HU229283B1

HU229283B1 - Microbiological method for producing amides

Info

Publication number: HU229283B1
Application number: HU0401111A
Authority: HU
Inventors: Karen Tracey Robins; Toru Nagasawa
Original assignee: Lonza Ag
Priority date: 2001-01-09
Filing date: 2002-01-08
Publication date: 2013-10-28
Also published as: DE50213120D1; CN1316010C; MXPA03006149A; CA2432060C; CA2432060A1; WO2002055670A1; IL155996A0; JP2004516849A; KR20080099348A; NO20033116L; EA200300749A1; US7838271B2; EP1352050B1; HUP0401111A2; IL155996A; ATE417919T1; PL365921A1; EP1352050A1; KR100880143B1; PL208060B1

Description

A találmány legalább 3 M konceatrációjó aeetonitriit tolerálni képes mikromganizíntiscslcra, nitrií-hldratáz aktivitása ettzijnre, amldok előállítására alkalmas, az említett mikroorganizmusok, 111. enzim alkalmazásán alapuló eljárásra, valamint a mikroorganizmusok aeetoniíril-hulladék megszüntetésére történő alkalmazására vonatkozik.

Amdok, például mkotinsav-amíd - amely a fí-vstamitt-komplex ember és állat számára esszenciális vitaminja - előállítására már több biotechnológiai eljárás ismert.

Az, EF-A 0 307 936 például a-cíano-piriáin Rkodonvccvs rfanfocfirous 1i segítségével történő, nikotinsavanridoí eredményező átalakítását írja le. Az eljárás hátránya, hogy a fih&dococct® rh&dockra&s 31 piros szína, így a termék elszlneződik. Emellett az említett mikrootgastiztansokn.sk a j-ciano-piridm sznbsztrátmnra vonatkozóan nagy a K^-énéke, hőmérséklet- és 3-ciano-plridm-türése csekély.

Á WÖ 99/05306 szerint nikotinsavamidot a megfelelő nitrilből kiindulva lehet előállítani Rhodoceectts, Amyc&seí&pAs és Actixomackra nemzetiségű mikroorganizmusok segítségével. Az eljárás hátránya, hogy az AmyctAaiöpsís mikroorganizmusok magasabb hőmérsékleten maktivalödnak. Emellett d-eisno-prridin- és niketínsavamid-fürése csekély; a leirt Rkvaococeits nemzetiségű mikroorganizmusok 3-ciano-piridinGel kapcsolatos K_M-értéke nagy, hómérsékleti stabilitásuk alaesmty. Ennek alapján az eljárás ipari kivitelezésére alkalmatlan.

A találmány feladata olyan mikroorganizmus megtalálása volt, amelynek nagyobb a stabilitása, például a 3-cíanö-pirídin szubsztrátummal szemben kisebb a KM-értéke, ezért amldok előállítására alkalmas gazdaságosabb, a megfelelő amidot igen jó hozammal és: jó tisztaságában szolgáltató eljárásban alkalmazható. A fenti feladatot az. 1, igénypont szerinti mikroorganizmusokkal, az 5, vagy 7. igénypont szerinti enzimmel és a S. igénypont szerinti eljárással oldottuk meg..

A találmány szerinti mikroorganizmusok megfelelő szelektálással például talajmintákból, iszapból vagy szennyvízből a szokásos mikrobiológiai technikák alkalmazásával elkalóuíöíetők. A mikroorganizmusokat célszerűen C-forrásként (1) általános képletö piriditt-aldoximot tartalmazó közegben, kohaltíonok és például élesztők!vonat és/vagy ammóniumsók jelenlétében szelektáljuk, A kapott tenyészetek közül azokat választjuk ki, amelyek képesek legalább 3 M koncentrációjú acetonitrih tolerálni, továbbá képesek rútrih, példát;! 3-cianopíridint és acetonitrih a megfelelő amiddá alakítani.

Psridln-aidoxímként pirsdsn-2-, pindín-3- vagy piridm-4~aldoxlmof alkalmazhattmfc.

A szelektáláshoz előnyösen azok a nitrüek alkalmazhatók, amelyek a későbbi híofranszfortnálás során szubsziráíxnnkéní kerülnek alkalmazásra, tehát például acetonltril (ecetsavnitrii), propiosííril, butironitdl, kroíonsavnitril, adípinsavnhrll és malorísavuüril.

A kobaltionok forrásaként az un. „kobaltionokat generáló kobaitvegyületek”-et részesítjük előnyben, ilyenek például Co²*- vagy Co'^f-sök, igy kobak-klorid, kobak-szulfát és kebalt-acetát, Előnyösen kobalfvegyületként Co—sót, például kobalí{il)-kloridot alkalmazunk, A tenyésztést azonban fém-kobalt vagy más kobalívegyüietek jelenlétében Is végezhetjük. Általában a kobak vagy kobaltvegyüiet 1-39 mg/1, előnyösen Ί -20 mg/1 mennyiségben; van: jelen a közegben.

Ammónuimsöként például ammómtmi-foszfáí, így (ΝΗνχΗΡΟ,? vagy (NH,_t}'H;;PO4 jöhet számításba.

A mikroorganizmusokat a tulajdonképpen; feiotranszformáiás előtt alkalmas előtenyésztésí közegbet;

tenyésztjük. Alkalmas közegek például a 3, és 3. táblázatiján megadottak.

9SÍW-S535 SL/kov

Az: előteuyésztés általában 2ö °C és· 40 -°C közötti hőmérsékleten és 5 és S közötti pB-érték mellett, előnyösen 25 ^CC és 35 °C között! hőmérsékleten és 6 és 7,5 közötti plf-érték mellett történik.

Áz elöíenyészfés során előnyős, ha a hatásos enzimeket, a nitfii-hídratázokat enzim-iadnktor adagolásával indukáljak,

Bnzim-induktorként az alábbiakat soroljak fel: telített vagy telítetlen alifás nitrilek vagy a megfelelő antldok, igy CrCr-alkánaitrifek,. például btttirosittik izobüllronítrih vateriáíssav-aftril vagy tzovaleriánsav-silril, vagy C_s-Cj-alkén-nttrilek, példán! nsetakrilntól vagy krotonsav-niíril; alifás amidként minden C_?-C_?-alkánantid, példán! buíirarnid. ízobutirarnid. valeríánsav-amid vagy propíonsav-anatd, vagy Cj-C-raikénamídök, így például metakríiamid vagy kroí<msav~;mnd alkalmazható. Előnyös enzim-induktorok a metakrilamid, btttlramíd, íz.obutlrantiö, valeriánsav-anrid, meí&krihntrU, krotonsav-smíd, butiromtril és izobutíronitríl, Különösen előnyösen metakrilnitnlí alkalmazunk enzíni-índnktofként.

A találmány szerinti nrikröorgarúzsnusök legalább 3M koncentrációjú acetonitrilt tolerálnak. Ezen az értendő, hogy 3 M aeetonítrilt tartalmazó, 7,0 pH-értékü 0,1 M káliurrdoszfát-pulferben 20 C-on végzett egy órás inkubálás után az enzim-aktivitás stabil, vagyis az akti vitás-veszteség legfeljebb lő %. Előnyös mikroorganizmusok legalább 6 M scetomírii~konce?ttráetot tolerálnak egy órán át a fenti körülmények között legfeljebb 50 % aktivitás-veszteség mellett Különösen, előnyös tókroorganizmusok legalább 9 M acetonlttil-koncenmáelót tolerálnak egy órán át a lenti körülmények közölt legfeljebb 70 % aktivitás-veszteség mellett, A legelőnyösebb mikroorganizmusok esetén az enzimaktívitás még 15 M és 19 M aeetomtrii-koneeníráeió (ez. tiszta acetonitrilnek felel meg) mellett végzett több perces ínkübálás után is stabil 15 M acetonttrílben végzett tíz perces inkubálás után: az enzimaktí vitás csökkenése 10 %-nál kisebb.

