemard és társai Journal of Molrcular Biology, 23:534-541, 1993), vagy pEMl (Schrumpf és társai, 1991, Journal of Bacterology 173:4510-4516). A plazmád vektort, amely az amplifikálandó gént tartalmazza, ezt követőleg konjugációval vagy transzformációval· átviszik a kívánt C. glutamicum törzsbe. A konjugációs módszereket például Schaffer és társai írják le (Applied and Enviromental Microbiology 60, 756-759, 1994. A transzformációs módszereket például Thierbach és társai (Applied Microbiology and Biotechnology 29, 356-362, 1988), Dunican és Shivman (Bio/Technology 7, 1067-1070, 1989), valamint Tauch és társai (FEMS Microbiological Letters 123, 343-347, 1994) ismertetik. Az átkereszteződés segítségével végrehajtott homológ rekombináció után az így létrejött törzs az adott génnek legalább két másolatát tartalmazza.
További tárgya még a jelen találmánynak eljárás Laminosavak, különösen L—lizin fermentatív előállítására, egy plazmid vektorral transzformált törzs és a glükokináz enzimet kódoló génnek megfelelő nukleotid szekvenciát
71.508/PA tartalmazó plazmid vektor.
Emellett előnyös lehet aminosavak, különösen az L-lizin előállítására, egy vagy több enzim glk génje mellett a mindenkori bioszintézis utak a glikolizis, az anaplerotikus folyamatok, a citromsav-ciklus vagy az aminosav export fokozása, különösen túlexpresszálása.
így például lehetséges, az L-üzin előállítása céljából, egyidejűleg túlexpresszálni az alábbi csoportokból kiválasztott egy vagy több gént:
- a dihidro-dipikolinát-szintázt kódoló dapA gén (Ep-B 0,197-335 számú európai szabadalmi leírás) vagy,
- a feed back rezisztens, aszpartátkinázt kódoló lysC gén (Kalinowski és társai, 1990, Molecular and General Genetics 224:317-324), vagy
- a gliceraldehid-3-foszfát dehidrogenázt kódoló gap gén (Eikmanns, Journal of Bacterology 174:6076-6086, 1992) vagy,
- a trióz-foszfát izomerázt kódoló tpi gén, (Eikmanns, Journal of Bacterology 174:6076-6086, 1992) vagy,
- a 3-foszfoglicerát kinázt kódoló pgk gén, (Eikmanns, Journal of Bacterology 174:6076-6086, 1992) vagy, a piruvát karboxilázt kódoló pyc gén (Eikmanns, Journal of Bacterology 174:6076-6086, 1992) vagy,
- a malat-kinon-oxidoreduktázt kódoló mqo gén (Molenaar és társai, European Journal of Biochemistry 254,395-403, 1998), vagy
- a lizin exportot kódoló lysE gén, (DE-A 198 48 222
71.508/PA számú német szabadalmi leírás).
Emellett előnyös lehet az aminosavak, különösen L-lizin előállítására, a glk gén mellett az alábbiak egyidejű legyengítése:
a foszfátpiruvát-karboxilázt kódoló gén (DE 199 50 409.1 számú német szabadalmi leírás, DSM 13047) és/vagy a glükóz-6-foszfát izomerázt kódoló pgi gén (US 09/396,478 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás, DSM12969) .
Ezen túlmenően előnyös az L-aminosavak, különösen Llizin előállításakor a glk gének túlexpresszálása mellett a nemkívánatos mellék-reakciókat kiiktatni (Nakayama: Breeding of Amino Acid Producing Micro-organisms, in: Overproduction of Microbial Products, Krumphanzl, Sikyta, Vanek (eds.), Academic Press, London, UK, 1982).
A találmány szerint előállított mikroorganizmusok tenyészthetők folyamatosan vagy szakaszosan, rátáplálásos szakaszos fermentációval vagy ismételt rátáplálásos szakaszos fermentációval aminosavak különösen L-lizin termelése céljából. Az ismert tenyésztési módszerekkel kapcsolatos összefoglalás található Chmiel tankönyvében (Bioprozesstechnik, Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991), vagy Storhas tankönyvében (Bioreaktoren und periphere Einrichtungen, Vieweg Verlag, Braunschweig/Wiesbaden, 1994).
Az alkalmazott tenyésztési közegnek megfelelő módon kell kielégítenie a mindenkori törzsek igényeit. A különböző
71.508/PA mikroorganizmusok tenyésztési közegeinek leírása megtalálható az American Society for Bacterology (Washington D. C. USA) Manual of Methods for General Bacterology című kézikönyvében. Szén-vegyület forrásként cukor és szénhidrátok, mint például glükóz, szacharóz, laktóz, fruktóz, maihoz, melasz, keményítő és cellulóz, olajok, zsírok, mint például szójaolaj, napraforgó-olaj, földimogyoró-olaj és kókusz-olaj, zsírsavak, mint például palmitinsav, sztearinsav és linolsav, alkoholok, mint például glicerin és etanol, valamint szerves savak, mint például ecetsav, használhatók. Ezek az anyagok alkalmazhatók magukban vagy keverékként. Nitrogén forrásként felhasználhatók nitrogén-tartalmú szerves vegyületek, mint a peptonok, keményítő-kivonat, húskivonat, maláta-kivonat, cefreoldat, szójabab őrlemény és karbamid, illetve szervetlen vegyületek, mint az ammónium-szulfát, ammonium—klórid, ammonium—foszfát, ammonium—karbonát es ammónium-nitrát. A nitrogén-tartalmú vegyületek alkalmazhatók magukban vagy keverékként. Foszfor forrásként alkalmazható foszforsav, kálium-dihidrogén-foszfát vagy dikálium-hidrogén-foszfát, illetve az ezeknek megfelelő nátrium tartalmú sók. A tenyésztési közegnek tartalmaznia kell továbbá fémsókat, mint például magnézium-szulfátot vagy vas—szulfátot, amelyek szükségesek a növekedéshez. Végül bevihetők még a fentieken kívül esszenciális növekedést serkentő anyagok, mint az aminosavak és vitaminok. A fent felsorolt anyagok egyszeri, egy tételben
71.508/PA történő adagolással adhatók hozzá a kultúrához, illetve megfelelő módon táplálhatok be a tenyésztés folyamán.
