CN104450866A - 一种分泌型脂肪酶基因工程菌的膜印迹高通量筛选方法 - Google Patents
一种分泌型脂肪酶基因工程菌的膜印迹高通量筛选方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN104450866A CN104450866A CN201410576815.4A CN201410576815A CN104450866A CN 104450866 A CN104450866 A CN 104450866A CN 201410576815 A CN201410576815 A CN 201410576815A CN 104450866 A CN104450866 A CN 104450866A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- membrane
- lipase
- genetically engineered
- throughput screening
- engineered bacteria
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 239000012528 membrane Substances 0.000 title claims abstract description 127
- 108090001060 Lipase Proteins 0.000 title claims abstract description 91
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 title claims abstract description 54
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 38
- 238000013537 high throughput screening Methods 0.000 title claims abstract description 33
- 239000004367 Lipase Substances 0.000 claims abstract description 89
- 102000004882 Lipase Human genes 0.000 claims abstract description 85
- 235000019421 lipase Nutrition 0.000 claims abstract description 85
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 57
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims abstract description 14
- 230000006698 induction Effects 0.000 claims abstract description 12
- 238000011068 loading method Methods 0.000 claims abstract description 3
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims description 33
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims description 23
- LHYQAEFVHIZFLR-UHFFFAOYSA-L 4-(4-diazonio-3-methoxyphenyl)-2-methoxybenzenediazonium;dichloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].C1=C([N+]#N)C(OC)=CC(C=2C=C(OC)C([N+]#N)=CC=2)=C1 LHYQAEFVHIZFLR-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 20
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 20
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 claims description 18
- -1 naphthyl ester Chemical class 0.000 claims description 16
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 claims description 16
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 claims description 15
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 14
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 claims description 13
- 238000011161 development Methods 0.000 claims description 13
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 13