A találmány szerinti mikroorganizmusok höstabilitása nagy, azaz nagy hőmérsékleten stabilitásuk az eddig ismert mikroorganizmusokhoz képest nagyobb. A találmány szerinti mikroorganizmusok enzimaktivitásának csökkenése 7,0 pB-ártékü 0,1 M kálium-fószfát-pnfferbeu 60 C-on 1 órán át végzett ínköbálás titán legfeljebb lő %, azonos körülmények között végzett 2 órás: inkubálás után legfeljebb 40 %.

Enzimaktivifúson itt a núrii-hídratáz-aktivítást, különösen a a-cíano-pirídín szubsztrátitorra vonatkozó níirü-hidratáz-akfivitást értjük.

A találmány szerinti rnikroorgaHizmusnk további tulajdonságai: nagy tolerancia a szabsztr&tumként előnyösen alkalmazott 3-ci;n!o-piridumel és az ebből keletkező nikoíinsavamíd termékkel szemben, 3-cianoptddinre vonatkozóan alacsony K_M-érték. Különösen kiváló tulajdonság, hogy a mikroorganizmusok az acetarnidot nagyobb koncentrációban képesek akkumulálni, mmt a 30 °C hőmérsékleten telített acetamid-oldat koncentráció ja (kb. '320-230 g acetamid/lÖÖ ml víz).

Előnyös mikroorganizmusok a ftö&d&cüzeus nemzetiséghez tartoznak. Olősösen előnyös a Fhodvcöccus sp. FZ4 sz. törzs és annak funkcionálisan ekvivalens variánsai és mutánsai. Funkcionálisan ekvivalens variánsokon és mutánsokon, az olyan variánsokat és mutánsokat értjük; amelyek képesek acetonitrilt legalább 3M koncentrációban tolerálni:. Igen előnyösek a „pígment-negaiiv” Aőcdococcus törzsek, azaz a kívánt tennék elszíneződést előidéző piros színnel nem rendelkező törzsek. Az ilyen törzsek, adott esetben könnyen létrehozhatók plgrnemképző míkroorgunizmusokböl UV-besugársással vagy mntagén vegyszerekkel előidézett mutagenézís útján.

A PhüdocGcctis sp. FZ4 sz. törzset 2ŐÖ0.Ő7.1 i-én a Mikroorganizmusok és Sejíkuitúrák Német Gyüjteményébets GmbH (DSMZj [Mascberoder Wcg 1b, D-38124 Braunschweig] A Budapesti Szerződés értelmében helyeztük letétbe DSM 13597 szám alatt. Ez a törzs- azonosítás;! adatai alapján egyik eddig ismert R&oí&xíwcks •tájhoz sem veit hozzárendelhető, ezért-őj fajhoz le® hozzárendelve.

A J?feífoeoe««s «ρ; FZ4 sz. törzs foakci-ooőlisa® ekvivalens variánsai és mutánsai vagy spontán mutáció vagy például ÜV«hesagárzás vagy rm-nagén vegyszer hatására jönnék létre. A Modococess ap: FZ4 sz. törzs előnyös funkcionálisan- ekvivalens variánsai és mutánsai „pigmenf-aegattV’ változatok, azaz nem rendelkeznek piros festékkel, amely a kívánt termék elszíneződéséi okozhatják.

Az enzimkivon&t például a rmkreorgamzmusök feltárásával nyerhető, ez történhet például ultrahanggal, francia préssel vagy Mzezhnes; módszerrel.

A találmány szerinti, nltríi-hidratáz-atóvitású enzimek a fest leírt mikroorganizmusokból nyerhető, előnyösen a Modocomts nemzettség mfeoorgamzmnsaihdl, különöse» előnyösen a A PboaGnocc^s sp FZ4 sz. törzsből (DSM 1.3- 597).

Ezeknek az enzimeknek az alábbi tulajdonságai vaunak:

a) K_M-értékük az acetonitril szubsztrátum vonatkozásában 2,S4 ± 1,00 mM, a 3-ciaao-ptriáin szöbszírátam vonatkozásában 80,5 ± 15,ö mM, Ö,ÖS M káhum-íbszíát-pufferben, pH 7,0 és 20 ^öC mellett;

b) pH-optimumak 6,5 ± 1,0- pH, 0,05 M feáham-foszlát-pnfferben, 20 ^aC mellett.

Az enzimek - 1-lPLC segítségével meghatározott - móltómege 465 + 50 köa.

A tulajdonképpeni hiötrmtszformálás a fentiekben leírt miktoorganÍ2nmsokktó, ezekből felvont enzim kivonattal vagy az elkülönített enzimekkel történhet A biotrwszfonnáiási. előnyösen a Xhodococcas ,tp. FZ4 mikroorganizmussal^: végezzük.,

A biotranszfermálás smbsz&átómaként (11) általános képletó nitníeket alkalmazhatunk. A (11) általános képletben R^?l jelentése Cf-C6-alkil~ vagy Cj-Ci-alkemlcsopon: vagy (IV) általános képlető csoport, amelyben X jelentése -N- vagy -CH~, őrig R² és R^$ -egymástól függetlenül hidrogénatomot, halogénatomot C;-Cfl—ai:kí.l· vagy Cj-Ce-alkenilesoportotjelenf,

A Ct-Q-alkilcsopmt lehet metil-, etil-, propil-, izopropil-, buti!-, tefc-featll-, IzoŐntii-, péitól-, hexllcsoport és a pentil- és hexílesoporf iaomerjei. A Cj-Cj-alkenü-cseport példájaként az alábbiakat soroljuk fel: vínli-, allil-, í-propén-l-il- é-s í-propén-241-esopetí.

A halogénatom lehet fluor-, klór-, bróm- vagy jődafont.

A (U) általános képlető nitrilek előnyös képviselői az alábbiak: acetonitril, btdironitól, akriteifril, propsonitril, krotons-avnitrrl, 2-ciano-piridm, 3-eianö-píridm, 4-eiano-piridin, benzonitríl, fiuor-benzonitól, kiörbenzonitrii és 'bróm-benzonhrii. Szafesztrtamként a legelőnyösebb az acetonitril és a 3-eimo-pirtóm..

A biofranszformálást előnyösen egyszeri vagy folyamatos szohsztrátum-adagolással végezzük. Szakember hídja, hogy a szubsztrátóm alkalmazandó koncentrációja az alkalmazott szabsztrátum oldhatóságától

Az. eljárást előnyőse» nyugvó (nem növekedő) sejtekkel valósítjuk meg.

A hiotranszformálás közegeként a szakterületen szokásos közegeket alkalmazhatjuk, például híg fosztát-puffert, HEPES-pnifert, cítrái-poffert és borát-paffert, Híg föszfát-pufferon előnyösen ö,01 -0,5 M tőszfátpatfert, különösen előnyösen 0.05--0,25 M foszfát-paffért ériünk.

A biütranszíbrrnáfást előnyőse® 5 *C és 50 °C közötti, különösen előnyösen 20 °C -és 40 °C közötti hőmérsékleten valósítjuk meg. A pH-érték előnyösen 5 és 18- közötti, különösen előnyöse® 6 és 7,5 közötti,

A (H) általános képletű nnrii átalakulása titán a megfelelő (Hl) általános .képletó anúdot - e képletben

R.’ jelentése a fenti - adott esetben a sejtek elkülönítése utáa a szokásos feldolgozási módszerek, például kristályosítás vagy porlasztva. szárítás segítségével izolálhatjuk.

A találmány további tárgya a leírt mikroorganizmusok, különösen a Kóedoccceus nemzetiséghez tartozó inikroorgasizmusok alkalmazása acetonírril-huliadék megszüntetésére.

