CN102851263B - 脂肪酶基因突变库高通量筛选方法和脂肪酶突变基因 - Google Patents

Abstract

本发明涉及脂肪酶基因突变库高通量筛选方法和采用该方法筛选得到的脂肪酶突变基因及其编码脂肪酶。采用本发明的方法与现有的方法相比，灵敏度更高。本发明的突变脂肪酶相比野生型具有更高的比活力。本发明还涉及一种用于筛选脂肪酶的反应体系。

Description

脂肪酶基因突变库高通量筛选方法和脂肪酶突变基因

技术领域

本发明属于生物工程领域。具体而言，本发明涉及一种脂肪酶基因突变库高通量筛选方法及由此筛选得到的新的脂肪酶突变基因。

背景技术

脂肪酶(E.C.3.1.1.3)亦称酰基甘油水解酶，是一类具有多种催化能力的酶，可以催化三酰甘油酯及其它一些水不溶性酯类的水解、还可以用于催化酯交换反应、醇解反应、转酯化及酯类的逆向合成反应，以及生物表面活性剂的合成、催化旋光异构体的拆分和手性药物的合成等。脂肪酶在粮油生产、食品工业、日用化学工业、油脂化学工业、农业化学工业、造纸工业、洗涤剂工业、以及药物合成等许多领域得到广泛应用。在油脂生产和油脂化工方面，脂肪酶具有巨大应用潜力。利用其专一性催化性能，改变脂肪酸链在甘油酯中的位置或替换上1个或多个新的脂肪酸来修饰酯，将廉价的油脂原料加工成昂贵的结构脂，如可可脂、OPO，单苷脂和苷二脂等。

提高脂肪酶的催化比活力，是降低脂肪酶生产成本的有效的途径之一。本发明以具有1，3专一性的米黑根毛霉脂肪酶为研究对象，首先采用易错PCR方法(ep-PCR)，在大肠杆菌中建立脂肪酶突变库，通过新的高通量筛选方法，对突变库进行筛选，获得了比活力提高的RML突变脂肪酶和相应的突变基因。

发明内容

本发明提供一种分离的多肽，所述多肽选自：

(1)SEQ ID NO：4、6、8、10或12所示氨基酸序列；和

(2)在(1)所述的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸，但至少保留以SEQ ID NO：2的氨基酸序列编号计第57位氨基酸残基为Val，且具有脂肪酶活性的由(1)衍生的多肽。

在一具体实施例中，以SEQ ID NO：2的氨基酸序列编号计，上述(2)所述的多肽至少还保留一个或多个以下位置上的残基：第67位的Ala、第111位的Thr、第168位的Pro和第65位的Ala。

本发明提供一种分离的多核苷酸，所述分离的多核苷酸选自：

(1)编码本发明所述多肽的多核苷酸；和

(2)与(1)所述的多核苷酸互补的多核苷酸。

在一具体实施例中，该多核苷酸编码如SEQ ID NO：4、6、8、10或12所示的多肽。

在一具体实施例中，该多核苷酸的核苷酸序列如SEQ ID NO：3、5、7、9或11所示。

本发明提供一种载体，它含有本发明所述的多核苷酸。

本发明提供一种遗传工程化的宿主细胞，所述宿主细胞含有本发明所述的载体或多核苷酸。

本发明提供一种筛选脂肪酶的方法，所述方法包括以甘油三酯作为待筛选脂肪酶的底物进行酶解并根据pH指示剂产生的颜色变化筛选出比活力提高的脂肪酶的步骤。

在一具体实施例中，所述方法包括以下步骤：

(1)提供待筛选的脂肪酶；

(2)提供含有pH指示剂和低级烷基羧酸盐的溶液；

(3)将甘油三酯加到步骤(2)的溶液中，得到混合液；

(4)将脂肪酶加到步骤(3)所得的混合液中；和

(5)观察混合液颜色的变化，根据pH指示剂所产生的颜色变化筛选出比活力提高的脂肪酶。

在一具体实施例中，所述甘油三酯为脂肪酸碳链长度为12-22的甘油三酯。

在一具体实施例中，所述低级烷基羧酸盐为长2-6个碳原子烷基羧酸的IIA族金属盐。

在一具体实施例中，所述pH指示剂选自溴百里酚蓝、苯酚红、亚甲蓝、中性红、甲基红、溴甲酚绿、甲基橙、溴酚蓝、刚果红或其组合。

在一具体实施例中，所述方法还包括使用野生型脂肪酶作为对照，通过对比待筛选脂肪酶产生的颜色与对照产生的颜色筛选出比活力提高的脂肪酶。

在一具体实施例中，所述方法是使用多孔板进行筛选。

在一具体实施例中，所述方法还包括：

建立脂肪酶突变文库；

表达突变脂肪酶。

在一具体实施例中，所述方法还包括：采用碱滴定法对所筛选得到的脂肪酶进行复筛，筛选出比活力提高的脂肪酶。

本发明提供一种用于筛选脂肪酶的反应体系，所述反应体系含有：

(1)甘油三酯；和

(2)pH指示剂。

在一具体实施例中，所述反应体系还含有低级烷基羧酸盐。

在一具体实施例中，每200μl所述反应体系计，所述反应体系含有15～25μl的pH指示剂溶液、50～70μl的0.1～0.3M低级烷基羧酸盐的Tris缓冲溶液、和80～120μl甘油三酯溶液，其中，所述pH指示剂溶液为pH指示剂以0.3～1.5mg/L的浓度溶解于Tris缓冲液，所述甘油三酯溶液为甘油三酯以1：4～6的体积比溶于有机溶剂而获得的溶液。

在一具体实施例中，所述反应体系的pH在4.0～9.0的范围内。在一具体实施例中，所述反应体系的pH在5.0～9.0的范围内。在其它具体实施例中，所述反应体系的pH在4.0～7.0的范围内。在其它具体实施例中，所述反应体系的pH在7.0～9.0的范围内。

在一具体实施例中，所述甘油三酯为脂肪酸碳链长度为12-22的甘油三酯。

在一具体实施例中，所述低级烷基羧酸盐为长2-6个碳原子烷基羧酸的IIA族金属盐。

在一具体实施例中，所述pH指示剂选自溴百里酚蓝、苯酚红、亚甲蓝、中性红、甲基红、溴甲酚绿、甲基橙、溴酚蓝、刚果红或其组合。

附图说明

图1显示筛选方法灵敏性验证结果。

图2显示采用本发明方法和已知方法对脂肪酶催化活性进行筛选的结果。

图3显示脂肪酶基因的PCR结果。1号泳道为用于克隆至pET30a载体的PCR片段，2号泳道为用于克隆至pET32a载体的PCR片段，3号泳道为用于克隆至pET22b载体的PCR片段。

图4显示阳性克隆鉴定。其中，A图显示pET30a-脂肪酶的阳性克隆鉴定，B图显示pET32a-脂肪酶的阳性克隆鉴定，C图显示pET22b-脂肪酶的阳性克隆鉴定，箭头所指为脂肪酶基因的条带，出现箭头所示的目标条带的克隆即为阳性克隆。