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 13
- 241000235058 Komagataella pastoris Species 0.000 claims description 10
- 239000002033 PVDF binder Substances 0.000 claims description 10
- 239000007640 basal medium Substances 0.000 claims description 10
- 229920002981 polyvinylidene fluoride Polymers 0.000 claims description 10
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims description 10
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 claims description 9
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 claims description 9
- 241001506991 Komagataella phaffii GS115 Species 0.000 claims description 8
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 claims description 8
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 7
- 229920002301 cellulose acetate Polymers 0.000 claims description 7
- 239000011148 porous material Substances 0.000 claims description 6
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 5
- IAKVKXNIMLQHPA-UHFFFAOYSA-N naphthalen-1-yl hexadecanoate Chemical compound C1=CC=C2C(OC(=O)CCCCCCCCCCCCCCC)=CC=CC2=C1 IAKVKXNIMLQHPA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims description 5
- 239000008055 phosphate buffer solution Substances 0.000 claims description 4
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 claims description 3
- 238000013016 damping Methods 0.000 claims 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 claims 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 claims 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 abstract description 12
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 abstract description 5
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 abstract description 2
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 abstract description 2
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 abstract description 2
- 230000028327 secretion Effects 0.000 abstract 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 19
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 19
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 19
- 101000968489 Rhizomucor miehei Lipase Proteins 0.000 description 9
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 9
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 9
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 8
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 8
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 7
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 4