A tenyészet pH-jának szabályozására lúgos vegyületeket, mint nátrium-hidroxidot, kálium-hidroxidot, ammóniát vagy szalmiák-szeszt, illetve savakat, mint foszforsavat vagy kénsavat adagolunk alkalmas módon. A habképződés szabályozására habzásgátlókat adunk hozzá, mint például zsírsav-poli-glikol-észtereket. A plazmidok stabilitásának fenntartására a közegnek megfelelő, szelektív hatású anyagokat, például antibiotikumokat adagolunk. Az aerob körülmények biztosítására oxigént vagy oxigéntartalmú gázkeveréket, például levegőt vezetünk a kultúrába. A tenyészet hőmérséklete normális körülmények között 20 ° C és 45 ° C között van, előnyösen 25 ° C és 40 ° C között. A tenyésztést addig folytatjuk, amíg maximális mennyiségű lizin keletkezik. Ezt a célt normál körülmények között 10160 óra alatt érjük el.
A találmány tárgya még eljárás L-aminosavak, különösen L-lizin fermentatív előállítására, amelynek során a következő műveleteket végzik:
a) az L-aminosavakat termelő korinerform baktériumok fermentációja, amelynek során legalább a glükokináz enzimet kódoló gént felerősítik, különösen túlexpresszálják.
b) az L-aminosavak feldúsítása a közegben, illetve a baktériumok sejtjeiben és
c) az L-aminosavak izolálása.
A lizin analízisét anioncserélő-kromatográfiával és az
71.508/PA azt követő ninhidrines származékképzéssel hajtjuk végre, ahogy ezt Spackman és társai (Analytical Chemistry, 30, 1958, 1190) leírták.
A találmány szerinti eljárás L-aminosavak, különösen Llizin fermentatív előállítására szolgál.
PÉLDÁK:
Jelen találmányt az alábbi példák közelebbről is megvilágítják.
1. Példa
Egy Corynebacterium glutamicum ATCC 13032-ből származó genom- kozmid génbank előállítása
Corynebacterium glutamicum ATCC 13032-ből kromoszomális DNS-eket izoláltunk - ahogy azt Tauch és társai (1955, Plasmid 33:168-179) leírták és Sau3AI restrikciós enzimmel (Amersham Pharmacia, Freiburg, Deutschland,
Produktbeschreibung Sau3AI, Code no. 27-0913-02) részlegesen hasítottuk. A DNS fragmenseket borjúbél lúgos foszfatázzal (Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, Deutschland, Produktbeschreibung SAP Code no. 1758250) defoszforizáltuk. A Stratagene cég által szállított (La Yolla, USA, Produktbeschreibung Supe Cosl Cosmid Vektor Kit, Code no. 251301) SuperCosl kozmid vektor (Wahl és társai, 1987, Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 84.2160-2164) DNS-ét az Xbal restrikciós enzimmel (Amersham Pharmacia, Freiburg, Deutschland, Produktbeschreibung BamHI, Code no. 27-0948-02) hasítottuk és hasonlóképpen borjúbél lúgos foszfatázzal
71.508/PA defoszforizáltuk. Végül a kozmid DNS-t a BamHI restrikciós enzimmel (Amersham Pharmacia, Freiburg, Deutschland, Produktbeschreibung BamHI, Code no. 27-0968-04) hasítottuk. Az ilyen módon kezelt kozmid DNS-t összekevertük a kezelt ATCC13032 DNS-el és az egészet T4-DNS-ligázzal (Amersham Pharmacia, Freiburg, Deutschland, Produktbeschreibung T4DNA-Ligáz, Code no. 27-0870-04) kezeltük. A ligációs keveréket Gigapack II XL Packing Extracts (Stratagene, La Jolla, USA, Produktbeschreibung Gigapack, II XL Packing Extract, Code no. 200217) segítségével fágokba pakoltuk. Az NM554 E.coli törzs (Raleigh és társai, 1988, Nucleic Acid Reeseach 16:1563-1575) fertőzése céljából a sejteket 10 mmol MgSO4-tal vettük fel és a f ág-szuszpenzió alikvót részével összekevertük. A kozmid bank fertőzését és titrálását úgy hajtjuk végre, ahogy azt Sambrook és társai leírták (1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor), amelynek során a sejteket, 100 ig/ml ampicillinnel, LB-agaron (Lennox, 1955, Virology, 1:190) szélesztettük. Éjszakán át 37 ° C-on történő inkubálás után a rekombináns egyedi kiónokat szelektáltuk.