Az acetonitril olyan oldószer, amelyet például a nagynyomású félyaáéldcr©exategmRás eljárások során alkalmaznak és amelyet végSl 'hulladékként áríaltsallantíatn kell. Áz acetouitril-hulladék találmány szerinti ártalmatlanításánál az scetoxútril koncentrációja 19 M lehet,, ez tiszta acetonitriluek felel meg. Előnyösen 9,2515,0 M, célszerűen l-lö M koncentrációjú acetcnixril-oldstot, 111, -sznszpenziót alkalmazunk.

Acetönittíi-bulladék. megszüntetésekor a mikroorganizmusokat előnyösen 5 °C és 50 C közötti, célszerűéit 20 *C. és 40 *C közötti hőmérsékleten alkalmazzuk. A plí-érték előnyösen 5 és 10 közötti, célszerűen 6 és 8 közötti.

A hulladékkezelés során az acetonitril aceíaxnid reakció időtartama az acetonitril koncentrációjától függ. Ha például az. acetouitríi-oldat, íll. -szuszpenzló koncentrációja 9,5 M, pH 7,0 és kb. 20 *C hőmérséklet mellett az átalakulás mintegy 2 órát vesz igénybe.

Az FZ4 (DSM 13597) törzs azonosítása

A) Kemo-taxonomisi Ismérvek:

1. A pepridogiskán diagnosztikai aminosavat mszo-áiunrino-pimelinsav

2. Mikoigavakt C«-C48 lánchosszúságú míkolsavak vannak jelen

3. Zslrsavösszetétsd:; lineáris, telített és telítetlen zsírsavak, nagy részarányban íaberkulö-szícarinssv. Az

FZ4 törzset: a zslrsavösszeíetel alapján azonosították a Rbadoccccus nemzetiség tagjának.

B) Hagyományos ismérvek

Az F24 törzs sejtjeinek makroszkópos megjelenése és morfológiája a /Őkk/ococcss’ Fta&cfcre»s-hoz hasonlít .Az FZ4 törzs telepei lazaepirosak (RAL 3ö22), a fiatal tenyészet elágazó Álfákat fejleszt, amelyekből pálcikák és kokkuszok lesznek,

A kemo-taxonómial és a hagyományos Ismérvek alapján az ,FZ4 törzset a R/mdococazs fdedosbrenshoz. tartozónak azonosították, de a korrelációs tényező alacsony.

C) A lös rDNS első 509 feázisásak-elemzése

A 1 ős rDNS első 590 bázisának szekvenciája csak 97,7 %-ig hasonlít a ffkodococcíís rAodookroas fajta tipikus képviselőjéhez, a Pbadaeaecus rti&d&ekr&us DSM 43241-hez, és 99,1 %-ig: egy másik Rkoáeevceus Mxfatne refereueiatörzsfeöz. Tekintettel arra, hogy az FZ4 törzs 16S rDNS-a első 500 bázisának szekvenciája 99,5 %-«ái kisebb azonosságot mutatott a Rbad&CGccns rhad&tör&tts DSM 43241 megfelelő szekvenciájával, az FZ4 törzset nem lehet .ifitottbeoeeto záodocő«Mi5-hoz tartozónak tekinteni. Ezért az EZ4 törzset a Rbodococcíís nemzetiségen belüli áj fajtaként azonosították.

Ábrák;

1. ábra: acetonitril -» scstamid biotranszförtuálás sdtáodococcíís sp, EZ4 törzs nyugvó sejtjeivel;

2. ábra; a Moáococctis sp. FZ4 törzs: nyugvó sejtjei nittil-bidraláz-aktivitásának hőmérsékleti optimuma:

3. ábra: a Sóodococeus sp. FZ4 törzs nyugvó sejtjei nitríl-hidratáz-akfivitásának hő-stabilitása;

4. ábra: a Róodococ-í?us sp. FZ4 törzs nyugvó sejtjei niirii-hldratáz-aktivltásásak pH-optíjnuma;

5. ábra·: a Rbcdacaccus sp, PZ4 törzs nyugvó sejtjei: niírii-hídratáz-aktivitásáusk plí-stabditása;

6. ábra: a Rhodocacctts sp. FZ4 törzs nyugvó sejtjei niírjl-hidratáz-skíivitásájsak S-ciatto-plriötnuel szembeni toleranciája;

7. ábra: a Rfaxfocoeeiis sp. E£4 törzs nyugvó sejtjei nitril-hidratáz-aktivitásának nikotissav-amiddai szembeni toleranciája;

S, ábra: az scstoniiríl-koncenlráclónak a Rfiodsícaccus sp.. ΪΖ4 törzs nyugvó sejtjeinek ítitfil-mdratázaktivitására kifejteti befolyása az acetoEHtril --> aceíamid biotranszformálás során;

9. ábra; az acelomírtl-koncentrácittek a /óWőceccus sp. FZ4 törzs· nyugvó sejtjeinek nkril-hidralázaktivitására gyakorolt befolyása;

10. ábra; a Áöadoooccm' sp. FZ4 törzs nyugvó -sejtjeinek, nhril-hidratáz-akíivitása a 3-cíauo-piriáin koncentrációjának függvényében;

11. ábra; a. uitríl-hidratáz és a referencia-proteinek móltöfnegének iogarimmsa a HPtC-reteneiós idő függvényében;

12. ábra: a ttftril-hidratáz-alegs'ségmk ás a referencia-proteinek xnóMömegének íögartansa az SDS Page RFérték függvényében;

13. ábra: a ÁáoJococe&r sp. FZ4-ból nyert tisztított nitaí-indratáz aktivitása a S-ctano-pindín koncentrációja függvényében;

14. ábra: a .Rhodococcns a/?, FZ4-ból nyert tisztított aitríi-hidtatáz aktivitása az acetonitril koncentrációja függvényében;

15. ábra; a ffiiaddcoccus a/?, FZ4-ból nyert tisztított nitrií-hídratáz hőstabiikása;

lö, ábra: a /ífexíbccccas sp. FZ4-ból nyert tisztított nitríi-hídratáz pí-l-öptnüurna;

17. ábra: a .ék'odbcoccws sp, FZ4-boi nyers tisztított niíril-hidratáz pH-stabditása,

1, példa

A nitril-hídraíáz-aktlvrtás meghatározása

A niíril-hidratáz-aktivitás meghatározására 3-císno-piridtnbős (1,0 M, 1,0 ml), káitutn-foszfát-puffetból (0,1 M, pH 7,0; 6,5 nd) és sejí-szüszpenzióből (9,5 mi) álló reakeiőelegyei keverés közben 29 X-on: 5 percen át inkubáitubk. A reakciót sósav (5 Μ, 0,1 mi) adagolásával megszakítottuk. A reakcíóelegyet 6,2 ptn szűrön keresztül szűrtök, majd HPLC segítségével (W&ters Spherísorb 5 μ ÖDS2 (4,6 χ 156 mm); KHjPO^/HjPÖ^ (lö rnM; pH 2,S)/acetoniírÍi “ 9:1 <v/v>; í mbperc; 236 stanj meghatároztak a keletkezett otkotinsavamid mennyiségét Az összaktivitást percenként és milliliterenként keletkezett janól mkötinsav-amidkéní fejezzük ki, a fajlagos aktivitás mértékegysége: pmől nikotínsavamid/ípere x ml x ÖD_íi05ÍB1).

2. példít

A A^ndPíOccííA sp. FZ4 (1>SM 13S97) törzs elkülönítése

Leírták taár (.-L'c.h. Aífcrod?·:·’/. 1998, 170, 85-90), bogy a Rhodococais sp. YH3-3 (TPÜ 3453) törzs 3piriáía-aidoximot 3-eiano-pirtdmsn és nikotinsavamíéon kérész®! mkoímsavvá metsbokzál. A Modocoraas sp. YH3-3 (TPü .3453) törzs aldöxim-dehidratáz-aktivitását, nítrií-hídratáz-aktivitását és amidáz-aktivitását különböző aldoximokkai és nítrilekkel indukálták.