图5显示重组子进行诱导表达后进行的SDS-PAGE电泳结果。M：蛋白质电泳Marker；C：未诱导的菌体超声破碎后作对照；1：以pET32a为载体，表达的蛋白大小大约为50kD；2：以pET30a为载体，表达的蛋白大小约为38kD；3：以pET22b为载体，表达的蛋白大小约为38kD。箭头所指为重组脂肪酶蛋白条带。

图6显示易错PCR结果。

图7显示脂肪酶经过定向进化和定点改造后比活力的变化趋势。

图8显示考马斯亮蓝测蛋白质浓度的标准曲线。

图9显示本发明采用的酸碱滴定法的具体流程。

具体实施方式

如本文所用，“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多聚核苷酸和多肽是没有分离纯化的，但同样的多聚核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化的。

如本文所用，“分离的多肽”或“分离的脂肪酶”是指脂肪酶基本上不含天然与其相关的其它蛋白、脂类、糖类或其它物质。本领域的技术人员能用标准的蛋白质纯化技术纯化脂肪酶。

本发明的多肽可以是重组多肽、天然多肽、合成多肽，优选重组多肽。本发明的多肽可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、丝状真菌、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。根据重组生产方案所用的宿主，本发明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。

在本发明中，术语“脂肪酶”包括具有脂肪酶活性的SEQ ID NO：4、6、8、10或12所示的多肽。该术语还包括具有脂肪酶功能的、SEQ ID NO：4、6、8、10或12的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：一个或多个(例如1-10个，最佳地1-5个，更佳地，1-3个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加或缺失一个或数个(通常为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。优选所述变异形式包括一个或多个(例如1-10个，最佳地1-5个，更佳地，1-3个)保守性取代。“保守性取代”是利用具有相似侧链的一种氨基酸残基替代另一种氨基酸残基。具有相似侧链的家族在本领域已有明确定义。这些家族包括具有碱性侧链的氨基酸(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、具有酸性侧链的氨基酸(例如天冬氨酸、谷氨酸)、具有不带电荷的极性侧链的氨基酸(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、具有非极性侧链的氨基酸(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、具有β-分支侧链的氨基酸(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和具有芳香侧链的氨基酸(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。

应理解，对于本发明SEQ ID NO：4、6、8、10和12的变异形式，优选的是它们保留了本发明所特别指出的突变位点上的突变。“保留”在本文中指本发明多肽的变异形式除具有本发明所特别指出的突变位点上的突变外，还含有其它变异，例如在其它一个或多个(优选1～5个，更优选1～3个)位点上发生如前文所述的插入、缺失或突变。例如，本发明多肽的变异形式至少保留第57位残基为Val。在其它实施例中，所述变异形式至少保留第57位残基为Val和第168位为Pro。在其它实施例中，所述变异形式至少保留第57位残基为Val和第111位为Thr。在其它实施例中，所述变异形式至少保留第57位残基为Val和第67位为Ala。在其它实施例中，所述变异形式至少保留第57位残基为Val、第67位为Ala和第111位为Thr。在其它实施例中，所述变异形式至少保留第57位残基为Val、第67位为Ala、第111位为Thr和第168位为Pro。在其它实施例中，所述变异形式至少保留第57位残基为Val、第65位为Ala、第67位为Ala、第111位为Thr和第168位为Pro。

此外，本领域技术人员公知，在基因克隆操作中，常常需要设计合适的酶切位点，这势必在所表达的蛋白末端引入了一个或多个不相干的残基，而这并不影响目的蛋白的活性。又如为了构建融合蛋白、促进重组蛋白的表达、获得自动分泌到宿主细胞外的重组蛋白、或利于重组蛋白的纯化，常常需要将一些氨基酸添加至重组蛋白的N-末端、C-末端或该蛋白内的其它合适区域内，例如，包括但不限于，适合的接头肽、信号肽、前导肽、末端延伸等。本发明的脂肪酶的氨基端或羧基端还可含有一个或多个多肽片段，作为蛋白标签。任何合适的标签都可以用于本发明。例如，所述的标签可以是FLAG，HA，HA1，c-Myc，Poly-His，Poly-Arg，Strep-TagII，AU1，EE，T7，4A6，ε，B，gE以及Ty1。这些标签可用于对蛋白进行纯化。下表列出了其中的一些标签及其序列。

本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。编码成熟多肽的编码区序列可以与SEQ ID NO：3、5、7、9或11所示的编码区序列相同或者是简并的变异体。如本文所用，“简并的变异体”在本发明中是指编码SEQ ID NO：4、6、8、10或12的蛋白质，但与SEQ ID NO：3、5、7、9或11所示所示的编码区序列有差别的核酸序列。

术语“编码多肽的多核苷酸”可以是包括编码此多肽的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。

本发明还涉及与上述的序列杂交且两个序列之间具有至少50％，较佳地至少70％，更佳地至少80％相同性的多核苷酸。本发明特别涉及在严格条件(或严紧条件)下与本发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。在本发明中，“严格条件”是指：(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×SSC，0.1％SDS，60℃；或(2)杂交时加有变性剂，如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清白蛋白/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在90％以上，更好是95％以上时才发生杂交。并且，可杂交的多核苷酸编码的多肽与SEQ ID NO：4、6、8、10或12所示的成熟多肽有相同的生物学功能和活性。

本发明还涉及与上述的序列杂交的核酸片段。如本文所用，“核酸片段”的长度在15～50个核苷酸，较好是15～30个核苷酸之间。核酸片段可用于核酸的扩增技术(如PCR)以确定和/或分离编码脂肪酶的多聚核苷酸。

本发明中的多肽和多核苷酸优选以分离的形式提供，更佳地被纯化至均质。

本发明的脂肪酶核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。

一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。

此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。

目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。

应用PCR技术扩增DNA/RNA的方法被优选用于获得本发明的基因。特别是很难从文库中得到全长的cDNA时，可优选使用RACE法(RACE-cDNA末端快速扩增法)，用于PCR的引物可根据本文所公开的本发明的序列信息适当地选择，并可用常规方法合成。可用常规方法如通过凝胶电泳分离和纯化扩增的DNA/RNA片段。

本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体，以及用本发明的载体或脂肪酶编码序列经基因工程产生的宿主细胞，以及经重组技术产生本发明所述多肽的方法。优选的，本发明的载体是表达载体。

通过常规的重组DNA技术，可利用本发明的多聚核苷酸序列可用来表达或生产重组的脂肪酶。一般来说有以下步骤：

(1).用本发明的编码脂肪酶的多核苷酸(或变异体)，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；

(2).在合适的培养基中培养的宿主细胞；

(3).从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。

本发明中，编码脂肪酶的多核苷酸序列可插入到重组表达载体中。术语“重组表达载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒如腺病毒、逆转录病毒或其它载体。只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。

本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含脂肪酶编码DNA序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。这些启动子的代表性例子有：大肠杆菌的lac或trp启动子；λ噬菌体PL启动子；真核启动子包括CMV立即早期启动子、HSV胸苷激酶启动子、早期和晚期SV40启动子、反转录病毒的LTRs和其它一些已知的可控制基因在原核或真核细胞或其病毒中表达的启动子。

此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性以及绿色荧光蛋白(GFP)，或用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性。