2. Példa
A glk gének izolálása és szekvenciálása
Egy különálló kolónia kozmid DNS-ét Qiaprep Spin Miniprep Kit (Poduct No. 27106 Qiagen, Hilden Germany) segítségével a gyártó előírása szerint izoláltuk és Sau3AI restrikciós enzimmel (Amersham Pharmacia, Freiburg, Deutschland, Produktbeschreibung Sau3AI Produkt No. 2771.508/ΡΑ
0913-02) részelegesen hasítottuk. A DNS fragmenseket borjúbél lúgos foszfatázzal (Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, Deutschland, Produktbeschreibung SAP Produkt No.1758250) defoszforizáltuk. A gélelektroforézist követően, a QiaExII Gel Extraction Kit (Product No.20021, Qiagen, Hilden, Germany) segítségével a 1500-2000 bp nagyságrendű kozmid fragmenseket sikerült izolálni. A pZero-1 szekvencia vektorok DNS-eit (szállító Firma Invitrogen, Groningen Niederlande, Produktionsbeschreibung Zero Background Cloning Kit, Product No.K2500-01) BamHI restrikciós enzimmel (Amersham Pharmacia, Freiburg, Deutschland, Produktbeschreibung BamHI, Produkt No. 270868-04) hasítottuk. A kozmid fragmensek ligációját a pZero-1 szekvencia vektorokba úgy végeztük, ahogy azt Sambrook és társai leírták (1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor), amelynek során a DNS keveréket T4-ligázzal (Pharmacia Biotech, Freiburg, Deutschland) éjszakán át inkubáltuk. Ezután ezt a ligációs keveréket a DH5áMCR E.coli törzsbe (Grant, 1990, Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 87:4645-4649) elektoporáció segítségével vittük be (Tauch és társai, 1994 FEMS Microbiol Letters, 123:343-7) és 50 ig/ml zeocinnal, LB-agaron (Lennox, 1955, Virology, 1:190) szélesztettük. A rekombináns kiónok plazmád preparációját a Biorobot 9600-al (Product No. 90020, Qiagen, Hilden, Deutschland) hajtottuk végre. A szekvenálást Sanger és társai didezoxi-láncfelbontás! eljárásának (1977,
71.508/ΡΑ
Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 74:5463-5467) és Zimmermann és társai (1990, Nucleic Acids Research, 18:1067) által módosított módszerével végeztük. A PE Applied Biosystems (Product No.403044, Weiterstadt, Deutschland) RR dRhodanin Terminator Cycle Sequencing Kitjét használtuk. Ά Rotiphores NF Akrilamid/Bisz-akrilamid gélben (29:1) (Product No. A124.1, Roth, Karlsruhe, Deutschland) történő gélelektroforézis kiértékelését és a szekvencia elemzést, a PE Applied BioSystems, (Weiterstadt, Deutschland) ABI Prism 377 szekvenáló berendezésével hajtottuk végre.
A kapott nyers szekvencia adatokat ezután a Stadenprogramcsomag (1986, Nucleic Acids Research, 14:217-231) 97-0 verziója alkalmazásával dolgoztuk fel. A pZero-1 származék egyedi szekvenciáit összefüggő Contig-ba állítottuk össze. A komputerizált kódtartomány elemzést az XNIP programmal (Staden, 1986, Nucleic Acids Research, 14:217-231) hajtottuk végre. További elemzést a BLAST search programs (Altschul és társai, 1997, Nucleic Acids Research, 25:3389-3402) segítségével végeztünk, szemben a National Center for Biotechnology Information (NBCI, Bethesda, MD, USA) nem redundáns adatbankjával.
Az így nyert nukleotid szekvenciát az 1. azonosító számú szekvenciában mutatjuk be. A nukleotid szekvenciák analízise egy 969 bázispárból álló nyitott leolvasási keretet adott, amelyet glk génként jelöltünk. A glk gén egy 323 aminosavból álló fehérjét kódol.
71.508/PA
3. Példa pEC-K18mob2glkexp ingavektor előállítása glk gének felerősítésére Corynebacterium glutamicuiriban
3.1 A glk gének klónozása
Eickmanns és társai módszerével (Microbiology 140:18171828, 1994) kromoszomális DNS-t izoláltunk az ATCC 13032 törzsből. A glk géneknek a C. glutamicum vonatkozásában a 2. példából ismert szekvenciái alapján, a következő oligonukleotidokat választottuk ki a polimeráz láncreakcióhoz:
glk-exl:
5' ACT GAC GTG AGC CAG AAC 3' glk-ex2:
5' GAT CTA TCT AGA CAC CTA GTT GGC TTC CAC 3'
A bemutatott primereket az ARK Scientific GmbH Biosystems cég (Darmstadt, Deutschland) szintetizálta és Innis és társai standard PCR módszere szerint (PCR protocols. A guide to methods and applications, 1990, Academic Press) hajtottuk végre a Roche Diagnostics GmbH cég (Mannheim, Deutschland) Pwo-polimerázával. A polimeráz láncreakció lehetővé tette a primernek egy körülbelül 1,45 kb nagyságú DNS fragmens amplifikálását, amelyet a glk gén a potenciális promoter régióval együtt hordoz. Az amplifikált DNS fragmens DNS szekvenciáját szekvenálással vizsgáltuk meg.
3.2 A pEC-K18mob2 E. coli-C. glutamicum ingavektorok
71.508/PA előállítása
Az E. coli-C. glutamicum ingavektort a jelenlegi technika szerint állítottuk össze. A vektor tartalmazza a pGAl plazmid rep replikációs régióját, beleértve a per replikációs effektort (US-A 5,175,108 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás; Nesvera és társai, Journal of Bacteriology 179, 1525-1532, 1997), a kanamicin rezisztenciát közvetítő Transposon Tn5 aph (3')-IIa génjét (Beck és társai, Gene 19, 327-336, 1984), a pMBl plazmid oriV replikációs régióját (Shuttcliffe, Cold Spring Harbor Symposium on Quantitative Biology 43, 77-90, 1979), az lacZá gén fragmenst, beleértve lac promotert és egy többszörös klónozási hasítási szakaszt (multiple clonig site, mcs) (Norrander,JM és társai, Gene 26, 101-106, 1983), valamint az RP4 plazmid mob-régióját (Simon és társai, Bio/Technology 1:784-791,1983). A megszerkesztett vektort a DH5á E. coli törzsbe (Hanahan, In:DNA Cloning. A Practical Approach. Vol. I IRL-Press, Oxford, Washington DC USA) transzformáltuk. A plazmid hordozó sejtek szelekciója a transzformációs elegy 50 mg/1 kanamicinnel, LB-agaron (Sambrook és társai, Molecular cloning: a laboratory manual. 2nd Ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.) történő szélesztésével történt. A plazmid DNS-t egy transzformánsból a Qiagen cég QIAprep Spin Miniprep Kit-tel izoláltuk és az EcoRI és Hindin restrikciós enzimmel történő hasításával, illetve az azt
71.508/PA követő agaróz gélelektroforézissel (0,8 %) vizsgáltuk meg. A plazmidot pEC-K18mob2-nek neveztük el és az 1. ábrán mutattuk be.