Különböző talajmintákkal az 1. táblázat szerinti dúsítási közeget inoksláknk, maid 7-19 napon át 37 “C-on ínkubáltuk azt. Ezt háromszor megismételtük. Utána a tenyészeteket hígítottak és szé teszteltük. A lemezeket 5 napon át 3? °C-on infcubálva· telepeket nyertünk. Az egyes telepeket az 1. példa szerint mtril-hiáratázaktivhásra vizsgáltuk. így elkülönítettük a Rfaxfozeecux sp. FZ4 (DSM 13597) törzset. A. S-pi-ridin-aldoxbn helyett acetonisni, propionítril, butiroditri!, krotonsávmbíi, adipinxavnítril és ntaionsavniíri! ís alkalmazható Cferráskdíd.

1. táblázat: dúsító közeg

Komponens	Koncentráció [g/lj
S-piridin-aldoxím	3,0 vagy 1.0
<nh₄wq<	2.0
5CH₂PO₄	2,0
NaCl	1,0
MgSO₄ x MO	e,2
CoC!.> x 6H₂Ö	0,01
élesztők) vonat	0,2

3, példa

Kofaktorok tenyésztés közbeni befolyása ^Arídneocens %.>. FX4 nitrii-bidratáz-aktivitásdra A 2, táblázat szertói előtenyésztő közeget a ,S»W<á)cocc?« sp. FZ4 ÍD-SM 13577) törzzsel ineknláknk, majd rázás közben 28 °C-o« 1-2 napon át inkabáitak. Az eíőtenyeszetet a 3. táblázat szerte!, vagy Co(ll)Rtódot vagy Fe(.íí)-szoliatot tartalmazó alapközegbe áioltottak és rázás közben 28 °C-on 1-2 napon át inkabáktsk, A nstríl-bidratáz-skiívítást az 1, példa szerint határoztuk meg. Az eredményeket a 4. táblázatban foglaltuk össze. A nitrd-hidratáz.-aktivitas csak akkor volt számottevő, ha a /ífeodbeoceas .$/?. FZ4 törzset kobalt jelenlétében tenyésztettek.

2. táblázat: előtenyésztő közeg

Komponens	Koncentráció jg/!\|
pepton	S,ö
húskivonat	5,0
NaCl	2,0
éiesztökivoríat	0,5

vizzei 1 literre feltöltve, pH - ?,0

3. táblázat; alapközeg

Komponens	Koncentráció [g/lj
éieszíőkivonat	2,0
pepton	0,2
L-ghítamát, Na-só:	1.5,0
MgS-Oí x 7B>0	0,5
CoCh x őHjO vagy FeSCb x? Η,Ο	0,004
krotorsamid	5,0

4. 'táblázni: koíáktöte tenyésztés közben a oíöil-hkssteztet!vitásra kifejteit befolyása

Knfaktor	Növekedés iOöf,ÍI);._Wi	Ősszakrivítás Ipmól/Cpero x ml)	Fajlagos aktivitás [praólApere s sni χ OfA_!;írst,)j
re.SO,_;	2,86	0,989	0,346
CoCb	2,79	38,1	13,1

IsáukíoFoks&k tenyésztés közben a /^edneeecws sp. F24 nítril-kiár&táz-akrivitására kifejtett hatású

A 2. táblázat szerinti elötenyészhő közeget a gfoodoeecctts sp. FZ4 (DSM 13597) törzzsel btokuláltuk, majd rázás közben 28 C-on 1-2 napon át Inkubáltek. Az ^tenyészetet az 5. táblázat .szerinti, különböző isduktorekaí tartalmazó közegbe kioltottuk, és a tenyészeteket 2.8 ^eC-on rázás közben 3 napon át tenyésztettük- A Kitrll-hidratázvaktiv itási az 1. példa szerint határoztuk meg. Az eredményeket a 6. táblázatban foglaltuk össze. A Rküdee&ccus sp. FZ4 nitriWridratáz enzimje csak iadafctor jelenlétében képződött.

5. táblázat: lenyésztöközeg

Komponens	Koncentráció (g/lj
éiesztökívonat	1,0
nátritun-CJtrát	10,0
malátakivor.at	15,0
induktor	0,2 vegyesN
KH₂PÖ4	2,0
MgSOi x 7H₂O	0,5
CoClj x 61-00	0,015

Ahoíteua’Ms sp> FZ4 előtenyésztése

A 2. táblázat szerinti előtenyésztö közeget a Rk&dococcus sp. F24 törzzsel 'beoltotok és rázás közben 28 *€-0» 1-2 napon át inkubáituk, Az elotertyészeteí az 5. táblázat szerinti, induktorként ő g/1 metakrilsmidot tartalmazó közegbe átoltoítük és rázás közben 28 ^sC-en 3 napon át tenyésziettők. Negyvennyolc óra ekekével járulékosan még 0,2 térfcgat% metskrilamídcé adagoltuk.

A 6-13. példákban a SMxoosk sp. FZA nyugvó sejtjeit használtuk.

A Rh&a'&'Ci-iceiis sp. FZ4 «jtól-hldraíáz-akíivjtását különböző szub.tetáiumokon mértük sz k példa szerint ágy, hogy 3-ciano-piridis helyett a megfelelő szabsztótnmot alkalmaztuk és a HPLC-fekétefeket az adott sznbsztrátumauk megfelelően variáltak, A Rhod&c&ccsts sp. F24 nltril-hlűratáz-akíivitásának szubszt'rátumiajlagösíágát a 7. táblázatban összehasonltjuk a Rkadöa&ccíis rkodochrous 11 nitril-bídraláz-aldívitásánsk szabsztrátum-fajlagosságávak

6. táblázat* íaáofcforok befolyása aaltrilüidratás-ííktlvÍtásta

lodaHor	Növekedés {ÖILiiOrnttl	Ósszakdvífás kdíaój/(perc s ml)	Fajlagos .aktivitás (potól/lperc s mis OD,.;,.©:
metskriiamid	4,55	56«	125
izobiitiramid	3,55	387	109
budramid	4,7	344	73,2
rcüskriSnidil	4,61	339	71,5
tofonaanid	9,32	558	59,9
butironiirll	57ö	20?	58,4
vaíeriátisavamid	5.6 i	322	57,5
izobutíroattti's	5,24	273	52,1
tofonsavrutrii	8,24	407	49,4
propionsavandd	5,17	149	28,7
valeranferi!	3,79	129	32,4
izokapronsavfotríl	4,72	134	28,5
foovaleroslPil	3,22	747	23,2
.kapronsavfoinl	4,54	104	23,9
prapionltríl	4,72	95,8	20,3
akrilamid	5,17	69,5	11,7
o-peíiten-níp’il	4,62	62	13,4
s-kapFohtktám	4,44	40,3	9,08
beszonkril	5,62	40,3	7,17
piknlfesavanttd	3,8Ö	26,1	6,87
l·-	4,2	27,7	6,59
danoaeetamiá	4,75	30,9	6,50
scetamid	4,37	21.6	4,98
aceton itri 1	4,46	18,4	4,13
S-ciaso-píndss	5,54	12,3	2,21
; izoaikotinsavainid	5,03	10,9	2,17
benzamld	3,88	8,24	2,12
akriln úr iI	3,27	5,91	1,8 i
nikotinsava-nki	2,55	4,94	1,39
karb&íttíd	6,16	5,66	0,918

7. táblázat: ftlnxfccoccttó sj». FZ4 és f&ödoeoeeus zAodoefo-oas il skril-h-idratáz-aktivtósa szuhsztrátonfájlagosságának összehasonlítása

	Khödvcocciis sp. FZ4	Fhoihcoccíis zAíxfeicátrtoíS 31
Szabszérátum	Relatív aktivitás	Relatív aktmtás 1%\|
acetotótní	646	0 (mtril-hldraíáz A) 115 {nltril-hidratáz B)
akribútrii	498	478
buíirouiírll	466	26
propionitril	412	435
a-ciartö-piriöm	1ÖÖ	100
d-eiano-pIríöHí	98.4	70
krotonsavaitól	92,1	78
benzotúttT.	oH,7	27
2-ctimo-piridin	59,3	45
m-klór-benzoKttril	39,3	43
p-klór-'benzorntril	8,25	13
metakrilnítril	3,64	87
o-klór-feesizomiril	ő	2,8

7. példa

HF&decifceai’ sp. FZ4 a^rR-biáratáz-akámtásának hőmérsékleti optimuma és hőstabiiitása

Λ mtril-hldratáz-aktivitást 2Ö °C és 70 ’C közötti tartományba» különböző hőmérsékleteken mértük az {. példa szerint. A ntbll-bidraiáz hőmérsékleti optimuma 60 ’C-ο» van (2. ábra).

