CN1834236A - 野生型枯草芽胞杆菌脂肪酶a变体及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了野生型枯草芽胞杆菌脂肪酶A变体及其应用。其目的是提供野生型枯草芽胞杆菌脂肪酶A的变体及其筛选方法与其在制备洗涤剂中的应用。该野生型枯草芽胞杆菌脂肪酶A变体是将野生型枯草芽胞杆菌脂肪酶A的氨基酸残基序列进行下列五种突变中的一种或几种突变组合后得到的蛋白质：1)自氨基端第16位的丝氨酸突变为脯氨酸；2)第112位的赖氨酸突变为谷氨酸；3)第142位的精氨酸突变为丝氨酸；4)第152位的组氨酸突变为谷氨酰胺；5)第153位的甘氨酸突变为天门冬氨酸。本发明具有较高的实际应用价值和广阔的市场前景。
Description
技术领域
本发明涉及脂肪酶变体及其应用，特别是涉及野生型枯草芽胞杆菌脂肪酶A(BSLA)的变体及其筛选方法与其在制备洗涤剂中的应用。
背景技术
脂肪酶(Lipase)被广泛认为是一种非常有用的生物催化剂，不仅可作为洗涤剂添加剂、食品成分使用，还可用于造纸、生物柴油生产、有机合成等诸多领域。其中，来自于枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis 168)的脂肪酶A具有多种与众不同的性质(Dartois V.，B.，A.，Schanck，K.，Colson，C.，Cloning，nucleotide sequenceand expression in Escherichia coli of a lipase gene from Bacillus subtilis168，BIOCHIMICA ET BIOPHYSICA ACTA，1992，1131：253-260；Jaeger，K.，S.Ransac，et al.，Bacterial lipases，FEMS MICROBIOLOGY REVIEWS，1994，15(1)：29-63；Reetz，M.，Lipases as practical biocatalysts，CURRENT OPINION IN CHEMICALBIOLOGY，2002，6(2)：145-150)，包括：1)是目前所知的最小的脂肪酶之一，其成熟蛋白(mature protein)仅由181个氨基酸残基组成，分子量约为19kDa；2)没有盖子(lid)结构，不需要界面激活(Interfacial activation)；3)对具有中等链长脂肪酸的脂显示最高活性；4)最适pH值为10。以上这些特性，尤其是由于不需要界面激活(interfacial activation)的特点使得该酶的水解活性不依赖恰当的油水界面(或适当的水含量)，并防止与残留脂肪分子的结合，本发明的发明人认为该脂肪酶非常有望在洗涤剂行业中实现首次洗涤(first-wash)，并可将其用于食品工业或其它工业生物技术领域。
酶的定向计划是通过改变酶分子的基因序列来改变酶的性质的一种手段。具体来讲，它是在实验室模仿自然进化。首先对酶的基因进行随机突变(常用的技术有易错PCR(Error-prone PCR)，DNA洗牌(DNA shuffling)等)，构建变体文库；其次，选择合适的载体和宿主进行表达；最后对文库进行筛选(screening)或是选择(selection)得到性质改变的变体。然后再以此变体为模板，重复上述过程，直至变体达到所期望的性质。目前，定向进化已经成功用于改变酶的底物活性、底物特异性、热稳定性、对映体选择性等，并取得了显著的成绩(Kuchner，O.，F.Arnold，Directed evolution of enzyme catalysts，TRENDS IN BIOTECHNOLOGY，1997，15(12)：523-530；Petrounia，I.，F.Arnold，Designed evolution of enzymatic properties，CURRENT OPINION IN BIOTECHNOLOGY，2000，11(4)：325-33；Arnold，F.，combinatorial and computational challenges for biocatalyst design，NATURE，2001，409(6817)：253-257)。
发明内容
本发明的目的是提供具有改良酶活性的野生型枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)脂肪酶A的变体。
所述变体是将野生型枯草芽胞杆菌脂肪酶A的氨基酸残基序列进行下列五种突变中的一种或几种突变组合后得到的蛋白质：1)自氨基端(N端)第16位的丝氨酸(S)突变为脯氨酸(P)，记为S16P；2)第112位的赖氨酸(K)突变为谷氨酸(E)，记为K112E；3)第142位的精氨酸(R)突变为丝氨酸(S)，记为R142S；4)第152位的组氨酸(H)突变为谷氨酰胺(Q)，记为H152Q；5)第153位的甘氨酸(G)突变为天门冬氨酸(D)，记为G153D；所述野生型枯草芽胞杆菌脂肪酶A具有序列表中SEQ ID №：1的氨基酸残基序列。