A Budapesti Egyezménynek megfelelően a Deutscher Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen-nél (DSMZ, Braunschweig, Deutschland) az alábbi mikroorganizmust helyeztük letétbe:
- DSM 5715/pEC-K18mob2 C. glutamicum törzs, DSM 13245 nyilvántartási számon
3.3 glk gén klónozása a pEC-K18mob2 E. coli-C. glutamicum ingavektorba
Vektorként a 3.2 szakaszban leirt pEC-K18mob2 E. coli-C. glutamicum ingavektort alkalmaztuk. Ennek a plazmádnak a DNS-ét EC1136II restrikciós enzimmel teljesen széthasítottuk, majd borjúbél lúgos foszfatázzal (Roche Diagnostic GmbH, Mannheim, Deutschland, Produktbeschreibung SAP, Product No. 1758250) defofoszforizáltuk.
A 3.1 példa szerint leírt módon nyert glk fragmenst az előkészített pEC-K18mob2 vektorral összekevertük és a keveréket T4-DNS-ligázzal (Code no. 27-0870-04) kezeltük. A ligációs elegyet DH5ámcr E.coli törzsbe (Grant, 1990, Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 87:4645-4649) transzformáltuk. A plazmád hordozó sejtek szelektálása a transzformációs elegynek 25 mg/1 kanamicinnel LB-agaron (Lennox, 1955, Virology, 1:190) történő szélesztésével történt. Az egy éjszakán át 37 ° C hőmérsékleten végzett inkubáció után szelektáltuk a
71.508/PA • · ··9♦ ·9f· · _ * rekombináns egyedi kiónokat. A DNS plazmidot Qiarep Spin Miniprep Kit-tel (Product No. 27106, Qiagen, Hilden Deutschland) az előállító előírásai szerint izoláltuk és EcoRI meg Xbal restrikciós enzimekkel felhasítottuk, hogy a plazmidot az ezután következő agaróz gélelektroforézissel vizsgáljuk meg. A kapott plazmidot pEC-K18mob2glkexp-nek neveztük.
4. Példa
A RES167 Corynebacterium glutamicum törzs transzformálása pEC-K18mob2glkexp plazmiddal
Az RES167 C. glutamicum törzset (Schaffer A, és társai, Journal Bacteriological 176:7309-731, 1994) a pECK18mob2glkexp plazmiddal Liebl és társai által leírt (FEMS Microbiology Letters, 53:299-303, 1989) elektroporációs módszerrel transzformáltuk. A transzformánsok szelektálását 18,5 g/1 agy-szív táplevesből, 0,5 mól szorbitolból, 5 g/1 Bacto-Tryptonból, 2,5 g/1 bakto-élesztő extraktumból, 5 g/1 NaCl-ből és 18 g/1 Bacto-Agarból álló, LBHIS agaron hajtottuk végre, amelyet 25 mg/1 kanamicinnel egészítettünk ki. Az inkubációt 33 °C hőmérsékleten 2 napig végeztük.
A plazmid DNS-t a szokásos eljárással (Peters-Wendisch és társai, 1998, Microbiology, 144, 915-927, 1998) izoláltuk egy transzformánsból, EcoRI és Sáli restrikciós endonukleázokkal széthasítottuk, majd a plazmidot ezt követő agaróz gélelektroforézissel vizsgáltuk meg. A kapott törzset C. glutamicum RES167/ pEC-K18mob2glkexp-nek neveztük.
71.508/ΡΆ »>
5. Példa
Lizin előállítása
A 4. Példa szerint nyert C. glutamicum RES167/ pECK18mob2glkexp törzset egy lizin előállítására alkalmas tápközegben tenyésztettük és meghatároztuk a tenyészetben a lizin tartalmát.
Ezután a törzset agar lemezen a megfelelő antibiotikummal (agy-szív agar, 25 mg/1 tetraciklinnel) 33 °C hőmérsékleten 24 óráig inkubáltuk. Kiindulva ebből az agar lemez tenyészetből, beoltottunk egy előtenyészetet (10 ml közeg 100 ml-es erlenmeyer lombikban). Az előtenyészet közegekét a Cg III teljes közeget használtunk.
Cg III közeg
NaCl 2,5g/1
Bacto-Pepton 10g/1
Bacto-Yeast-Extrakt 10g/1
Glukóz (autoklávozott) 2 % (m/v)
A pH értéket 7,4 -re állítottuk be.
Ehhez 25 mg/1 kanamicint adtunk. Az előtenyészetet 33 °C hőmérsékleten rázógépen 240 rpm mellett 16 órán át inkubáltuk. Ebből az előtenyésztből főtenyészetet oltottunk, úgy, hogy a fő-tenyészet kezdeti OD-je (660 nm) 0,05 volt. A főtenyészethez az MM közeget használtuk.
MM közeg
CSL (kukorica áztató folyadék) g/1
71.508/PA
| MOPS | (Morfolin-propán-szülfonsav) | 20 g/1 |
| Glükóz | (autoklávozott) | 50 g/1 |
| (NH4)2SO4 kh2po4 | 25 g/1 0,1 g/1 | |
| MgSO4 | * 7 H20 | 1,0 g/1 |
| CaCl2 | * 2 H20 | 10 mg/1 |
| FeSO4 | * 7 H20 | 10 mg/1 |
| MnSO4 | * h2o | 5 mg/1 |
| Biotin | (sterilen szűrt) | 0,3 mg/1 |
| Tiamin CaCO3 | * HC1 (sterilen szűrt) | 0,2 mg/1 25 g/1 |
A CSL-t, a MOPS-t és a sóoldatot ammónia oldattal 7 pHra állítottuk be és autoklávban kezeltük. Ezután hozzáadtuk a steril szubsztrátum és vitamin oldatot, valamint az autolávban kiszárított CaCO3-t.
A tenyésztést 10 ml térfogatban hajtották végre 100 mles erlenmeyer lombikban. 25 mg/1 kamamicint adtunk hozzá. A tenyésztés 33 ° C hőmérsékleten történt, 80 % légnedvesség mellett.
óra elteltével 660 nm mérési hullámhosszon megmértük az OD-t Biomek 1000-el (Beckmann Instruments GmbH, München). A keletkezett lizin mennyiséget az EppendorfBioTronik cég (Hamburg, Deutschland) aminosav analizátora segítségével ioncserélő kromatográfiával és ninhidrin detektálású oszlop-derivatizálással határoztuk meg.