A nitni-hídratáz hösfafeilitásáuak meghatározására a sejt-szaszpenziőkat 40 ’-C és 70 ’C közötti különböző hőmérsékleteken 15 percen át inknbáltok, uttea 20 ’C'-on meghatároztok a nítril-hidratáz-sktivitást az 1. példa szerint. A 40-60 ’C-ort végzett 15 perces mkubálás utáni nitril-hidratáz-aktsvitás az eredeti nitril-hidratázakii vitásnak felelt meg (3. ábra)..

8. példa

JMmccí» sj». FZ4 nftríWíidratáz-aktivításának pB-optimuma és pH-stabdítása

A sitríl-hldratáz-akfivhásl: 3-12 közötti különböző pH-örtékek mellett: határoztok meg az 1. példa szerbit, különböző Ö.l mólos pafferok alkalmazásával A nííril-bidratáz-akt'svitás pH-optimuma 6 és 7 közötti pHsál volt (4. ábra).

A toml-hidratáz-aktivitás pH-stabllkásának meghatározására a sejtsznsz-penzidkaf. 4 és 10 közötti különbőzé pR-értékek melleit 2C> ’C-on 24 érán át Inkubálúik, utána centn&gáltok. Az elválasztott sejteket mostak és kálmm-ibszföt-pufferban (ö.l M; pH 7,0) újból -szaszpesdáltok. A nitril-hsdratáz-akíivttást az 1. példa szerint határoztok meg. Az 5 és 10 közötti pH-értékek mellett végzett 24 órás Inkubálás utáni nítriMndratázaktiviíás lényegében az eredeti müil-hidratáz-aktivl-íásnak felelt meg (5. ábra).

9. példa

Á 3-etaRO-piridxn femeentrácíójámtk Merfeceeejm $/?. FZ4 Bitril-hidratáiz-aktlvitdaára gyakorolt basása

K.íSlösbőző 3-csano-pirsdin-konees)tibcíók mellett (0-10 vegyesei)· inkubál-íitok sejiszxi&zpesxziókss 20 “C-on 60 percen át, A sejteket eiválasztodök, mostok és kálfem-feszfet-puíferban (0,1 M; pH 7,0) újból szwsspertáálísik, A totfíi-hsdraláz-aklfeitást az 1. példa szerfes 'határoztuk meg, A 0-20 vegyest 3-cigno-piridínktmeenb'áeiő mellett végzett 60 perces inktsbálás sdáni tníríldnóratáz-aktivitás lényegébe!) az eredeti ttitriífesdfatáz-aktsvifilsnisk fele Is meg: (6, ábra), tO. példa

A td&trüBsavaraid koeeeatrácléj&aak F&orföcot'ess ,ψ, FZ4 mtríl-hidratáz-ííktfeitására gyakorolt hatása

Kklönbözó i)ikotirssavaa«d-koneenírációk mellett (0-20 vegyes%) inköbálAank sepsznszpes)ziők;5t 20 “C-on 24 órán át A sejteket eiváiaszíoönk, mostuk és kálinto-foszfát-pnl'ferban (0.1 M; pH 7,0) újból szuszpendálttsk. A nitfíi-bisfcilsíz-akSívitást az 1. példa szerint h&tsb-oztok .meg. A 0-20 vegyes% stikotinsavasnidkoncenPáoió mellett. végzést 24 őrás inkabálás atáni niíríl-hidrsiáz-gktferiás lényegébe!) az eredeti nítril-hidmtáz-aldxviíásnak. felelt meg.(7,. ábra).

IL példa

3-Ciano-píridin Kjw-értéke &tesbcem»: sp. FZ4 oitril-bldratáza esetén

3-Ciano'piridiitből (0,1-1,0 Μ; 1,0-1,8 nd), vizes NaCl-oldatból (Ö,S5 vegves%; 0,7-0,1 ml), káliumfoszfát-ptsfeból (0,1 M; pH. 7,0; 0,3 ral) és seitszuszpenziöból (0,01 ml) álló reakcióelegyet rázás közben 30 ^ftC-on 10 percest át inkubáhunk, A reakclóelegyek Sssztörfogata a 3-eiasto-piridm koncetoráeléjától fUggóen 2,0 ml és 2,2 ml közöd volt. A reakciót 0,1 tnl 2 M sósav adagolásával megszakítóitok. A reakcióelegyet centrifugáltuk (12 ÖOO perc'⁵,5 pere), «sásra a keletkezett nikattosavanxid mennyiségét az 1. példa szerint HPLC segítségével snögfesíaroztak. A talált K_M-é«ék 160 mM volt (löt ábra).

12. példa &&ed&c&CGtfi> sp. FZ4, valamint Isáresn ismert ns&Feorgamzm&s - .dwív-er/tonpsí's ,sp. NA40, ffiteitf&ciwetfs sp, GF270 és r&»d«KsS;re«® 41 - nitrd-hidrstáz-aktsvttásamak ósszefxaseolflasa

A 3-ciano-plrláin K._M-értékét F&odbeoom» sp. PZ4, fthűdacecciis sp. GF27Q (DSM 1221S; WO 00/65306), ,yp- NÁ.40 (D6.M 11617; WO 00/05366) és Kkod&cacctts riioáödtroes íí nxtrilhldratáz-akíiviíása vonatkozásában vizsgáltak az 11. példa, szerint, mindig az adott sníkroorganiztonst használva, Az Aísyeo/ofigwA sp. NA4Ö és AAodiícoecKs .ψ. FZ4 K_M-é«ékei alacsonyabbak, mint a két másik mikroorganizntosé (8 táblázat).

8. táblázat: Kj^-ettékek összehasonlítása d-eiano-pirídin sznbsztrásn·» esetén

K,< i mMj
F/íní/öenecKS' ,sp. FZ4	/?bodo£:e£'«z? .sp. GF270	Afííy&ÁaÍ&piis NA40	sp.	./ókodöíijoctaf moZoehrasA 3 í
160	>200	41J	200

lí

A Ráöúbcoccms sp. F24, ,$p, GF27Ö, 4Bjy<?o/«ío/^iy φ, NA4G és 7?0oífocscx-í« /•áetfecí^w I 1 nitríi’hídraíázaaktívitá&ának h&stabilitását a 7. példa szerint határoztuk meg, mindig az adott mikroorganizmust alkalmazva a 9. táblázatban megadott inkubációs körülmények között. Á likűdae&ecijs sp. FZ4 Ritril-hidratáz-aktlvitása a többi mikroorganizmusok nitril-hidratáz-akrivitásával összehasonlítva a íegnagvobb hostabiliíást mutatta.