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 4
- 241000235648 Pichia Species 0.000 description 3
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 3
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 3
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 3
- 238000011426 transformation method Methods 0.000 description 3
- 241000235402 Rhizomucor Species 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 239000010408 film Substances 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 230000003301 hydrolyzing effect Effects 0.000 description 2
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 2
- BTJIUGUIPKRLHP-UHFFFAOYSA-N 4-nitrophenol Chemical compound OC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 BTJIUGUIPKRLHP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000620209 Escherichia coli DH5[alpha] Species 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 1
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 1
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 1
- 101000702488 Rattus norvegicus High affinity cationic amino acid transporter 1 Proteins 0.000 description 1
- 241000235403 Rhizomucor miehei Species 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- 239000003225 biodiesel Substances 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 1
- 238000007036 catalytic synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 235000013351 cheese Nutrition 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 229940079919 digestives enzyme preparation Drugs 0.000 description 1
- 239000003995 emulsifying agent Substances 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 description 1
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 1
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 239000003262 industrial enzyme Substances 0.000 description 1
- 239000010985 leather Substances 0.000 description 1
- 235000019626 lipase activity Nutrition 0.000 description 1
- 230000004130 lipolysis Effects 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- UFWIBTONFRDIAS-UHFFFAOYSA-N naphthalene-acid Natural products C1=CC=CC2=CC=CC=C21 UFWIBTONFRDIAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 1
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 1
- 230000035699 permeability Effects 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 238000003892 spreading Methods 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 239000010409 thin film Substances 0.000 description 1