Az eredmények az 1. Táblázaton láthatók:
1. Táblázat
71.508/PA .:. .K. :·ί· :·7· ·.>
| Törzs | OD (660) | Lisin-HCl mg/1 |
| C. glutamicum RES167 | 13,8 | 287 |
| C. glutamicum RES167/ pEC- K18mob2glkexp | 15 | 345 |
Ábrák:
l .ábra: A pEC-K18mob plazmid .ábra: pEC-Kl8mob2glkexp plazmád
Az ábrán alkalmazott rövidítéseknek jelentése a következő:
| per: | apGAl kópiaszámot ellenőrző gén |
| or ÍV : | ColEl-hez hasonló origó a pMBl-ből |
| rep: | a C. glutamicum pGAl plazmid-kódolt |
replikációs
| tartománya | |
| RP4mob: | RP4-mobilizálási hely |
| Kan: | kanamicin rezisztencia gén |
| glk: | glk gén a C. glutamicum-ból |
| EcoRI: | az EcoRI restrikciós enzim hasítási helye |
| HindlII: | a HindlII restrikciós enzim hasítási |
helye
71.508/PA 29 ........
• · · · · · ·♦··♦♦» ♦ ' ·*
Ecll36II: az Ecll36II restrikciós enzim hasítási helye
71.508/ΡΑ
SZEKVENCIA LISTA <110> Degussa-Hüls AG <120> Új glk-gént kódoló nukleotid szekvencia <130> 990177 BT <140>
<141>
<160> 2 <170> Patentin Ver. 2.1 <210> 1 <211> 1540 <212> DNS <213> Corynebacterium glutamicum <220>
<221> CDS <222> (461)..(1429) <400> 1
| aaattccttg ggcgccttga | atatcaagat | atgatcaaca | cgcttgccgc | egeagatatt | 60 | |
| ttcgcgatgc | cagcgcgcac | ccgcggtggc | ggacttgatg | ttgaaggett | gggcattgtc | 120 |
| tatetegagg | cacaagcctg | cggagtgccg | gtgatagccg | gcacctctgg | cggcgcgcca | 180 |
| gagacggtga | ctccggcaac | tggcctggtt | gtggaggggt | eggaegtega | taagctgtct | 240 |
| gagettttaa | ttgagettet | cgacgatccg | atccgccgcg | ccgcgatggg | cgctgcaggt | 300 |
| agggcgcatg | tggaggeega | atggtcgtgg | gaaatcatgg | gggagcggtt | gaccaatatt | 360 |
| ttgcagagtg | aaccacgatg | atggttggac | agetgttgat | agetataett | tgaaagatta | 420 |
| aattcaccta | aatcctgtgt | agaacgcgag | gggcactctt | atg cca caa aaa ccg Met Pro Gin Lys Pro | 475 |
5 gcc agt ttc gcg gtg ggc ttt gac atc ggc ggc acc aac atg cga gcc523
Alá Ser Phe Ala Vai Gly Phe Asp He Gly Gly Thr Asn Met Arg Ala
1520 ggg ctt gtc gac gaa tcc ggg ege atc gtg acc agt ttg teg gcg ccg571
Gly Leu Val Asp Glu Ser Gly Arg He Val Thr Ser Leu Ser Alá Pro 25 3035 teg ccg ege acg acg cag gca atg gaa cag ggg att ttt gat cta gtc619
Ser Pro Arg Thr Thr Gin Ala Met Glu Gin Gly He Phe Asp Leu Val 40 4550
71.508/PA .1.,<
gaa cag etc aag gee gaa tac ccg gtt ggt get gtg gga ett gee gtc667
Glu Gin Leu Lys Ala Glu Tyr Pro Vai Gly Ala Vai Gly Leu Ala Vai
6065 geg gga ttt ttg gat oct gag tgc gag gtt gtt ega ttt gee ccg cac715
Ala Gly Phe Leu Asp Pro Glu Cys Glu Vai Vai Arg Phe Ala ProHis
75 8085 ott cet tgg ege gat gag cca gtg cgt gaa aag ttg gaa aac ett ttg763
Leu Pro Trp Arg Asp Glu Pro Vai Arg Glu Lys Leu Glu Asn LeuLeu
95100 ggc ctg cet gtt cgt ttg gaa cat gat gee aac tea gca geg tgg ggt811
Gly Leu Pro Vai Arg Leu Glu His Asp Ala Asn Ser Ala Ala TrpGly
105 110115 ag cat cgt ttt ggt gca get caa ggc get gac aac tgg gtt ttg ttg 859
Glu His Arg Phe Gly Ala Ala Gin Gly Ala Asp Asn Trp Vai Leu Leu 120 125130 gca etc ggc act gga att ggt gca geg ctg att gaa aaa ggc gaa att907
Ala Leu Gly Thr Gly lie Gly Ala Ala Leu Tie Glu Lys Gly Glu He 135 140145 tac cgt ggt gca tat ggc acg gca cca gaa ttt ggt cat ttg cgt gtt955
Tyr Arg Gly Ala Tyr Gly Thr Ala Pro Glu Phe Gly His Leu ArgVai
150 155 160165 gtt cgt ggc gga ege gca tgt geg tgt ggc aaa gaa ggc tgc ctg gag1003
Vai Arg Gly Gly Arg Ala Cys Ala Cys Gly Lys Glu Gly Cys LeuGlu
170 175180 cgt tac tgt tee ggt act gee ttg gtt tac act geg cgt gaa ttg get1051
Arg Tyr Cys Ser Gly Thr Ala Leu Vai Tyr Thr Ala Arg Glu LeuAla
185 190195 teg cat ggc tea ttc ege aac age ggg ctg ttt gac aag ate aaa gee1099
Ser His Gly Ser Phe Arg Asn Ser Gly Leu Phe Asp Lys He LysAla