9. táblázat: a nitril-hidratáz-tdítivitások hastsbllitásának összehasonlítása

	Relatív aktivitás \| %]
Ink.ubáeíós kőről-	Rhodococcus sp.:	Sí?..	^mycö/afopsis· sp.	Rfeodococeas
menyek	FZ4	Cd'270	Ní:4Ö	.CíOítbeOrmc? J 3
15 perc
50 ’C-ou	100	100	n.a.	100
60 C-on	93	95	n.a.	80
70 C-on	··>	5	n.a.	0
60 perc
20*C-on	100	100	100	ma.
70 C-on	100	100	95	n.a.
40 C-on	1Ö0	ISO	80	n.a.
50 C-on	ιοο	100	32	n.a.
60 ’C-on	100	89	0	n.a.
70 73-on	6	0	0	n.a.
60 C-en
0 perces át	100	100	n.a.	n.a.
30 percen át	100	67-80	n.a.	n,a.
60 percen át	92-100	52-68	n.a.	n.a.
120 percen át	72-87	29-47	n.a.	n.a.

a.a.^: nincs sdst

A 3-ciano-piridín-koneentrációuak a /^ödbeocűBa sp, FZ4, Rhodacozcus sp . GF270,, Awyc&l&töpsis sp, NÁ4Ö és Kh&decoccus rhadocfavas 11 nitríl-hidratáz-aktivitúsára jjfejtett befolyását a 9. példa szerint vizsgáltuk meg, mindig az adott mikroorganizmust alkalmazva a 10. táblázatban megadott il-ciano-pirídínkoncentrációk mellett, A Rhodoeoeeus sp. FZ4 ás a Sfefe>cocc«s sp. GF27Ö törzs aítFil-hi^ataz-atóvítása a legjobban törte a a-cíano-pirldiní.

10. táblázat: a S-dano-piriáin-koncentrácifeak a nitFil-hidtatáz-akíívííásra gyakorolt befolyásának összehasonlítása

	Relatív aktivitás j%j
3 ~c iano-pkiőm fve- gyes%]	Jróoöocooc’ízs’ ,ψ. FZ4	AkoííoewccKí sp. GF270	Aísvío/örópíís .$/?. Na4Ö	/öVoííbcoceító’ ráoíáxsárow J1
0	100“	10Ö^a	100“	lÖ0^b
2,5	löö^a	100“	74^h	n.ad
5.0	10O^a	100“	5ó^b	Só”
7,5	100“	100“	47^ε	n.a.^c
10,0	100“	!Ö0^a	ló⁵⁵	ö/

⁴ bö perces snkobáiás * 15 perces Inknbalás; ' nem határoztak meg

A alkotinsas'amid-konceníráciősak a FF&mícocctss xp.. FZ4, Ráoútoeoceas sp. GF270, ,$p.. NA4Ö és fttxxfoeoccus rhodockrous I! nitrll-bidratáz-aktivitására kifejtett befolyását a 9. példa szériát vizsgáljak meg, mindig .az adott míkroorganizmast alkalmazva a 11. táblázatban: megadott' nlkotinsavsarrid-koncentrációk melled. A l&Kxtoeoeats sp. EZ4 és a ^sdacaccus sp. GF27Ö törzs nitrö-hldratáz-akíivhása a legjobban tolerálta a nikotmsavamsdot (11. táblázat).

11. táblázat: a aikotinsavatnid-koncentrácíósak a sitríl-tódratáz-^divitea gyakorolt befolyásának összehasonlítása

	Relatív aktivitás (%)
nikotínsaviMnid	tf&odbcoceas sp.	foWőeöceaK sp.	Atnycofaíapsis sp.	AAooWöecMS
\|vegyes%\|	FZ4	GF270	Na4Ö	r&vd&ehriwx 11
0	100	100	100	n.a.
10	100	100	55	H.3„
29	100	1Ö0	0	na.
30	100	100	0	n.a.

13. példa

3-Ciano-pirtdin lÍtáodecoma .ψ, FZ4 törzzsel végzett biötranszformá-lása oikotinsavamiddá S-Ciane-piridm-oldatot 42 adagban (42 x 0,52 g ~ 21,8 g; 0,21 mól) ssjt-szaszpcszíótel <13,7 mg száraz sejltöiaeg, 4 ml) és kálbim-rószlat-puf&rból (0,1 M; pH 6,0; 16 ml)· állő koltérához: .adtunk. A kővetkező 3eianc-piridin adagot mindig akkor adagoltok, amikor a reakciőelegybes a 3-ciano-piridin már teljesen, ebeagálí mketinsavamiddá. A reakeióelegy a reakció során megszilárdult. összesen 25,7 g (100 %-os hozam) mkötfosavamid képződött.

14. példa

Acetonitril Jféíttfocoeow sp. FZ4 törzzsel végzett feiotranszformáiása ecetsavamiddá Acetonitrilt (5 ml; 95 mmól) 80 pere alatt kálíom-foszfát-pnfferből (0,1 M; pH 7,0; 4,5 ml) és sejtszuszpenzlöhöi (4,88 mg száraz sejttömeg, 0,5 ml) álló· kultúrához csepegtettünk 29 ’C-oo. Az atóreagálás rázás közben 20 °C-on történt. Az ecetsavamid képződését reakció közben HPLC segítségéve; [Waters Spherísorp 5 μ ODS2 (4,6 χ l Sö mm); KH;PO,j (10 mM; pH 2,5)/3.cetonitril ~ 99; 1 íérfegatarány); 1,0 nrl/perc; 219 nm] követtük:. 120 perc alatt 6,14 g (109 %-os hezarn) «cetsavamíd keletkezett, amely a. reakcíóküzegben íéklüsu'FS (;. ábra),

15. példa

Az; acetönitríi koncentrációjának tifö&á&eecests .ψ, Ϊ-24 nltril-hídrsláz-akilvítására gyakorolt befolyása az acetonitril eceísavamld bíötranxzfbr-málása során

Áeetonitriíból (0,2-19,0 M; 1,0-1,6 ml), vizes Naül-oídatból (Ö,85 vegyes%; 0,6-0,0 ml), kállumfoszlát-ptrtférből (0, 1 M; pH '7,0; ö,3 tál) és sejíszoszpenzióból (0,1 xnl) ádö reakcióelegyet rázás közben 20 fejős 10 percen st inkubálínnk. A reakcióelegy össztérfogata 2,0 ml volt. A reakciót metanol adagolásával megszakítottuk. A reakcióelegyet centrifugáltok (12 ÖÖÖ perc*'', 5 perc), és a keletkezett eeetsavamid mennyiségét HPLC segítségével a 14, példa szerint meghatároztuk.

A rsibil-bldraíáz-aktivitás a Ö,1 -15 M acetonitril tartományban lényegében állandó volt (8. ábra).

Az amonitril-koncexrtrádó befolyása sp. FZ4 nitril-lridra-iáz-akrivítására

Sejteket acetonitrilt (0,0-15,0 M) tartalmazó kálínm-foszfót-pufletben (0,1 M, pH 7,0) 20 fel-oa egy órán át irrkubáltunk. A sejtszuszpenziót eentrlfogálmk (12 ÖOÖ perc*¹, 5 perc) és a sejteket (1,85: vegyes%~os vizes NaCl-oldatban újból szaszpendákuk. Ebből a sejlszuszpenzióból (0,1 ml), 3-ciano-plridínböl <0,5 M, 1,0 ml). vizes 0,85 vegyes%-os NaCl-otdatbói (0,6 mi) és kálíttm-foszláí-pufferból (0,1 M; pH 7,0; 0,3 ml) álló reakeíóelegyet rázás közben 30 feJ-on 5 perce® át Inkubátek. A reakciót metanol adagolásával megszakítottuk. A reakcióelegyet cetttrifugáliuk (12 000 perc⁴, 5 perc) és a képződött ecetsavandd mennyiségét HPLC segítségével a 14. példa szerint meghatároztuk.