- 238000005809 transesterification reaction Methods 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明公开一种分泌型脂肪酶基因工程菌的膜印迹高通量筛选方法。本发明是利用负载膜将所筛选菌株接种到印迹膜上进行诱导培养，所分泌的脂肪酶结合到印迹膜，再利用脂肪酶催化酯类水解的产物可与显色剂显色的原理对分泌型脂肪酶基因工程菌进行高通量筛选。本发明可筛选到具有特殊性能的分泌型脂肪酶基因工程菌，尤其是耐高温、耐甲醇等脂肪酶基因工程菌株。本发明可对大量脂肪酶工程菌突变库进行高通量筛选，在获得筛选高效性的同时，保证了亚克隆库的完整性，以便于实现对亚克隆库多种条件下的筛选，适用范围广，操作简单便捷，结果准确。
Description
技术领域：
本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种分泌型脂肪酶基因工程菌的膜印迹高通量筛选方法。
背景技术：
脂肪酶是重要的工业酶制剂之一，可以催化脂解、酯交换、酯合成等反应，广泛应用于食品行业，造纸行业，皮革行业，饲料行业，医药催化合成，油脂奶酪加工及生物柴油生产等行业。然而，脂肪酶本身是一种蛋白质，必须在一定的条件下才能发挥其催化作用，一旦外界条件诸如温度、pH及有机溶剂浓度等改变的情况下就容易失活。为了获得酶活力更高、性能更加稳定的脂肪酶，目前研究人员通常采用分子进化、定点突变等方法对脂肪酶进行改造，而这些方法都涉及脂肪酶突变文库的构建及高通量筛选等步骤。一种高效的高通量筛选方法是保证突变文库顺利进行筛选的关键因素。
目前通常的脂肪酶高通量筛选方法是指示剂显色法及水解圈法。这些方法涉及粗酶大量发酵及酶活力测定等步骤，工作量大，耗费时间长。已有改进方法是对硝基苯酚显色法，通过将对硝基苯酚酯直接铺在突变库菌株的表面，再根据颜色反应筛选脂肪酶活力高的菌株。该方法虽在筛选效率上有所提高，但是这些方法在保证亚克隆库的完整性及特殊条件下的筛选(如高甲醇浓度、高pH等)存在着一定的局限性。因此，迫切需要获得一种新型脂肪酶基因工程菌株的高通量筛选方法，既要保证筛选的高效性，又要保证亚克隆库的完整性，以便于实现对亚克隆库多种条件下的筛选。
发明内容：
本发明的目的是提供一种分泌型脂肪酶基因工程菌的膜印迹高通量筛选方法。该方法能够筛选具有特殊性能的如耐高温、耐甲醇及产酶活力高的分泌型脂肪酶基因工程菌。
本发明的分泌型脂肪酶基因工程菌的膜印迹高通量筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)、将分泌型脂肪酶基因工程菌接种到基础培养基上进行培养，所述的分泌型脂肪酶基因工程菌含有能够表达脂肪酶的表达载体，该表达载体上含有正常的或者经过突变的脂肪酶基因表达盒；
(2)、将负载膜平置于步骤(1)中的接种有分泌型脂肪酶基因工程菌的基础培养基上，使所有分泌型脂肪酶基因工程菌的菌落转移到负载膜上；
(3)、将印迹膜放置在诱导培养基上，再将步骤(2)中转移了菌落的负载膜的含菌落面正面朝向上置于印迹膜上，并根据被筛选工程菌菌株的最佳生长温度进行诱导培养，直到分泌型脂肪酶基因工程菌中的脂肪酶基因充分表达；
(4)、将步骤(3)中的印迹膜取出，用缓冲液充分清洗，洗膜结束后将印迹膜取出，将其浸在显色溶液中，静置一段时间直至颜色显现，将印迹膜取出，再用缓冲液充分清洗；
(5)、观测印迹膜的显色情况，所显颜色越深说明其菌株所产脂肪酶活力越高，根据印迹膜上颜色较深点的相应位置确定在已保存的基础培养基上表达该脂肪酶的相应位置。
所述的分泌型脂肪酶基因工程菌，优选为酵母或细菌。
所述的酵母，优选为毕赤酵母。
所述的毕赤酵母，优选为毕赤酵母GS115或毕赤酵母X33。
所述的能够表达脂肪酶的表达载体，优选为酵母表达载体，所述的酵母表达载体为能将 蛋白分泌到胞外的表达载体。
所述的酵母表达载体，优选为酵母表达载体pPIC9K或酵母表达载体pPICZaA。
所述的基础培养基为相应菌株的最适生长培养基，优选为MD固定培养基或YPD固体培养基。
所述的负载膜为能在菌落转移中起负载作用并能够支撑菌株生长的薄膜，优选为醋酸纤维素膜或滤纸膜，负载膜的大小与培养皿相适应。
所述的印迹膜为具有一定通透性、菌株能够透过其吸取下层营养物质且能够高效吸附分泌蛋白的薄膜，优选为硝酸纤维素膜、尼龙膜或PVDF膜，所述的印迹膜，其孔径大小优选为0.22～0.45μm，印迹膜的大小与培养皿相适应。
所述的诱导培养基为分泌型脂肪酶基因工程菌表达脂肪酶的培养基，优选为添加了0.5～1％甲醇的BMMY培养基。
配制好液体的基础培养基及诱导培养基后分别倒入培养皿中形成固体培养基，所述的培养皿为方形或圆形，优选为圆形，直径大小为5～15mm，优选为9mm。
步骤(3)中所述的诱导培养，诱导时间优选为12～48h。
所述的缓冲液为具有合适pH值、乳化剂等能够使目的脂肪酶稳定的缓冲液，优选为添加了0.75mg/mL NaCl、1％Trriton X-100的pH8.0磷酸缓冲液。
所述的显色溶液为一种能够被脂肪酶水解的酯类和一种能够与该酯类显色的显色剂组合，优选为：fastblue RR萘酯水溶液或fastblue B萘基棕榈酸酯水溶液，所述的fastblue RR萘酯水溶液含萘酯0.4mg/ml，fastblue RR 0.2mg/ml，所述的fastblue B萘基棕榈酸酯水溶液含萘酯0.6mg/ml，fastblue B 0.2mg/ml。
优选，在步骤(3)和(4)之间还包括步骤：将印迹膜置于高温下及高浓度的有机溶液中进行处理，从而在之后的步骤中获得该温度下及该浓度的有机溶液下酶活稳定的脂肪酶及其菌株。