包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。

宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；丝状真菌细胞、或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属；鼠伤寒沙门氏菌的细菌细胞；真菌细胞如酵母、丝状真菌、植物细胞；果蝇S2或Sf9的昆虫细胞；CHO、COS、293细胞、或Bowes黑素瘤细胞的动物细胞等。

本发明的多核苷酸在高等真核细胞中表达时，如果在载体中插入增强子序列时将会使转录得到增强。增强子是DNA的顺式作用因子，通常大约有10到300个碱基对，作用于启动子以增强基因的转录。

本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体、启动子、增强子和宿主细胞。

用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl₂法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl₂。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。

获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。

在上面的方法中的重组多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。

本发明提供一种筛选脂肪酶的方法，所述方法包括以甘油三酯作为待筛选脂肪酶的底物进行酶解并根据pH指示剂产生的颜色变化筛选出比活力提高的脂肪酶的步骤。

本发明的筛选方法可包括以下步骤：

(1)提供待筛选的脂肪酶；

(2)提供含有pH指示剂和低级烷基羧酸盐的溶液；

(3)将甘油三酯加到步骤(2)的溶液中，得到混合液；

(4)将脂肪酶加到步骤(3)所得的混合液中；和

(5)观察混合液颜色的变化，根据pH指示剂所产生的颜色变化筛选出比活力提高的脂肪酶。

适用于本发明的甘油三酯可以是脂肪酸碳链长度为12-22的甘油三酯，包括但不限于橄榄油、棕榈油酸甘油三酯，亚油酸甘油三酯，a-亚麻酸甘油三酯，r-亚麻酸甘油三酯，花生四烯酸甘油三酯，顺-5，8，11，14，17-二十碳五烯酸(EPA)甘油三酯，顺-4，7，10，13，16，19-二十二碳六烯酸(DHA)甘油三酯等。

甘油三酯可以被配制在有机溶剂中，有机溶剂包括但不限于DMF、DMSO、聚乙烯醇、阿拉伯树胶等。

适用于本发明的低级烷基羧酸盐包括长2-6个碳原子烷基羧酸的IIA族金属盐，包括但不限于乙酸、丙酸、丁酸等的钙盐和镁盐。在一优选实施例中，所述低级烷基羧酸盐为醋酸钙。

适用于本发明的pH指示剂包括各种在pH 4.0～9.0(例如，在4.0～7.0的范围内，或者在7.0～9.0的范围内，或者在5.0～9.0的范围内，或者在5.0～8.0的范围内)下显色的pH指示剂，包括但不限于溴百里酚蓝、苯酚红、亚甲蓝、中性红、甲基红、溴甲酚绿、甲基橙，溴酚蓝，刚果红。这些pH指示剂可单独使用，或者可混合使用。例如，可使用溴百里酚蓝和苯酚红的组合，和苯酚红和亚甲蓝的组合。若组合使用，组合中各指示剂的比例可以为1∶5～5∶1，优选1∶1。例如，可使用1∶1的溴百里酚蓝和苯酚红或1∶1的苯酚红和亚甲蓝。

用于本发明的pH指示剂可显示各种颜色，只需在实施本发明过程中存在颜色变化(例如由深变浅或由浅变深)即可，以便于观察。

通常，可使用各种缓冲液来配制低级烷基羧酸盐和pH指示剂的缓冲液，只要该缓冲液不与该盐反应。例如，可用Tris缓冲液来配制低级烷基羧酸盐和pH指示剂的缓冲液。本领域技术人员能够根据本领域现有技术能够确定哪些缓冲液会与低级烷基羧酸盐反应。应理解，可分别配制低级烷基羧酸盐的缓冲液和pH指示剂的缓冲液，然后再将其混合；也可将两者一起加到缓冲液中进行配制。优选用于配制低级烷基羧酸盐的缓冲液与用于配制pH指示剂的缓冲液相同。

本发明的方法通过pH指示剂显示的颜色变化来筛选比活力提高的脂肪酶。例如，可通过比较不同脂肪酶导致的脂肪酶加入前后混合液的颜色的变化来筛选比活力提高的脂肪酶。还可使用野生型脂肪酶作为对照，通过对比待筛选脂肪酶产生的颜色与对照产生的颜色筛选出比活力提高的脂肪酶。通常，颜色变化越明显，表明酶活越高。

本发明方法可使用多孔板进行筛选，为高通量筛选方法。例如，本发明的方法可使用96孔板进行。

以使用多孔板进行的筛选方法为例，每个孔中可加入约15～25μl的pH指示剂溶液、约50～70μl的低级烷基羧酸盐的缓冲溶液、约80～120μl甘油三酯溶液和约5～30μl的酶液。孔中的溶液量宜不超过孔的总容积，例如，对于96孔板，每孔的总溶液量宜不超过200微升。

因此，在一个优选实施例中，每200微升的反应溶液中含有约20微升的pH指示剂溶液、约60微升的低级烷基羧酸盐的缓冲溶液，约100微升的甘油三酯溶液和约20微升的酶液。在使用其它多孔板时，可根据该多孔板孔的容积调整溶液中各成分的体积，以避免溶液过多，溢出孔外，造成交叉污染。

应理解，对于筛选所用的甘油三酯、pH指示剂、低级烷基羧酸盐的量并无特别限制。通常，甘油三酯和低级烷基羧酸盐可过量，pH指示剂只要能够起到指示变色即可，与酶没有具体量的关系。而对酶的量也无特别限制，酶液量从5微升到100微升都可检测出来。本领域技术人员可根据实际筛选情况选用适当量的甘油三酯、pH指示剂、低级烷基羧酸盐和酶来进行筛选。

在一具体实施例中，当单独配制时，所述pH指示剂溶液中pH指示剂的浓度为0.3～1.5mg/LTris缓冲液。当同时使用两种或多种pH指示剂时，其总浓度宜在该范围之内。

在一具体实施例中，当单独配制时，所述低级烷基羧酸盐的缓冲液中，低级烷基羧酸盐的浓度为0.1～0.3M。应理解，若将pH指示剂与低级烷基羧酸盐同时加到缓冲液中时，它们各自的浓度宜在混合上述单独配制的溶液所得的混合液中的pH指示剂和低级烷基羧酸盐的浓度范围之内。

在一具体实施例中，甘油三酯溶液为甘油三酯以约1∶4～6的体积比溶于有机溶剂而获得的溶液。

待筛选的脂肪酶可通过以下方法获得：采用常规的遗传工程技术建立脂肪酶突变文库；和表达突变脂肪酶。本文实施例部分描述了建立脂肪酶突变文库及表达突变脂肪酶的具体例子。应理解，本领域已知的各种文库建立方法和蛋白质表达方法都可用于实施本发明。

在采用上述方法筛选得到比活力提供的脂肪酶之后，可采用碱滴定法对所筛选得到的脂肪酶进行复筛，筛选出比活力提高的脂肪酶。碱滴定法的一个例子可参见本申请实施例2的第2.1部分。更多的碱滴定法可参见Brockman H L.Triglyceride lipase from porcine pancrease，Methods Enzymol，1981，71：619-627；何耀强，王炳武，谭天伟，假丝酵母99-125脂肪酶的发酵工艺研究，生物工程学报，2004，20(6)：918-921；江惠芳，王雅琴，刘春国，三种脂肪酶活力测定方法的比较及改进，化学与生物工程，2007，24(8)：72-75。