A nitril-lridratáz-akrivisás 1 órás inkubálás 6-3 M acetonitril mellett lényegében állandó volt. 6 M acetonitril mellett 1 órán át végzett inkubálás mán az eredeti ndril-hidratáz-aktí vítás még 60 %-a maradt meg. 9 M acetonitril mellett ; érán át végzett inkubálás után az eredeti nltrll-hídratáz-aktíviíás még kb. 35 %-a maradt meg (9. ábra).

17. példa

Sb&e&e&ccíts sp. PZ4 pigment-negatív változatának létrhozása

A Möík»eocxw i'p. FZ4 törzset 50 ml „Jámrient-Brodr'-kőzegben 28 °C-c-n rázás közben ínkubáltuk addig, míg az ÖOsjobk, érték 6,29 nem leit. Az előkel túrából 10 ml-t 25 ml ..Notriení-Brotb^-kőzcgbe ámítottunk és 28 °C-on rázás közben 1,99 OD_6í(toffi optikai sűrűségig ínkubáltsnk. Az igy kapod tenyészetei (10 ml) centrifugáltuk (8000 perc⁴, 5 perc). A felülaszóí kiöntöttük és a sejtcsapadékot 5 ml foszfát—pucérok NáCl-oldatbaa szuszpendáltuk. A seíiszoszpenziót 90 mm átmér^Ű Petri-esészébe öntöttük és HV-tepával (15 W, 2S4 nm) 25 cm távolságból 17 percen át besugároztak. Utána a sejteket dupla koncentrációjú „Nn.trient-Broth''-kőzegbcn 28 °C-on rázás közben 4 napon át inkabálfeát. Az Így kapott tenyészetet iOO-szoresára higjíotmk és 100-100 μΙes íelöhlszót „plate oonst -agar” lemezeken széleszletl'Snk. A lemezeket 28 °C-ou Ínkubáltuk, Mindegyik lemezen kb. 150 telep nőtt. A lemezeket kiteltük a napfénynek, hogy a piros pigment kialakulását serkentsük. A pigsmt-negatív telepeket könnyért meg lehetett, kblönhözteíní a színes mutánsoktól és a piros· mezei törzsiéi.

Í8. példa

JMmas a/j. FZ4-boi nyert nttrií-hidratáz tisztítása .Rkod&coecus sp, FZ4 sejteket a '3, példa szerint 2 literes íerrnentorban előtenyészetülnk. A tenyészetet centrifugáltak, és a sejtcsapadékot 0,85 vegyesOos vizes HttCl-oídatban újból szuszpendáltuk. A sejtszuszpenziót 44 mM vajsavat tartalmazó kálíum-foszfát-pafferbe ÍÖ, I M; pft 7,0) átvittük es ultrahanggal kezeltük, A seiítnaradványokat ccntrlíugálássai eltávolítottuk. A feiSiüszét a möríMdár&táz 12. táblázat szerint végzett tisztítására használtak. A tútril-hídratáz-aktivitást az 1. példa szerint határoztak meg, de sejtszuszpenzíő helyett a kivonatokat, alkalmaztuk.

12. táblázat: Ahodo«>ee?.«· sp. P24~ből nyert mtrii-hidtatáz tisztítása

Tisztítási lépés	Freteintamfem h'g)	Összskíivitás [gmóVpercj	Fajlagos aktivitás ipmóíApere s mg)]
Sejtmentes kivonat	335	5881	17,6
(NH^jjSO^-kicsapás	198	6087	.28,4
DEAE-Sepfeaeel:	73,0	3553	4S,7
bníil-Toyopettrl	66,2 í 203 5	30,7
fenií-Sepharese	26,2 890	34,0

19. példa

A tisztított nítril-hidratáz ntóitömegéoek megteíározása

A móltömeget HPLC segítségével határoztuk: meg (TSK-géi ö 300 SW (0,75 x 60 cm); káliutn-iosziátpalibr (0,1 M; pH 7,5) és kálknn-kksrid (0,2 M);:Ő,7 ml/pere; 280 nm]. A atiril-feitetáz mókömege 465 kDa volt (11. ábra)., A nitríi-bidratáz 27,7 kDa mökömegö a-alsgységhól és 31,2 kiás móitömegű O-alegységböl áll (12. ábra).

A tisztított nítriS-hidratáz hősíabilitása

Niinldadratáz-oidaíból (0,697 pmőFperc; 0,025 ml) és kálium-fősziát-pufterböt (0,1 M; pH 7,0; 9,475 ml) álló oldatot 20-70 °C közötti különböző hőmérsékleteit 60 percen át inkubskunk. Ezt követőéit: az oldatot jeges fürdőben 20 ^::C-ra hütöííük, majd 3-eiano-piridint (0,5 M; 0,500 nd) adagoltunk. A reakciós legyet 20 *Con 10 percen át inkubáltuk, utána a reakciót metanol adagolásával megszakítottuk, A képződött nikotinsavamid mennyiségét az 1. példa szerint HPLC segítségével meghatároztuk. A oiírd-hsdratáz-akíivitás 40 ^eC feleit 60 percen át végzett inkubálás után határozottan csökkent, 50 °C-on végzett 60 perces inkubálás után a nitriihidrstáz-akttvitös már csak az eredeti aktivitás kb. 25 %~a volt (15, ábra).

21. példa

A tisztított nitnl-bidratáz pfí-öpttnrums

3-Ciane-piridinböl (0,5 M; 0,500 ml), nitrii-hídratáz-oldatból (0,69? pmől/perc; 0,025 ml) és különböző, 4~i 1 pH-értékű pufferékből (0,1 M; 0,0473 ml) álló reakciőeíegyeket 20 ’C-eo 10 percen át snkubáimk. A reakciót metanol adagolásával megszakítottuk. A képződött nikotinsavamid mennyiségét az. 1. példa szerint HPLC segítsége vei meghatároztuk, A nitríl-hidratáz pH-optímnma 6,0 és 6,5 között volt (1 ő, ábra) .

22. példa

A tisztított aiírsl-íiidratáz pH-stafdtitása

Nkrij-hídrafáz-oídatból <8,36 pappere;: 0,47 ml) különböző, 4,Ö~11,0 pH-éríéfcő pafferekből <0,3 M; 0,1 sál) és desztillált vízből álló oldatot 20 ⁰C~oo 30 percen át inkubálíunk. A íelülászójából <0,05 mi), 3-ektnopirldinbői <0,5 M; 0.5 ml) és az adott pafferből <0,1 M; 0,45 ml) reakcióelegyet késziíettQnk, ezt 20 ^cC-sm 10 percen áí inkubálíük. A reakciót metanol adagolásával megszakítottuk. A képződött nilsoíinsavamíd mennyiségét az 1. példa szerint HPLC segítségével meghatároztok. A 6 és S közötti pR-tartcmáatyban végzett 60 perces Inktíbálás után a aitril-hidratáz-aktivnás lényegébe»: az eredeti nitril-hidratáz-aktivitásnak felelt meg. (17. ábra).

23, példa

A tisztított mtríl-bidraíáz szufesztrátnm-fajtogosságs!