200 205210 gat ccg aat tee ate aat gga aaa acg ate act geg gca geg ege caa1147
Asp Pro Asn Ser He Asn Gly Lys Thr He Thr Ala Ala Ala ArgGin
215 220225 gaa gac cca ett get etc gee gtt ctg gaa gat ttc age gag tgg ctg1195
Glu Asp Pro Leu Ala Leu Ala Vai Leu Glu Asp Phe Ser Glu TrpLeu
230 235 240245
71.508/PA ggc gaa act ttg gcg ate att get gat Gly Glu Thr Leu Ala lie lie Ala Asp 250 ate att ggt ggc gga ctg tee aat get lie lie Gly Gly Gly Leu Ser Asn Ala 265270 teg gtc aac cac tat tee ace ego ate Ser Vai Asn His Tyr Ser Thr Arg He 280285 ttg gca ege gtt gee aca get cag ttg Leu Ala Arg Vai Ala Thr Ala Gin Leu 295300 ggt gtc get gat eta get ega ege tet Gly Vai Ala Asp Leu Ala Arg Arg Ser 310 315 gtc ett gac cca ggc atg ate 1243
Vai Leu Asp Pro Gly Met He
255 260 gee gac ett tat ttg gat ege 1291
Ala Asp Leu Tyr Leu Asp Arg 275 gtc ggc gca gga tat ege cet 1339
Vai Gly Ala Gly Tyr Arg Pro 290 ggt gcg gat get ggc atg ate 1387
Gly Ala Asp Ala Gly Met He 305 gta gtg gaa gee aac 1429
Vai Vai Glu Ala Asn
320 taggtgtttt tcggtgggct gegatgaege atgtccacca aaagagccac cccttaaaga 1489 atcgtgggta a 1540 aattaaaaag tggttttggt agcttcgcag <210> 2 <211> 323 <212> PRT <213> Corynebacterium glutamicum <400> 2
Met Pro Gin Lys Pro Ala Ser Phe Ala 15
Thr Asn Met Arg Ala Gly Leu Vai Asp
2025
Ser Leu Ser Ala Pro Ser Pro Arg Thr
3540 lie Phe Asp Leu Vai Glu Gin Leu Lys 5055
Vai Gly Leu Ala Vai Ala Gly Phe Leu
6570
Vai Gly Phe Asp He Gly Gly 10 15
Glu Ser Gly Arg He Vai Thr 30
Thr Gin Ala Met Glu Gin Gly 45
Ala Glu Tyr Pro Vai Gly Ala 60
Asp Pro Glu Cys Glu Vai Vai 75 80
Arg Phe Ala Pro His Leu Pro Trp Arg Asp Glu Pro Vai Arg Glu Lys
71.508/PA
Leu
Glu
Asn
Leu
100
Leu
Gly
Leu
Pro
Vai
105
Arg
Leu
Glu
His
Asp
110
Ala
Asn
Ser
Al a
Ala
115
Trp
Gly
Glu
His
Arg
120
Phe
Gly
Ala
Ala
Gin
125
Gly
Ala
Asp
Asn
Trp 130
Vai
Leu
Leu
Ala
Leu
135
Gly
Thr
Gly
He
Gly 140
Ala
Ala
Leu
He
Glu
145
Lys
Gly
Glu
He
Tyr
150
Arg
Gly
Ala
Tyr
Gly
155
Thr
Ala
Pro
Glu
Phe
160
Gly
His
Leu
Arg
Vai
165
Vai
Arg
Gly
Gly
Arg 170
Ala
Cys
Ala
Cys
Gly
175
Lys
Glu
Gly
Cys
Leu
180
Glu
Arg
Tyr
Cys
Ser
185
Gly
Thr
Ala
Leu
Vai
190
Tyr
Thr
Ala
Arg
Glu
195
Leu
Ala
Ser
His
Gly
200
Ser
Phe
Arg
Asn
Ser
205
Gly
Leu
Phe
Asp
Lys 210
He
Lys
Ala
Asp
Pro
215
Asn
Ser
He
Asn
Gly 220
Lys
Thr
He
Thr
Ala
225
Ala
Ala
Arg
Gin
Glu
230
Asp
Pro
Leu
Ala
Leu
235
Ala
Vai
Leu
Glu
Asp
240
Phe
Ser
Glu
Trp
Leu
245
Gly
Glu
Thr
Leu
Ala
250 lie
He
Ala
Asp
Vai
255
Leu
Asp
Pro
Gly
Met
260
He lie lie
Gly
Gly
265
Gly
Leu
Ser
Asn
Ala
270
Ala
Asp
Leu
Tyr
Leu
275
Asp
Arg
Ser
Vai
Asn
280
His
Tyr
Ser
Thr
Arg
285 lie
Vai
Gly
Ala
Gly
290
Tyr
Arg
Pro
Leu
Ala
295
Arg
Vai
Ala
Thr
Ala
300
Gin
Leu
Gly
Ala
Asp
305
Ala
Gly
Met
He
Gly
310
Vai
Ala
Asp
Leu
Ala
315
Arg
Arg
Ser
Vai
Vai
320
Glu Ala Asn
Claims (22)
- 71.508/PASzabadalmi igénypontok:1. Korineform baktériumokból izolált polinukleotid, amely az alábbi csoportokból kiválasztott polinukleotid szekvenciákat tartalmazza:a) olyan polinukleotidok, amelyek legalább 70 %-ban azonosak a 2. azonosító számú szekvencia (SEQ ID NO) szerinti aminosav-szekvenciát tartalmazó polipeptidet kódoló polinukleotiddal;b) olyan polipeptidet kódoló polinukleotid, amely olyan aminosav szekvenciával rendelkezik, amelyik legalább 70 %ban azonos a 2. azonosító számú aminosav szekvenciával;c) olyan polinukleotid, amelyik az a) vagy b) szerinti polinukleotidok komplementere;d) olyan polinukleotid, amelyik legalább 15 egymásután következő - a), b) , vagy c) szerinti polinukleotid szekvenciájú nukleotidot tartalmaz.
- 2. Az 1. igénypont szerinti polinukleotid, amely polinukleotid a korineform baktériumokban replikálható, előnyösen rekombináns DNS.