所述的将印迹膜置于高温下，优选温度为不低于55℃，所述的高浓度的有机溶液，优选为55％的甲醇水溶液。
本发明中涉及到印迹膜的显色，显色原理为：脂肪酶与能被其水解的酯类发生作用，生成能与显色剂进行显色的物质，通过颜色作为初步筛选的依据。
本发明的优点在于：
(1)、可高通量地筛选分泌型脂肪酶的基因工程菌，更优选的，能够高通量筛选到具备特殊性能脂肪酶基因工程菌；
(2)、方便快捷，节约成本，结果灵敏准确；
(3)、本发明的方法不涉及对菌株进行直接添加化学物质，不会影响菌株的生长及活性，保证亚克隆库的完整性，以便于实现对亚克隆库多种条件下的筛选；
(4)、本发明操作步骤简单，材料价格低廉容易获得；
(5)、本发明适用范围广泛，适用于细菌、酵母、真菌等。
附图说明：
图1是本发明的分泌型脂肪酶基因工程菌的膜印迹高通量筛选方法的示意图，其中(1)为在基础培养基上放置负载膜(左侧，浅蓝色表示)，在诱导培养基上放置印迹膜(右侧，黄色表示)；(2)将负载膜180°翻转使菌落面正面朝上并转移到印迹膜上，并进行诱导培养，菌株产生的脂肪酶印迹到印迹膜上；(3)培养结束后将带有脂肪酶的印迹膜转移到另一 个器皿中；(4)在膜上分别添加缓冲液、甲醇及显色溶液处理；(4)染色结果，颜色深的为阳性克隆；
图2是对不同产酶能力大小的分泌型脂肪酶基因工程菌的筛选结果，其中，1～6为不同产脂肪酶活力的米黑根毛霉脂肪酶基因酵母工程菌，9K为将pPIC9K质粒转化到毕赤酵母GS115的基因工程菌，作为阴性对照；
图3是对脂肪酶突变文库进行高通量筛选的结果，箭头所示A1～A5菌株为所挑选的产脂肪酶能力较大的基因工程菌菌株；
图4是在脂肪酶基因工程菌突变文库中对耐高温脂肪酶基因工程菌菌株进行高通量筛选的结果，箭头所示B1及B2菌株为所挑选的耐高温脂肪酶基因工程菌菌株；
图5是在脂肪酶基因工程菌突变文库中对耐甲醇脂肪酶基因工程菌菌株进行高通量筛选的结果，箭头所示C1～C6菌株为所挑选的耐甲醇脂肪酶基因工程菌菌株。
具体实施方式：
以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
MD固体培养基、YPD固体培养基、BMMY固体培养基、磷酸缓冲液的配制方法为现有技术。
质粒pPIC9K、毕赤酵母GS115、毕赤酵母X33均购自LifeTechnologies公司。
滤纸膜、硝酸纤维素膜、尼龙膜、醋酸纤维素膜及PVDF膜均购自上海生物工程股份有限公司。
其他没有详细说明的技术步骤均为本领域人员所熟知的方法。
实施例1：不同产酶活力的脂肪酶基因工程菌的筛选
将米黑根毛霉脂肪酶基因rml与pPIC9K质粒同时用EcoR I及Not I双酶切，用T4连接酶进行连接，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，将转化后细胞涂布于含有100ug/mL氨苄青霉素的LB平板中，37℃倒置培养12～16h后从平板上挑取2～5个单菌落，接种于LB液体培养基中，37℃、250r/min振摇过夜。用质粒试剂盒进行质粒DNA的小量提取，用EcoRI及Not I双酶切鉴定，获得连接成功的pPIC9K-rml质粒。将pPIC9K-rml质粒用SalⅠ进行线性化并电转化至宿主菌毕赤酵母GS115上，涂布于MD平板上，28℃培养2-3d后获得产酶能力大小不同的米黑根毛霉脂肪酶基因酵母工程菌菌株。
将产酶能力大小不同的6个米黑根毛霉脂肪酶基因酵母工程菌菌株(见表1)及已转化了pPIC9K质粒的毕赤酵母GS115工程菌菌株(作为阴性对照)，分别接种于含有MD固体培养基的直径为9mm的培养皿上，30℃培养至长出相应单菌落；将直径为9mm的滤纸膜平置于MD固体培养基上，用涂布棒轻压使滤纸膜完全湿润并赶尽气泡，使所有菌落转移到滤纸膜上，将该MD固体培养基平板置于4℃保存；在另一个直径为9mm的培养皿的添加了0.5％甲醇的BMMY固体培养基平板上平置一张同样大小的孔径为0.2μm的硝酸纤维素膜，赶出气泡；将转移了菌落的滤纸膜的菌落面正面朝上置于硝酸纤维素膜上，赶出气泡，在30℃下诱导培养36h；培养结束后将下层的硝酸纤维素膜取出，用含0.75mg/mL NaCl、1％Trriton X-100的pH8.0磷酸缓冲液洗膜5min，重复3次，洗膜结束后将硝酸纤维素膜取出，将其浸在fastblue RR萘酯水溶液(含萘酯0.4mg/ml，fastblue RR 0.2mg/m)中进行显色，静置一段时间直至显色，再将硝酸纤维素膜取出，同样用含0.75mg/mL NaCl、1％Trriton X-100的pH8.0磷酸缓冲洗膜5min；观测硝酸纤维素膜的显色情况，如图2所示，显紫色的为阳性克隆的产酶能力大小不同的6个米黑根毛霉脂肪酶基因酵母工程菌菌株的蛋白印迹，而阴性对照并没 有显色，紫色圈大小与菌落的产酶能力相符。
表1.产酶能力大小不同的6个米黑根毛霉脂肪酶基因酵母工程菌菌株
实施例2：脂肪酶基因工程菌突变文库的高通量筛选
通过易错PCR的方法对米黑根毛霉脂肪酶基因进行改造并将其转化到毕赤酵母X33中，转化方法同实施例1中所述，将转化后的毕赤酵母X33接种于含有YPD固体培养基的直径为9mm的培养皿上，30℃培养获得米黑根毛霉脂肪酶毕赤酵母基因工程菌突变文库。将直径为9mm的醋酸纤维素膜平置于YPD固体培养基上，用涂布棒轻压使滤纸膜完全湿润并赶尽气泡，使所有菌落转移到醋酸纤维素膜上，将该YPD固体培养基平板置于4℃保存；在另一个直径为9mm的培养皿的添加了1％甲醇的BMMY固体培养基平板上置一张同样大小的孔径为0.45μm的尼龙膜，赶出气泡；将转移了菌落的醋酸纤维素膜的菌落面正面朝上置于尼龙膜上，赶出气泡，在30℃下诱导培养12h。培养结束后将下层的尼龙取出，用含0.75mg/mL NaCl、1％Trriton X-100的pH8.0磷酸缓冲液洗膜5min，重复3次，洗膜结束后将尼龙膜取出，将其浸在fastblue B萘基棕榈酸酯水溶液(含萘酯0.6mg/ml，fastblue B 0.2mg/ml)中进行显色，静置一段时间直至显色，再将尼龙膜取出，同样用含0.75mg/mL NaCl、1％Trriton X-100的pH8.0磷酸缓冲洗膜5min；观测尼龙膜的显色情况，根据获得显色较深点的相应位置确定在已保存的醋酸纤维素膜上表达该脂肪酶工程菌的相应位置。如图3所示，A1～A5号 菌株对应的显色较深。选取A1～A5号菌株接种并测定其产脂肪酶能力，结果见表2，所筛选的菌株产酶活力在32～45UI/mL之间，相比母本均有所提高，证明了本实施例中的方法能够有效地对脂肪酶基因工程菌突变文库中产脂肪酶活力高的菌株进行有效的筛选。
