CN101045933A

CN101045933A - 一种适冷蛋白酶的基因mcp01及其制备方法

Info

Publication number: CN101045933A
Application number: CN 200710013366
Authority: CN
Inventors: 陈秀兰; 张玉忠; 张熙颖; 何海伦; 石梅
Original assignee: Shandong University
Current assignee: Shandong University
Priority date: 2007-03-12
Filing date: 2007-03-12
Publication date: 2007-10-03

Abstract

本发明公开一种适冷蛋白酶的基因mcp01及其制备方法，属于生物技术领域。本发明含有深海适冷蛋白酶基因mcp01的2676bp基因组DNA片段，其中含有一个具有2508个核苷酸的开放阅读框架，该开放阅读框架即是编码蛋白酶MCP－01的基因，由蛋白酶MCP－01的基因mcp01表达的适冷蛋白酶最适酶活温度为35℃左右，最适pH为9.0，可用于低温肉的保鲜、增鲜，乳制品的加工、洗涤剂等行业。

Description

一种适冷蛋白酶的基因mcp01及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种新型深海适冷蛋白酶的基因及其制备方法，属于海洋生物技术领域。

背景技术

蛋白酶(proteases，proteinases)也称肽酶(peptidases)，是一类催化肽键断裂的水解酶类。蛋白酶广泛存在于动物内脏、植物茎叶和果实，多种微生物能分泌胞外蛋白酶，是工业生产蛋白酶的主要来源。根据作用方式不同，蛋白酶分为外肽酶(exopeptidases)和内肽酶(endopeptidases)。外肽酶切割一条多肽链N端或C端的一个或几个氨基酸。因此，外肽酶有氨肽酶(从N端切割)和羧肽酶(从C端切割)两大类。内肽酶断裂多肽链内部的肽键。根据催化机制不同，内肽酶分为精氨酸蛋白酶、丝氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、金属蛋白酶和苏氨酸蛋白酶五大类。蛋白酶商品生产始于20世纪初，由于其广泛的用途，早已成为最主要的酶制剂，在世界各国销量巨大。蛋白酶的主要用途有以下5个方面：

(1)制造蛋白质水解物：例如蛋白胨，混合氨基酸，水解蛋白输液，要素膳食，氨基酸调味液，牛肉浸膏，肝宁，胎盘水解物等。

(2)用作除蛋白剂：制造鱼肝油、香料时去除蛋白质，废影片脱胶回收片基及银粒、丝绸织物只脱胶精练、羊毛精练、啤酒及葡萄酒等澄清，乳糖去蛋白以及用于洗涤剂、牙粉等以增强洗涤效果。

(3)用于革新工艺提高产品质量：皮革原料皮脱毛，毛皮软化，羊毛低温染色，制造胶原纤维，肉质嫩化，面包制造，酱油酿造，生产硫酸软骨素、冠心舒等药物。

(4)作为医药及试剂：作为消化、消炎、化痰止咳药物以及治疗跌打伤、水肿血肿和消除坏死组织等药物。

(5)作为饲料添加剂，促进幼畜成长，节约饲料，增加家禽产卵率。

由于蛋白酶的广泛用途，对蛋白酶的研究和开发一直都被世界各国科学家所重视。开发具有新的用途的新型蛋白酶具有非常重要的理论意义和应用价值。自20世纪70年代以来，随着基因重组技术和分子生物学的发展，许多蛋白酶的编码基因和一级结构被详细研究。丝氨酸蛋白酶是蛋白酶中研究和应用最广泛的一类酶，分为14个clan。枯草杆菌素类蛋白酶(subtilase)属于clan SB中的S8A亚家族(subfamily)。该类蛋白酶大部分由细菌和真菌等微生物分泌，其前体一般包括信号肽(signal peptide)、N端结构域和催化结构域，真菌分泌的酶通常在C端还有一个称为P-domain的结构域，但它们的成熟酶只含有一个催化结构域，分子量一般在3kDa左右。该类蛋白酶用途广泛，例如，枯草芽孢杆菌产的枯草杆菌素(subtilisin)广泛用于洗衣粉等洗涤用品，蛋白酶K作为去蛋白剂广泛用于分子生物学和生物技术领域，而且，枯草芽孢杆菌素和蛋白酶K在蛋白质生产肽的领域中也广泛应用。

近些年的研究表明，深海存在着大量的微生物，这些微生物长期生长在高盐、高压、寡营养、低温或高温(海底热液口附近)的极端环境下，形成了适应这些环境条件的特殊结构和特殊机制，因此，深海微生物是发现新型酶的好材料。但由于采样和培养的困难，目前对深海微生物的研究相对较少。

本申请的发明人在1855米深的海底沉积物中分离到一株适冷菌，经鉴定属于假单胞菌属，命名为Pseudomonas sp.SM9913。参见陈秀兰等，“深海适冷菌SM9913产生的低温蛋白酶”，《海洋科学》2001年，第5卷，第1期，第4-8页。本申请人的ZL01127405.0专利提供了利用该深海适冷菌Pseudomonas sp.SM9913制备适冷风味蛋白酶的方法(授权公告号CN1141388C)。

发明内容：

本发明提供了一种新型深海适冷蛋白酶MCP-01的基因mcp01及其制备方法。由蛋白酶MCP-01的基因mcp01表达的适冷蛋白酶可用于低温肉的保鲜、增鲜，也可用于洗涤剂等行业。

本发明涉及的适冷菌Pseudomonas sp.SM9913制备方法参见陈秀兰等，“深海适冷菌SM9913产生的低温蛋白酶”，《海洋科学》2001年，第5卷，第1期，第4-8页。

将菌株适冷菌Pseudomonas sp.SM9913分泌的一种蛋白酶命名为MCP-01。该蛋白酶的提取在实施例2中将作详细说明。

提取Pseudomonas sp.SM9913的基因组DNA。对蛋白酶MCP-01的N端和其自溶片段N端进行测序，根据测序结果设计引物。然后，利用PCR技术克隆编码蛋白酶MCP-01的基因的一部分。再根据获得方法的部分基因设计引物，利用Tail PCR技术克隆出蛋白酶MCP-01的完整基因。测序结果表明获得的2676bp的DNA片段中含有一个具有2508个核苷酸的开放阅读框架，该开放阅读框架即是编码蛋白酶MCP-01的基因，起始密码子位于143bp，终止密码子位于2648bp，共编码氨基酸835个。