- 3. Az 1. igénypont szerinti polinukleotid, amely polinukleotid egy RNS.
- 4. A 2. igénypont szerinti replikálható DNS, azzal jellemezve, hogy magában foglalja:71.508/PA (i) a 1. azonosító számú szekvencia szerinti nukleotid szekvenciát, vagy (ii) legalább egy olyan szekvenciát, amely a genetikai kód degenerációs tartományán belül megfelel az (i) szerinti szekvenciának, vagy (iii) legalább egy szekvenciát, amely az (i) vagy (ii) szekvenciákkal komplementer szekvenciával hibridizál, és adott esetben (iv) az (i)-ben a funkció-semleges néma mutációk.
- 5. A 2. igénypont szerinti polinukleotid szekvencia, ami olyan polipeptidet kódol, amely a 2. azonosító számú szekvenciának megfelelő aminosav szekvenciát tartalmaz.
- 6. Az 1. igénypont szerinti polinukleotid szekvenciát tartalmazó vektor.
- 7. A 6. igénypont szerinti vektort tartalmazó korineform baktérium.
- 8. Eljárás L-aminosavak, fermentatív előállítására, azzal jellemezve, hogy a következő műveleteket hajtjuk végre:a) az L-aminosavakat termelő korineform baktériumokat fermentáljuk, melynek során legalább a glükokináz enzimet kódoló gént felerősítjük, különösen túlexpresszáljuk;71.508/PAb) az L-aminosavakat egy közegben, illetve a baktériumok sejtjeiben feldúsítjuk, ésc) az L-aminosavak izoláljuk.
- 9. A 8. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan baktériumokat alkalmazunk, amelyekben az Laminosavak bioszintézis útjainak további génjeit felerősítjük.
- 10. A 8. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan baktériumokat alkalmazunk, amikben legalább részben kiiktattuk azokat az anyagcsere folyamatokat, amelyek az L-aminosavak képződését csökkentik.
- 11. A 8. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy egy plazmid vektorral transzformált törzset alkalmazunk, és a plazmid vektor a glukokináz enzimet kódoló gént hordozza.
- 12. A 8-11. igénypontok szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy olyan korineform baktériumokat használunk, amelyek L-lizint állítanak elő.
- 13. A 9. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy egyidejűleg a dihidro-pikolinát-szintázt kódoló dapA gént túlexpresszáljuk.71.508/PA
- 14. A 9. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy egyidejűleg a feed back rezisztens aszpartát-kinázt kódoló lysC gént túlexpresszáljuk.
- 15. A 9. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy egyidejűleg a gliceraldehid-3-foszfát-dehidrogenázt kódoló gap gént túlexpresszáljuk.
- 16. A 9. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy egyidejűleg a triózfoszfát-izomerázt kódoló tpi gént túlexpresszálj uk.
- 17. A 9. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy egyidejűleg a 3-foszfátglicerát-kinázt kódoló pgk gént túlexpresszáljuk.
- 18. A 9. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy egyidejűleg a piruvát-karboxilázt kódoló pyc gént túlexpresszáljuk.
- 19. A 9. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy egyidejűleg a malat-kinon-oxireduktázt kódoló mqo gént túlexpresszáljuk.
- 20. A 9. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy egyidejűleg a lizin exportot kódoló lysE gént túlexpresszáljuk.71.508/PA
- 21. A 10. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy egyidejűleg a glükóz-6-foszfát izomerázt kódoló pgi gén expresszióját gyengítjük.
- 22. A 10. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy egyidejűleg a fosztoenol-piruvát-karboxilázt kódoló pck gén expresszióját gyengítjük.A meghatalmazott li. Vyt _ £ J C' i \ -izetkSzi r, ’ nr Úja > Anr.issyút 113.J ; < । “>·' -1 f v ' ’
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE19958159A DE19958159A1 (de) | 1999-12-02 | 1999-12-02 | Neue für das glk-Gen codierende Nukleotidsequenzen |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| HU0004783D0 HU0004783D0 (hu) | 2001-02-28 |
| HUP0004783A2 true HUP0004783A2 (hu) | 2003-03-28 |
Family
ID=7931209
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| HU0004783A HUP0004783A2 (hu) | 1999-12-02 | 2000-12-01 | Új, a glk-gént kódoló nukleotid szekvenciák |
Country Status (16)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US20020040129A1 (hu) |
| EP (1) | EP1106694A1 (hu) |
| JP (1) | JP2001204481A (hu) |
| KR (1) | KR20010062078A (hu) |
| CN (1) | CN1305000A (hu) |
| AU (1) | AU7198800A (hu) |
| BR (1) | BR0005678A (hu) |
| CA (1) | CA2325227A1 (hu) |
| DE (1) | DE19958159A1 (hu) |
| HU (1) | HUP0004783A2 (hu) |
| ID (1) | ID28565A (hu) |
| MX (1) | MXPA00011815A (hu) |
| PL (1) | PL344237A1 (hu) |
| RU (1) | RU2000129933A (hu) |
| SK (1) | SK17942000A3 (hu) |
| ZA (1) | ZA200007078B (hu) |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE10032173A1 (de) * | 2000-07-01 | 2002-01-17 | Degussa | Neue für das plsC-Gen kodierende Nukleotidsequenzen |
| ES2319626T3 (es) * | 2001-11-19 | 2009-05-11 | Medigene Ag | Farmaco para el tratamiento de enfermedades tumorales y de la piel virales. |
| DE10162730A1 (de) | 2001-12-20 | 2003-07-03 | Degussa | Allele des glk-Gens aus coryneformen Bakterien |
