CN1486363A - 制造氨基化合物的微生物学方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一类新的微生物，它们可以耐受至少3M浓度的乙腈溶液；并且本发明还涉及用该类微生物和相应的腈制备具有通式(III)的氨基化合物的方法，其中R1为C1－6烷基、C2－6烯基或者是通式(IV)的基团，通式IV中，X是氮原子或者－CH＝，R2和R3是彼此独立的氢原子、卤素原子、C1－6烷基或者C2－6烯基。本发明进一步涉及用上述的微生物来清理乙腈废物。
Description
技术领域
本发明涉及一种可以耐受至少3M乙腈溶液含量的微生物、一种具有腈水合酶活性的酶、一种用上述的酶或微生物来制造氨基化合物的方法，以及应用上述的微生物来清理乙腈废物。
背景技术
已知许多生物技术方法可以用来制造氨基化合物，例如，烟酰胺，它是一种对于动物和人类都必不可少的属于维生素B族的维生素。
例如，EP-A 0 307 926公开了一种通过Rhodococcus rhodochrous J1将3-氰基吡啶转化为烟酰酐的方法。这种方法的缺点是红色的Rhodococcusrhodochrous J1致使产物污染。而且，微生物对于底物3-氰基吡啶有很高的米氏常数值(Km)，对于3-氰基吡啶和温度的耐受能力都比较低。
又如，WO 99/05306公开了一种通过红球菌属(Rhodococcus)、土壤丝菌属(Amycolatopsis)和放线菌属(Actinomadura)的微生物用相应的腈制造烟酰胺的方法。这种方法的缺点是所用到的土壤丝菌属微生物在较高的温度下会失活。另外，这种微生物对于3-氰基吡啶和烟酰酐的耐受能力都比较低。而所说的红球菌属的微生物对于3-氰基吡啶有很高的米氏常数值，而且温度稳定性差。因此，该方法在工业生产中并不经济。
本发明的目的是提供一些微生物，它们相对稳定并且对于底物(例如3-氰基吡啶)具有相对低的米氏常数值，从而可以提供更经济的，可以大量的、高纯度的分离出氨基化合物的方法。
该目的通过权利要求1中所述的微生物，权利要求5-7中所述的酶，以及权利要求8中所述的方法来实现。
本发明中的微生物可以在一般的微生物技术帮助下，通过对土壤样本、矿泥以及废水进行适当的处理得到。它们可以通过在一种分子式为
的吡啶醛肟或者腈作为碳源，在有钴离子以及例如酵母浸膏和/或铵盐的条件下培养，而提取出来。这样就可以从培养基中得到可承受至少3M乙腈浓度的微生物，并且可以把腈，例如-氰基吡啶和乙腈转化成相应的氨基化合物。
可能用的吡啶醛肟一般为吡啶-2-，吡啶-3-或者吡啶-4-醛肟。
适合选择的腈尤其指那些在后来的生物转化中打算被用作底物的腈，例如乙腈(乙酸腈)、丙腈、丁腈、巴豆酸腈、乙二酸腈和丙二酸腈。
首选的钴离子源主要是可以产生钴离子的钴合物，例如Co2+和Co3+的盐，比如钴的氯化物、钴的硫酸盐和钴的醋酸盐。而首选的钴的化合物是Co2+的盐，例如CoCl2。但是，也可能是和金属钴或者其它的钴的化合物组合使用。通常，在培养基中，钴或钴化合物的量为1-30毫克/升，最适宜的是1-20毫克/升。
用到的铵盐可能是磷酸盐，例如，(NH4)2HPO4或者(NH4)H2PO4。
在实际的生物转化以前，微生物要在适当的培养基中培养，在表3和5中列举了一些适宜的培养基。
培育通常在温度20-40℃、PH值为5.0-8.0的环境中进行，而最适宜的条件是温度25-35℃、PH值6.0-7.5。
在培养过程中，通过加入酶诱导剂，能很方便地诱导出活性酶，也就是腈水合酶。
可能用到的酶诱导剂是饱和的或者不饱和的脂肪腈或者相应的氨基化合物。用到的脂肪腈是C2-7-烷腈，例如丁腈、异丁腈、戊腈何异戊腈，或者是C3-7-烯腈，例如甲基丙烯腈或者巴豆腈。用到的脂肪氨基化合物是任何C2-7-烷酰胺，例如丁酰胺、异丁酰胺、戊酰胺或者丙酰胺，或者C3-7-烯酰胺，例如，甲基丙酰胺或者巴豆酰胺。优选的酶诱导物是甲基丙酰胺、丁酰胺、异丁酰胺、戊酰胺、甲基丙烯腈、巴豆酰胺、丁腈和异丁腈。最优选的酶诱导物是甲基丙烯腈。
本发明的微生物可以承受至少3M的乙腈浓度，意味着在0.1M钾磷酸缓冲液中与3M的乙腈溶液，在PH7.0和20℃的条件下培育一个小时后酶的活性仍然稳定，也就是说损失了不到10％的活性。优选的微生物在上面的条件下，可以在浓度至少为6M的乙腈中耐受一个小时，而损失的活性少于50％。特别优选的微生物在上面的条件下，可以在浓度至少为9M的乙腈中耐受一个小时，而损失的活性少于70％。
极特别优选的微生物，在15M和19M的乙腈(对应于纯乙腈)中培育几分钟后，酶的活性仍然是稳定的。这样，在15M的乙腈中培育10分钟后，酶活性的损失少于10％。
本发明中的微生物有很高的热稳定性，也就是说，在高温下比目前已知的微生物更稳定。本发明的微生物，在0.1M的磷酸钾缓冲液中，PH7.0，60℃的条件下培育一个小时后，酶活性的损失少于10％，而且，在同样条件下培育2小时酶损失的活性少于40％。
这里所说的酶活性是指腈水合酶的活性，特别是和底物3-氰基吡啶有关的腈水合酶活性。
本发明微生物的其他的特点包括，对于优选的被用作底物的3-氰基吡啶以及产物烟酰胺具有较高的耐受能力，对于3-氰基吡啶有比较低的米氏常数值。另外，一个非常突出的特点在于：它们可以在比30℃时乙酰胺饱和溶液的浓度(近似于100ml水中220-230g乙酰胺)更高的浓度下积累乙酰胺。
优选的微生物属于红球菌属(Rhodococcus)。特别是Rhodococcus sp.FZ4菌株和与其功能等价的变种以及它的突变体。功能上等价的变种以及它的突变体是指可以承受乙腈的浓度至少为3M的菌株。尤其优选的微生物是无色素的红球菌株，也就是缺乏会污染产物的红色素的菌株。适当的条件下，可以通过UV射线或者诱导突变的化学药品，从生成色素的微生物中突变得到这些菌株。
菌株Rhodococcus sp.FZ4由德国菌种保存中心(DSMZ)(地址：Mascheroder Weg 1b，D-38 124 Braunschweig)于2000年7月11日，按照布达佩斯条约编号为DSM 13597。根据它的鉴别数据，不可能把它和已知的任何红球菌属归为一类，所以就把它当成一个新的物种。
功能上相等的Rhodococcus sp.FZ4菌株的变种和突变体可以产生自发的突变，或者在诸如UV射线和诱发突变的化学物质的作用下突变。优选的Rhodococcus sp.FZ4菌株的变种或者突变体是无色素的，也就是说，它们没有可以污染产物的红色素。
酶浸膏可以通过分解微生物等方法得到，例如，通过超声波、费氏压碎机或者溶菌酶方法。
本发明中有腈水合酶活性的酶可以从上面描述的微生物中得到。最适合的微生物是红球菌属的微生物，特别是Rhodococcus sp.FZ4(DSM 13597)。
所述的酶具有如下性质：
a)在20℃，PH值7.0的条件下，0.05M磷酸钾缓冲溶液中，对于底物乙腈的米氏常数值为2.84±1.00mM，而对于底物3-氰基吡啶为80.5±15.0mM；
b)在20℃，0.05M的磷酸钾缓冲溶液中，最适宜的pH值为6.5±1.0.特别的，所提到的酶具有：
c)由高效液相层析测得的固有分子量为465±50kDa。
实际操作中的生物转化可以通过上述的微生物、该微生物的酶提取物或者独立的酶来完成。优选的微生物为Rhodococcus sp.FZ4。
可以用在生物转化过程中的底物是具有下述分子通式的腈：
R1-CN II.
在通式II中，取代基R1是C1-6-烷基，C2-6-烯基或者是通式IV的基团。
通式IV中，X是氮原子或者-CH＝，R2和R3是彼此独立的氢原子、卤素原子、C1-6烷基或者C2-6烯基。
可用的C1-6烷基包括甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、叔丁基、异丁基、戊基和它的异构体，以及己基和它的异构体。可以用到的C2-6烯基包括乙烯基、烯丙基、1-丙烯-1-基和1-丙烯-2-基。
可以使用的卤素原子为F、Cl、Br和I。
优选的具有通式II的代表性的腈有乙腈、丁腈、丙烯腈、乙腈、巴豆腈、2-氰基吡啶、3-氰基吡啶、4-氰基吡啶、苯基腈、氟代苯基腈、氯代苯基腈和溴代苯基腈。最优选的底物是乙腈和3-氰基吡啶。
生物转化要经过一次或者连续的底物增加来进行。技术熟练的工人都知道，所用的底物浓度要由底物的溶解度来决定的。
优先选择静止细胞(非生长期)来实现上面的方法。
在此生物转化的过程中使用的培养基都是在该领域中已知的，例如，低摩尔浓度的磷酸盐缓冲液、HEPES缓冲液、柠檬酸盐缓冲液和硼酸盐缓冲液。低摩尔浓度的磷酸盐缓冲液一般是指0.01-0.5M，特别是0.05-0.25M的磷酸盐缓冲液。
通常，该生物转化过程优选于在5-50℃，特别是20-40℃的范围内进行。优选的pH值在5.0-10.0之间，最优选的是6-7.5之间。
当通式为II的腈完成转化后，去掉细胞，用结晶或者喷雾干燥等常规方法分离出相应的通式为
R1-CONH2 III
的氨基化合物。
本发明还涉及到应用上述的微生物，特别是红球菌属来清理乙腈废物。
乙腈是一种溶剂，例如可以用在高效液相层析法中，最终它需要作为废品被处理掉。由于本发明中乙腈废物的处理方法，可以使用的乙腈浓度相对于纯乙腈最大可以达到19M。方便起见，可以使用0.25-15M，最好是1-10M的溶液或者悬浊液。
考虑到处理乙腈废品的需要，最好在5-50℃，特别是20-40℃时应用微生物，而比较适宜的pH值为5-10，特别是6-8。
将乙腈转化成乙酰胺从而除掉乙腈废物的持续时间由乙腈的浓度决定。例如，在20℃，pH值为7.0的条件下，生成9.5M乙酰胺溶液或悬浊液的时间大约为2小时。
FZ4(DSM 13597)菌株的鉴定：
A)化学分类标准：
1.肽葡聚糖的诊断氨基酸；内消旋二氨基庚二酸。
2.霉菌酸：存在具有长链C40-C48的霉菌酸。
3.脂肪酸模式：存在线性的、饱和的和不饱和的脂肪酸以及很大比例的结核脂酸。根据脂肪酸构型，FZ4菌株被鉴定属于红球菌属。
B)传统鉴定标准：
FZ4菌株细胞的宏观的外观和形态与Rhodococcus rhodochrous很相似。它的菌落是鲑红色的(RAL 3022)，而且初期的培养物生成一些有分叉的菌丝，它们发展成棒条状或者球状体。
根据化学分类中的和传统上的一些分类标准，菌株F24被划分到Rhodococcus rhodochrous类，但是，相关因子比较低。
C)16s rDNA最开始的500个碱基的分析结果
16s rDNA的最开始500个碱基序列表现出与Rhodococcus rhodochrous的典型的代表菌株Rhodococcus rhodochrous DSM 43241 97.7％的相似性，而与其它的Rhodococcus rhodochrous相关菌株99.1％的相关性。因为F24菌株和Rhodococcus rhodochrous的16s rDNA的最开始500个碱基序列的相似性低于99.5％，F24菌株不可能被鉴别为Rhodococcus rhodochrous物种中的一员。
因此F24菌株被鉴别为红球菌属中的一个新的物种。
附图说明
图1为应用Rhodococcus sp.FZ4休止细胞将乙腈转化为乙酰胺的生物转化过程。
图2为休止细胞中Rhodococcus sp.FZ4腈水合酶活性的温度最适度。
图3为休止细胞中Rhodococcus sp.FZ4腈水合酶活性的热稳定性。
图4为休止细胞中Rhodococcus sp.FZ4腈水合酶活性的pH最适值。
图5为休止细胞中Rhodococcus sp.FZ4腈水合酶活性的pH稳定性。
图6为休止细胞中Rhodococcus sp.FZ4腈水合酶活性对的耐受性。
图7为休止细胞中Rhodococcus sp.FZ4腈水合酶活性对烟酰胺的耐受性。
图8为从乙腈到乙酰胺的生物转化过程中，在休止细胞中乙腈浓度对于Rhodococcus sp.FZ4腈水合酶活性的影响。
图9为休止细胞中乙腈浓度对于Rhodococcus sp.FZ4腈水合酶活性的影响。
图10为休止细胞中3-氰基吡啶浓度对于Rhodococcus sp.FZ4腈水合酶活性的影响。
图11为腈水合酶和参考蛋白质的分子量随各自的高效液相层析的滞留时间变化的对数曲线。
图12为腈水合酶亚基与参考蛋白质的分子量随各自的SDA Page RF值变化的对数曲线图。
图13为3-氰基吡啶浓度对于纯化的Rhodococcus sp.FZ4腈水合酶活性的影响。
图14为乙腈浓度对于纯化的Rhodococcus sp.FZ4腈水合酶活性的影响。
图15为纯化的Rhodococcussp.FZ4的热稳定性。
图16为Rhodococcus sp.FZ4腈水合酶活性的pH最适值。
图17为Rhodococcus sp.FZ4腈水合酶的pH稳定性。
具体实施方式
实施例1
腈水合酶活性的鉴定
腈水合酶的活性鉴定首先要在20℃下对一种反应混合物搅拌培养5分钟，该反应混合物由3-氰基吡啶(1.0M，1.0ml)、磷酸钾缓冲液(0.1M，pH7.0；0.5ml)和细胞悬液(0.5ml)组成。加入HCl溶液(5M；0.1ml)可使该反应停止。然后，用0.2微米的过滤器来过滤混合物，由高效液相层析(WatersSpherisorb 5μODS2(4.6×150mm)；KH2PO4/H3PO4(10mM；pH2.8)/乙腈＝9∶1(v/v)；1ml/min；230nm)确定生成的的量。总的活力用每分钟每毫升的溶液里生成烟酰胺的量(μmol/(min×ml))表示。比活力用生成的烟酰胺的量μmol/(min×ml×OD610nm)来表示。
实施例2
Rhodococcus sp.FZ4(DSM 13597)菌株的分离
Arch.Microbiol.(1998，170，85-90)中曾经讲述了Rhodococcus sp.YH3-3(TPU 3453)菌株将3-吡啶醛肟降解成3-氰基吡啶和烟酰胺，再降解成烟酸的过程。在这种情况下，Rhodococcus sp.YH3-3(TPU 3453)菌株的醛肟脱水酶活性、腈水合酶活性和酰胺酶活性会受到不同的醛肟和腈的诱导。
将不同的土壤样品接种到表1的富集培养基中，并在37℃的条件下培养7-10天。得到的培养物转移到同样的培养基中，再在37℃条件下培养7-10天。重复此过程3次。最后，培养物被稀释并倾入培养皿中。培养皿在37℃条件下培养5天，就可得到分散的单个菌落。根据例1中的腈水合酶活性鉴定方法来鉴定各个菌落，这样，就可以分离出Rhodococcus sp.FZ4(DSM 13597)菌落。用腈比如乙腈、丙腈、丁腈、巴豆腈、己二腈和丙二腈代替3比啶醛肟作碳源也是可以的。
表1：富集培养基
| 组分 | 浓度[g/l] |
| 3-吡啶醛肟 | 3.0或1.0 |
| (NH4)2HPO4 | 2.0 |
| KH2PO4 | 2.0 |
| NaCl | 1.0 |
| MgSO4×7H2O | 0.2 |
| CoCl2×6H2O | 0.01 |
| 酵母浸膏 | 0.2 |
加水稀释到11(pH7.0)。
实施例3
在培养的过程中一些辅助因子对于Rhodococcus sp.FZ4腈水合酶活性的影响
将Rhodococcus sp.FZ4(DSM 13597)菌株接种到表2给出的前培养基中，在28℃下摇床培养1-2天。得到的培养物转移到由表3给出的包含CoCl2或者FeSO4的基础培养基中，在28℃下摇床培养2-3天。根据例1鉴定腈水合酶活性。结果由表4给出。只有当Rhodococcus sp.FZ4在钴存在条件下培养才表现出腈水合酶活性。
表2：前培养基
| 组分 | 浓度[g/l] |
| 蛋白胨 | 5.0 |
| 肉膏 | 5.0 |
| NaCl | 2.0 |
| 酵母膏 | 0.5 |
加水稀释到11(pH7.0)。
表3：基础培养基
| 组分 | 浓度[g/l] |
| 酵母膏 | 2.0 |
| 蛋白胨 | 0.2 |
| L-谷氨酸盐，钠盐 | 15.0 |
| MgSO4×7H2O | 0.5 |
| CoCl2×6H2O(或FeSO4×7H2O) | 0.004 |
| 巴豆酰胺 | 5.0 |
加水稀释到11(pH6.8)。
表4：
在培养的过程中一些辅助因子对于Rhodococcus sp.FZ4腈水合酶活性的影响
| 辅助因子 | 生长[OD610nm] | 总活力[μmol/(min×ml) | 比活力[μmol/(min×ml×OD610nm)] |
| FeSO4 | 2.86 | 0.989 | 0.346 |
| CoCl2 | 2.79 | 38.1 | 13.1 |
实施例4
在培养的过程中诱导物对于Rhodococcus sp.FZ4腈水合酶活性的影响
将Rhodococcus sp.FZ4(DSM 13597)菌株接种到的表2给出的前培养基中，在28℃下摇床培养1-2天。得到的培养物转移到表5给出的包含不同的诱导物的培养基中，在28℃下摇床培养3天。根据例1鉴定腈水合酶活性。结果由表6给出。只有在诱导物存在条件下培养，才表达出Rhodococcus sp.FZ4腈水合酶。
表5：培养基
| 组分 | 浓度[g/l] |
| 酵母膏 | 1.0 |
| 柠檬酸钠 | 10.0 |
| 麦芽膏 | 15.0 |
| 诱导物 | 0.2％(w/v) |
| KH2PO4 | 2.0 |
| MgSO4×7H2O | 0.5 |
| CoCl2×6H2O | 0.015 |
加水稀释到11(pH7.0)。
表6：在培养的过程中诱导物对于Rhodococcus sp.FZ4腈水合酶活性的影响
| 诱导物 | 生长[OD610nm] | 总活力[μmol/(min×ml)] | 比活力[μmol/(min×ml×OD610nm)] |
| 异丁烯酰胺 | 4.55 | 569 | 125 |
| 异丁酰胺 | 3.55 | 387 | 109 |
| 丁酰胺 | 4.7 | 344 | 73.2 |
| 甲基丙烯腈 | 4.61 | 330 | 71.5 |
| 巴豆酰胺 | 9.32 | 558 | 59.9 |
| 丁腈 | 5.26 | 307 | 58.4 |
| 戊酰胺 | 5.61 | 322 | 57.5 |
| 异丁腈 | 5.24 | 273 | 52.1 |
| 巴豆腈 | 8.24 | 407 | 49.4 |
| 丙酰胺 | 5.17 | 149 | 28.7 |
| 戊腈 | 3.70 | 120 | 32.4 |
| 异己腈 | 4.72 | 134 | 28.5 |
| 异戊腈 | 3.22 | 74.7 | 23.2 |
| 己腈 | 4.54 | 104 | 23.0 |
| 丙腈 | 4.72 | 95.8 | 20.3 |
| 丙烯酰胺 | 5.17 | 60.5 | 11.7 |
| 3-戊烯腈 | 4.62 | 62 | 13.4 |
| ε-己内酰胺 | 4.44 | 40.3 | 9.08 |
| 氰苯 | 5.62 | 40.3 | 7.17 |
| 吡啶酰胺 | 3.80 | 26.1 | 6.87 |
| - | 4.2 | 27.7 | 6.59 |
| 氰基乙酰胺 | 4.75 | 30.9 | 6.50 |
| 乙酰胺 | 4.37 | 21.6 | 4.98 |
| 乙腈 | 4.46 | 18.4 | 4.13 |
| 3-氰基吡啶 | 5.54 | 12.3 | 2.21 |
| 异烟酰胺 | 5.03 | 10.9 | 2.17 |
| 苯甲酰胺 | 3.88 | 8.24 | 2.12 |
| 丙烯腈 | 3.27 | 5.91 | 1.81 |
| 烟酰胺 | 3.55 | 4.94 | 1.39 |
| 尿素 | 6.16 | 5.66 | 0.918 |
实施例5
Rhodococcus sp.FZ4的培养
将Rhodococcus sp.FZ4(DSM 13597)菌株接种到表2给出的前培养基中，在28℃下摇床培养1-2天。得到的培养物转移到表5给出的包含6g/l的异丁烯酰胺作为诱导物的培养基中，在28℃下摇床培养3天。48小时以后，再加入0.2％(v/v)的异丁烯酰胺。
例6-13中，使用Rhodococcus sp.FZ4的休止细胞。
实施例6
Rhodococcus sp.FZ4腈水合酶活性的底物特异性
用例1的方法鉴定针对不同底物的Rhodococcus sp.FZ4腈水合酶活性，不同的是用适当的底物来替换3-氰基吡啶，并且针对所用的底物选择适当的HPLC条件。例7总结了不同底物情况下Rhodococcus sp.FZ4和Rhodococcusrhodochrous J1腈水合酶活性。
表7：
Rhodococcus sp.FZ4和Rhodococcus rhodochrous J1的腈水合酶活性的底物特异性比较
| Rhodococcus sp.FZ4 | Rhodococcus rhodochrous J1 | |
| 底物 | 相对活性[％] | 相对活性[％] |
| 乙腈 | 646 | 0(腈水合酶A)115(腈水合酶B) |
| 丙烯腈 | 498 | 478 |
| 丁腈 | 466 | 26 |
| 丙腈 | 412 | 435 |
| 3-氰基吡啶 | 100 | 100 |
| 4-氰基吡啶 | 98.4 | 70 |
| 巴豆腈 | 92.1 | 78 |
| 氰苯 | 41.7 | 27 |
| 2-氰基吡啶 | 39.3 | 45 |
| m-氯苯腈 | 39.3 | 43 |
| p-氯苯腈 | 8.25 | 13 |
| 甲基丙烯腈 | 3.64 | 87 |
| o-氯苯腈 | 0 | 2.8 |
实施例7
Rhodococcus sp.FZ4腈水合酶活性的温度最适度和热稳定性
在20-70℃范围内的不同温度下，根据例1方法测定腈水合酶的活性。腈水合酶活性的最适点是60℃(见图2)。
为了确定腈水合酶的温度稳定性，在40-70℃范围内的不同温度下培育细胞悬液15分钟。然后在20℃，用例1中的方法来测定腈水合酶的活性。在40-60℃的范围内的不同温度下培育15分钟后，腈水合酶活性相对于初始的腈水合酶活性(图3)。
实施例8
Rhodococcus sp.FZ4腈水合酶活性的pH值最适度和pH值稳定性
PH值3-12范围内，用不同的缓冲液(0.1M)应用例1中给出的方法来测定腈水合酶的活性。腈水合酶的pH值最适点在6-7之间(图4)。
为了得到腈水合酶的pH值稳定性，在20℃，pH值由4-10的范围内培育细胞悬液24小时。离心细胞悬液，清洗分离出的细胞，加入磷酸钾缓冲溶液(0.1M；pH7.0)中。在5-10的pH值变化范围内培育24小时后，根据实施例1的方法测定腈水合酶活性，得到的值与初始的腈水合酶活性接近(图5)。
实施例9
3-氰基吡啶浓度对于Rhodococcus sp.FZ4腈水合酶活性的影响
细胞悬液在20℃下，在0-10％(w/v)范围内的不同浓度的3-氰基吡啶溶液中培养60分钟。分离出细胞，清洗，加入磷酸钾缓冲溶液(0.1M；pH7.0)。在0-20％(w/v)范围内的不同浓度的3-氰基吡啶溶液中培养60分钟后，根据实施例1中的方法测定腈水合酶活性，近似于初始的腈水合酶活性(图6)。
实施例10
烟酰胺浓度对于Rhodococcus sp.FZ4腈水合酶活性的影响
细胞悬液在20℃下，在0-20％(w/v)范围内的不同浓度的烟酰胺溶液中培养24小时。分离出细胞，清洗，加入磷酸钾缓冲溶液(0.1M；pH7.0)。在0-20％(w/v)范围内的不同浓度的烟酰胺溶液中培养24小时后，由实施例1中的方法测定腈水合酶活性，得到的值近似于初始的腈水合酶活性(图7)。
实施例11
测定Rhodococcus sp.FZ4腈水合酶对3-氰基吡啶的米氏常数值
将由3-氰基吡啶(0.1-1.0M；1.0-1.8ml)、NaCl水溶液(0.85％(w/v)；0.7 to0.1ml)、磷酸钾缓冲液(0.1M；pH7.0；0.3ml)和细胞悬液(0.01ml)组成的反应混合物在30℃下摇床培养10分钟。反应混合物的体积大约2.0-2.2ml，主要由3-氰基吡啶浓度决定。反应可以通过加入HCl溶液(2M；0.1ml)终止。将反应混合物离心(12000rpm；5分钟)，生成的烟酰胺的量由实施例1中的高效液相层析方法测得。得到的米氏常数值为160mM(图10)。
实施例12
Rhodococcus sp.FZ4腈水合酶活性与已知的微生物Amycolatopsis sp.NA40，Rhodococcus sp.GF270和Rhodococcus rhodochrous J1的腈水合酶活性的比较
相应于Rhodococcus sp.FZ4，Rhodococcus sp.GF270(DSM 12211；WO 99/05306)，Amycolatopsis sp.NA40(DSM 11617；WO 99/05306)和Rhodococcus rhodocrous J1的腈水合酶的活性的底物3-氰基吡啶的米氏常数值用相应的微生物根据实施例11来测定。
Amycolatopsis sp.NA40和Rhodococcus sp.FZ4菌株的米氏常数值小于其它的微生物相应的值(表8)。
表8：底物3-氰基吡啶的米氏常数值比较
| KM[mM] | |||
| Rhodococcussp.FZ4 | Rhodococcussp.GF270 | Amycolatopsissp.NA40 | Rhodococcusrhodochrous J1 |
| 160 | ＞200 | 41.7 | 200 |
Rhodococcus sp.FZ4，Rhodococcus sp.GF270，Amycolatopsis sp.NA40和Rhodococcus rhodocrous J1的腈水合酶热稳定性根据实施例7的方法，用相应的微生物和表9给出的培育条件测得。Rhodococcus sp.FZ4菌株腈水合酶活性和其它微生物的腈水合酶活性相比，热稳定性最高。
表9：腈水合酶活性的热稳定性比较
| 相对活性[％] | ||||
| 培育条件 | Rhodococcussp.FZ4 | Rhodococcussp.GF270 | Amycolatopsissp.NA40 | Rhodococcusrhodochrous J1 |
| 15min在 | ||||
| 50℃ | 100 | 100 | nda | 100 |
| 60℃ | 93 | 95 | nda | 80 |
| 70℃ | 2 | 5 | nda | 0 |
| 60min在 | ||||
| 20℃ | 100 | 100 | 100 | nda |
| 30℃ | 100 | 100 | 95 | nda |
| 40℃ | 100 | 100 | 80 | nda |
| 50℃ | 100 | 100 | 32 | nda |
| 60℃ | 100 | 89 | 0 | nda |
| 70℃ | 6 | 0 | 0 | nda |
| 60℃培育 | ||||
| 0min | 100 | 100 | nda | nda |
| 30min | 100 | 67-80 | nda | nda |
| 60min | 92-100 | 52-68 | nda | nda |
| 120min | 72-87 | 29-47 | nda | nda |
a待定
通过实施例9，用相应的微生物和表10中给出的3-氰基吡啶浓度来测定3-氰基吡啶浓度对于Rhodococcus sp.FZ4，Rhodococcus sp.GF270，Amycolatopsis sp.NA40和Rhodococcus rhodocrous J1的腈水合酶活性的影响。Rhodococcus sp.FZ4和Rhodococcus sp.GF270菌株的腈水合酶活性表现出最高的3-氰基吡啶耐受性。
表10：3-氰基吡啶浓度对腈水合酶活性的影响
| 相对活力[％] | ||||
| 3-氰基吡啶[％(w/v)] | Rhodococcussp.FZ4 | Rhodococcussp.GF270 | Amycolatopsissp.NA40 | Rhodococcusrhodochrous J1 |
| 0 | 100a | 100a | 100b | 100b |
| 2.5 | 100a | 100a | 74b | ndc |
| 5.0 | 100a | 100a | 56b | 86b |
| 7.5 | 100a | 100a | 47b | ndc |
| 10.0 | 100a | 100a | 16b | 63b |
a培育60分钟。b培育15分钟。
c待定
根据实施例9，用相应的微生物和表11中给出的烟酰胺浓度来测定烟酰胺浓度对Rhodococcus sp.FZ4，Rhodococcus sp.GF270，Amycolatopsis sp.NA40和Rhodococcus rhodocrous J1的腈水合酶活性的影响。Rhodococcus sp.FZ4和Rhodococcus sp.GF270菌株的腈水合酶活性表现出最高的烟酰胺耐受性(表11)。
表11：烟酰胺浓度对于腈水合酶活性的影响
| 相对活力[％] | ||||
| 烟酰胺[％(w/v)] | Rhodococcussp.FZ4 | Rhodococcussp.GF270 | Amycolatopsissp.NA40 | Rhodococcusrhodochrous J1 |
| 0 | 100 | 100 | 100 | nda |
| 10 | 100 | 100 | 55 | nda |
| 20 | 100 | 100 | 0 | nda |
| 30 | 100 | 100 | 0 | nda |
a待定
实施例13
通过Rhodococcus sp.FZ4实现由3-氰基吡啶到烟酰胺的生物转化
往细胞悬液(13.7mg干细胞重，4ml)和磷酸钾缓冲液(0.1M；pH6.0；16ml)组成的混合液中加入42份的3-氰基吡啶(42×0.52g＝21.8g；0.21mol)。当反应混合物中的3-氰基吡啶全部数量都转化成了烟酰胺之后，再加入下一份的3-氰基吡啶。在反应过程中反应混合液变成固态。生成的烟酰胺共有25.7g。
实施例14
通过Rhodococcus sp.FZ4实现从乙腈到乙酰胺的生物转化
在20℃下，往磷酸钾缓冲液(0.1M；pH7.0；4.5ml)和细胞悬液(4.88mg干细胞重；0.5ml)的反应混合物中逐滴加入乙腈溶液(5ml；95mmol)，滴加80分钟。并在20℃下将该反应混合液不断摇动。反应中的乙酰胺产物通过高效液相层析(Waters Spherisorp 5μODS2(4.6×150mm)；KH2PO4(10mM；pH2.5)/乙腈＝99/1(v/v)；1.0ml/min；210nm)测定。120分钟内在反应培养基中共积累生成6.14g乙酰胺产物。
实施例15
由乙腈到乙酰胺的生物转化过程中，乙腈的浓度对Rhodococcus sp.FZ4腈水合酶活性的影响
将乙腈(0.2-19.0M；1.0-1.6ml)、NaCl水溶液(0.85％(w/v)；0.6-0.0ml)、磷酸钾缓冲液(0.1M；pH7.0；0.3ml)和细胞悬液(0.01ml)组成的反应混合物在20℃下摇床培养10分钟。总的反应物体积为2.0ml。反应通过加入MeOH而终止。将反应混合物离心(12000rpm，5min)，乙酰胺产物的量由实施例14中的高效液相层析方法确定。
在0.1-15M浓度范围的乙腈溶液中，腈水合酶的活性几乎是不变的(图8)。
实施例16
乙腈的浓度对Rhodococcus sp.FZ4腈水合酶活性的影响
20℃下，在含0.0-15.0M乙腈的磷酸钾缓冲溶液(0.1M，pH7.0)中培育细胞1小时。离心(12000rpm，5min)细胞悬液，将得到的细胞加到NaCl水溶液(0.85％(w/v))中，得到新的细胞悬液。30℃下，摇床培育由该细胞悬液(0.1ml)，3-氰基吡啶(0.5Mj 1.0ml)，NaCl水溶液(0.85％(w/v)；0.6ml)和磷酸钾缓冲液(0.1M；pH7.0；0.3ml)的反应混合物5分钟。加入MeOH使反应停止。离心(12000rpm，5min)反应混合物，生成的乙酰胺量通过实施例14给出高效液相层析方法测得。
经过一个小时的培育以后，在乙腈的浓度从0M到3M的过程中腈水合酶活性几乎不变。而若在6M的乙腈中培育1小时后，60％的最初的腈水合酶活性仍然存在。在9M的乙腈中培育1小时后，接近350％的最初的腈水合酶活性仍然存在(图9)。
实施例17
无色素Rhodococcus sp.FZ4突变体的发生
将Rhodococcus sp.FZ4菌株接种到“肉汁”培养基(50ml)，在28℃下摇床培养直到OD610nm达到6.29为止。然后前培养物(10ml)被转移到“肉汁”培养基(25ml)，在28℃下摇床培养直到OD610nm达到1.90为止。将得到的培养物(10ml)离心(8000rpm，5min)。弃上层清液，在细胞沉淀中加入磷酸盐缓冲液得到细胞悬液。离心(8000rpm，5min)该细胞悬液。丢弃上层清液，细胞沉淀加入磷酸盐缓冲液中得到悬液(5ml)。然后将细胞悬液转移到直径为90mm的玻璃培养皿中。从25cm的距离处用一个UV灯(15W，254nm)照射细胞17分钟。然后28℃下在双浓缩的“肉汁”培养基中摇床培养4天。得到的培养物稀释100倍，这样就得到100μl等分，每等分制成一个琼脂平板，28℃下培养。在每个平板上几乎可以得到150个单一的菌落。为了诱导红色素的形成，将这些平板暴露在日光中。突变的无色素菌落很容易和那些有色突变以及红色野生型区分开。
实施例18
Rhodococcus sp.FZ4腈水合酶的纯化
在2-1发酵罐中，根据例3培育Rhodococcus sp.FZ4。离心培养物，细胞沉淀在NaCl水溶液(0.85％(w/v))中制成悬液。该细胞悬液转移到包含丁酸(44mM)的磷酸钾缓冲溶液(0.1M；pH7.0)中，并经过声波处理。离心除去细胞残骸。按照表12利用上层清液制得纯化的腈水合酶。腈水合酶的活性由例1的方法确定，要注意用相应的浸膏代替细胞悬液。
表12：Rhodococcus sp.FZ4腈水合酶的纯化
| 纯化步骤 | 蛋白质含量[mg] | 活力[μmol/min] | 比活力[μmol/(min×mg)] |
| 无细胞提取物 | 335 | 5881 | 17.6 |
| (NH4)2SO4沉淀 | 198 | 6087 | 28.4 |
| DEAE-Sephacel | 73.0 | 3553 | 48.7 |
| Butyl-Toyopearl | 66.2 | 2035 | 30.7 |
| Phenyl-Sepharose | 26.2 | 890 | 34.0 |
实施例19
纯化的腈水合酶分子量的确定
该分子量是通过高效液相层析方法(TSK gel G 300 SW(0.75×60cm)；磷酸钾缓冲液(0.1M；pH7.5)和KCl(0.2M)；0.7ml/min；280nm)确定的。
腈水合酶的分子量为465kDa(图11)。
腈水合酶由一个分子量为27.7kDa的α-亚基和一个分子量为31.2kDa的β-亚基组成(图12)。
实施例20
纯化的腈水合酶的热稳定性
在20-70℃范围内的不同温度下，将乙腈水合酶溶液(0.697μmol/min；0.025ml)和磷酸钾缓冲液(0.1M；pH7.0；0.475ml)组成的溶液孵育60分钟。然后用冰浴将溶液降温到20℃并加入3-氰基吡啶(0.5M；0.500ml)。20℃下混合液孵育10分钟。加入MeOH使反应停止。生成的烟酰胺量通过实施例1的高效液相层析方法测定。在40℃以上的温度下培育60分钟，腈水合酶活性显著下降。在50℃下培育60分钟后，腈水合酶的活性只有原来的25％(图15)。
实施例21
纯化的腈水合酶的pH最适度
在20℃温度下，将3-氰基吡啶溶液(0.5M；0.500ml)、腈水合酶溶液(0.697μmol/min；0.025ml)以及pH值为4-11的不同的缓冲液(0.1M；0.0475ml)所组成的反应混合液孵育10分钟。反应通过加入MeOH使其停止，生成的烟酰胺数量通过例1给出高效液相层析方法测定。腈水合酶的最适pH值在6.0-6.5之间(图16)。
实施例22
纯化的腈水合酶的pH稳定性
在20℃下，将腈水合酶溶液(8.36Gmol/min；0.47ml)、pH值4.0-11.0的不同的缓冲液(0.3M；0.10ml)和蒸馏水(0.03ml)所组成的溶液孵育30分钟。将所培养的腈水合酶溶液的一部分(0.05ml)、3-氰基吡啶溶液(0.5M；0.5ml)和相应的缓冲液(0.1M；0.45ml)所组成的反应混合液在20℃下孵育10分钟。加入MeOH可使反应终止。生成的烟酰胺量通过实施例1的高效液相层析方法测定。在6-8范围内的不同pH值下培育60分钟后，腈水合酶活性与初始的腈水合酶活性接近(图17)。
实施例23
纯化的腈水合酶的底物特异性
将腈水合酶溶液(0.695μmol/min；0.025ml)、不同底物(0.500ml)和磷酸钾缓冲液(0.1M；pH7.0；0.475ml)所组成的反应混合物在20℃下培育5-10分钟。所使用的底物的浓度为0.015-0.250M。反应通过加入MeOH停止。生成的氨基化合物的量通过高效液相层析测得。结果由表13给出。在提到的底物中，腈水合酶对于底物乙腈的活性最高。
表13：纯腈水合酶的底物特异性
| 底物 | 浓度[M] | 相关活性[％] |
| 乙腈 | 0.2 | 1008 |
| 丙烯腈 | 0.2 | 774 |
| 丙腈 | 0.2 | 693 |
| 丁腈 | 0.2 | 578 |
| 巴豆腈 | 0.2 | 114 |
| 3-氰基吡啶 | 0.25 | 100a |
| 4-氰基吡啶 | 0.125 | 92.8 |
| 氰苯 | 0.015 | 75.6 |
| m-氯苯腈 | 0.015 | 66.5 |
| 2-氰基吡啶 | 0.125 | 36.7 |
| p-氯苯腈 | 0.015 | 8.31 |
| 异丁烯酰胺 | 0.2 | 1.39 |
| o-氯苯腈 | 0.015 | 0 |
a总活力：4164μmol/(min×ml)
实施例24
潜在的抑制物对于纯化的腈水合酶的影响
在20℃下，将由腈水合酶溶液(0.695μmol/min；0.025ml)、磷酸钾缓冲液(0.1M；pH7.0；0.475ml)、蒸馏水(0.150ml)和不同的潜在抑制剂(0.100ml)所组成的溶液孵育培养5分钟。然后加入3-氰基吡啶溶液(1.0M；0.250ml)。反应混合液中的抑制剂的浓度为1.0mM。反应混合物在20℃孵育10分钟。反应通过加入MeOH停止。生成的烟酰胺量通过实施例1中的高效液相层析方法测定。结果由表14给出。在所测的潜在的抑制剂中，羟胺和氰化钾具有最强的抑制反应。
表14：潜在的抑制物对于纯化的腈水合酶的影响
| 潜在抑制剂 | 相对活性[％] |
| p-氯汞苯甲酸a | 187 |
| 钛试剂 | 114 |
| 氟化磺酰苯甲烷 | 110 |
| 1，10-邻二氮杂菲 | 106 |
| 尿素 | 106 |
| 二硫苏糖醇 | 103 |
| 乙二铵四乙酸b | 100 |
| - | 100c |
| 巯乙胺 | 99.1 |
| 8-羟基喹啉 | 97.8 |
| 2，2′-联吡啶 | 97.8 |
| 碘乙酸 | 96.7 |
| N-乙基顺丁烯二酰亚胺 | 95.3 |
| 叠氮化钠 | 93.5 |
| 5，5′-二硫双(2-硝基苯酸)a | 93.4 |
| 二乙基二硫氨基甲酸 | 93.3 |
| D-环丝氨酸 | 86.3 |
| 苯肼 | 84.6 |
| 2-巯基乙醇 | 76.3 |
| 羟胺 | 1.34 |
| 氰化钾 | 0 |
a0.1mM.b乙二胺四乙酸。
c总活力：3776μmol/(min×ml)
实施例25
金属离子对于纯化的腈水合酶活性的影响
根据实施例24的方法测定金属离子对于纯腈水合酶活性的影响，不同的是要加入金属离子代替潜在的抑制剂。反应混合物中金属离子的浓度为1.0mM。结果由表15给出。在提到的金属离子中，只有银阳离子和二价汞离子表现出抑制性。
表15：金属离子对于纯化的腈水合酶活性的影响
| 金属离子 | 相对活性[％] |
| CuSO4 | 177 |
| MnCl2 | 123 |
| NiCl2 | 123 |
| ZnSO4 | 121 |
| FeSO4 | 113 |
| CaCl2 | 113 |
| CoCl2 | 110 |
| FeCl3 | 105 |
| - | 100a |
| AgNO3 | 0 |
| HgCl2 b | 0 |
a总活力：3375μmol/(min×ml).b 0.1mM
实施例26
相对于纯化的腈水合酶，3-氰基吡啶的米氏常数值的测定
在含腈水合酶溶液(0.0697μmol/min；0.025ml)和磷酸钾缓冲液(0.1M；pH7.0；0.475ml)的混合溶液中，分别加入不同浓度的3-氰基吡啶(3.1-800mM；0.500ml)。反应混合物在20℃孵育10分钟。加入甲醇停止反应。根据实施例1的高效液相层析方法测定生成的烟酰胺量。
3-氰基吡啶的米氏常数值为80.5mM(图13)。
实施例27
相对于纯化的腈水合酶，乙腈的米氏常数值的鉴定
在含腈水合酶溶液(0.0697μmol/min；0.025ml)和磷酸钾缓冲液(0.1M；pH7.0；0.475ml)的混合溶液中，分别加入不同浓度的乙腈(2.5-80mM；0.500ml)。反应混合物在20℃孵育10分钟。加入甲醇停止反应。根据实施例1中的高效液相层析方法测定生成的乙酰胺量。乙腈的米氏常数值为2.84mM(图14)。
Claims (11)
1.一种微生物，其特征在于它可以耐受至少3M浓度的乙腈溶液。
2.根据权利要求1所述的微生物，其特征在于该微生物是红球菌属。
3.根据权利要求2所述的微生物，其特征在于该微生物是Rhodococcus sp.FZ4菌株，DSM编号为13597。
4.一种从权利要求1-3的任何一个微生物中提取得到的酶浸膏。
5.一种从权利要求1-3的任何一个微生物中提取得到的腈水合酶。
6.根据权利要求5所述的腈水合酶，其特征在于：
a)对于底物乙腈的米氏常数值为2.84±1.00mM，底物3-氰基吡啶的米氏常数值为80.5±15.0mM
b)pH值最适度为6.5±1.0。
7.一种腈水合酶，其特征在于：
a)对于底物乙腈的米氏常数值为2.84±1.00mM，底物3-氰基吡啶的米氏常数值为80.5±15.0mM
b)pH值最适度为6.5±1.0。
8.一种制备具有如下通式氨基化合物的方法，
R1-CONH2 III
其中，R1为C1-6烷基、C2-6烯基或者具有通式
R1-CN II的腈转化制得的，其中R1定义如上。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于使用的腈是3-氰基吡啶或者乙腈。
10.根据权利要求8或9所述的方法，其特征在于反应在5-50℃，pH值5-10的范围内进行。
11.一种使用权利要求1-3所述的任一微生物来清理乙腈废物。
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