本发明还提供一种用于筛选脂肪酶的反应体系，该反应体系含有：

(1)甘油三酯；和

(2)pH指示剂。

在一具体实施例中，所述反应体系还含有低级烷基羧酸盐。

适用于本发明的甘油三酯可以是脂肪酸碳链长度为12-22的甘油三酯，包括但不限于橄榄油，棕榈油酸甘油三酯，亚油酸甘油三酯，a-亚麻酸甘油三酯，r-亚麻酸甘油三酯，花生四烯酸甘油三酯，顺-5，8，11，14，17-二十碳五烯酸(EPA)甘油三酯，顺-4，7，10，13，16，19-二十二碳六烯酸(DHA)甘油三酯等。

适用于本发明的低级烷基羧酸盐包括长2-6个碳原子烷基羧酸的IIA族金属盐，包括但不限于乙酸、丙酸、丁酸等的钙盐和镁盐。在一优选实施例中，所述低级烷基羧酸盐为醋酸钙。

适用于本发明的pH指示剂包括各种在pH 4.0～9.0(例如，在4.0～7.0的范围内，或者在7.0～9.0的范围内，或者在5.0～9.0的范围内，或者在5.0～8.0的范围内)下显色的pH指示剂，包括但不限于溴百里酚蓝、苯酚红、亚甲蓝、中性红、甲基红、溴甲酚绿、甲基橙，溴酚蓝，刚果红。这些pH指示剂可单独使用，或者可混合使用。例如，可使用溴百里酚蓝和苯酚红的组合，和苯酚红和亚甲蓝的组合。若组合使用，组合中各指示剂的比例可以为1∶5～5∶1，优选1∶1。例如，可使用1∶1的溴百里酚蓝和苯酚红或1∶1的苯酚红和亚甲蓝。因此，本发明反应体系的pH范围在4.0～9.0之间，例如，在4.0～7.0的范围内，或者在7.0～9.0的范围内，或者在5.0～9.0的范围内，或者在5.0～8.0的范围内。本领域技术人员可以根据实际的筛选条件选用不同的pH范围和pH指示剂。

用于本发明的pH指示剂可显示各种颜色，只需在实施本发明过程中存在颜色变化(例如由深变浅或由浅变深)即可，以便于观察。

通常，本发明的反应体系中还含有用于配制甘油三酯的有机溶剂和用于配制pH指示剂和/或低级烷基羧酸盐的缓冲液。因此，在一具体实施例中，本发明的反应体系含有：甘油三酯、pH指示剂、有机溶剂和缓冲液，以及任选的低级烷基羧酸盐。有机溶剂包括但不限于DMF、DMSO、聚乙烯醇、阿拉伯树胶等。可使用各种缓冲液来配制低级烷基羧酸盐和pH指示剂的缓冲液，只要该缓冲液不与该盐反应。例如，可用Tris缓冲液来配制低级烷基羧酸盐和pH指示剂的缓冲液。本领域技术人员能够根据本领域现有技术能够确定哪些缓冲液会与低级烷基羧酸盐反应。优选用于配制低级烷基羧酸盐的缓冲液与用于配制pH指示剂的缓冲液相同。

应理解，对于本发明反应体系中甘油三酯、pH指示剂、低级烷基羧酸盐的量并无特别限制。通常，甘油三酯和低级烷基羧酸盐可过量，pH指示剂只要能够起到指示变色即可，与酶没有具体量的关系。

在本发明的一个反应体系例子中，每200μl所述反应体系可含有和约80～120μl甘油三酯溶液和约15～25μl的pH指示剂溶液。优选地，所述甘油三酯溶液为甘油三酯以1∶4～6的体积比溶于有机溶剂而获得。pH指示剂溶液中，pH指示剂的浓度为0.3～1.5mg/L Tris缓冲液。当使用两种或多种pH指示剂时，pH指示剂的总浓度宜在上述范围之内。任选地，该反应体系还可含有约50～70μl的低级烷基羧酸盐的缓冲溶液。低级烷基羧酸盐的缓冲溶液中低级烷基羧酸盐的浓度通常为0.1～0.3M。

通常，可分别配制甘油三酯溶液、pH指示剂溶液和/或低级烷基羧酸盐溶液，然后再将它们混合在一起。因此，本发明的反应体系可含有独立存在的甘油三酯溶液、pH指示剂溶液和/或低级烷基羧酸盐的缓冲液。或者，可同时将甘油三酯、pH指示剂和/或低级烷基羧酸盐加到例如有机溶剂和缓冲液的混合液中，形成以混合液形式存在的反应体系。但应理解，后一种情况下，混合后所得溶液中甘油三酯、pH指示剂和/或低级烷基羧酸盐各自的浓度应在混合单独配制的溶液所得的混合液中各自的浓度范围之内。

本发明的反应体系也可以试剂盒的形式提供。例如，试剂盒中可包含分别装有上述各溶液的容器；或者，试剂盒中可包含装有上述溶液的混合液的容器。试剂盒中还可包括例如用于实施高通量筛选的多孔板等。试剂盒中还可包括指导实施本发明筛选方法的使用说明书。

在一优选的实施例中，本发明的反应体系含有：20微升指示剂(溴百里芬兰和苯酚红，各0.5mg/mL溶于Tris缓冲液)，60微升0.1M醋酸钙和100ul橄榄油(按1∶6溶于DMF中)。

应理解，本发明的反应体系可用于高通量筛选，因此其总体积通常为少于高通量筛选用多孔板每个孔的容积。因此，可根据待加入的酶液体积和孔容积选择适当的反应体系体积。通常，酶液量从5微升到100微升都可用本发明的反应体系检测出来。此外，当不用高通量进行筛选时，本领域技术人员也可以根据实际情况配制本发明的反应体系，而不一定将其体积限于上文所述的范围之内。

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等，《分子克隆：实验室指南》(美国纽约州：冷泉港实验室出版社(Cold SpringHarbor Laboratory Press)，1989)所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件进行。对于试剂的用法和用量，除非另有说明，否则按照常规的用法和用量使用。

实施例1：脂肪酶的克隆与表达

1.1材料与方法

1.1.1材料

1.1.1.1目的基因、菌株与质粒

来源于真核生物Rhizomucor miehei的脂肪酶基因由上海闪晶分子生物科技有限公司合成；表达质粒pET30a(+)，pET22b，pET32a和宿主菌E.coliBL21购于Novagen(WI)公司(Wisconsin，USA)。所用菌株均在相应培养基中添加相应的抗生素进行37℃摇床培养。

1.1.1.2工具酶

Taq DNA polymerase购于Promega公司，PrimeSTAR^TMHS DNA Polymerase购于Takara公司，限制性内切酶EcoR I、Not I、HindIII、NcoI以及T4DNA快速连接酶购于生工生物工程(上海)有限公司。

1.1.1.3试剂

普通PCR所用的Mg²⁺，Buffer，dNTP购于Promega公司，高保真PCR所用的Buffer(含Mg²⁺)购于Takara公司，PCR Cleanup试剂盒、质粒提取试剂盒、凝胶纯化试剂盒以及基因组提取试剂盒均购于axygen公司，PCR引物由上海英俊生物公司合成，其他试剂均为国产分析纯。