| US7915018B2 (en) * | 2004-10-22 | 2011-03-29 | Ajinomoto Co., Inc. | Method for producing L-amino acids using bacteria of the Enterobacteriaceae family |
Family Cites Families (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH0655149B2 (ja) * | 1985-03-12 | 1994-07-27 | 協和醗酵工業株式会社 | Ｌ―リジンの製造法 |
| DE69334150T2 (de) * | 1992-05-14 | 2008-03-13 | Baylor College Of Medicine, Houston | Mutierte steroidhormonrezeptoren, methoden für ihre benutzung und molekularer schalter für gentherapie |
| DE19644567A1 (de) * | 1996-10-26 | 1998-04-30 | Forschungszentrum Juelich Gmbh | Mikrobielle Herstellung von Substanzen aus dem aromatischen Stoffwechsel / II |
| DE19644566A1 (de) * | 1996-10-26 | 1998-04-30 | Forschungszentrum Juelich Gmbh | Mikrobielle Herstellung von Substanzen aus dem aromatischen Stoffwechsel / I |
| DE19818541C2 (de) * | 1998-04-24 | 2003-04-10 | Forschungszentrum Juelich Gmbh | Mikrobielle Herstellung von Substanzen aus dem aromatischen Stoffwechsel / III |
| DE19924365A1 (de) * | 1999-05-27 | 2000-11-30 | Degussa | Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Aminosäuren und für das accDA Gen codierende Nukleotidsequenzen |
| KR20070087092A (ko) * | 1999-06-25 | 2007-08-27 | 바스프 악티엔게젤샤프트 | 탄소 대사 및 에너지 생산과 관련된 단백질을 코딩하는코리네박테리움 글루타미쿰 유전자 |
| JP4623825B2 (ja) | 1999-12-16 | 2011-02-02 | 協和発酵バイオ株式会社 | 新規ポリヌクレオチド |
-
1999
- 1999-12-02 DE DE19958159A patent/DE19958159A1/de not_active Withdrawn
-
2000
- 2000-11-24 EP EP00125716A patent/EP1106694A1/de not_active Withdrawn
- 2000-11-24 ID IDP20001019D patent/ID28565A/id unknown
- 2000-11-27 SK SK1794-2000A patent/SK17942000A3/sk unknown
- 2000-11-29 MX MXPA00011815A patent/MXPA00011815A/es unknown
- 2000-11-29 JP JP2000363632A patent/JP2001204481A/ja active Pending
- 2000-11-29 CA CA002325227A patent/CA2325227A1/en not_active Abandoned
- 2000-11-30 ZA ZA200007078A patent/ZA200007078B/xx unknown
- 2000-11-30 US US09/725,898 patent/US20020040129A1/en not_active Abandoned
- 2000-12-01 HU HU0004783A patent/HUP0004783A2/hu unknown
- 2000-12-01 CN CN00134610A patent/CN1305000A/zh active Pending
- 2000-12-01 RU RU2000129933/13A patent/RU2000129933A/ru not_active Application Discontinuation
- 2000-12-01 PL PL00344237A patent/PL344237A1/xx not_active Application Discontinuation
- 2000-12-01 BR BR0005678-2A patent/BR0005678A/pt not_active IP Right Cessation
- 2000-12-02 KR KR1020000072627A patent/KR20010062078A/ko not_active Withdrawn
- 2000-12-04 AU AU71988/00A patent/AU7198800A/en not_active Abandoned
-
2002
- 2002-07-18 US US10/197,541 patent/US6913910B2/en not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| ID28565A (id) | 2001-06-07 |
| US20030022320A1 (en) | 2003-01-30 |
| US6913910B2 (en) | 2005-07-05 |
| KR20010062078A (ko) | 2001-07-07 |
| MXPA00011815A (es) | 2002-06-04 |
| HU0004783D0 (hu) | 2001-02-28 |
| AU7198800A (en) | 2001-06-07 |
| JP2001204481A (ja) | 2001-07-31 |
| PL344237A1 (en) | 2001-06-04 |
| SK17942000A3 (sk) | 2001-10-08 |
| CA2325227A1 (en) | 2001-06-02 |
| DE19958159A1 (de) | 2001-06-07 |
| EP1106694A1 (de) | 2001-06-13 |
| BR0005678A (pt) | 2001-08-21 |
| RU2000129933A (ru) | 2003-01-10 |
| CN1305000A (zh) | 2001-07-25 |
| ZA200007078B (en) | 2001-06-06 |
| US20020040129A1 (en) | 2002-04-04 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US6632644B2 (en) | Nucleotide sequences which code for the zwa1 gene | |
| EP1109915B2 (en) | Nucleotide sequences for the tal gene | |
| US6740742B2 (en) | Nucleotide sequences encoding the dapC gene and process for the production of L-lysine | |
| EP1287143B1 (en) | Corynebacterium glutamicum nucleotide sequences coding for the glbo gene | |
| US6913910B2 (en) | Nucleotide sequences coding for the glk-gene | |
| AU7254800A (en) | New nucleotide sequences coding for the ptsH gene | |
| US6830921B2 (en) | Nucleotide sequences which code for the ACP gene | |
| US6806068B1 (en) | Nucleotide sequences which encode the pfk gene | |
| US6949374B2 (en) | FadD15 gene of Corynebacterium glutamicum, encoding an acyl-CoA synthase polypeptide | |
| US20030224499A9 (en) | Nucleotide sequences encoding the ptsH gene | |
| KR20010051876A (ko) | ｐｆｋＡ 유전자를 암호화하는 신규한 뉴클레오타이드 서열 | |
| US6987015B1 (en) | Nucleotide sequences encoding the pfkA gene | |
| EP1278860B1 (en) | Nucleotide sequences which code for the cma gene | |
| US6562607B2 (en) | Nucleotide sequences coding for the cls gene | |
| US6638753B2 (en) | Nucleotide sequences which code for the cma gene | |
| US20040092710A1 (en) | Nucleotide sequences coding for the cdsA gene | |
| US20020155555A1 (en) | Nucleotide sequences which code for the pgsA2 gene | |
| US20020034794A1 (en) | Nucleotide sequences which encode the gpsA gene | |
| EP1278857A1 (en) | Nucleotide sequences which code for the fadd15 gene | |
| KR20020097244A (ko) | ｐｇｓＡ2 유전자를 암호화하는 신규한 뉴클레오타이드 서열 | |
| KR20020097251A (ko) | ｃｌｓ 유전자를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열 |