表2.高酶活脂肪酶基因工程菌突变文库高通量筛选验证
实施例3：耐高温脂肪酶基因工程菌的高通量筛选
通过易错PCR的方法对米黑根毛霉脂肪酶基因进行改造并将其转化到毕赤酵母GS115中，转化方法同实施例1中所述，将转化后的毕赤酵母GS115接种于含有MD固体培养基的直径为9mm的培养皿上，30℃培养获得米黑根毛霉脂肪酶毕赤酵母基因工程菌突变文库。将直径为9mm的滤纸膜平置于MD固体培养基上，用涂布棒轻压使滤纸膜完全湿润并赶尽气泡，使所有菌落转移到PVDF膜上，将该MD固体培养基平板置于4℃保存；在另一个直径为9mm的培养皿的添加了0.5％甲醇的BMMY固体培养基平板上置一张同样大小的孔径为0.22μm的PVDF膜，赶出气泡；将转移了菌落的醋酸纤维素膜的菌落面正面朝上置于PVDF膜上，赶出气泡，在30℃下诱导培养48h，诱导培养结束后将下层的PVDF膜取出，置于55℃热处理60min，冰上放置15min后用含0.75mg/mL NaCl、1％Trriton X-100的pH8.0磷酸缓冲液洗膜5min，重复3次，洗膜结束后将PVDF膜取出，将其浸在fastblue RR萘酯水溶液(含萘酯0.4mg/ml，fastblue RR 0.2mg/m)中进行显色，静置一段时间直至显色，再将PVDF 膜取出，同样用含0.75mg/mL NaCl、1％Trriton X-100的pH8.0磷酸缓冲洗膜5min；观测PVDF膜的显色情况，根据获得水解活力高的酶的相应位置确定在已保存的MD固体培养基平板上表达该脂肪酶工程菌的相应位置。如图4所示，经高温处理后，B1及B2菌株仍具有一定酶活，说明其可能具有一定的耐热能力。选取B1、B2号菌株接种及诱导表达，对其所产脂肪酶进行55℃、60min热处理，测定其耐热能力，实验结果如表3所示。结果表明，所筛选到的两个菌株在高温处理后所残存酶活力高于母本，证明了本实施例的方法能够有效地筛选到耐高温脂肪酶基因工程菌。
表3.耐高温脂肪酶突变文库高通量筛选验证
实施例4：耐甲醇脂肪酶基因工程菌的高通量筛选
通过易错PCR的方法对米黑根毛霉脂肪酶基因进行改造并将其转化到毕赤酵母GS115中，转化方法同实施例1中所述，将转化后的毕赤酵母GS115接种于含有MD固体培养基的直径为9mm的培养皿上，30℃培养获得米黑根毛霉脂肪酶毕赤酵母基因工程菌突变文库。将直径为9mm的滤纸膜平置于MD固体培养基上，用涂布棒轻压使滤纸膜完全湿润并赶尽气泡，使所有菌落转移到滤纸膜上，将该MD固体培养基平板置于4℃保存；在另一个直径为9mm的培养皿的添加了1％甲醇的BMMY固体培养基平板上置一张同样大小的孔径为 0.22μm的硝酸纤维素膜，赶出气泡；将转移了菌落的滤纸膜的菌落面正面朝上置于硝酸纤维素膜上，赶出气泡，在30℃下诱导培养36h。诱导培养结束后将下层的硝酸纤维素膜取出，用含0.75mg/mL NaCl、1％Triton X-100的pH8.0磷酸缓冲液洗膜5min，重复三次。洗膜结束后用55％的甲醇水溶液处理1h。将硝酸纤维素膜从甲醇水溶液中取出用含0.75mg/mL NaCl、1％Triton X-100的pH8.0磷酸缓冲液洗膜5min。将硝酸纤维素膜浸在fastblue RR萘酯水溶液(含萘酯0.4mg/ml，fastblue RR 0.2mg/m)上进行显色，静置一段时间直至显色。再将硝酸纤维素膜取出，同样用含0.75mg/mL NaCl、1％Trriton X-100的pH8.0磷酸缓冲洗膜5min。观测硝酸纤维素膜的显色情况，根据获得水解活力高的酶的相应位置确定在已保存的MD平板上表达该脂肪酶工程菌的相应位置。如图5所示，经高浓度甲醇处理后，C1～C6菌株仍具有一定酶活，说明其可能具有一定的耐甲醇能力。选取C1～C6号菌株接种及诱导表达，对其所产脂肪酶进行55％甲醇、60min热处理，测定其耐甲醇能力。结果表明，所筛选到的6个菌株在高浓度甲醇处理后所残存酶活力要远远高于母本，证明了本方法能够有效地筛选到耐甲醇脂肪酶基因工程菌。
Claims (10)
1.一种分泌型脂肪酶基因工程菌的膜印迹高通量筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将分泌型脂肪酶基因工程菌接种到基础培养基上进行培养，所述的分泌型脂肪酶基因工程菌含有能够表达脂肪酶的表达载体，该表达载体上含有正常的或者经过突变的脂肪酶基因表达盒；
(2)、将负载膜平置于步骤(1)中的接种有分泌型脂肪酶基因工程菌的基础培养基上，使所有分泌型脂肪酶基因工程菌的菌落转移到负载膜上；
(3)、将印迹膜放置在诱导培养基上，再将步骤(2)中转移了菌落的负载膜的含菌落面正面朝向上置于印迹膜上，并在一定温度下诱导培养，直到分泌型脂肪酶基因工程菌中的脂肪酶基因充分表达；
(4)、将步骤(3)中的印迹膜取出，用缓冲液充分清洗，洗膜结束后将印迹膜取出，将其浸在显色溶液中，静置一段时间直至颜色显现，将印迹膜取出，再用缓冲液充分清洗；