LB培养基：

1％蛋白胨、0.5％酵母粉，1％NaCl。用NaOH调pH7.2，121℃灭菌备用。(固体培养基在LB培养基中添加1.5-2％琼脂)。

1.1.2实验方法

1.1.2.1琼脂糖凝胶电泳

所配试剂：

10×TBE：108g Tri s碱、55g硼酸、40ml 0.5mol/LEDTA(pH8.0)，定容1L

6×上样缓冲液：50％甘油、0.25％溴酚蓝、0.25％二甲苯蓝FF、1mmol/L EDTA(pH8.0)。

实验方法：

(1)称量0.2g琼脂糖倒入锥形瓶中，加入0.5×TBE缓冲液40ml；

(2)微波炉中加热煮沸至琼脂糖完全溶解后，室温放置到50℃左右，加入2μl DNAGreen染色剂，摇匀后倒入两端已封口并且已经放置好梳子的电泳槽中；

(3)带琼脂糖凝固后，取走梳子，将凝胶板放入电泳槽中，根据正、负极放好，将5μl DNA样品与1μl上样缓冲液混匀后加入胶孔中，接通电源，以10V/cm的电压进行DNA的电泳分析。

1.1.2.2质粒的提取与纯化

所配试剂：均有质粒提取试剂盒自带

实验方法：按千分之一的接种量将含有目标质粒的宿主菌接入到5mlLB培养液中(含有相对应的抗生素，比例为千分之一)，37℃，200r/min培养12-16小时，然后参照Plasmid extraction kit说明书处理菌液，进行质粒的提取及纯化。

1.1.2.3克隆载体的选择与引物设计和合成

根据不同的基因表达特点，选择含有编码硫氧还蛋白序列的载体pET32a，含有编码信号肽的载体pET22b以及常用大肠杆菌表达载体pET30a为克隆载体，并根据各载体的不同特点，通过Primer软件，对目标基因进行引物设计(包括酶切位点和保护碱基)。

PCR反应体系：

10×DNA聚合酶缓冲液5μl

MgCl₂(25mmol/L)4μl

dNTPs(10mmol/L)1μl

正向引物(50μmol/L)1μl

反向引物(50μmol/L)1μl

含有目的基因的重组载体pUC模板：约10pmol

聚合酶(5U/μl)0.5μl

加ddH₂O至总体积为50μl

PCR反应程序：

第一步：95℃预变性3min

第二步：(35个循环)

变性，95℃30s；退火，55℃，50S；延伸，72℃，1min

第三步：72℃延伸10min

4℃保温

1.1.2.4脂肪酶基因的纯化、酶切以及与载体的连接

纯化：

所配试剂：均由Cleanup纯化试剂盒和凝胶回收试剂盒自带

方法：由PCR扩增得到的基因通过PCR-Cleanup kit直接进行纯化或者选用DNA extraction kit试剂盒进行割胶回收纯化(方法步骤根据试剂盒自带的protocol进行操作)。

酶切：

根据所设计的PCR引物的酶切位点进行双酶切反应，同时，将需要连接的质粒也采用同样的内切酶进行双酶切反应。

酶切体系(40μl)：

PCR产物或质粒DNA：29μl

10×Tango缓冲液：8μl

内切酶1：1.5μl

内切酶2：1.5μl

在37℃条件下，酶切体系保温3-4小时。

酶切产物纯化：

所配试剂：均由凝胶纯化试剂盒自带

方法：将酶切产物与8μl6×上样缓冲液进行混合后，进行凝胶电泳，通过割胶回收的方法，分别纯化回收PCR酶切产物与质粒酶切产物。割胶回收纯化方法根据凝胶回收试剂盒自带说明进行。

连接：

将割胶回收的酶切产物进行电泳后，大致计算浓度，以PCR产物：质粒为1∶5的浓度进行连接，其中加入0.5μl的T4DNA快速连接酶(5U/μl)以及1μl连接酶缓冲液，最后加ddH₂O补足至10μl，22℃下连接1小时，以用于下一步的转化。

1.1.2.5大肠杆菌BL21普通感受态的制备以及转化

所配试剂：

CaCl₂溶液：60mmol/LCaCl₂、15％甘油(pH7.2)，121℃灭菌后4℃保存。

方法：

感受态细胞的制备：

(1)挑取细菌单菌落接种到5ml LB培养基中，37℃震荡培养12-16小时；

(2)取2ml培养物接种到200ml LB培养基/500ml三角瓶中，37℃震荡培养基至OD₆₀₀为0.3-0.4；

(3)将培养物转移到50ml离心管中，冰上放置20min；

(4)4℃、3000rpm离心5min，收集菌体，弃去上清液；

(5)用10ml预冷的CaCl₂溶液重悬菌体，4℃、3000rpm离心5min；

(6)用10ml预冷的CaCl₂溶液重悬菌体，冰浴30min；

(7)分装100μl到eppendorf管中，立即投入液氮中，再于-80℃保存，备用。

感受态细胞的转化：

(1)准备PCR连接产物以及质粒自连的对照连接产物(该体系中，用ddH₂O代替PCR产物)；

(2)取两管100μl的感受态细胞，在冰上融化；

(3)将10μl的PCR连接产物与质粒自连产物分别加入到感受态细胞中，轻轻用枪混匀；

(4)冰浴20-40min；

(5)42℃热击90s，迅速放入冰中，冰浴5min；

(6)添加1mlLB培养基，37℃，200rpm震荡培养40-50min；

(7)取200-300μl培养液涂布于含有相应抗生素的LB培养基平板上，于37℃培养箱培养30min后，倒置培养过夜。

1.1.2.6重组子的鉴定

(1)从转化平板上挑取单菌落接种于5mlLB培养基中，37℃振荡培养6-8小时，进行质粒提取；

(2)根据PCR引物的设计，以相同的内切酶进行酶切(反应体系见上)3小时，将酶切产物进行凝胶电泳，检测目的基因的存在。

(3)保存阳性克隆，用于今后使用。

1.1.2.7目标蛋白的诱导表达

所配试剂：

100mmol/L IPTG(溶于DMSO中)；

PBS：NaCl 8g/l，KCl 0.2g/l，Na₂HPO₄·12H₂O 3.63g/l，KH₂PO₄0.24g/l，pH7.4。

Tris-HCl缓冲液：50mmol/L Tris-HCl(pH8.0)

实验方法：

(1)将阳性克隆挑取到5ml含抗生素的LB培养基的试管中，培养12-16小时，后以2％的接种量转接于含50ml含抗生素的LB培养基的250ml摇瓶中于37℃进行培养；

(2)待菌液OD₆₀₀值达到0.5左右时，加入0.1mmol/L的IPTG于16℃条件下诱导16-20个小时；

(3)次日，离心收集菌体，并用PBS(pH7.4)进行洗涤，离心后收集菌体，溶于4ml的50mmol/L Tris-HCl(pH8.0)溶液中，进行超声破碎；

(4)破碎后进行离心(4000rpm，10min)，目的蛋白则溶于上清液中，取其中得的10μl与30μl 4×的蛋白质上样缓冲液进行混匀后，进行SDS-PAGE蛋白质电泳。电泳结束后用考马斯亮蓝R-250染色，进行凝胶成像系统查看结果。