蛋白酶MCP-01的前体的结构包括信号肽，N端结构域、催化结构域、连接区域、P-domain结构域、PKD结构域和C端区域七部分，其成熟酶包括催化结构域、连接区域、P-domain结构域和PKD结构域四部分，是一个多结构域的枯草杆菌素类蛋白酶，此类型蛋白酶目前尚未报道，蛋白酶MCP-01是目前唯一的一个被纯化的该类型蛋白酶，我们将这种新型蛋白酶命名为deseasin。该酶的最适酶活温度为35℃左右，最适pH为9.0。

本发明克隆的含有深海适冷蛋白酶基因mcp01的基因组DNA片段具有如下序列，SEQ IDNO.1：

gttttgttcc tgattttgct ttttttactt gagttagtga cggattaccc gttttcttaa 60

cgcttgccac gtgattactt aaattcataa acgtaaatat ttcgcttagt aaagctaagt 120

taacttaatt acggatagaa caatgaaaac aaaattatct attattacac ttgcactttt 180

accttgttta gctgcggcta aattgcctga tgttaacagt acaactcaaa aagtaactgc 240

gagcagtgac tcgattattg ttaagtataa aaagaatgct tcgccgaaaa tgcgtaagca 300

agctcgttcg ttagtaaaag ccaaaatatc tgatctaaat aacgatgaaa ttgatgataa 360

cttcacctcg ttattttctg gccgcctcgc aaaatttaaa atatcaggaa tgagcgctaa 420

agaagcaatt gagcgcttaa aatcgcatca agctattgag tatgttgagc ctgattaccg 480

agtgagcata gcaagcgcaa cgaacgaccc gcgatttgac gatttatggg gcttaaacaa 540

cgaaggccaa actggtggca cggctgatgc cgatattgat gcaccagaag catggtcaat 600

ctctacaggt agtcgtgatg ttgtagtagg tgttattgat acgggtgttg attatagtca 660

ccctgattta gctgcgaacg cgtgggtaaa cagtggtgaa attgccggtg atggtatcga 720

taatgacgga aacggttaca ttgatgacgt tcacggtatt aatgcaatta ctgatgttgg 780

tgatccgatg gatgacgaag gccatggtac acacgtatcg ggtacaatcg gtgccagtgg 840

taacaatggt gtcggtgttg ttggtgtaaa ccatgatgtt tctattgttg gttgtaagtt 900

tttagccgca gatggtacag gttctacctc tggtgctatt aagtgtatcg attacatggt 960

tggccttaaa aatgcgggtg ttaatctgcg tgtgttaaat aatagctggg gcggcggtgg 1020

ttttagccaa gcgttagctg atgcgattac ggctagtgag caagctgata ttttatttgt 1080

tgctgctgcg ggtaacgatg cggttgataa cgatcaaaat ccacactacc catctaatta 1140

tgaaaacgac aacgtattat cgatagctag tactgatagc agagataata tgtctagctt 1200

ttctcaatgg ggcctaacaa gtgttgatat gggcgcacct ggctcaggta ttttgtcgac 1260

cgttcctggt aatagctatg ctacttattc aggtacatct atggcaacac cgcatgtagc 1320

tggtgctgct gcacttgtac tttcagttaa tcctgattta acaacactag agcttaaaga 1380

attacttatg tctagtggtg atgctaatgc ggcattaaat ggtaaaacgg ttgcaggtac 1440

acgcctaaat gttaaccaag cgctaattga tgctgatcca actccaggct ttaaattatc 1500

tgtatcgccg gtttctcagc aagcgactgt aggtgatacg gttacttata cctttacgat 1560

tggctcaatt gcacaatggg aaggtgacgt ttcactggct ttagcttcag atcttaccga 1620

tgcatcacta agcgcaacta ccgctcgtcc gggcgatgaa gttgttctaa cggttgcaac 1680

taacagcgat actcagtggg gaaattacga ctttactgtt accgcaacaa ctgaagagca 1740

agttaaagaa caaactgtta gcttaatgct tcaacctgct ggtttaaatg actttactta 1800

cagcagtgat gaaaacatcg ctattccaga taattctcca gagggcgcaa gctcagttat 1860

tacggttgct gatgatttaa ctatttttgg caccactgct gatgtagata ttacgcatac 1920

ttggtctggt gacttagtac ttacgcttat ttcagcgcaa ggtacagaag taactttaca 1980

aagcaatgaa ggtggcagtg cagacgatat tgttaagtca tttacatcaa gcgtatttaa 2040

ttctgaagtg gcaaccggag attggacact tcatgttgaa gatacagctg gtgcagatac 2100

gggtaatatc aatggttggt cacttacatt tagcgctatt ggtgaggtaa gcccacaacc 2160

accacaagct ggctttagtg tttcagcaca aggtttaact gctacatttg taggtacaag 2220

tcgtgatgta aatgatgaca tttcacagtg gagctggaac tttggtgatg gttcaacatc 2280

aacaaaccca aatcctacac atgtttacgc tcagtcagga agttatgagg ttgaattaac 2340

cgtaacggat agtgaaaata actcagatac attcactcaa acagtggttg ttagtgatgt 2400

tgaaattgaa ttgagcttaa aacgcgctaa caagtcacgt cttgatacta tgcgtgttga 2460

gttaaactgg gcagaagtag gggctgagtc acttagccta taccgaaatg gcgaactagt 2520

agataccgta tcagataatg gccgttaccg tgattatgtg cgtaacgcaa cattaccggc 2580

atacgactat cagttatgcg tatctgaaaa cgtatgttcg aatattatta cggtttcatt 2640