Hlíní-hidraSáz-oldatből (0,695 pffiólzpetc; 0,025 ml), különböző szöbsztrá&Mnokhóí <0,5000 ml) és kálium-toszfát-puSérból (0,1 M; pH?,0; 0,475 ml) álló reakcióelegyet 20 °C-on 5-10 percen ái Hskübáífenk. Az alkalmazott szabsztráíumok koncentrációja 0,015 M és 0,250 M közötti volt. A reakciót metanol adagolásával megszakítottuk.. A keletkezett amid mennyiségét HPLC segítségével 'natároztnk meg. Az eredményeket a 13. táblázat matatja, A vizsgáit szubsztráfemok közül a niírrl-bidratáz aktivitása acetomtril esetén a legnagyobb volt

13. táblázat;: a tisztltött nitril-hidratáz szobszírátum-fájlagossága

Sznbsztrátom	Koncentráció j M \|	Relatív aktivitás 1%j
Acetonítril	0,2	1088
Akti inán·	0.2	774
Propionltril	9,2	693
Butíronitrii	0,2	578
Kretonsavöíítií	0,2	.114
3-Ctano-pirldín	9,25	100⁵
4~Ciano-piridin	0.12S	92,8
Beozönífril	0,815	75,6
jn-klór-benzottitoil	8,05	66,5
2-Cíanö~pínd:in	0,125	3ő,7
p-kíór-benzotnáii	0,015	8,31
Metaktilamfá	0.2	1,39
o-klór-benzontiríi	0,015	0

^a ősszaktivítás 4164 psnök(perc s mi)

24, példa

Petenciális inhibitoroknak a tisztított aittdl-ltidnttázra kifejtett hatása

Niírií’kidrsíázböi (0,695 pmóí/perc; 0,025 mi), káíium-fosziat-puíferböí <0,1 M: pH 7,ö; 0,475 ml), desztillált vízből (0,150 ml) és különböző potenciális iAílátorokbcl <0,100 ml) álló oldatttot 20 °C~on 5 percen át inkubáltouk. Utána >cíano-piridisf <1M; 0,250 ml) adagoltunk. Az inhibitorok koncentrációja a reakcíóelegyhert 1,0 ®M volt. A reakcióelegyet 20 *C-on lö percen át inkubáltuk, majd a reakciót'metanol adagolásával megszakítottak. A képződött mkoltesavatnid mennyiségét az 1. példa szerint HPLC segítségévei határoztuk ió meg. Áz eredményeket a 14, táblázatban foglaltak össze, A vizsgált potenciális inhibitorok közül biárokíiamín és kálium-cianid .gátolta a legjobban az enzimet.

14. táblázat; potenciális iolbbslörok befolyása a tisztítóit niíril-hidrasázra

Potenciális infeibttor	Relatív aktivitás í%j
p-kibr-merkuri-benzoesav	187
tkon	114
fenilmetánsKuifoníifluoriö	110
i.lö-fcrssrs trolin	106
kaffcasmd	106
dhio-trettól	103
lilTA	Iöö
—	100
císzteamái	90,1
8-hídroxi-kmoll·;	97,8
2.2'.bipind;i	97,8
lód-aeetát	96,7
'N-etil-mafeisimid	95,3
nátrinm-azíd	93,5
5,5Mittobisz(2-nttro4>enzoesavj*	93,4
dietii-dttsokarbamót	93,3
D-cikloszcrin	86,3
feoil-hidrazin	84,6
2-merkapto-etanoi	767
hidroxilamin	.1,34
fcálium-ciamd	0

<-----------—...»...........——— -——.—...J ’ ö, I mM etiíéndiamin-tetraecetsav ^e összatóvitás 3776 gmól/perc s ml

25. példa

Fémionok befolyása a tisztított Hitríl-feiáratázra

A fémionoknak a tisztított nitril-bidrakkzra kifejtett hatásának vizsgálata során a 14. példa szerint jármok el azzal az eltéréssel, hogy inhibitor helyett fémionokat adagoltunk. A reakeiőelegyben a fémionok kon· csuháélója 1,0 mM volt. Az· eredményeket a 15. táblázatban foglaltok össze; A vizsgált fémionok közöl csak az ezüst-kation és a kétvegyértékn higaíty-katios mutatott gátló hatást.

15. táblásai: iémloook befolyása a tisAitott nitrii-hidratáz aktivitására

Fémion	Relatív aktivitás [%j:
CuSOi	177
MaCg	123
NiCL	123
ZeSCk	121
FéSOt	113
CaCL	113
CoCL	110
FeCL	105
-	IÖ8^S
AgNCy	0
HgCl?	0

------------------------—...........................................................

³ összakd vitás 3375 gm<''(perc x ml) ^x Ö, t Λ

26. példa

S-Ciano-piridsn K^-értéke tisztított aitril-hldratáz eseté»

Niíril-hidratáz-oldatbói (0,0697 pEbperg,; 0,025 és tóiium^foszfát-pufferbóí (8,1 M; pH 7,8; 0,475 ml) álló oldathoz 3-cíano-pmdiot adónk különböze koscentrációkbaí· (3,1 - Söö mM; 0,580 mi), A reakciéeiegyeí 20 °€-ö» 10 percen át mkubálíak, A reakciót metanol adagolásával megszakstottítk, és a képződött »ikoímsavaxald mennyiségét az 1. példa szerint HPLC segítségével: határoztuk meg, A 3-ciano-pirídín K^-értéke 80,5 volt (13. ábra).

Acetonitrií K_M-értéke tisztított míriMbdratáz esetén

Nitril-hidratáz-oldatból (0,069? pm/pere; 0,025 és kálíum-foszhit-puíiérból (0,1 M.; pH 7,0; 0,475 ml) álló oldathoz acetonhnlt adunk különböző koncentrációkban (2,5 - 80 mM; 0,500 nd), A reákcióelegyet 20 °Cött 18 percen át btabáltufc. A reakciói .metanol adagolásával megszakítottak, és a képződött ecstsavamid menyayíségéí az: I. példa szerint HPLC segítségévei határozták meg. Az acetooitrii K_M-értéke 80,5 volt (14. ábra).

Claims

SZABADALMI IGÉNVFONTOK

1. Mikröorgaroztrmsek a Phrnloceeeus ,<φ. FZ4- fejből, 1359? DSM-száro alatt letétbe helyezve.
2. Az 1, igénypont szerinti inikroorgsTOzmosok, azzal jellemezve, hogy képesek aeetonitrilt legalább 3M konce-hrác lóban tolsrálni.
3. A 2, igénypont szerinti mikroorganizmusok, azzal jellemezve, högy képesek 3-ckmo-piridint nikotinsavamiddá átalakítani.
4. Az 1-3, igénypontok bátmelyike szerinti mikroorganizmusok, azzal jellemezve, hogy a tnikolsavak C» lánc ho sszúsággal vannak jelen,
5. Az 1-4. igénypontok bármelyike szerinti mikroorganizmusokból nyerhető erszimkivonatek. ó, Az: M. igénypontok bármelyike szerinti: mikroorganizmusból nyerhető nióil-hldratáz.
7. Nitril-hidratáz, amelynek

a) Κί,ί-értéke az acetonidil-szubsztráíxan esetés 2,84 ±1,00 mM és 3-ciano-piridin szubszíráíum esetén

80,5 ±15,0 mM,

b) pH-optlmuma 6,5 ±1,0,

e) móltöroege 465 ±50 Dalion, beleértve az «- és β-afcgységeket. és HPLC segítségévei meghatározva.

S. Eljárás (III) általános képleiü amidok előállítására, amelyek képletében R* jelentése C_:!-C_tralkilesoport, C^-Cű-alkenilcsoport vagy (IV) általános képletű csoport, amelyben X jelentése ~'N~ vagy -CH⁵⁵⁵ és R’ és R* jelentése egymástól függetlenül hidrogénatom, halogénatom, Cj-C^aiklfc söpört vagy C₂-Cé-alkeníicsoport, azzal jellemezve, hogy egy (11) általános képletű siírilí, amelynek képletében R¹ jelentése a fenti, az 1-4. igénypontok bármelyike szerinti mikroorganlzntusok, az 5. igénypont szerinti enzímkivonst vagy a 6-7. igénypontok bármelyike szerinti enzim segítségével átalakítunk.
9, A 8. igénypont, szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy nitriíként S-eiano-píridml vagy a&etomtrilt alkalmazunk.
10. A. 8. vagy 9, igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a reagálíaíást .5 °C és 5Ö ^::'C közötti hőmérsékleten és 5 és IÖ közötti pH-éríéken végezzék.

LI. Áz 1-4.. igénypontok bármelyike szerinti: mikroorganizmusok alkalmazása, aeetoniíril-huil&dék árnbnatlanítására..