(5)、观测印迹膜的显色情况，所显颜色越深说明其菌株所产脂肪酶活力越高，根据印迹膜上颜色较深点的相应位置确定在已保存的基础培养基上表达该脂肪酶的的相应位置。
2.根据权利要求1所述的分泌型脂肪酶基因工程菌的膜印迹高通量筛选方法，其特征在于，所述的分泌型脂肪酶基因工程菌为酵母或细菌。
3.根据权利要求2所述的分泌型脂肪酶基因工程菌的膜印迹高通量筛选方法，其特征在于，所述的酵母为毕赤酵母，进一步为毕赤酵母GS115或毕赤酵母X33。
4.根据权利要求1所述的分泌型脂肪酶基因工程菌的膜印迹高通量筛选方法，其特征在于，所述的能够表达脂肪酶的表达载体为酵母表达载体，进一步为酵母表达载体pPIC9K或酵母表达载体pPICZaA。
5.根据权利要求1所述的分泌型脂肪酶基因工程菌的膜印迹高通量筛选方法，其特征在于，所述的基础培养基为MD固定培养基或YPD固体培养基；所述的诱导培养基为添加了0.5～1％甲醇的BMMY培养基。
6.根据权利要求1所述的分泌型脂肪酶基因工程菌的膜印迹高通量筛选方法，其特征在于，所述的负载膜为醋酸纤维素膜或滤纸膜，负载膜的大小与培养皿相适应；所述的印迹膜为硝酸纤维素膜、尼龙膜或PVDF膜，其孔径大小为0.22～0.45μm，印迹膜的大小与培养皿相适应。
7.根据权利要求1所述的分泌型脂肪酶基因工程菌的膜印迹高通量筛选方法，其特征在于，步骤(3)中所述的诱导培养，诱导时间为12～48h。
8.根据权利要求1所述的分泌型脂肪酶基因工程菌的膜印迹高通量筛选方法，其特征在于，所述的缓冲液为添加了0.75mg/mL NaCl、1％Trriton X-100的pH8.0磷酸缓冲液；所述的显色溶液为fastblue RR萘酯水溶液或fastblue B萘基棕榈酸酯水溶液，所述的fastblue RR萘酯水溶液含萘酯0.4mg/ml，fastblue RR 0.2mg/ml，所述的fastblue B萘基棕榈酸酯水溶液含萘酯0.6mg/ml，fastblue B 0.2mg/ml。
9.根据权利要求1所述的分泌型脂肪酶基因工程菌的膜印迹高通量筛选方法，其特征在于，完成步骤(3)的诱导培养之后，将印迹膜置于高温下及高浓度的有机溶液中进行处理，从而在之后的步骤中获得该温度下及该浓度的有机溶液下酶活稳定的脂肪酶及其菌株。
10.根据权利要求9所述的分泌型脂肪酶基因工程菌的膜印迹高通量筛选方法，其特征在于，所述的高温为不低于55℃，所述的高浓度的有机溶液为55％的甲醇水溶液。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201410576815.4A CN104450866B (zh) | 2014-10-24 | 2014-10-24 | 一种分泌型脂肪酶基因工程菌的膜印迹高通量筛选方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201410576815.4A CN104450866B (zh) | 2014-10-24 | 2014-10-24 | 一种分泌型脂肪酶基因工程菌的膜印迹高通量筛选方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN104450866A true CN104450866A (zh) | 2015-03-25 |
| CN104450866B CN104450866B (zh) | 2018-02-13 |
Family
ID=52897612
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201410576815.4A Active CN104450866B (zh) | 2014-10-24 | 2014-10-24 | 一种分泌型脂肪酶基因工程菌的膜印迹高通量筛选方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN104450866B (zh) |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1834236A (zh) * | 2006-03-31 | 2006-09-20 | 清华大学 | 野生型枯草芽胞杆菌脂肪酶a变体及其应用 |
-
2014
- 2014-10-24 CN CN201410576815.4A patent/CN104450866B/zh active Active
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1834236A (zh) * | 2006-03-31 | 2006-09-20 | 清华大学 | 野生型枯草芽胞杆菌脂肪酶a变体及其应用 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN104450866B (zh) | 2018-02-13 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Kumar et al. | Optimization of culture variables for improving glucoamylase production by alginate-entrapped Thermomucor indicae-seudaticae using statistical methods | |
| Gamarra et al. | Cellulase production by Aspergillus niger in biofilm, solid-state, and submerged fermentations | |