1.1.2.8SDS-PAGE蛋白电泳

所配试剂：

10％APS；10％SDS

4×蛋白质电泳上样缓冲液：200mmol/L Tris-HCl(pH6.8)、8％SDS、0.04％溴酚蓝、40％甘油、400mmol/L DDT，4℃保存；

10×蛋白质电泳电极缓冲液：Tris 6g、Glyc i ne 28.8g、SDS10g、pH8.3，定容1L；

30％胶母液：30％Acrylamide、0.8％bis；

分离胶缓冲液(pH8.8)：3.0mmol/L Tris；

浓缩胶缓冲液(pH6.8)：1.0mol/L Tris；

考马斯亮蓝染色液：考马斯亮蓝R-250 1.0g、甲醇500ml、冰醋酸100ml，定容1L；

脱色液：甲醇50ml，醋酸75ml，定容1L；

分离胶与浓缩胶配方见表1：

表1：SDS-PAGE蛋白电泳中分离胶和浓缩胶的配方

实验方法：

电泳前准备：

(1)装板；

(2)配分离胶(采用15％凝胶)

(3)将配好的分离胶溶液混匀后，立即灌于胶中；

(4)在分离胶上覆盖一层异丙醇(约200μl)，室温放置约2小时左右，使分离胶完全聚合；

(5)倒去异丙醇，用水清洗，吸干多于水分后，配制浓缩胶；

(6)将浓缩胶溶液混匀后，立即灌入胶中，并插上梳子，注意不能产生气泡；

(7)室温放置约半小时，等浓缩胶完全聚合后，用蒸馏水洗涤，然后在上、下电泳槽中加入1×SDS电泳缓冲液反复清洗加样孔后，在上、下电泳槽中加入1×SDS电泳缓冲液。上槽的1×SDS电泳缓冲液要高过凝胶加样孔。

电泳操作：

(1)将30μl的蛋白溶液与10μl的4×SDS上样缓冲液混合，100℃处理5min，离心后取上清；

(2)将样品加入加样孔中，将电压调至100V开始电泳，当样品进入浓缩胶后加大电压为150V直至电泳结束；

(3)小心取出胶，割去浓缩胶，用考马斯亮蓝R520溶液进行浸泡(没过胶即可)，平缓摇动约1小时后，倒去染液，再用脱色液进行脱色，更换几次脱色液后并脱色过夜；

(4)将SDS-PAGE电泳放于凝胶成像系统中，查看结果。

1.1.2.9Bradford法测定蛋白浓度

材料：测定蛋白质标准曲线试剂盒Quick Start^TMBovine Serum Albumin(BSA)Standard Set购于Bio-RAD公司。

所配试剂：

考马斯亮蓝G-250染料试剂：称100mg考马斯亮蓝G-250，溶于50ml95％的乙醇后，再加入120ml 85％磷酸，用水稀释至1升。

实验方法：

(1)将玻璃比色皿事先浸泡在95％乙醇中清洗，然后小心用镊子夹取，用吹风机烘干。然后在其中加入1.0ml考马斯亮蓝G-250试剂，于595nm处测量吸光值，作为空白对照。

(2)分别选取不同浓度的蛋白标准品(0.125mg/ml、0.25mg/ml、0.5mg/ml、0.75mg/ml、1mg/ml)20μl，小心加入上一步中提到的加有考马斯亮蓝的比色皿中，轻轻混匀，待蓝色均匀分布整个比色皿后，于595nm处读取数值，则为该浓度下所对应的蛋白吸光值。

(3)以OD₅₉₅数值为横坐标，用标准蛋白质量(mg)为纵坐标作图，即得到考马斯亮蓝测蛋白质浓度的标准曲线，如图8所示。

结果：

脂肪酶基因的扩增

根据选用的不同克隆载体，设计引物如下所示：

载体：pET30a；酶切位点：EcoRI+HindIII，

上引物：5‘GCGGAATTCGGTGCCAATCAAGAGACAATC3’(SEQ ID NO：13)

下引物：5’GCGAAGCTTTTAATGGTGGTGATGATGGT3’(SEQ ID NO：14)

载体：pET32a；酶切位点：EcoRI+NotI，

上引物：5‘GCGGAATTCGGTGCCAATCAAGAGACAATC3’(SEQ ID NO：15)

下引物：5’GCGGCGGCCGCTTAATGGTGGTGATGATGGT3’(SEQ ID NO：16)

载体：pET22b；酶切位点：EcoRI+NotI，

上引物：5‘GCGGAATTCAGGTGCCAATCAAGAGACAATC3’(SEQ ID NO：17)

下引物：5’GCGGCGGCCGCTTAATGGTGGTGATGATGGT3’(SEQ ID NO：18)

PCR产物经1.0％琼脂糖凝胶电泳鉴定后，获得与预计大小一致的PCR产物(见图3)。基因序列(野生型)显示在SEQ ID NO：1，氨基酸序列见SEQ IDNO：2。

重组表达载体的构建

表达载体和宿主细胞的选择

克隆过程中，选择合适的表达载体和宿主非常重要。不同的大肠杆菌菌种在培养条件和外源基因的表达能力上有着比较达的差异。表达产物在大肠杆菌中有三条途径：(1)形成天然构象，可溶并且有活力，不容易被降解；(2)蛋白质可溶，但是构象并不是天然的，容易被胞内各种蛋白酶识别并降解；(3)多肽链之间彼此形成不可溶的包涵体，并且具有蛋白酶抗性。其中，形成天然构象，并且不被蛋白酶降解是最理想的形式，并且对于以后的定向进化而言，表达的产物可溶并且具有活力对顺利进行高通量筛选至关重要。因此，在构建表达载体前就要选择合适的表达系统。因目标基因来源于真核米黑霉，故在大肠杆菌中的表达会存在蛋白二硫键形成困难，以及缺少翻译后修饰等问题，从而影响了目标蛋白在大肠杆菌中的表达效果。本发明选择pET32a作为克隆载体，因其带有编码硫氧还蛋白的序列，在蛋白表达时可以帮助目标蛋白的二硫键的形成，从而帮助目标蛋白可溶性表达；选择pET22b作为克隆载体，因其带有编码信号肽的序列，在蛋白表达时，可以引导目标蛋白进入大肠杆菌周质空间，那里更利于大肠杆菌二硫键的形成，从而帮助目标蛋白可溶性表达；选择pET30a作为克隆载体，因为其是大肠杆菌表达常用载体，操作方便，研究成熟，而且该载体上没有任何融合标签，因此若用该载体可以对目标蛋白进行理想的可溶性表达，对于后期蛋白的纯化、改造都是很方便的。实验中成功获得了由以上三种质粒作为载体的重组子，阳性克隆鉴定如图4所示，出现箭头所示的目标条带的克隆即为阳性克隆。

重组表达载体的诱导表达

根据前述的方法，对克隆好的重组子进行诱导表达。诱导后，离心收集上清和沉淀。进行15％的SDS-PAGE电泳，电泳结果显示，目标蛋白在预计的位置都有表达的条带，如图5所示。