ttctgaataa aacgtttacc ccttagacat tcaaag 2676

上述基因中核苷酸与编码氨基酸对应关系如下：

1 ATG AAA ACA AAA TTA TCT ATT ATT ACA CTT GCA CTT TTA CCT TGT

1 M K T K L S I I T L A L L P C

46 TTA GCT GCG GCT AAA TTG CCT GAT GTT AAC AGT ACA ACT CAA AAA

16 L A A A K L P D V N S T T Q K

91 GTA ACT GCG AGC AGT GAC TCG ATT ATT GTT AAG TAT AAA AAG AAT

31 V T A S S D S I I V K Y K K N

136 GCT TCG CCG AAA ATG CGT AAG CAA GCT CGT TCG TTA GTA AAA GCC

46 A S P K M R K Q A R S L V K A

181 AAA ATA TCT GAT CTA AAT AAC GAT GAA ATT GAT GAT AAC TTC ACC

61 K I S D L N N D E I D D N F T

226 TCG TTA TTT TCT GGC CGC CTC GCA AAA TTT AAA ATA TCA GGA ATG

76 S L F S G R L A K F K I S G M

271 AGC GCT AAA GAA GCA ATT GAG CGC TTA AAA TCG CAT CAA GCT ATT

91 S A K E A I E R L K S H Q A I

316 GAG TAT GTT GAG CCT GAT TAC CGA GTG AGC ATA GCA AGC GCA ACG

106 E Y V E P D Y R V S I A S A T

361 AAC GAC CCG CGA TTT GAC GAT TTA TGG GGC TTA AAC AAC GAA GGC

121 N D P R F D D L W G L N N E G

406 CAA ACT GGT GGC ACG GCT GAT GCC GAT ATT GAT GCA CCA GAA GCA

136 Q T G G T A D A D I D A P E A

451 TGG TCA ATC TCT ACA GGT AGT CGT GAT GTT GTA GTA GGT GTT ATT

151 W S I S T G S R D V V V G V I

496 GAT ACG GGT GTT GAT TAT AGT CAC CCT GAT TTA GCT GCG AAC GCG

166 D T G V D Y S H P D L A A N A

541 TGG GTA AAC AGT GGT GAA ATT GCC GGT GAT GGT ATC GAT AAT GAC

181 W V N S G E I A G D G I D N D

586 GGA AAC GGT TAC ATT GAT GAC GTT CAC GGT ATT AAT GCA ATT ACT

196 G N G Y I D D V H G I N A I T

631 GAT GTT GGT GAT CCG ATG GAT GAC GAA GGC CAT GGT ACA CAC GTA

211 D V G D P M D D E G H G T H V

676 TCG GGT ACA ATC GGT GCC AGT GGT AAC AAT GGT GTC GGT GTT GTT

226 S G T I G A S G N N G V G V V

721 GGT GTA AAC CAT GAT GTT TCT ATT GTT GGT TGT AAG TTT TTA GCC

241 G V N H D V S I V G C K F L A

766 GCA GAT GGT ACA GGT TCT ACC TCT GGT GCT ATT AAG TGT ATC GAT

256 A D G T G S T S G A I K C I D

811 TAC ATG GTT GGC CTT AAA AAT GCG GGT GTT AAT CTG CGT GTG TTA

271 Y M V G L K N A G V N L R V L

856 AAT AAT AGC TGG GGC GGC GGT GGT TTT AGC CAA GCG TTA GCT GAT

286 N N S W G G G G F S Q A L A D

901 GCG ATT ACG GCT AGT GAG CAA GCT GAT ATT TTA TTT GTT GCT GCT

301 A I T A S E Q A D I L F V A A

946 GCG GGT AAC GAT GCG GTT GAT AAC GAT CAA AAT CCA CAC TAC CCA

316 A G N D A V D N D Q N P H Y P

991 TCT AAT TAT GAA AAC GAC AAC GTA TTA TCG ATA GCT AGT ACT GAT

331 S N Y E N D N V L S I A S T D

1036 AGC AGA GAT AAT ATG TCT AGC TTT TCT CAA TGG GGC CTA ACA AGT

346 S R D N M S S F S Q W G L T S

1081 GTT GAT ATG GGC GCA CCT GGC TCA GGT ATT TTG TCG ACC GTT CCT

361 V D M G A P G S G I L S T V P

1126 GGT AAT AGC TAT GCT ACT TAT TCA GGT ACA TCT ATG GCA ACA CCG

376 G N S Y A T Y S G T S M A T P

1171 CAT GTA GCT GGT GCT GCT GCA CTT GTA CTT TCA GTT AAT CCT GAT

391 H V A G A A A L V L S V N P D

1216 TTA ACA ACA CTA GAG CTT AAA GAA TTA CTT ATG TCT AGT GGT GAT

406 L T T L E L K E L L M S S G D

1261 GCT AAT GCG GCA TTA AAT GGT AAA ACG GTT GCA GGT ACA CGC CTA

421 A N A A L N G K T V A G T R L

1306 AAT GTT AAC CAA GCG CTA ATT GAT GCT GAT CCA ACT CCA GGC TTT

436 N V N Q A L I D A D P T P G F

1351 AAA TTA TCT GTA TCG CCG GTT TCT CAG CAA GCG ACT GTA GGT GAT

451 K L S V S P V S Q Q A T V G D

1396 ACG GTT ACT TAT ACC TTT ACG ATT GGC TCA ATT GCA CAA TGG GAA

466 T V T Y T F T I G S I A Q W E

1441 GGT GAC GTT TCA CTG GCT TTA GCT TCA GAT CTT ACC GAT GCA TCA

481 G D V S L A L A S D L T D A S

1486 CTA AGC GCA ACT ACC GCT CGT CCG GGC GAT GAA GTT GTT CTA ACG

496 L S A T T A R P G D E V V L T

1531 GTT GCA ACT AAC AGC GAT ACT CAG TGG GGA AAT TAC GAC TTT ACT

511 V A T N S D T Q W G N Y D F T

1576 GTT ACC GCA ACA ACT GAA GAG CAA GTT AAA GAA CAA ACT GTT AGC

526 V T A T T E E Q V K E Q T V S

1621 TTA ATG CTT CAA CCT GCT GGT TTA AAT GAC TTT ACT TAC AGC AGT

541 L M L Q P A G L N D F T Y S S

1666 GAT GAA AAC ATC GCT ATT CCA GAT AAT TCT CCA GAG GGC GCA AGC

556 D E N I A I P D N S P E G A S

1711 TCA GTT ATT ACG GTT GCT GAT GAT TTA ACT ATT TTT GGC ACC ACT

571 S V I T V A D D L T I F G T T

1756 GCT GAT GTA GAT ATT ACG CAT ACT TGG TCT GGT GAC TTA GTA CTT

586 A D V D I T H T W S G D L V L

1801 ACG CTT ATT TCA GCG CAA GGT ACA GAA GTA ACT TTA CAA AGC AAT

601 T L I S A Q G T E V T L Q S N

1846 GAA GGT GGC AGT GCA GAC GAT ATT GTT AAG TCA TTT ACA TCA AGC

616 E G G S A D D I V K S F T S S

1891 GTA TTT AAT TCT GAA GTG GCA ACC GGA GAT TGG ACA CTT CAT GTT

631 V F N S E V A T G D W T L H V

1936 GAA GAT ACA GCT GGT GCA GAT ACG GGT AAT ATC AAT GGT TGG TCA

646 E D T A G A D T G N I N G W S

1981 CTT ACA TTT AGC GCT ATT GGT GAG GTA AGC CCA CAA CCA CCA CAA

661 L T F S A I G E V S P Q P P Q

2026 GCT GGC TTT AGT GTT TCA GCA CAA GGT TTA ACT GCT ACA TTT GTA

676 A G F S V S A Q G L T A T F V

2071 GGT ACA AGT CGT GAT GTA AAT GAT GAC ATT TCA CAG TGG AGC TGG

691 G T S R D V N D D I S Q W S W

2116 AAC TTT GGT GAT GGT TCA ACA TCA ACA AAC CCA AAT CCT ACA CAT

706 N F G D G S T S T N P N P T H

2161 GTT TAC GCT CAG TCA GGA AGT TAT GAG GTT GAA TTA ACC GTA ACG

721 V Y A Q S G S Y E V E L T V T

2206 GAT AGT GAA AAT AAC TCA GAT ACA TTC ACT CAA ACA GTG GTT GTT

736 D S E N N S D T F T Q T V V V

2251 AGT GAT GTT GAA ATT GAA TTG AGC TTA AAA CGC GCT AAC AAG TCA

751 S D V E I E L S L K R A N K S

2296 CGT CTT GAT ACT ATG CGT GTT GAG TTA AAC TGG GCA GAA GTA GGG

766 R L D T M R V E L N W A E V G

2341 GCT GAG TCA CTT AGC CTA TAC CGA AAT GGC GAA CTA GTA GAT ACC

781 A E S L S L Y R N G E L V D T

2386 GTA TCA GAT AAT GGC CGT TAC CGT GAT TAT GTG CGT AAC GCA ACA

796 V S D N G R Y R D Y V R N A T

2431 TTA CCG GCA TAC GAC TAT CAG TTA TGC GTA TCT GAA AAC GTA TGT

811 L P A Y D Y Q L C V S E N V C

2476 TCG AAT ATT ATT ACG GTT TCA TTT TCT GAA TAA

826 S N I I T V S F S E *

本发明适冷蛋白酶的基因mcp01克隆方法如下，步骤如下：

1、利用CTAB/NaCl法提取Pseudoomonas sp.SM9913的基因组DNA，

2、对蛋白酶MCP-01的N端和其自溶片段N端进行测序，根据测序结果设计两个兼并引物，

3、然后，利用PCR技术克隆编码蛋白酶MCP-01的基因的一部分，再根据获得的部分基因设计引物，

4、利用Tail PCR技术克隆已知部分的上游和下游序列，测序后进行拼接，最后得到一条2676bp的DNA片段，其中含有一个编码MCP-01的2508bp的开放阅读框架，起始密码子位于143bp，终止密码子位于2648bp，共编码835个氨基酸。

根据该开放阅读框架的两端设计引物，利用PCR从基因组DNA中克隆该基因并进行测序验证，结果证明克隆到的基因mcp01和利用PCR和Tail PCR技术克隆到的基因序列完全正确。

利用CDD分析软件对根据基因序列推导的氨基酸序列进行分析表明，蛋白酶MCP-01的前体的结构包括信号肽、N端结构域、催化结构域、连接区域、P-domain结构域、PKD结构域和C端区域七部分。

蛋白酶MCP-01的前体酶和成熟酶的结构如图6所示。根据成熟酶的N端序列和分子量(65.38kDa)推导出MCP-01的成熟酶包括催化结构域、连接区域、P-domain结构域、PKD结构域，是一个多结构域枯草杆菌素类蛋白酶。该类型蛋白酶目前尚无报道。我们将这种新型蛋白酶命名为deseasin。

本发明的优良效果：

本发明克隆的基因mcp01编码一种新型枯草杆菌素类蛋白酶deseasin MCP-01。deseasin MCP-01的成熟酶包括催化结构域、连接区域、P-domain结构域、PKD结构域等多个结构域，而以前报道的枯草杆菌素类蛋白酶的成熟酶都只有一个催化结构域。与其它的枯草杆菌素类蛋白酶相比，deseasin MCP-01不仅能切断裂P1位是疏水氨基酸的肽键，而且对P1位是碱性氨基酸的肽键具有很高的催化效率。由于PKD结构域可以结合不可溶性底物，MCP-01可能对不可溶性蛋白具有很好的降解效果，并且该酶是典型的适冷蛋白酶，最适酶活温度(35℃)较中温蛋白酶最适酶活温度(55℃)低20℃左右。因此，本发明克隆的基因mcp01编码的蛋白酶可以在食品加工、乳制品加工和洗涤剂等领域有很好的用途。

附图说明：

图1.通过PCR扩增克隆的MCP-01的部分基因片段的电泳图。1：扩增的DNA片段；2：DNA分子量marker.。

图2.通过TAIL PCR扩增的MCP-01的部分基因片段的上游临近DNA片段的电泳图。1：扩增的DNA片段；2：DNA分子量marker.

图3通过TAIL PCR扩增的MCP-01的部分基因片段的下游临近DNA片段的电泳图。1：DNA分子量marker；2：扩增的DNA片段。

图4..克隆的MCP-01的基因核苷酸序列及其编码的MCP-01的氨基酸序列。信号肽切割位点以及成熟酶N端和C端切割位点用箭头标示。终止子用星号表示。下划线部分是成熟酶序列。成熟酶的第一个氨基酸标号为+1。参与催化的三个氨基酸((D₄₉，H₁₀₄和S₂₆₉)用黑体标示。

图5.MCP-01的前体酶和成熟酶结构示意图。

图6.MCP-01与其它枯草杆菌素类蛋白酶序列比较进化树及其结构示意图。A：比较进化树，MCP-01在进化树中以标示，除MCP-01以外，其余12个deseasin蛋白酶基因都是从基因组序列中预测的；B：前体酶结构示意图。

具体实施方式

实施例1：

新型深海适冷蛋白酶deseasin MCP-01的编码基因片段序列如前所述的SEQ ID NO.1。基因中核苷酸与编码氨基酸对应关系亦如前所述。该基因组DNA片段共2676bp，其中含有一个2508bp的开放阅读框架编码蛋白酶deseasin MCP-01，起始密码子位于143bp，终止密码子位于2648bp，共编码835个氨基酸。

实施例2：本发明的基因片段克隆方法

菌种来源：假单胞菌Pseudomonas sp.SM9913在1855米深的海底沉积物中分离得到。参见陈秀兰等，“深海适冷菌SM9913产生的低温蛋白酶”，《海洋科学》2001年，第5卷，第1期，第4-8页。

具体方法如下：

1.MCP-01的纯化

(1)假单胞菌Pseudomonas sp.SM9913菌悬液按2％接种量接种于发酵培养基(玉米粉2％，麸皮1％，豆粕2％，Na₂HPO₄ 0.4％，K₂PO₄ 0.03％，CaCl₂ 0.1％，陈海水pH7.5)，50ml/500ml，12℃，180转/分钟，培养72小时。

(2)培养完毕，收集培养液，4℃下11000转/分钟离心15分钟，取上清液，在冰浴种边搅拌边加入硫酸铵粉末至55％饱和度，然后4℃下10000转/分钟离心1分钟，去上清，沉淀溶入50mM Tris-HCl缓冲液(pH8.5)中。

(3)4℃下11000转/分钟离心15分钟，将上清液装入透析袋，用50mM Tris-HCl缓冲液(pH8.5)透析20小时，然后用分子量20000的聚乙二醇浓缩。

(4)浓缩后的酶液上sephardex G100柱(1.6×100cm)进行分离纯化，用50mM Tris-HCl缓冲液(pH8.5)洗脱，流速8ml/h，用核酸蛋白检测仪在280nm下检测蛋白，用自动部分收集器进行收集，20分钟收集一管。

(5)用毛细管电泳检测含有蛋白的每一管收集液中MCP-01的含量及纯度。将纯的MCP-01溶液收集起来，保存于-20℃备用。

2.MCP-01分子量的测定

将纯化的MCP-01溶液用截留量3kDa超虑离心管浓缩至1mg/ml.送上海基康生物技术公司用MALDI-TOF质谱测定其分子量。

3.MCP-01及其自溶片段的N端测序。

(1)纯的MCP-01溶液在35℃保温1小时使其自溶，然后将纯的MCP-01和其自溶的片段一起电泳。电泳采用SDS-PAGE电泳，采用Bio-Rad公司的Mini-PROTEIN 3电泳装置，浓缩胶4％，分离胶12.5％，恒流15mA电泳1小时。

(2)将电泳胶中的MCP-01及其自溶片段电转至PVDF膜上。转膜采用Bio-Rad公司的电转移装置，操作按其说明书进行。

(3)用蛋白质序列自动分析仪测定转至膜上的MCP-01和其自溶片段的N端序列。

4.MCP-01编码基因的克隆

4.1假单胞菌Pseudomonas sp.SM9913基因组DNA的提取

参照《精编分子生物学实验指南》。

(1)培养50ml细菌培养物至饱和状态，取15ml的培养物12000g离心5min；

(2)沉淀物加入5670μl TE，用吸管反复吹打使之重悬。加入300μl 10％SDS和30μl20mg/mL蛋白酶K，混匀，37℃温育2.5-3h；

(3)加入1000μl 5M NaCl，充分混匀，再加入800μl CTAB/NaCl溶液，混匀，于65℃温育30-60min(从这一步开始可以除去多糖及其它污染的大分子)；

(4)加入等体积的氯仿/异戊醇(24∶1)，混匀，4℃，12000g离心20min，将上清液转入一个新管中，如难移出上清，先用牙签除去界面物质；

(5)加入等体积的氯仿/异戊醇(24∶1)，混匀，4℃，14000g离心30min，将上清转到一只新管中；

(6)加入等体积的氯仿/异戊醇(24∶1)，混匀，4℃，16000g离心30min，将上清转到一只新管中；

(7)加入0.6倍体积异丙醇，轻轻混合(缓慢上下颠倒3分钟)，置于4℃冰箱中保持10min，用一细弯玻棒将絮状沉淀沟出，转入一5ml的离心管中；

(8)用3ml的70％乙醇中洗涤2次，再用无水乙醇洗涤2次，各12000g离心2min，弃上清，超净工作台上风干(勿使沉淀完全干燥，否则极其难溶)；

(9)加入100-200μl TE缓冲液，4℃过夜溶解DNA；

(10)加10mg/ml RNase至终浓度为50ug/mL，37℃温育1h；

(11)加等体积酚/氯仿/异戊醇抽提1次，上清液再用氯仿/异戊醇抽提1次；

(12)向上清中加入1/10体积3M NaAc(pH5.2)和2倍体积预冷的无水乙醇，倒置混合；

(13)离心后轻轻弃去上清，DNA沉淀用70％乙醇和无水乙醇各洗涤1次，稍干后溶于适量TE buffer中，用紫外分光光度计测定DNA浓度及纯度后置于4℃冰箱保存(可于-20℃长期保存)。

4.2利用PCR克隆基因MCP-01的部分基因

(1)根据MCP-01的N端序列SATNDP和其一条自溶片段的N端序列AVDNDQ，设计两条兼并引物M1：TCNGCNACNAA(TC)GA(TC)CC，M2：TG(GA)TC(GA)TT(GA)TCNACNGC，由博亚生物技术公司合成。

(2)以M1和M2为引物，以基因组DNA为模板，做PCR扩增。PCR反应条件为：95℃，5分钟；然后95℃，1分钟；55℃，1分钟；72℃，2分钟，30个循环后，72℃，延伸10分钟。

(3)对PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，然后用Omega公司的DNA回收试剂盒按照其说明回收扩增DNA片段。

将回收DNA片段连接到Promega公司的pGEMT载体上。连接反应体系：

连接酶Buffer 1μl

载体pGEMT 1μl

外源DNA片段 3μl

T₄连接酶 1μl

补加ddH₂O 至10μl

盖紧盖子，手指轻弹离心管，混匀样品，在离心机上转2sec，把样品集中在管底，16℃水浴中连接过夜。

(4)按《分子克隆实验指南》上制备大肠杆菌感受态的方法制备大肠杆菌DH5α感受态。

(5)按《分子克隆实验指南》上的热激转化方法将连接好的重组pGEM-T载体转至大肠杆菌DH5α感受态。

(6)转化的大肠杆菌DH5α涂于含50μg/L氨苄青霉素的麦康凯培养基，37℃过夜培养，挑选白色转化子作为模板，用M1和M2作为引物，通过菌落PCR验证白色转化子中质粒是否含有PCR扩增的DNA片段。

(7)将质粒含有PCR扩增的DNA片段的转化子送上海生工生物技术有限公司测序。因此，获得MCP-01的部分基因序列620bp。

4.3利用TAIL PCR克隆基因MCP-01的全基因

(1)根据已经克隆到的MCP-01的620bp基因序列的5’和3’端序列分别设计3个特异引物和两个通用引物。引物序列如下：

N1：5’GCATCAATATCGGCATCAGCCG3’

N2：5’GCCACCAGTTTGGCCTTCGT3’

N3：5’AATCGCGGGTCGTTCGTGGC3’

C1：5’GCCAAGCGTTAGCTGATGCG3’

C2：5’TACGGCTAGTGAGCAAGCTG3’

C3：5’CGGGTAACGATGCGGTGGTC3’

AND：5’AAGCGTATG3’

ADC：5’GCAGCGTTA3’

引物由上海生工生物技术有限公司合成。

(2)采用TAIL PCR扩增已知的部分基因的两端临近序列。TAIL PCR的反应条件如下表。

PCR号	循环数	PCR反应条件
PCR号	循环数	PCR反应条件	第一次PCR第二次PCR第三次PCR	15110121121251	94℃，5min94℃，1min，58℃，1min，72℃，2.5min94℃，1min，30℃，2min，rise to 72℃withspeed of 0.3℃/s，72℃，2.5min94℃，30s，40℃，1min，72℃，2.5min94℃，30s，58℃，1min，72℃，2.5min94℃，30s，58℃，1min，72℃，2.5min94℃，30s，40℃，1min，72℃，2.5min72℃，10min94℃，30s，58℃，1min，72℃，2.5min94℃，30s，58℃，1min，72℃，2.5min94℃，30s，40℃，1min，72℃，2.5min72℃，10min94℃，30s，40℃，1min，72℃，1.5min72℃，10min

(3)TAIL PCR的扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，结果分别从已知序列两端扩增到约500bp和1500bp的DNA片段。

(4)将这两条DNA片段送上海生工生物技术有限公司测序。

(5)将这两条测序片段与PCR克隆的已知片段的序列进行拼接，得到一条2676bp的DNA片段，其中含有一个2508bp的编码MCP-01的完整开放阅读框架。

4.4对克隆的MCP-01基因的克隆与验证

(1)根据编码MCP-01的开放阅读框架的5’和3’端序列设计两个引物，引物序列如下：

MCPN：5’ATGAAAACAAAATTATCTATT3’

MCPC：5’TTATTCAGAAAATGAAACCGT3’

(2)以基因组DNA为模板，用PCR扩增MCP-01的完整基因。PCR反应条件为：95℃，5分钟；然后95℃，1分钟；50℃，1分钟；72℃，3分钟，30个循环后，72℃，延伸10分钟。

(3)将PCR扩增出的MCP-01基因插入pGEM-T载体，转化大肠杆菌DH5α，送上海生工生物技术有限公司测序。将测序结果与前面通过PCR和TAIL PCR克隆到的MCP-01基因序列进行对比，验证基因序列。

5.结果

通过对MCP-01及其自溶片段进行测序得到MCP-01及其一条自溶片段的N端序列。MCP-01的N端序列为SATNDP，其中一条自溶片段的N端序列为AVDNDQ。根据编码这两个序列的核酸序列设计引物，以基因组DNA为模板，通过PCR扩增克隆到一条620bp的DNA片段，编码MCP-01的部分基因(图1)。根据得到的DNA片段序列，设计引物，以基因组DNA为模板，通过TAIL PCR扩增已知DNA片段两端的临近序列，分别得到554bp和1622bp的DNA片段(图2，图3)，通过拼接得到一条2676bp的DNA序列，序列如SEQ ID N0.1所示。通过NCBI网站的blastX软件分析发现其中含有一个2508bp的编码MCP-01的开放阅读框架。以开放阅读框架的5’和3’端序列设计两个引物，以基因组DNA为模板，通过PCR扩增克隆到编码MCP-01的完整基因。对该基因序列进行测序结果证明与通过PCR和TAIL PCR克隆到的MCP-01基因序列完全一致。MCP-01的完整基因序列及其编码的氨基酸序列如图4所示。

利用NCBI网站的CDD软件分析MCP-01的结构，结果如图5所示，蛋白酶MCP-01的前体酶的结构包括信号肽，N端结构域、催化结构域、连接区域、P-domain结构域、PKD结构域和C端区域七部分。MCP-01成熟酶的N端序列是SATNDP，MALDI-TOF质谱测定其分子量为65.38kDa。因此，根据MCP-01成熟酶的N端序列和分子量推导出MCP-01的成熟酶包括催化结构域、连接区域、P-domain结构域、PKD结构域，是一个多结构域枯草杆菌素类蛋白酶。通过同源比对和构建进化树发现，MCP-01和其它12个从基因组中预测的蛋白酶结构相同，而与其它的枯草杆菌素类蛋白酶的结构差别很大(图6)。该类型蛋白酶目前尚无报道，MCP-01是第一个被分离纯化的该类型蛋白酶。

序列表

<110>山东大学

<120>一种适冷蛋白酶的基因mcp01及其制备方法

<140>

<141>

<160>1

<170>Patent In3.1

<210>1

<211>330

<212>DNA

<213>Pseudomonas sp.SM9913

<400>1

gttttgttcc tgattttgct ttttttactt gagttagtga cggattaccc gttttcttaa 60

cgcttgccac gtgattactt aaattcataa acgtaaatat ttcgcttagt aaagctaagt 120

taacttaatt acggatagaa caatgaaaac aaaattatct attattacac ttgcactttt 180

accttgttta gctgcggcta aattgcctga tgttaacagt acaactcaaa aagtaactgc 240

gagcagtgac tcgattattg ttaagtataa aaagaatgct tcgccgaaaa tgcgtaagca 300

agctcgttcg ttagtaaaag ccaaaatatc tgatctaaat aacgatgaaa ttgatgataa 360

cttcacctcg ttattttctg gccgcctcgc aaaatttaaa atatcaggaa tgagcgctaa 420

agaagcaatt gagcgcttaa aatcgcatca agctattgag tatgttgagc ctgattaccg 480

agtgagcata gcaagcgcaa cgaacgaccc gcgatttgac gatttatggg gcttaaacaa 540

cgaaggccaa actggtggca cggctgatgc cgatattgat gcaccagaag catggtcaat 600

ctctacaggt agtcgtgatg ttgtagtagg tgttattgat acgggtgttg attatagtca 660

ccctgattta gctgcgaacg cgtgggtaaa cagtggtgaa attgccggtg atggtatcga 720

taatgacgga aacggttaca ttgatgacgt tcacggtatt aatgcaatta ctgatgttgg 780

tgatccgatg gatgacgaag gccatggtac acacgtatcg ggtacaatcg gtgccagtgg 840

taacaatggt gtcggtgttg ttggtgtaaa ccatgatgtt tctattgttg gttgtaagtt 900

tttagccgca gatggtacag gttctacctc tggtgctatt aagtgtatcg attacatggt 960

tggccttaaa aatgcgggtg ttaatctgcg tgtgttaaat aatagctggg gcggcggtgg 1020

ttttagccaa gcgttagctg atgcgattac ggctagtgag caagctgata ttttatttgt 1080

tgctgctgcg ggtaacgatg cggttgataa cgatcaaaat ccacactacc catctaatta 1140

tgaaaacgac aacgtattat cgatagctag tactgatagc agagataata tgtctagctt 1200

ttctcaatgg ggcctaacaa gtgttgatat gggcgcacct ggctcaggta ttttgtcgac 1260

cgttcctggt aatagctatg ctacttattc aggtacatct atggcaacac cgcatgtagc 1320

tggtgctgct gcacttgtac tttcagttaa tcctgattta acaacactag agcttaaaga 1380

attacttatg tctagtggtg atgctaatgc ggcattaaat ggtaaaacgg ttgcaggtac 1440

acgcctaaat gttaaccaag cgctaattga tgctgatcca actccaggct ttaaattatc 1500

tgtatcgccg gtttctcagc aagcgactgt aggtgatacg gttacttata cctttacgat 1560

tggctcaatt gcacaatggg aaggtgacgt ttcactggct ttagcttcag atcttaccga 1620

tgcatcacta agcgcaacta ccgctcgtcc gggcgatgaa gttgttctaa cggttgcaac 1680

taacagcgat actcagtggg gaaattacga ctttactgtt accgcaacaa ctgaagagca 1740

agttaaagaa caaactgtta gcttaatgct tcaacctgct ggtttaaatg actttactta 1800

cagcagtgat gaaaacatcg ctattccaga taattctcca gagggcgcaa gctcagttat 1860

tacggttgct gatgatttaa ctatttttgg caccactgct gatgtagata ttacgcatac 1920

ttggtctggt gacttagtac ttacgcttat ttcagcgcaa ggtacagaag taactttaca 1980

aagcaatgaa ggtggcagtg cagacgatat tgttaagtca tttacatcaa gcgtatttaa 2040

ttctgaagtg gcaaccggag attggacact tcatgttgaa gatacagctg gtgcagatac 2100

gggtaatatc aatggttggt cacttacatt tagcgctatt ggtgaggtaa gcccacaacc 2160

accacaagct ggctttagtg tttcagcaca aggtttaact gctacatttg taggtacaag 2220

tcgtgatgta aatgatgaca tttcacagtg gagctggaac tttggtgatg gttcaacatc 2280

aacaaaccca aatcctacac atgtttacgc tcagtcagga agttatgagg ttgaattaac 2340

cgtaacggat agtgaaaata actcagatac attcactcaa acagtggttg ttagtgatgt 2400

tgaaattgaa ttgagcttaa aacgcgctaa caagtcacgt cttgatacta tgcgtgttga 2460

gttaaactgg gcagaagtag gggctgagtc acttagccta taccgaaatg gcgaactagt 2520

agataccgta tcagataatg gccgttaccg tgattatgtg cgtaacgcaa cattaccggc 2580

atacgactat cagttatgcg tatctgaaaa cgtatgttcg aatattatta cggtttcatt 2640

ttctgaataa aacgtttacc ccttagacat tcaaag 2676

Claims

1、含有深海适冷蛋白酶基因mcp01的基因组DNA片段，具有如下序列：

gttttgttcc tgattttgct ttttttactt gagttagtga cggattaccc gttttcttaa 60

cgcttgccac gtgattactt aaattcataa acgtaaatat ttcgcttagt aaagctaagt 120

taacttaatt acggatagaa caatgaaaac aaaattatct attattacac ttgcactttt 180

accttgttta gctgcggcta aattgcctga tgttaacagt acaactcaaa aagtaactgc 240

gagcagtgac tcgattattg ttaagtataa aaagaatgct tcgccgaaaa tgcgtaagca 300

agctcgttcg ttagtaaaag ccaaaatatc tgatctaaat aacgatgaaa ttgatgataa 360

cttcacctcg ttattttctg gccgcctcgc aaaatttaaa atatcaggaa tgagcgctaa 420

agaagcaatt gagcgcttaa aatcgcatca agctattgag tatgttgagc ctgattaccg 480

agtgagcata gcaagcgcaa cgaacgaccc gcgatttgac gatttatggg gcttaaacaa 540

cgaaggccaa actggtggca cggctgatgc cgatattgat gcaccagaag catggtcaat 600

ctctacaggt agtcgtgatg ttgtagtagg tgttattgat acgggtgttg attatagtca 660

ccctgattta gctgcgaacg cgtgggtaaa cagtggtgaa attgccggtg atggtatcga 720

taatgacgga aacggttaca ttgatgacgt tcacggtatt aatgcaatta ctgatgttgg 780

tgatccgatg gatgacgaag gccatggtac acacgtatcg ggtacaatcg gtgccagtgg 840

taacaatggt gtcggtgttg ttggtgtaaa ccatgatgtt tctattgttg gttgtaagtt 900

tttagccgca gatggtacag gttctacctc tggtgctatt aagtgtatcg attacatggt 960

tggccttaaa aatgcgggtg ttaatctgcg tgtgttaaat aatagctggg gcggcggtgg 1020

ttttagccaa gcgttagctg atgcgattac ggctagtgag caagctgata ttttatttgt 1080

tgctgctgcg ggtaacgatg cggttgataa cgatcaaaat ccacactacc catctaatta 1140

tgaaaacgac aacgtattat cgatagctag tactgatagc agagataata tgtctagctt 1200

ttctcaatgg ggcctaacaa gtgttgatat gggcgcacct ggctcaggta ttttgtcgac 1260

cgttcctggt aatagctatg ctacttattc aggtacatct atggcaacac cgcatgtagc 1320

tggtgctgct gcacttgtac tttcagttaa tcctgattta acaacactag agcttaaaga 1380

attacttatg tctagtggtg atgctaatgc ggcattaaat ggtaaaacgg ttgcaggtac 1440

acgcctaaat gttaaccaag cgctaattga tgctgatcca actccaggct ttaaattatc 1500

tgtatcgccg gtttctcagc aagcgactgt aggtgatacg gttacttata cctttacgat 1560

tggctcaatt gcacaatggg aaggtgacgt ttcactggct ttagcttcag atcttaccga 1620

tgcatcacta agcgcaacta ccgctcgtcc gggcgatgaa gttgttctaa cggttgcaac 1680

taacagcgat actcagtggg gaaattacga ctttactgtt accgcaacaa ctgaagagca 1740

agttaaagaa caaactgtta gcttaatgct tcaacctgct ggtttaaatg actttactta 1800

cagcagtgat gaaaacatcg ctattccaga taattctcca gagggcgcaa gctcagttat 1860

tacggttgct gatgatttaa ctatttttgg caccactgct gatgtagata ttacgcatac 1920

ttggtctggt gacttagtac ttacgcttat ttcagcgcaa ggtacagaag taactttaca 1980

aagcaatgaa ggtggcagtg cagacgatat tgttaagtca tttacatcaa gcgtatttaa 2040

ttctgaagtg gcaaccggag attggacact tcatgttgaa gatacagctg gtgcagatac 2100

gggtaatatc aatggttggt cacttacatt tagcgctatt ggtgaggtaa gcccacaacc 2160

accacaagct ggctttagtg tttcagcaca aggtttaact gctacatttg taggtacaag 2220

tcgtgatgta aatgatgaca tttcacagtg gagctggaac tttggtgatg gttcaacatc 2280

aacaaaccca aatcctacac atgtttacgc tcagtcagga agttatgagg ttgaattaac 2340

cgtaacggat agtgaaaata actcagatac attcactcaa acagtggttg ttagtgatgt 2400

tgaaattgaa ttgagcttaa aacgcgctaa caagtcacgt cttgatacta tgcgtgttga 2460

gttaaactgg gcagaagtag gggctgagtc acttagccta taccgaaatg gcgaactagt 2520

agataccgta tcagataatg gccgttaccg tgattatgtg cgtaacgcaa cattaccggc 2580

atacgactat cagttatgcg tatctgaaaa cgtatgttcg aatattatta cggtttcatt 2640

ttctgaataa aacgtttacc ccttagacat tcaaag 2676。

2、如权利要求1的蛋白酶基因mcp01的基因组DNA片段，其特征在于其中含有一个具有2508个核苷酸的开放阅读框架，该开放阅读框架是编码蛋白酶MCP-01的基因，起始密码子位于143bp，终止密码子位于2648bp，共编码氨基酸835个。

3、如权利要求2所述的蛋白酶基因mcp01的基因组DNA片段，其特征在于所述的蛋白酶MCP-01的前体的结构包括信号肽、N端结构域、催化结构域、连接区域、P-domain结构域、PKD结构域和C端区域七部分。

4、如权利要求2所述的蛋白酶基因mcp01的基因组DNA片段，其特征在于所述的蛋白酶MCP-01的成熟酶包括催化结构域、连接区域、P-domain结构域、PKD结构域，是一个多结构域枯草杆菌素类蛋白酶。

5、如权利要求2所述的蛋白酶基因mcp01的基因组DNA片段，其特征在于所述的蛋白酶MCP-01的最适酶活温度为35℃左右，最适pH为9.0。

6、适冷蛋白酶的基因mcp01克隆方法，步骤如下：

(1)利用CTAB/NaCl法提取Pseudoomonas sp.SM9913的基因组DNA，

(2)对蛋白酶MCP-01的N端和其自溶片段N端进行测序，根据测序结果设计两个兼并引物，

(3)然后，利用PCR技术克隆编码蛋白酶MCP-01的基因的一部分，再根据获得的部分基因设计引物，

(4)利用Tail PCR技术克隆已知部分的上游和下游序列，测序后进行拼接，最后得到一条权利要求1所述序列的2676bp的DNA片段，其中含有一个编码MCP-01的2508bp的开放阅读框架，起始密码子位于143bp，终止密码子位于2648bp，共编码835个氨基酸。

7、如权利要求6所述的适冷蛋白酶的基因mcp01克隆方法，其特征在于，步骤(2)所述的两个兼并引物是M1：TCNGCNACNAA(TC)GA(TC)CC，M2：TG(GA)TC(GA)TT(GA)TCNACNGC。

8、如权利要求6所述的适冷蛋白酶的基因mcp01克隆方法，其特征在于，步骤(3)是根据已经克隆到的MCP-01的620bp基因序列的5’和3’端序列分别设计3个特异引物和两个通用引物，引物序列如下：

N1：5’GCATCAATATCGGCATCAGCCG 3’

N2：5’GCCACCAGTTTGGCCTTCGT 3’

N3：5’AATCGCGGGTCGTTCGTGGC 3’

C1：5’GCCAAGCGTTAGCTGATGCG 3’

C2：5’TACGGCTAGTGAGCAAGCTG 3’

C3：5’CGGGTAACGATGCGGTGGTC 3’

AND：5’AAGCGTATG 3’

ADC：5’GCAGCGTTA 3’。