| Wang et al. | Bioprocessing strategies to improve heterologous protein production in filamentous fungal fermentations | |
| Kar et al. | Statistical optimization of α-amylase production by Streptomyces erumpens MTCC 7317 cells in calcium alginate beads using response surface methodology | |
| He et al. | Humidity control strategies for solid-state fermentation: Capillary water supply by water-retention materials and negative-pressure auto-controlled irrigation | |
| Danial et al. | Characteristics of immobilized urease on grafted alginate bead systems | |
| Birnbaum et al. | Hybrid living capsules autonomously produced by engineered bacteria | |
| Rodríguez‐Nogales et al. | Immobilization of Oenococcus oeni in lentikats® to develop malolactic fermentation in wines | |
| Toscano et al. | Production and partial characterization of extracellular lipase from Trichoderma harzianum by solid-state fermentation | |
| CN103421758A (zh) | 利用水稻胚乳细胞作为生物反应器生产重组脂肪酶的方法 | |
| Zhang et al. | Heterologous expression of an alkali and thermotolerant lipase from Talaromyces thermophilus in Trichoderma reesei | |
| Yang et al. | Cell surface display of Thermomyces lanuginosus lipase in Pichia pastoris | |
| Wang et al. | Immobilization of Trametes versicolor cultures for improving laccase production in bubble column reactor intensified by sonication | |
| JP2017515511A5 (zh) | ||
| Liu et al. | Development of genetic tools in glucoamylase-hyperproducing industrial Aspergillus niger strains | |
| CN104911243A (zh) | 一种接种大量液体标本的固体培养基及培养方法 | |
| Sapna et al. | Free and immobilized Aspergillus oryzae SBS50 producing protease-resistant and thermostable phytase | |
| Parascandola et al. | PVA-gel (Lentikats®) as an effective matrix for yeast strain immobilization aimed at heterologous protein production | |
| CN103667149B (zh) | 一株具有抗菌活性的菌株及其筛选方法和应用 | |
| Ji et al. | A novel locus essential for spreading of Cytophaga hutchinsonii colonies on agar | |
| CN104450866B (zh) | 一种分泌型脂肪酶基因工程菌的膜印迹高通量筛选方法 | |
| Mitra et al. | Cellulase and xylanase activity in relation to biofilm formation by two intertidal filamentous fungi in a novel polymethylmethacrylate conico-cylindrical flask | |
| Karmakar et al. | Effect of extracellular factors on growth and dimorphism of Rhizopus oryzae with multiple enzyme synthesizing ability | |
| CN113186176A (zh) | 一种全合成培养基及发酵法生产米黑根毛霉脂肪酶的方法 | |
| CN105062909A (zh) | 双脂肪酶细胞表面共展示工程菌及其构建方法和应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |