HU213589B

HU213589B - Process for the renaturation of denatured protein

Info

Publication number: HU213589B
Application number: HU9202354A
Authority: HU
Inventors: Dorothea Ambrosius; Rainer Rudolph
Original assignee: Boehringer Mannheim Gmbh
Priority date: 1990-11-22
Filing date: 1991-11-21
Publication date: 1997-08-28
Also published as: HU9202354D0; PT99578B; KR960013385B1; HUT63437A; IE913474A1; US5618927A; WO1992009622A1; CA2074182A1; JPH05502245A; PT99578A; KR927003623A; EP0512087B1; AU8919591A; DE59108583D1; DK0512087T3; RU2070888C1; DE4037196A1; ATE149514T1; CA2074182C; IE62052B1

Description

A találmány tárgya eljárás denaturált protein szolubilizálására és renaturálására, amelynek során a proteint egy olyan trisz-pufferral kezeljük, amely legalább 400 mmol/1 koncentrációban trisz-bázist vagy ennek megfelelő trisz-sót tartalmaz.

Proteinek prokarióta sejtekben, például E.coli-ban való előállítása során főként nehezen oldható protein-aggregátumok (zárványtestek: inclusion bodies) keletkeznek. Ezeknek a proteineknek aktív formába való átalakításához szolubilizálási és renaturálási műveletekre van szükség. A proteinek szolubilizálása ismert eljárás (lásdpéldáulazEP-A0 361 475, EP-A 0 114 506, EP-A 0 093 619 és EP-A 0 253 823 számú európai közrebocsátási iratokat).

Ismeretesek továbbá denaturált proteinek renaturálására alkalmas pufferok és eljárások is (lásdpéldául a WO 87/02763 szám alatt közzétett PCT bejelentést, az EP-A 0 364 926 számú európai közrebocsátási iratot és az EP 0 241 022 számú európai szabadalmi leírást).

A WO 87/02763 számú nemzetközi közzétételi iratban leírnak egy eljárást prokariótákban való expresszió után sejtfeltárással, denaturáló és redukáló körülmények között végzett szolubilizálással és oxidáló körülmények között GSH/GSSG jelenlétében végzett reaktiválással kapott nem-glükozilált tPA aktiválására, amely eljárás során a reaktiválási műveletben 9-től 12-ig terjedő pH-n, 0,1-20 mmol/1 GSH-koncentrációnál, 0,01-3 mmol/1 GSSG-koncentrációnál és valamilyen denaturálószer denaturálódást nem okozó koncentrációjánál dolgoznak. Az EP-A 0 241 022 számú európai közrebocsátási iratban denaturált proteinek valamilyen renaturáló pufferrel készített oldatban való renaturálására szolgáló eljárást közölnek, amelynek során a kiválasztott pufferben a naturálandó protein kritikus koncentrációjú oldatát készítik el, és az összehajtogatódott intermedier képződése után további, a kritikus koncentráció eléréséhez szükséges mennyiségű renaturálandó proteint adnak az oldathoz. Az EP-A 0 364 926 számú európai közrebocsátási irat tárgya géntechnológiai módszerrel előállított, prokariótákban kifejezett, sejtfeltárás után denaturáló és redukáló körülmények között végzett szolubilizálással és ezt követően oxidáló és renaturáló körülmények között végzett reaktiválással kapott biológiailag aktív proteinek aktiválási eljárása, amelyben 1-1000 pg/ml proteinkoncentrációnál dolgoznak, és a szolubilizálás és a reaktiválás között 1 és 4 közötti pH-jú, 4—8 mol/g guanidin-hidrokloridot vagy 6-10 mol/1 karbamidot tartalmazó pufferral szembeni dializálást végeznek.

Proteinek renaturálására ismertet eljárást a 198514 számú magyar szabadalmi leírás, ahol 150 mmol/1 maximális trisz-koncentrációnál renaturálnak. Az ezzel a megoldással elérhető renaturálási kitermelés gyengébb a találmány szerinti eljárással elérhetőnél.

Egy lényeges, a renaturált protein kitermelését korlátozó faktor a (diszulfidhidakat tartalmazó vagy nem tartalmazó) proteinek reaktiválásánál a denaturált proteinnek a helyesen összegöngyölődő intermedierré való átalakulása több proteinmolekula aggregátumává való átalakulása közötti konkuráló reakció. Ezért a denaturált protein koncentrációja a renaturáló pufferban lényeges paraméter a renaturálási eljárás kitermelése szempontjából, azaz a denaturált protein növekvő koncentrációja az aggregációnak kedvez, és csökkenti a natív protein konformációjával rendelkező renaturált protein relatív kitermelését.

A proteinek reaktiválásához ezért szükséges a jelenleg ismert eljárás esetében az, hogy a denaturált protein mennyisége az elegyben ne haladjon meg egy kritikus koncentrációt. A proteinnek az alkalmazott reaktiváló pufferban való gyakran csekély oldhatósága esetében ezért jelentős hátrányok adódnak alacsonyabb kitermelés, magasabb időigény és/vagy nagyobb puffertérfogatok vonatkozásában.

A találmány feladatául ezért azt tűztük ki, hogy a reaktiválásra (azaz különösen a szolubilizálásra és renaturálásra) olyan körülményeket és olyan puffért biztosítsunk, amelyekkel a denaturált és renaturált protein oldhatósága az ismert pufferokhoz képest jelentősen növekedik.

Ezt a feladatot a találmány szerint egy denaturált protein naturálására szolgáló olyan eljárással oldottuk meg, amelyre az jellemző, hogy a proteint trisz(hidroxi-metil)-amino-metán bázis (amelyet a továbbiakban csak trisz néven említünk) vagy a trisz valamilyen sójának legalább 400 mmol/1 koncentrációjú és olyan pH-jú oldatával inkubáljuk, amelynél a kezelendő protein natív konformációját felveheti.

Olyan puffer alkalmazásával, amely 400 mmol/l-nél magasabb koncentrációban tartalmaz trisz bázist vagy annak sóját, a denaturált proteinek reakti válásakor a renaturálódó proteinek oldhatósága jelentősen növekszik. Ez az aktív protein kitermelésének az ismert eljárásokéhoz viszonyított lényeges növekedéséhez vezet. Jóllehet az eddig ismert reaktiváló pufferok gyakran tartalmaznak íriszt 50-től 100 mmol/l-ig terjedő koncentrációban a reakcióelegy pufferolására, a trisz legalább 400 mmol/1 koncentrációnál kifejtett meglepő oldékonyság-közvetítő (és ezáltal a renaturálási kitermelést javító) tulajdonsága ez ideig nem volt ismeretes.

A találmány szerinti eljárás értelmezése szerint a trisz sóján valamilyen tetszőleges szerves vagy szervetlen savval képzett trisz-só értendő. A trisz-sókra példaként trisz-acetát, trisz-benzoát, trisz-borát, trisz-karbonát, trisz-citrát, trisz-hidrokloroid, trisz-maleát, trisz-nitrát, trisz-oxalát, trisz-foszfát, trisz-szukcinát, trisz-szulfát és hasonlók említhetők.

A találmány szerinti eljárás proteinek általános renaturálására alkalmas, amennyiben a denaturálódás oka (só, hő stb.) önmagában nem kritikus. Bár a találmány szerinti eljárás elsősorban a géntechnológiai módszerekkel előállított és inaktív formában zárványtest anyagként kiváló termékek renaturálásra alkalmas, azonban az eljárás alapjában véve más denaturált proteinek esetében is alkalmazható. A találmány szerinti eljárás különösen a WO 87/02673 számú nemzetközi közzétételi iratban, az EP-A 0 241 022 és EP-A 0 364 926 számú európai közrebocsátási iratokban szereplő eljárások esetében alkalmazható.

A találmány szerinti eljárás két változatban hajtható végre. Az egyik változat az, amelyben adott koncentrá2

HU 213 589 Β ciójú trisz-pufferban dolgozunk, hogy a triszt és/vagy a trisz valamilyen sóját pH-beállításra is használjuk. A második változat az, hogy egy már korábban a megfelelő eljárásra leírt pufferban dolgozunk, és pótlólag triszt és/vagy trisz valamilyen sóját adjuk hozzá. Ez azt jelenti, hogy az inkubáló oldat pH-ját egy trisz-től eltérő pufferanyaggal állítjuk be. Mindkét esetben célszerű gondoskodni arról, hogy a trisz hozzáadásával, illetve a triszkoncentráció növelésével ne okozzunk pH-változást.

Az inkubálás olyan pH-értéknél történik, amelynél a kezelendő protein natív konformációjában előfordulhat. Ez azt jelenti, hogy az inkubálás a találmány szerinti eljárás során nem olyan pH-értéknél történik, amely natív proteinkonformáció kialakulását lehetetlenné teszi. Natív proteinkonformációk alatt olyan szekunder, tercier és - adott esetben - kvatemer struktúrák értendők, amelyek esetében a protein biológiai aktivitással rendelkezhet.

A találmány szerinti eljárás magában foglalja egy denaturált proteinnek egy olyan trisz-oldattal végzett inkubálását, amelynek koncentrációja legalább 400 mmol/1. A trisz-koncentráció előnyösen 0,4-2 mol/1, különösen előnyösen körülbelül 1 mol/1. Egyes proteinek esetében (például antitest-fragmentumoknál) már 0,5 mol/1 tartományba eső trisz-koncentrációknál optimális reaktiválási kitermeléseket érünk el.

Egy renaturálási eljárás kitermelése, mint előbb már leírtuk, függ a proteinnek a renaturáló oldatban levő koncentrációjától. A találmány szerinti eljárás esetében előnyösen 4000 pg/ml határig terjedő proteinkoncentrációt választunk. A protein és a renaturálási eljárás milyenségétől függően azonban ezen határ feletti proteinkoncentrációk is megfelelőnek bizonyulhatnak.

A találmány szerinti eljárás esetében a denaturált proteint vagy folyamatosan vagy adagonként [például szakaszos adagolásos (pulzáló) renaturálás esetében] adjuk a renaturáló oldathoz. Sok esetben (például tPA és tPA-származékok renaturálása esetében) kedvezőnek bizonyul az is, ha az inkubáló oldathoz 0,2-1 mol/1 arginint adunk.

A találmány szerinti eljárással renaturálható proteinekre előnyös példákként rekombináns tPA vagy tPAmuteinek (különösen egy K2P domén-összetételü nem glükozilezett tPA-mutein), rekombináns granulocita telep stimuláló faktor (G-CSF) vagy antitestek vagy ezek fragmentumai említhetők. A találmány szerinti eljárás azonban nem csak ezekre a példákra korlátozódik, hanem bármely tetszőleges proteinre alkalmazható.

A találmány szerinti reaktiválási eljárás előnyei közé tartozik főként az aktív protein végső kitermelésének 30-300%-kal való növelése egy olyan eljáráshoz képest, amelyben egy olyan pufferral dolgozunk, amelyben a trisz-koncentráció alacsonyabb. Továbbá a végső kitermelés csökkenése nélkül növelhető a denaturált protein koncentrációja a renaturáló pufferban, azaz a renaturálási eljárás jelentősen gyorsabb és hatásosabb lesz.

Különösen előnyös a találmány szerinti eljárás egy renaturáló reaktorban végzett adagolásos renaturálás esetén. Ebben az esetben nő a renaturált protein kitermelése, továbbá növelhető adagonként a protein-koncentrációja, amiből a reaktiválási időtartam lerövidülése adódik. A renaturáló elegybe magasabb protein koncentrációig végezhető az adagolás anélkül, hogy csökkent renaturálási kitermelést észlelnénk. Ebből adódik a puffertérfogat jelentős csökkenése is. Különösen kedvezőnek bizonyult egy olyan szakaszos adagolásos renaturálási eljárás, amelynek során a renaturálást arginint tartalmazó körülbelül 1 mol/1 trisz-koncentrációjú pufferben végezzük, és a renaturálandó protein koncentrációja adagolásonként körülbelül 200 pg/ml-rel nő.

A találmányt részletesebben a következőkben leírt példákkal szemléltetjük:

Az alkalmazott rövidítések:

GSH: redukált glutation,

GSSG: oxidált glutation, t-PA: szöveti plazminogén aktivátor,

Cprot: protein-koncentráció,

Arg: arginin,

Gdn: guanindin, renat.: renaturálás,

CK: kreatinkináz.

1. példa:

A renaturálási kitermelés a második adag hozzáadásáig eltelt inkubációs idő függvényében (+/- 1 mol/1 trisz).

Kiindulási anyag:

A K2P TPA-mutein zárványtesteket a W090/09437 nemzetközi közzétételi számú PCT-bejelentés 1. példája szerint állítottuk elő, és utána az EP-A 0 361 475 Al számú európai közrebocsátási irat 1. példájában leírtak szerint szolubilizáltuk, és vegyes diszulfiddá alakítottuk. A 2-5. példák esetében a kiindulási anyaggal hasonlóképpen jártunk el.

Renaturálás: 0,6 mol/1 arginin/HCl puffer, pH 8,5;

mmol/1 EDTA;

0,7 mmol/1 redukált glutation (GSH);

+/—1 mol/1 trisz;

Cprot =140 pg/ml adagolásonként.

A 2. adag hozzáadása: 1-9 óra (lásd az 1. táblázatot). Inkubálás: 12 óra szobahőmérsékleten az utolsó adag hozzáadása után.

1. táblázat

idő 2. adag (óra)	trisz nélkül aktivitás (+ fibrin) (egység/ml)	1 mol/1 trisz aktivitás (+ fibrin) (egység/ml)
0	2855	4 736
1	4671	9 256
2	4974	9 732
3	5060	10 359
4	5233	9 343
5	5168	9 645
6	6845	10 185
7	6152	9 252
8	6814	10 726
9	7115	10 335

HU 213 589 Β

A renaturált K2P tP A-mutein aktivitásának meghatározását és az egység definícióját Lili úja le a ZGIMAL 42, 478-486 (1987) közleményben.

Az 1. táblázatból látható, hogy trisz nélküli arginin-pufferban a második adag hozzáadásáig eltelt 6 óra feletti tartózkodási idő esetén a maximális renaturálási kitermelés érhető el. Amennyiben 1 mol/1 trisz-t adunk az elegyhez, akkor a következő változások lépnek fel: a renaturálásnál a maximális kitermelés 30-40%-kal növekszik; már 1-3 óra tartózkodási idő után a renaturálási kitermelés csökkenése nélkül újból adagolható denaturált protein.

2. példa:

A renaturálás függése a trisz-koncentrációtól és az arginin/guanidin-aránytól.

Kiindulási anyag:

Az 1. példában leírtak szerint előállított K2P tPAmutein-zárványtestek.

A renaturálás körülményei az alábbiak:

/-kísérlet: trisz-függőség.

0,6 mol/1 arginin/HCl puffer, pH 8,5;

mmol/1 EDTA;

0,7 mmol/1 GSH.

trisz-koncentráció: 0, 50, 100, 500, 1000 és 2000 mmol/1.

Cp_rot = 80 pg/ml.

Inkubálás: 24 óra szobahőmérsékleten.

ő-kísérlet: puffer-függőség.

mmol/1 EDTA, pH 8,5;

0,7 mmol/1 GSH;

Cp_rot = 80 μ g/ml.

Puffer: (1) 0,6 mol/1 arginin/HCl, (2) 0,4 mol/1 arginin/HCl +

0,2 mol/1 guanidin (Gdn)/HCl, (3) 0,2 mol/1 arginin/HCl +

0,5 mol/1 guanidin (GDN)/HC1; valamint +/- 1 mol/1 trisz.

Inkubálás: 24 óra szobahőmérsékleten.

2A. táblázat /-kísérlet: trisz-függőség

Trisz (mmol/1)	Aktivitás (+ fibrin) (egység/ml)
0	2173
50	2750
100	2651
500	3902
1000	5339
2000	5131

2B. táblázat ő-kísérlet: a pufferek változtatása

Puffer	Adalékok	Aktivitás (+ fibrin) (egység/ml)
(1) 0,6 mol/1 Arg	—	2047
	1 mol/1 trisz	3553
(2) 0,4 mol/1 Arg/	-	1577
0,2 mol/1 Gdn	1 mol/1 trisz	4350
(3) 0,2 mol/1 Arg/	-	1402
0,5 mol/1 Gdn	1 mol/1 trisz	3277

/-kísérlet: A trisz-nek a renaturáló pufferban való koncentrációja emelkedésével nő a kitermelés. A renaturálás optimuma körülbelül 1 mol/1 trisz-koncentrációnál van. 100 mmol/1 és 500 mmol/1 közötti trisz-koncentrációnál meglepően növekszik a renaturálási kitermelés, ő-kísérlet: 1 mol/1 trisz hozzáadásával minden esetben drasztikusan (2-3 faktorral) nő a kitermelés.

3. példa:

Renaturálás a protein-koncentráció függvényében. (+/—1 mol/1 trisz).

Kiindulási anyag:

Az 1. példában leírtak szerint előállított K2P tPAmutein-zárványtestek.

A renaturáláshoz az alábbi oldatokat használjuk:

/-puffer:

0,6 mol/1 arginin/HCl puffer, pH 8,5;

mmol/1 EDTA;

0,7 mmol/1 GSH.

Cp_rot. = 112, 223 és 446 pg/ml.

/-puffer:

0,6 mol/1 arginin/HCl puffer, pH 8,5;

mol/1 trisz;

mmol/1 EDTA;

0,7 mmol/1 GSH.

C_prot. = 112, 223,446, 893,2230 és 4460 pg/ml. Inkubálás: 24 óra, szobahőmérsékleten.

A kísérlet eredményeit a 3. táblázatban összesítjük.

3. táblázat

Trisz (mmol/1)	Cprot. (pg/ml)	Aktivitás (+ fibrin) (egység/ml)	Aktivitás/Cprot. (egység/ml)
0	112	2875	25 670
	223	4187	18 780
	446	5956	13 350
1	112	2900	25 890
	223	5171	23 190
	446	10 163	22 790
	893	13 286	14 880
	2230	17 483	7840
	4460	24 930	5590

HU 213 589 Β

Triszt nem tartalmazó arginin-pufferban a renaturálási sebesség a protein-koncentráció emelkedésével csökken. Amennyiben a pufferhoz 1 mol/1 triszt adunk, akkor 400 pg/ml protein-koncentrációig nem mérhető jelentős csökkenés a naturálási kitermelésben (aktivitás/Cp_rot). Csak magasabb protein-koncentrációnál csökken a kitermelés a koncentráció növekedésével.

4. példa:

Szakaszos adagolásos (pulzáló) naturálás: +/-1 mol/1 trisz.

Kiindulási anyag:

Az 1. példában leírtak szerint előállított K2P tPAmutein-zárványtestek.

A renaturálását az alábbi körülmények között végezzük:

0,6 mol/1 Arg/HCl puffer, pH 8,5;

mmol/1 EDTA;

0,7 mmol/1 GSH.

Trisz: +/- 1 mol/1.

Cprot- =150 pg/ml adagonként.

Tartózkodási idő: 12 óra.

Végkoncentráció: 1500 pg/ml.

Előkezelés vegyes diszulfidokkal 0°C-on, reakció nitrogéngáz alatt.

A kísérlet eredményeit a 4. táblázatban foglaljuk össze.

A renaturálás körülményei az alábbiak:

0,6 mol/1 Arg/HCl puffer, pH 8,5;

0,7 mmol/1 GSH;

mmol/1 EDTA;

+/-1 mol/1 trisz.

Cp^-növekedés adagolásonként: (A) 9,3 pg/ml;

(B) 31 pg/ml.

Hozzányomatási szivattyúzási időtartam: 2 perc. Végkoncentráció: 300 pg/ml.

Előkezelés vegyes diszulfidokkal 0 °C-on, reakció nitrogéngáz alatt.

A kísérlet eredménye az 5. táblázatban látható.

5A. táblázat mol/1 trisz, C_prot = 9,3 pg/ml 30 percenként

Idő (óra)	Cprot. (pg/ml)	Aktivitás (+fibrin) (egység/ml)	Aktivitás/Cp_rot. (egység/ml)
16	245	10 223	41 726
23	527	23 295	44 203
42	800	30 405	38 006
48	904	43 339	47 941
69	1299	43 964	33 844
73	1375	49 505	36 003
137	2580	107 499	41 666
146	2759	104 009	37 698

4. táblázat

Trisz (mmol/1)	Cprot. (pg/ml)	Aktivitás (+ fibrin) (egység/ml)	Aktivitás/Cprot. (egység/ml)
0	150	3000	20 000
	450	-
	750	11 622	15 496
	1050	14 430	13 743
	1350	17 507	12 968
1	150	4353	29 020
	450	10 978	24 395
	750	17319	23 092
	1050	22 600	21 524
	1350	27 920	20 681

Trisz nélkül, C_prot = 9,3 pg/ml 30 percenként

Idő	Cprot.	Aktivitás (+ fibrin)	Aktivitás/Cp_rot
(óra)	(pg/ml)	(egység/ml)	(egység/ml)
8	114	2932	25 719
24	338	5635	16 671
40	563	14 723	26 150
56	788	24 035	30 501
72	1013	27 909	27 550
88	1238	33 802	27 303
104	1463	37 734	25 792
120	1688	46 420	27 500
176	2485	59 195	23 821
192	2710	62 098	22 914
208	2935	61 764	21 044
224	3160	65 896	20 853

Trisz nélkül végzett adagolásnál 700 mg/ml protein-koncentrációtól kezdve jelentős zavarosodás lép fel, míg ellenben 1 mol/1 trisz-adalékkal végzett adagolásnál még 1,5 mg/ml protein-koncentrációnál is teljesen tiszta az oldat. 1 mol/1 trisz hozzáadásával a végső kitermelés körülbelül 30%-kal emelkedik.

5. példa:

Szakaszos adagolásos (pulzáló) renaturálás: közelítés a folyamatos eljáráshoz (+/- 1 mol/1 trisz).

Kiindulási anyag:

Az 1. példában leírtak szerint előállított K2P tPAmutein-zárványtestek.

5B. táblázat mol/1 trisz, C_prot =31 pg/ml 30 percenként

Idő	Cprot.	Aktivitás (+ fibrin)	Aktivitás/C_Pr_Ot.
(óra)	(pg/ml)	(egység/ml)	(egység/ml)
1	94	1590	16 914
3	218	6264	28 738
18	1094	33 897	30 984
42	2563	-	-
49	3031	53 033	17 496
65	3696	72 056	19 495

HU 213 589 Β

Trisz nélkül, C_prot. = 31 pg/ml 30 percenként

Idő	Cprot.	Aktivitás (+ fibrin)	Aktivitás/C_pro,
(óra)	(pg/ml)	(egység/ml)	(egység/ml)
1	94	107
3	219	4587	20 945
18	1094	20 257	18516
42	2563	23 580	9200
49	3031	33 482	11 046
65	3696	36 126	97 74

A folyamatos eljáráshoz való közelítés (az egyes naturálási adagok adagolási gyakoriságának növelése egyébként azonos körülmények között) a szakaszos adagolást! (pulzáló) renaturálási kísérlethez viszonyítva azonos naturálási sebességeket ad. 1 mol/1 trisz-nek a renaturáló pufferhoz való hozzáadásával a végső kitermelés körülbelül 20-100%-kal növekszik.

6. példa:

Redukált K2P renaturálásának függése a trisz-koncentrációtól

Kiindulási anyag:

Az 1. példában leírtak szerint előállított K2P tPAmutein-zárványtestek.

Szolubilizálás: 6 mol/1 Gdn/HCl, pH 8,3;

0,1 mol/1 trisz;

mmol/1 EDTA;

0,1 mol/1 DTE;

Cprot. = 7,5 mg/ml;

perc Ultraturrax;

inkubálás: 1 óra szobahőmérsékleten; leállítás: sósavval pH 3,0-ra.

Dialízis: 6 mol/1 Gdn/HCl, pH 3,0;

mmol/1 EDTA.

Renaturálás: 0,7 mol/1 Arg/HCl, pH 8,5;

mmol/1 EDTA;

mmol/1 GSH;

0,3 mmol/1 GSSG (oxidált glutation); trisz: 0; 0,3; 0,6; 0,9; 1,2; 1,5; 1,8 és 2,1 mol/1.

Cprot. = 150 pg/ml.

Az eredmény a 6. táblázatban látható.

6. táblázat trisz Aktivitás (mol/1) (egység/ml)

A redukált protein közvetlen renaturálásánál is körülbelül 30%-kal növelhető a renaturálási kitermelés 1 mol/1 vagy annál több trisz hozzáadásával.

7. példa:

G-CSF renaturálása

Kiindulási anyag: A WO 91/11520 sz. nemzetközi közzétételi irat 3. példája szerint előállított G-CSF zárványtestek.

Szolubilizálás: 6 mol/1 Gdn/HCl, pH 8;

0,1 mol/1 trisz;

mmol/1 EDTA;

0,1 mmol/1 DTE;

C_prot = 10 Pg/ml;

perc Ultraturrax;

inkubálás: 2 óra szobahőmérsékleten keverés közben; leállítás: sósavval pH 3.

Dialízis: 6 mol/1 Gdn/HCl, pH 2,5;

mmol/1 EDTA;

°C, amíg a redukálószer teljesen eltávozik.

Protein-koncentráció a dialízis után: 8,5 mg/ml. Renaturálás: I. kísérlet:

0,6 mol/1 Arg/HCl, pH 8;

mmol/1 EDTA;

0,5 mmol/1 GSH;

mmol/1 GSSG.

A) 0,1 mol/1 trisz Β) 1 mol/1 trisz

Adag: C = 50 pg/ml 30 perc alatt, t = 1 óra, protein-végkoncentráció: 1 mg/ml. II. kísérlet: 0,6 mol/1 Arg/HCl, pH 8;

mmol/1 EDTA;

0,5 mmol/1 GSH;

mmol/1 GSSG.

A) 0,1 mol/1 trisz Β) 1 mol/1 trisz

Adag: C = 50 pg/ml 30 perc alatt, t = 1 óra, protein-végkoncentráció:

0,6 mg/ml.

A renaturálás után 30 perces centrifugálás következik percenkénti 16 000 fordulatnál. Ezután következik egy dialízis 20 mmol/1 8 pH-jú íriszt és 1 mmol/1 EDTA-t tartalmazó oldattal szemben.

Az eredmény a 7. táblázatban látható.

7. táblázat

0	1339
0,3	1478
0,6	1591
0,9	1725
1,2	1766
1,5	1766
1,8	1725
2,1	1717

Kísérlet % renaturálás

8,0 pH-jú trisz-pufferban végzett dialízis után

I. kísérlet

0,1 mol/1 trisz	10
1 mol/1 trisz	63
kísérlet
0,1 mol/1 trisz	20
1 mol/1 trisz	50

HU 213 589 Β további növelésével a kitermelés már csak csekély mértékben javul.

A G-CSF-aktivitás meghatározása egy G-CSF-függő rágcsáló (murine) leukémia sejtvonallal (NFS60) végzett szaporodási teszt (³H-timidin-beépülés) segítségével történik a T. Mossmann, [J. Immunoi. Methods 65, 66-73 (1985)] és Holmes, K.L., Plaszynski, E., Frederickson, T.T., Morse, H.C. III and Ihle, J., [PNAS Acad. Sci. USA 82, 6687-6691 (1985)] által leírtak szerint.

Hasonló eredményeket kapunk áz EP-A 0 456 200 számú európai közrebocsátási irat szerint előállított G-CSF-fel és G-CSF-mutánsokkal.

8. példa:

Antitest Fab-fragmentumok renaturálása

Denaturálás:

mol/1 Gdn/HCl, pH 8,5;

0,1 mol/1 trisz;

mmol/1 EDTA;

0,3 mol/1 DTE;

Cprot. = 5 pg/ml, inkubálás: 2-3 óra szobahőmérsékleten.

Renaturálás: trisz-puffer, pH 7,5;

(trisz: 0,05; 0,1; 0,2; 0,3; 0,5; 0,75 és 1 mol/1);

mmol/1 EDTA;

mmol/1 GSSG;

Cp_rot. = 50 pg/ml; inkubálás: 80 óra 10 °C-on.

Aktivitási vizsgálat: ELISA biotinilezett CK-val a DE-A 38 35 350.4 számú német szövetségi köztársaságbeli közzétételi irat 8.2 példája szerint.

Az eredmény a 8. táblázatban látható.

8. táblázat

trisz (mol/1)	% renaturálás
0,05	13
0,1	18
0,2	22
0,3	27
0,5	35
0,75	36
1	37

Az antitest Fab-k renaturálási kitermelése lineárisan nő 0,5 mol/1 trisz-koncentrációig; a trisz-koncentráció

Claims

SZABADALMI IGÉNYPONTOK

1. Eljárás denaturált protein renaturálására, mimellett önmagában ismert módon előzetesen szolubilizálunk, azzaljellemezve, hogy a denaturált proteint egy trisz-bázis és/vagy egy trisz-só egy olyan oldatával inkubáljuk, amely legalább 400 mmol/1 koncentrációjú és amelynek pH-értékét a protein natív konformációját biztosító értékre állítjuk be.
2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az inkubációs oldat pH-értékét egy trisz-től eltérő puffer-anyaggal állítjuk be.
3. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a pH-érték beállítására trisz-t használunk.
4. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzaljellemezve, hogy 0,4-2 mol/1 koncentrációjú triszoldattal inkubálunk.
5. Az 1-4. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az inkubációs oldathoz 0,2-1,0 mol/1 arginint adunk.
6. Az 5. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy proteinként rekombináns tPA-t vagy egy tPAmuteint renaturálunk.
7. A 6. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy tPA-mutánsként a K2P domén-összetételü, nemglükozilezett tPA-muteint renaturálunk.
8. Az 1-7. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a denaturált proteint folyamatosan vagy szakaszosan adagoljuk a renaturáló oldathoz.
9. A 8. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a szakaszos adagolású (pulzáló) renaturálást egy renaturáló reaktorban végezzük.
10. A 9. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a renaturálást egy arginint tartalmazó, körülbelül 1 mol/1 trisz-koncentrációjú pufferben végezzük, és a protein mennyiségét adagonként körülbelül 200 pg-mal növeljük.
11. Az 1-5. vagy 8-10. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy rekombináns G-CSF-et renaturálunk.
12. Az 1-5. vagy 8-10. igénypontok bármelyike szerinti eljárás azzaljellemezve, hogy antitesteket vagy ezek fragmentumait renaturáljuk.