实施例2：脂肪酶活性的测定及蛋白的纯化

2.1酶表观活性及比活的测定：

本研究中，脂肪酶活性的测定主要采用酸碱滴定法，具体操作步骤如下所示：

(1)实验试剂及仪器

橄榄油，0.02kg/L聚乙烯醇(PVA)溶液，0.05mol/L Tris-HCl缓冲液pH8.0，95％乙醇，酚酞，0.05mol/L NaOH标准溶液。

超声破碎仪，漩涡振荡器，恒温摇床，碱性滴定管。

(2)实验步骤

4ml橄榄油乳化液：3ml聚乙烯醇(2％W/V)，1ml橄榄油混合，先于混合震荡仪上震动混匀，再于超声破碎仪中进行进一步乳化，直至形成乳白色乳状体，油、水不再分层。

具体步骤如图9所示。

脂肪酶酶活力单位定义为：每分钟催化底物释放出1μmol脂肪酸的酶量为1个脂肪酶活力单位(U)。

酶活计算公式：

式中：V：滴定样液所消耗的NaOH溶液体积(ml)

V₀：滴定空白样所消耗的NaOH溶液体积(ml)

t：反应时间(min)

n：酶液体积(ml)

M：滴定用的NaOH溶液的浓度(mmol/L)

样品酶的比活＝样品的酶活力(U/ml)/样品的浓度(mg/ml)

2.2蛋白质的分离纯化

2.2.1材料

菌株：pET30a-RML；

设备：AKTA蛋白纯化仪；

固化Ni²⁺层析柱(预装柱)：购于GE Healthcare Bio-Science AB(Sweden)公司

试剂；结合缓冲液(pH7.8)：

20mmol/L磷酸钠；500mmol/L NaCl；20mmol/L咪唑

洗脱缓冲液(pH6.0)：

20mmol/L磷酸钠；500mmol/L NaCl；500mmol/L咪唑

注意：结合缓冲液和洗脱缓冲液配制完成时，要进行抽滤，并超声除气泡

2.2.2实验方法：

(一)待纯化目标蛋白样品的处理

1.按照前述处理菌体的方法，通过超声破碎得到粗酶液；

2.将粗酶液分装于2ml eppendorf管中，于13000rpm离心5-10min，进一步分离可溶性蛋白和包涵体及细胞碎片；

3.收集离心后的上清液，用水溶性过滤器过滤，纯化样品；

(二)纯化带组氨酸标签蛋白

1.将Ni²⁺装于蛋白纯化仪上；

2.用3倍体柱体积的无菌水冲洗填充树脂；

3.用3倍柱体积的结合缓冲液(pH7.8)平衡树脂；

4.将树脂上的结合缓冲液引流到柱顶部；

5.将细胞裂解液上清进行上柱，流速调整为每小时10个柱体积；

6.用6个柱体积的结合缓冲液(pH7.8)洗柱；

7.用4个柱体积的洗脱缓冲液(pH6.0)洗柱，直到A280＜0.01；

8.用6个柱体积的10mmol/L咪唑洗脱缓冲液洗脱结合蛋白，每份1ml分布收集，检测A280的值；

9.用更高浓度咪唑洗脱缓冲液洗脱，每份1ml分布收集，检测A280的值；

10.将收集获得的蛋白进行12％的SDS-PAGE进行电泳，分析聚组氨酸标签蛋白的分布。

结果：

重组蛋白浓度及表观活性测定

以牛血清蛋白为标准蛋白，采用实施例1所述的Bradford法测定重组蛋白的浓度；采用酸碱滴定法，测量重组蛋白的表观活性。

具体如下表所示：

重组蛋白的浓度及表观活性测定

测活比较，采用pET30a表达的蛋白水解活性最好，且载体上无融合标签，原理简单，故最终选择pET30a作为最终克隆载体。

实施例3：通过定向进化提高脂肪酶立体选择性

3.1材料与方法：

3.1.1材料

菌株：前述实验已构建的重组菌，重组质粒为pET30a-RML，宿主菌为BL21，用于提取质粒DNA做易错PCR的模板。

工具酶：限制性内切酶、T4DNA快速连接酶购于生工生物工程(上海)有限公司；Taq DNA聚合酶及其配套PCR所需试剂均购于Promega(USA)公司。

试剂均为国产分析纯。

细胞裂解液：先配置50mmol/L的Tris-HCl缓冲液(pH8.0-pH8.5)500ml，再加入氯化镁(其终浓度达到5mmol/L)，溶菌酶250mg，DNA酶1000U。

溴百里酚蓝和苯酚红指示剂：用10mM pH 8.5Tris-HCl溶液配成各0.5mg/ml的双指示剂浓度。

醋酸钙溶液：用10mM pH 8.5Tri s-HCl溶液配50mM醋酸钙溶液。

Inoue转化缓冲液：

a.0.5mol/L的PIPES(pH6.7)[哌嗪-N.N’-双(2-乙磺酸)]溶液的配制：将15.1gPIPES溶于80ml水中，用5mol/LKOH调pH至6.7。最后加纯水定容至100ml。(-20℃保存)，用预先灭菌处理的过滤器过滤除菌。

b.将下列组分溶于800ml纯水中，然后加20ml0.5mol的PIPES(pH6.7)，加纯水定容至1L：MnCl₂·4H₂O，55mmol/L；CaCl₂·2H₂O，15mmol/L；KCl，250mmol/L

3.1.2实验方法：

3.1.2.1BL21超级感受态的制备

(1)准备Inoue转化缓冲液(用前冰上预冷)

(2)挑取一个经37℃培养16-20h平板上的单菌落(BL21)。接种至250ml锥形瓶中有25mlLB培养基中，37℃摇床(250-300r/min)培养6-8小时。

(3)晚上约6点钟，将上述初始培养物接种于一个盛有125mlLB培养液的500ml锥形瓶中，第一个加500μl，第二个加1ml，第三个加2ml，于18-22℃，200r/min摇床过夜。

(4)次日早晨，测量三瓶培养物的OD₆₀₀值，每半小时测一次，当其中一瓶的OD₆₀₀值达到0.55时，将培养瓶置于冰上20min，弃去另两瓶培养物。

(5)于4℃，4000r/min离心10min收集菌体。

(6)倒去培养液，将离心管倒扣在吸水纸上2min以吸干剩余液体，加40ml预冷的Inoue转化缓冲液重悬细菌沉淀(轻轻旋转吹打，不要用振荡器)。

(7)于4℃，4000r/min离心10min收集菌体。

(8)用10ml预冷的Inoue转化缓冲液重悬细菌沉淀。

(9)加入0.75mlDMSO，轻轻婚约细菌沉淀，放置冰上10min。

(10)迅速将悬液分装到冷却的无菌的eppendorf管中，封紧管口，投入液氮中快速冰冻感受态细胞，-80℃备用。

3.1.2.2易错PCR与突变文库的建立

PCR引物：

正向引物：5’-CGCGCCATGGTGCCAATCAAGAGACAATC-3’，NcoI；(SEQ IDNO：19)

反向引物：5’-GCCGAAGCTTAAGTACAGAGGCCTGTGT-3’，Hi ndI I I；(SEQ IDNO：20)

PCR体系：准备7支PCR管，每管中PCR体系为50μl，其中质粒DNA模板1μl(约为10pmol)，上游引物1μl，下游引物1μl，dNTP 1μl，Mg²⁺4l，Buffer 5μl，酶0.5μl，另在体系中加入Mn²⁺，使其浓度依次达到0mmol/L，0.1mmol/L，0.2mmol/L，0.3mmol/L，0.4mmol/L，0.5mmol/L，0.6mmol/L；其余用ddH₂O补足，根据DNA凝胶电泳成像结果挑选合适的Mn²⁺浓度。

PCR条件：预变性，95℃，3min，变性，95℃，30S；退火，55℃，50S；延伸，72℃，1min，共35个循环，72℃延伸10min，4℃保温30min。

将PCR产物以1％(W/V)的琼脂糖凝胶电泳，用PCR纯化回收试剂盒进行纯化回收。纯化后的易错PCR产物用限制性内切酶NcoI和hindIII进行3-4小时的37℃的酶切，后与同样经过酶切的pET30a载体进行连接，连接方法和体系见前述。然后将连接产物转化大肠杆菌BL21超级感受态细胞中，涂布于LB(含50mg/ml Kanamyc in)平板，37℃培养16-20小时。突变体个数要求达到6000-8000左右。

3.1.2.3RML脂肪酶突变体的诱导表达

对于RML脂肪酶突变体，采用96微孔板进行表达。将LB固体培养平板上的单菌落逐个挑到每个孔含有200μl LB培养基的96孔板中(此板称为母版)，于37℃，200r/min转速培养12-16小时，然后以2％接种量，将母板上每个孔中的菌液接种到新的每个孔都含有500μlLB培养基的96孔微量板中(此板为子板)。同时，母板中每个孔加10％的甘油，-80℃保存以备今后适用。同时，子板于37℃，200r/min摇床中进行培养。待每个孔中菌液的浓度达到OD值为0.5左右，加入IPTG诱导，使其终浓度达到0.1mmol/l。诱导4小时后，经离心、洗涤以后，收集菌体。含有诱导表达菌体的子板放入-80℃过夜后，每个孔中加入250μl的细胞裂解液，放置于37℃1-2小时，使菌体裂解。此时，由于冷热膨胀，菌体细胞壁破碎，所含有的酶蛋白将释放在液体中。然后4000rpm，4℃离心20分钟，目标蛋白即溶于上清中，将其在4℃保存，用于之后测定反应。

3.1.2.4突变体对油脂催化活性的初筛(高通量筛选)

原理如上所示。以溴百里酚蓝和苯酚红作为pH指示剂，其在pH＝7.5变色，选择这个变色点是因为这个米黑霉酶液喜欢弱碱性的环境。用10mM pH8.5Tris-HCl溶液配成各0.5mg/ml的双指示剂浓度。用10mM pH 8.5Tris-HCl溶液配50mM醋酸钙溶液。橄榄油溶解于二甲基甲酰胺中(大约体积比的1∶6)。

我们加入预期产物油酸替代橄榄油来验证这个方法的灵敏性。其颜色变化如图1所示，其中，在加入的油酸浓度为0时，反应体系的颜色呈现深蓝色，随着油酸浓度的增加，反应体系的颜色逐渐变成淡蓝色、绿色和淡蓝色。

在96孔板上的反应体系为如下：

1.每个孔加20μl指示剂和60μl醋酸钙溶液。可事先将它们混合成100μl混合液再将该混合液加入孔中。

2.加入100μl溶解在二甲基甲酰胺中的橄榄油。

3.加入20μl酶液。反应15分钟可观察到颜色变化。

这个新的高通量方法有效的和米黑霉脂肪酶的定向进化结合了起来并因此得到了很好的优势菌。

和p-NPP方法比较，用本发明方法的优点如下：第一，用p-NPP方法不能区分活性大的酶。图2中的a-G2和a-G1显示了使用p-NPP测试的结果，其中显示，即使随着酶量的减少，p-NPP方法也不能显出颜色的梯度变化。图b-G2和b-G1显示了本发明方法的结果，该结果显示所示，颜色的梯度可以明显显示出来。第二，甘油三酯是稳定的，而p-NPP易于水解，且这水解速度很受温度和溶剂等外界因素影响。用本发明方法得出的结果和酸碱滴定法的结果是一致的，而用p-NPP方法的却没有。图中G1和G2分别为SEQ ID NO：3和5所示的脂肪酶。

3.1.2.5突变体对油脂催化活性的复筛

通过高通量筛选每一轮挑出大约20株活性较野生菌相比提高的菌株，采用碱滴定法测定活性，具体操作步骤如前所述。

反应体系为：

4ml橄榄油乳化液：3ml聚乙烯醇(2％W/V)，1ml橄榄油混合，先于混合震荡仪上震动混匀，再于超声破碎仪中进行进一步乳化，直至形成乳白色乳状体，油、水不再分层。

3ml Tri s-HCl缓冲液或磷酸缓冲液(50mmol/L；pH8.5)；

2ml ddH₂O，

加入10μl酶液(粗酶液和纯化后的酶液都有作反应)。

实验结果

定向进化结果

易错PCR结果见图6，其中，泳道1-7：No，0.1mmol/L Mn²⁺，0.2mmol/LMn²⁺，0.3mmol/L Mn²⁺，0.4mmol/L Mn²⁺，0.5mmol/L Mn²⁺，0.6mmol/L Mn²⁺。

从图中可以看出，随着体系中加入Mn²⁺的浓度变大，PCR的条带依次变暗，若选择Mn²⁺浓度过大的PCR条件，则PCR亮度不够，且不能保证突变平衡，有过高的突变，导致表达蛋白活性下降；若选择Mn²⁺浓度过低的PCR条件，则没有保证一定的突变率，因此，综上分析，选择Mn²⁺浓度为0.4mmol/L为理想突变浓度。

通过上述初筛和复筛，本发明筛选到一系列突变的脂肪酶，根据上文所述方法纯化得到这些脂肪酶，并对其进行测序和活性测定。

活性测定结果及基因突变结果如下：

野生型脂肪酶的核苷酸序列见SEQ ID NO：1，氨基酸序列见SEQ ID NO：2。

图7显示脂肪酶经过定向进化和定点改造后活性的变化趋势，其中，表观活性较野生型相比，提高了5.5倍；比活较野生型相比，提高了6.7倍。

Claims (5)

1.一种分离的多肽，其特征在于，所述多肽选自SEQ ID NO：4、6、8、10或12所示氨基酸序列。

2.一种分离的多核苷酸，其特征在于，所述分离的多核苷酸选自：

(1)编码权利要求1所述的多肽的多核苷酸；和

(2)与(1)所述的多核苷酸互补的多核苷酸。

3.如权利要求2所述的多核苷酸，其特征在于，该多核苷酸的核苷酸序列如SEQ ID NO：3、5、7、9或11所示。

4.一种载体，其特征在于，它含有权利要求2－3中任一项所述的多核苷酸。

5.一种遗传工程化的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞含有权利要求4所述的载体，或含有权利要求2－3中任一项所述的多核苷酸。