其中，优选的野生型枯草芽胞杆菌脂肪酶A变体可具有下述氨基酸残基序列之一：
1)序列表中SEQ ID №：2；
2)序列表中SEQ ID №：3。
序列表中SEQ ID №：2-3均由181个氨基酸残基组成。将具有序列表中SEQ ID №：2的氨基酸残基序列的变体命名为BSLA-1-4，该变体同时具有上述S16P和G153D两种突变；将具有序列表中SEQ ID №：3的氨基酸残基序列的变体命名为BSLA-2-6，该变体同时具有上述S16P、K112E、R142S、H152Q和G153D五种突变。
编码上述野生型枯草芽胞杆菌脂肪酶A变体的基因也属于本发明的保护范围，其中，优选的野生型枯草芽胞杆菌脂肪酶A变体基因，可为下述核苷酸序列之一：
1)序列表中SEQ ID №：5；
2)序列表中SEQ ID №：6。
序列表中SEQ ID №：5-6均由543个碱基组成，分别编码上述野生型枯草芽胞杆菌脂肪酶A变体BSLA-1-4和BSLA-2-6。
含有上述野生型枯草芽胞杆菌脂肪酶A变体基因的表达载体、转基因细胞和宿主菌也属于本发明的保护范围。
本发明的另一个目的是提供一种筛选具有较高酶活性的脂肪酶变体的方法。
本发明所提供的筛选方法，包括以下步骤：
1)构建脂肪酶基因的变体文库；
2)将变体文库与载体连接，然后将携带有变体文库的重组载体导入宿主菌；
3)将步骤2)获得的转化子接种于初筛平板上进行定性初筛，筛选出具有脂肪酶活性的变体；所述初筛平板为在宿主菌常规培养用固体培养基的基础上添加能筛选出外源载体的标记物，以及脂肪酶的底物；
4)挑取步骤3)经初筛后具有脂肪酶活性的变体，将其接种于生长平板上进行培养，长出单菌落后作为母板保存；所述生长平板为在宿主菌常规培养用固体培养基的基础上添加能筛选出外源载体的标记物；
5)用转膜法将步骤4)母板上的菌落转印到诱导平板上进行诱导；所述诱导平板为在宿主菌常规培养用固体培养基的基础上添加能筛选出外源载体的标记物，以及诱导剂；
6)裂解步骤5)中经诱导的菌落，使其表达的脂肪酶吸附在转印膜的表面，再将转印膜置于复筛平板上进行定性复筛，得到较野生型脂肪酶活性提高的变体；所述复筛平板为仅含有琼脂糖和脂肪酶的底物的平板；
7)定量测定脂肪酶变体的活性。
在上述筛选方法中，所述步骤1)中可选用任何一种能在一个给定的脂肪酶基因上随机地引入突变的方法构建脂肪酶基因变体文库，如易错PCR(Error-prone PCR)、DNA洗牌(DNA shuffling)等。
步骤2)中所用的载体和宿主菌可以采用分子生物学领域中任何一种适用于脂肪酶基因克隆和表达的载体和宿主菌；所述载体可为pET30a(+)、pBR332、YEplac112、pRB473等；宿主菌可为大肠杆菌BL21(DE3)、大肠杆菌5K、酵母菌13bxV4、枯草芽胞杆菌MB216等。
使用的宿主菌不同，步骤3)中用于制备初筛平板所选取的固体培养基也可能不同，比如LB固体培养基适用于大肠杆菌、YPD培养基适用于酵母菌等。此外，必须根据具体所用的载体和宿主菌来确定能筛选出外源载体的标记物，比如对于那些载体上含有抗生素抗性的质粒和不具有该抗性的宿主菌，可以使用该抗生素来筛选出含有该质粒的宿主菌，常用的抗生素为卡那霉素、氨苄青霉素、四环素等。对于某些营养缺陷型的宿主菌，则可以选用该营养物质来筛选，例如对尿嘧啶(Uracil)缺陷的酵母菌INVSc I和含有尿嘧啶基因的质粒pYES2，则可以用尿嘧啶来筛选出含有质粒pYES2的酵母菌INVSc I。脂肪酶的底物可以是任何一种能被脂肪酶所催化、且易判断该反应是否发生的物质。例如：无色的棕榈酸对硝基苯脂(p-nitrophenyl palmitate)被脂肪酶水解后生成黄色的对硝基苯酚；橄榄油(Olive oil)被脂肪酶水解后生成的物质能与红色染料若丹明B(Rhodamine B)反应生成在紫外灯照射下具有橙色荧光的化合物；在固体培养基中的三丁酸甘油脂(Tributyrin)被脂肪酶水解后能形成透明的水解圈等。
步骤5)中所用的转印膜可为任意一种能转移菌落并吸附蛋白质的薄膜，例如硝酸纤维素膜、尼龙膜等；根据具体所用的载体和宿主菌选择合适的诱导剂，如对于含有T7启动子的质粒pET30a(+)，当该质粒导入大肠杆菌BL21(DE3)后，可采用异丙基β-D硫代半乳糖苷(Isopropyl-β-D-thigalactopyranoside，IPTG)作为诱导剂。
步骤6)中可采用任何一种常规的菌落裂解方法，如用含有裂解液(如溶菌酶)的滤纸接触菌落。
步骤7)中可将步骤6)中经定性复筛得到的较野生型脂肪酶活性提高的变体在液体培养基中进行诱导后，定量测定其活性。
上述筛选具有较高酶活性的脂肪酶变体的方法适用于任意一种脂肪酶，尤其适用于野生型枯草芽胞杆菌脂肪酶A。
本发明提供了野生型枯草芽胞杆菌脂肪酶A变体。脂肪酶活性测定结果表明本发明的野生型枯草芽胞杆菌脂肪酶A变体与野生型该酶相比，对pNPP、pNPC及橄榄油的比活最高可分别提高4.8、3.0和2.6倍。结合背景技术中提到的脂肪酶的种种特性，本发明的野生型枯草芽胞杆菌脂肪酶A变体在洗涤剂的工业制备方面具有更大的优势。此外，本发明脂肪酶变体的筛选方法具有操作简单，筛选周期短的优点，易实现高通量筛选。基于上述优点，本发明具有较高的实际应用价值和广阔的市场前景。
下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。
附图说明
图1为重组质粒pET30a-BSLA的物理图谱
图2为野生型BSLA的晶体结构
具体实施方式
下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，具体步骤可参见：《Molecular Cloning：A Laboratory Manual》(Sambrook，J.，Russell，Dayid W.，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，3rd edition，2001，NY，Cold SpringHarbor)。所用引物均由大连宝生物(TakaRa)或上海生工合成。
实施例1、野生型枯草芽胞杆菌脂肪酶A变体的筛选
用下述方法筛选具有较高酶活性的野生型枯草芽胞杆菌脂肪酶A变体，具体过程包括以下步骤：
1、野生型枯草芽胞杆菌脂肪酶A(BSLA)基因的克隆
使用Promega公司的Wizard Genomic DNA Purification试剂盒并参照试剂盒说明书操作提取枯草芽胞杆菌168(Bacillus subtilis 168)的基因组DNA，然后以所提取的基因组DNA为模板，在引物P1(上游引物)：5’
AT
GAATTCATGGCTGAACACAATCCAGTCGTTATGG-3’(带下划线碱基为限制性内切酶EcoR I识别位点)和引物P2(下游引物)：5’-CCAGGGCG
AAGCTTTTCATTAATTCGTATTCTGG-3’(带下划线碱基为限制性内切酶Hind III识别位点)的引导下，用Touch Down PCR的方法扩增枯草芽胞杆菌脂肪酶A基因，该PCR反应使用NEB公司的Deep VentRDNA聚合酶，PCR反应条件为：先94℃ 2min；然后94℃ 1min，62℃ 1min，每个循环递减0.5℃，72℃ 80sec，共21个循环；再94℃ 1min，52℃ 1min，72℃ 80sec，共16个循环；最后72℃ 10min。反应结束后，对PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，结果PCR扩增出575bp大小的条带，与预期结果相符。回收、纯化该目的片段，将其用限制性内切酶EcoR I和Hind III进行双酶切后与经同样酶双酶切的质粒pET30a(+)(Novagen)进行连接，将连接产物电击转化大肠杆菌Escherichia coliBL21(DE3)感受态细胞，将转化细胞涂布于添加有50μg/mL卡那霉素的LB平板上筛选阳性克隆，提取质粒，对其进行测序，测序结果表明所克隆的BSLA基因序列正确(序列表中的SEQ ID №：4)，且正确连入pET30a(+)中，将该重组质粒命名为pET30a-BSLA，其物理图谱如图1所示。
2、构建枯草芽胞杆菌脂肪酶A变体文库并导入宿主
对步骤1克隆的枯草芽胞杆菌脂肪酶A(BSLA)基因进行易错PCR扩增，具体方法为：以步骤1构建的重组质粒为模板，在相同引物P1和P2的引导下进行易错PCR扩增，该PCR反应使用TaKaRa公司的TaqTM DNA聚合酶，MnCl2浓度为0.5mM，PCR反应条件为：先94℃ 2min；然后94℃ 1min，52℃ 1min，72℃ 40sec，共30个循环；最后72℃ 10min。反应结束后，对PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，回收、纯化PCR扩增的具有突变的BSLA基因，将其用限制性内切酶EcoR I和Hind III进行双酶切后与经同样酶双酶切的质粒pET30a(+)连接，将连接产物电击导入大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)中。
3、筛选酶活提高的BSLA变体
1)定性初筛
将步骤2的转化有BSLA变体基因的转化子直接涂布于含50μg/mL卡那霉素、10mg/L若丹明B(Rhodamine B)和31.25ml/L橄榄油(Olive oil)的LB抗性平板上(平板配制方法参见：Kouker，G.，K.-E.Jaeger，Specific and Sensitive PlateAssay for Bacterial Lipases，APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY，1987，53(1)：211-213)，在37℃下培养12-16小时进行初步筛选。
2)生长
挑取步骤1)经初筛后在平板长出的红色小点状的菌落，将其接种于含50μg/mL卡那霉素的LB抗性平板上，在37℃下培养3-4小时，作为母板保存。
3)平板诱导表达
用硝酸纤维素膜将母板上的菌落转印到含50μg/mL卡那霉素和0.5mM IPTG的LB抗性平板上，在30C下诱导6小时。
4)定性复筛
用常规裂解方法裂解菌体细胞，细胞内表达的脂肪酶释放出来被硝酸纤维素膜吸附。然后将膜覆盖到含10mg/L若丹明B(Rhodamine B)和31.25ml/L橄榄油(Oliveoil)的琼脂糖平板上，在37℃下温浴10小时，使BSLA变体与橄榄油及若丹明B反应。然后揭下膜，将平板置于紫外灯下观察，橙色荧光越强的菌落表示其中表达的脂肪酶的活性越高。
5)定量测定BSLA变体的酶活性
挑取橙色荧光强于野生型BSLA的变体，接种到含50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，加入0.5mM IPTG，在30℃下诱导6小时，收获5 OD600细胞，破壁，提取胞内酶，纯化后，对脂肪酶活性进行定量检测(以野生型BSLA为对照)，确定活性最高的变体。至此，完成了一轮进化。然后可以活性最高的BSLA变体基因作为易错PCR的模板，重复上述步骤2和步骤3，进行新一轮的进化。
其中，脂肪酶活性的定量测定方法如下：
测定野生型BSLA及其变体对棕榈酸对硝基苯脂(p-nitrophenyl palmitate，pNPP)、辛酸对硝基苯脂(p-nitrophenyl caprylate，pNPC)、橄榄油(olive oil)三种底物的活性。对pNPP及pNPC的活性测量方法详见文献(Winkler，U.K.，M.Stuckmann，Glycogen，Hyaluronate，and Some Other Polysaccharides GreatlyEnhance the Formation of Exolipase by Serratia marcescens，JOURNAL OFBACTERIOLOGY，1979，138(3)：663-670)，对橄榄油的活性的测量方法详见文献(N.W.Tietz，E.A.Fiereck，A specific method for serum lipase determination，Clinica Chimica acta，1966，13：352-359)。活性定义为：在测定条件下，1分钟内水解上述底物产生1μmol的对硝基苯酚(p-nitrophenol)或是脂肪酸(fatty acid)所需要的酶量定义为1个活性单位。
结果在第一轮进化后，得到活性最高的一个变体，命名为BSLA-1-4，改变体是将野生型枯草芽胞杆菌脂肪酶A的氨基酸残基序列自氨基端(N端)第16位的丝氨酸(S)突变为脯氨酸(P)(记为S16P)，且将第153位的甘氨酸(G)突变为天门冬氨酸(D)(记为G153D)，具有序列表中SEQ ID №：2的氨基酸残基序列，编码它的核苷酸序列为序列表中SEQ ID №：5。以该变体为模板进行第二轮进化后，将得到的活性最高的变体命名为BSLA-2-6，该变体是将野生型枯草芽胞杆菌脂肪酶A的氨基酸残基序列自氨基端(N端)第16位的丝氨酸(S)突变为脯氨酸(P)(记为S16P)，第112位的赖氨酸(K)突变为谷氨酸(E)(记为K112E)，第142位的精氨酸(R)突变为丝氨酸(S)(记为R142S)，第152位的组氨酸(H)突变为谷氨酰胺(Q)(记为H152Q)，以及将第153位的甘氨酸(G)突变为天门冬氨酸(D)(记为G153D)，具有序列表中SEQ ID №：3的氨基酸残基序列，编码它的核苷酸序列为序列表中SEQ ID№：6。野生型BSLA及变体BSLA-2-6对pNPP、pNPC及橄榄油的比活如表1所示，变体BSLA-2-6比野生型BSLA对pNPP、pNPC及橄榄油的活性分别提高了4.8、3.0和2.3倍。
表1 野生型BSLA及变体BSLA-2-6对于pNPP、pNPC及橄榄油的比活比较
| 对pNPP的比活(U/mg protein) | 倍数 | 对pNPC的比活(U/mg protein) | 倍数 | 对橄榄油的比活(U/mg protein) | 倍数 | |
| BSLABSLA-2-6 | 4.6522.42 | 1.04.8 | 29.4288.99 | 1.03.0 | 21.5353.06 | 1.02.6 |
实施例2、野生型枯草芽胞杆菌脂肪酶A变体的氨基酸残基取代在三维结构中的位置分析
对实施例1获得的野生型枯草芽胞杆菌脂肪酶A变体的氨基酸残基取代进行三维结构的位置分析。野生型BSLA的晶体结构可以从PDB中获得(ID：1ISP)，如图2所示，图中球棍模型标记的氨基酸为BSLA的催化三元酸(Ser77、Asp133和His156)，而本发明的野生型枯草芽胞杆菌脂肪酶A变体的5个氨基酸取代的位置(S16、K112、R142、H152和G153)分别用棍棒模型标记，这几个氨基酸取代均发生在该酶表面。
序列表
<160>6
<210>1
<211>181
<212>PRT
<213>枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)
<400>1
Ala Glu His Asn Pro Val Val Met Val His Gly Ile Gly Gly Ala Ser
1 5 10 15
Phe Asn Phe Ala Gly Ile Lys Ser Tyr Leu Val Ser Gln Gly Trp Ser
20 25 30
Arg Asp Lys Leu Tyr Ala Val Asp Phe Trp Asp Lys Thr Gly Thr Asn
35 40 45
Tyr Asn Asn Gly Pro Val Leu Ser Arg Phe Val Gln Lys Val Leu Asp
50 55 60
Glu Thr Gly Ala Lys Lys Val Asp Ile Val Ala His Ser Met Gly Gly
65 70 75 80
Ala Asn Thr Leu Tyr Tyr Ile Lys Asn Leu Asp Gly Gly Asn Lys Val
85 90 95
Ala Asn Val Val Thr Leu Gly Gly Ala Asn Arg Leu Thr Thr Gly Lys
100 105 110
Ala Leu Pro Gly Thr Asp Pro Asn Gln Lys Ile Leu Tyr Thr Ser Ile
115 120 125
Tyr Ser Ser Ala Asp Met Ile Val Met Asn Tyr Leu Ser Arg Leu Asp
130 135 140
Gly Ala Arg Asn Val Gln Ile His Gly Val Gly His Ile Gly Leu Leu
145 150 155 160
Tyr Ser Ser Gln Val Asn Ser Leu Ile Lys Glu Gly Leu Asn Gly Gly
165 170 175
Gly Gln Asn Thr Asn
180
<210>2
<211>181
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>2
Ala Glu His Asn Pro Val Val Met Val His Gly Ile Gly Gly Ala Pro
1 5 10 15
Phe Asn Phe Ala Gly Ile Lys Ser Tyr Leu Val Ser Gln Gly Trp Ser
20 25 30
Arg Asp Lys Leu Tyr Ala Val Asp Phe Trp Asp Lys Thr Gly Thr Asn
35 40 45
Tyr Asn Asn Gly Pro Val Leu Ser Arg Phe Val Gln Lys Val Leu Asp
50 55 60
Glu Thr Gly Ala Lys Lys Val Asp Ile Val Ala His Ser Met Gly Gly
65 70 75 80
Ala Asn Thr Leu Tyr Tyr Ile Lys Asn Leu Asp Gly Gly Asn Lys Val
85 90 95
Ala Asn Val Val Thr Leu Gly Gly Ala Asn Arg Leu Thr Thr Gly Lys
100 105 110
Ala Leu Pro Gly Thr Asp Pro Asn Gln Lys Ile Leu Tyr Thr Ser Ile
115 120 125
Tyr Ser Ser Ala Asp Met Ile Val Met Asn Tyr Leu Ser Arg Leu Asp
130 135 140
Gly Ala Arg Asn Val Gln Ile His Asp Val Gly His Ile Gly Leu Leu
l45 150 155 160
Tyr Ser Ser Gln Val Asn Ser Leu Ile Lys Glu Gly Leu Asn Gly Gly
165 170 175
Gly Gln Asn Thr Asn
180
<210>3
<211>181
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>3
Ala Glu His Asn Pro Val Val Met Val His Gly Ile Gly Gly Ala Pro
1 5 10 15
Phe Asn Phe Ala Gly Ile Lys Ser Tyr Leu Val Ser Gln Gly Trp Ser
20 25 30
Arg Asp Lys Leu Tyr Ala Val Asp Phe Trp Asp Lys Thr Gly Thr Asn
35 40 45
Tyr Asn Asn Gly Pro Val Leu Ser Arg Phe Val Gln Lys Val Leu Asp
50 55 60
Glu Thr Gly Ala Lys Lys Val Asp Ile Val Ala His Ser Met Gly Gly
65 70 75 80
Ala Asn Thr Leu Tyr Tyr Ile Lys Asn Leu Asp Gly Gly Asn Lys Val
85 90 95
Ala Asn Val Val Thr Leu Gly Gly Ala Asn Arg Leu Thr Thr Gly Glu
100 105 110
Ala Leu Pro Gly Thr Asp Pro Asn Gln Lys Ile Leu Tyr Thr Ser Ile
115 120 125
Tyr Ser Ser Ala Asp Met Ile Val Met Asn Tyr Leu Ser Ser Leu Asp
130 135 140
Gly Ala Arg Asn Val Gln Ile Gln Asp Val Gly His Ile Gly Leu Leu
145 150 155 160
Tyr Ser Ser Gln Val Asn Ser Leu Ile Lys Glu Gly Leu Asn Gly Gly
165 170 175
Gly Gln Asn Thr Asn
180
<210>4
<211>543
<212>DNA
<213>枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)
<400>4
gctgaacaca atccagtcgt tatggttcac ggtattggag gggcatcatt caattttgcg 60
ggaattaaga gctatctcgt atctcagggc tggtcgcggg acaagctgta tgcagttgat 120
ttttgggaca agacaggcac aaattataac aatggaccgg tattatcacg atttgtgcaa 180
aaggttttag atgaaacggg tgcgaaaaaa gtggatattg tcgctcacag catggggggc 240
gcgaacacac tttactacat aaaaaatctg gacggcggaa ataaagttgc aaacgtcgtg 300
acgcttggcg gcgcgaaccg tttgacgaca ggcaaggcgc ttccgggaac agatccaaat 360
caaaagattt tatacacatc catttacagc agtgccgata tgattgtcat gaattactta 420
tcaagattag atggtgctag aaacgttcaa atccatggcg ttggacacat cggccttctg 480
tacagcagcc aagtcaacag cctgattaaa gaagggctga acggcggggg ccagaatacg 540
aat 543
<210>5
<211>543
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>5
gctgaacaca atccagtcgt tatggtccac ggtattggag gggcaccatt caattttgcg 60
ggaattaaga gctatctcgt atctcagggc tggtcgcggg acaagctgta tgcagttgat 120
ttttgggaca agacaggcac aaattataac aatggaccgg tattatcacg atttgtgcaa 180
aaggttttag atgaaacggg tgcgaaaaaa gtggatattg tcgctcacag catggggggc 240
gcgaacacac tttactacat aaaaaatctg gacggcggaa ataaagttgc aaacgtcgtg 300
acgcttggcg gcgcgaaccg tttgacgaca ggcaaggcgc ttccgggaac agatccgaat 360
caaaagattt tatacacatc catttacagc agtgccgata tgattgtcat gaattactta 420
tcaagattag atggtgctag aaacgttcaa atccatgacg ttggacacat cggccttctg 480
tacagcagcc aagtcaacag cctgattaaa gaagggctga acggcggggg ccagaatacg 540
aat 543
<210>6
<211>543
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>
<400>6
gctgaacaca atccagtcgt tatggtccac ggtattggag gggcaccatt taattttgcg 60
ggaattaaga gctatctcgt atctcagggc tggtcgcggg acaagttgta tgcagttgat 120
ttttgggaca agacaggcac aaattataac aatggaccgg tattatcacg atttgtgcaa 180
aaggttttag atgaaacggg tgcgaaaaaa gtggatattg tcgctcacag catggggggc 240
gcgaacacac tttactacat aaaaaatctg gacggcggaa ataaagttgc aaacgtcgtg 300
acgcttggcg gcgcgaaccg tttgacgaca ggcgaggcgc ttccgggaac agatccgaat 360
caaaagattt tatacacatc catttacagc agtgccgata tgattgtcat gaattactta 420
tcaagtttag atggtgctag aaacgttcaa atccaggacg ttggacacat cggccttctg 480
tacagcagcc aagtcaacag cctgattaaa gaagggctga acggcggggg ccagaatacg 540
aat 543
Claims (8)
1、野生型枯草芽胞杆菌脂肪酶A变体，是将野生型枯草芽胞杆菌脂肪酶A的氨基酸残基序列进行下列五种突变中的一种或几种突变组合后得到的蛋白质：1)自氨基端第16位的丝氨酸突变为脯氨酸；2)第112位的赖氨酸突变为谷氨酸；3)第142位的精氨酸突变为丝氨酸；4)第152位的组氨酸突变为谷氨酰胺；5)第153位的甘氨酸突变为天门冬氨酸；所述野生型枯草芽胞杆菌脂肪酶A具有序列表中SEQ ID№：1的氨基酸残基序列。
2、根据权利要求1所述的野生型枯草芽胞杆菌脂肪酶A变体，其特征在于：所述变体具有下述氨基酸残基序列之一：
1)序列表中SEQ ID №：2；
2)序列表中SEQ ID №：3。
3、编码权利要求1所述的野生型枯草芽胞杆菌脂肪酶A变体的基因。
4、根据权利要求3所述的基因，其特征在于：所述基因是下述核苷酸序列之一：
1)序列表中SEQ ID №：5；
2)序列表中SEQ ID №：6。
5、含有权利要求3所述基因的表达载体、转基因细胞和宿主菌。
6、一种筛选脂肪酶变体的方法，包括以下步骤：
1)构建脂肪酶基因的变体文库；
2)将变体文库与载体连接，然后将携带有变体文库的重组载体导入宿主菌；
3)将步骤2)获得的转化子接种于初筛平板上进行定性初筛，筛选出具有脂肪酶活性的变体；所述初筛平板为在宿主菌常规培养用固体培养基的基础上添加能筛选出外源载体的标记物，以及脂肪酶的底物；
4)挑取步骤3)经初筛后具有脂肪酶活性的变体，将其接种于生长平板上进行培养，长出单菌落后作为母板保存；所述生长平板为在宿主菌常规培养用固体培养基的基础上添加能筛选出外源载体的标记物；
5)用转膜法将步骤4)母板上的菌落转印到诱导平板上进行诱导；所述诱导平板为在宿主菌常规培养用固体培养基的基础上添加能筛选出外源载体的标记物，以及诱导剂；
6)裂解步骤5)中经诱导的菌落，使其表达的脂肪酶吸附在转印膜的表面，再将转印膜置于复筛平板上进行定性复筛，得到较野生型脂肪酶活性提高的变体；所述复筛平板为仅含有琼脂糖和脂肪酶的底物的平板；
7)定量测定脂肪酶变体的活性。
7、根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述步骤1)中的脂肪酶基因为野生型枯草芽胞杆菌脂肪酶A基因。
8、权利要求1所述的野生型枯草芽胞杆菌脂肪酶A变体在制备洗涤剂中的应用。
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